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WO2005019437A1 - 脂質生産菌の育種方法 - Google Patents

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Publication number
WO2005019437A1
WO2005019437A1 PCT/JP2004/012021 JP2004012021W WO2005019437A1 WO 2005019437 A1 WO2005019437 A1 WO 2005019437A1 JP 2004012021 W JP2004012021 W JP 2004012021W WO 2005019437 A1 WO2005019437 A1 WO 2005019437A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
lipid
strain
breeding
mortierella
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/012021
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Misa Ochiai
Hiroshi Kawashima
Sakayu Shimizu
Original Assignee
Suntory Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Limited filed Critical Suntory Limited
Priority to EP04771982A priority Critical patent/EP1666584B1/en
Priority to CA2536606A priority patent/CA2536606C/en
Priority to DE602004030807T priority patent/DE602004030807D1/de
Priority to JP2005513313A priority patent/JP4537319B2/ja
Priority to US10/569,103 priority patent/US20070072275A1/en
Priority to AT04771982T priority patent/ATE493489T1/de
Priority to DK04771982.8T priority patent/DK1666584T3/da
Priority to BRPI0413830-9A priority patent/BRPI0413830A/pt
Priority to KR1020067003636A priority patent/KR101187081B1/ko
Priority to MXPA06002074A priority patent/MXPA06002074A/es
Priority to AU2004267294A priority patent/AU2004267294B2/en
Publication of WO2005019437A1 publication Critical patent/WO2005019437A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/03—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil

Definitions

  • the present invention relates to a method for breeding a lipid-producing bacterium, and in particular, to Mortierella (
  • the present invention relates to a method for breeding by transformation without selection using an antibiotic in a lipid-producing bacterium belonging to the genus Mortierella.
  • lipid-producing bacteria having the ability to produce lipids in large quantities by metabolism.
  • Representative lipid-producing bacteria include fungi of the genus Mortierella, such as Mortierella alpina. Fungi of the genus Mortierella are known to produce highly unsaturated fatty acids (PUFAs), including arachidonic acid, and are particularly useful industrially (see, for example, Japanese Patent Publication No. Date: April 19, 1995, Published gazette: Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-444891, and published: Shoga-b, February 25, 1988).
  • PUFAs highly unsaturated fatty acids
  • breeding that is, improvement of genetic properties of useful organisms to more desirable properties (breeding) is required.
  • breeding is very important from the viewpoint of improving the production efficiency of compounds by microorganisms and reducing the production cost of the compounds.
  • the breeding method basically includes a step of creating a population containing a genetic variation (referred to as a population creation step for convenience) and a step of selecting varieties exhibiting more desirable properties from the population (selection for convenience).
  • a population creation step for convenience a genetic variation
  • selection for convenience a step of selecting varieties exhibiting more desirable properties from the population.
  • Process Various methods can be used depending on the type of useful organisms to be bred in both the population production process and the selection process. However, in the above-mentioned microorganisms such as lipid-producing bacteria, in the population production process, (1) a method using mutation treatment is mainly used. And (2) a method by transformation.
  • Mutation treatment method In the case of performing the population creation process by mutation treatment, many kinds of mutations are generated at random S, the ability to create a population by causing mutations in microorganisms by various methods. Therefore, even if a variety (strain) exhibiting the target trait could be obtained in the subsequent selection process, there is no possibility that unexpected damage has occurred to other genes other than the gene related to the target trait. Absent. For example, in the case of the above-mentioned lipid-producing bacteria, even if the type of lipid produced changes, the ability to grow and sporulate may deteriorate. Therefore, it is not always possible to obtain highly productive strains in the population production process by mutation processing.
  • a transformant is obtained by introducing (transformation) a DNA fragment necessary for obtaining desired properties using a useful organism to be bred as a host.
  • a population of In other words, a population will be created in which the expression of only a specific gene is regulated according to the purpose. Therefore, in the subsequent selection step, only the more desirable varieties (strains) need to be selected from the obtained transformants. It is also possible to avoid the occurrence of damage. Therefore, the labor required for breeding can be significantly reduced.
  • a method based on transformation is preferably used. For example, many techniques have been reported on a method for transforming a filamentous fungus to which Mortierella fungi belong.
  • references 1 to 3 listed below include Aspergillus nidulans and Neurospora crassa
  • a technique for transforming such a filamentous fungus by a particle delivery method has been disclosed.
  • a diacil-requiring strain is used as a host strain to be transformed, and a gene complementary thereto is used as a marker gene, and a transformed strain is selected.
  • a technique disclosed in the following Reference 4 is known.
  • spores are transformed into protoplasts, and genes are introduced into cells by electoporation.
  • a hygromycin B resistance gene (hpt) derived from Escherichia coli was used as a marker gene.
  • hpt hygromycin B resistance gene
  • the filamentous fungus such as A. nidulans or N. crassa to be transformed has a lipid-producing ability. Therefore, it is not suitable for industrial production of lipids such as PUFA.
  • the technique disclosed in the above (b) Document 4 is a technique for transforming M. alpina, which is known as an oil-producing bacterium that can be used industrially. Therefore, it is considered to be industrially superior to the technique (a).
  • Mortierella fungi represented by M. alpina are not hygromycin-sensitive. Therefore, when breeding is performed using this technique, hygromycin resistance cannot be used as a marker if the host organism of Mortierella is hygromycin resistant.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and its object is to use antibiotics. Another object of the present invention is to provide a breeding method capable of effectively and efficiently breeding lipid-producing bacteria belonging to the genus Mortierella.
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems, and as a result, obtained an auxotrophic strain of Mortierella spp., A lipid-producing bacterium, and transformed it with a gene complementary thereto as a marker gene. If a system can be established, efficient and effective transformation can be achieved in all strains of the genus Mortierella, and if this system is used, senorefle cloning will be possible, and breeding will be more efficient. The present inventors have found that the present invention can be effectively performed, and have completed the present invention.
  • the method for breeding lipid-producing bacteria according to the present invention is a method for breeding lipid-producing bacteria belonging to the genus Mortierella, using the auxotrophic strain of the lipid-producing bacteria as a host, A gene transfer step in which the marker gene is introduced into a host by using a gene complementary to the auxotrophy as a force gene, and a selection step in which a transformant is selected by using the recovery of the auxotrophy of the host as a marker. And a transformation step comprising the steps of:
  • the lipid-producing bacterium is Mortierella alpina (
  • auxotrophic strain which is preferably Mortierella alpina), monoretierella hygrophila or Mortierella chlamydospora, is more preferably a perillacil-requiring strain.
  • an orotidine-15'-phosphate decarboxylase gene or an orotidylate pyrophosphorylase gene is used.
  • an elect-portation method or a particle delivery method can be used in the gene introduction step.
  • the breeding method may further include an auxotrophic strain obtaining step of obtaining an auxotrophic strain from the original lipid-producing bacterium.
  • a transformation step using an auxotrophy as a marker is performed as a step of creating a population containing genetic variation in breeding (population creation step). Specifically, an auxotrophic strain of Mortierella spp., which is a lipid-producing bacterium, is obtained, and a gene that complements the auxotrophy is introduced (transformed) using this strain as a host. Thereafter, a transformed strain is selected from the above population using the recovery of the auxotrophy of the host as a marker.
  • the fungus of the genus Mortierella which is the subject of the present invention may be any of the above two subgenus.
  • M. alpina M. alpina
  • M. elongata M. exigua
  • M. exigua M. exigua
  • M. isabelina M. Turncola
  • M. gamsn M. cogitans
  • M. capitata M. vinacea
  • M. chlamydospora etc.
  • M. alpina M. alpina
  • M. alpina a strain that accumulates PUFAs such as arachidonic acid (ARA) in cells is known, and is widely used not only for research on PUFA biosynthesis but also for industrial use for PUFA production. ing.
  • ARA arachidonic acid
  • Mortierella fungi including the above M. alpina is not particularly limited, and may be obtained from microbial depositories such as the Fermentation Research Institute and the ATCC (American Type Culture Collection). Just fine. Alternatively, in the case of a strain for which a patent application has been filed, obtain it from the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Can do. An unknown strain belonging to the genus Mortierella may be obtained from a natural environment by a known screening method and used.
  • the breeding method according to the present invention may be any method that includes a transformation step using transformation in the above-described population production step, and more preferably includes an auxotrophic strain acquisition step.
  • a transformation step using transformation in the above-described population production step and more preferably includes an auxotrophic strain acquisition step.
  • other steps may be included.
  • each step will be described in detail.
  • the step of obtaining an auxotrophic strain is not particularly limited as long as it is a step of obtaining an auxotrophic strain (auxotrophic mutant) from the original species of Mortierella spp.
  • auxotrophic strain auxotrophic mutant
  • known techniques can be used.
  • a gene relating to auxotrophy is clear (for example, in the case of whole genome decoding), since auxotrophic strains can be easily obtained by crushing the gene.
  • the specific type of the auxotrophic strain is not particularly limited, for example, an amino acid auxotroph such as leucine, histidine, methionine, arginine, tryptophan, lysine; a nucleobase requirement such as peracyl or adenine. Auxotrophs; vitamin auxotrophs; and the like.
  • a Perinole auxotroph strain is used. ⁇
  • the bacterium of the genus Mortierella has the advantage that screening can be carried out using the positive selection of 5-fluoroorotic acid (5-FOA) resistance as a marker.
  • auxinile auxotrophy if screening is performed using the above-mentioned 5-FOA, a strain of auxin auxotrophy having a mutation in the URA3 gene or URA5 gene can be obtained.
  • a lysine auxotroph if screening is performed using aminoadipic acid, a lysine auxotrophy having a mutation in the LYS2 gene or LYS5 gene can be obtained.
  • an auxotrophic strain with a limited mutant gene it can be used in the subsequent transformation step. It is preferable because the marker gene to be used can be clearly specified.
  • the transformation step is a step in which transformation is used in the step of producing a population in breeding, and is a step that goes through at least two steps: a gene introduction step and a selection step. Of course, steps other than these may be performed as needed.
  • an auxotrophic strain of a fungus (lipid-producing bacterium) of the genus Mortierella is used as a host, and a gene complementary to the auxotrophy is used as a marker gene.
  • a gene complementary to the auxotrophy is used as a marker gene.
  • the marker gene is not particularly limited as long as it is a gene that complements a mutation in an auxotrophic strain (auxotrophic mutation).
