KR20100026597A

KR20100026597A - 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20100026597A
Application number: KR1020080085655A
Authority: KR
Inventors: 김정인; 권오천; 최영현
Original assignee: 경남도립남해대학 산학협력단
Priority date: 2008-09-01
Filing date: 2008-09-01
Publication date: 2010-03-10

Abstract

본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 흑마늘 추출물이 U937 세포에서 PMA-유도된 PGE₂생성 및 COX-2 발현 저해 효과, 그리고 전사인자인 NF_KB(Nuclear Factor_KB) 활성 저해 효과를 나타냄을 확인한 바, 상기 조성물은 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

흑마늘, 염증, PGE₂, COX-2, NFκB, 염증성 질환

Description

흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising the extract of black garlic as an active ingredient for preventing and treating inflammatory disease}

본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.

[문헌 1] Vainio, Int . J. Cancer, 94, pp.613-614, 2001

[문헌 2] Wymann and Schneiter, Nat . Rev . Mol . Cell . Biol ., 9, pp.162-176, 2008

[문헌 3] Dempke et al., J. Cancer Res . Clin . Oncol., 127, pp.411-417, 2001

[문헌 4] Surh et al., Mutat . Res ., 480, pp.243-268, 2001

[문헌 5] Sawaoka et al., Lab . Invest ., 79, pp.1469-1477, 1999

[문헌 6] Yamamoto et al., J. Clin . Invest ., 107, pp.135-142, 2001

[문헌 7] Kramer et al., Am . J. Physiol . Lung Cell . Mol . Physiol ., 293, pp.L314-L327, 2007

[문헌 8] 정보섭 및 신민교, 향약대사전, 영림사, pp.158-161, 1998

[문헌 9] Mossman T., J. Immunol . Methods, 65, pp.55-63, 1983

[문헌 10] Kawada K. et al., Acta . Med . Okayama, 56, pp.129-134, 2002

[문헌 11] Moon D.O. et al., Biochemical pharmacology, 76, pp.312-321, 2008

[문헌 12] Moon D.O. et al., International Immunopharmacology, 7, pp.506-514, 2007

[문헌 13] Lee J.H. et al., Pharmacological Research, 51, pp.553-560, 2005

염증 (inflammation)은 외부 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나이다. 염증반응이 일어나면 여러 가지 염증 인자들 (pro-inflammatory mediators)이 만들어지는데 이로 인하여 임상적으로는 발적, 발열, 종창, 동통, 기능장애 등의 증상이 나타난다.

염증을 포함한 다양한 생체 반응에서 프로스타글란딘은 세포의 분열이나 증식을 조절함으로서 각종 인체 질병의 유발과 진행에 중요한 역할을 함이 최근 밝혀지고 있다(Vainio, Int. J. Cancer, 94, pp.613-614, 2001; Wymann and Schneiter, Nat . Rev . Mol . Cell . Biol ., 9, pp.162-176, 2008). 프로스타글란딘의 합성에서 2가지의 cyclooxygenase (COX) isoform이 관여하고 있는데, 대부분의 조직에서 일정한 수준으로 발현되는 COX-1의 경우 인체의 항상성 유지와 연관된 기능수행에 관여하며, COX-2는 암을 포함한 세포의 성장 및 분화와 연관된 각종 퇴행성 질환의 발병과 진행에 중요한 역할을 한다(Dempke et al., J. Cancer Res . Clin . Oncol., 127, pp.411-417, 2001). 역학적 조사와 여러 종류의 진행성 염증 및 암 조직에서 COX-2와 inducible nitric oxide synthease (iNOS)가 높은 수준으로 발현되고 있으며 이들 두 유전자의 발현을 증대시킬 경우 생리적 조건에서 정상적으로 일어나는 세포죽음인 세포사멸(apoptosis)에 대한 저항성을 가지는 점으로 보아 특히 염증반응과 함께 세포의 암화에 COX-2는 iNOS와 밀접한 관계를 가진다고 볼 수 있다(Surh et al., Mutat . Res., 480, pp.243-268, 2001). 또한 COX-2의 과발현에 의해 암조 직에서의 혈관신생 및 전이능이 높아지고 세포사멸 (apoptosis)을 막는다는 점과 COX-2 특이적 저해제에 의한 혈관신생(angiogenesis)과 종양형성의 억제 등의 결과에서 이 유전자의 선택적 조절에 의한 염증 예방뿐만 아니라 암 예방을 위한 전략으로 대두되고 있다(Sawaoka et al., Lab . Invest ., 79, pp.1469-1477, 1999; Yamamoto et al., J. Clin . Invest ., 107, pp.135-142, 2001).

