CN105617402A - 一种唾液酸酶Neu1在制备药物方面的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种唾液酸酶Neu1在制备药物方面的用途，属于药物制备技术领域。本发明首次报道Neu1在有效治疗膀胱癌中的应用。本发明的唾液酸酶对α-2,3及α-2,6连接形式的底物均能进行水解，对细胞表明的FN进行转化，同时首次发现该酶能够通过将癌细胞表面因子纤连蛋白FN的唾液酸去掉导致FN的降解，而抑制膀胱癌细胞的增殖能力，实验数据表明该蛋白对膀胱癌的治疗具有一定的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种唾液酸酶Neu1在制备药物方面的用途，属于药物制备技术领域。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。全球每年大约有43万人被诊断为膀胱癌，其中约17万人死于膀胱癌，其致死率约为38％。膀胱癌在我国泌尿生殖系肿瘤发病率中高居榜首，膀胱癌的发病率随年龄增长而增加，高发年龄段为50-70岁。男性膀胱癌发病率高于女性。膀胱癌患者经尿道电切术后，其复发率约为70％，一般术后膀胱内灌注卡介苗或化疗药物可降低其复发率。常用的灌注化疗药物有丝裂霉素、阿霉素、噻替派、羟基喜树碱等。
目前在哺乳动物体内共发现了4种唾液酸酶(Neuraminidases，NA)，其中Neu1最为保守，主要定位于溶酶体，其功能是特异识别低聚糖和糖蛋白中的糖苷键，并对其进行剪切。唾液酸酶抑制剂可抑制人皮肤成纤维细胞、主动脉平滑肌细胞金额耳软骨细胞中弹性纤维的组装，并引起弹性纤维的合成受损。在过去的40年中，细胞表面糖蛋白唾液酸的修饰情况常作为区分不同肿瘤的标志，因此唾液酸也被认为是潜在的癌症治疗靶点，Neu1作为可水解唾液酸的酶也受到高度关注。有研究者对多株小鼠结肠腺癌细胞分析，发现恶性程度较高的细胞株中Neu1表达明显低于良性细胞株，然而该研究仅限于表达量的分析，并没有进一步数据表面其与结肠腺癌之间的关系，由于生物机体的性能受到大量基因的相互作用与影响，所以Neu1与结肠腺癌的关系尚未可知。
由于膀胱癌的发病率居高不下，并且复发率很高，开发有效治疗膀胱癌的药物是目前亟需解决的问题。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种唾液酸酶Neu1的新用途，是首次报道Neu1在有效治疗膀胱癌中的应用。本发明的有效的蛋白Neu1，通过质粒构建，转染至膀胱癌细胞中，引起相关通路的激活或抑制，并用实验数据表明该蛋白对膀胱癌的治疗具有一定的治疗效果。
本发明的唾液酸酶Neu1，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：
(a)氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；
(b)在(a)的基础上发生氨基酸插入、缺失或者替换得到的氨基酸序列，且编码有活性的唾液酸酶。
所述唾液酸酶Neu1的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
本发明提供了所述唾液酸酶Neu1在制备药物方面的应用；是用来制备抑制膀胱癌细胞迁移或者增殖的药物。
在本发明的一种实施方式中，所述药物是抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，是先将编码氨基酸序列如SEQIDNO.1的唾液酸酶Neu1基因，采用适合的表达载体和/宿主进行表达得到唾液酸酶Neu1，然后再用于制备药物。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为真核表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述药物，可以在膀胱癌的治疗中可通过膀胱灌注的方法使用，以达到抑制膀胱癌的效果。
本发明还提供表达唾液酸酶的转基因细胞系或者基因工程菌在制备抑制膀胱癌细胞迁移和/或增殖的药物方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述唾液酸酶Neu1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