  • auxotrophic mutation Specifically, for example, leu2 gene for leucine auxotrophs, his3 gene for histidine auxotrophs, lys2 gene for lysine auxotrophy, trp for tributophan auxotrophs
  • the ura3 gene or ura5 gene can be mentioned, and in the case of the adenine-requiring strain, the ade2 gene can be mentioned.
  • a host is a peracil-requiring strain, and a ura5 gene is used as a marker gene.
  • the method for obtaining each of the above marker genes is not particularly limited, and may be obtained from a heterogeneous (micro) organism such as yeast using a known method, or a commercially available marker gene may be used. You can. Further, in the present invention, since self-cloning is possible, a marker gene may be obtained from a bacterium of the genus Mortierella which is a host. For example, in the examples described below, the host ura5 gene is obtained using the base sequence of the ura5 gene in three types of yeast.
  • the gene transfer method (transformation method) used in the gene transfer step is not particularly limited, and a conventionally known method such as an elect-portion method or a particle delivery method can be suitably used.
  • a conventionally known method such as an elect-portion method or a particle delivery method
  • the cells be protoplasted.
  • a particle gun method may be mentioned. The power you can do Of course, it is not limited to this.
  • the marker gene may be introduced into a bacterium of the genus Mortierella so that it can be expressed, and thus the specific configuration is not limited.
  • an expression cassette comprising at least a promoter connected thereto is constructed, and further, a gene construct in which a region to be recombined with a chromosome (referred to as a recombination region) is connected to the expression cassette. Therefore, the above-mentioned gene construct may be introduced into a vector and then introduced into the above-mentioned host, or the above-mentioned gene construct may be introduced as it is.
  • the expression cassette of the marker gene contained in the above-mentioned gene construct may have a configuration in which at least a promoter is connected upstream of the marker gene, but may have a structure in which a terminator is connected downstream of the marker gene. Preferably, there is.
  • a multicloning site may be included in the gene construct so that an expression cassette for expressing various genes can be introduced.
  • the gene construct may contain an expression cassette (promoter, marker gene, terminator) of the marker gene, a recombination region, or a DNA fragment other than a multiple cloning site.
  • a more specific configuration is not particularly limited.
  • each of the above DNA fragments is not particularly limited.
  • a known promoter is not particularly limited as long as it can effectively express a marker gene, and a known promoter can be suitably used.
  • the hisH4.1 promoter is used, but the present invention is not limited to this.
  • the terminator is not particularly limited as long as it has a function as a transcription termination site, and may be any known terminator. In the embodiment described later, the trpC terminator is used, but is not limited to this.
  • the DNA segment is not particularly limited as long as it is a DNA segment that allows the marker gene to be introduced into the bacterium of Mortierella to be integrated and present in the chromosome.
  • 18S ribosomal DNA (18Sr) is used.
  • the case where the above gene construct is incorporated into a vector to form an expression vector is not particularly limited. What is necessary is just to be a general recombinant expression vector that cannot be used. Plasmids, phages, cosmids, and the like can be used for producing the recombinant expression vector, but are not particularly limited. In addition, a known method may be used as a manufacturing method. Usually, a plasmid can be preferably used.
  • the selection step in the transformation step is not particularly limited as long as it is a step of selecting a transformed strain using the recovery of the auxotrophy of the host as a marker, and any known method can be suitably used. That is, a specific nutrient is removed from the synthetic medium based on the auxotrophy as a marker, and the transformant obtained after the above-described gene transfer step may be cultured in the synthetic medium. Thereby, the transformant can be easily and efficiently screened.
  • auxotrophy is used as a marker in the transformation step.
  • the auxotrophic marker has advantages such as simplicity of operation, low background, and availability of a gene derived from a host of Mortierella. It also has advantages such as being more convenient for food development as compared with the case where antibiotic resistance is used as a marker.
  • the auxotrophy is a ⁇ racil auxotroph
  • a gene that complements the auxotrophy such as the ura5 gene can be obtained. It is possible to produce lipids while selecting the cells into which is introduced.
  • using auxotrophy as a marker has the advantage that contamination with ino and idaromycin can be avoided and that cultivation with selection is always possible. Therefore, it is more preferable to use an auxotrophic marker as in the present invention.
  • ⁇ Selection process> In the method for breeding lipid-producing bacteria according to the present invention, it is possible to obtain a population of strains having various properties by introducing various genes using the auxotrophy as a marker in the transformation step. Therefore, in the present invention, after the above-mentioned transformation step, a selection step of selecting a variety having more desirable properties from the obtained population may be carried out.
  • the “selection step” referred to here is different from the “selection step” in the above-mentioned transformation step, and is not performed by selecting a transformant using auxotrophy as a marker. Refers to the step of selecting a transformant showing more preferable properties.
  • the specific method of the selection step is not particularly limited, and conditions are set such that a transformant having favorable properties can be selected according to the purpose of breeding. If you prefer, select a transformed strain.
  • the method for breeding lipid-producing bacteria uses auxotrophy as a marker to select (screen) varieties exhibiting more desirable properties from a population containing genetic mutations. . Therefore, it is possible to efficiently and effectively produce a new variety (new strain) using a lipid-producing bacterium belonging to the genus Mortierella as an original species.
  • Bacteria of the genus Mortierella are well known as lipid-producing bacteria and include highly reliable bacteria such as M. alpina.For example, strains with even higher lipid productivity can be easily and efficiently produced. It will be possible to produce it properly.
  • an appropriate DNA fragment for example, a gene to be introduced
  • an appropriate DNA fragment may be a DNA fragment capable of realizing more desirable properties or a property capable of realizing such properties in a host Mortierella bacterium.
  • the DNA fragment is not particularly limited as long as it has a DNA fragment.
  • this DNA fragment is constructed so that an expression cassette is constructed by linking at least a promoter and preferably a terminator, and then inserted into the recombinant expression vector. Good, but not limited to this.
  • the GLELO gene is used as the DNA fragment, but the present invention is not limited to this.
  • Czapek-Dox medium 3% sucrose, 0.2% NaNO, 0.1% KH P ⁇ , 0.05% KC1, 0.05% MgSO-7H, 0.001% FeSO
  • the mutated spores were adjusted to a GY medium (2. /. Glucose, 1. /. Yeast extract, 2% agar, pH 6.0) containing 1. Omg / ml 5-FOA and 0.05 mg Zml peracil. ) And cultured at 28 ° C for 4 days to obtain 6 5-FOA resistant strains. These strains were evaluated for Peracinole requirement.
  • SC medium yeast Nitrogen Base w / o Amino Acids and Ammonium Sulfate 5.0 g, ( ⁇ ) SO 1.7 g, gnorecose 20 g, agar 20 g, adenine 20 mg, (Difco)
  • Tyrosine 30 mg methionine 1.Omg, anoreginin 2.Omg, histidine 2.Omg, lysine 4Omg, tryptophan 4.Omg, threonine 5.Omg, isoleucine 6.Omg, leucine 6.Omg, phenylalanine 6.Omg / Liters) and growth in SC medium supplemented with Peracil (Peracil 50 mgZ liter).
  • orotidine mono-5'-phosphate decarboxylase encoded by the ura3 gene and abbreviated as ura3p
  • orotidylate pyrophosphorylase encoded by the ura5 gene
  • the enzyme is abbreviated as ura5p). Therefore, the enzyme activities of the above A ura-l strain and A ura-2 strain were measured.
  • Each strain was cultured in a GY medium supplemented with Peracil at 28 ° C for 4 days with shaking. Preparation of a cell-free extract of cells was performed according to the method of Wynn et al. (JP P. Wynn et al. Microbiology, 146,
  • the cells cultured in a GY liquid medium containing 0.05 mg / ml of peracil at 28 ° C for 4 days were suspended in 0.1 M Tris buffer ( ⁇ 7.5) containing 5 mM i3-mercaptoethanol. did. Thereafter, the cells were crushed at 35 MPa using a French press and centrifuged. The obtained supernatant was used as a cell-free extract. Further, ultracentrifugation was performed at 100,000 X g for 60 min to remove the Onoreganella, thereby obtaining a soluble fraction.
  • ura3p activity was measured according to the method of Yoshimoto et al. (A. Yoshimoto et al. Methods in Enzymology Vol 51, 74-79, ACADEMIC PRESS 1978).
  • ura5p activity was measured according to the method of Umezu et al. (K. Umezu et al. J. Biochem., 70, 249-262, 1971).
  • Table 1 shows the results, that is, comparisons of enzyme activities related to pyrimidine biosynthesis. As is evident from the results in Table 1, both of these two strains exhibited the same activity of ura3p as the parent strain, whereas ura5 No P activity was detected.
  • M. alpina and a peracil-requiring strain (the A ura-l and A ura-2 strains above) derived from the wild type were cultured in GY liquid medium at 28 ° C for 5 days, respectively.
  • Genomic DNA was prepared from the cells according to the method of Sakuradani et al. (E. Sakuradani et al. Eur. J. Biochem "260, 208-216, 1999).
  • spores of P. alpina were inoculated in a liquid medium (2% glucose, 1% yeast extract, adjusted to pH 6.0) and cultured at 28 ° C for 4 days.
  • the cells were collected and total RNA was prepared by the guanidine hydrochloride / CsCl method. Purify mRNA from total RNA using ligotex_dT30-ku Super> mRNA Purification Kit (From Total RNA) (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.), ZAP-cDNA Synhesis Kit (trade name, manufactured by STRATAGENE) was used to prepare a cDNA library.
  • Region 1 FGPAYKGIP (see SEQ ID NO: 1)
  • Sense primer 5'-TTYGGHCCIGCITAYAARGGHATYCC-3, (SEQ ID NO: 3)
  • Antisense primer 5, -CCCTCDCCRTGRTCYTTIGCYTCYTT-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • PCR was performed using T. Gradient Thermocycler (trade name, manufactured by Biometra) using the genomic DNA of M. alpina as type II and Ex Taq polymerase (manufactured by Takara Bio) with the above two primers.
  • the PCR conditions at this time are 94. The conditions were such that lmin at C, lmin at 52 ° C, and 2min at 72 ° C were defined as one cycle, and 35 min after the first cycle, the lOmin was extended at 72 ° C.
