MÉTODO DE REPRODUCCIÓN DE HONGOS PRODUCTORES DE LÍPIDOS
Campo de la Invención La presente invención se refiere a un método para reproducir un hongo productor de lípidos, especialmente un método para reproducir un hongo productor de lípidos que pertenece a la especie Mortierella spp., siendo dicho método de modo que la reproducción se lleva a cabo mediante la transformación, pero no la selección utilizando un antibiótico. Antecedentes de la Invención Las técnicas (técnicas de fermentación en un sentido amplio) para la producción de compuestos útiles mediante el metabolismo de microorganismos ha sido desarrollado y reducida en la práctica. Los hongos productores de lípidos con capacidad de reproducir un lípido en una gran cantidad mediante su metabolismo, son algunos ejemplos concretos. Los hongos que pertenecen a la especie Mortierella spp., tales como el Mortierella alpina son hongos típicos reproductores de lípidos, los cuales se conoce que producen ácido graso polünsaturado (PUFA), tal como ácido araquidónico, son hongos ¡ndustrialmente útiles (por ejemplo, ver la Publicación de Patente Japonesa No. 7-34752 otorgada a Tokukouhei (publicada en abril 19, 1995) que corresponde a la Publicación de Patente Japonesa sin Examinar No. 63-
44891 otorgada a Tokukaisho (publicada en febrero 25, 1988)). La reproducción (por ejemplo, la mejora de reproducción) para mejorar sus propiedades genéticas han sido llevadas a cabo para diferentes organismos útiles incluyendo microorganismos, tales como hongos reproductores de lípidos y similares. La reproducción es muy importante especialmente en la tecnología de fermentación con el objeto de lograr una eficiencia mejor, un costo más bajo y similares en la producción microbiana de un compuesto. El método de reproducción básicamente incluye el paso de crear una población que incluye una variación genética (en los sucesivo a este paso nos referimos como el paso de la creación de la población, por razones de facilidad de explicación) y el paso de seleccionar de la población una variedad que tiene una propiedad deseada (nuevamente en lo sucesivo nos referimos a este paso como el paso de selección, por razones de facilidad de explicación). Se pueden adoptar diferentes procesos como el paso de creación de la población y el paso de selección dependiendo de cual tipo de organismo útil va a ser reproducido. Para los microorganismos tales como los hongos productores de lípidos y similares, (1) el proceso de tratamiento del mutagén ó (2) el proceso de transformación, principalmente es
adoptado como el paso de la creación de la población. (1) Proceso de Tratamiento del utagén En el paso de la creación de la población que adopta el proceso de tratamiento del mutagén, la población es creada induciendo la mutación en el microorganismo por diferentes métodos. La mutagén ocasiona muchos tipos de mutaciones de manera aleatoria. Por lo tanto, aún si es obtenida una variedad (cepa) que muestra una amenaza objetivo en el paso de selección, existe la posibilidad de que la variación tendría un daño inesperado en un gen diferente al gen que se refiere a la amenaza del objetivo. Por ejemplo, la mutación deterioraría un nuevo productor de lípidos, en términos de la multiplicación, la capacidad de formación de esporas o similares, aunque la mutación ocasiona que el hongo productor de lípidos produzca un tipo diferente de lípidos. Por lo tanto, el paso de creación de la población que adopta el proceso de tratamiento del mutagén no promete que se pueda obtener una cepa muy productiva. Además, este método crea una población que consiste de individuos en los cuales son ocasionados muchos tipos de mutaciones de manera aleatoria. Por lo tanto, si el paso de selección después del paso de creación de la población no tuvo un método de selección apropiado (método de selección) para obtener el muíante (cepa) que tenga el carácter de envío que se tuvo por objetivo, todos los individuos de los que
consiste la población deben de ser revisados para revisar que tipos de mutaciones tienen. Esto consume muchísima mano de obra. (2) Proceso de Transformación Mientras tanto, el paso de creación de la población que adopta el proceso de transformación crea una población de transformantes mediante la transferencia en un organismos útil que va a ser reproducido, un fragmento de ADN necesario para obtener el carácter que se tenía por objetivo (por ejemplo, la transformación). Esto es, que el paso de creación de la población que adopta el proceso de transformación crea una población controlada para expresar solamente el gen específico para el carácter de envío al objetivo. Por lo tanto, el paso de selección posterior a paso de la creación de la población solamente se refiere para seleccionar la variedad deseada (cepa) de los transformantes obtenidos. Por lo tanto, la selección es fácil en el paso de selección. Además, es posible evitar el daño inesperado del gen que no sea el gen con respecto al carácter que se envío el objetivo. Por lo tanto, este método ahorra de manera importante la mano de obra de la reproducción. Como se describió anteriormente el paso de creación de la población en la reproducción adopta preferentemente el proceso de transformación. Por ejemplo, se han reportado muchas técnicas con respecto a como transformar hongos
filamentosos a los cuales pertenece la especie Mortierella spp. Específicamente, (a) los documentos del 1 al 3 de la lista siguiente describen técnicas para transformar hongos de filamentos, tales como Asperglllus nidu!ans, Neurosporas crassa, mediante el método de administración de partículas. En estas técnicas, se utilizan cepas uracil-auxotróficas como las cepas huésped que van a ser transformadas y los genes complementarios a las cepas uracil auxotróficas son usados como el marcador del gen con el objeto de seleccionar el transformante. Además, (b) el Documento 4 de la lista siguiente describe una técnica del proceso de transformación de la especie M. aplina. En esta técnica, los protoplastos son preparados de esporas y un gen es transferido dentro de las células mediante un método de electroporación . Además, la selección de los transformantes se realiza utilizando, como gen marcador, un gen resistente a la higromicina B (hpt), derivado de Esherichia coli. Con esto, se puede reproducir un organismo en un medio que contiene higromicina que puede ser seleccionado como transformante. Documento 1: Fungaro M. H. et al. Fems microbial Lett., 25. Páginas 293 a 297, 1995. Documento 2: Herzog R. W., et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., 45, páginas 333 a 337, 1996.
