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JP2024164273A - ヒト組換えヒポシアル酸付加エリスロポエチン、その精製方法及び処置用途 - Google Patents

ヒト組換えヒポシアル酸付加エリスロポエチン、その精製方法及び処置用途 Download PDF

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JP2024164273A JP2024151043A JP2024151043A JP2024164273A JP 2024164273 A JP2024164273 A JP 2024164273A JP 2024151043 A JP2024151043 A JP 2024151043A JP 2024151043 A JP2024151043 A JP 2024151043A JP 2024164273 A JP2024164273 A JP 2024164273A
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De Jesus Rodriguez Obaya Teresita
ゴンザレス、ダニエル エンリケ アマロ
Enrique Amaro Gonzalez Daniel
アルタレホ、ユデイ アイメッド ガルシア
Aymed Garcia Artalejo Judey
テステ、イリアナ マリア ソーサ
Maria Sosa Teste Iliana
コンデ、ヤナラ サルミエント
Sarmiento Conde Yanara
デ ラ ローザ、ローデス エルナンデス
Hernandez De La Rosa Lourdes
ゴイレ、デイリー ディアス
Diaz Goire Dayli
ロペス、エステラ ギメネス
Gimenez Lopez Estela
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Abstract

【課題】組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）の医薬組成物を提供する。【解決手段】全グリカンの４０～６０％に相当するモノ及びバイ－シアル酸付加シアル酸残基、全グリカンの４０～４３％に相当するトリシアル酸付加シアル酸残基、ならびに全グリカンの１０～１３％に相当するテトラシアル酸付加シアル酸残基を有する２、３及び４分岐構造によって形成されるフコシル化Ｎ－グリカンの微小不均一性を有することを特徴とするｒｈＥＰＯの医薬組成物が提供される。このグリコシル化パターンにより、該組成物は、神経系の障害での使用を可能にする特性を付与される。ただし、前記ｒｈＥＰＯは、３５℃の温度及び７．２～７．３のｐＨ範囲で撹拌タンクで行われる発酵プロセス、及びＱ四級アンモニウム配位子を有するアニオン交換体として一体型カラムを用いるクロマトグラフィー工程が用いられる精製プロセスにより得られる。【選択図】なし

Description

技術の範囲
本発明は、バイオテクノロジー及び医学の分野に関し、とくに、神経系の障害での使用を可能にする特性を付与するグリコシル化パターンを有する組換えヒトエリスロポエチンの医薬組成物を得ることに関する。
背景
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、３０．４ｋＤａの分子量を有する１６６個のアミノ酸によって形成される糖タンパク質ホルモンである（Ｌａｎｆｒａｎｃｏ，Ｆ ａｎｄ Ｓｔｒａｓｂｕｒｇｅｒ，Ｃ．Ｊ．（２０１６）Ｓｐｏｒｔｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ４７：１１５－２７）。ＥＰＯは、胎児期及び周産期には肝臓の類洞周囲細胞で、成人期には主に腎臓の間質性線維芽細胞で天然に産生される。このホルモンは、骨髄で赤血球の産生を刺激し、ニューロン損傷に対する脳の応答に重要な役割を果たす（Ｓｉｒｅｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９８（７）：４０４４－９。
ＥＰＯは高度にグリコシル化された分子であり、その炭水化物部分は分子量の４０％を構成する。このタンパク質は、ポリペプチド鎖に連結されたオリゴ糖の４つの複合鎖を含み、そのうちの３つはＮ型結合により、１つはＯ型結合によるものであり、その位置は異なる著者のＥｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９（１６）：１６８５４－１６８６２；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ４（２）：２２７－２３７によって十分に記載されている。Ｎ型結合を有するオリゴ糖は、変数のシアル酸末端残基を含む場合があり、分泌、分子安定性、受容体結合及びインビボ活性に重要である（Ｅｇｒｉｅ，Ｊ．ａｎｄ Ｂｒｏｗｎｅ，Ｊ．（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８４（ｌ）：３－１０；Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２４９：４２０２－４２０６）。
１９９０年代から現在に至るまで、組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）の神経保護特性に関する多数の証拠が蓄積されてきた。１９９８年に、Ｓａｋａｎａｒａと同僚らは、スナネズミの全虚血モデルにおいて、総頸動脈の閉塞後、側脳室を通じたｒｈＥＰＯの供給がＣＡ１領域の海馬ニューロンに虚血性損傷の減少をもたらしたことを実証した（Ｓａｋａｎａｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：４６３５－４６４０）。
中枢神経系に及ぼすＥＰＯの細胞保護効果は、２００４年にＭａｉｅｓｅと同僚らによって、その後、２００５年にＶｉｖｉａｎｉと同僚らによって実証された（Ｍａｉｅｓｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ２５（１１）：５７７－８３；Ｖｉｖｉａｎｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ９３（２）：２５７－２６８）。造血ＥＰＯに関する非臨床試験で蓄積された全ての情報にもかかわらず、得られた結果は、その長期使用に伴って患者に生じる有害事象のために、臨床で再現されていない。
成人では、神経系におけるＥＰＯ受容体の発現は、主にニューロン、星状膠細胞及びミクログリアで見出されるが、星状膠細胞はＥＰＯを産生し、これはヒポシアル酸付加ＥＰＯである（Ｎａｇａｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ＆Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６０（４）：３１７－３１９）。
同じ神経保護特性を有するが、造血作用によって惹起される有害事象のない薬物を得るために、かなりの数の研究者がｒｈＥＰＯを改変する課題に取り組んでいる。