한편 염증성 질환뿐만 아니라 면역계 질환, 심혈관 질환, 당뇨, 암 등과 관련된 유전자의 프로모터(promoter) 영역에 결합하여 그들의 유전자발현을 유도하는 nuclear factor kappa B (NF_KB p65)에 의하여 COX-2 발현이 조절된다는 보고들에서도 COX-2의 중요성을 잘 알 수 있다(Surh et al., Mutat. Res ., 480, pp.243-268, 2001; Yamamoto et al., J. Clin . Invest ., 107, pp.135-142, 2001). 또한 전사조절인자 중의 하나인 early growth response gene-1 (Egr-1)에 의해서도 다양한 염증매개 물질들이 조절되고 있다는 결론이 최근 많은 연구자들에 의하여 증명되고 있다(Kramer et al., Am . J. Physiol . Lung Cell . Mol . Physiol ., 293, pp.L314-L327, 2007). 이러한 COX-2의 최근 연구 방향은 전사활성 요소와 연관된 상위 신호전달 경로에 많은 관심이 모아지고 있으며 이들의 활성을 조절할 수 있는 물질의 탐색작업에 많은 비중을 두고 있다.

최근, 천연자원은 여러 치료제의 선도 물질로서 개발되어 제약 산업에 소중한 자원으로서 이용되어 왔다. 그러므로 천연자원에서 항염증 질환의 예방 및 치료 물질을 개발하여 인공적인 화학물질보다 부작용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 가격 면에서도 경쟁력이 있다.

마늘(Allium sativum L.)은 전국에서 재배되는 다년생 초본으로서 그 인경을 약재 또는 식품 재료로 널리 사용하며, 그 구성 성분으로는 칼슘, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 C 등의 성분이 알려져 있으며, 항암작용, 항진균 작용, 항원충작용, 항암작용 등이 보고된 바가 있다(정보섭 및 신민교, 향약대사전, 영림사, pp.158-161, 1998년).

그러나 상기 문헌 어디에도 본 발명의 마늘을 가공한 흑마늘 추출물이 염증성 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물로서 사용가능하다고 교시되거나 개시된 바는 없다.

이에 본 발명자들은 흑마늘 추출물이 U937 세포에서 PMA-유도된 PGE₂생성 및 COX-2 발현 저해효과, 그리고 전사인자인 NF_KB 활성 저해 효과를 나타내어 항염증 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 흑마늘은 경상남도 남해군에서 재배된 생마늘을 일정한 온도와 습도에서 자연숙성 및 발효시킨 가공 마늘로서, 구체적으로는 생마늘을 1차 열풍 숙성, 자연건조 및 2차 열풍 건조하는 가공공정, 보다 구체적으로는 생마늘을 10 내지 120℃, 바람직하게는 40 내지 90℃에서 150 내지 500시간, 바람직하게는 280 내지 320시간 동안 열풍으로 1차 숙성하는 제 1단계; 상기 단계에서 숙성된 마늘을 10 내지 60시간, 바람직하게는 38 내지 42시간 동안 자연 건조하는 제 2단계; 상기 건조 마늘을 다시 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 30℃의 온도의 열풍으로 10 내지 100시간, 바람직하게는 30 내지 50시간 동안 숙성하는 2차 숙성 단계를 포함하는 제 3단계 공정을 통하여 수득한 흑색의 가공 마늘을 의미한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물과 메탄올의 혼합용매, 더욱 바람직하게는 60-100% 메탄올 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 염증성 질환은 동맥경화증, 결막염, 아토피, 관절염, 비염, 궤양성 대장염, 고혈압, 당뇨병, 암 또는 천식, 바람직하게는 동맥경화증, 결막염, 아토피 또는 관절염, 더욱 바람직하게는 동맥경화증 또는 관절염을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 흑마늘은 국내 경상남도 남해군에서 재배된 생마늘을 10 내지 120℃, 바람직하게는 40 내지 90℃에서 150 내지 500시간, 바람직하게는 280 내지 320시간 동안 열풍으로 1차 숙성하는 제 1단계; 상기 단계에서 숙성된 마늘을 10 내지 60시간, 바람직하게는 38 내지 42시간 동안 자연건조하는 제 2단계; 상기 건조 마늘을 다시 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 30℃의 온도의 열풍으로 10 내지 100시간, 바람직하게는 30 내지 50시간 동안 숙성하는 2차 숙성 단계를 포함하는 제 3단계 공정을 통하여 본 발명의 가공한 흑마늘을 제조할 수 있다.

