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TW201813663A - 製備改良豬血漿纖連蛋白以增強傷口癒合之應用 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示了可用於臨床傷口癒合與組織修復的材料及其應用。為了尋求安全的血漿纖連蛋白來源以使用於傷口敷料的實際應用，本發明從豬血漿中分離並修飾纖連蛋白，經修飾後的豬血漿纖連蛋白適用於人體，且可以作為刺激細胞貼附和定向細胞移動的基礎材料。本發明還揭示了一種增強傷口癒合的材料與一種醫藥組合物。

Description

製備改良豬血漿纖連蛋白以增強傷口癒合之應用
本發明涉及改良豬血漿纖連蛋白以作為臨床傷口癒合和組織修復的安全材料之用途。本發明還揭示了一種增強傷口癒合的材料與一種醫藥組合物。
傷口癒合是一種動態過程，其包括止血、發炎、增生和重塑。纖連蛋白是細胞外基質(ECM)醣蛋白，在傷口癒合的不同階段起重要作用，其主要功能是調節細胞貼附和細胞遷移。纖連蛋白作用以激活細胞表面整合素受體，其誘導一系列細胞蛋白質聚集以連接細胞內的肌動蛋白細胞骨架，以形成整聯蛋白的黏著胞器，黏著斑(focal adhesions,FAs)。黏著斑(focal adhesions,FAs)連接細胞內的肌動蛋白細胞骨架(actin cytoskeleton)和細胞外基質(ECM)的纖連蛋白(fibronectin)以動力驅動傷口癒合中的定向細胞遷移。
傷口癒合時，肌動蛋白聚合(actin polymerization)產生細胞突起並連結成為緻密的肌動蛋白網，然後往細胞外基質(ECM)纖連蛋白(fibronectin)的方向延伸，進而在接觸後形成新生的黏著斑(nascent adhesions,new-born FAs)。進一步，新生的黏著斑經由肌動蛋白絲上肌球蛋白-II(myosin II)產生的收縮力進入成熟作用而增大。成熟的黏著斑提供細胞施力點，傳遞從肌動蛋白細胞骨架上肌球蛋白II驅動的收縮力到細胞外基質的纖連蛋白，而將細胞體向前拉。最後，伴隨著肌球蛋白II驅動的收縮力將細胞後端的黏著斑從細胞外基質(ECM)纖連蛋白拔起以促使細胞後端回縮。細胞外基質(ECM)纖連蛋白在細胞外活化細胞表面整合素受體 並促進黏著斑形成，以連接細胞內細胞骨架(actin cytoskeleton)，所以在透過黏著斑(FAs)動態調控，控制傷口癒合過程中的細胞黏著和細胞移動。
纖連蛋白有兩種形式：血漿纖連蛋白(plasma fibronectin)和細胞纖連蛋白(cellular fibronectin)。血漿纖維連接蛋白由肝細胞合成並分泌到血漿中，而細胞纖連蛋白是由許多細胞類型如纖維母細胞(fibroblasts)、內皮細胞(endothelial cells)、肌原細胞(myocytes)和軟骨細胞(chondrocytes)產生。在傷口癒合過程中，已經有許多研究表示血漿纖連蛋白在傷口產生時會累積在傷口處，這對血小板、纖維母細胞和內皮細胞的各種功能如黏著(adhesion)、遷移(migration)和聚集(aggregation)是至關重要的，顯示血漿纖連蛋白適合作為加速傷口修復的物質。在動物實驗中，含有血漿纖連蛋白的臨時基質在表皮細胞黏著和遷移均有顯著效果，這些先前研究顯示血漿纖連蛋白在人傷口癒合和組織修復中的臨床潛力。
然而，由人類血漿中取得的血漿纖連蛋白是既不安全而且昂貴的來源。尤其人血漿纖連蛋白對人傷口癒合的臨床應用尚未得到驗證，原因是來自人體的纖維連接蛋白並不適合用於醫療產品。過去的研究證明癌症患者中的纖連蛋白具有特異性異常醣基化修飾，其具有促進癌症轉移的作用，因此若高純度纖維連接蛋白是來自於未知健康狀況的個體所提供的血液純化而來，在使用上會產生醫療風險。另外，在過去的其他文獻中，纖連蛋白純化的方法太粗糙，不但纖連蛋白的純度太低，且並未闡明其對醣基保護的作用。
