JP5716018B2

JP5716018B2 - ラクリチンの部分ペプチド

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Publication number: JP5716018B2
Application number: JP2012513804A
Authority: JP
Inventors: 毅中嶋; 朋子中嶋; 光佳東
Original assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-09-16
Filing date: 2010-09-16
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2030-09-16
Also published as: US8518412B2; EP2478010B1; WO2011034207A1; EP2478010A1; JP2013504519A; EP2478010A4; US20120245102A1

Description

本発明は、涙液中のタンパク質であるラクリチンの特定の部分配列を有するポリペプチドに関する。特に、本発明は、修飾されたラクリチンの部分ペプチドに関する。

細胞と細胞外マトリックスとの接着は、細胞の生存及び運動性などの種々の機能に関与することが知られている。これは個体の正常な発達、組織の維持、あるいは損傷及び感染からの回復を調節するための必須のプロセスである。このような細胞接着に基づいたシグナリング経路の異常が、発達異常、循環器疾患、細胞の形質転換・転移につながる場合もある。
また、細胞−細胞外マトリックス間の接着が阻害された場合、細胞は「アノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）」と呼ばれる細胞死に陥ることが報告されており、細胞外マトリックスへの接着は細胞の生存にとって重要である（非特許文献１参照）。

ラクリチン（Ｌａｃｒｉｔｉｎ）は、涙液分泌促進因子または成長因子様タンパク質として同定されたタンパク質である（特許文献１及び２、並びに非特許文献２参照）。ラクリチンについては、以下１）〜５）が報告されている：
１）ラクリチンは、角膜上皮細胞及び涙腺腺房細胞の成長因子としての活性を有していること；
２）ラクリチンは、涙液タンパク質分泌促進効果を有していること；
３）ラクリチンは、涙腺、耳下腺、小唾液腺、顎下腺、甲状腺、乳腺及び角膜上皮等の組織に由来する細胞で発現していること；
４）ラクリチンを含有する点眼剤が、ドライアイ症候群、シェーグレン症候群または角膜上皮創傷等の眼疾患の治療に利用できる可能性があること；
５）ラクリチン受容体を発現させた細胞を用い、ラクリチンに依存するカルシウムのシグナルを指標とすることで、ラクリチン又はラクリチン受容体に結合する化合物を探索できること。

また、ラクリチンまたはその両末端の一部分を切断したペプチドが、^３Ｈ−チミジンの取り込みを検出する試験から唾液腺細胞の分裂を促進する作用を有することが報告されている（非特許文献３参照）。

しかしながら、ラクリチンまたはそのフラグメント（部分ペプチド）が、細胞と細胞外マトリックス接着との接着に関与することはこれまで報告されていない。

一方、通常、Ｎ末端にグルタミン又はグルタミン酸を有するポリペプチドが水溶液中で不安定な場合があることが知られている。そして、安定化する方法として、ピロ化など、即ちピログルタミン酸の誘導体を合成する方法などが知られている。しかしながら、ピロ化などの修飾により、本来の活性が損なわれる場合が報告されている（特許文献３）。

国際公開第０２/０６５９４３号パンフレット国際公開第０５/１１９８９９号パンフレット特表２００３−５２８１１２号公報

Frisch, S. M. et al., Journal of Cell Biology 124, pp.619-626 (1994年) Sanghi, S. et al., Journal of Molecular Biology 310, pp.127-139 (2001年) Wang, J. et al., Journal of Cell Biology 174, pp.689-700 (2006年)

本発明の目的は、細胞と細胞外マトリックスとの接着、特に角膜上皮細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進することができ、且つ水溶液中での安定性に優れた物質の提供にある。

本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、ラクリチンの特定の部分配列を有するポリペプチドが、角膜上皮細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進し得ること、さらに涙腺腺房細胞からの涙液タンパク質の分泌を促進し得ることを見出した。さらに、本発明者らは、当該ポリペプチドのＮ末端のグルタミンを修飾（例、ピロ化）することにより、細胞接着促進効果を維持しつつ水溶液中での安定性を著しく向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下の通りである。
［１］配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。
［２］上記［１］記載のポリペプチドを含有する、細胞接着促進剤。
［３］上記［１］記載のポリペプチドの有効濃度を細胞に接触させることを含む、細胞の接着を促進させる方法。
［４］上記［１］記載のポリペプチドを有効成分として含有する、医薬。
［５］水性液剤である上記［４］記載の医薬。
［６］角膜上皮障害の予防又は治療用である、上記［４］記載の医薬。
［７］上記［１］記載のポリペプチドの有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、角膜上皮障害の予防又は治療方法。
［８］細胞の接着を促進させるための、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。
［９］角膜上皮障害の予防又は治療のための、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および添付の図面、ならびに当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。

本発明によれば、細胞と細胞外マトリックスの接着、特に角膜上皮細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進することができ、且つ、水溶液中で安定な新規ポリペプチドを提供することが可能となる。このような新規ポリペプチドを提供することにより、保存安定性に優れた医薬の提供、特に水性液剤の形態による該医薬の提供が可能になる。
本発明のポリペプチドを、移植用の角膜上皮シートを調製するための培養液に加えることによって、細胞の脱落が防止された長期間安定に機能する角膜上皮シートを調製することもできる。また、本発明のポリペプチドは、角膜上皮障害に対して有用な予防治療薬を提供し得る。

図１は、ラクリチン部分ペプチドの水溶液中での安定性に及ぼすピロ化の影響を示したものである。図２は、各種ラクリチン部分ペプチドの細胞接着促進効果を調べた結果を示すグラフである。縦軸は、ポリペプチドを加えなかった場合を１００％として求めた細胞接着率を示す。横軸は、ペプチドの種類を示す。図３は、ラクリチンの部分ペプチドによる、サル涙腺アシナー細胞からの涙液タンパク質（ラクトフェリン）の分泌促進効果を調べた結果を示すグラフである。縦軸は、ＰＢＳを１００％として求めた、培地中に分泌したラクトフェリン量を示す。横軸は、評価した各種ペプチドを示す。

以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
本発明のポリペプチドは、以下の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
Pyr Gly Thr Ala Lys Val Thr Ser Ser Arg Gln Glu Leu Asn Pro Leu Lys Ser Ile Val Glu Lys Ser Ile Leu Leu Thr Glu Gln Ala Leu Ala Lys Ala
（配列番号１）
（配列中、Pyrはピログルタミン酸を意味する）

配列番号１に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示す１３８残基からなるヒト由来全長ラクリチン（ＧｅｎＢａｎｋ/ＥＢＩデータバンクのアクセッション番号NM_033277およびay005150（ゲノミック）；AAG32949（extracellular glycoprotein lacritin precursor）参照）の６９〜１０２番の領域においてそのＮ末端（即ち６９番目）のグルタミンがピロ化されたポリペプチドに相当する。
さらに、本発明においては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて、Ｎ末端のピログルタミン酸の代わりにアセチルグルタミンが用いられていてもよい（配列番号６）。すなわち、配列番号５に示す１３８残基からなるヒト由来全長ラクリチン（ＧｅｎＢａｎｋ/ＥＢＩデータバンクのアクセッション番号NM_033277およびay005150（ゲノミック）；AAG32949（extracellular glycoprotein lacritin precursor）参照）の６９〜１０２番の領域においてそのＮ末端（即ち６９番目）のグルタミンがアセチル化されたポリペプチドも本発明では提供される。
Ac-Gln Gly Thr Ala Lys Val Thr Ser Ser Arg Gln Glu Leu Asn Pro Leu Lys Ser Ile Val Glu Lys Ser Ile Leu Leu Thr Glu Gln Ala Leu Ala Lys Ala（配列番号６）
（配列中、Ac-Glnはアセチルグルタミンを意味する）
従って、本明細書中では、Ｎ末端のグルタミンがピロ化またはアセチル化により修飾されたポリペプチドを「本発明のラクリチン部分ペプチド」とも以下称する。