본 발명의 흑마늘 추출물은 상기 공정으로부터 수득한 흑마늘을 동결건조하고 이를 분쇄한 후, 시료중량의 1 내지 30배, 바람직하게는 5 내지 15배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물과 메탄올의 혼합용매, 더욱 바람직하게는 60-100% 메탄올에 가용한 추출물을 1 내지 48시간, 바람직하게는 5 내지 12시간 동안 실온에서 열수추출, 냉침추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 가열추출 등의 추출방법, 바람직하게는 냉침추출법으로 추출하여 감압여과하고 수득한 제 1차 추출액과 잔사를 분리한 후, 수득한 잔사에 추출 시작 당시의 흑마늘 시료중량의 1 내지 20배, 바람직하게는 5 내지 10배 부피(w/v)의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물과 메탄올의 혼합용매, 더욱 바람직하게는 60-100% 메탄올에 가용한 추출물을 실온에서 1 내지 10시간, 바람직하게는 1 내지 5시간 동안 열수추출, 냉침추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 가열추출 등의 추출방법, 바람직하게는 냉침추출법으로 추출하여 감압여과하고 제 1차 추출액과 합쳐 농축, 건조하는 제조공정을 통하여 본 발명의 흑마늘 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 흑마늘 추출물을 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 흑마늘 추출물을 0.1 내지 50 중량% 포함한다.

본 발명의 흑마늘 추출물을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 흑마늘 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제 된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골 (macrogol), 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 흑마늘 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 이를 첨가할 수 있는 식품으로는 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.

또한, 염증성 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때 식품 또는 음료 중의 흑마늘 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 기능성 음료 조성물은 100 ml 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에르트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유 할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지는 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 흑마늘 추출물은 U937 세포에서 PMA에 의해 유발된 염증 인자의 지표인 PGE₂의 생성량, COX-2의 발현도 및 전사인자인 NF_kB(Nuclear Factor _KB) 활성도를 유의적으로 감소시키는 항염 효과를 확인함으로서, 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물로서 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 참고예, 실시예, 비교예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 흑마늘 추출물의 제조

1-1. 흑마늘의 제조

경상남도 남해군에서 재배된 국내산 생마늘 500g을 40 ∼ 90℃에서 280 ∼ 320시간 열풍으로 숙성하고, 이를 38 ∼ 42시간 동안 자연 건조한 후, 다시 20 ∼ 30℃의 열풍으로 30 ∼ 50시간 숙성하여 흑마늘 347.5g을 수득하였다.

1-2. 흑마늘 추출물의 제조

상기 실시예 1-1의 제조방법으로 수득된 흑마늘 100g을 동결 건조기(Clean-Vac 24T, 바이오트론)로 동결건조하여 분쇄한 후, 시료 중량의 약 7배 부피의 100% 메탄올로 실온에서 10시간 동안 추출하고, 감압 여과하여 얻은 1차 추출액 및 잔사를 분리하였다. 여기에서 수득한 잔사에 추출 시작 당시의 흑마늘 시료중량의 약 6배 부피의 100% 메탄올로 실온에서 3시간 동안 추출한 후, 감압여과하고 제 1차 추출액과 합하여 농축 및 동결건조하여 본 발명의 흑마늘 추출물(이하,“BE”라 명명함) 14.5g을 수득하였다.

비교예 1. 생마늘 추출물의 제조

국내산 남해지역에서 재배된 생마늘을 상기 실시예 1-2의 제조방법과 동일한 방법으로 추출하여 생마늘 추출물(이하,“NE”라 명명함) 6.5g을 수득하였다.

