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KR100818066B1 - 사람 ｉｌ-１２에 결합하는 사람 항체 - Google Patents

사람 ｉｌ-１２에 결합하는 사람 항체 Download PDF

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KR100818066B1
KR100818066B1 KR1020017012238A KR20017012238A KR100818066B1 KR 100818066 B1 KR100818066 B1 KR 100818066B1 KR 1020017012238 A KR1020017012238 A KR 1020017012238A KR 20017012238 A KR20017012238 A KR 20017012238A KR 100818066 B1 KR100818066 B1 KR 100818066B1
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화이트마이클
카이막칼란제흐라
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사코라파스폴
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와른니콜라스더블유
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둔칸알렉산더알
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스미쓰스티븐
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두포우사라엘
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애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게
제네틱스 인스티튜트, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 사람 인터류킨-12(hIL-12)와 특이적으로 결합하는 사람 항체, 바람직하게는 재조합 사람 항체에 관한 것이다. 바람직한 항체는 hIL-12에 대해 높은 친화성을 갖고 생체내 및 시험관내에서 hIL-12 활성을 중화시킨다. 본 발명의 항체는 완전한 길이의 항체 또는 이의 항원 결합부일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 일부는 hIL-12를 검출하고 예를 들어, hIL-12 활성이 유해한 질병을 앓는 사람 환자에 있어서 hIL-12 활성을 억제하는데 유용하다. 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 사람 항체를 발현하기 위한 핵산, 벡터 및 숙주 세포, 및 재조합 사람 항체를 합성하기 위한 방법에 관한 것이다.
사람 인터류킨-12, 재조합 사람 항체

Description

사람 ＩＬ-１２에 결합하는 사람 항체{Human antibodies that bind human IL-12}
관련 출원
본 출원은 1999년 3월 25일자로 출원된 미국 가출원 제60/126,603호(이의 내용은 본원에 참조로 인용된다)의 우선권을 주장하는 비-가출원이다.
사람 인터류킨 12(IL-12)는 독특한 구조 및 다양한 발현 효과를 갖는 사이토카인으로서 최근에 특성화되었다[Kobayashi, et al. (1989) J. Exp. Med. 170:827-845; Seder, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp. Med. 154:116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237]. IL-12는 면역 및 염증 반응과 관련된 몇몇 질병과 관련된 병변에서 결정적인 역할을 수행한다. IL-12에 대한 개관, 이의 생물학적 활성, 및 이의 질병에서의 역할은 문헌[Gately et al. (1998) Ann. Rev. Immunol. 16:495-521]에서 확인할 수 있다.
구조적으로, IL-12는 이황화 결합으로 함께 결합된 35kDa 서브유니트(p35) 및 40kDa 서브유니트(p40)("p70 서브유니트"로 지칭됨)를 포함하는 이종이량체성 단백질이다. 상기 이종이량체성 단백질은 단핵구, 대식세포 및 수상세포 같은 항원 제시 세포에 의해 주로 생산된다. 이러한 세포 유형은 또한 p70 서브유니트에 대해서 p40 서브유니트를 과량으로 분비한다. p40 및 p35 서브유니트는 유전학적으로 무관하며 생물학적 활성을 갖는 것으로 공지된 바 없지만, p40 동종이량체는 IL-12 길항제로서 작용할 수 있다.
기능적으로, IL-12는 항원 특이적 T 헬퍼 유형 1(Th1) 및 유형 2(Th2) 임파구 사이에서의 균형을 조절하는 중요한 역할을 수행한다. Th1 및 Th2 세포는 자가면역질병의 개시 및 진행을 조절하며, IL-12는 Th1-임파구 분화 및 성숙의 조절에서 중요하다. Th1 세포에 의해서 분비되는 사이토카인은 염증성이며, 인터페론 γ(IFNγ), IL-12 및 림프구독소(LT)를 포함한다. Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13을 분비하여 체액성 면역, 알레르기 반응 및 면역억제를 촉진시킨다.
자가면역 질병에서 Th1 반응의 우세 및 IFNγ의 염증촉진(proinflammatory) 활성과 일치하여, IL-12는 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS) 및 크론 질병과 같은 수 많은 자가면역 및 염증성 질병과 관련된 병변에서 주요한 역할을 할 수 있다.