さらに本発明のラクリチン部分ペプチドは、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び／又は前記配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等の活性、即ち当該ポリペプチドが有する細胞接着促進作用および水溶液中での安定性が維持されている限り、配列番号１及び／又は６に示すアミノ酸配列において１〜３個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。但し、本発明は、Ｎ末端のグルタミンが修飾（例、ピロ化、アセチル化）されていることを特徴とするので、上記アミノ酸の欠失、置換または付加はＮ末端以外のアミノ酸において適用される。

本明細書において「アミノ酸」とは、通常「天然のアミノ酸」を意味するが、本発明の目的を満たす限り「非天然のアミノ酸」であってもよい。ここで「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。ここで「非天然のアミノ酸」とは、タンパク質中に通常は含有していないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＤ−フェニルアラニン、あるいはその他の修飾アミノ酸が挙げられる。
本明細書において「アミノ酸の欠失」とは、アミノ酸配列の任意の位置において、構成アミノ酸が取り除かれることをいう。
本明細書において「アミノ酸の置換」とは、アミノ酸配列の任意の位置において、構成アミノ酸が別のアミノ酸に置き換わることをいう。アミノ酸の置換としては、保存的置換が好ましい。保存的置換とは、アミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換され、そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの２次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予期されるような置換をいう。互いに保存的置換であるアミノ酸の群としては一般に以下のものが知られている：（１）グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニンおよびチロシン；（２）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン；（３）グリシン、アラニン、セリン、トレオニンおよびメチオニン；（４）ロイシン、イソロイシンおよびバリン；（５）グルタミンおよびアスパラギン；（６）グルタミン酸およびアスパラギン酸；（７）アルギニン、リジンおよびヒスチジン；（８）フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。
また、当該アミノ酸の置換は、修飾アミノ酸への置換であってもよい。該修飾アミノ酸としては、アミノ基への保護基の付加（例えば、アセチル化、ホルミル化、ブチルオキシカルボニル化（Ｂｏｃ化）、フルオレニルメトキシカルボニル化（Ｆｍｏｃ化））、カルボキシル基のエステル化（エチル化など）などが施されたアミノ酸が挙げられる。
本明細書において「アミノ酸の付加」とは、アミノ酸配列の任意の位置において、任意のアミノ酸が付け加わることをいい、アミノ酸の挿入を含む。

本明細書において「ペプチド」とは、２個以上の上記アミノ酸（天然、非天然アミノ酸）がアミノ基とカルボキシル基の間で脱水してペプチド結合を形成した物質の総称である。結合しているアミノ酸の数が２個であればジペプチド、３個であればトリペプチド、数個から十個程度のアミノ酸が結合している場合はオリゴペプチド、それ以上のアミノ酸が結合している場合にはポリペプチドと区別し得る。
本明細書において「ラクリチン部分ペプチド」とは、配列番号５に示されるラクリチンのアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸配列からなるポリペプチドを示す。

上述のように、本発明のポリペプチドは、前記配列番号１及び／又は前記配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等の活性を有する限り、そのアミノ酸配列において１〜３個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよく、そのようなポリペプチドも本発明の範疇である。ここで、「同等の活性を有する」とは、アミノ酸が欠失、置換または付加される前のポリペプチドが有する細胞接着促進作用に対して、約８０％以上、好ましくは約９０％以上の細胞接着促進作用を有することを意味し、且つ、アミノ酸が欠失、置換または付加される前のポリペプチドの水溶液中での安定性に対して、約８０％以上、好ましくは約９０％以上の安定性を維持していることを意味する。本明細書において、「細胞接着促進作用」とは、細胞と細胞外マトリックスとの接着（細胞−基質間接着）あるいは細胞同士の細胞間接着を促進する作用であり、好ましくは細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進する作用である。ここで、「細胞接着を促進する」とは、例えば細胞−基質間接着を促進する場合であれば、被験ポリペプチド非存在下の場合に比べて被験ポリペプチドを存在させることによって基質に接着した細胞の数を増やすことに相当する。具体的にはこの作用は、後述の実施例に記載のように、適当な細胞外マトリックスをコーティングしたプレート上に被験ポリペプチドを加え、角膜上皮細胞を重層し、所定時間インキュベートした後に接着した細胞の数を測定することによりアッセイすることができる。水溶液中での安定性としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の水溶液中での安定性が例示される。この作用は、後述の実施例に記載のように、ＰＢＳ等の適当な水溶液中に被験ポリペプチドを加え、所定の条件下で保存した後に該ポリペプチドの残存率をＨＰＬＣ等により測定することにより評価することができる。

本発明のラクリチン部分ペプチドの水溶液中での優れた安定性としては、具体的には、少なくとも４週間の４℃〜４０℃での保存、あるいは少なくとも２週間の６０℃での保存が可能であることが挙げられる。

本発明のポリペプチドは公知の方法により塩の形態であってもよい。ポリペプチドの塩としては、薬理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属）または酸との塩が用いられるが、特に、薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。薬理学的に許容される酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などを例示することができる。

本発明のポリペプチドは、通常の化学的合成法または組換えＤＮＡ技術などにより製造することができる。

本発明のポリペプチドを化学的合成法で製造する場合には、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。ペプチド合成法には、固相合成法、液相合成法等があり、固相合成法が好ましい。固相合成法としては、例えばＦｍｏｃ法が挙げられる。Ｆｍｏｃ法は、α−アミノ基を９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、側鎖官能基をｔ−ブチルアルコール系保護基で保護する方法で、Ｆｍｏｃ基を第二級アミンであるピペリジンにより脱保護しつつＦｍｏｃアミノ酸を縮合し、最後に側鎖保護基をトリフルオロ酢酸のような弱酸により脱保護する。つまり、合成しようとするペプチドのＣ末端側より、α−アミノ保護基の選択的除去、保護アミノ酸の縮合という一連の操作を繰り返して保護ペプチド鎖を構築し、側鎖官能基の保護基を脱保護することにより、目的のペプチドを得ることができるものである。
固相ペプチド合成法においては、自動ペプチド合成装置による合成も一般的に用いられている（例えば、「新生化学実験講座１タンパク質IV」(1992) 日本生化学会編, 東京化学同人；“The Peptides:Analysis, Synthesis, Biology” Vol.1-5, ed. by E. Gross, J. Meienhofer; Vol. 6-9, ed. by S. Udenfriend, J. Meienhofer, Academic Press, New York (1979-1987)）。