回顧前人已發表的文獻方法，包括利用基因重組的纖連蛋白重組體，和從人血液中純化的纖維連接蛋白等方式皆是有缺陷的。由於纖連蛋白上的醣基化在促進傷口癒合中具有重要作用，而由基因重組表達的重組纖維連接蛋白並不具有醣基化修飾，因此其作用是有缺陷的。
在發明人的研究中，發現人類和豬纖連蛋白有相似的聚醣(glycans)，且功能相似。此外，發明人進一步分析人血和豬血漿纖連蛋白上的醣基化(glycosylation)位點和聚醣結構的特徵，發現血漿纖維連接蛋白上 的聚醣藉由調節細胞表面整合素受體介導的黏著訊號在細胞黏著和定向細胞遷移中具有重要影響。因此，豬血漿纖連蛋白的應用於傷口癒合，可以補足人血漿纖連蛋白應用可能產生的缺失，以取代人血漿纖連蛋白的功能。
經發明人研究，豬纖連蛋白上的唾液酸(sialic acids)的結構是N-乙酰神經氨酸(Neu5AC)和N-乙酰神經氨酸(Neu5GC)，而人纖連蛋白的結構僅為Neu5AC，這樣的結果顯示Neu5GC在臨床應用中具有引起人體免疫反應的可能性，但由於發明人研究證實，纖連蛋白的唾液酸在細胞黏附和定向細胞遷移中並不具備關鍵的作用，故本發明中特別針對豬血漿纖連蛋白中的唾液酸做去除，以修飾為較適合人類傷口癒合和組織修復的安全材料。
鑑於血漿纖連蛋白對傷口癒合的重要性，以及其在醫學應用中的潛力，發明人從豬隻的血漿中分離豬血漿纖連蛋白，並修飾為適合人類傷口癒合與組織修復的纖連蛋白，可作為替代人血漿纖連蛋白之材料，相較人血漿纖連蛋白具備較佳且安全性和更高的量。
為了解決前述的問題，本發明提供了一種用於製備治療傷口癒合之纖連蛋白的用途，其中該組合物包含一酵素修飾的一醣基化的豬纖連蛋白。
在本發明的一個實施方案中，其中在豬纖連蛋白上被修飾的醣基係指一複數個唾液酸分子醣基。
在本發明的一個實施方案中，其中該些唾液酸分子醣基係為N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)和/或N-乙酰神經氨酸(Neu5GC)。
在本發明的一個實施方案中，其中該些唾液酸分子醣基被除去大於80%。
在本發明的一個實施方案中，其中該酵素為α 2-3,6,8神經氨酸酶(α 2-3,6,8 Neuraminidase)。
在本發明的一個實施方案中，其中該酵素為進一步包含一蛋白酶，該蛋白酶具備將纖連蛋白切割成纖連蛋白胜肽之功效。
在本發明的一個實施方案中，其中該酵素為包含一基質金屬 蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3)。
在本發明的一個實施方案中，該醣基化的豬纖連蛋白由唯一一明膠-瓊脂糖凝膠快速流動4B的預柱(gelatin-Sepharose Fast Flow 4B)製備。
為了解決前述的問題，本發明提供了一種用於促進傷口癒合的醫藥組合物，包含：一酵素修飾的一醣基化的豬纖連蛋白；一膠原蛋白；以及一透明質酸；和/或其藥學上可接受的鹽。
為了解決前述的問題，本發明提供了一種用於促進傷口癒合的材料，包含一酵素修飾的一醣基化的豬纖連蛋白，其中被修飾的醣基係指豬纖連蛋白上複數個唾液酸分子醣基，其中該些唾液酸分子醣基被除去大於80%，其中該酵素為α 2-3,6,8神經氨酸酶(α 2-3,6,8 Neuraminidase)。
本發明提供了一種用於純化修飾的醣基化的豬血漿纖連蛋白的方法，其包括：步驟1：提供乾淨的豬血漿；步驟2：使用乾淨的豬血漿通過明膠-瓊脂糖凝膠快速流動4B的預柱；步驟3：通過用TBS-EDTA順序洗滌去除凝膠中非特異性吸附的蛋白質；步驟4：通過用1M NaCl依次洗滌除去凝膠中非特異性吸附的蛋白質；步驟5：使用小於0.5莫耳濃度的精氨酸(Arg)順序洗滌去除凝膠中非特異性吸附的蛋白質；步驟6：使用大於0.5莫耳濃度的精氨酸(Arg)洗脫豬血漿纖連蛋白樣品。