Documento 3: Armaleo, D., et al. Curr. Genet., 17, páginas 97 a 103, 1990. Documento 4: Mackenzie D. A., et al. Appl. Environ. icrobiol., 66, páginas 4655 a 4661, 2000. Sin embargo, la técnica que adopta la transformación tiene la desventaja que es difícil de realizar la reproducción del hongo productor de lípidos que produce el PUFA de una manera efectiva y eficiente. Específicamente, en la técnica (a) que adopta la transformación del hongo de filamento mediante el método de administración de partículas, los hongos de filamentos, tales como A. nldulans y N. Crassa que van a ser transformados no son adecuados para la producción industrial de lípidos, tales como el PUFA, debido a que la capacidad de producción de lípido de los hongos de filamentos es baja. Por otra parte, la técnica (b) descrita en el Documento 4, es una técnica de transformación de M. aplina, la cual es conocida como el hongo productor de lípidos que se puede aplicar industrialmente. Por lo tanto, la técnica (b) es ventajosa sobre la técnica (a), en términos de la aplicación industrial. Sin embargo, no todas la especies Mortierella spp., tipificadas como M. aplina, son sensibles a la higromicina. Por lo tanto, si se utiliza como huésped un hongo de Mortierella spp tolerante a la higromicina., la tolerancia a la
higromicina no puede ser utilizada como el marcador. La mayor parte de los lípidos PUFA, son ácidos grasos esenciales, a los cuales se relaciona - con funciones fisiológicas complicadas in vivo. Por lo tanto, el PUFA recibe recientemente mucha atención como un nutriente importante. Por lo tanto, existe una demanda de técnicas de fermentación que produzcan PUFA de una manera más eficiente. Para lograr esta técnica de fermentación, es necesario establecer una técnica para reproducir los hongos de la especie Mortierella spp de una manera eficiente y efectiva, la cual es altamente confiable como el hongo productor de lípidos. La presente invención se realiza en vista del problema anterior. Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para la reproducción de un hongo productor de lípidos que pertenece a la especie Mortierella spp., teniendo la capacidad el método de reproducir el hongo que produce lípidos de manera efectiva y eficiente sin utilizar un antibiótico. Sumario de la Invención En vista de los problemas anteriores, los inventores de la presente invención descubrieron, como resultado de un trabajo diligente, que sería posible realizar de manera eficiente y efectiva la transformación de todas cepas de los hongos de la especie Mortierella spp. y una cepa auxotrófica de un hongo de la especie Mortierella spp., la cual es un
hongo productor de lípidos, era obtenida y se establecía un sistema en el cual la transformación se realizaba utilizando como marcador un gen complementario a la cepa auxotrofica para la misma. Los inventores también descubrieron que el uso de este sistema hace posible dotar la autoclonación, haciendo de este modo más eficiente y efectiva la reproducción. La presente invención está basada en estos descubrimientos. Un método de acuerdo con la presente invención es un método de reproducción de un hongo productor de lípidos que pertenece a la especie Mortierella spp., incluyendo el método el paso de: realizar la transformación. El paso de realizar la transformación incluye los pasos de: transferir un gen marcador en un huésped, en donde el huésped es una cepa auxotrofica de un hongo productor de lípidos y el gen marcador es un gen complementario de la auxotrofia y seleccionar un transformante utilizando, como un marcador, la recuperación de la auxotrofia del huésped. El método de preferencia está adaptado, de modo que el hongo productor de lípidos es Mortierella alpina, Mortierella hygrophila, o Mortierella chlamydospora. Además, el método de preferencia está adaptado que la cepa auxotrofica es una cepa uracil auxotrofica. Además, el método de preferencia está adaptado de modo que el gen marcador es un gen de decarboxilasa de orotidina-5'-fosfato o un gen de
pirofosforilasa de ácido orotidílico. Además, el método puede estar adaptado de modo que utiliza un método de electroporación o método de administración de partículas en el paso de transferencia. Además, el método puede incluir además el paso de obtención de la cepa auxotrófica de un hongo productor de lípidos de tipo original. Los objetos, características y fuerzas adicionales de la presente invención se harán claras mediante la siguiente descripción. Además, las ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente explicación que hace referencia a los dibujos. Descripción Detallada de la Invención A continuación se describe una modalidad de la presente invención. Deberá observarse que la modalidad no limita la presente invención. En la presente invención, el paso de realizar la transformación en el cual es utilizada la auxotrofia como un marcador, se realizó como el paso de creación de una población que incluye una variación genética que va a ser reproducida (por ejemplo, como el paso de creación de la población). Específicamente, se obtiene una cepa auxotrófica de un hongo de la especie Mortierella spp. Este hongo es un hongo productor de lípidos. Utilizando este hongo como huésped, un gen complementario a la auxotrofia es
1 o
transferido en las células del hongo (transformación). Después de esto, se selecciona un transformante de la población que utiliza la recuperación de la auxotrofia en el huésped como marcador. Lo siguiente describe en detalle el hongo de la especie
Mortierella spp., el cual utiliza la presente invención, para el método de reproducción de acuerdo con la presente invención y el uso del mismo. (1) Hongo de la Especie Mortierella spp El hongo de la especie Mortierella spp., que va a ser reproducido mediante el método de la presente invención no está particularmente limitado. Varios hongos de filamentos que pertenecen a la especie Mortierella spp., pueden ser utilizados como el hongo, por ejemplo, la especie Mortierella spp., se divide en dos subgéneros, es decir, Mortierella y Micromucor. Todos los hongos que pertenecen al subgénero Mortierella producen ácidos grasos con 20 carbonos, en la forma de ácido araquidónico, mientras que los hongos que pertenecen al subgénero Mortierella spp., producen ácidos grasos de 18 ó menos carbonos. Los hongos de la especie Mortierella spp., utilizados en la presente invención pueden ser cualesquiera hongos que pertenecen, ya sea al subgénero Mortierella o Micromucor. Los ejemplos específicos de los hongos que pertenecen a la especie Mortierella spp., son: M. aplina, M. elongata, M.
exigua, M. hygrophila, M. isabelina, M. turficola, M. gamsü, M. cogitans, M. capitata, M. vinacea, M. chlamydosporas y similares. Deberá observarse que la presente invención no está limitada a estos hongos. Entre ellos, puede ser utilizada preferentemente en la presente invención la especie M. aplina (Mortierella alpina), la cual es ampliamente utilizada como el hongo productor de lípidos. Es conocido que las cepas de la especie M. aplina se acumulan dentro de los cuerpos del hongo, el PUFA tal como ácido araquidónico (ARA). La especie M. aplina es ampliamente utilizada, no solamente en las investigaciones de la biosíntesis de PUFA, sino también en la producción industrial de PUFA. La forma de obtención del hongo de Mortierella spp., incluyendo la especie M. aplina, no está particularmente limitada. Es posible obtener el hongo de instituciones de depósitos de microorganismos y similares, tales como el Instituto para la fermentación de Osaka, ATCC (American Type Culture Collection) o una institución similar. Para las cepas para las cuales se ha presentado la Solicitud de Patente, es posible obtener la cepa del Depósito de Organismo Internacional de Patentes, del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada. Además, es posible obtener y utilizar una cepa no conocida que pertenece a la especie Mortierella spp. de un entorno natural utilizando un método bien conocido de selección.