本发明的有益效果：发现了一种唾液酸酶Neu1的新用途，是首次报道Neu1在有效治疗膀胱癌中的应用。本发明的唾液酸酶对α2,3及α2,6连接形式的底物均能进行水解，对细胞表明的FN进行转化，同时首次发现该酶能够通过将癌细胞表面因子纤连蛋白FN的唾液酸去掉导致FN的降解，而抑制膀胱癌细胞的增殖能力。本发明的有效的蛋白Neu1转染至膀胱癌细胞中，可引起相关通路的激活或抑制，实验数据表明该蛋白对膀胱癌的治疗具有一定的治疗效果。
附图说明
图1为YTS-1/Neu1和YTS-1中Neu1的表达情况；
图2为YTS-1/Neu1和YTS-1细胞中唾液酸水平的差异；
图3为YTS-1/Neu1和YTS-1细胞中唾液酸酶活性的差异；
图4为膀胱癌细胞YTS-1中过表达Neu1蛋白后FN蛋白表达的变化；
图5为膀胱癌细胞YTS-1中过表达Neu1蛋白后细胞增殖能力的变化；
图6为YTS-1/Neu1和YTS-1的肿瘤组织重量比较；
图7为YTS-1/Neu1和YTS-1的肿瘤组织生长趋势比较；
图8为肿瘤组织照片。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：过表达YTS-1细胞株的构建
1、唾液酸酶Neu1基因的克隆
Neu1基因的序列信息通过网站http://avermitilis.ls.kitasato-u.ac.jp/获得，并通过SignalP4.1Server网站对该酶的信号肽情况进行预测，结果显示该酶为不含有信号肽的胞内酶，大小约为45kDa的唾液酸酶。在neu1基因的编码区进行引物设计，由公司合成如下引物Neu1-F/Neu1-R(序列分别如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示)。引物序列如下：
Neu1-F:CCCAAGCTTATGACTGGGGAGCGACC；
Neu1-R:GGAATTCCAGTGGCACAGCTCAGAGTG
以人细胞基因组为模板进行PCR扩增，扩增条件如下：95℃10min，96℃1min，65℃45s，72℃1min30s重复34个循环，72℃10min。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，获得neu1基因片段(核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)。
neu1基因片段与载体质粒pcDNA3.1分别经过EcoRI和HindIII酶切后16℃连接过夜，连接产物转化E.coliJM109，挑取氨苄霉素抗性的转化子提取质粒进行酶切验证和测序验证，获得构建正确的neu1表达质粒。
2、唾液酸酶Neu1过表达YTS-1细胞株(YTS-1/Neu1)的构建
将细胞接板于12孔板，37℃、5％CO2培养箱贴壁过夜，将构建好的pcDNA3.1/Neu1重组质粒利用转染试剂转染至YTS-1细胞中，待细胞长满后，加入含抗生素G418的培养基处理细胞，挑选单克隆，利用含有G418的培养基继续扩增挑选出来的单克隆(若第一次挑选的纯度不高，可进行第二次单克隆筛选)，待长到足够量以后，收取一部分细胞裂解蛋白样品进行WesternBlotting鉴定Neu1的表达情况(图1)。由图1可知，Neu1蛋白过表达的YTS-1细胞株构建成功。
实施例2：过表达Neu1的膀胱癌细胞YTS-1/Neu1和YTS-1细胞中唾液酸水平和唾液酸酶活的差异
(1)过表达Neu1的膀胱癌细胞YTS-1/Neu1和YTS-1细胞中唾液酸水平的差异
在24孔板中放入圆形盖玻片，加入过表达细胞YTS-1/Neu1和YTS-1细胞进行培养24h；吸出培养基，用1×PBS洗2遍，4％多聚甲醛固定；加入0.1％TritonX-100溶液通透化细胞10min；再用1×PBS洗3遍，1％BSA溶液4℃封闭过夜；加入溶于PBS的Cy3标记的凝集素，室温下避光孵育3h，1×PBS洗3遍，DAPI染色10min，最后将细胞爬片倒扣在滴有Glycergel固封剂的载玻片上，晾干后于4℃条件下避光保存。用尼康倒置荧光显微镜ECLIPSETi-U在10×60倍下拍照(图2)。由图2可知，Neu1过表达后，与对照组相比YTS-1/Neu1细胞中唾液酸的水平明显降低。
(2)过表达膀胱癌细胞YTS-1/Neu1和YTS-1细胞中唾液酸酶活性的差异