참고예 1. 시료 전처리

상기 실시예 1-2 및 비교예 1의 제조방법으로 수득된 추출물들을 세포에 처리하기 직전, 교체용 세포배양배지에 첨가하여 녹인 후 0.22 ㎛의 pore size를 가 진 주사기용 필터 유닛 또는 1회용 펌프 필터 유닛을 사용하여 미생물 및 불순물을 걸러낸 다음, 세포배양배지를 추출물이 함유된 배지로 교체함으로 추출물을 처리하였다.

참고예 2. 재료의 준비

Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)-1640 배지는 Gibco BRL사 (Grand Island, USA)에서, fetal bovine serum (FBS)는 JR사(Woodland, CA, USA)에서, 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)은 Biofluids사 (Rockville, MD, USA)에서, Phorbol 12-Myrsitate 13-Acetate(PMA)는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 하기 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology사 (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham사에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급이상으로 사용하였다.

참고예 3. 세포배양

U937 세포(21593)는 한국생명공학연구소에서 분양받았다. 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 RPMI-1640 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였으며, 세포배양용 페트리 접시에 약 5 × 10⁴개/㎖ 농도로 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후 하기 실험에 사용하였다.

실험예 1. 세포독성 측정

1-1. MTT assay 에 의한 세포 성장억제 조사

상기 실시예 1 및 비교예 1의 제조방법으로 수득된 BE 및 NE 추출물들의 U937 세포에 대한 독성 측정을 위해 문헌(Mossman T., J. Immunol . Methods, 65, pp.55-63, 1983)에 기재된 3-(4,5-디메틸티아졸-2)-2,5-디페닐테트라졸리움브로미드 (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; MTT) 분석 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. 상기 참고예 3의 방법으로 배양된 U937 세포를 세포 배양용 96 웰 플레이트에 5 × 10³개/웰로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음, BE 및 NE 추출물을 각각 농도별 (0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 μg/ml)로 배지에 희석하여 6시간 동안 처리하였다. 또한 PMA을 40 nM로 단독 처리 또는 전처리 후 BE 및 NE 추출물을 각각 농도별 (0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 μg/ml)로 배지에 희석하여 6시간 동안 혼합처리하였다. 이후 배지를 제거하고 테트라졸리엄 브로마이드염(tetrazolium bromide salt: MTT, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 시약을 0.5 ㎎/㎖ 농도로 희석하여 200 ㎕씩 첨가하여 3시간 동안 반응시킨 후, MTT 시약을 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma)를 100 ㎕씩 첨가하여 well에 생성된 포마진(formazin)을 모두 녹인 후 엘리 자 리더(ELISA reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 각각 3회 반복 측정하였다. 세포 생존율은 추출물을 처리하지 않은 대조군에 대한 백분율로 표시하였으며, 평균값과 표준 오차를 Sigma Plot 4.0 프로그램 (SPSS Ins.)으로 구하여 평균값 ± 표준편차로 표시하였다.

실험결과, 도 1에 나타난 바와 같이, BE 및 NE 추출물은 500 μg/ml 농도까지에서 U937 세포의 생존율에 거의 영향을 주지 않아 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 2에 나타난 바와 같이 PMA을 40 nM로 단독 처리 또는 전처리 후 BE 및 NE 추출물을 각 농도별로 혼합 처리 시, BE 및 NE의 처리 농도(0-500 μg/ml)의 증가에도 불구하고 세포생존율은 큰 변화가 없었다. 즉 40 nM의 PMA와 BE 또는 NE 추출물을 500 μg/ml까지 단독 혹은 혼합 처리 시에도, U937 세포의 생존율에 거의 영향을 주지 않아 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있었다.

1-2. 세포성장 및 세포핵의 형태 관찰

1-2-1. 세포성장 변화

상기 실시예 1 및 비교예 1의 제조방법으로 수득된 BE 및 NE 추출물의 세포성장에 대한 영향을 살펴보기 위해 문헌 (Kawada K. et al., Acta Med . Okayama, 56, pp.129-134, 2002)에 기재된 MTT 분석 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

상기 참고예 3의 방법으로 배양된 U937 세포를 세포 배양용 100 mm 페트리 디쉬(petri dishes)에 5 × 10⁴개/ml 세포를 각 웰(well)에 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 이후 BE 또는 NE 추출물을 각각 단독 처리(500 μg/ml) 또는 PMA(40 nM) 전처리 후 BE 또는 NE 추출물을 각각 혼합 처리(500 μg/ml)하여 6시간 동안 배양한 다음, 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 세포 형태의 변화를 관찰하였다.