ｒｈＥＰＯの全酵素的脱シアル酸付加によって得られるＡｓｉａｌｏＥＰＯ（ＵＳ２００４／０１２２２１６）と呼ばれるＥＰＯは、上述の所望の特性を有し、この種のＥＰＯは、ｒｈＥＰＯ受容体に対して高い親和性を有するが、血漿半減期が極めて短いため保護作用が限定される。エリスロポエチンの別の修飾例は、ＣＥＰＯと呼ばれるカルバミル化ＥＰＯをもたらすタンパク質のカルバミル化によるリジンのホモシトルリンへの変換である（Ｌｅｉｓｔ，Ｍ．，Ｇｈｅｚｚｉ，Ｐ．，Ｇｒａｓｓｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００４）３０５（５６８１）：２３９－２４２）。両ＥＰＯは造血効果を示さなかったが、ＣＥＰＯを用いて行われた臨床試験では、有害作用が観察されなかったとしても、神経保護の有効性は実証されなかった。
ＷＯ２００７／００９４０４による特許出願では、その著者の刊行物で後にＮｅｕｒｏＥＰＯと呼ばれる、シアル酸含量が低いＥＰＯの異なる経鼻製剤がクレームされている（Ｇａｒｃｉａ，ＪＣ ａｎｄ Ｓｏｓａ，Ｉ．（２００９）、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ，９：９７０－９８１）。このｒｈＥＰＯは、最も酸性のイソ型（シアル酸含量が低いものからシアル酸含量が高いもの）を分離するための精製において、中空繊維膜発酵プロセス及びイオン交換クロマトグラフィーによって得られる。該ＮｅｕｒｏＥＰＯは１３個のイソ型のプロファイルを有し、そのうち９個をＥＰＯＣＩＭ（登録商標）と呼ばれる造血ｒｈＥＰＯと共有した。
本発明の発明者らは、追加の化学的修飾及び遺伝的修飾なしに、ｒｈＥＰＯヒポシアル酸付加イソ型の発現を増加できる四級アンモニウム配位子Ｑを有するアニオン交換体として一体型カラムを使用するクロマトグラフィーによって行われる精製工程と組み合わせた撹拌タンク（ＳＴ）での製造方法（production process）を初めて記載する。これらのイソ型は、４．２５～５．８５のｐＨ範囲で等電点プロファイルを有し、インビトロ及びインビボの両方の神経保護機構及び神経修復機構でより高い有効性をもたらすＮｅｕｒｏＥＰＯとは異なるグリコシル化に関連する三次構造を有する。
発明の簡単な説明
一態様における本発明の目的は、有効成分として、等電点が４．２５～５．８５の範囲であるイソ型プロファイルを有するｒｈＥＰＯを含むことを特徴とする医薬組成物にある。該ｒｈＥＰＯは、全グリカンの４０～６０％に相当するモノ及びバイ－シアル酸付加シアル酸残基、４０～４３％に相当するトリシアル酸付加シアル酸残基及び１０～１３％に相当するテトラシアル酸付加シアル酸残基を有する２、３及び４分岐構造と、薬学的に許容される賦形剤とによって形成されるフコシル化Ｎ－グリカンの微小不均一性を有する。
とくに、セリン１２６のＯ－グリコシル化部位は、０～２個のシアル酸残基を有する３つのシアロ型を有し、モノシアル酸付加構造が最も豊富であり、全グリカンの７８～８２％を占める（represent）一方、非シアル酸付加（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）構造は全グリカンの６～１０％を占める。
アスパラギン８３のＮ－グリコシル化部位は、
－１個及び２個のシアル酸残基を有するフコシル化２分岐構造であって、該構造が全グリカンの８～１２％に相当する、フコシル化２分岐構造、
－１、２及び３個のシアル酸残基を有するフコシル化３分岐構造であって、これらの構造が全グリカンの１７～２１％に相当する、フコシル化３分岐構造、
－１～４個のシアル酸残基を有するフコシル化４分岐構造であって、これらの構造が全グリカンの２７～３１％に相当する、フコシル化４分岐構造、及び
－１～４個のシアル酸残基を有するＮ－アセチルラクトサミン１及び２型を有するフコシル化４分岐構造であって、これらの構造が全グリカンの３８～４２％に相当する、フコシル化４分岐構造、
を含む。
本発明で特許請求される医薬組成物のための薬学的に許容される賦形剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの生体接着性ポリマー、ならびにＬ－トリプトファン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－アルギニンヒドロクロリド及びＬ－ヒスチジンヒドロクロリドなどのタンパク質安定剤が含まれるが、これらに限定されない。
本発明が目的とする医薬組成物の一部であるｒｈＥＰＯイソ型の上記構造により、該組成物は、インビトロ及びインビボの両方の神経保護機構及び神経修復機構で、より高い有効性が付与される。
別の態様において、本発明の目的は、未修飾ｒｈＥＰＯを得るための方法にあり、発酵プロセスは、３４±２℃の温度範囲で、７．２～７．３のｐＨ範囲のタンパク質を含まない培養培地を用いて、ＳＴで灌流モードで行われ、この培地は、８～１２ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度が得られるまでグルタミンが補充される。この方法はまた、クロマトグラフィー工程を有する精製プロセスも含み、該工程では、一体型カラムは、Ｑ四級アンモニウム配位子を有するアニオン交換体として用いられ、平衡緩衝液は、ｐＨが７．９～８．１０の範囲にあり、１．３５～１．６５ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液であり、精製プロセスでは、ｐＨが４．３～４．５であり、導電率が２～３．５ｍＳ／ｃｍである５０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム溶出緩衝液を使用する。
本願における方法においては、医薬組成物は、ＮｅｕｒｏＥＰＯとは異なるグリコシル化に関連する三次構造を有する低シアル酸含量のイソ型の数が増加し、これはインビトロ及びインビボの両方の神経保護機構及び神経修復機構でより高い有効性をもたらす。
認知症、脳卒中、パーキンソン病、運動失調、頭蓋脳外傷、緑内障、自閉症、新生児の低酸素症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、及び外傷、中毒症又は放射線によって誘発される神経の損傷を処置するための本明細書に記載の医薬組成物の使用も本発明の目的である。とくに、かかる医薬組成物を用いて、上述のような処置を必要とする対象を処置する方法が記載されているところ、該組成物の投与は、１ｍＬの体積で０．１ｍｇ～４ｍｇの投与範囲で６～１２か月の期間に１週間に１～３回行われる。
医薬組成物
本発明のｒｈＥＰＯの目的は、４．２５～５．８５の等電点プロファイルと、セリン１２６のＯ－グリコシル化部位ならびにアスパラギン２４、３８及び８３の３つのＮ－グリコシル化部位を有するグリコシル化に関連する同じ三次構造を保持するｒｈＥＰＯに類似するグリコシル化に関連しない二次及び三次タンパク質構造と、を有することを特徴とする。本明細書に記載されるｒｈＥＰＯの炭水化物組成により、他のｒｈＥＰＯと識別される。フコシル化Ｎ－グリカンの微小不均一性は、全炭水化物の４０～６０％の範囲、好ましくは４３～５０％の範囲のモノ及びバイ－シアル酸付加シアル酸残基と、４０～４３％の範囲のトリシアル酸付加シアル酸残基と、全炭水化物の１０～１３％の範囲のテトラシアル酸付加シアル酸残基とを有する２、３及び４分岐構造から構成される。
