UA72205C2

UA72205C2 - Спосіб підвищення ударної в'язкості та твердості кісток і зменшення кількості випадків переломів за допомогою паратиреоїдного гормону (варіанти)

Info

Publication number: UA72205C2
Application number: UA2000095457A
Authority: UA
Inventors: Жанет Марі Хок; Жанет Мари Хок; Грегорі А. Гейч; Віллард Онглен Дір
Original assignee: Елі Ліллі Енд Компані; Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 1998-08-19
Filing date: 1999-08-19
Publication date: 2005-02-15
Also published as: KR100454207B1; HK1212602A1; DE15152726T1; NO20072983L; CZ20004134A3; CA2325371C; HK1030545A1; PE20001089A1; KR20010072763A; EP1059933B1; AU746277B2; CO5130020A1; PT2266598T; EA200001015A1; EA003362B1; BR9909445A; DK2907522T1; WO2000010596A1; HUP0101594A3; TR200003455T2

Abstract

Цей винахід має відношення до способу зниження перелому хребців та невертебральних кісток у людини, яка знаходиться у стані ризику виникнення остеопорозу або має остеопороз. Згідно з ним такій людині вводять людський паратиреоїдний гормон РТН(1-34) у денній дозі, що складає 20-40 мкг, впродовж від 12 місяців до 3 років.

Description

Цей винахід має відношення до способів підвищення ударної в'язкості та/або твердості кісток та/або зменшення ймовірності та/або тяжкості перелому кісток шляхом введення паратиреоїдного гормону. Зокрема, цей винахід має відношення до способу підвищення ударної в'язкості або твердості кісток на місці потенційної або фактичної травми, наприклад, тазостегнового суглоба або хребетного стовпа, особи, яка знаходиться у стані ризику виникнення або стращає на остеопороз. Зокрема, цей винахід має відношення до способу зменшення кількості випадків переломів хребців, зменшення кількості випадків множинних переломів хребців, зменшення тяжкості переломів хребців та/або зменшення кількості випадків невертебральних переломів.

Засоби, які існують, наприклад, естроген, біфосфонат, фторид або кальцитонін, можуть запобігати рарефікації кісток та викликати 3-595 підвищення маси кісткової тканини шляхом поновного заповнення простору ремоделювання, однак це не забезпечує суттєвого стимулювання остеогенезу. Ретенція кісткової тканини шляхом інгібування її метаболізму може не забезпечити достатнього захисту від ризику виникнення перелому у пацієнтів, які вже мають значний рівень розрідження кісток. Анаболічні агенти, які підвищують міцність кісток шляхом стимулювання остеогенезу, можуть за переважним варіантом забезпечити кращий захист проти перелому у пацієнтів з розвинутим остеопорозом.

Паратиреоїдний гормон (РТН) представляє собою секретований 84-амщокислотний продукт паращитоподібної залози ссавців, який контролює рівні кальцію у сироватці завдяки своїй дії на різноманітні тканини, у тому числі кісткову. Гадають, що М-кінцевий 34-амінокислотний РТН (РТН(1-34)) людини та великої рогатої худоби є біологічно еквівалентним повномірному гормону. Інші амінокислотні фрагменти РТН (у тому числі, наприклад, 1-31 та 1-38) або РТНГР (РТН-споріднений пептид/білок), або аналоги будь-якого з них, або обох, які активують РТН/РТНГР рецептор (РТНІ рецептор), демонструють подібний же біологічний вплив на кісткову масу, хоча масштаби згаданого впливу можуть різнитись.

Результати досліджень на людях з різноманітними формами РТН продемонстрували анаболічний вплив на кісткову тканину та викликали значну зацікавленість його застосуванням для лікування остеопорозу та споріднених розладів, пов'язаних з кістками. Значний анаболічний вплив РТН на кісткову тканину, у тому числі стимулювання остеогенезу, наслідком чого є чисте збільшення кісткової маси та/або міцності, був продемонстрований на багатьох тваринних моделях та на людях.

Розповсюджена точка зору полягає у тому, що введення РТН людям та спорідненим тваринним моделям справляє негативний вплив на кортикальний шар кістки. Фактично наслідком природного підвищення вмісту ендогенного РТН, яке спостерігається під час розладу, гіперпаратиреозу, є стоншення кортикального шару кістки, яке супроводжується підвищенням зв'язності та маси губчастої кістки. Результати проведених досліджень дозволяють висунути припущення, суть якого полягає у тому, що у разі ремоделювання гаверсова кортикального шару кістки (який існує у людей та вищих ссавців) під впливом РТН, буде відбуватись перерозподіл кісткової тканини таким чином, що маса та міцність кортикального шару кістки буде падати, у той час як маса та міцність губчатої кістки буде зростати. Наприклад, за результатами опублікованих клінічних досліджень введення РТН, маса кортикального шару кістки після лікування екзогенним РТН зменшувалась, і ці дані викликали занепокоєння тим, що наслідком лікування РТН буде зменшення маси кортикального шару кістки та зниження його міцності. Занепокоєння, яке було викликано згаданими дослідженнями, полягає також у тому, що наслідком втрати кортикального шару кістки буде зменшення загальної скелетної кісткової маси.

Це має велике клінічне значення, оскільки у разі остеопорозу більша втрата губчастої кістки, порівняно з втратою кортикального шару кістки, означає, що механічне навантаження буде припадати головним чином на залишкову частину кортикального шару кістки. Постійне розрідження кортикального шару кістки підвищує ризик виникнення перелому. Важливо, таким чином, щоб терапевтичний засіб для лікування остеопорозу підтримував або збільшував залишкову частину кортикального шару кістки суб'єкту.

Вплив РТН на кортикальний шар кістки було досліджено на тваринах, окрім людини, з ремоделюванням гаверсова кортикального шару кістки, наприклад, на собаках, тхорах, вівцях та мавпах, однак величина зразків, як правило, є занадто малою для проведення надійного статистичного аналізу. Вплив змін, яким піддаються механічні властивості кортикального шару кістки у таких тварин у разі лікування за допомогою

РТН, залишається невідомим. Результати опублікованих досліджень гризунів демонструють збільшення маси кортикального шару кістки під час введення РТН, але зникнення цієї переваги після припинення введення

РТН. Однак структура кортикального шару кісток гризунів чітко відрізняється від структури гаверсова кортикального шару і ремоделюється шляхом поверхневої аппозиції а не інтракортикальним ремоделюванням остеонів. На додаток до цього унаслідок технологічних обмежень біохімічних випробувань відносно коротких кісток гризунів виникають артефакти вимірів, коли засіб, наприклад, РТН, змінює геометрію кістки для її потовщення. Унаслідок подібних артефактів екстраполювання реакції кортикального шару кісток пацюків на кістки людей або інших тварин з рецоделюванням остеонів стає ненадійним. Таким чином дані, які існують для тварин, а також для людей, які піддаються гаверсовому ремоделюванню, вказують на те, що РТН може мати шкідливий вплив на кортикальний шар кістки з викликанням результуючої втрати кісткової маси унаслідок виснаження кортикального шару кістки.

Як наслідок, розповсюджена думка щодо дії РТН полягає у тому, що пацієнти потребують одночасного або подальшого лікування з застосуванням протирезорбційного препарату для зведення до мінімуму втрати кісткової тканини, яку було викликано РТН. Фактично, ця модель була основою проведення декількох клінічних досліджень на жінках. Наприклад, було проведено три клінічні дослідження на постклімактеричних жінках, коли РТН застосовували одночасно з введенням кальцитоніну або естрогену, або на передклімактеричних жінках, які приймали агоніст гонадотропін-рилізинг-гормону, синарел, з приводу ендометриту. Протилежний вплив естрогену та РТН на, метаболізм кортикального шару кістки особливо ускладнює спостереження ефектів самого РТН під час комбінованого лікування за допомогою двох згаданих препаратів.

Залишається потреба у способі застосування РТН для підвищення міцності та твердості кісток у людей та інших тварин з гаверсовим ремоделюванням, а також для зменшення кількості випадків перелому кісток у згаданих тварин. На додаток до цього залишається потреба у способі підвищення якості та об'єму кортикального шару кістки.

Цей винахід включає спосіб підвищення ударної в'язкості та/"або твердості кістки, за переважним варіантом кортикального шару кістки, та/"або зменшення кількості випадків та/або тяжкості перелому кісток шляхом введення паратиреоїдного гормону. Зокрема, цей винахід має відношення до способу підвищення ударної в'язкості або твердості кісток на місці потенційної або фактичної травми. Підвищення ударної в'язкості та/або твердості кістки може проявлятись численними шляхами, відомими фахівцям у цій галузі, наприклад, підвищенням мінеральної густини кістки, підвищенням вмісту мінеральних речовин кістки, підвищенням роботи до руйнування тощо. За одним з варіантів втілення цього винаходу спосіб за цим винаходом знижує кількість випадків або тяжкість вертебральних та/або невертебральних переломів. Згаданий спосіб за цим винаходом може використовуватись для зниження ризику таких переломів або для лікування таких переломів. Зокрема, згаданий спосіб за цим винаходом може знизити кількість випадків вертебральних та/або невертебральних переломів, знизити тяжкість вертебрального перелому, знизити кількість випадків множинних вертебральних переломів, поліпшити якість кістки тощо.

Згаданий спосіб може підвищити ударну в'язкість або твердість на місці потенційної травми, наприклад, стегна або хребетного стовпу особи з остеопорозом, або на іншому місці, яке має аномально низьку кісткову масу або погану структуру кістки. Згаданий спосіб може також підвищувати ударну в'язкість або твердість кістки на місці фактичної травми, наприклад, перелому, наприклад, стегна або хребця. Переважним суб'єктом для згаданого способу за щем винаходом є жінка або чоловік, який знаходиться у стані ризику виникнення або який має остеопороз, за переважним варіантом жінка у постклімактеричному періоді, та який не піддається одночасній гормональнозамісній терапії (НАТ), естрогенній або еквівалентній терапії або протирезорбційній терапії. За одним з варіантів втілення цього винаходу згаданий пацієнт одержує також допоміжні засоби кальцію та/або вітаміну 0.

Паратиреоїдний гормон, наприклад, М-кінцеві амінокислоти 1-34 рекомбінантного людського паратиреоїдного гормону, може вводитись циклічним або переміжним чином. За переважним варіантом циклічне введення включає введення РТН впродовж 2 або декількох циклів ремоделювання з подальшим припиненням введення РТН впродовж одного або декількох циклів ремоделювання. На додаток до цього, за згаданим способом за цим винаходом, підвищення ударної в'язкості та/або твердості кістки може тривати впродовж декількох циклів ремоделювання або впродовж декількох років після останнього введення паратиреоїдного гормону.

На Фігурах 1А та 18 показано, що ВМО (мінеральна густина кістки) та ВМС (вміст мінеральних речовин у кістковій тканині) діафізу стегнової кістки (кортикальний шар кістки) (А) та проксимального відділу стегнової кістки (губчаста речовина кістки«ккортикальний шар кістки) (В) були значно вищими у тварин, яких піддавали обробці РТН, аніж у контрольних тварин при обох дозах.

На Фігурах 2А-20 показано вплив РТН на механічну міцність та момент інерції поперечного розтину (СЗМІ) кортикального шару діафізу стегнової кістки.

Фігура З ілюструє відсоткову зміну критеріїв ОХА (подвійної рентгенівської абсорбціометри) загального вмісту мінеральної речовини кісток у контрольній та експериментальній групах.

Фігури 4А-С ілюструють відсоткову зміну критеріїв ЮХА (подвійної рентгенівської абсорбціометри) хребетного стовпу для контрольної та експериментальної груп у поперекових хребцях 2-4 для площі кістки (А), вмісту мінеральних речовин у кістковій тканині (В) та мінеральної густини кісткової тканини (С).

Фігури 5А та 5В ілюструють збільшення маси кістки (А) та міцності кістки (В) поперекових хребців приматів, яких було піддано обробці паратиреоїдним гормоном.

Фігури бА та 6В ілюструють підвищення міцності шийки стегнової кістки (А) та постійної міцності середньої частини діафізу плечової кістки (В) приматів, яких було піддано обробці паратиреоїдним гормоном.

Фігура 7 ілюструє активацію швидкості остеогенезу на ендостальній та періостальній поверхнях діафізу плечової кістки.

Фігура 8 ілюструє гістограмний аналіз зміщення густини об'ємного елементу зображення кістки поперекових хребців унаслідок лікування РТН, порівняно до контролю. Слід звернути увагу на підвищення густини кортикального шару кістки після припинення лікування РТН.

Фігура 9 ілюструє підвищення ВМО поперекового відділу хребетного стовпу впродовж 23 місяців лікування пацієнтів РТН у дозі 20мкг/день або 4Омкг/день, порівняно до контрольних пацієнтів, яким вводили плацебо.

Фігура 10 ілюструє зростання ВМО стегнової кістки та шийки стегнової кістки впродовж 24 місяців лікування пацієнтів РТН у дозі 20мкг/день або 40мкг/день, порівняно до контрольних пацієнтів, яким вводили плацебо.

Цей винахід має відношення до способу підвищення ударної в'язкості та/або твердості кістки та/або зменшення кількості випадків перелому у суб'єкку шляхом введення паратиреоїдного гормону. Згаданий спосіб можна застосовувати для підвищення твердості та/або ударної в'язкості на місці потенційної травми або на місці фактичної травми. Травма, взагалі, включає перелом, хірургічну травму, протезування суглобу, ортопедичні процедури тощо. Підвищення ударної в'язкості та/або твердості кістки включає, взагалі, підвищення мінеральної густини кортикального шару кістки, підвищення міцності кістки, підвищення стійкості до навантаження тощо. Зменшення кількості випадків перелому включає, взагалі, зменшення ймовірності або фактичної кількості випадків перелому для суб'єкту, порівняно з контрольними суб'єктами, які лікуванню не піддавались.

Вираз "гранична сила", який використано у цьому описі, означає максимальну силу, яку витримує зразок кістки; твердість означає нахил лінійної ділянки кривої залежності деформації від навантаження; та робота до руйнування означає площу під кривою залежності деформації від навантаження перед переломом. Кожен зі згаданих показників можна виміряти та вирахувати за способами, стандартними для галузі, яка займається вивченням кісток. Згадані параметри є структурними властивостями, які залежать від внутрішніх властивостей та геометрії матеріалу і можуть визначатись за описом, який наведено у роботі Тарнера К.Г. (Тигпег С.Н.) та

Барра Д.Б. (Ви 0.В.), 1993, "Вавіс Біотеспапіса! теазигетепів ої ропе: а ішоїпа!", Вопе, 14:595-608, яку включено до цього опису як посилання. Гранична сила, твердість та робота до руйнування можуть бути нормалізовані для визначення внутрішніх властивостей матеріалу, наприклад, межі міцності, модуля пружності та ударної в'язкості, які не залежать від розміру та форми. Термін "межа міцності", який використано у цьому описі, означає максимальне зусилля, яке може витримати зразок; модуль пружності означає внутрішню твердість матеріалу; та ударна в'язкість означає стійкість до руйнування на одиницю об'єму. Кожен зі згаданих показників можна визначити за допомогою способів, відомих у цій галузі. Дивись літературне джерело, яке було згадано перед тим. Міцність стегнової кістки, як згадується у цьому описі, можна визначити на шийці стегнової кістки або на діафізі шляхом згинання згаданої частини кістки у трьох або чотирьох точках.

Травма кісток

Згаданий спосіб за цим винаходом є корисним для суб'єкту, який страждає або страждав на травму однієї або декількох кісток, Згаданий спосіб може бути корисним для суб'єктів-ссавців, наприклад, людей, коней, собак та кішок, зокрема, для людей. Травма кістки може бути проблемою для бігових коней та собак, а також для кімнатних тварин. Людина може страждати від будь-якої з різноманітних травм, які можуть бути викликані аварією, медичним втручанням, хворобою або розладом. У молодих людей травма кістки є, ймовірно, наслідком перелому, медичного втручання, яке було здійснено з метою лікування перелому, або відновлення функції суглобів або сполучної тканини, яку було пошкоджено, наприклад, унаслідок зайняття спортом.

Травми кісток інших типів, наприклад, травми унаслідок остеопорозу, дегенеративної хвороби кісток (наприклад, артриту або остеоартриту), протезування тазостегнового суглобу або вторинних станів, які пов'язані з лікуванням інших системних станів (наприклад, глюкокортикоїдного остеопорозу, опіків або трансплантації органу) найчастіше спостерігаються у людей похилого віку.

До переважних суб'єктів належить людина, за переважним варіантом жінка, яка знаходиться у стані ризику виникнення або страждає на остеопороз. Фактори ризику для остеопорозу є відомими у цій галузі і включають гіпогонадні стани у чоловіків та жінок, незалежно від віку, станів, хвороб або лікарських засобів, які викликають гіпогонадизм, фактори харчування, пов'язані з остеопорозом (найпоширенішим є низький вміст кальцію або вітаміну 0), паління, споживання спиртних напоїв, лікарські засоби, пов'язані з остеопорозом (наприклад, глюкокортикоїди, тироксин, гепарин, літій, антиконвульсивні засоби тощо), втрату зору, яка сприяє падінням, космічний політ, імобілізацію, постійну госпіталізацію або постільний режим та інші системні хвороби, які пов'язують з підвищеним ризиком остеопорозу. Ознаки присутності остеопорозу є відомими у цій галузі техніки і включають радіологічне підтвердження компресійного перелому як мінімум одного хребця, низьку кісткову масу (за типовим варіантом як мінімум 1 стандартне відхилення нижче середніх стандартних значень для молодого віку) та/або атравматичні переломи.

Наслідком остеопорозу можуть бути, наприклад, вертебральні та/або невертебральні переломи.