실험결과, 도 3에 나타난 바와 같이, BE 또는 NE 추출물을 각각 단독 처리(500 μg/ml) 또는 PMA(40 nM) 전처리 후 BE 또는 NE 추출물을 각각 혼합 처리하였을 때, 세포의 밀도 변화 및 세포독성에 의한 세포사멸의 지표인 다양한 형태적 변화가 동반되지 않아 세포의 밀도와 형태적 변화에 따른 생존율 감소와 증식에는 아무런 영향이 없음을 확인할 수 있었다.

1-2-2. 세포핵의 형태 관찰

상기 실시예 1 및 비교예 1의 제조방법으로 수득된 BE 및 NE 추출물의 세포핵의 형태에 대한 영향을 살펴보기 위해 문헌 (Moon et al., Biochemical pharmacology, 76, pp.312-321, 2008)에 기재된 핵 염색 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

상기 실험예 1-2-1에서와 동일한 방법으로 배양 및 처리된 각각의 U937 세포에 37% 포름알데하이드(formaldehyde) 용액과 포스페이트 완충용액(Phosphate buffered saline; PBS)을 1 : 9의 비율로 섞은 고정액(fixing solution)을 이용하 여 상온에서 10분 동안 고정하였다. 이를 1,000 rpm에서 5분간 싸이토스핀(cytospin, Shandon사)을 이용하여 슬라이드 글라스(slide glass) 위에 부착시킨 후 0.2%의 트리톤 엑스-100(Triton X-100, Amresco)을 첨가하여 상온에서 10분간 고정하였다. 그 후 다시 PBS로 수세하고 세포가 고정된 슬라이드 글라스 위에 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI, Sigma) 용액의 적당량을 떨어뜨린 후 빛을 차단하고 상온에 약 15분간 방치하여 염색시켰다. 이후 PBS로 DAPI 용액을 충분히 세척하고 증류수로 재빨리 세척한 다음, 무수 알콜 (absolute alcohol)을 이용하여 탈수과정을 거친 슬라이드 글라스 위에 마운팅 용액 (mounting solution)을 처리한 후 형광 현미경 (fluorescent microscope, Carl Zeiss)을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 세포 핵의 형태 변화를 관찰하였다.

실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이, BE 또는 NE 추출물을 각각 단독 처리 (500 μg/ml) 또는 PMA (40 nM) 전처리 후 BE 또는 NE 추출물을 각각 혼합 처리 (500 μg/ml) 하였을 때 세포핵의 형태 변화가 동반되지 않아, 세포핵의 형태적 변화에 따른 생존율 감소와 증식에는 아무런 영향이 없음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. Prostaglandin E ₂ ( PGE ₂ )의 생성량 측정

상기 실시예 1 및 비교예 1의 제조방법으로 수득된 BE 및 NE 추출물의 PGE₂ 생성량에 대한 영향을 측정하기 위해 PGE₂ EIA(Prostaglandin E₂ enzyme- immunoassay) kit(Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