MS에 걸린 사람 환자는 급성 MS 플라크에서 p40 mRNA 수준으로 보고된 바와 같이 IL-12 발현 증가를 나타낸다[Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996]. 또한, MS 환자로부터의 CD40L-발현 T 세포를 사용한 항원 제시 세포의 생체외 자극은 대조군 T 세포와 비교하여 IL-12 생산 증가를 초래하며, 이는 CD40/CD40L 상호작용이 IL-12의 잠재적인 유도 인자라는 관찰과 일치한다.
IL-12 p70의 증가된 수준은 건강한 대조군과 비교하여 RA 환자의 활액에서 검출되었다[Morita et al (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-314]. RA 활액에서 사이토카인 전령 리보핵산(mRNA) 발현 특성은 주로 Th1 사이토카인으로 확인되었다[Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367]. IL-12는 또한 크론 질병(CD)과 관련된 병변에서 결정적인 역할을 하는 것으로 보인다. INFγ 및 IL-12의 증가된 발현이 상기 질병에 걸린 환자의 소장 점막에서 관찰되었다[Fais et al. (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology. 112:1169-1178, and Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152:667-672]. CD 환자의 고유층(lamina propria)으로부터 T 세포의 사이토카인 분비 특성은 급증된 IFNγ 수준을 포함하는, 주로 Th1 반응의 특성이다[Fuss, et al., (1996) J. Immunol. 157:1261-1270]. 또한, CD 환자로부터의 결장 조직 절편은 IL-12 발현 대식세포 및 IFNγ발현 T 세포가 풍부함을 보여준다[Parronchi et al (1997) Am. J. Path. 150:823-832].
다양한 사람 질병에서 사람 IL-12의 역할로 인해, 치료 전략은 IL-12 활성을 억제하거나 상쇄하도록 고안되어 왔다. 특히, IL-12에 결합하여 이를 중화시키는 항체가 IL-12 활성을 억제하는 수단으로서 추구되어 왔다. 최초의 항체 중 일부는 IL-12로 면역화시킨 쥐의 임파구로부터 제조된 하이브리도마에 의해 분비되는 쥐의 모노클로날 항체(mAb)이다[참조: 예를 들면, 국제특허원 공개공보 WO 제97/15327호(by Strober et al.); Neurath et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1281-1290; Duchmann et al. (1996) J. Immunol. 26:934-938]. 이러한 쥐의 IL-12 항체는 짧은 혈청 반감기, 특정한 사람 효능인자 기능을 촉발하지 못하는 무능력 및 사람에서 쥐 항체에 대한 바람직하지 못한 면역 반응의 유발["사람 항-마우스 항체"(HAMA) 반응] 같은 사람에 대한 마우스 항체의 투여와 관련된 문제점들로 인해 생체내에서 이의 사용이 제한적이다.
일반적으로, 사람에서 완전한 쥐의 항체의 사용과 관련된 문제점들을 극복하고자 하는 시도는 항체를 보다 "사람-유사"(human-like)하게 유전자 조작하는 것을 포함한다. 예를 들면, 항체 쇄의 가변 영역은 쥐로부터 유도되며 항체 쇄의 접촉 부위는 사람으로부터 유도되는 키메라 항체가 제조된 바 있다[Junghans et al. (1990) Cancer Res. 50:1495-1502; Brown et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:2663-2667; kettleborough et al. (1991) Protein Engineering. 4:773-783]. 그러나, 이러한 키메라 사람화된 항체도 또한 일부 쥐의 서열을 함유하고 있기 때문에, 특히 지속적인 기간 동안 투여하는 경우, 이는 여전히 바람직하지 않은 면역 반응, 사람 항-키메라 항체(HACA) 반응을 유발한다.