  • the cDNA of the ura5 gene has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and ura5p encoded by the ura5 gene has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • Primer CRON1 CTTCTCTTCAGCCCCCAGCCGCATCGGTCC (Distributor No. 7; primer)
  • CRON2 GAGTCCACGAAAACTGCTGATGAGCAGCAC (SEQ ID NO: 8) was synthesized, and genomic DNA of M. alpina was type III, and ura5 genomic DNA was cloned by PCR.
  • the PCR conditions at this time are 94. Lmin at C, 55. The conditions were such that lmin at C and 2 min at 72 ° C were defined as one cycle, and 30 min after which the lOmin was extended at 72 ° C. As a result, it was revealed that there was no intron on the ura5 genomic gene.
  • PCR was performed using the above primers CRON1 and CRON2, and genomic DNA of Aura-1 and Aura-2 strains, which are auxotrophs, respectively.
  • the ura5 genomic gene was cloned.
  • PCR condition at this time was set to conditions for 10 min extension at 94 ° C at lmin, 55 0 C lmin, and 2min at 72 0 C after 30 Saikunore as 1 Saikunore at 72 0 C.
  • one adenine was inserted at the 93rd base counted from the start codon, and a frame shift occurred in the ⁇ RF.
  • Plasmid pD4 (available from DB Archer, see Reference 4) was digested with restriction enzymes Ncol and BamHI, and the ends were smoothed using DNA Blunting Kit (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.). Except for the hpt m ° d fragment, which is a resistance gene, the 5.4 kbp DNA fragment was purified using GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (trade name, manufactured by Amersham Biosciences). The above PBMAURA5 obtained in (4) was digested with restriction enzymes EcoRI and Xhol, the ends were blunted, and then a fragment of about 0.65 kbp containing ura5 cDNA was purified.
  • SC agar medium was used as a selective medium for the transformants.
  • Spores 1 0 8 A ura-l strain as a host was applied to the SC agar medium.
  • the above pDura5 was introduced (transformed) into the host by the particle delivery method.
  • Gene transfer using the PDS-1000 / He particle delivery system (trade name, manufactured by BIO RAD) is performed under the following conditions: helium pressure: 7590 kPa (1100 psi), vacuum inside the chamber: 28 inches Hg, distance to target 3 cm, tungsten particle diameter 1 Performed under the condition of 1 ⁇ m.
  • the cells were cultured at 28 ° C for 23 days. As a result, four colonies grew and were obtained as transformants. For convenience, numbers # 1 to # 4 were assigned to these transformed strains.
  • Primer RDNA1 ACAGGTACACTTGTTTAGAG (SEQ ID NO: 9)
  • Primer RDNA2 CGCTGCGTTCTTCATCGATG (SEQ ID NO: 10)
  • PCR was performed using Ex Taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). The PCR conditions were as follows: lmin at 94 ° C, lmin at 54 ° C, and lmin at 72 ° C. C was used to extend lOmin. In this connection, the control was confirmed by PCR in the same manner as in the Aura_l strain.
  • Example 1 the growth using the peracil-requiring strain constructed in Example 1 was performed.
  • An example of creating a new strain, a GLELO transgenic strain, using the seed method will be described.
  • the GLELO gene which encodes a fatty acid chain length enzyme that converts y-linolenic acid into dihomo-linolenic acid, is described in JM Parker-Barnes et al. Pro Natl. Acad. Sci. USA., 97 (15),
  • Primer MAGLELOl CCATGGATGGAGTCGATTGCGCCATTCC (SEQ ID NO: 11)
  • Primer MAGLEL02 GGATCCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC (SEQ ID NO: 12)
  • the amplified GLELO gene was digested with restriction enzymes Ncol and BamHI to obtain a fragment of about 1 kb. Further, pD4 was digested with restriction enzymes Ncol and BamHI to obtain a fragment of about 7.7 kb. The above fragments were ligated using ligation high (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to obtain plasmid pDGL EL ⁇ .
  • pDura5 was partially digested with EcoRI, and an approximately 6.2 kb DNA fragment cut at only one of the two EcoRI sites was purified. This fragment was blunt-ended with a DNA Bluntiong Kit (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.), and then self-ligated with ligation high (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.). The site with only the site that remained was selected and named pDura5 '.
  • the pDGLELO was digested with EcoRI to obtain a 2.7 kb fragment, which was inserted into the EcoRI site of pDura5 '. From these, a plasmid in which the GLELO expression cassette and the ura5 expression cassette were arranged in the same direction was selected, and this was used as a recombinant expression vector pDura5GLEL ⁇ .
  • a ura-l strain was transformed by the same method as in Example 1, (8), and three transformants were obtained. For convenience, these transformants were numbered # 5 # 7.
  • RNA was extracted from the cells using an RNeasy plant mini kit (trade name, manufactured by QIAGEN). Reverse transcription reaction was performed using 1 ⁇ g of total RNA Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR! (Name of Invitrogen, manufactured by Invitrogen) using a random hexamer as a primer to synthesize cDNA. Using 1 ⁇ l ( ⁇ 20 amount) of the synthesized cDNA as type ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , primers MAGLEL05 and MAGLEL06 shown below
  • Primer MAGLEL05 CTTTGTGGGCATGCAGATCA (SEQ ID NO: 13)
  • Primer MAGLEL06 PCR was performed using TGAAGATGGAGCTGTGGTGGTA (SEQ ID NO: 14) and Ex Taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). The PCR conditions at this time were as follows: lmin at 94 ° C, lmin at 55 ° C, and 2min at 72 ° C as one cycle, and after 20 cycles, lOmin extension at 72 ° C.
  • the spores of the two types of ura5 transgenic strains # 1 and # 2 created in Example 1 and the spores of the G LELO transgenic strain # 5— # 7 obtained in (2) above were each added to a liquid medium (5% gnorecose, 1 % Yeast extract, adjusted to pH 6.0) and cultured with shaking at 28 ° C for 7 days. After the culture, the cells were collected by filtration, dried, and weighed. Fatty acid residues in the cells by the methanol-hydrochloric acid method Was extracted with hexane, and the hexane was distilled off. The resulting fatty acid methyl ester was analyzed by gas chromatography. Table 3 shows the obtained results, that is, the weight of the dried cells when the above-described gene-introduced strains (transformants) were grown, the fatty acid composition and the total lipid production in the cells of each strain.
  • 16: 0 indicates palmitic acid
  • 18: 0 indicates stearic acid
  • 18: 1 indicates oleic acid
  • 18: 2 indicates linoleic acid
  • 18: 3 indicates ⁇ .
  • 20: 3 indicates dihomo_ ⁇ -linolenic acid
  • 20: 4 indicates arachidonic acid
  • 24: 0 indicates lignoceric acid
  • the introduction of the GLELO gene increased the weight of dried bacteria, increased the proportion of dihomo_ ⁇ -linolenic acid and arachidonic acid in the total fatty acids, and increased the proportion of ⁇ -linolenic acid. Percentage decreased. In addition, total lipid production and total lipid content also increased, and the production and content of dihomo- ⁇ -linolenic acid and arachidonic acid also increased. Increased.
  • the ratio of dihomo-gamma-linolenic acid, which is the product of the chain elongation reaction, to its substrate, gamma-linolenic acid (20: 3/18: 3 ratio), or the metabolite of dihomo_ ⁇ -linolenic acid The ratio of the sum of certain arachidonic acids to ⁇ -linolenic acid ((20: 3 + 20: 4) / 18: 3 ratio) showed a remarkably large value in the GLELO transgenic strain.
  • Czapek-Dox medium 3% sucrose, 0.2% NaNO, 0.1% KH P ⁇ , 0.05% KC1, 0.05% Mg
  • a spore solution was prepared. Mutation was performed on 1 X 10 8 — 10 9 spores with N-methyl-N '
  • mutated spores were placed in a GY medium (2% gnorecose, 1% yeast extract, 2% agar, adjusted to pH 6.0) containing 1.0 mg / ml 5-FOA and 0.05 mg / ml peracil. Apply at 28 ° C
  • SC medium Yeast Nitrogen Base w / o Amino Acids and Ammonium Sulfate
  • Tyrosine 30mg Methionin 1.Omg, Anoreginin 2.Omg, Histidine 2.Omg, Lysine 4.Omg, Tryptophan 4.Omg, Threonine 5.Omg, Isoleucine 6.Omg, Leucine 6.Omg, Phenylalanine 6.Omg / Liters) and growth in SC medium supplemented with Peracil (Peracil 50 mgZ liter).
  • M. nygrophila MH-A ura-l or f M. chlamydospora MC_A ura_l was inoculated into Czapek_Dox medium and cultured at 28 ° C for 2 weeks to form spores. Spores were collected as described in (1) above.
  • An SC agar medium was used as a selective medium for the transformants.
  • pDura5 was introduced (transformed) into the host by the particle delivery method.
  • Gene transfer using the PDS-1000 / He Particle Delivery System (trade name, manufactured by BIO RAD) is as follows: helium pressure: 7590 kPa (110 Opsi), vacuum inside the chamber: 28 inches Hg, distance to target 3 cm, tungsten particles The measurement was performed under the condition of a diameter of 1.1 ⁇ m. After transfection, the cells were cultured at 28 ° C for 2 to 3 days. As a result, more than a dozen colonies grew, and these were obtained as transformants.
  • the method for breeding lipid-producing bacteria uses the auxotrophic strain of the lipid-producing bacterium as a host, and uses, as a marker gene, a gene that complements the auxotrophy as described above. It comprises a transformation step of introducing a gene into a host (gene introduction step) and selecting a transformant (selection step) using the above-mentioned recovery of the nutritional requirements of the host as a marker. Therefore, there is an effect that a new variety (new strain) can be efficiently and effectively produced by using a lipid-producing bacterium belonging to the genus Mortierella as an original species.
  • the bacterium of the genus Mortierella is well known as a lipid-producing bacterium, and includes highly reliable bacteria such as M. alpina. Therefore, when the present invention is used, for example, it is possible to easily and efficiently produce a strain with even higher lipid productivity.
  • the present invention can be used in industries related to various fermentation technologies utilizing fungi of the genus Mortierella, food industries and pharmaceutical industries using the fermentation technologies, and the like.