상기 참고예 3의 방법으로 배양된 U937 세포의 배지에 BE 또는 NE 추출물을 500 μg/ml 농도로 1시간 동안 전 처리한 후, PMA를 40 nM로 6시간 동안 처리하였다. 이후 세포 배양액을 goat anti-mouse로 코팅 (coating)된 96웰 플레이트에 각각의 배양액을 100 ㎕씩 주입(loading)하였다. 여기에 mouse anti-PGE₂ antibody와 peroxidase-conjugated PGE₂를 각 웰에 가한 후, 실온에서 교반시키며 방시시켰다. 각 웰에 담긴 배지를 버리고 세척 완충용액(washing buffer)으로 4회 세척하고 3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine/hydrogen peroxide 용액을 가하고 실온에서 30분간 방치한 후 H₂SO₄를 가해 반응을 정지시켰다. 엘리자 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과, 도 5에 나타난 바와 같이, U937 세포에서 BE 또는 NE 추출물의 처리는 PMA에 의해 유도된 PGE₂ 생성을 현저하게 억제하였다. 즉, U937 세포에서 PMA (40 nM)의 단독 처리는 아무 처리도 하지 않은 대조군에 비해 PGE₂ 생성량이 약 8배 증가되었으나, BE 또는 NE 추출물을 500 μg/ml로 전 처리한 후 PMA (40 nM)를 혼합 처리 시에는 PMA-유도된 PGE₂의 생성이 매우 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있었으며, BE (500 μg/ml) 또는 NE (500 μg/ml) 추출물의 단독 처리는 PGE₂ 생성에 큰 영향이 없음을 알 수 있었다. 또한 마늘 추출물 처리에 의한 PGE₂ 생성의 저해 효과는 NE 추출물도 우수하였지만 BE 추출물이 PGE₂ 생성 저해 효과가 더 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 3. iNOS , COX -1 및 COX -2의 발현 분석

3-1. PMA 에 의한 iNOS , COX -1 및 COX -2의 발현 변화

PMA 처리에 의한 COX-2 단백질의 발현 변화를 측정하기 위해, 문헌 (Moon D.O. et al., International Immunopharmacology, 7, pp.506-514, 2007)에 기재되어 있는 방법을 이용하여 단백질 정량 및 웨스턴 블롯 분석을 하기와 같이 수행하였다.

상기 참고예 3의 방법대로 배양된 U937 세포에 PMA를 농도별(0, 20, 40, 60, 80, 100 nM) 또는 시간별(0, 0.5, 1, 2, 4, 6 시간)로 처리한 후, 세포들을 모아서 100㎕의 라이시스 완충 용액(lysis buffer: 25 mM Tris-Cl, pH 7.5, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT))을 첨가하여 4 ^oC에서 1시간 동안 반응시킨 후, 14,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 단백질 농도는 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 Bradford protein assay kit를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 동량의 시약(Laemmli sample buffer, Bio-Rad)을 섞어서 샘플(sample)을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(sodium dodecyl sulphate(SDS)-polyacrylamide gel)을 이 용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 아크릴아미드 겔을 니트로셀룰로오즈 멤브레인(nitrocellulose membrane, Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시킨 후, 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위하여 블로킹 용액 (blocking buffer: 5% skim milk를 함유한 PBS-T(0.1% Tween 20을 함유한 PBS))에 담구어 상온에서 약 1시간 동안 반응시킨 후, PBS-T로 15분정도 세척하였다. 준비된 멤브레인에 1차 항체(anti-iNOS, anti-COX1 및 anti-COX2)를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 4^oC에서 over night 시킨 다음 PBS-T로 세척한 다음, 2차 항체 (peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin)를 사용하여 상온에서 약 1시간 동안 반응시켰다. 다시 PBS-T로 세척하고 enhanced chemiluminescence(ECL) 용액(Amersham Life Science Corp, Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 암실에서 엑스레이 필름(X-ray film)에 감광시켜 단백질의 양을 분석하였다.

실험결과, 도 6에 나타난 바와 같이, PMA를 농도별로 6시간 처리했을 때, COX-2 단백질의 발현은 대조군에 비해 현저히 증가됨을 확인할 수 있었으나, iNOS 또는 COX-1의 발현은 대조군과 비교하여 큰 변화가 없었다. PMA 농도를 40 nM로 고정하고 처리 시간의 증가에 따라서 COX-2의 발현변화에 대하여 조사해 본 결과, iNOS나 COX-1의 발현은 PMA 처리 시간의 증가에 의해서도 큰 변화가 없었으나, COX-2의 발현은 PMA 처리 후 2시간부터 6시간까지 지속적인 증가를 확인할 수 있었다. 이로써, U937 세포에 PMA를 처리했을 때 염증발현조절에 큰 작용을 하는 COX-2 가 현저히 증가되는 반면, iNOS 혹은 COX-1의 발현은 큰 변화가 없음을 확인하여, iNOS 혹은 COX-1는 U937 세포에 있어 PMA에 의한 증식과는 아무런 연관성이 없음을 확인할 수 있었다.

