TW201946934A

TW201946934A - 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法

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Publication number: TW201946934A
Application number: TW108131956A
Authority: TW
Inventors: 愛利歐波維尼; 保羅摩爾; 強納森李; 萊斯利強生; 坎帕納尚
Original assignee: 美商宏觀基因股份有限公司
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2019-12-16
Also published as: KR20170012347A; TW201625696A; EP3152235A1; CA2950008A1; NZ726520A; IL249266B; EA201692504A1; US20170198045A1; TW201945399A; AU2019204236B2; PE20170766A1; US20200199223A1; SG10201913680PA; CN113416252A; SG11201609917PA; JP6647222B2; BR112016027912A2; US10647768B2; AU2019204236A1; AU2015266797B2

Abstract

一種三特異性結合分子具有三個結合結構域的多鏈多肽分子，因此能夠介導與三個表位的協同結合。三特異性結合分子可具備允許其免疫特異性結合以下表位元的結合結構域：(1) 第一癌症抗原的表位、(2) 第二癌症抗原的表位和(3) 在免疫系統效應細胞的表面上表達的分子的表位，因此能夠將免疫系統效應細胞定位至表達癌症抗原的細胞，以便從而利於殺傷癌症細胞。

Description

特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法

一種三特異性結合分子，其是具有三個結合結構域的多鏈多肽分子，因此能夠介導與三個表位的協同結合。三特異性結合分子可具備允許其免疫特異性結合以下表位元的結合結構域：(1) 第一癌症抗原的表位、(2) 第二癌症抗原的表位和(3) 在免疫系統效應細胞的表面上表達的分子的表位，因此能夠將免疫系統效應細胞定位至表達癌症抗原的細胞，以便從而利於殺傷癌症細胞。

哺乳免疫系統

哺乳動物免疫系統用作抵抗各種病況，包括例如損傷、感染和瘤形成的防禦。人和其他哺乳動物發展對病原體、外源物質和癌症抗原的免疫應答的效率取決於兩個特徵：對抗原識別的免疫應答的精巧的特異性和當用相同的抗原再啟動時允許更快和更強力應答的免疫記憶(參見Portolés, P.等(2009) “The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination ,” Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300；Guy, C.S.等(2009) “Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex ,” Immunol Rev. 232(1):7-21)。

哺乳動物免疫系統由下述兩個分開但是相互關聯的系統介導：細胞和體液免疫系統。一般而言，體液系統由可溶性產物(抗體或免疫球蛋白)介導，可溶性產物具有結合並中和被系統識別為身體外源的產物的能力。相反，細胞免疫系統涉及動員某些細胞，稱為“T細胞”，其具有各種治療作用。T細胞是淋巴細胞，其源自胸腺，並且在組織、淋巴系統和循環系統之間迴圈。回應外源結構(抗原)的存在和識別，T細胞被“啟動 (activated)”，以啟動免疫應答。在許多情況下，這些外源抗原由於瘤形成或感染而在宿主細胞上表達。儘管T細胞它們本身不分泌抗體，但是它們對於通過第二類淋巴細胞——B細胞(其源自骨髓)的抗體分泌通常是必要的。關鍵地，T細胞展示非凡的免疫特異性，以便能夠區分一個抗原與另一個抗原)。兩種類型的T細胞——“T輔助細胞”和“細胞毒性T細胞”尤其相關。

T輔助細胞特徵在於它們的糖蛋白，CD4的表達(即，它們是“CD4⁺ ”)。CD4⁺ T細胞是大部分哺乳動物免疫和自體免疫應答的主要組織者(參見Dong, C.等(2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules ,” Immunolog. Res. 28(1):39-48)。已經發現CD4⁺ T細胞的啟動通過排列於抗原呈遞細胞(比如B細胞、巨噬細胞或樹突細胞)的表面上的抗原：II類主要組織相容性(major histocompability class II，MHC II )分子複合物和排列於初始CD4⁺ T細胞的表面上的兩個分子——T細胞受體(T Cell Receptor，“TCR ”)和CD3 細胞表面受體配體的複合物之間的共刺激相互作用而被介導。啟動的T輔助細胞能夠增殖成Th1細胞，其能夠介導對靶細胞的炎症反應。

細胞毒性T細胞特徵在於它們對CD8 的表達(即，它們是“CD8+”以及CD3⁺ )。已經發現CD8⁺ T細胞的啟動通過排列於靶細胞的表面上的抗原：I類主要組織相容性(major histocompability class I，MHC I )分子複合物和排列於CD8⁺ T細胞表面上的CD8和T細胞受體複合物之間的共刺激相互作用而被介導。與僅僅由某些免疫系統細胞表達的MHC II分子不同，MHC I分子被非常廣泛地表達。因此，細胞毒性T細胞能夠結合各種細胞類型。啟動的細胞毒性T細胞通過它們釋放細胞毒素穿孔蛋白、粒酶和粒溶素(granulysin)而介導細胞殺傷。通過穿孔蛋白的作用，粒酶進入靶細胞的細胞質，並且它們的絲氨酸蛋白酶功能觸發胱天蛋白酶級聯，其是最終導致靶細胞的細胞凋亡(程式性細胞死亡)的一系列半胱氨酸蛋白酶。

T細胞受體(“TCR”)是α和β鏈的共價連接的異源二聚體(“TCRαβ”)。這些鏈是長度為259 (α)和296 (β)個氨基酸的I類膜多肽。CD3分子是T細胞共受體，由五條不同的多肽鏈組成(CD3 γ鏈、CD3 δ鏈、兩條CD3 ε鏈和兩條ζ鏈)。獨立的多肽鏈締合，以形成三個二聚體的複合物(εγ、εδ、ζζ) (參見Wucherpfennig, K.W.等(2010) “Structural Biology Of The T Cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation of Signaling ,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140；1-14頁；Chetty, R.等(1994) “CD3: Structure, Function And The Role Of Immunostaining In Clinical Practice ,” J. Pathol. 173:303-307；Guy, C.S.等(2009) “Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex ,” Immunol Rev. 232(1):7-21；Call, M.E.等(2007) “Common Themes In The Assembly And Architecture Of Activating Immune Receptors ,” Nat. Rev. Immunol. 7:841-850；Weiss, A. (1993) “T Cell Antigen Receptor Signal Transduction : A Tale Of Tails And Cytoplasmic Protein-Tyrosine Kinases ,” Cell 73:209-212)。CD3複合物與TCR結合以便在T淋巴細胞中產生啟動信號。在缺少CD3的情況下，TCR不能適當組裝，並被降解(Thomas, S.等(2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T Cell Receptor Gene Transfer ,” Immunology 129(2):170–177)。發現CD3結合所有成熟T細胞的膜，並且事實上不結合其他細胞類型的膜(參見Janeway, C.A.等(2005)在以下中：Immunobiology: THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE,”第6版，Garland Science Publishing, NY, 214-216頁；Sun, Z. J.等(2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer ,” Cell 105(7):913-923；Kuhns, M.S.等(2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex ,”Immunity. 2006年2月；24(2):133-139)。

TCR和CD3複合物以及CD3 ζ鏈ζ鏈(也稱為T細胞受體T3 ζ鏈或CD247)包括TCR複合物(參見van der Merwe, P.A.等(2010年12月3日電子公開) “Mechanisms For T Cell Receptor Triggering ,” Nat. Rev. Immunol. 11:47-55；Wucherpfennig, K.W.等(2010) “Structural Biology Of The T Cell Receptor : Insights into Receptor Assembly , Ligand Recognition , And Initiation of Signaling ,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140)。複合物非常重要，因為其包含大量的(十個)免疫受體酪氨酸基的啟動基序(ITAMs)。

兩種相互作用對於T細胞啟動是必要的(參見Viglietta, V.等(2007) “Modulating Co-Stimulation ,” Neurotherapeutics 4:666-675；Korman, A.J.等(2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy ,” Adv. Immunol. 90:297-339)。在第一相互作用中，細胞必須展示結合細胞主要組織相容性複合物的相關靶抗原，從而其可結合初始T淋巴細胞的T細胞受體(“TCR”)。在第二相互作用中，細胞的配體必須結合T淋巴細胞的共受體(參見Dong, C.等(2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules ,” Immunolog. Res. 28(1):39-48；Lindley, P.S.等(2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation ,” Immunol. Rev. 229:307-321)。經歷兩種刺激信號的T細胞然後能夠響應細胞因數(比如白介素-2和白介素-12)。在TCR結合期間缺少兩種共刺激信號的情況下，T細胞進入功能上無應答的狀態，稱為克隆無能(參見Khawli, L.A.等(2008) “Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors ,” Exper. Pharmacol. 181:291-328)。在病理學狀態下，T細胞是各種器官特異性自身免疫性疾病，比如I型糖尿病、類風濕性關節炎和多發性硬化症的關鍵參與者(參見Dong, C.等(2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules ,” Immunolog. Res. 28(1):39-48)。

認為啟動T細胞需要兩種信號以便它們實現適應性免疫應答提供了這樣一種機制：避免對在系統中其可能被T細胞識別的位置可能存在於抗原呈遞細胞上的自體抗原的應答。在T細胞與細胞的接觸導致產生兩種必要的信號中的僅僅一種信號的情況下，T細胞不被啟動並且不發生適應性免疫應答。

抗體和其他結合表位的分子

A. 抗體

“抗體 ”是免疫球蛋白分子，其能夠通過位於免疫球蛋白分子的可變結構域中的至少一個抗原識別位點特異性結合靶，比如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等。如本文所使用，該術語不僅僅包括完整的多克隆或單克隆抗體、駱駝源化(camelized)抗體、單鏈抗體和抗特應(抗Id)抗體(包括，例如，本發明任一實施方式的抗體的抗Id和抗抗Id抗體)，而且也包括其突變體、天然存在的變異、包括具有需要的特異性的抗原識別位元點的抗體部分的融合蛋白、人源化的抗體、和嵌合抗體、以及包括具有必要特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾結構。遍及本申請，抗體輕鏈和重鏈的氨基酸殘基的編號是根據EU索引，如在以下中：Kabat等(1992) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，國立衛生研究院公開號91-3242。如本文所使用，“抗體的抗原結合片段”是抗體的具有至少一個抗原識別位元元元點的部分。如本文所使用，該術語包括片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)₂ Fv)、二硫連接的雙特異性Fvs (sdFv)，胞內抗體（intrabody）和單鏈分子(例如，scFv)。尤其地，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含抗原結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以屬於任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。

天然抗體(比如IgG抗體)由與兩條重鏈 (Heavy Chains)複合的兩條輕鏈 (Light Chains)組成。每條輕鏈包含可變結構域(Variable Domain)(VL )和固定結構域(Constant Domain)(CL )。每條重鏈包含可變結構域(Variable Domain)(VH )、三個固定結構域(Constant Domain)(CH1 、 CH2 和CH3 )和位於CH1和CH2結構域之間的鉸鏈結構域。因此，天然存在的免疫球蛋白(例如，IgG)的基礎結構單元是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體，通常表示為約150,000 Da的糖蛋白。每條鏈的氨基-末端(“N”)部分包括具有約100至110或更多個氨基酸的可變區，其主要負責抗原識別。每條鏈的羧基末端(“C”)部分限定固定區，其中輕鏈具有單個固定結構域和重鏈通常具有三個固定結構域和鉸鏈區。因此，IgG分子的輕鏈結構是n-VL-CL-c和IgG重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中H是鉸鏈區，並且n和c分別表示多肽的N-末端和C-末端)。

完整的、未修飾的抗體(例如，IgG抗體)結合抗原的表位的能力取決於免疫球蛋白輕鏈和重鏈上是否存在可變結構域(即，分別為VL結構域和VH結構域)。抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用，尤其地，其VL和VH結構域的相互作用形成抗體的表位結合位點中的一個。IgG分子的可變區由互補決定區(complementarity determining region，CDR )和非CDR區段組成，互補決定區(CDR)包含接觸表位的殘基和非CDR區段被稱為框架區段(framework segment，FR )，其一般維持結構和確定CDR環的定位，以便允許這樣的接觸(儘管某些框架殘基也可接觸抗原)。因此，VL和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。作為(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDR_L 1 結構域、 CDR_L 2 結構域 和CDR_L 3 結構域 。類似地，作為(或可用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDR_H 1 結構域、 CDR_H 2 結構域 和CDR_H 3 結構域 。因此，術語CDR_L 1結構域、CDR_L 2結構域、CDR_L 3結構域、CDR_H 1結構域、CDR_H 2結構域和CDR_H 3結構域指多肽，其在摻入到蛋白質中時，使得蛋白質能夠結合特異性表位，無論這樣的蛋白質是否是具有輕鏈和重鏈的抗體或雙抗體或單鏈結合分子(例如，scFv，BiTe等)，或是另一類型的蛋白質。與這樣的抗體相反，scFv構建物包括包含在單個多肽鏈中的抗體的VL和VH結構域，其中結構域被足夠長的靈活接頭分開，允許兩個結構域自組裝成功能性表位結合位點。在由於不足長度的接頭(小於約12個氨基酸殘基)而導致VL和VH結構域的自組裝是不可能的情況下，兩個scFv構建物可彼此相互作用形成二價分子，其中一條鏈的VL締合另一條鏈的VH(參見Marvin等(2005)“Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658)。

除了它們在診斷中的已知用途，已經顯示抗體可用作治療劑。過去數十年已經看到對抗體治療潛能的興趣的復興，並且抗體已經成為一類重要的源自生物技術的藥物(參見Chan, C.E.等(2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases ,” Singapore Med. J. 50(7):663-666)。接近200種基於抗體的藥物已經被批准使用或正在開發。

術語“單克隆抗體 (monoclonal antibody)”指同質性(homogenous)抗體群體，其中單克隆抗體由參與抗原的選擇性結合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)組成。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個表位(或抗原位點)。術語“單克隆抗體”不僅僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且也包括其片段(比如Fab、Fab’、F(ab’)₂ Fv)、單鏈(scFv)，其突變體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括具有必要特異性和結合抗原能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾結構。就抗體來源或製備其的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)而言不期望受到限制。該術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據定義“抗體”描述的片段。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler, G.等的方法(1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity ,” Nature 256:495-497或其改良方法。典型地，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用包含期望的表位的免疫原量的細胞、細胞提取物或蛋白製品免疫動物而產生抗體。免疫原可以是，但不限於原代細胞、培養的細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可培養一段時間(例如，至少24小時)，然後它們用作免疫原。細胞可通過它們本身或結合非變性佐劑比如Ribi用作免疫原(參見Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production ,” ILAR J. 37(3):119-125)。

一般而言，當用作免疫原時，細胞應保持完整和優選地能存活。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫的動物更好地檢測。變性或烈性佐劑，例如，弗氏佐劑的使用，可使細胞破裂，因此，其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以維持在動物(例如，在組織重組體中)中的生存力這樣的方式被施用。可選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其他等價抗體可被測序並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方式中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆至載體用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞中保持在載體中，並且，可然後擴張和冷凍宿主細胞用於將來的使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可被用於遺傳操作，以產生嵌合抗體、人源化的抗體或犬源化(caninized)的抗體，或改善抗體的親和性，或其他特徵。術語“人源化的 ”抗體指一般使用重組技術製備的嵌合分子，其具有源自來自非人物種的免疫球蛋白的抗原結合位點和基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的分子的剩餘的免疫球蛋白結構。這樣的抗體的可變結構域的多核苷酸序列可用於遺傳操作，以產生這樣的衍生物和改善這樣的抗體的親和性，或其他特徵。人源化抗體的一般原理涉及保留抗體的抗原結合部分的基礎序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。使單克隆抗體人源化大體上有四個步驟。這些是：(1)測定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列(2)設計人源化的抗體或犬源化的抗體，即，確定在人源化或犬源化過程期間使用哪個抗體框架區(3)實際人源化或犬源化方法/技術和(4)轉染和表達人源化的抗體。參見，例如，美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。

這樣的抗體的表位元結合結構域可包括融合在固定結構域上的完整可變結構域或僅僅包括移植在可變結構域中適當的框架區上的互補決定區(CDR)。抗原結合位點可以是野生型的或被一個或多個氨基酸取代而修飾。這消除了固定區在人個體中作為免疫原，但是仍存在對外源可變區的免疫應答的可能性(參見LoBuglio, A.F.等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (美國) 86:4220-4224)。另一方法不僅僅關注提供源自人的固定區，而且也修飾可變區以便重塑它們盡可能接近人形式。已知重鏈和輕鏈二者的可變區包含三個互補決定區(CDR)，其回應所討論的抗原而改變並且決定結合能力，其由四個框架區(FR)側接，此框架區在給定的物種中相對保守並且推測為CDR提供支架材料(scaffolding)。當就具體的抗原製備非人抗體時，可變區可通過將源自非人抗體的CDR移植在待修飾的人抗體中存在的FR上被“重塑”或”人源化”。下述文獻已經報導了此方法應用於各種抗體：Sato, K.等(1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等(1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation ,” Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等(1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity ,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等(1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (美國) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等(1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo ,”Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等(1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (美國) 88:2869-2873；Carter, P.等(1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (美國) 89:4285-4289；和Co, M.S.等(1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen ,” J. Immunol. 148:1149-1154。在一些例子中，人源化的抗體保留所有的CDR序列(例如，包含來自小鼠抗體的所有六個CDR的人源化的小鼠抗體)。在其他例子中，人源化的抗體具有序列相對於原始抗體不同的一個或多個CDR (一、二、三、四、五或六個)。

已經描述了包括源自非人免疫球蛋白的抗原結合位點的許多“人源化的”抗體分子，包括具有齧齒動物或修飾的齧齒動物V區域和它們締合的融合至人固定結構域的互補決定區(CDR)的嵌合抗體(參見，例如，Winter等(1991) “Man-made Antibodies, ” Nature 349:293-299；Lobuglio等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man : Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (美國) 86:4220-4224 (1989)，Shaw等(1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen ,” J. Immunol. 138:4534-4538和Brown等(1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody ,” Cancer Res. 47:3577-3583)。其他參考文獻描述齧齒動物CDR移植到人支撐框架區(FR)中，然後與適當的人抗體固定結構域融合(參見，例如，Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies : Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；和Jones等(1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse ,” Nature 321:522-525)。另一參考文獻描述由重組形成的(veneered)的齧齒動物框架區支撐的齧齒動物CDR。參見，例如，歐洲專利公開號519,596。這些“人源化的”分子被設計，以使對齧齒動物抗人抗體分子的有害的免疫應答最小化，其限制了這些部分在人接受者中的治療性應用的持續時間和效力。也可使用的人源化抗體的其他方法由下述文獻公開：Daugherty等(1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins ,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476和美國專利號6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。

B. 雙特異性抗體、多特異性雙抗體和DART™雙抗體

天然抗體僅僅能夠結合一個表位種類(即，它們是“單特異性的”)，儘管它們可能夠結合該種類的多個拷貝(即，它們可展示二效價或多效價)。已經開發了各種重組雙特異性抗體形式(參見，例如，PCT公開號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)，其大部分使用接頭肽，以將抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合至抗體核心的或其中的進一步結合的蛋白(例如，scFv，VL VH等)，或融合多個抗體部分或將(例如兩個Fab片段或scFv)融合至異源二聚化-促進結構域比如CH2-CH3結構域或可選的多肽(參見WO 2005/070966、WO 2006/107786A WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。典型地，這樣的方法涉及折中和權衡。例如，PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了接頭的使用可在治療情形中引起問題，並且教導了三特異性抗體，其中CL和CH1結構域由它們各自的天然位置被交換以及VL和VH結構域已經被多樣化(參見WO 2008/027236、WO 2010/108127)，以允許它們結合多於一個抗原。因此，這些文件中公開的分子用結合特異性換取結合另外抗原種類的能力。PCT公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域，以包含包括結合結構域的融合蛋白加合物。文件敘述了CH2結構域可能在介導效應子功能中僅起到最小的作用。PCT公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了重組抗體，其Fc結構域已經用另外的VL和VH結構域取代，以便形成三價結合分子。PCT公開號WO 2003/025018和WO2003012069公開了重組雙抗體，其單條鏈包含scFv結構域。PCT公開號WO 2013/006544公開多價Fab分子，其作為單條多肽鏈被合成並且然後進行蛋白酶解以產生異源二聚結構。因此，這些文件中公開的分子用所有或一些介導效應子功能的能力換取結合另外抗原種類的能力。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了添加另外的結合結構域或官能團至抗體或抗體部分(例如，添加雙抗體至抗體的輕鏈，或添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈，或添加異源融合蛋白或彼此連接的多個Fab結構域)。因此，這些文件中公開的分子用天然抗體結構換取結合另外的抗原種類的能力。

現有技術已經另外敘述了產生雙抗體的能力，雙抗體與這樣的天然抗體的不同之處在於能夠結合兩個或更多個不同表位種類(即，除了雙效價或多效價之外還展示雙特異性或多特異性) (參見，例如，Holliger等(1993) “‘Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, ” Proc. Natl. Acad. Sci. (美國) 90:6444-6448；US 2004/0058400 (Hollinger等)；US 2004/0220388 (Mertens等)；Alt等(1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D.等(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；WO 02/02781 (Mertens等)；Olafsen, T.等(2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications ,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27；Wu, A.等(2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single-chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange ,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A.等(2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944)。

雙抗體的設計是基於單鏈可變結構域片段(single-chain Variable Domain fragment，scFv)的結構。這樣的分子通過經短連接肽彼此連接輕鏈和/或重鏈可變結構域而製備。Bird等(1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins, ” Science 242:423-426)描述了連接肽的例子，其在一個可變結構域的羧基末端和另一可變結構域的氨基末端之間橋跨約3.5 nm。已經設計和使用了其他序列的接頭(參見Bird等(1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins, ” Science 242:423-426)。接頭可進而被修飾用於另外的功能，比如藥物的附著或附著至固體載體。可經重組或經合成產生單鏈變異。對於合成產生scFv，可使用自動合成儀。對於重組產生scFv，包含編碼scFv的多核苷酸的適當質粒可被引入適當的宿主細胞——真核細胞比如酵母細胞，植物細胞，昆蟲細胞或哺乳細胞，或原核細胞比如大腸埃希氏菌(E. coli )大腸埃希氏菌。編碼scFv的多核苷酸可通過常規的操作比如多核苷酸的連接而製備。所得scFv可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離。

美國專利號7,585,952和美國專利公開號2010-0173978涉及對ErbB2免疫特異性的scFv分子。已經描述了雙特異性T細胞連接子(Bi-specific T cell engager，“BiTEs ”)，其是一類scFv分子(參見WO 05/061547；Baeuerle, P等(2008) “BiTE: A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells ,” Drugs of the Future 33: 137-147；Bargou, 等2008) “Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody ,” Science 321: 974-977)。這樣的分子由具有兩個抗原結合結構域的單個多肽鏈分子組成，其中一個抗原結合結構域免疫特異性結合CD3表位和其第二個免疫特異性結合靶細胞表面上存在的抗原。

提供非單特異性雙抗體提供了明顯的優勢：共連接和共定位表達不同表位的細胞的能力。二價雙抗體因此具有寬的應用範圍，包括治療和免疫診斷。二價允許在各種應用中在設計和工程化雙抗體時更大的靈活性，提供對多聚體抗原的增強的抗體親抗原性，交聯不同的抗原，和依賴於兩個靶抗原的存在引導靶向特定的細胞類型。由於它們增加的效價，低解離速率和從迴圈的快速清除(對於~50 kDa或更低的小尺寸雙抗體)，本領域已知的雙抗體分子也已經顯示在腫瘤成像領域的具體用途(參見Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221)。尤其重要的是不同細胞的共連接，例如，細胞毒性T細胞與腫瘤細胞的交聯(參見Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631，和Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305)。

雙抗體表位元結合結構域可以針對任何免疫效應細胞比如CD3、CD16、CD32、CD64等的表面決定簇，此免疫效應細胞在T淋巴細胞、天然殺傷細胞(Natural Killer，NK)細胞或其他單核細胞上表達。在許多研究中，也發現結合效應細胞決定簇例如Fcγ受體(FcγR)的雙抗體啟動效應細胞(參見Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305；Holliger等(1999)“Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916；WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO 2012/162068)。通常，通過經Fc-FcγR相互作用使結合抗原的抗體結合效應細胞激發效應細胞啟動；因此，在這方面，雙抗體分子可展示Ig樣功能，這不依賴於它們是否包括Fc結構域(例如，如在本領域已知的或本文列舉的任何效應功能試驗中所分析的(例如，ADCC試驗))。通過交聯腫瘤和效應細胞，雙抗體不僅僅使效應細胞接近腫瘤細胞而且導致有效的腫瘤殺傷(參見，例如，Cao等(2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197)。

例如，美國專利號6,171,586涉及如下產生雙特異性抗體：通過蛋白酶解切割兩個抗體，以獲得它們的F(ab’)₂ 片段，在用於防止分子間二硫鍵形成的條件下還原這樣的片段，並且然後混合片段，以產生雙特異性抗體)。美國專利號6,551,592、6,994,853和8,277,806和PCT公開號WO 2012/156430、WO 2002/020039、WO 2000/018806和WO 1998/003670涉及產生三特異性抗體，其能夠同時結合腫瘤細胞上的T細胞和其他抗原，並且，經雙特異性抗體的Fc部分結合具有這樣的受體的細胞的Fc受體。PCT公開號WO 2000/018806、WO 1998/003670和WO 2006/072152涉及產生能夠同時結合T細胞和其他抗原的三特異性抗體。美國專利公開號2008-0057054公開了雙特異性綴合物，其對於針對澱粉狀蛋白β寡聚物的結合元件和針對跨膜蛋白質端腦蛋白 (telencephalin)的結合元件是特異性的。美國專利公開號2010-0291112涉及雙特異性和三特異性單鏈Fv分子，其特異性結合一個(或兩個)腫瘤抗原和效應細胞抗原(比如CD3、CD16、CD32、CD64等)。

PCT公開號WO 1999/042597和WO 1998/006749公開了抗體衍生物，其包括人主要組織相容性複合物結合結構域，有或沒有結合的MHC結合肽。PCT公開號WO 02/072141涉及多特異性結合分子，其結合速率(on-rate)(它們結合靶分子的速率)和解離速率(off-rate)(它們釋放靶分子的速率)不同，以便相比它們與另一這樣的靶分子的結合優選結合一個靶。三特異性分子，例如這樣的分子，其具有作為抗CD3或抗CD28抗體的單價第一部分和第二部分，此第二部分包括發揮二價免疫功能的部分，其免疫特異性結合靶患病細胞或免疫細胞上的一個或多個靶配體。

美國專利號7,695,936和專利公開2007/0196363涉及由兩個抗體的重鏈形成的雙特異性抗體，其中一個抗體具有工程化至其重鏈的突出(protuberance)和其第二個具有工程化至其重鏈的互補的腔。這樣互補的“杵(knob)”和“臼(hole)”的存在教導相對於包含相同抗體的兩個重鏈的單特異性同源抗體，優選形成雙特異性異源抗體(具有每個這樣的抗體的一個重鏈)。提出了各種雙特異性異源抗體，包括對CD3和腫瘤細胞抗原免疫特異性的那些。也提出了各種三特異性異源抗體，包括對下述免疫特異性的一些三特異性異源抗體：CD3、CD8和CD37 (主要在參與T細胞增殖調節的B細胞上表達的跨膜蛋白質(參見Robak, T.等(2014) “Anti-CD37 Antibodies For Chronic Lymphocytic Leukemia ,” Expert Opin. Biol. Ther. 14(5):651-661)，但是，沒有提供它們產生的機制也沒有公開它們的結構。

PCT公開WO2012-162561涉及雙特異性、四價結合分子，其包括兩個多肽，其每個多肽包括兩個雙抗體結構，由間插CH2-CH3結構域分開。此文件也涉及由四個多肽鏈組成的四價結合分子，其中多肽鏈中的兩個包含兩個抗原的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域，和其中其他兩個多肽鏈包含抗原的互補的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域和末端CH2-CH3結構域。通過它們各自CH2-CH3結構域的締合形成雙特異性、四價結合分子。在四個多肽鏈構建物中，“輕”鏈不是共價結合至重鏈，因此導致不穩定(參見Lu, D.等(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Iike Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。此文件公開了第三構建物，其中鏈被改變，以提供這樣的共價鍵合，但是代價是消除了它們的雙特異性(即，分子是單特異性的)。公開了對CD2、CD3、CD4、CD8、CD161、趨化因數受體、CD95、CCR5等具有特異性的分子。未公開能夠結合CD3和CD8二者的雙特異性分子。

但是，上述優勢需要顯著的成本。形成這樣的非單特異性雙抗體需要成功組裝兩個或更多個有區別的和不同多肽(即，這樣的形成需要通過異源二聚化不同的多肽鏈種類形成雙抗體)。該事實與單特異性的雙抗體相反，其通過相同多肽鏈的同二聚化形成。因為必須提供至少兩個不同的多肽(即，兩個多肽種類)以便形成非單特異性雙抗體，並且因為這樣的多肽的同二聚化導致無活性的分子(參見Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)，產生這樣的多肽必須以防止相同種類的多肽之間的共價結合的方式完成(參見Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)。所以現有技術教導了非共價締合這樣的多肽(參見，例如，Olafsen等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Asano等(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” 摘要3P-683，J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Lu, D.等( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。

但是，現有技術已經認識到由非共價締合的多肽組成的雙特異性雙抗體不穩定並且容易解離成非功能性單體(參見，例如，Lu, D.等( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。

面對該挑戰，現有技術已經成功開發了穩定、共價結合的異源二聚非單特異性雙抗體，稱為DARTs™ (參見，例如，美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538；和Moore, P.A.等(2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；Veri, M.C.等(2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold ,”Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；Johnson, S.等(2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion ,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449)。這樣的雙抗體包括兩個或更多個共價複合的多肽並且涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化至每個採用的多肽種類，這允許形成二硫鍵並且從而共價鍵合兩個多肽鏈。例如，添加半胱氨酸殘基至這樣的構建物的C-末端已經顯示允許多肽鏈之間的二硫鍵合，穩定所得異源二聚體而不幹擾二價分子的結合特徵。

有許多DART™實施方式。最簡單DART™實施方式的兩個多肽的每一個包括三個結構域(圖 1 A-1B )。第一多肽包括：(i)第一結構域，其包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域的結合區(VL1)，(ii)第二結構域，其包括第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域的結合區(VH2)，和(iii)第三結構域，其包含半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)和異源二聚化-促進結構域，其用於促進與第二多肽鏈的異源二聚化。第三結構域的半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)用於促進雙抗體的第一多肽鏈與第二多肽鏈的共價鍵合。第二多肽包含：(i)互補的第一結構域(包含VL2的結構域)，(ii)互補的第二結構域(包含VH1的結構域)和(iii)第三結構域，其包含半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)和，任選地，互補的異源二聚化-促進結構域，其與第一多肽鏈的異源二聚化-促進結構域複合，以便促進與第一多肽鏈的異源二聚化。第二多肽鏈的第三結構域的半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)用於促進雙抗體的第二多肽鏈與第一多肽鏈的共價鍵合。這樣的分子是穩定、有效力的並且能夠同時結合兩個或更多個抗原。它們能夠促進重定向T細胞介導的表達靶抗原的細胞的殺傷。

在一個例子中，第一和第二多肽的第三結構域每個包含半胱氨酸殘基，其用於將多肽經二硫鍵結合在一起。多肽中的一個或兩個的第三結構域可另外具有CH2-CH3結構域的序列，使得雙抗體多肽的複合形成Fc結構域，其能夠結合細胞(比如B淋巴細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜伊紅粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞)的Fc受體 (圖 2A-2B )。

已經描述了這樣的分子的許多變型(參見，例如，美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。這些具有Fc的DART可包括三條多肽鏈(例如，圖 2B )。這樣的雙抗體的第一多肽鏈包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域，(ii)包含VH2的結構域和(iii)包含半胱氨酸殘基的結構域(或包含半胱氨酸的結構域)和異源二聚化-促進結構域和(iv)半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域和CH2-CH3結構域。這樣的DART™的第二多肽鏈包含：(i)包含VL2的結構域，(ii)包含VH1的結構域和(iii)包含半胱氨酸殘基的結構域(或包含半胱氨酸的結構域)和異源二聚化-促進結構域，其促進與第一多肽鏈的異源二聚化。第二多肽鏈的第三結構域的半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)用於促進雙抗體的第二多肽鏈與第一多肽鏈的共價結合。這樣的DART™的第三多肽包括半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)和CH2-CH3結構域。因此，這樣的DART™的第一和第二多肽鏈締合在一起形成能夠結合表位的VL1/VH1結合位點以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。第一和第二多肽通過在它們各自第三結構域中涉及半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。注意，第一和第三多肽鏈彼此複合形成經二硫鍵穩定的Fc結構域。這樣的雙抗體具有增強的效力。這樣具有Fc的DART ™可具有兩個取向之一(表 1 )：

表 1

已經描述了甚至更複雜的DART™雙抗體，稱為Ig-DART ™ (圖 3A-3B )和Fc-DART™ 雙抗體(圖 3C ) (WO 2012/018687)。Fc-DARTs™具有四條多肽鏈。這樣的雙抗體的第一和第三多肽鏈包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域，(ii)包含VH2的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。Fc-DART™的第二和第四多肽包含：(i)包含VL2的結構域，(ii)包含VH1的結構域和(iii)促進與Fc-DART^TM 的第一多肽鏈的異源二聚化和共價結合的結構域。第三和第四，以及第一和第二多肽鏈可以相同或不同，以便允許是單特異性的、雙特異性的或四特異性的四價結合。這樣更複雜的DART™分子也具有包含半胱氨酸的結構域，其用於形成共價結合的複合物。Fc-DART™雙抗體包含CH1和CL結構域。