쥐의 항체 또는 이의 유도체(예를 들면, 키메라 또는 사람화된 항체)보다 선호되는 바람직한 IL-12 억제제는 전적으로 사람 항-IL-12 항체일 것이며, 이는 상기 제제가 지속적인 기간 동안 사용되는 경우에도 HAMA 반응을 유발하지 않기 때문이다. 그러나, 상기 항체는 선행기술에서 기술된 바 없으며, 따라서 여전히 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 사람 IL-12에 결합하는 사람 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 IL-12 항체를 사용하여, IL-12 관련된 병변의 급성 또는 만성 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 것에 관한 것이다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 사람 IL-12에 결합하는 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 사람 IL-12에 결합하도록 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화에서 활성 증진 아미노산 잔기로 선택적으로 돌연변이된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는, 선택적으로 돌연변이된 사람 IL-12 항체를 제공한다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 사람 IL-12에 결합하도록 우선 선택적 돌연변이 유발 부위에서 활성 증진 아미노산 잔기로 선택적으로 돌연변이된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는, 선택적으로 돌연변이된 사람 IL-12 항체를 제공한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 선택적으로 돌연변이된 사람 IL-12 항체 또는 이의 항원 결합부는 하나 이상의 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 활성 증진 아미노산 잔기로 선택적으로 돌연변이된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 선택적으로 돌연변이된 사람 IL-12 항체 또는 이의 항원 결합부는 3개 이하의 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 선택적으로 돌연변이된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 선택적으로 돌연변이된 사람 IL-12 항체 또는 이의 항원 결합부는 2개 이하의 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 선택적으로 돌연변이된다. 또한 또 다른 바람직한 양태에서, 선택적으로 돌연변이된 사람 IL-12 항체 또는 이의 항원 결합부는 선택적으로 돌연변이되어 표적 특이성 친화도 수준이 달성되며, 이러한 표적 수준은 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 동일한 항원에 대해서 항체를 선택하는 경우 달성되는것 이상으로 개선된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 선택적으로 돌연변이된 사람 IL-12 항체는 추가로 하나 이상의 바람직한 특성 또는 특징, 예를 들면, 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차 반응성의 보존성, 에피토프 인식의 보존성, 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산성을 보유한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 사람 IL-12에 결합하며 표면 플라스몬 공명으로 측정한 바와 같이 사람 IL-12로부터 Koff 속도 상수 0.1s-1 이하로 해리되며, 시험관내 식물성 혈구응집소 모세포 증식 분석(PHA 분석)에서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 1x10-6M 이하의 IC50으로 억제하는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 보다 바람직하게는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부는 1x10-2s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 IL-12로부터 해리되며 시험관내 PHA 분석에서 1x10-7M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제한다. 보다 바람직하게는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부는 1x10-3s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 IL-12로부터 해리되며 시험관내 PHA 분석에서 1x10-8M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제한다. 보다 바람직하게는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부는 1x10-4s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 IL-12로부터 해리되며 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제한다. 보다 바람직하게는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부는 1x10-5s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 IL-12로부터 해리되며 시험관내 PHA 분석에서 1x10-10M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제한다. 보다 더욱 바람직하게는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부는 1x10-5s-1 이하의 Koff 속도로 사람 IL-12로부터 해리되며 시험관내 PHA 분석에서 1x10-11M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-6M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고;
b) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 가지며;
c) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 가짐을 특징으로 하는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 갖는다. 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 갖는다. 더욱 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.
바람직한 양태에서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고;
b) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 가지며;
c) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 가짐을 특징으로 하는, 분리된 사람 항체, 또는 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 갖는다. 보다 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 및 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 갖는다. 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하며;
b) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 가지며;
c) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 갖는다. 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 갖는다. 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체는 문헌[kabat et al. (Kabat, E.A. et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 이는 본원에 참조로 인용됨]에서 언급된 바와 같이, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 접촉 부위 또는 이의 대립형질 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 접촉 부위를 포함한다. 보다 바람직한 양태에서, 항체 중쇄 접촉 부위는 IgG1이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체는 Fab 단편, 또는 F(ab')2 단편 또는 단일쇄 Fv 단편이다.
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또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고;
b) 서열 404 내지 서열 469로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 가지며;
c) 서열 534 내지 서열 579로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는, 분리된 사람 항체, 또는 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 335 내지 서열 403으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 506 내지 서열 533으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 갖는다. 보다 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 288 내지 서열 334로 이루어진 그룹으로부터 선택 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 및 서열 470 내지 서열 505로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 갖는다. 더욱 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 보다 더 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체는 상기된 바와 같은 중쇄 접촉 부위, 또는 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편 또는 단일쇄 Fv 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고;
b) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 가지며;
c) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 갖는다. 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 갖는다. 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 항원 결합부는 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체는 상기된 바와 같은 중쇄 접촉부위, 또는 Fab 단편, 또는 F(ab')2 단편 또는 단일쇄 Fv 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-6M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세 포 증식을 억제하고;
b) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 이의 돌연변이체(이때, 돌연변이체는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함하는 항체보다 10배 이하의 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하고;
c) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 돌연변이체(이때, 돌연변이체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 포함하는 항체보다 10배 이하의 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고;
b) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 이의 돌연변이체(이때, 돌연변이체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함하는 항체보다 10배 이하의 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하고;
c) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 돌연변이체(이때, 돌연변이체는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 포함하는 항체보다 10배 이하의 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고;
b) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 이의 돌연변이체(이때, 돌연변이체는 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함하는 항체보다 10배 이하의 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하고;
c) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 돌연변이체(이때, 돌연변이체는 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 포함하는 항체보다 10배 이하의 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항체, 또는 항원 결합부를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 바람직한 분리된 핵산은 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 암호화한다. 분리된 핵산은 항체 중쇄 가변 영역을 암호화 한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 CDR2를 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 암호화한다. 분리된 핵산은 항체 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역의 CDR2를 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 암호화한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하며;
b) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 돌연변이체(이때, 돌연변이체는 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함하는 항체보다 10배 이하의 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하고;
c) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 돌연변이체(이때, 돌연변이체는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 포함하는 항체보다 10배 이하의 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 분리된 핵산은 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 암호화한다. 분리된 핵산은 항체 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 CDR2를 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 암호화한다. 분리된 핵산은 항체 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역의 CDR2을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 암호화한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) IL-12에 결합하고 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 측정한 바와 같이, 0.1s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 IL-12로부터 해리되거나, 시험관내 식물성 혈구응집소 모세포 증식 분석(PHA 분석)에서 1x10-6M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하며;
b) 중쇄 가변 영역이 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 활성 증진 아미노산 잔기로 돌연변이된 VH3 배선 계열의 구성원으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖고;
c) 경쇄 가변 영역이 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 활성 증진 아미노산 잔기로 돌연변이된, Vλ1 배선 계열의 구성원으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) IL-12에 결합하고 표면 플라스몬 공명에 의해 측정한 바와 같이, 0.1s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 IL-12로부터 해리되거나, 시험관내 식물성 혈구응집소 모세포 증식 분석(PHA 분석)에서 1x10-6M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하며;
b) 중쇄 가변 영역이 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 활성 증진 아미노산 잔기로 돌연변이된, 서열 595 내지 서열 667로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖고;
c) 경쇄 가변 영역이 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 활성 증진 아미노산 잔기로 돌연변이된, 서열 669 내지 675로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) IL-12에 결합하고 표면 플라스몬 공명에 의해 측정한 바와 같이, 0.1s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 IL-12로부터 해리되거나, 시험관내 식물성 혈구응집소 모세포 증식 분석(PHA 분석)에서 1x10-6M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하며;
b) 중쇄 가변 영역이 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 활성 증진 아미노산 잔기로 돌연변이된 COS-3 배선의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖고;
c) 경쇄 가변 영역이 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 활성 증진 아미노산 잔기로 돌연변이된 DPL8 배선의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) IL-12에 결합하고 표면 플라스몬 공명에 의해 측정한 바와 같이, 0.1s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 IL-12로부터 해리되거나, 시험관내 식물성 혈구응집소 모세포 증식 분석(PHA 분석)에서 1x10-6M 이하의 IC50으로 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하며;
b) 중쇄 가변 영역이 다른 VH3 배선 계열 구성원으로부터의 CDR2와 구조적으로 유사한 CDR2 및 다른 VH3 배선 계열 구성원으로부터의 CDR1과 구조적으로 유사한 CDR1을 포함하고, 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 활성 증진 아미노산 잔기로 돌연변이된 VH3 배선 계열의 구성원으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖고;