とくに、セリン１２６のＯ－グリコシル化部位は、０～２個のシアル酸残基を有する３つのシアロ形態を有し、モノシアル酸付加構造が最も豊富であり、全グリカンの７８～８２％に相当し、非シアル酸付加（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）構造は全グリカンの６～１０％に相当する。
アスパラギン８３のＮ－グリコシル化部位は、
－１個及び２個のシアル酸残基を有するフコシル化２分岐構造であって、該構造が全グリカンの８～１２％に相当する、フコシル化２分岐構造と、
－１、２及び３個のシアル酸残基を有するフコシル化３分岐構造であって、これらの構造が全グリカンの１７～２１％に相当する、フコシル化３分岐構造と、
－１～４個のシアル酸残基を有するフコシル化４分岐構造であって、これらの構造が全グリカンの２７～３１％に相当する、フコシル化４分岐構造と、
－１～４個のシアル酸残基を有するＮ－アセチルラクトサミン１及び２型を有するフコシル化４分岐構造であって、これらの構造が全グリカンの３８～４２％の範囲である、フコシル化４分岐構造と、
を含む。
ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯ、ＥＰＯ、ＨＳ又は塩基性イソ型の語は、本発明において、相互に交換可能に用いられ、上記の特徴を有する医薬組成物を指し、通常ＮｅｕｒｏＥＰＯ ｐｌｕｓとも称される。
本発明の目的の医薬組成物は、有効成分として、ｒｈＥＰＯのヒポシアル酸付加イソ型を有する。これらのヒポシアル酸付加イソ型は、本発明として記載されるプロセス（process）によって得られ、これは、該イソ型を得るためのｒｈＥＰＯの化学的修飾及び／又は遺伝的修飾を意味しない。該医薬組成物の有効成分の一部であるｒｈＥＰＯイソ型は、ＮｅｕｒｏＥＰＯとは異なるグリコシル化に関連する三次構造を有し、これはインビトロ及びインビボの両方の神経保護機構及び神経修復機構でより高い有効性をもたらす。
本発明の目的の医薬組成物は、鼻又は眼の投与経路によって投与され、その最終剤形が点鼻薬、鼻腔スプレー又は点眼薬である水溶液の形態である。該医薬製剤は、有効成分としてヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯを含み、場合により薬学的に適した賦形剤及び／又は安定剤を含む。
薬学的に許容される賦形剤及び／又は安定剤は、用いられる用量及び濃度で投与される対象に対して非毒性であり、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びメチルセルロースなどの生体接着性ポリマーと、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－アルギニンヒドロクロリド及び／又はＬ－ヒスチジンヒドロクロリドなどのタンパク質安定剤及びその塩とを含み得る。
処置用途及び処置方法
本発明は、脳血管疾患、精神疾患及び神経変性疾患などの神経系障害の処置に有用な医薬組成物を提供する。とくに、該疾患は、認知症、脳卒中、パーキンソン病、運動失調、頭蓋脳外傷、緑内障、自閉症、新生児の低酸素症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、及び外傷、中毒症又は放射線によって誘発される神経の損傷であり得る。
本発明はさらに、そのような処置を必要とする対象に、６～１２か月の期間にわたり週に１～３回、ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯを投与することを含む方法を提供する。該投与は、ムコース（ｍｕｃｏｓｅ）への薬物の滴下によって、徐々に鼻腔内（ＩＮ）で実施される。投与用量は、０．１ｍｇ～４ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇ～１ｍｇの範囲である。１用量あたりの最大投与量は１ｍＬであり、３ｍＬの総１日用量について鼻孔あたり０．５ｍＬである。該体積は、各適用間で５～１５分の時間間隔で、好ましくは１５分ごとに、より小さな体積で分配することができる。
ｒｈＥＰＯのヒポシアル酸付加イソ型を得るための方法
本発明において特許請求される方法は、異なる段階から構成され、以下に記載される細胞株を使用する。
細胞株
本発明の方法目的を実施するために使用することができる細胞株は、ｒｈＥＰＯの産生について報告されたものと同じである。最も用いられる株は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、Ｎａｍａｌｗａ、ＨｅＬａ、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２であり、本発明では好ましくはＣＨＯ細胞株が用いられる。
発酵プロセス
本発明の発酵プロセスは、ＳＴ技術を用いて行われる。かかるプロセスは、いくつかの段階からなり、第１の段階は、室温（１８～２４℃）に達するまでに作業セルバンクからアンプルを解凍することを含む。続いて、バイオマスを増加させる目的で、シード発酵槽の適切な播種を確実にする細胞濃度及び細胞生存率に細胞を調整する増殖段階が行われる。
１×１０６細胞／ｍＬ以上の細胞密度に達すると、異なる操作モードで発酵を開始する。これらの様式は、バッチ培養、バイオマスの保持に関わらず連続培養であり得る。
ヒポシアル酸付加イソ型を得るためには、発酵のこの段階で３４±２℃の範囲の温度及び６．８±０．４の範囲のｐＨが確保されるべきである。
８～１２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲のグルタミンの最終濃度が得られるまで無タンパク質培養培地で細胞を増殖させるべきである。
精製プロセス
ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯの精製プロセスは、以下のクロマトグラフィー工程を含む。
まず、着色配位子での擬似アフィニティークロマトグラフィーを行う。この工程の目的は、ｒｈＥＰＯの捕捉及び上清（ＳＮ）に存在する主な夾雑物の部分的除去である。続いて、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施して、タンパク質の緩衝液を次のクロマトグラフィー工程用の適用溶液の緩衝液に変更する。
次いで、金属キレートによる擬似アフィニティークロマトグラフィーを行う。この工程は、ｒｈＥＰＯを捕捉し、該プロセスの前工程で除去されなかった夾雑物の画分を完全に除去することを目的とする。再度ゲル濾過クロマトグラフィーを行い、緩衝液を次のクロマトグラフィー工程の適用溶液の緩衝液に変更する。
本製造方法の重要な段階（stage）として、Ｑ四級アンモニウム配位子を用いたアニオン交換クロマトグラフィーが行われる。このクロマトグラフィー工程では、一体型カラムが用いられる。このクロマトグラフィーの目的は、酸性イソ型からのヒポシアル酸付加（生物学的に活性な）イソ型の分離、ＤＮＡの保持及び生成物の濃度である。これらは全て、混入又は酸性イソ型との混合なしにヒポシアル酸付加イソ型が得られることを保証する。
最後に、緩衝液を変更し、タンパク質を活性原料の形態で溶出させる目的で、ゲル濾過クロマトグラフィーを再度行う。
