SK13672001A3 - Ľudské protilátky, ktoré sa viažu na ľudský IL-12, a spôsoby ich produkcie - Google Patents
Ľudské protilátky, ktoré sa viažu na ľudský IL-12, a spôsoby ich produkcie Download PDFInfo
- Publication number
- SK13672001A3 SK13672001A3 SK1367-2001A SK13672001A SK13672001A3 SK 13672001 A3 SK13672001 A3 SK 13672001A3 SK 13672001 A SK13672001 A SK 13672001A SK 13672001 A3 SK13672001 A3 SK 13672001A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- amino acid
- binding portion
- activity
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 414
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 148
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 716
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 714
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 697
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 690
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 690
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 378
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 62
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 55
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 388
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 269
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 258
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 228
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 228
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 171
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 145
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 145
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 108
- 238000002823 phage display Methods 0.000 claims description 87
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 82
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 74
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 claims description 74
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 74
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 claims description 74
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 74
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims description 68
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 60
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 50
- 102220473219 Glycodelin_H52A_mutation Human genes 0.000 claims description 49
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 48
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 46
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 36
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 28
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 claims description 28
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 24
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 19
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 claims description 16
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 13
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 13
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 12
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 102220484488 Nuclear factor erythroid 2-related factor 3_L30A_mutation Human genes 0.000 claims description 9
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 9
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 8
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 8
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 7
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 7
- 102220482489 Serine/threonine-protein kinase Nek7_L31A_mutation Human genes 0.000 claims description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 claims description 3
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 claims description 3
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 241001515942 marmosets Species 0.000 claims description 3
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims 6
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 claims 5
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 claims 5
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims 5
- 239000005541 ACE inhibitor Substances 0.000 claims 4
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims 4
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims 4
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims 4
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims 4
- UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N Jacareubin Natural products CC1(C)OC2=CC3Oc4c(O)c(O)ccc4C(=O)C3C(=C2C=C1)O UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 claims 4
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 claims 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims 4
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims 4
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 4
- NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N sulfasalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N 0.000 claims 4
- 229960001940 sulfasalazine Drugs 0.000 claims 4
- NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N sulfasalazine Natural products C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(N=NC=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- -1 IL- 6 Proteins 0.000 claims 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims 3
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims 3
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims 3
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 claims 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims 3
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 claims 3
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims 2
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 claims 2
- 206010003267 Arthritis reactive Diseases 0.000 claims 2
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 claims 2
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 claims 2
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 claims 2
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims 2
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 claims 2
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 claims 2
- 206010008874 Chronic Fatigue Syndrome Diseases 0.000 claims 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 claims 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 claims 2
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims 2
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 claims 2
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 claims 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims 2
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 claims 2
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 claims 2
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 claims 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims 2
- 201000004331 Henoch-Schoenlein purpura Diseases 0.000 claims 2
- 206010019617 Henoch-Schonlein purpura Diseases 0.000 claims 2
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims 2
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims 2
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 claims 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims 2
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 208000031814 IgA Vasculitis Diseases 0.000 claims 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims 2
- 102400000025 Interleukin-1 receptor type 1, soluble form Human genes 0.000 claims 2
- 101800000542 Interleukin-1 receptor type 1, soluble form Proteins 0.000 claims 2
- 101800001003 Interleukin-1 receptor type 2, soluble form Proteins 0.000 claims 2
- 102400000027 Interleukin-1 receptor type 2, soluble form Human genes 0.000 claims 2
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims 2
- 102000049772 Interleukin-16 Human genes 0.000 claims 2
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 claims 2
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 claims 2
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims 2
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims 2
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 claims 2
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 claims 2
- 208000011200 Kawasaki disease Diseases 0.000 claims 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 claims 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 claims 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 claims 2
- 206010028527 Myelitis transverse Diseases 0.000 claims 2
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 claims 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims 2
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 claims 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims 2
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 claims 2
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 claims 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims 2
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 claims 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims 2
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 claims 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims 2
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims 2
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 claims 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims 2
- 206010044248 Toxic shock syndrome Diseases 0.000 claims 2
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 claims 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 claims 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims 2
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 claims 2
- 230000001800 adrenalinergic effect Effects 0.000 claims 2
- 239000000464 adrenergic agent Substances 0.000 claims 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims 2
- 229940044094 angiotensin-converting-enzyme inhibitor Drugs 0.000 claims 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims 2
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 claims 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims 2
- 229940082638 cardiac stimulant phosphodiesterase inhibitors Drugs 0.000 claims 2
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims 2
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims 2
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 claims 2
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 claims 2
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 claims 2
- 208000015446 immunoglobulin a vasculitis Diseases 0.000 claims 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims 2
- 229960000681 leflunomide Drugs 0.000 claims 2
- VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N leflunomide Chemical compound O1N=CC(C(=O)NC=2C=CC(=CC=2)C(F)(F)F)=C1C VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 claims 2
- 108010000525 member 1 small inducible cytokine subfamily E Proteins 0.000 claims 2
- 239000003475 metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 claims 2
- 208000001725 mucocutaneous lymph node syndrome Diseases 0.000 claims 2
- 208000029766 myalgic encephalomeyelitis/chronic fatigue syndrome Diseases 0.000 claims 2
- RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N mycophenolate mofetil Chemical compound COC1=C(C)C=2COC(=O)C=2C(O)=C1C\C=C(/C)CCC(=O)OCCN1CCOCC1 RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N 0.000 claims 2
- 229960004866 mycophenolate mofetil Drugs 0.000 claims 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims 2
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims 2
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 claims 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims 2
- 239000002571 phosphodiesterase inhibitor Substances 0.000 claims 2
- 239000003379 purinergic P1 receptor agonist Substances 0.000 claims 2
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 claims 2
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 claims 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims 2
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 claims 2
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 claims 2
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 claims 2
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 claims 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 claims 2
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 claims 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims 2
- 239000002447 tumor necrosis factor alpha converting enzyme inhibitor Substances 0.000 claims 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 claims 2
- SZXUTTGMFUSMCE-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-imidazol-2-yl)pyridine Chemical class C1=CNC(C=2N=CC=CC=2)=N1 SZXUTTGMFUSMCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NBGAYCYFNGPNPV-UHFFFAOYSA-N 2-aminooxybenzoic acid Chemical class NOC1=CC=CC=C1C(O)=O NBGAYCYFNGPNPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NUKYPUAOHBNCPY-UHFFFAOYSA-N 4-aminopyridine Chemical compound NC1=CC=NC=C1 NUKYPUAOHBNCPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 6alpha-methylprednisolone Chemical compound C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)CO)CC[C@H]21 VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 0.000 claims 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims 1
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 claims 1
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 claims 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 claims 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102400000792 Endothelial monocyte-activating polypeptide 2 Human genes 0.000 claims 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 claims 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 claims 1
- 101000878602 Homo sapiens Immunoglobulin alpha Fc receptor Proteins 0.000 claims 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims 1
- 102100038005 Immunoglobulin alpha Fc receptor Human genes 0.000 claims 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 claims 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 claims 1
- 239000000867 Lipoxygenase Inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 claims 1
- CKMOQBVBEGCJGW-LLIZZRELSA-L OC1=CC=C(C=C1C(=O)O[Na])\N=N\C1=CC=C(C=C1)C(=O)NCCC(=O)O[Na] Chemical compound OC1=CC=C(C=C1C(=O)O[Na])\N=N\C1=CC=C(C=C1)C(=O)NCCC(=O)O[Na] CKMOQBVBEGCJGW-LLIZZRELSA-L 0.000 claims 1
- 229940123932 Phosphodiesterase 4 inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 206010038546 Renal vasculitis Diseases 0.000 claims 1
- 102400001298 Soluble interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims 1
- 101800001839 Soluble interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims 1
- 239000004074 complement inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 claims 1
- 239000003602 elastase inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims 1
- 229960004979 fampridine Drugs 0.000 claims 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 claims 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims 1
- 102000009634 interleukin-1 receptor antagonist activity proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108040001669 interleukin-1 receptor antagonist activity proteins Proteins 0.000 claims 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 claims 1
- KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N mesalamine Chemical compound NC1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960004963 mesalazine Drugs 0.000 claims 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 claims 1
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 claims 1
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 claims 1
- QQBDLJCYGRGAKP-FOCLMDBBSA-N olsalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=C(C(O)=CC=2)C(O)=O)=C1 QQBDLJCYGRGAKP-FOCLMDBBSA-N 0.000 claims 1
- 229960004110 olsalazine Drugs 0.000 claims 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims 1
- 239000002587 phosphodiesterase IV inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 claims 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 1
- RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N thromboxane Chemical compound CCCCCCCC[C@H]1OCCC[C@@H]1CCCCCCC RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N 0.000 claims 1
- XFYDIVBRZNQMJC-UHFFFAOYSA-N tizanidine Chemical compound ClC=1C=CC2=NSN=C2C=1NC1=NCCN1 XFYDIVBRZNQMJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960000488 tizanidine Drugs 0.000 claims 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 claims 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 14
- 229940040731 human interleukin-12 Drugs 0.000 abstract description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 10
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 105
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 83
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 83
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 82
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 57
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 54
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 53
- 108090000663 Annexin A1 Proteins 0.000 description 51
- 102100030698 Interleukin-12 subunit alpha Human genes 0.000 description 51
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 41
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 41
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 36
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 15
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 15
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 15
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 10
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 9
- 230000036541 health Effects 0.000 description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 8
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 7
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 6
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 3
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091064702 1 family Proteins 0.000 description 2
- 102220560724 Autophagy-related protein 101_H31S_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 2
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000004560 Interleukin-12 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010017515 Interleukin-12 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000577979 Peromyscus spicilegus Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002288 cocrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/08—Bronchodilators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/16—Central respiratory analeptics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
- A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka ľudských protilátok neutralizujúcich aktivitu ľudského interleukínu 12.
Doterajší stav techniky
Ľudský interleukín 12 (IL-12) bol v poslednom čase charakterizovaný ako cytokín s výnimočnou štruktúrou a pleiotropickými účinkami (opisuje sa v publikácii Kobayashi, et al., (1989) J. Exp. Med. 170 827-845, Seder, et al , (1993) Proc. Natl. Acad Sci. 90: 10188-10192, Ling, et al., (1995) J. Exp. Med. 154: 1 16-127, Podlaski, et al., (1992) Árch Biochem. Biophys. 294: 230-237). IL-12 má dôležitú úlohu v patológii vážnych ochorení, ktoré zahrnujú imunitné a zápalové odozvy. Zhrnutie skutočností o IL-12, o jeho biologických aktivitách a o jeho úlohe pri ochorení sa nachádza v publikácii Gately et al., (1998), Ann. Rev. Immunol. 16: 495-521.
Štruktúrou je IL-12 heterodimérový proteín obsahujúci podjednotku s molekulovou hmotnosťou 35 000 (p35) a podjednotku s molekulovou hmotnosťou 40 000 (p40), ktoré sú spojené dohromady disulfidovým mostíkom (označené ako „podjednotka p70“). Heterodimérový proteín sa primárne produkoval bunkami prezentujúcimi antigén, ako sú monocyty, makrofágy a dendritické bunky. Tieto typy buniek tiež vylučujú vo vzťahu k podjednotke p70 nadbytok podjednotky p40. Podjednotky p40 a p35 nie sú geneticky príbuzné a ani nevykazujú biologickú aktivitu, hoci homodimér p40 môže fungovať ako antagonista IL-12.
Funkčne IL-12 zohráva centrálnu úlohu pri regulácii rovnováhy medzi antigénom špecifickým pre pomocné bunky T typ l (Thl) a typ 2 (Th2). Bunky Thl a Th2 riadia iniciáciu a progresiu autoimunitných porúch a IL-12 má kritickú úlohu pri regulácii diferenciácie a maturácie lymfocytov Thi. Cytokíny uvoľnené bunkami Thl sú zápalové a zahrnujú interferón γ (IFNy).
oprášená strana
IL-2 a lymfotoxín (LT). Bunky Th2 vylučujú 1L-4, IL-5, IL-6, 1L-10 a IL-13, aby napomáhali humorálnej imunite, alergickým reakciám a imunosupresii
V súlade s prevahou odoziev Thl u autoimunitných ochorení a prozápalových aktivít IFNy, IL-12 môže hrať dôležitú úlohu pri patológii spojenej s radom autoimunitných a zápalových ochorení, ako je reumatoidná artritída (RA), roztrúsená skleróza (MS) a Crohnova choroba.
Ľudskí pacienti trpiaci MS vykazovali zvýšenú expresiu IL-12, čo sa dokumentovalo množstvom mRNA podjednotky p40 v plakoch pri akútnej MS (opisuje sa v publikácii Windhagen et al., (1995), J. Exp. Med. 182: 19851996). Navyše stimulácia ex vivo buniek prezentujúcich antigén bunkami T, ktoré exprimujú CD40-L a ktoré sa získali od pacientov s MS, vedie k zvýšeniu produkcie IL-12 v porovnaní s kontrolnými bunkami T, čo je v súlade s pozorovaním, že interakcia CD40/CD40L je silné indukčné činidlo IL-12.
V kĺbovom maze pacientov s RA v porovnaní so zdravými kontrolnými pacientami bolo detegované zvýšené množstvo IL-12p70 (opisuje sa v publikácii Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-3 14). Profil expresie informačnej ribonukleovej kyseliny (mRNA) cytokínov v kĺbovom maze pri ochorení RA identifikoval prevážne cytokíny Thl (opisuje sa v publikácii Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347367). Tiež sa zdá, že IL-12 zohráva rozhodujúcu úlohu v patológii Crohnovej choroby (CD). V črevnej sliznici pacientov s týmto ochorením bola pozorovaná zvýšená expresia INFy a IL-12 (opisuje sa v publikácii Fais et al., (1994) J. Interferon Res 14: 235-238, Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150: 823-832, Monteleone et al., (1997) Gastroenterology. 112. 1 169-1178 a Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152: 667-672). Profil vylučovania cytokínov bunkami T slizničného väziva pacientov s CD je charakteristický prevládajúcou odozvou Thl, čo zahrnuje značne zvýšené množstvo IFNy (opisuje sa v publikácii Fuss, et al., (1996) J Immunol. 157. 1261-1270) Avšak sekcia tkaniva hrubého čreva u pacientov s CD vykazuje veľké množstvo makrofágov exprimujúcich IL-12 a buniek T exprimujúcich IFNy (opisuje sa v publikácii Parronchi et al , (1997) Am. J. Path 150’ 823-832)
Na základe úlohy ľudského IL-12 pri rôznych ľudských poruchách, boli navrhnuté terapeutické stratégie tak, aby sa inhibovala a neutralizovala aktivita IL-12. Obzvlášť protilátky, ktoré sa viažu na IL-12, a tak ho neutralizujú, sa považujú za prostriedok inhibujúci aktivitu IL-12. Niektoré z najskorších protilátok boli myšie monoklonálne protilátky (mAb) vylučované hybridómami pripravenými z lymfocytov myší imunizovaných 1L12 (opisuje sa napríklad v prihláške patentu č. WO 97/15327 (Strober et al., v publikácii Neurath et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1281-1290, Duchmann et al., (1996) J. Immunol. 26: 934- 938). Použitie týchto myších protilátok proti IL-12 in vivo je obmedzené problémami spojenými s aplikáciou myších protilátok ľuďom. Tieto problémy zahrnujú krátký polčas rozpadu séra, neschopnosť spustiť isté ľudské efektorové funkce a vyvolanie nežiaducej imunitnej odozvy proti myším protilátkam u ľudí (reakcia „ľudských antimyších protilátok“ (HAMA)),
Vo všeobecnosti úsilie o prekonanie uvedených problémov spojených s použitím plne myších protilátok u ľudí zahrnuje genetickú manipuláciu protilátok, aby boli pre človeka lepšie prijateľné. Napríklad sa pripravili chimérové protilátky, kde sa variabilné oblasti reťazcov protilátok získali z myší a konštantné oblasti reťazcov protilátok sa získali z ľudí (Junghans et al., (1990) Cancer Res. 50: 1495-1502, Brown et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2663-667, Kettleborough et al., (1991) Protein Engineering 4: 773783). Avšak pretože tieto chimérické a humanizované protilátky si stále ponechávajú niektoré myšie sekvencie, môžu stále vyvolať nežiaducu imunitnú reakciu, čo je reakcia človeka proti chimérickým protilátkam (HACA), obzvlášť, keď sa protilátky aplikujú dlhodobo.
Výhodným činidlom inhibujúcim IL-12 v prípade myších protilátok alebo ich derivátov (napríklad chimérické a humanizované protilátky) budú úplne ľudské anti-IL-12 protilátky, pretože také činidlo by nemalo vyvolať reakciu HAMA, dokonca, keď sa používa dlhodobo Také protilátky však neboli zatiaľ v doterajšom stave techniky opísané a preto existuje stále potreba ich vytvoriť.
Podstata vynálezu
Predložený vynález poskytuje ľudské protilátky, ktoré viažu ľudský IL-12. Vynález ďalej opisuje liečbu alebo prevenciu akútnych alebo chronických ochorení alebo stavov, ktorých patológia zahrnuje IL-12, použitím ľudských protilátok proti IL-12 podľa vynálezu.
Podľa jedného aspektu vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá sa viaže na ľudský IL-12.
V jednom uskutočnení vynález poskytuje selektívne mutovanú ľudskú protilátku proti IL-12, ktorá obsahuje:
ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, selektívne mutovanú vo výhodnej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe aminokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu tak, že sa protilátka viaže na ľudský IL-12.
V preferovanom uskutočnení vynález poskytuje selektívne mutovanú ľudskú protilátku proti IL-12 obsahujúcu:
ľudské protilátky alebo jej časť viažucu sa na antigén, selektívne mutovanú vo výhodnej polohe selektívnej mutagenézy aminokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu tak, že sa viaže na ľudský IL-12.
V ďalšom výhodnom uskutočnení, selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 alebo jej časť viažuca sa na antigén je selektívne mutovaná vo viac než jednej preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, kontaktných alebo hypermutačných polohách aminokyselinovým zvyškom, ktorý zosilňuje aktivitu. V inom výhodnom uskutočnení vynálezu je selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 alebo jej časť viažuca sa na antigén selektívne mutovaná v nie viac než v troch preferovaných polohách selektívnej mutagenézy, kontaktných alebo hypermutačných polohách. V inom preferovanom uskutočnení vynálezu selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 alebo jej časť viažuca sa na antigén je selektívne mutovaná v nie viac než vo dvoch preferovaných polohách selektívnej mutagenézy, kontaktných alebo hypermutačných polohách. V ešte v ďalšom preferovanom uskutočnení podľa vynálezu je selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 alebo jej časť viažuca sa na antigén selektívne mutovaná tak, že sa dosiahla úroveň cieľovej špecifickej afinity. Uvedená cieľová úroveň sa zlepšila v porovnaní s dosiahnutou, keď sa pri selekcii protilátok proti rovnakému antigénu použila technológia fágového zobrazenia. V inom preferovanom uskutočnení vynálezu si selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 ďalej ponecháva aspoň jednu požadovanú vlastnosť alebo charakteristiku, napríklad zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo s ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania épitopu, produkciu protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá sa viaže na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12 s rýchlostnou konštantou KOff 0,1 s*1 alebo nižšou, ako sa stanovilo povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo ktorá inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov (test PHA), pričom hodnota IC50 je 1 x 10'6 M alebo nižšia. Výhodnejšie, izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén disociuje z ľudského IL-12 s rýchlostnou konštantou Koff 1 x 10'2 s'1 alebo nižšou, alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, pričom hodnota IC50 je 1 x 10‘7 M alebo nižšia. Výhodnejšie je, keď izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén disociuje z ľudského IL-12 s rýchlostnou konštantou Korr 1 x 10 3 s'1 alebo nižšou alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA s hodnotou IC50 1 x 10‘8 M alebo nižšou. Výhodnejšie, izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén disociuje z ľudského IL-12 s rýchlostnou konštantou KOff 1 x 10‘4 s'1 alebo nižšou alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, s hodnotou IC50 1 x 10'9 M alebo nižšiou. Výhodnejšie, izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén disociuje z ľudského IL-12 s rýchlostnou konštantou KOff 1 x 10's s'1 alebo nižšou alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA s hodnotou IC50 1 x 1O’10 M alebo nižšou. Ešte výhodnejšie, izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén disociuje z ľudského IL-12 s rýchlostnou konštantou Koff 1 x 10'5 s'1 alebo nižšou, alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, s hodnotou IC5o 1 x 10'“ M alebo nižšou.
V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, pričom hodnota IC50 je 1 x 106 M alebo nižšia,
| b) | vykazuje sekvenciu | CDR3 ťažkého SEQ ID NO: 1 a | reťazca | obsahujúcu | aminokyselinovú |
| c) | vykazuje sekvenciu | CDR3 ľahkého SEQ ID NO: 2. | reťazca | obsahujúcu | aminokyselinovú |
| V preferovano | m uskutočnení | vynálezu | izolovaná | ľudská protilátka |
alebo jej časť viažuca antigén vykazuje CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 3 a vykazuje CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 4. V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 5 a vykazuje CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6. V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 7 a vykazuje variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 8.
V inom uskutočnení vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, pričom hodnota IC50 je 1 x 10’9 M alebo nižšia,
b) vykazuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 9 a
c) vykazuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 10.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 11 a vykazuje CDR.2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 12.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 13 a vykazuje CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 14.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 15 a vykazuje variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 16.
V inom uskutočnení vynálezu sa opisuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v iti vitro teste PHA, pričom hodnota IC50 je 1 x 10'9 M alebo nižšia,
b) vykazuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 17 a
c) vykazuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 18.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 19 a vykazuje CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 20.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 21 a vykazuje CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 22.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 23 a vykazuje variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 24.
V preferovanom uskutočnení izolovaná ľudská protilátka obsahuje konštantnú oblasť ťažkého reťazca vybranú zo skupiny zahrnujúcej konštantné oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE alebo ich ľubovoľné alelové varianty, ako sa opisuje v publikácii Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu konštantná oblasť ťažkého reťazca protilátok je IgGl.
V inom preferovanom uskutočnení vynálezu izolovanou ľudskou protilátkou je fragment Fab alebo fragment F(ab')2 alebo fragment jediného reťazca Fv.
V inom uskutočnení vynálezu sa opisuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, pričom hodnota IC50 je 1 x 10'9 M alebo nižšia,
b) vykazuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 404 až 469 a
c) vykazuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 534 až 579.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 335 až 403 a vykazuje CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 506 až 533. V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej SEQ ID NO: 288 až 334 a vykazuje CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 470 až 505 V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 23 a vykazuje variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 24. V preferovanom uskutočnení izolovaná ľudská protilátka obsahuje konštantnú oblasť ťažkého reťazca alebo fragment Fab alebo fragment F(ab')2 alebo fragment jediného reťazca Fv, ako sa opisuje vyššie v texte.
V inom uskutočnení vynálezu sa opisuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, pričom hodnota ICso je 1 x 10'9 M alebo nižšia,
b) vykazuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25 a
c) vykazuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 27 a vykazuje CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje CDRl ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO. 29 a vykazuje CDRl ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 30.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén vykazuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 31 a vykazuje variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 32.
V preferovanom uskutočnení izolovaná ľudská protilátka obsahuje konštantnú oblasť ťažkého reťazca alebo fragment Fab alebo fragment F(ab')2 alebo fragment jediného reťazca Fv, ako sa opisuje vyššie v texte.
V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, pričom hodnota IC50 je 1 x 10'6 M alebo nižšia,
b) obsahuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 1, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 3 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 5 alebo ich mutant, ktorý obsahuje jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v kontaktnej polohe alebo v hypermutačnej polohe, kde hodnota rýchlostnej konštanty kOff uvedeného mutantu nie je vyššia než je desaťnásobok hodnoty pre protilátku obsahujúcu CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 1, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 3 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 5 a
c) obsahuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 4 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6 alebo ich mutant, ktorý obsahuje jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v kontaktnej polohe alebo v hypermutačnej polohe, kde hodnota rýchlostnej konštanty k„ff uvedeného mutantu nie je vyššia než je desaťnásobok hodnoty pre protilátku obsahujúcu CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 4 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6.
V inom uskutočnení vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, pričom hodnota IC50 je 1 x 10‘9 M alebo nižšia,
b) obsahuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 9, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 11 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 13 alebo ich mutant, ktorý obsahuje jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v kontaktnej polohe alebo v hypermutačnej polohe, kde hodnota rýchlostnej konštanty kOff uvedeného mutantu nie je vyššia než je desaťnásobok hodnoty pre protilátku obsahujúcu CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 9, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 11 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 13 a
c) obsahuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 10, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 12 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 14 alebo ich mutant, ktorý obsahuje jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej polohe alebo v hypermutačnej polohe, kde hodnota rýchlostnej konštanty kOff uvedeného mutantu nie je vyššia než je desaťnásobok hodnoty pre protilátku obsahujúcu CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 10, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 12 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 14.
V inom uskutočnení vynálezu sa opisuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, pričom hodnota IC50 je 1 x 10'9 M alebo nižšia.
b) obsahuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 17, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 19 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 21 alebo ich mutant, ktorý obsahuje jednu alebo viac substitúcii aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej polohe alebo v hypermutačnej polohe, kde hodnota rýchlostnej konštanty kOff uvedeného mutantu nie je vyššia než je desaťnásobok hodnoty pre protilátku obsahujúcu CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 17, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 19 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 21 a
c) obsahuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 18, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 20 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 22 alebo ich mutant, ktorý obsahuje jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej polohe alebo v hypermutačnej polohe, kde hodnota rýchlostnej konštanty koff uvedeného mutantu nie je vyššia než je desaťnásobok hodnoty pre protilátku obsahujúcu CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 18, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 20 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 22.
Vynález tiež opisuje molekuly nukleových kyselín kódujúce protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén. Výhodná izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 17. Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 19. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR1 variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 21. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 23. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 18. Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 20. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR1 variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 22. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 24.
V inom uskutočnení vynálezu sa opisuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, pričom hodnota IC50 je 1 x 10*9 M alebo nižšia,
b) obsahuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 27 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 29 alebo ich mutant, ktorý obsahuje jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej polohe alebo v hypermutačnej polohe, kde hodnota rýchlostnej konštanty kOff uvedeného mutantu nie je vyššia než je desaťnásobok hodnoty pre protilátku obsahujúcu CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 27 a CDR1 ťažkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 29 a
c) obsahuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 30 alebo ich mutant, ktorý obsahuje jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej polohe alebo v hypermutačnej polohe, kde hodnota rýchlostnej konštanty kOff uvedeného mutantu nie je vyššia než je desaťnásobok hodnoty pre protilátku obsahujúcu CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 30.
Výhodná izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25. Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 27. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR1 variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 29. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 31. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26. Izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR2 variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje CDR1 variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 30. V inom uskutočnení vynálezu izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO- 32.
V inom aspekte vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) viaže sa na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12, pričom rýchlostná konštanta má hodnotu 0,1 s'1 alebo nižšiu, ako sa stanovilo povrchovou plazmónovou rezonanciou alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov (test PHA), pričom hodnota IC50 je 1 x 10'6 M alebo nižšia,
b) vykazuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú z člena embryonálnej rodiny Vh3, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca vykazuje v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe mutáciu aminokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu.
c) vykazuje variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú z člena embryonálnej rodiny Vxl, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca vykazuje v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe mutáciu aminokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu.
V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) viaže sa na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12, pričom rýchlostná konštanta má hodnotu 0,1 s'1 alebo nižšiu, ako sa stanovilo povrchovou plazmónovou rezonanciou alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov (test PHA), pričom hodnota IC50 je 1 x 10'6 M alebo nižšia,
b) vykazuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 595 až 667, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca vykazuje v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe mutáciu aminokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu.
c) vykazuje variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 669 až 675, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca vykazuje v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe mutáciu aminokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu.
Ďalej vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) viaže sa na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12, pričom rýchlostná konštanta má hodnotu 0,1 s'1 alebo nižšiu, ako sa stanovilo povrchovou plazmónovou rezonanciou alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov (test PHA), pričom hodnota IC50 je 1 x 10‘6 M alebo nižšia,
b) vykazuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu embryonálnu aminokyselinovú sekvenciu COS-3, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca vykazuje v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe mutáciu aminokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu,
c) vykazuje variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu embryonálnu aminokyselinovú sekvenciu DPL8, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca vykazuje v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe mutáciu aminokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu.
Ďalej vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) viaže sa na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12, pričom rýchlostná konštanta má hodnotu 0,1 s'1 alebo nižšiu, ako sa stanovilo povrchovou plazmónovou rezonanciou alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov (test PHA), pričom hodnota IC50 je 1 x 10'6 M alebo nižšia,
b) vykazuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú z člena embryonálnej rodiny Vh3, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca obsahuje CDR2, ktorá je štruktúrou podobná CDR2 z iných členov embryonálnej rodiny Vh3, a CDR1, ktorá je štruktúrou podobná CDR1 z iných členov embryonálnej rodiny Vh3, a kde variabilná oblasť ťažkého reťazca vykazuje v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe mutáciu aminokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu.
c) vykazuje variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú z člena embryonálnej rodiny Vxl, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca obsahuje CDR2, ktorá je štruktúrou podobná CDR2 z iných členov embryonálnej rodiny Vxl, a CDR1, ktorá je štruktúrou podobná CDR1 z iných členov embryonálnej rodiny Vx.1, a kde variabilná oblasť ľahkého reťazca vykazuje v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe mutáciu aminokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén vykazuje mutáciu v CDR3 ťažkého reťazca.
V inom výhodnom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén vykazuje mutáciu v CDR3 ľahkého reťazca
V inom výhodnom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén vykazuje mutáciu v CDR2 ťažkého reťazca. V inom výhodnom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén vykazuje mutáciu v CDR2 ľahkého reťazca. V inom výhodnom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén vykazuje mutáciu v CDR1 ťažkého reťazca. V inom výhodnom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén vykazuje mutáciu v CDRl ľahkého reťazca.
V ďalšom aspekte vynález poskytuje rekombinantné expresívne vektory nesúce nukleové kyseliny kódujúce protilátku podľa vynálezu a ďalej zahŕňa hostiteľské bunky, do ktorých boli také vektory zavedené, a spôsoby prípravy protilátok podľa vynálezu kultiváciou hostiteľských buniek podľa vynálezu.
V ďalšom aspekte vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá neutralizuje aktivitu ľudského IL-12 a aspoň jedného ďalšieho IL-12 primátov vybraného zo skupiny zahrnujúcej IL12 paviána, IL-12 kosmana, IL-12 šimpanza, IL-12 cynomolga a IL-12 makaka, ale ktorá neneutralizuje aktivitu myšieho IL-12.
V ďalšom aspekte vynález poskytuje farmaceutický prostriedok obsahujúci protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén podľa vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič.
V ďalšom aspekte vynález poskytuje prostriedok obsahujúci protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén a ďalšie činidlo, napríklad terapeutické činidlo.
V ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob inhibujúci aktivitu ľudského IL-12, ktorý zahrnuje kontakt ľudského IL-12 s protilátkou podľa vynálezu, napríklad J695, tak, že je inhibovaná aktivita ľudského IL-12.
Ďalej vynález poskytuje spôsob inhibujúci aktivitu ľudského IL-12 v ľudskom subjekte, ktorý trpí poruchou, pri ktorej je aktivita IL-12 škodlivá, a zahrnuje aplikáciu protilátky podľa vynálezu, napríklad J695, ľudskému subjektu tak, že sa v ľudskom subjekte inhibuje aktivita IL-12. Poruchou môže napríklad byť Crohnova choroba, roztrúsená skleróza alebo reumatoidná artritída.
Ďalej vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej antigén, aby sa dosiahla vopred stanovená cieľová aktivita, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy vybranej zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94,
c) individuálne mutácie vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká prvá skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity prvej skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, aby sa stanovilo, či mutácia jednotlivej polohy selektívnej mutagenézy produkuje protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén s vopred stanovenou cieľovou aktivitou alebo čiastočnou cieľovou aktivitou,
e) postupné kombinovanie jednotlivých mutácií, ktoré demonštrovali, že majú zlepšenú aktivitu, vo východiskovej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
f) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich časti viažucej sa na antigén, aby sa stanovilo, či kombinačné protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén majú vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo čiastočnú cieľovú aktivitu,
g) ak výsledkom kroku opísaného v odseku d) alebo f) nie je protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén s vopred stanovenou cieľovou aktivitou alebo protilátka iba s čiastočnou cieľovou aktivitou, ďalšie aminokyselinové zvyšky vybrané zo skupiny zahrnujúcej H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 sú mutované aspoň vo dvoch odlišných aminokyselinových zvyškoch, čím vzniká druhá skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén.
h) hodnotenie aktivity druhej skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, aby sa stanovilo, či mutácia jediného aminokyselinového zvyšku vybraného zo skupiny zahrnujúcej H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 vedie ku vzniku protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén s vopred stanovenou cieľovou aktivitou alebo čiastočnou cieľovou aktivitou,
i) postupné kombinovanie jednotlivých mutácií opísaných v odseku g), ktoré demonštrovali, že majú zlepšenú aktivitu, vo východiskovej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
j) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, aby sa stanovilo, či kombinačné protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén majú vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo čiastočnú cieľovú aktivitu,
k) ak výsledkom kroku opísaného v odseku h) alebo j) nie je protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén s vopred stanovenou cieľovou aktivitou alebo protilátka iba s čiastočnou cieľovou aktivitou, ďalšie aminokyselinové zvyšky vybrané zo skupiny zahrnujúcej H33B, H52B a L31A sú mutované aspoň vo dvoch odlišných aminokyselinových zvyškoch, čím vzniká tretia skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
l) hodnotenie aktivity tretej skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, aby sa stanovilo, či mutácia jediného aminokyselinového zvyšku vybraného zo skupiny zahrnujúcej H33B, H52B a L31A viedla ku vzniku protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén s vopred stanovenou cieľovou aktivitou alebo čiastočnou cieľovou aktivitou,
m) postupné kombinovanie jednotlivých mutácií opísaných v kroku k), ktoré demonštrovali, že majú zlepšenú aktivitu, vo východiskovej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
n) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, aby sa stanovilo, či kombinačné protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén majú vopred stanovenú cieľovú aktivitu, čím sa produkuje protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén s vopred stanovenou cieľovou aktivitou.
V ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,'ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR)
I mutácie, čím sa identifikuje vybraná preferovaná poloha selektívnej mutagenézy, kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva odlišné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,
e) opakovanie krokov b) až d) v prípade aspoň jednej ďalšej kontaktnej a hypermutačnej polohy,
f) postupné kombinovanie jednotlivých mutácií, ktoré demonštrovali, že majú zlepšenú aktivitu, vo východiskovej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich časti viažucej sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vzhľadom k východiskovej protilátke.
V jednom uskutočnení vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie rekombinantnej východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nie je ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, čím sa identifikuje vybraná kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva odlišné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a expresie uvedenej skupiny v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,
e) opakovanie krokov b) až d) v prípade aspoň jedné ďalšej kontaktnej alebo hypermutačnej polohy,
f) postupné kombinovanie jednotlivých mutácií, ktoré demonštrovali, že majú zlepšenú aktivitu, vo východiskovej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich časti viažucej sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou.
V preferovanom uskutočnení sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. V inom výhodnom uskutočnení vynálezu sa hypermutačné polohy vybrali zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu sú zvyšky pre selektívnu mutagenézu vybrané z výhodných polôh selektívnej mutagenézy zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Vo viac preferovanom uskutočnením vynálezu sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny zahrnujúcej L50 a L94.
V ďalšom uskutočnení vynálezu poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie rekombinantnej východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) v prípade mutácie, čím sa identifikuje vybraná kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva odlišné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedenej skupiny vo vhodnom expresívnom systéme,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) hodnotenie aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, kde vlastnosť alebo charakteristika je tá, ktorú je nutné u protilátky zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
V preferovanom uskutočnení vynálezu sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, ktorá je blízka embryonálnej imunoglobulínovej sekvencií. V inom uskutočnení vynálezu sú hypermutačné polohy vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a ďalšia charakteristika sa vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, ktorá je blízka embryonálnej imunoglobulínovej sekvencií. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu sú zvyšky pre selektívnu mutagenézu vybrané z výhodných polôh selektívnej mutagenézy zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a ďalšia charakteristika sa vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny L50 a L94 a ďalšia charakteristika sa vybrala z 1) ochrany proti skríženej reaktivite s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
V inom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie rekombinantnej východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, čím sa identifikuje vybraná výhodná poloha selektívnej mutagenézy, kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva odlišné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedenej skupiny v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) hodnotenie aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, kde vlastnosť alebo charakteristika je tá, ktorú je nutné zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,
f) opakovanie krokov a) až e) v prípade aspoň jednej ďalšej výhodnej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy,
g) kombinovanie vo východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch aminokyselinových zvyškov, ktoré individuálne zvyšujú aktivitu a ktoré ukázali, že majú zlepšenú aktivitu a aspoň jednu zachovanú vlastnosť alebo charakteristiku, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
h) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vzhľadom k východiskovej protilátke.
V preferovanom uskutočnení vynálezu sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, ktorá je blízka embryonálnej imunoglobulínovej sekvencií.
V inom uskutočnení vynálezu sú hypermutačné polohy vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a ďalšia charakteristika sa vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, ktorá je blízka embryonálnej imunoglobulínovej sekvencii. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu sú zvyšky pre selektívnu mutagenézu vybrané z výhodných polôh selektívnej mutagenézy zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a ďalšia charakteristika sa vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, ktorá je blízka embryonálnej imunoglobulínovej sekvencii. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94 a ďalšia charakteristika sa vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, ktorá je blízka embryonálnej imunoglobulínovej sekvencii.
V inom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie rekombinantnej východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, čím sa identifikuje vybraná kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva odlišné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedenej skupiny v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) hodnotenie aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, kde vlastnosť alebo charakteristika je tá, ktorú je nutné zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň s jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
V preferovanom uskutočnení sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu. V ďalšom výhodnom uskutočnení sú hypermutačné polohy vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a ďalšia charakteristika sa vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu sú zvyšky pre selektívnu mutagenézu vybrané z výhodných polôh selektívnej mutagenézy zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p7Op4O/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p7Op4O/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
V ďalšom .uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie rekombinantnej východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, čím sa identifikuje vybraná výhodná poloha selektívnej mutagenézy, kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedenej skupiny v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) hodnotenie aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, kde vlastnosť alebo charakteristika je tá, ktorú je nutné zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,
f) opakovanie krokov a) až e) v prípade aspoň jednej ďalšej výhodnej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy,
g) kombinovanie vo východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch aminokyselinových zvyškov, ktoré individuálne zvyšujú aktivitu a ktoré ukázali, že majú zlepšenú aktivitu a aspoň jednu zachovanú inú charakteristiku, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
h) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým je získavaná protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá vykazuje zlepšenú aktivitu vo vzťahu k východiskovej protilátke.
V preferovanom uskutočnení vynálezu sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu. V inom výhodnom uskutočnení sú hypermutačné polohy vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H3 1B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a ďalšia charakteristika sa vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu. Vo výhodnejšom uskutočnení sú zvyšky pre selektívnu mutagenézu vybrané z výhodných polôh selektívnej mutagenézy zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu. Vo výhodnejšom uskutočnení sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35.
ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
V inom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva odlišné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) hodnotenie zmien aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá vykazuje zlepšenú aktivitu a aspoň jednu zachovanú vlastnosť alebo charakteristiku vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
Ďalšia vlastnosť alebo charakteristika je výhodne vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
V inom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva odlišné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich časti viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) opakovanie krokov b) až d) pre aspoň jednu inú polohu CDR, ktorou nie je ani poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
f) kombinovanie vo východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch aminokyselinových zvyškov, ktoré individuálne zvyšujú aktivitu a ktoré ukázali, že majú zlepšenú aktivitu, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zosilňujúcimi aktivitu vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá vykazuje zlepšenú aktivitu vo vzťahu k východiskovej protilátke.
V ďalšom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie rekombinantnej východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a expresie uvedenej skupiny v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) hodnotenie zmien aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén vykazujúca zlepšenú aktivitu vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
Ďalšia vlastnosť alebo charakteristika je výhodne vybraná zo 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
V inom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementárnu (CDR) pre mutáciu v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a expresie uvedenej skupiny v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) opakovanie krokov b) až d) pre aspoň jednu inú polohu v CDR, ktorou nie je ani poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H3 1, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94,
f) kombinovanie vo východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch aminokyselinových zvyškov, ktoré individuálne zvyšujú aktivitu a ktoré ukázali, že majú zlepšenú aktivitu, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zosilňujúcimi aktivitu vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým je získavaná protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá vykazuje zlepšenú aktivitu vo vzťahu k východiskovej protilátke.
Ďalšia vlastnosť alebo charakteristika je výhodne vybraná zo 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
V inom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H3 1, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95,
Η96, Η97, Η98, Η101, L3O, L31, L32, L34, L5O, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) hodnotenie zmien aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,
f) opakovanie krokov b) až d) pre aspoň jednu inú polohu CDR, ktorou nie je ani poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
g) kombinovanie vo východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch aminokyselinových zvyškov, ktoré individuálne zvyšujú aktivitu a ktoré ukázali, že majú zlepšenú aktivitu, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
h) hodnotenie aktivity a zachovania aspoň jednej inej charakteristiky alebo vlastnosti kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zosilňujúcimi aktivitu vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá vykazuje zlepšenú aktivitu a aspoň jednu zachovanú vlastnosť alebo charakteristiku vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
V ďalšom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia afinity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá bola získaná výberom v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita sa nemôže ďalej zlepšovať mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) hodnotenie zmien aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka so zlepšenou aktivitou vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
V ďalšom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) hodnotenie zmien aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,
f) opakovanie krokov b) až e) pre aspoň jednu inú polohu CDR, ktorou nie je ani poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
g) kombinovanie vo východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch aminokyselinových zvyškov, ktoré individuálne zvyšujú aktivitu a ktoré ukázali, že majú zlepšenú aktivitu, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou a
h) hodnotenie aktivity a zachovania aspoň jednej vlastnosti charakteristiky kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zosilňujúcimi aktivitu vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá vykazuje zlepšenú aktivitu a aspoň jednu zachovanú vlastnosť alebo charakteristiku vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
Ďalšia vlastnosť alebo charakteristika je výhodne vybraná zo 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
V ďalšom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, bez ovplyvnenia iných charakteristík, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čim vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich časti viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čim sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) hodnotenie zmien aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým je získavaná protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén vykazujúca zlepšenú aktivitu a zachovanú inú charakteristiku alebo vlastnosť vo vzťahu k východiskovej protilátke.
V inom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie východiskovej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá bola získaná výberom v systéme fága, ale ktorej aktivita sa nemôže ďalej zlepšovať mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká skupina mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity a zachovania aspoň jednej inej charakteristiky alebo vlastnosti skupiny mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) opakovanie krokov b) až d) pre aspoň jednu inú polohu CDR, ktorou nie je ani poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
f) kombinovanie vo východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch aminokyselinových zvyškov, ktoré individuálne zvyšujú aktivitu a ktoré ukázali, že majú zlepšenú aktivitu a neovplyvňujú aspoň jednu inú charakteristiku alebo vlastnosť, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity a zachovania aspoň jednej inej charakteristiky alebo vlastnosti kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zosilňujúcimi aktivitu vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá vykazuje zlepšenú aktivitu a aspoň jednu zachovanú vlastnosť alebo charakteristiku vo vzťahu k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
Ďalšia vlastnosť alebo charakteristika je výhodne vybraná zo 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70p40/p35, ktorý predchádza ovplyvneniu naviazania voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Aby vynález bol zrozumiteľnejší, sú najskôr definované určité termíny.
Termín „aminokyselinový zvyšok zvyšujúci (zosilňujúci) aktivitu“ zahrnuje aminokyselinový zvyšok, ktorý zlepšuje aktivitu protilátky. Rozumie sa, že aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu môže nahradiť aminokyselinový zvyšok v kontaktnej, hypermutačnej polohe alebo vo výhodnej polohe selektívnej mutagenézy a ďalej v jednej alebo viac CDR môže byť prítomný viac ako jeden aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu. Aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu zahrnuje aminokyselinový zvyšok, ktorý zlepšuje väzbovú špecifitu/afinitu protilátky, napríklad anti-ľudskej IL-12 protilátky viažucej sa na ľudský IL-12. Aminokyselinový zvyšok zosilňujúci aktivitu tiež zahrnuje aminokyselinový zvyšok, ktorý zlepšuje neutralizačnú silu protilátky, napríklad protilátky proti ľudskému IL-12, ktorá inhibuje ľudský IL-12.
Termín „protilátka“ zahrnuje molekulu imunoglobulínu, ktorá obsahuje štyri polypeptidové reťazce, z toho dva ťažké reťazce (H) a dva ľahké reťazce (L), ktoré sú vnútorne spojené disulfidovými mostíkmi. Každý ťažký reťazec obsahuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca (tu je označená skratkou HCVR alebo VH) a konštantnú oblasť ťažkého reťazca. Konštantná oblasť ťažkého reťazca zahrnuje tri domény CHI, CH2 a CH3. Každý ľahký reťazec obsahuje variabilnú oblasť ľahkého reťazca (tu je označená skratkou LCVR alebo VL) a konštantnú oblasť ľahkého reťazca. Konštantná oblasť ľahkého reťazca obsahuje jednu doménu CL. Oblasti VH a VL sa môžu ďalej deliť na hypervariabilné oblasti, ktoré sa nazývajú oblasti určujúce komplementaritu (CDR) a medzi nimi sa nachádzajú viac konzervatívne oblasti, ktoré sa nazývajú úseky základnej štruktúry (FR). Každá VH a VL obsahuje tri CDR a štyri FR usporiadané od N-konca k C-koncu v nasledujúcom poradí: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Termín „časť protilátky viažuca sa na antigén“ (alebo „časť protilátky“) zahrnuje fragmenty protilátky, ktoré si uchovávajú schopnosť špecificky sa viazať na antigén (napríklad hIL-12). Ukázalo sa, že funkcia protilátky viazať sa na antigén, môže byť uskutočnená fragmentárni protilátky plnej dĺžky. Príklady väzbových fragmentov zahrnutých v termíne „časť protilátky viažuca sa na antigén“ obsahujú (i) fragment Fab, čo je monovalentný fragment obsahujúci domény VL, VH, CL a CHI, (ii) fragment F(ab')2, čo je bivalentný fragment obsahujúci dva fragmenty Fab spojené v pántovej oblasti disulfidovým mostíkom, (iii) fragment Fd obsahujúci oblasti VH a CHI, (iv) fragment Fv obsahujúci domény VL a VH jedného ramena protilátky, (v) fragment dAb (opisuje sa v publikácii Ward et al., (1989) Náture 341: 54444
546), ktorý obsahuje oblasť VH a (vi) izolovanú oblasť určujúcu komplementaritu (CDR).
Navyše, hoci dve oblasti fragmentu Fv, VL a VH, sú kódované oddelenými génmi, môžu byť spojené použitím metód rekombinácie syntetickým linkerom, ktorý im umožňuje, aby sa pripravili ako jediný proteínový reťazec, v ktorom sa oblasti VL a VH párujú za vzniku monovalentných molekúl (sú známe ako jediný reťazec Fv (scFv), opisuje sa v publikácii Bird et al., (1988) Science 242: 423-426 a Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Takéjednoreťazcové protilátky sú zahrnuté v pojme „oblasť protilátky viažuca sa na antigén“. Tento termín zahrnuje tiež iné formy jednoreťazcových protilátok, ako sú bivalentné protilátky („diabody“). Ide o bivalentnú, bišpecifickú protilátku, v ktorej sú exprimované oblasti VH a VL na jednom polypeptidovom reťazci, ale použitie linkera, ktorý je príliš krátky, aby umožnil párovanie dvoch domén na rovnakom reťazci, núti domény tvoriť páry s komplementárnymi oblasťami iného reťazca a vznikajú dve väzbové miesta pre antigén (opisuje sa napríklad v publikácii Holliger, P., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 64446448, Poljak, R.J., et al., (1994) Structure 2: 1121-1123). Ďalej protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén môže byť súčasťou väčších imunoadhezívnych molekúl vytvorených kovalentným alebo nekovalentným spojením protilátky alebo časti protilátky s jedným alebo viacerými odlišnými proteínmi alebo peptidmi. Príklady takých imunoadhezívnych molekúl zahrnujú použitie streptavidinovej jadrovej oblasti za vzniku tetramérovej molekuly scFv (opisuje sa v publikácii Kupriyanov, S. M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) a použitie cysteínového zvyšku, markerového peptidu a C-terminálnej polyhistidínovej značky za vzniku bivalentných a biotínom označených molekúl scFv (opisuje sa v publikácii Kipriyanov, S. M. et al., (1994) Mol. Immunol. 3 1: 1047-1056). Časti protilátok, ako sú fragmenty Fab a F(ab')2, sa môžu pripraviť z celých protilátok použitím bežných metód, ako je štiepenie celých protilátok papaínom alebo pepsínom. Navyše, protilátky, časti protilátok a imunoadhezívne molekuly môžu byť získané použitím tu opísaných štandardných metód rekombinácie DNA. Preferované oblasti viažuce sa na antigén sú celé oblasti alebo páry celých oblastí.
Termín „spätná mutácia“ znamená spôsob, v ktorom sú niektoré alebo všetky somaticky mutované aminokyseliny ľudskej protilátky nahradené zodpovedajúcimi embryonálnymi zvyškami z homológnej embryonálnej sekvencie protilátok. Sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca ľudskej protilátky podľa vynálezu sú usporiadané v databáze VBASE oddelene od embryonálnych sekvencií, aby sa identifikovali sekvencie s najvyššou homológiou. Rozdiely v ľudskej protilátke podľa vynálezu je možné vrátiť mutáciou definovaných polôh nukleotidov, ktoré kódujú takú odlišnú aminokyselinu, na embryonálnu sekvenciu. Mala by byť skúmaná úloha každej aminokyseliny, ktorá sa takto identifikovala ako kandidát spätnej mutácie, pri priamej alebo nepriamej úlohe pri naviazaní na antigén. Ľubovoľná aminokyselina, o ktorej sa zistilo, že po mutácii ovplyvňuje ľubovoľnú požadovanú charakteristiku, by nemala byť zahrnutá do konečnej ľudskej protilátky, ako napríklad aminokyseliny zosilňujúce aktivitu identifikované prístupom selektívnej mutagenézy nebudú predmetom spätnej mutácie. Aby sa minimalizoval počet aminokyselín vystavených spätnej mutácii, tie polohy aminokyselín, o ktorých sa zistilo, že sa líšia od najbližšej embryonálnej sekvencie, ale sú zhodné so zodpovedajúcou aminokyselinou v druhej embryonálnej sekvencií, sa môžu zachovať za predpokladu, že druhá embryonálna sekvencia je zhodná a ko-lineárna so sekvenciou ľudskej protilátky podľa vynálezu v prípade aspoň desiatich, výhodne dvanástich aminokyselín na oboch stranách diskutovanej aminokyseliny. Ku spätnej mutácii môže dôjsť v ľubovoľnom štádiu optimalizácie protilátky. Je výhodné, aby ku spätnej mutácii došlo priamo pred alebo po použití prístupu selektívnej mutagenézy. Výhodnejšie je, keď ku spätnej mutácii dôjde priamo pred použitím prístupu selektívnej mutagenézy.
Slovné spojenie „ľudský interleukín 12“ (tu sa skracuje ako hIL-12 alebo IL-12) zahrnuje ľudský cytokín, ktorý je primárne vylučovaný makrofágmi a dendritickými bunkami. Termín zahrnuje heterodimérový proteín obsahujúci podjednotku s molekulovou hmotnosťou 3 5 000 (p35) a podjednotku s molekulovou hmotnosťou 40 000 (p40), ktoré sú navzájom spojené sulfidovým mostíkom. Heterodimérový proteín sa označil ako „podjednotka p70“. Štruktúra ľudského IL-12 je opisovaná ďalej napríklad v publikácii Kobayashi, et al., (1989) J. Exp. Med. 170: 827-845, Seder, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10188-10192, Ling, et al., (1995) J. Exp. Med.154: 116-127, Podlaski, et al., (1992) Árch. Biochem. Biophys. 294: 230-237. Termín ľudský IL-12 zahrnuje rekombinantný ľudský IL-12 (rh IL12), ktorý môže byť pripravený metódami štandardnej rekombinantnej expresie.