(2) Método de Reproducción del Hongo Productor de Lípidos de Acuerdo con la Presente invención El método de reproducción de acuerdo con la presente invención puede ser adaptado de cualquier modo, siempre que el paso de creación de la población comprenda un paso de realización de la transformación (en lo sucesivo, paso de transformación). Sin embargo, el método de reproducción de acuerdo con la presente invención, puede comprender de una manera más preferente un paso de obtención de una cepa auxotrófica (en lo sucesivo, paso de obtención de cepa auxotrófica). Por supuesto, el método de reproducción puede comprender un paso diferente a estos pasos. En lo siguiente se describen detalladamente estos pasos. Paso de Obtención de una Cepa Auxotrófica El paso de obtención de la cepa auxotrófica no está particularmente limitado, siempre que obtenga una cepa auxotrófica (mutante auxotrófico) de un hongo de tipo original de la especie Mortierella spp. También puede ser adoptada 7una técnica conocida para obtener una cepa auxotrófica. Especialmente, en el caso en donde es conocido el gen relacionado con la auxotrofia (por ejemplo, en el caso de que sea descubierto el gen mediante el análisis del genoma completo, o un caso similar), es posible obtener la cepa auxotrófica, mediante la eliminación del gen. La presente invención no está limita a un tipo particular
de cepa auxotrófica. Por ejemplo, la cepa auxotrófica puede ser una cepa auxotrófica para un aminoácido, tal como leucina, histidina, metionina, arginina, triptofano, Iisina o similar; una cepa auxotrófica para una base de ácido nucleico, tal como uracilo, adenino o similar; una cepa auxotrófica para una vitamina o similar. Por ejemplo, en la presente Invención se utiliza una cepa auxotrófica para el uracilo (en lo sucesivo, cepa uracil auxotrófica), como en los ejemplos que se describen más adelante. La cepa uracil auxotrófica es especialmente provechosa para la especie Mortierella spp., debido a que permite utilizar la tolerancia al ácido 5-fluoro orótico (5-FOA) como marcador para la selección positiva en la selección. Por lo tanto, aunque puede ser adaptado el paso de obtención de la cepa auxotrófica para obtener una cepa que no se pueda reproducir en un medio sintético, en el cual carece de una nutrición particular, el paso de obtención de la cepa auxotrófica puede ser adaptado para obtener la cepa con la selección que limita el gen de mutación. Por ejemplo, la selección de 5-FOA puede ser realizada con el objeto de obtener una cepa uracil auxotrófica en la cual ocurre la mutación en el gen URA3 ó URA5. De un modo similar, la selección con ácido aminoadípico puede ser realizada con el objeto de obtener una cepa Usina auxotrófica en la cual ocurre la mutación en el gen LYS2 ó el gen LYS5. Se prefiere
obtener una cepa auxotrófica en la cual es limitado el gen de mutación. Esto es debido a que es posible especificar el gen marcador para utilizarlo en el paso de transformación. Paso de Transformación 1: Paso de Transferencia del Gen El paso de transformación, es como se describió anteriormente el paso de realizar la transformación en el paso de creación de la población para la reproducción. El paso de transformación por lo menos incluye un paso de transferencia del gen y el paso de selección. Por supuesto, de ser necesario, el paso de transformación puede incluir pasos diferentes a estos. El paso de transferencia del gen en la presente invención no está particularmente limitado, siempre que el paso de transferencia del gen transfiera un gen marcador en el huésped, en donde el huésped es una cepa auxotrófica de un hongo (hongo productor de lípidos) de la especie Mortierella spp. y el gen marcador es un gen complementario a la auxotrofia. El gen marcador no está particularmente limitado, siempre que el gen sea complementario a la mutación (mutación auxotrófica) en la cepa auxotrófica. Específicamente, los ejemplos del gen marcador son: un gen Ieu2 para las cepas de leucina auxotrófica, un gen his3 para la cepa histidina auxotrófica, un gen Iys2 para la cepa lisina auxotrófica, un gen trp1 para la cepa triptofan auxotrófica, un
gen ura3 ó un gen ura5 para la cepa uracil auxotrofica, un gen ade2 para la cepa adenina auxotrofica. Por ejemplo, la presente invención puede ser adaptada, de modo que el huésped es la cepa uracil auxotrofica y el gen marcador es el gen ura5, como se describe en los ejemplos. No existe una limitación particular con respecto a la forma de obtener el gen marcador. El gen marcador puede ser obtenido, utilizando un método bien conocido de un (micro) organismo (tal como levadura) que no sea el hongo. Puede ser utilizado un gen marcador que se consigue comercialmente. Alternativamente, debido a que es aplicable la autoclonación, en la presente invención, el gen marcador puede ser obtenido del hongo de la especie Mortierella spp., la cual es utilizada como huésped. Los ejemplos que se describen más adelante están adaptados de modo que se obtiene el gen ura5 de la cepa M. aplina (huésped) utilizando una secuencia de base del gen ura5 de tres tipos de levaduras. La forma de transferir el gen (por ejemplo, como transformarlo) en el paso de transferencia del gen no está particularmente limitada. Se puede utilizar de una manera apropiada un método bien conocido convencionalmente, tal como el método de electroporación, el método de administración de partículas o un método similar. Para los hongos de la especie Mortierella spp., se prefiere que los
cuerpos del hongo sean protoplastados, si es adoptado el método de electroporación. Un método específico de administración de partículas, es el método de pistola de partículas. Por supuesto, el método de administración de partículas no está limitado al método de pistola de partículas.
El gen marcador no está particularmente limitado en términos de su estructura específica, siempre que el gen marcador pueda ser transferido en los cuerpos del hongo de la especie Mortierella spp, de modo que pueda ser expresado el gen marcador. En la presente invención, el gen marcador debe ser construido como una construcción genética la cual es preparada ligando (a) una región (en lo sucesivo, la región recombinante) para ser recombinada con un cromosoma con (b) un cassette de expresión preparado ligando un promotor al mismo. Por lo tanto, la construcción del gen puede ser transferida en el huésped por medio de un vector en el cual ha sido insertada la construcción del gen. Alternativamente, la construcción del gen puede ser transferida en el huésped directamente. El cassette de expresión del gen marcador, el cual está contenido en la construcción del gen, debe de ser estructurado de modo que el promotor está ligado arriba del gen marcador. Se prefiere que el terminador sea ligado abajo del gen marcador. Además de los cassettes de expresión del gen marcador y la región recombinante, la construcción del
gen puede contener un sitio de multiclonación, de modo que se pueda ligar al mismo un cassette para la expresión de varios genes. Además, la región del gen puede contener un fragmento de ADN que no sea diferente al cassette de expresión del gen marcador (el cual tiene el promotor, el gen marcador y el terminador), la región recombinante y el sitio de multiclonación. La construcción del gen no está particularmente limitada en términos de su estructura específica. No existe una limitación particular con respecto a los tipos específicos de fragmentos de ADN mencionados anteriormente. Por ejemplo, no existe una limitación particular en el caso del promotor, siempre que el promotor pueda ocasionar la expresión del gen de manera efectiva. Es posible utilizar un promotor conocido apropiadamente en la presente invención. Deberá observarse que la presente invención no está limitada al promotor hisH4.1 utilizado en los ejemplos que se describen más adelante. De un modo similar, no existe una limitación particular en el caso del terminador, siempre que el terminador pueda funcionar como un sitio de terminación de la transcripción. Se puede utilizar un terminador conocido en la presente invención. Deberá observarse que la presente invención no está limitada al terminador trpC utilizado en los ejemplos que se describen más adelante. Además, no existe una limitación particular en
