JP2000125859A - 新規な選択マーカー遺伝子ならびにリゾムコール・プシルスの形質転換系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 リゾムコール属糸状菌、特にリゾムコール・
プシルスのための形質転換系、すなわち形質転換株のみ
を識別できる選択マーカー遺伝子、ならびに該遺伝子を
ベクターＤＮＡに挿入してなる形質転換用ベクター、該
遺伝子及びタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換
えベクターを提供する。 【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質を
コードするOMPデカルボキシラーゼ遺伝子をマーカー遺
伝子とし、ウラシル要求性のリゾムコール属糸状菌変異
株を宿主として、形質転換系を構築する。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質をコードする遺伝子。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、オロ
チジン-5'-1リン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタ
ンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オロチジン-5'-1
リン酸デカルボキシラーゼ（OMPデカルボキシラーゼ）
をコードする遺伝子に関する。また本発明は、この遺伝
子をマーカー遺伝子として含む組換えベクター、該組換
えベクターで形質転換されたリゾムコール属に属する糸
状菌形の形質転換体、及びこの形質転換体を用いたタン
パク質、特にムコール・レンニンの製造法に関する。ム
コール・レンニンは、チーズ製造に用いる凝乳酵素とし
て産業上有用である。

【０００２】

【従来の技術】リゾムコール属等の糸状菌は、デンプ
ン、タンパク質、脂質、セルロース等を分解する各種酵
素をはじめとする有用なタンパク質を菌体外に多量に分
泌していることが知られており、古くからこれら有用酵
素の生産菌として工業的に利用されてきた。近年、この
ような糸状菌のタンパク質分泌能力が注目され、遺伝子
工学的手法によって、産業上、有用なタンパク質をコー
ドする外来遺伝子を糸状菌の菌体に導入することによ
り、異種のタンパク質を菌体外に分泌・生産するような
菌株を創製するという、いわゆる菌株の分子育種の試み
がなされるようになった。

【０００３】しかしながら、大腸菌などの細菌や酵母と
異なり、糸状菌においては、自律複製型のプラスミドが
ほとんど知られておらず、糸状菌を形質転換させ得るよ
うなプラスミドや手法は種ごとに異なっている。さら
に、多くの糸状菌が胞子や菌糸などが多核細胞であるた
め、形質転換細胞の単離が困難である等の理由により、
糸状菌の高い利用価値にも関わらず、分子育種のための
手法としての形質転換技術の開発は遅れている。

【０００４】一方、真菌の接合菌に属するリゾムコール
・プシルス（Rhizomucor pusillus、旧名：ムコール・
プシルス(Mucor pusillus)）は、チーズ製造の際に凝乳
酵素として用いる仔牛レンネットの代替酵素の生産菌と
して発見された。現在では、リゾムコール・プシルスや
リゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）等の生
産するムコールレンネットが凝乳酵素のかなりの部分を
占めるようになった。尚、ムコールレンネット中の凝乳
酵素タンパク質は、酸性プロテアーゼであり、ムコール
レンニン、ムコールペプシン、あるいはリゾムコールペ
プシン等と呼ばれているが、本明細書ではムコールレン
ニンと呼ぶこととする。

【０００５】このように、リゾムコール・プシルスをは
じめとするリゾムコール属糸状菌の多くは、凝乳酵素の
生産菌等、食品用として永く使用されてきたために、菌
自体の安全性は広く認知されている。一方、糸状菌の中
でも、ある種の菌は菌体外に強力な非特異的タンパク質
分解活性を持ったプロテアーゼを分泌するために、生産
された異種タンパク質が自身のプロテアーゼによって分
解されるという問題が生じた。これに対し、リゾムコー
ル・プシルスは、菌体外タンパク質中の非特異的タンパ
ク質分解活性が低いことが知られている。

【０００６】上記の理由から、リゾムコール・プシルス
は異種の有用なタンパク質生産のための宿主としても優
れた菌株であるといえる。糸状菌の形質転換を行った例
としては、基礎的な分子生物学の研究に重要なアスペル
ギルス・ニジュランス［Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
81, 1470 (1984)］、ノイロスポーラ・クラッサ［Mol.
Cel. Biol., 4, 117 (1984)］、発酵工業や産業用酵素
生産に重要なアスペルギルス・オリゼ［Argc. Biol. Ch
em., 51, 323 (1987)］、トリコデルマ・リーセイ［Gen
e, 61, 155 (1987)］、接合菌類としてはリゾプス・ニ
ベウス［Curr. Genet., 19, 221 (1991)］、ムコール・
シルシネロイデス［Carlsberg Res. Commun., 49, 691
(1984)］などが知られている。

【０００７】一般に、プラスミド等のベクターを宿主細
胞に導入して発現させるためには、形質転換株のみを識
別できる選択マーカーをプラスミドに組み込むことが必
要である。その方法としては、(i)アミノ酸あるいは核
酸要求性の相補、(ii)ポジティブ選択マーカーとして、
抗生物質などに対する耐性遺伝子を利用する等が挙げら
れる。しかし、(ii)については、一般に接合菌は、子の
う菌類等に比べて薬剤に対して耐性であると言われてお
り、形質転換体の選択の際にバックグラウンドが高くな
るので、より明瞭な形質転換体の選択のためには、(i)
が好ましい。

【０００８】(i)の方法では、あらかじめアミノ酸や核
酸要求性変異株とその変異を相補する遺伝子を取得する
ことが必要である。一般に糸状菌では細菌や、酵母など
に比べて栄養要求性変異株の取得が難しい。特に接合菌
類では、菌糸に隔壁がなく、胞子のう胞子が多核である
ためにさらに取得が難しい。

【０００９】栄養要求性形質転換マーカーとして現在ま
でに報告があった例として、アルギニン合成系のargB、
ロイシン合成系のleuA、トリプトファン合成系のtrpC、
ピリミジン合成系のpyrG等が挙げられている。これらの
マーカー遺伝子には、種を越えて栄養要求性変異を相補
しうるものもあるが、形質転換の際の形質転換頻度が極
端に低かったり、宿主染色上に多コピーに挿入されてし
まうという理由から、宿主自身の遺伝子をクローニング
し、マーカー遺伝子として使用するのがより好ましい。

【００１０】これまで、リゾムコール・プシルスと近縁
であるムコール・シルシネロイデスにおいては、ロイシ
ン要求性変異を相補するプラスミドが取得され、プラス
ミド上にのっている遺伝子が、ロイシン生合成系のイソ
プロピルリンゴ酸イソメラーゼをコードしていることが
明らかになっている［Gene, 84, 335 (1989)］。

【００１１】しかしながら、リゾムコール・プシルス
は、前述の如く、遺伝子工学的手法により異種のタンパ
ク質を菌体外に分泌・生産する宿主として、また凝乳酵
素の生産菌として産業上有用でありながら、それの形質
転換系の確立、すなわちその核酸要求変異株、ならびに
核酸要求変異を相補するプラスミドの取得には至ってい
ないのが現状である。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、リゾムコール属糸状菌、特にリゾムコール・プ
シルスのための形質転換系、すなわち形質転換株のみを
識別できる選択マーカー遺伝子、ならびに該遺伝子をベ
クターＤＮＡに挿入してなる形質転換用ベクター、該遺
伝子及びタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換え
ベクターを提供することにある。

【００１３】本発明のさらなる課題は、上記組み換えベ
クターを用いて形質転換したリゾムコール属糸状菌、な
らびに該糸状菌を培地に培養することにより、タンパク
質を製造する方法を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、ウラシル要求性変
異株の選択マーカー遺伝子として機能しうるオロチジン
-5'-1リン酸デカルボキシラーゼ（以下、「OMPデカルボ
キシラーゼ」ともいう）をコードする遺伝子を、リゾム
コール・プシルスから新規にクローニングし、これを組
み込んだプラスミドを用いてリゾムコール・プシルスの
ための形質転換系を確立することに成功し、本発明を完
成させるに到った。

【００１５】すなわち、本発明は、以下のとおりであ
る。 （１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコード
するＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質をコードする遺伝子。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、OMP
デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。

【００１６】（２）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ
である請求項１記載の遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号８４０〜１０１９及び１０９０〜１６
９８からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号８４０〜１０１９及び１０９０〜１６
９８からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつ、OMPデカルボキシラーゼ活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【００１７】（３）前記（１）の遺伝子を含む組換えベ
クター。 （４）さらに目的タンパク質をコードする遺伝子を含む
（３）の組換えベクター。 （５）目的タンパク質がムコール・レンニンである
（４）の組換えベクター。 （６）前記（４）の組換えベクターで形質転換されたリ
ゾムコール属に属する糸状菌の形質転換体。 （７）リゾムコール属に属する糸状菌がリゾムコール・
プシルスである（６）の形質転換体。

【００１８】（８）前記（６）の形質転換体を培地に培
養し、培養物中に目的タンパク質を蓄積させ、培養物か
ら前記タンパク質を採取することを特徴とするタンパク
質の製造法。