3-2. BE 및 NE 추출물에 의한 PMA -유도된 COX -2의 발현 변화

BE 및 NE 추출물의 처리에 의한 PMA-유도된 COX-2의 발현 변화를 전사 및 번역 수준에서 살펴보기 위해, 전사수준의 발현 변화는 상기 실험예 3-1에 기재되어 있는 단백질 분석법과 동일하게 수행하였으며, 번역수준의 발현 변화는 문헌 (Lee J.H. et al., Pharmacological Research, 51, pp.553-560, 2005)에 기재되어 있는 방법을 이용하여 역전사중합효소연쇄반응 (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 하기와 같이 수행하였다.

상기 참고예 3의 방법으로 배양된 U937 세포에 BE 또는 NE 추출물을 500 μg/ml로 1시간 동안 전 처리한 후 PMA 40 nM을 추가적으로 1시간 처리하였으며, PMA 40 nM를 처리하지 않은 대조군과 비교하였다. 전사수준의 발현 변화를 측정하기 위해 세포들을 모아 상기 실험예 3-1의 단백질 분석법과 동일하게 수행하였다. 번역수준의 발현 변화를 측정하기위해 M-MLV reverse transcriptase(Gibco-BRL)를 사용하여 2g의 총 RNA로부터 Single-strand cDNA를 합성한 후 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)에 의해 mRNA를 증폭시켰다.

실험결과, 도 7에 나타난 바와 같이, BE 및 NE 추출물의 단독처리는 COX-2의 전사 및 번역 수준의 발현 즉, COX-2 mRNA 및 COX-2 단백질 발현의 변화는 대조군 에 비하여 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이에 반해 PMA를 단독 처리한 경우 COX-2의 발현이 전사 및 번역 수준 모두에서 약 8배로 현저히 증가되었다. 그러나 BE 및 NE 추출물을 전처리한 경우 PMA에 의한 COX-2의 전사수준의 발현이 현저하게 억제되었으며, 특히 NE 추출물보다 BE 추출물에서 COX-2의 전사수준의 발현 차단 효과가 더 높게 확인되었다. 또한 BE 및 NE 추출물을 전처리시 PMA에 의한 COX-2의 번역수준의 발현이 전사수준과 유사하게 번역 수준에서도 매우 억제되었으며 NE 추출물보다 BE 추출물에서 발현차단 효과가 높게 나타났다. 이로부터 BE 및 NE 추출물에 의한 COX-2의 발현 저해가 전사 수준에서 이루어지고 있으며, NE 추출물과 비교하여 BE 추출물의 COX-2의 발현 저해 효능이 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 4. Egr -1, NF _K B 및 I _K B 의 발현 분석

4-1. PMA 에 의한 Egr -1, NF _K B 및 I _K B 의 발현 변화

PMA에 의한 Egr-1, NF_KB 및 I_KB 단백질의 발현 변화를 측정하기 위해, 상기 실험예 3-1에 기재된 단백질 분석법과 동일한 방법으로 수행하였으며, 각 단백질의 해당하는 항체만을 달리하였다(1차 항체: anti-Egr-1, anti-NFkB, anti-IkB, 2차 항체: peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin).

상기 참고예 3의 방법으로 배양된 U937 세포에 PMA를 농도별(0, 20, 40, 60, 80, 100 nM) 또는 시간별(0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 시간)로 처리한 후, 세포들을 모 아서 상기 실험예 3-1에 기재된 단백질 분석법과 동일한 방법으로 Egr-1, NF_KB 및 I_KB 단백질의 양을 분석하였다.

실험결과, 도 8에 나타난 바와 같이, Egr-1 단백질 발현이 PMA 처리 후 30 분 이내에 현저하게 증가되었으며, 이는 PMA 처리 농도에 비례적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한 NF_KB 단백질은 PMA 처리 1시간 전후에 세포질로부터 핵 속으로 이동하는 것을 확인할 수 있었으며, NF_KB 단백질의 핵 내 이동에 따라 세포질의 I_KB 단백질의 분해가 매우 빠르게 일어나고 있음을 알 수 있었다.