可選的構建物是本領域已知的，用於其中期望四價分子但是不需要Fc的應用，包括但不限於四價串聯抗體，也稱為“TandAbs ” (參見，例如美國專利公開號2005-0079170、2007-0031436、2010-0099853、2011-020667 2013-0189263；歐洲專利公開號EP 1078004、EP 2371866、EP 2361936和EP 1293514；PCT公開號WO 1999/057150、WO 2003/025018和WO 2013/013700)，其通過兩個相同鏈的同二聚化形成，每條鏈各具有VH1、VL2、VH2和VL2結構域。

但是，儘管所有現有技術的進步，仍需要可為遭受癌症或其他疾病和病況的患者提供改善的治療價值的組合物。

本發明涉及一種三特異性結合分子。三特異性結合分子可具有三個結合結構域的多鏈多肽分子，因此能夠介導與三個表位的協同結合。在一些實施方式中，三特異性結合分子可具備允許其免疫特異性結合以下表位元的結合結構域：(1)第一癌症抗原的表位，(2)第二癌症抗原的表位和(3)在免疫系統效應細胞的表面上表達的分子的表位，因此能夠將免疫系統效應細胞定位至表達癌症抗原的細胞，以便從而利於殺傷癌症細胞。

在一實施方式中，三特異性結合分子能夠免疫特異性結合三不同表位，此些表位是表位I、表位II和表位III，其中三個表位中的兩個是癌症抗原(一個或多個)的表位和此些表位中的第三個是效應細胞抗原的表位。

在一些實施方式中，三特異性結合分子包括共價複合在一起的四條不同的多肽鏈，並且包括：(I) 抗原結合結構域I，其能够免疫特異性結合第一抗原上存在的表位I，和抗原結合結構域II，其能够免疫特異性結合第二抗原上存在的表位II，其中抗原結合結構域I和抗原結合結構域II都是雙抗體型結合結構域；(II) 抗原結合結構域III，其能够免疫特異性結合第三抗原上存在的表位III；和(III) Fc結構域，其通過兩個CH2-CH3結構域彼此複合而形成。其中，表位I、表位II或表位III之一是效應細胞抗原的表位，表位I、表位II或表位III中的第二個是第一癌症抗原的表位，和表位I、表位II或表位III中的第三個是第二癌症抗原的表位，並且其中結合分子的抗原結合結構域I、II和III介導表達效應細胞抗原的免疫系統效應細胞和表達第一和第二癌症抗原的癌症細胞的協同結合。

在一些實施方式中，Fc結構域能够結合排列在細胞表面上的Fc受體。

在一些實施方式中，效應細胞抗原排列在效應細胞的表面上，並且癌症抗原排列在癌症細胞的表面上，而免疫特異性結合足夠共定位效應細胞抗原和癌症抗原，從而針對癌症細胞促進效應細胞的啟動。

在一些實施方式中，效應細胞抗原選自：CD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD22、CD32B、CD64、B細胞受體(BCR)、T細胞受體(TCR)和NKG2D受體。

在一些實施方式中，第一和第二癌症抗原獨立地選自：結腸癌抗原19.9；胃癌黏蛋白；抗原4.2；糖蛋白A33 (gpA33)；ADAM-9；胃癌抗原AH6；ALCAM；惡性人淋巴細胞抗原APO-1；癌症抗原B1；B7-H3；β-聯蛋白；血型Aleb/Ley；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；結腸腺癌抗原C14；卵巢癌抗原CA125；羧肽酶M；CD5；CD19；CD20；CD22；CD23；CD25；CD27；CD30；CD33；CD36；CD45；CD46；CD52；CD79a/CD79b；CD103；CD317；CDK4；癌胚抗原(CEA)；CEACAM5；CEACAM6；CO17-1A；CO-43 (血型Leb)；CO-514 (血型Le^a )；CTA-1；CTLA4；細胞角蛋白8；抗原D1.1；抗原D₁ 56-22；DR5；E1系列(血型B)；EGFR (表皮生長因數受體)；肝配蛋白受體A2 (EphA2)；ErbB1；ErbB3；ErbB4；GAGE-1；GAGE-2；GD2/GD3/GM2；肺腺癌抗原F3；抗原FC10.2；G49；神經節苷酯GD2；神經節苷酯GD3；神經節苷酯GM2；神經節苷酯GM3；GD2；GD3；GICA 19-9；G_M2 ；gp100；人白血病T細胞抗原Gp37；黑素瘤抗原gp75；gpA33；HER2抗原(p185^HER2 )；人乳脂肪球(milk fat globule)抗原(HMFG)；人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7；高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)；I抗原(分化抗原) I(Ma)；整聯蛋白α-V-β-6整聯蛋白β6 (ITGB6)；白介素-13；受體α2 (IL13Rα2)；JAM-3；KID3；KID31；KS 1/4全(pan)癌抗原；人肺癌抗原L6和L20；LEA；LUCA-2；M1:22:25:8；M18；M39；MAGE-1；MAGE-3；MART；MUC-1；MUM-1；Myl；N-乙醯葡糖氨基轉移酶；新糖蛋白(neoglycoprotein)；NS-10；OFA-1；OFA-2；制瘤素M；p15；黑素瘤相關的抗原p97；多態上皮黏蛋白(PEM)；多態上皮黏蛋白抗原(PEMA)；PIPA；前列腺特異性抗原(PSA)；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；前列腺酸性磷酸鹽；R24；ROR1；鞘脂；SSEA-1；SSEA-3；SSEA-4；sTn；源自T細胞受體的肽；T5A7；TAG-72；TL5 (血型A)；TNF-α受體；TNF-ß受體；TNF-γ受體；TRA-1-85 (血型H)；轉鐵蛋白受體；腫瘤特異性移植抗原(TSTA)、胎性癌抗原-甲胎蛋白(AFP)；VEGF、VEGFR，VEP8；VEP9；VIM-D5；和Y半抗原、Ley。

在一些實施方式中，第一和第二癌症抗原選自：CD2、CD317、CEACAM5、CEACAM6、DR5、EphA2、gpA33、Her2、B7-H3；EGF、EGFR、VEGF和VEGFR。

在一些實施方式中，結合結構域III為非雙抗體型結合結構域III且此非雙抗體型結合結構域III包括Fab型結合結構域(VL_III /VH_III )，其能够免疫特異性結合表位III。其中，三特異性結合分子包括：(A) 第一多肽鏈，其在N-末端至C-末端方向包括：(1) 免疫球蛋白的輕鏈可變結構域，其能夠結合三個表位中的第一個(VL_I )；(2) 免疫球蛋白的重鏈可變結構域，其能夠結合三個表位中的第二個(VH_II )；(3) 異源二聚體-促進結構域；和(4) IgG的CH2和CH3結構域；(B) 第二多肽鏈，其在N-末端至C-末端方向包括：(1) 免疫球蛋白的輕鏈可變結構域，其能夠結合三個表位中的第二個(VL_II )；(2) 免疫球蛋白的重鏈可變結構域，其能夠結合三個表位中的第一個(VH_I )；和(3) 互補的異源二聚體-促進結構域；(C) 第三多肽鏈，其在N-末端至C-末端方向包括：(1) 免疫球蛋白的重鏈可變結構域，其能夠結合三個表位中的第三個(VH_III )；和(2) IgG的CH1結構域、鉸鏈結構域和CH2-CH3結構域；和(D) 第四多肽鏈，其在N-末端至C-末端方向包括：(1) 免疫球蛋白的輕鏈可變結構域，其能夠結合三個表位中的第三個(VL_III )；(2) 輕鏈固定結構域(CL)。其中，(i) VL_I 和VH_I 結構域締合形成能夠結合第一表位的結構域；(ii) VL_II 和VH_II 結構域締合形成能夠結合第二表位的結構域；(iii) VL_III 和VH_III 結構域締合形成能夠結合第三個表位的結構域；(iv) 第一多肽鏈的CH2-CH3結構域和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域締合形成Fc結構域；(v) 第一和第二多肽鏈彼此共價結合；(vi) 第一和第三多肽鏈彼此共價結合；和(vii) 第三和第四多肽鏈彼此共價結合。

在一些實施方式中，(A) 異源二聚體-促進結構域是E-螺旋和互補的異源二聚體-促進結構域是K-螺旋；或(B) 異源二聚體-促進結構域是K-螺旋和互補的異源二聚體-促進結構域是E-螺旋。

在一些實施方式中，(A) 第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域每個具有序列SEQ ID NO: 1 ，使得由它們締合形成的Fc結構域展示正常的FcγR介導的效應子功能；或(B) 第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域，相對於序列SEQ ID NO：1，包括至少一個氨基酸取代，使得由它們締合形成的Fc結構域展示改變的FcγR介導的效應子功能。

在一些實施方式中，至少一個氨基酸取代包括選自下述的至少一個氨基酸取代：L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中編號是如在Kabat中的EU索引的編號。

在一些實施方式中，至少一個氨基酸取代可包括：(A) 選自下述的至少一個取代：F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；(B) 選自下述的至少兩個取代：(1) F243L和P396L；(2) F243L和R292P；和(3) R292P和V305I；(C) 選自下述的至少三個取代：(1) F243L、R292P和Y300L；(2) F243L、R292P和V305I；(3) F243L、R292P和P396L；和(4) R292P、V305I和P396L；(D) 選自下述的至少四個取代：(1) F243L、R292P、Y300L和P396L；和(2) F243L、R292P、V305I和P396L；或(E) 選自下述的至少五個取代：(1) F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；和(2) L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。

在一些實施方式中，第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域彼此不同並且具有選自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO ： 52 和SEQ ID NO ： 53 。

在一些實施方式中，(A) 表位I、表位II和表位III分别是第一癌症抗原的表位、第二癌症抗原的表位和效應細胞抗原的表位；(B) 表位I、表位II和表位III分別是第一癌症抗原的表位、效應細胞抗原的表位和第二癌症抗原的表位；(C) 表位I、表位II和表位III分別是第二癌症抗原的表位、第一癌症抗原的表位和效應細胞抗原的表位；(D) 表位I、表位II和表位III分別是第二癌症抗原的表位、效應細胞抗原的表位和第一癌症抗原的表位；(E) 表位I、表位II和表位III分別是效應細胞抗原的表位、第一癌症抗原的表位和第二癌症抗原的表位；和(F) 表位I、表位II和表位III分別是效應細胞抗原的表位、第二癌症抗原的表位和第一癌症抗原的表位。

在一些實施方式中，(A) 效應細胞抗原的表位是抗體Lo-CD2a識别的CD2表位；(B) 效應細胞抗原的表位是抗體OKT3、M291、YTH12.5、抗CD3 mAb 1或抗CD3 mAb 2識别的CD3表位；(C) 效應細胞抗原的表位是抗體3G8或A9識別的CD16表位；(D) 效應細胞抗原的表位是抗體MD1342、MEDI-551、蘭妥莫單抗(blinatumomab)或HD37識别的CD19表位；(E) 效應細胞抗原的表位是抗體利妥昔單抗(rituximab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、奥法木單抗(ofatumumab)和托西莫單(tositumomab)抗識别的CD20表位；(F) 效應細胞抗原的表位是抗體依帕珠單抗(epratuzumab)識别的CD22表位；(G) 效應細胞抗原的表位是抗體CD32B mAb 1識别的CD32B表位；(H) 效應細胞抗原的表位是抗體CD64 mAb 1識別的CD64表位；(I) 效應細胞抗原的表位是抗體CD79 mAb 1識别的BCR/CD79表位；(J) 效應細胞抗原的表位是抗體BMA 031識別的TCR表位；或(K) 效應細胞抗原的表位是抗體KYK-2.0識別的NKG2D受體表位。

在一實施方式中，一種藥學組合物，其包括任何上述三特異性結合分子和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。

在一些實施方式中，前述之藥學組合物或前述之三特異性結合分子，其中的三特異性結合分子用於治療癌症。

在一些實施方式中，癌症特徵在於存在選自下述細胞的癌症細胞：腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦癌和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宫頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、成纖維細胞性小圓細胞瘤、室管膜瘤、尤文氏腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性内分泌瘤形成、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合徵、成神經細胞瘤、神經内分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症(pediatric cancer)、末梢神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤(phaeochromocytoma)、垂體腫瘤、前列腺癌、後眼色素層黑素瘤、罕見血液疾病、腎轉移性癌、杆狀(rhabdoid)腫瘤、横紋肌肉瘤(rhabdomysarcoma)、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鳞狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症和子宫癌。

在一些實施方式中，癌症是結腸直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌或直腸癌症。

在一些實施方式中，癌症可是急性髓細胞樣白血病(acute myeloid leukemia，AML)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、急性B成淋巴細胞白血病(acute B lymphoblastic leukemia，B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、毛細胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm，BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphomas，NHL)、包括套細胞白血病(mantel cell leukemia，MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma，SLL)、霍奇金淋巴瘤、系统性肥大細胞增生症，或伯基特淋巴瘤。

本申請要求美國專利申請號62/107,824 (2015年1月26日提交)、62/008,229 (2014年6月5日提交；未決)和62/004,571 (2014年5月29日提交；未決)的優先權，其每一篇申請通過引用以其整體併入本文。

本發明涉及一種三特異性結合分子。在一些實施方式中，三特異性結合分子可具有三個結合結構域的多鏈多肽分子，因此能夠介導與三個表位的協同結合。在一些實施方式中，三特異性結合分子可具備允許其免疫特異性結合以下表位元的結合結構域：(1)第一癌症抗原的表位、(2)第二癌症抗原的表位和(3)在免疫系統效應細胞的表面上表達的分子的表位，因此能夠將免疫系統效應細胞定位至表達癌症抗原的細胞，以便從而利於殺傷癌症細胞。

在一些實施方式中，三特異性結合分子可包括上面討論的抗體例如，DR5 mAb 1或DR5 mAb 2的人源化的、嵌合的或犬科化(caninized)的衍生物的表位元結合結構域。

Ⅰ . 一般技術和一般定義

除非另外指出，否則本發明任一實施方式的實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規的技術，其在本領域的技術範圍內。在下述文獻中充分闡釋了這樣的技術，比如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第三版(Sambrook等Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY；Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ；Oligonucleotide Synthesis (Gait, M.J., Ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ；Cell Biology: A Laboratory Notebook (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, New York, NY；Animal Cell Culture (Freshney, R.I., Ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (Mather, J.P. and Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York, NY；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (Doyle, A.等, Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) New York, NY；Weir’s Handbook of Experimental Immunology (Herzenberg, L.A.等Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller, J.M.等Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY；Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M.等, Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, K.等, Eds., 1994) Birkhäuser, Boston MA；Current Protocols in Immunology (Coligan, J.E.等, eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ；Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ；Immunobiology 7 (Janeway, C.A.等2007) Garland Science, London, UK；Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (Shepherd, P.等Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY；Using Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow, E.等Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；The Antibodies (Zanetti, M.等Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London, UK)；和DeVita, Hellman, and Rosenberg's Cancer: Principles & Practice of Oncology, Eighth Edition, DeVita, V.等Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA。

Ⅱ . 優選的三特異性結合分子

A. 結合能力

在一些實施方式中，三特異性結合分子能夠協同和同時結合三個不同的表位。優選的三特異性結合分子包括：(I) “結合結構域 Ⅰ ”，其能夠免疫特異性結合第一抗原上存在的“表位Ⅰ”，和“結合結構域 Ⅱ ”，其能夠免疫特異性結合第二抗原上存在的“表位Ⅱ”，其中結合結構域 Ⅰ 和結合結構域 Ⅱ 都是“雙抗體型結合結構域 ”； (Ⅱ) “結合結構域 Ⅲ ”，其能夠免疫特異性結合第三抗原上存在的“表位Ⅲ”；和(Ⅲ)Fc 結構域 ，其通過兩個CH2-CH3 結構域 彼此複合而形成。其中，(A) 表位Ⅰ、表位Ⅱ或表位Ⅲ之一是第一“癌症抗原”癌症抗原的表位；(B) 表位Ⅰ、表位Ⅱ或表位Ⅲ中的第二個是第二癌症抗原的表位；和(C) 表位Ⅰ、表位Ⅱ或表位Ⅲ中的第三個是免疫系統效應細胞表面上表達的分子(“效應細胞抗原”)的表位。並且，結合分子的結合結構域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ介導免疫系統效應細胞和表達第一和第二癌症抗原的細胞的協同結合，從而共定位這樣的細胞。

雙抗體表位元結合結構域也可針對B細胞的表面決定簇，比如CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD40和CD74 (參見Moore, P.A.等(2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；Cheson, B.D.等(2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma,” N. Engl. J. Med. 359(6):613-626；Castillo, J.等(2008) “Newer monoclonal antibodies for hematological malignancies ,” Exp. Hematol. 36(7):755-768。在許多研究中，也發現結合效應細胞決定簇例如Fcγ受體(FcγR)的雙抗體啟動效應細胞(參見Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bi-specific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305；Holliger等(1999)“Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-Cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bi-specific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bi-specific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916；WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068)。通常，通過使結合抗原的抗體經Fc-FcγR相互作用結合效應細胞來觸發效應細胞啟動；因此，在這點上，雙抗體分子可展示Ig樣功能，這不依賴於它們是否包括Fc結構域(例如，如在本領域已知的或本文列舉的任何效應子功能試驗(例如，ADCC試驗)中所分析的)。通過交聯腫瘤和效應細胞，雙抗體不僅僅使效應細胞接近腫瘤細胞，而且使得有效的腫瘤殺傷(參見，例如，Cao等(2003)“Bi-specific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197)。

儘管這樣的三特異性結合分子是尤其優選的，另外亦具體考慮這樣的三特異性結合分子：其包括足以產生具有三種結合特異性的分子的結合結構域的任何組合，並且在三種結合特異性中的兩種是針對癌症抗原的結合特異性和在三種結合特異性中的一種是針對效應細胞抗原的結合特異性。因此，例如，包括三個Fab型結合結構域的三特異性結合分子；包括一個二價、雙特異性抗體結構域(通過例如複合兩個不同輕鏈和兩個不同重鏈形成)和一個Fab型結合結構域的三特異性結合分子；包括兩個二價、雙特異性抗體結構域(通過例如複合四個不同的輕鏈和兩個不同的重鏈形成)但是使其中一個抗體結構域無活性的三特異性結合分子等。

術語“多肽 ”、 “ 多肽鏈 ”和“肽 ”在本文中可互換使用，指任何長度——但是尤其是長度大於3、5、10、15、20或25個氨基酸殘基——的氨基酸的聚合物，其中兩個，更優選地，所有氨基酸殘基經醯胺(肽)鍵(-NH-C(O)-)連接。但是，聚合物可以是線性的或分支的，其可包括修飾的氨基酸，並且其可被非氨基酸中斷。此術語也包括經天然修飾的或通過幹預修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質化(lipidation)、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，比如結合標籤組分。同樣包括在定義中的是，例如，多肽，其包含一個或多個氨基酸的類似物(包括，例如，非天然氨基酸等)以及本領域已知的其他修飾。於此，多肽可作為單鏈或複合的鏈存在。

“雙抗體型結合結構域 ”是雙抗體，尤其是DART®雙抗體的表位元結合結構域。術語“雙抗體 ”和“DART® 雙抗體 ”已經在上面討論了，其指這樣的分子：其包括優選地通過共價相互作用彼此複合的至少兩條多肽鏈，以形成至少兩個表位結合位點，其可識別相同的或不同的表位。雙抗體或DART®雙抗體的多肽鏈中的兩條均包括免疫球蛋白輕鏈可變區和免疫球蛋白重鏈可變區，但是這些區域不相互作用形成表位元結合位點(即，它們不是相互“互補的 ”)。相反，雙抗體或DART®雙抗體鏈中的一個(例如，第一)的免疫球蛋白重鏈可變區與不同的(例如，第二)雙抗體或DART®雙抗體多肽鏈的免疫球蛋白輕鏈可變區相互作用，形成表位結合位點。類似地，雙抗體或DART®雙抗體多肽鏈中的一個(例如，第一)的免疫球蛋白輕鏈可變區與不同的(例如，第二)雙抗體或DART®雙抗體多肽鏈的免疫球蛋白重鏈可變區相互作用，形成表位結合位點。DART®雙抗體分子公開在下述文獻中：美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221；和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2006/113665、WO 2008/157379；和Moore, P.A.等(2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；Veri, M.C.等(2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold ,”Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；和Johnson, S.等(2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion ,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449。

結合結構域 Ⅲ (Binding Domain Ⅲ)優選地是“非雙抗體型 (Non-Diabody-Type)” 結合結構域 ，其旨在表示結合結構域Ⅲ不具有雙抗體型結合結構域的結構。優選地，結合結構域Ⅲ是非雙抗體型結合結構域，其是Fab 型 (Fab-Type)結合結構域 或效應細胞受體型 (Effector Cell Receptor-Type)結合結構域 。因此，在圖 4A-4G 示例的一個實施方式中，結合結構域Ⅲ是Fab型結合結構域。圖 5A-5E 示例了其中結合結構域Ⅲ是效應細胞受體型結合結構域的實施方式。如本文所使用，術語“Fab 型結合結構域 ”指表位元結合結構域，其通過免疫球蛋白輕鏈的VL結構域和免疫球蛋白重鏈互補的VH結構域的相互作用形成。Fab型結合結構域與雙抗體型結合結構域的不同在於形成Fab型結合結構域的兩條多肽鏈僅僅包括單個表位元結合結構域，而形成雙抗體型結合結構域的兩條多肽鏈包括至少兩個表位元結合結構域。因此，如本文所使用，Fab型結合結構域與雙抗體型結合結構域不同。當結合結構域是Fab型結合結構域或雙抗體型結合結構域時，其由VL結構域和VH結構域組成，其可位於相同或不同的多肽鏈上。這樣的VL和VH結構域的選擇是協同的，以便結構域形成表位元結合結構域。如本文所使用，術語“效應細胞受體型結合結構域 ”指表位元結合結構域，其通過T細胞受體α鏈的可變結構域和T細胞受體β鏈的可變結構域相互作用而形成。這樣的受體能識別在MHC背景下展示的肽，因此能夠識別細胞內表位。

因此，根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子與四價結合分子比如由二價抗體二聚化產生的那些四價結合分子不同，並且優選地具備三個而不是四個結合結構域。如下面所討論，三特異性結合分子可具有另外的結合結構域(比如白蛋白-結合結構域、FcγR-結合結構域等)。但此另外的結合結構域不限制在被視為或考慮是三特異性結合分子的三個結合結構域之一。

如本文所使用，術語“締合 (association)”或“締合的 (assoiating)”，就多肽(例如，一個雙抗體多肽與另一雙抗體多肽締合、免疫球蛋白輕鏈與免疫球蛋白重鏈締合、一個CH2-CH3結構域與另一CH2-CH3結構域締合等)而言，旨在表示多肽的非共價結合。術語”複合 (complexes)”或“複合的 (complexing)”旨在表示多肽的共價結合。

如本文所使用，如果其結合結構域中有至少兩個或全部(優選地)能夠同時結合它們各自識別的表位或結合配體，則認為此結合分子的結合結構域介導“協同結合 (coordinated binding)”。這樣的結合可以是同時的。但是，本發明的一個方面涉及修飾此種結合結構域結合它們識別的表位的”結合速率”和/或“解離速率”。如本文所使用，結合的“結合速率 (on rate)”是對這樣的結合結構域識別和啟動與它們識別表位的結合的親和性的度量。相反，結合的“解離速率 (off rate)”是對結合結構域：表位複合物穩定性程度的度量。結合的”結合速率”和/或“解離速率”可通過改變結合結構域的CDR的氨基酸序列而被改變。如下面所討論，不依賴於任何CDR修飾，結合分子的協同結合的程度可通過改變它們的結合結構域的構型來調節，從而具體的結合結構域(即，VLx/VHx結構域)作為結合結構域III而存在或作為相對於結合結構域Ⅲ的內部或外部雙抗體型結合結構域(下面詳細討論)而存在。

本發明任一實施方式的結合分子的結合結構域的結合速率和解離速率可容易通過本領域熟知的方法測量，例如通過下述方法測量：Biacore®分析(Jason-Moller, L.等(2006) “Overview Of Biacore Systems And Their Applications ,” Curr. Protoc. Protein Sci. 第19章: 19.13單元；Swanson, S.J. (2005) “Characterization Of An Immune Response ,” Dev. Biol. (Basel). 122:95-101；Buijs, J.等(2005) “SPR-MS In Functional Proteomics ,” Brief Funct. Genomic Proteomic. 4(1):39-47；Karlsson, R.等(2004) “SPR For Molecular Interaction Analysis : A Review Of Emerging Application Areas ,” J. Mol. Recognit. 17(3):151-161；Van Regenmortel, M.H. (2003) “Improving The Quality Of BIACORE-Based Affinity Measurements ,” Dev. Biol. (Basel) 112:141-151；Malmqvist, M. (1999) “BIACORE : An Affinity Biosensor System For Characterization Of Biomolecular Interactions ,” Biochem. Soc. Trans. 27(2):335-340；Malmqvist, M.等(1997) “Biomolecular Interaction Analysis : Affinity Biosensor Technologies For Functional Analysis Of Proteins ,” Curr. Opin. Chem. Biol. 1(3):378-383；Fivash, M.等(1998) “Biacore For Macromolecular Interaction ,” Curr. Opin. Biotechnol. 9(1):97-101；Malmborg, A.C.等(1995) “Biacore As A Tool In Antibody Engineering ,” J. Immunol. Methods. 183(1):7-13)。並且，本發明任一實施方式的結合分子的結合結構域的結合速率和解離速率可容易通過如下方式改變：編碼這樣的結合結構域的核酸分子的隨機或定向誘變，隨後針對它們編碼展示這樣的改變結合動力學的突變蛋白質的能力，常規篩選收穫的核酸分子。

本發明任一實施方式的三特異性結合分子的結合結構域是以“免疫特異性 ”方式結合表位。如本文所使用，如果相對於供選擇的表位，一抗體、一雙抗體或其他表位結合分子與表位更頻繁、更快速地以更大的持續時間和/或以更大的親和性反應或締合，則認為抗體、雙抗體或其他表位結合分子“免疫特異性 ”結合另一分子的區域(即，表位)。例如，免疫特異性結合病毒表位的抗體是這樣的抗體：與其免疫特異性結合其他病毒表位或非病毒表位相比，抗體以更大的親和性、抗體親抗原性、更容易和/或以更持久的時間結合病毒表位。通過閱讀此定義，應理解，例如，免疫特異性結合第一靶的抗體(或一部分或表位)可能或可能不特異性或優選結合第二靶。因此，“特異性結合”不一定要求(儘管其可包括)排他性結合。一般而言，但是不一定，提及結合則意味著”特異性”結合。如果，這樣的結合展示受體結合它們各自配體的特異性，則認為兩個分子能夠彼此以“生理特異性 ”方式結合。

可通過產生基於抗體的多特異性分子來增強抗體的功能，此多特異性分子可同時結合兩個獨立且不同的抗原(或相同抗原的不同表位)，和/或通過產生對於相同的表位和/或抗原具有更高效價(即，大於兩個結合位點)的基於抗體的分子來增強抗體的功能。

因此，在它們最簡單的實施方式中，結合分子是至少三特異性的。顯著地，這樣的分子具有能夠結合抗原的至少三個“位點 ”：“外部 ”雙抗體型結合結構域，其距離結合結構域Ⅲ最遠；“內部 ”雙抗體型結合結構域，其距離結合結構域III最近；和結合結構域Ⅲ本身。這樣的結構域的位置分別命名為位點 A 、位點 B 和位點 C (圖 4A-4G ；圖 5A-5E )。

在一實施方式中，三特異性結合分子包括三個結合結構域，其能夠協同結合三個不同的表位。這樣的結合分子的結合結構域中的兩個能夠結合”癌症抗原 (Cancer Antigen)”的表位，使得分子能夠結合兩個不同的癌症抗原。這樣的結合分子的結合結構域中的第三結合結構域能夠結合在免疫系統效應細胞的表面上表達的分子(即，“ 效應細胞抗原 (Effector Cell Antigen)” )的表位。因此，三特異性結合分子能夠介導與表達兩個癌症抗原的癌症細胞和與表達效應細胞抗原的免疫系統效應細胞的協同和同時結合。於此，三特異性結合分子識別的表位可以是連續的或不連續的(例如，構象的)。

在一些實施方式中，由三特異性結合分子的癌症抗原結合結構域結合的第一和第二癌症抗原可選自特徵性存在於癌症細胞表面上的任何分子。本發明的一個方面涉及靶向“低表達 (Low Expression)癌症抗原 ” (即，可在癌症細胞上以過低水準表達而不能使單特異性結合分子提供有效的癌症療法的癌症抗原)的能力。與這樣的單特異性結合分子相反，三特異性結合分子通過靶向兩個癌症抗原而不是一個癌症抗原展示協同和協助增強的結合親和力，其可彌補結合的低親和性，因此可有利地用於靶向特徵甚至在於低表達癌症抗原的癌症。本發明的第二方面涉及靶向“低特異性 (Low Specificity)癌症抗原 ” (即，除了在癌症細胞上表達之外也可在正常細胞上表達的癌症抗原)的能力。三特異性結合分子更通過提供為兩個癌症抗原協同和協助增強的結合親和力，展示甚至對低特異性癌症抗原更高的結合親和力，因此提供了治療具有此種癌症抗原的癌症的手段。因此，本發明任一實施方式的三特異性結合分子可用於提供抗癌症療法，即使在靶癌症抗原中的一個或兩個本身不能有效提供這樣的療法的情況下。

例如，CD32B (FcγRIIB受體)在造血細胞上廣泛表達，造血細胞包括單核細胞、巨噬細胞、B細胞、NK細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞和血小板。當結合IgG Fc結構域時，CD32B抑制宿主免疫系統，從而抑制進行的免疫應答。儘管這樣的抑制在幫助宿主從炎症反應恢復方面是期望的，但其可加劇遭受癌症或感染疾病的受試者的免疫缺陷。結合CD32B以便阻斷IgG Fc分子結合的抗體用於防止這樣的抑制，因此可用作癌症和感染疾病治療中的輔助分子(參見Veri, M.C.等(2007) “Monoclonal Antibodies Capable Of Discriminating The Human Inhibitory Fcgamma-Receptor IIB (CD32B) From The Activating Fcgamma-Receptor IIA (CD32A): Biochemical, Biological And Functional Characterization,” Immunology 121(3):392-404)。不幸地，CD32B也在肝竇狀內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell，“LSE 細胞 ”)上表達(Shahani, T.等(2014) “Human Liver Sinusoidal Endothelial Cells But Not Hepatocytes Contain Factor VIII ,” J. Thromb. Haemost. 12(1):36-42；Géraud, C.等(2013) “Endothelial Transdifferentiation In Hepatocellular Carcinoma : Loss Of Stabilin-2 Expression In Peri-Tumourous Liver Correlates With Increased Survival ,” Liver Int. 33(9):1428-1440；Takabe, Y.等(2012) “Immunomagnetic Exclusion Of E-Cadherin-Positive Hepatoblasts In Fetal Mouse Liver Cell Cultures Impairs Morphogenesis And Gene Expression Of Sinusoidal Endothelial Cells ,” J. Anat. 221(3):229-239)。因此，結合CD32B的抗體攻擊LSE細胞。但是，通過形成其能結合CD32B和抗原(即，第一和第二癌症抗原)的三特異性結合分子，本發明任意實施例的組合物和方法可用於阻抑CD32B介導的免疫系統抑制。其中，結合的抗原不在LSE細胞上表達，或是以低水準表達(即，低表達癌症抗原)，或是以低特異性在癌症細胞和LSE細胞上表達(即，低特異性癌症抗原)。