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Abstract

　抗生物質によらず、モルティエレラ属に属する脂質生産菌の育種を有効かつ効率的に行うことができる育種方法を提供する。 　モルティエレラ（Mortierella）属に属する脂質生産菌の栄養要求性株、例えばウラシル要求性株を宿主とし、形質転換工程を行う。具体的には、マーカー遺伝子としてこの栄養要求性を相補する遺伝子を用いて、当該マーカー遺伝子を宿主に導入する（遺伝子導入段階）。その後、上記宿主の栄養要求性の回復をマーカーとして形質転換株を選抜する（選抜段階）。上記脂質生産菌としては、例えばモルティエレラ　アルピナ（M. alpina）を挙げることができる。

Description

明 細 書
脂質生産菌の育種方法
技術分野
[0001] 本発明は、脂質生産菌の育種方法に関するものであり、特に、モルティエレラ（
Mortierella)属に属する脂質生産菌において、抗生物質による選抜を用いずに形質 転換による育種を行う方法に関するものである。
背景技術
[0002] 従来から、微生物の代謝により有用な化合物を生産させる技術 (広義の醱酵技術） が開発、実用化されている。具体的には、例えば、代謝によって脂質を大量に生産 する能力を有する脂質生産菌を挙げることができる。代表的な脂質生産菌としては、 Mortierella alpina (モルティエレラ アルピナ）等のモルティエレラ属の菌類を挙げるこ とができる。モルティエレラ属の菌類は、ァラキドン酸をはじめとする高度不飽和脂肪 酸 (PUFA)を生産することが知られており、工業的に特に有用な菌類である（例えば 、特公平 7-34752 (公告日：平成 7 (1995)年 4月 19日、公開公報：特開昭 63 - 44 891、公開曰：昭禾ロ 63 (1988)年 2月 25曰）参照）。
[0003] ところで、上記脂質生産菌等の微生物も含めて各種有用生物においては、育種、 すなわち有用生物の遺伝的性質をより望ましい性質に改良する（品種改良する)こと カ¾されている。特に醱酵技術では、微生物による化合物の生産効率を向上し、当 該化合物の製造コストを低減する等の観点から、育種は非常に重要なものとなってい る。
[0004] 育種方法は、基本的には、遺伝的変異を含む集団を作出する工程 (便宜上、集団 作出工程と称する）と、当該集団からより望ましい性質を示す品種を選抜する工程（ 便宜上、選抜工程と称する）とからなっている。集団作出工程も選抜工程も育種しょう とする有用生物の種類に応じて様々な方法を用いることができるが、上記脂質生産 菌等の微生物では、集団作出工程において、主として（1)変異処理による方法と（2) 形質転換による方法とが利用される。
[0005] (1)変異処理による方法 変異処理により集団作出工程を行う場合、様々な手法で微生物に突然変異を生じ させて集団を作出する力 S、突然変異そのものは無作為に多くの種類が生じることにな る。そのため、その後の選抜工程にて、 目的の形質を示す品種 (株）を取得できたと しても、 目的の形質に関わる遺伝子以外の他の遺伝子に予想外の損傷が生じている 可能性が否めない。例えば、上記脂質生産菌の場合では、生産される脂質の種類に 変化が生じても、増殖や胞子形成能などが悪くなること等があり得る。したがって、変 異処理による集団作出工程では、必ずしも生産性のよい株を得ることができるとは限 らない。
[0006] さらに、この方法では、上記のように、得られる集団を形成する個体には、無作為に 多くの種類の突然変異が生じていることになる。それゆえ、その後の選抜工程におい て、 目的の性質を示す突然変異体 (株)を得るために、適切な選抜方法 (スクリーニン グ方法）がない場合には、上記集団を形成する個体全てについて突然変異の種類を 調べる必要があり、膨大な労力を必要とする。
[0007] (2)形質転換による方法
これに対して、形質転換により集団作出工程を行う場合、育種しょうとする有用生物 を宿主として、 目的の性質を獲得するために必要な DNA断片を導入 (形質転換)す ることにより形質転換体の集団を得る。すなわち、 目的に合わせた特定の遺伝子の みを発現制御した集団を作出することになる。そのため、その後の選抜工程では、得 られた形質転換体の中からより望ましい品種 (株）のみを選抜すればよいことになるの で、スクリーニングが容易になるだけでなぐ上記他の遺伝子に予想外の損傷が生じ ることも回避できる。したがって、育種にかける労力を著しく低減することができる。
[0008] このように、育種における集団作出工程では、形質転換による方法が好ましく用い られている。例えば、モルティエレラ属の菌類が属する糸状菌の形質転換方法につ いては、多くの技術が報告されている。
[0009] 具体的には、 (a)下記文献 1一 3等には、 Aspergillus nidulansや Neurospora crassa
等の糸状菌をパーティクルデリバリー法により形質転換する技術が開示されている。 これら技術では、形質転換する宿主株としてゥラシル要求性株を用いるとともに、そ れを相補する遺伝子をマーカー遺伝子として用レ、、形質転換株を選択している。 [0010] また、（b)上記 M. alpinaの形質転換方法としては、下記文献 4に開示されている技 術が知られている。この技術では、胞子をプロトプラスト化し、エレクト口ポレーシヨン 法によって遺伝子を細胞内に導入している。また、形質転換体のスクリーニングには 、マーカー遺伝子として大腸菌由来のハイグロマイシン B耐性遺伝子 (hpt)を用いて いる。これにより、ハイグロマイシン含有培地で生育できるものを形質転換体として選 択すること力 Sできる。
文献 1 : Fungaro M. H. et al. Ferns microbial Lett. , 25, 293 - 297， 1995
文献 2 : Herzog R. W. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. , 45, 333 - 337， 1996 文献 3 : Armaleo， D. et al. Curr. Genet. , 17, 97—103， 1990
文献 4 : Mackenzie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol. , 66， 4655—4661 , 2000 し力、しながら、上述した形質転換を利用した技術では、 PUFAを生産する脂質生産 菌の育種を有効かつ効率的に行うことが困難であるという課題を生じている。
[0011] 具体的には、上記 (a)糸状菌をパーティクルデリバリー法により形質転換する技術を 用いる場合、形質転換の対象となる上記 A. nidulansや N. crassa等の糸状菌類は 、脂質生産性が低いため、 PUFA等の脂質を工業的に生産させる用途には適して いない。
[0012] これに対して、上記 (b)文献 4に開示されている技術では、工業的にも利用可能な脂 質生産菌として知られている M. alpinaを形質転換する技術である。そのため、上記 (a)の技術に比べると工業的には優れていると考えられる。
[0013] ところが、 M. alpinaに代表されるモルティエレラ属の菌類は全てハイグロマイシン 感受性ではない。したがって、この技術を用いて育種を行う場合、宿主となるモルティ エレラ属の菌がハイグロマイシン耐性である場合、ハイグロマイシン耐性をマーカーと して用いることができない。
[0014] PUFAの多くは必須脂肪酸であり、生体内で複雑な生理機能に関与するため、近 年重要な栄養素として注目されている。それゆえ、より一層効率的に PUFAを生産 する醱酵技術が求められているが、そのためには、脂質生産菌として信頼性の高い モルティエレラ属の菌類を効率的かつ有効に育種する技術が必要となる。
[0015] 本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、抗生物質によら ず、モルティエレラ属に属する脂質生産菌の育種を有効かつ効率的に行うことができ る育種方法を提供することにある。
発明の開示
[0016] 本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、脂質生産菌であるモルティエ レラ属の菌類の栄養要求性株を取得し、それを相補する遺伝子をマーカー遺伝子と して形質転換できる系を確立できれば、モルティエレラ属の菌類全ての株において、 効率的かつ有効な形質転換が可能となるとともに、この系を利用すれば、セノレフクロ 一二ングも可能となり、育種をより一層効率的かつ有効に行い得ることを見出し、本 発明を完成させるに至った。
[0017] 本発明に力かる脂質生産菌の育種方法は、モルティエレラ（Mortierella)属に属す る脂質生産菌の育種方法であって、上記脂質生産菌の栄養要求性株を宿主とし、マ 一力一遺伝子として上記栄養要求性を相補する遺伝子を用いて、当該マーカー遺 伝子を宿主に導入する遺伝子導入段階と、上記宿主の栄養要求性の回復をマーカ 一として形質転換株を選抜する選抜段階とを有する形質転換工程を含むことを特徴 としている。
[0018] 上記育種方法においては、上記脂質生産菌は、モルティエレラ アルピナ（
Mortierella alpina)、モノレティエレラ ノヽィグロフイラ (Mortierella hygrophila)またはモ ノレティエレラ クラミドスボラ（Mortierella chlamydospora)であることが好ましぐ上記栄 養要求性株がゥラシル要求性株であることが好ましぐ上記マーカー遺伝子として、 ォロチジン一 5 '_リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子またはォロチジル酸ピロホスホリラ ーゼ遺伝子が用いられることが好ましい。
[0019] また、上記育種方法においては、上記遺伝子導入段階では、エレクト口ポレーショ ン法、または、パーティクルデリバリー法を用いることができる。
[0020] さらに、上記育種方法においては、原種の脂質生産菌から栄養要求性株を取得す る栄養要求性株取得工程を含んでレ、てもよレ、。
[0021] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十 分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白にな るだろう。 発明を実施するための最良の形態
[0022] 本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限 定されるものではない。
[0023] 本発明では、育種における遺伝的変異を含む集団を作出する工程 (集団作出工程 )として、栄養要求性をマーカーとした形質転換工程を実施する。具体的には、脂質 生産菌であるモルティエレラ属の菌類の栄養要求性株を取得し、これを宿主として、 上記栄養要求性を相補する遺伝子を導入 (形質転換)する。その後、上記集団から 上記宿主の栄養要求性の回復をマーカーとして形質転換株を選抜する。
[0024] 以下、本発明の対象となるモルティエレラ属の菌類、本発明に力かる育種方法、お よびその利用について、それぞれ詳細に説明する。