Termíny „číslovanie podľa Kabata“, „Kabatove definície“ a „Kabatove značenie“ sa tu môžu zamieňať. Tieto termíny, ktoré sú v odbore známe, znamenajú systém číslovania aminokyselinových zvyškov, ktoré sú viac variabilné (to znamená hypervariabilné) než iné aminokyselinové zvyšky variabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén (opisuje sa v publikácii Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190: 382-391 a Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 - 3242). V prípade variabilnej oblasti ťažkého reťazca hypervariabilná oblasť je v rozmedzí od polohy aminokyseliny 31 do 35 v prípade CDR1, polohy aminokyseliny 50 až 65 v prípade CDR2 a polohy aminokyseliny 95 až 102 v prípade CDR3. V prípade variabilnej oblasti ľahkého reťazca hypervariabilná oblasť je v rozmedzí od polohy aminokyseliny 24 do 34 v prípade CDR1, polohy aminokyseliny 50 až 56 v prípade CDR2 a polohy aminokyseliny 89 až 97 v prípade CDR3.
Číslovanie podľa Kabata sa tu používa s cieľom označenia polôh modifikácií aminokyselín uskutočnených v protilátkach podľa vynálezu. Napríklad protilátka proti IL-12 Y61 môže byť mutovaná v polohe 31 CDRI ťažkého reťazca zo serínu (S) na kyselinu glutamovú (E) (H31S -» E) alebo glycín (G) v polohe 94 CDR3 ľahkého reťazca môže byť mutovaný na tyrozín (Y) (L94G -> Y).
Termín „ľudská protilátka“ zahrnuje protilátku, ktorá má variabilnú a konštantnú oblasť zodpovedajúcu embryonálnym sekvenciám ľudského imunoglobulínu, ako sa opisuje v publikácii Kabat et. al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Ľudské protilátky podľa vynálezu môžu zahrnovať aminokyselinové zvyšky, ktoré nie sú kódované embryonálnymi sekvenciami ľudského imunoglobulínu (napríklad zavedené náhodnou alebo miestne riadenou mutagenézou in vitro alebo somatickou mutáciou in vivo) napríklad v CDR a obzvlášť v CDR3. Mutácie sú výhodne zavedené použitím opísaného „prístupu selektívnej mutagenézy“. Ľudská protilátka môže mať aspoň jednu polohu nahradenú aminokyselinovým zvyškom, napríklad aminokyselinovým zvyškom zosilňujúcim aktivitu, ktorý nie je kódovaný embryonálnou sekvenciou ľudského imunoglobulínu. Ľudská protilátka muže mať až dvadsať polôh nahradených aminokyselinovými zvyškami, ktoré nie sú časťou embryonálnej sekvencie ľudského imunoglobulínu. V inom uskutočnení vynálezu je nahradených až desať, až päť, až tri alebo až dve polohy. V preferovanom uskutočnení vynálezu tieto nahradenia sú v oblastiach CDR, ako sa opisuje detailne ďalej v texte. Avšak tu používaný termín „ľudská protilátka“ nezahrnuje protilátky, v ktorých sekvencie CDR získané z embrya iných cicavčích druhov, ako je myš, boli transplantované do sekvencií základnej ľudskej štruktúry.
Termín „rekombinantná ľudská protilátka“ zahrnuje ľudské protilátky, ktoré sú pripravené, exprimované, vytvorené alebo izolované spôsobmi rekombinácie. Sú to napríklad protilátky exprimované použitím rekombinantného expresívneho vektora transfekovaného do hostiteľskej bunky (opisuje sa ďalej v texte v sekcii II), protilátky izolované z knižnice ľudských rekombinantných, kombinačných protilátok (opisuje sa ďalej v texte v sekcii II), protilátky izolované zo zvieraťa (napríklad myš), ktoré je transgénne v prípade génov ľudského imunoglobulínu (opisuje sa napríklad v publikácii Taylor, L. D. et al., (1992), Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) alebo protilátky pripravené, exprimované, vytvorené alebo izolované ľubovoľnými inými spôsobmi, ktoré zahrnujú zostrih sekvencií génu ľudského imunoglobulínu s inými sekvenciami DNA. Také rekombinantné ľudské protilátky majú variabilné a konštantné oblasti získané z embryonálnych sekvencií ľudského imunoglobulínu (opisuje sa napríklad v publikácii Kabat, E. A. et al., (1991),
Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). V iných uskutočneniach vynálezu však také rekombinantné ľudské protilátky sú predmetom mutagenézy in vitro (alebo v prípade, že je použité zviera transgénne pre sekvencie ľudského lg, ide o somatickú mutagenézu in vivo) a tak aminokyselinové sekvencie oblastí VH a VL rekombinantných protilátok sú sekvencie, ktoré, zatiaľ čo sa získali z ľudských embryonálnych sekvencii VH a VL a sú s nimi príbuzné, nemôžu prirodzene existovať in vivo v súbore ľudských embryonálnych protilátok. V istých uskutočneniach vynálezu sú však také rekombinantné protilátky výsledkom prístupu selektívnej mutagenézy alebo spätnej mutácie alebo oboch prístupov.
Termín „izolovaná protilátka“ zahrnuje protilátku, ktorá v podstate neobsahuje inú protilátku s odlišnými antigénnymi špecifitami (napríklad izolovaná protilátka, ktorá sa špecificky viaže na hIL-12 v podstate neobsahuje protilátky, ktoré sa špecificky viažu na antigény iné než je hlL12). Izolovaná protilátka, ktorá sa špecificky viaže na hIL-12, sa môže viazať na molekuly IL-12 z iných druhov (diskutuje sa detailnejšie ďalej v texte). Izolovaná protilátka môže v podstate byť bez iného bunkového materiálu a/alebo chemikálií.
Termín „neutralizačná protilátka“ (alebo „protilátka, ktorá neutralizovala aktivitu hIL-12“) zahrnuje protilátku, ktorej naviazanie na hlL12 vedie k inhibícii biologickej aktivity hIL-12. Táto inhibícia biologickej aktivity hIL-12 môže byť hodnotená meraním jedného alebo viac indikátorov biologickej aktivity hIL-12, ako je inhibícia proliferácie ľudských fytohemaglutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov (PHA) alebo inhibícia naviazania receptora v teste naviazania receptora ľudského IL-12 (opisuje sa v príklade 3, test indukcie interferónu gama). Tieto indikátory biologickej aktivity hIL-12 sa môžu hodnotiť jedným alebo viac štandardnými testami in vivo alebo in vitro, ktoré sú známe v odbore (opisuje sa v príklade 3).
Termín „aktivita“ zahrnuje aktivity, ako je špecifita/afinita naviazania protilátky na antigén, napríklad protilátky proti hIL-12, ktorá sa viaže na antigén IL-12, a/alebo neutralizačná sila protilátky, napríklad protilátky proti hIL-12, ktorej naviazanie na hIL-12 inhibuje biologickú aktivitu hIL-12, napríklad inhibícia proliferácie blastov PHA alebo inhibícia naviazania receptora v teste naviazania receptora ľudského IL-12 (opisuje sa v príklade
3).
Termín „povrchová plazmónová rezonancia“ zahrnuje optický jav, ktorý umožňuje analýzu biošpecifických interakcii v reálnom čase, detekcií zmien koncentrácií proteínov v biosenzorovej matrici, napríklad použitím systému BIAcore (firma Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Ďalej sa opisuje v príklade 5 a v publikácii Jonsson, U., et al., (1993), Ann. Biol. Clin. 51: 19-26, Jonsson, U., et al., (1991) Biotechniques, 1 1: 620627, Johnsson, B., et al., (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131 a Johnnson, B., et al., (1991) Anál. Biochem. 198: 268-277.
Termín „Koff“ znamená rýchlostnú konštantu pre disociáciu protilátky z komplexu protilátka/antigén.
Termín „Kd“ tu znamená disociačnú konštantu určitej interakcie protilátka-antigén.
Termín „molekula nukleovej kyseliny“ zahrnuje molekuly DNA a RNA. Molekula nukleovej kyseliny môže byť jednoreťazcová alebo dvojreťazcová, ale výhodná je dvojreťazcová DNA.
Termín „molekula izolovanej nukleovej kyseliny“ tu znamená nukleové kyseliny kódujúce protilátky alebo časti protilátok (napríklad VH, VL, CDR3), ktoré sa viažu na hIL-12 (zahrnuté sú „izolované protilátky“) a zahrnuje molekulu nukleovej kyseliny, v ktorej nukleotidové sekvencie kódujúce protilátku alebo jej časť neobsahujú iné nukleotidové sekvencie kódujúce protilátku alebo jej časť, ktorá sa viaže na antigén iný než je hIL-12 a ktorú môžu iné sekvencie prirodzene lemovať v ľudskej genómovej DNA. Tak napríklad izolovaná nukleová kyselina podľa vynálezu kódujúca oblasť VH protilátky anti-IL-12 neobsahuje iné sekvencie kódujúce inú oblasť VH, ktorá sa viaže na iné antigény než je IL-12. Termín „molekula izolovanej nukleovej kyseliny“ tiež zahrnuje sekvencie kódujúce bivalentné, bišpecifické protilátky, ako je „diabody“, v ktorých oblasti VH a VL neobsahujú iné sekvencie než sekvencie bivalentnej bišpecifickej protilátky.
Termín „vektor“ zahrnuje molekulu nukleovej kyseliny schopnú prenášať inú nukleovú kyselinu, na ktorú bol naviazaný. Jedným typom vektora je „plazmid“, ktorý predstavuje slučku kruhovej dvojreťazcovej DNA, do ktorej mohli byť ligované ďalšie segmenty DNA. Iným typom vektoru je vírusový vektor, kde sa do vírusového genómu mohli ligovať ďalšie segmenty DNA. Isté vektory sú schopné autonómnej replikácie v hostiteľskej bunke, do ktorej sú zavedené (napríklad bakteriálne vektory, ktoré majú bakteriálny pôvod replikácie a epizomálne cicavčie vektory). Iné vektory (napríklad neepizomálne cicavčie vektory) sa môžu po zavedení do hostiteľskej bunky začleniť do genómu hostiteľskej bunky a tým sa replikujú spolu hostiteľským genómom. Navyše isté vektory sú schopné riadiť expresiu génov, ktoré sú do nich operatívne naviazané. Také vektory sa nazývajú „rekombinantné expresívne vektory“ (alebo jednoducho „expresívne vektory“). Vo všeobecnom prípade expresívne vektory, ktoré sa využívajú v metódach rekombinácie DNA sú často vo forme plazmidov. V tomto dokumente sa termíny „vektor“ a „plazmid“ môže navzájom zamieňať, pretože plazmid je najbežnejšie používaná forma vektoru. Vynález však tiež zahrnuje iné formy expresívnych vektorov, ako sú vírusové vektory (napríklad retrovírusy s defektnou replikáciou, adenovírusy a adeno-asociované vírusy), ktoré vykazujú ekvivalentné funkcie.
Výraz „rekombinantná hostiteľská bunka“ (alebo jednoducho „hostiteľská bunka“) zahrnuje bunku, do ktorej bol zavedený rekombinantný expresívny vektor. Rozumie sa, že taký termín neznamená iba určitú bunku, ale tiež potomstvo takej bunky. Vzhľadom na to, že sa môžu v nasledujúcich generáciách objaviť určité modifikácie spôsobené buď mutáciami alebo vplyvom prostredia, také potomstvo nemôže byť v skutočnosti identické s rodičovskou bunkou, ale stále sú v rozsahu tu použitého termínu „hostiteľská bunka“.
Tu používaný termín „modifikácia“ znamená zmeny jednej alebo viac aminokyselín v protilátkach alebo v ich častiach viažucich sa na antigén. Ku zmene môže dôjsť pridaním, substitúciou alebo deléciou aminokyseliny v jednej alebo vo viac polohách. Zmena môže byť uskutočnená použitím známych metód, ako je mutagenéza PCR.
Výraz „kontaktná poloha“ zahrnuje polohu aminokyseliny v CDR1, CDR2 alebo CDR3 variabilnej oblasti ťažkého reťazca alebo variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky, ktorá je obsadená aminokyselinou, ktorá je v kontakte s antigénom v jednej z dvadsiatich šiestich známych štruktúr komplexov protilátka-antigén. Ak aminokyselina CDR v ľubovoľnej z 26 známych objasnených štruktúr komplexov protilátka-antigén príde do kontaktu s antigénom, potom táto aminokyselina môže byť považovaná, že obsadila kontaktnú polohu. Kontaktné polohy vykazujú vyššiu pravdepodobnosť byť obsadené aminokyselinou, ktorá príde do kontaktu s antigénom, než polohy, ktoré nie sú kontaktné. Kontaktná poloha je výhodne poloha CDR, ktorá obsahuje aminokyselinu, ktorá príde do kontaktu s antigénom vo viac než 3 z 26 štruktúr (> 11,5 %). Najvýhodnejšie je, keď kontaktná poloha je poloha CDR, ktorá obsahuje aminokyselinu, ktorá príde do kontaktu s antigénom vo viac než 8 z 25 štruktúr (> 32 %).
Termín „hypermutačná poloha“ zahrnuje aminokyselinový zvyšok, ktorý obsadzuje polohu v oblasti CDR1, CDR2 alebo CDR3 variabilnej oblasti ťažkého alebo ľahkého reťazca protilátky, o ktorej sa uvažuje, že má vysokú frekvenciu alebo pravdepodobnosť somatickej hypermutácie počas afinitnej maturácie protilátky in vivo. Termín „vysoká frekvencia alebo pravdepodobnosť somatickej hypermutácie“ zahrnuje frekvenciu alebo pravdepodobnosť 5 až približne 40 %-nej šance, že zvyšok sa podrobí somatickej hypermutácii počas afinitnej maturácie protilátky in vivo. Rozumie sa, že všetky rozmedzia v tomto danom rozmedzí sú súčasťou vynálezu, napríklad 5 až približne 30 %, napríklad 5 až približne 15 %, napríklad 15 až približne 30 %.
Termín „výhodná (preferovaná) poloha selektívnej mutagenézy“ zahrnuje aminokyselinový zvyšok, ktorý obsadzuje polohu v oblasti CDR1, CDR2 alebo CDR3 variabilnej oblasti ťažkého alebo ľahkého reťazca, ktorú je možné považovať za kontaktnú alebo hypermutačnú polohu.
Výraz „prístup selektívnej mutagenézy“ zahrnuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky selekciou a individuálnou mutáciou aminokyselín CDR v aspoň jednej výhodnej polohe selektívnej mutagenézy, hypermutačnej a/alebo kontaktnej polohe. Termín „selektívne mutovaná“ ľudská protilátka je protilátka, ktorá obsahuje mutáciu v polohe vybranej použitím prístupu selektívnej mutagenézy. V inom uskutočnení podľa vynálezu prístup selektívnej mutagenézy poskytuje spôsob prednostne mutujúci vybrané jednotlivé aminokyselinové zvyšky v CDR1, CDR2 alebo CDR3 variabilnej oblasti ťažkého reťazca (ďalej v texte Hl, H2 respektíve H3) alebo CDR1, CDR2 alebo CDR3 variabilnej oblasti ľahkého reťazca (ďalej v texte sa označuje ako Ll, L2 respektíve L3) protilátky. Aminokyselinové zvyšky môžu byť vybrané z výhodných polôh selektívnej mutagenézy, kontaktných polôh alebo hypermutačných polôh. Jednotlivé aminokyseliny sa vybrali na základe ich polohy vo variabilnej oblasti ťažkého alebo ľahkého reťazca. Rozumie sa, že hypermutačná poloha môže byť tiež kontaktná poloha. V uskutočnení vynálezu prístup selektívnej mutagenézy je „cielený prístup“. Termín „cielený prístup“ zahrnuje spôsob výhodného mutovania vybraných jednotlivých aminokyselinových zvyškov v CDR1, CDR2 alebo CDR3 variabilnej oblasti ťažkého reťazca alebo CDR1, CDR2 alebo CDR3 variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky v cielenom spôsobe, napríklad „prístup cielený do skupín“ alebo „prístup cielený do CDR“. V „prístupe cielenom do skupín“ sú cielené jednotlivé aminokyselinové zvyšky v určitých skupinách na základe selektívnych mutácií, pričom tieto skupiny zahrnujú skupiny I (zahrnujúce L3 a H3), II (zahrnujúce H2 a Ll) a III (zahrnujúce L2 a Hl) a sú uvedené v poradí zodpovedajúcom preferencii pre cielenie. V „prístupe cielenom do CDR“ jednotlivé aminokyselinové zvyšky v určitých CDR sú cielené na základe selektívnych mutácií v poradí podľa preferencie cielenia, ktoré je nasledujúce: H3, L3, H2, Ll, Hl a L2. Vybraný aminokyselinový zvyšok je mutovaný, napríklad aspoň na dva iné aminokyselinové zvyšky, a je stanovený účinok mutácie na aktivitu protilátky. Aktivita je meraná ako zmena vo väzbovej špecifite/afinite a/alebo neutralizačná sila protilátky. Rozumie sa, že prístup selektívnej mutagenézy môže byť používaný pri optimalizácii ľubovoľnej protilátky získanej z ľubovoľného zdroja, ktorý zahrnuje fágové zobrazenie, transgénne zvieratá s embryonálnymi génmi ľudského IgG, ľudské protilátky izolované z ľudských buniek B. Výhodne je prístup selektívnej mutagenézy využívaný na protilátkach, ktoré nemôžu byť optimalizované ďalším použitím fágovej zobrazovacej technológie. Rozumie sa, že protilátky z ľubovoľného zdroja zahrnujúceho fágové zobrazenie, transgénne zvieratá s embryonálnymi génmi ľudského IgG, ľudské protilátky izolované z ľudských buniek B môžu byť subjektom spätnej mutácie pred alebo po prístupe selektívnej mutagenézy.
Termín „aminokyselinový zvyšok zvyšujúci, resp. zosilňujúci aktivitu“ zahrnuje aminokyselinový zvyšok, ktorý zlepšuje aktivitu protilátky. Rozumie sa, že aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu môže nahradiť aminokyselinový zvyšok vo výhodnej polohe selektívnej mutagenézy, kontaktnej polohe alebo hypermutačnej polohe a ďalej v jednej alebo viac CDR môže byť prítomný viac ako jeden zvyšok zvyšujúci aktivitu. Aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu zahrnuje aminokyselinový zvyšok, ktorý zlepšuje väzbovú špecifitu/afinitu protilátky, napríklad protilátky proti ľudskému IL-12 viažucu sa na IL-12. Aminokyselinový zvyšok zosilňujúci aktivitu tiež zahrnuje aminokyselinový zvyšok, ktorý zlepšuje neutralizačnú silu protilátky, napríklad protilátky proti ľudskému IL12, ktorá inhibuje ľudský IL-12.
Rôzne aspekty vynálezu sú detailnejšie opísané v nasledujúcich sekciách.
I. Ľudské protilátky, ktoré sa viažu na ľudský IL-12
Tento vynález poskytuje izolované ľudské protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén, ktoré sa viažu na ľudský IL-12. Výhodne ľudské protilátky podľa vynálezu sú rekombinantné ľudské protilátky neutralizujúce hIL-12. Protilátky podľa vynálezu, ktoré sa viažu na ľudský IL-12 môžu byť vybrané napríklad testovaním jednej alebo viac ľudských knižníc cDNA VL a Vn shIL-12, ako sú techniky zobrazujúce fága opísané v príklade 1. Testovanie knižníc ľudskej cDNA VL a Vn z počiatku identifikovalo série protilátok proti IL-12, z ktorých sa pre ďalší vývoj vybrala jedna protilátka nazvaná „Joe 9“ (alebo „Joe 9 divokého typu“). Joe 9 je protilátka proti ľudskému IL-12 s relatívne nízkou afinitou (napríklad hodnota Koff je približne 0,1 s'1), predsa však je použiteľná pri špecifickom naviazaní a detekcii hIL-12. Afinita protilátky Joe 9 sa zlepšila uskutočnením mutagenézy oblastí CDR ťažkého a ľahkého reťazca, pričom sa produkuje súbor variabilných oblastí ľahkého a ťažkého reťazca, ktoré sa „miešali a párovali“ a ďalej mutovali, čo vedie k radu ďalších protilátok proti hIL-12 so zvýšenou afinitou pre hIL-12 (opisuje sa v príklade 1, tabuľka 2 (doplnok A) a usporiadanie sekvencie na obrázku IA až D).
Z týchto protilátok ľudská protilátka proti hIL-12 označená ako Y61 demonštrovala podstatné zlepšenie väzbovej afinity (napríklad, hodnota Koft je približne 2 x 104 s'1). Protilátka Y61 proti hIL-12 sa vybrala pre ďalšiu afinitnú maturáciu uskutočnenú individuálnou mutáciou špecifických aminokyselinových zvyškov v oblastiach CDR ťažkého a ľahkého reťazca. Aminokyselinové zvyšky protilátky Y61 sa vybrali pre miestne špecifickú mutáciu (prístup selektívnej mutácie) založenú na aminokyselinovom zvyšku, ktorý zaberá preferovanú polohu selektívnej mutagenézy, kontaktnú a/alebo hypermutačnú polohu. Zhrnutie substitúcií vo vybraných polohách v oblastiach CDR ťažkého a ľahkého reťazca je zobrazené na obrázku 2A až 2H. Preferovaná rekombinantná neutralizačná protilátka podľa vynálezu, tu uvedená ako J695, je výsledkom substitúcie z Gly na Tyr v polohe 50 CDR2 ľahkého reťazca protilátky Y61 a substitúcie Gly na Tyr v polohe 94 CDR3 ľahkého reťazca protilátky Y61.
Usporiadania aminokyselinovej sekvencie variabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca súboru protilátok proti IL-12 podľa vynálezu pri vývoji protilátky Joe 9 divokého typu až na J695 sú zobrazené na obrázkoch č IA až ID. Tieto usporiadania sekvencií umožnili identifikáciu konvenčných sekvencií preferovanej variabilnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca protilátok podľa vynálezu, ktoré sa viažu na hIL-12, rovnako ako konvenčných sekvencií CDR3, CDR2 a CDR1, pri vývoji od protilátky Joe 9 až na J695. Okrem toho analýza mutagenézy protilátky Y61 zhrnutá na obrázkoch č. 2A až 2H umožnila identifikáciu konvenčných sekvencií variabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca, ktoré sa viažu na hIL-12, rovnako ako konvenčných sekvencií CDR3, CDR2 a CDR1, ktoré viažu hlL12, pri vývoji z Y61 na J695, ktoré obsahujú modifikované sekvencie protilátky Y61 a ešte si zachovávajú dobré väzbové charakteristiky pre hlL12. Preferované sekvencie CDR, VH a VL podľa vynálezu (zahrnujúce konvenčné sekvencie) ako sa identifikovalo sekvenčnými identifikátormi v priloženom zozname sekvencií, sú zhrnuté ďalej v texte.
| SEQ ID NO: | Reťazec protilátky | Oblasť | sekvencia |
| 1 | Konvenčný Joe 9 na J695 | CDR H3 | (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y) |
| 2 | Konvenčný Joe 9 až J695 | CDR L3 | Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)- (L/F/T/S)-(R/S/T/w/H)-(G/P)- (S/T/A/L)-(R/S/M/T/L)- (V/I/T/M/L) |
| 3 | Konvenčný Joe 9 na J695 | CDR H2 | F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V- K-G |
| 4 | Konvenčný Joe 9 na J695 | CDR L2 | (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S |
| 5 | Konvenčný Joe 9 na J695 | CDR Hl | F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H |
| 6 | Konvenčný Joe 9 na J695 | CDR L1 | (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)- (S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H) |
| 7 | Konvenčný Joe 9 na J695 | VH | (celá sekvencia VH, uvedené v zozname sekvencií) |
| 8 | Konvenčný Joe 9 na J695 | VL | (celá sekvencia VL, uvedené v zozname sekvencií) |
| 9 | Konvenčný Y61 na J695 | CDR H3 | H-(G/V/C/H)-(S/T)-(H/T/V/R/I)- (D/S)-(N/K/A/T/S/F/W/H) |
| 10 | Konvenčný Y61 na J695 | CDR L3 | Q-S-Y-(D/S)-(Xaa)- (G/D/Q/L/F/R/H/N/Y)-T-H-P-A-L- L |
| 11 | Konvenčný Y61 na J695 | CDR H2 | (F/T/Y)-1-(R/A)-Y-(D/S/E/A)- (G/R)-S-(Xaa)-K-(Y/E)-Y-A-D-S- V-K-G |
| 12 | Konvenčný Y61 na J695 | CDR L2 | (G/Y/S/T/N/Q)-N-D-Q-R-P-S |
| 13 | Konvenčný Y61 na J695 | CDR Hl | F-T-F-(Xaa)-(Xaa)-(Y/H)- (G/M/A/N/S)-M-H |
| 14 | Konvenčný Y61 na J695 | CDR L1 | S-G-G-R-S-N-I-G-(S/C/R/N/D/T)- (N/M/1)-(T/Y/D/H/K/P)-V-K |
| 15 | Konvenčný Y61 na J695 | VH | (celá sekvencia VH, uvedené v zozname sekvencií) |
| 16 | Konvenčný Y61 na J695 | VL | (celá sekvencia VL, uvedené v zozname sekvencií) |
| 17 | Y61 | CDR H3 | H-G-S-H-D-A |
| 18 | Y61 | CDR L3 | Q-S-Y-D-R-G-T-H-P-A-L-L |
| 19 | Y61 | CDR H2 | F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V- K-G |
| 20 | Y61 | CDR L2 | G-N-D-Q-R-P-S |
| 21 | Y61 | CDR Hl | F-T-F-S-S-Y-G-M-H |
| 22 | Y61 | CDR L1 | S-G-G-R-S-N-l-G-S-N-T-V-K |
| 23 | Y61 | VH | (celá sekvencia VH, uvedené v zozname sekvencií) |
| 24 | Y61 | VL | celá sekvencia VL, uvedené v zozname sekvencií) |
| 25 | J695 | CDR H3 | H-G-S-H-D-A |
| 26 | J695 | CDR 13 | Q-S-Y-D-R-Y-T-H-P-A-L-L |
| 27 | J695 | CDR H2 | F-I-R-Y-D-G-S-A-K-Y-Y-A-D-S-V- K-G |
| 28 | J695 | CDR L2 | Y-N-D-Q-R-P-S |
| 29 | J695 | CDR Hl | F-T-F-S-S-Y-G-M-H |
| 30 | J695 | CDR L1 | S-G-S-R-S-N-I-G-S-A-T-V-K |
| 31 | J695 | VH | (celá sekvencia VH, uvedené v zozname sekvencií) |
| 32 | J695 | VL | (celá sekvencia VL, uvedené v zozname sekvencií) |
Protilátky produkované afinitnou maturáciou protilátky Joe 9 divokého typu boli funkčne charakterizované povrchovou plazmónovou rezonanciou, aby sa stanovila hodnota Kd a KOff. Produkovala sa séria protilátok, ktoré vykazujú hodnotu Koff v rozmedzí približne 0,1 s'1 až približne 1 x 10'5 s'1 a výhodnejšie hodnota Koff je približne 1 x 10'4 s-1 až 1 x 10'5 s-1 alebo menej. U protilátok sa tiež in vitro charakterizovala schopnosť inhibovať proliferáciu fytohemaglutinínových blastov (PHA), ako sa opisuje v príklade 3.
Produkovali sa série protilátok, ktorých hodnota IC50 je v rozmedzí približne 1 x 10’6 M až približne 1 x 10'11 M, výhodnejšie je približne 1 x 1O'10 M až 1 x 10'11 M alebo menej.
Vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa antigén, ktorá sa viaže na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12 pri hodnote rýchlostnej konštanty KOff 0,1 s'1 alebo menšej, ako sa stanovilo povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo ktorá inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov (test PHA) in vitro s hodnotou IC50 je 1 x 10'6 M alebo menej. V preferovaných uskutočneniach podľa vynálezu izolovaná protilátka proti ľudskému IL-12 alebo jej časť viažuca sa antigén disociuje z ľudského IL-12 pri hodnote rýchlostnej konštanty K„ff 1 x 10'2 s'1 alebo menšej alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'7 alebo menej. Vo viac preferovanom uskutočnení izolovaná protilátka proti IL-12 alebo jej časť viažuca sa na antigén disociuje z ľudského IL-12 pri hodnote rýchlostnej konštanty Κοη· 1 x 10‘3 s'1 alebo menšej alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'8 alebo menšou Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu izolovaná protilátka proti ľudskému IL-12 alebo jej časť viažuca sa antigén disociuje z ľudského IL-12 pri hodnote rýchlostnej konštanty Koff 1 x 10'4 s’1 alebo menšej alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'9 alebo menšou. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu izolovaná protilátka proti ľudskému IL-12 alebo jej časť viažuca sa antigén disociuje z ľudského IL-12 pri hodnote rýchlostnej konštanty KOfť 1 x 10'5 s'1 alebo menšej alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 1O'10 alebo menšou. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu izolovaná protilátka proti ľudskému IL-12 alebo jej časť viažuca sa antigén disociuje z ľudského IL-12 pri hodnote rýchlostnej konštanty Κοπ- 1 x 10‘5 s'1 alebo menšej alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'11 alebo menej.
Rýchlostná konštanta disociácie (KOff) protilátky proti IL-12 môže byť stanovená povrchovou plazmónovou rezonanciou (opisuje sa v príklade 5). Vo všeobecnom prípade analýza povrchovou plazmónovou rezonanciou meria väzbové interakcie v reálnom čase medzi ligandom (rekombinantný ľudský IL-12 imobilizovaný na matrici biosenzoru) a analytom (protilátka v roztoku) povrchovou plazmónovou rezonanciou (SPR) použitím systému BIAcore (firma Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Povrchová plazmonová analýza môže byť tiež uskutočnená imobilizáciou analytu (protilátka na matrici biosenzora) a prítomnosťou ligandu (rekombinantný IL-12 v roztoku). Neutralizačná aktivita protilátok IL-12 alebo ich častí viažucich sa na antigén môže byť hodnotená použitím jedného alebo viac z niekoľkých vhodných testov in vitro (opisuje sa v príklade 3).
Je dobre známe v odbore, že oblasti CDR ťažkého a ľahkého reťazca protilátok zohrávajú dôležitú úlohu pri väzbovej špecifite/afinite protilátky pre antigén. Preto vynález zahrnuje ľudské protilátky, ktoré vykazujú oblasti CDR ľahkého a ťažkého reťazca protilátky Joe 9, rovnako ako protilátky majúce oblasti CDR, ktoré boli modifikované s cieľom zlepšenia väzbovej špecifity/afinity protilátky. Ako sa opisuje v príklade 1, série modifikácií CDR ľahkého a ťažkého reťazca vedie k afinitnej maturácii ľudských protilátok proti hIL-12. Usporiadanie aminokyselinovej sekvencie variabilnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca sérií ľudských protilátok vyskytujúcich sa pri vývoji od protilátky Joe 9 divokého typu na J695, ktoré sa viažu na ľudský IL-12, sú zobrazené na obrázkoch IA až ID. Motívy konvenčnej sekvencie v prípade CDR protilátok môžu byť stanovené z usporiadania sekvencie (ako je zhrnuté v tabuľke vyššie v texte). Napríklad konvenčný motív v prípade VH CDR3 pri vývoji od protilátky Joe 9 až na J695 obsahuje aminokyselinovú sekvenciu: (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y) (SEQ ID NO: 1), ktorá zahrnuje aminokyseliny z polohy 95 až 102 konvenčnej HCVR zobrazenej v SEQ ID NO: 7. Konvenčný motív v prípade VL CDR3 obsahuje aminokyselinovú sekvenciu: Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)-(L/F/T/S)-(R/S/T/W/H)-(G/P)(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L-V/I/T/M/L) (SEQ ID NO: 2), ktorá obsahuje aminokyseliny od polohy 89 do 97 konvenčnej LCVR zobrazenej v SEQ ID NO: 8.
Teda v ďalšom aspekte vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10’6 alebo nižšou,
b) má CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 1 a
c) má CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2.
V preferovanom uskutočnení protilátka ďalej obsahuje VH CDR2 zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-KG (SEQ ID NO: 3) (ktorá obsahuje aminokyseliny od polohy 50 do 65 konvenčnej HCVR zahrnujúcej aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 7) a ďalej obsahuje VL CDR2 zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu (G/Y)-N(D/S)-(Q/N)-R-P-S (SEQ ID NO: 4) (ktorá obsahuje aminokyseliny od polohy 50 do 56 konvenčnej LCVR zahrnujúcej aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO. 8).
V inom preferovanom uskutočnení protilátka ďalej obsahuje VH CDR1 zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H (SEQ ID NO: 5) (ktorá obsahuje aminokyseliny od polohy 27 do 35 konvenčnej HCVR obsahujúcej aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 7) a ďalej obsahuje VL CDR1 zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I(G/V)-(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H) (SEQ ID NO: 6) (ktorá obsahuje aminokyseliny od polohy 24 do polohy 34 konvenčnej LCVR obsahujúcej aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 8).
V ešte inom výhodnom uskutočnení protilátka podľa vynálezu obsahuje HCVR zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 7 a LCVR obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 8.
Ďalšie konvenčné motívy môžu byť stanovené na základe mutačnej analýzy uskutočnenej v prípade protilátky Y61, ktorá vedie k protilátke J695 (zhrnuté na obrázkoch 2A až 2H) Ako zobrazovali grafy uvedené na obrázkoch 2A až 2H), isté zvyšky oblastí CDR ľahkého a ťažkého reťazca protilátky Y61 boli podrobené substitúcii, bez toho, aby sa podstatne zhoršili väzbové vlastnosti protilátky na hIL-12. Jednotlivé substitúcie v polohe 30 v CDR Hl s dvanástimi rôznymi aminokyselinovými zvyškami napríklad podstatne neredukujú hodnotu rýchlostnej konštanty disociácie Koff protilátky, čo ukazuje, že táto poloha nepodlieha substitúcii rôznymi aminokyselinovými zvyškami. Potom na základe mutačnej analýzy (to znamená polohy v protilátke Y61, ktorá bola podrobená substitúcii inými aminokyselinovými zvyškami) boli stanovené konvenčné motívy. Konvenčné motívy v prípade CDR3 ťažkého a ľahkého reťazca sú zobrazené v SEQ ID NO: 9 a 10, v prípade CDR2 ťažkého a ľahkého reťazca sú uvedené v SEQ ID NO: 11 respektíve 12 a konvenčné motívy CDRI ťažkého a ľahkého reťazca sú zobrazené v SEQ ID NO: 13 respektíve 14. Konvenčné motívy v prípade oblastí VH a VL sú zobrazené v SEQ ID NO: 15 respektíve 16.
Obdobne v ďalšom aspekte vynálezu sa charakterizuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'9 alebo nižšou,
b) má CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 9 a
c) má CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 10.
V preferovanom uskutočnení protilátka ďalej obsahuje VH CDR2 zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 11 a ďalej obsahuje VL CDR2 zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 12.
V inom výhodnom uskutočnení protilátka ďalej obsahuje VH CDRI zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 13 a ďalej obsahuje VL CDRI zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 14.
V ešte inom výhodnom uskutočnení protilátka ďalej obsahuje HCVR zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 15 a ďalej obsahuje LCVR zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO. 16.
Preferovaná protilátka podľa vynálezu, ktorou je ľudská protilátka proti hIL-12 Y61, bola produkovaná afinitnou maturáciou protilátky Joe 9 divokého typu mutagenézou CDR3 (ako sa opisuje v príklade 3). Protilátka Y61 mala zlepšenú špecifitu/väzbovú afinitu, čo sa stanovilo povrchovou plazmónovou rezonanciou a neutralizačnými testami in vitro. CDR3 ťažkého a ľahkého reťazca protilátky Y61 sú zobrazené v SEQ ID NO: 17 respektíve 18, CDR2 ťažkého a ľahkého reťazca protilátky Y61 sú zobrazené v SEQ ID NO: 19 respektíve 20 a CDR1 ťažkého a ľahkého reťazca protilátky Y61 sú zobrazené v SEQ ID NO: 21 respektíve 22. VH protilátky Y61 má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 23 a VL protilátky Y61 má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 24 (tieto sekvencie sú tiež zobrazené na obrázkoch 1A až ID v porovnaní s protilátkou Joe 9).
Obdobne v ďalšom aspekte vynálezu sa charakterizuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou ICso 1 x 109 alebo nižšou,
b) má CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 17 a
c) má CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 18.
V preferovanom uskutočnení izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén má CDR2 ťažkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 19 a CDR2 ľahkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 20.
V inom výhodnom uskutočnení izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén má CDR1 ťažkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 21 a CDR1 ľahkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 22.
V ešte inom výhodnom uskutočnení izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén obsahuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ IĎ NO: 23 a variabilnú oblasť ľahkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 24.
V istých uskutočneniach vynálezu protilátka plnej dĺžky obsahuje kontaktnú oblasť ťažkého reťazca, ako sú konštantné oblasti IgGl, IgG2, lgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE, a ľubovoľný allotypický variant ako je opísaný v publikácii Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Konštantná oblasť ťažkého reťazca protilátky je výhodne konštantná oblasť ťažkého reťazca IgGl. V inom prípade časťou protilátky môže byť fragment Fab, fragment F(ab'2) alebo jednoreťazcový fragment Fv.
Modifikácie jednotlivých zvyškov protilátky Y61 vedú k produkcii súboru protilátok zobrazených na obrázkoch 2A až 2H. Špecifita/väzbová afinita každej protilátky sa stanovila povrchovou plazmónovou rezonanciou a/alebo neutralizačnými testami /// vilro.
Obdobne v ďalšom aspekte vynálezu sa charakterizuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'9 alebo nižšou,
b) má CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 404 až SEQ ID NO: 469 a
c) má CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 534 až SEQ ID NO: 579.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén ďalej obsahuje aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej SEQ ID NO: 335 až SEQ ID NO: 403 a ďalej obsahuje CDR2 ľahkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 506 až SEQ ID NO: 533.
V inom výhodnom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej Časť viažuca sa na antigén ďalej obsahuje CDRl ťažkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej SEQ ID NO: 288 až SEQ ID NO: 334 a ďalej obsahuje CDRl ľahkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 470 až SEQ ID NO: 505.
V ešte inom výhodnom uskutočnení izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén obsahuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 23 a variabilnú oblasť ľahkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 24.
V istých uskutočneniach vynálezu protilátka plnej dĺžky obsahuje konštantnú oblasť ťažkého reťazca, ako sú konštantné oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE, a ľubovoľný allotypický variant ako sa opisuje v publikácii Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Konštantná oblasť ťažkého reťazca protilátky je výhodne konštantná oblasť ťažkého reťazca IgGl. V inom prípade časťou protilátky môže byť fragment Fab, fragment F(ab’2) alebo jednoreťazcový fragment Fv.
Obzvlášť výhodná rekombinantná neutralizačná protilátka J695 podľa vynálezu bola produkovaná miestne riadenou mutagenézou kontaktných a hypermutačných aminokyselinových zvyškov protilátky Y61 (opisuje sa v príklade 2 v sekcii III ďalej v texte). Protilátka J695 sa líši od protilátky Y61 substitúciou Gly za Tyr v polohe 50 CDR2 ľahkého reťazca protilátky Y61 a substitúciou Gly za Tyr v polohe 94 ľahkého reťazca CDR3. CDR3 ťažkého a ľahkého reťazca protilátky J695 sú zobrazené v SEQ ID NO: 25 respektíve 26, CDR2 ťažkého a ľahkého reťazca protilátky J695 sú zobrazené v SEQ ID NO: 27 respektíve 28 a CDR1 ťažkého a ľahkého reťazca CDR1 protilátky J695 sú zobrazené v SEQ ID NO: 29 respektíve 30. VH protilátky J695 má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 31 a VL protilátky J695 má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 32 (tieto sekvencie sú tiež zobrazené na obrázkoch 1A až ID v porovnaní s protilátkou Joe 9)
Teda v ďalšom aspekte vynálezu sa charakterizuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vilro s hodnotou ICso 1 x 10’9 alebo nižšou,
b) má CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25 a
c) má CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén má CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 27 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28.
V inom výhodnom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén ďalej obsahuje CDR1 ťažkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 29 a ďalej obsahuje CDR1 ľahkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 30
Ešte v inom výhodnom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa antigén obsahuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 31 a variabilnú oblasť ľahkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 32
V istých uskutočneniach vynálezu protilátka plnej dĺžky obsahuje konštantnú oblasť ťažkého reťazca, ako sú konštantné oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE, a ľubovoľný allotypický variant ako sa opisuje v publikácii Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Konštantná oblasť ťažkého reťazca protilátky je výhodne konštantná oblasť ťažkého reťazca IgGl. V inom prípade časťou protilátky môže byť fragment Fab, fragment F(ab'2)alebo jednoreťazcový fragment Fv.
Môžu byť uskutočnené ďalšie mutácie vo výhodných konvenčných sekvenciách CDR3, CDR2 a CDR1 protilátok vo vývoji z protilátky Joe 9 na J695 alebo z protilátky Y61 na J695 za vzniku ďalších protilátok proti IL-12 podľa vynálezu. Také metódy úpravy môžu byť uskutočnené použitím štandardných postupov v molekulárnej biológii, ako je mutagenéza PCR, cielenie jednotlivých kontaktných alebo hypermutačných aminokyselinových zvyškov v CDR ľahkého a/alebo ťažkého reťazca. Ďalej nasleduje kinetická a funkčná analýza upravených protilátok, ako sa opisuje v texte (napríklad neutralizačné testy opísané v príklade 3 a analýza BIAcore, ako sa opisuje v príklade 5).
Obdobne v ďalšom aspekte vynálezu sa charakterizuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa antigén, ktorá:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'6 M alebo nižšou,
b) zahrnuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 1 a CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 3 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 5, alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy alebo v hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty disociácie vyššiu než je desaťnásobok hodnoty v prípade protilátky zahrnujúcej CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 1 a CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 3 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 5 a
c) zahrnuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO 4 a CDRI ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6, alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy alebo v hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty disociácie vyššiu než je desaťnásobok hodnoty v prípade protilátky obsahujúcej CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 4 a CDRI ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6.
Obdobne v ďalšom aspekte vynálezu sa charakterizuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa antigén, ktorá:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'9 M alebo nižšou,
b) obsahuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 9 a CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 11 a CDRI ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 13 alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej polohe alebo v hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty disociácie vyššiu než je desaťnásobok hodnoty v prípade protilátky obsahujúcej CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 9 a CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ 1D
NO: 11 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 13 a
c) obsahuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 10 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 12 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 14, alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej polohe alebo v hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty disociácie vyššiu než je desaťnásobok hodnoty v prípade protilátky obsahujúcej CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 10 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 12 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 14.
Pre odborníka je výhodné, že ďalšie mutácie v oblastiach CDR protilátky podľa vynálezu, napríklad u protilátky Y61 alebo J695, môžu byť uskutočnené za vzniku ďalších protilátok proti IL-12 podľa vynálezu. Také modifikačné metódy môžu byť uskutočnené použitím štandardných postupov molekulárnej biológie, ako sa opisuje vyššie v texte. Funkčná a kinetická analýza upravených protilátok môže byť uskutočnená podľa opisu v príklade 3 respektíve 5. Úpravy jednotlivých zvyškov protilátky Y61, ktoré vedú k identifikácii protilátky J695, sú zobrazené na obrázkoch 2A až 2H a sú opísané v príklade 2.
Teda v ďalšom uskutočnení vynálezu sa charakterizuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa antigén, ktorá:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vilro s hodnotou IC50 1 x 10'9 M alebo nižšou.
b) obsahuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 17 a CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 19 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 21, alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v
I preferovanej polohe selektívnej mutagenézy alebo v hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty disociácie vyššiu než je desaťnásobok hodnoty v prípade protilátky obsahujúcej CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 17 a CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 19 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO’ 21 a
c) obsahuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 18 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 20 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 22, alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy alebo v hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty disociácie vyššiu než je desaťnásobok hodnoty v prípade protilátky obsahujúcej CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 18 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 20 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 22.
V inom aspekte vynálezu sa charakterizuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá:
a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'9 M alebo nižšou,
b) obsahuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO. 27 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 29, alebo jej mutant, ktorý má jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy alebo v hypermutačnej
ΊΟ polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty disociácie vyššiu než je desaťnásobok hodnoty v prípade protilátky obsahujúcej CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO. 25, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO' 27 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 29 a
c) obsahuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28 a C.DR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 30 alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac substitúcií aminokyselín v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy alebo v hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty disociácie vyššiu než je desaťnásobok hodnoty v prípade protilátky obsahujúcej CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 30.
V ďalšom uskutočnení vynálezu sa opisujú izolované ľudské protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén, ktoré neutralizujú aktivitu ľudského IL12 a aspoň jedného ďalšieho IL-12 primátov vybraného zo skupiny zahrnujúcej IL-12 paviána, IL-12 kosmana, IL-12 šimpanza, IL-12 cynomolga a makaka, ale ktoré neneutralizujú aktivitu myšieho IL-12.
II. Výber rekombinantných ľudských protilátok
Rekombinantné ľudské protilátky podľa vynálezu môžu byť izolované testovaním knižnice rekombinantných kombinačných protilátok, uprednostňuje sa knižnica scFv zobrazujúca fága, pripravená použitím cDNA ľudskej VL a VH, ktorá sa pripravila z mRNA získanej z ľudských lymfocytov. Metodika prípravy a testovania takej knižnice je známa v odbore. Navyše bežne dostupné sady na vytvorenie knižníc zobrazujúcich fága (napríklad firma Pharmacia, Recombinant Phage Antibody System, kat. č. 279400-01 a firma Stratagene, sada pre fágové zobrazenie SurfZAP™, kat. č. 240612), príklady metód a činidiel obzvlášť využiteľných pre použitie pri príprave a testovaní knižníc zobrazujúcich protilátky môžu byť nájdené napríklad v publikácii Kang et al., prihláška PCT č. WO 92/18619, Winter et al., prihláška PCT WO 92/20791, Breitling et al., prihláška PCT č. WO 93/01288, McCafferty et al., prihláška PCT č. WO 92/01047, Gerrard et al., prihláška PCT č. WO 92/09690, Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9: 13701372, Hay et al., (1992) Hum. Antibody Hybridomas 3: 81-85, Huse et al., (1989) Science 246: 1275-1281, McCafferty et al., Náture (1990) 348: 552554, Griffths et al., (1993) EMBO J. 12: 725-734, Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896, Clackson et al., (1991) Náture 352: 624-628, Gram et al., (1992) PNAS 89: 3576-3580, Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377, Hoogenboom et al., (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137 a Barbas et al , (1991) PNAS 88: 7978-7982.
Protilátkové knižnice používané pri tejto metóde sú výhodne knižnice scFv pripravené z ľudskej cDNA VL a VH. Protilátkové knižnice scFv sa výhodne testujú použitím rekombinantného ľudského IL-12 ako antigénu s cieľom vybrať sekvencie ľudského ťažkého a ľahkého reťazca, ktoré vykazujú väzbovú aktivitu pro IL-12. S cieľom vybrať protilátky špecifické pre podjednotku p35 IL-12 alebo heterodimér p70, bolo uskutočnené testovanie v prítomnosti nadbytku voľnej podjednotky p40. Preferencie podjednotky môžu byť stanovené napríklad mikro-Friguetovou titráciou, ako sa opisuje v príklade 1.
Keď sú vybrané počiatočné ľudské segmenty VL a VH, sú uskutočnené experimenty „zmiešania a párovania“, aby sa vybrali výhodné kombinácie párov VL/VH (opisuje sa v príklade 1). V týchto experimentoch sa testuje schopnosť rôznych párov vybraných segmentov VL a VH viazať sa na IL-12. Ďalej, na ďalšie zlepšenie afinity a/alebo dosiahnutie nižšej hodnoty rýchlostnej konštanty Kofr pre naviazanie na hIL-12, segmenty VL a VH výhodného páru(ov) VL/VH môžu byť náhodne mutované, výhodne v oblasti CDR3 VH a/alebo VL, postupom analogickým s postupom somatickej mutácie in vivo zodpovedným za afinitnú maturáciu protilátok počas prirodzenej imunitnej odozvy. Táto afinitná maturácia in vitro môže byť uskutočnená amplifikáciou oblastí VH a VL použitím PCR primérov komplementárnych s VH CDR3 alebo respektíve VL CDR3, pričom priméry boli v istých polohách predĺžené náhodnou zmesou štyroch nukleotidových báz tak, že výsledné produkty PCR kódujú segmenty VH a VL, v ktorých sú do oblastí VH a/alebo VL CDR3 zavedené náhodné mutácie. Tieto náhodne mutované segmenty VH a VL môžu byť znovu vybrané a môže sa u nich testovať schopnosť viazať sa na hIL-12 a môžu byť vybrané sekvencie, ktoré vykazujú vysokú afinitu a nízku hodnotu KOff v prípade naviazania na IL-12. Tabuľka 2 (dodatok A) opisuje protilátky, ktoré vyjadrovali zmenenú väzbovú špecifitu/afinitu produkovanú ako výsledok afinitnej maturácie in vitro.
Po selekcii, izolácii a testovaní protilátky proti hIL-12 podľa vynálezu z rekombinantnej knižnice zobrazujúcej imunoglobulín, nukleová kyselina kódujúca vybranú protilátku môže byť získaná z fágovej častice(častíc) (napríklad z fágového genómu) a môže byť subklonovaná do iných expresívných vektorov štandardnými postupmi rekombinácie DNA. Ak je to nutné, nukleová kyselina môže byť ďalej manipulovaná za vzniku iných foriem protilátky podľa vynálezu (napríklad naviazané na nukleovú kyselinu kódujúce ďalšie domény imunoglobulínu také, ako sú ďalšie konštantné oblasti). Aby sa exprimovala rekombinantná ľudská protilátka izolovaná testovaním kombinačnej knižnice, DNA kódujúca protilátku je klonovaná do rekombinantného expresívneho vektora a je zavedená do cicavčích hostiteľských buniek, ako sa opisuje detailnejšie v sekcii IV ďalej v texte.
Metódy selekcie protilátok viažucich sa na ľudský IL-12 použitím fágovej zobrazovacej technológie a afinitná maturácia vybraných protilátok náhodnou alebo miestne riadenou mutagenézou oblastí CDR sú opísané detailnejšie v príklade 1.
Ako sa opisuje v príklade 1 testovanie cDNA knižnice ľudských VL a VH identifikovalo série protilátok proti IL-12, z ktorých bola vybraná pre ďalší vývoj protilátka Joe 9. Porovnanie variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky Joe 9 s embryonálnymi sekvenciami ťažkého reťazca vybranými z databázy VBASE, odhalilo, že protilátka Joe 9 bola podobná so zárodočnou sekvenciou COS-3. COS-3 patrí k rodine zárodočných sekvencií Vh3.
Rodina Vh3 je súčasťou zárodočného repertoáru ľudskej VH, ktorý je rozdelený do siedmich rodín VhI až V«7 založených na homológii nukleotidových sekvencií (opisuje sa v publikácii Tomlison et al., (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 a Cook et al., (1995) Imrnunology Today, 16, 237242). Rodina Vh3 obsahuje najvyšší počet členov a tvorí najväčší príspevok zárodočného repertoáru. V prípade ľubovoľnej danej sekvencie embryonálnej ľudskej protilátky Vh3, zhoda aminokyselinových sekvencií v celej rodine Vh3 je vysoká (opisuje sa napríklad v publikácii Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 a Cook et al., (1995) Imrnunology Today, 16, 237242). Rozmedzie zhody aminokyselinovej sekvencie medzi ľubovoľnými dvoma embryonálnymi sekvenciami VH rodiny Vh3 kolíše od zvyškov 69 až 98 z približne 100 zvyškov VH (to znamená, že medzi ľubovoľnými dvoma zárodočnými sekvenciami VH je 69 až 98% homológia aminokyselinovej sekvencie). V prípade väčšiny párov zárodočných sekvencií existuje aspoň 80 alebo viac zhodných aminokyselinových zvyškov (to je aspoň 80% homológia aminokyselinovej sekvencie). Vysoký stupeň homológie aminokyselinovej sekvencie medzi členmi rodiny Vh3 vedie k tomu, že isté aminokyselinové zvyšky sú prítomné v kľúčových miestach v CDR a v oblastiach kostry VH reťazca. Tieto aminokyselinové zvyšky udeľujú štrukturálne rysy oblastiam CDR.