本發明提供了修飾醣基化豬纖連蛋白的修飾方法，包括：步驟1：在緩衝液(pH5~7)中配置豬血漿纖維連接蛋白(1毫克)；步驟2：加入5~50單位α 2-3,6,8神經氨酸酶(一個單位定義為從1nmol Neu5Ac α 2-3Gal β 1-3GlcNAc β 1-3Gal β 1-4Glc-7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)切割大於95%的末端α-Neu5Ac所需的酶量，在37℃下作用5分鐘，總反應體積為10μl)；步驟3：在37℃下作用1~24小時。
本發明提供了修飾醣基化豬纖連蛋白的修飾方法，包括：將豬血漿纖連蛋白與基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3,MMP3)以酵素-受質比在1：5到1：30之比例，於37℃環境中隔夜共同反應。
本發明提供豬血漿纖連蛋白經過修飾後，對於細胞黏附和定向細胞遷移的正調節具有正向作用，此外，將纖連蛋白適當地切割成纖連 蛋白胜肽，則更有助於達成傷口癒合與組織修復之目的，故經修飾後的豬血漿纖連蛋白，可作為替代人血漿纖連蛋白之材料，相較人血漿纖連蛋白具備較佳地安全性和更高的量。
第1圖顯示本發明的純化方法。
第2圖顯示從明膠-瓊脂糖凝膠快速流動4B的預柱(gelatin-Sepharose Fast Flow 4B column)獲得的洗滌物質和洗脫物。
第3圖顯示相對於所有檢測到的N-糖基化位點的總光譜計數，具有或不具有唾液酸(sialic acids)的N-糖基化殘基的光譜計數之百分比。
第4a-c圖顯示使用人類和豬纖連蛋白測試U2OS、HFF1和Hela細胞傷口癒合效果。
第5圖顯示將U2OS細胞接種於指定濃度的纖連蛋白(μg/ml)塗覆的蓋玻片上30分鐘，然後通過相差顯微鏡檢查圖像。比例尺：100微米。
第6圖顯示將U2OS細胞接種於指定濃度的纖連蛋白(μg/ml)塗覆的蓋玻片上貼附擴散的細胞面積。
第7圖顯示將U2OS細胞接種於指定濃度的纖連蛋白上30分鐘，然後測量其相對於0μg/ml纖連蛋白組別的細胞附著程度之倍數。
第8圖顯示將U2OS細胞接種於指定的纖連蛋白濃度塗覆的蓋玻片上1.5小時，並用黏著斑標記蛋白(Paxillin)免疫螢光染色的TIRFM圖像。比例尺：10微米。
第9圖顯示細胞對應指定濃度纖連蛋白(μg/ml)，其形成黏著斑蛋白(Paxillin)蛋白標記(paxillin-marked)的黏著斑總面積。
第10圖顯示從豬纖連蛋白中去除唾液酸(sialic acid)不影響細胞纖連蛋白和細胞締合的程度。
第11圖顯示經基質金屬蛋白酶3修飾前後的豬纖連蛋白變化。
第12圖顯示經基質金屬蛋白酶3修飾後的豬纖連蛋白較修 飾前有較好的傷口癒合效果。
本發明為了在傷口敷料中尋求安全的血漿纖維連接蛋白，發明人從人類(homo)和豬(procine)的血漿中分離出纖連蛋白，證明豬血漿纖維連接蛋白具有與人血漿纖連蛋白相似的能力，可作為適合的傷口敷料，以刺激細胞黏附和定向細胞遷移。
本發明進一步鑑定豬血漿纖連蛋白上的醣基化位置，豬血漿纖連蛋白的這些醣基化修飾和其蛋白質功能具有協同作用以支持整合素受體所傳遞的信號，此為調節細胞黏附和定向細胞遷移所必須的。本研究不僅確定了聚醣在人和豬血漿纖連蛋白調解的細胞黏附和定向細胞遷移中的重要功能，而且揭示了豬血漿纖連蛋白可被作為臨床傷口癒合和組織修復材料的潛在應用價值。
實施例1. 材料和細胞
U2OS(人骨肉瘤細胞系)和Hela(人宮頸腺癌上皮細胞系)是由陳瑞華教授的實驗室(中央研究院，台灣，台北市)提供，且在5%CO2環境下，於10%FBS(Invitrogen)和1%抗生素溶液(青黴素和鏈黴素；Invitrogen)的DMEM-高葡萄糖(Invitrogen)中培養。HFF1(人包皮成纖維細胞)細胞購自ATCC，並在5%CO2環境下，於15%FBS和1%抗生素溶液(青黴素和鏈黴素)的DMEM-高葡萄糖中培養；人血漿是由自願者捐獻的人血液獲得的。所有與人體血液相關的方法，均按照有關指引和規定進行。所有與人體血液相關的實驗方案，均經國立陽明大學人體倫理委員會(IRB)批准。獲得所有受試者的知情同意書。豬血漿由嘉一香食品股份有限公司提供。