イソ型プロファイル：Ａ）イソ型の切断の定義；Ｂ）評価された温度及びｐＨの条件下での培養物で生成したＳＮを示す図である。 評価された温度及びｐＨ条件下での培養物におけるヒポシアル酸付加イソ型の割合を示す図である。 パイロットスケールで評価された条件下での各培養物におけるヒポシアル酸付加イソ型の割合を示す図である。 ＳＮにおける酸性度の低いイソ型の相対強度を示す図である。 ｒｈＥＰＯイソ型のＱ四級アンモニウム配位子における静的吸着能に及ぼす移動相のｐＨ及び導電率の影響：（Ａ）ヒポシアル酸付加（塩基性）、（Ｂ）酸性を示す図である。 破過曲線Ａ）：クロマトグラフィーマトリクス「Ｑ ＳＦＦ」、Ｂ）：一体型カラム「ＣＩＭ ＱＡ」を示す図である。 塩基性及び酸性のイソ型の性能に及ぼす溶出緩衝液ｐＨの影響を示す図である。 製造スケール（production scale）でのｒｈＥＰＯのヒポシアル酸付加イソ型の分布を示す図である。 質量分析と連結させた双性イオン性親水性相互作用液体クロマトグラフィーによるヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯのＮ－グリカンの研究を示す図である。 ａ）トリプシン及びノイラミニダーゼならびにｂ）トリプシンによる消化に起因して観察されるヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯ Ｏ１２６糖ペプチドグリコフォームの抽出イオン電気泳動図（ＥＩＥ）を示す図である。 トリプシン消化及びノイラミニダーゼ消化に起因するグリコフォームが観察されるＮ８３糖ペプチドのＥＩＥを示す図である。 ａ）トリプシン及びノイラミニダーゼならびにｂ）トリプシンによる消化に起因するグリコフォームが観察されるヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯ Ｎ８３糖ペプチドのＥＩＥを示す図である。 ８％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）による細胞損傷及びその後のヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯによる処理の２４時間後及び４８時間後の星状膠細胞培養物の細胞生存率プロファイルを示す図である。 カプラン・マイヤーチャート、観察７日間の生存率を示す図である。 梗塞２４時間後の動物の神経学的状態を示す図である。 正球性マウスモデルにおける網状赤血球の数に及ぼす異なるｒｈＥＰＯイソ型の適用の効果を示す図である。
以下の例及び図面を用いて本発明をさらに詳述する。しかしながら、これらの例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されることを意図しない。
例
例１．ｐＨ及び温度の実験室規模でのｒｈＥＰＯイソ型プロファイルへの影響.
ヒトＥＰＯ遺伝子をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞株から、無タンパク質培地の懸濁液で増殖するように適合させたシード細胞バンクを得た。この培養培地への完全な適応は、２５日間の培養に相当する３７世代後に得られた。
異なるｐＨ及び温度条件の存在下での細胞株の性能を評価するために、両変数を組み合わせた実験計画を行った。実験条件を表１に示す。培養物のｐＨは、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを添加して制御した。
評価される異なる条件の培養物で生成したＳＮの試料に対応するｒｈＥＰＯのイソ型プロファイルを等電点電気泳動によって決定した。ｐＨ範囲が２～５及び３～１０のアンフォライン（ａｍｐｈｏｌｉｎｓ）の混合物を使用し、内部のＥＰＯＣＩＭ（登録商標）参照物質を対照として使用した。試料における各イソ型の強度割合を、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓプログラムを使用して濃度測定によって分析した。ｐＨ値が２．８０～４．２５の範囲のイソ型を酸性イソ型と定義し、ｐＨ値が４．２５～６．５５の範囲のイソ型を塩基性イソ型と定義した（図１Ａ）。
図１Ｂには、イソ型プロファイルが温度によって強く影響されたことを示されている。ｐＨに関係なく、各条件に対応するＳＮ試料を３７℃の温度で対照と比較した場合、７つの酸イソ型が観察される。一方、３５℃では酸性イソ型の減少が観察され、これはｐＨ７．２及び７．３の条件でより顕著であった。
図２は、ｐＨ７．２及び７．３ならびに温度３５℃の条件下で、得られたイソ型の合計（１００％）が塩基性イソ型であったことを示す。
例２．ｐＨ及び温度のパイロットスケールでのｒｈＥＰＯイソ型プロファイルへの影響.
実験室規模で得られた最良の培養条件（温度３５℃、ｐＨ７．２及び７．３）について、細胞培養のための、さらに制御された好ましい環境の影響を評価した。例１に記載のシード細胞バンクから、有効体積が３．５ＬのＳＴ型バイオリアクター（Ｉｎｆｏｒｓ－ＡＧＣＨ４１０３、ボットミンゲン）を使用して４回の発酵運転を計画した。操作の条件を表２に示す。初期細胞生存率は、評価された全条件において９０％超であった。
各発酵の最後に試料を採取し、バイオリアクターで評価された条件について培養物で生成したＳＮ試料のイソ型プロファイルを等電点電気泳動技術によって決定した。これらのプロファイルが得られたら、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓプログラムを使用し、等電点電気泳動ゲルに対応する画像から始めて、ゲル中に存在する各バンドの強度を決定し、各条件についてのヒポシアル酸付加イソ型の割合を評価した。
培養条件２及び３（３５℃、ｐＨ７．２～７．３）の図３に示すように、ヒポシアル酸付加イソ型の割合は、条件１及び４よりも高かった。これらの結果は、実験室規模で得られた知見、すなわち、ｐＨ７．２～７．３及び３５℃の温度の操作条件を改変することによって、ｒｈＥＰＯのイソ型プロファイルも改変され、４．２５～５、８５のｐＨ値においてより大きな強度が得られることを裏付けるものである。
例３．培養培地のグルタミン濃度の増加によるｒｈＥＰＯ塩基性イソ型の発現促進.
培養培地のグルタミン濃度の増加がヒポシアル酸付加イソ型の増加に影響を及ぼしたか否かを評価するために、ｒｈＥＰＯを産生するＣＨＯ細胞株の性能を評価した。異なるグルタミン濃度の培養培地に曝露したシード細胞バンクを使用し、培養培地への馴化を１５日間行った。評価は、６００ｒｐｍの撹拌速度で３７℃のインキュベータに保持された回転ボトルを使用して、３００ｍＬの培養培地の最終体積において０．５×１０６細胞／ｍＬの初期細胞濃度で開始した。培養培地の最終グルタミン濃度は、８、１２及び１６ｍｍｏｌ／Ｌであり、６ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンを含む培養培地を対照として使用した。
培養物のＳＮにおけるヒポシアル酸付加イソ型の相対強度を、異なる濃度のグルタミンで７日間処理した後、デンシトメトリによって評価した。
図４は、評価した３つの変異体のそれぞれにおいて、対照に対してより高い割合のヒポシアル酸付加イソ型が得られたことを示す。すなわち、培養培地中のグルタミン濃度の増加に伴い、ＳＮのヒポシアル酸付加イソ型の取得が促進されることを裏付けている。これらのイソ型についての最も大きい値は、８ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン（８７％）において観察された。
例４．ｐＨ及び導電率の、実験室規模でのＱ強四級アンモニウムアニオン交換体の酸性イソ型及び塩基性イソ型の吸着への影響.