B. 示例性癌症抗原結合結構域

合適的癌症抗原的例子包括：如在結腸癌、胃癌黏蛋白中發現的19.9；；4.2 ；A33 (結直腸癌抗原；Almqvist，Y. 2006,Nucl Med Biol . Nov; 33(8):991-998)；ADAM-9 (美國專利公開號2006/0172350；PCT公開號WO 06/084075)；胃癌中發現的AH6 ；ALCAM (PCT公開號WO 03/093443)；APO-1 (惡性人淋巴細胞抗原)(參見Trauth等(1989)“Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis,” Science 245:301-304)；B1 (參見Egloff, A.M.等2006,Cancer Res. 66(1):6-9)；BAGE(參見Bodey, B. 2002Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84)；B7-H3 ；β- 聯蛋白 (參見Prange W.等2003J Pathol. 201(2):250-9)；如在結腸腺癌中發現的血型 ALe^b /Le^y ；如在結腸腺癌中發現的伯基特淋巴瘤抗原 -38.13 、C14 ；CA125 ( 卵巢癌抗原 ) (參見Bast, R.C. Jr.等2005Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81；Yu等(1991)“Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants,” Cancer Res. 51(2):468‑475)；羧肽酶 M (參見美國專利公開號2006/0166291)；CD5 (參見Calin, G.A.等2006Semin Oncol . 33(2):167-73；CD19 (參見Ghetie等(1994)“Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest,” Blood 83:1329-1336；Troussard, X.等1998Hematol Cell Ther. 40(4):139-48)；CD20 (參見Thomas, D.A.等2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36)；CD22 (參見Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18; 8(3):E532-51)；CD23 (參見Rosati, S.等2005Curr Top Microbiol Immunol . 5; 294:91-107)；CD25 (參見Troussard, X.等1998Hematol Cell Ther. 40(4):139-48)；CD27 (參見Bataille, R. 2006Haematologica 91(9):1234-40)；CD28 (參見Bataille, R. 2006Haematologica 91(9):1234-40)；CD33 (參見Sgouros等(1993)“Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia,” J. Nucl. Med. 34:422-430)；CD36 (參見Ge, Y. 2005Lab Hematol. 11(1):31-7)；CD40/CD154 (參見Messmer, D.等2005Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60)；CD45 (參見Jurcic, J.G. 2005Curr Oncol Rep. 7(5):339-46)；CD56( 參見Bataille, R. 2006Haematologica 91(9):1234-40)；CD46 (參見美國專利號7,148,038；PCT公開號WO 03/032814)；CD79a/CD79b (參見Troussard, X.等1998Hematol Cell Ther. 40(4):139-48；Chu, P.G.等2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106)；CD103 (參見Troussard, X.等1998Hematol Cell Ther. 40(4):139-48)；CDK4 (參見Lee, Y.M.等2006Cell Cycle 5(18):2110-4)；CEA (癌胚抗原)(參見Foon等(1995)“ Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine ,” J. Clin. Invest. 96(1):334-42)；CEA (癌胚抗原)(參見Mathelin, C. 2006Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46；Tellez-Avila, F.I.等2005Rev Invest Clin. 57(6):814-9)；CO17-1A (參見Ragnhammar等(1993)“Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting ， Complete Remissions Can Be Induced,” Int. J. Cancer 53:751-758)；CO-43 (血型Le^b )；如在腺癌中發現的CO-514 (血型Le^a )；CTA-1 ；CTLA4 (參見Peggs, K.S.等2006Curr Opin Immunol. 18(2):206-13)；細胞角蛋白 8 (參見PCT公開號WO 03/024191)；D1.1 ；D₁ 56-22 ；DR5 (參見Abdulghani, J.等(2010) “TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics ,” Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108；Andera, L.(2009) “Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family ,” Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. 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Immunother. 36:373-380)；神經節苷酯 GM2 (參見Livingston等(1994)“Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies : A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside,” J. Clin. Oncol. 12:1036-1044)；神經節苷酯 GM3 (參見Hoon等(1993)“Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers,” Cancer Res. 53:5244-5250)；G_D2 ；G_D3 ；GICA 19-9 (參見Herlyn等(1982)“Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal , Gastric , And Pancreatic Carcinoma,” J. Clin. Immunol. 2:135-140)；G_M2 ；gp100 (Lotem, M.等2006 J Immunother. 29(6):616-27)；Gp37 (人白血病T細胞抗原)(參見Bhattacharya-Chatterjee等(1988)“Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Ab1 , Ab2 , and Ab3),” J. Immunol. 141:1398-1403)；gp75 (黑素瘤抗原)(參見Vijayasardahl等(1990)“ The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product,” J. Exp. Med. 171(4):1375-1380)；gpA33 ；HER2 抗原 (p185^HER2 ) (參見Kumar, Pal S等2006 Semin Oncol. 33(4):386-91)；人 B- 淋巴瘤抗原 -CD20 (參見Reff等(1994)“Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20,” Blood 83:435-445)；人乳脂肪球抗原 ；人乳頭瘤病毒 -E6/ 人乳頭瘤病毒 -E7 (參見DiMaio, D.等2006Adv Virus Res. 66:125-59)；HMW-MAA (高分子量黑素瘤抗原)(參見Natali等(1987)“Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance,” Cancer 59:55-63；Mittelman等(1990)“Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies,”J. Clin. Invest. 86:2136-2144 )；I 抗原 (分化抗原 ) (參見Feizi (1985)“Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens,” Nature 314:53-57)；比如胃腺癌中發現的I(Ma) ；整聯蛋白 α -V- β -6 (參見PCT公開號WO 03/087340)；JAM-3 (參見PCT公開號WO 06/084078)；KID3 (參見PCT公開號WO 05/028498)；KID31 (參見PCT公開號WO 06/076584)；KS 1/4 全癌抗原 (參見Perez等(1989)“Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker,” J. Immunol. 142:3662‑3667；Möller等(1991)“Bi-specific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes,”Cancer Immunol. 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Cancer Instit. 81(6):445-454)；PEM (多態上皮黏蛋白)(參見Hilkens等(1992)“ Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property,” Trends in Biochem. Sci. 17:359-363)；PEMA( 多態上皮黏蛋白抗原)；PIPA (參見美國專利號7,405,061；PCT公開號WO 04/043239)；PSA( 前列腺特異性抗原)(參見Henttu等(1989)cDNA Coding For The Entire Human ProstateSpecific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes,”Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910 ；Israeli等(1993)“Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen,” Cancer Res. 53:227-230；Cracco, C.M.等2005Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11)；PSMA (前列腺特異性膜抗原)( 參見Ragupathi, G. 2005Cancer Treat Res. 123:157-180)；前列腺酸性磷酸鹽 (參見Tailor等(1990)“ Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone ,” Nucl. Acids Res. 18(16):4928)；黑素瘤中發現的R₂₄ ；ROR1 (參見美國專利號5,843,749)；鞘脂；SSEA-1 ；SSEA-3 ；SSEA-4 ；sTn (參見Holmberg, L.A. 2001Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91)；來自皮膚T細胞淋巴瘤的源自T 細胞受體的 肽 (參見Edelson (1998)“Cutaneous T-Cell Lymphoma ： A Model For Selective Immunotherapy,”Cancer J Sci Am. 4:62-71 )；髓樣細胞中發現的T₅ A₇ ；TAG-72 (參見Yokota等(1992)“Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms,” Cancer Res. 52:3402-3408)；TL5 (血型A)；TNF- 受體 (TNF-α受體，TNF-ß受體；TNF-γ受體)( 參見van Horssen, R.等2006Oncologist. 11(4):397-408；Gardnerova, M.等2000Curr Drug Targets. 1(4):327-64)；TRA-1-85 (血型H)；轉鐵蛋白受體 (參見美國專利號7,572,895；PCT公開號WO 05/121179)；TSTA (腫瘤特異性移植抗原)，比如病毒誘導的腫瘤抗原，包括T-抗原DNA腫瘤病毒和RNA腫瘤病毒的包膜抗原，胎性癌抗原-甲胎蛋白，比如結腸的CEA、膀胱腫瘤癌胚抗原(參見Hellström等(1985)“Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas,” Cancer. Res. 45:2210-2188)；VEGF 受體(參見O’Dwyer. P.J. 2006Oncologist. 11(9):992-998)；VEP8 ；VEP9 ；VIM-D5 ；和Y 半抗原 ，胚胎癌性細胞中發現的Le^y 。

1. 坎帕斯 ( Campath ) -1(CD52) 結合結構域 ( 阿侖單抗 ( Alemtuzumab ) )

人源化的抗CD52抗體“阿侖單抗 ”的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 205 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQNID KYLN WYQQKP GKAPKLLIY N TNNLQT GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYC LQ HISRPRT FGQ GTKVEIKR

人源化的抗CD52抗體“阿侖單抗 ”的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 206 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLQESGPG LVRPSQTLSL TCTVS GFTFT DFYMN WVRQP PGRGLEWIG F IRDKAKGYTT EYNPSVKG RV TMLVDTSKNQ FSLRLSSVTA ADTAVYYCAR EGHTAAPFDY WGQGSLVTVS S

2. CD317 (BMST2)- 結合結構域

CD317 (也稱為骨髓基質細胞抗原2；BMST)在從乳、肺、腎、子宮內膜和皮膚分離的各種癌症細胞上過表達(參見Kawai, S.等(2008) “Interferon-α enhances CD317 expression and the antitumor activity of anti-CD317 monoclonal antibody in renal cell carcinoma xenograft models,” Cancer Science 99(12):2461-2466；Cai, D.等(2009) “Up-Regulation Of Bone Marrow Stromal Protein 2 (BST2) In Breast Cancer With Bone Metastasis ,” BMC Cancer 9:102, pp. 1-10；Wang, W.等(2009)HM1.24 (CD317) Is A Novel Target Against Lung Cancer For Immunotherapy Using Anti-HM1.24 Antibody ,” Cancer Immunology, Immunotherapy58(6):967-976；Wang, W.等(2009) “Chimeric And Humanized Anti-HM1.24 Antibodies Mediate Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Lung Cancer Cells. Lung Cancer ,” 63(1):23-31；Sayeed, A.等(2013) “Aberrant Regulation Of The BST2 (Tetherin) Promoter Enhances Cell Proliferation And Apoptosis Evasion In High Grade Breast Cancer Cells ,” PLoS ONE8(6)e67191, pp. 1-10；Yi, E.H.等(2013) “BST-2 Is A Potential Activator Of Invasion And Migration In Tamoxifen-Resistant Breast Cancer Cells ,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 435(4):685-690；Staudinger, M. (2014) “The Novel Immunotoxin HM1.24-ETA' Induces Apoptosis In Multiple Myeloma Cells ,” Blood Cancer J.13;4:e219, pp. 1-11)。免疫特異性結合CD317的抗體是商業上可得的(參見Novus Biologicals LLC；BioLegend, Inc.；也參見美國專利號8,834,876，其引用抗體HM1.24的重鏈和輕鏈的保存號，為FERM BP-5644和FERM BP-5646；也見美國專利號8,394,374)。抗CD317抗體“HM1.24”的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 302 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCK KASQDV NTAVA WYQQK PGQSPKLLIY SASNRYT GVP DRITGSGSGT DFTFTISSVQ AEDLALTTC Q QHYSTPFT FG SGTKLEIK

抗CD317抗體“HM1.24”的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 303 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT PYWMQ WVKQR PGQGLEWIG S IFPGDGDTRY SQKFKG KATL TADKSSSTAY MQLSILAFED SAVYYCAR GL RRGGYYFDY W GQGTTLTVSS

3. CEACAM5- 和 CEACAM6- 結合結構域

已經發現癌胚抗原相關的細胞黏附分子5 (CEACAM5)和6 (CEACAM6)與各種類型的癌症相關，包括髓樣甲狀腺癌、結直腸癌、胰腺癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內膜癌、乳腺癌、造血癌(hematopoietic cancer)、白血病和卵巢癌(參見PCT公開號WO 2011/034660)，尤其是結直腸、胃腸道、胰腺、非小細胞肺癌(NSCL)、乳腺、甲狀腺、胃、卵巢和子宮癌(參見Zheng, C.等(2011) “A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity ,” PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11)。

已經發現CEACAM5在90%的胃腸道、結直腸和胰腺癌中過表達，在70%的非小細胞肺癌細胞和50%的乳腺癌中過表達(參見Thompson, J.A.等(1991) “Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives ,” J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366)。

過表達的癌胚抗原相關的細胞黏附分子6 (CEACAM6)在各種人癌症的浸潤和轉移中起重要的作用，人癌症包括髓樣甲狀腺癌、結直腸癌、胰腺癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內膜癌、乳腺癌、造血癌，白血病和卵巢癌(參見PCT公開號WO 2011/034660；Deng, X.等(2014) “Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma ,” Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697；Cameron, S.等(2012) “Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis ,” Mol. Cancer 11:74, pp. 1-11；Chapin, C.等(2012) “Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung ,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25；Riley, C.J.等(2009) “Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer ,” Cancer Res. 69(5):1933-1940；Lewis-Wambi, J.S.等(2008) “Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells ,” Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779；Blumenthal, R.D.等(2007) “Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers ,” BMC Cancer. 7:2, pp. 1-15)。免疫特異性結合CEACAM5和CEACAM6的抗體是商業上可得的(參見Santa Cruz Biotechnology, Inc., Novus Biologicals LLC；Abnova Corporation)。人源化的抗CEACAM5 /抗CEACAM6抗體16C3(EP 2585476)的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 304 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC GASENIY GALN WYQRKP GKSPKLLIW G ASNLAD GMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYY CQN VLSSPYT FGG GTKLEIK

人源化的抗CEACAM5/抗CEACAM6抗體16C3(EP 2585476)的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 305 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGS GYTFT DYAMH WVKQS HAKSLEWIG L ISTYSGDTKY NQNFKG KATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAR GD YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S

人源化的抗CEACAM5/CEACAM6抗體hMN15(WO 2011/034660)的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 306 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTC SASSRVS YIH WYQQKPG KAPKRWIY GT STLAS GVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYC QQW SYNPPT FGQG TKVEIKR

人源化的抗CEACAM5/CEACAM6抗體hMN15(參見WO 2011/034660)的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 307 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSG FALT DYYMS WVRQA PGKGLEWLG F IANKANGHTT DYSPSVKG RF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S

4. DR5- 結合結構域

DR5是優選的癌症抗原。優選的抗人DR5-結合分子具備鼠科抗人DR5單克隆抗體“DR5 mAb 1 ”和/或“DR5mAb 2 ”的VL和/或VH結構域，更優選地具備這樣的抗人DR5單克隆抗體的VL結構域的1個、2個或所有3個CDR和/或VH結構域的1個、2個或所有3個CDR。可選地，可採用任何抗人DR5單克隆抗體，尤其是：卓齊妥單抗 (drozitumab)(本文命名為“DR5 mAb 3”) 、坎妥木單抗 (conatumumab)(本文命名為“DR5 mAb 4”) 、替加珠單抗 (tigatuzumab)(本文命名為“DR5 mAb 5”) 、LBY135-1 (本文命名為“DR5 mAb 6”) 、LBY135-2 (本文命名為“DR5mAb 7”) 和KMTR2 (本文命名為“DR5 mAb 8”) 。

a. 抗人 DR5 抗體 DR5 mAb 1

DR5可潛在地用於治療寬範圍的癌症(例如，結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和直腸癌。人DR5前體的氨基酸序列(NCBI序列NP_003833.4) (SEQ ID NO: 2 )是：
MEQRGQNAPA ASGARKRHGP GPREARGARP GLRVPKTLVL VVAAVLLLVS AESALITQQD LAPQQRVAPQ QKRSSPSEGL CPPGHHISED GRDCISCKYG QDYSTHWNDL LFCLRCTRCD SGEVELSPCT TTRNTVCQCE EGTFREEDSP EMCRKCRTGC PRGMVKVGDC TPWSDIECVH KESGTKHSGE APAVEETVTS SPGTPASPCS LSGIIIGVTV AAVVLIVAVF VCKSLLWKKV LPYLKGICSG GGGDPERVDR SSQRPGAEDN VLNEIVSILQ PTQVPEQEME VQEPAEPTGV NMLSPGESEH LLEPAEAERS QRRRLLVPAN EGDPTETLRQ CFDDFADLVP FDSWEPLMRK LGLMDNEIKV AKAEAAGHRD TLYTMLIKWV NKTGRDASVH TLLDALETLG ERLAKQKIED HLLSSGKFMY LEGNADSAMS

DR5 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RASKSVS SSGYSYMH WY QQKPGQPPKV LIF LSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YC QHSRDLPP T FGGGTKLEI K

DR5 mAb 1的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 4 ):RASKSVSSSGYSYMH ；DR5 mAb 1的CDR_L 2 (SEQ ID NO: 5 ):LSSNLDS ；DR5 mAb 1的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 6 ):QHSRDLPPT 。

DR5 mAb 1的VL結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 7 )編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc atctcatgc a gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcac tggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatcttt c tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgt cagc acagtaggga tcttcctccg acg ttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa

DR5 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 8 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)。C-末端氨基酸可用丙氨酸取代，以利於該VH結構域的亞克隆。
EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVAS GFDFS RYWMS WVRQA PGKGLEWIG E INPDSNTINY TPSLKD KFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTR RA YYGNPAWFAY WGQGTLVTVSS

DR5 mAb 1的CDR_H 1(SEQ ID NO: 9 ):GFDFSRYWMS ；DR5 mAb 1的CDR_H 2(SEQ ID NO: 10 ):EINPDSNTINYTPSLKD ；DR5 mAb 1的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 11 ):RAYYGNPAWFAY 。

DR5 mAb 1的VH結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 12 )編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc tcctgtgtag cctca ggatt cgattttagt agatactgga tgagt tgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattgga gaa attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggat aa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aaga agggcc tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct tcc

b. 抗人 DR5 抗體 DR5 mAb 2

(1). 鼠科抗人抗體 DR5 mAb 2

DR5 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 13 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITC KASQDVN TAVA WYQQKP GQSPKLLIY W ASTRHT GVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYC QQ HYITPWT FGG GTKLEIK

DR5 mAb 2的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 14 ):KASQDVNTAVA ；DR5 mAb 2的CDR_L 2(SEQ ID NO: 15 ):WASTRHT ；DR5 mAb 2的CDR_L 3(SEQ ID NO: 16 ):QQHYITPWT 。

DR5 mAb 2的VL結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 17 )編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc atcacctgc a aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cc tggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttac tgg gcatccaccc ggcacact gg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga cactttatta ctgt cagcaa cactatatca ctccgtggac g ttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaaa

DR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 18 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKAS GYTFT EYILH WVKQK SGQGLEWIG W FYPGNNNIKY NEKFKD KATL TADKSSSTVY MELSRLTSED SAVYFCAR HE QGPGYFDY WG QGTTLTVSS

DR5 mAb 2的CDR_H 1(SEQ ID NO: 19 ):GYTFTEYILH ；DR5 mAb 2的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 20 ):WFYPGNNNIKYNEKFKD ；DR5 mAb 2的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 21 ):HEQGPGYFDY 。

DR5 mAb 2的VH結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 22 )編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
aaggtccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtgaaac ccggggcatc agtgaagctg tcctgcaagg cttct gggta caccttcact gagtatattt tacac tgggt aaagcagaag tctggacagg gtcttgagtg gattggg tgg ttttatcctg gaaataataa tataaagtac aatgagaaat tcaaggac aa ggccacactg actgcggaca aatcctccag cacagtctat atggaactta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aaga cacgaa caaggaccag gttactttga ctac tggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcc

(2). 人源化的 DR5 mAb 2 (“hDR5 mAb 2”)

上述鼠科抗人DR5抗體DR5 mAb 2被人源化，以顯示人源化抗人DR5抗體的能力，從而當施用至人接受者時降低其抗原性。人源化產生四個人源化的VL結構域，其在本文命名為“hDR5 mAb 2 VL-2 ”、“hDR5 mAb 2 VL-3 ”、“hDR5 mAb 2 VL-4 ”和“hDR5 mAb 2 VL-5 ”，並產生一個人源化的VH結構域，其在本文命名為“hDR5 mAb 2 VH-2 ”。任何人源化的VL結構域均可與人源化的VH結構域配對。因此，包含與人源化的VH結構域配對的人源化的VL結構域中的一個的任何抗體一般稱為“hDR5 mAb 2 ”，並且人源化的VL/VH結構域的具體組合參考VL結構域命名。

hDR5 mAb 2 VL-2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 23 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYC QQ HYITPWT FGG GTKLEIK

hDR5 mAb 2 VL-2優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 24 )編碼：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact attacttgta aagcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg ggcacaaaac tggaaatcaa a

hDR5 mAb 2 VL-3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 25 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT IT CRASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQHYITPWT FGG GTKLEIK

hDR5 mAb 2 VL-3 優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 26)編碼：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg ggcacaaaac tggaaatcaa a

hDR5 mAb 2 VL-4 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 27 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT IT CRASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ HYITPWT FGG GTKLEIK

hDR5 mAb 2 VL-4 優選地由具有下面顯示的序列多核苷酸(SEQ ID NO: 28 )編碼：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca gaggatatcg ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg ggcacaaaac tggaaatcaa a

hDR5 mAb 2 VL-5 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 29 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITC RASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ HYITPWT FGG GTKLEIK

hDR5 mAb 2 VL-5 優選地由具有下面顯示的序列多核苷酸(SEQ ID NO: 30 )編碼：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatatcg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg ggcacaaaac tggaaatcaa a

hDR5 mAb 2 VH-2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 31 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EYILH WVRQA PGQGLEWMG W FYPGNNNIKY NEKFKD RVTI TADKSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCAR HE QGPGYFDY WG QGTLVTVSS

hDR5 mAb 2 VH-2 優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 32 )編碼：
caggtccagc tggtgcagag tggggcagag gtgaaaaagc caggggcatc agtgaaagtg tcttgtaaag catcaggtta tacatttact gagtacatcc tgcactgggt gcgacaggca ccaggacagg gactggaatg gatggggtgg ttctaccctg gcaacaacaa cattaagtac aacgagaagt ttaaagaccg ggtgaccatc acagcggata agtctaccag tacagtctat atggagctga gctccctgag aagcgaagac accgccgtct actattgcgc tcgccacgaa cagggtccag gttactttga ttattggggg cagggaactc tggtcacagt cagctcc

hDR5 mAb 2 VL-3、hDR5 mAb 2 VL-4和hDR5 mAb VL-5的VL結構域的CDR1具有氨基酸序列：RASQDVNTAVA (SEQ ID NO: 320 )。

c. 卓齊妥單抗 (“DR5 mAb 3”)

卓齊妥單抗 (“DR5 mAb 3”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 54 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
SELTQDPAVS VALGQTVRIT C SGDSLRSYY AS WYQQKPGQ APVLVIY GAN NRPS GIPDRF SGSSSGNTAS LTITGAQAED EADYYC NSAD SSGNHVV FGG GTKLTVLG

DR5 mAb 3的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 55 ):SGDSLRSYYAS ；DR5 mAb 3的CDR_L 2 (SEQ ID NO: 56 ):GANNRPS ；DR5 mAb 3的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 57 ):NSADSSGNHVV 。

卓齊妥單抗 (“DR5mAb 3”) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 58 )顯示在下麵(CDR殘基以底線顯示)：
EVQLVQSGGG VERPGGSLRL SCAAS GFTFD DYAMS WVRQA PGKGLEWVSG INWQGGSTGY ADSVKG RVTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAK IL GAGRGWYFDY WGKGTTVTVS S

DR5 mAb 3的CDR_H 1 (SEQ ID NO: 59 ):GFTFDDYAMS ；DR5 mAb 3的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 60 ):INWQGGSTGYADSVKG ；DR5 mAb 3的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 61 ):ILGAGRGWYFDY 。

d. 坎妥木單抗 (“DR5 mAb 4”)

坎妥木單抗 (“DR5 mAb 4”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 62 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSC RASQGIS RSYLA WYQQK PGQAPSLLIY GASSRAT GIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYC Q QFGSSPWT FG QGTKVEIK

DR5 mAb 4的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 63 ):RASQGISRSYLA ；DR5 mAb 4的CDR_L 2 (SEQ ID NO: 64 ):GASSRAT ；DR5 mAb 4的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 65 ):QQFGSSPWT 。

坎妥木單抗 (“DR5 mAb 4”) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 66 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVS GGSIS SGDYFWS WIR QLPGKGLEWI G HIHNSGTTY YNPSLKS RVT ISVDTSKKQF SLRLSSVTAA DTAVYYCAR D RGGDYYYGMD V WGQGTTVTV SS

DR5 mAb 4的CDR_H 1 (SEQ ID NO: 67 ):GGSISSGDYFWS ；DR5 mAb 4的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 68 ):HIHNSGTTYYNPSLKS ；DR5 mAb 4的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 69 ):DRGGDYYYGMDV 。

e. 替加珠單抗 (“DR5 mAb 5”)

替加珠單抗 (“DR5 mAb 5”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 70 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVG TAVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YSSYRT FGQG TKVEIK

DR5 mAb 5的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 71 ):KASQDVGTAVA ；DR5 mAb 5的CDR_L 2 (SEQ ID NO: 72 ):WASTRHT ；DR5 mAb 5的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 73 ):QQYSSYRT 。

替加珠單抗 (“DR5 mAb5”) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 74 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS SYVMS WVRQA PGKGLEWVA T ISSGGSYTYY PDSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAR RG DSMITTDY WG QGTLVTVSS

DR5 mAb 5的CDR_H 1 (SEQ ID NO: 75 ):GFTFSSYVMS ；DR5 mAb 5的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 76 ):TISSGGSYTYYPDSVKG ；DR5 mAb 5的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 77 ):RGDSMITTDY 。

f. LBY135-1 (“DR5 mAb 6”)

LBY135-1 (“DR5 mAb 6”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 78 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIAMTQSHKF MSTLVGDRVS ITCKAS QDVN TAIA WYQQKP GQSPKLLIY W ASTRHT GVPD RFYGSGSGTD YTLTISSMEA EDAATYYC QQ WSSNPLT FGA GTKLELKRA

DR5 mAb 6的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 79 ):QDVNTAIA ；DR5 mAb 6的CDR_L 2 (SEQ ID NO: 80 ):WASTRHT ；DR5 mAb 6的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 81 ):QQWSSNPLT 。

LBY135-1 (“DR5 mAb 6”) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 82 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKAS GYTFT DYTIH WVKQR SGQGLEWIG W FYPGGGYIKY NEKFKD RATL TADKSSNTVY MELSRLTSEG SAVYFCAR HE EGIYFDY WGQ GTTLTVSS

DR5 mAb 6的CDR_H 1 (SEQ ID NO: 83 ):GYTFTDYTIH ；DR5 mAb 6的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 84 ):WFYPGGGYIKYNEKFKD ；DR5 mAb 6的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 85 ):HEEGIYFDY 。

g. LBY135-2 (“DR5 mAb 7”)

LBY135-2 (“DR5 mAb 7”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 86 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITC KASQDVN TAIA WYQQKP GQSPKLLIY W ASTRHT GVPD RFTGSGSGTD YTLTISSVQA EDLALYYC QQ HYTTPFT FGS GTKL

DR5 mAb 7的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 87 ):KASQDVNTAIA ；DR5 mAb 7的CDR_L 2 (SEQ ID NO: 88 ):WASTRHT ；DR5 mAb 7的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 89 ):QQHYTTPFT 。

[00131] LBY135-2 (“DR5 mAb 7”) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 90 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKAS GYTFT DYTIH WVKQR SGQGLEWIG W FYPGGGYIKY NEKFKD RATL TADKSSNTVY MELSRLTSED SAVYFCAR HE EGIYFDY WGQ GTTLTVSS

DR5 mAb 7的CDR_H 1 (SEQ ID NO: 91 ):GYTFTDYTIH ；DR5 mAb 7的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 92 ):WFYPGGGYIKYNEKFKD ；DR5 mAb 7的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 93 ):HEEGIYFDY 。

h. KMTR2 (“DR5 mAb 8”)

KMTR2 (“DR5 mAb 8”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 94 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS SYLA WYQQKP GQAPRLLIY D ASNRAT GIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ RSNWPLT FGG GTKVEIKR

DR5 mAb 8的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 95 ):RASQSVSSYLA ；DR5 mAb 8的CDR_L 2 (SEQ ID NO: 96 ):DASNRAT ；DR5 mAb 8的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 97 ):QQRSNWPLT 。

KMTR2 (“DR5 mAb 8”) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 98 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLVQSGAE MKKPGASVKV SCKTS GYTFT NYKIN WVRQA PGQGLEWMG W MNPDTDSTGY PQKFQG RVTM TRNTSISTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SY GSGSYYRDYY YGMDV WGQGT TVTVSS

DR5 mAb 8的CDR_H 1 (SEQ ID NO: 99 ):GYTFTNYKIN ；DR5 mAb 8的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 100 ):WMNPDTDSTGYPQKFQG ；DR5 mAb 8的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 101 ):SYGSGSYYRDYYYGMDV 。

5. EphA2- 結合結構域

受體酪氨酸激酶，肝配蛋白A型受體2 (EphA2 )是優選的癌症抗原。EphA2通常在成人上皮組織中細胞與細胞接觸的位點表達，但是，最近研究已經顯示，其也在各種類型的上皮癌中過表達，其中在轉移損害中觀察到最大水準的EphA2表達。在各種癌症和許多腫瘤細胞系，包括前列腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和黑素瘤中已經發現高表達水準的EphA2 (參見Xu, J.等(2014) “High Epha2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome,” Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687-692 ； Miao, B. 等(2014) “EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma,” Cancer Discov. pii: CD-14-0295。EphA2好像不僅僅是癌症的標記物，而是似乎在許多人癌症中持續過表達並且功能上被改變(參見Chen, P.等(2014) “Epha2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of Lncap Prostate Cancer Cells ,” Oncol. Lett. 8(1):41-46)。

在一些實施方式中，可考慮選擇EphA2作為癌症抗原，並且使用抗EphA2抗體，以提供三特異性結合分子的癌症抗原結合結構域。示例性抗EphA2抗體包括“EphA2 mAb 1 ”、“EphA2 mAb 2 ”和“EphA2 mAb 3 ”。

a. EphA2 mAb 1

優選的抗人EphA2抗體(“EphA2 mAb 1”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 153 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GYTLYT FGGG TKLEIK

EphA2 mAb 1的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 154 ):RASQDISNYLN ；EphA2 mAb 1的CDR_L 2 (SEQ ID NO: 155 ):YTSRLHS ；EphA2 mAb 1的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 156 ):QQGYTLYT 。

EphA2 mAb 1的VL結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 157) 編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc atcagttgc a gggcaagtca ggacattagc aattatttaa ac tggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctac tac acatcaagat tacactca gg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgc caacag ggttatacgc tgtacacg tt cggagggggg accaagctgg aaataaaa

EphA2 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 158 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVS GFSLS RYSVH WVRQP PGKGLEWLG M IWGGGSTDYN SALKS RLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCAR KHG NYYTMDY WGQ GTSVTVSS

EphA2 mAb 1的CDR_H 1 (SEQ ID NO: 159 ):GFSLSRYSVH ；EphA2 mAb 1的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 160 ):MIWGGGSTDYNSALKS ；EphA2 mAb 1的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 161 ): KHGNYYTMDY 。

EphA2 mAb 1的VH結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 162 )編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc acatgcactg tctct gggtt ctcattatcc agatatagtg tacac tgggt tcgccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctggga atg atatggggtg gtggaagcac agactataat tcagctctca aatcc agact gagtatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag a aaacatggt aactactata ctatggacta c tggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcc

b. EphA2 mAb 2

第二優選的抗人EphA2抗體(“EphA2 mAb 2”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 163 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSSGNTYLH W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP T FGSGTKLEI K

EphA2 mAb 2的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 164 ):RSSQSLVHSSGNTYLH ；EphA2 mAb 2的CDR_L 2 (SEQ ID NO: 165 ):KVSNRFS ；EphA2 mAb 2的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 166 ):SQSTHVPT 。

EphA2 mAb 2的VL結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 318 )編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgc a gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacat tgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ac aaagtttc caaccgattt tct ggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgc t ctcaaagtac acatgttccc acg ttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa

EphA2 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 167 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKAS GFTFT NYGMN WVKQA PGKGLKWMG W INTYIGEPTY ADDFKG RFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAR EL GPYYFDY WGQ GTTLTVSS

EphA2 mAb 2的CDR_H 1 (SEQ ID NO: 168 ):GFTFTNYGMN ；EphA2 mAb 2的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 169 ):WINTYIGEPTYADDFKG ；EphA2 mAb 2的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 170 ):ELGPYYFDY 。

EphA2 mAb 2的VH結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 171 )編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg cttct gggtt taccttcaca aactatggaa tgaac tgggt gaagcaggct ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggc tgg ataaacacct atattggaga gccgacatat gctgatgact tcaaggga cg gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggccacat atttctgtgc aaga gaactg ggaccatact actttgacta c tggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcc

c. EphA2 mAb 3

進一步優選的抗人EphA2抗體(“EphA2 mAb 3”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 172 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITC KASQDVT TAVA WYQQKP GQSPKLLIF W ASTRHA GVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYC QQ HYSTPYT FGG GTKLEIK

EphA2 mAb 3的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 173 ):KASQDVTTAVA ；EphA2 mAb 3的CDR_L 2 (SEQ ID NO: 174 ):WASTRHA ；EphA2 mAb 3的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 175 ):QQHYSTPYT 。

EphA2 mAb 3的VL結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 176 )編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac atcacctgc a aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cc tggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaattact gattttc tgg gcatccaccc ggcacgct gg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg cactttatta ctgt caacaa cattatagca caccgtacac a ttcggaggg gggaccaagc tggaaataaa a

EphA2 mAb 3的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 177 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAAS GFTFT DHYMY WVRQT PEKRLEWVA T ISDGGSFTSY PDSVKG RFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTR DE SDRPFPY WGQ GTLVTVSS

EphA2 mAb 3的CDR_H 1 (SEQ ID NO: 178 ):GFTFTDHYMY ；EphA2 mAb 3的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 179 ):TISDGGSFTSYPDSVKG ；EphA2 mAb 3的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 180 ):DESDRPFPY 。

EphA2 mAb 3的VH結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 319 )編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctct ggatt cactttcact gaccattaca tgtat tgggt tcgccagact ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgca acc attagtgatg gcggtagttt cacctcctat ccagacagtg tgaagggg cg attcaccatc tccagagaca ttgccaagaa caacctgtac ctccaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aaga gatgag agcgataggc cgtttcctta c tggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctcc

6. gpA33- 結合結構域

在一些實施方式中，gpA33可是優選的癌症抗原。結直腸癌是西方世界最常見的惡性腫瘤之一並且是癌症死亡的主要原因(參見Silverberg, E.等(1989) “Cancer Statistics, 1989 ,” CA Cancer J Clin. 39(1):3-20)。對於結腸癌，一個潛在有用的靶是43kD跨膜糖蛋白A33 (gpA33 )，其在>95%的所有結直腸癌中表達(參見Heath, J.K.等(1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474；Ritter, G.等(1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686；Wong, N.A.等(2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia ,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263)。通過培養針對源自人胰腺癌的細胞系ASPC1的單克隆鼠科抗體首次發現了gpA33。

在一些實施方式中，可考慮選擇gpA33作為癌症抗原，並且使用抗gpA33抗體提供三特異性結合分子的癌症抗原結合結構域。示例性抗gpA33抗體是“gpA33 mAb 1 ”。