實施例2. 血漿纖連蛋白製備步驟
血漿纖連蛋白純化：本發明提供了一種純化修飾的醣基化豬纖連蛋白的方法，其包括：步驟1：將乾淨的血漿通過明膠-瓊脂糖凝膠快 速流動4B的預柱、步驟2：通過50毫升的TBS-EDTA洗滌，去除非特異性吸附的蛋白質、步驟3：通過50毫升1莫耳濃度的NaCl洗滌，去除非特異性吸附的蛋白質、步驟4：通過50毫升小於0.5莫耳濃度精氨酸(Arg)順序洗滌，去除非特異性吸附的蛋白質、步驟5：通過大於0.5莫耳濃度精氨酸(Arg)洗脫纖連蛋白樣品、步驟6：用TBS(pH 5-8)透析纖連蛋白樣品在4℃下24小時、步驟7：使用Vivaspin 20離心濃縮器濃縮纖連蛋白樣品(截留分子量：100kDa)。
請參考第1圖和第2圖，本發明使用血漿纖連蛋白純化方法從豬血漿中分離出高質量，並且具備醣基化的纖連蛋白，將血漿裝入明膠-瓊脂糖凝膠快速流動4B的預柱中，將凝膠依次用TBS-EDTA，1莫耳濃度的NaCl和<0.5莫耳濃度的精氨酸(Arg)洗滌以除去非特異性結合蛋白，留下結合的纖連蛋白用>0.5莫耳濃度精氨酸洗脫，合併洗脫的纖維連接蛋白的部分，並在TBS中在4℃下透析24小時，並使用Vivaspin 20離心濃縮器(截留分子量：100kDa)濃縮。
血漿纖連蛋白修飾：本發明提供了修飾醣基化豬纖連蛋白的修飾方法，包括：步驟1：在緩衝液(pH5~7)中調配豬血漿纖維連接蛋白(1毫克)、步驟2：加入5~50單位α 2-3,6,8的神經氨酸酶(一個單位定義為從1nmol Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)切割>95%末端α-Neu5Ac所需的酶量，在37℃下反應5分鐘，總反應體積為10μl)、步驟3：於37℃反應1~24小時。
血漿纖連蛋白的醣蛋白鑑定：將沉澱的纖連蛋白(~10微克)用胰蛋白酵素進行蛋白質分解成小的胜肽。再將胜肽混合物溶解在0.1%甲酸中，使用Orbitrap Fusion Tribrid質譜儀(Thermo Scientific)搭配Dionex Ultimate 3000 nanoLC(Thermo Scientific)液相層析系統和25cm×75μm碳18層析管柱(Acclaim PepMap RSLC，Thermo Scientific)進行分析，使用100%移動相A(0.1%甲酸水溶液)在120分鐘線性梯度分離至40%移動相B(含0.1%甲酸的乙腈)，流速為300nL/min。使用PicoView(New Objective)納米噴霧源以正離子模式檢測，質譜儀以每3秒鐘循環進行數據收集，包括Orbitrap全掃描母離子MS1(m/z：400-2000)，在m/z 400 下分辨率為120,000，自動增益控制(AGC)目標在200,000，之後是以30%的碰撞能量進行高能量碰撞解離(HCD)產生子離子MS2圖譜，並在Orbitrap分析儀中以30000分辨率(AGC目標為100,000)檢測HCD MS2子離子圖譜。質譜數據分析使用ByonicTM搜索軟體(Protein Metrics，v.2.7.4)，蛋白質序列使用Swiss Prot(瑞士生物信息學研究所)資料庫包含FN1_人類或FN1_Sus scrofa，分別進行人和豬血漿纖連蛋白的質譜數據比對，將蛋白質修飾設置為羧甲基酰基甲基(C)(固定)，脫酰胺(N)(可變)，氧化(M)(可變)和N-連接的醣基化修飾(包含182種人類的N-醣糖基化資料庫；309種哺乳動物N-醣基化資料庫)，允許兩切點不完全消化，誤差值限定為母離子MS1質譜圖小於5ppm，MS2子離子質譜圖誤差小於10ppm。醣化胜肽鑑定，選擇Byonic分數超過100，錯誤發現率(FDR)小於1%。