【００１９】尚、本発明において「OMPデカルボキシラ
ーゼ活性」とは、オロチジン-5'-1リン酸からカルボキ
シル基を遊離させ、ウリジン-5'-１リン酸を生成する反
応を触媒する活性をいう。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２１】＜１＞リゾムコール・プシルスのOMPデカ
ルボキシラーゼをコードする遺伝子の単離 （１）リゾムコール・プシルスのウラシル要求性株の取
得 OMPデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、リゾム
コール・プシルスの染色体DNAライブラリー又はcDNAラ
イブラリーから、公知のOMPデカルボキシラーゼ遺伝子
の保存性の高い領域の配列に基づいて作製したプライマ
ーを用いたPCR（ポリメラーゼチェインリアクション：p
olymerase chain reaction、White, T. J. et al., Tre
nds Genet., 5, 185 (1989)）により、あるいは前記PCR
産物をプローブとするハイブリダイゼーションにより、
単離することができる。また、OMPデカルボキシラーゼ
をコードする遺伝子は、リゾムコール・プシルスの染色
体DNAライブラリー又は発現ベクターを用いたcDNAライ
ブラリーでリゾムコール・プシルスのウラシル要求性変
異株を形質転換し、ウラシル要求性が相補された形質転
換株を選択し、該形質転換体から組換えDNAを回収する
ことによっても、取得され得る。

【００２２】得られたDNA断片がOMPデカルボキシラーゼ
をコードしていることは、該DNA断片を適当な宿主で発
現させ、発現産物がOMPデカルボキシラーゼ活性を示す
ことを調べることによって確認することができる。

【００２３】リゾムコール・プシルスのウラシル要求性
変異株の取得については、Mol. Gen.Genet. 197, 345-3
46 (1984)記載のサッカロマイセス・セレビシエ（Sacch
aromyces cerevisiae）のアミノ酸要求性変異株の取得
方法を改良して行うことができる。すなわち、UV等を用
いてリゾムコール・プシルスの胞子を生存率が数％にな
るように変異処理し、それをウラシル、5−フロオロオ
ロチン酸(5-FOA)を含む培地で培養する。5-FOAはオロチ
ン酸アナログでありオロチジン-5'-1リン酸ホスホリボ
シルトランスフェラーゼ、オロチジン-5'-1リン酸デカ
ルボキシラーゼ（OMPデカルボキシラーゼ）により致死
性のピリミジンアナログである5-フルオロウリジン-1リ
ン酸（5-フルオロ-UMP)に変換される。したがって、ウ
ラシルと5-FOAを含む培地で生育可能な株は、この２種
の酵素活性のいずれかを欠損したウラシル要求性変異株
であると考えられる。

【００２４】（２）選択マーカー遺伝子の単離・同定 （ｉ）リゾムコール・プシルスのOMPデカルボキシラー
ゼ遺伝子の取得 リゾムコール・プシルスからウラシル生合成系のOMPデ
カルボキシラーゼをコードする遺伝子をクローニングす
るにあたり、公知のムコール・シルシネロイデスのOMP
デカルボキシラーゼ遺伝子であるpyrG［Gene, 116(1),
59-67 (1992)］、リゾプス・ニヴェウスのOMPデカルボ
キシラーゼ遺伝子であるpyr4［Curr. Genet., 27(5), 4
72-478 (1995)］、そしてニューロスポラ・クラッサのO
MPデカルボキシラーゼ遺伝子であるpyr4［Gene, 43(1-
2), 51-58 (1986)］の３種の遺伝子間でアミノ酸配列が
高度に保存されている部分（図１）から選択した配列、
例えば配列表の配列番号３及び４に示す塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドをプライマーとし、リゾムコール
・プシルスの染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、リ
ゾムコール・プシルスのOMPデカルボキシラーゼ遺伝子
の一部を取得する。

【００２５】これをプローブとし、リゾムコール・プシ
ルスの染色体ＤＮＡライブラリーに対してコロニー・ハ
イブリダイゼーション又はプラーク・ハイブリダイゼー
ションを行い、リゾムコール・プシルスのOMPデカルボ
キシラーゼ遺伝子全長を取得する。遺伝子全長を取得す
るためには、予め種々の制限酵素で消化したリゾムコー
ル・プシルスの染色体ＤＮＡに対してサザン・ハイブリ
ダイゼーションを行い、単一のバンドが検出される制限
酵素をライブラリーの作製に用いることが好ましい。

【００２６】（ii）リゾムコール・プシルス染色体ＤＮ
Ａライブラリーの作製 リゾムコール・プシルスからウラシル生合成系のOMPデ
カルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む染色体ＤＮ
Ａを抽出する方法としては、公知のいずれの方法もが使
用できる。その例としては、Nucl. Acids. Res., 14, 6
(1986)が挙げられる。

【００２７】その際、リゾムコール・プシルスとして、
（財）発酵研究所（ＩＦＯ）から入手可能なＩＦＯ４５
７８株、Faculty of Engineering, Hiroshima Universi
ty,Hiroshima, Japanから入手可能なＨＵＴ１１８６等
が利用できる、リゾムコール・プシルスを使用する際に
は、例えばＹＰＤ液体培地［1% Yeast extract、2% Bac
to peptone（以上、Difco社製）、2%ブドウ糖］(pH4.5)
で培養したものを使用することができる。

【００２８】得られた染色体ＤＮＡは、適当な制限酵
素、例えばPstＩで切断し、適当なベクター、例えばpUC
19のBAP（bacterial alkaline phosphatase）処理したP
stＩ切断部位にDNAリガーゼを用いて連結した後、大腸
菌を形質転換することにより染色体ＤＮＡライブラリー
を作製することができる。

【００２９】使用し得るベクターとしては、大腸菌で自
律複製可能で選択マーカーを持つベクターであればいず
れでもよく、具体的には、プラスミドpUC19以外に、pUC
18、pUC118、pUC119、pBR322等が挙げられる。

【００３０】以下に、制限酵素、BAP、DNAリガーゼによ
る処理条件の一例を示す。DNAの制限酵素による処理
は、PstIの場合は、10mM MgCl₂／50mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.5)／100mM NaCl／1mMジチオスレイトールで行う。

【００３１】pUC19の切断は、10ngのpCU19を上記反応液
中で37℃、１時間、PstＩを10ユニット用いて行う。BAP
処理は50mMトリス塩酸緩衝液(pH9.0)／1mM MgCl₂中で、
大腸菌C75株のアルカリ性ホスファターゼ１ユニットを
用いて65℃で1時間処理する。

【００３２】染色体ＤＮＡ断片とpUC19のライゲーショ
ンは、66mMトリス塩酸緩衝液(pH7.6)／6.6mM MgCl₂／0.
1mM ATP／10mMジチオスレイトール中で、T4 DNAリガー
ゼ350ユニットを用いて行う。

【００３３】（iii）OMPデカルボキシラーゼをコードす
る遺伝子を保持するクローンの選抜 上記のようにして得られたプラスミドから、OMPデカル
ボキシラーゼをコードする遺伝子断片を含むベクタープ
ラスミドを選択するには、微生物、例えば大腸菌に上記
のプラスミドを導入して得られる形質転換体を適当な手
段により選抜すればよい。

【００３４】選択する方法としては、作製したライブラ
リーを保持する大腸菌のコロニーをメンブランにトラン
スファーし、（１）でPCRにより取得したリゾムコール
・プシルスのOMPデカルボキシラーゼ遺伝子の一部をプ
ローブとして、先に行った染色体ＤＮＡに対するサザン
ハイブリダイゼーションでシグナルが検出された条件に
したがって、コロニーハイブリダイゼーションを行う。
このようにしてベクタープラスミドpUC19にOMPデカルボ
キシラーゼをコードする遺伝子が組み込まれたプラスミ
ドを有する形質転換体を得ることができる。

【００３５】後記実施例において、上記のようにして得
られたプラスミドは、pRPPyr4と命名された。pRPPyr4
は、ベクタープラスミドpUC19にリゾムコール・プシル
ス染色体由来の3.4kbのPstＩ断片（ＯＭＰデカルボキシ
ラーゼ遺伝子）が挿入されたものである。

【００３６】（iv）単離されたＤＮＡ断片（選択マーカ
ー遺伝子）の解析 上記のようにしてクローニングされたDNA断片（pRPPyr4
では約3.4kbの挿入断片）の塩基配列は、例えばエキソ
ヌクレアーゼを用いてデレーションシリーズを作成し、
ダイデオキシ法によって決定する。pRPPyr4中のクロー
ニング断片の塩基配列、及びこの塩基配列によってコー
ドされ得るアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示
す。また、このアミノ酸配列のみを配列番号２に示す。

【００３７】これまでにリゾムコール・プシルスのOMP
デカルボキシラーゼ遺伝子として報告がないことから、
決定された遺伝子配列を有する遺伝子は、新規である。
本発明のOMPデカルボキシラーゼ遺伝子は、コードされ
るOMPデカルボキシラーゼの活性が損なわれない限り、
１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位１若しくは複数の位置での１若しくは複数のア
ミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むOMP
デカルボキシラーゼをコードするものであってもよい。
ここで、「複数」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立
体構造における位置や種類によっても異なるが、２〜４
０個、好ましくは、２〜２０個、より好ましくは２〜１
０個である。

【００３８】上記のようなOMPデカルボキシラーゼと実
質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば
部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基
が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基
配列を改変することによって得られる。また、上記のよ
うな改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理に
よっても取得され得る。また、上記のような塩基の置
換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、OMPデカルボ
キシラーゼを保持する微生物の個体差、種や属の違いに
基づく場合などの天然に生じる変異も含まれる。