Прикладами невертебральних переломів є перелом стегнової кістки, перелом дистального відділу передпліччя, перелом проксимального відділу плечової кістки, перелом зап'ястя, перелом променевої кістки, перелом гомілковостопного суглобу, перелом плечової кістки, перелом ребра, перелом стопи, перелом тазу або комбінація згаданих переломів. Згаданий спосіб за цим винаходом може використовуватись для зменшення ризику таких переломів або для лікування таких переломів. Ризик перелому зменшується завдяки та загоєнню перелому сприяє підвищення міцності та/або твердості кістки, наприклад, стегна, хребетного стовпа або обох. Типовою жінкою, яка знаходиться у стані ризику виникнення остеопорозу, є постклімактерична жінка або передклімактерична, гіпогонадна жінка. Переважним суб'єктом є постклімактерична жінка незалежно від одночасно здійснюваної гормонозамісної терапії (НЕТ), естрогенної або еквівалентної терапії або протирезорбційної терапії. Згаданий спосіб за цим винаходом може бути корисним для суб'єкту на будь-якому етапі остеопорозу, однак, зокрема, на початковому та прогресуючому етапах.

Цей винахід надає спосіб, ефективний, зокрема, для запобігання або зменшення кількості переломів у суб'єкту, який має або знаходиться у стані ризику прогресування до остеопорозу. Цей винахід, наприклад, може зменшити кількість вертебральних та/або невертебральних переломів, знизити тяжкість вертебральних переломів, зменшити кількість множинних вертебральних переломів, поліпшити якість кістки тощо. За іншим варіантом втілення згаданий спосіб за цим винаходом може бути корисним для пацієнтів з низькою кістковою масою або попередніми переломами, які знаходяться у стані ризику виникнення майбутніх множинних скелетних переломів, наприклад, пацієнтів, у яких може швидко прогресувати остеопороз хребетного стовпу.

Інші суб'єкти також можуть бути у стані ризику виникнення або страждати на травму кістки і можуть одержати користь від згаданого способу за цим винаходом. Наприклад, для найрізноманітніших суб'єктів, які знаходяться у стані ризику виникнення одного або декількох зі згаданих перед тим переломів, може передбачатись хірургічне втручання з наслідковою травмою кістки, або вони можуть піддаватись ортопедичній процедурі з маніпулюванням кісткою на ділянці скелету з аномально низькою кістковою масою або поганою структурою, або з недостатнім рівнем вмісту мінеральних речовин. Наприклад, відновлення функції після хірургічного втручання, наприклад, протезування суглобу (наприклад, колінного або тазостегнового) або іммобілізації хребетного стовпу, або інших процедур, які іммобілізують кістку або скелет, можна поліпшити завдяки згаданому способу за цим винаходом. Згаданий спосіб за цим винаходом може також допомогти виздоровленню після ортопедичних процедур, під час яких здійснювалось маніпулювання з кісткою на ділянці з аномально низькою кістковою масою або поганою структурою; до згаданих процедур належить хірургічний поділ кістки, у тому числі остеотомії, протезування суглобу, де втрата кісткової структури потребує, наприклад, реструктурування зі створенням навісу вертлюжної западини та запобігання зсуву протезу. До інших придатних суб'єктів для практичного втілення цього винаходу належать суб'єкти, які страждають на гіпопаратиреоз або кіфоз, які можуть підлягти травмам, пов'язаним з або спричиненим гіпопаратиреозом або прогресуванням кіфозу.

Ударна в'язкість та твердість кісток

Згаданий спосіб за цим винаходом зменшує ризик виникнення травми або допомагає виздоровленню від травми шляхом підвищення ударної в'язкості або твердості кісток, або і того і іншого. Взагалі, ударна в'язкість або твердість кістки є наслідком маси або міцності кортикального шару кістки, губчастої кістки та губчатої речовини кістки. Згаданий спосіб за цим винаходом може забезпечити рівні ударної в'язкості, твердості, маси та/або міцності у межах або вище рівня нормальних суб'єктів. За переважним варіантом цей винахід забезпечує підвищені рівні відносно рівнів, наслідком яких є виникнення травми, або таких, які ведуть до стану ризику виникнення травми. Підвищення ударної в'язкості, твердості або того та іншого зменшує ризик або ймовірність перелому, порівняно до контрольних суб'єктів, які обробці не піддавались.

Певні характеристики кістки, у разі їхнього поліпшення, підвищують ударну в'язкість та/або твердість кістки. До таких характеристик належить мінеральна густина кісткової тканини (ВМО), вміст мінеральних речовин у кістковій тканині (ВМС), частота активування або швидкість остеогенезу, кількість кісткових брусів, товщина кісткових брусів, зв'язність кісткових та інших брусів, періостальний та ендокортикальний остеогенез, пористість кортикального шару кістки, площа поперечного розтину кістки та маса кістки, стійкість до навантаження та/або робота до руйнування. Поліпшення або підвищення однієї або декількох зі згаданих характеристик є переважним наслідком згаданого способу за цим винаходом.

Певні характеристики кістки, наприклад, кістково-мозковий проміжок або модуль пружності, у разі їхнього зниження, забезпечують підвищену ударну в'язкість та/або твердість кістки. Молодша (з більшою ударною в'язкістю та твердіша) кістка має кристаліти, які, як правило, є меншими за розміром, аніж кристаліти старішої кістки. Таким чином зменшення, у цілому, розміру кісткових кристалітів підвищує ударну в'язкість та твердість кістки та може зменшити кількість переломів. На додаток до цього, визрівання кристалітів кістки може надати кістці додаткових необхідних характеристик, у тому числі підвищеної ударної в'язкості та твердості, та/або зменшити кількість переломів. Зменшення однієї або декількох зі згаданих характеристик може бути переважним наслідком згаданого способу за цим винаходом.

Згаданий спосіб за цим винаходом є ефективним для підвищення ударної в'язкості та/або твердості будь- якої з декількох кісток. Наприклад, згаданий спосіб може підвищити ударну в'язкість та/або твердість кісток, у тому числі стегнової кістки, наприклад, клубової кістки, кістки вільної нижньої кінцівки, наприклад, стегнової кістки, кістки хребетного стовпу, наприклад, хребця, або кістки верхньої кінцівки, наприклад, дистального відділу кістки передпліччя або проксимального відділу плечової кістки. Це підвищення ударної в'язкості та/або твердості може спостерігатись уздовж усієї кістки або локалізуватись на певних ділянках згаданої кістки.

Наприклад, ударна в'язкість та/або твердість стегнової кістки може підвищуватись шляхом підвищення ударної в'язкості та/або твердості шийки стегнової кістки або вертелюгу стегнової кістки. Ударна в'язкість та/або твердість шийки стегнової кістки може підвищуватись шляхом підвищення ударної в'язкості та/або твердості клубового гребеню або клубової ості. Ударна в'язкість та/або твердість хребця може підвищуватись шляхом підвищення ударної в'язкості та/"або твердості ніжки, пластинки дути або тіла хребця. Згаданому впливу, переважно, піддаються хребці певних ділянок хребетного стовпа, наприклад, цервікальні, грудні, поперекові, крижові та/або куприкові хребці. Згаданому впливу за переважним варіантом піддається один або декілька хребців середньої частини груди та/або верхні поперекові хребці.

Згадане підвищення ударної в'язкості та/або твердості може спостерігатись у кістках кожного типу або, головним чином, у кістках одного типу. Типами кісток є кістки з губчастим (губчаста речовина кістки, губчаста кістка або пластинчаста кістка) та компактним (кортикальним або щільним) шарами, а також кісткова мозоля.

Згаданий спосіб за цим винаходом за переважним варіантом підвищує ударну в'язкість та/або твердість кістки завдяки своєму впливу на губчасту речовину або кортикальний шар кістки, або лише на кортикальний шар кістки. За допомогою згаданого способу може також підвищуватись ударна в'язкість та/або твердість губчастої кістки, тобто кістки, до якої прикріплюється сполучна тканина. Наприклад, вигідним є надання додаткової ударної в'язкості ділянці прикріплення зв'язки, сухожилля та/або м'язу.

За іншим аспектом цього винаходу підвищення ударної в'язкості або твердості може зменшити кількість випадків переломів. За цим аспектом підвищення ударної в'язкості або твердості може включати зменшення кількості випадків вертебральних переломів, зменшення кількості випадків тяжких переломів, зменшення кількості випадків переломів помірної тяжкості, зменшення кількості випадків невертебральних переломів, зменшення кількості випадків множинних переломів або їхніх комбінацій.

Паратиреоїдний гормон

Композиція або розчин може включати як активний інгредієнт повномірну 84-амінокислотну. форму паратиреоїдного гормону, зокрема, людську форму, ПРТН(1-84), яку було одержано рекомбінантним шляхом, синтезуванням пептидів або шляхом екстрагування з загальної води організму людини. Дивись, наприклад, патент США Ме5,208,041, який включено до цього опису як посилання. Амінокислотну послідовність ПРТН(1- 84) повідомлено Кімурою (Кітига) та іншими у Віоспет. Віорпуз. ВНе5. Сотт., 114 (2): 493.

Згадана композиція або розчин може також включати як активний інгредієнт, фрагменти або варіанти фрагментів людського РТН або РТН пацюка, свині або великої рогатої худоби, який має активність людського

РТН, як було визначено на моделі остеопорозу на оваріоектомізованих пацюках, за повідомленням Кіммеля (Кіттеї!) та інших, Епдосгіпоіоду, 1993, 32 (4): 1577.

Згадані фрагменти паратиреоїдного гормону, бажано, включають як мінімум перші 28 М-кінцевих залишків, наприклад, РТН(1-28), РТН(1-31), РТН(1-34), РТН(1-37), РТН(1-38) та РТН(1-41). Альтернативні різновиди форми варіантів РТН включають від 1 до 5 амінокислотних замін, які поліпшують стабільність та напівперіод існування РТН, наприклад, заміщення метіонінових залишків у положенням 8 та/або 18 лейцином або іншою гідрофобною амінокислотою, яка підвищує стійкість РТН проти окиснення та заміщення амінокислот на 25-27 ділянці нечутливими до трипсину амінокислотами, наприклад, гістидином або іншою амінокислотою, яка підвищує стійкість РТН проти протеази. До інших придатних форм РТН належить РТНГІР, РТНгІР(1-34),

РТНГР(1-36) та аналоги РТН або РТНІР, які активують РТНІ рецептор. Ці форми РТН охоплюються згаданим терміном "паратиреоїдний гормон", який використано у цьому описі у родовому значенні. Згадані гормони можна одержати за допомогою відомих рекомбінантних або синтетичних методів, опис яких наведено, наприклад, у патентах США МеМе4,086,196 та 5,556,940, які включено до цього опису як посилання.

Переважним гормоном є людський РТН(1-34), відомий також як терипаратид. Опис стабілізованих розчинів людського РТН(1-34), наприклад, рекомбінантного людського РТН(1-34) (ПРТН(1-34)), які можуть застосовуватись за цим способом, наведено у заявці на патент США Меб0/069,075, яку включено до цього опису як посилання. Опис кристалічних форм людського РТН(1-34), які можуть застосовуватись за цим способом, наведено у заявці на патент США Моеб60/069,875, яку включено до цього опису як посилання.

Введення паратиреоїдного гормону

Паратиреоїдний гормон за типовим варіантом може вводитись парентерально, за переважним варіантом шляхом підшкірного впорскування, за допомогою способів та у вигляді лікарських форм, добре відомих у цій галузі техніки. Опис стабілізованих лікарських форм людського РТН(1-34), які за переважним варіантом можуть застосовуватись за цим способом, наведено у заявці на патент США Моеб60/069,075, яку включено до цього опису як посилання. У згаданій заявці також наведено опис численних інших лікарських форм для зберігання та введення паратиреоїдного гормону. Стабілізований розчин паратиреоїдного гормону може включати стабілізатор, буфер, консервант тощо.

До складу згаданого стабілізатору, який включають до згаданого розчину або композиції, входить поліол, який включає сахарид, за переважним варіантом моносахарид або дисахарид, наприклад, глюкозу, трегалозу, рафінозу або цукрозу; спирт з цукру, наприклад, маніт, сорбіт або інозит, та багатоатомний спирт, наприклад, гліцерин, пропіленгліколь або їхні суміші. Переважним поліолом є маніт або пропіленгліколь. Концентрація поліолу може коливатись у межах від приблизно 195 до приблизно 2095 (мас), за переважним варіантом від приблизно 395 до 1095 (мас.) загального розчину.

Згаданим буфером, який використовують у згаданому розчині або композиції за цим винаходом, може бути будь-яка суміш кислот або солей, яка є фармацевтично прийнятною та здатною до підтримування рн згаданого водного розчину у межах від З до 7, за переважним варіантом від З до 6. Придатними буферними системами є, наприклад, джерела ацетату, тартрату або цитрату. Переважними буферними системами є джерела ацетату або тартрату, найпереважнішим є джерело ацетату. Концентрація буферу може бути у межах від приблизно 2мМ до приблизно 500мМ, за переважним варіантом від приблизно 2мМ до 100мМ.

Згаданий стабілізований розчин або композиція за цим винаходом може також включати парентерально прийнятний консервант. До таких консервантів належать, наприклад, крезоли, бензиловий спирт, фенол, бензалконійхлорид, бензтіонійхлорид, хлорбутанол, фенілетиловий спирт, метилпарабен, пропілпарабен, тимеросал, фенілмеркурнітрат та ацетат. Переважним консервантом є т-крезол або бензиловий спирт; найпереважнішим є т-крезол. Кількість консерванту, яка застосовується, може коливатись у межах від приблизно 0,195 до приблизно 2905 (мас), за переважним варіантом від приблизно 0,395 до приблизно 1,095 (мас.) загального розчину.

Таким чином, до складу згаданого стабілізованого розчину терипаратиду може входити маніт, ацетат та т-крезол з прогнозованим строком зберігання, який перевищує 15 місяців при температурі 5760.

Згадані композиції паратиреоїдного гормону можуть, у разі необхідності, надаватись у порошковій формі, яка включає не більше 295 (мас.) води, що є наслідком ліофілізації стерильного водного розчину гормону, який було одержано шляхом змішування вибраного паратиреоїдного гормону, буферу та стабілізатору за описом, який було надано перед тим. Особливо придатним буфером під час одержання ліофілізованих порошків є джерело тартрату. До особливо придатних стабілізаторів належить гліцин, цукроза, трегалоза та рафіноза.

На додаток до цього паратиреоїдний гормон може вводитись до складу лікарської форми з типовими буферами та наповнювачами, які використовуються у цій галузі для стабілізування та розчинення білків для парентерального введення. Опис визнаних у цій галузі фармацевтичних носіїв та їхніх лікарських форм наведено у роботі Мартіна (Мапіп), "Нетіпдіоп'є Рпаптасецшіїса! Зсієпсев", 15 видання, Маск Рибіїзпіпд Со.,

Еазюп (1975). Паратиреоїдний гормон може також доставлятись через легені, рот, ніс, за допомогою супозиторіїв або пероральних лікарських форм.

Паратиреоїдний гормон вводиться до складу лікарської форми для введення дози, ефективної для підвищення ударної в'язкості та/(або твердості однієї або декількох кісток суб'єкта талабо для зменшення ймовірності та/або тяжкості перелому кісток За переважним варіантом ефективна доза забезпечує поліпшення структури, маси та/або міцності кортикального шару кістки. За переважним варіантом ефективна доза зменшує кількість випадків вертебральних переломів, зменшує кількість випадків множинних вертебральних переломів, зменшує тяжкість вертебральних переломів та/"або зменшує кількість випадків невертебральних переломів. За переважним варіантом суб'єкт, який одержує паратиреоїдний гормон, одержує також ефективні дози кальцію та вітаміну 0, які можуть підвищувати ефективність згаданого гормону.

Ефективна доза паратиреоїдного гормону за типовим варіантом перевищує приблизно 5мкг/кг/день, хоча, зокрема, у людей, вона може дорівнювати від приблизно 1О0мкг/кг/день до приблизно 40мкг/кг/день або більше, у залежності від ефективності забезпечення підвищеної ударної в'язкості або твердості, зокрема, у кортикальному шарі кістки, або зниження кількості випадків переломів. Суб'єкт, який страждає на гіпопаратиреоз, може потребувати додаткових або більших доз паратиреоїдного гормону; такий суб'єкт потребує також замісної терапії зі згаданим гормоном. Дози, необхідні для замісної терапії при гіпопаратиреозі, є відомими у цій галузі. У певних випадках відповідні ефекти РТН можна спостерігати при дозах, менших за приблизно 5мкг/кг/день, або навіть менших за приблизно 1мкг/кг/день.

Згаданий гормон може вводитись регулярно (наприклад, один або декілька разів на день або тиждень), переміжно (наприклад, нерегулярно впродовж дня або тижня) або циклічно (наприклад, регулярно впродовж днів або тижнів з подальшим періодом без введення). За переважним варіантом у пацієнтів, хворих на остеопороз, РТН вводиться один раз на день впродовж 1-7 днів впродовж періоду часу, який становить від З місяців до З років. За переважним варіантом циклічне введення включає введення паратиреоїдного гормону впродовж як мінімум 2 циклів ремоделювання, та припинення введення паратиреоїдного гормону впродовж як мінімум 1 циклу ремоделювання. Інший переважний режим циклічного введення включає введення паратиреоїдного гормону впродовж як мінімум від приблизно 12 до приблизно 24 місяців, та припинення введення паратиреоїдного гормону впродовж як мінімум 6 місяців. За типовим варіантом благотворний вплив введення паратиреоїдного гормону зберігається після періоду введення. Благотворний вплив декількох місяців введення може зберігатись впродовж року, двох років або більше, без додаткового введення.

Використання лікарських форм паратиреоїдного гормону Цим винаходом передбачається також набір, до складу якого входять згадані фармацевтичні композиції та який призначено для використання за способами за цим винаходом. Згаданий набір може включати ампулу, яка містить лікарську форму за цим винаходом, та відповідні носії, висушені або у рідкій формі. Згаданий набір додатково включає інструкції у вигляді етикетки на згаданій ампулі та/або у формі вкладишу, який розміщують у коробці, до якої пакують згадану ампулу, для використання та введення згаданих сполук. Згадані інструкції можуть також друкуватись на коробці, до якої пакують згадану ампулу. Згадані інструкції містять інформацію, наприклад, інформацію відносно достатньої дози та шляху введення, для того, щоб будь-який працівник в цій галузі міг ввести згаданий лікарський засіб.