優選的抗人gpA33抗體(“gpA33 mAb 1”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 181 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC SARSSIS FMY WYQQKPG KAPKLLIY DT SNLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SSYPLT FGQG TKLEIK

gpA33 mAb 1的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 182 ):SARSSISFMY ；gpA33 mAb 1的CDR_L 2 (SEQ ID NO: 183 ):DTSNLAS ；gpA33 mAb 1的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 184 ):QQWSSYPLT 。

gpA33 mAb 1的VL結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 185 )編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgc t ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtac t ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctac gacaca agcaacctgg cctcc ggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg c cagcagtgg agcagctatc ctctgacc tt cggacagggg actaaactgg aaatcaag

gpA33 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 186 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKAS GYTFT GSWMN WVRQA PGQGLEWIG R IYPGDGETNY NGKFKD RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR IY GNNVYFDV WG QGTTVTVSS

gpA33 mAb 1的CDR_H 1 (SEQ ID NO: 187 ):GYTFTGSWMN ；gpA33 mAb1的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 188 ):RIYPGDGETNYNGKFKD ；gpA33 mAb 1的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 189 ):IYGNNVYFDV 。

gpA33 mAb 1的VH結構域優選地由具有下面顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO: 190 )編碼(編碼CDR的多核苷酸以底線顯示)：
caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag cgtgaaggtc tcctgcaaag catca ggcta tacatttaca ggcagctgga tgaac tgggt gaggcaggct ccaggacagg gactggagtg gatcggg cgc atctaccctg gagacggcga aactaactat aatggaaagt tcaaagac cg agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc taga atttac ggaaacaatg tctattttga cgtg tggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctcc

7. Her2- 結合結構域

在一些實施方式中，可考慮選擇Her2作為癌症抗原，並且使用抗Her2抗體提供三特異性結合分子的癌症抗原結合結構域。示例性抗Her2抗體包括“Her2 mAb 1 ”和曲妥珠單抗 。

a. Her2 mAb 1

抗Her2抗體“Her2 mAb 1 ”的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 191 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASFLES GVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ HYTTPPT FGQ GTKVEIKRT

抗Her2抗體“Her2 mAb 1 ”的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 192 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTAS GFNIK DTYIH WVKQR PEQGLEWIG R IYPTNGYTRY DPKFQD KATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGASVTVSS

b. 曲妥珠單抗

人源化的抗Her2抗體“曲妥珠單抗 ”的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 193 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASFLYS GVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ HYTTPPT FGQ GTKVEIKR

人源化的抗Her2抗體“曲妥珠單抗 ”的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 194 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAA SGFNIK DTYIH WVRQA PGKGLEWVA R IYPTNGYTRY ADSVKG RFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGTLVTVSS

8. B7-H3- 結合結構域

除了其在成神經細胞瘤細胞上的表達之外，還已知人B7-H3也在各種其他癌症細胞(例如，胃、卵巢和非小細胞肺癌)上表達。已經在腫瘤細胞系中經免疫組織學檢測到B7-H3蛋白質表達(參見Chapoval, A.等(2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production ,” Nature Immunol. 2:269–274；Saatian, B.等(2004) “Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation ,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217–L225；Castriconi等(2004) “Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (美國) 101(34):12640-12645)；Sun, M.等(2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes ,” J. Immunol. 168:6294-6297)。已經在心臟、腎、睾丸、肺、肝、胰腺、前列腺、結腸和成骨細胞細胞中發現了mRNA表達(參見Collins, M.等(2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands ,” Genome Biol. 6:223.1-223.7)。在蛋白質水準，在人肝、肺、膀胱、睾丸、前列腺、乳房、胎盤和淋巴器官中發現B7-H3 (參見Hofmeyer, K.等(2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (美國) 105(30):10277-10278)。

在一些實施方式中，可考慮選擇B7-H3作為癌症抗原，並且使用抗B7-H3抗體提供三特異性結合分子的癌症抗原結合結構域。示例性抗B7-H3抗體包括“B7-H3 mAb 1 ”、“B7-H3 mAb 2 ”和“B7-H3 mAb 3 ”。

a. B7-H3 mAb 1

抗B7-H3抗體“B7-H3 mAb 1 ”的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 195 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTC KASQNVD TNVA WYQQKP GQSPKALIY S ASYRYS GVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFC QQ YNNYPFT FGS GTKLEIK

抗B7-H3抗體“B7-H3 mAb 1 ”的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 196 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAAS GFTFS SFGMH WVRQA PEKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTLTV SS

b. B7-H3 mAb 2

抗B7-H3抗體“B7-H3 mAb 2 ”的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 197 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK

抗B7-H3抗體“B7-H3 mAb 2 ”的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 198 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKAS GYTFT SYWMQ WVKQR PGQGLEWIG T IYPGDGDTRY TQKFKG KATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GAGTTVTVSS

c. B7-H3 mAb 3

抗B7-H3抗體“B7-H3 mAb 3 ”的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 199 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITC RASESIY SYLA WYQQKQ GKSPQLLVY N TKTLPE GVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYC QH HYGTPPWT FG GGTNLEIK

抗B7-H3抗體“B7-H3 mAb 3 ”的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 200 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAAS GFTFS SYGMS WVRQT PDKRLEWVA T INSGGSNTYY PDSLKG RFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCAR HD GGAMDY WGQG TSVTVSS

9. EGF 受體 - 結合結構域 ( 西妥昔單抗 (Cetuximab))

嵌合抗EGFR抗體“西妥昔單抗 ”的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 201 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSC RASQSIG TNIH WYQQRT NGSPRLLIK Y ASESIS GIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYC QQ NNNWPTT FGA GTKLELKR

嵌合抗EGFR抗體“西妥昔單抗 ”的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 202 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVS GFSLT NYGVH WVRQS PGKGLEWLG V IWSGGNTDYN TPFTS RLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCAR ALT YYDYEFAY WG QGTLVTVSA

帕尼單抗 (Panitumumab) (例如，Vectibix®，Amgen)是根據本發明任一實施例的結合分子可使用的可選的EGF受體-結合抗體。

10. VEGF- 結合結構域 ( 貝伐單抗 (Bevacizumab))

人源化的抗VEGF抗體“貝伐單抗 ”的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 203 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC SASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKVLIY F TSSLHS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YSTVPWT FGQ GTKVEIKR

人源化的抗VEGF抗體“貝伐單抗 ”的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 204 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GYTFT NYGMN WVRQA PGKGLEWVG W INTYTGEPTY AADFKR RFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCA KYP HYYGSSHWYF DV WGQGTLVT VSS

11. 5T4- 結合結構域

癌胚蛋白質，5T4 ，是腫瘤相關的蛋白質，其展示在許多癌，包括腎癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌的細胞膜上和急性淋巴細胞白血病中(參見Boghaert, E.R.等(2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin ,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234；Eisen, T.等(2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin ,” Curr. Oncol. Rep. 16:370，1-6頁)。示例性抗5T4抗體(“5T4 mAb 1”) 的輕鏈可變結構域的氨基酸序列顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：(SEQ ID NO: 308 )：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQGIS NYLA WFQQKP GKAPKSLIY R ANRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYC LQ YDDFPWT FGQ GTKLEIK

這樣的示例性抗5T4抗體的重鏈可變結構域的氨基酸序列顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：(SEQ ID NO: 309 )：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKAS GYTFT SFWMH WVRQA PGQGLEWMG R IDPNRGGTEY NEKAKS RVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAG GN PYYPMDY WGQ GTTVTVSS

第二示例性抗5T4抗體(“5T4 mAb 2”) 的輕鏈可變結構域的氨基酸序列顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：(SEQ ID NO: 310 )：
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSIV YSNGNTYLE W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHVP FT FGSGTKLE IK

這樣的第二示例性抗5T4抗體的重鏈可變結構域的氨基酸序列顯示在下面(CDR殘基以底線顯示) (SEQ ID NO: 311 )：
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKAS GYTFT SYWIT WVKQR PGQGLEWIG D IYPGSGRANY NEKFKS KATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCAR YG PLFTTVVDPN SYAMDY WGQG TSVTVSS

12. IL13Rα2- 結合結構域

白介素-13受體α2 (IL13R α 2 )在各種癌症中過表達，癌症包括惡性膠質瘤、結直腸癌、宮頸癌、胰腺癌、多發性黑素瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌和肺癌(參見PCT公開號WO 2008/146911；Brown, C.E.等(2013) “Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis,” PLoS One. 18;8(10):e77769；Barderas, R.等(2012) “High Expression Of IL-13 Receptor Α2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis,” Cancer Res. 72(11):2780-2790；Kasaian, M.T.等(2011) “IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2,” J. Immunol. 187(1):561-569；Bozinov, O.等(2010) “Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas,” Neurol. Med. Chir. (Tokyo)50(8):617-621；Fujisawa, T.等(2009) “A novel role of interleukin-13 receptor alpha2 in pancreatic cancer invasion and metastasis,” Cancer Res. 69(22):8678-8685)。免疫特異性結合IL13Rα2的抗體是商業上可得的(例如，Abnova Corporation、Biorbyt、LifeSpan BioSciences、United States Biologicals；也參見PCT公開號WO2008/146911)。示例性抗IL13Rα2抗體(“hu08 ”)(參見PCT公開號WO2014/072888)的輕鏈可變結構域的氨基酸序列顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：(SEQ ID NO: 321 )：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVG TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRST GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYSAPWT FGG GTKVEIK

這樣的示例性抗IL13Rα2抗體(“hu08 ”)(參見PCT公開號WO2014/072888)的重鏈可變結構域的氨基酸序列顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：(SEQ ID NO: 322 )：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS RNGMS WVRQA PGKGLEWVA T VSSGGSYIYY ADSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR QG TTALATRFFD V WGQGTLVTV SS

13. 整聯蛋白 Beta6- 結合結構域

整聯蛋白β6 (ITGB6 )是整聯蛋白的亞型，其專門在上皮細胞的表面上表達，並且是細胞外基質(ECM)蛋白質的受體。ITGB6表達在腫瘤組織(比如結腸癌、前列腺癌、腎癌的那些組織)中特異性表達，但是一般在健康的上皮組織中是不可檢測的(參見Liang, B.等(2014) “Integrin β 6-targeted Immunoliposomes Mediate Tumor Specific Drug Delivery and Enhance Therapeutic Efficacy in Colon Carcinoma ,” Clin. Cancer Res. Dec 30. pii: clincanres.1194.2014)。免疫特異性結合ITGB6的單克隆抗體是商業上可用的(例如，MAB2075Z克隆R6G9，EMD Millipore；也參見，Weinacker, A.等(1994) “Role Of The Integrin Alpha V Beta 6 In Cell Attachment To Fibronectin. Heterologous Expression Of Intact And Secreted Forms Of The Receptor ,” J. Biol. Chem. 269:6940-6948)。抗ITGB6單克隆抗體3G9 和8G6 和其變異公開在PCT公開號WO 03/100033和WO 2007/008712中。

示例性人源化的抗ITGB6抗體(源自抗體3G9)(參見PCT公開號WO2007/008712)的輕鏈可變結構域的氨基酸序列顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：(SEQ ID NO: 312 )：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC SASSSVS SSYLY WYQQK PGQAPRLLIY STSNLAS GIP ARFSGSGSGT GFTLTISSLE PEDFAVYYC H QWSTYPPT FG GGTKVEIK

這樣的示例性人源化的抗ITGB6抗體(源自抗體3G9)(參見PCT公開號WO2007/008712)的重鏈可變結構域的氨基酸序列顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：(SEQ ID NO: 313 )：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS RYWMS WVRQA PGKGLEWVA S ISSGGRMYYP FTVKG RFTIS RDNAKNSLYL QMNSLRAEDT AVYYCAR GSI YDGYYVFPY W GQGTLVTVSS

示例性抗ITGB6抗體(源自抗體8G6)(參見PCT公開號WO2007/008712)的輕鏈可變結構域的氨基酸序列顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：(SEQ ID NO: 314 )：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS TSSYSYMY WY QQKPGQAPRL LIY YASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YC QHNWEIPF T FGGGTKVEI K

這樣的示例性抗ITGB6抗體(源自抗體8G6)(參見PCT公開號WO2007/008712)的重鏈可變結構域的氨基酸序列顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：(SEQ ID NO: 315 )：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTDYAMH WVRQAPGQGLEWMG VISTYYGNTNYNQKFKG RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR GGLRRGDRPSLQYAMDY WGQGTLVTVSS

14. 另外的抗癌症抗原結合結構域

在一些實施方式中，結合分子可使用的另外的抗癌症抗原抗體包括下述商業上可得的抗體：貝倫妥單抗 (Brentuximab) (例如，Adcetris®)，其結合CD30；吉妥單抗 (Gemtuzumab) (例如，Mylotarg®，Wyeth)，其結合CD33；和伊匹單抗 (Ipilimumab) (例如， Yervoy®)，其結合CTLA-4。

C. 示例性效應細胞 - 結合結構域

能夠結合免疫系統效應細胞的抗體可用於提供三特異性結合分子的效應細胞-結合結構域。尤其適合的是結合以下的抗體：CD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD22、CD32B、CD64、B細胞受體(BCR)、T細胞受體(TCR)和NKG2D受體。

1. CD2- 結合結構域

CD2是在T細胞和天然殺傷(NK)細胞的表面上發現的細胞黏附分子。可能作為NK細胞納米管形成的啟動子，CD2增強NK細胞細胞毒性(參見Mace, E.M.等(2014) “Cell Biological Steps And Checkpoints In Accessing NK Cell Cytotoxicity ,” Immunol. Cell. Biol. 92(3):245-255；Comerci, C.J.等(2012) “CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation ,” PLoS One 7(10):e47664:1-12)。抗CD2抗體(Lo-CD2a；ATCC登錄號：11423)的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 102 ) (CDR殘基以底線顯示)：
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISC RSSQSLL HSSGNTYLN W LLQRTGQSPQ PLIY LVSKLE S GVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYC MQFTHYP YT FGAGTKLE LK

抗CD2抗體(Lo-CD2a；ATCC登錄號：11423)的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 103 ) (CDR殘基以底線顯示)：
EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMY WVKQR PKQGLELVG R IDPEDGSIDY VEKFKK KATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCAR GK FNYRFAY WGQ GTLVTVSS

2. CD3- 結合結構域

在優選的實施方式中，三特異性結合分子結合的第二表位是CD3的表位。CD3是由四條不同的鏈組成的T細胞共受體(參見Wucherpfennig, K.W.等(2010) “Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling ,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140；1-14頁)。在哺乳動物中，複合物包含CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩條CD3ε鏈。這些鏈與稱為T細胞受體(TCR)的分子締合以便在T淋巴細胞中產生啟動信號。在缺少CD3的情況下，TCR不能適當組裝並且降解(參見Thomas, S.等(2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer ,” Immunology 129(2):170–177)。發現CD3結合所有成熟T細胞的膜，並且事實上不結合其他細胞類型的膜(參見Janeway，C.A.等(2005)在以下中：Immunobiology: THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE,”第6版, Garland Science Publishing, NY, 214-216頁；Sun, Z. J.等(2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer ,”Cell 105(7):913-923；Kuhns, M.S.等(2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex ,”Immunity. 2006年2月；24(2):133-139)。

如下面所討論，為了闡釋本發明，雙特異性抗人CD3 x抗人DR5-結合分子被生成。用於這樣的構建物的抗人CD3抗體在本文命名為“CD3 mAb 2 ”。CD3 mAb 2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG

CD3 mAb 2的CDR_L 1 (SEQ ID NO: 105 ):RSSTGAVTTSNYAN ；mAb 2的CDR_L 2CD3 (SEQ ID NO: 106 ):GTNKRAP ；CD3 mAb 2的CDR_L 3 (SEQ ID NO: 107 ):ALWYSNLWV 。

CD3 mAb 2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 108 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVK D RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL VTVSS

CD3 mAb 2的CDR_H 1 (SEQ ID NO: 109 ):TYAMN ；CD3 mAb 2的CDR_H 2 (SEQ ID NO: 110 ):RIRSKYNNYATYYADSVKD ；CD3 mAb 2的CDR_H 3 (SEQ ID NO: 111 ):HGNFGNSYVSWFAY 。

在一些CD3構造中，CD3 mAb 2 採用變異的VH結構域。變異的VH結構域具備D65G取代，因此具有下面顯示的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 ) (CDR殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVK G RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL VTVSS

取代造成CDR_H 2具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 113 ) RIRSKYNNYATYYADSVKG 。取代的位置(D65G)以雙底線顯示。

本文使用的第二抗CD3抗體是抗體莫羅單抗(Muromonab)-CD3 “OKT3” ( 參見Xu等(2000)“In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16-26)；Norman, D.J. (1995) “Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3 ,” Ther. Drug Monit. 17(6):615-620；Canafax, D.M.等(1987) “Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection ,” Pharmacotherapy 7(4):121-124；Swinnen, L.J.等(1993) “OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin-10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation ,” Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678)。OKT3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 114 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTC SASSSVS YMN WYQQKSG TSPKRWIY DT SKLAS GVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYC QQW SSNPFTF GSG TKLEINR

OKT3 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 115 )顯示在下面(CDR殘基以底線顯示)：
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMH WVKQR PGQGLEWIG Y INPSRGYTNY NQKFKD KATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCAR YY DDHYCL DYWG QGTTLTVSS

3. CD16- 結合結構域

CD16是FcγRIIIA受體。CD16由嗜中性粒細胞、嗜伊紅粒細胞、天然殺傷(NK)細胞和結合聚集的但是不結合單體人IgG的組織巨噬細胞表達(參見Peltz, G.A.等(1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013-1017；Bachanova, V.等(2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer ,” Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141；Miller, J.S. (2013) “Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic ,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253；Youinou, P.等(2002) “Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases ,” Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19；Peipp, M.等(2002) “Bi-specific Antibodies Targeting Cancer Cells ,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511)。

抗CD16抗體3G8的可變輕鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 116 ) (CDR殘基以底線顯示)：
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC KASQSVD FDGDSFMN WY QQKPGQPPKL LIY TTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YC QQSNEDPY T FGGGTKLEI K

抗CD16抗體3G8的可變重鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 117 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLR TSGMGVG WIR QPSGKGLEWL A HIWWDDDKR YNPALKS RLT ISKDTSSNQV FLKIASVDTA DTATYYCAQ I NPAWFAY WGQ GTLVTVSA

抗CD16抗體A9的可變輕鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 118 ) (CDR殘基以底線顯示)：
DIQAVVTQES ALTTSPGETV TLTC RSNTGT VTTSNYAN WV QEKPDHLFTG LIG HTNNRAP GVPARFSGSL IGDKAALTIT GAQTEDEAIY FC ALWYNNHW V FGGGTKLTV L

抗CD16抗體A9的可變重鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 119 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QVQLQQSGAE LVRPGTSVKI SCKASGYTFT NYWLG WVKQR PGHGLEWIG D IYPGGGYTNY NEKFKG KATV TADTSSRTAY VQVRSLTSED SAVYFCAR SA SWYFD VWGAR TTVTVSS

4. CD19- 結合結構域

CD19抗原是屬於免疫球蛋白Ig超家族的I型跨膜糖蛋白。CD19在濾泡樹突細胞和B細胞上表達。認為全B細胞標記物在整個B細胞發育中表達，但是在成熟細胞中相比在不成熟的B細胞中具有閾值更高的表達(參見Raufi A.等(2013) “Targeting CD19 In B-Cell Lymphoma: Emerging Role Of SAR3419 ,” Cancer Manag. Res. 5:225-233)。已經描述了許多CD19抗體(例如，MD1342、MEDI-551等) (參見Mei, H.E.等(2012) “Rationale Of Anti-CD19 Immunotherapy: An Option To Target Autoreactive Plasma Cells In Autoimmunity ,” Arthritis Res. Ther. 14(Suppl 5):S1:1-16)。抗CD19結合分子“蘭妥莫單抗”公開在EP 2186527中。

優選的抗CD19抗體(HD37)的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 120 ) (CDR殘基以底線顯示)：
DILITQSPKS MSMSVGERVT LTC KASENVV TYVS WYQQKP EQSPKLLIY G ASNRYT GVPD RFTGSGSATD FTLTISSVQA EDLADYHC GQ GYSYPYT FGG GTKLEIKR

抗CD19抗體HD37的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 121 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QVQLQQSGAE LVRPGSSVKI SCKAS GYAFS SYWMN WVKQR PGQGLEWIG Q IWPGDGDTNY NGKFKG KATL TADESSSTAY MQLSSLASED SAVYFCAR RE TTTVGRYYYA MDY WGQGTSV TVSS

5. CD20- 結合結構域

CD20是B細胞特異性分化抗原，其在成熟的B細胞和大部分B細胞非霍奇金淋巴瘤上表達，但是不在早期的B細胞祖細胞或後期成熟的血漿細胞上表達(參見Maloney, D.G. (2012) “Anti-CD20 Antibody Therapy for B-Cell Lymphomas ,” N. Engl. J. Med. 366:2008-2016)。利妥昔單抗是示例性抗人CD20抗體。嵌合抗CD20抗體(利妥昔單抗)的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 122 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTC RASSSVS YIH WFQQKPG SSPKPWIY AT SNLAS GVPVR FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYC QQW TSNPPT FGGG TKLEIKR

抗CD20抗體(利妥昔單抗)的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 123 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKAS GYTFT SYNMH WVKQT PGRGLEWIG A IYPGNGDTSY NQKFKG KATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCAR ST YYGGDWYFNV WGAGTTVTVS A

根據本發明任一實施方式的結合分子可使用的可選的抗CD20抗體包括下述商業上可得的抗體：替伊莫單抗 (例如，Zevalin®，Spectrum Pharmaceuticals, Inc.)、奧法木單抗 (例如，Arzerra®，SmithKlineGlaxo)和托西莫單抗 (例如，Bexxar®，GlaxoSmithKline)。

6. CD22- 結合結構域

CD22是在成熟的B細胞表面上發現的糖結合跨膜蛋白質，並且，在較小程度上，在一些不成熟B細胞上被發現(參見WO 2011/032633；Poe, J.C.等(2012) “CD22 And Siglec-G In B Cell Function And Tolerance ,” Trends Immunol. 33(8):413-420；Chen, W.C.等(2012) “Targeting B Lymphoma With Nanoparticles Bearing Glycan Ligands Of CD22 ,” Leuk. Lymphoma 53(2):208-210；Walker, J.A. (2008) “CD22: An Inhibitory Enigma ,” Immunology 123(3):314-325；Coleman, M.等(2003) “Epratuzumab: Targeting B-Cell Malignancies Through CD22 ,” Clin. Cancer Res. 9(10 Pt 2):3991S-3994S)。

抗CD22抗體(依帕珠單抗)的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 124 ) (CDR殘基以底線顯示)：
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MSC KSSQSVL YSANHKNYLA WYQQKPGKAP KLLIY WASTR ES GVPSRFSG SGSGTDFTFT ISSLQPEDIA TYYC HQYLSS WT FGGGTKVQ IKR

抗CD22抗體(依帕珠單抗)的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 125 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKAS GYTFT SYWLH WVRQA PGQGLEWIG Y INPRNDYTEY NQNFKD KATI TADESTNTAY MELSSLRSED TAFYFCAR RD ITTFY WGQGT TVTVSS

7. CD32B- 結合結構域

結合人CD32B的抗體的VL結構域的優選序列是CD32B mAb 1 (SEQ ID NO: 126 ) (CDR殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTC RASQEIS GYLS WLQQKP DGTIKRLIY A ASTLDS GVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYC LQ YFSYPLT FGA GTKLELK

結合人CD32B的CD32B mAb 1抗體的VH結構域的優選序列是(SEQ ID NO: 127 ) (CDR殘基以底線顯示)：
EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEAS GFTFS DAWMD WVRQS PEKGLEWVA E IRNKAKNHAT YYAESVIG RF TISRDDSKSS VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDY WGQGT TLTVSS

8. CD64- 結合結構域

CD64是FcγRI受體並且在單核細胞/巨噬細胞、樹突細胞和啟動粒細胞上表達。表達可通過IFN-γ刺激而上調。CD64結合IgG免疫複合物。CD64在抗原捕獲、IgG/抗原複合物的吞噬和抗體-依賴性細胞毒性中發揮作用(參見WO 2006/002438)。

結合人CD64的抗體的VL結構域的優選序列是CD64 mAb 1 (SEQ ID NO: 128 ) (CDR殘基以底線顯示)：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS SYLA WYQQKP GQAPRLLIY D ASSRAT GIPA RFGGSGSGGT DFTLTISSLE PEDFAVYYC Q LRSNWPPYT F GQGTKLEIK

結合人CD64的抗體的VH結構域的優選序列是(SEQ ID NO: 129 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFIFS GYGMH WVRQA PGKGLEWVT V IWYDGSNKYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAR DT GDRFFDY WGQ GTLVTVSS

9. BCR/CD79- 結合結構域

BCR由膜免疫球蛋白組成，膜免疫球蛋白與非共價締合的CD79的α和β亞單位(分別為“CD79a”和“CD79b”)一起形成BCR複合物。CD79a和CD79b是信號轉導亞單位，其包含信號轉導需要的保守的免疫受體酪氨酸基的啟動基序(“ITAM”)(參見Dylke, J.等(2007) “Role Of The Extracellular And Transmembrane Domain Of Ig-Alpha/Beta In Assembly Of The B Cell Antigen Receptor (BCR) ,” Immunol. Lett. 112(1):47-57；Cambier, J.C. (1995) “New Nomenclature For The Reth Motif (or ARH1/TAM/ARAM/YXXL) ,” Immunol. Today 16:110)。BCR複合物通過多價抗原的聚集啟動CD79a和CD79b ITAMs的轉磷酸以及受體相關的激酶的啟動(參見DeFranco, A.L. (1997) “The Complexity Of Signaling Pathways Activated By The BCR ,” Curr. Opin. Immunol. 9:296-308；Kurosaki, T. (1997) “Molecular Mechanisms In B Cell Antigen Receptor Signaling ,” Curr. Opin. Immunol. 9:309-318；Kim, K.M.等(1993) “Signalling Function Of The B-Cell Antigen Receptors ,” Immun. Rev. 132:125-146)。磷酸化的ITAMs募集另外的效應子比如PI₃ K、PLC-γ和Ras/MAPK途徑的成員。這些信號傳導事件是造成B細胞增殖和啟動標記物(比如MHCII和CD86)的增加的表達的原因，啟動標記物對於誘導(prime) B細胞以便它們隨後與T輔助(“T_h ”)細胞相互作用是必要的。

結合人B細胞受體(CD79)的抗體的VL結構域的優選序列是CD79 mAb 1 (SEQ ID NO: 130 ) (CDR殘基以底線顯示)：
DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISC KSSQSLL DTDGKTYLN W LLQRPQGSPN RLIY LVSKLD S GVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYC WQGTHFP LT FGAGTKLE LK

結合人B細胞受體(CD79)的CD79 mAb 1抗體的VH結構域的優選序列是(SEQ ID NO: 131 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKA SGYTFT SYWMN WVKQR PGQGLEWIG M VDPSDSETHY NQMFKD KATL TVDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARAM GYWGQGTSVT VSS

10. T 細胞受體 - 結合結構域

在可選的實施方式中，由三特異性結合分子結合的第二表位是T細胞受體(TCR)的表位。T細胞受體由CD4+或CD8+ T細胞天然地表達，並且允許這樣的細胞識別由抗原呈遞細胞的I類或II類MHC蛋白結合和呈遞的抗原肽。通過TCR識別pMHC (肽–MHC)複合物啟動細胞免疫應答的擴展，細胞免疫應答導致細胞因數的產生和抗原呈遞細胞的裂解(參見，例如，Armstrong, K.M.等(2008) “Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide–MHC Complexes ,” Biochem. J. 415(Pt 2):183–196；Willemsen, R. (2008) “Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy ,” Cytometry A. 73(11):1093-1099；Beier, K.C.等(2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation ,” Eur. Respir. J. 29:804-812；Mallone, R.等(2005) “Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes ,” Am. J. Ther. 12(6):534–550)。CD3是結合TCR的受體(參見Thomas, S.等(2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer ,” Immunology 129(2):170-177；Guy, C.S.等(2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex ,” Immunol. Rev. 232(1):7-21；St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) “Novel Targeted Therapies For Autoimmunity ,” Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657；Baeuerle, P.A.等(Epub 2009 Jun 9) “Bi-specific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944；Smith-Garvin, J.E.等(2009) “T Cell Activation ,” Annu. Rev. Immunol. 27:591-619；Renders, L.等(2003) “Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression ,” Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309)。

特異性結合T細胞受體的抗體包括抗TCR抗體BMA 031 (參見EP 0403156；Kurrle, R.等(1989) “BMA 031 – A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application ,” Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019；Nashan, B.等(1987) “Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex,” Transplant Proc. 19(5):4270-4272；Shearman, C.W.等(1991) “Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell,” J. Immunol. 146(3):928-935；Shearman, C.W.等(1991) “Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor ,” J. Immunol. 147(12):4366-4373)。

抗TCR抗體BMA 031的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 132 ) (CDR殘基以底線顯示)：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC SATSSVS YMH WYQQKPG KAPKRWIY DT SKLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYC QQW SSNPLT FGQG TKLEIK

抗TCR抗體BMA 031的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 133 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT SYVMH WVRQA PGQGLEWIG Y INPYNDVTKY NEKFKG RVTI TADKSTSTAY LQMNSLRSED TAVHYCAR GS YYDYDGFVY W GQGTLVTVSS

11. NKG2D 受體 - 結合結構域

在可選的實施方式中，由三特異性結合分子結合的第二表位是NKG2D受體的表位。NKG2D受體在所有的人(和其他哺乳動物)天然殺傷細胞上表達(參見Bauer, S.等(1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA ,” Science 285(5428):727-729；Jamieson, A.M.等(2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1):19-29)以及在所有的CD8⁺ T細胞上表達(參見Groh, V.等(2001) “Costimulation Of CD8 αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells ,” Nat. Immunol. 2(3):255-260；Jamieson, A.M.等(2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1):19-29)。這樣的結合配體，尤其是不在正常細胞上表達的那些，包括組織相容性60 (H60)分子、視黃酸早期可誘導的基因-1 (RAE-1)的產物和鼠科UL16-結合蛋白樣轉錄體1 (MULT1) (參見Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands ,” Nature Rev. Immunol. 3:781-790；Coudert, J.D.等(2005) “Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells ,” Blood 106:1711-1717)。特異性結合NKG2D受體的抗體包括KYK-2.0 (參見Kwong, KY等(2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity ,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156；和PCT/US09/54911)。

抗NKG2D抗體KYK-1.0的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 134 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QPVLTQPSSV SVAPGETARI PC GGDDIETK SVH WYQQKPG QAPVLVIY DD DDRPS GIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYC QVW DDNNDEWV FG GGTQLTVL

抗NKG2D抗體KYK-1.0的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 135 ) (CDR殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMH WVRQA PGKGLEWVA F IRYDGSNKYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAK DR FGYYLDY WGQ GTLVTVSS

抗NKG2D抗體KYK-2.0的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 136 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QSALTQPASV SGSPGQSITI SC SGSSSNIG NNAVN WYQQL PGKAPKLLIY YDDLLPS GVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYC A AWDDSLNGPV FGGGTKLTVL

抗NKG2D抗體KYK-2.0的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 137 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMH WVRQA PGKGLEWVA F IRYDGSNKYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK DR GLGDGTYFDY WGQGTTVTVS S

D. 優選的三特異性結合分子

1. 優選的 Fc 結構域

兩條重鏈的CH2和CH3結構域相互作用形成Fc 結構域 ，其是由細胞Fc 受體 (Fc γ Rs) 識別的結構域。如本文所使用，術語“Fc結構域”用於限定IgG重鏈的C-末端區域。示例性人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 1 )：

遍及本說明書，IgG重鏈中殘基的編號是如在以下文獻中的EU索引的編號：Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版, Public Health Service, NH1，MD (1991)，其通過參考明確併入本文。“如在Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗體的編號。來自免疫球蛋白的成熟的重鏈和輕鏈的可變區的氨基酸由氨基酸在鏈中的位置命名。Kabat描述了很多抗體的氨基酸序列、鑒別了各亞組的氨基酸一致性序列並分配殘基號給各氨基酸。通過參考保守的氨基酸比對所討論的抗體與Kabat中的一致性序列中的一條，Kabat的編號方案可延伸到不包括在他的綱要中的抗體。用於分配殘基號的這種方法已經成為領域中的標準，並容易鑒別在不同抗體中處於相等位置的氨基酸，抗體包括嵌合或人源化變異。例如，在人抗體輕鏈的位置50的氨基酸佔據了與小鼠抗體輕鏈的位置50處的氨基酸等同的位置

儘管邊界可能稍微不同，但是根據Kabat的編號系統，人IgG Fc結構域的CH2結構域通常從人IgG的氨基酸231延伸至氨基酸341。根據Kabat的編號系統，人IgG的CH3結構域通常從氨基酸342延伸至447。“鉸鏈區”或“鉸鏈結構域”一般定義為從人IgG1的Glu216延伸至Pro230。

在抗體固定區中的許多不同的位置(例如，Fc位置，包括但不限於270、272、312、315、356和358位，如通過Kabat中闡釋的EU索引編號)已經觀察到多態性，因此在呈現的序列和現有技術中的序列之間可能存在稍微的不同。已經充分表徵了人免疫球蛋白的多態形式。目前，已知18個Gm同種異型(allotype)：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (參見Lefranc, 等, The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990)；Lefranc, G.等, 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。在一些實施方式中，抗體可摻入任何任何免疫球蛋白基因的同種異型、同族同種異型(isoallotype)或單元型(haplotype)，並且不限於具有本文提供的序列的同種異型、同族同種異型或單元型。