Ｑ強四級アンモニウムアニオン交換体の酸性イソ型の最大吸着に有利なｐＨ及び導電率の条件を決定する目的で、以下の緩衝液を評価した。２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム（無水二塩基性及び一塩基性二水和物）及び２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ。緩衝液を、異なるｐＨ及び導電率の値、６～８のｐＨ及び１．５～５ｍＳ／ｃｍの間の導電率で試験した。
ｐＨ６及び導電率１．５０ｍＳ／ｃｍの条件で、酸性イソ型の交換体への最大吸着が観察された。他方で、ヒポシアル酸付加（塩基性）イソ型の吸着は、ｐＨ８及び導電率１．５０ｍＳ／ｃｍで最大化される。結果を図５に示す。
例５．一体型カラム技術を使用するＱ強アニオンマトリックスの、実験室規模でクロマトグラフィーゲルの従来技術を使用するものとの対比による、ｒｈＥＰＯイソ型を分離する能力に関する良好な性能.
研究中の各技術の動的吸着能（Ｑ）は、クロマトグラフィーゲル技術（Ｑ ＳＦＦ）については１００ｃｍ／時間及び６００ｃｍ／時間、一体型カラム（ＣＩＭ ＱＡ）については１５６ｃｍ／時間及び６２４ｃｍ／時間の各技術の製造業者によって推奨される線流量のうちの２つを使用して、２つの破過曲線を用いて算出された。従来技術による実験及び一体型カラム技術のために用いられた平衡溶液は、例４で得られた結果に従って、ｐＨ８及び導電率１．５ｍＳ／ｃｍのＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液であった。
ｒｈＥＰＯ試料をカラムに適用し、カラムからの出口で試料を異なる時間に採取した。各試料のタンパク質（Ｃ）濃度を分光光度法によって決定した。各試料におけるＣの既知値を用いて、非吸着タンパク質Ｃ／Ｃ０の画分を算出した。ｍｇのｒｈＥＰＯ／ｍＬのＱマトリックスで与えられるゲルの単位体積当たりのカラムに適用されるタンパク質の質量である負荷を各時間で算出した。
図６では、Ｃ／Ｃ０対動的吸着能の値は、特定の流量での非吸着タンパク質Ｃ／Ｃ０＝０．１の画分当たりのゲルのＱを知ることを可能にする破過曲線でグラフ表示される。図６Ａは、クロマトグラフィーゲルの従来技術で得られた破過曲線を示し、最も低い流量が最も高い動的容量を有するものであった。図６Ｂは、一体型カラムが、試験された２つの線形流量で非常に類似した動的吸着能を有するため、マトリックスの動的吸着能の変動を経験することなく、より高い流量で操作され得ることを示す。
表３は、異なる測定を行って得られたＱ値を示す。
充填層の強アニオン交換体及び一体型カラム技術で実施されたＱ研究の結果を比較すると、両技術は、研究された最も低い線速度で同様のＱを有することが観察された。しかしながら、最も高い線速度では、一体型カラムは、評価された従来のクロマトグラフィーマトリックスの動的吸着能よりも１．４０倍高い動的吸着容量を有する。したがって、一体型カラムは、精製されるｒｈＥＰＯ塊を処理（processing）する能力に影響を及ぼすことなく、該プロセスのワークフローの増加を可能にすると結論付けることができる。
例６．ｐＨの低下による、実験室規模での一体型カラムでヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯイソ型の溶出促進.
Ｑ ＳＦＦ及びＣＩＭ ＱＡカラムを使用して実験的な試験を行った。両技術に使用した平衡溶液は、例４によるｐＨ８及び導電率１．５ｍＳ／ｃｍのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液であった。Ｑ ＳＦＦカラムの作業線速度は６００ｃｍ／時間であり、一体型カラムの作業線速度は６２４ｃｍ／時間であった。実験に使用した生成物は、上記の平衡溶液への緩衝液の変更を行った後、「Ｓｅｐｈａｄｅｘ」Ｇ－２５分子排除クロマトグラフィーカラムから得られたものであった。塩基性イソ型の溶出のために、４．４１、４．８１、５．０６、５．２０のｐＨ値で、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｗｅｅｎ２０酢酸ナトリウム緩衝液を０．０１％で使用して一体型アニオン交換カラムを用いて数回の運転を行った。
各運転におけるヒポシアル酸付加（塩基性）イソ型及び酸性イソ型の溶出で得られた回収率を図７に示す。これらの結果の分析から、塩基性イソ型の溶出緩衝液のｐＨが上昇するにつれて、その性能が低下することが確認されたため、溶出用にｐＨ４．４１の５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液を選択した。
例７．ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯを製造スケール（production scale）で得るプロセスについての、イソ型の分離及び純度に関する一致性.
例１に記載のシード細胞バンクから発酵運転を実施したところ、初期細胞生存率は９０％より高かった。発酵段階を３５℃の温度で実施し、８ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン最終濃度に達するように補充した無タンパク質培養培地で、培地のｐＨを７．２～７．３に維持した。
４つの集菌が得られた後、精製段階を実施し、重要な工程において、一体型カラムを用いてＱ四級配位子を有するアニオン交換体を使用した。ｐＨ８及び導電率１．５ｍＳ／ｃｍのＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を平衡緩衝液として使用し、ｐＨ４．４１の５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液を溶出に使用した。
精製プロセスの後に得られた４つのバッチの活性原料のイソ型プロファイルを、等電点電気泳動技術によって決定した。ｐＨ範囲が２～５及び３～１０のアンフォライン（ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）の混合物を使用し、内部のＥＰＯＣＩＭ（登録商標）参照物質を対照として使用した。図８はイソ型の分離の一貫性を示し、６つの主要なイソ型によって構成されたイソ型プロファイルが観察され、そのうち２つのみが対照と共有されている。
さらに、精製イソ型のシアル酸含量は、Ｅｕｒｏｐｅ８．０ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（２０１４）に記載のこの分子の測定手順及び逆相ＨＰＬＣによる純度に従って決定された。得られたシアル酸含量及び純度の結果を表４に示す。
シアル酸の含量は、１タンパク質分子あたり１０モル未満のシアル酸であり、純度は、４つのバッチで９５％超であった。これらから、ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯを得るためのプロセスは、４．２５～５．８５のｐＨ範囲でイソ型を得ることを保証すると結論付けることができ、これはＮｅｕｒｏＥＰＯで観察されたものとは異なる。
例８．ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯのグリコシル化に関連する三次構造が示す、特徴的な微小不均一性.