【００３９】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
な細胞で発現させ、発現産物のOMPデカルボキシラーゼ
活性を調べることにより、OMPデカルボキシラーゼと実
質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られ
る。また、変異を有するOMPデカルボキシラーゼをコー
ドするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配
列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号８
４０〜１０１９及び１０９０〜１６９８からなる塩基配
列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつ、OMPデカルボキシラーゼ活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっ
ても、OMPデカルボキシラーゼと実質的に同一のタンパ
ク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「スト
リンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリ
ッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されな
い条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難
であるが、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８
０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮ
Ａ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮ
Ａ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。

【００４０】＜２＞組換えベクターの構築 リゾムコール属糸状菌を形質転換するためのベクター
は、上記で得られる選択マーカー遺伝子を、発現を所望
するタンパク質（目的タンパク質）をコードする遺伝子
を含むベクターに連結することにより構築できる。

【００４１】本発明の組換えベクターを適用するリゾム
コール属糸状菌としては、リゾムコール・プシルス、リ
ゾムコール・ミーヘイ等が挙げられる。

【００４２】目的タンパク質をコードする遺伝子は、例
えば宿主と同種の遺伝子のように、リゾムコール属糸状
菌で機能するプロモーターを含んでいる場合には、その
ままベクターに挿入することによって使用することがで
きる。一方、異種遺伝子又は同種の遺伝子であってもプ
ロモーターを含んでいない遺伝子の場合は、通常、宿主
糸状菌で機能するプロモーターを目的タンパク質のコー
ド領域の上流に連結する必要がある。

【００４３】リゾムコール・プシルスで機能するプロモ
ーターとしては、3−ホスホグリセレートキナーゼ、グ
リセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、エノエノラーゼ等の解糖系酵素の遺伝子、オルニチ
ンカルバモイルトランスフェラーゼ、トリプトファンシ
ンターゼ等のアミノ酸合成系酵素の遺伝子、α−アミラ
ーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セ
ルラーゼ、アセトアミダーゼ等の加水分解酵素の遺伝
子、あるいはナイトレートレダクターゼ、オロチジン−
5'−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒド
ロゲナーゼ等の酸化還元酵素の遺伝子のプロモーターが
挙げられる。以上の遺伝子は、リゾムコール属糸状菌内
で機能すれば特に限定されないが、一般にはリゾムコー
ル属糸状菌由来のものが用いられ、好ましくは、リゾム
コール・プシルスのムコールレンニン生産性遺伝子のプ
ロモーターが挙げられる。

【００４４】ベクターに挿入させ、発現させ得るタンパ
ク質は、特に制限されないが、同種タンパク質としては
ムコールレンニン、異種タンパク質としては、凝乳酵素
である仔牛由来キモシン、他の動物、微生物由来のプロ
テアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ等が例示
される。

【００４５】ベクターとしては、リゾムコール属細菌の
形質転換に先立って大腸菌等の細菌を利用して、ベクタ
ーＤＮＡを調製し、ベクターＤＮＡと挿入ＤＮＡとを連
結し、あるいは組換えＤＮＡを調製するために、大腸菌
等の微生物細胞中で自律複製可能なベクターを用いるこ
とが好ましい。リゾムコール・プシルスでは自律複製可
能なプラスミドベクターは知られていないが、環状又は
直線状の組換えベクターを細胞中に導入し、染色体ＤＮ
Ａと相同組換えを起こさせることによって、形質転換さ
せることができる。相同組換えのための標的配列として
は、目的タンパク質をコードする遺伝子が同種由来の遺
伝子であるか、異種由来の遺伝子であっても相同性が高
い場合は、該遺伝子が標的配列となり得る。また、マー
カー遺伝子も、ウラシル要求性宿主のOMPデカルボキシ
ラーゼ遺伝子が欠損していない場合には、標的配列とな
り得る。さらに、他の相同組換えを起こしやすい標的配
列と相同な配列をベクターに挿入してもよい。

【００４６】具体的には、リゾムコール・プシルスにム
コールレンニンを発現させるプラスミドは、例えば後述
のpMPPのBamHI消化により得られた断片をpRPPyr4のBamH
I消化部位に連結することにより構築できる、pMPPと
は、[Nucl. Acids Res., 14, 19 (1986) 7557-7568]に
記載されるムコールレンニン生産性遺伝子の上流と下流
の配列をもとに作製したプライマー(BamHI siteを含む)
を用いて、リゾムコール・プシルスの染色体ＤＮＡに対
してPCRを行い、得られた増幅断片をBamHIで消化し、pU
C19のBamHI消化部位に連結することにより構築したプラ
スミドである。

【００４７】尚、本発明をムコールレンニンに適用する
場合には、ムコールレンニンは、仔ウシキモシンに性能
がより近づいた低耐熱性の変異型酵素が知られており
（米国特許第5,332,668、特開平５−１０３６６９
号）、野生型酵素遺伝子と同様に利用することができ
る。低耐熱性変異型ムコールレンニンをコードするＤＮ
Ａを含むプラスミドＪＳ５２、ＪＳ５３、ＪＳ５２５を
保持するサッカロマイセス・セレビシエの形質転換体
は、それぞれ通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所にFERM P-12511、FERM P-12514、FERM P-12513の受
託番号で寄託され、ブダペスト条約に基づく国際寄託に
移管され、それぞれFERM BP-3898、FERM BP-3890、FERM
BP-3899の受託番号で寄託されており、これらの寄託菌
株からムコールレンニン遺伝子を取得することができ
る。これらのＤＮＡがコードする変異型ムコールレンニ
ンは、野生型酵素では１０１番目のアミノ酸残基及び１
８６番目のアミノ酸残基がそれぞれAla、Glyであるのに
対し、ＪＳ５２では１０１番目のアミノ酸残基がThr
に、ＪＳ５３では１８６番目のアミノ酸残基がAspに、
ＪＳ５２５では１０１番目のアミノ酸残基がThr、１８
６番目のアミノ酸残基がAspに、それぞれ置換されてい
る。また、ムコールレンニン遺伝子の塩基配列は開示さ
れているので（米国特許第5,332,668、特開平５−１０
３６６９号）、コード領域に隣接する塩基配列を有する
プライマーを用いたPCRにより、リゾムコール・プシル
ス染色体ＤＮＡからコード領域全長を単離することがで
きる。

【００４８】＜３＞リゾムコール属糸状菌の形質転換体 上記のようにして得られた組換えベクターを用い、＜１
＞で確立したウラシル生合成系のOMPデカルボキシラー
ゼを欠損する変異株を形質転換する方法としては、糸状
菌において一般に用いられている方法を用いることがで
きる。例えば、細胞壁分解酵素によってプロトプラスト
化された菌体に、マーカー遺伝子を搭載した組換えベク
ターを添加し、塩化カルシウムとポリエチレングリコー
ル存在下でプロトプラスト融合を起こさせてベクターＤ
ＮＡを菌体に取り込ませる。具体的には、フィコマイセ
ス・プラケスリーアヌスで用いられているMol. Gen. Ge
net., 212, 120 (1988)記載の方法を改良して用いるこ
とができる。

【００４９】＜４＞タンパク質の製造法 上記の形質転換体を培地に培養し、組換えベクター中の
目的タンパク質遺伝子を発現させることによって、目的
タンパク質を製造することができる。目的タンパク質が
分泌タンパク質の場合は、発現産物は培地中に蓄積す
る。また、目的タンパク質が分泌性でない場合には、発
現タンパク質は宿主細胞内に蓄積する。

【００５０】形質転換体の培養は、特に制限されず、通
常リゾムコール属糸状菌に用いられる培地、例えばYPD
培地（1% Yeast extract, 2% bacto peptone, 2%グルコ
ース）で培養すればよい。培養条件は、用いる宿主菌株
によっても異なるが、例えば37℃で振とう培養する。

【００５１】目的タンパク質遺伝子を発現させるのに用
いたプロモーターが誘導性の場合には、培養の適当な時
点で誘導条件にして前記遺伝子を発現させる。尚、培養
に先だって、ウラシルを含まない培地で予め培養するこ
とによって、マーカー遺伝子とともに目的タンパク質遺
伝子が相同組換えによって染色体ＤＮＡから脱落した株
の出現を抑制することができる。

【００５２】培地又は菌体からの目的タンパク質の採取
は、通常の糸状菌のタンパク質の採取と同様に行えばよ
い。目的タンパク質は、溶媒沈殿、塩析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー等により、通常のタンパ
ク質と同様にして精製することができる。

【００５３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何等限定
するものではない。

【００５４】

【実施例１】生育にウラシルを要求する変異株の取得 分泌ムコールレンニンの高活性を指標に単離されたリゾ
ムコール・プシルス1116株（アスパラギン結合型糖鎖付
加変異株）において、その育種過程で生じた最小培地で
の生育が良好となったリゾムコール・プシルス1116R3株
（糖鎖付加変異形質は保持している）をポテト・デキス
トロース寒天培地(Difco)上に生育させ、37℃で3日から
7日保温し、胞子を形成させた。尚、リゾムコール・プ
シルスの菌株は、1116R3株に限られず、任意の菌株が使
用可能である。