本発明のポリペプチドを組換えＤＮＡ技術で製造する場合には、例えば、Ｎ末端がグルタミンであるラクリチン部分ペプチドを組換えＤＮＡ技術で製造した後、Ｎ末端のグルタミンをピロ化することにより製造することができる。まず、Ｎ末端がグルタミンであるラクリチン部分ペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列に基づいてプライマーを設計し、適当なｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的とする配列を増幅することにより、当該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを製造することができる。このようなＰＣＲ手法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、“PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications”, Academic Press, Michael, et al., eds., 1990に記載されている。次いで、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター中に組み込み、これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して、それぞれの鎖を発現させることにより所望のポリペプチドを得ることができる。該ポリペプチドを発現させるために用いることができる宿主細胞の例としては、限定されないが、大腸菌、枯草菌等の原核生物宿主、および酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。ベクターとは、細胞にトランスフェクトすることができ、細胞ゲノム中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の核酸分子を表す。発現ベクターは、ＤＮＡの発現を駆動するプロモーター領域を含み、さらに転写および翻訳の制御配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、３’非コード領域、エンハンサー等を含んでいてもよい。プロモーターの例としては、原核生物宿主中で用いる場合には、ｂｌａプロモーター、ｃａｔプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、真核生物宿主中で用いる場合には、マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母解糖系酵素遺伝子配列プロモーター等が挙げられる。ベクターの例には、限定されないが、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ、ｐＫＲＣ、ＢＰＶ、ワクチニア、ＳＶ４０、２−ミクロン等が含まれる。
発現ベクターは、これを含有する宿主細胞を選択することができるように、１またはそれ以上のマーカーを有することが好ましい。マーカーとしては、栄養要求性宿主に対する栄養、抗生物質耐性（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ジェネティシン等）、または重金属耐性（例えば銅）を与えるものを用いることができる。
さらに、シグナル配列を用いて該ポリペプチドを分泌発現させるように、あるいは、該ポリペプチドを別のポリペプチドとの融合ポリペプチドの形で発現させるように、ベクターを構築することができる。融合ポリペプチドを用いることにより、ポリペプチドの安定性を改良し、または精製を容易にすることができる。そのような発現ベクターの構築は当該技術分野においてよく知られている。
該ポリペプチドを発現するよう構築したベクターは、トランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈澱、直接マイクロインジェクション等により、適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて該ポリペプチドを産生させ、細胞または培地から所望の組換えポリペプチドを回収し、精製することにより、該ポリペプチドを得ることができる。

Ｎ末端に修飾グルタミンを有するポリペプチドは、修飾グルタミンを原料として化学合成等により合成することもできるが、上記のようにして製造したＮ末端修飾を受けていないポリペプチドのＮ末端に存在するグルタミンを修飾することによっても合成することができる。例えばＮ末端に存在するグルタミンをピロ化する場合には、該グルタミンのアミノ基と、自身が有する遊離のγ−カルボン酸官能基とが分子内縮合し環化することによって実施され得る。ピロ化する方法としては、例えばポリペプチドを加熱する方法、酵素を用いる方法、緩衝液の組成を変える方法、及び塩を加える方法等が挙げられる(Biotechnology and Bioengineering, Vol. 97, No.3, June 15, 2007)。また、Ｎ末端に存在するグルタミンをアセチル化する場合には、無水酢酸を用いる方法等が用いられ得る(Molecular Immunology 40 (2003) 943-948; J. Peptide Res. 2001, 57, 528-538)。

どのような方法でピロ化されたものであっても本発明において使用することができる。同様にどのような方法でアセチル化されたものであっても本発明において使用することができる。

本発明のポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等の活性、即ち当該ポリペプチドが有する細胞接着促進作用および水溶液中での安定性が維持されている、該アミノ酸配列において１〜３個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む。当該ポリペプチドは、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法またはこれに準ずる方法により、その欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸位置に該当する改変を施すことにより、当該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを得、その遺伝子を用いて上述と同様の組換えＤＮＡ技術に付すことにより製造することもできる。遺伝子への変異導入は、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ株式会社）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ株式会社））など、あるいは、タカラバイオ株式会社のＬＡＰＣＲｉｎｖｉｔｒｏＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。

上述のようにして得られた本発明のポリペプチドは、公知の方法により単離及び精製することができる。公知の単離及び精製法としては、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などが挙げられる。

また、各ペプチドは、商業的に入手可能なもの、具体的には業者に委託して合成されたものを用いることもできる（例、Bachem、株式会社バイオロジカ、Biosynthesis Inc.等）。

このようにして得られる本発明のポリペプチドは、細胞と細胞外マトリックス、特に角膜上皮細胞と細胞外マトリックスの接着を促進するものであり、以下にその具体的用途を説明する。

（１）本発明のポリペプチドを含有する角膜上皮シート調製用培養液
本発明のポリペプチドは、角膜上皮細胞と細胞外マトリックスの接着促進効果により、移植用の角膜上皮シートの調製時において特に、角膜上皮細胞と基材との接着を促進し得る。

角膜上皮シートとは、角膜混濁に対する視力回復などを治療目的とした生体角膜の代用物であり、スティーブンス・ジョンソン症候群、化学外傷など、難治性角膜上皮疾患の治療に用いられる。角膜上皮シートは、例えば、血清培地中において羊膜およびコラーゲンシート等の基材上に角膜上皮細胞等の細胞を加えて培養し、その後、３Ｔ３線維芽細胞との共培養、またはａｉｒ−ｌｉｆｔｉｎｇなどの方法で重層化することにより調製される（眼科、第４２巻、第３号、２４５〜２５０頁、２０００年）。角膜上皮シートの調製方法としては、ＷＯ０３／０４３５４２号、特開２００４−２９８４４７号、特開２００４−２６１５３３号、特開２００２−３３１０２５号などに記載されている公知の方法が適用される。

当該角膜上皮シートの製造方法において、基材としては、角膜上皮シート製造に用いられる公知のものが使用でき、生体由来の基材及び人工的に作製される基材のいずれもが使用できる。具体的には、生体由来の基材としては羊膜、人工由来の基材としてはコラーゲンシートが挙げられる。なお、羊膜は、子宮と胎盤の最表層を覆う膜で、出産時に胎盤とともに体外へ出される膜である。
細胞の培養に用いられる培養液としては、角膜上皮シートの製造に使用される公知の培養液、例えば、ＥｐｉＬｉｆｅ培地（Cascade Biologics Inc.製）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Invitrogen Corporation製）、ＤＭＥＭ培地（Invitrogen Corporation製）などが使用でき、培養液には公知の血清を含有させることができる。培養温度は、上記細胞が良好に生育できる温度であれば特に限定されず、通常１５〜４５℃程度である。培養時間は、上記細胞が良好に生育できる期間であれば特に限定されず、通常１〜３０日程度である。

本発明のポリペプチドは、該角膜上皮シートを調製するための培養液に加えられ、角膜上皮細胞と基材との接着を促進するための有効成分となり得る。培養液中のポリペプチドの濃度は、通常、０．０００１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％、好ましくは０．００１ｗ／ｖ％〜０．０１ｗ／ｖ％である。本発明のポリペプチドは、基材の細胞外マトリックスと角膜上皮細胞との定着を促進し、細胞の脱落が防止された強固で長期間安定に機能する角膜上皮シートの調製を可能とすることができる。

（２）本発明のポリペプチドを含有する医薬
本発明のポリペプチドは、細胞接着、特に細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進する作用を有するため、細胞接着促進剤として有用である。本明細書において、「細胞接着促進剤」とは、上記「細胞接着促進作用」を有する物質であることを意味し、特に細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進する物質であることを意味する。ここで、細胞接着を促進する程度は、例えば細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進する為の剤であれば、本発明のポリペプチドを添加することによって、有意に基質に接着する細胞が増えればよい。本発明の接着促進剤は、哺乳動物（例、ラット、マウス、モルモット、トリ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒト等）由来の細胞（例えば、角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、結膜細胞など）に対して用いられ、好ましくはヒト由来の角膜上皮細胞に対して用いられる。細胞外マトリックスとは、細胞と接着し得る細胞外マトッリクスであれば特に限定されず、（１）コラーゲン、エラスチン等の繊維性タンパク質、（２）フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等の細胞接着性糖タンパク質、（３）ヘパリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸を含むグリコサミドグリカン等の複合糖質等が含まれ、また、これらの細胞外マトリックスから構成される基底膜（例えば、ボーマン膜、デスメ膜、羊膜など）も含むものである。