グリカン分析
そのＮ－グリカンプロファイルを研究するために、ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯを、ペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）による変性及び酵素消化のプロセスに供した。Ｎ－グリカンが放出された後、それらを、ＨｙｐｅｒＳｅｐ Ｈｙｐｅｒｃａｂ ＳＰＥカートリッジを使用する固相抽出によって精製した（Ｍａｎｃｅｒａ－Ａｒｔｅｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ９４０：９２－１０３。続いて、Ｇｉｍｅｎｅｚらによって２０１５年に記載された手順に従って誘導体化を行った（Ｇｉｍｅｎｅｚ，Ｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，８６６：５９－６８）。
Ｍａｎｃｅｒａ－Ａｒｔｅｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ９４０：９２－１０３によって記載される方法論に従って、質量分析と連結させた双性イオン－親水性相互作用キャピラリー液体クロマトグラフィーを実施した。
図９は、ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯで検出された３つのグリカンの質量スペクトルを示す。以上のように、グリカン３Ａｎｔ２ＳｉＡ１Ｆｕｃが最も豊富である一方、グリカン４Ａｎｔ４ＳｉＡ１Ｆｕｃは、より少ない量で見出される。
表５は、構造によるグリカンの相対面積の割合を示す。
表６は、対応する相対面積、モノアイソトピック実験分子量（Ｍｅｘｐ）及び質量誤差で検出されたグリカンを示す。以上のように、シアル酸付加構造が少ないかなりの数のグリカンが存在する。
表６に示すように、より多くのシアル酸付加構造（４つのシアル酸分子）を有するグリカンは低い比率で見出される。代わりに、３Ａｎｔ１ＳｉＡ１Ｆｕｃ、４Ａｎｔ１ＳｉＡ１Ｆｕｃ、４Ａｎｔ１ＬａｃＮＡｃ１ＳｉＡ１Ｆｕｃ及び４Ａｎｔ３ＬａｃＮＡｃ１ＳｉＡ１Ｆｕｃなどの他のｒｈＥＰＯでは見出されなかったシアル酸分子を有する構造が検出される。グリカン４Ａｎｔ３Ｓｉａ１Ｆｕｃは、ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯで豊富である。同様に、検出された全グリカンに対する分岐による相対面積の割合が他のｒｈＥＰＯとは異なり、１個又は２個のシアル酸残基を有する構造が分岐により相対面積の５０％超に相当することが分かる。
糖ペプチド分析
Ｏ１２６及びＮ８３糖ペプチドに存在する全てのグルコフォームを検出するために、ｒｈＥＰＯ及びｒｈＥＰＯ－ＣＲＳ（薬局方参照製品）をトリプシン及びノイラミニダーゼ（ｒｈＥＰＯ ＨＳ－ＴＮ）による消化に供した。トリプシン消化分析（ｒｈＥＰＯ ＨＳ－Ｔ）から検出された各グルコフォームの全てのシアロ形態を研究した。Ｇｉｍｅｎｅｚ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ２５：２３０７～２３１６により記載された手順に従って、試料を質量分析によって分析した。
図１０Ａ及び図１０Ｂは、ｒｈＥＰＯ ＨＳ－ＴＮ及びＨＳ－Ｔ消化物で検出されたＯ１２６糖ペプチドグリコフォームのＥＩＥをそれぞれ示す。最初の１つでは、ノイラミニダーゼが糖ペプチドの完全な脱シアル酸付加を生じ、その結果、全てのシアロ形態が単一のグリコフォームになるため、Ｏ１２６／０ＳｉＡグリコフォームのピークに対応する単一のピークが観察される。対照的に、トリプシンのみで消化した場合、０、１及び２個のシアル酸分子を有する３つのシアロ形態が観察される。
表７は、対応する相対面積、モノアイソトピック実験分子量（Ｍｅｘｐ）及び質量誤差で検出されたＯ１２６シアロ形態を示す。
得られた結果は、最も豊富なシアロ形態が１つのシアル酸分子を含むものであることを示している。非シアル酸付加（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）イソ型及びシアル酸を１つのみ有するイソ型の両相対面積の割合は、他のｒｈＥＰＯについて記載されたものと比較してより高い。両シアロ型の割合においてＣＲＳ ｒｈＥＰＯとの相違が見出される。
Ｎ８３糖ペプチドの場合、ｒｈＥＰＯ ＨＳ－ＴＮ消化物を分析すると、シアル酸を含まない６つの異なるグリコフォームに対応する６つのピークが検出された。得られたＥＩＥを図１１に示し、検出されたグリコフォームを表８に示す。得られた結果は、Ｎ８３部位では、より高い割合の複合脱シアル酸付加４分岐構造が存在することを示している。
図１２Ａは、ｒｈＥＰＯ ＨＳ－ＴＮ消化物の異なる４分岐構造間に分離がないことを示す。対照的に、ｒｈＥＰＯ ＨＳ－Ｔ消化物のシアル酸付加グリコフォームを分析すると、それらの間の明確な分離が観察され、３つのシアル酸残基を有するものはより大きな強度を有する（図１２Ｂ）。これらの結果は、グリカンの研究からの知見と一致する。
表９は、検出された全てのシアロ形態ならびに対応する相対面積、モノアイソトピック実験分子量（Ｍｅｘｐ）及び質量の誤差を示す。
結果は、タンパク質がトリプシンのみで消化される場合、ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯは、シアル酸付加構造（例えば、２Ａｎｔ１ＳｉＡ１Ｆｕｃ又は３Ａｎｔ１ＳｉＡ１Ｆｕｃ）がより少ないことを特徴とすることを裏付けている。モノ及びバイシアル酸付加構造の相対面積の割合を検証すると、結果は、それらが約６０％に相当することを示す。
Ｎ８３糖ペプチドの４分岐構造は、他のグリコフォームと比較して最も高い割合で見出され、２つのシアル酸残基を有するものが最も高い割合を有するものである。
例９．ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯの、星状膠細胞における、ＤＭＳＯの細胞毒性に対する回復効果.