【００５５】上記胞子をスプレッダーを用いて、数mlの
0.01%ポリオキシエチレンソルビタンモノオリエート溶
液（Tween#80）（東京化成工業社製）に懸濁し、懸濁液
を3G1ガラスフィルターで濾過し、胞子数をカウントし
た。胞子数が10⁸／10mlになるように0.01%ポリオキシエ
チレンソルビタンモノオリエート溶液で希釈し、10mlず
つシャーレに分注して攪拌しながらUVを照射し、死滅率
を99%とした。UV照射後の胞子を終濃度250μg/mlのウラ
シルと終濃度1.2mg/mlの5-FOAを含むYNB寒天培地にまい
て37℃で培養した。生育良好な5-FOA耐性コロニーから
終濃度250μg/mlのウラシルを含むYNB寒天培地および核
酸無添加のYNB寒天培地に釣菌し、ウラシルを含むYNB寒
天培地上でのみ生育可能な株を同様に３回植え継ぎ、変
異の安定化、ならびにウラシル要求性変異株の選択を行
った。

【００５６】上記のような方法でウラシルを要求する変
異株がリゾムコール・プシルス1116R3から18株得られ、
菌株名をそれぞれ1116U1〜1116U18とした。

【００５７】

【実施例２】 OMPカルボキシラーゼ遺伝子のクローニン
グ ＜１＞ハイブリダイゼーション用プローブの調製 公知のムコール・シルシネロイデス、リゾプス・ニヴェ
ウスそしてニューロスポラ・クラッサのOMPデカルボキ
シラーゼ遺伝子間で塩基配列が高度に保存されている部
分（図１）から選択した塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドをプライマーとし、リゾムコール・プシルスの染
色体ＤＮＡに対してPCRを行った。

【００５８】上流プライマーとして、 F1；5'-CCCGGATCCTTTGAAGATCGYAAATTTGCTGATATYGG-3'
（配列番号３） 下流プライマーとして R1；5'-CCCGGATCCAGGKGTTCTGTAYTGYTGACCCAAWCCATC-3'
（配列番号４） を、エスペックオリゴサービス株式会社に依頼して作製
した。

【００５９】PCRにはExpand^TMhigh fidelity PCR syste
m（ベーリンガー・マンハイム社製）を用い、サーマル
サイクラー（ＤＮＡ増幅装置）により行った。反応溶液
の組成及び反応条件は以下の通りである。

【００６０】 〔反応液組成〕 H₂O 78.0μl (10×) 反応バッファー 10.0μl dNTPs混合物（dATP、dGTP、dCTP、TTP、各2.5mM） 8.0μl 上流プライマーF1 100μM 1.0μl 下流プライマーR1 100μM 1.0μl リゾムコール・プシルス染色体ＤＮＡ 0.5mg/ml 1.0μl Expand^TMhigh fidelity PCR system酵素ミックス 1.0μl

【００６１】〔反応条件〕ポリメラーゼ連鎖反応の条件
は、以下の通りである。

【００６２】 94℃ 1.0分 55℃ 0.5分 72℃ 1.0分 この条件で反応を25サイクルで行った後、さらに72℃で
5分間インキュベートした。

【００６３】反応液を1.5%アガロース電気泳動し、増幅
された約400bpのＤＮＡ断片をゲルから単離、精製し
た。このＤＮＡ断片を制限酵素BamHI（宝酒造(株)製
以下、制限酵素は全て宝酒造(株)製）で処理し、同じく
同制限酵素で処理したpUC19にクローニングし、pRP400
を得た。このクローニングされた遺伝子断片の塩基配列
をサーモシーケナーゼ蛍光標識化プライマー・サイクル
シーケンシングキット（アマシャム社製）を用いてダイ
デオキシヌクレオシド法によって自動蛍光ＤＮＡシーケ
ンサー（model 400L LICOR)にて解析した。これによっ
て明らかになった約400bpの遺伝子配列は、公知のムコ
ール・シルシネロイデス、リゾプス・ニヴェウスそして
ニューロスポラ・クラッサのOMPデカルボキシラーゼ遺
伝子の部分配列と非常に高い相同性を示したので、この
遺伝子断片はリゾムコール・プシルスのOMPデカルボキ
シラーゼ遺伝子の一部であると判断した。

【００６４】次に上記のリゾムコール・プシルスのOMP
デカルボキシラーゼ遺伝子の一部約400bpをプローブと
したリゾムコール・プシルス染色体ＤＮＡサザンハイブ
リダイゼーションを行った。

【００６５】リゾムコール・プシルスIFO4578株の染色
体ＤＮＡを既知の方法[Nucl. AcidsRes., 14, 19 (198
6) 7557-7568]で抽出し、各種制限酵素で消化後、0.8%
アガロースゲルで電気泳動し、アマシャム社製のナイロ
ンメンブランフィルターHybondN⁺に添付のプロトコール
に従って、ゲル中のＤＮＡ断片を同メンブランにトラン
スファーした。

【００６６】前記のようにして得たpRP400を制限酵素Ba
mHIで消化し、1%アガロースゲルで電気泳動し、OMPデカ
ルボキシラーゼの構造遺伝子を含む約400bpの断片を単
離・精製した。次に、この断片をBcaBEST^TMランダムプ
ライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造(株)製）とα
-³²P dCTP（アマシャム社製）を用いて放射ラベルし、
これをプローブとしてアマシャム社のプロトコールに従
ってサザンハイブリダイゼーションを行った。

【００６７】その結果、ハイブリダイゼーションを42
℃、50%ホルムアミド存在下で行い、ハイブリダイゼー
ション後のメンブランの洗浄を0.1×SSC、室温で行うと
いう条件で、フィルム上に強いシグナルが検出された。
さらに、リゾムコール・プシルスの染色体ＤＮＡを制限
酵素PstIで消化したものについては、約3.4kbに一本の
シグナルが検出された。

【００６８】＜２＞リゾムコール・プシルス染色体ＤＮ
Ａライブラリーの作製とコロニーハイブリダイゼーショ
ン リゾムコール・プシルスIFO4578株の染色体ＤＮＡの10
μgを制限酵素PstIの30Uで37℃、12時間反応させた。反
応後、0.8%アガロースゲルで電気泳動し、約3.4kbのＤ
ＮＡバンドをジーンクリーンIIIキット(BIO101社製）で
単離、精製した。得られたＤＮＡフラグメントの一部を
制限酵素PstIで消化した100ngのpUC19と混合し、T4ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造(株)製）を用い、添付のプロトコー
ルに従ってライゲーション反応を行った。16℃、12時間
ライゲーション反応を行い、反応液の一部を大腸菌K-12
株 JM109コンピタントセル（宝酒造(株)製）に加え、
添付のプロトコールに従って形質転換を行い、アンピシ
リン添加のLB寒天培地上にpUC19プラスミド上に外来Ｄ
ＮＡのインサートを持つ約1000株の形質転換体を取得す
ることができた。これをリゾムコール・プシルス染色体
ＤＮＡのサブライブラリーとした。

【００６９】次に、リゾムコール・プシルス染色体ＤＮ
Ａのサブライブラリーである約1000個の大腸菌コロニー
を１株ずつ数枚のアンピシリン添加のLB寒天培地上に整
列して植菌し、37℃、12時間培養してコロニーを形成さ
せた。寒天培地上にコロニーをナイロンメンブランフィ
ルターHybond N⁺（アマシャム社製）に、添付のプロト
コールに従って菌体のトランスファー、メンブラン上の
溶菌、ＤＮＡの固定を行った。

【００７０】コロニーハイブリダイゼーションは、以下
の条件で行った。ＤＮＡが固定されたメンブランは、ハ
イブリダイゼーション溶液(6×SSC／5×デンハルト溶液
／0.5%ドデシル硫酸ナトリウム／50%ホルムアミド／0.0
1M EDTA／1mgサケ精子ＤＮＡ）で、まず42℃、2時間の
プレハイブリダイゼーションを行い、その後、ハイブリ
ダイゼーション溶液に先に放射ラベルしたpRP400の制限
酵素BamHI消化の約400bp断片をプローブとして加え(5〜
10ng/ml)、37℃、12時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。反応後の洗浄は、まず、2×SSC／0.1%SDS溶液中、
室温で１時間行い、続いて0.1×SSC／0.1%SDS溶液中、
室温で１時間行った。その後、Ｘ線フィルムを用いてオ
ートラジオグラフィーを行ったところ、フィルム上に１
個の強いシグナルが検出された。それらのシグナルに相
当するコロニー１株をマスタープレートからピックアッ
プし、200mlのLB液体培地［1% Tryptone／0.5% Bacto p
eptone(Difco社製)／0.5% NaCl］で培養し、アルカリ法
でプラスミドＤＮＡを回収し、塩化セシウム密度勾配遠
心で精製し、1μg/μlの濃度になるようにTE緩衝液［10
mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)／1mM EDTA］に溶解した。
このプラスミド名をpRPPyr4とし、以下に示すウラシル
生合成系のOMPデカルボキシラーゼを欠損する変異株の
形質転換実験で選択マーカー遺伝子として使用した。