Štúdie štruktúr protilátok ukázali, že priestorové usporiadanie CDR sa môže rozdeliť do rodín CDR s kánonickými (základnými) štruktúrami založenými na kľúčových aminokyselinových zvyškoch, ktoré obsadzujú isté polohy v CDR a v oblastiach kostry V dôsledku toho existujú v rôznych protilátkach podobné lokálne priestorové usporiadania CDR, ktorá majú kanonické štruktúry so zhodnými kľúčovými aminokyselinovými zvyškami (opisuje sa v publikácii Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917 a Chothia et al , (1989) Náture, 342, 877-883). V rodine VH3 existuje konzervácia zhody aminokyselinových zvyškov v kľúčových miestach kanonickej štruktúry CDR1 a CDR2 (opisuje sa v publikácii Chothia et al., (1992), J. Mol. Biol., 227, 799-817).
Embryonálny gén VH COS-3 je členom rodiny Vh3 a je variantom embryonálnej alely VH 3-30(DP-49). COS-3 sa líši od aminokyselinových sekvencií VH protilátky Joe 9 iba v piatich polohách. Vysoký stupeň homológie aminokyselinovej sekvencie medzi VH protilátky Joe 9 a COS-3 a medzi VH protilátky Joe 9 a iných členov rodiny Vh3 tiež udeľuje vysoký stupeň štrukturálnej homológie CDR (opisuje sa v publikácii Chothia et al., (1992) J. Mol. Biol., 227, 799-817, Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 a Chothia et al., (1989) Náture, 342, 877-883).
Pre odborníka je výhodné, že na základe vysokej podobnosti aminokyselinovej sekvencie a kánonickej štruktúry s protilátkou Joe 9, môžu byť používané iné členy rodiny Vh3 za vzniku protilátok, ktoré sa viažu na ľudský IL-12. To môže byť uskutočnené napríklad selekciou vhodnej VL metódami preskupenia reťazcov (opisuje sa v publikácii Winter et al., (1994) Annual Rev. Immunol., 12, 433-55) alebo zavedením CDR z hlodavca alebo inej ľudskej protilátky zahrnujúcej CDR z protilátok podľa vynálezu do základnej štruktúry rodiny VH3.
Zárodočný repertoár ľudského V lambda je rozdelený do 10-tich rodín založených na homológii nukleotidových sekvencií (opisuje sa v publikácii Williams et al., (1996) J. Mol. Biol., 264, 220-232). Porovnanie variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky Joe 9 so zárodočnými sekvenciami ľahkého reťazca vybranými z databázy VBASE ukázalo, že protilátka Joe 9 bola podobná embryonálnej DPL8 lambda. VL protilátky Joe 9 sa líši od sekvencie DPL8 iba v štyroch polohách základnej štruktúry a je vysoko homológna so sekvenciami základnej štruktúry iných členov rodiny VjJ. Na základe homológie aminokyselinovej sekvencie a podobnosti kanonickej štruktúry s protilátkou Joe 9 môžu byť používané na vytvorenie protilátok, ktoré sa viažu na ľudský IL-12, aj iné členy rodiny Vx.1. To môže byť uskutočnené napríklad selekciou vhodnej VH metódami preskupenia reťazcov (opisuje sa v publikácii Winter et al., (1994) Annual Rev. Immunol., 12, 433-55 alebo zavedením CDR inej ľudskej protilátky alebo protilátky hlodavca, ktoré obsahujú CDR z protilátok podľa vynálezu, do základnej štruktúry rodiny νλι.
Metódy podľa vynálezu zahrnujú rekombinantné protilátky, ktoré sa viažu na hIL-12, obsahujúce variabilnú oblasť ťažkého reťazca získanú z člena rodiny Vh3 zárodočných sekvencii a variabilnú oblasť ľahkého reťazca získanú z člena rodiny VjJ zárodočných sekvencii. Pre odborníka je však výhodné, že sekvencia ťažkého reťazca ľubovoľného člena rodiny Vh3 môže byť kombinovaná so sekvenciou ľahkého reťazca ľubovoľného člena rodiny VX1.
Pre odborníkov bude tiež výhodné, že v populácii (napríklad ľudská populácia) môžu existovať polymorfizmy sekvencii DNA, ktoré vedú ku zmenám v aminokyselinových sekvenciách embrya. Taký genetický polymorfizmus spôsobený prirodzeným alelickým variantom môže existovať medzi jedincami v populácii v zárodočných sekvenciách. Také prirodzené alelické varianty môžu v typickom prípade viesť k 1 až 5 % diskrepancii nukleotidovej sekvencie génu. Akékoľvek a všetky také nukleotidové variácie a výsledné aminokyselinové polymorfizmy v embryonálnych sekvenciách, ktoré sú výsledkom prirodzeného alelického variantu, patria do rozsahu tohoto vynálezu.
Teda v jednom aspekte vynálezu sa opisuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) viaže sa na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty disociácie 0,1 s'1 alebo nižšou, ako sa stanovilo povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro, pričom hodnota IC5o je 1 x 10'6 M alebo nižšia,
b) má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú z člena embryonálnej rodiny Vh3, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca má mutáciu v kontaktnej a hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu,
c) má variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu z člena embryonálnej rodiny VjJ, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca má mutáciu v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej polohe alebo hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu.
V preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej Časť viažuca sa na antigén má mutáciu v CDR3 ťažkého reťazca.
V inom preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén má mutáciu v CDR3 ľahkého reťazca.
V inom výhodnom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén má mutáciu v CDR2 ťažkého reťazca.
V inom preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén má mutáciu v CDR2 ľahkého reťazca.
V inom preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén má mutáciu v CDR1 ťažkého reťazca.
V inom preferovanom uskutočnení vynálezu izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén má mutáciu v CDR1 ľahkého reťazca.
Pre odborníka je výhodné, že na základe vysokej podobnosti aminokyselinovej sekvencie medzi členmi embryonálnej rodiny Vh3 alebo medzi ľahkými reťazcami členov embryonálnej rodiny VjJ, uvedené mutácie embryonálnych sekvencií môžu poskytnúť ďalšie protilátky, ktoré sa viažu na ľudský IL-12. Tabuľka 1 (dodatok A) ukazuje embryonálne sekvencie členov rodiny Vn3 a demonštruje podstatnú sekvenčnú homológiu u členov rodiny. V tabuľke 1 sú zobrazené embryonálne sekvencie členov rodiny V>.1. Na porovnanie sú poskytnuté sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca protilátky Joe 9. Mutácie embryonálnych sekvencií členov rodiny VH3 a Vxl môžu byť uskutočnené napríklad v rovnakých polohách aminokyselín ako sú tie uskutočnené v protilátkach podľa vynálezu (napríklad mutácie v protilátke Joe 9). Úpravy môžu byť uskutočnené použitím štandardných techník molekulárnej biológie, ako je mutagenéza PCR, cielenie jednotlivých aminokyselinových zvyškov do embryonálnych sekvencií, potom nasleduje tu opísaná kinetická a funkčná analýza upravených protilátok (napríklad neutralizačné testy opísané v príklade 3 a analýza BIAcore, ako sa opisuje v príklade 5).
Teda podľa jedného aspektu vynález poskytuje izolovanú ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 595 až 667, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca má mutáciu v preferovanej polohe selektívnej mutácie, v kontaktnej alebo v hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu,
b) má variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 669 až 675, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca má mutáciu v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej polohe alebo hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu.
Pre odborníka je výhodné, že na základe vysokej podobnosti aminokyselinovej sekvencie medzi protilátkou Joe 9 a embryonálnou sekvenciou ťažkého reťazca COS-3 a medzi protilátkou Joe 9 a embryonálnou sekvenciou DPL8 lambda, iné mutácie oblastí CDR týchto embryonálnych sekvencií môžu poskytovať ďalšie protilátky, ktoré sa viažu na ľudský IL-12. Také metódy modifikácie môžu byť uskutočnené použitím štandardných techník molekulárnej biológie, ako sa opisuje vyššie v texte.
V inom uskutočnení vynálezu sa opisuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) viaže sa na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty disociácie 0,1 s'1 alebo nižšou, ako sa stanovilo povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, pričom hodnota IC50 je 1 x 10‘6 M alebo nižšia,
b) má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu embryonálnu aminokyselinovú sekvenciu COS-3, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca má mutáciu v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej a hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu,
c) má variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu embryonálnu aminokyselinovú sekvenciu DPL8, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca má mutáciu v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej polohe alebo hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu.
Tým, že isté aminokyselinové zvyšky obsadzujú kľúčové miesta v CDR a oblasti základnej štruktúry vo variabilnej oblasti ľahkého a ťažkého reťazca, udeľujú týmto oblastiam štrukturálne rysy. Obzvlášť oblasti CDR1 a CDR2 sú subjektom kanonických štrukturálnych klasifikácií. Pretože tu existuje vysoký stupeň homológie aminokyselinových sekvencii medzi členmi rodiny, sú tieto kanonické rysy prítomné medzi členmi rodiny. Odborník ocení, že modifikácie aminokyselinových zvyškov, ktoré udeľujú kanonické štruktúry, by mali produkovať ďalšie protilátky, ktoré sa viažu na IL-12. Modifikácie môžu byť uskutočnené použitím štandardných techník molekulárnej biológie, ako sa opisuje vyššie v texte.
V inom uskutočnení vynálezu sa opisuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:
a) viaže sa na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty disociácie 0,1 s'1 alebo nižšou, ako sa stanovilo povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v in vitro teste PHA, pričom hodnota IC50 je 1 x 10'6 M alebo nižšia,
b) vykazuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú z člena embryonálnej rodiny Vh3, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca obsahuje CDR2, ktorá je štrukturálne podobná CDR2 z iných členov embryonálnej rodiny
Ί9
Vh3, a CDR1, ktorá je štrukturálne podobná CDR1 z iných členov embryonálnej rodiny Vh3, a kde variabilná oblasť ťažkého reťazca má mutáciu v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe mutáciou aminokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu,
c) vykazuje variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú z člena embryonálnej rodiny V\l, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca obsahuje CDR2, ktorá je štrukturálne podobná CDR2 z iných členov embryonálnej rodiny Vxl, a CDR1, ktorá je štrukturálne podobná CDR1 z iných členov embryonálnej rodiny V^l, a kde variabilná oblasť ťažkého reťazca vykazuje v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe mutáciu atninokyselinovým zvyškom, ktorý zvyšuje aktivitu.
Rekombinantné ľudské protilátky podľa vynálezu majú variabilné a konštantné oblasti, ktoré sú homológne s embryonálnymi sekvenciami ľudského imunoglobulínu vybranými z databázy VBASE. Mutácie v rekombinantných ľudských protilátkach (napríklad náhodnou mutagenézou alebo mutagenézou PCR) vedú ku vniku aminokyselín, ktoré nie sú kódované embryonálnymi sekvenciami ľudského imunoglobulínu. Tiež knižnice rekombinantných protilátok, ktoré boli získané z ľudských donorov budú obsahovať protilátkové sekvencie, ktoré sa líšia od ich zodpovedajúcich embryonálnych sekvencií, čo spôsobuje normálny postup somatickej mutácie, ktorý sa objavuje počas vývoja bunky B. Malo by sa poznamenať, že ak „embryonálne“ sekvencie získané amplifikáciou PCR kódujú rozdiely v aminokyselinách v oblastiach základnej štruktúry v porovnaní s opravdivou embryonálnou konfiguráciou (to je rozdiely v amplifikovanej sekvencií v porovnaní s opravdivou embryonálnou sekvenciou), môže byť nutné zmeniť tieto rozdiely aminokyselín späť na opravdivé embryonálne sekvencie (to je „spätná mutácia“ zvyškov základnej štruktúry v embryonálnej konfigurácii). Teda vynález môže voliteľne zahrnovať krok spätnej mutácie. Aby k tomu došlo, aminokyselinové sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca kódované embryonálnou DNA (ako sa zistilo ako príklad v databáze VBASE) sú najskôr porovnané s mutovanými aminokyselinovými sekvenciami základnej štruktúry ťažkého a ľahkého reťazca imunoglobulínu, pričom sa identifikujú aminokyselinové zvyšky v mutovanej sekvencii základnej štruktúry imunoglobulínu, ktoré sa líšia od najbližších embryonálnych sekvencii. Potom použitím genetického kódu sa stanoví, ktoré zmeny nukleotidov by mali byť uskutočnené a vhodné nukleotidy mutovanej imunoglobulínovej sekvencie sú mutované naspäť, aby zodpovedali embryonálnej sekvencii. Mutagenéza mutovanej sekvencie základnej štruktúry imunoglobulínu je uskutočnená štandardnými spôsobmi, ako je mutagenéza sprostredkovaná PCR (v ktorej mutované nukleotidy sú začlenené do primérov PCR tak, že produkt PCR obsahuje mutácie) alebo miestne riadená mutagenéza. Mala by sa skúmať priama alebo nepriama úloha každej aminokyseliny identifikovanej ako kandidát spätnej mutácie pri naviazaní na antigén a žiadna aminokyselina, ktorá po mutácii ovplyvňuje ľubovoľnú požadovanú charakteristiku ľudskej protilátky by sa nemala zahrnúť do konečnej ľudskej protilátky, ako napríklad aminokyseliny zvyšujúcu aktivitu identifikované prístupom selektívnej mutagenézy nebudú subjektom spätnej mutácie. Testy na stanovenie charakteristík protilátky, ktorá je výsledkom mutagenézy, môžu zahrnovať test ELISA, kompetitívny test ELISA, neutralizačné testy in vitro a in vivo a/alebo (opisuje sa napríklad v príklade 3) imunohistochemické rozbory sekcií tkanív z rôznych zdrojov (zahrnujúcich človeka, primáta a/alebo iné druhy).
Aby sa minimalizoval počet aminokyselín vystavených spätnej mutácii, môžu sa zachovať tie polohy aminokyselín, u ktorých sa zistilo, že sa líšia od najbližšej embryonálnej sekvencie, ale sú zhodné so zodpovedajúcou aminokyselinou v druhej embryonálnej sekvencii, pričom dochádza k tomu, že druhá embryonálna sekvencia je zhodná a ko-lineárna so sekvenciou ľudskej protilátky podľa vynálezu v prípade aspoň desiatich, výhodne dvanástich aminokyselín na oboch stranách diskutovanej aminokyseliny. To bude zaručovať, že ľubovoľný peptidový epitop prezentovaný imunitnému systému bunkami prezentujúcimi antigén v subjekte, ktorý je liečený ľudskou protilátkou podľa vynálezu, nebude cudzorodý, ale identický so samo81 antigénom, to je imunoglobulínom kódovaným uvedenou druhou embryonálnou sekvenciou. Spätná mutácia sa môže objaviť v ľubovoľnom štádiu optimalizácie protilátky, prednostne sa spätná mutácia objavuje priamo pred alebo po použití prístupu selektívnej mutagenézy. Výhodnejšie, spätná mutácia sa objavuje priamo pred použitím prístupu selektívnej mutagenézy.
III: Modifikácie výhodných polôh selektívnej mutagenézy, kontaktných a/alebo hypermutačných polôh
V typickom prípade selekcia protilátok so zlepšenými afinitami môže byť uskutočnená použitím metód fágového zobrazenia, ako sa opisuje v sekcii II vyššie v texte. To môže byť dosiahnuté kombináciou náhodných mutácií zvyškov CDR a vytvorením veľkých knižníc, ktoré obsahujú protilátky rôznych sekvencií. Avšak, aby tieto selekčné metódy fungovali, reakcia protilátka-antigén sa musí blížiť rovnováhe, aby sa po určitom čase umožnilo výhodné naviazanie protilátky s vyššou afinitou na antigén. Keď boli použité metódy zobrazujúce fága, aby sa zlepšila afinita vybraných protilátok proti IL-12, nemôžu byť stanovené (pravdepodobne v dôsledku ďalších nešpecifických interakcií medzi antigénom a časticou fága), selekčné podmienky na docielenie istého stupňa dosiahnutej afinity (to je stupeň afinity protilátky Y61), ktoré by umožnili dosiahnutie rovnováhy. Preto, použitím metód zobrazujúcich fága nemôžu byť vybrané protilátky s dokonca vyššími afinitami. Takže aspoň pre určité protilátky alebo antigény, metódy zobrazujúce fága sú limitujúce svojou schopnosťou vybrať protilátky s vysoko zlepšenou väzbovou špecifitou/afinitou. Aby sa obišlo toto obmedzenie, poskytnutý je spôsob nazvaný prístup selektívnej mutagenézy, ktorý nevyžaduje fágové zobrazenie afinitnej maturácie protilátok a je predmetom vynálezu. Hoci tento prístup selektívnej mutagenézy bol vyvinutý preto, aby sa obišli obmedzenia použitím systému fágového zobrazenia, malo by sa poznamenať, že táto metóda môže byť tiež použitá spolu so systémom fágového zobrazenia. Avšak prístup selektívnej mutagenézy môže byť používaný na zlepšenie aktivity ľubovoľnej protilátky.
Aby sa zlepšila aktivita (napríklad afinita alebo neutralizačná aktivita) protilátky, odborník by rád mutoval každú polohu CDR ako v ľahkom tak v ťažkom reťazci na každý iný možný aminokyselinový zvyšok. Pretože však v protilátke existuje priemerne 70 polôh CDR, taký prístup je pomerne časovo náročný a prácny. Obdobne spôsob podľa vynálezu umožňuje zlepšiť aktivitu protilátky mutáciou iba určitých vybraných zvyškov v CDR ťažkého a/alebo ľahkého reťazca. Ďalej spôsob podľa vynálezu umožňuje zlepšiť aktivity protilátky, bez toho, aby sa ovplyvnili jej ďalšie požadované vlastnosti.
Stanovenie, ktoré aminokyselinové zvyšky variabilnej oblasti protilátky sú v kontakte s antigénom nie je možné presne predpovedať na základe sekvencie alebo ich polôh vo variabilnej oblasti. Jednako len usporiadania sekvencii z protilátok s rôznymi špecifitami, ktoré zaviedol Kabat et al., identifikovali oblasti CDR ako miestne oblasti vo vnútri variabilných oblastí, ktoré sa medzi protilátkami významne líšia (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190, str 382-393, Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Štrukturálne štúdie ukázali, že povrch viažuci antigén je tvorený aminokyselinovými zvyškami prítomnými v CDR. Je tiež známe, že iné aminokyselinové zvyšky mimo CDR majú štrukturálne úlohy alebo sú priamo zahrnuté do naviazania antigénu. Teda aminokyselinové zvyšky v CDR alebo mimo týchto oblastí môžu byť dôležité v prípade každého páru antigén-protilátka.
Štúdie usporiadania sekvencii opísané v publikácii Tomlison et al., identifikovali rad polôh v CDR1 a CDR2 ťažkého a ľahkého reťazca a v časti CDR3 reťazca kappa, ktoré sú časté miesta somatickej mutácie (Tomlison et al., (1996) J. Mol. Biol. 256: 813-817). Obzvlášť polohy H31, H31B, H33, H33B, H52B, H56, H58, L30, L31, L31A, L50, L53, L91, L92, L93 a L94 boli identifikované ako časté miesta pre somatickú mutáciu. Táto analýza však vylučuje dôležité oblasti CDR3 ťažkého reťazca a sekcie CDR3 ľahkého reťazca, o ktorých je známe, že ležia v centre väzbového miesta protilátky a potencionálne poskytujú dôležité interakcie s antigénom. Ďalej sa v publikácii Tomlison et al., (1996) J. Mol. Biol. 256: 813-817 uvádza, že samotná somatická diverzita nevyhnutne nepredpokladá úlohu špecifickej ôpŕávena ttrana aminokyseliny pri naviazaní na antigén a naznačujú sa konzervované aminokyselinové zvyšky, ktoré prichádzajú do kontaktu s antigénom, a diverzné aminokyselinové zvyšky, ktoré neprichádzajú do kontaktu s antigénom. Tento záver je ďalej podporovaný mutačnými štúdiami úlohy somatických mutácií v protilátkovej afinite (Sharon, (1990), PNAS, 87: 48147). Devätnásť somatických mutácií v protilátke proti p-azofenylarzonátu (Ars) s vysokou afinitou bolo súčasne nahradených zodpovedajúcimi embryonálnymi zvyškami, čo vytvorilo embryonálnu verziu protilátok proti Ars, ktoré mali dvestokrát nižšiu aktivitu. Plnú aktivitu protilátky proti Ars bolo možné znovu získať opätovným uskutočnením iba troch z devätnástich somatických mutácií, čo ukazuje, že môžu byť povolené početné somatické mutácie, ktoré neprispievajú k väzbovej aktivite na antigén.
Výsledok je možné z časti vysvetliť podstatou samotnej protilátkovej diverzity. Nezrelé bunky B môžu spočiatku produkovať protilátky s nízkou afinitou, ktoré rozoznávajú rad vlastných antigénov (samo-antigénov) alebo antigénov, ktoré nie sú samo-antigény. Protilátky však môžu prejsť v priebehu afinitnej maturácie sekvenčnými variáciami, ktoré môžu spôsobiť samoreaktivitu. Hypermutácie takých protilátok s nízkou afinitou môžu slúžiť na elimináciu samo-reaktivity („negatívna selekcia“) a k zvýšeniu afinity pre cudzorodý antigén. Preto analýza primárnych a štrukturálnych dát veľkého množstva protilátok neposkytuje spôsob predpovedajúci buď (1) úlohu somatických hypermutačných miest v postupe afinitnej maturácie verzus v postupe zníženia afinity voči nechceným antigénom alebo (2) ako sa daná aminokyselina podieľa na vlastnostiach špecifického páru antigén-protilátka.
Iné pokusy adresované úlohe špecifických aminokyselinových zvyškov pri rozpoznávaní antigénu boli uskutočnené analýzou radu kryštalických štruktúr komplexov antigén-protilátka (MacCallum et al., (1996) J. Mol. Biol 262: 732-745). Bola naznačená potencionálna úloha polôh lokalizovaných v CDR alebo mimo týchto oblastí. Polohy v CDR zahrnuté v naviazaní na antigén vo viac než 10 z 26 analyzovaných štruktúr zahrnovali H31, H33, H50, H52, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98 a H100 v ťažkom reťazci a L30A, L32, L91, L92, L93, L94, L96 v ľahkom reťazci Autori však poznamenali, že predpoveď kontaktov antigénov použitím týchto a iných štrukturálnych dát môže viesť k nadmernému alebo nedostatočnému predpokladu kontaktných polôh, čo vedie k špekulácii, že pre rôzne antigény môžu byť aplikované rôzne stratégie.
Pini et al. opisujú náhodné rozdelenie viacnásobných zvyškov do sekvencií CDR protilátky vo veľkej knižnici zobrazujúcej fága s cieľom rýchlo zvýšiť protilátkovú afinitu (opisuje sa v publikácii Pini et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776). Protilátky s vysokou afinitou diskutované v publikácii Pini et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776 mali mutácie celkom v ôsmich polohách, ich redukčná analýza sa stáva nepraktická, pretože sa testuje veľký počet možných kombinácií pre najmenší počet nutných aminokyselín. Zmeny polôh sú absolútne nutné, aby sa zlepšila afinita protilátky.
Navyše náhodné rozdelenie množstva zvyškov nemusí nevyhnutne zachovať iné požadované vlastnosti protilátky. Požadované vlastnosti a charakteristiky protilátky sú v odbore známe a zahrnujú napríklad zachovanie neskríženej reaktivity, napríklad s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami a zachovanie sekvencií protilátok, ktoré sú blízke sekvenciám ľudského embryonálneho imunoglobulínu, zlepšenie neutralizačnej sily. Iné požadované vlastnosti alebo charakteristiky zahrnujú schopnosť uchovať druhy skríženej reaktivity, schopnosť zachovať špecifitu epitopu a schopnosť zachovať vysokú silu expresie proteínu v cicavčích bunkách. Požadované vlastnosti alebo charakteristiky môžu byť pozorované alebo merané použitím postupov známych v odbore, ktoré zahrnujú, ale nie sú obmedzené, na test ELISA, kompetitívnu ELISA, neutralizačné testy in vitro a in vivo (opisuje sa napríklad v príklade 3), imunohistochemické testy tkanivových sekcií z rôznych zdrojov, ktoré zahrnujú človeka, primáta alebo iné zdroje podľa potreby a štúdie expresie v cicavčích bunkách použitím dočasnej alebo stabilnej expresie.
Navyše spôsob opísaný v publikácii Pini et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776 môže zaviesť viac zmien, než je minimálne naozaj nutný počet, aby sa zlepšila afinita, a môže viesť k spusteniu tvorby proti-ľudských protilátok (HAMA) v ľudských subjektoch.
Ďalej, ako sa diskutuje inde, tu opísané fágové zobrazenie alebo iná príbuzná metóda zahrnujúca zobrazenie ribozómu nemusí správne fungovať pri dosiahnutí istých afinít medzi protilátkou a antigénom a podmienky nutné na dosiahnutie rovnováhy nemusia byť nastolené v náležitom časovom rámci vzhľadom k ďalším interakciám, ktoré zahrnujú interakcie s inými fágovými alebo ribozomálnymi komponentami a antigénom.
Odborník môže zbierať zaujímavé vedecké informácie o pôvode protilátkovej diverzity z obsahu publikácií diskutovaných vyššie v texte. Vynález však poskytuje spôsob na zvýšenie protilátkovej afinity špecifického páru antigén-protilátka, zatiaľ čo zachováva iné relevantné znaky alebo požadované charakteristiky protilátky. To je obzvlášť dôležité, keď sa zvažuje nutnosť prepožičania množstva rôznych charakteristík špecifickej protilátke vrátane naviazania na antigén.
Ak počiatočná protilátka má požadované vlastnosti alebo charakteristiky, ktoré je potrebné zachovať, prístup selektívnej mutagenézy môže byť najlepšou stratégiou zachovania týchto požadovaných vlastností, zatiaľ čo sa zlepší aktivita protilátky. Napríklad pri mutagenéze protilátky Y61 bolo cieľom zvýšiť afinitu voči hIL-12 a zlepšiť neutralizačný potenciál protilátky, zatiaľ čo si zachováva požadované vlastnosti. Požadované vlastnosti protilátky Y61 zahrnovali (1) zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, (2) zachovanie správnej špecifity epitopu, to je rozpoznávanie epitopu p40 prednostne v súlade s heterodimérom p70 (p40/p35), čím sa zachovajú väzbové interferencie od voľnej rozpustnej podjednotky p40 a (3) vytvorenie protilátky s aminokyselinovými sekvenciami ťažkého a ľahkého reťazca, ktoré sú natoľko blízke ich zodpovedajúcim sekvenciám embryonálneho imunoglobulínu, ako je to len možné.
V jednom uskutočnení vynálezu spôsob poskytuje prístup selektívnej mutagenézy ako stratégie zachovania požadovaných vlastností alebo charakteristík protilátky, zatiaľ čo sa zlepšuje afinita a/alebo neutralizačná sila. Termín „prístup selektívnej mutagenézy“ sa definuje vyššie v texte a zahrnuje spôsob jednotlivej mutácie vybraných aminokyselinových zvyškov.
Aminokyselinové zvyšky, ktoré budú mutované, sa najskôr vyberú z preferovaných polôh selektívnej mutagenézy, potom z kontaktných polôh a potom z hypermutačných polôh. Jednotlivá vybraná poloha môže byť mutovaná na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky a je stanovený účinok mutácie na požadované vlastnosti protilátky a zlepšenie aktivity protilátky.
Prístup selektívnej mutagenézy zahrnuje kroky:
výber kandidátských polôh v poradí 1) preferované polohy selektívnej mutagenézy, 2) kontaktné polohy, 3) hypermutačné polohy a zaradenie polôh na základe lokácie polohy vo variabilných oblastiach ťažkého a ľahkého reťazca protilátky (CDR3 sa preferuje pred CDR2 a táto oblasť sa preferuje pred CDR1), jednotlivá mutácia kandidátských preferovaných polôh selektívnej mutagenézy, hypermutačných a/alebo kontaktných polôh s cieľom hodnotenia na všetky možné iné aminokyselinové zvyšky a analýza účinku jednotlivých mutácií na aktivitu protilátky s cieľom stanovenia aminokyselinových zvyškov, ktoré zosilňujú aktivitu protilátky, ak je to nevyhnutné, vytvorenie postupných kombinácií jednotlivých aminokyselinových zvyškov zvyšujúcich aktivitu protilátok, výber mutovaných protilátok s aminokyselinovými zvyškami zvyšujúcimi aktivitu a hodnotenie mutantných protilátok založených na lokácii a zhode substitúcií aminokyselín vzhľadom na ich imunogénny potenciál. Najvyššie hodnotenie je udelené mutantným protilátkam, ktoré obsahujú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je skoro zhodná so sekvenciou variabilnej oblasti, ktorá je opísaná v embryonálnej databáze alebo má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je porovnateľná s inými ľudskými protilátkami. Nižšie hodnotenie je dané mutantným protilátkam obsahujúcim aminokyselinovú substitúciu, ktorá sa zriedka objavuje v ich embryonálnej sekvencií alebo v sekvenciách iných ľudských protilátok. Najnižšie hodnotenie je dané mutantným protilátkam s aminokyselinovou substitúciou, ktorá sa nevyskytuje v embryonálnej sekvencií alebo v sekvencií inej ľudskej protilátky. Ako je uvedené vyššie v texte, mutantné protilátky obsahujúce aspoň jeden aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu lokalizovaný v CDR3 je preferovaný pred CDR2, ktorý je preferovaný pred CDR1. CDR variabilných oblasti ťažkého reťazca sú preferované pred CDR variabilnej oblasti ľahkého reťazca.
U mutantných protilátok môže byť tiež študované zlepšenie aktivity, napríklad v porovnaní s ich rodičovskou protilátkou. Zlepšenie aktivity mutantnej protilátky môže byť stanovené napríklad neutralizačnými testami alebo väzbovou špecifitou/afinitou analýzou povrchovej plazmónovej rezonancie (opisuje sa v príklade 3). Zlepšenie aktivity môže byť výhodne aspoň 2 až 20 krát vyššie v porovnaní s rodičovskou protilátkou. Zlepšenie aktivity môže byť aspoň „xi“ a „X2“ krát vyššie v porovnaní s rodičovskou protilátkou, pričom symboly „xi“ a „X2“ sú celé čísla zahrnujúce čísla 2 až 20, zahrnujúce rozmedzie v existujúcom rozmedzí napríklad 2 až 15, napríklad 5 až 10.
Môžu byť tiež študované mutantné protilátky s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu, aby sa stanovilo či bola po mutácii zachovaná aspoň jedna požadovaná vlastnosť. U protilátky proti hIL-12 sa napríklad testovali 1) zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovanie rozpoznania epitopu, to je rozpoznanie epitopu p40 prednostne v súlade s heterodimérom p70 (p40/p35), čím sa uchováva väzbová interferencia z voľnej rozpustnej p40 a (3) vytvorenie protilátok s aminokyselinovými sekvenciami ťažkého a ľahkého reťazca, ktoré boli tak blízko svojim sekvenciám embryonálneho imunoglobulínu, ako je to možné, a stanovenie, ktorá protilátka bude menej pravdepodobne vyvolávať ľudskú imunitnú odozvu založenú na počte rozdielov od embryonálnej sekvencie. Rovnaké pozorovania môžu byť uskutočnené s protilátkou, ktorá má viac ako jeden aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu, napríklad aspoň dva alebo aspoň tri aminokyselinové zvyšky zvyšujúce aktivitu, aby sa stanovilo, či dôjde k zachovaniu požadovanej vlastnosti alebo charakteristiky.
Príklad použitia „prístupu selektívnej mutagenézy“ pri mutagenéze protilátky Y61 je opísaný ďalej v texte. Každá z jednotlivých mutácií H31S-»E, L50—»Y alebo L94G—>Y zlepšila neutralizačnú aktivitu protilátky. Keď však boli testované kombinačné klony, aktivita kombinovaného klonu
H31S-»E + L50—>Y + L94G->Y nebola lepšia než L50->Y + L94G->Y(J695). Preto zmena embryonálneho aminokyselinového zvyšku Ser na Glu v polohe 31 CDR1 nebola nevyhnutná pre zlepšenie aktivity J695 v porovnaní s Y61. Prístup selektívnej mutagenézy preto identifikoval minimálny počet zmien, ktoré prispievali ku konečnej aktivite, čím sa redukuje imunogénny potenciál konečnej protilátky a zachovávajú sa požadované vlastnosti protilátky.
Izolovaná DNA kódujúca VH a VL produkované prístupom selektívnej mutagenézy môže byť premenená na gény reťazca protilátky plnej dĺžky, na gény fragmentu Fab, ako na gén scFV, ako je opísané v sekcii IV. V prípade expresie oblastí VH a VL produkovaných prístupom selektívnej mutagenézy, expresívne vektory kódujúce ťažký a ľahký reťazec môžu byť transfekované do rôznych hostiteľských buniek, ako sa opisuje detailne v sekcii IV. Preferované hostiteľské bunky zahrnujú buď hostiteľské prokaryontné bunky, napríklad E. coli alebo eukaryontné hostiteľské bunky, napríklad kvasinkové bunky, napríklad S. cerevisiae. Najviac preferované eukaryontné hostiteľské bunky sú cicavčie hostiteľské bunky opísané detailnejšie v sekcii IV.
Prístup selektívnej mutagenézy poskytuje spôsob produkujúci protilátky so zlepšenými aktivitami bez predchádzajúcej afinitnej maturácie protilátky inými spôsobmi. Prístup selektívnej mutagenézy poskytuje spôsob produkujúci protilátky so zlepšenými afinitami, ktoré boli predmetom spätných mutácií. Prístup selektívnej mutagenézy tiež poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátok s afinitnou maturáciou.
Odborníkovi bude jasné, že prístup selektívnej mutagenézy môže byť používaný pri štandardných postupoch manipulácie protilátok, ktoré sú známe v odbore. Príklady zahrnujú, ale nie sú obmedzené na protilátky so zavedeným CDR, chimérové protilátky, fragmenty scFV, fragmenty Fab t
protilátok plnej dĺžky a ľudské protilátky z iných zdrojov, napríklad z transgénnej myši.
Rýchla mutačná analýza protilátok vo veľkom meradle zahrnuje transkripciu a transláciu in vitro použitím fágovej zobrazovacej technológie (opisuje sa napríklad v publikácii Hanes et al., (1997) Proc. Natl. Acad Sci.
94: 4937-4942, Dali Acqua et al., (1998) Curr. Opin. Strúc. Biol. 8: 443-450,
He et al., (1997) Nucleic. Acid. Res. 25: 5132-5134 a v US patentoch č. 5 643
768 a 5 658 754 (Kawasaki). Prístup selektívnej mutagenézy tiež poskytuje spôsob produkcie protilátok so zlepšenými aktivitami, ktoré môžu byť vybrané použitím postupov zobrazenia ribozómu.
V spôsoboch podľa vynálezu protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén sú ďalej upravené zmenami jednotlivých polôh v DR HCVR a/alebo LCVR. Hoci tieto úpravy môžu byť uskutočnené v protilátkach vyjadrených fágom, spôsob je výhodný v tom, že môže byť uskutočnený s protilátkami, ktoré sú exprimované v iných typoch hostiteľských systémov, ako sú bakteriálne, kvasinkové alebo cicavčie bunkové expresívne systémy. Jednotlivé polohy v CDR vybrané na základe svojej modifikácie sú založené na polohách, ktorými sú kontaktná a/alebo hypermutačná poloha. .
Preferované tu definované kontaktné polohy a hypermutačné polohy sú zobrazené v tabuľke 3 (dodatok A) a ich modifikácia v zhode s metódou podľa vynálezu je opísaná detailnejšie v príklade 2. Preferované kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. Preferované hypermutačné polohy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Viac preferované aminokyselinové zvyšky („preferované polohy selektívnej mutagenézy“) sú ako kontaktné tak hypermutačné polohy a sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Obzvlášť preferované kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej L50 a L94.
Preferované aminokyselinové zvyšky zvyšujúce aktivitu nahradia aminokyselinové zvyšky lokalizované v polohách vybraných zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. Viac preferované aminokyselinové zvyšky zvyšujúce aktivitu nahradia aminokyselinové zvyšky lokalizované v polohách vybraných zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56,
H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Obzvlášť preferované aminokyselinové zvyšky zvyšujúce aktivitu nahradia aminokyselinové zvyšky lokalizované v polohách vybraných zo skupiny obsahujúcej L50 a L94.
Vo všeobecnom prípade spôsob podľa vynálezu zahrnuje výber určitej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnú polohu a/alebo hypermutačnú polohu v CDR ťažkého a ľahkého reťazca diskutovanej pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, náhodnú mutáciu v tejto individuálnej polohe (napríklad genetickými spôsobmi použitím mutagénneho oligonukleotidu za vzniku „mini-knižnice“ upravených protilátok), alebo mutáciu polohy na špecifické požadované aminokyseliny, aby sa identifikovali aminokyselinové zvyšky zvyšujúce aktivitu, expresiu a čistenie modifikovaných protilátok (napríklad v hostiteľskom systéme, ktorý nezobrazuje fága), meranie aktivity modifikovaných protilátok voči antigénu (napríklad meranie rýchlostnej konštanty kOff nanalýzou BIAcore), opakovanie týchto krokov pre iné polohy CDR, ak je to nevyhnutné, a kombinácie jednotlivých mutácií, o ktorých je známe, že zlepšili aktivitu a testovanie skutočnosti, či kombinácie generujú protilátku s dokonca vyššou aktivitou (napríklad afinitou alebo neutralizačnou silou) v porovnaní s rodičovskou protilátkou alebo s jej časťou viažucou sa na antigén.
Teda v jednom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, obsahujúci:
a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti,
b) výber v poradí 1) preferovaná poloha selektívnej mutagenézy, 2) kontaktná poloha alebo 3) hypermutačná poloha pre mutáciu v oblasti stanovujúcej komplementaritu, čím sa identifikuje vybraná poloha selektívnej mutagenézy, kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa tvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,
e) je možné opakovať kroky a) až d) v prípade aspoň jednej inej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej polohy alebo hypermutačnej polohy,
f) kombinácie v pôvodnej protilátke, alebo jej časti viažucej sa na antigén, jednotlivých mutácií, ktoré majú zvýšenú aktivitu, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén. Vybraná protilátka alebo protilátky majú výhodne zlepšenú aktivitu, bez toho, aby strácali aspoň jednu požadovanú charakteristiku alebo vlastnosť pôvodnej protilátky alebo si ju zachovávajú, ako sa opisuje vyššie v texte. Požadovaná vlastnosť alebo charakteristika môže byť meraná alebo pozorovaná odborníkom použitím metódy známej v odbore.
Preferované kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. Preferované hypermutačné polohy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej H30, H3 1, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Viac výhodné preferované polohy selektívnej mutagenézy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31,
L32, L50, L91, L92, L93 a L94. Obzvlášť preferované kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94.
V inom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén zahrnujúci:
a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej polohy alebo hypermutačnej polohy pre mutáciu v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR),
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa tvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) je možné opakovať kroky a) až d) v prípade aspoň jednej inej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej polohy alebo hypermutačnej polohy,
f) kombinácie v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén dvoch jednotlivých aminokyselinových zvyškov zvyšujúcich aktivitu, ktoré preukázali, že majú zvýšenú aktivitu, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén
Preferované kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L9I, L92, L93, L94 a L96. Preferované hypermutačné polohy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93. Viac výhodné preferovane polohy selektívnej mutagenézy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94. Obzvlášť preferované kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94.
V ďalšom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén zahrnujúci:
a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej polohy alebo hypermutačnej polohy pre mutáciu v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR),
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa tvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) je možné opakovať kroky a) až d) v prípade aspoň jednej inej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej polohy alebo hypermutačnej polohy.
f) kombinácie v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén troch jednotlivých aminokyselinových zvyškov zvyšujúcich aktivitu, ktoré preukázali, že majú zvýšenú aktivitu, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zvyšujúcimi aktivitu vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén.
Aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu výhodne nahradí aminokyselinové zvyšky v polohách vybraných zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96.
Po mutagenéze jednotlivých vybraných polôh, mutované klony môžu byť sekvenované s cieľom identifikácie, ktoré aminokyselinové zvyšky boli zavedené do vybranej polohy každého klonu. Pre sekvenovanie môže byť vybraný malý počet klonov (napríklad približne 24), čo by štatisticky malo viesť k 10 až 15 jednotlivým protilátkam, zatiaľ čo môže byť sekvenovaný väčší počet klonov (napríklad vyšší než 60), aby sa zaistilo, že sú identifikované protilátky s každou možnou substitúciou vo vybranej polohe.
V jednom uskutočnení vynálezu sú najskôr vybrané pre mutagenézu kontaktné a/alebo hypermutačné polohy v oblastiach CDR3 ťažkého a/alebo ľahkého reťazca. Avšak v prípade protilátok, ktoré už boli afinitne maturované in vitro náhodnou mutagenézou oblastí CDR3 pomocou selekcií na základe fágového zobrazenia, môžu byť prednostne najskôr vybrané kontaktné a/alebo hypermutačné polohy v CDRI alebo CDR2 ťažkého a/alebo ľahkého reťazca.
Vo viac preferovanom uskutočnení vynálezu sú najskôr pre mutagenézu vybrané preferované polohy selektívnej mutagenézy v oblastiach CDR3 ťažkého a/alebo ľahkého reťazca. Avšak v prípade protilátok, ktoré už boli afinitne maturované in vitro náhodnou mutagenézou oblastí CDR3 prostredníctvom selekcie na základe fágového zobrazenia, môžu byť prednostne najskôr vybrané preferované polohy selektívnej mutagenézy v CDRl alebo CDR2 ťažkého a/alebo ľahkého reťazca.
V inom preferovanom uskutočnení vynálezu optimalizácia vybranej protilátky prístupom selektívnej mutagenézy je uskutočnená postupne nasledujúcim spôsobom: preferované polohy selektívnej mutagenézy vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 sú mutované každá najskôr na aspoň 2 iné aminokyselinové zvyšky (výhodne 5 až 14 iných aminokyselinových zvyškov) a výsledné protilátky sú charakterizované zvýšenou afinitou, neutralizačnou silou (a snáď tiež aspoň jednou inou zachovanou charakteristikou a vlastnosťou inde diskutovanou). Ak mutácia jedinej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy vôbec alebo dostatočne nezvyšuje afinitu alebo neutralizačnú silu a ak dokonca kombinácia viac aminokyselín zvyšujúcich aktivitu nahradzujúcich aminokyseliny v preferovaných polohách selektívnej mutagenézy nevedie ku kombinačnej protilátke, ktorá vykazuje cieľovú aktivitu (zahrnujúcu afinitu a/alebo neutralizačnú silu), budú vybrané ďalšie aminokyselinové zvyšky pre selektívnu mutagenézu zo skupiny zahrnujúcej H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 a sú mutované na aspoň 2 iné aminokyseliny (prednostne 5 až 14 iných aminokyselín) a výsledné protilátky sú charakterizované zvýšenou afinitou, neutralizačnou silou (a snáď tiež aspoň jednou inou inde diskutovanou zachovanou charakteristikou alebo vlastnosťou).
Ak mutácia jediného aminokyselinového zvyšku vybraného zo skupiny zahrnujúcej H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 vôbec alebo dostatočne nezvyšuje aktivitu (zahrnujúcu afinitu a/alebo neutralizačnú silu) a ak dokonca kombinácia viac aminokyselín zvyšujúcich aktivitu nahradzujúcich aminokyseliny v týchto polohách nevedie ku kombinačnej protilátke, ktorá vykazuje cieľovú aktivitu (zahrnujúcu afinitu a/alebo neutralizačnú silu), budú vybrané ďalšie aminokyselinové zvyšky pre selektívnu mutagenézu zo skupiny zahrnujúcej H33B, H52B, L3 1A a sú mutované na aspoň 2 iné aminokyseliny (prednostne 5 až 14 iných aminokyselín) a výsledné protilátky sú charakterizované zvýšenou afinitou, neutralizačnou silou (a snáď tiež aspoň jednou inou inde diskutovanou zachovanou charakteristikou alebo vlastnosťou).
Malo by byť jasné, že postupný prístup selektívnej mutagenézy môže skončiť v ľubovoľnom z krokov uvedených vyššie v texte, ihneď ako bola identifikovaná protilátka s požadovanou aktivitou (zahrnujúcou afinitu a neutralizačnú silu). Keď mutagenéza vopred vybraných polôh identifikovala aminokyselinové zvyšky zvyšujúce aktivitu, ale kombinačná protilátka stále nevykazuje cieľovú aktivitu (zahrnujúcu afinitu a/alebo neutralizačnú silu) a/alebo ak identifikované aminokyseliny zvyšujúce aktivitu tiež ovplyvňujú iné požadované charakteristiky a sú preto neprijateľné, zostávajúce zvyšky CDR môžu byť vystavené mutagenéze (opisuje sa v sekcii IV).
Spôsob podľa vynálezu môže byť používaný na zlepšenie aktivity protilátky alebo časti viažucej sa na antigén, aby sa dosiahla vopred stanovená cieľová aktivita (napríklad vopred stanovená afinita a/alebo neutralizačná sila a/alebo požadovaná vlastnosť alebo charakteristika).
Teda vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, aby sa docielila vopred stanovená cieľová aktivita, pričom spôsob zahrnuje:
a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy vybranej zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa vytvorí prvý súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
9Ί
d) hodnotenie aktivity prvého súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, aby sa stanovilo či mutácia jednej polohy selektívnej mutagenézy produkuje protilátku alebo jej časť viažucu antigén s vopred stanovenou cieľovou aktivitou alebo čiastočnou cieľovou aktivitou,
e) kombinovanie postupným spôsobom v pôvodnej protilátke, alebo v jej časti viažucej sa na antigén, jednotlivých mutácií, ktoré preukázali, že majú zlepšenú aktivitu za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
f) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s cieľom stanovenia, či kombinačné protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén majú vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo čiastočnú cieľovú aktivitu
g) ak kroky d) alebo f) nevedú ku vzniku protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktoré majú vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo vedú ku vzniku protilátky s iba čiastočnou aktivitou, ďalšie aminokyselinové zvyšky vybrané zo skupiny zahrnujúcej H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 sú mutované na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čim sa tvorí druhý súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
h) hodnotenie aktivity druhého súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s cieľom stanovenia, či mutácia jednotlivého aminokyselinového zvyšku vybraného zo skupiny obsahujúcej H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 vedie ku vzniku protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá má vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo čiastočnú aktivitu,
i) kombinovanie postupným spôsobom v pôvodnej protilátke, alebo v jej časti viažucej antigén, jednotlivých mutácií opísaných v kroku g), ktoré preukázali, že majú zlepšenú aktivitu za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
j) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s cieľom stanovenia, či kombinačné protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén majú vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo čiastočnú cieľovú aktivitu,
k) ak kroky h) alebo j) nevedú ku vzniku protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktoré majú vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo vedú ku vzniku protilátky s iba čiastočnou aktivitou, ďalšie aminokyselinové zvyšky vybrané zo skupiny zahrnujúcej H33B, H52B a L31A sú mutované na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa tvorí tretí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
l) hodnotenie aktivity tretieho súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s cieľom stanovenia, či mutácia jediného aminokyselinového zvyšku vybraného zo skupiny obsahujúcej H33B, H52B a L31A vedie ku vzniku protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá má vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo čiastočnú aktivitu,
m) kombinovanie postupným spôsobom v pôvodnej protilátke alebo v jej časti viažucej antigén jednotlivých mutácií kroku k), ktoré preukázali, že majú zlepšenú aktivitu za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
n) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s cieľom stanovenia, či kombinačné protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén majú vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo čiastočnú cieľovú aktivitu, čím sa produkuje protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén s vopred stanovenou cieľovou aktivitou.
Môže byť použitý rad metód mutagenézy, ktoré zahrnujú kompletáciu pomocou PCR, mutagenézu podľa Kunkela (dut-ung-) a mutagenézu riadenú tiofosfátoligonukleotidmi (Amersham Sculptor kit).
Pre expresiu mutovaných protilátok môžu byť použité rôzne hostiteľské expresívne systémy, ktoré zahrnujú bakteriálne, kvasinkové, bakulovírusové a cicavčie expresívne systémy (rovnako ako expresívne systémy zobrazujúce fága). Príkladom vhodného bakteriálneho expresívneho vektora je pUC119(Sfi). Iné protilátkové expresívne systémy sú známe v odbore a/alebo sú opísané ďalej v texte v sekcii IV.
Modifikované protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén produkované metódou podľa vynálezu môžu byť identifikované bez spoliehania sa na metódy fágového zobrazenia, ktoré sa používajú pri selekcii. Teda, spôsob podľa vynálezu je obzvlášť výhodný na zlepšenie aktivity rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšená mutagenézou v systéme fágového zobrazenia.
Teda v inom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia afinity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén zahrnujúci:
a) poskytnutie pôvodnej rekombinantnej protilátky alebo jej časti, ktorá bola získaná selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšená mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej polohy alebo hypermutačnej polohy pre mutáciu v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR), čím sa identifikuje vybraná kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa tvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a expresie uvedeného súboru v systéme nefágového zobrazenia,
100
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,
e) je možné opakovať kroky b) až d) v prípade aspoň jednej inej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej polohy alebo hypermutačnej polohy,
f) kombinovanie v pôvodnej protilátke, alebo jej časti viažucej sa na antigén, jednotlivých mutácií, ktoré ukázali, že vykazujú zlepšenú aktivitu za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén.
Preferované kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96. Preferované hypermutačné polohy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L3 1, L32, L53 a L93. Viac výhodné preferované polohy selektívnej mutagenézy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94. Obzvlášť preferované kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94.
Pomocou doteraz dostupných metód nie je možné alebo je extrémne prácne získať protilátku so zvýšenou väzbovou afinitou a neutralizačnou silou, pričom si zachováva iné vlastnosti alebo charakteristiky protilátok, ako sa diskutuje vyššie v texte. Spôsob podľa vynálezu však môže ľahko
101 identifikovať také protilátky. Protilátky podrobené spôsobu podľa vynálezu môžu pochádzať z ľubovoľného zdroja.
Preto v ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén obsahujúci:
a) poskytnutie rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej polohy alebo hypermutačnej polohy pre mutáciu v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR), čím sa identifikuje vybraná preferovaná poloha selektívnej mutagenézy, kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa tvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru vo vhodnom expresívnom systéme,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) v súbore mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén sa hodnotí aspoň jedna iná vlastnosť alebo charakteristika, pričom vlastnosť alebo charakteristika je tá, ktorú je nutné v protilátke zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
102
V preferovanom uskutočnení vynálezu kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
V inom preferovanom uskutočnení vynálezu sú hypermutačné polohy vybrané zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Vo viac preferovanom uskutočnení vynálezu zvyšky pre selektívnu mutagenézu sú vybrané z preferovaných polôh selektívnej mutagenézy zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Vo viac preferovanom uskutočnení vynálezu obzvlášť preferované kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými
103 proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Ak teda by mala byť afinita protilátky voči špecifickému antigénu zlepšená, ale spôsob fágového zobrazenia (alebo príbuzný systém zahrnujúci zobrazenie ribozómu) nie je ďalej aplikovateľný a malí by byť zachované iné požadované vlastnosti alebo charakteristiky, môže byť použitá metóda podľa vynálezu.