３．７ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したグルコース高含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培養培地でＰＧ４星状膠細胞株を培養した。５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気下、３７℃の温度で２４時間細胞をインキュベーションした。規定時間の後、ＳＮを抽出し、細胞を８％ＤＭＳＯで惹起される損傷に供し、再び２４時間インキュベーションした。その後、ＳＮを除去し、異なる濃度のヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯ（１．２５、２．５、５及び１０ｎｇ／ｍＬ）を含む２％ＤＭＥＭ培養培地を添加した。２４時間及び４８時間で、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ試薬を加え、次いで細胞を６時間インキュベーションし、５４０／６３０ｎｍで読み取りを行った。全てのインキュベーションは、５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中、３７℃の温度で行った。
図１３では、１．２５、２．５、５及び１０ｎｇ／ｍＬのヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯの異なる濃度で、細胞がどのように生存能を取り戻すことができたかを見ることができ、最良の条件は１．２５ｎｇ／ｍＬのヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯである。このことにより、星状膠細胞が回復能力を有することが実証される。
例１０．ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯの、ＮｅｕｒｏＥＰＯを上回る良好な神経保護活性.
１９７２年にＫａｈｎ Ｋ．によって記載された方法論に従って、持続性片側性虚血のモデルを開発するためにモンゴルからのスナネズミを使用した（Ｋａｈｎ Ｋ．（１９７２）Ｍｉｎｎｅａｐ２２：５１０－５１５）。その後、該動物を無作為に５つの実験群に割り付けた。
群１群：ビヒクル １０μＬのビヒクル
第２群：０．１４２ｍｇ／ｋｇのヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯで処置
第３群：０．０１４２ｍｇ／ｋｇのヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯで処置
第４群：０．１４２ｍｇ／ｋｇのＮｅｕｒｏＥＰＯで処置
第５群：０．０１４２ｍｇ／ｋｇのＮｅｕｒｏＥＰＯで処置
各処置を１日３回４日間鼻腔内経路で投与した。前記動物を、処置の最初の４日間及びその後の３日間の回復期間に評価した。
結果は、ビヒクルと比較した場合、０．１４２及び０．０１４２ｍｇ／ｋｇ用量のヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯで処置した動物で有意により高い生存率を示すが、ＮｅｕｒｏＥＰＯは、０．１４２ｍｇ／ｋｇの用量でのみ死亡率を有意に低下させたが、０．０１４２ｍｇ／ｋｇでは低下しなかった（図１４）。
神経学的評価により、ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯ（ＮｅｕｒｏＥＰＯ ｐｌｕｓ）の神経保護効果が示され、これは、プラセボ群及びＮｅｕｒｏＥＰＯで処置した群と比較して、使用用量のＮｅｕｒｏＥＰＯ ｐｌｕｓで処置した動物では神経学的尺度の値を有意に減少させ、ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯで得られた同じ結果は、０．１４２ｍｇ／ｋｇの用量でのみ達成することができた（図１５）（ダンカン統計検定、同じ文字間はｐ＞０．０５、異なる文字間はｐ＜０．０５）。
例１１ ヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯの、正球性マウスモデルの網赤血球数における非増加性.
Ｂ６Ｄ２Ｆ１雌マウスを無作為に６匹の動物の６つの実験群にそれぞれ割り付け、以下のように単回用量の処置を受けさせた。
第１群：皮下経路（ＳＣ）による２００μＬ体積の０．００３ｍｇ／ｍＬのｒｈＥＰＯ作業参照物質。
第２群：ＳＣ経路による２００μＬ体積の０．００６ｍｇ／ｍＬのヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯ。
第３群：ＩＮ経路による２００μＬ体積の０．５ｍｇ／ｍＬのヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯ。
第４群：ＩＮ経路による２００μＬ体積の１ｍｇ／ｍＬのヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯ。
第５群：ＩＮ経路による２００μＬ体積の２ｍｇ／ｍＬのヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯ。
群６：対照、ＳＣ経路による２００μＬの賦形剤。
網状赤血球数の結果を図１６に示す。以上のように、ＳＣ及びＩＮの両方によって、対照群の動物とヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯで処置した群の動物との間に有意差はなかった。ｒｈＥＰＯ作業参照物質で処置した動物の網状赤血球数は、両経路を使用して、対照群及びヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯで処置した群の動物の網状赤血球数よりも有意に高かった。（ダンカン検定、同じ文字間はｐ＞０．０５；異なる文字間はｐ＜０．０５）
これらの結果から、ヒポシアル酸付加ＥＰＯは、この試験のために確立された最高用量であっても網状赤血球数を増加させないことが実証された。このことは、ヒポシアル酸付加ＥＰＯが造血効果を有しないことを示す。
［請求項１］
等電点プロファイルが４．２５と５．８５との間である組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）を有効成分として含むことを特徴とする、医薬組成物。
［請求項２］
以下を特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物：
フコシル化Ｎ－グリカンの微小不均一性が２、３及び４－分岐構造により形成されていること、ただし、該分岐構造は、全グリカンの４０～６０％の範囲のモノ及びバイ－シアル酸付加シアル酸残基、全グリカンの４０～４３％の範囲のトリ－シアル酸付加シアル酸残基、ならびに全グリカンの１０～１３％の範囲のテトラ－シアル酸付加シアル酸残基を有する、及び
薬学的に許容される賦形剤。
［請求項３］
セリン１２６のＯ－グリコシル化部位が、０～２個のシアル酸残基を有する３つのシアロ形態を有し、モノシアル酸付加構造が、最も豊富であり全グリカンの７８～８２％に相当し、非シアル酸付加（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）構造が、全グリカンの６～１０％に相当することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
［請求項４］
アスパラギン８３のＮ－グリコシル化部位が以下を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物：
－１個及び２個のシアル酸残基を有するフコシル化２分岐構造、ただし、該構造は、全グリカンの８～１２％に相当する；
－１、２及び３個のシアル酸残基を有するフコシル化３分岐構造、ただし、該構造は、全グリカンの１７～２１％に相当する；
－１～４個のシアル酸残基を有するフコシル化４分岐構造、ただし、該構造は、全グリカンの２７～３１％に相当する；及び
－１～４個のシアル酸残基の間に存在するＮ－アセチルラクトサミン１及び２型を有するフコシル化４分岐構造、ただし該構造は、全グリカンの３８～４２％に相当する、
。
［請求項５］
薬学的に許容される賦形剤が、生体接着性ポリマー及びタンパク質安定剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
［請求項６］
生体接着性ポリマーが、
－ヒドロキシメチルセルロース、
－ヒドロキシプロピルセルロース、
－メチルセルロース、及び
を含む群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
［請求項７］
タンパク質安定剤が、
－Ｌ－トリプトファン、
－Ｌ－ロイシン、
－Ｌ－アルギニンヒドロクロリド、及び
－Ｌ－ヒスチジンヒドロクロリド、
を含む群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
［請求項８］