請參考第3圖，本發明使用α 2-3,6,8神經氨酸酶去除豬纖連蛋白上的N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)和N-乙酰神經氨酸(Neu5GC)醣基，結果顯示修飾後的豬纖連蛋白可用於傷口癒合，發揮與人纖連蛋白相同的功能。
實施例3. 人和豬血漿纖連蛋白在細胞粘附和遷移方面顯示出相同的效果
傷口癒合分析：將在組織培養板上生長的U2OS，Hela或HFF1細胞以胰蛋白酶切下，並再次接種在培養基中具有10μg/ml纖連蛋白塗層的6孔板上16小時，然後置於配有溫度和CO2控制，並配有10XNA0.25物鏡(Zeiss)的顯微鏡(Axio Observer.Z1，Zeiss)，使用由Zen圖像分析軟件(Zeiss)操作的AxioCamMR3 CCD照相機，在12小時內以15分鐘間隔獲得延時圖像，為了計算傷口閉合的百分比，使用Metamorph圖像分析軟件(Molecular Device)從延時圖像中獲得6小時或12小時移植期間的傷口癒合的面積，並計算為創傷後0小時傷口面積與淨傷口癒合面積的比值。
請參考第4a-c圖，為了比較來自人和豬血漿的分離的纖連蛋白的功能，發明人使用預先塗覆來自人或豬血漿的纖連蛋白塗層的玻片，進行細胞傷口癒合的遷移測定。結果顯示，使用人和豬纖連蛋白，在U2OS， HFF1和Hela的細胞傷口癒合分析中，表現出相似的傷口閉合效應，因此人和豬纖連蛋白在調節細胞遷移方面具有相同的能力。
細胞貼附試驗：細胞貼附測定使用已經在37℃下用1%變性BSA預處理1小時的96孔盤，然後用指定濃度的人或豬血漿纖連蛋白塗覆。為了進行實驗，將生長在組織培養板上的U2OS細胞進行胰蛋白酶處理，以懸浮於無血清培養基中，然後重新接種在預處理的96孔板上10分鐘或過夜(~16h)。培養後，通過用PBS洗滌兩次，以完全除去未附著的細胞，並在室溫下用5%戊二醛25分鐘以固定附著的細胞，接著於室溫下用0.1%結晶紫染色25分鐘，並除去所有未結合的結晶紫後，將結晶紫標記的細胞溶解在50μl溶液A(50%乙醇和0.1%乙酸的水)中，使用Thermo Scientific Multiskan以OD 550nm光譜測量結晶紫的量，結果以圖形方式使用Excel軟件(Microsoft)顯示。
免疫螢光染色和圖像分析：首先將黏著斑標的蛋白(Paxillin)以免疫螢光染色方式作染色。在TIRFM成像部分，將細胞安裝在含有沒食子酸丙酯的PBS的載玻片上，使用配備有100X 1.49NA物鏡(Nikon)的TIRF(Roper)/共軛焦顯微鏡(CSUX1，Yokogawa)顯微鏡系統，以EMCCD相機(Photometrics)獲得TIRFM圖像。為了確定黏附面積，將Paxillin染色的細胞的TIRFM圖像閾值化以僅突出黏著斑訊號範圍(focal adhesions,FAs)，並且使用Metamorph記錄這些區域的面積，記錄的黏著斑總面積相加得到細胞黏附總面積，結果以圖形方式使用Excel軟件(Microsoft)顯示。
細胞貼附擴散測定和圖像分析：將生長在組織培養盤上的細胞進行胰蛋白酶作用切下，並再次接種在塗有指定濃度的人或豬血漿纖連蛋白的玻片上，以使其貼附並擴散附著(30分鐘)。接下來，在室溫下用4%多聚甲酵在PBS中固定細胞20分鐘，然後使用配備有20×0.45NA物鏡(Nikon)的顯微鏡(Eclipse TS100；Nikon)系統以ISCapture軟件操作的WHITE CCD照相機成像(TUCSEN)。為了計算細胞貼附擴散面積，使用Metamorph圖像分析軟件(Molecular Device)，在相位圖像上手動盤點細胞區域，結果用Excel軟件(Microsoft)以圖形方式顯示。