Передбачається, що згаданим працівником у галузі є врач, медсестра, або інший фахівець, який може ввести згаданий лікарський засіб.

Цей винахід має також відношення до фармацевтичної композиції, яка включає лікарську форму одного або декількох паратиреоїдних гормонів, наприклад, гормону РТН(1-84) або людського РТН(1-34), та яка є придатною для парентерального введення. За цим винаходом лікарська форма одного або декількох паратиреоїдних гормонів, наприклад, людського РТН(1-84) або людського РТН(1-34), може використовуватись для одержання композиції або медикаменту, придатного для введення парентеральним шляхом. Цей винахід має також відношення до способів одержання композицій, які включають лікарську форму одного або декількох паратиреоїдних гормонів, наприклад, людського РТН(1-84) або людського РТН(1-34), у формі, яка є придатною для парентерального введення. Наприклад, рідка або тверда лікарська форма може бути одержана декількома шляхами за допомогою традиційних методів. Рідку лікарську форму можна одержати шляхом розчинення одного або декількох паратиреоїдних гомонів, наприклад, людського РТН(1-84) або людського РТН(1-34) у відповідному розчиннику, наприклад, воді, при відповідному рівні рН, з включенням буферів або інших наповнювачів, наприклад, для одержання одного зі згаданих стабілізованих розчинів, опис яких було наведено перед тим.

Приклади, які наведено далі, ілюструють цей винахід і не призначені для обмеження об'єму згаданого винаходу.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1 - Підвищення міцності та густини кісток у разі введення гПРТТН(1-34) кроликам

Експериментальні процедури

Інтактних білих новозеландських кроликів-самиць (компанія НАР Іпс., Оепмег, штат Пенсільванія), одну з найменших тварин, яка утворює остеони шляхом інтракортикального ремоделювання, віком приблизно 9 місяців та масою 3,25-3,75кг, розподілили за середньогруповою масою тіла на З групи по 6 тварин у кожній.

Дві експериментальні групи одержували біосинтетичний РТН(1-34) у дозах 10мкг/мл/кг/день або 4Омкг/мл/кг/день. Контрольна трупа, одержували 1,Омл/кг/день підкисленого 0,9М фізіологічного розчину, до складу якого входила 295 термоінактивована кроляча сироватка. РТН(1-34), або носій вводили один раз на день шляхом підшкірного впорскування 5 днів на тиждень впродовж 140 днів. Кролики одержували лабораторний раціон, який вміщував 0,595 Са та 0,419 Р, та воду ай Прішт.

Вибір доз було засновано на ряді попередніх досліджень, результати яких показали, що (1) після одноразового впорскування РТН(1-34) у дозі 100мкг/кг рівень кальцію у сироватці підвищувався та до вихідного рівня через 24 години не повернувся, у той час як після одноразової дози 50мкг/кг РТН(1-34) рівень кальцію у сироватці повернувся до вихідного рівня впродовж 24 годин, (2) результатом повторних впорскувань

РТН(1-34) у дозі 20мкг/кг було тимчасове підвищення рівня кальцію у сироватці з поверненням до вихідних значень у межах 6-24 годин, та (3) у разі введення РТН(1-34) у дозі «5мкг/кг, гісттоморфометрія поверхні кісток не змінювалась.

Набір подвійних алізаринових міток (компанія бідта, Сент-Луїс) вводили внутрішньом'язово у дозі 20мг/кг на 55 день та 63 день, у той час як набір подвійних кальцеїнових міток (компанія бідта, Сент-Луїс) вводили підшкірно у дозі 5мг/кг на 15 день та 7 день, перед забиттям. Кроликів анестезували за допомогою СО»5: у довільній послідовності через приблизно 3-6 годин після останнього впорскування з метою відбору крові шляхом серцевого проколу, після чого забивали пентобарбіталом натрію (100мг/кг), який вводили внутрішньоочеревинно. Після цього видаляли праву плечову кістку, обидві стегнові кістки, поперекові хребці (І. 3-І 5) та праву великогомілкову кістку.

Біохімія крові

Шляхом комп'ютеризованого багатоканального аналізу сироватки крові визначали рівні кальцію, фосфату, лужної фосфатази, креатиніну та азоту сечовини.

Гістоморфометрія

Гістоморфометричні виміри робили на кортикальному шарі діафізу великогомілкової кістки та на губчастій речовині поперекового хребця І 3. Після забиття згадані кістки видаляли з кожної тварини та фіксували у 1095 нейтральному забуференому розчині формаліну впродовж 24 годин. Згадані тканини дегідратували за допомогою ряду градуйованих спиртів (70-100905, 2 заміни на градус, кожна впродовж 4 годин під вакуумом).

Після цього згадані зразки переносили до ксилолу та просочували за 24-годинною схемою просочування метилметакрилатом під вакуумом під тиском 20фунтів/дюйм2 (1,40бкг/см?") впродовж 2годин/етап у автоматичному процесорі Зпапдоп Нурегсепіег (компанія Зпапдоп Іірепам, Рінериїщни, штат Пенсільванія).

Згадані зразки заливали 295 ООК-пластом з 0,295 ініціатором (компанія Оєсіамаге Оіатопа Кпіме5, УУитіпдіюп, штат Делавер). З поперечних розтинів великогомілкової кістки за допомогою станку для різання алмазною проволокою (компанія ЮОєЇІаулаге Юіатопа Кпімев5, Іпс., штат Делавер) робили зрізи товщиною 8О0мкм, які забарвлювали за допомогою трихрому Голднера. Незабарвлені поперечні розтини товщиною приблизно 8ЗОмкм піддавали динамічній гістоморфометрії з фторохромовими мітками. З поперечних розтинів поперекового хребця 3 за допомогою мікротому Райхерта-Юнга (Неїспеп-Уипд) 2050 (компанія Мадеє

Зсіепійіс Іпс., Оехіег, штат Мічиган) робили зрізи товщиною 5мкм, які забарвлювали за допомогою тетрахрому

Макніла або залишали незабарвленими для проведення динамічної гістоморфометрії.

Гістоморфометричні дослідження здійснювали з 150х збільшенням за допомогою флуоресцентного мікроскопу Мікоп (Оріїрпої, Мікоп, Токіо, Японія) та напівавтоматичного цифрового перетворювача (Віоднапі

ІМ, ВМ Віотеїгісв, МазпміПєЄ, штат Теннессі). Остеогенез та резорбцію у періостальній, ендокортикальній та інтракортикальній оболонках визначали на повній площі поперечних розтинів середньої частини діафізу великогомілкової кістки. Визначення на губчастій речовині кістки здійснювали на площі бмм? у центральній частиш поперекового хребця на відстані О0,5мм від краю довколишньої кортикальної оболонки. Номенклатура відповідала вимогам Комітету по гістоморфометричній номенклатурі Американського товариства досліджень кісток та мінеральних речовин (АБВМА Соттійеє оп пПізіотогрпотеїйіс потепсіайштгеє) (Парфітт А.М. (Рапті

А.М.), Дрезнер М.К. (Оіїє2гпег М.К.), Флоріо Ф.Г. (Ріогєих Е.Н.), Каніс Дж. А. (Капіз 9.А.), Маллачі Г. (МаПисне Н.),

Муньє П.Дж. (Мешппієг Р.).), Отт СМ. (ОК 5.М.), Рекер Р.Р. (ВескКег В.В.) "Вопе пізіоторпотегу: віапдагаїгайоп ої потепсіайшге, зутрої5, апа ипіїв. Вероп ої Ше АЗВМА Нівіотогрпотеїйу Мотепсіайте Соттіцее", 9.Вопе

Міпег. Нез., 2: 595-610). Динамічні параметри вимірювали на основі кальцеїнової мітки.

Визначення кісткової маси

Поперечні розтини діафізу великогомілкової кістки та четвертого поперекового хребцю у 5095 суміші етанолу/фізіологічного розчину піддавали кількісному комп'ютерному томографуванню (ОСТ або рост) за допомогою томографу рОСтТ 960А та аналізували за допомогою програми Оіспіє, версія 5.1 (компанія

Могпіапа/сігагес, РІ. Аїкіпзоп, штат Вісконсін). Вимірювали усі параметри тканин, у тому числі волюметричну мінеральну густину кісткової тканини (УВМО, мг/см3), площу поперечного розтину (Х-площа, мм?) та вміст мінеральних речовин кісткової тканини (ВМС, мг) з використанням розмірів об'ємного елементу зображення 148х148х1200мкм. Об'єм розраховується шляхом перемноження Х-площі на товщину зрізу 1,2мм. Повну площу шийки вирізаної стегнової кістки у ванні з 5095 сумішшю етанолу/фізіологічного розчину піддавали периферійній подвійній енергетичній абсорбціометри (рОЕХА, компанія Могпапа/5ігагес). Об'ємну мінеральну густину кісткової тканини (авмо, г/см"), площу проекції (см?) та вміст мінеральних речовин кісткової тернини (ВМС, г) вимірювали, зокрема, з застосуванням кроку сканування 0,5х1,0мм та порогу 0,04.

Біомеханічні випробування

Механічні властивості кісток вимірювали на діафізі правої стегнової кістки та на тілі поперекового хребця

І 5. Кістки вирізали, очищали від сполучної тканини, обертали марлею, просоченою ізотонічним фізіологічним розчином та зберігали у замороженому стані при температурі -20"С до проведення випробувань. Перед проведенням випробувань зразки відтаювали впродовж 1-2 годин при кімнатній температурі. Усі зразки випробували до руйнування у циркуляційній водяній ванні при температурі 37"С за допомогою сервогідравлічної установки для випробувань МТ5 810 (компанія МТ5 Согр., Міппеароїї5, штат Міннесота).

Криві навантаження-деформації реєстрували за допомогою вимірювально-графічної системи НР 7090А (компанія Нем/ей Раскага, Сата5, штат Вашингтон). Граничну силу (максимальна сила, яку витримують зразки), твердість (нахил лінійної частини кривої навантаження-деформації) та роботу до руйнування (площа під кривою навантаження-деформація перед руйнуванням) вимірювали за допомогою цифрового перетворювача (компанія дапає! 5сієпійіс, Сопе Мадега, штат Каліфорнія). Згадані параметри є структурними властивостями, які залежать від внутрішніх властивостей та геометрії матеріалу. Тарнер К.Г. (Тигпег С.Н.) та

Барр Д.Б. (Виїт О.В.), 1993, "Вазіс біотеспапіса! теазигетепів ої ропе: а ішогіа!", Вопе, 14: 595-608. Згадані дані було нормалізовано для визначення внутрішніх властивостей матеріалу, наприклад, межі міцності (максимальне зусилля, яке витримують зразки), модулю пружності (внутрішня твердість матеріалу) та ударної в'язкості (стійкість до руйнування на одиницю об'єму, які не залежать від розміру та форми. Дивись те ж саме літературне джерело, яке було наведено перед тим.

Міцність стегнової кістки вимірювали на діафізі шляхом згинання у трьох точках. Стегнову кістку розміщували у затискачі таким чином, що її передню сторону було спрямовано до навантажувача.

Навантаження прикладували у середній точці між двома опорами, які знаходились на відстані 54мм одна від другої. Динамометричний датчик переміщували зі швидкістю 1мм/сек до руйнування. Для нормалізації даних, які було одержано з кривої навантаження-деформація, межу міцності при згинанні вираховували з граничної сили за допомогою наведеної далі формули: си г/8І (1) де ої - зусилля руйнування при згинанні, Би - гранична сила. Ї - відстань між опорами, г - радіус у передньо-задньому напрямку, та І - момент інерції. Дивись те ж саме літературне джерело, яке було наведено перед тим. Значення моменту інерції вираховували, приймаючи поперечні розтини стегнової кістки еліптичними.

Середню товщину кортикального шару було вирахувано за визначеннями товщини кожного з чотирьох квадрантів поперечного розтину стегнової кістки, які було одержано за допомогою цифрових штангенциркулів з точністю 0,01:20,005мм (компанія Міїшіоуо, Японія).

Модуль пружності стегнової кістки (Ек) було вирахувано за допомогою рівняння, яке наведено далі:

Ес(твердість) І 3/481) (2)

Ударну в'язкість стегнової кістки (ударна в'язкість) було також вирахувано за допомогою рівняння, яке наведено далі:

Ударна в'язкість-З"(робота до руйнування)" /. І (3)

Для механічного випробування п'ятого поперекового хребця (І 5) обидві кірцеві пластини тіла хребця були розрізані паралельно за допомогою ниіїзькошвидкісного станку для різання Випіег Ізотеї (компанія ВОМІЄг ТО,

Емапвіоп, штат Іллінойс). Після резекції задніх виступів визначали механічну міцність 5 на стискання.

Стискувальне навантаження прикладували з регулюванням ходу при швидкості повзуна 1Імм/сек через обертальну пластину для коректування непаралельності лицьових поверхонь тіла хребця. Для нормалізування даних, які було одержано з кривої навантаження-деформація та для визначення внутрішніх властивостей матеріалу, які не залежать від геометрії тіла, межу міцності вираховували, як граничну силу, поділену на повну площу поперечного розтину.

Площу поперечного розтину (С5А) вираховували наведеним далі чином:

С5А-табр/4 (4)

де а та Б - ширина у передньо-задньому та середньо-боковому напрямках, відповідно.

Модуль пружності хребця (Еу) вираховували наведеним далі чином:

Ек(міцністьу 0ДСЗА/п) (5) де Пп - черепно-хвостова висота тіла хребця.

Ударну в'язкість хребця (Ударна в'язкістьу) вираховували наведеним далі чином:

Ударна в'язкість.-(робота до (6) руйнування) С5А"И)

Акустична мікроскопія

З середньої частини діафізу правої плечової кістки за допомогою станку для різання алмазною проволокою вирізали поперечні зрізи товщиною 500мкм. Точну товщину кожного зразку вимірювали за допомогою мікрометру (компанія Мішоуо, Японія) з роздільною здатністю 1мкм. Швидкість звуку вимірювали за допомогою сканувального акустичного мікроскопу (ШНЗ, ОіІутрив, Японія) за методом, опис якого було наведено раніше у роботі Хасегава К. (Назедама К.), Тарнера К.Г. (Тигпег С.Н.), Рекера Р.Р. (НКескКег В.В.), Ву

Е. (Ми Е.), Барра Д.Б. (Вит 0.8.), "ЕІазійс ргорепіє5з ої овіворогоїїс ропе теавзигей Бу зсаппіпд асоизіїс тістовсору", Вопе, 16: 85-90. За згаданою методикою можна докладно вимірювати внутрішні механічні властивості у вибраній фокальній точці. Акустичні хвилі у імпульсно-еховому режимі одержували за допомогою 50ОМГуц перетворювача (М-390, Рапатеїйісх, УМаййат, штат Массачусетс). 50ОМГцЦ лінза забезпечувала одержання акустичного променю діаметром приблизно бОомкм. Зразки закріплювали на дні камери, яку було заповнено водою з постійною температурою (22"С). Час запізнення між звуковими хвилями, які відбивались від верхньої частини згаданих зразків та звуковими хвилями, які відбивались від нижньої частини згаданих зразків вимірювали за допомогою цифрового осцилоскопу (ТО5 620, ТеКгопіх, Веамепоп, штат Орегон). Час запізнення вимірювали у п'яти різних точках. Взаємна відстань між точками на передньому корковому шарі перевищувала З0Омкм. Швидкість звуку вираховували як подвійну товщину зразків, розділену на середній час запізнення. Масу у вологому стані (М/му) та масу у зануреному стані (Муз) у 10095 етиловому спирті вимірювали за допомогою вагів (Ад100, компанія Мешег Іпвігитепі Согр., Неідпівіомп, штат Нью-

Джерсі). Густину у вологому стані (р) вираховували за законом Архімеду: р-МИ МУ мМ-М/5), РЕТОН (7) де РЕТОН - густина спирту (0,789г/см3).

Приймаючи шлях звукової хвилі у кістці за однорідний, коефіцієнт пружності (С), який представляє внутрішню твердість зразків, вираховували наведеним далі чином:

Сер'є (8) де р - густина у вологому стані та м - швидкість звуку.

Статистичний аналіз

Для перевірки однорідності дисперсії вдавались до аналізу Барлетту. У разі, коди дисперсія була однорідною, для кінцевого порівняння застосовували однофакторний дисперсійний аналіз з частковими випробуваннями за Фішером з середнім квадратичним відхиленням. У разі, коли дисперсія була неоднорідною, вдавались до непараметричного аналізу Краскала-Уелліса (КипизКа!І-Маїїв) з кінцевим аналізом за допомогою ОМ-тестів Мена-Уїтні (Мапп-М/піпеу). Статистична значущість приписувалась при ре«0,05.

Результати представлено як середнєжсередня квадратична помилка середнього.

Результати

Маса та біохімія тіла

Кролики, які піддавались обробці носієм РТН(1-34) у дозі 1Омг/кг/день, демонстрували незначне підвищення маси тіла впродовж 140 днів. Кролики, які одержували РТН(1-34) у дозі 4Омкг/кг/день, демонстрували незначне зменшення (51г) маси тіла, що представляло 1,4--1,690о втрати маси тіла впродовж експерименту (Таблиця 1). Показники сироватки знаходились у межах нормальної фізіологічної реакції для кроликів, хоча спостерігалось незначне підвищення рівня кальцію та азоту сечовини у сироватці. У разі більшої дози РТН(1-34) рівень лужної фосфатази у сироватці зростав у 2 рази (Таблиця 2).