Teda v ďalšom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti,
I ktorá bola získaná selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšená mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy pre mutáciu v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR), čím sa identifikuje vybraná poloha selektívnej mutagenézy, kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy aspoň na dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa tvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu
104
e) v súbore mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén sa hodnotí aspoň jedna iná vlastnosť alebo charakteristika, pričom vlastnosť alebo charakteristika je tá, ktorú je nutné v protilátke zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,
f) je možné opakovať kroky a) až e) v prípade aspoň jednej inej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej polohy alebo hypermutačnej polohy,
g) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch jednotlivých aminokyselinových zvyškov zvyšujúcich aktivitu, ktoré ukázali, že vykazujú zlepšenú aktivitu a aspoň jednu zachovanú vlastnosť alebo charakteristiku, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
h) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
V preferovanom uskutočnení vynálezu kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo
105
3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
V inom preferovanom uskutočnení sú hypermutačné polohy vybrané zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Vo viac preferovanom uskutočnení zvyšky pre selektívnu mutagenézu sú vybrané z preferovaných polôh selektívnej mutagenézy zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Vo viac preferovanom uskutočnení vynálezu sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p4O/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
V ďalšom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
106
a) poskytnutie rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti, ktorá bola získaná selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšená mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy pre mutáciu v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR), čím sa identifikuje vybraná kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa tvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) v súbore mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén sa hodnotí aspoň jedna iná vlastnosť alebo charakteristika, pričom vlastnosť alebo charakteristika je tá, ktorú je nutné v protilátke zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
V preferovanom uskutočnení vynálezu kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1)
107 zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p3 5, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
V ďalšom preferovanom uskutočnení vynálezu sú hypermutačné polohy vybrané zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93, a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza j
väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Vo viac preferovanom uskutočnení vynálezu sú zvyšky pre selektívnu mutagenézu vybrané z preferovaných polôh selektívnej mutagenézy zo skupiny pozostávajúcej z H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Vo viac preferovanom uskutočnení vynálezu sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo
108
3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
V inom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti, ktorá bola získaná selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšená mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy pre mutáciu v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR), čím sa identifikuje vybraná kontaktná alebo hypermutačná poloha,
c) jednotlivé mutácie uvedených vybraných preferovaných polôh selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy aspoň na dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa tvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich časti viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) v súbore mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén sa hodnotí aspoň jedna iná vlastnosť alebo charakteristika, pričom vlastnosť alebo charakteristika je tá, ktorú je nutné v protilátke zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vztiahnuté na k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,
109
f) je možné opakovať kroky a) až e) v prípade aspoň jednej inej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej polohy alebo hypermutačnej polohy,
g) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch jednotlivých aminokyselinových zvyškov zvyšujúcich aktivitu, ktoré ukázali, že vykazujú zlepšenú aktivitu a aspoň jednu zachovanú inú charakteristiku za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
h) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
V preferovanom uskutočnení vynálezu kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p4O/p3 5, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
V inom preferovanom uskutočnení vynálezu sú hypermutačná polohy vybrané zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3)
110 produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Vo viac preferovanom uskutočnení vynálezu zvyšky pre selektívnu mutagenézu sú vybrané z preferovaných polôh selektívnej mutafenézy zo skupiny obsahujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Vo viac preferovanom uskutočnení vynálezu sú kontaktné polohy vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94 a ďalšia charakteristika je vybraná z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
IV. Modifikácie iných zvyškov CDR
Všetky zvyšky CDR v danom páre protilátka-antigén identifikované ľubovoľným spôsobom sú nutné ako aminokyselinové zvyšky zvyšujúce aktivitu a/alebo sú nutné priamo alebo nepriamo pri naviazaní na antigén a/alebo pri zachovaní iných požadovaných vlastností alebo charakteristík protilátky. Také zvyšky CDR sú označené ako „preferované polohy selektívnej mutagenézy“. Malo by byť poznamenané, že pri špecifických okolnostiach, tieto preferované zvyšky selektívnej mutagenézy môžu byť identifikované tiež inými spôsobmi, ktoré zahrnujú spoločnú kryštalizáciu protilátky a antigénu a molekulárne modelovanie.
111
Ak sú preferované pokusy identifikovať aminokyseliny zvyšujúce aktivitu zameriavajúce sa na preferované polohy selektívnej mutagenézy, kontaktné a hypermutačné polohy opísané vyššie v texte vyčerpané, alebo ak sú nutné ďalšie zlepšenia, môžu byť modifikované zostávajúce zvyšky CDR, ako sa opisuje ďalej v texte. Malo by byť jasné, že protilátka by mohla už byť modifikovaná v ľubovoľnej jednej alebo viacerých kontaktných alebo hypermutačných polohách v súlade s uskutočneniami vynálezu diskutovanými vyššie v texte, ale môže byť nutné ďalšie zlepšenie. Preto, v inom uskutočnení vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén zahrnujúci:
a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej polohy napríklad na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa vytvorí mutovaná protilátka alebo súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity mutovanej protilátky alebo súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) u mutovaných protilátok a súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén sa hodnotia zmeny aspoň jednej vlastnosti alebo charakteristiky, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
112
Prednostne sa iná charakteristika alebo vlastnosť vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, ktorý predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
Keď mutagenéza jediného zvyšku nie je dostatočná, môžu byť zahrnuté iné zvyšky, preto v inom uskutočnení vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa vytvoria mutované protilátky alebo súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) opakovanie krokov b) až d) pre aspoň jednu inú polohu CDR, ktorou nie je ani poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
113
f) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch aminokyselinových zvyškov, ktoré individuálne zvyšujú aktivitu a ktoré ukázali, že majú zlepšenú aktivitu, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zosilňujúcimi aktivitu vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na antigén, so zlepšenou aktivitou vzhľadom k východiskovej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
Ak sú preferované pokusy identifikovať aminokyseliny zvyšujúce aktivitu zameriavajúce sa na kontaktné alebo hypermutačné polohy opísané vyššie v texte vyčerpané, alebo ak sú nutné ďalšie zlepšenia a diskutovaná protilátka nemôže byť ďalej optimalizovaná mutagenézou a metódami fágového zobrazenia (alebo príbuzným zobrazením ribozómu), môžu byť modifikované zostávajúce zvyšky CDR, ako sa opisuje ďalej v texte. Malo by byť jasné, že protilátka by mohla už byť modifikovaná v ľubovoľnej jednej alebo viacerých preferovaných polohách selektívnej mutagenézy, v kontaktných alebo hypermutačných polohách v súlade s uskutočneniami vynálezu diskutovanými vyššie v texte, ale môže byť nutné ďalšie zlepšenie.
Preto, v ďalšom uskutočnení, vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén zahrnujúci:
a) poskytnutie rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala výberom v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšená mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31,
H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95,
114
Η96, Η97, Η98, Η101, L3O, L31, L32, L34, L5O, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa vytvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) u súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén sa hodnotia zmeny aspoň jednej vlastnosti alebo charakteristiky, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
Prednostne sa iná charakteristika alebo vlastnosť vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p4O/p35, čo predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
Ak jediná mutagenéza nie je dostatočná, aby zvýšila afinitu protilátky, môžu byť do mutagenézy zahrnuté iné zvyšky. Preto, v inom uskutočnení vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala selekciou v systéme fágového zobrazenia,
115 ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšená mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa vytvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) opakovanie krokov b) až d) pre aspoň jednu inú polohu CDR, ktorou nie je ani poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94,
f) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch aminokyselinových zvyškov individuálne zvyšujúcich aktivitu, ktoré ukázali, že majú zlepšenú aktivitu, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok a iných vlastností alebo charakteristík kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zosilňujúcimi aktivitu vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej
116 časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou, čo sa vzťahuje k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
Prednostne sa iná charakteristika alebo vlastnosť vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, čo predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
Preferované pokusy identifikovať aminokyseliny zvyšujúce aktivitu zameriavajúce sa na preferované polohy selektívnej mutagenézy, kontaktné alebo hypermutačné polohy opísané vyššie v texte môžu byť vyčerpané alebo môžu byť nutné ďalšie zlepšenia a je dôležité zachovať iné vlastnosti alebo charakteristiky protilátky.
Preto v ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, bez ovplyvnenia iných charakteristík, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa vytvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo k jej
117 časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) u súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén sa hodnotia zmeny aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky, vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a zachovanou inou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
Prednostne sa iná charakteristika alebo vlastnosť vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, čo predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Keď mutagenéza jediného zvyšku nie je dostatočná, môžu byť zahrnuté iné zvyšky, preto v ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa vytvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,
118
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) u súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, sa hodnotia zmeny aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky,
f) opakovanie krokov b) až e) pre aspoň jednu inú polohu CDR, ktorou nie je ani poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
g) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch aminokyselinových zvyškov, ktoré individuálne zvyšujú aktivitu a ktoré ukázali, že majú zlepšenú aktivitu a neovplyvňujú aspoň jednu inú vlastnosť alebo charakteristiku, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
h) hodnotenie aktivity a zachovania aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zosilňujúcimi aktivitu vo vzťahu k pôvodnej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na antigén, so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou inou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
Mutagenéza preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktných a hypermutačných zvyškov nemusí dostatočne zvýšiť afinitu protilátky a mutagenéza a spôsob zobrazujúci fága (alebo príbuzná metóda zobrazujúca
119 ribozóm) nemusia byť ďalej použiteľné a mala by byť zachovaná aspoň jedna iná charakteristika alebo vlastnosť protilátky.
Preto v ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorý zahrnuje:
a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšená mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa vytvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) u súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén sa hodnotia zmeny aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
Prednostne sa iná charakteristika alebo vlastnosť vybrala z 1) zachovania neskríženej reaktivity s inými proteínmi alebo ľudskými tkanivami, 2) zachovania rozpoznania epitopu, to je rozpoznania epitopu podjednotky p40 výhodne v súvislosti s heterodimérom p70 p40/p35, čo
120 predchádza väzbovej interferencii voľnej rozpustnej podjednotky p40 a/alebo 3) produkcie protilátky, so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
Keď mutagenéza jediného zvyšku nie je dostatočná, môžu byť zahrnuté iné zvyšky, preto v inom uskutočnení vynález poskytuje metódu zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá zahrnuje:
a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšená mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,
b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, v polohe inej než H30, H3 1, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
c) jednotlivé mutácie uvedenej vybranej polohy aspoň na dva iné aminokyselinové zvyšky, čím sa vytvorí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie v systéme nefágového zobrazenia,
d) hodnotenie aktivity a zachovania aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,
e) opakovanie krokov b) až d) pre aspoň jednu inú polohu CDR, ktorou nie je ani poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,
121
f) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch aminokyselinových zvyškov, ktoré individuálne zvyšujú aktivitu a ktoré ukázali, že majú zlepšenú aktivitu a neovplyvňujú aspoň jednu inú vlastnosť alebo charakteristiku, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a
g) hodnotenie aktivity a zachovania aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky kombinačných protilátok alebo ich časti viažucej sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zosilňujúcimi aktivitu vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou inou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
V. Expresia protilátok
Protilátka alebo časť protilátky podľa vynálezu môže byť pripravená rekombinantnou expresiou génov ľahkého a ťažkého reťazca imunoglobulínu v hostiteľskej bunke. Aby došlo k expresii rekombinantnej protilátky, hostiteľská bunka sa transfekovala jedným alebo viac rekombinantnými expresívnymi vektormi, ktoré nesú fragmenty DNA kódujúce imunoglobulínový ľahký a ťažký reťazec protilátky tak, že ľahký a ťažký reťazec je exprimovaný v hostiteľskej bunke a prednostne sa vylučuje do média, v ktorom sú kultivované hostiteľské bunky a z ktorého sú protilátky získavané. Aby sa získali gény ťažkého a ľahkého reťazca protilátky, sú používané štandardné metódy rekombinácie DNA, pričom sa tieto gény začlenia do rekombinantných expresívnych vektorov a vektory sa zavedú do hostiteľských buniek, ako sa opisuje v publikácii Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al., (eds.) Current
122
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) a v US patente č. 4,816,397 (Boss et al.,).
Aby sa získal fragment DNA kódujúci variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky Joe 9 wt alebo protilátky príbuznej Joe 9 wt, testovali sa a mutovali sa protilátky špecifické pre ľudský IL-12 pochádzajúce z ľudskej knižnice, ako sa opisuje v sekcii 11. Keď sú získané fragmenty DNA kódujúce segmenty VH a VL protilátky Joe 9 wt alebo protilátky príbuznej protilátke Joe 9 wt, mutagenéza týchto sekvencií je uskutočnená štandardnými metódami, ako je miestne riadená mutagenéza (mutagenéza sprostredkovaná PCR, v ktorej sú mutované nukleotidy začlenené do primérov PCR tak, že produkt PCR obsahuje mutácie) alebo inými metódami miestne riadenej mutagenézy. Protilátky proti ľudskému IL-12, ktoré vyjadrovali potrebný stupeň aktivity a väzbovej špecifity/afinity, ako je napríklad J695, boli ďalej manipulované štandardnými metódami rekombinácie DNA, napríklad sa variabilné oblasti génov premenia na gény reťazcov protilátky plnej dĺžky, na gény fragmentov Fab alebo na gén scFv. Pri týchto manipuláciách fragment DNA kódujúci VL alebo VH je operatívne spojený s iným fragmentom DNA, ktorý kóduje iný proteín, ako je konštantná oblasť protilátky alebo flexibilná spojka. Termín „operatívne spojený“ používaný v tomto kontexte znamená, že dva fragmenty DNA sú spojené tak, že aminokyselinové sekvencie kódované dvoma fragmentárni DNA zostávajú v rámci.
Izolovaná DNA kódujúca oblasť VH môže byť premenená na gén ťažkého reťazca plnej dĺžky operatívnym spojením DNA kódujúcej VH k inej molekule DNA kódujúcej konštantné oblasti ťažkého reťazca (CHI, CH2 a CH3). V odbore sú známe sekvencie génov konštantnej oblasti ľudského ťažkého reťazca (opisuje sa napríklad v publikácii Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication č. 91-3242) a fragmenty DNA obsahujúce tieto oblasti môžu byť získané štandardnou amplifikácio PCR. Konštantná oblasť ťažkého reťazca môže byť konštantná oblasť IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM alebo IgD a ľubovoľný alotypický variant, ako sa opisuje v publikácii Kabat, E.A. et al., (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.
123
Department of Health and Human Services, NIH Publiaction No. 91-3242), ale najvýhodnejšia je konštantná oblasť IgGl alebo IgG4. V prípade génu ťažkého reťazca fragmentu Fab DNA kódujúca VH môže byť operatívne spojená s inou molekulou DNA, ktorá kóduje iba konštantnú oblasť CH1 ťažkého reťazca.
Izolovaná DNA kódujúca oblasť VL môže byť premenená na gén ľahkého reťazca plnej dĺžky (rovnako ako gén ľahkého reťazca fragmentu Fab) operatívnym spojením DNA kódujúcej VL s inou molekulou DNA, ktorá kóduje konštantnú oblasť ľahkého reťazca CL. Sekvencie génov konštantnej oblasti ľudského ľahkého reťazca sú známe v odbore (opisuje sa napríklad v publikácii Kabat, E. A., et al., (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), a fragmenty DNA obsahujúce tieto oblasti môžu byť získané štandardnou amplifikáciou pomocou PCR. Konštantná oblasť ľahkého reťazca môže byť konštantná oblasť kappa alebo lambda, ale najvýhodnejšia je konštantná oblasť lambda.
Aby sa vytvoril gén scFv, fragmenty DNA kódujúce VH a VL sú operatívne spojené s iným fragmentom kódujúcim flexibilnú spojku, napríklad kódujúcim aminokyselinovú sekvenciu (Gly4-Ser3) tak, že sekvencie VH a VL môžu byť exprimované ako kontinuálny jednoreťazcový proteín s oblasťami VL a VH spojenými flexibilnou spojkou (opisuje sa napríklad v publikácii Bird et al., (1988) Science 242: 423-426, Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. sci. USA 85: 5879-5883, McCafferty et al., Náture (1990) 348: 552554).
Aby sa exprimovali protilátky alebo časti protilátok podľa vynálezu, DNA kódujúce ľahké a ťažké reťazce čiastočnej alebo plnej dĺžky získané spôsobom opísaným vyššie v texte, sú začlenené do expresívnych vektorov tak, že gény sú operatívne spojené so sekvenciami, ktoré riadia transkripciu a transláciu. V tomto kontexte termín „operatívne spojený“ znamená, že gén protilátky je ligovaný do vektora tak, že sekvencie riadiace transkripciu a transláciu vo vektore plnia svoju funkciu regulácie transkripcie a translácie génu protilátky. Expresívny vektor a sekvencie riadiace expresiu sú vybrané
124 tak, aby boli kompatibilné s používanou expresívnou hostiteľskou bunkou. Gén ľahkého a ťažkého reťazca protilátky môže byť začlenený do nezávislého vektora alebo vo viac typickom prípade sa oba gény začlenili do rovnakého expresívneho vektora. Gény protilátky sú začlenené do expresívneho vektora štandardnými metódami (napríklad ligáciou komplementárnych reštrikčných miest vo fragmente génu protilátky alebo vektore alebo ligáciou tupých koncov, ak nie je prítomné žiadne reštrikčné miesto). Pred začlenením sekvencii ľahkého alebo ťažkého reťazca protilátky J695 alebo protilátky príbuznej J695, expresívny vektor môže už niesť sekvencie konštantnej oblasti protilátky. Jeden prístup konverzie sekvencii VH a VL protilátky J695 alebo protilátky príbuznej protilátke J695 na gény protilátky plnej dĺžky je ich začlenenie do expresívnych vektorov, ktoré už kódujú konštantné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca, respektíve tak, že segment VH je operatívne spojený so segmentom(ami) CH vo vektore a segment VL je operatívne spojený so segmentom CL vo vektore. Navyše alebo v inom prípade rekombinantný expresívny vektor môže kódovať signálny peptid, ktorý umožňuje vylučovanie reťazca protilátky z hostiteľskej bunky. Gén reťazca protilátky môže byť klonovaný do vektora tak, že signálny peptid je spojený v rámci s N-koncom génu reťazca protilátky. Signálny peptid môže byť signálny peptid imunoglobulínu alebo heterológny signálny peptid (to je signálny peptid z proteínu, ktorý nie je imunoglobulín).
Vedľa génov reťazca protilátky rekombinantné expresívne vektory podľa vynálezu nesú regulačné sekvencie, ktoré riadia expresiu génov reťazca protilátky v hostiteľskej bunke. Termín „regulačná sekvencia“ zahrnuje promótory, zosilňovače a iné elementy riadiace expresiu (napríklad polyadenylačné signály), ktoré riadia transkripciu alebo transláciu génov reťazca protilátky. Také regulačné sekvencie sú opísané napríklad v publikácii Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, C-A (1990). Pre odborníka je prínosné, keď uskutočnenie expresívneho vektora zahrnujúce selekciu regulačných sekvencii môže závisieť od takých faktorov ako je voľba hostiteľskej bunky, ktorá bude transformovaná, sila expresie požadovaného proteínu atď. Preferované regulačné sekvencie expresie cicavčej hostiteľskej bunky zahrnujú vírusové
125 elementy, ktoré riadia vysokú silu expresie proteínu v cicavčích bunkách tak, ako promótory a/alebo zosilňovače získané z cytomegelovírusu (CMV) (ako je promótor/zosilňovač CMV), opičieho vírusu 40 (SV40) (ako je promótor/zosilňovač SV40), adenovírusu (napríklad adenovírusový hlavný neskorý promótor (AdMLP)) a polyoma. Opis vírusových regulačných elementov a sekvencií sa uvádza v patentových dokumentoch patent US č. 5,168,062 (Stinski), patent uS č. 4,510,254 (Bell et al.) a patent US č. 4,968,615 (Schaffner et al.,), patent US č. 5,464,758 (Bujard et al.,) a patent US č. 5,654,168 (Bujard et al.,).
Vedľa génov reťazca protilátky a regulačných sekvencií rekombinantné expresívne vektory podľa vynálezu môžu niesť ďalšie sekvencie, ako sú sekvencie, ktoré regulujú replikáciu vektora v hostiteľských bunkách (napr. počiatok replikácie) a selektovateľné markerové gény. Selektovateľný markerový gén umožňuje selekciu hostiteľských buniek, do ktorých bol zavedený vektor (opisuje sa napríklad v dokumentoch patent US č. 4,399,216, 4,634,665 a 5,179,017 (Axel et al.). V typickom prípade napríklad selektovateľný markerový gén poskytuje hostiteľskej bunke, do ktorej bol vektor zavedený, rezistenciu na lieky, ako je G418, hygromycín alebo metotrexát. Preferované selektovateľné markerové gény zahrnujú gén dihydrofolátovej reduktázy (DHFR) (na použitie v hostiteľských bunkách dhfr's so selekciou na metotrexáte/amplifikáciou) a gén neu (v prípade selekcie pomocou G418).
Aby sa dosiahla expresia ľahkého a ťažkého reťazca, expresívny vektor(y) kódujúci ťažký a ľahký reťazec je transfekovaný do hostiteľskej bunky štandardnými postupmi. Variačné formy termínu „transfekcia“ zahrnujú široký sortiment postupov bežne používaných na zavedenie exogénnej DNA do prokaryontnej alebo eukaryontnej hostiteľskej bunky, napríklad elektroporáciou, zrážaním fosforečnanom vápenatým, transfekciou dextránomDEAE a podobne. Hoci je teoreticky možné exprimovať protilátky podľa vynálezu buď v prokaryontných alebo eukaryontných hostiteľských bunkách, najviac je preferovaná expresia protilátok v eukaryontných bunkách a najvýhodnejšie v cicavčích hostiteľských bunkách, pretože také eukaryontné bunky a obzvlášť cicavčie bunky s väčšou pravdepodobnosťou v porovnaní
126 s prokaryontnými bunkami tvoria a vylučujú správne zbalenú a imunologický aktívnu protilátku. Preferované cicavčie hostiteľské bunky vhodné pre expresiu rekombinantných protilátok podľa vynálezu zahrnujú bunky vaječníkov čínskych škrečkov (bunky CHO) (zahrnujúce bunky dhfr-CHO opísané v publikácii Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, používané so selekčným markerom DHFR, napríklad ako sa opisuje v publikácii Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601621), bunky myelómu NSO, bunky COS a SP2. Keď rekombinantné expresívne vektory kódujúce gény protilátok sú zavedené do cicavčích hostiteľských buniek, protilátky sú produkované kultiváciou hostiteľských buniek počas časového úseku, ktorý je dostatočný, aby umožnil expresiu protilátky v hostiteľských bunkách alebo výhodnejšie, vylučovanie protilátky do kultivačného média, v ktorom sú kultivované hostiteľské bunky. Protilátky môžu byť získané z kultivačného média použitím štandardných metód čistenia proteínu.
Hostiteľské bunky môžu byť tiež používané na produkciu častí intaktných protilátok, ako sú fragmenty Fab alebo molekuly scFV. Rozumie sa, že varianty vyššie opísaného postupu sú obsahom vynálezu. Môže byť napríklad nutné transfekovať hostiteľskú bunku DNA kódujúcou buď ľahký alebo ťažký reťazec (ale nie oba reťazce) protilátky podľa vynálezu. Technológia rekombinácie DNA môže tiež byť používaná na odstránenie časti alebo celej DNA kódujúcej buď ľahký alebo ťažký reťazec alebo oba, ktorá nie je nutná pri naviazaní na hIL-12. Molekuly exprimované z takých skrátených molekúl DNA sú tiež zahrnuté v protilátkach podľa vynálezu. Navyše môžu byť produkované bifunkčné protilátky, v ktorých jeden ťažký a jeden ľahký reťazec je protilátka podľa vynálezu a ďalší ťažký a ľahký reťazec je špecifický pre antigén iný než hIL-12, prekrížením protilátky podľa vynálezu s druhou protilátkou štandardnými metódami chemického zosieťovania.
V preferovanom systéme pre expresiu rekombinantnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén podľa vynálezu, je rekombinantný expresívny vektor kódujúci ťažký a ľahký reťazec protilátky zavedený do buniek dhfr’ CHO transfekciou sprostredkovanou fosforečnanom vápenatým
127
V rekombinantnom expresívnom vektore sú gény ťažkého a ľahkého reťazca protilátky každý operatívne spojený s regulačnými elementárni zosilňovača/promótora (získané napríklad z SV40, CMV, adenovírusu a podobne, ako je zosilňovač CMV/promótorový regulačný element AdMLP alebo zosilňovač SV40/promótorový regulačný element AdMLP), aby došlo k vysokému stupňu transkripcie génov. Rekombinantný expresívny vektor tiež nesie gén DHFR, ktorý umožňuje selekciu buniek CHO, ktoré boli transfekované vektorom použitím metotrexátovej selekcie/amplifikácie. Vybrané transformované hostiteľské bunky sú kultivované, aby sa umožnila expresia ťažkého a ľahkého reťazca protilátky a z kultivačného média je získavaná intaktná protilátka. Na prípravu rekombinantného expresívneho vektora, transfekovaných hostiteľských buniek, pri výbere transformantov, pri kultivácii hostiteľských buniek a získaní protilátky z kultivačného média sú používané štandardné metódy molekulárnej biológie. Protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén podľa vynálezu môžu byť exprimované vo zvierati (napríklad v myši), ktorá je transgénna v prípade génov ľudského imunoglobulínu (opisuje sa napríklad v publikácii Taylor L.D. et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295). Rastlinné bunky môžu byť tiež modifikované za vzniku transgénnych rastlín, ktoré exprimujú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén podľa vynálezu.
Na základe predchádzajúceho textu ďalší aspekt vynálezu sa týka kompozícií nukleovej kyseliny, vektora a hostiteľskej bunky, ktoré môžu byť použitíé pri expresii rekombinantnej protilátky a časti protilátok podľa vynálezu. Vynález výhodne charakterizuje izolované nukleové kyseliny, ktoré kódujú oblasti CDR protilátky J695 alebo variabilnú oblasť celého ťažkého a/alebo ľahkého reťazca protilátky J695. Teda v jednom uskutočnení vynálezu sa charakterizuje izolovaná nukleová kyselina kódujúca variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky, ktorá kóduje CDR3 ťažkého reťazca protilátky J695 obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25. Prednostne nukleová kyselina kódujúca variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky ďalej kóduje CDR2 ťažkého reťazca protilátky J695, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 27. Výhodnejšie je, keď nukleová kyselina kódujúca variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky ďalej kóduje
128
CDR1 ťažkého reťazca protilátky J695, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 29. Dokonca výhodnejšie je, keď izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 31 (celá oblasť VH protilátky J695).
V iných uskutočneniach vynálezu sa charakterizuje izolovaná nukleová kyselina kódujúca variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky, ktorá kóduje CDR3 ľahkého reťazca protilátky J695 obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26. Výhodnejšie je, keď nukleová kyselina kódujúca variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky ďalej kóduje CDR2 ľahkého reťazca protilátky J695, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28. Výhodnejšie je, keď nukleová kyselina kódujúca variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky ďalej kóduje CDR1 ľahkého reťazca protilátky, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 30. Dokonca výhodnejšie je, keď izolovaná nukleová kyselina kóduje variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 32 (celá oblasť VL protilátky J695).
Vynález tiež poskytuje rekombinantné expresívne vektory kódujúce ťažký a ľahký reťazec protilátky. V jednom uskutočnení vynálezu sa napríklad opisuje rekombinantný expresívny vektor kódujúci:
a) ťažký reťazec protilátky, ktorý má variabilnú oblasť obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO- 31 a
b) ľahký reťazec protilátky, ktorý má variabilnú oblasť obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 32.
Vynález tiež poskytuje hostiteľské bunky, do ktorých boli zavedené rekombinantné expresívne vektory podľa vynálezu. Hostiteľskou bunkou je výhodne cicavčia hostiteľská bunka, výhodnejšie je, keď hostiteľskou bunkou je bunka CHO, NSO alebo COS. Vynález ďalej poskytuje spôsob syntézy rekombinantnej ľudskej protilátky podľa vynálezu kultiváciou hostiteľskej bunky podľa vynálezu vo vhodnom kultivačnom médiu dokým nie je syntetizovaná rekombinantná ľudská protilátka podľa vynálezu Spôsob môže > r e
129 ópŕavena ŕtrana ďalej zahrnovať izoláciu rekombinantnej ľudskej protilátky z kultivačného média.
VI. Farmaceutické prostriedky a farmaceutická aplikácia
Protilátky a časti protilátok podľa vynálezu môžu byť začlenené do farmaceutických prostriedkov vhodných pre aplikáciu subjektu. V typickom prípade farmaceutický prostriedok obsahuje protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén a farmaceutický prijateľný nosič. V tomto vynáleze termín „farmaceutický použiteľný nosič“ zahrnuje ľubovoľné a všetky rozpúšťadlá, disperzné médiá, poťahové činidlá, antibakteriálne a fungicídne činidlá, izotonické činidlá a činidlá odďaľujúce absorpciu a podobne, ktoré sú fyziologicky kompatibilné. Príklady farmaceutický prijateľných nosičov zahrnujú jedno alebo viac činidiel zo skupiny obsahujúcej vodu, fyziologický roztok, fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanom, dextrózu, glycerol, etanol a podobne, rovnako ako ich kombinácie. V mnohých prípadoch bude výhodné, keď prostriedok zahrnuje izotonické činidlá napríklad cukry, polyalkoholy, ako je manitol, sorbitol alebo chlorid sodný. Farmaceutický prijateľné nosiče môžu ďalej obsahovať malé množstvo pomocných látok, ako sú zmáčacie alebo emulgačné činidlá, konzervačné činidlá alebo pufre, ktoré predlžujú možnú dobu skladovania alebo účinnosť protilátky alebo jej časti.
Protilátky alebo ich časti podľa vynálezu môžu byť začlenené do farmaceutického prostriedku vhodného pre parenterálnu aplikáciu. Prednostne protilátka alebo jej časti budú pripravované ako roztok obsahujúci 0,1 až 250 mg/ml protilátky vhodný pre zavedenie injekciou. Roztok vhodný pre aplikáciu injekciou môže byť obsiahnutý buď v kvapalnej alebo lyofilizovanej dávkovej forme v skúmavke, ampuli alebo vopred naplnenej injekčnej striekačke z bieleho alebo ambrového skla. Pufrom môže byť L-histidín (1 až 50 mM, v optimálnom prípade 5 až 10 mM s hodnotou pH 5,0 až 7,0 (v optimálnom prípade hodnota pH je 6,0). Iné vhodné pufry zahrnujú, ale nie sú obmedzené na ne, sukcinát sodný, citrát sodný, fosforečnan sodný alebo fosforečnan vápenatý Chlorid sodný môže byť používaný na modifikáciu
130 toxicity roztoku v koncentrácii 0 až 300 mM (v prípade kvapalnej dávkovej formy je optimálna hodnota koncentrácie 150 mM). Ochranné činidlá proti poškodeniu pri hlbokom zmrazení môžu byť zahrnuté v lyofilizovanej dávkovej forme, v princípe ide o 0 až 10 % sacharózy (v optimálnom prípade 0,5 až 1,0 %). Iné vhodné ochranné činidlá proti poškodeniu pri hlbokom zmrazení zahrnujú trenhalózu a laktózu. V lyofilizovanej dávkovej forme môžu byť obsiahnuté objemové činidlá, hlavne 1 až 10% manitolu (v optimálnom prípade 2 až 4%). Ako v kvapalnej tak lyofilizovanej dávkovej forme môžu byť používané stabilizačné činidlá, hlavne 1 až 50 mM L-metionínu (v optimálnom prípade 5 až 10 mM). Iné vhodné objemové činidlá zahrnujú glycín, arginín a môžu byť obsiahnuté ako 0 až 0,05% polysorbátu-80 (v optimálnom prípade 0,005 až 0,01%). Ďalšie povrchovo aktívne činidlá zahrnujú, ale nie sú obmedzené na polysorbát 20 a BRIJ.
V preferovanom uskutočnení vynálezu farmaceutický prostriedok zahrnuje protilátku v dávke približne 0,01 mg/kg až 10 mg/kg. Výhodnejšie dávky protilátky zahrnujú 1 mg/kg aplikovaný každý druhý týždeň alebo 0,3 mg/kg aplikovaný raz týždenne.
Prostriedky podľa vynálezu môžu byť v rôznych formách. Tieto formy zahrnujú napríklad kvapalné, semi-pevné a pevné dávkové formy, ako sú kvapalné roztoky (napríklad roztoky vhodné na zavedenie injekciou a infúziou), disperzie alebo suspenzie, tablety, pilulky, prášky, lipozómy a čapíky. Výhodná forma závisí od módu aplikácie a od terapeutickej aplikácie. Typické výhodné prostriedky sú vo forme roztokov vhodných pre zavedenie injekciou a infúziou, ako sú prostriedky podobné tým, ktoré sa používajú v prípade pasívnej imunizácie ľudí s inými protilátkami. Výhodný mód aplikácie je parenterálny (napríklad intravenózny, subkutánny, intraperitoneálny, intramuskulárny). V preferovanom uskutočnení vynálezu je protilátka aplikovaná intravenóznou infúziou alebo injekciou. V inom preferovanom uskutočnení vynálezu je protilátka aplikovaná intramuskulárnou alebo subkutánnou injekciou.
Terapeutické prostriedky musia byť v typickom prípade vo výrobných a skladovacích podmienok sterilné a stabilné Prostriedok môže tvoriť roztok,
131 mikroemulziu, disperziu, lipozóm alebo inú usporiadanú štruktúru vhodnú pre lieky s vysokou koncentráciou. Sterilné roztoky vhodné na zavedenie injekciou môžu byť pripravené začlenením aktívnej látky (to je protilátky alebo jej časti) v požadovanom množstve vo vhodnom rozpúšťadle, dohromady s jednou alebo s kombináciou ingrediencií uvedených vyššie v texte, ak je potrebné, nasledovanou sterilizáciou filtráciou. Vo všeobecnom prípade sú disperzie pripravené začlenením aktívnej zlúčeniny do sterilného vehikula, ktorý obsahuje bázické disperzné médium a požadované iné ingrediencie z tých vymenovaných vyššie v texte V prípade sterilných, lyofilizovaných práškov na prípravu sterilných roztokov vhodných pre aplikáciu injekciou sú preferované metódy prípravy sušenie vo vákuu a sušenie rozprašovaním, pričom vzniká prášok aktívnej ingrediencie plus ľubovoľná ďalšia požadovaná ingrediencia z ich roztokov, ktoré boli pred tým sterilizované filtráciou. Správna tekutosť roztoku môže byť udržovaná napríklad použitím poťahov, ako je lecitín, v prípade disperzie udržovaním požadovanej veľkosti častíc a použitím povrchovo aktívnych činidiel. Prolongovaná absorpcia prostriedkov vhodných na zavedenie injekciou môže byť uskutočnená, keď sa do prostriedku zahrnie činidlo, ktoré oneskoruje absorpciu napríklad monostearátové soli a želatína.
Protilátky a časti protilátok podľa vynálezu môžu byť aplikované rôznymi metódami známymi v odbore, hoci v prípade radu terapeutických aplikácií je výhodnou cestou/módom aplikácie subkutánna a intravenózna injekcia alebo infúzia. Pre odborníka je výhodné, aby spôsob a/alebo mód aplikácie bol rôzny v závislosti od požadovaných výsledkov. V istých uskutočneniach vynálezu môže byť aktívna látka pripravená s nosičom, ktorý bude chrániť zlúčeninu proti rýchlemu uvoľneniu, ako je formulácia s riadeným uvolňovaním, zahrnujúca implantáty, transdermálne náplasti a mikrokapsulárne zavádzacie systémy. Môžu byť použité biologicky rozložiteľné a biologicky kompatibilné polyméry, ako je etylén-vinylacetát, polyanhydridy, polyglykolová kyselina, kolagén, polyortoestery a kyselina polyrnliečna Rad metód prípravy takých formulácií je chránený patentom alebo je vo všeobecnom prípade známy v odbore (opisuje sa napr. v publikácii
132
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, 1978).
V istých uskutočneniach vynálezu protilátka alebo jej časť podľa vynálezu môže byť aplikovaná orálne, napríklad s inertným riedidlom alebo s prispôsobiteľným jedlým nosičom. Látka (a iné ingrediencie, ak je to žiaduce) môžu tiež byť uzavrené v tvrdej alebo mäkkej želatínovej dutej kapsule, lisované do tabliet alebo pridané priamo do jedla subjektu. V prípade orálnej aplikácie látky môžu byť začlenené s ekcipientami a môžu byť používané vo forme požívateľných tabliet, bukálnych tabliet, pastiliek, kapsúl, elixírov, suspenzií, syrupov, oplátok a podobne. Aby sa látka podľa vynálezu aplikovala inou než parenterálnou aplikáciou, môže byť nevyhnutné potiahnuť ju materiálom, ktorý bráni jej deaktivácii alebo látku s týmto materiálom možno aplikovať dohromady.
Do prostriedkov môžu tiež byť začlenené doplnkové aktívne zlúčeniny. V istých uskutočneniach vynálezu je protilátka alebo jej časť podľa vynálezu pripravená spoločne s jedným alebo s viac terapeutickými činidlami alebo sa s nimi spolu aplikuje. Uvedené činidlá sú použiteľné pri liečbe porúch, kde je aktivita IL-12 škodlivá. Napríklad protilátka proti hIL-12 alebo jej časť podľa vynálezu môže byť pripravená spoločne s jednou alebo viac ďalšími protilátkami, ktoré sa viažu na iné ciele, alebo je s nimi spoločne aplikovaná (napríklad protilátky, ktoré sa viažu na iné cytokíny alebo ktoré sa viažu na molekuly na bunečnom povrchu). Navyše jedna alebo viac protilátok podľa vynálezu môže byť použitá v kombinácii s dvoma alebo viac cudzorodými terapeutickými činidlami. Také kombinačné terapie môžu výhodne využívať nižšie dávky aplikovaných terapeutických činidiel a tak predísť možnej toxicite alebo komplikáciám spojeným s rôznymi jednotlivými terapiami. Pre odborníka bude výhodné, že keď sú používané protilátky podľa vynálezu ako časť kombinačnej terapie, môže byť požadovaná nižšia dávka, než keď sa subjektu aplikuje samotná protilátka (napríklad synergický terapeutický účinok je možné dosiahnuť použitím kombinačnej terapie, ktorá naopak umožňuje dosiahnuť požadovaný terapeutický účinok pri nižšej dávke protilátky).
133 * * - r
Interleukín 12 má dôležitú úlohu v patológii spojenú s rôznymi ochoreniami, ktoré zahrnujú imunitné a zápalové elementy. Tieto ochorenia zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, reumatoidnú artritídu, osteoartritídu, chronickú artritídu u mladistvých, Lymskú artritídu, psoriatickú artritídu, reaktívnu artritídu, spondyloartropatiu, systémový lupus erythematosus, Crohnovu chorobu, ulceratívnu kolitídu, zápalové ochorenie čreva, inzulín dependentnú cukrovku, tyreoiditídu, astmu, alergické ochorenia, psoriázu, dermatitídu skleroderma, atopickú dermatitídu, ochorenie hostiteľa verzus transplantát, odmietnutie transplantovaného orgánu, akútne alebo chronické imunitné ochorenie spojené s transplantáciou orgánu, sarkoidózu, aterosklerózu, diseminovanú intravaskulárnu koaguláciu, Kawasakiho ochorenie, exoftalmickú strumu, nefrotický syndróm, chronický únavový syndróm, Wegenerovu granulomatózu, Henochovu-Schoenleinovu purpuru, mikroskopickú vaskulitídu obličiek, chronickú aktívnu hepatitídu, uveitídu, septický šok, syndróm toxického šoku, sepsu, kachexiu, infekčné ochorenia, parazitické ochorenia, syndróm získanej imunitnej nedostatočnosti, akútnu myelitis transversa, Huntingtonovu choreu, Parkinsonovu chorobu, Alzheimerovu chorobu, mŕtvicu, primárnu biliárnu cirhózu, hemolytickú anémiu, zhubné bujnenie, zlyhanie srdca, infarkt myokardu, Addisonovu chorobu, sporadickú polyglandulárnu deficienciu typu 1 a polyglandulárnu deficienciu typu II, Schmidtov syndróm, syndróm (akútneho) sťaženého dýchania u dospelých, alopéciu, alopéciu aerata, séronegatívnu artropatiu, artropatiu, Reiterovu chorobu, lupienkovú artropatiu, artropatiu pri ulceróznej kolitíde, enteropatickú synovitídu, artropatiu alebo spondyloartropatiu spojenú s chlamýdiami, yersiniami a salmonelou, ateromatózu, artériosklerózu, atopickú alergiu, autoimunitné bulózne ochorenie, pemfigus vulgaris, listovitý pemfigus, pemfigoid, lineárne ochorenie IgA, autoimunitnú hemolytickú anémiu, Coombs-pozitívnu hemolytickú anémiu, získanú pernicióznu anémiu, juvenilnú pernicióznu anémiu, myalgickú encefalitídu/“Royal Free Disease“, chronickú mukokutánnu kandidózu, gigantocelulárnu arteritídu, primárnu sklerotizujúcu hepatitídu, kryptogénnu autoimunitnú hepatitídu, syndróm získanej imunitnej nedostatočnosti - AIDS, ochorenia spojené s AIDS, hepatitídu C, bežnú zmiešanú imunonedostatočnosť (bežnú variabilnú hypogamaglobul inémiu), dilatačnú
134 kardiomyopatiu, neplodnosť u žien, nefunkčnosť vaječníkov, predčasnú nefunkčnosť vaječníkov, fibrotické ochorenie pľúc, kryptogénnu fibrotizujúcu alveolitídu, pozápalové intersticiálne ochorenie pľúc, intersticiálny zápal pľúc, intersticiálne ochorenie pľúc spojené s ochorením spojivového tkaniva, ochorenie pľúc spojené so zmiešaným ochorením spojivového tkaniva, intersticiálne ochorenie pľúc spojené so systémovou sklerózou, intersticiálne ochorenie pľúc spojené s reumatoidnou artritídou, ochorenie pľúc spojené so systémovým lupus erythematosus, ochorenie pľúc spojené s dermatomyozitídou/polymyozitidou, ochorenie pľúc spojené so Sjógrenovou chorobou, ochorenie pľúc spojené s ankylozujúcou spondylitídou, vaskulitické difúzne ochorenie pľúc, ochorenie pľúc spojené s hemosiderózou, intersticiálne ochorenie pľúc vyvolané liekmi, radiačnú fibrózu, obliterujúcu bronchiolitídu, chronický eozinofilný zápal pľúc, lymfocytárne infiltračné ochorenie pľúc, postinfekčné intersticiálne ochorenie pľúc, dnavú artritídu, autoimunitnú hepatitídu, autoimunitnú hepatitídu typu 1 (klasickú autoimunitnú alebo lupoidnú hepatitídu), autoimunitnú hepatitídu typu 2 (anti-LKM protilátkovú hepatitídu), autoimunitne sprostredkovanú hypoglykémiu, rezistenciu na inzulín typ B s acanthosis nigricans, hypoparatyreózu, akútne imunitné ochorenie spojené s transplantáciou orgánu, chronické imunitné ochorenie spojené s transplantáciou orgánu, osteoartrózu, primárnu sklerotizujúcu cholangitídu, idiopaticku leukopéniu, autoimunitnú neutropéniu, renálne ochorenie inak nešpecifikované, glomerulonefritídy, mikroskopickú vaskulitídu obličiek, Iymskú boreliózu, diskoidný lupus erythematosus, idiopatickú alebo inak nešpecifikovanú mužskú neplodnosť, spermatickú autoimunitu, roztrúsenú sklerózu (všetky subtypy), inzulíndependentný diabetes mellitus, sympatický očný zápal, pľúcnu hypertenziu sekundárnu pri ochorení spojivového tkaniva, Goodpastureov syndróm, nodóznu polyarteritídu prejavujúcu sa v pľúcach, akútnu reumatickú horúčku, reumatickú spondylitídu, Stillovu chorobu, systémovú sklerózu, Takayasuovu chorobu/arteritidu, autoimunitnú trombocytopéniu, idiopatickú trombocytopéniu, autoimunitné ochorenie štítnej žľazy, hypertyreózu. autoimunitnú hypotyreózu so strumou (Hashimotova choroba), atrofickú autoimunitnú hypotyreózu, primárny myxedém, fakogénnu uveitídu, primárnu vaskulitídu a vitiligo Ľudské protilátky a ich časti podľa vynálezu môžu byť
- I*
135 používané na liečbu autoimunitných ochorení, obzvlášť tých, ktoré sú spojené so zápalom, ktoré zahrnujú reumatoidnú spondylitídu, alergiu, autoimunitný diabetes, autoimunitnú uveitídu.
Pri liečbe reumatoidnej artritídy, Crohnovej choroby, roztrúsenej sklerózy, inzulín dependentnej cukrovky a lupienky (psoriázy) sú prednostne používané protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén, ako sa opisuje detailnejšie v sekcii VII.
Ľudská protilátka alebo jej časť podľa vynálezu môže byť tiež aplikovaná spolu s jedným alebo viacerými ďalšími terapeutickými činidlami použiteľnými pri liečbe autoimunitných a zápalových ochorení.
Protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu byť používané pri liečbe takých ochorení samotné alebo v kombinácii. Malo by byť zrejmé, že protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu byť používané samotné alebo v kombinácii s ďalším činidlom, napríklad terapeutickým činidlom. Uvedené ďalšie činidlo je vybrané odborníkom pre jeho určený účel. Ďalšie činidlo môže byť napríklad terapeutické činidlo, ktoré je známe v odbore ako použiteľné pri liečbe ochorenia alebo stavu protilátkou podľa vynálezu. Ďalším činidlom môže byť tiež činidlo, ktoré prepožičiava terapeutickému prostriedku priaznivú charakteristickú vlastnosť, napríklad činidlo, ktoré ovplyvňuje viskozitu prostriedku.
Ďalej by malo byť zrejmé, že kombinácie, ktoré sú zahrnuté v tomto vynáleze, sú tie kombinácie, ktoré sú použiteľné pre ich určený účel. Činidlá opísané ďalej v texte sú ilustratívne a nie sú obmedzené. Kombinácie, ktoré sú súčasťou vynálezu môžu byť protilátky podľa vynálezu a aspoň jedno ďalšie činidlo vybrané zo zoznamov ďalej v texte. Kombinácia môže tiež zahrnovať viac než jedno ďalšie činidlo, napríklad dve alebo tri ďalšie činidlá, ak kombinácia je taká, že vytvorený prostriedok môže vykonať svoju určenú funkciu.
Preferované kombinácie sú nesteroidný(é) protizápalový(é) liek(y), ktoré sú známe ako NSAIDS, ktoré zahrnujú lieky ako je ibuprofén Iné
136 preferované kombinácie sú kortikosteroidy zahrnujúce prednizolón, dobre známe vedľajšie účinky pri použití steroidu môžu byť redukované alebo dokonca eliminované znížením nutnej dávky steroidu, keď sa pacient lieči steroidom v kombinácii s protilátkou proti IL-12 podľa vynálezu. Neobmedzujúce príklady terapeutických činidiel pre reumatoidnú artritídu, s ktorými protilátka alebo jej časť podľa vynálezu môže byť kombinovaná, zahrnujú nasledujúce: proti zápalový liek(y) potlačujúci cytokíny (CSAID), protilátky proti iným ľudským cytokínom alebo antagonisty iných ľudských cytokínov alebo rastových faktorov, napríklad TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PDGF. Protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu byť kombinované s protilátkami voči molekulám na bunečnom povrchu, ako sú CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90 alebo ich ligandy zahrnujúce CDI54(gp39 alebo CD40L)
Preferované kombinácie terapeutických činidiel môžu interferovať v rôznych bodoch v autoimunitnej a následnej zápalovej kaskáde, preferované príklady zahrnujú TNF antagonisty podobné chimérovým, humanizovaným alebo ľudským TNF protilátkam, D2E7, (patentová prihláška US sériové čislo 08/599,226, podaná 9.2 1996), cA2 (Remicade™). CDP 571, fragmenty antiTNF protilátok (napríklad CDP870) a rozpustné receptory TNF p55 alebo p75, ich deriváty, (p75TNFR lgG(Enbrel™) alebo p55TNFR lgG(Lenercept), rozpustný receptor IL-13 (sIL-13) a tiež inhibítory enzýmu premeny TNFa (TACE), podobne inhibítory IL-1 (napríklad inhibítory enzýmu premieňajúce intrleukín 1, ako je Vx740, alebo IL-1RA atď.) môžu byť z rovnakého dôvodu efektívne. Iné preferované kombinácie zahrnujú interleukín 11, anti-P7 a p-selektínový glykoproteínový ligand (PSGL). Ešte iná preferovaná kombinácia sú ďalší kľúčoví hráči autoimunitnej odozvy, ktorá môže pôsobiť paralelne, v závislosti alebo v zhode s funkciou IL-12, obzvlášť preferované sú antagonisty IL-18 zahrnujúce protilátky proti IL-18 alebo rozpustné receptory IL-18 alebo proteíny viažuce sa na IL-18. Ukázalo sa, že IL-12 a IL-18 majú prekrývajúce sa. ale odlišné funkcie a najúčinnejšia môže byť kombinácia antagonistov voči IL-12 a IL-18. Ešte iná preferovaná kombinácia sú anti-CD4 inhibítory Ešte iné preferované kombinácie zahrnujú
137 antagonistov ko-stimulačnej dráhy CD80(B7.1) alebo protilátky zahrnujúce
CD86(B7.2), rozpustné receptory alebo antagonistické ligandy.
Protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu tiež byť kombinované s činidlami, ako je metotrexát, 6-MP, sulfasalazín azatioprínu, mesalazín, chlorochinín olsalazínu/hydroxychlorochínu, penici 1 ínamín, aurotiomalát (intramuskulárny a orálny), azatioprín, kochicín, kortikosteroidy (orálne, inhalované a lokálna injekcia), agonisty beta-2 adrenoreceptora (salbutamol, terbutalin, salmeteral), xantíny (teofylín, aminofylín), kromoglykát, nedokromil, ketotifén, ipratropium a oxitropium, cyklosporín, FK506, rapamycín, mykofenolát mofetilu, leflunomid, NSAID, napríklad ibuprofén, kortikosteroidy, ako je prednizolón, inhibítory fosfodiesterázy, agonisty adenozínu, antitrombotické činidlá, inhibítory komplementu, adrenergické činidlá, činidlá, ktoré interferujú so signalizáciou pro-zápalových cytokínov, ako je TNFa alebo IL-1 (napríklad IRAK, NIK, IKK, p38 alebo inhibítory kinázy MAP), inhibítory enzýmu premieňajúceho IL-Ιβ (napríklad Vx740), anti-P7, p-selektínový glykoproteínový ligand (PSGL), inhibítory enzýmu premieňajúceho TNFa, inhibítory signalizácie buniek T, ako sú inhibítory kinázy, inhibítory metaloproteinázy, sulfasalazín, azatioprín, 6-merkaptopuríny, inhibítory enzýmu premieňajúceho angiotenzín, rozpustné receptory cytokínov a ich deriváty (napríklad rozpustné receptory TNF p55 alebo p75 a deriváty p75TNFRIgG (Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept), sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R, rozpustný receptor IL-13 (sIL-13)) a protizápalové cytokíny (napríklad IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 a TGFP). Preferované kombinácie zahrnujú metotrexát alebo leflunomid a v prípade miernej alebo silnej reumatoidnej artritídy cyklosporín.
Nelimitujúce príklady terapeutických činidiel zápalového črevného ochorenia, s ktorými môže byť protilátka alebo jej časť podľa vynálezu kombinovaná, zahrnujú nasledujúce: budenozid, epidermálny rastový faktor, kortikosteroidy, cyklosporín, sulfasalazín, aminosalicylát, 6-merkaptopurín, azatioprín, metronidazol, inhibítory lipoxygenázy, mesalamín, olsalazín, belsalazid, antioxidanty, inhibítory tromboxánu, antagonisty receptora IL-1, monoklonálne protilátky proti IL-Ιβ, monoklonálne protilátky proti IL-6,
138 rastové faktory, inhibítory elastázy, zlúčeniny pyridinyl-imidazolu, protilátky proti iným ľudským cytokínom alebo rastovým faktorom alebo antagonisty iných ľudských cytokínov alebo rastových faktorov, napríklad TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PDGF. Protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu byť kombinované s protilátkami proti molekulám na bunečnom povrchu, ako CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 alebo iné ligandy. Protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu tiež byť kombinované s činidlami, ako je metotrexát, cyklosporín, FK506, rapamycín, mykofenolát mofetilu, leflunomid, NSAID, napríklad ibuprofén, kortikosteroidy, ako prednizolón, inhibítory fosfodiesterázy, agonisty adenozínu, antitrombotické činidlá, inhibítory komplementu, adrenergické činidlá, činidlá, ktoré interferujú so signalizáciou pro-zápalových cytokínov, ako je TNFa alebo IL-1 (napríklad IRAK, NIK, IKK, p38 alebo inhibítory kinázy MAP), inhibítory enzýmu premieňajúceho IL-1 β (napríklad Vx740), anti-P7, p-selektínový glykoproteínový ligand (PSGL), inhibítory enzýmu premieňajúceho TNFa, inhibítory signalizácie T-bunky, ako sú inhibítory kinázy, metaloproteinázové inhibítory, sulfasalazín, azatioprín, 6merkaptopuríny, inhibítory enzýmu premieňajúceho angiotenzín, rozpustné receptory cytokínov a ich deriváty (napríklad rozpustné receptory p55 alebo p75, sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R, rozpustný receptor IL-13 (sIL-13)) a protizápalové cytokíny (napríklad IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 a TGFP).