啟動和抑制信號在它們連接至Fc結構域之後通過Fc受體(FcγRs)被轉導。這些完全相反的功能是由於不同受體同種型之間的結構差異造成的。受體的胞質信號轉導結構域中的兩個不同的結構域——稱為基於免疫受體酪氨酸的啟動基序(ITAMs)或基於免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIMS)——是造成不同應答的原因。募集不同胞質酶到這些結構中控制了FcγR-介導的細胞應答的結果。含有ITAM的FcγR複合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，然而，含ITIM的複合物僅包括FcγRIIB。人嗜中性粒細胞表達FcγRIIA基因。通過免疫複合物或特異性抗體交聯聚集的FcγRIIA用於使ITAM與促進ITAM磷酸化的受體相關的激酶聚集。ITAM磷酸化充當Syk激酶的泊靠位點，Syk激酶的啟動導致下游底物(例如，PI₃ K)的啟動。細胞啟動導致促炎性介質的釋放。FcγRIIB基因在B淋巴細胞上表達；其細胞外結構域與FcγRIIA是96%一致的，並且以不能區分的方式結合IgG複合物。ITIM在FcγRIIB的胞質結構域中的存在定義了FcγR的這種抑制性亞類。最近，確定了這種抑制的分子基礎。當與啟動FcγR共連接時，FcγRIIB中的ITIM成為磷酸化的，並且吸引肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)的SH2結構域，肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)水解由於含ITAM的FcγR介導的酪氨酸激酶啟動而釋放的磷酸肌醇信使，從而防止細胞內Ca⁺⁺ 的流入。因此FcγRIIB的交聯抑制對FcγR連接的啟動應答並抑制細胞應答。B-細胞啟動、B-細胞增殖和抗體分泌因此被中斷。

在一些實施方式中，結合分子的Fc結構域可以是完整的Fc結構域(例如，完整的IgG Fc結構域)或僅僅是完整的Fc結構域的片段。儘管雙特異性單價Fc雙抗體的Fc區可具有結合於一個或多個Fc受體(例如，FcγR(s))的能力，但更優選這樣的Fc結構域將導致對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)的改變的結合 (相對於由野生型Fc結構域的結合顯示的)，或將基本上消除這樣的Fc結構域結合抑制性受體(一個或多個)的能力。因此，含Fc結構域的雙抗體的Fc結構域可包括完整的Fc結構域的CH2結構域中的一些或全部和/或CH3結構域中的一些或全部，或可包括變異的CH2和/或變異的CH3序列(相對於完整的Fc結構域的CH2或CH3結構域，其可包括，例如，一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。這樣的Fc結構域可包括非Fc多肽部分或可包括非天然的完整的Fc結構域的部分或可包括非天然產生的取向的CH2和/或CH3結構域(諸如例如，兩個CH2結構域或兩個CH3結構域，或在N-末端至C-末端方向連接至CH2結構域的CH3結構域等)。

被鑒別為改變效應子功能的Fc結構域修飾在本領域中是已知的，包括提高與啟動受體(例如，FcγRIIA (CD16A)的結合的修飾和降低與抑制性受體(例如，FcγRIIB (CD32B)的結合的修飾 (參見，例如，Stavenhagen, J.B.等(2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors ,” Cancer Res. 57(18):8882-8890)。

在一些實施方式中，對於含Fc結構域的雙抗體的多肽鏈的CH2-CH3結構域，優選顯示對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上沒有的)結合(相對於通過野生型Fc結構域 (SEQ ID NO:1 )顯示的結合)。能夠介導這種改變的結合的Fc變異和突變體形式如上所述。在優選實施方式中，這樣的雙抗體的第一和/或第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括任意1、2、3、4、5、6或7個如下取代：L234A、L235A、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。具有與CD32B降低的結合和/或與CD16A增加的結合的人IgG1 Fc結構域的示例性變異包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L取代。這些氨基酸取代可以任何組合存在於人IgG1 Fc結構域中。在一個實施方式中，人IgG1 Fc結構域變異包含F243L、R292P和Y300L取代。在另一實施方式中，人IgG1 Fc結構域變異包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L取代。在一個實施方式中，這樣的雙抗體的第一和/或第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括任何1、2或3個如下取代：L234A、L235A、N297G、N297Q。在另一實施方式中，人IgG1 Fc結構域變異包含N297Q取代、L234A和L235A取代或D265A取代，因為這些突變消除了FcR結合。可選地，利用這樣的CH2-CH3結構域，其內在地顯示對FcγRIIIA (CD16a)降低的(或基本上沒有的)結合和/或降低的效應物功能(相對於通過野生型IgG1 Fc結構域 (SEQ ID NO:1 )顯示的結合)。在具體實施方式中，含Fc結構域的雙抗體包括IgG2 Fc結構域或IgG4 Fc結構域。在使用IgG4 Fc結構域的情況下，還包括引入穩定化突變，諸如S228P，如通過Kabat中列出的EU索引所編號的(參見Lu等, (2008) “The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation ,” J Pharmaceutical Sciences 97:960-969)，以降低鏈交換的發生。本領域中已知的其他穩定化突變可以被引入到IgG4 Fc結構域中(參見Peters, P等, (2012) “Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability ,” J. Biol. Chem., 287:24525-24533；PCT專利公開號：WO 2008/145142)。由於N297A、L234A、L235A和D265A取代消除了效應子功能，在期望效應子功能的情況下，優選不採用這些取代。

這樣的多肽鏈的CH2和/或CH3結構域在序列上不需要是一致的，並且有利地被修飾以促進兩條多肽鏈之間的複合。例如，氨基酸取代(優選用包括形成“杵”的大側基的氨基酸例如色氨酸進行取代)可被引入CH2或CH3結構域，以便空間幹擾將防止與類似的突變結構域的相互作用並將迫使突變的結構域與其中互補或適應性突變已經被工程化的結構域——即，“臼”——配對(例如，用甘氨酸取代)。這樣的突變組可被工程化到三特異性結合分子的任何兩個多肽中。相對於同源二聚化偏愛異源二聚化的蛋白質工程化的方法在本領域中是悉知的，尤其是關於工程化免疫球蛋白樣分子，這些都包括在本文中(參見，例如，Ridgway等 (1996)“‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621；Atwell等 (1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35；和Xie等 (2005)A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101；其均通過引用以其整體併入本文)。優選“杵”被工程化到第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中和“臼”被工程化到包含CH2-CH3的其他多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此，“杵”將有助於防止第一多肽鏈經其CH2和/或CH3結構域而同源二聚化。CH2-CH3 “攜帶臼的”多肽鏈與CH2-CH3 “攜帶杵的”多肽鏈異源二聚化，並且也與本身同二聚化。優選的杵通過修飾天然IgG Fc結構域以包含修飾T366W而產生。優選的臼通過修飾天然IgG Fc結構域以包含修飾T366S、L368A和Y407V而產生。為了幫助從終三特異性結合分子純化“攜帶臼的”多肽鏈同二聚體，“攜帶臼的” Fc結構域的CH2和CH3結構域的蛋白A結合位點優選地通過在435位的氨基酸取代而被突變(H435R)。因此，“攜帶臼的” Fc結構域同二聚體不結合蛋白A，而期望的三特異性結合分子經在第一多肽鏈上的蛋白A結合位點保持其結合蛋白A的能力。

在一些實施方式中，包含Fc結構域的雙抗體的第一多肽鏈的CH2和CH3結構域的優選序列具有“攜帶杵的 ”序列(SEQ ID NO: 52 )：
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN H YTQKS LSLSPGK

具有兩條多肽鏈的、包含Fc結構域的雙抗體的第二多肽鏈(或具有三條多肽鏈的、包含Fc結構域的雙抗體的第三多肽鏈)的CH2和CH3結構域的優選序列具有“攜帶臼的 ”序列(SEQ ID NO: 53 )：
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPGK

如將注意的，SEQ ID NO: 52 和SEQ ID NO: 53 的 CH2-CH3結構域包括在234位用丙氨酸進行的取代和在235用丙氨酸進行的取代，因此形成Fc結構域，展示與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上沒有的)結合(相對於野生型Fc結構域(SEQ ID NO: 1 )展示的結合)。

優選地，第一多肽鏈具有“攜帶杵的” CH2-CH3序列，比如SEQ ID NO: 52 的序列。但是，如將認識到，“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO: 53 )可在第一多肽鏈中採用，在該情況下，“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO: 52 )將在具有兩條多肽鏈的、包含Fc結構域的雙抗體的第二多肽鏈(或具有三條多肽鏈的、包含Fc結構域的雙抗體的第三多肽鏈)中採用。

2. 優選的第一多肽鏈

在一些實施方式中，結合分子的第一多肽鏈包括能夠結合表位I的可變輕鏈結構域(VL_I )、能夠結合表位II的可變重鏈結構域(VH_II )、異源二聚體-促進結構域和CH2-CH3結構域。

因為第一多肽的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域針對不同的表位，它們不能締合在一起形成能夠結合表位I或表位II的結合結構域。第一多肽的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域通過足夠短以基本上防止這些結構域締合的間插接頭肽而彼此間隔開。示例性接頭，稱為“接頭 1 ”具有序列(SEQ ID NO: 33 )：GGGSGGGG。

第一多肽的可變重鏈結構域和該多肽的異源二聚體-促進結構域優選地通過包含1、2、3或更多個半胱氨酸殘基的間插接頭肽而彼此間隔開。優選的包含半胱氨酸的間隔肽(“接頭2”)具有序列SEQ ID NO: 34 ：GGCGGG。

可用於連接CH2-CH3結構域與結合分子的多肽鏈的接頭包括：ASTKG (SEQ ID NO: 47 )、DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )、LEPKSS (SEQ ID NO: 49 )和APSSSPME (SEQ ID NO: 50 )、APSSS (SEQ ID NO: 152 )和GGG或GCG。SEQ ID NO: 49 可用於替代GGG或GCG以易於克隆。另外，SEQ ID NO: 49 之後可緊隨SEQ ID NO: 47 ，以形成可選接頭(LEPKSSDKTHTCPPCP；SEQ ID NO: 51) 。

協同選擇第一多肽的異源二聚體-促進結構域和第二多肽的異源二聚體-促進結構域。結構域彼此不同並且被設計為彼此締合以便促進第一和第二多肽鏈的締合。例如，異源二聚體-促進結構域中的一個被工程化以在pH 7具有負電荷，而兩條多肽鏈中的另一條被工程化，以在pH 7具有正電荷。這樣帶電荷的結構域的存在促進第一和第二多肽之間的締合，因此促進異源二聚化。哪個異源二聚體-促進結構域被提供至哪條鏈不重要，只要在第一和第二多肽鏈上採用的結構域不同以便促進這樣的鏈之間的異源二聚化。

異源二聚體-促進結構域可以是IgG CL和CH1結構域或可以是具有氨基酸序列GVEPKSC (SEQ ID NO: 35 )或VEPKSC (SEQ ID NO: 36 )的肽，其源自人IgG的鉸鏈結構域並且代替CL結構域，可採用人κ輕鏈的C-末端6個氨基酸，GFNRGEC (SEQ ID NO: 37 )或FNRGEC (SEQ ID NO: 38 )。

但是，更優選地，這樣的雙抗體的異源二聚體-促進結構域由一、二、三或四個串聯重複的帶相反電荷的螺旋結構域形成，此帶相反電荷的螺旋結構域包括具有至少六、至少七或至少八個帶電荷的氨基酸殘基的序列(參見Apostolovic, B.等(2008) “pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil ,” Biomacromolecules 9:3173–3180；Arndt, K.M.等(2001) “Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain ,” J. Molec. Biol. 312:221-228；Arndt, K.M.等(2002) “Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils ,” Structure 10:1235-1248；Boucher, C.等(2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled–Coil Interactions ,” Analytical Biochemistry 399:138-140；Cachia, P.J.等(2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy ,” J. Mol. Recognit. 17:540-557；De Crescenzo, G.D.等(2003) “Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding ,” Biochemistry 42:1754-1763；Fernandez-Rodriquez, J.等(2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag ,” Protein Science 21:511-519；Ghosh, T.S.等(2009) “End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures ,” Acta Crystallographica D65:1032-1041；Grigoryan, G.等(2008) “Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions ,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483；Litowski, J.R.等(2002) “Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity ,” J. Biol. Chem. 277:37272-37279；Steinkruger, J.D.等(2012) “The d′--d--d′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′--a--a′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif ,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626–2633；Straussman, R.等(2007) “Kinking the Coiled Coil – Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface ,” J. Molec. Biol. 366:1232-1242；Tripet, B.等(2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance ,” J. Molec. Biol. 323:345–362；Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies ,” Adv. Prot. Chem. 70:79-112；Zeng, Y.等(2008) “A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism ,” J. Gene Med. 10:355-367)。

這樣的重複螺旋結構域可以是精確的重複或可具有取代。例如，第一多肽的異源二聚體-促進結構域鏈可包括具有八個帶負電荷氨基酸殘基的序列和第二多肽鏈的異源二聚體-促進結構域可包括具有八個帶負電荷氨基酸殘基的序列。哪個螺旋被提供至第一或第二多肽鏈不重要，只要具有相反電荷的螺旋用於另一多肽鏈。帶正電荷的氨基酸可以是賴氨酸、精氨酸、組氨酸等，和/或帶負電荷的氨基酸可以是谷氨酸、天冬氨酸等。帶正電荷的氨基酸優選地是賴氨酸和/或帶負電荷的氨基酸優選地是谷氨酸。有可能僅僅採用單個異源二聚體-促進結構域 (因為這樣的結構域抑制同二聚化，從而促進異源二聚化)，但是，優選的雙抗體的第一和第二多肽鏈的二者均包含異源二聚體-促進結構域。

在優選的實施方式中，異源二聚體促進結構域中的一個將包括四個串聯“E-螺旋”螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 ： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)，其谷氨酸鹽殘基將在pH 7形成負電荷，而異源二聚體促進結構域中的另一個將包括四個串聯“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO: 40 ： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)，其賴氨酸殘基在pH 7形成正電荷。這樣的帶電結構域的存在促進第一和第二多肽之間的締合，因此促進異源二聚體形成。尤其優選的是這樣的異源二聚體促進結構域，其中SEQ ID NO:39 的四個串聯“E-螺旋”螺旋結構域中的一個已經被修飾成含有半胱氨酸殘基： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO: 41 )。同樣地，尤其優選的是這樣的異源二聚體促進結構域，其中SEQ ID NO:40 的四個串聯“K-螺旋”螺旋結構域中的一個已經被修飾成含有半胱氨酸殘基： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO: 42 )。

如WO 2012/018687中公開，為了提高雙抗體的體內藥代動力學性質，雙抗體可以被修飾成在雙抗體的一個或多個端處含有血清-結合蛋白的多肽部分。最優選地，這樣的血清-結合蛋白的多肽部分將被安裝在雙抗體的C-末端。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白，並且，其在人中的半衰期為19天。白蛋白具有若干小分子結合位點，其允許白蛋白非共價地結合其他蛋白，從而延長其血清半衰期。鏈球菌屬(Streptococcus)菌株G148的蛋白G的白蛋白-結合結構域3 (ABD3)由形成穩定的三-螺旋束的46個氨基酸殘基組成，並具有廣泛的白蛋白-結合特異性(參見Johansson, M.U.等 (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Module s,” J. Biol. Chem. 277(10): 8114-8120。因此，對於提高雙抗體的體內藥代動力學性質，尤其優選的血清-結合蛋白的多肽部分是來自鏈球菌蛋白G的白蛋白-結合結構域(ABD )，更優選地，鏈球菌屬菌株G148的蛋白G的白蛋白-結合結構域3 (ABD3) (SEQ ID NO:43 )：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP。

如在WO 2012/162068 (通過參考併入本文)中公開，SEQ ID NO: 43 “去免疫化的 ”變異能夠減弱或消除II類MHC結合。基於组合突變結果，考虑下述取代组合是用於形成这樣的去免疫化的白蛋白-結合結構域的优选取代：66S/70S +71A；66S/70S +79A；64A/65A/71A+66S；64A/65A/71A+66D；64A/65A/71A+66E；64A/65A/79A+66S；64A/65A/79A+66D；64A/65A/79A+66E。變異的ABD具有修饰L64A、I65A和D79A或修饰N66S、T70S和D79A。具有氨基酸序列SEQ ID NO: 44 或氨基酸序列SEQ ID NO: 45 的變異的去免疫化的ABD是尤其優選的，因為這樣的去免疫化的白蛋白-結合結構域展示基本上野生型結合，同時提供減弱的II類MHC結合。因此，這樣的具有白蛋白-結合結構域的雙抗體的第一多肽鏈含有第三接頭(接頭3)，其優選佈置於這樣的多肽鏈的E-螺旋(或K-螺旋)結構域的C-末端，以便間插在E-螺旋(或K-螺旋)結構域和白蛋白-結合結構域(其優選是去免疫化的白蛋白-結合結構域) 之間。這樣的接頭3的優選的序列是SEQ ID NO: 46 ：GGGS。

SEQ ID NO: 44 ：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A ₆₄ A ₆₅ NNAKT VEGVKALI A ₇₉ E ILAALP

SEQ ID NO: 45 ：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S ₆₆ NAK S ₇₀ VEGVKALI A ₇₉ E ILAALP

因此，優選的三特異性結合分子的第一多肽鏈優選地包括結構域和接頭：(VL_I 結構域 )─( 接頭 1)─(VH_II 結構域 )─( 接頭 2)─(E- 螺旋異源二聚體 - 促進結構域 )─( 接頭 3)─( 攜帶杵的 CH2-CH3 結構域 ) 。

3. 可選的第一多肽鏈

在一個實施方式中，上述結構域的取向為N-末端至C-末端方向。但是，在一個實施方式中，第一多肽鏈的結構域的取向是：NH₂ -( 攜帶杵的 CH3-CH2 結構域 )-(VL_I 結構域 )─( 接頭 1)─(VH_II 結構域 )─( 接頭 2)─(E- 螺旋異源二聚體 - 促進結構域 ) 。優選地，包含半胱氨酸的肽存在於這樣的CH2-CH3結構域的N-末端。示例性肽的序列是序列(SEQ ID NO: 48 )：DKTHTCPPCP。在該實施方式中，優選地，CH3結構域通過間插肽接頭(接頭4)，比如具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 152 )：APSSS的肽接頭，更優選地，具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 50 )：APSSSPME的肽接頭與VL_I 結構域間隔開。

4. 優選的第二多肽鏈

在一些實施方式中，三特異性結合分子的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括能夠結合表位II的可變輕鏈結構域(VL_II )、能夠結合表位I的可變重鏈結構域(VH_I )和異源二聚體-促進結構域。

因為第二多肽的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域針對不同表位元，它們不能締合在一起形成能夠結合表位I或表位II的結合結構域。第二多肽的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域通過足夠短以基本上防止這些結構域締合的間插接頭肽而彼此間隔開。具有序列(SEQ ID NO: 33 )：GGGSGGGG的“接頭 1 ”是用於該目的的示例性接頭。

如在第一多肽鏈的情況下，第二多肽的可變重鏈結構域和該多肽的異源二聚體-促進結構域優選地通過包含1、2、3或更多個半胱氨酸殘基的間插接頭肽而彼此間隔開。具有序列(SEQ ID NO: 34 ) GGCGGG的“接頭2”是用於該目的的示例性接頭。這樣的半胱氨酸殘基可與包含半胱氨酸的間隔肽中的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，此間隔肽分開第一多肽的可變重鏈結構域和該多肽的異源二聚體-促進結構域。因此，在一個實施方式中，結合分子的第一和第二多肽彼此共價結合。

如上所討論，選擇第二多肽鏈的異源二聚體-促進結構域，以便與第一多肽鏈的異源二聚體-促進結構域協同作用。因此，在優選的實施方式中，第一多肽鏈的異源二聚體-促進結構域是“K- 螺旋 ”結構域(SEQ ID NO: 40 )或“E- 螺旋 ”結構域(SEQ ID NO: 39 )。如果在第一多肽鏈中採用包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO: 41 )，那麼在第二多肽鏈中優選地採用包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO: 42 )。相反地，如果在第一多肽鏈中採用包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO: 42 )，那麼優選地在第二多肽鏈中採用包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO: 41 )。因為第一多肽鏈優選地具備“E- 螺旋 ”結構域，所以第二多肽鏈優選地包含“K- 螺旋 ”結構域。

因為第一和第二多肽鏈是雙抗體的多肽鏈，它們能夠締合在一起形成識別和免疫特異性結合表位I的結構域I結合結構域(VL_A /VH_A )，和識別和免疫特異性結合表位II的結構域II結合結構域(VL_B /VH_B )。

因此，在一個實施方式中，優選的結合分子的第二多肽鏈優選地可包括結構域和接頭：(VL_II 結構域 )─( 接頭 1)─(VH_I 結構域 )─( 接頭 2)─(K- 螺旋異源二聚體 - 促進結構域 ) 。

5. 優選的第三多肽鏈

在一些實施方式中，結合分子的第三多肽鏈是這樣的多肽：其在N-末端至C-末端方向上包括結合結構域、任選的CH1-鉸鏈結構域和CH2-CH3結構域的多肽。在一些實施方式中，結合分子的第三多肽鏈的結合結構域可以是能夠結合表位III的可變重鏈結構域(VH_III )，在此情況下，結合分子的第四多肽鏈(下面討論)是包括能夠結合表位III的可變輕鏈結構域(VL_III )的多肽，以便結合結構域能夠免疫特異性結合具備表位III的抗原。可選地，結合分子的第三多肽鏈的結合結構域可包括效應細胞受體型結合結構域，在此情況下，結合分子的第四多肽鏈(下面討論)是包括互補的效應細胞受體型結合結構域的多肽，以便兩條多肽鏈的相互作用形成能夠生理特異性結合在效應細胞表面上存在的分子的結合結構域。第三多肽鏈可分離自天然存在的抗體。可選地，其可被重組構建。示例性CH1結構域是人IgG1 CH1結構域，具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 207 )：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV

SEQ ID NO: 207的人IgG1 CH1結構域的變異是(SEQ ID NO: 208 )：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV

示例性鉸鏈結構域是人IgG1鉸鏈結構域，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 209 )：EPKSCDKTHTCPPCP。如將認識到，示例性鉸鏈結構域包括多個半胱氨酸殘基(Elkabetz等(2005) “Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains ,” J. Biol. Chem. 280:14402-14412)，其可參與鏈間共價鍵合。

儘管可採用野生型CH2-CH3結構域，但是，如上所述，優選採用修飾的CH2-CH3結構域，其促進與第一多肽鏈的CH2-CH3結構域的異源二聚化。

因此，優選地，第三多肽鏈的CH2-CH3結構域是“攜帶臼的” CH2-CH3結構域，其氨基酸序列與第一多肽中採用的“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )互補。如上所討論，攜帶臼的CH2-CH3結構域優選地應包括在435位的取代(H435R)，以去除蛋白A結合位點。對於第三多肽，具有H435R取代的示例性“攜帶臼的” CH2-CH3結構域是SEQ ID NO:53 。

如將認識到，在第三多肽鏈中可採用“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:52 )，在該情況下，在第一多肽鏈中採用“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:53 )。

在其中優選的三特異性結合分子的第三(和第四)多肽鏈每個包括效應細胞受體型結合結構域的多肽鏈的實施方式中，產生這樣的效應細胞受體型結合結構域的方法是熟知的(例如，US2012/0294874A1)。

因此，優選的結合分子的第三多肽鏈包括結構域和接頭：(VH_III 結構域 )─( 任選的 CH1 結構域 )─( 任選的鉸鏈結構域 )─(“ 攜帶臼的 ” CH2-CH3 結構域 ) ，或(T 細胞受體型結合結構域；其第一或第二多肽 )─( 任選的 CH1 結構域 )─( 任選的鉸鏈結構域 )─(“ 攜帶臼的 ” CH2-CH3 結構域 ) 。

6. 優選的第四多肽鏈

在一些實施方式中，三特異性結合分子的第四多肽鏈是效應細胞受體型結合結構域的多肽(其中第三和第四多肽形成針對在效應細胞表面上發現的受體的配體，或更優選地，免疫特異性結合表位III的上述抗體的輕鏈，或其與第三多肽鏈的結合結構域互補。

因此，在其中第三和第四多肽形成Fab型結合結構域的情況下，這樣的第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括能夠結合表位III的可變輕鏈結構域(VL_III )和促進與第三多肽鏈共價鍵合的結構域，或結合結構域和促進與第三多肽鏈共價鍵合的這樣的結構域。這樣的結構域可以是CL結構域，或其包含半胱氨酸的部分，比如(SEQ ID NO: 38 ) FNRGEC，或接頭比如接頭2 (具有序列(SEQ ID NO: 34 ) GGCGGG。與這樣的接頭2形成二硫鍵的示例性的包含半胱氨酸的肽包括氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO: 36 )或鉸鏈結構域。

第四多肽鏈可分離自天然存在的抗體。可選地，其可被重組構建。優選的CL結構域是人IgG1 CL κ結構域，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 210 )：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC

可選地，示例性CL結構域是人IgG1 CL λ2結構域，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 211 )：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS

如將注意到，第四多肽鏈的CL結構域或其他包含半胱氨酸的結構域包括半胱氨酸殘基。這樣的半胱氨酸殘基能夠共價結合第三多肽鏈的CH1結構域的半胱氨酸殘基，從而彼此共價複合結合分子的第三和第四多肽鏈。因此第三和第四多肽鏈彼此共價結合。

另外，第一多肽鏈的CH2-CH3結構域的半胱氨酸殘基可與第三多肽鏈的CH2-CH3結構域的半胱氨酸殘基形成二硫鍵。因此第一和第三多肽鏈彼此共價結合。

E. 變異的 Fc 結構域

在傳統免疫功能中，抗體-抗原複合物與免疫系統的細胞的相互作用導致各種應答，範圍從效應子功能諸如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞脫粒和對免疫調節信號的吞噬諸如調節淋巴細胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用均通過抗體或免疫複合物的Fc結構域與造血細胞上的專用細胞表面受體的結合而發起。通過抗體和免疫複合物觸發的細胞應答的多樣性是由三個Fc受體：FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)和FcγRIII (CD16)的結構異質性造成的。FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)和FcγRIII (CD16)是啟動(即，免疫系統增強)受體；FcγRIIB (CD32B)是抑制(即，免疫系統阻遏)受體。示例性IgG1 Fc結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1 )在上面示出。

Fc結構域的修飾通常導致改變的表型，例如改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的易感性或改變的效應子功能。就效應子功能而言，可期望修飾本發明任一實施方式的抗體，以便增強例如抗體治療癌症的效力。在某些情況下，例如在作用機制涉及阻斷或拮抗但是不殺傷攜帶靶抗原的細胞的抗體的情況下，期望降低或消除效應子功能。當針對非期望的細胞，比如腫瘤和外源細胞時，通常期望增加效應子功能，其中FcγR以低水準表達，例如，具有低水準FcγRIIB的腫瘤特異性B細胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)。在此實施方式中，具有賦予的或改變的效應子功能活性的結合分子可用於治療和/或預防其中期望增強效應子功能活性的效力的疾病、病症或感染。

在某些實施方式中，三特異性結合分子包括Fc結構域，其具有對野生型Fc結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1 )的一個或多個修飾(例如，取代、缺失或插入)，這降低Fc結構域的親和力和抗體親抗原性，因此，降低結合分子對一個或多個FcγR受體親和力和抗體親抗原性。在其他實施方式中，結合分子包括Fc結構域，其具有對野生型Fc結構域的氨基酸的一個或多個修飾，這提高Fc結構域的親和力和抗體親抗原性，因此，提高結合分子對一個或多個FcγR受體的親和力和抗體親抗原性。在其他實施方式中，結合分子包括變異的Fc結構域，其中相對於不包括Fc結構域的分子或包括野生型Fc結構域的分子，此變異賦予或介導提高的ADCC活性和/或對FcγRIIA提高的結合。在可選實施方式中，結合分子包括變異的Fc結構域，其中相對於不包括Fc結構域的分子或包括野生型Fc結構域的分子，此變異賦予或介導降低的ADCC活性 (或其它效應子功能)和/或對FcγRIIB提高的結合。在一些實施方式中，三特異性結合分子可包括變異的Fc結構域，此變異的Fc結構域相對於包括野生型Fc結構域的可比較的分子不顯示對任何FcγR的可檢測的結合。在其他實施方式中，三特異性結合分子可包括變異的Fc結構域，此變異的Fc結構域僅僅結合單個FcγR，優選地結合FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIIIA之一。任意這樣的提高的親和力和/或抗體親抗原性均優選通過在細胞中體外測量對FcγR可檢測的結合的程度或FcγR相關活性而評估，此細胞在親本分子(沒有修飾的Fc結構域)的結合活性不能在細胞中被檢測到時表達低水準FcγR，或者此細胞以以下密度表達非FcγR受體靶抗原：30,000至20,000個分子/細胞、20,000至10,000個分子/細胞、10,000至5,000個分子/細胞、5,000至1,000個分子/細胞、1,000至200個分子/細胞或200個分子/細胞或更少(但是至少10、50、100或150個分子/細胞)。

在一些實施方式中，三特異性結合分子可包括對啟動和/或抑制性Fcγ受體改變的親和性。在一個實施方式中，三特異性結合分子包括變異Fc結構域，其相對於具有野生型Fc結構域的可比較的分子，對FcγRIIB具有提高的親和力和對FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的親和力。在另一實施方式中，三特異性結合分子包括變異Fc結構域，其相對於具有野生型Fc結構域的可比較的分子，對FcγRIIB具有降低的親和力和對FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有提高的親和力。在另外的實施方式中，三特異性結合分子包括變異Fc結構域，其相對於具有野生型Fc結構域的可比較的分子，對FcγRIIB具有降低的親和力和對FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的親和力。在另外的實施方式中，三特異性結合分子包括變異Fc結構域，其相對於具有野生型Fc結構域的可比較的分子，對FcγRIIB具有不改變的親和力和對FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的(或提高的)親和力。

在某些實施方式中，三特異性結合分子包括變異Fc結構域，其對FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有改變的親和力，以便免疫球蛋白具有增強的效應子功能，例如，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。效應細胞功能的非限制性實例包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性吞噬、吞噬、調理、調理吞噬、細胞結合、蓮座(resetting)、C1q結合和補體依賴性細胞介導的細胞毒性。

在優選的實施方式中，相對於包括野生型Fc結構域的可比較的分子，親和性或效應子功能的改變是至少2倍，優選地至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在其他實施方式中，相對於包括野生型Fc結構域的分子，變異的Fc結構域以至少65%，優選地至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、225%或250%更大的親和性免疫特異性結合一個或多個FcR。這樣的測量可以是體內或體外分析，並且，在優選的實施方式中，是體外分析比如ELISA或表面等離子共振試驗。

在不同的實施方式中，三特異性結合分子包括變異的Fc結構域，其中此變異激動(agonize) FcγR受體的至少一種活性，或拮抗FcγR受體的至少一種活性。在優選的實施方式中，分子包括變異，其拮抗FcγRIIB的一個或多個活性，例如，B細胞受體介導的信號傳導、B細胞的啟動、B細胞增殖、抗體產生、B細胞的細胞內鈣流入，細胞週期進程、FcγRIIB介導的FcεRI信號傳導的抑制、FcγRIIB的磷酸化、SHIP募集、SHIP磷酸化和與Shc的締合，或拮抗FcγRIIB信號轉導途徑中一個或多個下游分子(例如，MAP激酶、JNK、p38或Akt)的活性。在另一實施方式中，三特異性結合分子包括變異，其激動FcεRI的一個或多個活性，例如，肥大細胞啟動、鈣動員、脫粒、細胞因數產生或血清素釋放。

在某些實施方式中，結合分子包括Fc結構域，其包含來自兩個或更多個IgG同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的區域。各種IgG同種型展示不同的物理和功能特性，包括血清半衰期、補體活化、FcγR結合親和力和效應子功能活性(例如ADCC、CDC等)，這是由於它們鉸鏈和/或Fc結構域的氨基酸序列的差異，例如如在以下文獻中描述的：Flesch和Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156；Chappel等(1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131；Chappel等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (美國) 88:9036-9040；或Brüggemann等(1987) J. Exp. Med 166:1351-1361。此類型的變異的Fc結構域可單獨使用，或結合氨基酸修飾使用，以影響Fc介導的效應子功能和/或結合活性。氨基酸修飾和IgG鉸鏈/Fc結構域的組合可展示類似的功能(例如，對於FcγRIIA的增加的親和性)，並且可另外地或，更優選地，協同作用，以相對於包括野生型Fc結構域的分子，改變結合分子的效應子功能。在其他實施方式中，氨基酸修飾和IgG Fc結構域可展示相反的功能(例如，分別增加和降低對於FcγRIIA的親和性)，並且可用於相對於不包括Fc結構域或包括相同同種型的野生型Fc結構域的分子，選擇性調和或降低結合分子的特定功能。

在優選的具體實施方式中，三特異性結合分子包括變異的Fc結構域，其中此變異的Fc結構域包括相對於野生型Fc結構域的至少一個氨基酸修飾，以便此分子具有對FcR改變的親和力，前提是此變異的Fc結構域在基於比如Sondermann等(2000) Nature 406:267-73公開那些的Fc-FcR相互作用的晶體學和結構分析直接接觸FcγR的位置沒有取代。Fc結構域中直接接觸FcγR的位置的例子是氨基酸殘基234-239 (鉸鏈結構域)、氨基酸殘基265-269 (B/C環)、氨基酸殘基297-299 (C’/E環)和氨基酸殘基327-332 (F/G環)。在一些實施方式中，結合分子包括變異的Fc結構域，其包括基於結構和晶體學分析不直接接觸FcγR——例如不在Fc-FcγR結合位點中——的至少一個殘基的修飾。

變異的Fc結構域是本領域熟知的，並且任何已知的Fc變異可在本發明任一實施方式的結合分子中使用，以賦予或改變包括Fc結構域(或其部分)的分子展示的效應子功能，如在功能上分析的，例如，在NK依賴性或巨噬細胞依賴性試驗中分析的。例如，在抗體工程化技術中公開了鑒定為改變效應子功能的Fc結構域變異，並且其中公開的任何合適的變異均可用於本發明任一實施方式的結合分子。