el caso de la región recombinante, siempre que la región recombinante sea un segmento de ADN por el cual va a ser transferido el gen marcador en el cuerpo del hongo de la especie Mortierella spp., que pueda ser insertado en el cromosoma. En el ejemplo descrito al final, la región recombinante, es un ADN del ribosoma 18S (18Sr). No existe limitación particular con respecto al vector de expresión recombinante en el caso en donde la construcción del gen es introducida en un vector para preparar un vector de expresión. El vector de expresión puede ser equivalente a un vector de expresión recombinante general. El vector de expresión puede ser preparado utilizando un plásmido, un fago, un cósmido o similar. Sin embargo, no existe una limitación particular con respecto a la forma de preparación del vector de expresión recombinante. Además, la preparación del vector de expresión recombinante puede llevarse a cabo utilizando un método conocido. En general, se puede utilizar un plásmido preferentemente en la preparación del vector de expresión recombinante. Paso de Transformación 2: Paso de Selección El paso de selección en el paso de transformación no está particularmente limitado, siempre que en el paso de selección se seleccione el transformante utilizando la recuperación de la auxotrofia del huésped como el marcador. El paso de selección se puede llevar a cabo utilizando de
manera correcta un método conocido. Específicamente, el paso de selección se puede llevar a cabo, en un medio sintético de los transformantes obtenidos después del paso de transferencia del gen, siendo dichos medios sintéticos tales que se omite en el mismo una nutrición específica en vista de la auxotrofia que va a ser utilizada como el marcador. Con esto, es posible seleccionar los transformantes fácil y eficientemente. Como se describió anteriormente, la auxotrofia es utilizada como marcador en el paso de transformación. El marcador auxotrófico es provechoso en la operación fácil y de bajo costo. Además, el marcador auxotrófico es provechoso debido a que es un derivado del hongo de la especie Mortierella spp., puede ser usado utilizado como huésped. Además, el uso de la auxotrofia como marcador preferentemente para el desarrollo de productos alimenticios, comparado con el caso en donde es utilizada como marcador la tolerancia al anticuerpo. Esto se explica de manera específica haciendo referencia al caso de la técnica del documento 4 explicado en los antecedentes de la presente invención, es decir, el caso en donde se utiliza, a modo de ejemplo, la tolerancia a la higromicina como marcador. Con el objeto de reproducir de manera estable los transformantes que van a ser seleccionados, es necesario agregar la higromicina en el
medio. Como resultado, el lípido producido utilizando los transformantes estaría contaminado con higromicina. Para que el lípido pueda ser consumido como alimento, es mejor evitar que el lípido esté contaminado con higromicina. Por ejemplo, en el caso de la auxotrofia de la cepa uracil auxotrófica, un medio que carece de uracilo es utilizado en la producción real, esto hace posible producir el lípido mientras que se selecciona la reproducción del hongo en el cual el gen complementario (tal como el gen ura5 o similar a la auxotrofia) es transferido. Es decir, utilizando la auxotrofia como marcador, es posible evitar la contaminación de higromicina y realizar siempre un cultivo selectivo. Por lo tanto, se prefiere utilizar el marcador auxotrófico en la presente invención. Paso de Selección De acuerdo con el método de reproducción de la presente invención, para la reproducción de un hongo productor de lípidos, puede ser obtenida la población de cepas de diferentes caracteres transfiriendo varios genes en el paso de transformación en el cual es utilizada la auxotrofia como el marcador. Por lo tanto, la presente invención puede ser adaptada para que comprenda para la selección, un paso de selección de la población obtenida, teniendo la variedad un carácter deseado. El "paso de selección" es diferente al paso de transformación. El paso de selección no es para
seleccionar el transformante, utilizando la auxotrofia como marcador. El paso de selección es para seleccionar un transformante que tenga un carácter más preferido, de la pluralidad de transformantes obtenidos. No existe una limitación particular con respecto con la forma de llevar a cabo específicamente el paso de selección. Con el objeto de seleccionar el transformante que tiene el carácter preferido, el paso de selección puede ser adaptado, de acuerdo con el propósito de la reproducción, para que se lleve a cabo mediante un método conocido bajo condiciones que permitan la selección del transformante que tiene el carácter preferido. (3) Uso de la Presente Invención El método de reproducción de acuerdo con la presente invención para reproducir un hongo productor de lípidos es, como se describió anteriormente, adaptado de modo que una variedad deseada que tiene un carácter que se puede desear es seleccionada de una población que tiene una variación genética. Como marcador en la selección (selección), se utiliza la auxotrofia. Con esta adaptación es posible producir de una manera eficiente y efectiva una variedad novedosa (cepa novedosa) obtenida como de tipo de original, un hongo productor de lípidos que pertenece a la especie. Mortierella spp. Las especies Mortierella spp. son bien conocidas como hongos productores de lípidos. Esencialmente, se sabe que
tiene la especie M. aplina., una confiabilidad alta como un hongo productor de lípidos. Es posible producir de una manera eficiente y fácilmente una cepa mejorada, por ejemplo, en la productividad del lípido. Además, el método de reproducción de acuerdo con la presente invención puede realizar la transformación utilizando para ser transformado solamente un gen del hongo productor de lípidos. Además, en la presente invención es aplicable la autoclonación. Por lo tanto, es posible obtener un fragmento apropiado de ADN de un hongo de tipo original de la especie Mortierella spp., y transferir el fragmento de ADN en la cepa auxotrófica, controlando de este modo, la expresión de un gen específico (alta expresión, control de tiempo de expresión, inhibición de expresión, etc.). Esto hace posible obtener un transformante, es decir una cepa novedosa, la cual puede lograr dichas mejoras, tal como un aumento en la producción de lípidos, la modificación de la producción de lípidos en términos de tipo o composición de lípidos que se van a producir, etc. Por supuesto, la presente invención puede ser adaptada de modo que un fragmento de ADN derivado de otra variedad haya sido transferido en la cepa auxotrófica, sin la autoclonación. El método de reproducción de acuerdo con la presente invención no está particularmente limitado en términos de la técnica, a adoptar y puede adoptar una técnica conocida. Por
ejemplo, en el caso de la autoclonación, la forma de obtención de un fragmento apropiado de ADN de un hongo de tipo original de la especie Mortierella spp., (huésped) no está particularmente limitada y se puede realizar mediante una técnica conocida. Además, el fragmento apropiado de ADN (por ejemplo, un gen que va a ser transferido, etc.) no está particularmente limitado, siempre que el fragmento de ADN pueda realizar un carácter deseado y de envío al objetivo, o que tenga la posibilidad de realizar el carácter. Por ejemplo, el fragmento de ADN puede ser tal que un cassette de expresión ligado por lo menos con un promotor y preferentemente con un terminador, sea insertado en un vector de expresión recombinante. Además, la presente invención no está limitada a esto. Además, la presente invención no está limitada al gen GLELO, el cual fue utilizado como el fragmento de ADN en los ejemplos que se describen más adelante. La presente invención se describe detalladamente haciendo referencia a los ejemplos. Deberá observarse que estos ejemplos no son para limitar la presente invención. [Ejemplo 1] Aquí, es explicado el ejemplo específico del método de reproducción de la presente invención. En el ejemplo actual, fue obtenida una cepa uracil auxotrófica y se realizaron la transformación y la selección de la cepa uracil auxotrófica.
(1) Obtención de la Cepa Uracil Auxotrófica (Paso de Obtención de la Cepa Auxotrófica) Con el objeto de formar esporas de la especie M. apllna, la especie M. aplina fue inoculada en un medio Czapek-Dox (3% de sacarosa, 0.2% de NaN03, 0.1% de KH2P04I, 0.05% de KC1 0.05% de gS04-7H20, 0.001% de FeS04-7H20, 2% de agar; y pH ajustado a pH 6.0) y se incubó a una temperatura de 28°C durante dos semanas. Esto se suspendió en una solución acuosa de Tween 80 (una gota/100 mi de H20). Entonces, se removieron las hifas utilizando un filtro de vidrio (Iwaki Glass Co., Ltd.; Producto No. 3G1), para de este modo obtener una solución de esporas. El tratamiento del mutagén se llevó a cabo con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) con respecto a las esporas de 10 x 108 a 109, de acuerdo con el método de Jareonkitmongkol et al. (S. Jareonkitmongkol et al. JAOCS, 69, páginas 939 a 944, 1992).