Таблиця 1

Вплив РТН(1-34) на масу тіла

РТН(1-34) РТН(1-34) 00000001 жить | зомекдв | зомдодсьь

Початкова маса тіла (кг) 3,4350,08 3,4250,08 3,4250,08

Кінцева маса тіла (кг) 3,70530,05 3,5120,05 3,372010

Приріст маси тіла (кг) 0,26:0,09 0,0920,05 -0,05:20,05"

Дані представлено як середнєжсередня квадратична помилка середнього для б кроликів на групу. хр«0,05 порівняно до контролю.

Таблиця 2

Вплив РТН(1-34) на біохімію сироватки

РТН(1-34) РТН(1-34) 0000 мою | ожохрдем, | зордеьь

Кальцій (мг/дл) 12,150,3 12,6520,2 13,5:20,37

Фосфат (мг/дл) 4,7-0,2 4,702 5,520,3

Лужна фосфатаза (М.Од./л) 241541 4А1,0ж8 1 4985717

Креатинін (мг/дл) 1,9201 1,6:2501 1,8:20,1

Азот сечовини (мг/дл 18,3520,3 18,1-50,8 23,921,9

Гістоморфометрія

У групах, які піддавались обробці РТН(1-34), остеогенез підвибдився на періостальній (Р5.М5/8В5) та ендокортикальній (Ес.М5/В5) поверхнях діафізу стефової кістки (Таблиця 3). Ре.М5/В5 у групі з більш високою дозою був значно вищим, аніж у 2 інших групах (р«е0,001), та Ес.М5/В5 у групі з більш вжхзкою дозою був значно вищим, аніж у контрольній групі (р«е0,05). Відповідно до підвищення рівня лужної фосфатази у сироватці, швидкість остеогенезу на кожній поверхні (Р5.ВЕВ/В5 та Ес.ВЕВ/В5) була значно більшою у групі з більш високою дозою, аніж у 2 інших групах (р«0,05). Швидкість аппозиції мінеральних речовин (МАВ) не змінювалась ні на періостальній, ні на ендокортикальній оболонках.

Інтракортикально, кількість ділянок резорбції (А5.М/Ст.Аг) у кроликів, які одержували РТН(1-34) у дозі 4Омкг/кг/ день, була значно більшою (у 7 разів), акрі у 2 інших групах (р«е0,05) (Таблиця 4). Кількість мічених остеонів (ШОп.М/СЯ.Аг) у кроликів, які одержували РТН(1-34) у дозі 40мкг/кг/день, також була значно більшою, порівняно до 2 інших груп (р«е0,01 порівняно до контрольної групи, р«е0,05 порівняно до групи, яка одержувала дозу 10мкг/кг/день). МАВ була значно більшою у обох експериментальних групах, аніж у контрольній групі (ре0,01), однак, суттєвої різниці між групами, які піддавались обробці РТН, не спостерігалось. Швидкість остеогенезу (ВЕВ/ВУ) та частота активації (Ас.Е) зростали (р«е0,05 та ре0,01, відповідно) при обох дозах.

Таблиця З

Вплив РТН(1-34) на ремоделювання періостальної та ендокортикальної ділянки діафізу великогомілкової кістки

РТР(1-34) РТН(1-34)

Поверхня ендокортикальних остеоїдів Ес.О5/В5 (95) 8,856,0 13,7510,5 20,255,8

Товщина ендокортикальних остеоїдів Ес.О. ТИ (мкм) 7,4124 3,752,3 8,150,9

Швидкість аппозиції мінеральних речовин на періостальній поверхні Рб5.МАВ (мкм/день) | 0,33:0,17 0,3820,08 0,6620,14

Швидкість аппозиції мінеральних речовин на ендокортикальній поверхні Ес.МАВ (мкм/день) | 1,3320,22 0,7920,16 1,3250,15

Поверхня мінералізації на періостальній ділянці Ра.М5/В5 (9е) 3,821,9 8,232 22352,"

Поверхня мінералізації на ендокортикальній ділянці Ес.М5/В5 (95) 26,46 6 32,6528,2 5775104

Остеогенез на періостальній ділянці Рз.ВЕВ/В5 (мкм3/мкм3/рік) 0,02520,02 0,0350,01 0,16:20,057

Остеогенез на ендокортикальній ділянці Ес.ВЕН/В5 (мкм3/мкм2/рію) 0,40530,10 0,31-50,10 0,72530,127

Дані представлено як середнєжсередня квадратична помилка середнього для б кроликів на групу. хр«0,05 порівняно до контролю. Р«е0,05 порівняно до групи, яка одержувала РТН(1-34) у дозі 1Омкг/кг/день.

Таблиця 4

Вплив РТН(1-34) на інтракортикальне ремоделювання діафізу великогомілкової кістки

РТН(1-34) РТН(1-34)

Кількість порожнин резорбції В5.М/О.Аг (кількість/мм?) | 0,01420,013| 0,01320,004 | 0,09720,036"

Кількість мічених остеонів .Оп.МЯ.Аг (кількість/мм?) 0,011-0,006| 0,027-0,006 | 0,215:0,0947

Товщина остеоїдів О.Т (мкм) 4,9250,59 5,4250,30 5,1620,27

Швидкість аппозиції мінеральних речовин МАВ (мкм/день) 1,1920,20 1,5620,13" 1,6050,127

Швидкість остеогенезу ВЕВ/ВМ (9в/рію 0,5:0,3 8,552,9" 21,453,8"

Частота активації Ас.Е (кількість/мм/ рік) 1,8-1,0 15,155,0" 43,8510,57

Площа кістки В.Аг (мм?) 29,1-1,3 33,351,9 37,82,"

Площа кісткового мозку Ма.Аг (мм) 12,720,7 11,951,0 10,7-1,0

Площа кортикального шару СТЕАг (мм) 16,4-0,9 21312 27,152,0"

Площа кортикального шару у 95 зоСИ.Аг (90 56,451,5 64 2ж1,6" 716-157

Незважаючи на те, що площа кістки (В.Аг) зростала при кожній дозі, значна різниця спостерігалась лише між групою з більшою дозою та контрольною групою (ре0,01). Площа кісткового мозку (Ма.Аї) зменшувалась після обробки, однак значної різниці поміж трьома групами не спостерігалось. Однак площа кортикального шару (СІ.Аг) у групі з більшою дозою була значно більшою ніж у 2 інших групах (р«е0,0001 порівняно до контрольної групи, ре0,05 порівняно до групи з нижчою дозою). СІ.Аг у групі з нижчою дозою також була значно вищою ніж у контрольної групи (р«е0,05). Подібні ж результати спостерігали і відносно 95Сї.Аг.

Пористість кортикального шару (Сі.Ро) у кроликів, які одержували РТН(1-34) у дозі 10мкг/кг/день, удвічі перевищувала відповідний показник для контрольної групи (р«е0,05), у той час як Сі.Ро у кроликів, які одержували РТН(1-34) у дозі 40мкг/кг/ день, була у 6 разів вищою ніж у контрольній групі (р«0,01). Однак пористість знаходиться у межах ендокортикального компартменту і, завдяки знаходженню на цій ділянці, навряд чи додає свій внесок до біомеханічної міцності, оскільки РТН також підвищує площу кортикального шару кістки, що відповідає підвищенню моменту інерції поперечного розтину.

Більшість параметрів остеогенезу у губчастій речовині кістки (05/85, ОБ5/В5, ОМ/ТМ та М5/В5) зростала у разі обробки за допомогою РТН(1-34) (Таблиця 5). Згадані параметри у кроликів, які одержували РТН(1-34) у дозі 40мкг/кг/день, були значно більшими ніж у 2 інших групах (р«е0,01 порівняно до контрольної крупи та групи, яка одержувало 10мкг/кг/день за всіма параметрами). Швидкість остеогенезу (ВЕВ/В5) також значно зростала у кроликів, які одержували РТН(1-34) у дозі 40мкг/кг/день, порівняно до 2 інших груп (р«е0,0001 порівняно до обох груп, контрольної та групи, яка одержувала 10мкг/кг/день). Незважаючи на те, що резорбція (ЕБ/В5 та

Ос.5/85) зростала у обох групах, які одержували РТН(1-34), лише еродована поверхня (Е5/В5) у групі з більшою дозою була значно вищою ніж у контрольній групі (ре0,001). Різниці за товщиною остеоїдів (О.ТИ) між трьома групами не спостерігалось. Незважаючи на ознаки прискореного кісткового метаболізму, відносний об'єм щеток (ВМ/ТМ) після обробки за допомогою РТР(1-34) не змінювався. Тунельна резорбція та перитрабекулярний фіброз у жодній групі не спостерігались.

Таблиця 5

Вплив РТН(1-34) на ремоделювання губчастої речовини третього поперекового хребця

РТН(1-34) ПРТН(1-34)

Об'єм кістки ВУЛ (95) 27,5:1,4 30,5:53,4 27,953,2

Товщина кісткового брусу ТЬ.ТИ (мкм) 124 857,3 147,4-12,7 126,4:213,7

Еродована поверхня Е5/В5 (95) 05:03 1,420,3 2,650,77

Поверхня остеокластів Ос.5/85 (Ов) 04-02 0,950,3 1,320,3

Поверхня остеоїдів О5/В5 (Ов) 5,231,3 7,212 27,73,8"

Поверхня остеобластів Ор.5/85 (95) 1,420,6 1,320,6 15,355,67

Товщина остеоїдів О.Т (мкм) 5,250,5 5,350,5 4,4302

Об'єм остеоїдів ОМЛУ (95) 0,1020,02 0,13520,03 0,46520,077

Швидкість аппозиції МАВ (мкм/день) 1,5330,2 1,5530,1 1,701 мінеральних речовин

Поверхня мінералізації М5/В5 (9) 44514 7,411,9 24,231,57

Швидкість остеогенезу ВЕВ/В5 (мкм3/мкме/рію) 19,755,3 38,5:28,9 153,0515,67

Дані представлено як середнєжсередня квадратична помилка середнього для б кроликів на групу. хр«0,05 порівняно до контролю. Р«е0,05 порівняно до групи, яка одержувала РТНІ(1-34) у дозі 1Омкг/кг/день.

Визначення маси кісток

Показники УВМО та ВМС діафізу стегнової кістки, які оцінювались за допомогою рост у групі, яка одержувала 40мкг/кг/день, були значно вищими ніж у 2 інших групах (р«е0,001 для УВМО та р«0,0001 для ВМС порівняно до контрольної групи, ре0,05 для хВМО та р«е0,01 для ВМС порівняно з групою, яка одержувала нижчу дозу) (Фіг1А). Показники «ВМО та ВМС у групі, яка одержувала 10мкг/кг/день, також були значно вищими ніж у контрольній групі (р«0,05 як для хВМО, так і для ВМС). Незважаючи на те, що площа діафізу стегнової кістки також зростала дозозалежним чином, статистично значуще зростання спостерігалось лише у групі, яка одержувала дозу 40мкг/кг/день (р«е0,05).

Показники авмоО та ВМС проксимального відділу стегнової кістки, за даними подвійної рентгенівської абсорбціометри (ОХА або рохХА) зростали дозозалежним чином. Статистично значущі різниці авмо та ВМС спостерігались між контрольною групою та групою, яка одержувала дозу 1Омкг/кг/день (р«е0,05), а також між контрольною групою та групою, яка одержувала дозу 4О0мкг/кг/день (р«е0,001) (Фіг.18). Статистично значущих різниць за площею кістки серед трьох груп не спостерігалось.

Взагалі, Фігура 1 показує, що ВМО (мінеральна густина кісткової тканини) та ВМС (вміст мінеральних речовин кісткової тканини) діафізу стегнової кістки (кортикальний шар кістки) (А) та проксимального відділу стегнової кістки (губчаста речовина кістки-кортикальний шар кістки) (В) були значно більшими у тварин, які піддавались обробці РТН, аніж у контрольних тварин при обох дозах. Площа кортикального шару діафізу стегнової кістки у кроликів, які одержували вищу дозу, була значно більшою ніж у контрольних тварин.

Статистично значущих різниць за площею проксимального відділу стегнової кістки між групами виявлено не було. Дані представлено як середнєжсередня квадратична помилка середнього. "Р«е0,05 порівняно до контролю. Р«е0,05 порівняно до групи, яка одержувала РТН у дозі 1О0мкг/кг/день.

Статистично значущих різниць за «ВМО, ВМС або площею поперекового хребця (І -4), які визначались за допомогою рост, серед трьох груп виявлено не було.

Біомеханічні випробування

Структурні властивості діафізу стегнової кістки, наприклад, гранична сила, міцність та робота до руйнування, зростали дозозалежним чином (Фіг.2). Фігура 2 показує вплив РТН на механічну міцність та момент інерції поперечного розчину (СЗМІ) кортикального шару діафізу стегнової кістки. Структурні механічні властивості (незаштриховані стовпчики) та СЗМІ значно зростали у групі, яка одержувала більш високу дозу, у той час як міцність також значно зростала у групі, яка одержувала меншу дозу. З-посеред внутрішніх властивостей матеріалу (заштриховані стовпчики) лише модуль пружності значно зростав у групі, яка одержувала меншу дозу, у разі порівняння з контрольними тваринами. Модуль пружності у групі, яка одержувала більшу дозу, значно знижувався у порівнянні з групою, яка одержувала меншу дозу. На Фігурі 2: дані представлено як середнєжсередня квадратична помилка середнього. " означає Р«е0,05 порівняно до контролю; та ! означає Р«0,05 порівняно до групи, яка одержувала дозу 1Омкг/кг/день.

У цьому дослідженні та згідно до результатів, які показано на фігурі 2, усі параметри були значно вищими у кроликів, які одержували РТН(1-34) у дозі 40мкг/кг/день, аніж у контрольній групі (ре0,01 для граничної сили та роботи до руйнування, р«е0,05 для міцності). Міцність у групі, яка одержувала меншу дозу, також була значно вищою, аніж у контрольній групі (р«е0,05). З-посеред внутрішніх властивостей матеріалу, модуль пружності був значно меншим у кроликів, які одержували 4Омкг/кг/день, аніж у тварин, які одержували 10мкг/кг/день (р«е0,01).

Щодо тіла поперекових хребців, статистично значущих різниць механічних властивостей серед трьох груп виявлено не було.

Акустична мікроскопія

Статистично значущих різниць у швидкості звуку або коефіцієнті пружності серед трьох згаданих груп виявлено не було.

Обговорення

Скелетна реакція кортикального шару кісток на біосинтетичний ПРТН(1-34) залучала як безпосередню регуляцію властивостей матеріалу, так і компенсаторну регуляцію біомеханічних властивостей трубчастих кісток інтактних статевозрілих кролиць. РТН(1-34) підвищував метаболізм кісток та пористість кортикального шару, а у дозі 40мкг/кг зменшував модуль пружності кортикального шару кістки. Однак знижений модуль пружності було більш ніж компенсовано підвищенням аппозиції на періостальній та ендокортикальній поверхнях, наслідком чого було значне поліпшення структурної міцності, твердості та роботи до руйнування кортикального шару кісток у кроликів.

Під час цього дослідження з використанням інтактних кроликів, об'єм губчастої речовини поперекового хребця не змінився після обробки за допомогою РТН(1-34), незважаючи на ознаки підвищеного метаболізму кісток. Попереднє використання як моделі остеопенії, присутність інтакортикального ремоделювання та короткий період ремоделювання, разом зі швидким ростом кроликів та раннім скелетним визріванням (на 6-9 місяць), утворили основу для вибору кроликів як моделі для визначення впливу переміжного введення РТН(1- 34).

У кроликів може спостерігатись коливання рівнів кальцію у сироватці у широких межах (10-1бмг/дл), однак згадані рівні не знаходяться під безпосереднім впливом кількості кальцію у раціоні, що надає ще одну перевагу згаданій моделі. Незважаючи на те, що у кроликів, які одержували РТН(1-34) у дозі 40мкг/кг, були зареєстровані тимчасові значні підвищення (приблизно 1мг/мл), фактичні значення завжди знаходились у відомих фізіологічних межах.

Під час проведення згаданого дослідження унаслідок 140-денного введення біосинтетичного ПРТНІ(1-34) спостерігалось підвищення як інтракортикального остеогенезу, так і остеогенезу на періостальній та ендокортикальній поверхнях. У групі, яка одержувала меншу дозу, спостерігався восьмиразовий зріст інтракортикального Ас.Е, у той час як відповідний показник у групі, яка одержувала більшу дозу, зріс у 20 разів.

Наслідком цього було дворазове підвищення пористості кортикального шару великогомілкової кістки у групі, яка одержувала меншу дозу, та шестиразове підвищення у групі, яка одержувала більшу дозу. Дані акустичного мікроскопування показують, що пружні властивості самого кісткового матеріалу плечової кістки згаданому впливу не піддавались. Це свідчить про те, що якість внутрішнього кортикального шару кістки була нормальною. Таким чином, незначне зменшення модулю пружності, властивості матеріалу, яка включає проміжки у корковому шарі, повинно пояснюватись підвищеною пористістю.

Підвищена кортикальна пористість була, однак, більш ніж компенсована значним підвищенням М5/В5 та

ВЕВ/В5 як на періостальній, так і на ендокортикальній поверхнях діафізу великогомілкової кістки у групі, яка одержувала більшу дозу, наслідком чого виявилось значне збільшення площі кістки. Як і у випадку діафізу стегнової кістки, це підвищить момент інерції поперечного розтину, який є пропорційним жорсткості кістки до вигинання (Фіг.2). Наслідками згаданих змін форми та властивостей матеріалу було підвищення механічної міцності та твердості діафізу стегнової кістки порівняно до контролів, що компенсувало потенційно шкідливі механічні ефекти підвищеної кортикальної пористості.

На завершення, підвищення кісткового метаболізму та кортикальної пористості після обробки за допомогою РТН(1-34) супроводжувалось одночасним збільшенням кістки на періостальній та ендокортикальній поверхнях. Наслідком комбінування згаданих явищ було підвищення ударної в'язкості, межі міцності, твердості та роботи до руйнування стегнової кістки.