[0025] ( 1 )モルティエレラ属の菌類
本発明に力かる育種方法の対象となるモルティエレラ属の菌類としては、特に限定 されるものではなぐモルティエレラ属に分類される各種糸状菌を挙げることができる 。 モノレティエレラ属は、 Mortierellaと Micromucorとの 2亜属に分けられる。 Mortierella 亜属の菌は全て、ァラキドン酸等の炭素数 20の脂肪酸を生産するが、 Micromucor亜 属は炭素数 18以下の脂肪酸しか生産しない。本発明の対象となるモルティエレラ属 の菌類は上記 2亜属の何れであってもよい。
[0026] モルティエレラ属の菌類としては、具体的には、 M. alpina, M. elongata, M. exigua, ivl. hygrophila, M. isabelina, . turncola, M. gamsn, M. cogitans, M. capitata, M. vinacea, M. chlamydospora等が知られている力 S、もちろんこれらに限定されるもので はない。中でも、本発明では、脂質生産菌として広く用いられている M. alpina (モル ティエレラ アルピナ）を好ましく用いることができる。 M. alpinaは、ァラキドン酸 (AR A)を始めとした PUFAを菌体内に蓄積する株が知られており、 PUFAの生合成研 究用だけではなく PUFAを生産する工業用にも広く用いられている。
[0027] 上記 M. alpinaを含むモルティエレラ属の菌類の入手方法は特に限定されるもので はなぐ財団法人醱酵研究所や ATCC (American Type Culture Collection)等の微 生物等寄託機関から入手すればよい。あるいは、特許出願されている株の場合であ れば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターから入手すること ができる。また、 自然環境からモルティエレラ属に属する未知の株を、公知のスクリー ニング方法により取得して用いてもよい。
[0028] (2)本発明にかかる脂質生産菌の育種方法
本発明にかかる育種方法は、上記集団作出工程において形質転換を用いる形質 転換工程を含むものであればよいが、より好ましくは、栄養要求性株取得工程を含ん でいる。もちろん他の工程を含んでいてもよい。以下、各工程について詳細に説明す る。
[0029] <栄養要求性株取得工程 >
栄養要求性株取得工程は、原種のモルティエレラ属の菌から栄養要求性株 (栄養 要求性変異株）を取得する工程であれば特に限定されるものではなぐ栄養要求性 株を取得するための公知の技術を用いることができる。特に、栄養要求性に関わる遺 伝子が明らかであれば (例えば、全ゲノム解読による場合等）、その遺伝子を潰すこと で容易に栄養要求性株を取得することが可能となるため、好ましい。
[0030] 栄養要求性株の具体的な種類は特に限定されるものではなぐ例えば、ロイシン、 ヒスチジン、メチォニン、アルギニン、トリプトファン、リジン等のアミノ酸要求性株；ゥラ シル、アデニン等の核酸塩基要求性株；ビタミン要求性株；等を挙げることができる。 本発明では、例えば、後述する実施例で説明するように、ゥラシノレ要求性株を用いて いる。ゥラシル要求性株の場合、特に、モルティエレラ属の菌においては 5_フルォロ ォロチン酸（5—FOA)耐性というポジティブセレクションをマーカーとしてスクリーニン グをかけることができるという利点がある。
[0031] したがって、栄養要求性株取得工程では、特定の栄養素を欠失した合成培地によ り成育できない株を取得するだけでもよいが、変異遺伝子を限定するスクリーニング をかけた上で株を取得してもよい。例えば、ゥラシノレ要求性株の取得においては、上 記 5—FOAを用いてスクリーニングをかければ、 URA3遺伝子または URA5遺伝子 に変異が生じたゥラシル要求性株を取得することができる。同様に、リジン要求性株 の取得においては、アミノアジピン酸を用いてスクリーニングをかければ、 LYS2遺伝 子または LYS5遺伝子に変異が生じたリジン要求性株を取得することができる。この ように、変異遺伝子を限定した栄養要求性株を取得すれば、後段の形質転換工程に 用いるマーカー遺伝子を明確に特定することができるため好ましい。
[0032] <形質転換工程 1 ·遺伝子導入段階 >
形質転換工程は、上述したように、育種における集団作出工程において形質転換 を用いる工程であり、遺伝子導入段階と選抜段階との二段階を少なくとも経る工程で ある。もちろん、必要に応じてこれら以外の段階を経てもよい。
[0033] 本発明における遺伝子導入段階は、モルティエレラ属の菌類 (脂質生産菌）の栄養 要求性株を宿主とし、マーカー遺伝子として上記栄養要求性を相補する遺伝子を用 いて、当該マーカー遺伝子を宿主に導入する段階であれば特に限定されるものでは ない。
[0034] 上記マーカー遺伝子としては、栄養要求性株の変異 (栄養要求性変異)を相補す る遺伝子であれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば、ロイシン要求 性株の場合には leu2遺伝子、ヒスチジン要求性株の場合には his3遺伝子、リジン要 求性株の場合には lys2遺伝子、トリブトファン要求性株の場合には trp l遺伝子、ゥラ シノレ要求性株の場合には、 ura3遺伝子または ura5遺伝子、アデニン要求性株の場 合には ade2遺伝子等を挙げることができる。本発明では、例えば、後述する実施例 で説明するように、宿主をゥラシル要求性株として、マーカー遺伝子として、 ura5遺 伝子を用いている。
[0035] 上記各マーカー遺伝子の取得方法も特に限定されるものではなぐ公知の方法を 用いて酵母等の異種の（微）生物から取得してもよレ、し、市販のマーカー遺伝子を利 用してもよレ、。また、本発明では、セルフクローニングが可能であるため、宿主である モルティエレラ属の菌からマーカー遺伝子を取得してもよい。例えば、後述する実施 例では、 3種の酵母における ura5遺伝子の塩基配列を利用して、宿主である M. alpina力 ura5遺伝子を取得している。
[0036] 上記遺伝子導入段階で用いられる遺伝子導入方法 (形質転換方法）は特に限定さ れるものではなぐエレクト口ポレーシヨン法、パーティクルデリバリー法等の従来公知 の方法を好適に用いることができる。モルティエレラ属の菌類では、エレクト口ポレー シヨン法を用いる場合、菌体をプロトプラスト化しておくことが好ましい。なお、上記パ 一ティクルデリバリー法の具体的な一例としては、パーティクルガン法を挙げることが できる力 もちろんこれに限定されるものではなレ、。
[0037] 上記マーカー遺伝子は、発現可能な状態となるようにモルティエレラ属の菌体内に 導入されればよいため、その具体的な構成は限定されるものではなレ、。本発明では、 少なくともプロモーターをつなげてなる発現カセットが構築され、さらにこの発現カセ ットに染色体と組み換える領域 (組換え領域と称する）がつなげられた遺伝子構築物 として構築されていればよい。したがって、上記遺伝子構築物は、ベクター中に揷入 された上で、上記宿主に導入されてもよいし、上記遺伝子構築物そのままで導入さ れてもよい。
[0038] 上記遺伝子構築物に含まれるマーカー遺伝子の発現カセットは、マーカー遺伝子 の上流に少なくともプロモーターが連結された構成であればょレ、が、さらにマーカー 遺伝子の下流にターミネータ一が連結された構成であることが好ましい。また、上記 遺伝子構築物には、上記マーカー遺伝子の発現カセットおよび組換え領域以外に、 種々の遺伝子を発現させる発現カセットを導入可能とするために、マルチクローニン グサイトが含まれていてもよい。さらに、上記遺伝子構築物には、上記マーカー遺伝 子の発現カセット（プロモーター、マーカー遺伝子、ターミネータ一）や組換え領域、 あるいはマルチクローニングサイト以外の DNA断片が含まれていてもよぐ上記遺伝 子構築物のより具体的な構成は特に限定されるものではない。
[0039] 上記各 DNA断片の具体的な種類も特に限定されるものではない。例えば、プロモ 一ターの場合、マーカー遺伝子を有効に発現させることが可能なプロモーターであ れば特に限定されるものではなぐ公知のプロモーターを好適に用いることができる。 後述する実施例では、 hisH4. 1プロモーターを用いているがもちろんこれに限定さ れるものではない。同様に、ターミネータ一の場合も、転写終結部位としての機能を 有していれば特に限定されるものではなぐ公知のものであればよい。後述する実施 例では、 trpCターミネータ一を用いているがもちろんこれに限定されるものではない 。さらに、組換え領域の場合、モルティエレラ属の菌体内に導入されるマーカー遺伝 子を、染色体内に組み込まれて存在させる DNAセグメントであれば特に限定される ものではない。後述する実施例では、 18Sリボソーム DNA (18Sr)を用いている。
[0040] 上記遺伝子構築物をベクターに組み込んで発現ベクターとする場合も特に限定さ れるものではなぐ一般的な組換え発現ベクターとなっておればよい。組換え発現べ クタ一の作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に 限定されるものではなレ、。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。通常、 プラスミドを好ましく用いることができる。
[0041] <形質転換工程 2 ·選抜段階 >
形質転換工程における選抜段階は、上記宿主の栄養要求性の回復をマーカーと して形質転換株を選抜する段階であれば特に限定されるものではなぐ公知の方法 を好適に用いることができる。すなわち、マーカーとなる栄養要求性に基づいて、合 成培地中から特定の栄養素を除き、上記遺伝子導入段階の後に得られた形質転換 体を合成培地で培養すればよい。これによつて、容易かつ効率的に形質転換体をス クリーニングすることができる。
[0042] このように、本発明では、形質転換工程において栄養要求性をマーカーとして用い ている。栄養要求性マーカーは、操作の簡便さ、低いバックグラウンド、宿主としてい るモルティエレラ属の菌由来の遺伝子が利用できる等の利点がある。また、抗生物質 耐性をマーカーとした場合と比較すると、食品開発に都合が良い等の利点もある。
[0043] 具体的には、例えば、背景技術で述べた前記文献 4の技術、すなわちハイグロマイ シン耐性をマーカーとする場合を例に挙げると、選抜された形質転換体を安定して 成育させるためには、培地にハイグロマイシンを添加しておく必要がある。そのため、 この形質転換体を用いて生産される脂質にハイグロマイシンが混入する可能性があ るが、脂質を食品用途に用いる場合には、ノ、イダロマイシンの混入は避けるべきもの である。
[0044] ここで、例えば、栄養要求性がゥラシル要求性株である場合を例に挙げれば、実生 産においてゥラシル欠損培地を用いて培養することで、 ura5遺伝子等の栄養要求性 を相補する遺伝子が導入された菌体を選択しながら、脂質を生産することが可能とな る。すなわち、栄養要求性をマーカーとすれば、ノ、イダロマイシンの混入を避けること ができる上に、常にセレクションをかけた培養が可能となるという利点もある。それゆ え、本発明のように栄養要求性マーカーを用いることはより好ましい。