本発明のポリペプチドを含有する細胞接着促進剤は、それが有する細胞接着促進作用により後述のように種々の臨床用医薬としての適用が企図されるが、研究用試薬としての用途もまた、本発明によって提供される。本発明のポリペプチドを含有する細胞接着促進剤は、研究用試薬として、細胞外マトリックスの研究、接着が関与する細胞シグナル伝達の研究等に用いられ得る。

細胞の生存には、細胞外マトリックスへの細胞接着が重要であることが報告されている(Frisch, S. M. et al., J. Cell Biol. 1994, 124, 619., Porcu, M., et al., Cornea 2007, 26, 73.)。また、角膜において、細胞外マトリックスの一つであるラミニン５の消失による細胞接着阻害が、角膜上皮細胞の細胞死を促進することも報告されている。本発明のポリペプチドは、細胞外マトリックスから構成されている角膜上皮の基底膜（ボーマン膜など）への角膜上皮細胞の接着を促進することにより、眼表層における角膜上皮細胞の細胞死を抑制する。また、角膜上皮の修復には、分裂、移動（伸展）、接着からなる細胞の運動が関与することが知られている(Suzuki, K. et al., Prog. Retin. Eye Res. 2003, 22, 113)。本発明のポリペプチドは、この細胞運動における接着過程を促進することによって、角膜上皮の損傷（すなわち、創傷または欠損）の修復を促進する。

従って、本発明のポリペプチドを含有する医薬は角膜上皮障害の治療に有用である。角膜上皮障害を引き起こす具体的疾患としては、物理的・化学的刺激、アレルギー、細菌・真菌・ウイルス感染等による角膜炎のほか、角膜潰瘍、角膜上皮剥離（角膜糜爛）、角膜上皮浮腫、角膜熱傷、化学物質等による角膜腐蝕、ドライアイ、眼球乾燥症、慢性表層角膜炎、点状表層角膜症、角膜上皮糜爛、遷延性角膜上皮欠損等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドはこれらの疾患に伴う角膜上皮障害の治療に特に有用である。

また、本発明のポリペプチドは、涙腺腺房細胞からの涙液分泌促進作用を有する。涙液は、角膜および結膜からなる眼球表面を覆って角結膜の湿潤性を保持し、乾燥を防いでいる。しかしながら、近年、涙液減少症に伴う角結膜表面の乾燥、コンタクトレンズ装用時の眼の乾燥、あるいはＯＡ機器の操作中に起きる眼の乾燥等により、疲労感、異物感を始めとした種々の症状、すなわち、ドライアイ症状を訴える人が増えている。ドライアイは、しばしば角膜上皮細胞の障害による角膜上皮障害および角膜上皮糜爛等を伴い、重篤な場合は角膜潰瘍および眼感染症を発症させることもある。これらの乾燥に伴うさまざまな症状を緩和するために、塩化ナトリウム等の塩類を主剤とした人工涙液、ヒドロキシエチルセルロース、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸を含む点眼剤等が使用されているが、未だ満足すべきものがないのが現状である。しかしながら、これらの対症療法によって症状を軽減することはできるが、根本的に治療するための原因療法とはならない。涙液にはその本来の機能によりドライアイによる角結膜障害を治癒する効果があると考えられるので、涙腺に直接作用し、涙液分泌を促進する物質は、ドライアイおよびドライアイを伴う疾病に対して有用な予防治療薬となることが期待される。

本発明のポリペプチドを含有する医薬品の投与剤型は特に制限されないが、好ましくは点眼剤、洗眼剤、眼軟膏、錠剤等の投与剤型で提供される。特に、水溶液中での安定性が著しく改善されていることから、水性液剤の形態、具体的には点眼剤として投与されることが好ましい。ここで「水性液剤」とは、水性溶剤を使用した液剤であり、該水性溶剤としては、注射用蒸留水、イオン交換樹脂又は蒸留によって精製された精製水、該精製水を滅菌した滅菌精製水等が挙げられる。また、本発明のポリペプチドを含有する医薬品は、溶解後室温で保存可能な、用時溶解型製剤の形態で提供されることも好ましい。これらは汎用されている技術を用いて調製することができる。例えば、点眼剤は、添加物として、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤等を適宜配合して調製することができる。また、ｐＨ調整剤、増粘剤、分散剤などを添加し、薬物を懸濁化させることによって、安定な点眼剤を得ることもできる。

等張化剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ソルビトール、マンニトール、ブドウ糖、ホウ酸等が挙げられるが、これらに限定されない。
緩衝剤としては、例えば、リン酸、リン酸塩、クエン酸、酢酸、ε−アミノカプロン酸、トロメタモール、クエン酸塩、酢酸塩、ホウ酸、グルタミン、炭酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。
ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ホウ酸、ホウ砂、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。
可溶化剤としては、例えば、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、マクロゴール４０００等が挙げられるが、これらに限定されない。
増粘剤、分散剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース系高分子、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等が、また、安定化剤としては、例えばエデト酸、エデト酸ナトリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。
汎用される保存剤としては、汎用のソルビン酸、ソルビン酸カリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ホウ酸、エデト酸ナトリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの保存剤を組み合わせて使用することもできる。

本発明のポリペプチドを含有する点眼剤は、そのｐＨを４〜８に設定することが望ましく、また、浸透圧比を１付近に設定することが望ましい。

本発明のポリペプチドを含有する医薬品において、本発明のポリペプチドの濃度は症状、年齢等に応じて設定すればよく、特に限定する必要はないが、例えば本発明のポリペプチドを点眼剤、洗眼剤等に含める場合、通常、約０．００００３ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００００１ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％、約０．０００１ｗ／ｖ％〜約０．０００５ｗ／ｖ％、約０．００１ｗ／ｖ％〜約０．００５ｗ／ｖ％、約０．０１ｗ／ｖ％〜約０．０５ｗ／ｖ％、より好ましくは約０．００３ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％、最も好ましくは約０．００１ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％である。投与量としては、点眼剤を例にすれば１回１滴〜数滴、１日１〜数回点眼すればよい。点眼剤は、通常の点眼液のほか、用時溶解型の点眼液でもよい。

本発明のポリペプチドを有効成分として含有する医薬品は、例えば、哺乳動物（例、ラット、マウス、モルモット、トリ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒト等）などに使用することができる。

以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１ポリペプチド１の合成（ＰｙｒＬａｃ５０−８３）
ポリペプチド１の合成は、固相合成法を用いて行った。すなわち、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を導入したアミノ酸を樹脂に担持し、溶媒としてジクロロメタンを用い、カップリング試薬として２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）及びＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）を用いてアミド結合形成反応を行った。保護基の脱離は、ＤＭＦ/２０％ピペリジンを用いて行った。得られた生成物を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ、溶媒：水/アセトニトリル/０．０５％ＴＦＡ）を用いて精製し、以下のアミノ酸配列から成るポリペプチド１を得た。
ポリペプチド１：Pyr Gly Thr Ala Lys Val Thr Ser Ser Arg Gln Glu Leu Asn Pro Leu Lys Ser Ile Val Glu Lys Ser Ile Leu Leu Thr Glu Gln Ala Leu Ala Lys Ala（配列番号１）
（配列中、Pyrはピログルタミン酸を意味する）
Bachem（製造販売元）：Ｐｒｏｄｕｃｔ番号４０６４３９０
白色粉末ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳＣａｌｃｄ．：３６３６．２０；Ｆｏｕｎｄ：３６３６．８９；Ｐｕｒｉｔｙ（ＨＰＬＣＡ／Ａ％）＞９２％