Preferované príklady terapeutických činidiel pre Crohnovu chorobu, v ktorých môže byť protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén kombinovaná, zahrnujú nasledujúce: antagonisty TNF, napríklad protilátky proti TNF, D2E7 (US patentová prihláška sériové číslo 08/599,226, podaná 9.2.1996), cA2 (Remicade™), CDP 571, fragmenty protilátok proti TNF, (napríklad CDP870), konštrukty TNFR-Ig(p75TNFRIgG(Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept)), anti-P7, p-selektínový glykoproteínový ligand (PSGL), rozpustný receptor IL-13 (sIL-13) a inhibítory PDE4. Protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu byť kombinované s kortikosteroidmi ako sú napríklad budenozid a dexametazón. Protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu tiež byť
139 kombinované s činidlami, ako je sulfasalazín, 5-aminosalicylová kyselina a olsalazín a činidlá, ktoré interferujú so syntézou alebo účinkom prozápalových cytokínov ako IL-1, napríklad inhibítory enzýmu premieňajúceho IL-Ιβ (napr. VX740) a IL-lra. Protilátky podľa vynálezu alebo ich časť viažuca antigén môžu tiež byť užívané s inhibítormi signalizácie T buniek napríklad inhibítormi tyrozínovej kinázy 6-merkaptopurínmi. Protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu byť kombinované s IL11.
Nelimitujúce príklady terapeutických činidiel v prípade roztrúsenej sklerózy, s ktorými môže byť kombinovaná protilátka alebo jej časť, zahrnujú: kortikosteroidy, prednizolón, metylprednizolón, azatioprín, cyklofosfamid, cyklosporín, metotrexát, 4-aminopyridín, tizanidín, interferónβla (Avonex, Biogen), interferón-pib (Betaseron, Chiron/Berlex), Copolymer 1 (Cop-1, Copaxone, Teva Pharmaceutical Industries, Inc.), hyperbarický kyslík, intravenózny imunoglobulín, klabribín, protilátky proti iným ľudským cytokínom a rastovým faktorom alebo antagonisty iných ľudských cytokínov alebo rastových faktorov napríklad TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PDGF. Protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu byť kombinované s protilátkami k molekulám na bunečnom povrchu, ako CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 alebo iné ligandy. Protilátky podľa vynálezu alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu tiež byť kombinované s činidlami, ako je metotrexát, cyklosporín, FK506, rapamycín, mykofenolát mofetilu, leflunomid, NSAID napríklad ibuprofén, kortikosteroidy ako prednizolón, inhibítory fosfodiesterázy, agonisty adenozínu, antitrombotické činidlá, inhibítory komplementu, adrenergické činidlá, ktoré interferujú so signalizáciou prozápalových cytokínov ako TNFa alebo IL-1 (napríklad IRAK, NIK, IKK, p38 alebo inhibítory kinázy MAP), inhibítory enzýmu premieňajúceho IL-Ιβ (napríklad Vx740), anti-P7, pselektínový glykoproteínový ligand (PSGL), inhibítory TACE, inhibítory signalizácie T-bunky ako inhibítory kinázy, inhibítory metaloproteinázy, sulfasalazín, azatioprín, 6-merkaptopuríny, inhibítory enzýmu premieňajúceho angiotenzín, rozpustné cytokínové receptory a ich deriváty (napríklad
140 rozpustné receptory TNF p55 alebo p75, sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R, rozpustný receptor IL-13 (sIL-13)) a protizápalové cytokíny (napríklad IL-4, IL-10, IL13 a TGFP).
Preferované príklady terapeutických činidiel pre roztrúsenú sklerózu, v ktorých môže byť protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén kombinovaná tak, aby zahrnovala interferón-β, napríklad IFNpi a IFNpib, kopaxón, kortikosteroidy, inhibítory IL-1, inhibítory TNF a protilátky proti Ugandu CD40 a CD80.
Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu môžu zahrnovať „terapeuticky účinné množstvo“ alebo „profylaktický účinné množstvo“ protilátky alebo jej časti podľa vynálezu. Termín „terapeuticky účinné množstvo“ znamená množstvo účinné, v dávkach a počas nevyhnutných časových úsekov, na dosiahnutie požadovaného terapeutického výsledku. Terapeuticky účinné množstvo protilátky alebo jej časti môže kolísať v súlade s faktormi, ako je štádium ochorenia, vek, pohlavie a hmotnosť jednotlivca a schopnosť protilátky alebo jej časti vyvolať u jedinca požadovanú odozvu. Terapeuticky účinné množstvo je tiež to, pri ktorom ľubovoľné toxické alebo škodlivé účinky protilátky alebo jej časti sú vyvážené terapeuticky prospešnými účinkami. Termín „profylaktický účinné množstvo“ znamená množstvo účinné pri dávkach a v časových úsekoch nevyhnutných na dosiahnutie požadovaného profylaktického výsledku. V typickom prípade, keďže profylaktický účinné množstvo je užívané u subjektov pred ochorením alebo v jeho ranej fáze, bude profylaktický účinné množstvo menšie než terapeuticky účinné množstvo.
Dávkové režimy môžu byť upravené tak, aby sa dosiahla optimálna požadovaná odozva (napríklad terapeutická a profylaktická odozva). Môže byť aplikovaná napríklad jedna tableta, v časových úsekoch sa môže aplikovať niekoľko rozdelených dávok alebo dávka môže byť proporcionálne redukovaná alebo zvýšená podľa naliehavosti terapeutickej situácie. S cieľom jednoduchosti aplikácie a jednotnosti dávky je obzvlášť výhodné vytvoriť parenterálne prostriedky v jednotkovej dávkovej forme. Jednotková dávková forma tu znamená fyzikálne diskrétne jednotky vhodné ako unitárne dávky pre
141 cicavčie liečené subjekty; každá jednotka obsahuje vopred stanovené množstvo aktívnej zlúčeniny vypočítané tak, aby produkovala požadovaný terapeutický účinok v spojení s požadovaným farmaceutickým nosičom. Špecifikácie pre jednotkové dávkové formy podľa vynálezu sú diktované a priamo závislé od (a) jedinečných charakteristík aktívnej látky a určitého terapeutického alebo profylaktického účinku, ktorý sa má dosiahnuť a (b) obmedzení vlastných odboru prípravy zmesí ako je aktívna látka pre liečbu citlivosti u jedincov.
Príkladne neobmedzujúce rozmedzie pre terapeuticky alebo profylaktický účinné množstvo protilátky alebo jej časti podľa vynálezu je 0,01 až 20 mg/kg, výhodnejšie je 1 až 10 mg/kg, dokonca ešte výhodnejšie je 0,3 až 1 mg/kg. Je nutné poznamenať, že hodnoty dávok môžu kolísať s typom a vážnosťou stavu, ktorý sa má zmierniť. Je nutné vedieť, že v prípade ľubovoľného určitého subjektu by sa mali upraviť špecifické dávkové režimy v priebehu času v súlade s individuálnou potrebou a profesionálnym úsudkom osoby, ktorá aplikuje alebo dohliada na aplikáciu prostriedkov a že tu uvedené dávkové rozmedzia sú iba príkladom a neobmedzujú rozsah alebo praktické použitie nárokovaného prostriedku.
VII. Použitie protilátok podľa vynálezu
Na základe ich schopností viazať sa na hIL-12, protilátky proti hIL-12 alebo ich časti podľa vynálezu môžu byť použité na detekciu hIL-12 (napríklad v biologickej vzorke, ako je sérum alebo plazma) použitím bežných testov, ako je test ELISA, rádioimunologický test (RIA) alebo imunohistochemický test tkaniva. Vynález poskytuje spôsob detekcie hIL-12 v biologickej vzorke, ktorý zahrnuje kontakt biologickej vzorky s protilátkou alebo s jej časťou podľa vynálezu a detekciu buď protilátky (alebo časti protilátky) viazanej na hIL-12 alebo neviazanej protilátky (alebo časti protilátky), čím sa deteguje hIL-12 v biologickej vzorke. Protilátka je značená priamo alebo nepriamo detegovateľnou látkou, ktorá umožňuje detekciu viazanej alebo neviazanej protilátky. Vhodné detegovateľné látky
142 zahrnujú rôzne enzýmy, protetické skupiny, fluorescenčné materiály, luminiscenčné materiály a rádioaktívne materiály. Príklady vhodných enzýmov zahrnujú chrenovú peroxidázu, alkalickú fosfatázu, β-galaktozidázu alebo acetylcholínesterázu, príklady vhodných prostetických skupinových komplexov zahrnujú streptavidín/biotín a avidín/biotín, príklady vhodných fluorescenčných materiálov zahrnujú umbeliferón, fluoresceín, izotiokyanát fluoresceínu, rodamín, dichlorotriazinylamín fluoresceínu, dansylchlorid alebo fykoerytrín, príklad luminiscenčného materiálu zahrnuje luminol a príklady vhodného rádioaktívneho materiálu zahrnujú 125I, 131I, 35S alebo 3H.
Vedľa značenia protilátky môže byť v biologických tekutinách prítomnosť hIL-12 testovaná kompetitívnym imunotestom, ktorý využíva štandardy rhIL-12 značených detegovateľnou látkou a nedetegovateľnou protilátkou proti hIL-12. V tomto teste sú kombinované biologická vzorka, značené štandardy rHIL-12 a protilátka proti hIL-12 a je stanovené množstvo značeného štandardu rhIL-12 viazaného na neznačenú protilátku. Množstvo hIL-12 v biologickej vzorke je nepriamo úmerné množstvu značeného štandardu rhIL-12 viazaného na protilátku proti hIL-12.
Protilátky Y61 a J695 podľa vynálezu môžu byť tiež používané na detekciu IL-12 z druhov iných než je človek, obzvlášť IL-12 z primátov. Napríklad protilátka Y61 môže byť používaná na detekciu IL-12 u opice cynomolgus a makak. Protilátka J695 môže byť používaná na detekciu IL-12 u opice cynomulgus, makak a pavián. Žiadna protilátka však nereaguje skrížené s myším alebo krysím IL-12 (opisuje sa v príklade 3 podsekcie F).
Protilátky a časti protilátok podľa vynálezu sú schopné neutralizovať aktivitu hIL-12 in vitro (opisuje sa v príklade 3) a in vivo (opisuje sa v príklade 4). Teda protilátky a časti protilátok podľa vynálezu môžu byť používané na inhibíciu aktivity IL-12, napríklad v bunkovej kultúre obsahujúcej hIL-12, v ľudských subjektoch alebo v iných cicavčích subjektoch, ktoré obsahujú IL-12, s ktorým protilátka podľa vynálezu skrížené reaguje (napríklad primáti, ako je pavián, cynomulgus a makak). V preferovanom uskutočnení vynálezu sa opisuje izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá neutralizuje aktivitu ľudského
143
IL-12 a aspoň jedného ďalšieho IL-12 z primáta vybraného zo skupiny zahrnujúcej IL-12 paviána, kosmana, šimpanza, cynomolga a makaka, ale ktorý neneutralizuje aktivitu myšieho IL-12. Výhodne je IL-12 ľudský IL-12. Aby sa inhibovala aktivita hIL-12 v kultúre, môže byť do kultivačného média kultúry buniek obsahujúceho hIL-12 alebo kde sa predpokladá, že obsahuje hIL-12, pridaná protilátka alebo časť protilátky podľa vynálezu.
V inom uskutočnení vynález poskytuje metódu inhibície aktivity IL-12 v subjekte, ktorý trpí poruchou, pri ktorej aktivita IL-12 je škodlivá. IL-12 bol zahrnutý do patofyziológie širokého rozmedzia porúch (opisuje sa v publikácii Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996, Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306-314, Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367, Fais et al., (1994) . Interferon Res. 14: 235-238, Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150: 823-832, Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112: 1 169-1178 and Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152: 667-672, Parronchi et al (1997) Am. J. Path. 150: 823-832). Vynález poskytuje spôsoby inhibície aktivity IL-12 v subjekte, ktorý trpí takou poruchou, pričom spôsob obsahuje aplikáciu protilátky alebo časti protilátky podľa vynálezu subjektu tak, že je aktivita IL-12 v subjekte inhibovaná. Uprednostňuje sa, keď IL-12 je ľudský IL-12 a subjekt je ľudský subjekt. V inom prípade subjektom môže byť cicavec exprimujúci IL-12, s ktorým protilátka podľa vynálezu skrížené reaguje. Subjektom môže ďalej byť cicavec, do ktorého bol zavedený hIL-12 (napríklad aplikáciou hIL-12 alebo expresiou transgénu hIL-12). Protilátka podľa vynálezu môže byť aplikovaná ľudskému subjektu pre terapeutické účely (ako sa diskutuje ďalej v texte). Protilátka podľa vynálezu však môže byť aplikovaná cicavcovi, ktorý nie je človek a ktorý exprimuje IL-12, s ktorou protilátka skrížené reaguje, čo sa využíva na veterinárne účely alebo ako zvierací model ľudského ochorenia. Vzhľadom na posledne uvedené také zvieracie modely môžu byť použiteľné na hodnotenie terapeutickej účinnosti protilátok podľa vynálezu (napríklad testovanie dávok a časové priebehy aplikácie).
Tu používaný termín „porucha, kde aktivita IL-12 je škodlivá“ zahrnuje ochorenia a iné poruchy, v ktorých sa ukázalo, že prítomnosť IL-12 u subjektu trpiaceho poruchou, zodpovedá za patofyziológiu poruchy alebo je
144 faktorom, ktorý prispieva k zhoršeniu poruchy. Teda porucha, kde aktivita IL12 je škodlivá, je poruchou, u ktorej sa očakáva, že inhibícia aktivity IL-12 zmierni symptómy a/alebo postup poruchy. Také poruchy môžu byť preukázané napríklad zvýšením koncentrácie IL-12 v biologickej tekutine subjektu, ktorý trpí poruchou (napríklad zvýšením koncentrácie IL-12 v sére, plazme, synoviálnej tekutine atď. subjektu), ktorá môže byť detegovaná napríklad použitím protilátky proti IL-12, ako sa opisuje vyššie v texte. Existuje rad príkladov porúch, kde aktivita IL-12 je škodlivá. V jednom uskutočnení vynálezu protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu byť použité pri terapii, kedy sa liečia tu opísané ochorenia alebo poruchy. V inom uskutočnení vynálezu protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén môžu byť použité pri výrobe liečiva na liečbu tu opísaných ochorení alebo porúch. .Použitie protilátok a častí protilátok podľa vynálezu pri liečbe niekoľkých neobmedzujúcich špecifických porúch je diskutované ďalej v texte:
A. Reumatoidná artritída:
Interleukín-12 sa podieľa na dôležitej úlohe pri zápalových ochoreniach, ako je reumatoidná artritída. V kĺbovom maze pacientov trpiacich reumatoidnou artritídou bola detegovaná indukovateľná mRNA IL12p40 a ukázalo sa, že IL-12 je prítomný v synoviálnych tekutinách u pacientov trpiacich reumatoidnou artritídou (opisuje sa napríklad v publikácii Morita et al., (1998) Arthritis and Reumatism 41: 306-314). Zistilo sa, že bunky pozitívne na IL-12 sú prítomné v povrchovej vrstve kĺbovej mazotvornej blany zasiahnutej reumatoidnou artritídou. Ľudské protilátky a časti ľudských protilátok podľa vynálezu môžu byť používané na liečbu napríklad reumatoidnej artritídy, Lymskej artritídy, reumatoidnej spondylitídy, osteoartritídy a dnavej artritídy. V typickom prípade protilátka alebo jej časť je aplikovaná systémovo, hoci pri istých poruchách môže byť výhodné aplikovať protilátku alebo časť protilátky lokálne. Protilátka alebo jej časť podľa vynálezu môže byť tiež aplikovaná s jedným alebo viacerými ďalšími terapeutickými činidlami použiteľnými pri liečbe autoimunitných ochorení.
145
V myšom modeli pre reumatoidnú artritídu vyvolanú kolagénom (CIA) liečba myší monoklonálnymi protilátkami proti IL-12 (krysia monoklonálna protilátka proti myšiemu IL-12 C17.15) pred vznikom artritídy úplne potlačila vznik ochorenia a obmedzila jeho výskyt a vážnosť. Liečba monoklonálnou protilátkou proti IL-12 skoro po vzniku artritídy obmedzila vážnosť ochorenia, ale neskoršia liečba myší monoklonálnymi protilátkami proti IL-12 po vzniku ochorenia mala minimálny účinok na vážnosť ochorenia.
B. Crohnova choroba
Interleukín-12 tiež zohráva úlohu pri zápalovom ochorení čriev, Crohnovej chorobe. U pacientov trpiacich Crohnovou chorobou sa objavuje v črevnej sliznici zvýšená expresia IFN-γ a IL-12 (opisuje sa napríklad v publikácii Fais et al., (1994) J. Interferón Res. 14: 235-238, Parronchi et al., (1997) Amer. J. pathol. 150: 823-832, Monteleone et al., (1997)
Gastroenterology 1 12: 1169-1178, Berrebi et al., (1998) Amer. J. Pathol. 152: 667-672). Ukázalo sa, že protilátky proti IL-12 potlačujú ochorenie v myších modeloch kolitídy, napríklad kolitída u myší vyradených pomocou IL-12 indukovaná TNBS a v poslednej dobe aj myší vyradených IL-10. Teda, pri liečbe zápalových ochorení čriev môžu byť použité protilátky alebo ich časti podľa vynálezu.
C. Roztrúsená skleróza
Interleukín-12 pôsobí pri roztrúsenej skleróze ako kľúčový mediátor. V léziách u pacientov s roztrúsenou sklerózou môže byť demonštrovaná expresia indukovateľnej mRNA IL-12p40 alebo samotného IL-12 (opisuje sa v publikácii Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996, Drulovic et al., (1997) J. Neurol. Sci. 147: 145-150). U chronických progresívnych pacientov trpiacich roztrúsenou sklerózou sa zvýšilo množstvo cirkulujúceho IL-12. Výskum buniek T a buniek prezentujúcich antigén (APC) pochádzajúcich od pacientov s roztrúsenou sklerózou ukázal samopokračujúce
146 série imunitných reakcií ako základ progresívnej roztrúsenej sklerózy vedúci k imunitnej odozve typu Thl. Zvýšené vylučovanie IFN-γ u buniek T viedlo ku zvýšenej produkcii IL-12 bunkami APC, čo má za následok pokračovanie cyklu vedúceho k chronickému štádiu imunitnej aktivácie typu Thl a k ochoreniu (Balashov et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci 94. 599-603) Úloha IL-12 pri roztrúsenej skleróze sa skúmala použitím myších a krysích experimentálnych modelov alergickej encefalomyelitídy (EAE). Predchádzajúca liečba monoklonálnou protilátkou proti IL-12 v modeli recidivujúcej-ustupujúcej EAE roztrúsenej sklerózy u myší oddialila paralýzu a redukovala klinické skóre. Liečba monoklonálnou protilátkou proti IL-12 pri vrchole paralýzy alebo počas následného obdobia remisie redukovala klinické skóre. Teda protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén podľa vynálezu môžu slúžiť na zmiernenie symptómov spojených s roztrúsenou sklerózou u ľudí.
D. Inzulín dependentná cukrovka
Interleukín-12 bol implikovaný ako dôležitý mediátor inzulín dependentnej cukrovky (IDDM). IDDM bola vyvolaná u myší NOD aplikáciou IL-12 a v adoptívnom transférovom modeli IDDM pôsobili protilátky proti IL12 ako ochrana. Pacienti pri skorej fáze ochorenia IDDM majú často skúsenosť s tzv. obdobím „honeymoon“ („medový mesiac“), počas ktorého je udržovaná funkcia niektorých zvyškových ostrovčekových buniek. Tieto zvyškové ostrovčekové bunky produkujú inzulín a regulujú množstvo glukózy lepšie než aplikovaný inzulín. Liečba týchto pacientov počas skorej fázy s protilátkou IL-12 môže brániť ďalšiemu poškodeniu ostrovčekových buniek, čím sa udržuje endogénny zdroj inzulínu.
E. Lupienka (psoriáza)
Interleukín-12 pôsobí ako kľúčový mediátor lupienky. Lupienka zahrnuje akútne a chronické kožné lézie, ktoré sú spojené s profilom expresie
147 cytokínov typu TH1 (Hamid et al., (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1: 225231, Turka et al., (1995) Mol. Med. 1: 690-699). Vo vzorkách kože chorého človeka bola detegovaná mRNA IL- 12p35 a p40. Teda, protilátky a ich časti viažuce sa na antigén podľa vynálezu môžu zmierniť chronické kožné poruchy takejto lupienky.
Vynález je ďalej ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré by nemali byť v žiadnom prípade chápané ako obmedzujúce. Obsahy všetkých citovaných referencií, ktoré zahrnujú citácie literatúry, vydané patenty a zverejnené patentové prihlášky, ktoré sú citované v tejto prihláške sú týmto spôsobom začlenené odkazom. Ďalej je zrejmé, že obsahy všetkých priradených tabuliek (uvedené v dodatku A) sú začlenené do textu citáciou.
sekvencie rodiny embryonálneho VH3, ktoré sa číslujú podľa Kabata (na porovnanie je ce
Ό o
D £>
rt
H
zcauDUDcao . O O O O a O A Λ Λ tí Λ Λ oauoooaaoaaaooaooooa *> M M «Λ •él-ŕ»*·· ·» U -j U -j I. * K X M ««υυυοουυουοουυοοο — *c m m κ^χκιί^κ^’· — — — _ιαοαοζχ_ lOUUUOOO^ «, <KC««C<K
- M M M M M· *. MM >, M M M ·< M M M M ·· ~ «« — — — — - — ----- . _____ — - - —
Uh.U.UUUU>UUh.k.UUUk>kkkUkkfc-h»h»Uk
OCOOOOOOlíOOOOOOOOOOOOOOOOtJ
.....--‘'KM*£MlCMaeie«llCK«|CM.>c1>E^ >>>>>>>>>>>>>
M<<<<ooaoo
44X<<<X<<<<
««UUWUOUt-t-X
LUkb.Utl,UkUL.
« < c a.
OOOOOOOO <<><«-<<« x x >->>* ►· <<<<^<<Q <<<<<<<<<ΟΟΟΧΟΟ~ ~ „».Η»·>··Ι«'«Ι·»·<Η»-ί-ΗΗΗ^Ηί«<Ο''^ϋ >.*·»·ΟΟθνΐ«ΐ>·ΟΟΟΟΟΟΟθνιΐ4ν» · o o o
Vt M O O O M V|
- r- -- — — — . · ’ - M. Ml Μ» .isi»UOOUOU»nv»*lv»«»viW»»l»IUOUl4v» · *» »,^>·»·000«Λ·1>·00000000***»ν» ..Ζ··<«»ι«ΐ9θ0000000130ΐ300001300 «•m»,vimooomviouoooom«ouooooooouooowoo οοοχϊοοοΪ;
xxxxxxoviv>xoooooooxxxx<««»;^2«*etu>.>.>.>.>.>.>.a.f.MM>.>.a.^M <<<<· · ’ *Vt<ft<1«******t*t*OUX*** W
2^MM...M«iaft»eKWXi«xviMViviMO<* ...............
XXXXXXX«>V1MVIM«1AM»·* ** .......... ...
« « < X M X M · · < X M * « * * . ·* — *·** ľ,i^-;íŕ<<ac<<>>>>>>>>><<>>><» XJJJOOU>->-*<<et««*>’>-«U<’-C><*<*
004>0*·'·'»**ΑΟ·000000|Λ'*·,·η**ΙΛ**?'ϊϊϊΐ5>>ί>>>>>>>>>>>>>>>
XUU-IXX**** ******* ******S2uUWWUOMWMUUUMUMUWWh*UU
UUU«UOWUMUlWWUfclfclUUWUU«W“W*J«WMjjjjjJJUJJJJJUeJUUeJ <, «Ota000000000000000000POW»w«^.^^^Me»<^wrfwwehíLWLwt^^w.<1 at o
ltaMW«lX(AX<AVtXW1WtlA«AXVtW»V)ZXXXVlXX KXXXXXZXXZEXEXXXJCEt-XKEXEEX H>*^>>*<OH>^< X X X X x x >->.QOOQ>.<< HXXXX>”>*><>-»^Vt<<<<<<XXVtVt*1>«X>»>” iXXXMXXXXXXXXXXXXX___ íxxxcxxxxxxxxxxxxexxx :<<<<<<<<<<<<<<<<<<ou
Tabuľka 1: Aminokyselinové sekvencie rodiny embryonálneho VH3, ktoré sa číslujú podľa Kabata (na porovnanie je zahrnutá VH protilátky Joe9)
MU<X<<XXXXHXXX tXXXXXXXXXXXX •ikCJUUUUUUOUOUU <<JUU1JUUUOUUO0<
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>><
χ >· .
•tu > > > > >
i*Xfr*fr*fr*fr*fr**-ŕ*fr*fr*fr-fr-fr-fr-fr-fr*Hfr*fr*fr*fr«3Cfr*fr«fr*XI «<<α0θοαοαοοααααααααααοηα — — -
m *i w x x x x _ ’ϊ ϊ ϊ Ϊ X x x X x i ?
“οοσοααοο ?SSS5S!5SS5SSSSsss55š53šžsšs • * x x x x X ľ, o S o o o ° ^«.«βχχχζχχβχχχχ .AA«.«.XXXXXXXXXXXXXXX ίοαοοοοαοαααοσοοοοοο tXXXXXXXXXXXXXXXXXXX • kVefr-kkkkUkHHkkkkkkkk 'jdu.j'j'jujj'ju.jq tXXXXfr«t«XH xxxxxxxx ___zxbzxszzxxxxx-._ «|uuBuac9OOQOOOOOOOOOO0QOOOO0Q mXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCCXXX «•«ixxxvixvivixxxxxxxxxxxxxxxxmxMM »· ·* ·*··* MW**MM**MM**M»*Mk*»«M»*»>***h«MMU^^.*^
U t* t H ť H |lk h h (» k U x x x x x hhhhhhhk kbkkUUkbl
XXKXXXXX • fr- fr* fr· fr- fr» H H b b b b b b U B K X X O X X •1000
M x x x «»> k > u n x x «t o o o
H < < <
I* >< H b
U H k >· ti X X X
HX x x
I» M W «I
H u o u
H O O Q
Uc> k k «Η n VI *1 u o XXX k > > M X X α o a XXX k k k k k k XXX XXX «I VI «I o o u Q O 0 >·>·>·
O 19 x x k k M X a o x x k k k k x x x x
O W lí XXX k k k X M M o a o XXX k k k k k k XXX Z X k k X H x x x x
O x x k k x w 0 Q x x k k k k ►í M
H *· i X X 1
0 X X k k X x o o x x k k k x
0 0 O O Q k k k X x x
VI «I VI V»
U 1» o o k >
0 O 0 X X K X k > k k x x x x 0 O O O x x x >
k k k k H X X X H H H X O x x w 0 x x m 0 0 0 0 H 0 0 O * X X O •XXX
0 0 x x x X k k XXX o O Q x > x b k x X k H H X X X U X XXX 0 0 0 o a 0 X O k XXX vfl> c o kl «» í5
Φ
| ·· x | x | x | x |
| «· k | > | k | k |
| »> | x | x | X |
| «•u | u | u | U |
| n X | x | x | x |
| ««0 | o | 0 | 0 |
| <t x | x | x | X |
| «10 | 0 | 0 | 0 |
| «1 k | k | k | k |
| to X | x | aC | x |
| >· 0 o O | o | ||
| toX | x | X | x |
| n > | k | > | > |
| MI | x | x | x |
| nx | s | x | s |
| H x | x | x | x |
| II 0 | 0 | 0 | 0 |
| U k | k | k | k |
| H x | x | x | X |
| to M | M | x | x |
| 1« k | k | k | k |
| *· fr* | fr* | fr* | fr* |
| I» k | k | b | k |
| H0 | 0 | 0 | 0 |
| «« X | m | VI | x |
| ·« < | x | X | x |
| II X | x | X | x |
| II U | 0 | U | u |
| H M | x | w | x |
| l«X | x | x | x |
| t· X | x | x | x |
| •t «I | «4 | x | x |
| 1« M | x | x | x |
| 1« X | x | x | x |
| »10 | 0 | 0 | 0 |
| S« k | k | k | k |
| 110 O | O | o | |
| II > | > | > | k |
| H k | > | k | > |
| •fr 0 | 0 | 0 | 0 |
| «0 | 0 | 0 | 0 |
| « 0 | 0 | 0 | 0 |
| • X | X | V» | x |
| «U | U | U | u |
| l> | > | k | > |
| «x | x | X | x |
| »σο | O | o | |
| λ k | > | k | k |
| • 0 o o | o |
>>>>>>> fc»>>>>>>>«xxx>«xxx*ex£ <^<XXXXXXXXXXXXXXXXX«C0<ee >>>>kk>kkkkkkkkkkkk»k>>> x£XXXX**XXXXXXXXXZfc*XXXX UUUWaUUUUjfclUUUUUUUW>>U>WM
222000000000000000000000 S íí £ «xxxxxx xx xxx xx x x x x x S S O0000000000U0000UtSO000BB ^bbbfebbbbbbtototofefetoktofeatafeatZ
90000000000000000X000000 <XXXXXXXXXXXX<X<<<<<<<<< J > >>>kkkkk>kkkkkkk>kkkkk XXXk9EfcXXBXB*X9BBXX9BKBkfcarS
555ΣΪ5χχχχχχχχχχχχχχ·»χ<· Ε££χχχχχχχχχχχ* χχ ·» x x x x x x
222O0000000UXXXXX>XBBBB0 ^bkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkk χχχχχνιηνιχχχνιχχχχηχχνιχχχχ
U U U k k fr- fr- f- k fr*
U «J x x (J u x x x x 0 0 k k p o O > >
> >
0
0
0 x m x u > k •9 U i O o > k
O o
X x 0 u x x •9 *9 X x •4 U X x B X 0 0 k k O O k k k k 0 0 0 O 0 0 X X U U k k 4 U O O k k o o k k 0 0 M X X X X x u u fr- frk k U 0 X m X x x x o u x x x x x x k k k k k k f* < fr« <· k fr* k k k k k k 0 O U 0 0 0 , U U U U U C X X X X l U «9 *9 U U ι M X X X X
| x | x | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | U (1 | 0 0 | ||
| k | k | k | k | k | k |
| > o σ σ x | X | X | |||
| k | > | k | k | k | k |
| k | k | X | x | x | x |
| 0 | 0 | 0 | o | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 0 | o | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| x | X | X | X | x | X |
| u | u | W | U | w | W |
| k | > | > | k | k | k |
| x | x | X | X X | X | |
| ι o σ | o | o o | O | ||
| k | k | k | k | k | k |
| o | o | u | u | w | u |
XXX XXX O o u XXX U k X XXX XXX XXX 0 0 0 o o o k k k O O O > k k XXX 0 0 0 0 0 0 0 0 0 XXX U U M > k > XXX O OO k Q k U U U k k fr- fr* k
0 0 0 0 x x x vi vi
X X XXX 0 u o
XXX XXX XXX XXX XXX 0 0 0 0 0 0 k k k O O O k > k XXX 0 0 0 0 0 0 0 0 0 XXX U U W > > > XXX o o o k > k u u u x x x x O U x x x x x x x x x x 0 x 0 0 k k o o k k k
x 0 0 0 x u o k k x x o o k k u o ?« sekvencie rodiny embryonálneho VXl, ktoré sa číslujú podľa Kabata (na porovnanie j ch (D o
f·
O rt
... «egpougog í? J ». u u u ·» _ mXXXXX·*·*· ιιΜΓ»αα0χ·>· ΐοοοαοααα «ixacXXX****4
Hsssžážss m u u o o y «»·»·»·»· »« ««>·>*»»·>· i o o o o o x < < < »u u u u u ,1 o o a o o t o u w u w •i k XXX n O X OXO ·« U U U U U H U U U U U u h b X X « •1
U O U b b H b b b OOQ x x 2 U U M OOO U U M w x a ooo
J J ooo b b K
| n O | o | X | X x | X | á | |
| •1 ·* | .4 | •4 | «4 X | x | X | U |
| •f H | H | M | X X | x | X | m |
| M X | X | X | X X | x | x | X |
| M X | X | X | X X | x | x | x |
| ·« b | H | e* | b b | b | b | b |
| •c O | O | o | O O | O | o | o |
| »» X | «1 | x | X X | «1 | M | w |
| ·« x | X | x | X X | X | x | X |
| <1 M | •t | m | x m | x | X | « |
| ci U | o | o | o o | o | O | u |
| u n | w | M | x x | x | x | x |
| u | b | b b | b | b | ||
| •i x | ac | x | x x | O | X | x |
| ••o | o | O | o o | O | o | M |
| It · | Λ> | b | b X | b | b | t |
| 1· ►* | M | > | > > | > | > | ŕ |
| ti O | o | O | o o | O | O | o |
| CC vi | «1 | V» | x x | x | X | x |
| a· | a- | b b | b | b | b | |
| la X | x | Λ | x u | x | X | X |
| ci x | x | O | o x | x | X | O |
| ii X | x | * | x 9 | x | X | 14 |
| II x | x | « | x o | x | x | X |
| wo | u | M | X b | o | u | |
| tc b | b | b | b b | b | b | H |
| »« | w w | w | w | x | ||
| U | «4 | U | x x | x | x | ·{ |
| ««*4 | U | »4 | x x | x | x | ♦J |
| it X | X | X | x x | x | x | K |
| Cl *· | a. | b | b b | b | b | b |
| ci X | X | X | x x | X | X | g |
| Cl t* | b | b | b X | b | b | b |
| ivo | O | O | <9 O | O | o | o |
| ii b | b | a· | b b | •b | b' J | b |
MO O OO O 0.00 » o&o ooo a b b b b b b H x x x » x
II O < M H ' u a t« n u> II · 11 C»x i« x
I· O IICM mx x « b x x £ £ . · « x > o · «C b b · b b b
S E x x o O *
Z M X X X X X
S δ S S o O o
X M w M ·<« M O * X X X x x
M I . t* x i« x II O «« V» «1 „uuoouuoo «» x x x x X , vi Vt x x X X O k O O O O O O O — -- m X b b «
| «* b b | b | b | b | b | b |
| U > > | > | > | > | > | > |
| l« X X | X | x | X | X | X |
| ii O O | O | o | O | O o | |
| it O O | O | o | X | O | (9 |
| II b b | b | b | b | b | b |
| ii X X | b | b | x | X | X |
| c» X X | o | o | u | o | o |
| II O x | V» | x | x | x | x |
| l· > ► | x | x | > | > | > |
| • X X | m | x | x | x | x |
| c b b | b | b | b | b |
ibbbbbbbb «οσοοσσοο tbbbbbbbH • U U I > >
iooSSooox °£ U e €M (M tO fM tO
Ot <vt
CD ξ
n
E <Q . 9» b b b b H n t ·> «4 U U > M : > > > > > E X > *» « ·ί 5. S ? · «3
Ό
O a
J3 (β
O H
Dodatok A cd ’S
X>
«J
H
CM ιΩ
Dodatok A
CM c3 ”3 (4
H
Dodatok A
o1 lD
Dodatok A <M td 'í x
es t-
m in r-<
Dodatok A
kO m t—í
Dodatok A
| n te | 1 c 1 o 1 rH 1 * |
| í—* | |
| 3 | |
| X> | |
| d | |
| H |
m
O* Q
Ä g U rm
Dodatok A n
CD
Si *3 _D
n]
H
SE
Oi
- O aj ΜΊ n (J <u w
4-» *,=
So «n
CY u
S O|^
V» z1*
O _ U o cn z n o cn < x A. S > H o. h x x H tU|bl á
x|w
I t uIcjiu o o o o o|o a Ip* I®
U X Z m *-· *4 co «c Z Qu O· w W S HM* ®|φ o n|n,n »
CM l CM ( CM CMlCM <n = |š
ZIZ O|Q X, mien o o ®|®
CJ tí <Ml<n cmIcm |ol§ cnlcn (Λ o|o o
Z x |O I® ® CM m W olo I · ' m m Im o\ o
I I bl CJ O O
Μ|Τ|ώ gWo o
u| ω n o ^«Ip· in Celel ·->
o o I f U tí ,<M O ?
s1 o
CJ
21? Š|s m
a
If tí «o o
> .J u sáá (b fiU OU O X Z H I- t* [XS cmIcmícm z zlz o|a|o x cn cnlcnlcn o UICJO x xxx mlmlm ®l®l® 1® ® *n, _ m v ho tí ste 2 H*£
SS olo
XIX cnlcn
OO mi® w|«e
CMICM *n to *n CM CM m|«elriinl<n|>n <m|c<|cm
Z|Z o tí |«n o x
Z o tí|tí, _ .olo o xx|x|x vt|<0 a|o
1’ cn|cn o
SlE in
Dodatok A
t cu o
σ
M σ\ lf)
Dodatok A
CM
G ,0 ce
H tn o g a o u o <n Z n O U w
O _ W o cn Z m o
U «4 £Š
C- X tu X Λ Λ O O X x cn tn o o tn
J®
CM i CM >i o|o XIX u
I tu o
o «n o
I ω
v t0 bl
U < a. X X
Q
X tn •4 «4 <
X
X x
es o
x tn o
«Μ
X o
x «Λ
O
X x
x u
at o
tn <□
X x
x u
•4 •4 <
X x
x
X o
x tn
O “ 0 S ss
Í& g ’ s~ s?
—I .4 t0 X
I
X <r O\ — *4 · *-* σ», «ο »-< x — x o Wl *A »J σ\ to ·->
bl cn x
t' * o u O o m <n U u ·· CM CM <4 u
X X O O U
U ♦
| 102 | z | ||
| 1 | 101 | o | >4 |
| 1 x | 98 | x | >4 |
| i * I o | 91 | «Π | M |
| I ° | 96 | o | >4 |
| 95 | x | X | |
| 65 | O | ||
| 64 | X | ||
| 63 | > | ||
| .62 | cn | ||
| 61 | Q | ||
| 60 | < | - | |
| 59 | > | ||
| ) 1 x | 58 | >* | >4 |
| t «c | 51 | x | |
| f O 1u | 56 | z | M |
| 55 | cn | ||
| 54 | e» | »4 | |
| •1 | 53 | ct | >4 |
| 52A | M | ||
| 52 | et | X | |
| 51 | w | ||
| 5t | ) u | >4 |
ee x
3< S 33 U 32 »31 <n 30 w 29 <“ *21 t“ >a i *1
M »4 >4 *0
JJ o
Λ rt
Id je _o o
tx •β
O
Dodatok A m
cä _D ed
H
| 97 - | ||
| 96 - | 1 x | |
| 95C “ | ||
| 95B ft | 1 | |
| 95A 1 | ||
| 95 ► | » | |
| 94 Ľ | >4 | |
| 93 « | >4 | « |
| 92 <= | b M | |
| 91 * | x | |
| 90 v | 1 | |
| 99 C | > | |
| . 56 · | ) | |
| 55 e | . x | |
| 54 « | í | |
| 53 ‘ | > >4 | M |
| 52 ‘ | a x | |
| 51 | & | |
| 50 | J 94 | |
| 34 | H X | |
| 33 | > | |
| 32 | H M | 1 * |
| 31 | Z M | 1 94 |
| 30 | Wí >41 94 |
28 27BI 21ΛΙ 21 26,
24l «I w
<X
O jí •rt
e.
>
•rt
C rt >
O
9* a
S rt
A
O rt XS O 2 a O «rt tí »O rt *» tí g
>* ?
Λ Λ o 2 x> *° í » rt rt »rt e 5 *· T* j* rt *· “ e
X « «rt e
r o
Ä I «9» e
zj rt rt w
e o
l-a
Sl
Ä •tí
Q t-S , o »II,
J3 I »· I o e
o.
x
V prítomnosti nadbytku voľnej podjednotky p40
162
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obrázkoch 1A až 1B sú zobrazené usporiadania aminokyselinovej sekvencie variabilných oblastí ťažkých reťazcov série ľudských protilátok, ktoré sa viažu na ľudský IL-12, v porovnaní s embryonálnymi sekvenciami Cos-3/JH3 a Dpll8 Lvl042. Pri identifikácii polôh aminokyselín sa používa číslovanie podľa Kabata. V prípade protilátky Joe9 je zobrazená celá sekvencia. V prípade iných protilátok sú zobrazené iba tie polohy aminokyselín, ktoré sa líšia od protilátky Joe9 divokého typu.
Na obrázkoch IC až ID sú zobrazené usporiadania aminokyselinových sekvencii variabilných oblastí ľahkých reťazcov sérií ľudských protilátok, ktoré sa viažu na ľudský IL-12. Pri identifikácii polôh aminokyselín sa používa číslovanie podľa Kabata. V prípade protilátky Joe9 je zobrazená celá sekvencia. V prípade iných protilátok sú zobrazené iba tie polohy aminokyselín, ktoré sa líšia od divokého typu Joe9.
Na obrázkoch 2A až 2E sú zobrazené polohy CDR v ťažkom reťazci protilátky Y61, ktoré sa mutovali miestne riadenou mutagenézou a príslušné substitúcie aminokyselín v každej polohe. Grafy na pravej strane obrázku zobrazujú rýchlostnú konštantu disociácie v prípade substituovaných protilátok (čierne stĺpce) v porovnaní s nemutovanou protilátkou Y61 f
(prázdny stĺpec).
Na obrázkoch 2B až 2H sú zobrazené polohy CDR ľahkého reťazca protilátky Y61, ktoré sa mutovali miestne riadenou mutagenézou a príslušné aminokyselinové substitúcie v každej polohe. Grafy na pravej strane obrázku zobrazujú rýchlostnú konštantu disociácie v prípade substituovaných protilátok (čierne stĺpce) v porovnaní s nemutovanou protilátkou Y61 (prázdny stĺpec).
Obrázok 3 demonštruje účinnosť in vivo ľudskej protilátky J695 proti IL-12 na množstvo plazmového neopterínu u opíc cynomolgus.
163
Obrázok 4 zobrazuje graf priemerného výskytu artritídy verzus dni po imunizácii myší kolagénom, čo ukazuje, že ošetrenie s C17.15 podstatne znižuje symptómy spojené s artritídou v porovnaní s liečbou krysím IgG.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Izolácia protilátok proti IL-12
A. Testovanie protilátok viažucich sa na IL-12
Protilátky proti IL-12 boli izolované testovaním troch jednotlivých knižníc zobrazujúcich fága pripravených použitím cDNA ľudských VL a VH z mRNA získanej z ľudských mandlí (označených ako scFv 1), mandlí a lymfocytov periférnej krvi (PBL) (označených ako scFv 2) a lymfocytov získaných z kostnej drene (označených ako BMDL). Konštrukcia knižnice a spôsoby selekcie sú opísané v publikácii Vaughan et al., (1996) Náture Biotech 14: 309-3 14.
Knižnice sa testovali použitím antigénov, podjednotky p70 ľudského IL-12, podjednotky p40 ľudského IL-12, chimérického IL-12 (myšia p40/ľudská p35), myšieho IL-12, biotinylovaného ľudského IL-12 a biotinylovaného chimérického IL-12. Protilátky špecifické pre IL-12 boli vybrané na základe potiahnutia antigénu na steny imunologických skúmaviek použitím štandardných postupov (opisuje sa v publikácii Marks et ak, (1991) J. Mol. Biol. 222: 528-597). scFv knižnica 2 sa testovala buď použitím IL-12 alebo biotinylovaného IL-12 a vytvorilo sa podstatné množstvo väzieb špecifických pre IL-12. Bolo vybraných päť odlišných klonotypov stanovených paternami štiepením enzýmom BstNl a potvrdili sa sekvenovaním DNA. Hlavné klonotypy boli VHD58/VLDPL11, VHDP77/VLDPK3 1, VHDP47/VL a VHDP77/VLDPK3 1, pričom každý z nich rozpoznal podjednotku p40 ÍL-12.
Testovanie knižnice BMDL použitím IL-12 p70 generovalo tri rôzne klonotypy. Zistilo sa, že dva z nich sú skrižene reagujúce klony. Dominantný kloň bol sekvenovaný a obsahoval VHDP35/VLDP. Tento kloň rozoznáva
164 podjednotku p40 IL-12. Testovanie knižnice scFv použitím IL-12p70 neprodukuje špecifické protilátky proti IL-12.
S cieľom identifikovať protilátky proti IL-12, ktoré sa prednostne viažu na heterodimér p70 alebo podjednotku p35 IL-12, skôr než na podjednotku p40, boli použité kombinované knižnice scFv 1 + 2 a BMDL. Aby sa vybrali protilátky proti IL-12, ktoré rozoznávajú heterodimér p70 alebo podjednotku p35, fágové knižnice boli vopred inkubované a vybrané v prítomnosti voľného p40. Sekvenovanie izolovaných klonov ukázalo deväť rôznych línií protilátok. Preferenčné podjednotky boli ďalej analyzované mikro-Friguetovou titráciou. Supernatant obsahujúci scFv bol titrovaný IL-12 značeným biotínom v teste ELISA a stanovila sa hodnota ED50. Koncentrácia scFv produkujúca 50 % ED bola vopred inkubovaná so zvýšenou koncentráciou voľnej podjednotky p70 alebo p40 (inhibítory). Bol meraný pokles signálu v teste ELISA na doštičkách potiahnutých IL-12 značeným biotínom a hodnoty sa vyniesli proti koncentrácii voľnej podjednotky p70 alebo p40. Ak sa titrácia v prípade oboch podjednotiek prekrýva, potom scFv sa viaže na obe podjednotky p40 a p70. Ľubovoľná odchýlka od prekryvu udáva stupeň preferencie podjednotky p70 pred p40.
B. Afinitná maturácia línie protilátok špecifických pre IL-12 (Joe 9)
U klonov bola testovaná ich schopnosť inhibovať naviazanie IL-12 na svoj receptor v teste naviazania IL-12 na svoj receptor (označil sa RBA) a schopnosť inhibovať proliferáciu ľudských blastových buniek stimulovaných PHA vyvolanou IL-12 (test PHA), ako sa opisuje v príklade 3. Kloň Joe 9 vykazoval v teste RBA a PHA najnižšiu hodnotu IC50. Táto hodnota v oboch testoch je 1 x 10'6 M. Navyše variabilná oblasť (VH) ťažkého reťazca protilátky Joe 9 mala v porovnaní s najbližšou embryonálnou sekvenciou COS-3 najmenší počet zmien, čo sa zistilo z databázy VBASE. Tabuľka 1 (uvádza sa v dodatku A) zobrazuje embryonálne sekvencie rodiny Vh3, ktorej členom je sekvencia COS-3 rovnako ako členy embryonálnych sekvencií rodiny Υλΐ. Preto pre afinitnú maturáciu bola vybraná protilátka Joe 9.
165
Aminokyselinové sekvencie VH a VL protilátky Joe 9 divokého typu (Joe 9 wt) sú zobrazené na obrázku IA až ID.
S cieľom zvýšiť afinitu protilátky Joe 9 boli uskutočnené rôzne mutácie oblasti 3 stanovujúcej komplementaritu (CDR3) ťažkého i ľahkého reťazca. Použitím miestne riadenej PCR mutagenézy s degeneratívnymi oligonukleotidmi špecifickými pre CDR3 ťažkého reťazca (označených ako „H3“) alebo ľahkého reťazca (označených ako „L3“) sa vytvorili varianty CDR3 s priemerným počtom substitúcií troch báz v každom CDR3 (označuje sa ako „spike“). PCR mutagenéza CDR3 ťažkého reťazca bola uskutočnená použitím degeneratívneho oligonukleotidu ťažkého reťazca, ktorý obsahuje náhodnú zmes všetkých štyroch nukleotidov
5’TGTCCCTTGGCCCCA(G)(T)(A)(G)(T)(C)(A)(T)(A)(G)(C)(T)(C)(C)(C)(A)(C)(T) .
GGTCGTACAGTAATA 3’ (SEQ IDNO: 580) a oligonukleotidu pUC Reverse Tag
GAC ACC TCG ATC AGC GGA TAA CAA Ί i l CAC ACA GG (SEQ ID NO: 581) za vzniku súboru mutantov CDR3 ťažkého reťazca. Pôvodný ľahký reťazec bol amplifikovaný použitím reverzného oligonukleotidu protilátky Joe 9 (5' TGG GGC CAA GGG ACA 3' (SEQ ID NO: 582) a fdteteseq 24 + 21 oligonukleotidu (5'- ATT CGT CCT AT A CCG TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT -3' (SEQ ID NO: 583).
Komplementarita medzi dvoma produktami PCR bola používaná k priebehu tepelnej hybridizácie dvoch fragmentov v reakcii PCR a rekombinačná knižnica scFv plnej dĺžky bola amplifikovaná s pUC Reverse Tag (SEQ ID NO: 581) a fdTag 5'-ATT CGT CCT ATA CCG TTC-3'(SEQ ID NO: 584). Mutagenéza PCR ľahkého reťazca bola uskutočnená použitím oligonukleotidu ľahkého reťazca obsahujúceho zmes všetkých štyroch nukleotidov
5'GGTCCCAGTTCCGAAGACCCTCGAACC(C)(C)(T)(C)(A)(G)(G) (C)(T)(G)(C)(T)(G)(T)(C)ATATGACTGGCAGTAATAGTCAGC3' (SEQ ID NO: 585) a reverzného oligonukleotidu protilátky Joe 9 5'TGG GGC CAA GGG ACA 3' (SEQ ID NO: 586) za vzniku súboru mutantov CDR3 ľahkého
166 reťazca. Východiskový ťažký reťazec sa amplifikoval s pUC Reverse Tag (SEQ ID NO: 581) a oligonukleotidu HuJH3FOR
5'TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3' (SEQ ID NO: 587). Komplementarita medzi dvoma produktami PCR bola použitá k priebehu teplotnej hybridizácie dvoch fragmentov v reakcii PCR a rekombinovaná knižnica scFv plnej dĺžky bola amplifikovaná s Reverse Tag GAC ACC TCG ATC AGC G (SEQ ID NO: 588) a s oligonukleotidom HuA 2-3 FOR NOT 5'GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC 3' (SEQ ID NO: 589).
Mutanty CDR3 ťažkého reťazca boli vybrané použitím 1 nM IL-12 značeného biotínom a premývali sa počas jednej hodiny pri teplote miestnosti v PBS, ktorý obsahuje voľný IL-12 alebo podjednotku p40 v koncentrácii 7 nM. Klony sa analyzovali fágovým testom ELISA a tie, ktoré sa viažu na IL12 boli testované v kinetických väzbových štúdiách BIAcore použitím čipu s IL-12 s nízkou hustotou (opisuje sa v príklade 5 v postupe analýzy BIAcore). Vo všeobecnom prípade analýza BIAcore meria väzbové interakcie v reálnom čase medzi ligandom (rekombinantný ľudský IL-12 imobilizovaný na biosenzorovej matrici) a analytom (protilátky v roztoku) povrchovou plazmónovou rezonanciou (SPR) použitím systému BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Systém využíva optické vlastnosti SPR na detekciu zmien v koncentráciách proteínu v dextránovej biosenzorovej matrici. Proteíny sú kovalentne viazané na dextránovú matricu v známej koncentrácii. Protilátky sú zavedené injekciou cez dextránovú matricu a špecifické naviazanie medzi protilátkami zavedenými injekciou a imobilizovaným ligandom vedie ku zvýšenej koncentrácii matricového proteínu a k výslednej zmene v signáli SPR. Tieto zmeny v signáli SPR sú zaznamenávané ako jednotky rezonancie (RU) a sú vyjadrené vzhľadom na čas na osi Y senzogramu. Aby sa stanovili hodnoty koff, kon, asociačná konštanta (Ka) a disociačná konštanta (Kd), bol používaný Software hodnotiaci kinetiku BIAcore (verzia 2.1). Klony, ktoré demonštrovali zlepšenie rýchlostnej konštanty koff, boli analyzované neutralizačnými testami, ktoré zahrnovali inhibíciu protilátkou proti IL-12 viažucou sa na svoj receptor (test RBA), inhibíciu proliferácie vyvolanej IL-12 v ľudských
167 blastových bunkách stimulovaných PHA (test PHA) a inhibíciu produkcie interferónu gama vyvolanú IL-12 ľudskými blastovými bunkami (test IFN gama). Súhrn disociačných konštánt a/alebo hodnôt IC50 z neutralizačných testov klonov 70-1 až 70-13 s pridanou CDR3 ťažkého reťazca je prezentovaný v tabuľke 2 (opisuje sa v dodatku A). Kloň 70-1 vykazoval rýchlostnú konštantu kOff lepšiu než pôvodný kloň Joe9 a vykazoval najnižšiu hodnotu IC50 2,0 x 10‘7 M. Preto bol kloň 70-1 vybraný pre konverziu na úplný IgGl.