Приклад 2 - Підвищення міцності та густини кісток у разі введення "ПРТН(1-34) мавпам

Експериментальні процедури

На живому етапі цього дослідження було використано диких дорослих (з закритим тім'ячком) приматів

Масаса газсісціагіз (макак-крабоїдів) масою 2,7720,03Зкг (середнежсередня квадратична помилка середнього

ІЗЕМІ). Мавп витримували на карантині впродовж 3 місяців, після чого тварин почали годувати раціоном, який включав 0,390 кальцію, 0,395 фосфату та 250 міжнародних одиниць вітаміну 03/100г з даванням фторованої води (Тррт (частин на мільйон) фтору) ай Прішт. Вміст кальцію відповідав 1734мг кальцію/2000 калорій. Після 1 місяця на згаданій дієті тварин було розподілено на групи 21 або 22 (група, тварини у складі якої піддавались симульованій операції, та група, тварини у складі якої піддавались оваріоектомії). Підшкірні впорскування носію (контрольні тварини для групи, яка піддавалась симульованій операції, та групи, тварини у складі якої піддавались оваріоектомії) або пиРТН(1-34) у дозі мкг/кг (РТНІ) або 5мкг/кг (РТН5) було розпочато через 24 години після оваріоектомії. Тварин обробляли впродовж 18 місяців (РТНІ та РТН5) або впродовж 12 місяців з подальшим припиненням обробки (РТНІ-ЖМ та РТН5Б-М/).

Згадані експериментальні групи було поділено, як показано у Таблиці 6.

Таблиця 6

Експериментальні групи для проведення досліджень на приматах ни НИ Се тк

Група Скорочення : й но дослідження (п-128)| кінцевих аналізів (п-121

Симульована оваріоектомізація, носій Зпат 21 21 впродовж 18 місяців

Оваріоектомізовані, носій впродовж 18 ОУХ 22 20 місяців

Оваріоектомізовані, 18 місяців РТН(1-34) у РТНІ 21 19 дозі Тмкг/кг/7/день

Оваріоектомізовані, 12 місяців ГПРТН(1-34) РТНІ-М 21 20 дозі Імкг/кг/день, 6 місяців носій

Оваріоектомізовані, 18 місяців ГПРТН(1-34) РєРТН5 22 21 дозі 5мкг/кг/день

Оваріоектомізовані, 12 місяців ГПРТН(1-34) РТНБ-М 21 20 дозі 5мкг/кг/день, 6 місяців носій

Зразки сироватки та сечі відбирали через 24 години після впорскування носія або пРТН(1-34) з 3- місячними інтервалами. Для здійснення фармакокінетичних досліджень було розроблено план неінтенсивного відбирання зразків від 5 мавп у кожній групі, яка одержувала гпРТН(1-34). Відбирання зразків (з 0-240- хвилинним часовим інтервалом кожного разу) здійснювали у вихідній точці, через 7 місяців, 11 місяців та 17 місяців. У час 0 та з б-місячними інтервалами за допомогою подвійної енергетичної рентгенівської абсорбціометри (ОХА) визначали загальну кісткову масу скелету та хребетного стовпу (від 1-2 до 1-4); периферійну кількісну комп'ютерну рентгенографічну томографію (рОСТ) було використано для визначення кісткової маси діафізу та дистального відділу променевих кісток та проксимального відділу великогомілкових кісток. Через 6 місяців та 15 місяців робили біопсію клубової кістки з метою проведення гістоморфометричних досліджень. Усіх тварин забили через 18 місяців.

Біохімічним випробуванням було піддано поперекові хребці (від 1-3 до 1-4), шийку стегнової кістки, діафіз плечової кістки та зразок кортикального шару, який було вирізано з діафізу стегнової кістки (розміри наведено у Таблиці 7). Традиційним статичним та динамічним гістоморфометричним дослідженням було піддано (розміри наведено у Таблиці 11) діафіз плечової кістки, поперековий хребець 1-2, шийку великогомілкової кістки, діафіз стегнової кістки, діафіз променевої кістки та дистальний відділ променевої кістки. За допомогою початкового статистичного аналізу усі групи порівняли з оваріоектомізованими тваринами контрольної групи, яким вводили носій. Одержані дані є придатними для додаткового дослідницького аналізу з метою визначення дозозалежності, впливу припинення введення засобу, взаємодії між кінцевими результатами та часових змін за допомогою методів, відомих фахівцям у цій галузі. Усі аналізи було здійснено та визначено за методами, відомими у цій галузі.

Для певних експериментальних завдань кортикальний шар плечової кістки було піддано гістоморфометричному дослідженню та дослідженню за допомогою поляризаційного інфрачервоного мікроскопу з перетворенням Фур'є. Інфрачервону мікроскопію з перетворенням Фур'є було здійснено шляхом пристосування методів, відомих для здійснення такої мікроскопії.

Дослідження з об'ємним моделюванням з кінцевою кількістю елементів

Під час проведення цих досліджень були одержані дані для об'ємного моделювання з кінцевою кількістю елементів на хребцях мавп, яким впродовж 18 місяців вводили РТН. Вирізані хребці 1-5 групи оваріоектомізованих тварин (п-/) та групи тварин, які одержували РТН (п-7), у 5095 суміші етанолу/фізіологічного розчину піддавали періодичному скануванню з 500мкм кроком засобами кількісного комп'ютерного томографування (ОСТ, Мопапа, Рі. Аїкіпзоп, штат Вісконсін) з об'ємними елементами зображенням 70х70мкм. Кожен з 500мкм поперечних розтинів аналізували на волюметричну мінеральну густину кісткової тканини (ВМО, мг/сму), вміст мінеральних речовин кісткової тканини (ВМС, мг), поперечну площу (Х-площу), об'єм губчастої речовини кістки (ВМ/ТМ), товщину кісткових брусів (ТЬ.ТИ) та зв'язність (густина вузлів, аналіз міжвузлових перемичок). Елементи зображення під час кожного періодичного сканування усереднювались з одержанням об'ємних елементів зображення 490х490х500мкм. Після цього усі скановані зображення об'єднували і для кожної кістки розробляли триангуляційну поверхневу сітку з використанням алгоритму "крокуючих кубів" (дивись, наприклад, Лоренсен (І огепзеп) та Клайн (Сіїпе), 1987, "Магспіпд сирез, а Підп гезоїшіоп ЗО в5ипйасе сопвігисіоп аідопійтт", Сотршег Старпісв, 21, 163-169). Після цього упорядковану версію кожної поверхневої сітки використовували для створення тетраєдричної сітки для об'ємного моделювання з кінцевою кількістю елементів.

Модулі Юнга для кожного тетраеєдричного елементу було одержано з густини вихідного об'ємного елементу зображення, а властивості матеріалу було визначено шляхом випробувань зразку кортикального шару у вигляді бруса, який було вирізано з діафізу стегнової кістки мавп. Кожну тетраедричну сітку повертали таким чином, щоб нижня поверхня кожного хребця співпадала з площиною. Після цього кожну модель 1-5 піддавали лінійному аналізу пружного зусилля, під час якого до верхньої поверхні тіла хребця, перпендикулярно нижній площині, прикладували розподілене навантаження величиною 100Н, у той час як нижню поверхню було зафіксовано у напрямку навантаження. Визначали контури результуючої аксіальної деформації та розподіл ВМО, та порівнювали одержані результати між РТН- та оваріоектомізованою групою.

При цій роздільній здатності густина кожного об'ємного елементу зображення залежить від ступеню заповненості кожного об'ємного елементу зображення кістковою тканиною, у протилежність до м'якої тканини.

Результати

Повідомлені різниці у тексті є статистично значущими, р«0,05. Під час проведення дослідження, незалежно від обробки, усі тварини мали 4-99о5 приріст до початкової маси тіла.

Результати аналізів сироватки та сечі

Рівні естрадіолу у сироватці усіх оваріоектомізованих мавп на З місяцях та 18 місяцях були нижче за 5пг/мл. У разі порівняння показників кальцієвого гомеостазу з контрольними тваринами, які було піддано симульованій операції, оваріоектомізовані контролі мали нижчі рівні сироваткового кальцію, фосфату та 1,25- дигідроксивітаміну 0, однак не відрізнялись за рівнями ендогенного РТН, циклічного аденозинмонофосфату (ЦАМФ) у сечі, кальцію у сечі, креатиніну у сечі або азоту сечовини у сироватці при визначенні через 24 години після останнього впорскування. Тварини, які одержували "ПРТНІ(1-34), мали нижчі рівні фосфату у сироватці, нижчі рівні ендогенного РТН та вищі рівні 1,25-дигідроксивітаміну О та ЦАМФ у сечі, порівняно з відповідними показниками оваріоектомізованих тварин. Результати аналізу сироваткового маркеру остеогенезу показали, що оваріоектомізовані мавпи мали низькі сироваткові рівні загальної лужної фосфатази (АР) та остеокальцину, порівняно до симульовано оперованих; відповідні рівні у тварин, які одержували гПРТН(1-34) повернулись до рівня симульовано оперованих. Екскретування С-телопептиду (кісткові перекладини) з сечею, який було використано як біохімічний маркер резорбції кісткової тканини, не змінилось під впливом гПРТН(1- 34), порівняно до відповідних показників оваріоектомізованих контрольних тварин.

Кісткова маса

Загальна скелетна кісткова маса, яку було виражено як загальну тілесну ВМС, значно збільшувалась під впливом РТН(1-34) (Ффіг.3). Мінеральна густина (ВМО) кісток хребетного стовпу залишалась стабільною у оваріоектомізованих контрольних тварин впродовж 18 місяців, у той час як симульовано оперовані тварини мали приблизно 595 приріст відносно вихідного рівня (Фігури 4А-4С та 5А). ПРТН(1-34) підвищував ВМО хребетного стовпу на 7-1495 та вміст мінеральних речовин кісткової тканини (ВМС, Фігура 3) усього тіла на 695, порівняно до вихідних рівнів (Фігури 4А-4С та 5А). Вміст мінеральних речовин кісткової тканини хребетного стовпу також підвищився (Фіг.5А). У приматів, які одержували пРТН(1-34), величина цих підвищень була значно вищою, аніж відповідні показники оваріоектомізованих контрольних тварин. Вона співпадала (РТНІ) або перевищувала (РТН5) відповідний показник симульовано оперованих. "ПРТН(1-34) не змінив ВМО діафізу або дистального відділу променевих кісток. Площа поперечних розтинів у групі РТН5О зросла на 795. У проксимальному відділі великогомілкової кістки не спостерігалось підвищення площі поперечних розтинів, але

ТРТН(1-34) підвищив ВМС та ВМО, порівняно до оваріоектомізованих контрольних тварин. Через шість місяців після припинення лікування, показники ВМО та ВМС кісток хребетного стовпа та шийки стегнової кістки були більшими за відповідні показники оваріоектомізованих контрольних тварин за відсутності змін у кортикальному шарі діафізу плечової кістки.

Міцність кісток

ТРТНІ(1-34) підвищив міцність (Ру) хребців майже на 4395 (Таблиці 7 та 8, Фіг.58). ППРТН(1-34) підвищив міцність шийки стегнової кістки ) (Ту) майже на 1295 (Таблиці 7 та 9, Фіг.6бА). ПРТН(1-34) не змінив параметри кортикального шару діафізу плечової кістки (Таблиці 7 та 10) або властивості матеріалу зразків у вигляді балок, яку було вирізано з діафізу стегнової кістки (Таблиці 7 та 9, Фіг.6В), у разі їхнього порівняння до відповідних показників оваріоектомізованих контрольних тварин. У тварин, які одержували пПРТН(1-34) впродовж 12 місяців з подальшим припиненням введення впродовж б місяців, показники міцності кісток залишались значно вищими аніж у оваріоектомізованих контрольних тварин (Таблиці 7-10, Фігури 58 та бА).

Таблиця 7

Змінні величини для третього та четвертого поперекових хребців (І -3 та 1-4), діафізу плечової кістки, проксимального відділу шийки стегнової кістки та зразків у форми балки, які було вирізано зі стегнової кістки 00111111 Зміннавеличина,ї///// | ОдиниціЇ 77777771 Опис/77///ССССсСсС

Поперекові хребці, І -3 та 1 -4

А мм? Площа поперечного розтину що н Силою пластичної деформації є сила при 0,295 відхиленні

Н/мм Нахил лінійної ділянки кривої сила-зміщення (твердість) су МПа Межа плинності

Е МПа Модуль Юнга

Діафіз плечової кістки ! ММ Середня товщина кортикального шару кістки

Еш н Граничною силою є максимальна сила, яку може витримати зразок 5 Н/мм Нахил лінійної ділянки кривої сила-зміщення (твердість), у цьому випадку твердість ту/ Н/мм Площа під кривою навантаження-зміщення (О-робота до руйнування)

Проксимальний відділ шийки стегнової кістки

Еш н Граничною силою є максимальна сила, яку може витримати зразок

Зразки у формі балки, які було вирізано з діафізу стегнової кістки он МПа Межа міцності

Е ГПа Модуль Юнга и Дж/м3 |Ударна в'язкість

Би гранична деформація

Таблиця 8

Біохімічні параметри міцності хребетного стовпу (об'єднані показники для поперекових хребців І -3 та І -4) оваріоектомізованих приматів через 18 місяців

А (мм?) 90,552,159 86,732,3 88,332,0 90,922,3 87,352,7 82,8х21 в (Н) 1738552 14992945 1915:51059 18995739 2113ж7750 17925599

З (Н/мм) 73125319 5805:4765 7701-4749 | 7401534529 8012ж3679 707453140 су (МПса) 194520,6 17,3531,0 21,941,39 21,150,89 24,б21,150 21,920,99

Е (МПа) 65032 546149 1175489 659542 7595369 6982419

Скорочення: Зпат-Симульовано оперовані тварини;

ОХ: Оваріоектомізовані контрольні тварини; РТНІ-ГППРТН(1-34) у дозі мкг/кг впродовж 18 місяців;

РТНІ-М/«припинення введення впродовж 6 місяців після лікування гпРТН(1-34) у дозі 1мкг/кг впродовж 12 місяців; РТН5-ГПРТНІ(1-34) у дозі 5мкг/кг впродовж 18 місяців; РТН5-М/еприпинення введення впродовж б місяців після лікування "ПРТН(1-34) у дозі 5мкг/кг впродовж 12 місяців. а Дивись Таблицю 4.1 для опису змінних величин. ь Дані представлено як середнєжсередня квадратична помилка середнього (ЗЕМ) на групу. о Статистично значуща порівняно до оваріоектомізованих контрольних тварин (р«е0,05). з Статистично значуща порівняно до симульовано оперованих контрольних тварин (ре«0,05).

Таблиця 9

Біомеханічні параметри властивостей матеріалу зразків у формі балок еквівалентного розміру з діафізу стегнової кістки та біомеханічні параметри міцності шийки стегнової кістки оваріоектомізованих приматів через 18 місяців си (МПа) 22255 21655 22214 21446 2066 208516

Е (ГПа) 17,250,6 16,4520,4 17,120,4 16,620,6 15,420,65 15,320,65 и (мДж/м3) 5,920,3 5,8:0,4 6,12504 5,510,4 5,450,4 6б,120,4

Би 0,035:30,001 10,035:0,002 | 0,03620,002 | 0,0340,002 | 0,034-0,002 10,038:250,002

Проксимальний відділ шийки стегнової кістки Гу 1288241 11052535 1235:2459 12585529 13625309 12135242

РТНІ-М/хприпинення введення після лікування гПРТН(1-34) у дозі М1мкг/кг впродовж 12 місяців;

РТНБ5-ТРТН(1-34) у дозі 5мкг/кг впродовж 18 місяців; РТН5-М/«припинення введення після лікування

ПРТН(1-34) у дозі 5мкг/кг впродовж 12 місяців. а Дивись Таблицю 4.1 для опису змінних величин. ь Дані представлено як середнєжсередня квадратична помилка середнього (ЗЕМ) на групу. о Статистично значуща порівняно до оваріоектомізованих контрольних тварин (р«е0,05). з Статистично значуща порівняно до симульовано оперованих контрольних тварин (ре«0,05).

Таблиця 10

Біомеханічні параметри кортикального шару діалізу плечової кістки оваріоектомізованих приматів через 18 місяців о (одиниційїд/ ЇЇ

І (мм) 1,7420,049 1,63:0,035 1,68:50,03 1,66:20,04 1,80-0,047 1,72520,05

ЕН) 125126 63626 6543123 689:23 б8вОж155 107124

З (Н/мм) 601523 520126 544123 573120 5481218 57324 и (мДж) 1797585 15425192 16412137 1751584 1804299 17755113

РТНІ-М/хприпинення введення після лікування гПпРТН(1-34) у дозі М1мкг/кг впродовж 12 місяців;

ПРТН(1-34) у дозі 5мкг/кг впродовж 12 місяців. а Дивись Таблицю 4.1 для опису змінних величин. ь Дані представлено як середнєжсередня квадратична помилка середнього (ЗЕМ). о Статистично значуща порівняно до оваріоектомізованих контрольних тварин (р«е0,05). з Статистично значуща порівняно до симульовано оперованих контрольних тварин (р«е0,05).

Гістоморфометрія кісток

Незважаючи на більш інтенсивний метаболізм у оваріоектомізованих порівняно до симульовано оперованих контрольних тварин, значного зниження об'єму кісткової тканини клубового гребеню не спостерігалось. Оскільки тетрациклінова мітка, яка вводились на 6 місяцях, у багатьох тварин не виявлялась, для цієї часової точки визначали лише статичні параметри. Дані статичної та динамічної гістоморфометрії на місяцях показали, що лікування за допомогою гпРТН(1-34) збільшило об'єм губчастої речовини кістки порівняно до оваріоектомізованих тварин та підвищило остеогенез без перевищення параметрами резорбції відповідних показників у оваріоектомізованих контрольних тварин. Швидкість остеогенезу поступово збільшувалась більшими дозами гпРТН(1-34). Незважаючи на те, що об'єм губчастої речовини кістки залишався підвищеним, порівняно до відповідного показнику оваріоектомізованих контрольних тварин після припинення введення гпРТН(1-34) після 12 місяців лікування, параметри остеогенезу та резорбції повернулись до рівня, який спостерігався у оваріоектомізованих контрольних тварин, у той час як метаболізм кісток залишався на більш високому рівні порівняно до симульовано оперованих контрольних тварин.