比較例１ポリペプチド２の合成（Ｌａｃ５０−８３）
実施例１と同様にして以下のアミノ酸配列から成るポリペプチド２を得た。
ポリペプチド２：Gln Gly Thr Ala Lys Val Thr Ser Ser Arg Gln Glu Leu Asn Pro Leu Lys Ser Ile Val Glu Lys Ser Ile Leu Leu Thr Glu Gln Ala Leu Ala Lys Ala（配列番号２）
Biosynthesis Inc.（製造元）
白色粉末ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳＣａｌｃｄ．：３６５３．２７；Ｆｏｕｎｄ：３６５２．２８；Ｐｕｒｉｔｙ（ＨＰＬＣＡ／Ａ％）９９．２６％

比較例２ポリペプチド３の合成（ＰｙｒＬａｃ５０−９４）
実施例１と同様にして以下のアミノ酸配列から成るポリペプチド３を得た。
ポリペプチド３：Pyr Gly Thr Ala Lys Val Thr Ser Ser Arg Gln Glu Leu Asn Pro Leu Lys Ser Ile Val Glu Lys Ser Ile Leu Leu Thr Glu Gln Ala Leu Ala Lys Ala Gly Lys Gly Met His Gly Gly Val Pro Gly Gly（配列番号３）
（配列中、Pyrはピログルタミン酸を意味する）
Bachem（製造販売元）：Ｐｒｏｄｕｃｔ番号４０６４３８８
白色粉末ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳＣａｌｃｄ．：４５７１．２８；Ｆｏｕｎｄ：４５７１．４０；Ｐｕｒｉｔｙ（ＨＰＬＣＡ／Ａ％）：＞９０％

比較例３ポリペプチド４の合成（Ｌａｃ５０−９４）
実施例１と同様にして以下のアミノ酸配列から成るポリペプチド４を得た。
ポリペプチド４：Gln Gly Thr Ala Lys Val Thr Ser Ser Arg Gln Glu Leu Asn Pro Leu Lys Ser Ile Val Glu Lys Ser Ile Leu Leu Thr Glu Gln Ala Leu Ala Lys Ala Gly Lys Gly Met His Gly Gly Val Pro Gly Gly（配列番号４）
Biosynthesis Inc.（製造元）
白色粉末ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳＣａｌｃｄ．：４５８８．３５；Ｆｏｕｎｄ：４５９０．１４；Ｐｕｒｉｔｙ（ＨＰＬＣＡ／Ａ％）９６．８８％

比較例４ポリペプチド５の合成（Ｌａｃ４９−８３）
実施例１と同様にして以下のアミノ酸配列から成るポリペプチド５を得た。
ポリペプチド５：Val Gln Gly Thr Ala Lys Val Thr Ser Ser Arg Gln Glu Leu Asn Pro Leu Lys Ser Ile Val Glu Lys Ser Ile Leu Leu Thr Glu Gln Ala Leu Ala Lys Ala（配列番号９）
Biosynthesis Inc.（製造元）
白色粉末ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳＣａｌｃｄ．：３７５２．４；Ｆｏｕｎｄ：３７５１．３８；Ｐｕｒｉｔｙ（ＨＰＬＣＡ／Ａ％）９６．１３％

試験例１ラクリチンの部分ペプチドの水溶液中での安定性に対するピロ化の影響
本発明のラクリチンの部分ペプチドを医薬、特に、水性液剤の形態で提供される医薬とする場合、その水溶液中での安定性が望まれる。そこで、本発明において、Ｎ末端のグルタミンをピロ化することにより水溶液中での安定性にどのような影響を与えるのかを調べた。
実施例１で製造したＰｙｒＬａｃ５０−８３と、比較例１で製造したＬａｃ５０−８３とを用いて、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅｓｐＨ７．２（Invitrogen）；成分（／１００ｍＬ）：ＫＨ_２ＰＯ_４０．０２１ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４０．０７２６ｇ、ＮａＣｌ０．９ｇ）中、保管条件を種々に変えて、そのペプチド含量の残存率（％）を測定した。各ペプチドの濃度は、１０^−４Ｍとした。ＰｙｒＬａｃ５０−８３とＬａｃ５０−８３とは、上記アミノ酸配列からも明らかなように、Ｎ末端のグルタミンがピロ化している（ＰｙｒＬａｃ５０−８３）かしていないか（Ｌａｃ５０−８３）の点のみで異なるポリペプチドである。
[保管条件]
温度：４℃、２５℃、４０℃、６０℃
期間：７日間、１４日間、２１日間、２８日間
各保管条件で両ポリペプチドを保存した後、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによりペプチド含量を測定し、それらの残存率を算出した。また、残存率は、可能な限り、保存容器からの水分蒸発量を考慮して、下記式１により算出した。
［式１］
残存率（水分補正）（％）＝水分補正前の残存率（％）×（１００−容器の水分透過率（％））／１００
式中、「容器の水分透過率」は、保存容器空（風袋）重量、保存前及び保存後の検体重量を測定後、下記式２に従って算出する。
（ここで、検体重量とは、保存容器及び溶液重量を足し合わせたものである。）
［式２］
容器の水分透過率（％）＝（保存前の検体重量（ｇ）−各条件保存後の検体重量（ｇ））／（保存前の検体重量（ｇ）−保存容器空重量（ｇ））×１００
[ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件]
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２２０ｎｍ）
カラム：内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレス管に平均粒子径５μｍの液体クロマトグラフ用オクタデシルシリル化シリカゲルを充てんした市販のカラムを使用した。
（ＣａｐｃｅｌｐａｋＣ１８ＵＧ１２０Å、Ｓ５μｍ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、資生堂）
カラム温度：２０℃付近の一定温度
移動相Ａ：トリフルオロ酢酸溶液（０．５→１０００）（溶媒：精製水）
移動相Ｂ：トリフルオロ酢酸溶液（０．５→１０００）（溶媒：アセトニトリル）
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を次のように変えて直線濃度勾配制御した。

流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
オートサンプラー温度：４℃付近の一定温度
インジェクター洗浄液：アセトニトリル水溶液（５０→１００）（溶媒：精製水）
結果を図１に示す。
ピロ化することにより、水溶液中でのより長期間の保存が可能となり、また、より高温での保存が可能になることがわかった。