Mutanty s CDR3 ľahkého reťazca boli vybrané použitím lnM IL-12 značeného biotínom a premyli sa PBS, ktorý obsahuje 7 nM voľnej podjednotky p40. Klony sa testovali vo fágovom teste ELISA a tie, ktoré sa viazali na IL-12, boli testované väzbovou analýzou BIAcore použitím čipov s IL-12 s nízkou hustotou. Klony, ktoré vykazovali hodnotu korf lepšiu než pôvodný kloň Joe 9, boli testované v neutralizačných testoch, ktoré merali buď inhibíciu naviazania na receptor IL-12 alebo inhibíciu proliferácie PHA blastových buniek. Súhrn hodnôt disociačných rýchlostí a/alebo hodnôt IC50 z neutralizačných testov mutantných klonov CDR3 ľahkého reťazca 78-34 až 79-1 je prezentovaný v tabuľke 2 (opisuje sa v dodatku A).
Založené na hodnote rýchlostnej konštanty kOfr, klony 78-34 a 78-35 vykazovali zlepšenú hodnotu koff v porovnaní s pôvodnou protilátkou Joe9. Oba tieto klony boli vybrané pre kombinačnú analýzu s mutantami ťažkého reťazca.
C. Kombinačné klony
Klony s mutovaným ľahkým a ťažkým reťazcom, ktoré vykazovali najlepšie väzbové charakteristiky boli používané pri kombinácii a kompletácii scFv. Mutantné klony so zlepšenými účinnými charakteristikami boli kombinované presahujúcou extenziou pomocou PCR a predlžovaním mutovaných segmentov VH a VL, ako sa opisuje vyššie v texte. Klony 101-14 až 26-1 zobrazené v tabuľke 2 (viď dodatok A) boli produkované z kombinácie mutantov ťažkého reťazca (70-2, 70-13 a 70-1) s mutantami
168 ľahkého reťazca (78-34, 78-35 a 79-1). Hodnoty rýchlostnej konštany k„ff a/alebo IC50 získané z neutralizačných testov pre tieto klony sú prezentované v tabuľke 2.
Väzbová analýza BIAcore identifikovala kloň 101-11 produkovaný z kombinácie mutantného klonu CDR3 ťažkého reťazca 70-1 s mutantným klonom CDR3 ľahkého reťazca 78-34 majúce disociačnú konštantu (kOff) 0,0045 s'1. Hodnota disociačnej konštanty bola podstatne zlepšená v porovnaní s hodnotou disociačných konštánt samotného mutovaného klonu CDR3 ľahkého reťazca 78-34 (0,0164 s'1). Navyše, kloň 101-11 vykazoval podstatné zlepšenie v neutralizačných testoch. Teda kloň 101-11 bol vybraný pre afinitnú maturáciu, ako sa opisuje ďalej v texte.
D. Afinitná maturácia klonu 101-11 v
Ďalšia afinitná maturácia klonu 101-11 zahrnovala opakované cykly PCR mutagenézy oboch CDR3 ťažkého a ľahkého reťazca 101-11 použitím pridaných oligonukleotidových primérov. Klony boli vybrané pomocou znižujúcich sa koncentrácií IL-12 značeného biotinom (bio-IL-12). Väzbové charakteristiky mutovaných klonov boli odhadnuté väzbovou analýzou BIAcore a RBA, PHA neutralizačnými testami. Hodnoty rýchlostnej konštanty kOff a/alebo ICjo v prípade klonov 136-9 až 170-25 sú prítomné v tabuľke 2 (uvedené v dodatku A). Kloň 103-14 demonštroval zlepšenú hodnotu IC50 v teste naviazania na receptor a PHA blastovom teste. Kloň 103-14 tiež demonštroval nízku hodnotu rýchlostnej konštanty koff a podobne bol vybraný pre ďalšiu afinitnú maturáciu.
E. Vytvorenie a výber náhodných knižníc klonu 103-14 CDR3 ľahkého reťazca
CDR3 ľahkého reťazca klonu 103-14 (QSYDRGFTGSMV (SEQ ID NO: 590)) bola systematicky náhodne rozdelená do 3 segmentov použitím 3 rôznych knižníc, ako je uvedené ďalej v texte, kde symbol X je kódovaný
169 náhodným kodónom sekvencie NNS, pričom symbol N je ľubovoľný nukleotid a symbol S je buď deoxycytozín alebo deoxyguanidín.
L3.1 = XXXXXXFTGSMV (SEQ ID NO: 591)
L3.2 = QSYXXXXXXSMV (SEQ ID NO: 592)
L3.3 = QSYDRGXXXXXX (SEQ ID NO: 593)
Bola uskutočnená náhodná mutagenéza všetkých troch CDR ľahkého reťazca (označených ako L3.1, L3.2 a L3.3) klonu 103-14. CDR3 ťažkého reťazca (označený H3) klonu 103-14 nebola mutovaná. Boli skonštruované štyri náhodné knižnice založené na klone 103-14 (H3 a L3.1, L3.2 a L3.3) a boli vystavené mnohým rôznym selekčným podmienkam, ktoré zahrnovali použitie limitujúcej koncentrácie antigénu a prítomnosť alebo absenciu nadbytku voľného antigénu (p40 a p70). Výstupy z výberov (klony 73-B1 až 99-G11) boli testované primárne analýzou BIAcore a v prípade nutnosti testom RBA a sú zobrazené v tabuľke 2 (zobrazené v dodatku A).
Náhodná mutagenéza CDR ľahkého reťazca 103-14 vytvorila kloň Y61, ktorý vykazoval podstatné zlepšenie hodnoty IC50 v porovnaní s pôvodným klonom 103-14. Kloň Y61 bol vybraný na získanie celého IgGl. Celý Y61IgGl mal hodnotu IC50 približne 130 pM stanovenú testom PHA. Hodnota IC50 nebola ovplyvnená 50 násobným molárnym nadbytkom voľného p40, čo demonštruje, že voľný p40 nereaguje skrížené s Y61 protilátkou proti IL-12, čím znižuje naviazanie protilátky na heterodimér. Sekvencie plnej dĺžky variabilnej oblasti ťažkého reťazca a variabilnej oblasti ľahkého reťazca Y61 sú zobrazené ďalej v texte.
Peptidová sekvencia variabilnej oblasti ťažkého reťazca Y61
CDR Hl
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA
CDR H2
FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKT
CDR H3
HGSHDN WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 23)
170
Peptidová sekvencia variabilnej oblasti ľahkého reťazca Y61
CDRL1
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGGRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIY
CDR L2
GNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
CDR L3
QSYDRGTHPALL FGTGTKVTVLG (SEQ ID NO:24)
Zvyšky CDR sú označené podľa definícii Kabata.
Príklad 2: Mutácia Y61 v hypermutačných a kontaktných polohách
V typickom prípade selekcia rekombinantných protilátok so zlepšenými afinitami môže byť uskutočnená použitím metód zobrazujúcich fága. To je docielené náhodne mutujúcimi kombináciami zvyškov CDR za vzniku veľkých knižníc, ktoré obsahujú jednoreťazcové protilátky rôznych sekvencii. V typickom prípade protilátky so zlepšenými afinitami sú vybrané na základe ich schopnosti dosiahnuť rovnováhu v reakcii protilátka-antigén. Keď sa však exprimovala na povrchu fága Y61 scFV a inkubovala sa s IL-12, nemohli byť nájdené selekčné podmienky, ktoré by umožnili systému dosiahnuť normálnu rovnováhu protilátka-antigén. scFV-fág zostal naviazaný na IL-12, čo pravdepodobne spôsobila nešpecifická interakcia, pretože čistená Y61 scFv vykazovala normálne disociačné kinetiky. Keďže nemohli byť využité obvyklé metódy fága zobrazujúce afinitné maturácie na Y61 (to je vytvorenie knižnice a selekcia mutagenézou viac zvyškov CDR), bola vyvinutá nová stratégia, pri ktorej boli mutované jednotlivé polohy CDR.
Táto stratégia zahrnuje selekciu polôh CDR vhodných pre mutáciu a je založená na identifikácii a selekcii aminokyselín, ktoré sú preferované polohy selektívnej mutagenézy, kontaktné polohy a/alebo hypermutačné polohy. Kontaktné polohy sú definované ako zvyšky, ktoré majú vysokú
171 pravdepodobnosť kontaktu s antigénom, keď antigén interaguje s protilátkou, zatiaľ čo hypermutačné polohy sú definované ako zvyšky, o ktorých sa uvažuje, že majú vysokú pravdepodobnosť somatickej hypermutácie počas afinitnej maturácie protilátky in vivo. Preferované polohy selektívnej mutagenézy sú polohy CDR, ktoré sú ako kontaktné, tak aj hypermutačné polohy. Protilátka Y61 bola už optimalizovaná v oblastiach CDR3 použitím postupu opísaného v príklade 1, preto bolo ťažké ďalej zlepšiť oblasť, ktorá leží v strede väzbového miesta protilátky použitím selekčných metód fágového zobrazenia. Väčšie zlepšenia aktivity bola získané mutáciou potenciálnych kontaktných polôh mimo oblastí CDR3 buď odstránením škodlivého kontaktu antigén-protilátka alebo vytvorením nového kontaktu.
Aminokyselinové zvyšky protilátky Y61, ktoré boli považované za kontaktné body s antigénom a tie polohy CDR, ktoré sú miesta somatických hypermutácií počas afinitnej maturácie in vivo, sú zobrazené v tabuľke 3 (viď dodatok A). V prípade afinitnej maturácie Y61 bolo vybrané pre mutagenézu PCR 15 zvyškov mimo CDR3, tri zvyšky v slučke L3 a 5 zvyškov v slučke H3.
Gén Y61 scFv bol klonovaný s cieľom mutagenézy do plazmidového vektora pUC119(Sfi). Oligonukleotidy boli navrhnuté a syntetizované s náhodnými kodónmi, aby sa mutovala každá vybraná poloha. Po PCR mutagenéze bol sekvenovaný malý počet klonov (približne 24) a exprimoval sa v hostiteľskej bunke napríklad v bakteriálnej, kvasinkovej alebo cicavčej hostiteľskej bunke. Čistila sa exprimovaná protilátka a koff sa merala použitím systému BIAcore. Tento postup sa opakoval v prípade iných polôh CDR. Jednotlivé mutácie, ktoré majú zlepšenú neutralizačnú aktivitu boli kombinované za vzniku protilátky s dokonca väčšou neutralizačnou silou.
Polohy CDR protilátky Y61, ktoré boli mutované s cieľom zlepšiť neutralizačnú silu a aminokyselinové substitúcie v každej polohe sú zobrazené na obrázkoch 2A až 2H. Hodnoty konštanty rýchlosti disociácie sú dané, ako sa stanovilo analýzou BIAcore. Tieto hodnoty konštanty rýchlosti disociácie sú tiež zobrazené v histogramoch na pravej strane každej tabuľky.
172
Výsledky týchto substitúcií v polohách H30, H32, H33, H50, H53, H54, H58, H95, H97, H101, L50, L92, L93 demonštrovali, že všetky skúmané substitúcie aminokyselín viedli k protilátkam s menšími hodnotami konštanty rýchlosti disociácie než sú hodnoty protilátky Y61. V polohách H52, L32 a L50 bola zistená iba jedna substitúcia aminokyseliny, aby sa zlepšila hodnota konštanty rýchlosti disociácie protilátky Y61, všetky iné zmeny nepriaznivo ovplyvňovali aktivitu. V prípade L50 jediná zmena Gly -> Tyr podstatne (5 až 10 krát) zlepšila neutralizačnú silu protilátky Y61. Výsledky demonštrovali dôležitosť týchto polôh vzhľadom k aktivite protilátky Y61 a naznačujú, že vo väčšine prípadov fágového zobrazenia bolo možné vybrať optimálne zvyšky. Bolo zistené, že niekoľko substitúcií v polohách H31, H56, L30 a L94 zlepšilo hodnotu konštanty rýchlosti disociácie protilátky Y61, čo naznačuje, že tieto polohy boli tiež dôležité pre naviazanie antigénu, hoci prístup fágového zobrazenia neumožňoval selekciu optimálnych zvyškov.
Selektívna mutácia kontaktných a hypermutačných polôh protilátky Y61 identifikovala aminokyselinový zvyšok L50 v CDR2 ľahkého reťazca a zvyšok L94 CDR3 ľahkého reťazca, ktoré zlepšili neutralizačnú schopnosť protilátky Y61. Kombinácia týchto mutácií produkovala aditívny účinok generujúci protilátku J695,· ktorá vykazovala podstatné zvýšenie neutralizačnej schopnosti. Sekvencia plnej dĺžky variabilnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca protilátky J695 je zobrazená ďalej v texte.
Peptidová sekvencia variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky J695
CDRH1
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFŤFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA
CDR H2
FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKT
CDR H3
HGSHDN WGQGTMVTVSS (SEQ IDNO: 31)
173
Peptidová sekvencia variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky J695
CDRL1
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGSRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIY
CDR L2
YNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
CDR L3
QSYDRYTHPALL FGTGTKVTVLG (SEQ ID NO: 32)
Zvyšky CDR sú označené podľa definícií Kabata.
Zhrnutie usporiadania sekvencií variabilnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca zobrazujúce postup vývoja klonov, ktoré boli na dráhe vývoja z protilátky Joe9 na protilátku J695 je zobrazené na obrázkoch 1A až ID. Číslovanie oblastí CDR a zvyškov je podľa Kabata.
Príklad 3: Funkčná aktivita protilátok proti hIL-12
Aby sa testovala funkčná aktivita ľudských protilátok proti ľudskému IL-12 podľa vynálezu, protilátky boli používané v niekoľkých testoch, ktoré merajú schopnosť protilátky inhibovať aktivitu IL-12.
A. Príprava ľudských lymfoblastov aktivovaných PHA
Ľudské jednojadrové bunky periférnej krvi (PBMC) boli izolované z leukopaku získaného zo zdravého darcu centrifugáciou s gradientom zmesi fikol-Hypaque počas 45 minút pri rýchlosti 1 500 ot./min., ako sa opisuje v publikácii Current Protocols in Imrnunology, Unit 7.1. PBMC na rozhraní vodného roztoku krvi a média pre separáciu lymfocytov boli zobrané a s cieľom odstránenia častíc zmesi fikol-Paque sa trikrát premyli fyziologickým roztokom pufrovaným fosforečnanom (PBS) a centrifugovali sa počas 15 minút pri 1 500 ot./min .
174
PBMC boli potom aktivované za vzniku lymfoblastov, ako sa opisuje v publikácii Current Protocols in Immunology, Unit 6.16 Premyté PBMC boli resuspendované v úplnom médiu RPMI v koncentrácii 0,5 až 1 x 106 buniek/ml (médium RPMI 1640, 10% fetálne bovinné sérum (FBS), 100 U/ml penicilínu, 100 μg/ml streptomycínu), doplneného 0,2 % (objein/objem) PHA-P (Difco, Detroit, MI) a kultivovali sa počas 4 dní pri teplote 37 °C v atmosfére 5% CO2. Po štyroch dňoch boli bunkové kultúry rozdelené v pomere 1:1 do objemu úplného média RPMI plus 0,2% (objem/objem) PHA-P a 50 U/ml rekombinantného ľudského IL-2. Rekombinantný ľudský IL2 bol produkovaný transfekciou expresívneho vektora, ktorý nesie cDNA ľudského IL-2 do buniek COS (opisuje sa v publikácii Kaufman et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4484-4490) a čistil sa, ako sa opisuje v dokumente PCT/US96/01382. Bunkové kultúry boli potom inkubované počas ďalšieho jedného dňa až troch dní. Získali sa PHA blastové bunky, dvakrát sa premyli úplným médiom RPMI a zamrazili sa v 95 % FBS, 5 % DMSO v koncentrácii ΙΟχ 106 buniek/ml.
S cieľom použitia v teste naviazania IL-12 na svoj receptor (opisuje sa v sekcii B) PHA blastové bunky sa zozbierali po jednodennej kultivácii v prítomnosti IL-2, zatiaľ čo PHA blastové bunky, ktoré budú používané v PHA blastovom proliferačnom teste (opisuje sa v sekcii C) a teste indukcie interferónu gama (opisuje sa v sekcii D) boli zozbierané po trojdennej kultivácii v prítomnosti IL-2.
B. Test naviazania IL-12 na svoj receptor
Analyzovala sa schopnosť protilátok proti IL-12 inhibovať naviazanie rádioaktívne značeného IL-12 na receptory IL-12 na PHA blastoch nasledujúcim spôsobom. Rôzne koncentrácie protilátky proti IL-12 boli vopred inkubované počas jednej hodiny pri teplote 37 °C s 50 až 100 pM I25IhIL-12 (hIL-12 značený jódom bol pripravený použitím značiacej metódy Bolton-Hunter so špecifickou aktivitou 20 až 40 mCi/mg, od firmy NENDupont) vo väzbovom pufre (RPMI 1640, 5% FBS, 25 mM Hepes pH 7,4)
175
PHA blastové bunky izolované ako sa opisuje vyššie v texte, boli jedenkrát premyté a resuspendované vo väzbovom pufre s hustotou buniek 2xl07 buniek/ml. PHA blasty (v množstve lxlO6 buniek) boli pridané k protilátkovej zmesi 125I-hIL-12 a inkubovali sa počas dvoch hodín pri teplote miestnosti. Bunečná väzbová rádioaktivita sa oddelila od voľného l25I-hIL-12 centrifugáciou testovanej zmesi počas 30 sekúnd pri teplote miestnosti, roztok sa odsal a zvyšok sa premyl 0,1 ml väzbového pufru, potom nasleduje centrifugácia pri teplote 4 °C počas 4 minúty pri 10 000 x g. V bunečnom pelete sa testovala bunečná väzbová rádioaktivita použitím počítača gama. Celkové naviazanie bolo stanovené v neprítomnosti protilátky a nešpecifické naviazanie bolo stanovené inklúziou 25 nM neznačeného IL-12 v teste. Inkubácie boli uskutočnené dvojmo.
V teste naviazania IL-12 na svoj receptor sa použili ľudské protilátky proti IL-12 Y61 a J695, pričom obe protilátky demonštrovali porovnateľnú inhibíciu naviazania IL-12 na receptor. Protilátka Y61 inhibovala naviazanie IL-12 na receptor s hodnotou IC50 približne 1,6 x 10'11 M, zatiaľ čo protilátka J695 mala hodnotu IC50 približne 1,1 x 10'11 M.
C. Test proliferácie ľudských PHA blastov
U protilátok proti IL-12 bola hodnotená ich schopnosť inhibovať proliferáciu PHA blastov (pričom proliferácia je stimulovaná IL-12). Sériové riedenia protilátky proti IL-12 boli vopred inkubované počas jednej hodiny pri teplote 37°C, v atmosfére 5% CO2 s 230 pg/ml hIL-12 v 100 ml úplného média RPMI na mikrotitračnej doštičke (dno v tvare U, 96 jamiek, Costar, Cambridge, MA). PHA blastové bunky izolované ako sa opisuje vyššie v texte boli jedenkrát premyté a resuspendovali sa v úplnom médiu RPMI s hustotou buniek 3xl05 buniek/ml. PHA blasty (objem 100mi, množstvo 3 x 104 buniek) boli pridané do zmesi protilátka/hlL-12, všetko sa inkubovalo počas troch dní pri teplote 37 °C v 5 % atmosfére CO2 a značilo sa počas 4 až 6 hodín s 0,5 mCi/jamku (3H)-tymidínu (Amersham, Arlington Heights, IL). Obsahy kultúr
176 boli zachytené na filtroch zo sklenených vlákien pomocou zariadenia na zozbieranie buniek (Tomtec, Orange, CT) a začlenenie (3H)-tymidínu do bunečnej DNA bolo merané počítačom v scintilačnom roztoku. Všetky vzorky sa testovali dvojmo.
Výsledky neutralizácie v prítomnosti rôznych koncentrácií p70:p40) to je pomer heterodiméru IL-12 k voľnej podjednotke p40) sú zobrazené v tabuľke 4 (opisuje sa v dodatku A).
Analýza ľudskej protilátky proti IL-12 v teste proliferácie PHA blastov demonštrovala, že protilátka inhibovala proliferáciu PHA blastov s hodnotou IC50 približne 1,8 x ÍO'10 M v prítomnosti samotnej podjednotky p70 IL-12 bez nadbytku podjednotky p40 (pomer p70:p40 je 1:0). V prítomnosti 50 násobného nadbytku voľnej podjednotky p40 (pomer p70:p40 je 1 : 50) protilátka Y61 inhibovala proliferáciu PHA blastov s hodnotou IC50 približne
1.8 x 1O10 M. Tento výsledok demonštruje, že schopnosť protilátky Y61 inhibovať proliferáciu blastov nie je oslabená prítomnosťou nadbytku podjednotky p40.
Ľudská protilátka proti IL-12 J695 inhibovala proliferáciu PHA blastov s hodnotou IC50 približne 1,0 x ÍO11 M v prítomnosti podjednotky p70 a p40 v pomere 1:0. V prítomnosti podjednotiek p70 a p40 v pomere 1:50 táto protilátka inhibuje proliferáciu PHA blastov s hodnotou IC50 približne 5,8 ±
2.8 x 10'12 M (n=2), čo demonštruje, že nadbytok podjednotky p40 mal na protilátku iba slabý inhibičný účinok. Celkove výsledky demonštrujú zlepšenú neutralizačnú aktivitu protilátky J695 v porovnaní s protilátkou Y61, čo spôsobili mutácie v L50 a L94.
D. Test indukcie interferónu gama
Schopnosť protilátok proti IL-12 inhibovať produkciu IFNy PHA blastami (ktorých produkcia je stimulovaná IL-12) bola analyzovaná nasledujúcim spôsobom. Rôzne koncentrácie protilátky proti IL-12 boli vopred inkubované počas jednej hodiny pri teplote 37 °C, v atmosfére 5 %
177
C.O2 s 200 až 400 pg/ml hIL-12 v 100 ml úplného média RPMI v mikrotitračnej doštičke (dno v tvare U, 96 jamiek, Costar). PHA blastové bunky izolované, ako sa opisuje vyššie v texte, boli jedenkrát premyté a resuspendovali sa v úplnom médiu RPMI s bunečnou hustotou 1 x 10 buniek/ml. PHA blasty (objem 100 μΐ, množstvo 1 x 106 buniek) boli pridané do zmesi protilátka/hIL-12 a inkubovali sa počas 18 hodín pri teplote miestnosti a v atmosfére 5 % CO2. Po inkubácii sa z každej jamky odobralo 150 μΐ supernatantov bez buniek a testom ELISA bolo merané množstvo ľudského produkovaného IFNy (test ELISA na stanovenie endogénneho interferónu gama, Endogen, Cambridge, MA). Každý supernatant sa testoval dvojmo.
Analýza ľudskej protilátky proti hIL-12 Y61 v tomto teste demonštrovala, že protilátka Y61 inhibovala produkciu ľudského IFNy s hodnotou IC50 približne 1,6 x 10'10 M, zatiaľ čo ľudská protilátka proti IL12 J695 inhibovala produkciu ľudského IFNy s hodnotou IC50 približne 5,0 ± 2,3 x 10*12 M (n = 3). Výsledok demonštruje podstatné zlepšenie afinity protilátky J695 ako výsledok modifikácií v L50 a L94.
E. Indukcia IL-12, ktorý nie je ľudský, z izolovaných PBMC
Aby sa testovala skrížená reaktivita ľudských protilátok proti hIL-12 s IL-12 z iných druhov, IL-12, ktorý nepochádza z človeka, bol produkovaný nasledujúcim postupom. PBMC boli separované z čerstvej krvi ošetrenej heparínom centrifugáciou s hustotným gradientom, ako sa opisuje vyššie v texte použitím sady Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norsko) v prípade PBMC opice cynomolgus, pavián a psa, v prípade PBMC psa sa použije sadaAccupaque (Accurate Chemical and Sci. Corp., Westbury, NY) alebo v prípade krysích PBMC sa použije sada Lympholyte-rat (Accurate Chemical and Sci. Corp., Westbury, NY).
PBMC boli potom indukované za vniku IL-12, ako sa opisuje v publikácii D'Andrea et al., (1992) J. Exp. Med. 176, 1387-1398, Villinger et
178 al., (1995) J. Immunol. 155, 3946-3954, Buettner et al., (1998) Cytokine 10, 241-248). Premyté PBMC boli resuspendované v koncentrácii 1 x 106 buniek/ml úplného média RPMI doplneného 0,0075 % (hmotn./objem) SAC (Pansorbin, Calbiochem-Behring Co., La Jolla, CA) alebo 1 až 5 mg/ml ConA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) plus 0,0075 % SAC a inkubovalo sa bez počas 18 hodín pri teplote 37 °C v atmosfére 5% CO2. Médium bez buniek a SAC sa zhromaždilo centrifugáciou a filtráciou cez filter s pórami 0,2 nm.
IL-12 z opice makak bol získaný ako rekombinantný IL-12 makaka z inštitúcie Emory University School of Medicíne, Atlanta, GA.
F. Proliferačný test s myšími bunkami 2D6
Kloň 2D6 myších T buniek proliferuje ako odozva na myší IL-2, IL-4, IL-7 a IL-12 (Maruo et al., (1997) J. Leukocyte Biol. 61, 346-352). Významná proliferácia bola tiež detegovaná ako odozva na supernanty s krysími PBMC, ktoré obsahujú krysí IL-12. Bunky nevykazujú odozvu na IL-12 pochádzajúci zo psa, opice cynomolgus, paviána a človeka. Myšie bunky 2D6 boli propagované v úplnom médiu RPMI doplnenom 50 mM beta-merkaptoetanolu (βΜΕ) a 30 ng/ml myšieho IL-12. Jeden deň pred testom bol myší IL-12 vymytý a bunky sa inkubovali cez noc v úplnom médiu RPMI plus βΜΕ.
Sériové riedenia protilátky proti IL-12 boli vopred inkubované počas jednej hodiny pri teplote 37 °C v atmosfére 5 % CO2 so 40 pg/ml myšieho IL12 v 100 ml RPMI úplného média plus βΜΕ v mikrotitračnej doštičke (dno v tvare U, 96 jamiek, Costar). Bunky 2D6 boli jedenkrát premyté a resuspendovali sa v úplnom médiu RPMI obsahujúcom βΜΕ s hustotou buniek 1 x 105 buniek/ml. Bunky 2D6 (objem 100 μΐ, množstvo 1 x 104 buniek) boli pridané do zmesi protilátka/hlL-12, inkubovali sa počas 3 dní pri teplote 37 °C v atmosfére 5 % CO2 a značili sa počas 4 až 6 hodín s 0,5 mCi na jamku pomocou (3H)-tymidínu. Obsahy kultúry boli zobraté a intenzita radiácie sa stanovila počítačom v scintilačnom roztoku. Všetky vzorky sa testovali dvojmo.
175
G. Skrížená reaktivita protilátky J695 s IL-12, ktorý nepochádza z človeka, medzi druhmi
Skrížená reaktivita protilátky J695 s IL-12, ktorý nepochádza z človeka, medzi druhmi bola analyzovaná použitím PBMC izolovaných z niekoľkých druhov, medzi ktorými nie je človek. Prítomnosť aktitivy IL-12, ktorý nepochádza z človeka, v PBMC supernatantoch z krysy, psa, opice cynomolgus a paviána, bola potvrdená použitím niekoľkých biotestov opísaných vyššie v texte, ako je proliferačný test myších 2D6, proliferačný test ľudských PHA blastov a test indukcie interferónu-gama blokovaním odoziev indukovaných nie ľudskými PBMC králičími a/alebo ovčími polyklonálnymi protilátkami s myším a/alebo ľudským IL-12. Skrížená reaktivita ľudských protilátok proti hIL-I2 Y61 a J695 s nie ľudským IL-12 v PBMC supernatantoch alebo s čisteným IL-12 myši a makaka bola potom odhadnutá v niektorom bioteste(och) stanovením koncentrácie protilátky J695, pri ktorej bola pozorovaná 50% inhibícia odozvy. Výsledky skríženej reaktivity medzi druhmi sú zhrnuté do tabuľky č. 5. Výsledky demonštrujú, že každá protilátka Y61 a J695 je schopná rozoznávať IL-12 z opíc (napríklad IL-12 cynomolga a makaka v prípade protilátky Y61 a cynomolga, makaka a paviána v prípade protilátky J695) a že protilátka J695 je približne 35 krát menej aktívna v prípade psieho IL-12. Ani protilátka Y61 ani J695 nereagujú skrižene s myším alebo krysím IL-12.
H. Špecifita protilátky J695 voči ľudskému cytokínu
Špecifita protilátky J695 bola testovaná v kompetitívnom teste ELISA, v ktorom sa u súboru ľudských cytokínov testovala ich schopnosť interferovať s naviazaním rozpustnej J695 na imobilizovaný ľudský IL-12. Súbor ľudských cytokínov zahrnoval IL-Ία a IL-1 β (Genzyme, Boston, MA), IL-2 (Endogen), IL-4, IL-10, IL-17, IFN-gama a TGF-βΙ (R&D, Minneapolis, MN) IL-8 (Calbiochem), PDGF, IGF-1 a IGF-II (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN), TNFa a lymfotoxín, IL-6, rozpustný receptor IL-6, IL-11, IL-12p70, IL-12p40, M-CSF a protein príbuzný LIF, EBI-3 a IL-12p40, ktorý
180 je indukovaný infekciou vírusom Epstein-Barrovej v B lymfocytoch (opisuje sa v publikácii Devergne et al., (1996) J. Virol. 70, 1 143-1153), bol exprimovaný ako chiméra ľudského IgG-Fc (ΕΒΙ-3/Fc). Bola tiež testovaná jednoreťazcová DNA (Sigma) spermy lososa.
Tabuľka 5: Dáta skríženej reaktivity medzi druhmi
| ľudský IL- 12 | čistený | b κ o V» | 1,7 x 1010 | b κ o Ά | ||||
| d | ||||||||
| c | ||||||||
| •rt | ||||||||
| • M | Ó. | s | — | |||||
| X d CU | 3 M | b | O | |||||
| f«| | U | |||||||
| 2 | κ | κ | ||||||
| J] | m | o | •ζΊ | |||||
| Cu | rs | — | ||||||
| d | ||||||||
| ^4 | ||||||||
| d | ||||||||
| ^4 | 9 | — | ||||||
| rt | ||||||||
| 53 | b | o | O | |||||
| ·>» | ||||||||
| rs | C | |||||||
| «1 | κ | κ | κ | |||||
| < | (Zl | o | o | o | ||||
| M | »o | |||||||
| d | ||||||||
| en | ||||||||
| o | ||||||||
| E | ||||||||
| O | CU | » | 9 | |||||
| c | 3 | γ | ||||||
| i*» o | <Z1 | b | b | O | ||||
| rS | O | κ | ||||||
| — | xs | * | ||||||
| Jj | oa | rs | rs | o | ||||
| Cu | rs | — | ||||||
| ZS e | CS | cú 3 | e | |||||
| «Λ | (M | M | b | |||||
| U | j | U | ||||||
| «4 | * | |||||||
| M | «n | |||||||
| CU | eu | |||||||
| u | ||||||||
| •3 | ||||||||
| 3 | ||||||||
| n | ô. | N | ||||||
| I | 3 | M | ||||||
| J | (Λ | b | d | |||||
| U | κ | 3 | ||||||
| M | xä | u | ||||||
| >. U | CQ | o | C 11 | |||||
| 14 | Cu | VO* | e | |||||
| o | o | |||||||
| •3 | •3 | |||||||
| 3' | S* | |||||||
| rs | N | N | ||||||
| «— | - | |||||||
| 1 J | ó | O | d u | d u w | ||||
| «Μ | C v V» | κ o | κ ·*Ί | 3 41 e | «4 e | |||
| E | O | m | — | β | c | |||
| rs | rs | rs | ||||||
| rs | ||||||||
| ·—< | J | rs | J | J | ||||
| J | ||||||||
| 3 | J | 3 | 3 | |||||
| 3 | Ξ | ** | .Si | X | ||||
| d | S | o | 3 X | a | ä | |||
| <z | 0 | — | s | ‘1*. | >*. | |||
| «u | 1 | 14 | 14 | |||||
| rt | u | M | M | M | VI | |||
| 14 | u | >. | •d | *3 | •3 | |||
| o. | U | u | 3 | 3 | ||||
| •o | •VI | 1£ | ^4 | ε | t- | |||
| O | ||||||||
| u | ||||||||
| CU | (*> | |||||||
| Ά | O | rs | ||||||
| 0 | ffl | VO | ||||||
| N | r- | m | Xi | |||||
| •rt | M | o | 00 | VO | OV | |||
| z | U | CC | U | < | VO |
182
Mikrotitračné doštičky pre imunologický test ELISA s plochým dnom (96 jamiek, pre vysoké naviazania, Costar) boli potiahnuté cez noc pri teplote 4 °C s 0,1 ml ľudského IL-12 (2 pg/ml) v 0,1 M uhličitanovom poťahovacom pufre (4 objemy 0,1 M NaHC03 plus 8,5 objemov 0,1 M NaHCO3)). Doštičky boli premývané dvakrát PBS, ktorý obsahuje 0,05 % Tween 20 (PBS-T), blokované 200 μΐ bovinného sérového albumínu s koncentráciou 1 mg/ml (BSA, Sigma) v PBS-T, počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a opäť sa premyli dvakrát PBS-T. Boli pridané vzorky (objem 100 μΐ) obsahujúce protilátky proti IL-12 J695 (100 ng/ml) a každý cytokín (v koncentrácii 2 nM) v PBS-T obsahujúci 50 μg/ml BSA (PBS-T/BSA) a inkubovali sa počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Doštičky boli premyté štyrikrát a inkubovali sa počas jednej hodiny pri teplote miestnosti so 100 μΐ myšieho anti-ľudského lambda-HRP (1:500 v PBS-T/BSA, Southern Biotech. Ass. Inc , Birmingham, AL). Doštičky boli premyté štyrikrát a vyvíjali sa pomocou ABTS (Kirkegaard & Perry Lab., Geithersburg, MD) počas 20 až 30 minút v tme. Hodnoty OD pri vlnovej dĺžke 450 nm boli odčítané použitím čítacieho zariadenia (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Percento naviazania bolo stanovené vo vzťahu k naviazaniu protilátky J695 na doštičku potiahnutú IL12 v neprítomnosti ľubovoľného rozpustného cytokínu
Výsledky demonštrovali, že naviazanie protilátky J695 na imobilizovaný ľudský IL-12 bolo blokované iba ľudským IL-12p70 a v menšom rozsahu ľudským IL-12p40 a nie ľubovoľnými inými testovanými cytokínmi.
I. Naviazanie na novú molekulu IL-12
Bol opísaný alternatívny heterodimér IL-12, v ktorom podjednotka p3 5 je nahradená novou molekulou p!9. Molekula pl9 bola identifikovaná použitím vyhľadávania homológie 3D v prípade členov rodiny IL-6/IL-12 a je syntetizovaná aktivovanými dendritickými bunkami. Molekula p 19 sa viaže na podjednotku p40 za vzniku diméru pl9/p40, ktorý mal aktivitu podobnú 1L12, ale pri indukcii IFNy nie je tak silný ako heterodimér p35/p40.
183
Predpokladá sa, že protilátky, ktoré rozoznávajú samotnú podjednotku p40, ale prednostne v súvislosti s molekulou p70 (napríklad protilátka J695 a Y61, opisuje sa v príklade 3H) tiež neutralizujú obe molekuly p35/p4O a molekuly pl9/p40.
Príklad 4: Aktivita protilátok proti hIL-12 in vivo
Účinky in vivo protilátok proti IL-12 na odozvy vyvolané IL-12 boli testované v modeli, ktorým je upravený model použitý na štúdium účinku ľudského IL-12 na periférnu hematológiu u opice cynomolgus (opisuje sa v publikácii Bree et al., (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 204: 1 150-1157. V týchto predchádzajúcich štúdiách aplikácia ľudského IL-12 v koncentrácii 1 pg/kg/deň počas piatich dní viedla ku zníženiu počtu bielych krviniek (WBC), obzvlášť v podsúboroch lymfocytov a monocytov, po 24 hodinách. Zníženie počtu trombocytov bolo pozorované po 72 hodinách. Množstvo plazmového neopterínu, čo je marker pre aktiváciu monocytov pri odozve na IFN-γ, začína rásť po 24 hodinách a najvyššie bolo po 72 hodinách.
V prvej štúdii s ľudskými protilátkami proti hIL-12, bolo sedatívami upokojených 15 zdravých opíc cynomolgus s priemernou telesnou hmotnosťou 5 kg a rozdelilo sa do 5 skupín (n = 3). Skupine 1 sa intravenózne (IV) aplikovalo 10 mg/kg ľudského intravenózneho imunoglobulínu (IVIG, Miles, Eckhart, IN, čistený použitím sefarózy s proteínom A). Skupine 2 sa intravenózne aplikovalo 1 mg/kg protilátky C8.6.2 (neutralizačná myšia monoklonálna protilátka proti ľudskému IL-12) Skupine 3 sa intravenózne aplikovalo 10 mg/kg protilátky C8.6.2. Skupine 4 sa intravenózne aplikovalo 1 mg/kg protilátky Y61 (ľudská protilátka proti IL-12, izolovala sa z upraveného média vhodného pro bunky CHO). Skupine 5 sa aplikovalo intravenózne 10 mg/kg protilátky Y61.
Jednu hodinu po aplikácii protilátky všetky zvieratá dostali jedinú podkožnú injekciu (SC) ľudského IL-12 (1 pg/kg) Krvné vzorky boli odobrané v nasledujúcich časoch: základný čas, 8, 24, 48, 96 a 216 hodín a analyzoval sa celkový počet krvných buniek pomocou rozdielov a chemickou
184 analýzou séra. Bol tiež meraný sérový ľudský IL-12, protilátka C8,6.2, protilátka Y61, opičí IFN-gama, opičí IL-10, opičí IL-6 a množstvo neopterínu v plazme.
Zvieratá ošetrené IL-12 plus kontrolnou protilátkou IVIG (skupina 1) vykazovali rad očakávaných hematologických zmien, ktoré zahrnujú zníženie WBC, trombocytov, počtu lymfocytov a monocytov. Tieto zníženia neboli pozorované alebo boli menej výrazné u zvierat ošetrených buď protilátkou C8.6.2 alebo Y61 pri koncentrácii 1 alebo 10 mg/kg (skupiny 2 až 5).
Vzorky séra a plazmy boli analyzované testom ELISA špecifickým pre opičí IFN-gama a opičí IL-10 (Biosource International, Camarillo, CA), opičí IL-6 (Endogen) a plazmový neopterín (ICN Pharmaceuticals, Orangeburg, NY). IFN-gama, IL-10 alebo IL-6 neboli detegované u žiadného zo zvierat ošetrených IL-12, ktoré zahrnujú kontrolné zvieratá ošetrené IL-12 plus IVIG. To bolo pravdepodobne spôsobené nízkým stupňom expozície IL-12 (iba jedna dávka v koncentrácii 1 pg/kg). Napriek tomu množstvo neopterínu v plazme sa zvýšilo u zvierat ošetrených IL-12 plus IVIG približne trikrát, ale nemenilo sa u zvierat ošetrených protilátkou C8.6.2 alebo Y61, ktoré zahrnujú zvieratá ošetrené nižšou dávkou protilátky Y61 (1 mg/kg), čo indikuje, že protilátka Y61 bola účinná in vivo pri blokovaní tejto citlivej odozvy na IL12.
Pri druhej štúdii boli študované aktivity in vivo a farmakodynamiky (PD) protilátky J695 u opíc cynomolgus aplikáciou exogénneho rhIL-12 a stanovilo sa, či protilátka J695 by mohla blokovať alebo redukovať odozvu, ktorá je v normálnom prípade spojená s aplikáciou rhIL-12. Samcom opíc cynomolgus (3 v skupine) bola aplikovaná jediná dávka protilátky J695 v koncentrácii 0,05, 0,3 alebo 1,0 mg/kg alebo 1 mg/kg intravenózneho imunoglobuiínu (IVIG) ako bolusová intravenózna (IV) injekcia do safenóznej žily alebo podkožné, subkutánne (SC) do dorzálnej kože. Jednu hodinu po aplikácii protilátky J695 alebo IVIG, dostali všetky zvieratá jednu dávku 1/mg/kg rhIL-12 (SC) aplikovanú do dorzálnej kože. Vzorky krvi sa odobrali z femorálnej žily až 29 dní po aplikácii protilátky J695 Z každej vzorky krvi sa získalo sérum a testom ELISA sa testovala prítomnosť IL-12,
185
J695, IFN-γ a protilátky proti J695. Neopterín sa testoval pomocou HPLC s reverznou fázou.
Množstvo neopterínu normalizované vzhľadom na množstvo neopterínu, ktoré sa nameralo pred aplikáciou protilátky J695 alebo rhIL-12, je uvedené na obrázku 3. Aby sa porovnalo zníženie množstva neopterínu medzi skupinami, bola vypočítaná v prípade každého zvieraťa oblasť pod krivkou (AUC) normalizovaná pre množstvo neopterínu (tabuľka 6). Vystavenie neopterínu (AUC) bolo potlačené spôsobom závislým od dávky medzi približne 71 a 93 % v skupinách IV a medzi 71 a 100 % v skupinách SC, vzhľadom ku kontrolnej skupine IVIG. Tieto výsledky naznačujú, že dávka protilátky J695 nevyhnutná pre 50 % inhibíciu neopterínovej odozvy (ED50) bola nižšia než 0,05 mg/kg, keď sa aplikovala buď IV alebo SC cestou.
Tabuľka 6: Od dávky závislé potlačenie neopterínu indukovaného IL-12 protilátkou J695 u opíc cynomolgus.
| Spôsob dávkovania IVICI alebo J695 a rhIL-12 | dávka J695 (mg/kg) | dávka IVIG (mg/kg) | AlIC normalizovaného množstva neopterínu | % zníženia AlIC neopterínu v porovnaní s kontrolou |
| jediná IVinjekcia nasledovaná o jednu hodinu neskôr dávkou 1 μβ/kg ľudského IL-12 podaného SC | - | 1.0 | I 745 ± 845 | 0 |
| 0,05 | - | 502 ± 135 | 71,3 | |
| 0.2 | - | 199 ± 316 | 92.7 | |
| 1.0 | - | 1 480 ± 604 | 0 | |
| jediná injekcia SC nasledovaná o hodinu neskôr dávkou 1 μβ/kg ľudského IL-12 podaného SC | - | 1.0 | 1 480 ± 604 | 0 |
| 0.05 | - | 426 ± 108 | 71.2 | |
| 0.2 | - | 395 ± 45.9 | 73,3 | |
| 1.0 | - | 0 + 109 | 100 |
186
Liečba protilátkou J695 tiež zabránila zmenám alebo redukovala zmeny v hematológii, ktoré sú normálne spojené s aplikáciou rhIL-12 (leukopénia a trombocytopénia). 24 hodín po aplikácii rhIL-12 boli znížené počty lymfocytov o približne 50 % v porovnaní so základnými hodnotami v kontrolných skupinách ošetrených IV a SC IVIG. Aplikácia protilátky J695 buď cestou SC alebo IV v celkovom množstve troch dávok predišla tejto redukcii, výsledkom je, že počty lymfocytov po 24 hodinách približne zodpovedajú základným hodnotám. 48 hodín po aplikácii IL-12 počty trombocytov v skupinách ošetrených IV a SV IVIG boli znížené o približne 25 % v porovnaní so základnými hodnotami.
Príkladom dávkového rozvrhu cieleného na udržanie sérového množstva nad 90 % účinného množstva by malo byť 1 mg/kg IV a SC podané približne každý druhý týždeň alebo 0,3 mg/kg podané približne každý týždeň, pričom sa predpokladá, že počas opakovaných dávok dochádza k slabej akumulácii. Táto štúdia ukazuje, že aplikácia protilátky opiciam v takej dávke je bezpečná. V nezávislej štúdii toxicity bolo ďalej zistené, že pre opice môže byť bezpečná až dávka protilátky 100 mg/kg.
Protilátka J695 bola tiež účinná pri prevencii produkcie IFN-gama u myší ošetrených chimérickým IL-12, molekulou, ktorá kombinuje myšiu podjednotku p35 s ľudskou podjednotkou p40 IL-12. Na rozdiel od ľudského IL-12, ktorý nie je u myší biologicky aktívny, tento chimérický IL-12 si zachováva u myší biologickú funkciu, čo zahrnuje indukciu IFN-gama. Navyše ľudská podjednotka p40 umožňuje molekule, aby bola viazaná a neutralizovaná protilátkou J695. Samiciam myší C3H/HeJ (10 myší v experimetnálnej skupine) bol aplikovaný chimérický IL-12 v piatich denných dávkach i.p. v deň 0, 1, 2, 3 a 4, pričom dávka obsahuje 0,05 mg/kg. 30 minút pred aplikáciou injekcie IL-12 bola aplikovaná v deň 0, 2 a 4 protilátka J695 v dávke 0,05, 0,01, 0,002, 0,0004, 0,00008 a 0,000016 mg/kg i.p.. Kontrolný hulgGly bol aplikovaný IP v dávke 0,05 mg/kg v deň 0, 2 a 4. Myšiam sa odobrali krvné vzorky v deň 5 a testom ELISA bolo stanovené množstvo IFN-gama v sére. Výsledky demonštrovali, že protilátka J695 spôsobila inhibíciu produkcie IFN-gama závislej od dávky s hodnotou EDjo
187 približne 0,001 mg/kg. Súhrnne tieto výsledky demonštrujú, že protilátka
J695 je účinným inhibítorom aktivity IL-12 in vivo.
Príklad 5: Kinetická analýza naviazania ľudských protilátok na rekombinantný ľudský IL-12 (rhIL-12)
Väzbové interakcie v reálnom čase medzi značeným ligandom (ľudská protilátka J695 proti rhIL-12, zachytená na biosenzorovej matrici) a analytom (rhIL-12 v roztoku) boli merané povrchovou plazmónovou rezonanciou (SPR) použitím systému BIAcore (Biacore AB, Uppsala, Švédsko). Systém využíva optické vlastnosti SPR, aby sa detegovali zmeny v koncentrácii proteínu na dextránovej biosenzorovej matrici. Proteíny sú kovalentne viazané na dextránovú matricu v známych koncentráciách. Protilátky sú zavedené injekciou cez dextránovú matricu a špecifické naviazanie injekciou zavedených protilátok a imobilizovaného ligandu vedie k zvýšeniu koncentrácie proteínu na matrici a k výslednej zmene v signáli SPR. Tieto zmeny v signáli SPR sú zaznamenávané ako jednotky rezonancie (RU) a sú vyjadrené vzhľadom na čas vynesený na os Y senzogramu.
Aby sa umožnila imobilizácia kozieho anti-ľudského IgG /Southern Biotechnology Associates, kat. č. 2040-01, Birmingham, AL) na biosenzorovej matrici, kozí anti-ľudský IgG je kovalentne spojený cez voľné aminoskupiny s dextránovou matricou pomocou prvých aktivačných karboxylových skupín na matrici so 100 mM N-hydroxysukcínimidu (NHS) a 400 mM N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydrochloridu (EDC). Ako ďalší sa cez aktivovanú matricu injekciou zavedie kozí anti-ľudský IgG. Cez aktivovaný biosenzor je injekciou zavedených 35 mikrolitrov kozieho anti-ľudského IgG (25 gg/ml) riedeného v acetáte sodnom pH 4,5 a voľné amíny proteínu sú viazané priamo na aktivované karboxylové skupiny. Nezreagované estery viazané na matricu EDC sú deaktivované injekciou IM v
etanolamínu. Štandardné kity spojovania amínov boli bežne dostupné (Biacore AB, kat. č. BR-1000-50, Uppsala, Švédsko).
188
Protilátka J695 bola riedená v pufre HBS (Biacore AB, kat. č. BR-100188, Uppsala, Švédsko), aby bola zachytená na matricu cez kozí proti-ľudský IgG. Aby sa stanovila kapacita protilátok špecifických pre rhIL-12 viazať sa na imobilizovaný kozí anti-ľudský IgG, urobil sa väzbový test nasledujúcim spôsobom. Alikvóty protilátky J695 (25 pg/ml), alikvóty objemu 25 mikrolitrov) boli zavedené injekciou cez dextránovú matricu spojenú s kozou polyklonálnou protilátkou proti ľudskému IgG s prietokovou rýchlosťou 5 mikrolitrov za minútu. Pred injekciou proteínu a bezprostredne po nej pretiekol samotný pufer HBS každou voľnou bunkou. Množstvo viazaného komplexu IgGl J695 reprezentuje čistý rozdiel signálu medzi základnou hodnotou a hodnotou v bode zodpovedajúcemu približne 30 sekundám po dokončení zavedenia protilátky J695 injekciou (približne 1 200 RU). Meralo sa priame naviazanie protilátky špecifickej pre rhIL12 na rozpustný rhIL12. Cytokíny boli riedené v pufre používanom na uskutočnenie HBS a alikvóty objemu 50 μΐ boli injekciou zavedené cez matrice s imobilizovaným proteínom s prietokovou rýchlosťou 5 mikrolitrov za minútu. Používané koncentrácie rhIL-12 boli 10, 20, 25, 30, 40, 50, 80, 100, 150 a 200 nM. Pred injekciou rhIL-2 a bezprostredne po nej, samotný pufer HBS pretiekol každou voľnou bunkou. Aby sa reprezentovala väzbová hodnota určitej vzorky, bol stanovený čistý rozdiel základného signálu a signálu po zavedení cytokínov injekciou. Pred aplikáciou ďalšej vzorky injekciou boli biosenzorové matrice regenerované použitím 100 mM HCI. Aby sa stanovila konštanta rýchlosti disociácie a konštanta rýchlosti asociácie bol použitý Software na hodnotenie kinetiky BIAcore (verzia 2.1).
Reprezentatívne výsledky naviazania protilátky J695 získanej z CHO na rhIL-12 v porovnaní s protilátkou J695 získanou z buniek COS sú uvedené v tabuľke 7.
189
Tabuľka 7: Naviazanie protilátky J695 získanej z buniek CHO a COS na rhIL-12
| zdroj | rhIL12, nM | rhIL12 viazaný,’RU's | Ab, viazaný, RU's | rhILI2/AB |
| CHO | 200 | 1112 | 1613 | 1.48 |
| CHO | ISO | 1033 | 1525 | 1.45 |
| CHO | 100 | 994 | 1490 | 1.43 |
| CHO | 80 | 955 | 1457 | 1.40 |
| CHO | 50 | 912 | 1434 | 1.36 |
| CHO | 40 | 877 | 1413 | 1.33 |
| CHO | 25 | 818 | 1398 | 1.25 |
| CHO | 20 | 773 | 1382 | 1.20 |
| CHO | 10 | 627 | 1371 | 0.98 |
| zdroj | rhILI2. nM | rhlL 12viazaný, RU's | Ab.'viazoný, RU'S | rhILI2'AB |
| COS | 200 | 1172 | 1690 % | 1.49 |
| COS | 150 | 1084 | 1586 | 1.46 |
| COS | 100 | 1024 | 1524 | 1.44 |
| COS | 80 | 985 | 1489 | 1.42 |
| COS | 50 | 932 | 1457 | 1.37 |
| COS | 40 | 894 | 1431 | 1.34 |
| COS | 25 | 833 | 1409 | 1.27 |
| COS | 20 | 783 | 1394 | 1.20 |
| COS | 10 | 642 | 1377 | 1.00 |
Použitím technológie BIAcore boli kvantitatívne analyzované molekulové kinetické interakcie medzi zachytenou protilátkou J695 a rozpustným rhIL-12. Uskutočnilo sa niekoľko nezávislých experimentov a výsledky boli analyzované dostupným softwarom BIAcore pre matematickú analýzu, aby sa získali kinetické rýchlostné konštanty, ako je zobrazené v tabuľke 8.
Tabuľka 8: Zdanlivá kinetická rýchlosť a afinitné konštanty protilátky J695 pre rhIL-12
| Protilátka | zdroj | k„„ (Μ’1 s-'). priemerná hodnota | koff (s*1), priemerná hodnota | Kd(M) priemerná hodnota |
| J695 | CHO | 3,52E+05 | 4,72E-05 | l,34E-10 |
| J695 | COS | 3,40E+05 | 2,61E-05 | 9,74E-11 |
190
Existoval tu malý rozdiel medzi vypočítanou zdanlivou konštantou (Kd) v prípade interakcie medzi protilátkou J695 získanou z CHO (Kd = 1,34'10 M' ') a protilátkou J695 získanou z COS (Kd = 9,74 x 10'11 M'1). Zdanlivá disociačná konštanta (Kd) medzi protilátkou J695 a rhIL12 bola posúdená z pozorovaných rýchlostných konštánt podľa vzorca Kd = koff/kon.