【００７１】＜３＞プラスミドpRPPyr4によるリゾムコ
ール・プシルスの形質転換 ウラシル生合成系のOMPデカルボキシラーゼを欠損する
変異株である1116U1株〜1116U18株のうちの一株1116U17
株を、400μg/mlウラシルを含むこうじ寒天培地[10%こ
うじ抽出液（pH5.3）、2%寒天]上で37℃、4日間培養
し、胞子を形成させた。これらのプレートから、0.01%
ポリオキシエチレンソルビタンモノオリエート溶液数ml
にスプレッダーを用いて胞子を分散させ、3G1ガラスフ
ィルターで菌糸を取り除き、胞子数をカウントした。胞
子懸濁液から胞子数3×10⁸個を500ml坂口フラスコ中の4
00μg/mlウラシルを含む50mlのYPD液体培地［1% Yeast
extract／2% Bact peptone(Difco社製）／2%グルコース
(pH4.5)］に接種し、37℃で18〜19時間振とう培養し
た。この際に培養液の一部をサンプリングし、顕微鏡で
菌の生育を観察し、胞子がスウェリング（膨張）を終了
し、培養中の全ての胞子について菌糸の出芽がほぼ同時
におきていることを確認する必要がある。菌糸の出芽と
成長が同調していないと、後のプロトプラストの作製の
際に、形質転換可能なプロトプラストの収量の低下を引
き起こすことがわかった。形質転換可能なプロトプラス
トの調製に好適な細胞を得るためには、培養温度の維持
と培養時間の調節がきわめて重要であった。

【００７２】培養液の残りを1500rpm、5分間遠心して出
芽してすぐの若い菌糸を集めた。この菌体を10mlの0.5M
ソルビトール溶液に再び懸濁し、遠心、洗浄を二回繰り
返した。この洗浄菌体を1500rpm、5分間遠心し、5mlの
プロトプラスト化緩衝液［0.5Mソルビトール／10mMリン
酸ナトリウム緩衝液(pH6.7)］に懸濁した。

【００７３】この懸濁液に、同プロトプラスト化緩衝液
に溶解した溶菌酵素溶液［5mg/mlノボザイム234（ノボ
・ノルディスク社製）／3mg/mlキナーゼ（シグマ社製）
／3mg/mlキトサナーゼ（和光純薬工業社製）］5mlを添
加し、30℃、2〜3時間、胞子のほとんどがプロトプラス
ト化するまで緩やかに振とうした。この反応液を1200rp
m、5分間遠心し、0.5Mソルビトール溶液20mlで沈殿物を
2回洗浄した後、1200rpm、5分間遠心し、形質転換緩衝
液［0.5Mソルビトール・25mM CaCl₂／10mMトリス塩酸緩
衝液(pH7.6)］に、プロトプラスト濃度が1×10⁷/mlにな
るように懸濁し、プロトプラスト溶液とした。

【００７４】プロトプラスト溶液の1mlを氷冷し、コロ
ニーハイブリダイゼーションによってクローニングした
pRPPyr4のプラスミド溶液(1μg/μl）20μlあるいは対
照として同濃度のpUC19プラスミドを10μl加え混合後、
さらに氷上に5分間静置した。さらに1.0mlのPEG溶液［4
0% PEG3350(シグマ社製）／25mM CaCl₂／10mMトリス塩
酸緩衝液(pH7.6)］を添加し混合後、室温に30分間静置
した。

【００７５】この溶液に10mlの形質転換緩衝液を添加し
て混合後、1200rpm、5分間遠心し、さらに10mlの形質転
換緩衝液で洗浄後、同緩衝液2mlに再懸濁した。この懸
濁液200mlずつを、20mlの2%寒天と0.5Mソルビトールを
含むYNB培地(pH4.6)からなるプレート上にのせ、さらに
あらかじめ48℃に保温しておいた1%寒天と0.5Mソルビト
ールを含むYNB培地(pH4.6) 3mlを重層し、混合後固化さ
せた。

【００７６】このプレートを37℃で4日程度保温する
と、1116U17株のプロトプラストにpRPPyr4プラスミドを
添加したサンプルはプレート上に幾つかのセクターが出
現するが、pUC19プラスミドを加えたサンプルに生育は
見られなかった。1116U17株にpRPPyr4を加えて出現した
セクターの7株をYNB寒天培地(pH4.5)に植え継ぎ、胞子
を20%グリセロールに懸濁して、これらをプラスミドpRP
Pyr4による形質転換体として-80℃で凍結保存した。

【００７７】さらにこれらの1116U17から得た形質転換
体7株を、ポテト・デキストロース寒天培地で選択圧の
ない条件で植え継いで単胞子分離を繰り返した後、再度
YNB寒天培地で生育をみたが、４回の単胞子分離の後も
安定に形質を保持していた。次に、1116U17株のpRP1に
よる形質転換体の染色体ＤＮＡに挿入されていると思わ
れる、pRPPyr4プラスミドＤＮＡをサザンハイブリダイ
ゼーションによって検出した。1116U17株のpRPPyr4によ
る形質転換体7株と親株である1116R3株、また形質転換
前の1116U17株より、公知の方法[Nucl. Acids Res., 1
4, 19 (1986)7557-7568]で染色体ＤＮＡを抽出し、この
ＤＮＡを制限酵素SacIで消化した。これを1.0%アガロー
スゲルで電気泳動し、ナイロンメンブランフィルター H
ybondN⁺(アマシャム社製）に添付のプロトコールに従っ
てトランスファーし、BcaBEST^TMランダムプライマーＤ
ＮＡラベリングキット（宝酒造社製）を用い、α-³²PdC
TP（アマシャム社製）で放射ラベルしたpUC19プラスミ
ドをプロープとして、固定化した染色体ＤＮＡに対して
サザンハイブリダイゼーションを行った。

【００７８】その結果、形質転換体5株いずれにおいて
も用いたＤＮＡプローブとハイブリダイズするpUC19プ
ラスミドの全長に相当する約2.6kbのバンドが検出され
たのに対し、親株の1116R3株、また1116U17株において
は検出されなかった。これらの結果は、形質転換体にお
いて、プラスミドpRPPyr4が導入され、その結果pRPPyr4
に含まれる遺伝子が発現し、その遺伝子産物がウラシル
生合成系のOMPデカルボキシラーゼの欠損を補ったため
に、核酸を含まない培地での生育が可能になったことを
示す。また、pUC19プラスミドでは形質転換体が得られ
ないことから、pUC19自身がコードしている遺伝子の産
物には宿主変異株の変異を相補しうるものはなく、pUC1
9にクローニングされた遺伝子断片の中の遺伝子が変異
の相補に関与していることを示している。

【００７９】＜４＞pRPPyr4プラスミドに含まれる約3.4
kb遺伝子断片の全塩基配列の決定 pRPPyr4（図２）は、以下に示す数種類に制限酵素で消
化した後、1%アガロースゲルで電気泳動した。これから
以下に示す大きさのバンドを回収し、回収した断片と同
じ制限酵素で消化したプラスミドpUC19にサブクローニ
ングした。

【００８０】PstI, EcoRI；約1.9, 1.5kbの２つの断片
（それぞれプラスミドpEP1、pEP2とした） PstI, BglII；約1.0, 1.7, 0.7kbの３つの断片（それぞ
れプラスミドpBP1、pBB2, pBP2とした）

【００８１】以上に示した計５断片をザブクローニング
したプラスミド５種類のＤＮＡをアルカリ法で抽出し
た。

【００８２】これらの断片を鋳型として、サーモシーケ
ナーゼ蛍光標識化プライマーサイクルシーケンシングキ
ット（アマシャム社製）を用い、キット添付のプロトコ
ールに従ってポリメラーゼ反応を行い、自動蛍光ＤＮＡ
シーケンサー（model 400L LICOR)によって、遺伝子配
列の解析を行った。その結果、3403bpからなるOMPデカ
ルボキシラーゼ遺伝子を含むPstI断片の全塩基配列が決
定された（配列番号１）。この塩基配列から、この遺伝
子は新規な遺伝子であることがわかった。

【００８３】配列番号１に示す塩基配列及びアミノ酸配
列について、公知のOMPデカルボキシラーゼ遺伝子との
相同性を検索を行ったところ、プローブに相当する領域
については、リゾプス・ニベウス［Curr. Genet., 19,
221 (1991)］のpyrGと塩基配列で79.94%、アミノ酸配列
で92.18%、及び、ムコール・シルシネロイデス［Carlsb
erg Res. Commun., 49, 691 (1984)］のpyr4と塩基配列
で79.7%、アミノ酸配列で89.8%の相同性が、それぞれ認
められた。また、コード領域全域については、リゾプス
・ニベウスのpyrGと塩基配列で72.9%、アミノ酸配列で7
9.9%、ムコール・シルシネロイデスのpyr4と塩基配列で
74.1%、アミノ酸配列で82.2%、及びノイロスポーラ・ク
ラッサ［Mol. Cel. Biol., 4, 117 (1984)］のpyr4と塩
基配列で53.1%、アミノ酸配列で45.6%の相同性が、それ
ぞれ認められた（図１参照）。

【００８４】

【実施例３】リゾムコール・プシルスのムコールレンニ
ン生産性増強株の取得 ＜１＞リゾムコール・プシルス1116U17株のムコールレ
ンニン遺伝子による形質転換 リゾムコール・プシルスへ、既にクローニングされてい
るムコールレンニン遺伝子を新たに導入し、遺伝子投与
効果によるレンニン生産性増強株の取得を行った。