試験例２ラクリチンの部分ペプチドによる、細胞外マトリックスへのヒト角膜上皮細胞の接着促進効果
試験例１で、Ｎ末端のグルタミンをピロ化することにより、水溶液中での該ポリペプチドの安定性が著しく向上することがわかった。そこで、ラクリチンの部分ペプチドが有する本来の特性、即ち、細胞接着促進効果がピロ化により影響を受けないか否かを調べた。
なお、ネガティブコントロールとして、ラクリチンペプチドの、本発明とは異なる配列を有するペプチド（Ｌａｃ２４−５６，Ｌａｃ５０−６５）を用いた。これらのペプチドは、上述のペプチドと同様の方法を用いて作製した。
・ポリペプチドＬａｃ２４−５６
Glu Ile Ser Gly Pro Ala Glu Pro Ala Ser Pro Pro Glu Thr Thr Thr Thr Ala Gln Glu Thr Ser Ala Ala Ala Val Gln Gly Thr Ala Lys Val Thr (配列番号７)
Bachem（製造販売元）：Ｐｒｏｄｕｃｔ番号４０６４３８４
・ポリペプチドＬａｃ５０−６５
Gln Gly Thr Ala Lys Val Thr Ser Ser Arg Gln Glu Leu Asn Pro Leu （配列番号８）
Biosynthesis Inc.（製造元）
９６ウェルプレート（岩城硝子株式会社、カタログ番号：３８６０−０９６）に、１０μｇ／ｍＬの濃度の細胞外マトリックス溶液（コラーゲンタイプＩＶ：Becton, Dickinson and Company、カタログ番号：３５４２４５）を加えた。それを３７℃で１時間インキュベートし、プレートに細胞外マトリックスをコーティングした。余分な細胞外マトリックス溶液を除去し、細胞外マトリックスでコーティングされなかった領域をブロッキングするために、０．１％のＢＳＡ溶液（Sigma-Aldrich Co.、カタログ番号：Ａ３８０３）を加えた。続いて、ＢＳＡ溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後、実施例１（ＰｙｒＬａｃ５０−８３）および比較例１〜３（Ｌａｃ５０−８３、ＰｙｒＬａｃ５０−９４、Ｌａｃ５０−９４）で合成したポリペプチド１〜４（濃度１００μｇ／ｍＬ）及びネガティブコントロールのポリペプチド（Ｌａｃ２４−５６、Ｌａｃ５０−６５）を１ウェル当たり５０μＬずつ加えた。さらに、このウェルに予め無血清の状態で一晩培養した株化ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥ−Ｔ：Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995, 36, 614に記載された方法にて調製した）を２×１０^４個／１００μＬＤＭＥＭ／Ｆ１２培地／ウェルになるように加えた。それを３７℃で２５分間インキュベートし、細胞をプレートに接着させた。
その後、細胞を１０％の中性緩衝ホルムアルデヒド液（ナカライテスク株式会社、カタログ番号：３７１５２−５１）により固定し、１％のクリスタルバイオレット染色液（Sigma-Aldrich Co.、カタログ番号：Ｃ３８８６）によって染色した。染色された細胞の写真は、倒立型顕微鏡（オリンパス株式会社、ＩＸ７１）を用いて取り込み、接着した細胞のエリアをＩｍａｇｅ−ＰｒｏＰｌｕｓＶｅｒ．４．５（株式会社日本ローパー）を用いて、測定した。ポリペプチドを加えなかった場合を１００％として求めた細胞接着率を図２に示す。
図２から明らかなように、ポリペプチド１（ＰｙｒＬａｃ５０−８３）は、角膜上皮細胞と細胞外マトリックスとの細胞接着を促進する活性を有することが確認され、Ｌａｃ５０−８３ではＮ末端グルタミンのピロ化の影響を受けないことが確認された。一方、ポリペプチド２（ＰｙｒＬａｃ５０−９４）は、ピロ化する前のポリペプチド（ポリペプチド４：Ｌａｃ５０−９４）に比べてその活性が低くなり、Ｌａｃ５０−９４のＮ末端グルタミンのピロ化は、細胞接着促進効果を減弱させることがわかった。
以上の結果から、本発明のラクリチン部分ポリペプチドは、細胞接着促進効果を維持しつつ水溶液中での安定性が改善されている、という点で優れていることが確認された。

試験例３ラクリチンの部分ペプチドによる、サル涙腺アシナー細胞からの涙液タンパク質分泌促進効果
（アシナー細胞の調製）
３頭分のサル涙腺（カニクイザル）を、株式会社イブバイオサイエンスから入手し、実験に使用した。使用したサル涙腺の詳細は、下記のとおりである。
９歳６ヶ月（雄性、ベトナム）
１０歳９ヶ月（雄性、中国）
１０歳８ヶ月（雄性、ベトナム）
これらの涙腺を０．１ｍｇ／ｍＬＴｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Sigma、カタログ番号：Ｔ９００３）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen Corporation、カタログ番号：１１３３０）中で細切した。続いて、涙腺に０．７６ｍｇ／ｍＬＥＤＴＡ（和光純薬工業株式会社、カタログ番号：３４５−０１８６５）を含むＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ株式会社、カタログ番号：１４１７５）を添加して、３７℃で７−１２分間緩やかに振盪処理した。その後、遠心処理により上清を除き、２００Ｕ／ｍＬｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＡ（Roche、カタログ番号：１１０８８７８５１０３），６９８Ｕ／ｍＬＨｙａｒｕｌｏｎｉｄａｓｅ（Worthington、カタログ番号：ＬＳ００２５９２）、１０Ｕ／ｍＬＤＮａｓｅ（Roche、カタログ番号：４５３６２８２）（ＣＨＤ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加え、３７℃で１０−４０分間緩やかに振盪した。上記の工程を２度行った。その後、２０％ＦＢＳ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：１００８２−１４７）を添加して酵素反応を止め、さらにピペッティング操作により細胞を分散させた。１００μｍ（Becton, Dickinson and Company、カタログ番号：３５２３６０）及び４０μｍ（Becton, Dickinson and Company、カタログ番号：３５２３４０）のセルストレーナーで残渣を除いた。その後、細胞を１０％，３０％，６０％パーコール（Sigma、カタログ番号：Ｐ４９３７）で分離し、３０％と６０％の間に集まった細胞をアシナー細胞とした。
（培地中に分泌された涙液タンパク質ラクトフェリンの検出）
本試験例で調製したサルアシナー細胞を、ｒａｔｃｏｌｌａｇｅｎ，ＴｙｐｅＩ（０．０１ｍｇ／ｃｍ^２；BD Biosciences、カタログ番号：３５４２３６）をコートしたプレートへ播き、１０ｎｇ／ｍｌｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Sigma、カタログ番号：Ｄ２９１５），１ｍＭｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ（Sigma、カタログ番号：Ｐ５７８０），５０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（Invitrogen Corporation，ＰＨＧ０３１１），２５μｇ／ｍｌＬ−ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ（Sigma、カタログ番号：Ａ４５４４），１ｘＩｎｓｕｌｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅｍｅｄｉａｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Sigma、カタログ番号：Ｉ１８８４）、１０μｇ／ｍＬＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（Sigma、カタログ番号：Ｇ６０１３）および５０μｇ／ｍｌｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：１５７５０）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて、１日間培養した。翌日、サプリメントの含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で３０分間のプレインキュベートを行った。その後、ラクリチン部分ペプチドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を加え、３７℃で１０分間のインキュベートを行い、培地を回収した。
ラクリチンポリペプチドとしてはポリペプチド１（ＰｙｒＬａｃ５０−８３）及びポリペプチド２（Ｌａｃ５０−８３）を用いた。また、対照群にはポリペプチドの代わりにＰＢＳを用いた。
回収した培地を、ＲｅａｄｙＰｒｅｐ２Ｄｃｌｅａｎｕｐｋｉｔ（Bio-Rad Laboratories, Inc.、カタログ番号：１６３−２１３０）で精製し、ＮｕＰＡＧＥＬＤＳｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：ＮＰ０００７）に溶解後、７０℃で１０分間の熱変性を行った。等量のサンプルを４−１２％ＮｕＰＡＧＥＮｏｖｅｘＢｉｓＴｒｉｓｇｅｌ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：ＮＰ０３２２ＢＯＸ）、ＭＥＳｂｕｆｆｅｒ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：ＮＰ０００２）中で２００Ｖ、３５分間の電気泳動の後、トランスブロットミニセル（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いて、ＰＶＤＦメンブレン（日本ミリポア株式会社、カタログ番号：ＩＰＶＨ０００１０）に１００Ｖで６０分間のブロッティングを行った。メンブレンを、０．５％スキムミルク（和光純薬工業株式会社、カタログ番号：１９８−１０６０５）入りＴＴＢＳ（Bio-Rad Laboratories, Inc.、カタログ番号：１７０−６４３５）で室温３０分間のブロッキングした後、終夜４℃で１００００倍希釈のラクトフェリン抗体（Sigma-Aldrich Co.、カタログ番号：Ｌ−３２６３）と反応させた。ＴＴＢＳで洗浄後、抗ｒａｂｂｉｔＨＲＰの２次抗体を１００００倍に希釈し、室温６０分間の反応を行った。次いで、ＥＣＬｐｌｕｓ（GE healthcare、カタログ番号：ＲＰＮ２１３２）を用いてバンドを検出し、測定した。
結果を図３に示す。なお、本試験例において使用したサルは３頭であり、１頭目及び２頭目のサルからは１つのサンプルを採取し、３頭目のサルからは２つのサンプルを採取し、合計４サンプルを使用した。