為了比較人和豬纖連蛋白在調節細胞黏附強度，以及比較人 和豬纖連蛋白對細胞貼附擴散的影響，發明人比較了接種在逐漸增加濃度的人或豬纖連蛋白塗覆的玻片上的U2OS細胞，在30分鐘後測量細胞貼附擴散的面積，結果顯示，隨著纖連蛋白的濃度增加，細胞貼附擴散面積增加(請參考第5圖)，細胞黏附能力也增強(請參考第6圖)，這也表明了人或豬纖連蛋白隨著濃度的增加而促進細胞黏附到纖連蛋白的能力是相同的(請參考第7圖)。接下來，發明人比較接種在增加濃度的人或豬纖連蛋白上1.5小時的細胞免疫螢光染色訊號顯示黏著斑標的蛋白(Paxillin)細胞模式(請參考第8圖)，結果顯示，隨著纖連蛋白濃度的增加，黏著斑形成面積增加(μm2)；根據黏著斑標的蛋白(Paxillin)標記的黏著斑面積進行定量(請參考第9圖)。
為了進一步確定在黏附增強期間，唾液酸(Neu5Ac與Neu5GC)是否具備關鍵的作用，發明人首先使用α 2-3,6,8神經氨酸酶(唾液酸酶)從豬纖連蛋白切割唾液酸(請參考第3圖)。從結果得知，將豬纖連蛋白中去除唾液酸不影響細胞和纖連蛋白結合的能力(請參考第10圖)。由於在人體內不存在內源性Neu5Gc，故直接利用豬纖連蛋白的臨床應用可能因為Neu5Gc的存在而引起異常免疫反應，且來自豬血漿纖連蛋白，予以去除唾液酸之後並沒有改變纖連蛋白對細胞黏貼附著的能力(請參考第3圖和第10圖)，故綜合上述結果可知，在生產過程中從豬血漿纖連蛋白中去除唾液酸，以作為具有新穎性的傷口敷料材料，可增強傷口癒合，而不會由於Neu5Gc的存在引起異常免疫反應的可能。
實施例4. 豬血漿纖連蛋白經過蛋白酶修飾後在傷口閉合中表現出更好的效果
豬血漿纖連蛋白經MMP3修飾：為了使豬血漿纖連蛋白上的聚醣結構更完整暴露，以提供更好的傷口閉合功能，本發明提供了一種修飾醣基化豬血漿纖連蛋白的方法，包括：將豬血漿纖連蛋白與基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3,MMP3)以酵素-受質比在1：5到1：30之比例，於37℃環境中隔夜共同反應。
傷口癒合分析：將在組織培養盤上生長的U2OS細胞進行胰蛋白酶作用切下，並再次接種在具有10μg/ml纖連蛋白塗覆的6孔盤上16小時，然後置於具溫度和CO2控制，並配有10XNA0.25物鏡(Zeiss)的顯微鏡(Axio Observer.Z1，Zeiss)，使用由Zen圖像分析軟件(Zeiss)操作的AxioCamMR3 CCD照相機，在12小時內以15分鐘間隔獲得延時圖像，為了計算傷口閉合的百分比，使用Metamorph圖像分析軟件(Molecular Device)從延時圖像中獲得12小時移植期間的傷口癒合的面積，並計算為創傷後0小時傷口面積與淨傷口癒合面積的比值。
本發明使用MMP3以產生豬纖連蛋白胜肽(請參考第11圖)。為了比較經由MMP3修飾前後的豬纖連蛋白胜肽的傷口癒合效果，發明人使用已經接種在經過MMP3修飾的豬纖連蛋白胜肽，或未經過MMP3修飾的豬纖連蛋白塗抹玻片上的細胞進行傷口癒合遷移測定。結果顯示經過MMP3修飾的豬纖連蛋白胜肽具有顯著的促進傷口閉合效果(請參考第12圖)。因此，經MMP3修飾處理後的豬血漿纖連蛋白，在調節細胞遷移方面具有更好的效果。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本發明之專利範圍中。

Claims (19)

  1. 一種用於製備治療傷口癒合之纖連蛋白的用途，其中該組合物包含一酵素修飾的一醣基化的豬纖連蛋白。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該修飾化的醣基係指豬纖連蛋白上一複數個唾液酸分子醣基。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的用途，其中該些唾液酸分子醣基係為N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)和/或N-乙酰神經氨酸(Neu5GC)。