[0045] <選抜工程 > 本発明にかかる脂質生産菌の育種方法では、上記形質転換工程において、栄養 要求性をマーカーとして、様々な遺伝子を導入することで、様々な性質を示す株の 集団を得ることが可能である。それゆえ、本発明では、上記形質転換工程の後に、得 られた集団からより望ましい性質を示す品種を選抜する選抜工程を実施してもよい。 なお、ここで言う「選抜工程」は、上記形質転換工程における「選抜段階」とは異なり、 栄養要求性をマーカーとして形質転換株を選択するのではなぐ得られた複数の形 質転換株から、より好ましい性質を示す形質転換株を選択する工程を指す。
[0046] 選抜工程の具体的な手法は特に限定されるものではなぐ育種の目的に応じて好 ましい性質を示す形質転換株を選択できるような条件を設定し、公知の手法に基づ レヽて好ましレヽ形質転換株を選択すればょレヽ。
[0047] (3)本発明の利用
本発明にかかる脂質生産菌の育種方法は、上記のように、栄養要求性をマーカー として、遺伝的変異を含む集団からより望ましい性質を示す品種を選抜 (スクリーニン グ)するようになっている。それゆえ、モルティエレラ属に属する脂質生産菌を原種と して、新規品種 (新規株)を効率的かつ有効に生産することが可能となる。モルティエ レラ属の菌は脂質生産菌として良く知られており、 M. alpinaのように信頼性の高いも のも含まれているため、例えば、脂質生産性をより一層高めた株を容易かつ効率的 に生産することが可能となる。
[0048] また、本発明にかかる育種方法では、形質転換を行う脂質生産菌の遺伝子のみを 用いて形質転換できるので、セルフクローニングが可能となる。それゆえ、本発明で は、原種のモルティエレラ属の菌から適当な DNA断片を取得してこれを栄養要求性 株に導入し、特定の遺伝子の発現調節（高発現、発現時期の調節、発現抑制など） することが可能となり、脂質生産量の増加、生産できる脂質の種類の改変、組成の改 変等が可能な形質転換体すなわち新規株を得ることができる。もちろん本発明では、 セルフクローニングではなぐ他種由来の DNA断片を栄養要求性株に導入すること ができることはいうまでもない。
[0049] 本発明にかかる育種方法では、例えばセルフクローユングの場合、原種（宿主）の モルティエレラ属の菌から適当な DNA断片を取得する方法は特に限定されるもので はなぐ公知の方法を用いることができる。また、ここで言う適当な DNA断片（例えば 、導入したい遺伝子等）は、宿主となるモルティエレラ属の菌において、 目的とするよ り望ましい性質を実現できる DNA断片、あるいは当該性質を実現できる可能性のあ る DNA断片であれば特に限定されるものではない。
[0050] この DNA断片は、上記 ura5遺伝子と同様に、少なくともプロモーターと、好ましく はターミネータ一とも連結することで発現カセットが構築された上で、組換え発現べク ター中に挿入されていればよいが、これに限定されるものではない。後述する実施例 では、上記 DNA断片として、 GLELO遺伝子を用いているがもちろん本発明はこれ に限定されるものではない。
[0051] 以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれに限定 されるものではない。
[0052] 〔実施例 1〕
本実施例では、本発明にかかる育種方法の一例として、ゥラシル要求性株を取得し 、これを形質転換して選抜する具体例にっレ、て説明する。
[0053] (1)ゥラシル要求性株の取得 (栄養要求株取得工程）
M. alpinaの胞子を形成させるために、 Czapek-Dox培地（3%スクロース、 0· 2%N aNO、 0. 1 %KH P〇、 0. 05%KC1、 0. 05%MgSO - 7H〇、 0. 001 %FeSO ·
7H〇、 2%寒天、 pH6. 0に調整）に本菌を植菌し、 28°Cで約 2週間培養した。これ を Tween 80水溶液（1 drop/ lOOmlH O)で懸濁し、ガラスフィルター（岩城硝子社 製、商品番号： 3G1)で菌糸を除去して胞子液を調製した。変異処理は 1 X 108— 10 9個の胞子に対し、 N-methy卜 N' -nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)を用いて、 Jareonkitmongkolらの方法（S. Jareonkitmongkol et al. JAOCS, 69， 939—944, 1992) にしたがって行った。
[0054] 変異処理した胞子を 1. Omg/mlの 5—FOAと 0. 05mgZmlのゥラシルを含む GY 培地（2。/。グルコース、 1。 /。酵母エキス、 2%寒天、 pH6. 0に調整）に塗布し、 28°Cで 4日間培養することにより、 5—FOA耐性株を 6株得た。これらの株に対してゥラシノレ 要求性の評価を行った。
[0055] すなわち、 SC培地（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Difco社製） 5. 0g、（ΝΗ ) SO 1. 7g、グノレコース 20g、寒天 20g、アデニン 20mg、
4 2 4
チロシン 30mg、メチォニン 1. Omg、ァノレギニン 2· Omg、ヒスチジン 2. Omg、リジン 4 • Omg、トリプトファン 4· Omg、スレオニン 5· Omg、イソロイシン 6· Omg、ロイシン 6· Omg、フエ二ルァラニン 6. Omg/リットル）およびゥラシル添加 SC培地（ゥラシル 50 mgZリットル）における生育の比較を行った。
[0056] その結果、 6株の 5— FOA耐性株の全てが、ゥラシルを含む培地では親株と同様に 生育できたが、ゥラシノレを含まない培地では生育が悪ぐそのうち 2株はまったく生育 できなかった。これらの株をそれぞれ A ura-l株、 A ura_2株と命名した。
[0057] (2)酵素活性の測定
5—FOA耐性かつゥラシノレ要求性という表現系を示す場合、ォロチジン一 5'_リン酸 デカルボキシラーゼ（ura3遺伝子にコードされる酵素で ura3pと略す）またはォロチ ジル酸ピロホスホリラーゼ（ura5遺伝子にコードされる酵素で ura5pと略す）活性が欠 失していることが考えられる。そこで、上記 A ura-l株および A ura-2株についてこれら の酵素活性を測定した。
[0058] それぞれの株をゥラシル添加 GY培地で 28°C、 4日間振とう培養した。菌体の無細 胞抽出液の調製は、 Wynnらの方法（J. P. Wynn et al. Microbiology, 146,
2325-2331, 2000)を改良して行った。
[0059] すなわち、 0. 05mg/mlのゥラシルを含む GY液体培地で 28°C、 4日間培養した 菌体を、 5mM i3—メルカプトエタノールを含む 0· 1Mトリスバッファー（ρΗ7· 5)で懸 濁した。その後、フレンチプレスを用い 35MPaにて細胞を破砕し、遠心した。得られ た上清を無細胞抽出液とした。さらに、 100,000 X g、 60minの条件で超遠心すること でオノレガネラを除き、可溶性画分を得た。
[0060] 得られた可溶性画分を用いて、 ura3p活性を Yoshimotoらの方法（A. Yoshimoto et al. Methods in Enzymology Vol 51， 74-79, ACADEMIC PRESS 1978)にしたがって 測定した。同じく得られた可溶性画分を用いて、 ura5p活性を Umezuらの方法 (K. Umezu et al. J. Biochem., 70， 249-262, 1971)にしたがって測定した。その結果すな わちピリミジン生合成に関わる酵素活性の比較を表 1に示す。表 1の結果から明らか なように、これら 2株はどちらも、 ura3pの活性は親株と同程度あつたのに対し、 ura5 P活性は全く検出されなかった。
[0061] さらに、別に調製した 108— 109個の胞子に対して同様の変異処理を行ったところ、
5株の 5— FOA耐性株が得られ、そのうちの 3株は、ゥラシノレを含まない培地ではまつ たく生育できなかった。
[0062] [表 1]
Figure imgf000014_0001
※一 ：検出されず。
(3) M. alpinaのゲノム DNAの取得および cDNAライブラリーの作製
M. alpinaと、これを原種 (wild type)として誘導したゥラシル要求株（上記 A ura-l株 および A ura-2株）をそれぞれ GY液体培地で 28°C、 5日間培養し、得られた菌体か ら Sakuradaniらの方法（E. Sakuradani et al. Eur. J. Biochem" 260， 208-216, 1999) にしたがって、ゲノム DNAを調製した。
[0063] Μ· alpinaの胞子を、液体培地（2%グルコース、 1 %酵母エキス、 pH6. 0に調整） に植菌し、 28°Cで 4日間培養した。菌体を回収し、塩酸グァニジン/ CsCl法で全 R NAを調製した。〇ligotex_dT30く Super〉mRNA Purification Kit (From Total RNA) (商 品名、タカラバイオ社製）を用いて、全 RNAから mRNAの精製を行レ、、 ZAP-cDNA Synhesis Kit (商品名、 STRATAGENE社製）を用いて cDNAライブラリーを作製した。
[0064] (4) M. alpinaからの ura5 cDNAの取得
3禾 の酵母 Glomerella gramimcola、 Saccharomyces cerevisiae、および; sordana macrosporaにおける ura5pのアミノ酸配列について、その相同性の極めて高い二つの 領域である次のアミノ酸配列
領域 1： FGPAYKGIP (配列番号 1参照）
領域 2： KEAKDHGEG (配列番号 2参照）
に基づレ、て、次の塩基配列を有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー を合成した。なお、下記のプライマーにおける Iはイノシンを示している。また、配列表 では、イノシンに相当する部位は nで示している。 センスプライマー： 5 ' -TTYGGHCCIGCITAYAARGGHATYCC-3，（配列番号 3) アンチセンスプライマー： 5， -CCCTCDCCRTGRTCYTTIGCYTCYTT-3 ' (配列番号 4)
次に、 T Gradientサーモサイクラ一（商品名、 Biometra社製）により M. alpinaのゲノ ム DNAを錡型として、上記 2つのプライマーで、 Ex Taq polymerase (タカラバイオ社 製）を用いて PCRを行った。このときの PCR条件は、 94。Cで lmin、 52°Cで lmin、お よび 72°Cで 2minを 1サイクルとして 35サイクルの後に 72°Cで lOmin伸長させる条件 とした。