試験例４ラクリチンの部分ペプチドによる、ラットおよびウサギの涙腺アシナー細胞からの涙液タンパク質分泌促進効果（アシナー細胞の調製）
ラットおよびウサギの涙腺を、０．１ｍｇ／ｍＬＴｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Sigma、カタログ番号：Ｔ９００３）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen Corporation、カタログ番号：１１３３０）中で細切する。続いて、０．７６ｍｇ／ｍＬＥＤＴＡ（和光純薬工業株式会社、カタログ番号：３４５−０１８６５）を含むＨＢＳＳ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：１４１７５）を添加して、３７℃で１５−２０分間緩やかに振盪処理する。その後、遠心処理により上清を除き、２００Ｕ／ｍＬｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＡ（Roche、カタログ番号：１１０８８７８５１０３），６９８Ｕ／ｍＬＨｙａｒｕｌｏｎｉｄａｓｅ（Worthington、カタログ番号：ＬＳ００２５９２）、１０Ｕ／ｍＬＤＮａｓｅ（Roche、カタログ番号：４５３６２８２）（ＣＨＤ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加え、３７℃で１５−５０分間緩やかに振盪する。上記の工程を２度行い、その後、２０％ＦＢＳ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：１００８２−１４７）を添加して酵素反応を止め、さらにピペッティング操作により細胞を分散させる。１００μｍ（Becton, Dickinson and Company、カタログ番号：３５２３６０）及び４０μｍ（Becton, Dickinson and Company、カタログ番号：３５２３４０）のセルストレーナーで残渣を除く。その後、細胞を１０％，３０％，６０％パーコール（Sigma、カタログ番号：Ｐ４９３７）で分離し、３０％と６０％の間に集まった細胞をアシナー細胞とする。
（培地中に分泌された涙液タンパク質ラクトフェリンの検出）
ラットおよびウサギのアシナー細胞を、ｒａｔｃｏｌｌａｇｅｎ，ＴｙｐｅＩ（０．０１ｍｇ／ｃｍ^２；BD Biosciences、カタログ番号：３５４２３６）をコートしたプレートへ播き、１０ｎｇ／ｍｌｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Sigma、カタログ番号：Ｄ２９１５），１ｍＭｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ（Sigma、カタログ番号：Ｐ５７８０），５０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（Invitrogen Corporation，ＰＨＧ０３１１），２５μｇ／ｍｌＬ−ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ（Sigma、カタログ番号：Ａ４５４４），１ｘＩｎｓｕｌｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅｍｅｄｉａｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Sigma、カタログ番号：Ｉ１８８４）、１０μｇ／ｍＬＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（Sigma、カタログ番号：Ｇ６０１３）および２５μｇ／ｍｌｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：１５７５０）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて、１日間ＣＯ_２インキュベータ中で培養する。翌日、サプリメントの含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で３０分間のプレインキュベートを行う。その後、ラクリチン部分ペプチドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を加え、３７℃で３０分または６０分間のインキュベートを行い、培地を回収する。
培地中に分泌された涙液タンパク質の量は、ペルオキシダーゼ活性をＡｍｐｌｅｘＲｅｄＨｙｄｒｏｇｅｎＰｅｒｏｘｉｄｅ／ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＡｓｓａｙＫｉｔキット（Invitrogen Corporation、カタログ番号：Ａ２２１８８）、アルブミン量をＲａｔＡｌｂｕｍｉｎＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＳｅｔ（Bethyl Laboratories Inc.、カタログ番号：Ｅ１００−１２５−１２）、ＩｇＡ量をＲａｔＩｇＡＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＳｅｔ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：Ｅ１００−１０２）を用いて測定することができる。

試験例５ラクリチンの部分ペプチドによる、サイトカイン存在下でのサル涙腺アシナー細胞からの涙液タンパク質分泌促進効果
サイトカインは、アシナー細胞からの涙液タンパク質の分泌作用を減少させる働きを有する。本実施例では、サイトカインにより涙液分泌機能が低下したアシナー細胞において、ラクリチンの部分ペプチドが涙液タンパク質を分泌促進する効果を有するか否かを検討することができる。
サル涙腺を０．１ｍｇ／ｍＬＴｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Sigma、カタログ番号：Ｔ９００３）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen Corporation、カタログ番号：１１３３０）中で細切する。続いて、０．７６ｍｇ／ｍＬＥＤＴＡ（Sigma，カタログ番号：Ｅ−５１３４）を含むＨＢＳＳ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：１４１７５）を添加して、３７℃で７−２０分間緩やかに振盪処理を行う。その後、遠心処理により上清を除き、２００Ｕ／ｍＬｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＡ（Roche、カタログ番号：１１０８８７８５１０３），６９８Ｕ／ｍＬＨｙａｒｕｌｏｎｉｄａｓｅ（Worthington、カタログ番号：ＬＳ００２５９２）、１０Ｕ／ｍＬＤＮａｓｅ（Roche，カタログ番号：４５３６２８２）（ＣＨＤ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加え、１５−５０分間３７℃インキュベータ中で緩やかに振盪する。上記の工程を２度行う。その後、２０％ＦＢＳ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：１００８２−１４７）を添加して酵素反応を止め、さらにピペッティング操作により細胞を分散させる。１００μｍ（Becton, Dickinson and Company、カタログ番号：３５２３６０）及び４０μｍ（Becton, Dickinson and Company、カタログ番号：３５２３４０）のセルストレーナーで残渣を除いた後、細胞を１０％，３０％，６０％パーコール（Sigma、カタログ番号：Ｐ４９３７）で分離し、３０％と６０％の間に集まった細胞をアシナー細胞とする。
サルアシナー細胞を、ｒａｔｃｏｌｌａｇｅｎ，ＴｙｐｅＩ（０．０１ｍｇ／ｃｍ^２；BD Biosciences、カタログ番号：３５４２３６）をコートしたプレートへ播き、１０ｎｇ／ｍｌｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Sigma、カタログ番号：Ｄ２９１５），１ｍＭｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ（Sigma、カタログ番号：Ｐ５７８０），５０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（Invitrogen Corporation，ＰＨＧ０３１１），５０μｇ／ｍｌＬ−ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ（Sigma、カタログ番号：Ａ４５４４），１ｘＩｎｓｕｌｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅｍｅｄｉａｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Sigma、カタログ番号：Ｉ１８８４）、１０μｇ／ｍＬＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（Sigma、カタログ番号：Ｇ６０１３）および２５μｇ／ｍｌｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：１５７５０）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ培養液）を用いて、１日間ＣＯ_２インキュベータ中で培養する。翌日、培地を１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−ａｌｐｈａ（R&D systems、カタログ番号：２１０−ＴＡ）および１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−ｇａｍｍａ（R&D systems、カタログ番号：２８５−ＩＦ）を含むＣｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ培養液へと交換し、さらに１日間ＣＯ_２インキュベータ中で培養する。その後にラクリチン部分ペプチドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を加え、１０分間ＣＯ_２インキュベータ中で刺激し、培地を回収する。回収した培地を、ＲｅａｄｙＰｒｅｐ２ＤＣｌｅａｎｕｐＫｉｔ（Bio-Rad Laboratories, Inc.、カタログ番号：１６３−２１３０）により脱塩、濃縮し、ＮｕＰＡＧＥＬＤＳｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（Invitrogen Corporation、カタログ番号：ＮＰ０００７）に溶解後、７０℃で１０分間の熱変性を行う。等量のサンプルを４−１２％ＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓｇｅｌ、ＭＥＳｂｕｆｆｅｒ中で２００Ｖ，３５分間室温で分離後、トランスブロットミニセル（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いてＰＶＤＦメンブレンに１００Ｖで６０分間のブロッティングを行う。メンブレンを、０．５％スキムミルク入りＴＴＢＳを用いて、室温３０分間のブロッキングに供し、その後、終夜４℃で５０００倍希釈のラクトフェリン抗体（Sigma、カタログ番号：Ｌ３２６２）と反応させる。ＴＴＢＳで洗浄後、抗ラビットＨＲＰの２次抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.、カタログ番号：ｓｃ−２０５４）を１００００倍に希釈し、室温６０分間の反応を行う。次いで、ＥＣＬｐｌｕｓ（GE Healthcare、カタログ番号：ＲＰＮ２１３２）を用いてラクトフェリンを検出する。