【００８５】まず、リゾムコール・プシルスのムコール
レンニン遺伝子をリゾムコール・プシルスF27株から、
配列番号５、６に示す塩基配列を有するプライマー(Bam
HI siteを含む)を用いてPCRにより増幅し、増幅産物を
制限酵素BamHIで消化し、1.0%アガロースゲルで電気泳
動し、ムコールレンニン遺伝子を含む約1.9kbの断片を
単離、精製した。制限酵素BamHIで消化しアルカリフォ
スファターゼ処理したpUC19にこの断片をクローニング
し、これをpMPPとした。次に、pMPPをBamHI酵素で消化
し、1.0%アガロースゲルで電気泳動後、約1.9kbの断片
を単離、精製し、この断片を制限酵素BamHIで処理したp
RPPyr4と混合し、T4ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）を使用
してライゲーションを行い、プラスミドpMP4を得た（図
３）。

【００８６】このpMP4を用いて、上記の方法でリゾムコ
ール・プシルス1116U17株を形質転換した。選択培地に
生育してきた形質転換体５株（RM1、RM2、RM3、RM4、RM
5）を任意に選択し、それぞれYNB寒天培地(pH4.5)で植
え継いで単胞子分離をしてから胞子を回収し、10mlのYP
D培地［1% Yeast Extract／2% Bacto Peptone／2%グル
コース］に接種し、振とう培養器で37℃、3日間培養し
た。また、親株である1116R3株及び上記と同様にしてpR
PPyr4で形質転換した1116U17株（TP5）も、同条件で培
養した。

【００８７】培養後、菌体と培養液を濾別し、乾燥菌体
重量に反比例する量の培養液をSDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動し、分画されたタンパク質をニトロセルロ
ースフィルターにトランスファーし、ウサギ抗リゾムコ
ール・プシルスムコールレンニン血清でウエスタンブロ
ッティングを行った。解析の結果、pMP4形質転換体５株
のうち２株において、抗体と反応するタンパク質の量
は、バンドのシグナル強度から親株である1116R3株やpR
PPyr4の形質転換体より明らかに多く、７〜８倍のムコ
ールレンニンを生産していることがわかった（図４）。

【００８８】＜２＞リゾムコール・プシルスのムコール
レンニン生産性増強株が産出するムコールレンニンの凝
乳活性測定 10ml YPD培地(1% Yeast extract／2% bacto peptone／2
%グルコース)を入れた大試験管に、pMP4で形質転換した
1116R3株のうちの一株（RM1）の胞子約10⁵を植菌して37
℃で振とう培養した。１日目〜５日目の培養液より、菌
体を遠心と0.45μmのフィルトレーションにて除き、培
養液をそのまま100μl、またはセントリコン^TM10(500P
K)にて10倍濃縮した溶液を100μl用いて活性を測定し
た。活性値はYPD 1mlあたりのユニット数に換算して表
した。尚、１ユニットは、35℃、40分間で1mlのスキムミ
ルク溶液(10mM CaCl₂、12%スキムミルク）を凝固するの
に必要な酵素量である。同様に、親株である1116R3株に
ついて、酵素活性を測定した。結果を表１に示す。

【００８９】

【表１】 表１ ───────────────────────────── 培養日数 1 2 3 4 5 ───────────────────────────── 1116R3株 0 0 0 0.4 1.0 0 0 0 0.9 1.2 凝乳活性 0 2.1 2.8 ────────────────────── [units/ml] RM1株 0 4.4 11.4 18.2 19.7 0 6.6 11.9 20.0 19.8 16.9 25.8 20.5 ─────────────────────────────

【００９０】

【発明の効果】本発明により、リゾムコール・プシルス
由来の新規OMPデカルボキシラーゼをコードする遺伝
子、及び該遺伝子を用いたリゾムコール属糸状菌のため
の形質転換系が提供される。