以2-(4-甲基伞形酮)-D-N乙酰神经氨酸钠盐(4-MU-NANA)作为底物，YTS-1/Neu1和YTS-1细胞悬浮在含500mM的醋酸钠，0.1％TritonX-100补充有蛋白酶抑制剂的200μL缓冲液。然后，在有4-MU-NANA存在下37℃孵育1h，其间每15min搅拌一次；加甘氨酸-NaOH缓冲液(pH＝10.3)终止唾液酸反应；酶标仪检测荧光强度(激发波长355nm，发射460nm)(图3)。由图3可知，Neu1过表达后，与对照组相比YTS-1/Neu1细胞中唾液酶的活性明显增加。
实施例3：唾液酸酶Neu1抑制膀胱癌细胞YTS-1增殖能力和成瘤能力的研究
膀胱癌是泌尿系统中最常见的一种恶性肿瘤，世界范围内，膀胱癌位列男性最常见实体瘤的第四位，在女性位列第七位，每年新诊断的膀胱癌患者超过三十五万名；在中国，膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤，大约90％的膀胱癌为膀胱尿路上皮癌。在恶性膀胱癌细胞YTS-1的迁移能力较正常膀胱上皮细胞更强。
对细胞增殖能力的研究采用MTT法测定，结果表明Neu1蛋白过表达的YTS-1迁移能力明显降低，说明该酶能有效抑制恶性膀胱癌细胞的增殖(图4)；对FN的含量变化情况的检测采用westernblotting的方法，细胞接种于6孔板，待细胞长至90％，RIPA裂解液将细胞裂解后，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入SDSloadingbuffer在100℃水浴中煮沸样品5min，10％SDSPAGE胶进行电泳后，westernblotting鉴定YTS-1/Neu1和YTS-1中FN蛋白表达的变化(图5)，实验发现，Neu1蛋白过表达后的YTS-1FN蛋白的含量明显增加，说明Neu1能有效的转化恶性膀胱癌细胞表面的FN纤连蛋白，这种转化有可能是导致细胞增殖能力变化的原因之一。
细胞成瘤实验操作如下：18只小鼠随机平均分为3组，其中两组用于实验，第三组用于预实验；将生长状态良好的细胞株YTS-1和YTS-1/Neu1分别用无血清培养基重悬，与等体积Matrigel混匀，分别注射到BalbC/裸鼠背部皮下(2*106cells/200μL/只)；正常喂食饮水，连续3-4周隔天观察肿瘤的生长情况，并用游标卡尺测定肿瘤直径，记录；结束实验，麻醉后脱臼处死小鼠，分析获取的肿瘤组织的重量(图6)、肿瘤组织生长的趋势(图7)、取肿瘤组织拍照(图8)。结果显示YTS-1/Neu1细胞的成瘤能力明显弱于YTS-1细胞，表明Neu1对肿瘤的形成有抑制作用。说明Neul具有用于制备治疗膀胱癌药物的潜力，可通过对患者进行膀胱灌注的方法，从而抑制膀胱癌细胞的增殖和生长。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.唾液酸酶Neu1在制备药物方面的应用；所述药物是抑制膀胱癌细胞迁移或者增殖的药物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述唾液酸酶Neu1的氨基酸序列如(a)或(b)所示：
(a)氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；
(b)在(a)的基础上发生氨基酸插入、缺失或者替换得到的氨基酸序列，且编码有活性的唾液酸酶。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是抗体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，唾液酸酶Neu1的核苷酸序列是SEQIDNO.2。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是先将编码氨基酸序列如SEQIDNO.1的唾液酸酶Neu1基因，采用适合的表达载体和/宿主进行表达得到唾液酸酶Neu1，然后再用于制备药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体。
7.表达唾液酸酶的转基因细胞系或者基因工程菌在制备抑制膀胱癌细胞迁移和/或增殖的药物方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述唾液酸酶Neu1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
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