ТРТН(1-34) не впливав на мінералізацію, частоту активації або періоди ремоделювання. Різниці у рівновазі (на основі кісткової багатоклітинної одиниці (ВМИ)) між резорбцією та остеогенезом у окремих тварин не спостерігалось. Узагальнено, (ПРТН(1-34) збільшив об'єм губчастої речовини кістки шляхом вибіркового стимулювання остеогенезу.

У кортикальному шарі плечової кістки, де ПРТН(1-34) не викликав значного модифікування показників

ВМО або міцності, гПРТН(1-34) стимулював зміни у періоетальному, ендостальному та інтракортикальному компартментах (Таблиці 11 та 12). Незважаючи на відсутність різниці у загальній площі або площі кісткового мозку між групами, ПРТН(1-34) збільшив площу кортикального шару і групи РТН5 та РТН5О-М/ мали значно більший кортикальний шар, що дозволяє припустити можливість існування більшого моменту інерції поперечного розтину, критерію міцності. Збільшення площі може пояснюватись підвищеним остеогенезом як на періостальній, так і на ендостальній поверхнях (Фіг.7).

Симульовано оперовані контрольні тварини та тварини групи РТН5-М/ мали зменшені періостальні поверхні мінералізації порівняно до оваріоектомізованих контрольних тварин та інших груп, які одержували

ТРТН(1-34). Ендокортикальні поверхні мінералізації були значно більшими у оваріоектомізованих контрольних тварин, порівняно до симульовано оперованих, і гГПРТН(1-34) не підвищив згаданого параметру над відповідними параметрами оваріоектомізованих контрольних тварин. Відносно інтракортикального ремоделювання, оваріоектомізовані тварини мали більші резорбційні проміжки і частота активації була більшою у оваріоектомізованих, РТНІ та РТН5 групах, аніж у симульовано оперованих контролів або будь-якої групи з припиненням введення пПРТН(1-34). Оваріоектомізовані тварини мали значно більше мічених остеонів на одиницю площі, аніж симульовано оперовані контрольні тварини і ПиРТН(1-34) забезпечив лише незначне перевищення показників оваріоектомізованих контрольних тварин.

Інтракортикальна пористість була більшою у оваріоектомізованих порівняно до симульовано оперованих тварин і не різнилась між оваріоектомізованими контрольними тваринами та тваринами, які входили до складу групи РТНІ. Пористість у тварин груп РТН5 та РТН5-М/ перевищувала відповідний показник У оваріоектомізованих контрольних тварин. Дані досліджень на кроликах дозволяють висунути гіпотезу, суть якої полягає у тому, що згадане підвищення пористості, яке супроводжується збільшенням кортикального шару кістки, може бути структурною реакцією, яка спрямовується на підтримку біомеханічних властивостей кістки, яку було оброблено "ПРТН(1-34). Різниць у періоді остеогенезу, ширині остеоїдів, ширині стінок або визріванні остеоїдів у 18 місяців між оваріоектомізованими та іншими групами не спостерігалось.

Узагальнено, не існувало різниць у швидкості метаболізму між оваріоектомізованими контрольними тваринами та тваринами, які одержували "(ПРТНІ(1-34) у будь-якій зі згаданих доз. Симульовано оперовані контрольні тварини мали нижчу швидкість метаболізму аніж оваріоектомізовані контрольні тварини або тварини, які одержували пПРТН(1-34). У разі припинення введення "ПРТН(1-34) впродовж б місяців швидкість метаболізму значно зменшувалась, однак показники ВМО та біохімічні параметри міцності залишались вищими, аніж у оваріоектомізованих контрольних тварин. Нормальні показники ширини остеоїдів та часу інтракортикального визрівання для усіх груп вказують на те, що лікування не викликало будь-якого порушення нормального часового проходження процесу мінералізації. Нормальні показники ширини стінки вказують на те, що лікування не змінило нормальної рівноваги між резорбцією та остеогенезом на рівні окремої ВМО.

Таблиця 11

Гістоморфометричні змінні величини параметрів кортикального шару плечової кістки кортикального шару кістки о ендокортикальної поверхні періостальної поверхні

УМ 11111111 мкмо |Ширинаостеоїдїв.7/:///СССС:/33//ССС1111111с1С

МУ 11111111 мкмо |Ширинастінмостеону.д7/////////77777777777711111111111111111111111111с1сС оті 77777701 дні |Часвизріванняостеоїду.ї7//://ОССССССССССС1111111с1С

Ро 77777777 17111196 |Пористість відсотоккістковоїплощі, зайнятий проміжкамиїд поверхні (з включенням пористості) а Номенклатура, рекомендована у доишгпаї ої Вопе апа Міпега! Незеагси, 1987.

Таблиця 12

Гістоморфометрія кортикального шару діафізу плечової кістки оваріоектомізованих приматів у 18 місяців (п-121) (одиниці)?

Ас.Е 1,85:1,872с 6,0623,31 7,69:4,96 3,05:2,152 8,70ж53,97 2,05:21,462

ВЕВ/В5.Ес 7,08:х23,80 20,93219,23 | 18,14513,95 | 14,895410,32 | 34,045219,01 |12,73:216,332

ВЕВ/В5.Рз 3,7953,07 9,1257,58 8,53210,54 3,6023,848 8,99ж5,81 5,7924,05

ВЕВ/ВУ 2,13:22,062 9,1655,37 9,2355,93 4,393,482 12,9325,942 | 2,21-41,732

ЕР 82,73241,06 | 65,94519,79 | 63,44510,02 | 64,945411,99 | 81,97297,63 | 88,63ж252,90

Оп.МСА 0,28:50,272 1,0320,52 1,26:20,71 0,5020,362 1,45:20,472 0,38:20,262

МАВ 0,910,332 1,0720,19 0,98:20,128 1,0620,27 1,035250,23 0,85::0,282

МАНВ.Ес 0,4830,192 0,75:0,25 0,6650,15 0,6650,16 0,75:0,14 0,63ж20,17

МАН.Рз 0,6250,24 0,69:20,23 0,89:20,95 0,54:0,152 0,6650,17 0,8250,15

М5/8В5.Ес 3,09-6,492 20,99218,04 | 25,19517,14 | 11,74514,412 | 40,47224,682 | 8,93215,399

М5/В5.Ре 1,8153,592 10,03:2-10,49 8,5955,73 3,8654,832 11,00529,63 2,30х3,762

ОМ 3,77530,92 4,0420,91 З,6620,67 3,96520,83 3,9421,13 3,7620,83

А5.М/СКА 0,1250,178 0215013 0,28:0,18 0,12:20,072 0,43:0,262 0,19520,18

М Мі 63,23513,61 | 68,63515,09 | 61,36ж-7,79 | 63,12ж17,35 65,28ж9,43 63,8258,31 оті 4,5831,262 3,8731,04 3,76х20,70 3,8620,74 6,45:13,85 5,0712,65

Ро 1,32:20,602 2,61521,40 4,65:4,78 2,23-1,60 6,7834,232 6,40-4,222

В.Аг 53,1255,50 52,82517,09 54,22ж5,97 54,9416,55 55,81-6,24 | 58,16528,792

СТ. Аг 37,4053,75 33,355,04 37,6153,86 38,1024,83 40,96524,302 | 40,8355,802

Ме. Аг 15,7214,07 17,4714,22 16,6153,77 16,843,74 14,85-4,722 | 17,34-6,05

РТНІ-М/хприпинення введення після лікування (РТМ(1-34) у дозі імкг/кг впродовж 12 місяців;

ГАРТН(1-34) у дозі 5мкг/кг впродовж 12 місяців. а Статистично значуща порівняно до оваріоектомізованих контрольних тварин (р«0,05). ь Дивись Таблицю 4.2 для опису змінних величин. с Дані представлено як середнєжсередня квадратична помилка середнього (ЗЕМ).

Результати аналізу засобами гістоморфометрії та поляризаційної інфрачервоної мікроскопії з перетворенням Фур'є показали, що введення РТН поліпшувало якість кісток завдяки заміщенню старої кісткової тканини (кристаліти великого розміру) молодою кістковою тканиною (кристаліти різного розміру зі схильністю до меншого). На додаток до цього після припинення введення РТН мавпам, які одержували малі дози, з'являється додаткова вигода, оскільки матрикс стає оптимально мінералізованим і кристаліти визрівають. Дані, які було одержано засобами гістоморфометрії та поляризаційної інфрачервоної мікроскопії з перетворенням Фур'є, показали неочікувану вигоду для якості кортикального шару кістки, яка полягає у тому, що у той час коли відбувається оптимальна мінералізація, мінеральна фаза визріває.

Дослідження середнього 500мкм зрізу Ї-5 показало 2195 підвищення ВМО для РТН порівняно до оваріоектомізованих тварин, що було обумовлено 2795 зростанням ВМС без зміни площі поперечного розтину.

Аналіз тіла хребця з РТН показав 7395 зростання ВМ/ТУ, що було обумовлено 3095 збільшенням ТЬ.ТА та ТБ.М, яке перевищувало на 3795 відповідний показник оваріоектомізованих тварин. Аналіз зв'язності для цієї ділянки показав для хребців з РТН на 14095 більшу густину вузлів (вузол/об'єм тканини) та більшу на 28695 кількість міжвузлових перемичок.

Гістограмний аналіз розподілу густини об'ємних елементів зображення кістки для РТН показав зменшення пропорції низької густини (0-355мг/см3) та підвищення середньої густини (356-880мг/см3) з незначним впливом на об'ємні елементи зображення з високою густиною (887-1200мг/смУ) порівняно до оваріоектомізованих тварин (Ффіг.8). Найбільш вражаючим був зсув до більшої густини об'ємного елементу зображення кортикального шару кістки після припинення лікування впродовж 6 місяців (Фіг.8).

Було вирахувано пропорцію елементів хребцевої кістки (об'ємні елементи зображення), які знаходились у межах певного діапазону значень ВМО. Обрані діапазони ВМО виглядали наведеним далі чином: низька ВМО, 0-з00мг/см3; середня ВМО, 300-700мг/см3; висока ВМО, 700-1000мг/см3; та кортикальна ВМО»100Омг/см3 (Таблиця 13). Порівняно до оваріоектомізованих контрольних тварин, обробка РТН значно знизила об'єм кісток з низькою ВМО та підвищила об'єм кісток з середньою ВМО. Після припинення введення РТН спостерігалось зниження кісток з середньою ВМО та підвищення кісток з високою ВМО, що вказувало на підвищення густини кісток з середньою ВМО.

Таблиця 13

Відсотки об'єму хребців І 5, згруповані за значеннями ВМО (середнєжсередня квадратична помилка середнього)

Таблиця 14

ВМС на середньому рівні хребця І 5 та результативна деформація хребця

Результативна деформація (гранична деформація) х статистично різні (р«0,05 за частковим випробуванням за Фішером з середнім квадратичним відхиленням).

Дані, які узагальнено на Фігурі 8, показують, що хребець І-5 мавп Масаса газсісціагіз (макак-крабоідів), яким впродовж 18 місяців вводили РТН, відреагував значним підвищенням кісткової маси, товщини кісткового брусу, зв'язності кісткових брусів, з незначним впливом на зовнішні розміри (Х-площа) хребця. Аналіз розподілу кісткових елементів у І-5 показав, що сильно мінералізовані ділянки кістки піддались найменшим змінам без ознак остеосклерозу. Скоріше максимальну реакцію на РТН продемонструвала пориста губчаста кістка. Зміщення ВМО обумовило значне зниження аксіальної деформації, що свідчить про поліпшення механічних властивостей. Як чітко показано на гістограмах ВМО оваріоектомізованих тварин та тварин, які одержували РТН, паратиреоїдний гормон перетворив об'ємні елементи зображення кісток низької густини на об'ємні елементи зображення середньої густини без значного впливу на об'ємні елементи зображення високої густини.

Дані, які узагальнено у Таблиці 2, показують, що ВМС у середній частині хребців було значно підвищено обробкою за допомогою і благотворний ефект РТН залишився після 6 місяців припинення його введення.

Середню механічну деформацію хребцю було знижено на 3695 завдяки лікуванню за допомогою і цей показник був на 2395 нижче за відповідний показник для оваріоектомізованих тварин після припинення введення РТН.

Результати цього дослідження показують, що припинення лікування за допомогою РТН на 6 місяців не спричинювало резорбції новоутвореної кістки. Замість цього спостерігався корисний перерозподіл кісток середньої густини на кістки нижчої та вищої густини. Наслідком цього перерозподілу є постійне зниження деформації і, таким чином, поліпшення механічної функції.

Результати цього дослідження на приматах показують, що РТН, у разі його введення за відсутності інших медикаментів, які могли б вплинути на кістки, благотворно впливає як на кортикальний шар кісток, так і на губчасту кістку з підвищенням загальної кісткової маси скелету. Більше того, припинення введення РТН не викликає значної втрати благотворного впливу, який пов'язано з лікуванням за допомогою РТН, впродовж як мінімум 2 циклів ремоделювання.

Під час проведення інших випробувань для індикації активності у кістках було використано сурогатні маркери. Приймали, що зміна параметру відбиває зміни кісткової маси. Незважаючи на існування опублікованих даних, які було одержано на людях та приматах, та які вказують на підвищення маркерів утворення та резорбції кісткової тканини, що відповідає активації кісткового метаболізму, наприклад, на початковому етапі менопаузи або на активному етапі хвороби, високий рівень метаболізму розглядається як свідчення рарефікації кісткової тканини. Високий рівень метаболізму під час визрівання людського скелету у підлітковому віці було досліджено з меншою докладністю, однак він супроводжується анаболічним приростом кісткової маси. Таке явище, відповідно до сучасного стану у цій галузі, було б повністю неочікуваним у фармакотерапії остеопорозу. Таким чином, підвищення маркерів кісткового метаболізму не співпадає з відомим анаболічним ефектом РТН, який полягає у підвищенні маси та міцності кісток, як показано даними цього дослідження.

Дані цього 18-місячного дослідження на макаках-крабоїдах підтримують неочікувані результати, які наведено далі: - Загальне значне підвищення повної скелетної маси. - Значне підвищення маси та міцності шийки стегнової кістки. - Відсутність ознак "крадіжки" кортикального шару кісток для збільшення губчастої кістки. Підвищення маси та міцності кісток було статистично значущим на ділянках, зі збагаченням або кортикального шару (шийка стегнової кістки), або губчастої кістки (поперекові хребці). На ділянках чисто кортикального шару (середня частина діафізу стегнової кістки) спостерігалась схильність РТН до стабілізування або незначного збільшення маси та міцності кісток, порівняно до оваріоектомізованих контрольних тварин. - Зміни кісткових маркерів у оваріоектомізованих мавп (та людей) не відбивають благодійного анаболічного впливу РТН на скелет. Використання загальної води організму приматів у цьому дослідженні забезпечує можливість розробки нових та більш придатних сурогатних маркерів. - Збереження приросту кісткової маси та міцності впродовж як мінімум 2 циклів ремоделювання після припинення лікування.

Результати цього дослідження РТН на приматах відрізняються від опублікованих результатів досліджень на макаках-резус та макаках-крабоїдах тим, що у цьому дослідженні було використано зразки великого розміру для одержання відповідної потужності статистики для виявлення різниць, які не могли бути явними у попередніх, набагато менших, дослідженнях; контролі включали як оваріоектомізованих приматів (які було використано у опублікованих дослідженнях), так і симульовано оперованих, однак інтактних приматів. Про останню контрольну групу раніше у дослідженнях такого типу не повідомлялось, завдяки чому деякі благотворні ефекти РТН та відновлення певних параметрів до рівнів симульовано оперованих контрольних тварин було визначено вперше.

Це 18-місячне дослідження на статевозрілих, диких, оваріоектомізованих (ОУХ) мавпах Масаса газсісшагів (макаках-крабоїдах) забезпечило ефективне одержання надійних результатів лікування за допомогою

ТРТН(1-34) впродовж 12 місяців з подальшим припиненням лікування на 6 місяців, або лікування впродовж 18 місяців. ГПРТН(1-34) значно підвищував масу та міцність кісток хребетного стовпу та шийки стегнової кістки порівняно до оваріоектомізованих контрольних тварин, до рівнів, еквівалентних або більших за рівні симульовано оперованих контрольних тварин. У оваріоектомізованих мавп, які одержували ПРТНІ(1-34), параметри кальцієвого гомеостазу (рівень кальцію, фосфату та 1,25-дигідроксивітаміну О у сироватці) було відновлено до рівнів симульовано оперованих контрольних тварин. Параметри сироватки, сечі та гістоморфометрії, які було використано для оцінки кісткового метаболізму, показали, що гпПРТН(1-34) підтримував швидкість остеогенезу на рівні, еквівалентному або вищому за рівні оваріоектомізованих контрольних тварин, у той час як біохімічні маркери резорбції кісток залишались еквівалентними маркерам симульовано оперованих контрольних тварин. Фармакокінетичні параметри усіх тварин, які одержували

ТРТН(1-34) до 18 місяців, з часом не змінювались, і накопичення (пРТНІ(1-34) не спостерігалось. Після 18- місячного лікування ознак тривалої гіперкальціємії або патології нирок не спостерігалось. Змін періодів мінералізації або ремоделювання не спостерігалось. Чисте збільшення вмісту мінеральних речовин скелетних кісток, яке спостерігалось під час лікування пПРТН(1-34), може пояснюватись підвищенням швидкості остеогенезу та збільшенням поверхні остеогенезу з незначним або з повною відсутністю впливу на резорбцію кісткової тканини. Спостерігалось значне підвищення вмісту мінеральних речовин кісткової тканини, мінеральної густини кісткової тканини та біохімічних параметрів міцності, у тому числі ударної в'язкості та твердості, на клінічно важливих ділянках, наприклад, хребтового стовпу, шийки стегнової кістки та проксимального відділу великогомілкової кістки.