4-2. BE 및 NE 추출물에 의한 PMA -유도된 Egr -1, NF _K B 및 I _K B 의 발현 변화

BE 및 NE 추출물에 의한 PMA-유도된 Egr-1, NF_KB 및 I_KB 단백질의 발현 변화를 측정하기위해, 상기 실험예 3-1에 기재된 단백질 분석법과 동일한 방법으로 수행하였다.

상기 참고예 3의 방법으로 배양된 U937 세포에 BE 또는 NE 추출물을 500 μg/ml로 1시간 동안 전처리 한 후 PMA 40 nM을 추가적으로 1시간 처리하였으며, PMA 40 nM를 처리하지 않은 대조군과 비교하였다.

실험결과, 도 9에 나타난 바와 같이, BE 및 NE 추출물을 전처리했을 경우 PMA에 의한 세포질 내 I_KB 단백질의 빠른 분해가 억제되었으며, PMA에 의한 핵 내로 의 NF_KB 전이도 매우 유의적으로 억제되었음을 알 수 있었다. 이러한 PMA에 의한 NF_KB의 활성 억제는 NE 추출물에서도 어느 정도 효과가 있었으나 NE 추출물과 비교하여 BE 추출물의 효능이 우수함을 확인할 수 있었다. 그러나 BE 및 NE 추출물의 전처리에 의해 PMA-유도된 Egr-1의 발현 증가에는 큰 변화가 없었다. 이로부터 PMA에 의한 COX-2 발현 증가와 연관된 PGE₂ 생성의 증가를 억제하는 HE 및 NE 추출물의 효과는 Egr-1의 발현 조절과는 상관없이 NF_KB 활성 저해에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 흑마늘 추출물(BE)을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 조제

BE 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 조제한다.

제제예 2. 정제의 제조

BE 추출물 10 mg

옥수수 전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

BE 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

BE 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

BE 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적정량

통상 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강기능식품의 제조

BE 추출물 1000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

BE 추출물 1000 mg

구연산 1000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수 전체 900 ml

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 MTT assay에 의한 흑마늘 추출물(BE)의 세포증식에 미치는 효과를 측정한 도이고,

도 2는 PMA 처리 후, MTT assay에 의한 흑마늘 추출물(BE)의 세포증식에 미치는 효과를 측정한 도이며,

도 3은 흑마늘 추출물(BE)이 세포밀도 및 세포의 형태적 변화에 미치는 효과를 측정한 도이고며),

도 4는 흑마늘 추출물(BE)이 세포핵의 형태적 변화에 미치는 효과를 측정한 도이며며,

도 5는 흑마늘 추출물(BE)이 PMA-유도된 PEG₂ 생성량에 미치는 효과를 측정한 도이고,

도 6은 PMA의 농도 및 처리시간에 따른 iNOS, COX-1 및 COX-2 발현에 미치는 효과를 측정한 도이며,

도 7은 흑마늘 추출물(BE)의 PMA-유도된 COX-1 및 COX-2의 전사 및 번역 수준의 발현에 미치는 효과를 측정한 도이고,

도 8은 PMA의 농도 및 처리시간에 따른 Egr-1, NF_kB 및 I_kB의 발현에 미치는 효과를 측정한 도이며,

도 9는 흑마늘 추출물(BE)의 PMA-유도된 Egr-1, NF_kB 및 I_kB의 발현에 미치는 효과를 측정한 도이다.

Claims

흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 흑마늘은 생마늘을 1차 열풍 숙성, 자연건조 및 2차 열풍 건조하는 가공공정을 통하여 수득됨을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 흑마늘은 생마늘을 10 내지 120℃에서 150 내지 500시간 동안 열풍으로 1차 숙성하는 제 1단계; 상기 단계에서 숙성된 마늘을 10 내지 60시간 동안 자연 건조하는 제 2단계; 상기 건조 마늘을 다시 10 내지 50℃의 온도의 열풍으로 10 내지 100시간 동안 숙성하는 2차 숙성 단계를 포함하는 제 3단계 공정을 통하여 수득한 흑색의 가공 마늘임을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출됨을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 동맥경화증, 결막염, 아토피, 관절염, 비염, 궤양성 대장염, 고혈압, 당뇨병, 암 또는 천식임을 특징으로 하는 약학조성물.
흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 6항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제 또는 음료인 건강기능식품.