【００９１】

【配列表】Sequence Listing

【００９２】 <110> 名糖産業株式会社(Meito Sangyo Co., Ltd.) <120> 新規な選択マーカー遺伝子ならびにリゾムコール・プシルスの形質転換系 <130> P-5933 <141> 1998-10-26 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００９３】 <210> 1 <211> 3403 <212> DNA <213> Rhizomucor pusillus <220> <221> CDS <222> (840)..(1019) <220> <221> CDS <222> (1090)..(1698) <220> <221> intron <222> (1020)..(1089) <400> 1 ctgcagctat acaaaaaatg cagaagcagc agtatgatgt aagtatacga aagtttccaa 60 acggggctta tatctcatgc gactacagat cctaagtgca gtcttggatg cgactgggac 120 tcttcaaagt agaaaatcgg gtatcggtaa gtgatgtaga aatgagtaac aaccgatatc 180 aacatcgtaa caaattctag gtcctaacga tccacttgtg ctatctttac aaagtaagcc 240 tgtgtctatt gctgagtagt gccgttgtac taaagtgcat cacaataaaa gaatttacag 300 aatcatccaa gcattcttct aaaaggagta tcatgatgga taacgcagct aacagtgatg 360 gctcaacgag cttgaccaac tcttctcttc cctcttcagc aaggagcagt gatgtataca 420 gtttttcgat acccctgtcg cacaagtttc catctgtcag tgacggcaag agtcatctag 480 aaggtcagca tctgccttcc atcaatgagg ctatatctac aacggaactg acggatgcgt 540 tgccgccctt gacgccatct acgaaggatg aacagattgc ttcgtctaat acaaataaaa 600 tctagtttga cctatcaaca ggaaggttct actgttggtc aaaggtgttg atgcatcaga 660 cttggcgtgt ttgtaagttg ttgttaacgc attcaactct tctaacaaca tatagcactt 720 agcgacctac atcgattggg aagtctgtgt gatgttgtta cacgattgtg gagcgggaat 780 acattgattc tgtcaaccac ttttttcttt ctttcgtcgc accctcttcc cccgccggt 839 atg aac act ttc aag acc tac gct gat cgc gct gca cga cat ccc aat 887 Met Asn Thr Phe Lys Thr Tyr Ala Asp Arg Ala Ala Arg His Pro Asn 1 5 10 15 ggt tgc gct aaa gct ctg ttt gag ctc atg gag cgt aag cag acg aat 935 Gly Cys Ala Lys Ala Leu Phe Glu Leu Met Glu Arg Lys Gln Thr Asn 20 25 30 ctg tct atc gct gcc gac gtg acc aca aag aaa gaa ctc ctt cac att 983 Leu Ser Ile Ala Ala Asp Val Thr Thr Lys Lys Glu Leu Leu His Ile 35 40 45 gct gat gcc tgt gga cct tac atc tgc att cta aag gtcagatctc 1029 Ala Asp Ala Cys Gly Pro Tyr Ile Cys Ile Leu Lys 50 55 60 gatttgcaat aggacgagag agaaaatggg tccagctagg ctgacgcaat agttcttcag 1089 aca cac att gat atc att gat gac ttt gac gaa gac ctt gtt gcg cag 1137 Thr His Ile Asp Ile Ile Asp Asp Phe Asp Glu Asp Leu Val Ala Gln 65 70 75 ctg tgc gag ttg gca aag aag cac gac ttc ttg tta ttt gag gat cgc 1185 Leu Cys Glu Leu Ala Lys Lys His Asp Phe Leu Leu Phe Glu Asp Arg 80 85 90 aag ttt gcg gat atc ggc aac acg gtc aag cat cag tac gga aaa ggt 1233 Lys Phe Ala Asp Ile Gly Asn Thr Val Lys His Gln Tyr Gly Lys Gly 95 100 105 gtt tac aag atc gct tcc tgg gca cac att acg aac gcc cac acc gtg 1281 Val Tyr Lys Ile Ala Ser Trp Ala His Ile Thr Asn Ala His Thr Val 110 115 120 cct ggc gaa ggt atc atc acc gga ttg cgc gaa gtc ggt ctt cct ctc 1329 Pro Gly Glu Gly Ile Ile Thr Gly Leu Arg Glu Val Gly Leu Pro Leu 125 130 135 140 ggt cga gga ctg ttg tta tta gct gaa atg tca tcc aag ggt gca ttg 1377 Gly Arg Gly Leu Leu Leu Leu Ala Glu Met Ser Ser Lys Gly Ala Leu 145 150 155 act aag ggc agc tac acg acc gaa tcc gtc gag atg gca cga cgt aac 1425 Thr Lys Gly Ser Tyr Thr Thr Glu Ser Val Glu Met Ala Arg Arg Asn 160 165 170 caa gac ttt gtt ttt gga ttt att gcc cag cac aag atg aac gaa aaa 1473 Gln Asp Phe Val Phe Gly Phe Ile Ala Gln His Lys Met Asn Glu Lys 175 180 185 gac gat gaa gat ttc gtt gtc atg gca cct ggt gtc gga ctg gat gtc 1521 Asp Asp Glu Asp Phe Val Val Met Ala Pro Gly Val Gly Leu Asp Val 190 195 200 aag gga gat gga ctc ggt cag caa tat aga acg cct tac cag gtc att 1569 Lys Gly Asp Gly Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Pro Tyr Gln Val Ile 205 210 215 220 gtt gag tct gga tgc gat gtc att atc gtg gga cgt ggt atc tat ggc 1617 Val Glu Ser Gly Cys Asp Val Ile Ile Val Gly Arg Gly Ile Tyr Gly 225 230 235 aac ccc gac cag atc gag ttc cag gca aag cgt tac aag gaa gct gga 1665 Asn Pro Asp Gln Ile Glu Phe Gln Ala Lys Arg Tyr Lys Glu Ala Gly 240 245 250 tgg aac gcg tac ttg gaa cgt gta caa aag cat tagatcattt ctcattattc 1718 Trp Asn Ala Tyr Leu Glu Arg Val Gln Lys His 255 260 tttgtacagc atatcatgat ttaaagagag agacgaaaca tcaagcataa aaaatgagtc 1778 atcttcataa taagtatgag tatatggtaa tttttggtaa ccttttttct ctctctttcg 1838 actttacaga gcccaatcgg cggtatatga gaagccagca aactcttctt gttccgcgct 1898 tgtcagtgca cttgctatgg gtgtgagcac tggtcgctga acagtgaatt cgtcatcaaa 1958 gttggaagta tcggctgcac ctttgacagt tggaaagaat ggaggtctca cacgctttgc 2018 caacacatcg tcccagttta cacctttgaa gaatgcgtgt tgctttacag aggctgcacc 2078 tgtgagacgg ttgctacggt ctcgattcaa tagctacata gacagaatgt caatgcaaaa 2138 aaattgggca ttgcagcaaa cgtttcaggg ttttacctgt ttacacagtg atatagcatt 2198 ttttgacatg ttgattggat acatgacatc gtcattgagg atggcgcctg caatttcttg 2258 atcatcctca ccccaaaacg gtggctgatc tattgttagg atcgagtacg tgggtttata 2318 tatgcatata tatcttacca tgcccaacag catttgataa atcaatacgc cgaacgccca 2378 ccaatcgacc tcttggccgt actcttgatg caaaacgatt tccggggcca taaaatctgg 2438 tgtgccacaa aatgtgtttg tagtacatcc gatccacatg ttgtctttgc ataatccgta 2498 atcagccaac ttgatgtgtc cgtccttgca cagtaaaata ttgtcaagtt tcagatcacg 2558 gtaaataata cccctttggt ggaaatactc taatgcacac agtacttcac acgcgtagaa 2618 tctaaaaggc ttactgattt agcaaaatta tcagtgattc taaattgatt gaatggcggc 2678 ttactttgct cgtctctcag aaaacggttc tcgttggatg tggctcataa gatctccgcc 2738 gttgacatat tccatcacga aacaaagatg ggcgtgcgtt tggaagcaag aatgcaagtt 2798 gaccaagaag ggatgtcgtt cttgattggc agcttcgaaa acccgttttt caatgcggat 2858 gctacgcaaa gtatatcaat accaacacaa tatccataca tgacaactcc caatcaccct 2918 tgcacatctt cgaaatcgag agctgatcgt ttcttgagaa tcttgatcgc atacacctcg 2978 ccgtcccttt ggtattgcgc aaggaggacc ttcgttgtat gtcagtatct acgttcatga 3038 cagagaacaa aggcttacat acctttccaa aattgcccct gccgagcact ttgagcagtg 3098 taaagtcttg caatccgatt ttgaaccgtc tggcttctga tgactagaaa atctacatgt 3158 caatattcgc ggtaaaagca taaattgttt gtgccaaaca cttgcttctt gagttgtggt 3218 ggaagagaca tgtgaggtgg ttgcatgatc cctatgtagt tgttcatcta tcttgacata 3278 tgcgttgaga tatgatgatt cgctggagga tgcagactct cggtgtggat gagccattgg 3338 cacatgtgga atgctttgcg ctgcgggaga gttacggaga gccaatggat caaagtattc 3398 tgcag 3403 <210> 2 <211> 263 <212> PRT <213> Rhizomucor pusillus <400> 2 Met Asn Thr Phe Lys Thr Tyr Ala Asp Arg Ala Ala Arg His Pro Asn 1 5 10 15 Gly Cys Ala Lys Ala Leu Phe Glu Leu Met Glu Arg Lys Gln Thr Asn 20 25 30 Leu Ser Ile Ala Ala Asp Val Thr Thr Lys Lys Glu Leu Leu His Ile 35 40 45 Ala Asp Ala Cys Gly Pro Tyr Ile Cys Ile Leu Lys Thr His Ile Asp 50 55 60 Ile Ile Asp Asp Phe Asp Glu Asp Leu Val Ala Gln Leu Cys Glu Leu 65 70 75 80 Ala Lys Lys His Asp Phe Leu Leu Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp 85 90 95 Ile Gly Asn Thr Val Lys His Gln Tyr Gly Lys Gly Val Tyr Lys Ile 100 105 110 Ala Ser Trp Ala His Ile Thr Asn Ala His Thr Val Pro Gly Glu Gly 115 120 125 Ile Ile Thr Gly Leu Arg Glu Val Gly Leu Pro Leu Gly Arg Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Ala Glu Met Ser Ser Lys Gly Ala Leu Thr Lys Gly Ser 145 150 155 160 Tyr Thr Thr Glu Ser Val Glu Met Ala Arg Arg Asn Gln Asp Phe Val 165 170 175 Phe Gly Phe Ile Ala Gln His Lys Met Asn Glu Lys Asp Asp Glu Asp 180 185 190 Phe Val Val Met Ala Pro Gly Val Gly Leu Asp Val Lys Gly Asp Gly 195 200 205 Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Pro Tyr Gln Val Ile Val Glu Ser Gly 210 215 220 Cys Asp Val Ile Ile Val Gly Arg Gly Ile Tyr Gly Asn Pro Asp Gln 225 230 235 240 Ile Glu Phe Gln Ala Lys Arg Tyr Lys Glu Ala Gly Trp Asn Ala Tyr 245 250 255 Leu Glu Arg Val Gln Lys His 260

【００９４】 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying pyr4 gene <400> 3 CCCGGATCCT TTGAAGATCG YAAATTTGCT GATATYGG 38

【００９５】 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying pyr4 gene <400> 4 CCCGGATCCA GGKGTTCTGT AYTGYTGACC CAAWCCATC 39

【００９６】 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Mucor rennin gene <400> 5 cccggatcca atcgggcatt gtacagcgtt ttacc 35

【００９７】 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Mucor rennin gene <400> 6 cccggatcca taccgtcagc taggtcaagc tgctt 35

【００９８】 <210> 7 <211> 263 <212> PRT <213> Rhizomucor pusillus <400> 7 Met Asn Thr Phe Lys Thr Tyr Ala Asp Arg Ala Ala Arg His Pro Asn 1 5 10 15 Gly Cys Ala Lys Ala Leu Phe Glu Leu Met Glu Arg Lys Gln Thr Asn 20 25 30 Leu Ser Ile Ala Ala Asp Val Thr Thr Lys Lys Glu Leu Leu His Ile 35 40 45 Ala Asp Ala Cys Gly Pro Tyr Ile Cys Ile Leu Lys Thr His Ile Asp 50 55 60 Ile Ile Asp Asp Phe Asp Glu Asp Leu Val Ala Gln Leu Cys Glu Leu 65 70 75 80 Ala Lys Lys His Asp Phe Leu Leu Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp 85 90 95 Ile Gly Asn Thr Val Lys His Gln Tyr Gly Lys Gly Val Tyr Lys Ile 100 105 110 Ala Ser Trp Ala His Ile Thr Asn Ala His Thr Val Pro Gly Glu Gly 115 120 125 Ile Ile Thr Gly Leu Arg Glu Val Gly Leu Pro Leu Gly Arg Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Ala Glu Met Ser Ser Lys Gly Ala Leu Thr Lys Gly Ser 145 150 155 160 Tyr Thr Thr Glu Ser Val Glu Met Ala Arg Arg Asn Gln Asp Phe Val 165 170 175 Phe Gly Phe Ile Ala Gln His Lys Met Asn Glu Lys Asp Asp Glu Asp 180 185 190 Phe Val Val Met Ala Pro Gly Val Gly Leu Asp Val Lys Gly Asp Gly 195 200 205 Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Pro Tyr Gln Val Ile Val Glu Ser Gly 210 215 220 Cys Asp Val Ile Ile Val Gly Arg Gly Ile Tyr Gly Asn Pro Asp Gln 225 230 235 240 Ile Glu Phe Gln Ala Lys Arg Tyr Lys Glu Ala Gly Trp Asn Ala Tyr 245 250 255 Leu Glu Arg Val Gln Lys His 260