[0065] その結果約 130bpDNA断片が得られ、この DNA断片の塩基配列を決定した。こ の DNA断片は既知の ura5遺伝子と高い相同性を示した。この DNA断片をプロ一 ブとして、（3)で調製した M. alpinaの cDNAライブラリーをプラークハイブリダィゼー シヨンによりスクリーニングすることにより、 M. alpinaの ura5遺伝子の cDNAを含むプ ラスミド PBMAURA5を得た。
[0066] なお、 ura5遺伝子の cDNAは、配列番号 5に示される塩基配列を有しており、この ura5遺伝子にコードされている ura5pは配列番号 6に示されるアミノ酸配列を有して いる。
[0067] (5) ura5ゲノム DNAのクローニング
上記 ura5遺伝子の cDNA配列（配列番号 5)を基に、次に示すプライマー CRON 1および CRON2
プライマー CRON1： CTTCTCTTCAGCCCCCAGCCGCATCGGTCC (配歹幡号 7；) プライマー CRON2： GAGTCCACGAAAACTGCTGATGAGCAGCAC (配列番号 8) を合成し、 M. alpinaのゲノム DNAを铸型として、 PCRにより ura5ゲノム DNAをクロ 一二ングした。このときの PCR条件は、 94。Cで lmin、 55。Cで lmin、および 72°Cで 2 minを 1サイクルとして 30サイクルの後に 72°Cで lOmin伸長させる条件とした。その結 果、 ura5ゲノム遺伝子上にはイントロンは存在しないことが明らかになった。
[0068] (6)栄養要求性株における変異部位の特定
上記プライマー CRON1および CRON2を用レ、、ゥラシル要求性株である A ura- 1 株および A ura-2株のゲノム DNAをそれぞれ铸型として PCRを行レ、、それぞれの株 の ura5ゲノム遺伝子をクローニングした。なお、このときの PCR条件は、 94°Cで lmin 、 550Cで lmin、および 720Cで 2minを 1サイクノレとして 30サイクノレの後に 720Cで 10 min伸長させる条件とした。その結果、 A ura-l株では，開始コドンから数えて 93番目 の塩基に 1塩基のアデニンの揷入があり、〇RF内でフレームシフトを起こしていた。 一方、 A ura-2株では、 398番目のグァニンがアデニンに置換されており、モチーフ 配列内の 133番目のグリシンがァスパラギン酸に置換されていた。これら変異の結果 、上記 2株は ura5p活性を失ったことが示唆された。
[0069] (7)組換え発現ベクター： pDura5の構築
プラスミド pD4 (D. B. Archer氏より分譲、前記文献 4参照）を制限酵素 Ncolおよび BamHIで消化し、 DNA Blunting Kit (商品名、タカラバイオ社製）を用いて末端を平 滑化したのち、ハイグロマイシン B耐性遺伝子である hptm°d断片を除く 5. 4kbpの DN A断片を GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (商品名、アマシャムバイオサ ィエンス社製）を用いて精製した。 （4)で得られた上記 PBMAURA5を制限酵素 Eco RIおよび Xholで消化し、末端を平滑化した後、 ura5 cDNAを含む約 0. 65kbpの 断片を精製した。これら 2つの断片を ligation high (商品名、東洋紡社製)を用いて連 結した。 ura5遺伝子の方向を確認し、 ura5遺伝子の 5'上流側に hisH4. 1プロモー ター、 3 '下流側に trpCターミネータ一が連結されているものを選択し、プラスミド pD ura5とした。
[0070] (8) pDura5による形質転換 (形質転換工程）
形質転換株の選択培地には SC寒天培地を用いた。宿主となる A ura-l株の胞子 1 08個を SC寒天培地に塗布した。上記 pDura5はパーティクルデリバリー法により宿主 に導入（形質転換）した。 PDS—1000/Heパーティクルデリバリーシステム（商品名 、 BIO RAD社製）による遺伝子導入は、ヘリウム圧： 7590kPa (1100psi)、チャンノ 一内の真空： 28インチ Hg、ターゲットとの距離 3cm、タングステン粒子径 1. 1 μ mの 条件で行った。遺伝子導入後、 28°Cで 2 3日間培養すると 4個のコロニーが生育し てきたので、これらを形質転換株として取得した。なお、便宜上、これらの形質転換株 に対して # 1一 # 4の番号を付与した。
[0071] 形質転換株 # 1一 # 4に遺伝子が導入されているか否力 ^rPCRにて確認した。す なわち、それぞれの形質転換株よりゲノム DNAを調製し、これを铸型として、次に示 すプライマー RDNA1および RDNA2
プライマー RDNA1： ACAGGTACACTTGTTTAGAG (配列番号 9)
プライマー RDNA2： CGCTGCGTTCTTCATCGATG (配列番号 10)
と、 Ex Taq polymerase (タカラバイオ社製）を用いて PCRを行った。このときの PCR条 件は、 94°Cで lmin、 54°Cで lmin、および 72°Cで lminを 1サイクルとして 35サイクル の後に、 72。Cで lOmin伸長させる条件とした。なお、コントローノレとして、 A ura_l株に っレ、ても同様にして PCRにて確認した。
[0072] その結果、宿主とした A ura-l株では、 DNAの増幅が見られなかったのに対し、形 質転換株 # 1一 # 4では何れも 1. 5kbpの DNA断片の増幅が確認された。このこと から、上記 # 1一 # 4の 18SrDNA領域でプラスミド pDura5と組換えが生じて ura5 遺伝子が導入されてレ、ることが確認できた。
[0073] さらに、上記形質転換株 # 1一 # 4を SC液体培地中で、 28°C4日間振とう培養し、 ura5p酵素活性を測定した。その結果すなわち ura5p酵素活性の比較を表 2に示す 。表 2の結果から明らかなように、形質転換株 # 1一 # 4では野生株 (wild type)と同 程度もしくは数倍の活性を回復しており、導入した ura5遺伝子が有効に機能してい ることが示された。
[0074] [表 2]
Figure imgf000017_0001
さらに、 A ura-l株の胞子約 108個に対して、同様の遺伝子導入操作を別途 2回行 レ、、 28°Cで 2— 3日間培養したところ、それぞれ、 3個および 4個のコロニーが生育し ており、形質転換に再現性があることが確認された。
〔実施例 2〕
本実施例では、上記実施例 1において構築されたゥラシル要求性株を利用した育 種方法を用いて、新規な株である GLELO遺伝子導入株を創出する例について説 明する。
[0076] (l) pDura5GLELOベクターの構築
y—リノレン酸をジホモ Ί—リノレン酸とする脂肪酸鎖長酵素をコードする GLELO遺 伝子は、 J. M. Parker-Barnes et al. Pro Natl. Acad. Sci. USA., 97 (15),
8284-8289, 2000に記載されてレ、る配列 GBの ID : AF206662の塩基配列に基づレ、て 、 M. alpinaの cDNAを錡型として、 PCRにより増幅することにより取得した。このとき 、次に示すプライマー MAGLELOlおよび MAGLEL02を用いた。
プライマー MAGLELOl： CCATGGATGGAGTCGATTGCGCCATTCC (配列番号 11)
プライマー MAGLEL02： GGATCCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC (配列番 号 12)
増幅した GLELO遺伝子を制限酵素 Ncolおよび BamHIで消化し約 lkbの断片を 得た。また、 pD4を制限酵素 Ncolおよび BamHIで消化し約 7. 7kbの断片を得た。 上記各断片を ligation high (商品名、東洋紡社製）を用いて連結し、プラスミド pDGL EL〇を得た。
[0077] 一方、 pDura5を EcoRIで部分消化し、 2箇所ある EcoRIサイトのうち 1箇所のみで 切断された約 6. 2kbの DNA断片を精製した。この断片を DNA Bluntiong Kit (商品 名、タカラバイオ社製）によって末端を平滑化した後、 ligation high (商品名、東洋紡 社製）によりセルフライゲーシヨンさせ、ヒストン 4. 1プロモーターの 5，上流側となるサ イトのみが残ったものを選択し、 pDura5 'とした。また、上記 pDGLELOを EcoRIで 消化して 2. 7kbの断片を得て、これを上記 pDura5 'の EcoRIサイトに揷入した。そ の中から、 GLELO発現カセットおよび ura5発現カセットが同じ方向に並んでいるプ ラスミドを選択し、これを組換え発現ベクター pDura5GLEL〇とした。
[0078] (2) pDura5GLELOによる形質転換（形質転換工程）
実施例 1の（8)と同じ方法により、 A ura-l株を形質転換し、形質転換株を 3株取得 した。なお、便宜上、これらの形質転換株に対して # 5 # 7の番号を付与した。
[0079] これら形質転換株 # 5— # 7に pDura5GLEL〇が導入されてレ、るか否かを、実施 例 1の（8)と同じぐプライマー RDNA1および RDNA2を用いて PCRにて確認した。 その結果、 3株とも 1. 5kbpの DNA断片の増幅が確認された。このこと力 、これら 3 株の 18SrDNA領域で pDura5GLEL〇と組換えが生じて ura5遺伝子が導入されて レ、ることが確認できた。
[0080] (3) GLEL〇遺伝子の発現解析
実施例 1で創出した 2種類の ura5遺伝子導入株 # 1 · # 2と、上記（2)で取得した G LELO遺伝子導入株 # 5— # 7 (脂質分析を行ったものと同様の培養条件の菌体） から、 RNeasy plant mini kit (商品名、 QIAGEN社製）を用いて全 RNAを抽出した。 1 μ gの全 RNA Superscript First-Strand Synthesis System for RT—PCR !^口j名、 Invitrogen社製）を用いて、ランダムへキサマーをプライマーとして逆転写反応を行い 、 cDNAを合成した。合成された cDNAのうち 1 μ 1 (ΐΖ20量）を錡型として、次に示 すプライマー MAGLEL05および MAGLEL06
プライマー MAGLEL05： CTTTGTGGGCATGCAGATCA (配列番号 13)
プライマー MAGLEL06： TGAAGATGGAGCTGTGGTGGTA (配列番号 14) と、 Ex Taq polymerase (タカラバイオ社製）を用いて PCRを行った。このときの PCR条 件は、 94°Cで lmin、 55°Cで lmin、および 72°Cで 2minを 1サイクルとして 20サイクル の後に、 72°Cで lOmin伸長させる条件とした。