  4. 如申請專利範圍第2項的用途，其中該些唾液酸分子醣基被除去大於80%。
  5. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該酵素為 α 2-3,6,8神經氨酸酶( α 2-3,6,8 Neuraminidase)。
  6. 如申請專利範圍第5項的用途，其中該酵素為進一步包含一蛋白酶，該蛋白酶具備將纖連蛋白切割成纖連蛋白胜肽之功效。
  7. 如申請專利範圍第6項的用途，其中該酵素為包含一基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3)。
  8. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該醣基化的豬纖連蛋白由唯一一明膠-瓊脂糖凝膠快速流動4B的預裝管柱(gelatin-Sepharose Fast Flow 4B)製備。
  9. 一種用於促進傷口癒合的醫藥組合物，包含：一酵素修飾的一醣基化的豬纖連蛋白；一膠原蛋白；以及一透明質酸；和/或其藥學上可接受的鹽。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的組合物，其中該修飾的醣基係指豬纖連蛋白上一複數個唾液酸分子醣基。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的組合物，其中該些唾液酸分子醣基係為N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)和/或N-乙酰神經氨酸(Neu5GC)。
  12. 如申請專利範圍第10項所述的組合物，其中該些唾液酸分子醣基被除去大於80%。
  13. 如申請專利範圍第9項所述的組合物，其中該酵素為 α 2-3,6,8神經氨酸酶( α 2-3,6,8 Neuraminidase)。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的組合物，其中該酵素為進一步包含一蛋白酶，該蛋白酶具備將纖連蛋白切割成纖連蛋白胜肽之功效。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的組合物，其中該酵素為包含一基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3)。
  16. 如申請專利範圍第9項所述的組合物，其中該醣基化的豬纖連蛋白由唯一一明膠-瓊脂糖凝膠快速流動4B的預裝管柱(gelatin-Sepharose Fast Flow 4B)製備。
  17. 一種用於促進傷口癒合的材料，包含一酵素修飾的一醣基化的豬纖連蛋白，其中該修飾的糖基係指豬纖連蛋白上一複數個唾液酸分子醣基，其中該些唾液酸分子醣基被除去大於80%，其中該酵素為 α 2-3,6,8神經氨酸酶( α 2-3,6,8 Neuraminidase)。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的材料，其中該酵素為進一步包含一蛋白酶，該蛋白酶具備將纖連蛋白切割成纖連蛋白胜肽之功效。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的材料，其中該酵素為包含一基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3)。
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