【００９９】 <210> 8 <211> 265 <212> PRT <213> Mucor circinelloides <400> 8 Met Asn Thr Tyr Lys Thr Tyr Ser Glu Arg Gly Gln Gln His Pro Asn 1 5 10 15 Ala Cys Ala Arg Ser Leu Phe Glu Leu Met Glu Arg Asn Glu Ser Asn 20 25 30 Leu Ser Val Ala Val Asp Val Thr Thr Lys Lys Glu Leu Leu Ser Ile 35 40 45 Ala Asp Ala Val Gly Pro Phe Val Cys Val Leu Lys Thr His Ile Asp 50 55 60 Ile Val Glu Asp Phe Asp His Asp Leu Val Ala Gln Leu Glu Gln Leu 65 70 75 80 Ala Lys Lys His Asp Phe Leu Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp 85 90 95 Ile Gly Asn Thr Val Lys His Gln Tyr Ala Asn Gly Ile Tyr Lys Ile 100 105 110 Ala Ser Trp Ser His Ile Thr Asn Ala His Thr Val Pro Gly Glu Gly 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Leu Gly Glu Val Gly Leu Pro Leu Gly Arg Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Ala Glu Met Ser Ser Lys Gly Ala Leu Thr Lys Gly Ser 145 150 155 160 Tyr Thr Ser Glu Ser Val Glu Met Ala Arg Arg Asn Lys Asp Phe Val 165 170 175 Phe Gly Phe Ile Ala Gln His Lys Met Asn Glu His Asp Asp Glu Asp 180 185 190 Phe Val Val Met Ser Pro Gly Val Gly Leu Asp Val Lys Gly Asp Gly 195 200 205 Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Pro His Glu Val Ile Val Glu Ser Gly 210 215 220 Gly Asp Ile Ile Ile Val Gly Arg Gly Ile Tyr Gly Asn Pro Asp Gln 225 230 235 240 Val Glu Ala Gln Ala Lys Arg Tyr Arg Gln Ala Gly Trp Asp Ala Tyr 245 250 255 Leu Glu Arg Val Arg Leu His Lys Lys 260 265

【０１００】 <210> 9 <211> 265 <212> PRT <213> Rizopus niveus <400> 9 Met Asn Thr Tyr Lys Pro Tyr Ser Glu Arg Ala Lys Gln His Ser Asn 1 5 10 15 Ala Cys Ala Arg Ser Leu Leu Glu Leu Met Glu Arg Lys Gln Thr Asn 20 25 30 Leu Ser Val Ala Val Asp Val Thr Thr Lys Lys Glu Leu Ile Ser Ile 35 40 45 Ala Asp Ala Ile Gly Pro Tyr Ile Cys Val Leu Lys Thr His Ile Asp 50 55 60 Ile Val Glu Asp Phe Asp Ala Asp Leu Ile Gln Gln Leu Gln Glu Leu 65 70 75 80 Ala Lys Lys His Asp Phe Leu Phe Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp 85 90 95 Ile Gly Asn Thr Val Lys His Gln Tyr Ala Asn Gly Ile Tyr Lys Ile 100 105 110 Ala Ser Trp Ser His Ile Thr Asn Ala His Thr Val Pro Gly Glu Gly 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Leu Ala Glu Val Gly Leu Pro Leu Gly Arg Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Ala Glu Met Ser Ser Lys Gly Ala Leu Thr Lys Gly Ser 145 150 155 160 Tyr Thr Thr Asp Ser Val Glu Met Ala Arg Arg Asn Lys Asp Phe Val 165 170 175 Phe Gly Phe Ile Ala Gln Asn Lys Met Asn Gln Tyr Asp Asp Glu Asp 180 185 190 Phe Ile Val Met Ser Pro Gly Val Gly Leu Asp Val Lys Gly Asp Gly 195 200 205 Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Pro Arg Glu Val Ile Val Glu Ser Gly 210 215 220 Ala Asp Val Ile Ile Val Gly Arg Gly Ile Tyr Gly Gln Pro Asp Lys 225 230 235 240 Leu Val Glu Gln Ala Gln Arg Tyr Arg Gln Ala Gly Trp Asp Ala Tyr 245 250 255 Leu Glu Arg Leu Ala Leu His Asn Lys 260 265

【０１０１】 <210> 10 <211> 397 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 10 Met Ser Thr Ser Gln Glu Thr Gln Pro His Trp Ser Leu Lys Gln Ser 1 5 10 15 Phe Ala Glu Arg Val Glu Ser Ser Thr His Pro Leu Thr Ser Tyr Leu 20 25 30 Phe Arg Leu Met Glu Val Lys Gln Ser Asn Leu Cys Leu Ser Ala Asp 35 40 45 Val Glu His Ala Arg Asp Leu Leu Ala Leu Ala Asp Lys Val Gly Pro 50 55 60 Ser Ile Val Val Leu Lys Thr His Tyr Asp Leu Ile Thr Gly Trp Asp 65 70 75 80 Tyr His Pro His Thr Gly Thr Gly Ala Lys Leu Ala Ala Leu Ala Arg 85 90 95 Lys His Gly Phe Leu Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe Val Asp Ile Gly 100 105 110 Ser Thr Val Gln Lys Gln Tyr Thr Ala Gly Thr Ala Arg Ile Val Glu 115 120 125 Trp Ala His Ile Thr Asn Ala Asp Ile His Ala Gly Glu Ala Met Val 130 135 140 Ser Ala Met Ala Gln Ala Ala Gln Lys Trp Arg Glu Arg Ile Pro Tyr 145 150 155 160 Glu Val Lys Thr Ser Val Ser Val Gly Thr Pro Val Ala Asp Gln Phe 165 170 175 Ala Asp Glu Glu Ala Glu Asp Gln Val Glu Glu Leu Arg Lys Val Val 180 185 190 Thr Arg Glu Thr Ser Thr Thr Thr Lys Asp Thr Asp Gly Arg Lys Ser 195 200 205 Ser Ile Val Ser Ile Thr Thr Val Thr Gln Thr Tyr Glu Pro Ala Asp 210 215 220 Ser Pro Arg Leu Val Lys Thr Ile Ser Glu Asp Asp Glu Met Val Phe 225 230 235 240 Pro Gly Ile Glu Glu Ala Pro Leu Asp Arg Gly Leu Leu Ile Leu Ala 245 250 255 Gln Met Ser Ser Lys Gly Cys Leu Met Asp Gly Lys Tyr Thr Trp Glu 260 265 270 Cys Val Lys Ala Ala Arg Lys Asn Lys Gly Phe Val Met Gly Tyr Val 275 280 285 Ala Gln Gln Asn Leu Asn Gly Ile Thr Lys Glu Ala Leu Ala Pro Ser 290 295 300 Tyr Glu Asp Gly Glu Ser Thr Thr Glu Glu Glu Ala Gln Ala Asp Asn 305 310 315 320 Phe Ile His Met Thr Pro Gly Cys Lys Leu Pro Pro Pro Gly Glu Glu 325 330 335 Ala Pro Gln Gly Asp Gly Leu Gly Gln Gln Tyr Asn Thr Pro Asp Asn 340 345 350 Leu Val Asn Ile Lys Gly Thr Asp Ile Ala Ile Val Gly Arg Gly Ile 355 360 365 Ile Thr Ala Ala Asp Pro Pro Ala Glu Ala Glu Arg Tyr Arg Arg Lys 370 375 380 Ala Trp Lys Ala Tyr Gln Asp Arg Arg Glu Arg Leu Ala 385 390 395

【図面の簡単な説明】

【図１】 各種OMPデカルボキシラーゼ遺伝子（ムコー
ル・シルシネロイデス（pyrG）、リゾプス・ニヴェウス
（pyr4）、ニューロスポラ・クラッサ（pyr4））の間で
アミノ酸配列が高度に保存されている部分の比較を示す
図。「＊」印は、共通のアミノ酸残基を示す。反転文字
は、プライマー設計部位を示す。上段から順に、リゾム
コール・プシルス（配列番号７）、ムコール・シルシネ
ロイデス（配列番号８）、リゾプス・ニヴェウス（配列
番号９）、ニューロスポラ・クラッサ（配列番号10）の
OMPデカルボキシラーゼのアミノ酸配列を示す。

【図２】 OMPデカルボキシラーゼ遺伝子を含むプラス
ミドpRPPyr4の構造を示す図。

【図３】 ムコールレンニン遺伝子を含むプラスミドpM
P4の構造を示す図。

【図４】 形質転換体のムコールレンニン発現量を示す
ウエスタンブロッティングの結果を示す写真。 TP5：pRPPyr4で形質転換した1116U17株 RM1、RM4：pMP4で形質転換した1116U17株のうちの２株

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA07 BA14 CA03 CA09 DA11 EA04 FA02 FA10 GA07 GA21 HA01 HA12 4B050 CC04 DD03 LL02 LL10 4B065 AA58Y AA66X AA66Y AA69Y AB02 AC14 AC20 BA02 BA08 BA10 BA25 CA27 CA31 CA42

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
   をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
   るタンパク質をコードする遺伝子。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
   て、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
   加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、オロ
   チジン-5'-1リン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタ
   ンパク質。
2. 【請求項２】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
   る請求項１記載の遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
   なくとも塩基番号８４０〜１０１９及び１０９０〜１６
   ９８からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
   なくとも塩基番号８４０〜１０１９及び１０９０〜１６
   ９８からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハ
   イブリダイズし、かつ、オロチジン-5'-1リン酸デカル
   ボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】 請求項１記載の遺伝子を含む組換えベク
   ター。
4. 【請求項４】 さらに目的タンパク質をコードする遺伝
   子を含む請求項３記載の組換えベクター。
5. 【請求項５】 目的タンパク質がムコール・レンニンで
   ある請求項４記載の組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項４記載の組換えベクターで形質転
   換されたリゾムコール(Rhizomucor)属に属する糸状菌の
   形質転換体。
7. 【請求項７】 リゾムコール属に属する糸状菌がリゾム
   コール・プシルスである請求項６記載の形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項６記載の形質転換体を培地に培養
   し、培養物中に目的タンパク質を蓄積させ、培養物から
   前記タンパク質を採取することを特徴とするタンパク質
   の製造法。