在某些實施方式中，三特異性結合分子包括變異的Fc結構域，其在一個或多個位點中具有一個或多個氨基酸修飾，此修飾(一個或多個)改變(相對於野生型Fc結構域)變異Fc結構域與啟動FcγR (諸如FcγRIIA或FcγRIIIA)相對於抑制性FcγR (諸如FcγRIIB)的親和力比：

在一些實施方式中，三特異性結合分子具備變異的Fc結構域(相對於野生型Fc結構域)，其中Fc變異的親和力的比大於1。這樣的分子在提供對其中期望增強FcγR介導的效應細胞功能(例如，ADCC)的效力的疾病、病症或感染——例如，癌症或感染疾病——的治療性或預防性治療或改善其症狀方面尤其有用。相比之下，親和力的比小於1的Fc變異介導降低的效應細胞功能的效力。表 1 按照它們的親和力的比是否大於或小於1列舉了示例性單(single)、雙(double)、三(triple)、四(quadruple)和五(quintuple)個突變。

表 1 根據親和力的比列舉的示例性單和多突變

在具體的實施方式中，在變異的Fc結構域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：235、240、241、243、244、247、262、263、269、298、328，或330，和優選地一個或多個下述殘基：A240、I240、L241、L243、H244、N298、I328或V330。在不同的具體實施方式中，在變異的Fc結構域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439，和優選地一個或多個下述殘基：H280、Q280、Y280、G290、S290、T290、Y290、N294、K295、P296、D298、N298、P298、V298、I300或L300。

在優選的實施方式中，在以改變的親和力結合FcγR的變異的Fc結構域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439。優選地，變異的Fc結構域具有任何下述殘基：A256、N268、Q272、D286、Q286、S286、A290、S290、A298、M301、A312、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、N326、S326、K330、T339、A333、A334、E334、H334、L334、M334、Q334、V334、K335、Q335、A359、A360或A430。

在不同的實施方式中，在以降低的親和力結合FcγR (經其Fc結構域)的變異的Fc結構域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。

在不同的實施方式中，在以增強的親和力結合FcγR (經其Fc結構域)的變異的Fc結構域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398，或430。在不同的實施方式中，在以增強的親和力結合FcγRIIA的變異的Fc結構域中，任何下述殘基：A255、A256、A258、A267、A268、N268、A272、Q272、A276、A280、A283、A285、A286、D286、Q286、S286、A290、S290、M301、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、S326、K330、A331、Q335、A337或A430。

優選的變異包括在下述任何位置的一個或多個修飾：228、230、231、232、233、234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、271、273、275、281、284、291、296、297、298、299、302、304、305、313、323、325、326、328、330或332。

尤其優選的變異包括選自A-AI組的一個或多個修飾：

仍更尤其優選的變異包括選自1-105組的一個或多個修飾：

在一個實施方式中，多價DR5結合分子包括變異的Fc結構域，其在Fc結構域中具有至少一個修飾。在某些實施方式中，變異的Fc結構域包括至少一個取代，其選自L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中此編號是如在Kabat中的EU索引的編號。

在具體的實施方式中，變異的Fc結構域包括：(A) 選自下述的至少一個取代：F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；(B) 選自下述的至少兩個取代：(1) F243L和P396L；(2) F243L和R292P；和(3) R292P和V305I；(C) 選自下述的至少三個取代：(1) F243L、R292P和Y300L；(2) F243L、R292P和V305I；(3) F243L、R292P和P396L；和(4) R292P、V305I和P396L；(D) 選自下述的至少四個取代：(1) F243L、R292P、Y300L和P396L；和(2) F243L、R292P、V305I和P396L；或(E) 選自下述的至少五個取代：(1) F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；和(2) L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。

在另一具體的實施方式中，變異的Fc結構域包括下述取代：(A) F243L、R292P和Y300L；(B) L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L；或(C) F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。

在其他實施方式中，根據本發明的結合分子可包括本領域已知的任何Fc變異，比如下述文獻公開的那些Fc變異的用途：Jefferis, B.J.等(2002) “Interaction Sites On Human IgG- FcFor FcgammaR: Current Models ,” Immunol. Lett. 82:57-65；Presta, L.G.等(2002) “Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function ,” Biochem. Soc. Trans. 30:487-90；Idusogie, E.E.等(2001) “Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement ,” J. Immunol. 166:2571-75；Shields, R.L.等(2001) “High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R ,” J. Biol. Chem. 276:6591-6604；Idusogie, E.E.等(2000) “Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc ,” J. Immunol. 164:4178-84；Reddy, M.P.等(2000) “Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4 ,” J. Immunol. 164:1925-1933；Xu, D.等(2000) “In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies ,” Cell. Immunol. 200:16-26；Armour, K.L.等(1999) “Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities ,” Eur. J. Immunol. 29:2613-24；Jefferis, R.等(1996) “Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions ,” Immunol. Lett. 54:101-04；Lund, J.等(1996) “Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains ,” J. Immunol. 157:4963-4969；Hutchins等(1995) “Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84；Jefferis, R.等(1995) “Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation ,” Immunol. Lett. 44:111-17；Lund, J.等(1995) “Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors ,” FASEB J. 9:115-19；Alegre, M.L.等(1994) “A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo ,” Transplantation 57:1537-1543；Lund等(1992) “Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11 ,” Mol. Immunol. 29:53-59；Lund等(1991) “Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG ,” J. Immunol. 147:2657-2662；Duncan, A.R.等(1988) “Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG ,” Nature 332:563-564；美國專利號5,624,821、5,885,573、6,194,551、7,276,586和7,317,091；和PCT公開WO 00/42072和PCT WO 99/58572。

在一些實施方式中，結合分子進一步包括一個或多個糖基化位點，以便一個或多個碳水化合物部分共價連接於分子。優選地，與親本抗體相比，在Fc結構域具有一個或多個糖基化位點和/或一個或多個修飾的本發明任一實施方式的結合分子賦予或具有增強的抗體介導的效應子功能，例如增強的ADCC活性。在一些實施方式中，這樣的結合分子可包括已知直接或間接與抗體的碳水化合物部分相互作用的一個或多個氨基酸修飾，包括但不限於在下述位置的氨基酸241，243，244，245，245，249，256，258，260，262，264，265，296，299和301。直接或間接與抗體的碳水化合物部分相互作用的氨基酸在本領域中是已知的，參見，例如Jefferis等, 1995Immunology Letters , 44: 111-7，其通過引用以其整體併入本文。

在另一實施方式中，結合分子已經通過將一個或多個糖基化位點引入到分子的一個或多個位點而被修飾，優選不改變分子的功能，例如與靶抗原或FcγR的結合活性。糖基化位點可以被引入到本發明任一實施方式的結合分子的可變區和/或固定區。如本文中使用的，“糖基化位點”包括與低聚糖(即，碳水化合物，其含有兩個或多個連接在一起的單糖)特異性和共價連接的抗體中任何具體的氨基酸序列。低聚糖側鏈通常經N-或O-鍵連接至抗體的骨架。N-連接的糖基化指將低聚糖部分連接至天冬醯胺殘基的側鏈。O-連接的糖基化指將低聚糖部分連接至羥基氨基酸，例如絲氨酸、蘇氨酸。在一個實施方式中，結合分子可包括一個或多個糖基化位點，包括N-連接的和O-連接的糖基化位點。對於N-連接的或O-連接的糖基化，本領域中已知的任意糖基化位元點均可以根據本發明使用。可根據本發明的方法使用的示例性N-連接的糖基化位點是氨基酸序列：Asn-X-Thr/Ser，其中X可以是任意氨基酸，和Thr/Ser表示蘇氨酸或絲氨酸。利用本發明所屬領域中已知的方法，這樣的位點或多個位點可以被引入到本發明任一實施方式的結合分子中(參見，例如，IN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson等, W.H. Freeman and Company, New York, 1983, 第8章, pp. 106-116，其通過引用以其整體併入本文。用於將糖基化位點引入本發明任一實施方式的結合分子的示例性方法可包括：修飾或突變分子的氨基酸序列，以便獲得期望的Asn-X-Thr/Ser序列。

在一些實施方式中，更提供了通過添加或刪除糖基化位點修飾前述的結合分子的碳水化合物含量的方法。修飾抗體(以及包括抗體結構域的分子)的碳水化合物含量的方法是本領域中悉知的，並可應用在本發明的任一實施方式中，參見，例如美國專利號6,218,149；EP 0 359 096 B1；美國公開號US 2002/0028486；WO 03/035835；美國公開號2003/0115614；美國專利號6,218,149；美國專利號6,472,511；其均通過引用以其整體併入本文。在其他實施方式中，更提供了通過刪除分子的一個或多個內源碳水化合物部分修飾前述的結合分子的碳水化合物含量的方法。在具體實施方式中，此方法可包括通過修飾臨近297的位置改變抗體的Fc結構域的糖基化位點。在具體實施方式中，此方法可包括修飾位置296，以便位置296而不是位置297被糖基化。

也可通過技術諸如通過將一個或多個半胱氨酸殘基引入到Fc結構域中修飾效應子功能，從而允許在該區域中發生鏈間二硫鍵形成，導致產生同二聚抗體，其可具有改進的內在化能力和/或提高的補體-介導的細胞殺傷和ADCC (參見Caron, P.C.等 (1992) “Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies ,” J. Exp. Med. 176:1191-1195；Shopes, B. (1992) “A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity ,” J. Immunol. 148(9): 2918-2922。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚抗體還可利用異源雙功能交聯劑被製備，如以下文獻中描述的：Wolff, E.A.等 (1993) “Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice ,” Cancer Research 53:2560-2565。可選地，抗體可被工程化，其具有雙Fc結構域，並且，從而可具有增強的補體分解和ADCC能力(參見Stevenson, G.T.等 (1989) “A Chimeric Antibody With Dual Fc Domains (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge ,” Anti-Cancer Drug Design 3:219-230)。

Ⅲ . 示例性三特異性結合分子

F ． gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1

構建由四條多肽鏈組成的示例性三特異性結合分子。三特異性結合分子包括gpA33 mAb 1的VL和VH結構域、抗體CD3 mAb 2的VL和VH結構域和DR5 mAb 1的VL和VH結構域，因此命名為“gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 xDR5 mAb 1 ”。該三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 212 )：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

在SEQ ID NO: 212 中，氨基酸殘基1-106對應gpA33 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 181 )，殘基107-114對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基115-239對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基240-245對應GGCGGG接頭(SEQ ID NO: 34 )，殘基246-273對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )，殘基274-276是接頭GGG，殘基277-286是接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )和殘基287-503是“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )。

編碼SEQ ID NO: 212 的多核苷酸是SEQ ID NO: 213 ：
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 214 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E

在SEQ ID NO: 214 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-237對應gpA33 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 186 )，殘基238-243對應接頭GGCGGG (SEQ ID NO: 34 )和殘基244-271是K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

編碼SEQ ID NO: 214 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 215 )：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 216 )：
EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K

在SEQ ID NO: 216 中，氨基酸殘基1-121對應DR5 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 8 )，殘基122-219對應修飾的CH1結構域(SEQ ID NO: 208 )，殘基220-234對應接頭(SEQ ID NO: 209 )和殘基235-451對應“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 53 )。

編碼SEQ ID NO: 216 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 217) ：
gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 218 )：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC

在SEQ ID NO: 218 中，氨基酸殘基1-111對應DR5 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3 )和殘基112-218對應CL κ結構域(SEQ ID NO: 210 )。

編碼SEQ ID NO: 218 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 219) ：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt

G. gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2

構建由四條多肽鏈組成的第二示例性三特異性結合分子。三特異性結合分子包括gpA33 mAb 1的VL和VH結構域、抗體CD3 mAb 2的VL和VH結構域和DR5 mAb 2的VL和VH結構域，因此命名為“gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2 ”。該三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 220 )：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

在SEQ ID NO: 220 中，氨基酸殘基1-106對應gpA33 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 181 )，殘基107-114對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基115-239對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基240-245對應GGCGGG接頭(SEQ ID NO: 34 )，殘基246-273對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )，殘基274-276是接頭GGG，殘基277-286是接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )和殘基287-503是“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )。

編碼SEQ ID NO: 220 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 221) ：
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 222 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E

在SEQ ID NO: 222 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-237對應gpA33 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 186 )，殘基238-243對應接頭GGCGGG (SEQ ID NO: 34 )和殘基244-271是K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

編碼SEQ ID NO: 222 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 223) ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 224 )：
KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT EYILHWVKQK SGQGLEWIGW FYPGNNNIKY NEKFKDKATL TADKSSSTVY MELSRLTSED SAVYFCARHE QGPGYFDYWG QGTTLTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK

在SEQ ID NO: 224 中，氨基酸殘基1-119對應DR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 18 )，殘基120-217對應修飾的CH1結構域(SEQ ID NO: 208 )，殘基218-232對應接頭(SEQ ID NO: 209 )和殘基233-449對應“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 53 )。

編碼SEQ ID NO: 224 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 225) ：
aaggtccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtgaaac ccggggcatc agtgaagctg tcctgcaagg cttctgggta caccttcact gagtatattt tacactgggt aaagcagaag tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg ttttatcctg gaaataataa tataaagtac aatgagaaat tcaaggacaa ggccacactg actgcggaca aatcctccag cacagtctat atggaactta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacacgaa caaggaccag gttactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctccgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 2的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 226 )：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC

在SEQ ID NO: 226 中，氨基酸殘基1-107對應DR5 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 13 )和殘基108-214對應CL κ結構域(SEQ ID NO: 210 )。

編碼SEQ ID NO: 226 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 227) ：
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat cggtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt

H. EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1

構建由四條多肽鏈組成的進一步示例性三特異性結合分子。三特異性結合分子包括EphA2 mAb 1的VL和VH結構域、抗體CD3 mAb 2的VL和VH結構域和DR5 mAb 1的VL和VH結構域，因此命名為“EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1 ”。該三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 228 )：
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

在SEQ ID NO: 228 中，氨基酸殘基1-106對應EphA2 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 153 )，殘基107-114對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基115-239對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基240-245對應GGCGGG接頭(SEQ ID NO: 34 )，殘基246-273對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )，殘基274-276是接頭GGG，殘基277-286是接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )和殘基287-503是“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )。

編碼SEQ ID NO: 228 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 229) ：
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg accaagctgg aaataaaagg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaa

EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 230 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLKESGPGLV APSQSLSITC TVSGFSLSRY SVHWVRQPPG KGLEWLGMIW GGGSTDYNSA LKSRLSISKD NSKSQVFLKM NSLQTDDTAM YYCARKHGNY YTMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE

在SEQ ID NO: 230 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-236對應EphA2 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 158 )，殘基237-242對應接頭GGCGGG (SEQ ID NO: 34 )和殘基243-270是K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

編碼SEQ ID NO: 230 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 231) ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtg cagctgaagg agtcaggacc tggcctggtg gcaccctcac agagcctgtc catcacatgc actgtctctg ggttctcatt atccagatat agtgtacact gggttcgcca gcctccagga aagggtctgg agtggctggg aatgatatgg ggtggtggaa gcacagacta taattcagct ctcaaatcca gactgagtat cagcaaggac aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg aacagtctgc aaactgatga cacagccatg tactactgtg ccagaaaaca tggtaactac tatactatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 232 )：
EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K

在SEQ ID NO: 232 中，氨基酸殘基1-121對應DR5 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 8 )，殘基122-219對應修飾的CH1結構域(SEQ ID NO: 208 )，殘基220-234對應接頭(SEQ ID NO: 209 )和殘基235-451對應“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 53 )。

編碼SEQ ID NO: 232 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 233) ：
gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa

EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 234 )：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC

在SEQ ID NO: 234 中，氨基酸殘基1-111對應DR5 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3 )和殘基112-218對應CL κ結構域(SEQ ID NO: 210 )。

編碼SEQ ID NO: 234 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 235) ：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt

I. EphA2 mAb 2x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1

構建由四條多肽鏈組成的進一步示例性三特異性結合分子。三特異性結合分子包括EphA2 mAb 2的VL和VH結構域、抗體CD3 mAb 2的VL和VH結構域和DR5 mAb 1的VL和VH結構域，因此命名為“EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1 ”。該三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 236 )：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP TFGSGTKLEI KGGGSGGGGE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY YADSVKGRFT ISRDDSKNSL YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK

在SEQ ID NO: 236 中，氨基酸殘基1-111對應EphA2 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 163 )，殘基112-119對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基120-244對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基245-250對應GGCGGG接頭(SEQ ID NO: 34 )，殘基251-278對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )，殘基279-281是接頭GGG，殘基282-291是接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )和殘基292-508是“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )。

編碼SEQ ID NO: 236 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 237) ：
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaaggtggag gatccggcgg cggaggcgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gagggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca tacgctatga attgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggagtgggt tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac tatgccgact ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg tgtgagacac ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt ggggacaggg gacactggtg actgtgtctt ccggaggatg tggcggtgga gaagtggccg cactggagaa agaggttgct gctttggaga aggaggtcgc tgcacttgaa aaggaggtcg cagccctgga gaaaggcggc ggggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa

EphA2 mAb 2x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 238 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQI QLVQSGPELK KPGETVKISC KASGFTFTNY GMNWVKQAPG KGLKWMGWIN TYIGEPTYAD DFKGRFVFSL ETSASTAYLQ INNLKNEDMA TYFCARELGP YYFDYWGQGT TLTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE

在SEQ ID NO: 238 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-236對應EphA2 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 167 )，殘基237-242對應接頭GGCGGG (SEQ ID NO: 34 )和殘基243-270是K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

編碼SEQ ID NO: 238 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 239) ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacagatc cagttggtgc agtctggacc tgagctgaag aagcctggag agacagtcaa gatctcctgc aaggcttctg ggtttacctt cacaaactat ggaatgaact gggtgaagca ggctccagga aagggtttaa agtggatggg ctggataaac acctatattg gagagccgac atatgctgat gacttcaagg gacggtttgt cttctctttg gaaacctctg ccagcactgc ctatttgcag atcaacaacc tcaaaaatga ggacatggcc acatatttct gtgcaagaga actgggacca tactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

EphA2 mAb 2x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 240 )：
EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K

在SEQ ID NO: 240 中，氨基酸殘基1-121對應DR5 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 8 )，殘基122-219對應修飾的CH1結構域(SEQ ID NO: 208 )，殘基220-234對應接頭(SEQ ID NO: 209 )和殘基235-451對應“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 53 )。

編碼SEQ ID NO: 240 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 241) ：
gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa

EphA2 mAb 2x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 242 )：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC

在SEQ ID NO: 242 中，氨基酸殘基1-111對應DR5 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3 )和殘基112-218對應CL κ結構域(SEQ ID NO: 210 )。

編碼SEQ ID NO: 242 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 243) ：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt

J. EphA2 mAb 3x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1

構建由四條多肽鏈組成的進一步示例性三特異性結合分子。三特異性結合分子包括EphA2 mAb 3的VL和VH結構域、抗體CD3 mAb 2的VL和VH結構域和DR5 mAb 1的VL和VH結構域，因此命名為“EphA2 mAb 3x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1 ”。該三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 244 )：
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK

在SEQ ID NO: 244 中，氨基酸殘基1-107對應EphA2 mAb 3的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 172 )，殘基108-115對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基116-240對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基241-246對應GGCGGG接頭(SEQ ID NO: 34 )，殘基247-274對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )，殘基275-277是接頭GGG，殘基278-287是接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )和殘基288-504是“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )。

編碼SEQ ID NO: 244 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 245) ：
gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaattact gattttctgg gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg gggaccaagc tggaaataaa aggtggagga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa

EphA2 mAb 3x CD3 mAb 2x DR5 mAb 1的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 246 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGSV KPGGSLKLSC AASGFTFTDH YMYWVRQTPE KRLEWVATIS DGGSFTSYPD SVKGRFTISR DIAKNNLYLQ MSSLKSEDTA MYYCTRDESD RPFPYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE

在SEQ ID NO: 246 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-236對應EphA2 mAb 3的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 177 )，殘基237-242對應接頭GGCGGG (SEQ ID NO: 34 )和殘基243-270是K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

編碼SEQ ID NO: 246 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 247) ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggagaagtg cagctggtgg agtctggggg aggctcagtg aagcctggag ggtccctgaa actctcctgt gcagcctctg gattcacttt cactgaccat tacatgtatt gggttcgcca gactccggaa aagaggctgg agtgggtcgc aaccattagt gatggcggta gtttcacctc ctatccagac agtgtgaagg ggcgattcac catctccaga gacattgcca agaacaacct gtacctccaa atgagcagtc tgaagtctga ggacacagcc atgtattact gtacaagaga tgagagcgat aggccgtttc cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

EphA2 mAb 3x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 248 )：
EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K

在SEQ ID NO: 248 中，氨基酸殘基1-121對應DR5 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 8 )，殘基122-219對應修飾的CH1結構域(SEQ ID NO: 208 )，殘基220-234對應接頭(SEQ ID NO: 209 )和殘基235-451對應“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 53 )。

編碼SEQ ID NO: 248 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 249) ：
gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa

EphA2 mAb 3x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 250 )：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC

在SEQ ID NO: 250 中，氨基酸殘基1-111對應DR5 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3 )和殘基112-218對應CL κ結構域(SEQ ID NO: 210 )。

編碼SEQ ID NO: 250 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 251) ：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt

儘管上述示例性三特異性結合分子對於每個結合結構域包括三個輕鏈(VL) CDR和三個重鏈(VH) CDR，應認識到三特異性結合分子可具有：(1) 任何這樣的結合結構域的VL結構域的至少一個CDR；(2) 任何這樣的結合結構域的VL結構域的至少兩個CDR；(3) 任何這樣的結合結構域的VL結構域的三個CDR；(4) 任何這樣的結合結構域的VH結構域的至少一個CDR；(5) 任何這樣的結合結構域的VH結構域的至少兩個CDR；(6) 任何這樣的結合結構域的VH結構域的三個CDR；(7) 任何這樣的結合結構域的VL結構域的至少一個CDR和該結合結構域的VH結構域的至少一個CDR；(8) 任何這樣的結合結構域的VL結構域的至少兩個CDR和該結合結構域的VH結構域的至少兩個CDR；(9) 任何這樣的結合結構域的VL結構域的三個CDR和該結合結構域的VH結構域的三個CDR；(10) 任何這樣的結合結構域的VL結構域；(11) 任何這樣的結合結構域的VH結構域；或(12) 任何這樣的結合結構域的VL和VH結構域。

K. gpA33 mAb 1x CD3 mAb 2 xEphA2 mAb 1

構建由四條多肽鏈組成的三特異性結合分子，其包括gpA33 mAb 1的VL和VH結構域、抗體CD3 mAb 2的VL和VH結構域和EphA2 mAb 1的VL和VH結構域。三特異性結合分子所以命名為“gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1 ”。該三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 252 )：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

在SEQ ID NO: 252 中，氨基酸殘基1-106對應gpA33 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 181 )，殘基107-114對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基115-239對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基240-245對應GGCGGG接頭(SEQ ID NO: 34 )，殘基246-273對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )，殘基274-276是接頭GGG，殘基277-286是接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )和殘基287-503是“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )。

編碼SEQ ID NO: 252 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 253) ：
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 254 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E

在SEQ ID NO: 254 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-237對應gpA33 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 186 )，殘基238-243對應接頭GGCGGG (SEQ ID NO: 34 )和殘基244-271是K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

編碼SEQ ID NO: 254 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 255) ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 256 )：
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM IWGGGSTDYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG NYYTMDYWGQ GTSVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

在SEQ ID NO: 256 中，氨基酸殘基1-118對應EphA2 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 158 )，殘基119-216對應修飾的CH1結構域(SEQ ID NO: 208 )，殘基217-231對應接頭(SEQ ID NO: 209 )和殘基232-448對應“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 53 )。

編碼SEQ ID NO: 256 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 257) ：
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc acatgcactg tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg tacactgggt tcgccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaagcac agactataat tcagctctca aatccagact gagtatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaaacatggt aactactata ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctccgcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 1的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 258 )：
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC

在SEQ ID NO: 258 中，氨基酸殘基1-106對應EphA2 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 153 )和殘基107-213對應CL κ結構域(SEQ ID NO: 210 )。

編碼SEQ ID NO: 258 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 259) ：
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg accaagctgg aaataaaacg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt

L. gpA33 mAb 1x CD3 mAb 2 xEphA2 mAb 2

構建由四條多肽鏈組成的三特異性結合分子，其包括gpA33 mAb 1的VL和VH結構域、抗體CD3 mAb 2的VL和VH結構域和EphA2 mAb 2的VL和VH結構域。三特異性結合分子所以命名為“gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2 ”。該三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 260 )：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

在SEQ ID NO: 260 中，氨基酸殘基1-106對應gpA33 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 181 )，殘基107-114對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基115-239對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基240-245對應GGCGGG接頭(SEQ ID NO: 34 )，殘基246-273對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )，殘基274-276是接頭GGG，殘基277-286是接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )和殘基287-503是“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )。

編碼SEQ ID NO: 260 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 261) ：
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 262 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E

在SEQ ID NO: 262 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-237對應gpA33 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 186 )，殘基238-243對應接頭GGCGGG (SEQ ID NO: 34 )和殘基244-271是K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

編碼SEQ ID NO: 262 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 263) ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 264 )：
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW INTYIGEPTY ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL GPYYFDYWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

在SEQ ID NO: 264 中，氨基酸殘基1-118對應EphA2 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 167 )，殘基119-216對應修飾的CH1結構域(SEQ ID NO: 208 )，殘基217-231對應接頭(SEQ ID NO: 209 )和殘基232-448對應“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 53 )。

編碼SEQ ID NO: 264 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 265) ：
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg cttctgggtt taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct atattggaga gccgacatat gctgatgact tcaagggacg gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggccacat atttctgtgc aagagaactg ggaccatact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctccgcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 2的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 266 )：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP TFGSGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC

在SEQ ID NO: 266 中，氨基酸殘基1-111對應EphA2 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 163 )和殘基112-218對應CL κ結構域(SEQ ID NO: 210 )。

編碼SEQ ID NO: 266 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 267) ：
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt

M. gpA33 mAb 1x CD3 mAb 2 xEphA2 mAb 3

構建由四條多肽鏈組成的三特異性結合分子，其包括gpA33 mAb 1的VL和VH結構域、抗體CD3 mAb 2的VL和VH結構域和EphA2 mAb 3的VL和VH結構域。三特異性結合分子所以命名為“gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3 ”。該三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 268 )：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

在SEQ ID NO: 268 中，氨基酸殘基1-106對應gpA33 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 181 )，殘基107-114對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基115-239對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基240-245對應GGCGGG接頭(SEQ ID NO: 34 )，殘基246-273對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )，殘基274-276是接頭GGG，殘基277-286是接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )和殘基287-503是“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )。

編碼SEQ ID NO: 268 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 269) ：
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 270 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E

在SEQ ID NO: 270 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-237對應gpA33 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 186 )，殘基238-243對應接頭GGCGGG (SEQ ID NO: 34 )和殘基244-271是K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

編碼SEQ ID NO: 270 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 271) ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 272 )：
EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT ISDGGSFTSY PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE SDRPFPYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

在SEQ ID NO: 272 中，氨基酸殘基1-118對應EphA2 mAb 3的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 177 )，殘基119-216對應修飾的CH1結構域(SEQ ID NO: 208 )，殘基217-231對應接頭(SEQ ID NO: 209 )和殘基232-448對應“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 53 )。

編碼SEQ ID NO: 272 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 273) ：
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcact gaccattaca tgtattgggt tcgccagact ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gcggtagttt cacctcctat ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca ttgccaagaa caacctgtac ctccaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagatgag agcgataggc cgtttcctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctccgcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa

gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x EphA2 mAb 3的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 274 )：
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC

在SEQ ID NO: 274 中，氨基酸殘基1-107對應EphA2 mAb 3的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 172 )和殘基108-214對應CL κ結構域(SEQ ID NO: 210 )。

編碼SEQ ID NO: 274 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 275) ：
gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaattact gattttctgg gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg gggaccaagc tggaaataaa acgtacggtg gctgcaccat cggtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt

N. EphA2 mAb 1 xCD3 mAb 2 xgpA33 mAb 1

構建可選的EphA2 /CD3 /gpA33三特異性結合分子。分子由四條多肽鏈組成並且包括EphA2 mAb 1的VL和VH結構域、抗體CD3 mAb 2的VL和VH結構域和GpA33 mAb 1的VL和VH結構域。分子命名為“EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1 ”。此三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 276 )：
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

在SEQ ID NO: 276 中，氨基酸殘基1-106對應EphA2 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 153 )，殘基107-114對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基115-239對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基240-245對應GGCGGG接頭(SEQ ID NO: 34 )，殘基246-273對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )，殘基274-276是接頭GGG，殘基277-286是接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )和殘基287-503是“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )。

編碼SEQ ID NO: 276 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 277) ：
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg accaagctgg aaataaaagg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 278 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLKESGPGLV APSQSLSITC TVSGFSLSRY SVHWVRQPPG KGLEWLGMIW GGGSTDYNSA LKSRLSISKD NSKSQVFLKM NSLQTDDTAM YYCARKHGNY YTMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE

在SEQ ID NO: 278 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-236對應EphA2 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 158 )，殘基237-242對應接頭GGCGGG (SEQ ID NO: 34 )和殘基243-270是K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

編碼SEQ ID NO: 278 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 279) ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtg cagctgaagg agtcaggacc tggcctggtg gcaccctcac agagcctgtc catcacatgc actgtctctg ggttctcatt atccagatat agtgtacact gggttcgcca gcctccagga aagggtctgg agtggctggg aatgatatgg ggtggtggaa gcacagacta taattcagct ctcaaatcca gactgagtat cagcaaggac aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg aacagtctgc aaactgatga cacagccatg tactactgtg ccagaaaaca tggtaactac tatactatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 280 )：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK

在SEQ ID NO: 280 中，氨基酸殘基1-119對應gpA33 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 186 )，殘基120-217對應修飾的CH1結構域(SEQ ID NO: 208 )，殘基218-232對應接頭(SEQ ID NO: 209 )和殘基233-449對應“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 53 )。

編碼SEQ ID NO: 280 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 281) ：
caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag cgtgaaggtc tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga tgaactgggt gaggcaggct ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc atctaccctg gagacggcga aactaactat aatggaaagt tcaaagaccg agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctccgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa

EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 282 )：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC

在SEQ ID NO: 282 中，氨基酸殘基1-106對應gpA33mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 181 )和殘基107-213對應CL κ結構域(SEQ ID NO: 210 )。

編碼SEQ ID NO: 282 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 283) ：
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaagcg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt

O. EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1

構建第二可選的EphA2 /CD3 /gpA33三特異性結合分子。分子由四條多肽鏈組成並且包括EphA2 mAb 2的VL和VH結構域、抗體CD3 mAb 2的VL和VH結構域和GpA33 mAb 1的VL和VH結構域。分子命名為“EphA2 mAb 2 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1 ”。該三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 284 )：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP TFGSGTKLEI KGGGSGGGGE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY YADSVKGRFT ISRDDSKNSL YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK

在SEQ ID NO: 284 中，氨基酸殘基1-111對應EphA2 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 163 )，殘基112-119對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基120-244對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基245-250對應GGCGGG接頭(SEQ ID NO: 34 )，殘基251-278對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )，殘基279-281是接頭GGG，殘基282-291是接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )和殘基292-508是“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )。

編碼SEQ ID NO: 284 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 285) ：
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaaggtggag gatccggcgg cggaggcgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gagggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca tacgctatga attgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggagtgggt tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac tatgccgact ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg tgtgagacac ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt ggggacaggg gacactggtg actgtgtctt ccggaggatg tggcggtgga gaagtggccg cactggagaa agaggttgct gctttggaga aggaggtcgc tgcacttgaa aaggaggtcg cagccctgga gaaaggcggc ggggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa

EphA2 mAb 2x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 286 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQI QLVQSGPELK KPGETVKISC KASGFTFTNY GMNWVKQAPG KGLKWMGWIN TYIGEPTYAD DFKGRFVFSL ETSASTAYLQ INNLKNEDMA TYFCARELGP YYFDYWGQGT TLTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE

在SEQ ID NO: 286 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-236對應EphA2 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 167 )，殘基237-242對應接頭GGCGGG (SEQ ID NO: 34 )和殘基243-270是K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

編碼SEQ ID NO: 286 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 287) ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacagatc cagttggtgc agtctggacc tgagctgaag aagcctggag agacagtcaa gatctcctgc aaggcttctg ggtttacctt cacaaactat ggaatgaact gggtgaagca ggctccagga aagggtttaa agtggatggg ctggataaac acctatattg gagagccgac atatgctgat gacttcaagg gacggtttgt cttctctttg gaaacctctg ccagcactgc ctatttgcag atcaacaacc tcaaaaatga ggacatggcc acatatttct gtgcaagaga actgggacca tactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

EphA2 mAb 2x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 288 )：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK

在SEQ ID NO: 288 中，氨基酸殘基1-119對應gpA33 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 186 )，殘基120-217對應修飾的CH1結構域(SEQ ID NO: 208 )，殘基218-232對應接頭(SEQ ID NO: 209 )和殘基233-449對應“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 53 )。

編碼SEQ ID NO: 288 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 289) ：
caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag cgtgaaggtc tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga tgaactgggt gaggcaggct ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc atctaccctg gagacggcga aactaactat aatggaaagt tcaaagaccg agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctccgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa

EphA2 mAb 2x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 290 )：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC

在SEQ ID NO: 290 中，氨基酸殘基1-106對應gpA33 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 181 )和殘基107-213對應CLκ結構域(SEQ ID NO: 210 )。