Aby sa stanovila zdanlivá asociačná a disociačná rýchlostná konštanta pre interakciu medzi protilátkou J695 a rhIL-12, uskutočnilo sa niekoľko väzbových reakcií použitím fixovaného množstva protilátky J695 (2 gg/ml) a rôznej koncentrácie rhIL-12. Senzogramy väzbových interakcií medzi zachyteným J695 a rozpustným rhIL12 vykazovali, že obe formy protilátky boli veľmi podobné pre asociačnú a disociačnú fázu.
S cieľom ďalšieho hodnotenia kapacity značenej monoklonálnej protilátky IgGl J695 viazať rozpustný rekombinantný cytokín bola použitá priama metóda BIAcore. Pri tejto metóde kozí anti-ľudský IgG (25 gg/ml) spojený so senzorovým povrchom karboxymetyldextránu bol potiahnutý IgGl J695 (2 gg/ml) a potom bol pridaný rekombinantný cytokín. Keď sa rozpustný rhlL 12 zaviedol injekciou cez biosenzorový povrch spojený s IgGl J695 získaným z CHO alebo COS, vzrástla v roztoku sila signálu v súlade so zvýšením koncentrácie cytokínu. V prípade rmIL12 (R&D Systems, kat. č. 419-ML, Minneapolis, MN) alebo rhIL12 v ľubovoľnej testovanej koncentrácii až do 1 000 nM nedošlo k žiadnemu naviazaniu. Tieto výsledky podporujú záver, že protilátky IgGl J695 rozoznávajú odlišnú determinantu na rhIL12.
Tabuľka 9 ukazuje výsledky experimentálneho použitia BIAcore, aby demonštrovala naviazanie ľudskej protilátky IgGl J695 iba na rozpustný rhILl2 a nie na iné rekombinantné cytokíny.
Tabuľka 9’ Epitop mapujúci protilátku J695 použitím technológie BIAcore
| zachytený ligand COS J695 | zachytený ligand CHO J695 | |
| Rozpustný analyt | ||
| rek ľudský IL12 | Pozitívny | Pozitívny |
| rek. myší IL12 | Negatívny | Negatívny |
191
Príklad 6: Ďalšie štúdie afinity protilátky J695 pre IL-12
Molekulárne kinetické interakcie medzi protilátkou J695 a ľudským IL-12 boli kvantitatívne analyzované použitím technológie plazmónovej rezonancie BIAcore a boli odvodené zdanlivé kinetické rýchlostné konštanty.
Technológia BIAcore bola používaná na meranie naviazania rozpustného IL-12 na protilátku J695 zachytenú na pevnej fáze. Kozia antiľudská protilátka IgG bola imobilizovaná na biosenzorové čipy, potom fixované množstvo protilátky J695 bolo zavedené injekciou a zachytené na povrchu. Boli aplikované rôzne koncentrácie rhIL-12 a bolo merané naviazanie IL-12 v rôznych koncentráciách na protilátku J695 ako funkcia času. Bola vypočítaná zdanlivá asociačná a disociačná rýchlostná konštanta, pričom sa predpokladá disociačná kinetika nultého rádu a asociačná kinetika prvého rádu, rovnako ako jednoduchá interakcia jedna ku jednej medzi protilátkou J695 a IL-12. Uskutočnili sa tri nezávislé experimenty a zobrazené hodnoty sú priemery hodnôt získaných v troch experimentoch. Z týchto meraní boli získané zdanlivé disociačné (kd) a asociačné (ka) rýchlostné konštanty a použili sa na výpočet hodnoty Kd pre interakciu (opisuje sa v tabuľke 10). Výsledky indikovali, že protilátka J695 vykazovala vysokú afinitu pre rhIL-12.
Tabuľka 10: Kinetické parametre interakcie medzi protilátkou J695 a ľudským IL-12
| kinetický parameter | Hodnota |
| kj | 3,71 ± 0,40 x 10‘5 s'1 |
| ka | 3,81 ± 0,48 x 10'5 M^s’1 |
| Kd | 9,74 x 10'11 M (14 ng/ml) |
Príklad 7: Charakteristiky a neutralizačná aktivita krysej monoklonálnej protilátky C17.15 proti myšiemu interleukínu-12
192
Aby sa odhadla relevantnosť štúdií liečby IL-12 zápalových a autoimuinitných ochorení použitím monoklonálnych protilátok špecifických pre myší IL-12 v myších modeloch s podobnými prístupmi u ľudského ochorenia, testovala sa interakcia C17.15, krysej monoklonálnej protilátky proti myšiemu interleukínu-12 s myším IL-12. Bola posúdená schopnosť protilátky 07.15 neutralizovať aktivitu myšieho IL-12 v teste proliferácie PHA blastov a blokovať naviazanie myšieho IL-12 na bunečné povrchové receptory, rovnako ako kinetiky väzbovej interakcie 07.15 - myší IL-12.
V teste proliferácie ľudských PHA blastov (opisuje sa v príklade 3) sériové riedenia 07.15 alebo krysieho IgG2a (kontrolná protilátka) boli vopred inkubované s 230 pg/ml myšieho IL-12 počas 1 hodiny pri teplote 37 °C. Blastové bunky stimulované PHA boli pridané ku zmesi protilátky IL-12 a inkubovali sa počas troch dní pri teplote 37 °C. Bunky boli následne značené počas 6 hodín s [3H]-tymidínom s 1 pCi/jamku. Kultúry boli zhromaždené a bol meraný začlenený [ H]-tymidín. Pozadie nešpecifickej proliferácie bolo merané v neprítomnosti pridaného myšieho IL-12. Všetky vzorky boli testované dvojmo. Hodnota IC50 (M) protilátky 07.15 v prípade rekombinantného myšieho IL-12 v tomto teste bola 1,4 x 1011 porovnané s hodnotou IC50 5,8 x 10'12 pozorovanou pre protilátku J695 vytvorenú proti rekombinantnému ľudskému IL-12 za rovnakých podmienok (opisuje sa v tabuľke 11).
Tabuľka 11: Porovnanie vlastností monoklonálnej protilátky J695 proti ľudskému IL-12 a krysej monoklonálnej protilátky 07.15 proti myšiemu IL-12
| protilátka | epitop | biomo | ckulárny | interakčný test | test naviazania na receptor | test PHA blastov | ||
| Ka (M-'s’1) | kd (s'') | Kd (M) | ic5o (M) | IC«, (M) | ||||
| J695 | Hu p40 | 3,81 x IO5 | 3,71 x | IO'5 | 9,74 x IO'11 | 1,1 x 10 | 5,8 > | IO’12 |
| C 17.15 | Mu p40 | 3,80 x IO5 | 1.84 x | IO“1 | 4,80 x IO'' | 1.5 x IO’1 | 1.4 > | 10 |
193
Tiež bola meraná schopnosť protilátky C17.15 inhibovať naviazanie myšieho IL-12 na bunečné receptory. Sériové riedenia protilátky 07.15 boli vopred inkubované počas jednej hodiny pri teplote 37 °C so 100 pM [I25I]myšieho IL-12 vo väzbovom pufre. Ku zmesi protilátka/[125I]-myší IL-12 boli pridané bunky 2D6 (v množstve 2 x 106) a zmes sa inkubovala počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Na bunky viazaná rádioaktivita sa oddelila od voľného [l25I]-IL-12 a bola stanovená zostávajúca rádioaktivita viazaná na bunky. Bolo stanovené celkové naviazanie značeného myšieho IL-12 na receptory na bunkách 2D6 v neprítomnosti protilátky a v teste bolo stanovené nešpecifické naviazanie inklúziou 25 nM neznačeného myšieho IL-12. Špecifické naviazanie bolo vypočítané ako celkové naviazanie mínus nešpecifické naviazanie. Inkubácie boli urobené dvojmo. Výsledky ukázali, že protilátka C17.15 vykazuje pre inhibíciu naviazania myšieho IL-12 na bunečné receptory hodnotu IC50 1,5 x 1O’10 M.
Afinita protilátky C17.15 pre rekombinantný myší IL-12 bola posúdená analýzou biomolekulárnych interakcií. Kozia protilátka proti krysiemu IgG bola imobilizovaná na biosenzorových čipoch, potom nasledovala injekcia fixného množstva protilátky C17.15, čo vedie k naviazaniu protilátky C17.15 na povrch čipu. Rôzne koncentrácie rekombinantného myšieho IL-12 boli aplikované na povrch viazanej protilátky C17.15 a bolo merané naviazanie myšieho IL-12 na imobilizovanú protilátku 07.15 ako funkcia času. Boli vypočítané zdanlivé disociačné a asociačné rýchlostné konštanty, pričom sa predpokladá disociačná kinetika nultého rádu a asociačná kinetika prvého rádu, rovnako ako jednoduchá interakcia jedna ku jednej medzi imobilizovanou protilátkou 07.15 a myším IL-12. Z týchto meraní boli vypočítané zdanlivé disociačné (kd) a asociačné (ka) rýchlostné konštanty. Tieto výsledky boli použité na výpočet hodnoty Kd v prípade interakcie. V prípade interakcie rekombinantného myšieho IL-12 - C17.15 bola pozorovaná hodnota ka 3,8 x 105 M^s'1, kd 1,84 x 10'4 s1 a Kd 4,8 x 1O'10.
Pozorované aktivity protilátky Cl7.15 pri neutralizácii aktivity myšieho IL-12 a naviazaní na bunečné povrchové receptory rovnako ako kinetiky naviazania protilátky C17 15 na myší IL-12 korelujú s podobnými meraniami
194 v prípade interakcie J695-rhIL-12. To indikuje, že módy pôsobenia krysej protilátky C17.15 proti myšiemu IL-12 a protilátky J695 proti ľudskému IL12 sú skoro zhodné, co sa týka hodnôt ka, kd, Kd, IC5o a testu s PHA blastami. Preto protilátka 07.15 bola použitá ako homológna protilátka v prípade protilátky J695 v myších modeloch zápalového a autoimunitného ochorenia pre štúdium účinkov blokády IL-12 na vznik a postup ochorenia u týchto modelových zvierat (opisuje sa v príklade 8).
Príklad 8: Liečba autoimunitných a zápalových ochorení u myší aplikáciou protilátky proti α-myšiemu IL-12
A. Potlačenie artritídy vyvolanej kolagénom u myší pomocou protilátky 07.15 proti a-IL-12
Bola demonštrovaná korelácia medzi množstvom IL-12 a reumatoidnou artritídou (RA). Bolo napríklad detegované zvýšené množstvo IL-12p70 v kĺbnom maze pacientov trpiacich reumatoidnou artritídou v porovnaní so zdravými kontrolami (opisuje sa v publikácii Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-315). Preto bola hodnotená schopnosť protilátky C 17.15, čo je krysia protilátka proti myšiemu IL-12, potlačiť artritídu vyvolanú kolagénom.
Samci myší DBA/1 (10 myší vo skupine) boli imunizovaní kolagénom typu II v deň O a ošetrili sa protilátkou C17.15 alebo kontrolným krysím IgG v koncentrácii 10 mg/kg intraperitoneálne každý druhý deň odo dňa -1 (jeden deň pred imunizáciou kolagénom) až do dňa 12. U zvierat bol klinicky sledovaný vývoj artritídy labiek až do dňa 90. Artritída bola rozdelená do stupňov: symbol O znamená normálny stav, symbol 1 znamená artritídu lokalizovanú v jednom kĺbe, symbol 2 znamená, že je zahrnutý viac ako jeden kĺb, ale nie celá labka, symbol 3 znamená, že je zahrnutá celá labka, symbol 4 označuje deformáciu labky, symbol 5 označuje ankylózu zahrnutých kĺbov. Artritické skóre u myši bol súčet artritických stupňov pre každú jednotlivú labku danej myši (maximálna hodnota je 20). Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SEM v každej skupine.
195
Výsledky, ako sú zobrazené na obrázku 4, indikujú, že artritické skóre bolo merateľné u myší ošetrených protilátkou C17.15 iba po dni 50 po liečbe a tak maximum priemernej hodnoty artritického skóre získaného u myší ošetrených protilátkou 07.15 bolo aspoň 5 krát nižšie než maximum merané u myší ošetrených IgG. To demonštrovalo, že krysia protilátka 07.15 proti myšiemu IL-12 zabránila u myší vývoju artritídy vyvolanej kolagénom.
B. Potlačenie kolitídy u myší krysou protilátkou 07.15 proti a-myšiemu IL-12
Ukázalo sa, že IL-12 má úlohu pri vývoji/patológii kolitídy. Ďalej sa ukázalo, že napríklad protilátky proti IL-12 potlačujú ochorenie v myších modeloch kolitídy, napríklad kolitídy vyvolanej TNBS u myší postihnutých účinkom IL-12 (opisuje sa v publikácii Simpson et al., (1998) J. Exp. Med. 187(8): 1225-34). Podobne sa ukázalo, že protilátky proti IL-12 potlačujú vznik kolitídy u myší postihnutých účinkom IL-10. Vo dvoch štúdiách bola hodnotená schopnosť krysej protilátky proti myšiemu IL-12, C17.15, potlačiť TNBS kolitídu u myší (opisuje sa v publikácii Davidson et al., (1998) J. Immunol. 161(6): 3143-9).
V prvej štúdii bola kolitida vyvolaná u myší SJL, ktoré neobsahujú patogén, aplikáciou 150 μΐ 50% roztoku etanolu, ktorý obsahuje 2,0 mg TNBS zavedeného detským umbilikálnym arteriálnym katétrom do konečníka. Kontrolné zvieratá boli ošetrené iba 150 μΐ 50% roztoku etanolu. Chvostovou žilou bola aplikovaná intravenózne v deň 11 jediná dávka 0,75, 0,5, 0,25, alebo 0,1 mg protilátky C17.15 alebo 0,75 mg kontrolného krysieho IgG2a a hodnotil sa terapeutický účinok liečby vážením zvierat v deň 11 a 17 a histologickým vyšetrením v deň 17. Telesná hmotnosť myší ošetrených protilátkou 07.15 vzrástla počas 48 hodín liečby protilátkou a normalizovala sa v deň 6 po liečbe. Účinok liečby s protilátkou 07.15 bol potvrdený histologický. Ďalej bolo uskutočnené hodnotenie vylučovania IFN-γ bunkami T CD4+ zo sleziny a hrubého čreva ošetrených myší, rovnako ako množstvo
196
IL-12 z makrofágov získaných zo sleziny a hrubého čreva pochádzajúcich z ošetrených myší (opisuje sa v tabuľke 12).
Pri druhej štúdii bolo optimalizované dávkovanie a myši sa ošetrili celkovou dávkou 0,1 mg alebo 0,5 mg protilátky 07.15 alebo respektíve 0,1 mg kontrolného IgG2a rozdelených do dní 12 a 14. Zistilo sa, že aplikácia protilátky 07.15 v jednej dávke, kedy sa aplikovalo jednej myši 0,1 mg alebo 0,25 mg, viedla iba k čiastočnému zlepšeniu kolitídy vyvolanej TNBS a neviedla k podstatnej redukcii produkcie IFN-γ v bunkách T CD4+ in vitro, ale výsledkom bolo podstatné zníženie vylučovania IL-12 v porovnaní s neliečenými kontrolami. Bola pozorovaná odozva, keď sa jednej myši v jednej dávke aplikovalo 0,5 mg alebo viac. Keď sa vzala najnižšia dávka testovanej protilátky a aplikovala sa vo dvoch rozdelených injekciách (v deň 12 a 14) zlepšil sa dávkovací režim, čo indikuje, že viacnásobné nízke dávky môžu byť viac účinné v porovnaní s jednou bolusovou dávkou. Získané dáta sú zobrazené v tabuľke 12.
Tabuľka 12: Monoklonálna protilátka 07.15 proti myšiemu IL-12 potlačuje preukázanú kolitídu u myší
| Vyvolanie ochorenia v deň 0 | liečba deň 11 | Hmotnosť (g) | IFN-γ vylúč. bunkami CD4+ sleziny (U/ml) | IL-12 vylúč. makrofágmi sleziny (pg/ml) | |
| deň 11 | deň 17 | ||||
| TNBS+eta- nol | kontrola lgG2a 0,75 mg | 16,0 | 15,26 | 3 326 | 300 |
| TNBS+eta- nol | 07.15 0,75 mg | 16,0 | 20,21 | 1 732 | 0 |
| TNBS+eta- nol | 07.15 0,5 mg | 16,36 | 19,94 | 1 723 | 0 |
| TNBS+eta- nol | 07.15 0,25 mg | 16,28 | 17,7 | 3 618 | 7 |
| TNBS+eta- nol | 07.15 0,1 mg | 16,2 | 17,98 | 3 489 | 22 |
| kontrola etanol | - | 20,76 | 21,16 | 1 135 _ | 0 |
197
Aplikácia monoklonálnej protilátky C17.15 proti IL-12 vo dvoch rozdelených dávkach v intervale jedného dňa, pričom celková dávka je 0,1 mg/myš alebo 0,05 mg/myš, viedla k úplnému zvratu kolitídy, ako sa hodnotilo na základe celkového stavu a makroskopického vzhľadu hrubého čreva. Navyše tento dávkový rozvrh viedol k podstatnej negatívnej regulácii produkcie lFN-γ T buniek slizničného väziva a produkcie IL-12 makrofágov, takže neskôr boli produkcie porovnateľné s množstvom identifikovaným u myši ošetrených kontrolným roztokom etanolu, u ktorých nedošlo ku vzniku TNBS-kolitídy. Tak aplikácia protilátky 07.15 v myších modeloch vhodných pre TNBS kolitídu zvrátila postup ochorenia v závislosti od dávky.
A. Potlačenie experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy (EAE) u myší protilátkami proti a-IL-12
Všeobecne sa usudzuje, že IL-12 má úlohu pri patogenéze roztrúsenej sklerózy (MS). Ukázalo sa, že indukovateľná mRNA IL-12 p40 bola exprimovaná v akútnych plakoch pacientov trpiacich roztrúsenou sklerózou, ale nie v zápalových mozgových infarktových léziách (opisuje sa v publikácii YVindhagen, A et ak, (1995) J Exp. Med. 182: 1985-1996). Bunky T z pacientov trpiacich roztrúsenou sklerózou (ale nie kontrolné T bunky) stimulujú produkciu IL-12 v bunkách prezentujúcich antigén cez neregulovanú expresiu CD40L (opisuje sa v publikácii Balashov, K. E. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 599-603). Pacienti trpiaci roztrúsenou sklerózou vykazujú zvýšenú sekréciu IFN-γ, ktorá môže byť blokovaná in vitro protilátkami proti a-IL-12 (opisuje sa v publikácii Balashov, K. E. et al., (1997) Proc. Natl Acad. Sci. USA 94. 599-603). U pacientov trpiacich roztrúsenou sklerózou, nie však inými neurologickými chorobami, je detegované zvýšené množstvo sérového IL-12 (opisuje sa v publikácii Nicoletti, F. et al., (1996) J. Neuroimmunol. 70: 87-90). Ukázalo sa, že zvýšená produkcia IL-12 koreluje s aktivitou ochorenia u pacientov s MS (opisuje sa v publikácii Cormabella, M. et al., (1998) J Clin Invest. 102: 671-678). Bola študovaná úloha IL-12 v patogenéze myšieho modelu roztrúsenej sklerózy, experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy (EAE)
198 (opisuje sa v publikácii Leonard, J P. et al., (1995) J Exp. Med. 181: 281386, Banerjee, S. et al., (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33, a Segal, B. M. et al., (1998) J. Exp. Med. 187: 537-546). Je známe, že ochorenie v tomto modeli bolo indukované T bunkami podsúboru THj Preto sa hodnotila schopnosť protilátok proti a-IL-12 predchádzať vzniku akútnej EAE.
Zistilo sa, že protilátky proti a-IL-12 budú schopné inhibovať vznik akútnej EAE, aby sa potlačilo ochorenie po jeho vzniku, a znížiť vážnosť recidívy u myší imunizovaných autoantigénom, ktorým je myelínový základný proteín (opisuje sa v publikácii Benerjee, S. et al., (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33). Výhodné účinky liečby myšou protilátkou proti a-IL-12 pretrvávali viac ako dva mesiace po ukončení liečby. Tiež sa ukázalo, že protilátky proti IL-12 potlačujú ochorenie u myší, ktoré sú recipienti encefalitogénnych buniek T adoptívnym prenosom (opisuje sa v publikácii Leonard, J. P. et al., (1995) J. Exp. Med. 181: 281-386).
Príklad 9: Klinická farmakológia protilátky J695
V rekombinantnej Štúdii sa 64 zdravým mužom aplikovali stúpajúce dávky protilátky J695 alebo placebo. Meranie fragmentu komplementu C3a pred aplikáciou dávky a 15 minút po aplikácii nedemonštrovalo aktiváciu systému komplementu. U subjektov, kde boli pozorované symptómy konkurenčnej infekcie vzrástlo iba množstvo CRP a fibrinogénu
Všetky subjekty prežili a všeobecná tolerovateľnost protilátky J695 bola veľmi dobrá. Ani v jednom prípade nemusela byť liečba zastavená na základe nežiaducich javov (AE). Najbežnejšie pozorované AE boli bolesť hlavy a bežná nádcha/bronchitída, žiadny z týchto príznakov nebol zaradený do kategórie vážnych príznakov.
Jeden zo študovaných subjektov, 33 ročný slobodný muž trpel na začiatku štúdie ochorením lupienkou, psoriasis guttata. Podľa náhodného navrhnutia štúdie tento subjekt mal šancu dostať 5 mg/kg protilátky J695 subkutánnou (SC) aplikáciou. Desať dní pred aplikáciou protilátky subjekt
199 vykazoval iba malé diskrétne papulárne lézie na horných a dolných končatinách. V čase aplikácie protilátky subjekt vykazoval zvýšené začervenanie, zvýšenú hrúbku erytematóznych plakov a zvýšenú hyperkeratózu. Jeden týždeň po aplikácii protilátky J695 subjekt hlásil zlepšenie stavu kože zahrnujúce zoslabenie lézií a zníženie odlupovania kože. Krátko po druhej aplikácii protilátky J695 (5 mg/kg IV) koža subjektu bola úplne bez lupienkových lézií, bez toho, aby došlo k akejkoľvek lokálnej liečbe. Erytematózne plaky pokryté bielymi šupinami sa znovu objavili v súlade s očakávaným vymiznutím protilátky J695 po druhej aplikácii protilátky.
Príklad 10: Porovnanie protilátky J695 produkované dvoma bunečnými líniami CHO
S cieľom dosiahnuť rekombinantnú expresiu protilátky J695 je rekombinantný expresívny vektor kódujúci ťažký aj ľahký reťazec protilátky zavedený do buniek dhfr- CHO (Urlaub, G. and Chasin. L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220) transfekciou sprostredkovanou fosforečnanom vápenatým. V rekombinantnom expresívnom vektore je každý gén ťažkého a ľahkého reťazca protilátky spojený s regulačnými elementárni zosilňovačom/promótorom (napríklad získanými z SV40, CMV, adenovírusu a podobne, ako je regulačný element CMV zosilňovač/AdMLP promótor alebo regulačný element SV40 zosilňovač/AdMLP promótor), aby riadili silnú transkripciu génov. Rekombinantný expresívny vektor tiež nesie gén DHFR, ktorý umožňuje selekciu buniek CHO, ktoré boli transfekované vektorom použitím metotrexátovej selekcie/amplifikácie.
Stopäťdesiat mikrogramov expresívneho vektora kódujúceho peptidové sekvencie ľudskej protilátky J695 bolo rozpustených v 2,7 ml vody v kónickej skúmavke objemu 50 ml. Bolo pridané 300 μΐ 2,5 M CaCl2 a táto zmes DNA bola pridaná po kvapkách do 3 ml 2 x koncentrovaného fyziologického roztoku upraveného pufrom HEPES v kónickej skúmavke objemu 50 ml Po zamiešaní na vortexe počas 5 sekúnd a inkubácii pri teplote miestnosti počas
200 minút, sa na každú platňu naniesol 1 ml zmesi (stále v médiu F12) a platne boli inkubované pri teplote 37 °C počas 4 hodín. Kvapalina sa odsala a na každú platňu boli pridané 2 ml 10% DMSO v médiu F12. Šok spôsobený DMSO pokračoval počas jednej minúty, potom sa DMSO nariedil pridaním 5 ml PBS na každú platňu. Platne boli dvakrát premyté v PBS a potom nasledovalo pridanie 10 ml MEM alfa doplneného H/T a 5% FBS (selekcia pre bunky exprimujúce DHFR) a inkubácia cez noc pri teplote 37°C. Bunky boli prenesené na platne s 96 jamkami s hustotou 100 buniek v jednej jamke a platne boli inkubované pri teplote 37 °C v atmosfére 5 % CO2 počas dvoch týždňov, pričom médium bolo vymieňané jedenkrát týždenne.
Päť dni po poslednej výmene média boli supernatanty kultúr riedené v pomere 1:50 a boli testované použitím testu ELISA špecifickým pre reťazec ľudského IgG gama. Klony, ktoré poskytujú najvyšší signál v teste ELISA boli prenesené z platní s 96 jamkami na platne s 12 jamkami, kde v jednej jamke bolo 1,5 ml média alfa MEM s 5% dialyzovaným sérom. Po troch dňoch bol uskutočnený iný test ELISA špecifický pre reťazec ľudského IgG gama a 12 klonov s najvyššou aktivitou bolo rozdelených do média alfa MEM s 5% dialyzovaným sérom a 20 nM MTX. Bunečná línia 031898 218 rástla v prítomnosti 20 nM MTX bez toho, aby došlo k zjavnému odumieraniu buniek alebo ku zníženiu rastovej rýchlosti a produkovala v trojdennom teste 1,8 gg/ml hlgG. Kultúry T-25 línie 03 1898 218 rastúce v médiu, ktoré obsahuje MTX, produkovali v priemere 11,9 pg/ml protilátky J695. Línia označená ALP903 bola prispôsobená rastu v suspenzii v podmienkach bez séra, kde produkovala 7,5 pg protilátky J695 v prípade jednej bunky za 24 hodín.
Bunky ALP903 po počiatočnej selekcii v kultivačnom médiu alfa MEM/5% FBS/20 nM MTX boli opäť pasážované v 20 nM MTX. Bunky boli kultivované pri selekcii 100 nM MTX a potom nasledovalo dvakrát pasážovanie v 500 nM MTX v priebehu ďalších 30-tich dní V tejto dobe kultúra produkovala 32 pg/ml protilátky J695 za 24 hodín. Kultúra bola subklonovaná v limitujúcom riedení Subklon 218-22 produkoval vo dvoch dňoch 16,5 pg/ml protilátky J695 na platni s 96 jamkami a 50,3 pg/ml na
201 platni s 12 jamkami. Kloň 218-22 bol kultivovaný v kultivačnom médiu alfa
MEM/5% dialyzované FBS/500 nM MTX počas 38 dní, potom nasledovala adaptácia na kultiváciu v kultivačnom médiu bez séra, ako sa opisuje vyššie v texte. Priemerná bunečná špecifická produktivita suspenzie kultúry bez séra, označenej ALP 905, bola 58 pg/bunku za 24 hodín.
Prvá bunečná línia používaná na produkciu protilátky J695 (ALP 903) vykazovala nižšie výťažky protilátky v porovnaní s druhou bunečnou líniou ALP 905. Aby bolo isté, že protilátka J695 produkovaná ALP 905 bola funkčne zhodná s protilátkou produkovanou ALP 903, u oboch protilátok bola hodnotená IL-12 afinita, schopnosť blokovať naviazanie IL-12 na bunečné receptory, schopnosť inhibovať indukciu IFN-γ pomocou IL-12 a schopnosť inhibovať proliferáciu PHA blastov sprostredkovanú IL-12.
Afinita protilátky J695 z buniek ALP 903 a ALP 905 pre IL-12 bola stanovená meraním kinetických rýchlostných konštánt naviazania IL-12 štúdiami povrchovej plazmónovej rezonancie (analýzy BIAcore). Konštanta rýchlosti disociácie (kd) a asociácie (ka) protilátky z bunečnej línie ALP 903 a ALP 905 pre naviazanie na rhIL-12 boli stanovené v troch experimentoch (ako sa opisuje v príklade 3). Afinita (Kd) naviazania IL-12 bola vypočítaná delením konštanty kd konštantou ka. Hodnota Kd bola vypočítaná pre každý jednotlivý experiment a potom sa vypočítal priemer hodnôt. Výsledky ukázali, že stanovené kinetické parametre a afinita naviazania na rhIL-12 boli veľmi podobné pre protilátku J695 z oboch bunečných línií ALP 903 a ALP 905: vypočítaná hodnota Kd bola 1,19 ± 0,22 x 10‘10 M v prípade ALP 203 a 1,49 ± 0,47 x 10'10 M v prípade ALP 905 (uvedené v tabuľke 13).
Bola hodnotená schopnosť protilátky J695 získanej z ALP 903 a ALP 905 blokovať naviazanie rhIL-12 na receptory IL-12 na ľudských T-lymfoblastoch aktivovaných PHA (opisuje sa v príklade 3). Každá vzorka protilátky J695 bola testovaná pri počiatočnej koncentrácii 1 x 10'8 s desaťnásobným sériovým riedením. Protilátka bola vopred inkubovaná počas jednej hodiny pri teplote 37 °C s 50 pM [125I]-ľudského IL-12 vo väzbovom pufre. PHA blastové bunky boli pridané do zmesi protilátka/[125I]-ľudský IL12 a všetko sa inkubovalo počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Rádioaktivita
202 viazaná na bunke bola oddelená od voľného [125I]-IL-12 centrifugáciou a premývactmi krokmi a vypočítalo sa percento inhibície. Hodnoty IC50 v prípade protilátky J695 boli stanovené z inhibičných kriviek použitím krivky zdpovedajúcej štyrom parametrom a boli potvrdené dvoma nezávislými experimentami. Inkubácie boli uskutočnené dvojmo. Výsledky pre oba druhy protilátok J695 boli veľmi podobné (opisuje sa v tabuľke 13).
Bola hodnotená schopnosť protilátky J695 z buniek ALP 903 a ALP 905 inhibovať produkciu IFN-gama vyvolanú rhIL-12 ľudskými lymfoblastami aktivovanými PHA in vitro. Sériové riedenia protilátky J695 boli vopred inkubované s 200 pg/ml rhIL-12 počas jednej hodiny pri teplote 37 °C. Boli pridané PHA lymfoblasty a boli inkubované počas 18 hodín pri teplote 37 °C. Po inkubácii bol izolovaný supernatant bez buniek a testom ELISA sa stanovilo množstvo IFN-gama. Hodnoty IC50 získané z inhibičných kriviek boli vynesené do grafov proti koncentrácii protilátky použitím krivky zodpovedajúcej 4 paramatrom. Výsledky demonštrujú, že schopnosť oboch protilátok inhibovať produkciu IFN-gama je veľmi podobná.
Na meranie neutralizačnej kapacity ALP 903 a ALP 905 pre rhIL-12 bol použitý test proliferácie PHA blastov in vitro. Sériové riedenia protilátky J695 každého typu boli vopred inkubované s 230 pg/ ml ľudského IL-12 počas 1 hodiny pri teplote 37 °C. Boli pridané ďalšie PHA blastové bunky a inkubovali sa počas troch dní pri teplote 37 °C. Bunky boli potom značené počas 6 hodín s 1 yCi/jamku [3H]-tymidínom. Kultúry boli zhromaždené a meralo sa začlenenie [3H]-tymidínu. V neprítomnosti rhIL-12 bola meraná nešpecifická proliferácia (pozadie). Bolo zistené, že hodnoty IC50 pre protilátku J695 produkovanú bunkami ALP 903 a ALP 905 sú veľmi podobné a sú uvedené v tabuľke 13.
Aktivita protilátok J695 produkovaných bunkami ALP 903 a ALP 905 pri neutralizácii aktivity rhIL-12, pri blokovaní naviazania IL-12 na receptory bunečného povrchu a pri naviazaní na rhIL-12 sa podstatne nelíši a tak protilátky produkované týmito rôznymi bunečnými typmi boli ekvivalentné.
203
Tabuľka 13: Porovnanie vlastností protilátky J695 šarže ALP 903 a ALP 905
| protilátka | ka (M'1 | s‘) | kd (s ‘) | Kd (M) | RB test IC50 (M) | PHA blastový test IC50 (M) | IFN-γ test IC5() (M) |
| J695 | 3,75 x | 105 | 4,46 x 10'5 | 1,19 x IO10 | 3,4 x IO'11 | 5.5 x IO12 | 5,8 x 10'12 |
| ALP 903 | |||||||
| J695 | 3,91 x | 10s | 5,59 x IO 5 | 1,49 x IO10 | 3,0 x IO’ | 4,4 x IO12 | 4,3 x IO’12 |
| ALP 905 |
Ekvivalenty
Odborníci v odbore rozpoznajú, alebo budú schopní určiť použitím nie viac než rutinného experimentu, rad tu opísaných ekvivalentov špecifických uskutočnení vynálezu. Také ekvivalenty sú zahrnuté v nasledujúcich nárokoch.
Claims (144)
- PATENTOVÉ NÁROKYK>Q?-20Ol1. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá sa viaže na ľudský IL-12, kde uvedená ľudská protilátka je neutralizujúca protilátka.
- 2. Selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 obsahujúca ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén selektívne mutovanú v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohe aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu tak, že sa protilátka viaže na ľudský IL-12.
- 3. Selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 obsahujúca ľudskú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén selektívne mutovanú v preferovanej polohe selektívnej mutagenézy aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu tak, že sa protilátka viaže na ľudský IL-12.
- 4. Selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 podľa nároku 2, kde ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén je selektívne mutovaná vo viac než jednej preferovanej polohe selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohe aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu.
- 5. Selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 podľa nároku 4, kde ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén je selektívne mutovaná nie vo viac než v troch preferovaných polohách selektívnej mutagenézy, kontaktných alebo hypermutaČných polohách.
- 6. Selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 podľa nároku 4, kde ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén je selektívne mutovaná nie vo viac než vo dvoch preferovaných polohách selektívnej mutagenézy, kontaktných alebo hypermutaČných polohách.205
- 7. Selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 podľa nároku 2, kde ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén je selektívne mutovaná tak, že je dosiahnutý cieľový stupeň špecifickej afinity, uvedený cieľový stupeň je zlepšený v porovnaní s dosiahnuteľným stupňom, keď sa uskutoční selekcia protilátky proti rovnakému antigénu použitím fágovej zobrazovacej technológie.
- 8. Selektívne mutovaná ľudská protilátka proti IL-12 podľa nároku 7, ktorá si ďalej zachováva aspoň jednu požadovanú vlastnosť alebo charakteristiku.
- 9. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá sa viaže na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty kOff 0,1 s'1 alebo nižšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo ktorá inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov in vitro (PHA test) s hodnotou IC50 1 x 10'6M alebo nižšou.
- 10. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 9 alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty kOfr 1 x 10'2 s'1 alebo nižšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo ktorá inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov in vitro (PHA test) s hodnotou IC50 1 x 10'7M alebo nižšou.
- 11. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 9 alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty koff 1 x 10'3 s’1 alebo nižšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo ktorá inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov zzz vitro (PHA test) s hodnotou IC50 1 x 10 8M alebo nižšou.
- 12. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 9 alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej206 konštanty k„ff 1 x 10'4 s'1 alebo nižšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo ktorá inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov in vitro (PHA test) s hodnotou IC5o 1 x 10'9M alebo nižšou.
- 13 Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 9 alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty kOff 1 x 10'5 s'1 alebo nižšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo ktorá inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov in vitro (PHA test) s hodnotou IC50 1 x 10'10M alebo nižšou.
- 14. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 9 alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty kOfr 1 x 10‘5 s'1 alebo nižšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo ktorá inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov in vitro (PHA test) s hodnotou IC50 1 x 10_l 1 M alebo nižšou.
- 15. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'6 M alebo nižšou,b) vykazuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 1 ac) vykazuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2.
- 16. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 15 alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá ďalej vykazuje CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 3 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 4.207
- 17. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 15 alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá ďalej vykazuje CDRI ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 5 a CDRI ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6.
- 18. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 16, ktorá má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 7 a variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 8.
- 19. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:a) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'9 M alebo nižšou,b) vykazuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 9 ac) vykazuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 10.
- 20. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 19 alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá ďalej má CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 11 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 12.
- 21. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 19 alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá ďalej vykazuje CDR] ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 13 a CDRI ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 14.
- 22. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 19, ktorá má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 15 a variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 16.208
- 23. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén, ktoráa) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10’9 M alebo nižšou,b) vykazuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 17 ac) vykazuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 18.
- 24. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 23, ktorá ďalej má CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 19 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 20.
- 25. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 23, ktorá ďalej vykazuje CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 21 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 22.
- 26. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 23 a variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 24.
- 27. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 26 obsahujúca konštantnú oblasť ťažkého reťazca vybranú zo skupiny zahrnujúcej konštantné oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE.
- 28. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 27, kde konštantná oblasť ťažkého reťazca protilátky je IgGl.
- 29. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 26, ktorou je fragment Fab.
- 30. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 26, ktorou je fragment F(ab')2.209
- 31. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 26, ktorou je jednoreťazcový fragment Fv.
- 32. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén, ktoráa) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'9 M alebo nižšou,b) vykazuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 404 až 469 aleboc) vykazuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej SEQ ID NO: 534 až 579.
- 33. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, podľa nároku 32, ktorá ďalej má CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo SEQ ID NO: 335 až 403 alebo CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo SEQ ID NO: 506 až 533.
- 34. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 32, ktorá ďalej vykazuje CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej SEQ ID NO: 288 až 334 alebo CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 470 až 505.
- 35. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej Časť viažuca sa na antigén, ktorá má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 23 a variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 24.
- 36. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 3 5 obsahujúca konštantnú oblasť ťažkého reťazca vybranú zo skupiny zahrnujúcej konštantné oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE.210
- 37. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 36, kde konštantná oblasť ťažkého reťazca protilátky je IgGl.
- 38. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 35, ktorou je fragment Fab.
- 39. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 35, ktorou je fragment F(ab')2.
- 40. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 35, ktorou je jednoreťazcový fragment Fv.
- 41. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén, ktoráa) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'9 M alebo nižšou,b) vykazuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25 ac) vykazuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26.
- 42. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 41, ktorá ďalej má CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 27 a CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28.
- 43. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 41, ktorá ďalej vykazuje CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 29 alebo CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO 30.
- 44. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 31 a variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 32.211
- 45. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 44 obsahujúca konštantnú oblasť ťažkého reťazca vybranú zo skupiny zahrnujúcej konštantné oblasti IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA a IgE.
- 46. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 45, kde konštantná oblasť ťažkého reťazca protilátky je IgGl.
- 47. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 44, ktorou je fragment Fab.
- 48. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 44, ktorou je fragment F(ab')2.
- 49. Izolovaná ľudská protilátka podľa nároku 44, ktorou je jednoreťazcový fragment Fv.
- 50. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén, ktoráa) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'6 M alebo nižšou,b) zahrnuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 1, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 3 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 5 alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových substitúcií v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty kofr vyššiu než je desaťnásobok hodnoty u protilátky zahrnujúcej CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 1, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 3 a CDR1 ťažkého reťazca zahrnujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 5 ac) zahrnuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO’ 4 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6 alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových substitúcií v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant212 nemá hodnotu rýchlostnej konštanty kOff vyššiu než je desaťnásobok hodnoty u protilátky zahrnujúcej CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO- 2, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 4 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6.
- 51. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén, ktoráa) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'9 M alebo nižšou,b) zahrnuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 9, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 11 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 13 alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových substitúcií v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty kOff vyššiu než je desaťnásobok hodnoty u protilátky zahrnujúcej CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 9, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 11 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 13 ac) zahrnuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 10, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 12 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 14 alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových substitúcií v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty kOff vyššiu než je desaťnásobok hodnoty u protilátky zahrnujúcej CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 10, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 12 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 14.213
- 52. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca antigén, ktoráa) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10‘9 M alebo nižšou,b) zahrnuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO. 17, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 19 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 21 alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových substitúcií v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty koff vyššiu než je desaťnásobok hodnoty u protilátky zahrnujúcej CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 17, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 19 a CDR1 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 21 ac) zahrnuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 18, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 20 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 22 alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových substitúcií v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty koff vyššiu než je desaťnásobok hodnoty u protilátky zahrnujúcej CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 18, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 20 a CDR1 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 22.
- 53. Izolovaná nukleová kyselina kódujúca CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 17.
- 54. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 53, ktorá kóduje variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky.214
- 55. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 54, kde CDR2 variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 19.
- 56. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 54, kde CDR1 variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 21.
- 57. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 56, ktorá kóduje variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 23.
- 58. Izolovaná nukleová kyselina kódujúca CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 18.
- 59. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 58, ktorá kóduje variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky.
- 60. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 59, kde CDR2 variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 20.
- 61. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 59, kde CDR1 variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO. 22.
- 62. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 61, ktorá kóduje variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 24.
- 63. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktoráa) inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste PHA in vitro s hodnotou IC50 1 x 10'9 M alebo nižšou,b) zahrnuje CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu215 aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 27 a CDRI ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 29 alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových substitúcií v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty kOff vyššiu než je desaťnásobok hodnoty u protilátky zahrnujúcej CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25, CDR2 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 27 a CDRI ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 29 ac) zahrnuje CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28 a CDRI ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 30 alebo ich mutant, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových substitúcií v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe, pričom uvedený mutant nemá hodnotu rýchlostnej konštanty koff vyššiu než je desaťnásobok hodnoty u protilátky zahrnujúcej CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO- 26, CDR2 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28 a CDRI ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO. 30.
- 64. Izolovaná nukleová kyselina kódujúca CDR3 ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 25.
- 65. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 64, ktorá kóduje variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky.
- 66. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 65, kde CDR2 variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 27.216
- 67. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 65, kde CDRI variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 29.
- 68. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 67, ktorá kóduje variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 31.
- 69. Izolovaná nukleová kyselina kódujúca CDR3 ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26.
- 70. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 69, ktorá kóduje variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky.
- 71. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 70, kde CDR2 variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28.
- 72. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 70, kde CDRI variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 30.
- 73. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 72, ktorá kóduje variabilnú oblasť ťažkého reťazca protilátky obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 32
- 74. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:a) viaže sa na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty kOff 0,1 s'1 alebo nižšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov in vitro (test PHA) s hodnotou IC50 1 x 10'6 M alebo nižšou,217b) má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú z člena embryonálnej rodiny VH3, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca má mutáciu v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu,c) má variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú z člena embryonálnej rodiny VXl, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca má mutáciu v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu.
- 75. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:a) viaže sa na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty kOfr 0,1 s'1 alebo nižšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov in vitro (test PHA) s hodnotou IC50 1 x 10’6 M alebo nižšou,b) má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej SEQ ID NO: 595 až 667, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca má mutáciu v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe aminokyselinovým zvyškom zosilňujúcim aktivitu,c) má variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO: 669 až 675, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca má mutáciu v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zosilňujúcim aktivitu.
- 76. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:a) viaže sa na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty koff 0,1 s’1 alebo nižšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo inhibuje proliferáciu fytohema218 glutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov in vitro (test PHA) s hodnotou IC50 1 x 10'6 M alebo nižšou,b) má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu embryonálnu aminokyselinovú sekvenciu COS-3, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca má mutáciu v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu,c) má variabilnú oblasť ľahkého reťazca zahrnujúcu embryonálnu aminokyselinovú sekvenciu DPL8, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca má mutáciu v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu.
- 77. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má nasledujúce charakteristiky:a) viaže sa na ľudský IL-12 a disociuje z ľudského IL-12 s hodnotou rýchlostnej konštanty koff 0,1 s'1 alebo nižšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo inhibuje proliferáciu fytohemaglutinínových blastov v teste proliferácie fytohemaglutinínových blastov in vitro (test PHA) s hodnotou IC50 1 x 10'6 M alebo nižšou,b) má variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú z člena embryonálnej rodiny VH3, kde variabilná oblasť ťažkého reťazca obsahuje CDR2, ktorá je štruktúrou podobná CDR2 z iných členov embryonálnej rodiny VH3, a CDR1, ktorá je štrukturálne podobná CDR1 z iných členov embryonálnej rodiny VH3, a kde variabilná oblasť ťažkého reťazca má mutáciu v kontaktnej alebo hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu,c) má variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú z člena embryonálnej rodiny VXl, kde variabilná oblasť ľahkého reťazca obsahuje C.DR2, ktorá je štrukturálne podobná CDR2 z iných členov embryonálnej rodiny VXl, a CDR1, ktorá je štrukturálne podobná CDR1 z iných členov embryonálnej rodiny VÁl, a kde variabilná oblasť ľahkého reťazca má mutáciu v kontaktnej alebo219 hypermutačnej polohe s aminokyselinovým zvyškom zvyšujúcim aktivitu.
- 78. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 74, 75, 76 alebo 77, kde mutácia je v CDR3 ťažkého reťazca.
- 79. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 74, 75, 76 alebo 77, kde mutácia je v CDR3 ľahkého reťazca.
- 80. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 74, 75, 76 alebo 77, kde mutácia je v CDR2 ťažkého reťazca.
- 81. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 74, 75, 76 alebo 77, kde mutácia je v CDR2 ľahkého reťazca.
- 82. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 74, 75, 76 alebo 77, kde mutácia je v CDR1 ťažkého reťazca.
- 83. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén podľa nároku 74, 75, 76 alebo 77, kde mutácia je v CDR1 ľahkého reťazca.
- 84. Rekombinantný expresný vektor kódujúci:a) ťažký reťazec protilátky majúci variabilnú oblasť obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO’ 31 ab) ľahký reťazec protilátky majúci variabilnú oblasť obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 32.
- 85. Hostiteľská bunka, do ktorej bol zavedený rekombinantný expresný vektor podľa nároku 84.
- 86. Spôsob syntézy ľudskej protilátky, ktorá sa viaže na ľudský IL-12, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 85 v kultivačnom médiu, dokým nie je bunkou syntetizovaná ľudská protilátka, ktorá sa viaže na ľudský IL-12.220
- 87. Izolovaná ľudská protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá neutralizuje aktivitu ľudského IL-12 a aspoň jedného ďalšieho IL-12 primáta vybraného zo skupiny zahrnujúcej IL-12 paviána, kosmana, šimpanza, cynomolga a makaka, ale ktorá neneutralizuje aktivitu myšieho IL-12.
- 88. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 52, 74 až 83 a 87 a farmaceutický prijateľný nosič.
- 89. Prostriedok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 52, 74 až 83 a 87 a ďalšie činidlo.
- 90. Prostriedok podľa nároku 89, vyznačujúci sa tým, že ďalším činidlom je terapeutické činidlo.
- 91. Prostriedok podľa nároku 90, vyznačujúci sa tým, že terapeutické činidlo je vybrané zo skupiny zahrnujúcej budenozid, epidermálny rastový faktor, kortikosteroidy, cyklosporín, sulfasalazín, aminosalicyláty, 6merkaptopurín, azatioprín, metronidazol, inhibítory lipoxygenázy, mesalamín, olsalazín, balsalazid, antioxidanty, tromboxánové inhibítory, antagonisty receptora IL-1, monoklonálne protilátky proti IL-Ιβ, monoklonálne protilátky proti IL-6, rastové faktory, inhibítory elastázy, zlúčeniny pyridinylimidazolu, protilátky alebo agonisty k TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PDGF, protilátky proti CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 alebo ich ligandy, metotrexát, cyklosporín, FK506, rapamycín, mykofenolát mofetil, leflunomid, NSAID, ibuprofén, kortikosteroidy, prednizolón, inhibítory fosfodiesterázy, agonisty adenozínu, antitrombotické činidlá, inhibítory komplementu, adrenergiká, IRAK, NIK, IKK, p38, inhibítory kinázy MAP, inhibítory enzýmu konvertujúceho IL-Ιβ, inhibítory enzýmu konvertujúceho TNFa, inhibítory signalizácie T-bunky, inhibítory metaloproteinázy,221 sulfasalazín, azatioprín, 6-merkaptopuríny, inhibítory enzýmu konvertujúceho angiotenzín, rozpustné receptory cytokínov, rozpustný receptor p55 TNF, rozpustný receptor p75 TNF, sIL-lRI, slL-lRII, sIL6R, protizápalové cytokíny, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 a TGFp.
- 92. Terapeutický prostriedok podľa nároku 90, vyznačujúci sa tým, že terapeutické činidlo je vybrané zo skupiny zahrnujúcej protilátky proti TNF a ich protilátkové fragmenty, konštrukty TNFR-Ig, inhibítory TACE, inhibítory PDE4, kortikosteroidy, budenozid, dexametazón, sulfasalazín, kyselinu 5-aminosalicylovú, olsalazín, inhibítory enzýmu konvertujúceho IL-1 β, IL-lra, inhibítory tyrozinovej kinázy, 6-merkaptopuríny a IL-11.
- 93. Terapeutický prostriedok podľa nároku 90, vyznačujúci sa tým, že terapeutické činidlo je vybrané zo skupiny zahrnujúcej kortikosteroidy, prednizolón, metylprednizolón, azatioprín, cyklofosfamid, cyklosporín, metotrexát, 4-aminopyridín, tizanidín, interferón-pia, interferón-Plb, kopolymér 1, hyperbarický kyslík, intravenózny imunoglobulín, klabribín, protilátky alebo agonisty k TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-I6, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PDGF, protilátky proti CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD89, CD90 alebo ich ligandy, metotrexát, cyklosporín, FK506, rapamycín, mykofenolát mofetil, leflunomid, NSAID, ibuprofén, kortikosteroidy, prednizolón, inhibítory fosfodiesterázy, agonisty adenozínu, antitrombotické činidlá, inhibítory komplementu, adrenergiká, IRAK, NIK, IKK, p38, inhibítory kinázy MAP, inhibítory enzýmu konvertujúceho IL-1 β, inhibítory TACE, inhibítory signalizácie T-bunky, inhibítory kinázy, inhibítory metaloproteinázy, sulfasalazín, azatioprín, 6-merkaptopuríny, inhibítory enzýmu konvertujúceho angiotenzín, rozpustné receptory cytokínov, rozpustný receptor p55 TNF, rozpustný receptor p75 TNF, sIL-lRI, slL-lRII, sIL-6R, sIL-13R, anti-P7s, glykoproteínový ligand p-selektínu (PSGL), protizápalové cytokíny, IL-4, IL-10, IL-13 a TGFp.222
- 94. Spôsob inhibície aktivity ľudského IL-12, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kontakt ľudského IL-12 s protilátkou podľa nároku 44 tak, že je inhibovaná aktivita ľudského IL-12.
- 95. Spôsob inhibície aktivity ľudského IL-12 u ľudského subjektu trpiaceho poruchou, pri ktorej je aktivita IL-12 škodlivá, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje aplikáciu protilátky podľa nároku 44 ľudskému subjektu tak, že je u ľudského subjektu inhibovaná aktivita ľudského IL-12.
- 96. Spôsob podľa nároku 95, vyznačujúci sa tým, že porucha je vybraná zo skupiny zahrnujúcej reumatoidnú artritídu, osteoartritídu, chronickú artritídu u mladistvých, lymskú artritídu, psoriatickú artritídu, reaktívnu artritídu, spondyloartropatiu, ankylozujúcu spondylitídu, systémový lupus erytematózus, Crohnovu chorobu, ulceratívnu kolitídu, zápalové ochorenie čriev, roztrúsenú sklerózu, inzulín dependentnú cukrovku, tyreoiditídu, astmu, alergické ochorenia, psoriázu, dermatitídu skleroderma, zápal štítnej žľazy, ochorenie transplantát verzus hostiteľ, odmietnutie transplantovaného orgánu, akútne alebo chronické imunitné ochorenie spojené s transplantáciou orgánu, sarkoidózu, aterosklerózu, diseminovanú intravaskulárnu koaguláciu, Kawasakiho ochorenie, exoftalmickú strumu, nefrotický syndróm, chronický únavový syndróm, nodóznu polyarteritídu, Wegenerovu granulomatózu, HenochSchoenleinovu purpuru, mikroskopickú vaskulitídu obličiek, chronickú aktívnu hepatitídu, Sjógrenov syndróm, uveitídu, sepsu, septický šok, syndróm toxického šoku, syndróm (akútneho) sťaženého dýchania u dospelých, kachexiu, infekčné ochorenia, parazitické ochorenia, syndróm získanej imunitnej nedostatočnosti, akútne myelitis transversa, ťažkú myasténiu, Hungtingtonovu choreu, Parkinsonovu chorobu, Alzheimerovu chorobu, mŕtvicu, primárnu biliárnu cirhózu, fibrotické ochorenia pľúc, hemolytickú anémiu, zhubné bujnenie, zlyhanie srdca a infarkt myokardu.