Las esporas tratadas por el mutagén fueron rociadas por un medio GY (2% de glucosa, 1% de extracto de levadura, 2% de agar; ajustada a un pH 6.0) con un contenido de 5-FOA de 1.0 mg /mi y uracilo de 0.05 mg/ml, y se incubó a una temperatura de 28°C durante 4 días. De este modo, se obtuvieron seis cepas tolerantes al 5-FOA. Las cepas obtenidas fueron evaluadas con respecto a la auxotrofia uracilo. Es decir, las reproducciones de estas cepas en un medio
CS y el medio SC con uracilo agregado fueron comparadas (medio SC: Base de Levadura de Nitrógeno sin Aminoácidos, y 5.0g de Sulfato de Amonio (Difco),1.7g de (NH4)2S04, 20g de glucosa, 20g de agar, 20 mg de adenina, 30 mg de tirosina, metionina 1.0 mg, arginina 2.0 mg, histidina 2.0 mg, 4.0 mg de lisina, 4.0 mg de triptofano, 5.0 mg de treonina, 6.0 mg de isoleucina, 6.0 mg de leucina, 6.0 mg/litro de fenilalanina; medio SC uracilo agregando: 50 mg/litro de uracilo). La evaluación mostró que todas las seis cepas tolerantes al 5-FOA que se reproducirían en un medio con uracilo agregado como la cepa de origen, pero se reproducirían de manera deficiente en un medio que no contiene uracilo. Dos de las seis cepas tolerantes al 5-FOA no se podrían reproducir en el medio que no contiene uracilo, estas cepas fueron nombradas como la cepa Aura- y la cepa Aura-2. (2) Evaluación de la Actividad de la Enzima Cuando la cepa muestra una tolerancia al 5-FOA y a la auxotrofia uracilo como sus fenotipos, una posibilidad es que la cepa carezca de una actividad de orotidin-5'-fosfato descarboxilasa (la cual es una enzima codificada por el gen ura3; abreviada en lo sucesivo como ura3p), o pirofosforilasa de ácido orotidílico (la cual es la enzima codificada por el gen ura5; abreviada como ura5p). Por lo tanto, fueron evaluadas
las actividades de estas enzimas en las cepas Aura-1 y la cepa ura-2A. Estas cepas fueron incubadas en un medio GY con uracilo agregado a una temperatura de 28°C durante 4 días con agitación. Se llevó a cabo la preparación de una solución de extracto libre de células de los cuerpos del hongo, de acuerdo con un método modificado del método de Wynn et al. (J. P. Wynn et al. Microbiology, 146, páginas 2325 a 2331, 2000). Específicamente, los cuerpos del hongo obtenidos del día 4 de la incubación a una temperatura de 28°C en el medio líquido GY con contenido de uracilo de 0.05 mg/ml fueron suspendidos en un regulador tris 0.1M (pH 7.5) con un contenido de ß-mercaptoetanol. Luego, las células fueron aplastadas aplicando 35MPa utilizando una prensa French. La solución obtenida fue centrifugada para obtener el sobrenadante, el cual era una solución de extracto libre células. Además, el sobrenadante fue sometido a una super centrifugación bajo condiciones de 100,000 x g durante 60 minutos, eliminando de este modo la organela. De este modo, se obtuvo una fracción soluble. La actividad de la ura3p fue medida utilizando la fracción soluble obtenida de acuerdo con el método de Yoshimoto et., el. (A. Yoshimoto et al. Methods in Enzimology Vol 51, páginas 74 a 79, ACADEMIC PRESS 1978). La
actividad del ura5p fue medida utilizando una fracción soluble obtenida de acuerdo con el método de Umezu et., al. (K. Umezu et al. J. Biochem., 70 páginas 249 a 262, 1971). Los resultados, es decir la comparación de las actividades enzimáticas con respecto a la biosíntesis de pirimidina, se proporcionan en la Tabla 1. Como se puede observar de los resultados de la Tabla 1, las dos cepas tenían una actividad ura3p equivalente a la cepa paterna, pero no se detectó actividad ura5p en estas dos cepas. Además, las esporas de 10d a 109 preparadas por separado fueron sometidas al mismo tratamiento del mutagén. Esto produjo cinco especies tolerantes al 5-FOA, tres de las cuales no se podían reproducir en el medio que no contiene uracilo. Tabla 1
- : no detectado (3) Obtención del ADN del genoma de M. aplina, y la librería de cDNA La especie M. aplina y las cepas uracil auxotróficas (las cepas Aura- y la cepa Aura-2) derivadas de M. aplina como del tipo original, fueron incubadas respectivamente en un
medio líquido GY a una temperatura de 28°C durante 5 días. De los cuerpos del hongo obtenidos, se prepararon los ADNs del genoma de acuerdo con el método de Sakuradani et., al. (E. Sakuradani et al. Eur. J. Biochem., 260, páginas 208 a 216, 1999). Las esporas de M. apüna fueron inoculadas en un medio líquido (2% de glucosa, 1% de extracto de levadura; pH ajustado a 6.0) incubadas a una temperatura de 28°C durante 4 días, y de ahí se recolectaron los cuerpos del hongo. Entonces, se prepararon todos los ARNs mediante el método de clorhidrato de guanidina/CsC1. Utilizando el equipo de purificación Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit (del ARN Total) (Nombre del Producto (Takara Bio Inc.)), los mARNs fueron purificados del ARN total. Luego, se preparó la librería de cADN utilizando el Equipo de Síntesis ZAP.cDNA (Nombre del Producto (STRATAGENE)). (4) Obtención del cADN de ura5 de M. aplina La secuencia de aminoácidos del ura5p de los tres tipos de levaduras, es decir, Glomerella graminlcola, Saccharomyces cerevisiae y Sordaria macrospora, las siguientes son secuencias de aminoácidos de dos regiones que tienen una alta homología entre ellas. Región 1: FGPAYKGIP (ver SEQ. ID. NO. 1) Región 2: KEAKDHGEG (ver SEQ. ID. NO. 2) Basados en estas secuencias de aminoácidos de las dos
regiones, los cebadores sentido y los cebadores antisentido, respectivamente, los cuales tienen las secuencias básicas siguientes fueron sintetizados. Cebadorsentido: 5' -TTYGGHCCIGCITAYAARGGHATYCC-3' (ver SEQ. ID. NO. 3) Cebador antisentido: 5' -CCCTCDCCRTG RTCYTTIGCYTCYTT-3' (ver SEQ . ID. NO. 4) "I" en el cebador permanece para inosina. Observar que en la Tabla de Secuencias, "n" permanece para el sitio que corresponde a la inosina. Entonces, se llevó a cabo el PCR con (a) ADN del genoma de M. aplina como plantilla, (b) los dos cebadores mencionados anteriormente, y (c) la polimerasa Ex Taq (Takara Bio Inc.), utilizando un termociclador de Gradiente T (nombre del producto; Biometra). El PCR fue llevado a cabo con 35 ciclos de un minuto a una temperatura de 94°C, un minuto a 52°C y 2 minutos a 72°C, y luego una prolongación de 10 minutos a una temperatura de 72°C. Esto produjo aproximadamente el fragmento ADN 130bp, una secuencia básica, la cual fue determinada después. Se descubrió que el fragmento de ADN era altamente homólogo con el gen ura5 conocido. Utilizando el ADN como una muestra, se seleccionó la librería de cADN de M. aplina (3)
mediante la hibridación de placa, obteniendo de este modo el plásmido pBMAURA5 que contiene el cADN del gen ura5. El cADN del gen ura5 tenía la secuencia básica mostrada en la SEQ. ID. NO. 5. El gen ura5 codifica el ura5p, el cual tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. NO. 6. (5) Clonación del ADN del genoma ura5. Basados en las secuencias de cADN (SEQ. ID. NO. 5) del gen ura5, se sintetizaron los siguientes cebadores CRON1 y CRON2: Cebador CRON 1:
CTTCTCTTCAGCCCCCAGCCGCATCGGTCC (SEQ. ID. NO. 7) Cebador CRON 2: GAGTCCACGAAAACTGCTGATGAGCAGCAC (SEQ. ID. NO. 8) Utilizando el ADN del genoma de M. aplina como plantilla, fue clonado el ADN del genoma del ura5 mediante PCR. El PCR se llevó a cabo con 30 ciclos de un minuto a 94°C, un minuto a 55°C y 2 minutos a 72°C, y luego una prolongación de 10 minutos a 72°C. Como resultado, se descubrió que no existió intrón en el gen del genoma ura5.