編碼SEQ ID NO: 290 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 291) ：
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaagcg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt

P . EphA2 mAb 3x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1

構建第三可選的EphA2 /CD3 /gpA33三特異性結合分子。分子由四條多肽鏈組成並且包括EphA2 mAb 3的VL和VH結構域、抗體CD3 mAb 2的VL和VH結構域和GpA33 mAb 1的VL和VH結構域。分子命名為“EphA2 mAb 3x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1 ”。該三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 292 )：
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK

在SEQ ID NO: 292 中，氨基酸殘基1-107對應EphA2 mAb 3的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 172 )，殘基108-115對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基116-240對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基241-246對應GGCGGG接頭(SEQ ID NO: 34 )，殘基247-274對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )，殘基275-277是接頭GGG，殘基278-287是接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48 )和殘基288-504是“攜帶杵的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 52 )。

編碼SEQ ID NO: 292 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 293) ：
gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaattact gattttctgg gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg gggaccaagc tggaaataaa aggtggagga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa

EphA2 mAb 3x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 294 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGSV KPGGSLKLSC AASGFTFTDH YMYWVRQTPE KRLEWVATIS DGGSFTSYPD SVKGRFTISR DIAKNNLYLQ MSSLKSEDTA MYYCTRDESD RPFPYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE

在SEQ ID NO: 294 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 3的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-236對應EphA2 mAb 3的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 177 )，殘基237-242對應接頭GGCGGG (SEQ ID NO: 34 )和殘基243-270是K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

編碼SEQ ID NO: 294 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 295) ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggagaagtg cagctggtgg agtctggggg aggctcagtg aagcctggag ggtccctgaa actctcctgt gcagcctctg gattcacttt cactgaccat tacatgtatt gggttcgcca gactccggaa aagaggctgg agtgggtcgc aaccattagt gatggcggta gtttcacctc ctatccagac agtgtgaagg ggcgattcac catctccaga gacattgcca agaacaacct gtacctccaa atgagcagtc tgaagtctga ggacacagcc atgtattact gtacaagaga tgagagcgat aggccgtttc cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

EphA2 mAb 3x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 296 )：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK

在SEQ ID NO: 296 中，氨基酸殘基1-119對應gpA33 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 186 )，殘基120-217對應修飾的CH1結構域(SEQ ID NO: 208 )，殘基218-232對應接頭(SEQ ID NO: 209 )和殘基233-449對應“攜帶臼的” CH2-CH3結構域(SEQ ID NO: 53 )。

編碼SEQ ID NO: 296 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 297) ：
caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag cgtgaaggtc tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga tgaactgggt gaggcaggct ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc atctaccctg gagacggcga aactaactat aatggaaagt tcaaagaccg agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctccgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa

EphA2 mAb 3x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 298 )：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC

在SEQ ID NO: 298 中，氨基酸殘基1-106對應gpA33 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 181 )和殘基107-213對應CLκ結構域(SEQ ID NO: 210 )。

編碼SEQ ID NO: 298 的多核苷酸是(SEQ ID NO: 299) ：
gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaagcg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt

Ⅳ . 參考抗體和雙抗體

為了有助於表徵本發明的三特異性結合分子，構建下述參考雙抗體。

Q. DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 雙抗體

構建由兩條多肽鏈組成的示例性雙特異性雙抗體，其具有抗人DR5抗體DR5 mAb 1的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域。雙抗體命名為“DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 雙抗體 ”。雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 140 )：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY YADSVKGRFT ISRDDSKNSL YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK

在SEQ ID NO: 140 中，氨基酸殘基1-111對應DR5 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3 )，殘基112-119對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基120-244對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基245-249對應ASTKG接頭(SEQ ID NO: 47 )和殘基250-277對應包含半胱氨酸的E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 41 )。編碼SEQ ID NO: 140 的多核苷酸是SEQ ID NO: 141 ：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggaggcg gatccggcgg cggaggcgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gagggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca tacgctatga attgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggagtgggt tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac tatgccgact ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg tgtgagacac ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt ggggacaggg gacactggtg actgtgtctt ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa a

DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 142 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV KFLESGGGLV QPGGSLKLSC VASGFDFSRY WMSWVRQAPG KGLEWIGEIN PDSNTINYTP SLKDKFIISR DNAKNTLYLQ MTKVRSEDTA LYYCTRRAYY GNPAWFAYWG QGTLVTVSAA STKGKVAACK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE

在SEQ ID NO: 142 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-239對應DR5 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 8 )，不同之處是SEQ ID NO: 8 的C-末端絲氨酸殘基已經被丙氨酸殘基取代)，殘基240-244對應ASTKG接頭(SEQ ID NO: 47 )和殘基245-272對應包含半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 42 )。編碼SEQ ID NO: 142 的多核苷酸是SEQ ID NO: 143 ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga ggtggtggat ccggcggcgg aggcgaggtg aagtttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt gtagcctcag gattcgattt tagtagatac tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca atacgataaa ctatacgcca tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca aaaatacgct gtatctgcaa atgaccaaag tgagatctga ggacacagcc ctttattatt gtacaagaag ggcctactat ggtaacccgg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc tccaccaagg gcaaagtggc cgcatgtaag gagaaagttg ctgctttgaa agagaaggtc gccgcactta aggaaaaggt cgcagccctg aaagag

R. DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 雙抗體

構建由兩條多肽鏈組成的示例性雙特異性雙抗體，其具有抗人DR5抗體DR5 mAb 2的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域。雙抗體命名為“DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 雙抗體 ”。雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 144 )：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK

在SEQ ID NO: 144 中，氨基酸殘基1-107對應DR5 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 13 )，殘基108-115對應間插間隔肽(接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基116-240對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基241-245對應ASTKG接頭(SEQ ID NO: 47 )和殘基246-273對應包含半胱氨酸的E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 41 )。編碼SEQ ID NO: 144 的多核苷酸是SEQ ID NO: 145 ：
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc gcctccacca agggcgaagt ggccgcatgt gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaa

DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO: 146 )：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGKV QLQQSGAELV KPGASVKLSC KASGYTFTEY ILHWVKQKSG QGLEWIGWFY PGNNNIKYNE KFKDKATLTA DKSSSTVYME LSRLTSEDSA VYFCARHEQG PGYFDYWGQG TTLTVSSAST KGKVAACKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE

在SEQ ID NO: 146 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-237對應DR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 18 )，殘基238-242對應ASTKG接頭(SEQ ID NO: 47 )和殘基243-270對應包含半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 42 )。編碼SEQ ID NO: 146 的多核苷酸是SEQ ID NO: 147 ：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggcgg aggcaaggtc cagctgcagc agtctggagc tgaactggtg aaacccgggg catcagtgaa gctgtcctgc aaggcttctg ggtacacctt cactgagtat attttacact gggtaaagca gaagtctgga cagggtcttg agtggattgg gtggttttat cctggaaata ataatataaa gtacaatgag aaattcaagg acaaggccac actgactgcg gacaaatcct ccagcacagt ctatatggaa cttagtagat tgacatctga agactctgcg gtctatttct gtgcaagaca cgaacaagga ccaggttact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc cgcctccacc aagggcaaag tggccgcatg taaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

S. DR5 mAb 3 x CD3 mAb 2 雙抗體

構建由兩條多肽鏈組成的示例性雙特異性雙抗體，其具有抗人DR5抗體DR5 mAb 3的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域。雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列具有序列(SEQ ID NO: 148 ) (CDR殘基以底線顯示)：
SELTQDPAVS VALGQTVRIT C SGDSLRSYY AS WYQQKPGQ APVLVIY GAN NRPS GIPDRF SGSSSGNTAS LTITGAQAED EADYYC NSAD SSGNHVV FGG GTKLTVLGGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFS TYAM N WVRQAPGKG LEWVG RIRSK YNNYATYYAD SVKG RFTISR DDSKNSLYLQ MNSLKTEDTA VYYCVR HGNF GNSYVSWFAY WGQGTLVTVS SASTKGEVAA CEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEK

在SEQ ID NO: 148 中，氨基酸殘基1-108對應DR5 mAb 3的VL結構域(SEQ ID NO: 54 )，殘基109-116對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基117-241對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基242-246對應ASTKG接頭(SEQ ID NO: 47 )和殘基247-275對應包含半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 42 )。

雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列具有序列(SEQ ID NO: 149 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVQSGGGVE RPGGSLRLSC AAS GFTFDDY AMS WVRQAPG KGLEWVSG IN WQGGSTGYAD SVKG RVTISR DNAKNSLYLQ MNSLRAEDTA VYYCAK ILGA GRGWYFDY WG KGTTVTVSSA STKGKVAACK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE

在SEQ ID NO: 149 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-239對應DR5 mAb 3的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 58 )，殘基240-244對應ASTKG接頭(SEQ ID NO: 47 )和殘基245-272對應包含半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 42 )。

T. DR5 mAb 4 x CD3 mAb 2 雙抗體

構建由兩條多肽鏈組成的示例性雙特異性雙抗體，其具有抗人DR5抗體DR5 mAb 4的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域。雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列具有序列(SEQ ID NO: 150 ) (CDR殘基以底線顯示)：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSC RASQGIS RSYLA WYQQK PGQAPSLLIY GASSRAT GIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYC Q QFGSSPWT FG QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFS TYAM N WVRQAPGKG LEWVG RIRSK YNNYATYYAD SVKG RFTISR DDSKNSLYLQ MNSLKTEDTA VYYCVR HGNF GNSY VSWFAY WGQGTLVTVS SASTKGEVAA CEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEK

在SEQ ID NO: 150 中，氨基酸殘基1-108對應DR5 mAb 4的VL結構域(SEQ ID NO: 62 )，殘基109-116對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基117-241對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基242-246對應ASTKG接頭(SEQ ID NO: 47 )和殘基247-275對應包含半胱氨酸的E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 41 )。

雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列具有序列(SEQ ID NO: 151 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQESGPGLV KPSQTLSLTC TVS GGSISSG DYFWS WIRQL PGKGLEWIG H IHNSGTTYYN PSLKS RVTIS VDTSKKQFSL RLSSVTAADT AVYYCAR DRG GDYYYGMDV W GQGTTVTVSS ASTKGKVAAC KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE

在SEQ ID NO: 151 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-240對應DR5 mAb 4的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 66 )，殘基241-245對應ASTKG接頭(SEQ ID NO: 47 )和殘基246-273對應包含半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 42 )。

U. 參考 gpA33 x CD3 mAb 2 雙抗體

為了進一步例證本發明的雙特異性三特異性結合分子，使用GpA33 mAb 1和CD3 mAb 2的VL和VH結構域構建由兩條多肽鏈組成的雙抗體。雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列具有序列(SEQ ID NO: 316 ) (CDR殘基以底線顯示)：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC SARSSIS FMY WYQQKPG KAPKLLIY DT SNLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SSYPLT FGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFS TYAMN W VRQAPGKGLE WVG RIRSKYN NYATYYADSV KG RFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVR HGNFGN SYVSWFAY WG QGTLVTVSSA STKGEVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK

在SEQ ID NO: 316 中，氨基酸殘基1-106對應gpA33 mAb 1的VL結構域(SEQ ID NO: 181 )，殘基107-114對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基115-239對應具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 112 )，殘基240-244對應ASTKG接頭(SEQ ID NO: 47 )和殘基245-272對應包含半胱氨酸的E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 41 )。

雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列具有序列(SEQ ID NO: 317 ) (CDR殘基以底線顯示)：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KAS GYTFTGS WMN WVRQAPG QGLEWIG RIY PGDGETNYNG KFKD RVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCAR IYGN NVYFDV WGQG TTVTVSSAST KGKVAACKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE

在SEQ ID NO: 317 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-237對應gpA33 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 186 )，殘基238-242對應ASTKG接頭(SEQ ID NO: 47 )和殘基243-270對應包含半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 42 )。

V. 參考抗螢光素抗體

抗螢光素抗體4-4-20 (參見Gruber, M.等(1994) “Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bi-specific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli,” J. Immunol. 152(11):5368-5374；Bedzyk, W.D.等(1989) “Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family,” J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569)用在對照雙抗體中。抗螢光素抗體4-4-20的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域的氨基酸序列如下：

抗螢光素抗體4-4-20的可變輕鏈結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 138 ) (CDR殘基加底線)：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSNGNTYLR W YLQKPGQSPK VLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP W TFGGGTKLE IK

抗螢光素抗體4-4-20的可變重鏈結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 139 ) (CDR殘基加底線)：
EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVA SGFTFS DYWMN WVRQS PEKGLEWVA Q IRNKPYNYET YYSDSVKG RF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG SYYGMDY WGQ GTSVTVSS

Ⅴ . 生產方法

可由對DR5、期望的癌症抗原和期望的效應細胞免疫特異性的抗體的多核苷酸和/或序列，通過本領域已知的方法例如合成或重組，產生本發明任一實施方式的三特異性結合分子。產生這樣的肽激動劑、拮抗劑和調諧劑的一種方法涉及化學合成多肽，然後在適於獲得天然構象，即，正確的二硫鍵鍵合，的氧化條件下處理。這可利用本領域技術人員悉知的方法完成(參見，例如，Kelley, R. F.等(1990)在以下中：Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., 12卷,1-19頁；Stewart, J.M等(1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL；也見美國專利號4,105,603、3,972,859、3,842,067和3,862,925)。

本發明任一實施方式的多肽可以利用固相肽合成被常規製備(參見Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis ,” Science 232(4748):341-347；Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135；Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century ,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10)。

在又另一可選方案中，通過使用已經被工程化以表達特定人免疫球蛋白蛋白質的商業上可得的小鼠，可獲得具有期望的抗DR5抗體、抗癌症抗原抗體或抗效應細胞抗體的一個或多個CDR的合適的抗體。被設計以產生更期望的(例如，完全人抗體)或更強大的免疫應答的轉基因動物還可被用於產生人源化或人抗體。這樣的技術的實例是Xenomouse™ (Abgenix，Inc.，Fremont，CA)和HuMAb- Mouse ®和TC Mouse ™ (二者都來自Medarex，Inc.，Princeton，NJ)。

可選地，抗體可以重組製備，並利用本領域中已知的任意方法表達。抗體可以如下重組製備：首先分離從宿主動物制得的抗體、獲得基因序列和利用基因序列在宿主細胞(例如，CHO細胞)中重組表達抗體。可以應用的另外的方法是在植物{例如，煙草)或轉基因奶中表達抗體序列。用於在植物或奶中重組表達抗體的合適方法已經被公開(參見，例如，Peeters等 (2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants ,” Vaccine 19:2756；Lonberg, N.等 (1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice ,” Int. Rev. Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies ,” J. Immunol方法s 231:147-157)。用於製備抗體衍生物例如人源化抗體、單鏈抗體等的合適方法在本領域中是已知的。可選地，抗體可以通過噬菌體展示技術被重組製備(參見，例如，美國專利號5,565,332；5,580,717；5,733,743；6,265,150；和Winter, G.等 (1994) “Making Antibodies By Phage Display Technology ,” Annu. Rev. Immunol. 12.433-455)。

可通過Edman降解法對感興趣的抗體或蛋白質測序，這是本領域技術人員熟知的。由質譜或Edman降解法產生的肽資訊可用於設計探針或引物，其被用於克隆感興趣的蛋白質。

克隆感興趣的蛋白質的可選的方法是通過使用純化的DR5和/或期望的癌症抗原和/或在期望的效應細胞的表面上表達的分子(或任何這樣的分子的部分)，“淘選”表達具有一個或多個CDR的感興趣的抗體或蛋白質的細胞，以便能夠結合DR5，或這樣的期望的癌症抗原或效應細胞分子。“淘選”程式可如下進行：從表達DR5的組織或細胞獲得cDNA文庫，在第二細胞類型中過表達cDNA，並且，在存在或不存在能夠結合這樣的分子的已知抗體(例如，在淘選新的抗DR5抗體等情況下的DR5 mAb 1或DR5 mAb 2)的情況下，篩選特異性結合DR5的第二細胞類型的轉染的細胞。用於通過“淘選”克隆編碼細胞表面蛋白質的哺乳基因的方法的詳細描述可見於現有技術(參見，例如，Aruffo, A.等(1987) “Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577和Stephan, J.等(1999) “Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation ,” Endocrinol. 140:5841-5854)。

含有感興趣的多核苷酸的載體可通過一些適當手段中的任意手段被引入到宿主細胞中，此適當手段包括電穿孔；採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質進行轉染；微彈轟擊(microprojectile bombardment)；脂轉染；和感染(例如，在載體是感染劑諸如痘苗病毒的情況下)。引入載體或多核苷酸的選擇常常取決於宿主細胞的特徵。

能夠過表達異源DNA的任何宿主細胞均可被用於分離編碼感興趣的抗體、多肽或蛋白質的基因的目的。合適的哺乳動物宿主細胞的非限制性實例包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。優選地，相比於宿主細胞中相應的感興趣的內源抗體或蛋白質（如果存在），宿主細胞以約高5-倍，更優選高10-倍，甚至更優選高20-倍的水準表達cDNA。通過免疫試驗或FACS實現篩選特異性結合DR5的宿主細胞。過表達感興趣的抗體或蛋白質的細胞可被鑒定。

在一些實施方式中，更提供一種含有前述任一實施方式之抗體的氨基酸序列的多肽。此多肽可通過本領域中已知的方法製備。可如下產生多肽：抗體的蛋白水解或其他降解、如上述的重組方法(即，單一或融合多肽)或化學合成。抗體的多肽，尤其地，上至約50個氨基酸的較短的多肽，通過化學合成常規製備。化學合成方法在本領域中是已知的，並且是商業上可得到的。例如，抗-DR5多肽可通過應用固相法的自動多肽合成儀產生。

在一些實施方式中，結合分子還可包括對下述任一者的修飾：任何這樣的抗體(或其結合DR5、癌症抗原或效應細胞的任何多肽片段，這根據具體情況而定)和這樣的分子的激動劑、拮抗劑和調諧劑，包括功能上等同的抗體和不顯著影響這樣的分子的特性的融合多肽以及具有增強的或降低活性的變異。多肽的修飾在本領域中是常規操作，因而不需要在本文詳細描述。修飾的多肽的實例包括這樣的多肽，其具有氨基酸殘基的保守取代、未明顯有害改變功能活性的氨基酸的一個或多個缺失或添加、或使用化學類似物。可彼此保守取代的氨基酸殘基包括但不限於：甘氨酸/丙氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；天冬氨酸/谷氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯基丙氨酸/酪氨酸。這些多肽還包括糖基化和非糖基化多肽以及具有其它翻譯後修飾的多肽，其它翻譯後修飾，諸如例如，用不同糖進行糖基化、乙醯化和磷酸化。優選地，氨基酸取代是保守的，即，取代的氨基酸具有與原始氨基酸類似的化學性質。這樣的保守取代在本領域中是已知的，並且已經在上文提供實例。氨基酸修飾範圍可從改變或修飾一個或多個氨基酸到區域諸如可變區的完全重新設計（redesign）。可變區中的變化可改變結合親和力和/或特異性。其它修飾方法包括利用本領域中已知的偶聯技術，包括、但不限於酶促手段、氧化取代和螯合。修飾可用於例如連接免疫試驗的標籤，諸如連接放射性部分用於放射免疫分析。修飾的多肽利用本領域中確定的方法製備，並且可利用本領域中已知的標準實驗來篩選。

在一些實施方式中，結合分子還可包括融合蛋白，其包括一個或多個多肽。在一個實施方式中，提供的融合多肽包括輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈二者。在另一實施方式中，融合多肽包含異源免疫球蛋白固定區。在另一實施方式中，融合多肽包含由公共保藏的雜交瘤產生的抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區。為了本發明的目的，抗體融合蛋白包含一個或多個多肽結構域，其特異性結合DR5，癌症抗原或效應細胞(根據具體情況而定)；和在天然分子中不與多肽結構域連接的另外的氨基酸序列，例如，來自另一區域的異源序列或同源的序列。

Ⅵ . 三特異性結合分子的用途

在一些實施方式中，三特異性結合分子提供對於癌症的一般療法。可通過這樣的分子治療的癌症包括特徵在於存在癌症細胞，此癌症細胞選自下述細胞：腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦癌和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、成纖維細胞性小圓細胞瘤、室管膜瘤、尤文氏腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤形成、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合徵、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症、末梢神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後眼色素層黑素瘤、罕見血液疾病、腎轉移性癌、杆狀腫瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症和子宮癌。在一些實施方式中，三特異性結合分子可用於治療結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和直腸癌症。

通過另外能夠結合排列在這樣的腫瘤細胞表面上的DR5分子，三特異性結合分子加強了由針對靶腫瘤的細胞的特有癌症抗原的抗體提供的癌症療法。本發明任一實施方式的用途尤其見於其中癌症抗原的密度低的情況，或當抗癌症抗原抗體的結合動力學不理想而不能(或不足以)促進臨床上足夠的治療性應答的情況。在這樣的情況下，結合分子結合腫瘤細胞的癌症抗原和DR5的能力提供了增強的結合(經抗體親抗原性)，其足以促進臨床上足夠的治療性應答。另外，通過還具備能夠結合免疫系統效應細胞表面上的分子的結合結構域，三特異性結合分子允許將這樣的免疫系統細胞共定位至腫瘤細胞，從而經重定向殺傷促進針對腫瘤細胞的細胞毒素應答。

如表 2 中顯示，具備癌症抗原結合結構域的具體組合的三特異性結合分子優選用於治療具體的癌症。

表 2

除了它們在療法中的用途，三特異性結合分子可被可檢測地標記，和用於癌症的診斷或腫瘤和腫瘤細胞的成像。

Ⅶ . 藥學組合物

在一些實施方式中，組合物包括散裝藥物組合物(例如，不純的或非無菌組合物)，其可用於製造藥學組合物和用於製備可用於製備單位劑型的藥學組合物(即，適於施用至受試者或患者的組合物)。這樣的組合物包括預防或治療有效量的三特異性結合分子，或這樣的劑和藥學上可接受的載體的組合。優選地，組合物可包括預防或治療有效量的三特異性結合分子和藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，藥學組合物中的三特異性結合分子具有以下的DR5-結合結構域：(1) DR5 mAb 1抗體；(2) DR5 mAb 2抗體；(3) DR5 mAb 3抗體；(4) DR5 mAb 4抗體；(5) DR5 mAb 5抗體；(6) DR5 mAb 6抗體；(7) DR5 mAb 7抗體；或(8) DR5 mAb 8抗體(或任何這樣的抗體的人源化的衍生物)。

在一些實施方式中，藥學組合物中的三特異性結合分子具有癌症抗原結合結構域，其：(A) 結合EphA2的表位，尤其其中三特異性結合分子具有EphA2 mAb 1、EphA2 mAb 2或EphA2 mAb 3或其人源化的或嵌合變異的癌症抗原結合結構域；或(B) 結合gpA33的表位，尤其其中三特異性結合分子具有gpA33 mAb 1或其人源化的或嵌合變異的癌症抗原結合結構域；或(C) 結合Her2的結合表位，尤其其中三特異性結合分子具有Her2 mAb 1或曲妥珠單抗或其人源化的或嵌合變異的癌症抗原結合結構域；或(D) 結合B7-H3的表位，尤其其中三特異性結合分子具有B7-H3 mAb 1、B7-H3 mAb 2或B7-H3 mAb 3或其人源化的或嵌合變異的癌症抗原結合結構域。

在一些實施方式中，藥學組合物中的三特異性結合分子具有效應細胞-結合結構域，其結合CD2、CD3、CD17、CD20、CD22、CD32B、CD64、BCR/CD79、T細胞受體或NKG2D受體。在一些實施方式中，藥學組合物中的三特異性結合分子具有下述抗體的效應細胞-結合結構域：Lo-CD2a、CD3 mAb 2、OKT3、3G8、A9、HD37、利妥昔單抗、依帕珠單抗、CD32B mAb 1、CD64 mAb 1、CD79 mAb 1、BMA 031、KYK-1.0，或KYK-2.0。

在一些實施方式中，在三特異性結合分子、包括此結合分子的藥學組合物和此三特異性結合分子的用途中：(1) DR5結合結構域是任何抗DR5抗體的DR5結合結構域；(2) 癌症結合結構域是本文公開的任何癌症抗原；和(3) 效應細胞-結合結構域結合任意下述一種或多種：CD2、CD3、CD17、CD20、CD22、CD32B、CD64、BCR/CD79、T細胞受體或NKG2D受體。

在一些實施方式中，在三特異性結合分子、包括此結合分子的藥學組合物和此三特異性結合分子的用途中：(1) DR5結合結構域是任何抗DR5抗體的DR5結合結構域；(2) 癌症結合結構域是任意下述一種或多種：EphA1、gpA33、Her2或B7-H3；和(3) 效應細胞-結合結構域結合任意下述一種或多種：CD2、CD3、CD17、CD20、CD22、CD32B、CD64、BCR/CD79、T細胞受體或NKG2D受體。

在一些實施方式中，在三特異性結合分子、包括此結合分子的藥學組合物和此三特異性結合分子的用途中：(1) DR5結合結構域是任意下述的DR5結合結構域：DR5 mAb 1抗體、DR5 mAb 2抗體、DR5 mAb 3抗體、DR5 mAb 4抗體、DR5 mAb 5抗體、DR5 mAb 6抗體、DR5 mAb 7抗體或DR5 mAb 8抗體；(2) 癌症抗原結合結構域是任意下述的結合結構域：EphA2 mAb 1、EphA2 mAb 2、EphA2 mAb 3、gpA33 mAb 1、Her2 mAb 1、曲妥珠單抗、B7-H3 mAb 1、B7-H3 mAb 2或B7-H3 mAb 3；和(3) 效應細胞-結合結構域是任意下述的結合結構域：Lo-CD2a、CD3 mAb 2、OKT3、3G8、A9、HD37、利妥昔單抗、依帕珠單抗、CD32B mAb 1、CD64 mAb 1、CD79 mAb 1、BMA 031、KYK-1.0或KYK-2.0。因為列舉了8個抗DR5結合結構域抗體、9個抗癌症抗原結合結構域抗體和14個抗效應細胞-結合結構域抗體，因此這樣的具體考慮包括所有(8 x 9 x 14 =) 1,008個這樣的結合結構域的組合。

在一些實施方式中，藥學組合物可另外包括對具體的癌症抗原具有特異性的第二治療性抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)和藥學上可接受的載體。

在具體實施方式中，術語“藥學上可接受的 ”表示獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可，或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他通常獲得認可的藥典中，供用於動物，特別是用於人類。術語“載體 ”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。這類藥學載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥學組合物時，水是優選的載體。鹽水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液也可以用作液體載體，特別是對於可注射溶液而言。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要，組合物也可以含有小量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋製劑等形式。

通常，前述組合物的成分被單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如作為標明活性劑的量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物，此密封容器如安瓿或小袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌的藥學級水或鹽水的輸注瓶分配。當通過注射施用任一實施方式的組合物時，則可以提供具有注射用無菌水或鹽水的安瓿，以便可以在施用前混合成分。

在一些實施方式中，可以將任一實施方式的組合物配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的鹽以及用陽離子形成的鹽，此陰離子例如來源於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子，並且此陽離子例如來自氫氧化納、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的陽離子。

在一些實施方式中，藥學包裝或試劑盒包括填充本發明任一實施方式的三特異性結合分子(更優選地，上面討論或示例的任何特異性結合分子)的一個或多個容器。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑也可以包括於此藥學包裝或試劑盒中。在一些實施方式中，藥學包裝或試劑盒可包含一個或多個容器，此容器填充以藥學組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器(一個或多個)關聯的可以是管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的佈告(notice)，此佈告反映了管理機構許可用於人類施用的製造、使用或銷售。

在一些實施方式中，更提供可用於上述方法的試劑盒。試劑盒可包括任意實施方式的三特異性結合分子。試劑盒可在一個或多個容器中進一步包括用於治療癌症的一種或多種其他預防劑和/或治療劑；和/或試劑盒可進一步包括結合與癌症相關的一個或多個癌抗原的一種或多種細胞毒性抗體。在某些實施方式中，其他預防劑或治療劑是化療劑。在其他實施方式中，預防劑或治療劑是生物或激素治療劑。

Ⅷ . 施用方法

通過向受試者施用有效量的本發明任一實施方式的融合蛋白或綴合分子或包括本發明任一實施方式的融合蛋白或綴合分子的藥學組合物，可以提供本發明任一實施方式的組合物用來治療、預防和改善與疾病、病症或感染相關的一種或多種症狀。在優選的方面，這類組合物基本上是純的(即，基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物，如非靈長類(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。

各種遞送系統是已知的，並且可以用於施用本發明任一實施方式的組合物，例如：封裝於脂質體、微粒、微膠囊、能表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用(參見，例如，Wu等(1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System ”J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。

施用本發明任一實施方式的結合分子的方法包括、但不限於腸胃外施用(例如皮內、肌肉、腹腔內、靜脈內以及皮下)、硬膜外以及黏膜(例如鼻內和口腔途徑)。在具體實施方式中，三特異性結合分子經肌肉、靜脈內或皮下施用。組合物可以通過任何方便途徑施用，例如通過輸注或彈丸注射、通過上皮或黏膜皮膚被覆(lining) (例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，也可以應用肺部施用，例如通過使用吸入器或噴霧器，並且與霧化劑一起配製。參見，例如，美國專利號6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公開號WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903，其各自通過引用以其整體併入本文。

在一些實施方式中，本發明任一實施方式的三特異性結合分子可被包裝在密封容器中，比如指示分子的量的安瓿或小袋中。在一個實施方式中，這樣的分子作為凍幹無菌粉或無水濃縮物提供於密封容器中，並且可以例如用水或鹽水重構至適當濃度，用於施用於受試者。優選地，本發明任一實施方式的三特異性結合分子可作為凍幹無菌粉提供於密封容器中，其單位劑量為至少5 μg、更優選地至少10 μg、至少15 μg、至少25 μg、至少50 μg、至少100 μg、或至少200 μg。

在一些實施方式中，凍幹的三特異性結合分子應在它們的原容器中儲存在2和8℃之間，並且分子應在重構之後的12小時內，優選地6小時內、5小時內、3小時內或1小時內施用。在可選的實施方式中，這樣的分子以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。優選地，當以液體形式提供時，這樣的三特異性結合分子提供在密封容器中，其中分子存在的濃度為至少1 μg/ml，更優選地至少2.5 μg/ml、至少5 μg/ml、至少10 μg/ml、至少50 μg/ml或至少100 μg/ml。

在一些實施方式中，可通過標準臨床技術測定組合物有效治療、預防或改善與病症相關的一個或多個症狀的量。製劑中採用的精確劑量還取決於施用的路徑和病況的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線推斷。

在一些實施方式中，對於包括的三特異性結合分子單價雙抗體，施用給患者的劑量優選基於接受受試者的體重(kg)確定。施用的劑量通常為至少約0.3 ng/kg/天至約0.9 ng/kg/天、至少約1 ng/kg/天至約3 ng/kg/天、至少約3 ng/kg/天至約9 ng/kg/天、至少約10 ng/kg/天至約30 ng/kg/天、至少約30 ng/kg/天至約90 ng/kg/天、至少約100 ng/kg/天至約300 ng/kg/天、至少約200 ng/kg/天至約600 ng/kg/天、至少約300 ng/kg/天至約900 ng/kg/天、至少約400 ng/kg/天至約800 ng/kg/天、至少約500 ng/kg/天至約1000 ng/kg/天、至少約600 ng/kg/天至約1000 ng/kg/天、至少約700 ng/kg/天至約1000 ng/kg/天、至少約800 ng/kg/天至約1000 ng/kg/天、至少約900 ng/kg/天至約1000 ng/kg/天或至少約1,000 ng/kg/天。

在另一個實施方式中，患者被施用這樣的治療方案，其包括一個或多個劑量的這類預防有效量或治療有效量的三特異性結合分子，其中治療方案在2天、3天、4天、5天、6天或7天內施用。在某些實施方式中，治療方案包括間歇施用預防有效量或治療有效量的三特異性結合分子的劑量(例如，在給定周的第1天、第2天、第3天和第4天施用劑量和不施用預防有效量或治療有效量的三特異性結合分子的劑量。

在一些實施方式中，可在相同周的第5天、第6天和第7天施用這樣的三特異性結合分子，其包括上面討論的DR5結合結構域、癌症抗原結合結構域和效應細胞-結合結構域的任何具體的組合)。典型地，有1、2、3、4、5或更多個療程。每個療程可以是相同的方案或不同的方案。

在另一個實施方式中，施用的劑量在方案（一個或多個）的前四分之一、前一半、或前三分之二或四分之三內上升(例如，在四療程的第一、第二或協力廠商案內)，直到達到日預防有效量或治療有效量的三特異性結合分子。表 3 提供針對典型療程的上述不同給藥方案的5個實例。

表 3

在一些實施方式中，三特異性結合分子的施用劑量和頻率可通過修飾比如，例如脂質化，來增強分子的吸收和組織滲透而被降低或改變。

在一些實施方式中，可計算施用至患者的任一實施方式的三特異性結合分子的劑量，以用作單劑療法。可選地，分子可組合其他治療性組合物被使用，並且施用至患者的劑量小於當此分子作為單試劑療法使用時的劑量。

在一些實施方式中，任一實施方式的藥學組合物可局部施用至需要治療的區域；這可通過例如，但不限於下述方式實現：局部輸注、通過注射、或通過植入物的手段，此植入物是多孔的、非多孔的或膠狀材料，包括膜，比如矽橡膠膜或纖維。優選地，當施用任一實施方式的結合分子時，必須注意使用不吸收該分子的材料。