試験例６前眼部刺激性試験
本試験例では、各ポリペプチドを含む点眼液を点眼して、前眼部における刺激性を評価した。
ポリペプチド１（ＰｙｒＬａｃ５０−８３）点眼液およびポリペプチド５（Ｌａｃ４９−８３）点眼液は、各ポリペプチドを、ＰＢＳ［（塩化ナトリウム０．９ｇ（ナカライテスク株式会社、カタログ番号：３１３２０−０５）、リン酸二水素一ナトリウム０．１ｇ（ナカライテスク株式会社、カタログ番号：３１７１８−１５）を蒸留水で全量１００ｍｌ（ｐＨ７．０）に溶解したもの）］により、１ｍＭ濃度に希釈することによって調製した。
日本白色種雄性ウサギ（北山ラベス株式会社、体重約２．０ｋｇ；ポリペプチド１投与群はＮ＝１、ポリペプチド５投与群はＮ＝２）に、ポリペプチド１点眼液、ポリペプチド５点眼液またはＰＢＳ（対照群）を１回１００μＬ、１時間間隔で８回点眼した。前眼部の観察とフルオレセイン（和光純薬工業株式会社、カタログ番号：２１３−０００９２）による角膜染色斑の観察を点眼前と最終点眼の３０分後に行い、ＭｃＤｏｎａｌｄ−Ｓｈａｄｄｕｋ法(Hackett, R. B. and McDonald, T. O., Chapter 44:Assessing Ocular Irritation, Dermatotoxicology fifth edition, Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach, Taylor & Francis, U.S.A.:557-567, 1996)により、前眼部の刺激性を評価した。
点眼後の前眼部の観察を、角膜、虹彩、結膜について行った。その結果、角膜については、透明度は正常であり、混濁や実質内の血管新生は認められなかった。また、フルオレセインによる角膜染色斑も観察されなかった。虹彩については、光応答は正常であり、充血は認められなかった。結膜についても、結膜の充血や浮腫は認められず、正常であった。また、異常な分泌物も観察されなかった。これらの結果は、ＭｃＤｏｎａｌｄ−Ｓｈａｄｄｕｋ法（下記参照）に準じるとスコア０の判定を示し、ポリペプチド１点眼液とポリペプチド５点眼液のいずれにおいても異常は認められなかった。また、角膜染色斑の観察においても両点眼液で異常は認められなかった。このことから、ポリペプチド１点眼液及びポリペプチド５点眼液の安全性は高いことが明らかとなった。
スコア０の判定基準
Ａ）結膜の充血：正常、充血なし。時々、１２、６時方向のリンバス周辺部や眼瞼・球結膜の血管が観察される
Ｂ）結膜の浮腫：正常、浮腫なし。
Ｃ）分泌物：正常、分泌物なし。
Ｄ）虹彩の光応答：正常な瞳孔応答。
Ｅ）虹彩の充血：正常。時々、１２〜１時、６〜７時方向の瞳孔縁にわずかに充血した直径約１−２ｍｍの部位が存在する。
Ｆ）角膜の透明度：正常。
Ｇ）角膜混濁の範囲：混濁のない正常な角膜。
Ｈ）角膜実質への血管新生：血管新生なし。
Ｉ）フルオレセイン染色による角膜染色：フルオレセイン染色なし。

製剤例１角膜上皮シート調製用培養液
４ｍＬのＨＣＧＳ増殖添加剤（内容物：ｍＥＧＦ、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリンおよびＢＰＥ、倉敷紡績株式会社、カタログ番号：ＫＣ−６１５０）および１５ｍｇのポリペプチド１にＥｐｉＬｉｆｅ培地（角膜上皮細胞基礎培地 Cascade Biologics、カタログ番号：Ｍ−ＥＰＩ−５００−ＣＡ）を加え、全量５００ｍＬの培養液を調製する。

製剤例２ラクリチン部分ペプチドを含有する点眼剤
常法により下に示す点眼剤を調製する。
ポリペプチド１０．５ｇ
リン酸二水素ナトリウム０．１ｇ
塩化ナトリウム０．９ｇ
水酸化ナトリウム適量
滅菌精製水適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７）

本発明によれば、細胞と細胞外マトリックスとの接着、特に角膜上皮細胞と細胞外マトリックスとの接着を促進し、且つ、水溶液中で安定なる新規ポリペプチドを提供することが可能となる。本発明のポリペプチドは、角膜上皮細胞と細胞外マトリックスの接着を促進することができ、且つ水溶液中で安定であるので、保存安定性に優れた医薬の提供、特に水性液剤の形態による該医薬の提供が可能になる。
（配列表の説明）
配列番号１：ピロ化されたラクリチン部分ペプチド（ＰｙｒＬａｃ５０−８３）のアミノ酸配列
配列番号２：ラクリチン部分ペプチド（Ｌａｃ５０−８３）のアミノ酸配列
配列番号３：ピロ化されたラクリチン部分ペプチド（ＰｙｒＬａｃ５０−９４）のアミノ酸配列
配列番号４：ラクリチン部分ペプチド（Ｌａｃ５０−９４）のアミノ酸配列
配列番号５：ヒト由来全長ラクリチンのアミノ酸配列
配列番号６：アセチル化されたラクリチン部分ペプチドのアミノ酸配列
配列番号７：ラクリチン部分ペプチド（Ｌａｃ２４−５６）のアミノ酸配列
配列番号８：ラクリチン部分ペプチド（Ｌａｃ５０−６５）のアミノ酸配列
配列番号９：ラクリチン部分ペプチド（Ｌａｃ４９−８３）のアミノ酸配列

配列番号１：Ｘａａはピログルタミン酸を示す。
配列番号３：Ｘａａはピログルタミン酸を示す。

本出願は、日本で出願された特願２００９−２１５０３０を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。
請求項１記載のポリペプチドを含有する、細胞接着促進剤。
請求項１記載のポリペプチドの有効濃度を生体外で細胞に接触させることを含む、生体外で細胞の接着を促進させる方法。
請求項１記載のポリペプチドを有効成分として含有する、医薬。
水性液剤である請求項４記載の医薬。
角膜上皮障害の予防又は治療用である請求項４記載の医薬。
細胞の接着を促進させるための、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。
角膜上皮障害の予防又は治療のための、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。