(6) Identificación del Sitio de Mutación en la Cepa Auxotrófica
Utilizando los cebadores CRON 1 y CRON 2, se realizó el PCR utilizando como plantilla el ADN del genoma de la
cepa Aura-1 y la cepa Aura-2, las cuales fueron cepas auxotróficas uracilo. De este modo, fueron clonados los genes del genoma de ura5 de las cepas respectivas. El PCR se llevó a cabo con 30 ciclos de un minuto a 94°C, un minuto 55°C y 2 minutos a 72°C, y luego una prolongación de 10 minutos a 72°C. Se descubrió que en la cepa Aura-1 estaba insertada una adenina en el 93o. del codón de iniciación, y se observó en el ORF el cambio de la estructura. Por otra parte, en la cepa Aura-2, se reemplazó la guanina en el 398°. por adenina, y glicina en el 133°. en una secuencia de patrón que fue reemplazada con ácido aspártico. Esto sugirió que estas mutaciones inactivaron la actividad del ura5p en estas dos cepas. (7) Vector de Expresión Recombinante: Construcción de pDura5 El plásmido pD4 (suministrado por D. B. Archer, ver Documento 4) fue digerido con las enzimas de restricción Ncol y BamHI y sus extremos fueron despuntados utilizando el Equipo de Despuntado de ADN (Nombre del Producto: Takara Bio Inc.). Entonces, fue purificado el fragmento de ADN de 5.4 kbp, excepto el fragmento hpt mod, el cual es el gen tolerante de higromicina B utilizando el ADN GFX PCR y el Equipo de Purificación de Banda de Gel (Nombre del Producto, (hecho por Amasham Pharmacia Biotech & Science). Fueron digeridos con las enzimas de restricción
EcoRI y Xhol, los pBMAURA5 obtenidos en (4). Después de despuntar sus extremos, fue purificado un fragmento de aproximadamente 0.65 kbp del cADN de ura5. Estos dos fragmentos fueron ligados entre ellos utilizando una alta ligación (Nombre del Producto (Toyobo Ltd.). La dirección del gen ura5 es confirmada para seleccionar, como el plásmido pDura5, un fragmento que contiene el promotor hisH4.1 en el lado 5' del gen ura5, y el terminador trpC de llenado 3' del gen ura5. (8) Transformación utilizando el pDura 5 (Paso de Transformación) Se utilizó medio de agar SC como el medio selectivo para el transformante. Se esparcieron esporas (x108) de la cepa Aura-1 en el medio de agar SC. El pDura5 fue transferido al huésped mediante el método de administración de partículas (transformación). La transferencia del gen, se llevó a cabo utilizando un sistema de administración de partículas PDS-1000/He ((Nombre del Producto; BIORAD), se realizó bajo las siguientes condiciones: Presión del Helio: 7590kPa 77.33765 kg/cm2 (1100 psi); vacío en la cámara: 0.7112 m (28 pulgadas) HG; Distancia del objetivo: 3cm; y diámetro de la partícula de tungsteno 1.1pm. Se reprodujeron cuatro colonias en el medio de agar SC después de una incubación de 2 a 3 días a una temperatura de 28°C después de la transferencia del gen. Estas colonias se recolectaron
como el transformante, las cuales fueron marcadas como del #1 al #4. El transformante del #1 al #4 fue examinado utilizando el PCR como si el gen fuera transferido en el mismo. Es decir, se preparó un ADN del genoma de cada transformante. El PCR se llevó a cabo utilizando el ADN del genoma como plantilla, polimerasa EX Taq (Takara Bio Inc.), y los siguientes cebadores RDNA1 y RDNA2. Cebador RDNA1: ACAGGTACACTTGTTTAGAG (SEQ. ID. NO. 9) Cebador RDNA2: CGCTGCGTTCTTCATCGATG (SEQ. ID. NO. 10) El PCR se llevó a cabo con 35 ciclos de un minuto a una temperatura de 94°C, un minuto a 54°C y 2 minutos a 72°C, y luego una prolongación de 10 minutos a una temperatura de 72°C. Como control, el PCR se realizó en la cepa Aura-1. Se descubrió que no se observó amplificación del ADN para la cepa Aura-1 utilizada como huésped. Mientras tanto, el fragmento de ADN de 1.5kbp fue amplificado en cada uno de los transformantes del #1 al #4. Esto confirmó que la recombinación con el plásmido pDura5 ocurrió en la región 18SrADN de cada uno de los transformantes del #1 al #4, transfiriendo de este modo el gen ura5. Además, los transformantes del #1 al #4 fueron incubados en un medio líquido SC a una temperatura de 28°C
durante 4 días con agitación, con el objeto de evaluar la actividad de la enzima ura5p. Los resultados, es decir, la comparación de las actividades de la enzima ura5p se muestra en la Tabla 2. Como se puede ver por el resultado de la Tabla 2, el transformante del #1 al #4 había recuperado la actividad de una manera equivalente a, o varias veces mayor que la del tipo original. Esto probó que funcionó de manera efectiva el gen ura5 transferido. Tabla 2
Además, se repitió dos veces la misma operación de transferencia del gen en aproximadamente 108 esporas de la cepa Aura-1. Los resultantes fueron incubados respectivamente por un período de 2 a 3 días a una temperatura de 28°C, los cuales reprodujeron de 3 y 4 colonias, respectivamente. Esto confirmó que la transformación se puede reproducir. [Ejemplo 2] El presente ejemplo describe un ejemplo en donde fue preparada una cepa novedosa, es decir la cepa transferida
del gen GLELO mediante el método de reproducción en el cual fue utilizada la cepa uracil auxotrófica preparada en el Ejemplo 1. (1) Construcción del vector pDura 5GLELO El gen GLELO codifica una enzima de prolongación de la cadena de ácido graso, la cual convierte el ácido ?-llnolénico en ácido dihomo-Y-linolénico. El gen GLELO fue preparado mediante amplificación PCR utilizando el cADN de la especie M. aplina como plantilla basado en la secuencia básica de la secuencia Británica (ID: AF206662) descrita en la publicación de J. . Parker-Barnes et al. en Proc. Nati. Acad. Sci. EUA., 97 (15), páginas 8284 a 8289, 2000. En la amplificación PCR, se utilizaron los siguientes cebadores MAGLELOI y MAGLEL02. Cebador MAGLELOI: CCATGGATGGAGTCGATTGCGCCATTCC (SEQ. ID. NO. 11) Cebador MAGLEL02: GGATCCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC (SEQ. ID. NO. 12) El gen GLELO amplificado fue digerido con enzimas de restricción Ncol y BamHI, obteniendo de este modo un fragmento de aproximadamente 1 kb . Además, el pD4 fue digerido con las enzimas de restricción Ncol y BamHI, para obtener de este modo un fragmento de aproximadamente