[0081] 得られた PCR産物を電気泳動し、約 300bpのフラグメントのバンドについて、その 蛍光濃度を比較した。その結果、 ura5遺伝子導入株では 2株ともバンドの蛍光濃度 が非常に薄かったのに対して、 GLELO遺伝子導入株は 3株とも明確な濃度のバン ドを確認することができた。一方、 PCRを同様に 30サイクルで行った場合には、何れ の株においても明確な濃度のバンドを検出することができた。このこと力、ら、 GLELO 遺伝子導入株では、 GLELO遺伝子の発現量が増加してレ、ることが示唆された。
[0082] (4) GLELO遺伝子導入株の脂質分析
実施例 1で創出した 2種類の ura5遺伝子導入株 # 1 · # 2と、上記（2)で取得した G LELO遺伝子導入株 # 5— # 7の胞子を、それぞれ液体培地（5%グノレコース、 1% 酵母エキス、 pH6. 0に調整）に植菌し、 28°Cで 7日間振とう培養した。培養後、菌体 を濾過により集めて乾燥し、秤量した。塩酸メタノール法により菌体内の脂肪酸残基 をメチルエステルに誘導した後、へキサンで抽出し、へキサンを留去して得られた脂 肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析した。得られた結果、すなわち、 上記各遺伝子導入株 (形質転換体)を成育したときの乾燥菌体重量と、各株の菌体 内における脂肪酸組成と総脂質生産量とを表 3に示す。
[0083] なお、表中の 16:0はパルミチン酸を示し、 18:0はステアリン酸を示し、 18:1がォ レイン酸を示し、 18 :2がリノール酸を示し、 18 :3が γ—リノレン酸を示し、 20 :3がジ ホモ _γ—リノレン酸を示し、 20 :4がァラキドン酸を示し、 24:0がリグノセリン酸を示す
[0084] [表 3]
Figure imgf000020_0001
表 3の結果から明らかなように、 GLELO遺伝子を導入することにより、乾燥菌体重 量が増加し、総脂肪酸中に占めるジホモ _γ—リノレン酸およびァラキドン酸の割合が 増加するとともに、 γ—リノレン酸の割合が減少した。また、総脂質生産量、総脂質含 量も増加し、さらに、ジホモ— γ—リノレン酸およびァラキドン酸の生産量および含量も 増加した。鎖長延長反応の生成物であるジホモ一 γ—リノレン酸とその基質である γ - リノレン酸との比（20 : 3/18 : 3比）、あるいは、ジホモ _ γ—リノレン酸の代謝物である ァラキドン酸も合計したものと γ -リノレン酸との比（（20： 3 + 20： 4) /18： 3比）は、 G LELO遺伝子導入株において顕著に大きな値を示した。
[0085] 〔実施例 3〕
本実施例では、 M. alpina以外のモルティエレラ属の菌について、本発明にかかる 育種方法を適用した具体例について説明する。
[0086] (1)ゥラシル要求性株の取得 (栄養要求株取得工程）
M. hygrophilaおよび M. chlamydosporaの胞子を形成させるために、 Czapek- Dox 培地（3%スクロース、 0. 2%NaNO、 0. 1%KH P〇、 0. 05%KC1、 0. 05%Mg
3 2 4
SO - 7H 0、 0. 001 %FeSO - 7H〇、 20/0寒天、 pH6. 0(こ調整） ίここれらの菌をそ
4 2 4 2
れぞれ植菌し、 28°Cで約 2週間培養した。これを Tween 80水溶液（1 drop/ 100ml H〇）で懸濁し、ガラスフィルター (岩城硝子社製、商品番号 : 3G1)で菌糸を除去し
2
て胞子液を調製した。変異処理は 1 X 108— 109個の胞子に対し、 N-methyl-N'
— mtro— N— nitrosoguamdine (MNNu-) 用レヽて JareonKitmongkolらの方法 (S.
Jareonkitmongkol et al. JAOCS, 69, 939-944, 1992)にしたがって行った。
[0087] 変異処理した胞子を 1. 0mg/mlの 5— FOAと 0· 05mg/mlのゥラシルを含む GY 培地（2%グノレコース、 1 %酵母エキス、 2%寒天、 pH6. 0に調整）に塗布し、 28°Cで
4日間培養して生育できる 5—FOA耐性株を、 M. hygrophilaから 2株、 M.
chlamydosporaから 1株得た。これらの株に対してゥラシル要求性の評価を行った。
[0088] すなわち、 SC培地 (Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate
(Difco社製） 5. 0g、（NH ) SO 1. 7g、グノレコース 20g、寒天 20g、アデニン 20mg、
4 2 4
チロシン 30mg、メチォニン 1. Omg、ァノレギニン 2. Omg、ヒスチジン 2. Omg、リジン 4 . Omg、トリプトファン 4. Omg、スレオニン 5. Omg、イソロイシン 6. Omg、ロイシン 6. Omg、フエ二ルァラニン 6. Omg/リットル）およびゥラシル添加 SC培地（ゥラシル 50 mgZリットル）における生育の比較を行った。
[0089] その結果、得られた 5-FOA耐性株すべてが、ゥラシノレを含む培地では親株と同様 に生育できたが、ゥラシルを含まない培地では生育が悪ぐそのうち M. hygrophilaの 1株（MH- A ura-lと命名）、 Μ· chlamydosporaの 1株（MC_ A ura-lと命名）はまったく 生育できなかった。
[0090] (2)酵素活性の測定
上記の 2株をゥラシル添カ卩 GY培地で 28°C、 4日間振とう培養した。菌体の無細胞 抽出液の調製は、 Wynnらの方法（J. P. Wynn et al. Microbiology, 146, 2325-2331,
2000)を改良して行った。
[0091] すなわち、 0. 05mg/mlのゥラシルを含む GY液体培地で 28°C、 4日間培養した 菌体を、 5mM j3 _メルカプトエタノールを含む 0. 1Mトリスバッファー（pH7. 5)で懸 濁した。その後、フレンチプレスを用い 35MPaにて細胞を破砕し、遠心した。得られ た上清を無細胞抽出液とした。さらに、 100,000 X g、 60minの条件で超遠心すること でオノレガネラを除き、可溶性画分を得た。
[0092] 得られた可溶性画分を用いて、ォロチジノレ酸ピロホスホリラーゼ (ura5p)活性を、
Umezuらの方法（K. Umezu et al. J. Biochem., 70, 249-262, 1971)にしたがって測定 した。その結果、いずれの株でも ura5p活性は検出限界以下であった。
[0093] (3) pDura5による形質転換 (形質転換工程）
M. nygrophila MH- A ura-lま 7こ f M. chlamydospora MC_ A ura_lを Czapek_Dox 培地に植菌し、 28°Cで 2週間培養して胞子を形成させた。上記（1)に記載のとおり胞 子を回収した。
[0094] 形質転換株の選択培地には SC寒天培地を用いた。 pDura5はパーティクルデリバ リー法により宿主に導入 (形質転換)した。 PDS-1000/Heパーティクルデリバリー システム（商品名、 BIO RAD社製）による遺伝子導入は、ヘリウム圧： 7590kPa (110 Opsi)、チャンバ一内の真空： 28インチ Hg、ターゲットとの距離 3cm、タングステン粒 子径 1. 1 μ mの条件で行った。遺伝子導入後、 28°Cで 2— 3日間培養すると、それ ぞれ十数個のコロニーが生育してきたので、これらを形質転換株として取得した。
[0095] なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様ま たは実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのよう な具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に 記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。 産業上の利用の可能性
[0096] 本発明にかかる脂質生産菌の育種方法は、上記のように、上記脂質生産菌の栄養 要求性株を宿主とし、マーカー遺伝子として上記栄養要求性を相補する遺伝子を用 いて、当該マーカー遺伝子を宿主に導入 (遺伝子導入段階)し、上記宿主の栄養要 求性の回復をマーカーとして形質転換株を選抜 (選抜段階)する形質転換工程を含 む構成である。それゆえ、モルティエレラ属に属する脂質生産菌を原種として、新規 品種 (新規株)を効率的かつ有効に生産することが可能となるという効果を奏する。ま た、本発明では、セルフクローニングが可能となるため、原種のモルティエレラ属の菌 力 適当な DNA断片を取得してこれを栄養要求性株に導入し、特定の遺伝子の発 現調節（高発現、発現時期の調節、発現抑制など)することが可能となり、脂質生産 量の増加、生産できる脂質の種類の改変、組成の改変等が可能な形質転換体すな わち新規株を得ることができるとレ、う効果を奏する。
[0097] モルティエレラ属の菌は脂質生産菌としてよく知られており、 M. alpinaのように信頼 性の高いものも含まれている。それゆえ、本発明を用いれば、例えば、脂質生産性を より一層高めた株を容易かつ効率的に生産することができる等の効果を奏する。
[0098] したがって、本発明は、モルティエレラ属の菌類を利用する各種醱酵技術に関わる 産業や、当該醱酵技術を用いた食品産業、医薬品産業等に利用することが可能で ある。

Claims

請求の範囲
[1] モルティエレラ（Mortierella)属に属する脂質生産菌の育種方法であって、
上記脂質生産菌の栄養要求性株を宿主とし、マーカー遺伝子として上記栄養要求 性を相補する遺伝子を用いて、当該マーカー遺伝子を宿主に導入する遺伝子導入 段階と、
上記宿主の栄養要求性の回復をマーカーとして形質転換株を選抜する選抜段階と を有する形質転換工程を含むことを特徴とする脂質生産菌の育種方法。
[2] 上記脂質生産菌は、モルティエレラ アルピナ（Mortierella alpina)、モルティエレラ ハイグロフイラ (Mortierella hygrophila)またはモノレティエレラ クラミドスポラ (
Mortierella chlamydospora)であることを特徴とする請求の範囲 1に記載の脂質生産 菌の育種方法。
[3] 上記栄養要求性株がゥラシノレ要求性株であることを特徴とする請求の範囲 1または
2に記載の脂質生産菌の育種方法。
[4] 上記マーカー遺伝子として、ォロチジン一 5'—リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子また はォロチジノレ酸ピロホスホリラーゼ遺伝子が用いられることを特徴とする請求の範囲 3 に記載の脂質生産菌の育種方法。
[5] 上記遺伝子導入段階では、エレクト口ポレーシヨン法、または、パーティクルデリバリ 一法が用いられることを特徴とする請求の範囲 1ないし 4の何れ力、 1項に記載の脂質 生産菌の育種方法。
[6] さらに、原種の脂質生産菌から栄養要求性株を取得する栄養要求性株取得工程を 含むことを特徴とする請求の範囲 1ないし 5の何れ力、 1項に記載の脂質生産菌の育 種方法。
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