在一些實施方式中，任一實施方式的組合物可在泡狀體(vesicle)，尤其是脂質體中遞送(參見Langer (1990)“New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)；Treat等, 在以下中：LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein和Fidler (eds.), Liss, New York, 353-365頁(1989)；Lopez-Berestein, ibid., 3 17-327頁)。

在一些實施方式中，可以在控釋或緩釋系統中遞送任一實施方式的組合物。可以使用本領域技術人員已知的任何技術產生包括一個或多個本發明任一實施方式的三特異性結合分子(一種或多種)的緩釋製劑。參見，例如，美國專利號4,526,938；PCT公開物WO 91/05548；PCT公開物WO 96/20698；Ning等 (1996)“ Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained‑Release Gel ,” Radiotherapy & Oncology 39:179‑189；Song等 (1995)“ Antibody Mediated Lung Targeting Of Long‑Circulating Emulsions ,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‑397；Cleek等(1997)“ Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application ,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‑854；和Lam等 (1997)“ Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery ,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‑760，其各通過引用以其整體併入本文。在一個實施方式中，泵可用於控釋系統(參見Langer，上文；Sefton, (1987)“ Implantable Pumps ,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240；Buchwald等 (1980)“ Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis ,” Surgery 88:507-516；和Saudek等 (1989)“ A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery ,” N. Engl. J. Med. 321:574-579)。在另一個實施方式中，聚合材料可用於實現分子的控釋(參見例如Medical Applications of Controlled Release, Langer和Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen和Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Levy等 (1985)“ Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate ,” Science 228:190-192；During等 (1989)“ Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization ,” Ann. Neurol. 25:351-356；Howard等 (1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1)：105-112)；美國專利號5,679,377；美國專利號5,916,597；美國專利號5,912,015；美國專利號5,989,463；美國專利號5,128,326；PCT公開號WO 99/15154；和PCT公開號WO 99/20253)。緩釋製劑所用的聚合物的實例包括但不限於聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)以及聚原酸酯(polyorthoester)。控釋系統可接近治療靶標(例如，肺)佈置，因此僅僅需要全身劑量的一部分(參見，例如，Goodson,在Medical Applications of Controlled Release中，上文，卷2, 115-138頁(1984))。可根據Dunn等 (參見U.S. 5,945,155)，使用可用作控釋移植物的聚合物組合物。該具體的方法基於生物活性材料從聚合物系統的原位控釋的治療效果。移植可通常發生於患者身體內需要治療的任何地方。可使用非聚合物持續遞送系統，由此受試者身體內的非聚合物移植物被用作藥物遞送系統。一旦移植到身體中，移植物的有機溶劑會從組合物中消散、分散或滲漏到周圍組織流體中，並且非聚合物材料會逐漸凝結或沉澱，形成固體微孔基質(參見U.S. 5,888,533)。

控釋系統在Langer (參見1990,“ New Methods Of Drug Delivery ,” Science 249:1527-1533)的綜述中有論述。可以使用本領域技術人員已知的任何技術來生產包含本發明任一實施方式的一種或多種治療劑的緩釋製劑。參見，例如，美國專利號4,526,938；國際公開號WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等 (1996)“ Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained‑Release Gel ,” Radiotherapy & Oncology 39:179‑189；Song等 (1995)“ Antibody Mediated Lung Targeting Of Long‑Circulating Emulsions ,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‑397；Cleek等 (1997)“ Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application ,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‑854；和Lam等 (1997)“ Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery ,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760，其各通過引用以其整體併入本文。

在一些實施方式中，在組合物是編碼三特異性結合分子的核酸的情況下，核酸可體內施用，以通過如下方式促進其編碼的三特異性結合分子的表達：通過將其構建為適當的核酸表達載體的一部分並且施用它從而其成為細胞內的，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(參見美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；生物彈道技術(Biolistic)，Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染試劑塗覆，或通過與已知進入核的同源框樣肽一起施用(見例如Joliot等 (1991)“ Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868) 等。可選地，可以將核酸引入細胞內並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中，以進行表達。

用治療或預防有效量的任一實施方式的三特異性結合分子治療受試者可包括單一治療或，優選地，可包括一系列治療。在優選的實施例中，用這樣的雙抗體每週治療受試者一次持續約1至10周，優選地2至8周，更優選地約3至7周，和甚至更優選地約4、5或6周。在一些實施方式中，此藥學組合物可一天施用一次、一天兩次或一天三次。可選地，藥學組合物可一周施用一次、一周兩次、每兩週一次、一個月一次、每六週一次、每兩個月一次、一年兩次或每年一次。應當認識到，用於治療的分子的有效劑量可以隨著具體療程增加或降低。

實施例：

已經一般性描述了本發明，通過參考下述實施例將更容易理解本發明，此實施例通過示例的方式被提供而不旨在限制本發明，除非指出的。針對材料和方法二者的許多更改可以被實踐而不背離本公開的範圍，這對於本領域技術人員來說是明顯的。

W. 實施例 1 ：抗人 DR5 單克隆抗體 DR5 mAb 1 和 DR5 mAb 2 的表徵

兩個單克隆抗體由於能夠免疫特異性結合於人DR5而被分離，並被授予命名“DR5 mAb 1”和“DR5 mAb 2”。如上面所討論的，發現這些抗體的CDR不同。為了確定抗體是否結合至不同DR5表位，製備了人DR5-Fc融合蛋白，並將其塗覆至固定的表面。將DR5 mAb 1 (1 μg/mL)生物素化，並用對照IgG或用DR5 mAb 2 (10 μg/mL)孵育，並且，通過測量固定的生物素化抗體的量評估IgG或DR5 mAb 2抗體與DR5 mAb 1競爭結合(至人DR5-Fc融合蛋白)的能力。另外，評估IgG或DR5 mAb 1抗體與生物素化的DR5 mAb 2競爭結合的能力。該實驗的結果顯示於表 4 中。

表 4

此實驗的結果表明，生物素化抗體能夠結合DR5蛋白質，即使在存在過量非生物素化抗體的情況下。因此，結果顯示DR5 mAb 1和DR5 mAb 2結合DR5的不同表位。

為了進一步表徵DR5 mAb 1和DR mAb 2抗體，評估其阻斷DR5和TRAIL配體之間結合的能力。因此，生物素化DR5 mAb 1、生物素化DR5 mAb 2或生物素化DR5-Fc融合物(各為2 μg/mL)分別用固定的DR5-Fc融合物(1 μg/mL)在緩衝液或組氨酸標記的TRAIL (20 μg/mL)存在下孵育。評估固定的生物素化抗體的量。該實驗的結果顯示於表 5 。

表 5

結果顯示結合固定的DR5-Fc的DR5 mAb 1或DR5 mAb 2的量不受組氨酸標記的TRAIL的存在的影響，因此指示DR5 mAb 1和DR5 mAb 2都不阻斷DR5的TRAIL配體結合位點。另外，兩種抗體都不能夠結合組氨酸標記的TRAIL配體。

X. 實施例 2 ：抗人 DR5 單克隆抗體 DR5 mAb 1 和 DR5 mAb 2 的物種特異性

為了評估抗人DR5單克隆抗體DR5 mAb 1和DR5 mAb 2的物種特異性，比較抗體結合人DR5的能力與它們結合食蟹猴(Macaca fascicularis )DR5的能力。該實驗的結果顯示在圖 6 中。結果顯示兩個抗體都能夠結合食蟹猴DR5，但是它們每個展示對人DR5更高的結合親和力。

使用Biacore分析研究結合的動力學，如圖 7 中所顯示。用His標記的DR5孵育雙特異性DR5 x CD3雙抗體並且經Biacore分析測定結合的動力學。採用的雙抗體是DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 (圖 7 ，圖 A 和E )、DR5 mAb 2x CD3 mAb 2 (圖 7 ，圖 B 和F )、DR5 mAb 3x CD3 mAb 2 (圖 7 ，圖 C 和G )和DR5 mAb 4x CD3 mAb 2 (圖 7 ，圖 D 和H )。圖 7 ，圖 A-D 顯示人DR5的結果。圖 7 ，圖 E-H 顯示食蟹猴DR5的結果。計算的ka、kd和KD顯示在表 6 中。

表 6

結果表明DR5 mAb 1和DR5 mAb 2展示相對於參考抗體DR5 mAb 3和DR5 mAb 4改變的結合動力學。

Y. 實施例 3 ： DR5 mAb 1 和 DR5 mAb 2 出人意料的優勢

將DR5-結合分子DR5 mAb 1和DR5 mAb 2介導細胞毒性的能力與參考抗DR5抗體：DR5 mAb 3和DR5 mAb 4介導細胞毒性的能力進行比較。為了進行這樣的比較，製備包含這些抗體的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域的雙特異性DR5 x CD3雙抗體。製備的雙抗體是：DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2、DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2、DR5 mAb 3 x CD3 mAb 2和DR5 mAb 4 x CD3 mAb 2。

採用的對照雙抗體包含抗螢光素抗體4-4-20的VL和VH結構域(分別為SEQ ID NOs:138 和139 )和CD3 mAb 2的VL和VH結構域(分別為SEQ ID NOs:102 和108 )，並且命名為抗螢光素x抗CD3對照雙抗體“4-4-20 x CD3 mAb 2 ”。雙抗體由兩條多肽鏈組成。雙抗體的第一多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 300 ) (CDR以底線顯示)：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSNGNTYLR W YLQKPGQSPK VLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP W TFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMN WVRQA PGKGLEWVA R IRSKYNNYAT YYADSVKD RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK

在SEQ ID NO: 300 中，氨基酸殘基1-112對應抗螢光素抗體4-4-20的VL結構域(SEQ ID NO: 138 )，殘基113-120對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基121-245對應CD3 mAb 2的VH結構域(SEQ ID NO: 108 )，殘基246-251是包含半胱氨酸的間隔肽(GGCGGG) (SEQ ID NO: 34 )和殘基252-280對應E-螺旋結構域(SEQ ID NO: 39 )。

雙抗體的第二多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 301 ) (CDR以底線顯示)：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV KLDETGGGLV QPGRPMKLSC VA SGFTFSDY WMN WVRQSPE KGLEWVA QIR NKPYNYETYY SDSVKG RFTI SRDDSKSSVY LQMNNLRVED MGIYYCTG SY YGMDY WGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE

在SEQ ID NO: 301 中，氨基酸殘基1-110對應CD3 mAb 2的VL結構域(SEQ ID NO: 104 )，殘基111-118對應間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO: 33 )，殘基119-236對應抗螢光素抗體4-4-20的VH結構域(SEQ ID NO: 139 )，殘基237-242是包含半胱氨酸的間隔肽(GGCGGG) (SEQ ID NO: 34 )和殘基243-270對應K-螺旋結構域(SEQ ID NO: 40 )。

靶腫瘤細胞用這些雙抗體中的一種或用對照雙抗體(4-4-20 x CD3 mAb 2)在存在外周血單核細胞(PBMC )和A549腺癌人肺泡基底上皮細胞的情況下孵育24小時，效應子與靶細胞比例為20:1。通過測量受損細胞向培養基中進行的乳酸脫氫酶(LDH)的釋放測定細胞毒性百分數。

此研究的結果顯示在圖 8 中。使用SKMES人肺癌細胞、DU145人前列腺癌細胞、A375人惡性黑素瘤細胞、SKBR3人HER2-過表達乳腺癌細胞和JIMT人乳腺癌細胞獲得類似的結果。結果指示DR5 mAb 1和DR5 mAb 2的VL和VH結構域在誘導細胞毒性方面比參考DR5 mAbs的VL和VH結構域顯著和出人意料地更有效。

Z. 實施例 4 ：三特異性結合分子介導與靶細胞的協同和同時結合

研究三特異性結合分子結合靶細胞的能力。採用的三特異性分子是：EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1、EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1和gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1。如圖 9A 中所顯示，發現包括EphA2癌症抗原結合結構域的那些三特異性結合分子能夠結合表達EphA2的CHO靶細胞。如圖 9B 中所顯示，發現包括DR5癌症抗原結合結構域的那些三特異性結合分子能夠結合表達DR5的CHO靶細胞。如圖 9C 中所顯示，發現包括EphA2癌症抗原結合或DR5癌症結合結構域的那些三特異性結合分子能夠結合DU145細胞。DU145細胞是人前列腺細胞系，其表達EphA2和DR5二者，但是不表達gpA33。上述參考gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2雙抗體用作對照。

顯著地，資料顯示當三特異性結合分子的兩個癌症抗原結合結構域都能夠結合靶細胞時，這樣的雙結合與靶結合的協同(例如，5-25倍)增強相關。

AA. 實施例 5 ：三特異性結合分子介導結合的靶細胞的細胞毒性

研究三特異性結合分子在存在細胞毒性淋巴細胞的情況下介導結合的靶細胞的細胞毒性的能力。採用的三特異性分子是：EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1、EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1和gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1。上述參考gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2雙抗體和4-4-20 x CD3 mAb 2雙抗體用作對照。

如圖 10A 中所顯示，包括EphA2癌症抗原結合結構域因而能夠結合表達EphA2的CHO細胞的那些三特異性結合分子能夠在存在細胞毒性淋巴細胞的情況下介導這樣的細胞的細胞毒性。如圖 10B 中所顯示，發現包括DR5癌症抗原結合結構域因而能夠結合表達DR5的CHO細胞的那些三特異性結合分子能夠在存在細胞毒性淋巴細胞的情況下介導表達DR5的CHO靶細胞的細胞毒性。

如圖 10C 中所顯示，包括EphA2癌症抗原結合或DR5癌症結合結構域因而能夠結合DU145細胞的那些三特異性結合分子能夠在存在細胞毒性淋巴細胞的情況下介導這樣的細胞的細胞毒性。顯著地，資料顯示當三特異性結合分子的兩個癌症抗原結合結構域都能夠結合靶細胞時，這樣的雙結合與靶結合的協同增強相關。因此，能夠結合EphA2和DR5的EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1，相比僅僅能夠結合DU146細胞的EphA2或DR5分子(因為這樣的細胞缺乏gpA33)的EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1或gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1，介導基本上更大的細胞毒性。

在這方面，以EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1近似的EC50，對於EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1或gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1，沒有看到細胞毒性淋巴細胞應答。以EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1近似的EC90，EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1顯示僅僅EC15和gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1根本不顯示細胞毒性淋巴細胞應答。

本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文，如同好像具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步更改，並且本申請旨在覆蓋大體上遵循本發明原理的本發明的任何變型、用途或改變，此變型、用途或改變包括與本公開的這種偏離，只要其在本發明所屬領域的已知或常規實施範圍內和只要其可應用於上文闡釋的本質特徵。

VL‧‧‧結構域

VL1‧‧‧結構域

VL2‧‧‧結構域

VL3‧‧‧結構域

VL4‧‧‧結構域

VL_I‧‧‧結構域

VL_II‧‧‧結構域

VL_III‧‧‧結構域

VH‧‧‧ 結構域

VH1‧‧‧結構域

VH2‧‧‧結構域

VH3‧‧‧結構域

VH4‧‧‧結構域

VH_I‧‧‧結構域

VH_II‧‧‧結構域

VH_III‧‧‧結構域

CH1‧‧‧結構域

CH2‧‧‧結構域

CH3‧‧‧結構域

CL‧‧‧結構域

MFI‧‧‧平均螢光值

mIgG‧‧‧免疫球蛋白

DR5‧‧‧死亡受體

mAb 1‧‧‧單克隆抗體

mAb 2‧‧‧單克隆抗體

His‧‧‧組氨酸(histidine)

CD3‧‧‧分化叢集分子3(Cluster of Differentiation 3)

PBMC‧‧‧外周血單核細胞

LDH‧‧‧乳酸脫氫酶

CHO‧‧‧中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary)

FACS‧‧‧流式細胞分選儀(Fluorescence-activated cell sorter)

DU145‧‧‧人類前列腺癌細胞株

EphA2‧‧‧肝配蛋白受體A2

gpA33‧‧‧糖蛋白A33

4-4-20‧‧‧抗螢光素抗體

CTL‧‧‧細胞毒性淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte)

EC90‧‧‧90%有效濃度

EC50‧‧‧50%有效濃度

EC15‧‧‧15%有效濃度

[圖 1A-1B ]顯示DART™雙抗體的結構域的圖示。圖 1A 顯示基本的DART™雙抗體的結構域的圖示。圖 1B 提供了由兩條多肽鏈組成的共價結合的雙抗體的示意圖，每條多肽鏈各具有識別相同表位的異源二聚體-促進結構域VL和VH結構域——使用相同的陰影顯示。

[圖 2A-2B ]提供了由兩條多肽鏈組成的共價結合的雙抗體的示意圖，每條多肽鏈具有CH2和CH3結構域(圖 2A )或其中僅僅一條多肽鏈具有CH2和CH3結構域(圖 2B )，以便締合的鏈形成Fc結構域，其包括天然存在的Fc結構域的全部或一部分。使用相同的陰影顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。

[圖 3A-3C ]提供了顯示由兩對多肽鏈組成的四價雙抗體的示意圖。多肽鏈對是不同的，因此產生雙特異性分子，其對於兩個表位中的每一個而言是二價的，其中一個表位是DR5的表位和另一個表位是效應細胞的表面上存在的分子的表位。每個對的一個多肽具有CH2和CH3結構域，以便締合的鏈形成Fc結構域，其包括天然存在的Fc結構域的全部或一部分。使用相同的陰影顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。僅僅一對表位(用相同的陰影顯示)能夠結合DR5。圖 3A 顯示Ig雙抗體。圖 3B 顯示Ig雙抗體，其包含E-螺旋和K-螺旋異源二聚體-促進結構域。圖 3C 顯示Fc-DART™雙抗體，其包含抗體CH1和CL結構域。符號“VL1 ”和“VH1 ”分別表示結合“第一”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。類似地，符號“VL2 ”和“VH2 ”分別表示結合“第二”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。

[圖 4A-4G ]提供了一實施方式的三特異性結合分子的結構域的圖示。圖示意性闡一實施方式的三特異性結合分子的實施方式的結構域的順序和取向。圖 4A 、 4B 和4G 闡釋了其中三特異性結合分子由四條多肽鏈組成的實施方式。圖 4C 、4D 、4E 和4F 闡釋了其中結合分子由三條多肽鏈組成的實施方式。分子可具有鉸鏈和/或CL結構域(圖 4A 、 4B 、4C 、4E )或可包含可選的接頭肽(圖 4D 、4F 、4G )。

[圖 5A-5E ]提供了三特異性結合分子的可選實施方式的結構域的圖示，其中效應細胞-結合結構域由效應細胞受體型結合結構域而不是雙抗體型結合結構域或Fab型結合結構域組成。圖 5A 和5B 闡釋了其中三特異性結合分子由四條多肽鏈組成的實施方式。圖 5C 和圖 5E 闡釋了其中結合分子由三條多肽鏈組成的實施方式。圖 5D 圖解了其中結合分子由五條多肽鏈組成的實施方式。分子可具有鉸鏈和/或CL結構域或可包含可選的接頭肽。

[圖 6 ]顯示抗人DR5單克隆抗體DR5 mAb 1和DR5 mAb2結合人DR5和結合食蟹猴的DR5的能力。

[圖 7 ]，圖 A-H 顯示DR5 mAb 1 (圖 A 和E )、DR5 mAb 2 (圖 B 和F )、DR5 mAb 3 (圖 C 和G )和DR5 mAb 4 (圖 D 和H )對於人DR 5 (圖 A-D )和食蟹猴DR5 (圖 E-H )的結合的動力學。

[圖 8 ]顯示DR5 mAb 1和DR5 mAb 2出人意料的優勢。通過比較具有DR5 mAb 1、DR5 mAb 2、DR5 mAb 3或DR5 mAb 4的VL和VH結構域的DR5 x CD3雙抗體介導A549腺癌人肺泡基底上皮腫瘤細胞的細胞毒性的能力評估優勢。

[圖 9A-9C ]顯示當三特異性結合分子的兩個癌症抗原結合結構域都能夠結合靶細胞時獲得的在靶細胞結合方面的協同增強。圖 9A 顯示當三特異性分子：EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1、EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1和gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1在存在表達EphA2的CHO細胞的情況下被孵育時達到的結合。圖 9B 顯示當這樣的三特異性分子在存在表達DR5的CHO細胞的情況下被孵育時獲得的結合。圖 9C 顯示當這樣的三特異性分子在存在表達EphA2和DR5但是不表達gpA33的DU145人前列腺細胞的情況下被孵育時獲得的結合。

[圖 10A-10C ]顯示當三特異性結合分子的兩個癌症抗原結合結構域都能夠結合靶細胞時獲得的在靶細胞細胞毒性方面的協同增強。圖 10A 顯示通過在存在表達EphA2的CHO細胞和細胞毒性淋巴細胞的情況下孵育三特異性分子：EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1、EphA2 mAb 1 x CD3 mAb 2 x gpA33 mAb 1和gpA33 mAb 1 x CD3 mAb 2 x DR5 mAb 1獲得的細胞毒性百分數。圖 10B 顯示當這樣的三特異性分子在存在表達DR5的CHO細胞和細胞毒性淋巴細胞的情況下被孵育時獲得的細胞毒性百分數。圖 10C 顯示當這樣的三特異性分子在存在DU145人前列腺細胞和細胞毒性淋巴細胞的情況下被孵育時獲得的細胞毒性。DU145細胞表達EphA2和DR5，不表達gpA33。通過細胞裂解時螢光素酶的釋放造成的發光增加來測量細胞毒性。

Claims

一種能夠免疫特異性結合三個不同的表位的三特異性結合分子，包括：共價複合在一起的三條不同的多肽鏈，其中該三特異性結合分子更包括： (I)抗原結合結構域I，其能夠免疫特異性結合第一抗原上存在的表位I，和抗原結合結構域II，其能夠免疫特異性結合第二抗原上存在的表位II； (II) 抗原結合結構域III，其能夠免疫特異性結合第三抗原上存在的表位III；和 (III) Fc結構域，其中： (A)表位I、表位II或表位III中的一個是效應細胞抗原的表位，表位I、表位II或表位III中的第二個是第一癌症抗原的表位，和表位I、表位II或表位III中的第三個是第二癌症抗原的表位； (B)第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：(VL_I 結構域)─(接頭1)─(VH_II 結構域)─(接頭2)─(異源二聚體-促進結構域)─(接頭3)─(CH2-CH3結構域)；或(CH2-CH3結構域)─(接頭4)─(VL_I 結構域)─(接頭1)─(VH_II 結構域)─(接頭2)─(異源二聚體-促進結構域)；或(包含半胱氨酸的結構域)─(CH2-CH3結構域)─(接頭4)─(VL_I 結構域)─(接頭1)─(VH_II 結構域)─(接頭2)─(異源二聚體-促進結構域); (C)第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：(VL_II 結構域)─(接頭1)─(VH_I 結構域)─(接頭2)─(異源二聚體-促進結構域)； (D)第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：(VL_III 結構域)─(靈活接頭)─(VH_III 結構域)─(包含半胱氨酸的結構域)─(CH2-CH3結構域)；或(包含半胱氨酸的結構域1)─(VL_III 結構域)─(靈活接頭)─(VH_III 結構域)─(包含半胱氨酸的結構域2)─(包含半胱氨酸的結構域)─(CH2-CH3結構域)； (E)該VL_I 結構域是能夠結合表位I的免疫球蛋白的輕鏈可變結構域，該VH_I 結構域是能夠結合表位I的免疫球蛋白的重鏈可變結構域，該VL_II 結構域是能夠結合表位II的免疫球蛋白的輕鏈可變結構域，該VH_II 結構域是能夠結合表位II的免疫球蛋白的重鏈可變結構域，該VL_III 結構域是能夠結合表位III的免疫球蛋白的輕鏈可變結構域，並且該VH_III 結構域是能夠結合表位III的免疫球蛋白的重鏈可變結構域； (F)該VL_I 結構域和該VH_I 結構域締合形成抗原結合結構域I，該VL_II 結構域和該VH_II 結構域締合形成抗原結合結構域II，該VL_III 結構域和該VH_III 結構域締合形成抗原結合結構域III，並且該第一多肽鏈的CH2-CH3結構域和該第三多肽鏈的CH2-CH3結構域締合形成該Fc結構域。
如請求項1所述的三特異性結合分子，其中該第三多肽鏈的該包含半胱氨酸的結構域1是CL結構域，並且該第三多肽鏈的該包含半胱氨酸的結構域2選自CH1結構域和/或鉸鏈結構域。
如請求項1或2所述的三特異性結合分子，其中：該接頭2包括半胱氨酸殘基，或該異源二聚體-促進結構域包括半胱氨酸殘基，或該接頭2包括半胱氨酸殘基，並且該異源二聚體-促進結構域包括半胱氨酸殘基。
如請求項1-3中的任一項所述的三特異性結合分子，其中：該第一多肽鏈的該CH2-CH3結構域是攜帶杵的CH2-CH3結構域，並且該第三多肽鏈的該CH2-CH3結構域是攜帶臼的CH2-CH3結構域；或者該第三多肽鏈的該CH2-CH3結構域是攜帶杵的CH2-CH3結構域，並且該第一多肽鏈的該CH2-CH3結構域是攜帶臼的CH2-CH3結構域。
如請求項1-4中任一項所述的三特異性結合分子，其中該第一多肽鏈的和該第三多肽鏈的該CH2-CH3結構域包括至少一個相對於序列SEQ ID NO:1的氨基酸取代，並且由它們締合形成的該Fc結構域展示改變的FcγR介導的效應子功能。
如請求項1-5中的任一項所述的三特異性結合分子，其中，該第一多肽鏈上的該異源二聚體-促進結構域是E-螺旋結構域，並且該第二多肽鏈上的該異源二聚體-促進結構域是K-螺旋結構域；或該第一多肽鏈上的該異源二聚體-促進結構域是K-螺旋結構域，並且該第二多肽鏈上的該異源二聚體-促進結構域是E-螺旋結構域。
如請求項1-6中的任一項所述的三特異性結合分子，其中，該接頭1包括序列SEQ ID NO:33；該接頭2包括序列SEQ ID NO :34或47；該異源二聚體-促進結構域包括序列SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41或42；該接頭3包括序列SEQ ID NO: 46、47、48、49、50、51、152、或GCG或GGG；該接頭4包括序列SEQ ID NO: 50或152；該CH2-CH3結構域包括序列SEQ ID NO:52或53；該CH1-鉸鏈結構域包括序列SEQ ID NO:207、208或209；該包含半胱氨酸的結構域包括序列SEQ ID NO：34、36、38、48、210或211；或上述的組合。
如請求項7所述的三特異性結合分子，其中，當接頭2包括序列SEQ ID NO:47時，存在包含序列SEQ ID NO:41或42的該異源二聚體-促進結構域，或者當接頭2包括序列SEQ IDNO:34時，存在包含序列SEQ ID NO: 39、40、41 或42的該異源二聚體-促進結構域。
如請求項1-8中的任一項所述的三特異性結合分子，其中： (A) 該表位I、表位II和表位III分別是第一癌症抗原的表位、第二癌症抗原的表位和效應細胞抗原的表位； (B) 該表位I、表位II和表位III分別是第一癌症抗原的表位、效應細胞抗原的表位和第二癌症抗原的表位； (C) 該表位I、表位II和表位III分別是第二癌症抗原的表位、第一癌症抗原的表位、和效應細胞抗原的表位； (D) 該表位I、表位II和表位III分別是第二癌症抗原的表位、效應細胞抗原的表位和第一癌症抗原的表位； (E) 該表位I、表位II和表位III分別是效應細胞抗原的表位、第一癌症抗原的表位和第二癌症抗原的表位；以及 (F) 該表位I、表位II和表位III分別是效應細胞抗原的表位、第二癌症抗原的表位、和第一癌症抗原的表位。
如請求項1至9中的任一項所述的三特異性結合分子，其中該效應細胞抗原選自：CD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD22、CD32B、CD64、B細胞受體(BCR)、T細胞受體(TCR)和NKG2D受體。
如請求項1-10中的任一項所述的三特異性結合分子，其中： (A) 該效應細胞抗原的表位是被抗體Lo-CD2a識别的CD2表位； (B) 該效應細胞抗原的表位是被抗體OKT3、M291、YTH12.5、抗CD3 mAb 1或抗CD3 mAb 2識别的CD3表位； (C) 該效應細胞抗原的表位是被抗體3G8或A9識別的CD16表位； (D) 該效應細胞抗原的表位是被抗體MD1342、MEDI-551、蘭妥莫單抗或HD37識別的CD19表位； (E) 該效應細胞抗原的表位是被抗體利妥昔單抗、替伊莫單抗、奧法木單抗和托西莫單抗識別的CD20表位； (F) 該效應細胞抗原的表位是被抗體依帕珠單抗識別的CD22表位； (G) 該效應細胞抗原的表位是被抗體CD32B mAb 1識別的CD32B表位； (H) 該效應細胞抗原的表位是被抗體CD64 mAb 1識別的CD64表位； (I) 該效應細胞抗原的表位是被抗體CD79 mAb 1識别的BCR/CD79表位； (J) 該效應細胞抗原的表位是被抗體BMA 031識別的TCR表位； (K) 該效應細胞抗原的表位是被抗體KYK-2.0識別的NKG2D受體表位；或 (L) 表位I、表位II或表位III中的一個是效應細胞抗原的表位，並且能夠免疫特異性結合該表位的抗原結合結構域包括SEQ ID NO: 102-104、108、112、114和115-137中的一個或多個。
如請求項1至11中的任一項所述的三特異性結合分子，其中該第一癌症抗原和該第二癌症抗原獨立地選自：結腸癌抗原19.9；胃癌黏蛋白；抗原4.2；糖蛋白A33 (gpA33)；ADAM-9；胃癌抗原AH6；ALCAM；惡性人淋巴細胞抗原APO-1；癌症抗原B1；B7-H3；β-聯蛋白；血型ALeb/Ley；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；結腸腺癌抗原C14；卵巢癌抗原CA125；羧肽酶M；CD5；CD19；CD20；CD22；CD23；CD25；CD27；CD30；CD33；CD36；CD45；CD46；CD52；CD79a/CD79b；CD103；CD317；CDK4；癌胚抗原(CEA)；CEACAM5；CEACAM6；CO17-1A；CO-43 (血型Leb)；CO-514 (血型Le^a )；CTA-1；CTLA4；細胞角蛋白8；抗原D1.1；抗原D₁ 56-22；DR5；E₁ 系列(血型B)；EGFR (表皮生長因數受體)；肝配蛋白受體A2 (EphA2)；ErbB1；ErbB3；ErbB4；GAGE-1；GAGE-2；GD2/GD3/GM2；肺腺癌抗原F3；抗原FC10.2；G49；神經節苷酯GD2；神經節苷酯GD3；神經節苷酯GM2；神經節苷酯GM3；G_D2 ；G_D3 ；GICA 19-9；G_M2 ；gp100；人白血病T細胞抗原Gp37；黑素瘤抗原gp75；gpA33；HER2抗原(p185^HER2 )；人乳脂肪球抗原(HMFG)；人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7；高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)；I抗原(分化抗原) I(Ma)；整聯蛋白α-V-β-6整聯蛋白β6 (ITGB6)；白介素-13；受體α2 (IL13Rα2)；JAM-3；KID3；KID31；KS 1/4全癌抗原；人肺癌抗原L6和L20；LEA；LUCA-2；M1:22:25:8；M18；M39；MAGE-1；MAGE-3；MART；MUC-1；MUM-1；Myl；N-乙醯葡糖氨基轉移酶；新糖蛋白；NS-10；OFA-1；OFA-2；制瘤素M；p15；黑素瘤相關的抗原p97；多態上皮黏蛋白(PEM)；多態上皮黏蛋白抗原(PEMA)；PIPA；前列腺特異性抗原(PSA)；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；前列腺酸性磷酸鹽；R₂₄ ；ROR1；鞘脂；SSEA-1；SSEA-3；SSEA-4；sTn；源自T細胞受體的肽；T₅ A₇ ；TAG-72；TL5 (血型A) ；TNF-α受體；TNF-ß受體；TNF-γ受體；TRA-1-85 (血型H) ；轉鐵蛋白受體；腫瘤特異性移植抗原(TSTA)、胎性癌抗原-甲胎蛋白(AFP)；VEGF、VEGFR；VEP8；VEP9；VIM-D5和Y半抗原、Ley。
如請求項12所述的三特異性結合分子，其中表位I、表位II或表位III中的一個是效應細胞抗原的表位，並且能夠免疫特異性結合該表位的抗原結合結構域包括SEQ ID NO: 3、8、13、18、23、25、27、29、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、153、158、163、167、172、177、181、186、191-206、302-306和308-315中的一個或多個。
一種核酸組合物，包括對如請求項1-13中任一項所述的三特異性結合分子的多肽鏈進行編碼的多核苷酸。
一種藥學組合物，其包括如請求項1-13中的任一項所述的三特異性結合分子，和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
一種如請求項1-13中任一項所述的三特異性結合分子或者請求項15所述的組合物在製造用於治療癌症或病原體感染的藥物中的用途。
如請求項16所述的用途，其中該癌症特徵在於存在癌症細胞，該癌症細胞選自下述的細胞：腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦癌和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、成纖維細胞性小圓細胞瘤、室管膜瘤、尤文氏腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤形成、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合徵、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症、末梢神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後眼色素層黑素瘤、罕見血液疾病、腎轉移性癌、杆狀腫瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症、或子宮癌。
如請求項16所述的用途，其中該癌症是結直腸癌；肝細胞癌；神經膠質瘤；腎癌；乳腺癌；多發性骨髓瘤；膀胱癌；成神經細胞瘤；肉瘤；非霍奇金淋巴瘤；非小細胞肺癌；卵巢癌；胰腺癌；直腸癌症；急性髓細胞樣白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)；急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；毛細胞白血病(HCL)；母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)；非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套細胞白血病(MCL)；小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)；霍奇金淋巴瘤；系統性肥大細胞增生症；或伯基特淋巴瘤。