7.7kb. Cada fragmento fue ligado utilizando alta ligación (Nombre del Producto; Toyobo Ltd.), para obtener de este modo el plásmido pDGLELO. Por otra parte, el pDura5 fue digerido parcialmente con EcoRI. Entonces fueron purificados los fragmentos de ADN de aproximadamente 6.2 kb, los cuales fueron cortados solamente en uno de los dos sitios EcoRI. Después de que los extremos de los fragmentos fueron despuntados mediante el Equipo de Despuntado de ADN (Nombre del Producto; Takara Bio Inc.), los fragmentos fueron sometidos a la autoligación utilizando alta ligación (Nombre del Producto; Toyobo Ltd.). Entonces, los fragmentos en los cuales solamente fueron recolectados como pDura 5' de los sitios que estaban localizados en el lado 5' del promotor de histona 4.1. Además, el pDGLELO fue digerido con EcoRI, para obtener de este modo fragmentos 2.7kb. Los fragmentos entonces fueron insertados en el sitio EcoRI de la línea pDura5'. De estos fragmentos, fue seleccionado un plásmido en el cual los cassettes de expresión GLELO y los cassettes de expresión ura5 fueron alineados en la misma dirección como el vector de expresión recombinante pDura5GLELO. (2) Transformación utilizando pDura5GLELO (Paso de Transformación) Siguiendo el mismo método que en el punto (8) del Ejemplo 1, se llevó a cabo la transformación para la cepa
Aura-1 obteniendo de este modo tres transformantes. Por razones de facilidad de explicación, estos transformantes fueron marcados como del #5 al #7, respectivamente. Los transformantes del # 5 al #7 fueron examinados utilizando el PCR con respecto a si fue transferido o no en los mismos el pDura5GLELO. El PCR se llevó a cabo de la misma manera que el punto (8) del Ejemplo 1, utilizando los cebadores RADN1 y RADN2. Se descubrió que el fragmento de ADN de 1.5kbp fue amplificado en cada una de las tres cepas del #5 al #7. Esto confirmó que la recombinación con pDura5GLELO ocurrió en la región 18SrADN de las tres cepas del #5 al #7, transfiriendo de este modo el ura5. (3) Análisis de Expresión del gen GLELO Utilizando un equipo de mini planta RNeasy (Nombre del Producto (hecho por QIAGEN)), el ARN total fue extractado por cada una de las dos cepas #1 y #2 transferidas de la gen ura5 creadas en el Ejemplo 1, y las cepas del #5 al #7 transferidas por el gen GLELO en el punto (2) anterior. Las cepas del #5 al #7 habían sido incubadas bajo las mismas condiciones de incubación que en el análisis del lípido. Utilizando el Sistema de Síntesis del Primer Hilo del Super Escrito para RT-PCR (Nombre del Producto (hecho por Invitrogen)), la transcripción inversa del ARN total (1pg) se realizó con un hexámero aleatorio, sintetizando de este modo el cADN. Luego, se realizó el PCR utilizando 1µ? (1/20 en
cantidad) en el cADN sintetizado como plantilla, polimerasa EX Taq (Takara Bio Inc.), y los siguientes cebadores MAGLELO 5 y MAGLELO 6: Cebador MAGLELO 5: CTTTGTGGGCATGCAGATCA (SEQ. ID. No. 13) Cebador MAGLELO 6: TGAAGATGGAGCTGTGGTGGTA (SEQ. ID. NO. 14) El PCR se llevó a cabo con 20 ciclos de un minuto a una temperatura de 94°C, un minuto a 55°C, 2 minutos a 72°C, y luego una prolongación de 10 minutos a una temperatura de 72°C. Se llevó a cabo la electroforesis del producto del PCR. Fue comparada La densidad fluorescente de una banda del fragmento de aproximadamente 300bp. Como resultado, la banda fue muy ligera en la densidad fluorescente en ambas cepas transferidas del gen ura5, mientras que la banda estuvo en una densidad clara en todas las tres cepas transferidas del gen GLELO. Por otra parte, cuando se llevó a cabo el PCR de la misma manera, pero con 30 ciclos, la banda estuvo en una densidad clara en todas las cepas. Esto sugiere que la cantidad del gen GLELO fue transferida en las cepas transferidas del gen GLELO. (4) Análisis del Lípido de la Cepa de Transferencia del Gen GLELO Las esporas de las dos cepas #1 y #2 transferidas del
gen ura5 creado en el Ejemplo 1 y las cepas del #5 al #7 transferidas del gen GLELO obtenidas en el punto (2) anterior, fueron inoculadas respectivamente en medios líquidos (5% de glucosa, 1% de extracto de levadura; ajustado a pH 6.0) e incubadas a una temperatura de 28°C durante 7 días con agitación. Después de la incubación, los cuerpos del hongo fueron recolectados mediante filtración. Los cuerpos del hongo recolectados entonces fueron secados. De acuerdo con el método de ácido clorhídrico-metanol, los residuos de ácido graso en los cuerpos del hongo fueron convertidos en éster metílico. El éster metílico obtenido entonces fue extractado con hexano, el cual fue destilado posteriormente obteniendo de este modo ácidos grasos de éster metílico. Los ácidos grasos de éster metílico obtenidos fueron analizados con cromatografía de gas. El resultado del análisis se muestra en la Tabla 3, mostrando el peso del cuerpo de los hongos secos cuando se reprodujeron las cepas transferidas del gen respectivo (transformante) y las composiciones el ácido graso y la cantidad total de producción de lípidos en los cuerpos de los hongos de cada cepa. En la Tabla 3, la proporción 16:0 es ácido palmítico, 18:0 es ácido esteárico, 18:1 es ácido oleico, 18:2 es ácido linoleico, 18:3 es ácido ?-linoleico, 20:3 es ácido dihomo-?-linoleico, 20:4 es ácido araquidónico y 24:0 es ácido
lignocérico. Tabla 3
Como se puede observar en la Tabla 3, la transferencia del gen GLELO aumentó el peso del cuerpo de los hongos secos y las proporciones de ácido dihomo-Y-linoléico y ácido araquidónico en los ácidos grasos totales. Sin embargo, la transferencia del gen GLELO disminuyó la proporción de
ácido ?-linoleico en los ácidos grasos totales. Además, La cantidad total de lípidos producidos y en el contenido total de lípidos producidos fue aumentada como resultado de la transferencia del gen GLELO. Además, la transferencia del gen GLELO aumentó la cantidad y contenido de producción de ácido dihomo-Y-linoleico y ácido araquidónico. Las cepas que tienen transferido el gen GLELO mostraron un aumento importante en la proporción (20:3/18:3) entre el ácido dihomo-Y-linoleico y ácido ?-linoleico, los cuales son el producto de la reacción de prolongación de la longitud de cadena y la substancia de tierra del mismo o la proporción ((20:3+20:4)/18:3) de una suma de ácido dihomo-Y-linoleico y ácido araquidónico, el cual es un metabolito del ácido dihomo-Y-linoleico sobre el ácido ?-linoleico. [Ejemplo 3] El ejemplo presente explica un ejemplo específico en el cual fue aplicado el método de reproducción de acuerdo con la presente invención a un hongo de la especie Mortierella spp. diferente a la especie M. aplina. (1) Obtención de Cepas Uracil Auxotróficas (Paso de Obtención de la Cepa Auxotrófica) Con el objeto de formar esporas de las especies de M. hygrophila y M. chlamydospora, estos hongos fueron inoculados respectivamente en un medio Czapek-Dox (3% de sacarosa, 0.2% de NaN03, 0.1% de KH2P04, 0.05% de KCi,