ТРТН(1-34) підвищив інтенсивність метаболізму кортикального шару діафізу плечових та променевих кісток, однак, не викликав значної зміни кісткової маси або біохімічних параметрів міцності, порівняно до оваріоектомізованих або симульовано оперованих контрольних тварин. Однак збільшення ширини та/або площі кортикального шару співпадає з підвищенням моменту інерції поперечного розтину, параметру міцності та твердості. ПРТН(1-34) не справив значного впливу на внутрішні властивості матеріалу кортикального шару кісток. Було стимульовано ендокортикальний остеогенез, завдяки чому зросла ширина кортикального шару та інтракортикальна пористість. Видається, що ці зміни пористості є відповідальними за підтримання пружності кістки.

У мавп 12-місячне лікування за допомогою /ПРТН(1-34) з подальшим припиненням лікування на 6 місяців пов'язувалось з невеликим, але усе ж таки значущим, приростом маси та міцності кісток хребетного стовпа та шийки стегнової кістки. Після припинення лікування не спостерігалось значного впливу на кортикальний шар діафізу плечових та променевих кісток. Кісткові маркери та гістоморфометричні параметри продемонстрували схильність до повернення до низьких рівнів метаболізму, які реєструвались у симульовано оперованих контрольних тварин.

Результати механістичних досліджень на гризунах іп мімо показали, що гени, пов'язані з анаболічними наслідками пРТН(1-34), активуються впродовж 1-6 годин і збільшення поверхні остеогенезу може бути виявленим у межах 24 годин після першої дози за відсутності явного впливу на резорбцію. гпРТН(1-34), здається, рекрутує недиференційовані клітини-попередники оостеоцитів у 5-фазі та стимулює їхню диференціацію на остеобласти і, тим самим, забезпечує швидке збільшення відсоткової поверхні остеогенезу.

Для індукування анаболічного ефекту у кістках у межах 1-годинного періоду може здійснюватись разове або багаторазове впорскування "ПРТН(1-34). Однак у разі, коли еквівалентна доза вводиться молодим пацюкам шляхом численних впорскувань впродовж б годин або 8 годин, анаболічний ефект нейтралізується, що дозволяє зробити припущення про те, що індукування анаболічного ефекту потребує обмеженого впливу

ТРТНІ(1-34).

Узагальнено, "ПРТНІ(1-34) є анаболіком для кісток мавп та кроликів. Цей гормон збільшує кісткову масу та підвищує біомеханічні параметри міцності на клінічно важливих ділянках, наприклад, на поперековій ділянці хребетного стовпа та на шийці стегнової кістки, шляхом вибіркового стимулювання остеогенезу.

Стимулювання кісткового метаболізму, утворення ендокортикальної поверхні та пористості, яке виявляється засобами гістоморфометрії на ділянках кортикального шару кісток, не змінює кісткову масу або біомеханічні параметри міцності кісток, але збільшує момент інерції поперечного розчину шляхом збільшення площі та/або ширини кортикального шару кісток.

Результати цих досліджень показують, що введення активаторів рецептору паратиреоїдного гормону, наприклад, рекомбінантного людського РТН(1-34), поліпшує якість кісток як під час так і після лікування.

Фактично, введення РТН один раз на день впродовж 18 місяців або у таких же самих дозах впродовж 12 місяців з подальшим б-місячним припиненням введення продемонструвало, за результатами гістоморфометричного аналізу та поляризаційної інфрачервоної мікроскопії з перетворенням Фур'є (ЕТІВ), явно виражене поліпшення якості кортикального шару плечової кістки. Результати цього аналізу показали, що введення РТН поліпшувало якість кістки завдяки заміщенню старої кісткової тканини (кристаліти великого розміру) молодою кістковою тканиною (кристаліти різного розміру зі схильністю до меншого). Таким чином, введення РТН може підвищити якість кортикального шару кістки, поліпшити та прискорити мінералізацію та заміну старої кісткової тканини на нову.

На додаток до цього після припинення введення РТН мавпам, які одержували малі дози, з'являється додаткова вигода, оскільки матрикс стає оптимальніше мінералізованим і кристаліти визрівають. Тобто у малих дозах РТН може забезпечувати додаткову вигоду під час припинення лікування шляхом стимулювання мінералізації. Ці дані вказують на вигоду кінцевого режиму лікування за допомогою РТН з подальшим періодом припинення лікування для одержання посиленої вигоди. Сучасні визначення якості кісток не включають ці аспекти поліпшеної мінералізації.

У попередніх дослідженнях лікувального етапу РТН з подальшим етапом припинення лікування, тривалість згаданого лікувального етапу була меншою за 1 місяць. Тривалий але кінцевий 18-24-місячний етап лікування з подальшим періодом, тривалість якого дорівнює як мінімум 2 циклам ремоделювання, раніше не досліджувався. Подальший благотворний вплив на приматів після припинення лікування знаходиться у явному протиріччі з результатами, які було одержано на гризунах при введенні РТН. Результати досліджень на гризунах однозначно показали, що кісткова тканина після припинення лікування піддається прискореній рарефікації. Ганнес-Хі М. (сиппез5-Неу М.) та Хок Дж.М. (Носк 9.М.) (1989) Вопе, 10: 447-452; Шен В. (Зпеп М.) та інші, (1993) .Сіїп. Іпмеві, 91: 2479-2487; Шен В. (5Пеп У.) та інші, (1992), Саїсії. Тіввице Іпі., 50: 214-220; та

Москілд Л. (Мозекіїае І.) та інші, (1997), Вопе, 20: 429-437.

Такий спосіб стимулювання мінералізації кісткової тканини раніше не спостерігався і є неочікуваним. Це новий спосіб, завдяки якому РТН забезпечує підвищення міцності та твердості кістки та може запобігати переломам. Цей новий спосіб включає посилення та регулювання мінералізації з одержанням твердішої, міцнішої та стійкішої до переломів кістки. Такий благотворний вплив потребує більше, ніж утворення нового матриксу. Ці дані вказують на те, що РТН може бути корисним для пацієнтів з імобілізованими кістками або скелетом, або для скелетів з дефіцитом мінеральних речовин, за умови забезпечення адекватного додаткового введення кальцію та вітаміну О.

Приклад 3. Підвищення міцності та густини кісток та зменшення кількості випадків переломів м разі введення ІПРТНІІ-34) людям

Плацебо: 544 на початку, 447 у кінці.

Критерії діагностування | Жінки віком від 30 до 85 років, постклімактеричні впродовж як мінімум 5 років з як та включення: мінімум одним середньої тяжкості або двома легкими атравматичними переломами хребців.

Дозування та введення: | Експериментальний продукт (сліпий метод)

ВИРТН(1-34): 20мкг/день, підшкірно

ТРТН(1-34): 40мкг/день, підшкірно

Еталонна терапія (сліпий метод)

Експериментальний матеріал (плацебо) для впорскування.

ТРТНІІ-34): 17-23 місяці (за виключенням б-місячного припинення лікування)

Плацебо: 17-23 місяці (за виключенням 6б-місячного припинення лікування кістковоспецифічна лужна фосфатаза, проколаген І, карбоксикінцевий пропептид); маркери сечі (кальцій, М-телопептид, вільний деоксипіридинолін); 1,25-дигідроксивітамін 0; мінеральна густина кісткової тканини; хребетний стовп, тазостегновий суглоб, зап'ястя та тіло у цілому; зріст; популяційна фармакокінетика; біопсія кісток (вибрані ділянки).

Характеристики пацієнтів 11111111 | Плацебо (мА544) | РТН-20 (МАБА1) ЇРТН-40 (М-А552) | Значення р

Білі 98,99 98,995 98,490 0,672

Вік 69,057,0 69,5:27 1 69,926,8 0,099

Кількість постклімактеричних років 20,958,5 21,558,7 21,858,2 0,273

Гістеректомізовані 23,89 23190 21,690 0,682

Маткачо або 1 яєчник 57 51 58

Маткан2 яєчники 61 57 51

Невідомо 11 17 10

Попереднє застосування 14995 15595 13,095 0,479 ліків проти остеопорозу

Вихідна ВМО хребетного стовпа 0,82520,17 0,8250,17 0,8250,17 »0,990

Вихідна кількість переломів хребців (0) 54 (10,4965) 45 (8,896) 54(10,196) 1 144 (27,89) 159 (31,195) 169 (31,69) 2 128 (24,76) 128 (25,095) 125 (23,495)

З 75 (14595) 67 (1,195) 81 (15196) 4 59(11,496) 49 (9,696) 45 (8,495) 28 (5,496) 31 (6,196) 21 (3,996) (5) 13 (2,595) 20 (3,996) 25 (4,796) 7 6 (1,296) 7 (1,496) 10 (1,995) 8 9 (1,796) 5 (1,090) З (0,690) 9 1 (0,296) (9) 2 (0,496) 1 (0,296) 1 (0,296) (0)

Не визначено 26 29 17

Результати

Під час проведення клінічних випробувань, у яких у цілому приймало участь 1637 жінок, яких лікували людським паратиреощним гормоном (1-34), ГПРТН(1-34) у дозі Омкг/день, 20мкг/день або 4Омкг/день та які додатково одержували вітамін О та кальцій, було одержано результати, які наведено у Таблицях 15-19.

У Таблиці 15 наведено дані, які показують зниження кількості та тяжкості переломів хребців після лікування РТН. Порівняння усіх результатів, які було одержано на пацієнтах, яких лікували за допомогою РТН, з результатами, які було одержано на пацієнтах, яким вводили плацебо, показало, що загальне зниження кількості пацієнтів з вертебральними переломами становило 67905 (р«е0,001), з 6595 зниженням (р«е0,001) у разі лікування за допомогою РТН у дозі 20мкг/день, порівняно до плацебо, та 6995 зниженням у разі лікування за допомогою РТН у дозі 40мкг/день, порівняно до плацебо (Таблиця 15). Порівняння усіх результатів, які було одержано на пацієнтах, яких лікували за допомогою РТН, з результатами, які було одержано на пацієнтах, яким вводили плацебо, показало, що загальне зниження кількості пацієнтів з множинними вертебральними переломами становило 8195 (р«е0,001), з 7795 зниженням (р«0,001) у разі лікування за допомогою РТН у дозі 20мкг/день, порівняно до плацебо, та 8695 зниженням у разі лікування за допомогою РТН у дозі 4Омкг/день, порівняно до плацебо. Порівняння усіх результатів, які було одержано на пацієнтах, яких лікували за допомогою РТН, з результатами, які було одержано на пацієнтах, яким вводили плацебо, показало, що загальне зниження кількості пацієнтів з вертебральними переломами з тяжкістю від помірної до тяжкої становило 8495 (р«е0,001), з 9095 зниженням (р«0,001) у разі лікування за допомогою РТН у дозі 20мкг/день, порівняно до плацебо, та 7895 зниженням у разі лікування за допомогою РТН у дозі 40мкг/день, порівняно до плацебо (Таблиця 15).

Таблиця 15

Вплив лікування за допомогою РТН на кількість випадків та тяжкість вертебральних переломів пт о вщИЕ | ВКА

РТН(п-444 РТН(п-434 вертебральними переломами новими вертебральними переломами переломами від помірних до тяжких"" "п:кількість пацієнтів з початковими та кінцевими рентгенограмами; ях Наслідком перелому помірної тяжкості є втрата висоти (або еквівалентний параметр) хребця, яка перевищує 2595. Наслідком тяжкого перелому є втрата висоти (або еквівалентний параметр) хребця, яка перевищує 4095. Переломи відповідають опису, який було наведено у роботі Дженана (Сепапі) та інших, (1993), Мепебга! Масішге аззеззтепі ивіпд а зетідпапійайме (Їесппідпе; У. Вопеє«Міп. Нез., 81137-1148.

Таблиця 16 ілюструє вплив лікування за допомогою РТН на кількість випадків переломів різноманітних невертебральних кісток у всьому тілі. Кількість випадків переломів (тазостегновий суглоб, променеві кістки, гомілковостопний суглоб, плечові кістки, ребра, стопа, таз та інші ділянки) явно зменшилась (Таблиця 16).

Згадане зменшення є статистично значущим, якщо воно розглядається як зниження загальної кількості переломів серед пацієнтів, які одержували лікування за допомогою РТН, порівняно до пацієнтів, які одержували плацебо. Згадане зниження стає ще більш значущим, коли розглядається як зниження загальної кількості випадків переломів тазостегнового суглобу, променевої кістки, гомілковостопного суглобу, плечової кістки, ребер, стоп та тазу серед пацієнтів, які одержували лікування за допомогою РТН, порівняно до пацієнтів, які одержували плацебо (Таблиця 16).

Таблиця 16

Вплив лікування за допомогою РТН на кількість випадків невертебральних переломів

ЛКК ве ит Ти (о-вая) | (Мова) | (вв) таз Ї1173 11717170 |ол711 0076 | 0519 | 0081 інше 77777771 1711716 | 14 | 9 00338) 0296 | 0723 | 0146 " Плацебо

Вплив РТН на вміст мінеральних речовин кісткової тканини (ВМС), мінеральну густину кісткової тканини (ВМО) та площу кістки визначали за допомогою подвійної енергетичної абсорбціометри (ОЕХА); одержані результати наведено у Таблицях 17-19. Введення РТН викликало явне підвищення ВМС у поперековому відділі хребетного стовпа, стегновій кістці та тазостегновому суглобі, зап'ясті та у всьому тілі пацієнта (Таблиця 17). Лікування за допомогою РТН викликало значне підвищення ВМО у поперековому відділі хребетного стовпа, стегновій кістці та тазостегновому суглобі пацієнта (Таблиця 18). Підвищення у поперековому відділі хребетного стовпа, стегновій кістці та тазостегновому суглобі пацієнта було статистично значущим з р«е0,001 (Таблиця 18). Лікування за допомогою РТН викликало значне підвищення площі кісток поперековому відділі хребетного стовпа, стегновій кістці та тазостегновому суглобі пацієнта (Таблиця 19).

Згадане підвищення було статистично значущим для поперекового відділу хребетного стовпа та шийки тазостегнового суглобу (Таблиця 19).

Особливо значним є вплив РТН на тіло у цілому, кількісні та якісні параметри кісток та ВМС. Згаданий вплив на тіло у цілому вказує на те, що об'єм кісток у тілі пацієнта зростає. Наслідком лікування за допомогою

РТН є не просто переміщення кісткової маси з однієї частини тіла пацієнта до іншої. Навпаки, лікування за допомогою РТН підвищує об'єм та якість кісток у тілі пацієнта.

Фігури 9 та 10 ілюструють підвищення з часом ВМО поперекового відділу хребетного стовпа та ВМО шийки стегнової кістки/тазостегнового суглобу, відповідно, у пацієнтів, які одержують лікування за допомогою

РТН, та контрольних пацієнтів, які одержують плацебо. ВМО поперекового відділу хребетного стовпа пацієнту постійно зростає впродовж як мінімум приблизно 18 місяців з подальшою відсутністю або менш значним зростанням впродовж подальших місяців. ВМО стегнової кістки/тазостегнового суглобу пацієнта явно зростає впродовж як мінімум 18 місяців і може зростати у разі подальшого лікування за допомогою РТН.

Таблиця 17

Вплив РТН на вміст мінеральних речовин кісткової тканини, який виражено як кінцеву 95 різницю (середнє квадратичне відхилення) з вихідним рівнем 11111111 | Плацебо, | РТН-2О | РТН-40 | Значенняр

Стегнова кістка/ тазостегновий суглоб

Разом -0,38 (5,18) 3,50 (6,26) 4,78 (6,70) -0,001

Шийка -0,51 (7,06) 2,99 (7,26) 5,80 (8,71) -0,001

Вертелюг стегнової кістки 0,98 (14,97) 5,68 (15,58) 6,53 (15,33) -0,001

Міжвертелюжний -0,23 (6,28) 3,59 (7,32) 4,99 (7,79) -0,001

Трикутник Уорда 0,01 (14,75 5,36 (14,78 8,86 (17,02 -0,001

Зап'ястя

Ультрадистальний відділ -1,67 (7,44) -0,25 (6,53) -1,88 (7,97) 0,184 1/3 променевої кістки -1,19 (6,12 -1,37 (4,51 -3,04 (6,09 0,025

Таблиця 18

Вплив РТН на мінеральну густину кісткової тканини, яку виражено як кінцеву 95 різницю (середнє квадратичне відхилення) з вихідним рівнем 11111111 | Плацебо, | РТН-2О | РТН-ЯЮ | Значенняр

Стегнова кістка/ тазостегновий суглоб

Разом -1,01 (4,25) 2,58 (4,88) 3,60 (5,42) -0,001

Шийка -0,69 (5,39) 2,79 (5,72) 5,06 (6,73) -0,001

Вертелюг стегнової кістки -0,21 (6,30) 3,50 (6,81) 4,40 (7,45) -0,001

Міжвертелюжний -1,29 (4,53) 2,62 (5,52) 3,98 (5,96) -0,001

Трикутник Уорда -0,80 (11,73 4,19(11,93 7,85 (13,24 -0,001

Зап'ястя

Ультрадистальний відділ -1,89 (7,98) -0,05 (7,14) -1,76 (7,20) 0108 1/3 променевої кістки -1,22 (3,37 -1,94 (4,07 -3,17 (4,62 0,001

Таблиця 19

Вплив РТН на площу кістки, яку виражено як кінцеву 95 різницю (середнє квадратичне відхилення) з вихідним рівнем 11111111 | о Плацебо, | РТН-2о | РТН-ЯО | Значенняр

Стегнова кістка/ тазостегновий суглоб

Разом 0,54 (3,02) 0,84 (3,16) 1,05 (2,98) 0,144

Шийка 0,04 (4,60) 0,27 (4,91) 0,81 (5,56) 0,035

Вертелюг стегнової кістки 0,95 (12,75) 1,99 (12,16) 1,92(11,30) 0,197

Міжвертелюжний 1,01 (5,17) 1,01 (4,99) 1,01 (4,89) 0,964

Трикутник Уорда 0,44 (7,60 1,13 (7,34 0,99 (8,06 0,309

Зап'ястя

Ультрадистальний відділ 0,25 (6,40) -0,25 (6,00) -0,39 (4,80) 0,653 1/3 променевої кістки -0,02 (5,73 0,52 (3,40 0,01 (4,42 0,586

Узагальнено, дані, які було наведено перед тим, вказують, що пацієнт, який лікується за допомогою РТН, має зменшену кількість випадків перелому. Зокрема, лікування за допомогою РТН знизило більше ніж на 6690 кількість пацієнтів з попередніми вертебральними переломами, які постраждали від нових вертебральних переломів. Лікування за допомогою РТН знизило також більше ніж на 7895 кількість пацієнтів з попередніми вертебральними переломами, які постраждали від нових, множинних вертебральних переломів. На додаток до цього, РТН знижує тяжкість вертебральних переломів зі значним зниженням на 7890 кількості пацієнтів з помірними або тяжкими переломами. Пацієнти, які одержують РТН, мають вигоду унаслідок значного зменшення кількості випадків усіх невертебральних переломів (у тому числі переломів тазостегнового суглобу, променевої кістки, зап'ястя, тазу, стопи, плечової кістки, ребер або гомілковостопного суглобу) зі значущістю на рівні ре0,007. Підвищується також якість кісток. Пацієнти з попереднім переломом мають вигоду унаслідок значного підвищення вмісту мінеральних речовин кісткової тканини тазостегнового суглобу, хребетного стовпа та тіла у цілому. Це підвищення вказує на те, що зниження кількості випадків перелому на цих ділянках може мати місце уже через 12 місяців лікування.