追加の化学的修飾及び遺伝的修飾ならびに４．２５～５．８５の等電点プロファイルを伴わずにｒｈＥＰＯを得るための方法であって、
発酵プロセスが撹拌タンクで行われること、及び
精製プロセスにおいて、Ｑ四級アンモニウム配位子を有するアニオン交換体として一体型カラムを用いるクロマトグラフィー工程が用いられること
を特徴とする、方法。
［請求項９］
ｒｈＥＰＯの発酵プロセスが、グルタミンを添加した無タンパク質培養培地で、３５℃の温度及び７．２～７．３のｐＨ範囲で撹拌タンクで行われ、８ｍｍｏｌ／Ｌと１２ｍｍｏｌ／Ｌとの間の最終濃度を与えることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
［請求項１０］
精製プロセスにおいて、ｐＨ８及び導電率１．５ｍＳ／ｃｍの２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液が平衡緩衝液として用いられ、ｐＨ４．４１の５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液が溶出緩衝液として用いられること、を特徴とする、請求項８に記載の方法。
［請求項１１］
有効成分が、請求項８～１０に記載の方法で得られるヒポシアル酸付加ｒｈＥＰＯである、医薬組成物。
［請求項１２］
認知症、脳卒中、パーキンソン病、運動失調、頭蓋脳外傷、緑内障、自閉症、新生児の低酸素症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、及び外傷、中毒又は放射線によって誘発される神経の損傷の処置のための、請求項１～７及び請求項１１のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
［請求項１３］
そのような処置を必要とする対象を処置するための方法であって、０．１ｍｇ～４ｍｇの投与範囲で、１ｍＬの体積で、週に１～３回、６～１２か月の間請求項１～７及び請求項１１のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

Claims (9)

  1. 等電点プロファイルが４．２５と５．８５との間である組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）を有効成分として含むことを特徴とする、医薬組成物であって、
    フコシル化Ｎ－グリカンの微小不均一性が２、３及び４－分岐構造により形成され、ただし、該分岐構造は、全グリカンの４０～６０％の範囲のモノ及びバイ－シアル酸付加シアル酸残基、全グリカンの４０～４３％の範囲のトリ－シアル酸付加シアル酸残基、ならびに全グリカンの１０～１３％の範囲のテトラ－シアル酸付加シアル酸残基を有すること、及び
    薬学的に許容される賦形剤、
    を特徴とする、医薬組成物、
    ただし、前記ｒｈＥＰＯは、３５℃の温度及び７．２～７．３のｐＨ範囲で撹拌タンクで行われる発酵プロセス、及び
    Ｑ四級アンモニウム配位子を有するアニオン交換体として一体型カラムを用いるクロマトグラフィー工程が用いられる精製プロセス
    により得られる。
  2. セリン１２６のＯ－グリコシル化部位が、０～２個のシアル酸残基を有する３つのシアロ形態を有し、モノシアル酸付加構造が、最も豊富であり全グリカンの７８～８２％を占め、非シアル酸付加（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）構造が、全グリカンの６～１０％を占めることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. アスパラギン８３のＮ－グリコシル化部位が以下を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物：
    －１個及び２個のシアル酸残基を有するフコシル化２分岐構造、ただし、該構造は、全グリカンの８～１２％を占める；
    －１、２及び３個のシアル酸残基を有するフコシル化３分岐構造、ただし、該構造は、全グリカンの１７～２１％を占める；
    －１～４個のシアル酸残基を有するフコシル化４分岐構造、ただし、該構造は、全グリカンの２７～３１％を占める；及び
    －１～４個のシアル酸残基を有するＮ－アセチルラクトサミン１及び２型を有するフコシル化４分岐構造、ただし該構造は、全グリカンの３８～４２％を占める。
  4. 薬学的に許容される賦形剤が、生体接着性ポリマー及びタンパク質安定剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 生体接着性ポリマーが、
    －ヒドロキシメチルセルロース、
    －ヒドロキシプロピルセルロース、
    －メチルセルロース、及び
    からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. タンパク質安定剤が、
    －Ｌ－トリプトファン、
    －Ｌ－ロイシン、
    －Ｌ－アルギニンヒドロクロリド、及び
    －Ｌ－ヒスチジンヒドロクロリド、
    からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
  7. ｒｈＥＰＯを得るための発酵プロセスが、グルタミンを添加した無タンパク質培養培地で行われ、８ｍｍｏｌ／Ｌと１２ｍｍｏｌ／Ｌとの間の最終濃度を与えることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  8. 精製プロセスにおいて、ｐＨ８及び導電率１．５ｍＳ／ｃｍの２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液が平衡緩衝液として用いられ、ｐＨ４．４１の５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液が溶出緩衝液として用いられること、を特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  9. 認知症、脳卒中、パーキンソン病、運動失調、頭蓋脳外傷、緑内障、自閉症、新生児の低酸素症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、及び外傷、中毒又は放射線によって誘発される神経の損傷の治療に用いるための、請求項１～６のいずれかに記載の医薬組成物。
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US7078376B1 (en) * 2000-08-11 2006-07-18 Baxter Healthcare S.A. Therapeutic methods for treating subjects with a recombinant erythropoietin having high activity and reduced side effects
US20040122216A1 (en) * 2002-07-01 2004-06-24 Jacob Nielsen Recombinant tissue protective cytokines and encoding nucleic acids thereof for protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues, and organs
DK1699821T3 (da) * 2003-12-31 2012-07-16 Merck Patent Gmbh Fc-ERYTHROPOIETIN-FUSIONSPROTEIN MED FORBEDREDE FARMAKOKINETIKKER
CN101090973B (zh) * 2004-12-30 2012-03-28 克鲁塞尔荷兰公司 从表达腺病毒e1a蛋白的细胞中获得唾液酸化增加的重组蛋白质的方法及由此获得的蛋白质
CU23317A1 (es) * 2005-07-22 2008-10-22 Ct De Investigacia N Y Desarro Formulaciones nasales de eporh con bajo contenido de ã cido siã lico para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central
CN101448852A (zh) * 2005-12-20 2009-06-03 布里斯托尔—迈尔斯斯奎布公司 组合物和用于生产组合物的方法
EP2027271A4 (en) * 2006-05-19 2010-06-09 Glycofi Inc RECOMBINANT VECTORS
KR101847169B1 (ko) * 2015-10-07 2018-04-09 주식회사 녹십자 지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물
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