0.05%de MgS04-7H20, 0.001% de FeS04-7H20, 2% de agar; pH ajustado a 6.0) e incubadas a una temperatura de 28°C durante aproximadamente 2 semanas. Estos fueron suspendidos en solución acuosa Tween 80 (1gota/100ml de H20). Entonces la hlfa fue removida utilizando un filtro de vidrio (Iwaki Glass Co., Ltd.; Producto No.: 3G1), para obtener de este modo una solución de esporas. El tratamiento del mutagén se llevó a cabo con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) con respecto a las esporas de 10 x 108 a 109 de acuerdo con el método de Jareonkitmongkol et al. (S. Jareonkitmongkol et al. JAOCS, 69, páginas 939 a 944, 1992). Las esporas tratadas mediante el mutagén fueron esparcidas en medios GY (2% de glucosa, 1% de extracto de levadura, 2% de agar; ajustado a un pH de 6.0), con un contenido de 5-FOA de 1.0mg/ml y uracilo de 0.05mg/ml, e incubadas a una temperatura de 28°C durante 4 días. De este modo, dos cepas tolerantes al 5-FOA obtenidas de la especie M. higrophila y una cepa tolerante al 5-FOA obtenida de la especie M. chlamydospora. Las cepas obtenidas fueron evaluadas con respecto a la uracil auxotrofia. Es decir, los cultivos de estas cepas en el medio SC y el medio SC con uracilo agregado fueron comparados (medio SC: Base de Nitrógeno de Levadura sin Aminoácidos y 5.0g de Sulfato de Amonio (Difco), 1.7g de (NH4)2S04, 20g de
glucosa, 20g de agar, 20mg de adenina, 30mg de tirosina, 1.0mg de metionina, 2.0mg de arginina, 2.0mg de histidina, 4.0mg de Usina, 4.0mg de triptofano, 5.0mg de treonina, 6.0mg de isoleucina, 6.0mg de leucina, 6.0mg/litro de fenilalanina; 50 mg/litro de uracilo). La evaluación mostró que todas las cepas tolerantes al 5-FOA podrían reproducirse en un medio con uracilo agregado como la cepa original, pero que se reprodujeron de manera deficiente en un medio que no contiene uracilo. Una de las dos cepas provenientes de la especie M. hlgrophüa y la cepa de la especie M. chlamydospora no podrían reproducirse en un medio uracilo. Esta de las dos cepas de la especie M. hygrophila fue denominada como cepa MH-Aura-1, mientras que fue denominada la cepa de la especie M. chlamydospora como cepa MC-Aura-1. (2) Evaluación de la Actividad de la Enzima Estas dos cepas fueron incubadas en un medio GY con uracilo agregado a una temperatura de 28°C durante 4 días con agitación. La preparación de la solución del extracto libre de células de los cuerpos de los hongos se llevó a cabo de acuerdo con un método modificado del método de Wynn et al. (J. P. Wynn et al. icrobiology, 146, páginas 2325 a 2331, 2000). Específicamente, los cuerpos de los hongos obtenidos del día 4 de la incubación a una temperatura de 28°C en el
medio líquido GY contiene uracilo de 0.05mg/ml fueron suspendidos en 0.1M de regulador tris (pH 7.5) con un contenido de ß-mercaptoetanol. Entonces la célula fueron aplastadas aplicando 35MPa utilizando una prensa French. La solución obtenida fue centrifugada para obtener un sobrenadante, el cual era una solución del extracto libre de células. Además, la super centrifugación se llevó a cabo bajo condiciones de 100,000xg durante 60 minutos, para eliminar de este modo la organela. De este modo, se obtuvo una solución soluble. Utilizando la fracción soluble obtenida, se evaluó la actividad de la pirofosforilasa de ácido orotidílico (ura5p), de acuerdo con el método de Umezu et al. (K. Umezu et al. J. Biochem., 70, páginas 249 a 262, 1971). La evaluación mostró que la actividad del ura5p fue debajo del límite mensurable en cada una de estas cepas. (3) Transformación utilizando pDura 5 (Paso de Transformación) La cepa M. hygrophila MH-Aura-1 o la cepa M.chlamydospora MC-Aura-1 fue inoculada en un medio Czapek-Dox e incubada a una temperatura de 28°C durante 2 semanas, formando de este modo, las esporas. Las esporas fueron recolectadas como se describió en el punto (1) anterior. El medio de agar SC fue utilizado como el medio
selectivo para las cepas transformadas. El pDura5 fue transferido en el huésped por un método de administración de partículas (transformación). La transferencia del gen, se llevó a cabo utilizando un sistema de administración de partículas PDS-1000/He (Nombre del Producto; BIO RAD), se realizó bajo las siguientes condiciones: Presión de helio: 7590kPa 77.33765 kg/cm2 (1100 psi); vacío en la cámara: 0.7112 m (28 pulgadas) HG; Distancia del objetivo: 3cm; y diámetro de partícula de tungsteno 1.1µ??). Después de la transferencia del gen, se reprodujeron aproximadamente una docena de colonias en el medio de agar SC después de los días 2 y 3 de incubación a una temperatura de 28°C por cada cepa. Estas colonias fueron recolectadas como el transformante. Las modalidades y los ejemplos concretos de la implementación explicada en la descripción detallada anterior, sirven únicamente para ilustrar los detalles técnicos de la presente invención, los cuales no deberán ser interpretados de una manera estrecha dentro de los límites de dichas modalidades y ejemplos concretos, sino más bien pueden ser aplicados en muchas variaciones dentro del espíritu de la presente invención, debido a que dichas variaciones no exceden el alcance de las reivindicaciones de la patente establecidos más adelante. APLICABILIDAD INDUSTRIAL Un método de acuerdo con la presente invención para
reproducción de un hongo productor de lípidos es, como se describió anteriormente, incluye un paso de transformación que incluye la transferencia de un gen marcador en un huésped, en donde ei huésped es una cepa auxotrófica del hongo productor de lípidos y el gen marcador es un gen complementario a la auxotrofia de la cepa auxotrófica (paso de transferencia del gen) y seleccionar un transformante, utilizando como un marcador, la recuperación de la auxotrofia del huésped (paso de selección). Con esta adaptación, la presente invención hace posible producir de una manera eficiente y efectiva una variedad novedosa (cepa novedosa) del hongo productor de lípidos que pertenece a la especie Mortierella spp. como su tipo original. Además, la auto-clonación es aplicable en la presente invención. Por lo tanto, es posible obtener un fragmento de ADN apropiado del hongo del tipo original de la especie Mortierella spp. y transferir el fragmento de ADN en la cepa auxotrófica, controlando de este modo la expresión de un gen específico (alta expresión, controlando el tiempo de la expresión, inhibiendo la expresión, etc.). Esto hace posible obtener un transformante, que es, una cepa novedosa, la cual puede lograr mejoras tales como un aumento en la producción de lípidos, la modificación de la producción de lípidos en términos del tipo o composición del lípido que se va a producir, etc.
Las especies Mortierella spp., son bien conocidas como hongos productores de lípidos e incluyen un hongo productor de lípidos altamente confiable, tal como la especie M. apllna. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, es posible lograr una producción fácil y efectiva de una cepa la cual es mejorada en la productividad de lípidos, o efectos similares. Por lo tanto, la presente invención se puede aplicar a las industrias que se relacionan con diferentes técnicas de fermentación que utilizan la especie Mortierella spp., la industria alimenticia, la industria farmacéutica e industrias similares que utilizan técnicas de fermentación.