- 97. Spôsob podľa nároku 95, vyznačujúci sa tým, že poruchou je Crohnova choroba.223
- 98. Spôsob podľa nároku 95, vyznačujúci sa tým, že poruchou je roztrúsená skleróza.
- 99. Spôsob podľa nároku 95, vyznačujúci sa tým, že poruchou je reumatická artritída.
- 100. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, aby sa dosiahla vopred stanovená cieľová aktivita, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy vybranej zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94,c) jednotlivé mutácie vybranej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy aspoň dvoch odlišných aminokyselinových zvyškov, čím vzniká prvý súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,d) hodnotenie aktivity prvého súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, aby sa stanovilo či mutácia jednotlivej polohy selektívnej mutagenézy produkuje protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén s vopred stanovenou cieľovou aktivitou alebo čiastočnou cieľovou aktivitou,e) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén postupným spôsobom jednotlivých mutácií, u ktorých sa zistila zlepšená aktivita, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,f) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, aby sa stanovilo, či kombinačné protilátky alebo ich časti224 viažuce sa na antigén majú vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo čiastočnú cieľovú aktivitu,g) ak výsledkom krokov opísaných v odsekoch d) alebo f) nie je protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén vykazujúca vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo protilátka iba s čiastočnou aktivitou, potom spôsob ďalej zahrnuje mutáciu ďalších aminokyselinových zvyškov vybraných zo skupiny zahrnujúcej H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká druhý súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,h) hodnotenie aktivity druhého súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, aby sa stanovilo, či výsledkom mutácie jediného aminokyselinového zvyšku vybraného zo skupiny zahrnujúcej H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A a L96 je protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo čiastočnú cieľovú aktivitu,i) kombinovanie jednotlivých mutácií opísaných v kroku g) vykazujúcich zlepšenú aktivitu postupným spôsobom v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,j) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí, aby sa stanovilo, či kombinačné protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén majú vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo čiastočnú cieľovú aktivitu,k) ak výsledkom kroku h) alebo j) nie je protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén majúca vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo protilátka iba s čiastočnou aktivitou, spôsob ďalej zahrnuje mutáciu ďalších aminokyselinových zvyškov vybraných zo skupiny zahrnujúcej H33B,225Η52Β a L31A na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká tretí súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažuci sa na antigén,l) hodnotenie aktivity tretieho súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, aby sa stanovilo, či výsledkom mutácie jediného aminokyselinového zvyšku vybraného zo skupiny zahrnujúcej H33B, H52B a L31A je protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén, ktorá má vopred stanovenú cieľovú aktivitu alebo čiastočnú aktivitu,m) kombinovanie jednotlivých mutácií opísaných v kroku k) vykazujúcich zlepšenú aktivitu postupným spôsobom v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,n) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, aby sa stanovilo, či kombinačné protilátky alebo ich časti viažuce sa na antigén majú vopred stanovenú cieľovú aktivitu, čím sa produkuje protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén s vopred stanovenou cieľovou aktivitou.
- 101. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, čím sa identifikuje vybraná preferovaná poloha selektívnej mutagenézy, kontaktná alebo hypermutačná poloha,c) jednotlivé mutácie uvedenej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, pričom vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,226d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,e) opakovanie krokov b) až d) v prípade aspoň jednej inej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy, ak nie je získaná požadovaná aktivita protilátky,f) kombinovanie jednotlivých mutácií vykazujúcich zlepšenú aktivitu postupným spôsobom v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén za vzniku kombinačných protilátok alebo ich časti viažucich sa na antigén, ag) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
- 102. Spôsob podľa nároku 101, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96.
- 103. Spôsob podľa nároku 101, vyznačujúci sa tým, že hypermutačné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93.
- 104. Spôsob podľa nároku 101, vyznačujúci sa tým, že preferované polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L150, L91, L92, L93 a L94.
- 105. Spôsob podľa nároku 101, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94227
- 106. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá sa získala selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nie je ďalej v uvedenom systéme fágového zobrazenia zlepšovaná mutagenézou,b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, čím sa identifikuje vybraná preferovaná poloha selektívnej mutagenézy, kontaktná alebo hypermutačná poloha,c) jednotlivé mutácie uvedenej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, pričom vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru v systéme nefágového zobrazenia,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,e) opakovanie krokov b) až d) v prípade aspoň jednej inej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy, ak nie je získaná požadovaná aktivita protilátky,f) kombinovanie jednotlivých mutácií vykazujúcich zlepšenú aktivitu postupným spôsobom v pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,g) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na228 antigén so zlepšenou aktivitou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
- 107. Spôsob podľa nároku 106, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96.
- 108. Spôsob podľa nároku 106, vyznačujúci sa tým, že hypermutačné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H3 1, H3 1B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93.
- 109. Spôsob podľa nároku 106, vyznačujúci sa tým, že preferované polohy selektívnej mutagenézy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94.
- 110. Spôsob podľa nároku 106, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej L50 a L94.
- 111. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, čím sa identifikuje vybraná preferovaná poloha selektívnej mutagenézy, kontaktná alebo hypermutačná poloha,c) jednotlivé mutácie uvedenej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, pričom vzniká súbor mutovaných protilátok229 alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru vo vhodnom expresnom systéme,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vztiahnuté na pôvodnú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,e) hodnotenie aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky v súbore mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, kde vlastnosť alebo charakteristika je taká, ktorú je nutné v protilátke zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
- 112. Spôsob podľa nároku 111, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a kde iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
- 113. Spôsob podľa nároku 111, vyznačujúci sa tým, že hypermutačné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H3I, H3 1B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a kde iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami.230 zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
- 114. Spôsob podľa nároku 111, vyznačujúci sa tým, že preferované polohy selektívnej mutagenézy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 a kde iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
- 115. Spôsob podľa nároku 111, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej L50 a L94 a kde iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
- 116. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá bola získaná selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, čím sa identifikuje vybraná preferovaná poloha selektívnej mutagenézy, kontaktná alebo hypermutačná poloha,c) individuálne mutácie uvedenej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné231 aminokyselinové zvyšky, pričom vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru v systéme nefágového zobrazenia,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čim sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,e) hodnotenie aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky, súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, kde vlastnosť alebo charakteristika je taká, ktorú je nutné zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,f) opakovanie krokov opísaných v odsekoch a) až e) v prípade aspoň jednej inej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy,g) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch individuálnych aminokyselinových zvyškov zvyšujúcich aktivitu, ktoré vykazujú zlepšenú aktivitu a aspoň jednu zachovanú vlastnosť alebo charakteristiku za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén ah) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén.232
- 117. Spôsob podľa nároku 116, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L3 1, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
- 118. Spôsob podľa nároku 116, vyznačujúci sa tým, že hypermutačné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
- 119. Spôsob podľa nároku 116, vyznačujúci sa tým, že preferované polohy selektívnej mutagenézy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94 a iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
- 120. Spôsob podľa nároku 116, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej L50 a L94 a iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.233
- 121. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá bola získaná selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,b) výber kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu, čím sa identifikuje vybraná kontaktná alebo hypermutačná poloha,c) individuálne mutácie uvedenej vybranej kontaktnej alebo hypermutačnej polohy aspoň na dva iné aminokyselinové zvyšky, pričom vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru v systéme nefágového zobrazenia,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,e) hodnotenie aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, kde vlastnosť alebo charakteristika je taká, ktorú je nutné zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén
- 122. Spôsob podľa nároku 121, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50,234Η52, Η52Α, Η53, Η54, Η56, Η58, Η95, Η96, Η97, Η98, Η101, L3O, L31, L32, L34, L5O, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
- 123. Spôsob podľa nároku 121, vyznačujúci sa tým, že hypermutačné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 a L93 a iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
- 124. Spôsob podľa nároku 121, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej L50 a L94 a iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
- 125. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá bola získaná selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,b) výber preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre235 mutáciu, čím sa identifikuje vybraná preferovaná poloha selektívnej mutagenézy, kontaktná alebo hypermutačná poloha,c) individuálne mutácie uvedenej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru v systéme nefágového zobrazenia,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,e) hodnotenie aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky v súbore mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, kde vlastnosť alebo charakteristika je taká, ktorú je nutné zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,f) opakovanie krokov opísaných v odsekoch a) až e) v prípade aspoň jednej inej preferovanej polohy selektívnej mutagenézy, kontaktnej alebo hypermutačnej polohy,g) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch individuálnych aminokyselinových zvyškov zvyšujúcich aktivitu, ktoré vykazujú zlepšenú aktivitu a aspoň jednu zachovanú vlastnosť alebo charakteristiku za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a236h) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vztiahnuté na pôvodnú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
- 126. Spôsob podľa nároku 125, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96 a iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
- 127. Spôsob podľa nároku 125, vyznačujúci sa tým, že hypermutačné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L3 1, L32, L53 a L93 a iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobuiínu.
- 128. Spôsob podľa nároku 125, vyznačujúci sa tým, že preferované polohy selektívnej mutagenézy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 a L94 a iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobuiínu.237
- 129. Spôsob podľa nároku 125, vyznačujúci sa tým, že kontaktné polohy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej L50 a L94 a iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencií embryonálneho imunoglobulínu.
- 130. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu v polohe inej ako H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L3I, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,e) hodnotenie zmien aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky v súbore mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.238
- 131. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu v polohe inej ako H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,e) opakovanie krokov opísaných v odsekoch b) až d) v prípade aspoň jednej inej polohy v CDR, ktorou nie je poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,f) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch individuálnych aminokyselinových zvyškov zvyšujúcich aktivitu, ktoré vykazujú zlepšenú aktivitu za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén ag) hodnotenie aktivity kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zvyšujúcimi aktivitu vztiahnuté na pôvodnú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, dokým je získavaná protilátka alebo jej časť viažuca sa na239 antigén so zlepšenou aktivitou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo k jej časti viažucej sa na antigén.
- 132. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie rekombinantnej pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá bola získaná selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu v polohe inej ako H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 ac) individuálne mutácie uvedenej vybranej kontaktnej a hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru v systéme nefágového zobrazenia,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,e) hodnotenie zmien aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky v súbore mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vztiahnuté k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.24033. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá bola získaná selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu v polohe inej ako H30, H31, H31B, H32, H33, H35, 1150, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,c) individuálne mutácie uvedenej vybranej kontaktnej a hypermutačnej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie uvedeného súboru v systéme nefágového zobrazenia,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,e) opakovanie krokov opísaných v odsekoch b) až d) v prípade aspoň jednej inej polohy v CDR, ktorou nie je poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94,f) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch individuálnych aminokyselinových zvyškov zvyšujúcich aktivitu, ktoré vykazujú zlepšenú aktivitu za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén a241g) hodnotenie aktivity a inej vlastnosti alebo charakteristík kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zvyšujúcimi aktivitu vztiahnuté na pôvodnú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
- 134. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu v polohe inej ako H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vztiahnuté na pôvodnú protilátku alebo jej časť viažucu sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,e) hodnotenie zmien aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, pričom je nutné vlastnosť alebo charakteristiku zachovať, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou242 aktivitou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.35. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén,b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu v polohe inej ako H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy na aspoň dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,e) hodnotenie zmien aspoň jednej vlastnosti alebo charakteristiky v súbore mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén,f) opakovanie krokov opísaných v odsekoch b) až e) v prípade aspoň jednej inej polohy v CDR, ktorou nie je poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,g) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch individuálnych aminokyselinových zvyškov zvyšujúcich aktivitu, ktoré vykazujú zlepšenú aktivitu, ale243 neovplyvňujú aspoň jednu inú vlastnosť alebo charakteristiku, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou ah) hodnotenie aktivity a zachovania aspoň jednej vlastnosti charakteristiky kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zvyšujúcimi aktivitu vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
- 136. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá bola získaná selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu v polohe inej ako H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy aspoň na dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie v systéme nefágového zobrazenia,d) hodnotenie aktivity súboru mutovaných protilátok alebo ich Častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti244 viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,e) hodnotenie zmien aspoň jednej inej vlastnosti alebo charakteristiky u súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.37. Spôsob zlepšenia aktivity protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:a) poskytnutie pôvodnej protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén, ktorá bola získaná selekciou v systéme fágového zobrazenia, ale ktorej aktivita nemôže byť ďalej zlepšovaná mutagenézou v uvedenom systéme fágového zobrazenia,b) výber aminokyselinového zvyšku v oblasti určujúcej komplementaritu (CDR) pre mutáciu v polohe inej ako H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,c) individuálne mutácie uvedenej vybranej polohy aspoň na dva iné aminokyselinové zvyšky, čím vzniká súbor mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén, a expresie v systéme nefágového zobrazenia,d) hodnotenie aktivity a zachovania aspoň jednej vlastnosti alebo charakteristiky u súboru mutovaných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, čím sa identifikuje aminokyselinový zvyšok zvyšujúci aktivitu,245e) opakovanie krokov opísaných v odsekoch b) až d) v prípade aspoň jednej inej polohy v CDR, ktorou nie je poloha vybraná v odseku b) ani poloha H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 a L96,f) kombinovanie v pôvodnej protilátke alebo v jej časti viažucej sa na antigén aspoň dvoch individuálnych aminokyselinových zvyškov zvyšujúcich aktivitu, ktoré vykazujú zlepšenú aktivitu, ale neovplyvňujú aspoň jednu inú vlastnosť alebo charakteristiku, za vzniku kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén ag) hodnotenie aktivity a zachovania aspoň jednej vlastnosti alebo charakteristiky kombinačných protilátok alebo ich častí viažucich sa na antigén s dvoma aminokyselinovými zvyškami zvyšujúcimi aktivitu vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén, dokým sa nezíska protilátka alebo jej časť viažuca sa na antigén so zlepšenou aktivitou a aspoň jednou zachovanou vlastnosťou alebo charakteristikou vzhľadom k pôvodnej protilátke alebo jej časti viažucej sa na antigén.
- 138. Spôsob podľa nárokov 130, 13 1, 132, 133, 134, 135, 136 alebo 137, vyznačujúci sa tým, že iná vlastnosť alebo charakteristika je vybraná zo skupiny zahrnujúcej zachovanie neskríženej reaktivity s inými proteínmi, zachovanie neskríženej reaktivity s inými ľudskými tkanivami, zachovanie rozpoznania epitopu a protilátky so sekvenciou blízkou sekvencii embryonálneho imunoglobulínu.
- 139. Spôsob detekcie ľudského IL-12, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kontakt ľudského IL-12 s protilátkou alebo jej časťou viažucou sa na antigén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 52, 74 až 83 a 87 tak, že je detegovaný ľudský IL-12.246
- 140. Spôsob podľa nároku 139, vyznačujúci sa tým, že ľudský IL-12 je detegovaný in vitro.
- 141 Spôsob podľa nároku 139, vyznačujúci sa tým, že ľudský IL-12 je detegovaný v biologickej vzorke pre diagnostické účely.
- 142. Použitie protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 52, 74 až 83 a 87 pri terapii.
- 143. Použitie protilátky alebo jej časti viažucej sa na antigén podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 52, 74 až 83 a 87 pri výrobe liečiva na liečbu poruchy, pri ktorej aktivita IL-12 je škodlivá.
- 144. Použitie podľa nároku 143, kde porucha je vybraná zo skupiny zahrnujúcej reumatoidnú artritídu, osteoartritídu, chronickú artritídu u mladistvých, Iymskú artritídu, psoriatickú artritídu, reaktívnu artritídu, spondyoartropatiu, ankylozujúcu spondylitídu, systémový lupus erythematosus, Crohnovu chorobu, ulceratívnu kolitídu, zápalové ochorenie čriev, roztrúsenú sklerózu, inzulín dependentnú cukrovku, tyroiditídu, astmu, alergické ochorenia, psoriázu, dermatitídu skleroderma, zápal štítnej žľazy, ochorenie transplantát verzus hostiteľ, odmietnutie transplantovaného orgánu, akútne a chronické imunitné ochorenia spojené s transplantáciou orgánu, sarkoidózu, aterosklerózu, diseminovanú intravaskulárnu koaguláciu, Kawasakiho ochorenie, exoftalmickú strumu, nefrotický syndróm, chronický únavový syndróm, nodóznu polyarteritídu, Wegenerovu granulomatózu, HenochSchoenleinovu purpuru, mikroskopickú vaskulitídu obličiek, chronickú aktívnu hepatitídu, Sjógrenov syndróm, uveitídu, sepsu, septický šok, syndróm toxického šoku, syndróm (akútneho) sťaženého dýchania u dospelých, kachexiu, infekčné ochorenia, parazitické ochorenia, syndróm získanej imunitnej nedostatočnosti, akútne myelitis transversa, ťažkú myasteniu, Hungtingtonovu choreu, Parkinsonovu chorobu, Alzheimerovu chorobu, mŕtvicu, primárnu biliárnu cirhózu, fibrotické247 ochorenia pľúc, hemolytickú anémiu, zhubné bujnenie, zlyhanie srdca a infarkt myokardu.
- 145. Použitie podľa nároku 143, kde poruchou je Crohnova choroba.
- 146. Použitie podľa nároku 143, kde poruchou je roztrúsená skleróza.
- 147. Použitie podľa nároku 143, kde poruchou je reumatoidná artritída.1/14
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12660399P | 1999-03-25 | 1999-03-25 | |
| PCT/US2000/007946 WO2000056772A1 (en) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK13672001A3 true SK13672001A3 (sk) | 2002-03-05 |
| SK288082B6 SK288082B6 (sk) | 2013-06-03 |
Family
ID=22425740
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1367-2001A SK288082B6 (sk) | 1999-03-25 | 2000-03-24 | Human antibodies that bind human IL-12, their use and methods for producing, pharmaceutical composition containing it, nucleic acid and recombinant vector, which they coded, and host cell |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (4) | EP2319870A3 (sk) |
| JP (3) | JP4841038B2 (sk) |
| KR (6) | KR20140094647A (sk) |
| CN (4) | CN101333256A (sk) |
| AR (3) | AR043274A1 (sk) |
| AU (1) | AU3921600A (sk) |
| BG (2) | BG66399B1 (sk) |
| BR (1) | BR0009323A (sk) |
| CA (3) | CA2669512A1 (sk) |
| CY (2) | CY1113326T1 (sk) |
| CZ (1) | CZ303725B6 (sk) |
| DK (1) | DK2168984T3 (sk) |
| ES (1) | ES2390849T3 (sk) |
| HK (1) | HK1142083A1 (sk) |
| HU (1) | HUP0200575A3 (sk) |
| IL (3) | IL145134A0 (sk) |
| LU (1) | LU92159I2 (sk) |
| MX (1) | MXPA01009645A (sk) |
| MY (2) | MY142984A (sk) |
| NO (3) | NO334828B1 (sk) |
| NZ (5) | NZ529571A (sk) |
| PL (2) | PL218748B1 (sk) |
| PT (1) | PT2168984E (sk) |
| SI (1) | SI2168984T1 (sk) |
| SK (1) | SK288082B6 (sk) |
| TR (5) | TR200501367T2 (sk) |
| TW (5) | TWI280980B (sk) |
| WO (1) | WO2000056772A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA200107774B (sk) |
Families Citing this family (166)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140094647A (ko) * | 1999-03-25 | 2014-07-30 | 아비에 도이치란트 게엠베하 운트 콤파니 카게 | 사람 ｉｌ-12에 결합하는 사람 항체 및 이의 제조방법 |
| US6914128B1 (en) | 1999-03-25 | 2005-07-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing |
| US7883704B2 (en) * | 1999-03-25 | 2011-02-08 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Methods for inhibiting the activity of the P40 subunit of human IL-12 |
| KR100951067B1 (ko) | 2000-02-10 | 2010-04-07 | 아보트 러보러터리즈 | 사람 인터류킨-18에 결합하는 항체 및 이를 제조하고사용하는 방법 |
| CN1451043A (zh) | 2000-06-29 | 2003-10-22 | 艾博特公司 | 双特异性抗体及其制备方法和用途 |
| US6902734B2 (en) | 2000-08-07 | 2005-06-07 | Centocor, Inc. | Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof |
| ZA200305995B (en) | 2001-01-05 | 2004-08-04 | Pfizer | Antibodies to insulin-like growth factor I receptor. |
| ES2629395T3 (es) | 2001-10-04 | 2017-08-09 | Genetics Institute, Llc | Métodos y composiciones para modular la actividad de la interleucina-21 |
| AU2002363339B2 (en) | 2001-11-08 | 2008-02-07 | Abbvie Biotechnology Ltd | Stable liquid pharmaceutical formulation of IGG antibodies |
| AU2003220557A1 (en) * | 2002-03-26 | 2003-10-13 | Centocor, Inc. | Multiple sclerosis-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses |
| WO2003083071A2 (en) * | 2002-03-26 | 2003-10-09 | Centocor, Inc. | Diabetes-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses |
| US20040033228A1 (en) | 2002-08-16 | 2004-02-19 | Hans-Juergen Krause | Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders |
| EP2108660A1 (en) | 2002-10-30 | 2009-10-14 | Genentech, Inc. | Inhibition of IL-17 production |
| WO2004041862A2 (en) | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor |
| EP1558646A2 (en) | 2002-11-08 | 2005-08-03 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses thereof |
| US20060034845A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-02-16 | Karen Silence | Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor |
| US9320792B2 (en) | 2002-11-08 | 2016-04-26 | Ablynx N.V. | Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof |
| DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
| KR20050110628A (ko) | 2003-02-10 | 2005-11-23 | 엘란 파마슈티칼스, 인크. | 면역글로불린 제제 및 이의 제조방법 |
| AU2012202845B2 (en) * | 2003-02-10 | 2014-09-04 | Biogen Ma Inc. | Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof |
| CA2518371A1 (en) | 2003-03-14 | 2004-09-30 | Wyeth | Antibodies against human il-21 receptor and uses therefor |
| RS20060099A (en) | 2003-08-13 | 2008-08-07 | Pfizer Products Inc., | Modified human igf-1r antibodies |
| FR2859725B1 (fr) | 2003-09-16 | 2006-03-10 | Neovacs | Procede a haut rendement pour l'obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine |
| US20050100965A1 (en) | 2003-11-12 | 2005-05-12 | Tariq Ghayur | IL-18 binding proteins |
| EP1531162A1 (en) | 2003-11-14 | 2005-05-18 | Heinz Vollmers | Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof |
| DE10353175A1 (de) | 2003-11-14 | 2005-06-16 | Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. | Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung |
| BRPI0508761A (pt) * | 2004-03-31 | 2007-08-14 | Genentech Inc | anticorpo humanizado, composição que compreende um anticorpo humanizado, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, processo de produção de anticorpo humanizado, método de tratamento de disfunção tgf-beta, método de detecção de tgf-beta, artigo industrializado e método de tratamento de cáncer |
| ME00226B (me) | 2004-07-15 | 2011-02-10 | Medarex Llc | Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade |
| EP2322217A3 (en) | 2004-07-16 | 2011-09-28 | Pfizer Products Inc. | Combination treatment for non-hematologic malignancies using an anti-IGF-1R antibody |
| BRPI0515858A (pt) | 2004-12-21 | 2008-08-12 | Centocor Inc | anticorpos anti-il-12, epìtopos, composições, métodos e usos |
| US7723486B2 (en) | 2005-02-08 | 2010-05-25 | Optein, Inc. | Antibodies to TGF-β |
| CA2596986A1 (en) | 2005-02-14 | 2006-08-24 | Wyeth | Use of il-17f in diagnosis and therapy of airway inflammation |
| JP2008532936A (ja) | 2005-02-14 | 2008-08-21 | ワイス | インターロイキン−１７ｆ抗体及び他のｉｌ−１７ｆシグナル伝達拮抗物質並びにそれらの使用 |
| GT200600148A (es) | 2005-04-14 | 2006-11-22 | Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis | |
| CN103145842A (zh) * | 2005-06-30 | 2013-06-12 | Abbvie公司 | Il-12/p40结合蛋白 |
| US7868140B2 (en) | 2005-07-18 | 2011-01-11 | Amgen Inc. | Human anti-B7RP1 neutralizing antibodies |
| EP2500356A3 (en) | 2005-08-19 | 2012-10-24 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
| EP1928506A4 (en) | 2005-08-19 | 2009-10-21 | Abbott Lab | IMMUNOGLOBULIN HAVING TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF |
| US7612181B2 (en) | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
| US8906864B2 (en) | 2005-09-30 | 2014-12-09 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (RGM) protein family and functional fragments thereof, and their use |
| KR101434935B1 (ko) | 2005-11-30 | 2014-10-01 | 애브비 인코포레이티드 | 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의용도 |
| RU2442793C2 (ru) | 2005-11-30 | 2012-02-20 | Эбботт Лэборетриз | АНТИТЕЛА ПРОТИВ ГЛОБУЛОМЕРА Аβ, ИХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ЧАСТИ, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ГИБРИДОМЫ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОРЫ, КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ, КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ УКАЗАННЫЕ АНТИТЕЛА, ПРИМЕНЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ |
| TWI417301B (zh) | 2006-02-21 | 2013-12-01 | Wyeth Corp | 對抗人類介白素-２２（ｉｌ-２２）之抗體及其用途 |
| TW200744634A (en) | 2006-02-21 | 2007-12-16 | Wyeth Corp | Methods of using antibodies against human IL-22 |
| EP3910065A1 (en) | 2006-09-08 | 2021-11-17 | AbbVie Bahamas Ltd. | Interleukin -13 binding proteins |
| US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
| US8324350B2 (en) | 2006-12-29 | 2012-12-04 | Abbott Laboratories | Dual-specific IL-1α/IL-1β antibodies |
| NZ578065A (en) * | 2007-01-16 | 2012-09-28 | Abbott Lab | Methods for treating psoriasis with an antibody which binds to an epitope |
| WO2008104386A2 (en) | 2007-02-27 | 2008-09-04 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Method for the treatment of amyloidoses |
| RU2476442C2 (ru) * | 2007-03-29 | 2013-02-27 | Эббот Лэборетриз | Кристаллические антитела против il-12 человека |
| US20110014117A1 (en) * | 2007-06-28 | 2011-01-20 | Schering Corporation | Anti-igf1r |
| WO2009114040A2 (en) * | 2007-09-28 | 2009-09-17 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Anti-il-12/23p40 antibodies, epitopes, formulations, compositions, methods and uses |
| EP2050764A1 (en) * | 2007-10-15 | 2009-04-22 | sanofi-aventis | Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof |
| EP2215125A1 (en) | 2007-11-27 | 2010-08-11 | Ablynx N.V. | Method for obtaining polypeptide constructs comprising two or more single domain antibodies |
| US8962803B2 (en) | 2008-02-29 | 2015-02-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Antibodies against the RGM A protein and uses thereof |
| NZ587765A (en) | 2008-03-18 | 2013-02-22 | Abbott Lab | Methods for treating psoriasis |
| SG190572A1 (en) | 2008-04-29 | 2013-06-28 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| NZ623706A (en) | 2008-05-05 | 2015-12-24 | Novimmune Sa | Anti-il-17a/il-17f cross-reactive antibodies and methods of use thereof |
| MY159667A (en) | 2008-05-09 | 2017-01-13 | Abbvie Inc | Antibodies to receptor of advanced glycation end products (rage) and uses thereof |
| CA2726345C (en) * | 2008-05-30 | 2018-08-28 | John Simard | Interleukin-1 alpha antibodies and methods of use |
| AR072001A1 (es) | 2008-06-03 | 2010-07-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma |
| TW201006485A (en) | 2008-06-03 | 2010-02-16 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| RU2559525C2 (ru) | 2008-07-08 | 2015-08-10 | Эббви Инк | Белки, связывающие простагландин е2, и их применение |
| JP5674654B2 (ja) | 2008-07-08 | 2015-02-25 | アッヴィ・インコーポレイテッド | プロスタグランジンｅ２二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用 |
| JP5823867B2 (ja) | 2008-10-29 | 2015-11-25 | アブリンクス エン．ヴェー． | 単一ドメイン抗原結合分子の製剤 |
| AU2009314311B2 (en) | 2008-10-29 | 2013-01-10 | Ablynx N.V. | Methods for purification of single domain antigen binding molecules |
| US20100172862A1 (en) * | 2008-11-28 | 2010-07-08 | Abbott Laboratories | Stable antibody compositions and methods of stabilizing same |
| US8030026B2 (en) * | 2009-02-24 | 2011-10-04 | Abbott Laboratories | Antibodies to troponin I and methods of use thereof |
| US8835610B2 (en) | 2009-03-05 | 2014-09-16 | Abbvie Inc. | IL-17 binding proteins |
| CA2759848C (en) | 2009-05-05 | 2018-12-04 | Novimmune S.A. | Anti-il-17f antibodies and methods of use thereof |
| CN105131112A (zh) | 2009-08-29 | 2015-12-09 | Abbvie公司 | 治疗用dll4结合蛋白 |
| CA2772628A1 (en) | 2009-09-01 | 2011-03-10 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| KR20140048229A (ko) * | 2009-09-14 | 2014-04-23 | 애브비 인코포레이티드 | 건선을 치료하는 방법 |
| CA2775959A1 (en) | 2009-10-15 | 2011-04-21 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| UY32979A (es) | 2009-10-28 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
| TW201121568A (en) | 2009-10-31 | 2011-07-01 | Abbott Lab | Antibodies to receptor for advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof |
| WO2011051466A1 (en) | 2009-11-02 | 2011-05-05 | Novartis Ag | Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof |
| BR112012013734A2 (pt) | 2009-12-08 | 2017-01-10 | Abbott Gmbh & Co Kg | anticorpos monoclonais contra a proteína rgm a para uso no tratamento da degeneração da camada de fibras nervosas da retina. |
| JP5785873B2 (ja) * | 2009-12-09 | 2015-09-30 | 田辺三菱製薬株式会社 | Ｔ細胞活性化阻害剤、これを含有する医薬組成物およびｔ細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法 |
| RU2605928C2 (ru) | 2010-03-02 | 2016-12-27 | Эббви Инк. | Терапевтические dll4-связывающие белки |
| MX360403B (es) | 2010-04-15 | 2018-10-31 | Abbvie Inc | Proteinas de union a amiloide beta. |
| AU2011252883B2 (en) | 2010-05-14 | 2015-09-10 | Abbvie Inc. | IL-1 binding proteins |
| WO2012006500A2 (en) | 2010-07-08 | 2012-01-12 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein |
| UY33492A (es) | 2010-07-09 | 2012-01-31 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
| KR20130100118A (ko) | 2010-08-03 | 2013-09-09 | 아비에 인코포레이티드 | 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 |
| EP2603524A1 (en) | 2010-08-14 | 2013-06-19 | AbbVie Inc. | Amyloid-beta binding proteins |
| US9505829B2 (en) | 2010-08-19 | 2016-11-29 | Zoetis Belgium S.A. | Anti-NGF antibodies and their use |
| JP2013539364A (ja) | 2010-08-26 | 2013-10-24 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用 |
| ES2959479T3 (es) | 2010-09-17 | 2024-02-26 | Takeda Pharmaceuticals Co | Estabilización de inmunoglobulinas a través de formulación acuosa con histidina a pH ácido débil a neutro |
| SG10201604699VA (en) | 2010-12-21 | 2016-07-28 | Abbvie Inc | Il-1 -alpha and -beta bispecific dual variable domain immunoglobulins and their use |
| TW201307388A (zh) | 2010-12-21 | 2013-02-16 | Abbott Lab | Ｉｌ－１結合蛋白 |
| AU2012283039A1 (en) | 2011-07-13 | 2014-01-30 | Abbvie Inc. | Methods and compositions for treating asthma using anti-IL-13 antibodies |
| WO2013063095A1 (en) | 2011-10-24 | 2013-05-02 | Abbvie Inc. | Immunobinders directed against sclerostin |
| CA2855840C (en) | 2011-12-14 | 2023-08-29 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders |
| CA2855570A1 (en) | 2011-12-14 | 2013-06-20 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders |
| UY34558A (es) | 2011-12-30 | 2013-07-31 | Abbvie Inc | Proteínas de unión específicas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17 |
| CN107880124B (zh) | 2012-01-27 | 2021-08-13 | 艾伯维德国有限责任两合公司 | 用于诊断和治疗与神经突变性相关的疾病的组合物和方法 |
| SI2852615T1 (sl) | 2012-05-22 | 2019-02-28 | Bristol-Myers Squibb Company | IL-17A/F IL-23 bispecifična protitelesa in njihova uporaba |
| EP2859018B1 (en) | 2012-06-06 | 2021-09-22 | Zoetis Services LLC | Caninized anti-ngf antibodies and methods thereof |
| AR091755A1 (es) | 2012-07-12 | 2015-02-25 | Abbvie Inc | Proteinas de union a il-1 |
| PL2892550T3 (pl) | 2012-09-07 | 2020-07-27 | Coherus Biosciences, Inc. | Stabilne wodne formulacje adalimumabu |
| US9163093B2 (en) | 2012-11-01 | 2015-10-20 | Abbvie Inc. | Anti-DLL4/VEGF dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
| US9550986B2 (en) | 2012-12-21 | 2017-01-24 | Abbvie Inc. | High-throughput antibody humanization |
| KR102068222B1 (ko) | 2013-02-20 | 2020-01-21 | 삼성디스플레이 주식회사 | 증착용 마스크 제조방법 |
| PH12022550138A1 (en) | 2013-03-13 | 2023-03-06 | Amgen Inc | Proteins specific for baff and b7rp1 and uses thereof |
| US9458246B2 (en) | 2013-03-13 | 2016-10-04 | Amgen Inc. | Proteins specific for BAFF and B7RP1 |
| EP2968526A4 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-09 | Abbott Lab | ANTIGEN-ANTIBODY COMBINATION ASSAY OF HEPATITIS C VIRUS AND METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE THEREWITH |
| BR112015023355A8 (pt) | 2013-03-14 | 2018-01-30 | Abbott Lab | antígenos recombinantes ns3 de hcv e mutantes dos mesmos para detecção de anticorpos aprimorada. |
| EP2971046A4 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-02 | Abbott Lab | MONOCLONAL ANTIBODIES WITH LIPID BINDING TO THE HEART OF HCV |
| JP2016522793A (ja) | 2013-03-15 | 2016-08-04 | アッヴィ・インコーポレイテッド | ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質 |
| US9469686B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-10-18 | Abbott Laboratories | Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same |
| CN103275222B (zh) * | 2013-05-15 | 2014-04-16 | 中山康方生物医药有限公司 | 一种阻断白介素12 p40功能的单克隆抗体及其编码基因和应用 |
| CA2914566A1 (en) | 2013-06-07 | 2014-12-11 | Duke University | Inhibitors of complement factor h |
| MX381087B (es) * | 2013-12-26 | 2025-03-12 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corp | Anticuerpo monoclonal neutralizador de anti-il-33 humana. |
| ES2774448T3 (es) * | 2014-10-03 | 2020-07-21 | Novartis Ag | Terapias de combinación |
| MX2017004975A (es) * | 2014-10-18 | 2017-06-30 | Pfizer | Composiciones de anticuerpos anti-il-7r. |
| AR102417A1 (es) | 2014-11-05 | 2017-03-01 | Lilly Co Eli | Anticuerpos biespecíficos anti-tnf- / anti-il-23 |
| WO2016094881A2 (en) | 2014-12-11 | 2016-06-16 | Abbvie Inc. | Lrp-8 binding proteins |
| KR102661078B1 (ko) | 2015-05-29 | 2024-05-23 | 애브비 인코포레이티드 | 항-ｃｄ40 항체 및 그의 용도 |
| TW201710286A (zh) | 2015-06-15 | 2017-03-16 | 艾伯維有限公司 | 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白 |
| US11229702B1 (en) | 2015-10-28 | 2022-01-25 | Coherus Biosciences, Inc. | High concentration formulations of adalimumab |
| CR20180365A (es) | 2015-12-16 | 2018-09-28 | Amgen Inc | PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS |
| CN105825196B (zh) * | 2016-03-28 | 2020-01-31 | 联想(北京)有限公司 | 一种信息处理方法和电子设备 |
| JP7468992B2 (ja) | 2016-03-29 | 2024-04-16 | ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド | 抗ｉｌ１２及び／又は－２３抗体の増加した間隔投与による乾癬の処置 |
| WO2017184880A1 (en) | 2016-04-20 | 2017-10-26 | Coherus Biosciences, Inc. | A method of filling a container with no headspace |
| US11673971B2 (en) * | 2016-09-23 | 2023-06-13 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multispecific antibody molecules comprising lambda and kappa light chains |
| JP2019530875A (ja) | 2016-10-03 | 2019-10-24 | アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ | 患者サンプルにおけるｕｃｈ−ｌ１状況を評価する改善された方法 |
| EP3824906A1 (en) | 2016-12-21 | 2021-05-26 | Amgen Inc. | Anti-tnf alpha antibody formulations |
| JP7346300B2 (ja) | 2017-03-23 | 2023-09-19 | アボット・ラボラトリーズ | 早期バイオマーカーであるユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼｌ１を使用する、ヒト対象における外傷性脳損傷の程度の診断及び決定の一助となるための方法 |
| JP7344797B2 (ja) | 2017-04-15 | 2023-09-14 | アボット・ラボラトリーズ | 早期バイオマーカーを使用する、ヒト対象における外傷性脳損傷の、超急性の診断及び決定の一助となるための方法 |
| BR112019022476A2 (pt) | 2017-04-28 | 2020-05-12 | Abbott Laboratories | Métodos para o auxílio no diagnóstico e determinação hiperagudos de lesão cerebral traumática usando biomarcadores iniciais em pelo menos duas amostras a partir do mesmo ser humano |
| US10865238B1 (en) | 2017-05-05 | 2020-12-15 | Duke University | Complement factor H antibodies |
| CN110651190A (zh) | 2017-05-25 | 2020-01-03 | 雅培实验室 | 用早期生物标记物帮助确定是否对已遭受或可能已遭受头部损伤的人受试者执行成像的方法 |
| BR112019025387A2 (pt) | 2017-05-30 | 2020-07-07 | Abbott Laboratories | métodos para auxiliar no diagnóstico e avaliação de uma lesão traumática cerebral branda em um indivíduo humano com o uso de troponina cardíaca i e biomarcadores precoces |
| US11169159B2 (en) | 2017-07-03 | 2021-11-09 | Abbott Laboratories | Methods for measuring ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 levels in blood |
| AU2018325645C1 (en) | 2017-08-31 | 2025-01-30 | Hyogo College Of Medicine | IL-33 antagonist-containing therapeutic agent for endometriosis |
| TW201922780A (zh) * | 2017-09-25 | 2019-06-16 | 美商健生生物科技公司 | 以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法 |
| CA3067055A1 (en) | 2017-12-09 | 2019-06-13 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in diagnosing and evaluating a traumatic brain injury in a human subject using a combination of gfap and uch-l1 |
| CN111094983A (zh) | 2017-12-09 | 2020-05-01 | 雅培实验室 | 使用胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)和/或泛素羧基末端水解酶l1(uch-l1)帮助诊断和评价已遭受骨科损伤并已遭受或可能已遭受头部损伤诸如轻度创伤性脑损伤(tbi)的患者的方法 |
| JP2021506794A (ja) * | 2017-12-13 | 2021-02-22 | ザ リサーチ ファウンデイション フォー ザ ステイト ユニバーシティー オブ ニューヨーク | 疼痛を治療し、疼痛感受性を増大させるためのペプチド及び他の薬剤 |
| RU2020129265A (ru) | 2018-03-12 | 2022-04-12 | ЗОИТИС СЕРВИСЕЗ ЭлЭлСи | Антитела против ngf и связанные с ними способы |
| EP3793521A4 (en) | 2018-05-18 | 2022-02-23 | Janssen Biotech, Inc. | SAFE AND EFFECTIVE METHOD OF TREATING LUPUS WITH AN ANTI-IL12/IL23 ANTIBODY |
| AU2019346134C1 (en) | 2018-09-24 | 2024-06-20 | Janssen Biotech, Inc. | Safe and effective method of treating ulcerative colitis with anti-il12/il23 antibody |
| CN111057719B (zh) * | 2018-10-17 | 2022-11-11 | 南京大学 | 一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用 |
| AU2020279987A1 (en) | 2019-05-23 | 2021-11-18 | Janssen Biotech, Inc. | Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha |
| CN110204736A (zh) * | 2019-06-07 | 2019-09-06 | 河南师范大学 | 一步合成不同形貌Pb-MOF金属有机骨架的方法 |
| IL295387A (en) | 2020-02-05 | 2022-10-01 | Larimar Therapeutics Inc | Tat peptide binding proteins and uses thereof |
| CN111471655B (zh) * | 2020-03-19 | 2023-07-07 | 湖州正熙医学检验实验室有限公司 | 抗人il12/23稳转细胞株及其构建方法和应用 |
| AU2021276930A1 (en) | 2020-05-21 | 2023-02-02 | Janssen Biotech, Inc. | Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha |
| WO2022031804A1 (en) | 2020-08-04 | 2022-02-10 | Abbott Laboratories | Improved methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample |
| WO2022119841A1 (en) | 2020-12-01 | 2022-06-09 | Abbott Laboratories | Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi |
| WO2023102384A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Abbott Laboratories | Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi |
| EP4271998A1 (en) | 2020-12-30 | 2023-11-08 | Abbott Laboratories | Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample |
| US20220381796A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-12-01 | Abbott Laboratories | Methods of evaluating brain injury in a pediatric subject |
| AU2022293389A1 (en) | 2021-06-14 | 2024-01-04 | Abbott Laboratories | Methods of diagnosing or aiding in diagnosis of brain injury caused by acoustic energy, electromagnetic energy, an over pressurization wave, and/or blast wind |
| CN113321729B (zh) * | 2021-07-01 | 2022-08-30 | 东大生物技术(苏州)有限公司 | 一组il-12单克隆抗体及其医药用途 |
| CN118715440A (zh) | 2021-08-31 | 2024-09-27 | 雅培实验室 | 诊断脑损伤的方法和系统 |
| EP4396587A1 (en) | 2021-08-31 | 2024-07-10 | Abbott Laboratories | Methods and systems of diagnosing brain injury |
| JP2024538608A (ja) | 2021-09-30 | 2024-10-23 | アボット・ラボラトリーズ | 脳の損傷を診断する方法及びシステム |
| JP2025503439A (ja) | 2021-12-17 | 2025-02-04 | アボット・ラボラトリーズ | 血液試料におけるｕｃｈ－ｌ１、ｇｆａｐ及び他のバイオマーカーを決定するためのシステム及び方法 |
| EP4473311A1 (en) | 2022-02-04 | 2024-12-11 | Abbott Laboratories | Lateral flow methods, assays, and devices for detecting the presence or measuring the amount of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 and/or glial fibrillary acidic protein in a sample |
| KR20230171660A (ko) | 2022-06-14 | 2023-12-21 | 오상민 | 공기 살균 정화기 |
| AU2023298134A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-11-28 | Abbott Laboratories | Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples |
| WO2024059708A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Abbott Laboratories | Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury |
| WO2024211475A1 (en) | 2023-04-04 | 2024-10-10 | Abbott Laboratories | Use of biomarkers to determine whether a subject has sustained, may have sustained or is suspected of sustaining a subacute acquired brain injury (abi) |
| WO2024226971A1 (en) | 2023-04-28 | 2024-10-31 | Abbott Point Of Care Inc. | Improved assays, cartridges, and kits for detection of biomarkers, including brain injury biomarkers |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4634665A (en) | 1980-02-25 | 1987-01-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| US5179017A (en) | 1980-02-25 | 1993-01-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| US4510245A (en) | 1982-11-18 | 1985-04-09 | Chiron Corporation | Adenovirus promoter system |
| GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US5168062A (en) | 1985-01-30 | 1992-12-01 | University Of Iowa Research Foundation | Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence |
| US4968615A (en) | 1985-12-18 | 1990-11-06 | Ciba-Geigy Corporation | Deoxyribonucleic acid segment from a virus |
| ATE168416T1 (de) | 1989-10-05 | 1998-08-15 | Optein Inc | Zellfreie synthese und isolierung von genen und polypeptiden |
| CA2109602C (en) | 1990-07-10 | 2002-10-01 | Gregory P. Winter | Methods for producing members of specific binding pairs |
| GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| ES2113940T3 (es) | 1990-12-03 | 1998-05-16 | Genentech Inc | Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas. |
| EP1471142B1 (en) | 1991-04-10 | 2008-11-19 | The Scripps Research Institute | Heterodimeric receptor libraries using phagemids |
| WO1994004679A1 (en) * | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
| DE4122599C2 (de) | 1991-07-08 | 1993-11-11 | Deutsches Krebsforsch | Phagemid zum Screenen von Antikörpern |
| US5734014A (en) * | 1992-08-11 | 1998-03-31 | Tsumura & Co. | Elafin derivative |
| US5464758A (en) | 1993-06-14 | 1995-11-07 | Gossen; Manfred | Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters |
| US5654168A (en) | 1994-07-01 | 1997-08-05 | Basf Aktiengesellschaft | Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units |
| EP0659766A1 (en) * | 1993-11-23 | 1995-06-28 | Schering-Plough | Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies |
| ZA95960B (en) * | 1994-03-14 | 1995-10-10 | Genetics Inst | Use of interleukin-12 antagonists in the treatment of autoimmune diseases |
| AU5632296A (en) * | 1995-04-27 | 1996-11-18 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| US5853697A (en) * | 1995-10-25 | 1998-12-29 | The United States Of America, As Represented By The Department Of Health & Human Services | Methods of treating established colitis using antibodies against IL-12 |
| DE69726878T2 (de) * | 1996-11-15 | 2004-10-21 | Kennedy Inst Of Rheumatology L | UNTERDRÜCKUNG VON TNFalpha UND IL-12 IN DER THERAPIE |
| KR20140094647A (ko) * | 1999-03-25 | 2014-07-30 | 아비에 도이치란트 게엠베하 운트 콤파니 카게 | 사람 ｉｌ-12에 결합하는 사람 항체 및 이의 제조방법 |
| US9601381B2 (en) | 2013-12-05 | 2017-03-21 | Stmicroelectronics (Crolles 2) Sas | Method for the formation of a finFET device with epitaxially grown source-drain regions having a reduced leakage path |
-
2000
- 2000-03-24 KR KR1020147017491A patent/KR20140094647A/ko not_active Ceased
- 2000-03-24 KR KR1020137024212A patent/KR20130105766A/ko not_active Ceased
- 2000-03-24 NZ NZ529571A patent/NZ529571A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 NZ NZ513945A patent/NZ513945A/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-03-24 AU AU39216/00A patent/AU3921600A/en not_active Abandoned
- 2000-03-24 CN CNA2008100993235A patent/CN101333256A/zh active Pending
- 2000-03-24 ES ES09175437T patent/ES2390849T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-24 CA CA002669512A patent/CA2669512A1/en not_active Abandoned
- 2000-03-24 CA CA002365281A patent/CA2365281C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 TR TR2005/01367T patent/TR200501367T2/xx unknown
- 2000-03-24 HU HU0200575A patent/HUP0200575A3/hu unknown
- 2000-03-24 TR TR2001/02715T patent/TR200102715T2/xx unknown
- 2000-03-24 CZ CZ20013434A patent/CZ303725B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 IL IL14513400A patent/IL145134A0/xx unknown
- 2000-03-24 CA CA2796140A patent/CA2796140A1/en not_active Abandoned
- 2000-03-24 MY MYPI20001172A patent/MY142984A/en unknown
- 2000-03-24 SI SI200031074T patent/SI2168984T1/sl unknown
- 2000-03-24 CN CNB008077835A patent/CN100439399C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 TR TR2008/02278T patent/TR200802278T2/xx unknown
- 2000-03-24 NZ NZ592550A patent/NZ592550A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 KR KR1020107002138A patent/KR101222450B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 PT PT09175437T patent/PT2168984E/pt unknown
- 2000-03-24 CN CN2005101286774A patent/CN101066997B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 MX MXPA01009645A patent/MXPA01009645A/es active IP Right Grant
- 2000-03-24 KR KR1020127020122A patent/KR20120091477A/ko not_active Withdrawn
- 2000-03-24 EP EP10180283A patent/EP2319870A3/en not_active Withdrawn
- 2000-03-24 JP JP2000606632A patent/JP4841038B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 SK SK1367-2001A patent/SK288082B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 NZ NZ611563A patent/NZ611563A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 TR TR2006/03997T patent/TR200603997T1/xx unknown
- 2000-03-24 PL PL351842A patent/PL218748B1/pl unknown
- 2000-03-24 KR KR1020067020750A patent/KR20060127247A/ko not_active Ceased
- 2000-03-24 EP EP00918396A patent/EP1175446A1/en not_active Withdrawn
- 2000-03-24 AR ARP000101321A patent/AR043274A1/es active IP Right Grant
- 2000-03-24 MY MYPI20064253A patent/MY145191A/en unknown
- 2000-03-24 EP EP09175437A patent/EP2168984B1/en not_active Revoked
- 2000-03-24 KR KR1020017012238A patent/KR100818066B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 CN CN2010101952865A patent/CN101921772B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 PL PL409839A patent/PL409839A1/pl unknown
- 2000-03-24 BR BR0009323-8A patent/BR0009323A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 NZ NZ596723A patent/NZ596723A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 DK DK09175437.4T patent/DK2168984T3/da active
- 2000-03-24 TR TR2005/03572T patent/TR200503572T2/xx unknown
- 2000-03-24 WO PCT/US2000/007946 patent/WO2000056772A1/en active Application Filing
- 2000-03-24 EP EP10180107A patent/EP2301970A1/en not_active Withdrawn
- 2000-09-18 TW TW89105501A patent/TWI280980B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-09-18 TW TW100149356A patent/TWI410433B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-09-18 TW TW101120051A patent/TW201300412A/zh unknown
- 2000-09-18 TW TW099128334A patent/TWI365193B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-09-18 TW TW095145663A patent/TWI339209B/zh not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-08-27 IL IL145134A patent/IL145134A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-09-20 ZA ZA200107774A patent/ZA200107774B/en unknown
- 2001-09-21 NO NO20014605A patent/NO334828B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-10-18 BG BG106027A patent/BG66399B1/bg unknown
-
2007
- 2007-11-08 AR ARP070104977A patent/AR063780A2/es not_active Application Discontinuation
-
2010
- 2010-07-15 IL IL207029A patent/IL207029A0/en unknown
- 2010-07-15 AR ARP100102574A patent/AR094125A2/es unknown
- 2010-09-06 HK HK10108446.1A patent/HK1142083A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-07-22 JP JP2011161258A patent/JP2012010702A/ja not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-11-08 BG BG111337A patent/BG111337A/bg unknown
- 2012-11-12 CY CY20121101073T patent/CY1113326T1/el unknown
-
2013
- 2013-02-26 CY CY2013007C patent/CY2013007I1/el unknown
- 2013-02-27 LU LU92159C patent/LU92159I2/fr unknown
- 2013-11-07 NO NO20131482A patent/NO20131482L/no not_active Application Discontinuation
-
2014
- 2014-02-14 JP JP2014026148A patent/JP2014138594A/ja active Pending
- 2014-09-18 NO NO2014024C patent/NO2014024I1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100818066B1 (ko) | 사람 ｉｌ-１２에 결합하는 사람 항체 | |
| AU2007338677B2 (en) | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing | |
| AU2010206050B2 (en) | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing | |
| AU2005200515B2 (en) | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing | |
| AU2013254916A1 (en) | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing | |
| AU2014202200A1 (en) | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Assignment and transfer of rights |
Owner name: ABBVIE DEUTSCHLAND GMBH & CO. KG, WIESBADEN, DE Free format text: FORMER OWNER: ABBOTT GMBH & CO. KG, WIESBADEN, DE Effective date: 20121101 |
|
| SPCF | Filing of an spc |
Free format text: PRODUCT NAME: USTEKINUMAB; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/08/494/001 20090116 Spc suppl protection certif: 10-2013 Filing date: 20130930 |
|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20160324 |