Ці дані по переломам є першими даними по зниженню кількості випадків переломів за допомогою РТН у людей. Ці дані демонструють поліпшення якості та міцності кісток, як і передклінічні дані, які було наведено перед тим. Ці результати показують також вигоду підвищення якості та міцності кісток на невертебральних ділянках. Показники зменшення кількості випадків переломів, які підтримуються впродовж 18-23-місячного періоду лікування, раніше у клінічних або передклінічних дослідженнях не спостерігались.

До спроби перевірки на людях, чи забезпечує РТН самостійно підвищення твердості та міцності кісток з підвищенням стійкості до переломів, раніше не вдавались. У опублікованих літературних джерелах постійно вказується на те, що РТН повинен вводитись у комбінації з протирезорбційним засобом або естрогеном. До опублікованих клінічних іспитів раніше залучали надто малу кількість людей для визначення значного зниження кількості випадків переломів. Під час одного з досліджень переваги РТН не можна було оцінити, оскільки були відсутні плацебо-контролі. Під час другого дослідження, у якому було використано загальноприйняте визначення перелому, зменшення кількості випадків переломів не спостерігали.

Показники зменшення кількості випадків переломів на комбінованих невертебральних ділянках є особливо неочікуваними, приймаючи до уваги розповсюджену думку про те, що РТН негативно впливає на такі ділянки.

Суть розповсюдженої догми полягає у тому, що РТН підвищує пористість кортикального шару кістки, унаслідок чого ослабляє кістку, особливо на початковому етапі лікування. На додаток до цього ця догма стверджує, що ділянки кортикального шару кістки піддаються підвищеному ризику перелому і що РТН не забезпечує зниження кількості випадків переломів на невертебральних ділянках. Та ж сама догма стверджує також, що

РТН самостійно навряд чи може бути ефективним і потребує одночасної протирезорбційної терапії для блокування негативного впливу на кортикальний шар кістки. Одержані дані демонструють переваги РТН, які раніше не спостерігались, у разі введення його пацієнту, який додатково одержує вітамін ЮО та кальцій.

Неочікувано, РТН зміцнює кістки зі зниженням кількості випадків нових переломів у пацієнта, який знаходиться у стані ризику виникнення множинних переломів хребетного стовпа, у стані ризику виникнення додаткових невертебральних переломів, у стані ризику виникнення від помірних до тяжких додаткових переломів хребетного стовпа тощо.

Результати клінічного дослідження на постклімактеричних жінках показали особливу вигоду лікування пацієнтів малими дозами (20мкг/день), оскільки дозу РТН (який у великих дозах може мати побічні ефекти у деяких пацієнтів) було знижено, зі збереженням однак здатності до запобігання переломів та зниження кількості випадків переломів; подібний ефект спостерігається і у разі застосування високої дози (4Омкг/день).

Дані, які було одержано на мавпах за допомогою поляризаційного інфрачервоного електронного мікроскопу з перетворенням Фур'є, надали можливе, однак не обмежувальне, механістичне пояснення. Результати дослідження на мавпах показують, що РТН у малих дозах підвищує утворення кристалів та прискорює мінералізацію кортикального шару кісток. На додаток до цього, мавпи, які одержували малі дози, мали додаткову вигоду після припинення введення РТН, оскільки останній підвищує вміст мінеральних речовин кісткової тканини. Одержані дані демонструють нову вигоду, яка полягає у тому, що введення малих доз РТН пацієнтам, які додатково одержують вітамін ОО та кальцій, забезпечує ефективне запобігання як вертебральних, так і невертебральних переломів. У протилежність розповсюдженій думці, РТН зміцнює кістки на невертебральних ділянках з запобіганням нових переломів або знижує тяжкість переломів, ймовірно шляхом підвищення мінералізації та вмісту мінеральних речовин кісткової тканини.

Опис цього винаходу було наведено з посилання на різні специфічні та переважні варіанти втілення та методики. Слід зрозуміти, однак, що можливо здійснити численні варіанти та модифікації, та залишитись у межах духу та обсягу цього винаходу. Усі публікації та заявки на патенти у цьому описі свідчать про рівень пересічного професіоналізму у тій галузі, до якої належить цей винахід.

ФІГ. ІА А. Діафіз стехнової кістки я ВМО ж з ж 1200 пт Х-площа і "ВМО ер 1000 є

І. 8 - ї 800. Е

Я | -ї е о. 40 Її ! І аю аг же в 30 А ПУ ни : і І ар г | Ії і й з у л сх і о Ю . 4 о 10 40

Доза РЕН(ИІ-34) (мкг/кт/вень) Доза РІТНІ-34) (мко/кг/день -

ФІ Г . І! В В. Проксимальний вілділ стеунової кістки 144 сіні - 4.5 я г вМе вою 0.35 ї ГУ, Плоша проекції 124 авмМмо стен Гр оз 35

В лу й як! й Го25 Б З -08 роз 8000525 . - те ку. 0, | 015 дж 5 не як во 0.4. і. Х ол в т. ба: 7 0.05 0.5

ПІ сі па А а 0 Й 0. ши ж 40 . а то 30

Я й Доза ГНЕ) сякгктудень Доза РТ: Н(1-34) (міхуюудень)

Фіг. А А РІГ. 2В в ве Пиквиеня сил А гл - врд С бинакть 16 я - 23 МЕЖА міцності й ! Ай Га МодульпРУжностяк 14 га тою 5 1 гй ша що 0: и ер - я

І їн Й роз ; я ш дочое 7 7 і 5 або д а о Е : - З щ я в зе| Я ХА в 3ю ІІ" «НИ - мою 5 Е 5 в 2097 1 : « то ов В . ї А Дію се Б. ою 7 Х 5 йю Х я а «а 2 й й А с 0 - о лю 40 о тю 40

Доза ВТНО -34) (мкг/кг/лень) Доза ВТРЦІ-343 (мкт/ктудені)

Фіг. сс Фіг. 205

Е бос Грроботе до руйнування в 35 Кз 160 г мів «

Я Ударна в'язкість ; 3 В Кая 146 що ЗО й ; 75 СЗШ й

Е р ра й в в МОЯ жо 5 | зо ЦЮ що ЗХ ! | 158 ва

Я г шЕ в 200 Твоя дя

Го 7 не а -к 3 0

В до. БА 1 і. 5 сш - 5 4 0 юю ШИ НІ іо 40

Лоза РТН(1-343 (мкт/кгудень) Доза РІНСІ-34) (мкг/кту/венв

Ї ту

ФІГ. З

Вміст мінеральних речовин кісткової тканини. тіла у щілому: -- Симульовацо оперовані 55 29 зейня Суваріосктомізовані к -- Низько о 18 5 І о-на- Низька-у 8 вро Висока чех в зо зник тт --- Висока я

Бе

З ? рос Й 5 м т і ; я х і Порівняння з ва 5 | 5. де оваріосстомі знаними де -- вав 04 і | ее рх 01 що аж о 5 т 455 18 р .001

Місяці

ВіДСоткКоОвА ЗМІНА ПАРАМЕТРІВ ПОДВІЙНОЇ : ЕНЕРГЕТИЧНОЇ АБСОРБШНОМЕТРІЇ ХРЕБЕТНОГО СТОВИХ : Плоці тіла поперекових хребців 2-4 -о- зЗпапт яв МК 5 1 -- РТНІ

З З Ї І рт ФІ А РТМ

Я ач І ки он

З Н сов, ; я 34 дже ко а РТНІМУ

В 7 4 си а рен шЕ 7 Лорівняння сх : В і я , оваріозктомізованими

Ши ША Ина и ! "веб й " ке зі « ДІ - ; жах р « о б 6 12 18 | і

ФІГ. ав Вміст мінеральних печовин кісткової те вині: ДЗКЕКОЄ -- Зате" пканини поперекових хребтів 2-5

Пенн нн ОУХ ; їй те РІНЕЄ " "ж З РТНІМее 8 5 ді Та» РТНВия и 5 і де а рІНЯДДяя в о т т 7-0

З ЖЕ секти і Порівилиня з 5 8 Е з ис оваріоєктомізопаними

З й є се й ж. «

В ран ак ш оче ; і й ! ре о : я Р « 0 й 5 т 8

: ФІГ . 1С Мінеральна густина кісткової тканини хз . : поперекових кребнів 2-4 -а- лат їв і " і ОМ 14. : | я РІНІ де (тА РТНІМИ

Ще о ) яеРІНЕЄ

Я я в ж, | ев ВТуоад :

В, " І Порівняння

Б З т 7 | оварізектом ваними : й 4 : | Ш ре -й - вед в В 12 78

Е З Кісткова мзса - ї 25

БЕ 5 ї : 40 ! знов Заг

Як «ве ОУХ ОМ

В 5 а

Б а сосовфунсяс ТВ - - о вже. ок й І

БЕ я нен РТНБАУ око -Б

Е о б 12 5 8

Місянпі лікування

ФІГ. 5А

Міцність кістки 2500 І жж 2а00- ж | х 1500 ре пк ! ! в ї -- 1006 і в і і о я ват ОМХ-АМ РТНЬ РТНБАУ

Мінність шийки 1500 Ж ж т і т гу ій 12504 7 ши т ш ше п 3000 ! 750 | . ! вро пр

ЗБат Зх СМх-Вв Дух-вАМ

Міцність середи частини діафізу плечової кістки во т КИ

От т т вч 400. ! м, р 2 400. пі ! и 200- У т, о С ГА,

Знат 0Уих-У ОМХв ОМАРА

ФІГ. В

Утворення поверхні кортикального шару хісккиа; діафіз плечової кістки

Й тіні ом ве ів

Х пихи й

Ух РЬ ІІІ Кс з

ВИДИ

І І і

ОУХ-РІМУ ур

Ох ни ендостильний, 18 місяців сно п періостальнуй, 18 місяов

ОУХ М папи ит ЕДИА нн ши

УКВ ендосталіьний, 15 місяців

І З зпат уут урамі- 2 періостальний, ІЯ місядія 0 Ю 70 Зо 40

Ніввдкість остеосенезу, ВЕН

ФІГ " 8 Оюб'єднавмі гістоєрами 0. 030 Метр ; -- ; о | --я лікарський засіб Е 1025 Щі ра зно- опарівектомізовані рі і х шин ПрРИЗИцБЕННЯ ЛІЕУВаНИЯ о.о20-;ЙІ " ху ши я п а а

Б ос іх .

ЕЕ ! / Ле» г і , , В 5 . оно / ее де Х : й - ; ; ц І. й р Х їх й ТУбчаста Й Лідян ка ї у 9.005 М речовина кістки | нестабільності Ко тикаль М ле) І ра кістки ц

О.О тя : ; зн А ї о я4бо 200 300 400 5О0 8ООо 700 800 900 1000 1100 1200

Густина (мг/єми)

ТМінеральна густина кісткової ткавнни пепсроколого відділу 18 хребетного стовий.

Ж ча ; т. - ї

Е т я що В ; я о 4 ; 2 в Ша ше вв й

З і

Е 4 я в і лю е -5 понти 5 ія та 15 - й

Місяці 20 25

ТО Плацебо «е-ВТНОВ нак РТНаВ ши Мінеральна туствна кісткової тканинв стегнової кістки шийки 7 тазостегнового суглобу в !

Е ; 5 - ; ва щш р я ї 7 ; 33 - | ; в | , 1 в

У й я ре е то ро 2 й з -ї З і" 10 15 20 25

Й Місяпі

Г-е- Пляцебо «а РТНІЮ те-РТНАО

Claims

1. Спосіб зниження ризику перелому водночас як хребця, так і невертебральної кістки у людини, яка знаходиться у стані ризику виникнення остеопорозу або має остеопороз, який включає введення зазначеній людині людського РТН(1-34) без паралельного введення протирезороційного агента, відмінного від вітаміну Ю або кальцію, у денній дозі, яка складає від 20 мкг до 40 мкг.

2. Застосування паратиреоїдного гормону, до складу якого входить амінокислотна послідовність 1-34 людського паратиреоїдного гормону, для виготовлення лікарського засобу для зниження ризику перелому водночас як хребця, так і невертебральної кістки у постклімактеричної жінки, яка знаходиться у стані ризику виникнення остеопорозу або має остеопороз, де зазначений лікарський засіб вводять зазначеній жінці без паралельного введення протирезороційного агента, відмінного від вітаміну Ю або кальцію, у денній дозі, яка складає від 20 мкг до 40 мкг, впродовж від принаймні близько 12 місяців до 3 років.

3. Застосування за п. 2, яке відрізняється тим, що зазначена денна доза складає 20 мкг.

4. Застосування за п. 2, яке відрізняється тим, що зазначена денна доза вводиться впродовж принаймні близько 24 місяців.

5. Застосування за п. 2, яке відрізняється тим, що зазначений лікарський засіб поміщений у пакувальний матеріал, який має друкований напис, який повідомляє про те, що зазначений лікарський засіб є придатним для зниження ризику перелому водночас як хребця, так 1 невертебральної кістки у постклімактеричної жінки, яка знаходиться у стані ризику виникнення остеопорозу або має остеопороз, при його введенні зазначеній жінці у такий спосіб, що зазначений паратиреоїдний гормон вводиться без паралельного введення протирезорбоційного агента, відмінного від вітаміну Ю або кальцію, у денній дозі, яка складає від 20 мкг до 40 мкг, впродовж від принаймні близько 12 місяців до 3 років.

б. Застосування за будь-яким з пп. 2-5, яке відрізняється тим, що зазначена людина має остеопороз.

7. Застосування людського РТН(1-34) для виготовлення лікарського засобу для зниження ризику перелому невертебральної кістки у людини, яка знаходиться у стані ризику виникнення остеопорозу або має остеопороз, де зазначений паратиреоїдний гормон вводять зазначеній людині без паралельного введення протирезороційного агента, відмінного від вітаміну І або кальцію, у денній дозі, яка складає від 20 мкг до 40 мкг.

8. Застосування за п. 7, яке відрізняється тим, шо зазначена людина знаходиться у стані ризику виникнення остеопорозу або має остеопороз, який є наслідком пов'язаного з віком гіпогонадного стану.

9, Застосування за п. 8, яке відрізняється тим, що зазначеною людиною є постклімактерична жінка.

10. Застосування за будь-яким з пп. 7-9, яке відрізняється тим, що зазначена людина має остеопороз.

11. Застосування за будь-яким з пп. 7-10, яке відрізняється тим, що зазначений лікарський засіб вводять впродовж від принаймні близько 12. місяців до 3 років.

12. Застосування за п. 7, яке відрізняється тим, що зазначена денна доза складає 20 мкг.

13. Застосування за п. 7, яке відрізняється тим, що зазначена денна доза вводиться впродовж принаймні близько 24 місяців.

14. Застосування за п. 7, яке відрізняється тим, що зазначений лікарський засіб поміщений у пакувальний матеріал, який має друкований напис, який повідомляє про те, що зазначений лікарський засіб є придатним для зниження ризику перелому невертебральної кістки у людини, яка знаходиться у стані ризику виникнення остеопорозу або має остеопороз, при його введенні зазначеній людині у такий спосіб, що зазначений паратиреоїдний гормон вводиться без паралельного введення протирезорбційного агента, відмінного від вітаміну Ю або кальцію, у денній дозі, яка складає від 20 мкг до 40 мкг.

15. Застосування людського РТН(1-34) для виготовлення лікарського засобу для підвищення твердості кортикального шару кістки людини, яка знаходиться в стані ризику виникнення остеопорозу або має остеопороз, де зазначений паратиреоїдний гормон вводять зазначеній людині без паралельного введення проти резорбційного агента, відмінного від вітаміну І або кальцію, у денній дозі, яка складає від 20 мкг до 40 мкг.

16. Застосування за п. 15, яке відрізняється тим, що згадана людина знаходиться у стані ризику виникнення остеопорозу або має остеопороз, який є наслідком пов'язаного з віком гіпогонадного стану.

17. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що зазначеною людиною є постклімактерична жінка.

18. Застосування за будь-яким з пп. 15-17, яке відрізняється тим, що зазначена людина має остеопороз.

19. Застосування за будь-яким з пп. 15-18, яке відрізняється тим, що зазначений лікарський засіб вводять впродовж від принаймні близько 12. місяців до 3 років.