c) 경쇄 가변 영역이 다른 Vλ1 배선 계열 구성원으로부터의 CDR2와 구조적으로 유사한 CDR2 및 다른 Vλ1 배선 계열 구성원으로부터의 CDR1과 구조적으로 유사한 CDR1을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 활성 증진 아미노산 잔기로 돌연변이된 Vλ1 배선 계열의 구성원으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 중쇄 CDR3에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 경쇄 CDR3에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 중쇄 CDR2에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 항원 결합부는 경쇄 CDR2에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 중쇄 CDR1에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 경쇄 CDR1에서 돌연변이를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체-암호화 핵산을 갖는 재조합 발현 벡터를 제공하며, 상기 벡터를 도입시킨 숙주 세포가 본 발명에 포함되고, 본 발명의 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 항체를 제조하는 방법도 본 발명에 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 IL-12의 활성을 중화시키고, 비비 IL-12, 마모셋 IL-12, 침팬지 IL-12, 시아노몰거스 원숭이 IL-12 및 레서스 원숭이 IL-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 하나 이상의 영장류를 중화시키지만, 마우스 IL-12의 활성을 중화시키지는 않는, 분리된 사람 항체, 또는 항원 결합부를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합부, 및 추가 제제 예를 들면, 치료제를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 예를 들면, J695를 사람 IL-12와 접촉시켜 사람 IL-12 활성을 억제시킴을 포함하여, 사람 IL-12 활성을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 사람 환자에게 본 발명의 항체, 예를 들면, J695를 투여하여 사람 환자에서 사람 IL-12 활성을 억제시킴을 포함하여, IL-12 활성이 유해한 질병을 앓는 사람 환자에서 사람 IL-12 활성을 억제시키는 방법을 제공한다. 상기 질병은 예를 들면, 크론 질병, 다발성 경화증 또는 류마티스성 관절염일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94로 이루어진 그룹으로부터 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위를 선택하고;
c) 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위를 각각 돌연변이시켜 일단의 제1 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하며;
d) 일단의 제1 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여 단일 선택적인 돌연변이유발 부위의 돌연변이가 예정된 표적 활성 또는 부분적인 표적 활성을 갖는 항체 또는 항원 결합부를 생산하는지를 결정하고;
e) 모 항체, 또는 이의 항원 결합부에, 개선된 활성을 갖는 것으로 밝혀진 개개의 돌연변이를 단계적인 방식으로 조합하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키며;
f) 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부가 예정된 표적 활성 또는 부분적인 표적 활성을 갖는지를 결정하 고;
g) 단계 d) 또는 f)가 예정된 표적 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성하지 않거나, 단지 부분적인 활성만을 갖는 항체를 형성하는 경우, H35, H50, H53, H54, H95, H97, H98, L30A 및 L96으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 부가적인 아미노산 잔기를 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜 일단의 제2 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고;
h) 일단의 제2 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여 H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A 및 L96으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단일 아미노산 잔기의 돌연변이가 예정된 표적 활성 또는 부분적인 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는지를 결정하고;
i) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 개선된 활성을 갖는 것으로 밝혀진 단계 g)의 개개의 돌연변이를 단계적인 방식으로 조합하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키며;
j) 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여 조합 항체 또는 이의 항원 결합부가 예정된 표적 활성 또는 부분적인 표적 활성을 갖는지를 결정하고;
k) 단계 h) 또는 j)가 예정된 표적 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성하지 않거나, 단지 부분적인 활성만을 갖는 항체를 생성하는 경우, H33B, H52B 및 L31A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 부가적인 아미노산 잔기를 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜 일단의 제3 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고;
l) 일단의 제3 돌연변이된 항체 또는 항원 결합부의 활성을 평가하여 H33B, H52B 및 L31A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단일 아미노산 잔기의 돌연변이가 예정된 표적 활성 또는 부분적인 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성하는지를 결정하고;
m) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 개선된 활성을 갖는 것으로 밝혀진 단계 k)의 개개의 돌연변이를 단계적인 방식으로 조합하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키고;
n) 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부가 예정된 표적 활성을 가지고 예정된 표적 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성하는지를 결정함을 포함하여, 예정된 표적 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 돌연변이를 위한 상보성 결정 영역(CDR)에서 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하여 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하며;
c) 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제조하고;
d) 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하며;
e) 단계 b) 내지 d)를 적어도 다른 하나의 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 대해서 반복하고;
f) 개선된 활성을 갖는 것으로 밝혀진 개개의 돌연변이를 모 항체, 또는 이의 항체 결합부에 조합하여, 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부를 형성하며;
g) 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 대해서 평가하여, 모 항체, 또는 이의 항원 결합부와 비교하여, 개선된 활성을 갖는 항체, 또는 이의 항원 결합부를 수득함을 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
한 가지 양태에서, 본 발명은,
a) 파아지 디스플레이 시스템에서 선택에 의해 수득되지만, 이의 활성이 파아지 디스플레이 시스템에서 돌연변이유발에 의해 추가로 개선되지 않는, 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이를 위한 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하여 선택된 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하며;
c) 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 두 개 이상의 아미노산 잔기로 돌연변이시켜 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고, 이를 비-파아지 디스플레이 시스템에서 발현시키고;
d) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 대해서 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하며;
e) 단계 b) 내지 d)를 적어도 하나 이상의 다른 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 반복하고;
f) 개선된 활성을 갖는 것으로 밝혀진 개개의 돌연변이를 모 항체, 또는 이의 항원 결합부에서 조합하여 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부를 형성시키며;
g) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 대해서 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 대해서 개선된 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득함을 포함하여, 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키기 위한 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 선택적인 돌연변이유발을 위한 잔기는 H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 더욱 바람직한 양태에서, 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 개선된 활성을 갖고 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이를 위한 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하여 선택적인 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하며;
c) 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제조하고 이를 적합한 발현 시스템내에서 발현시키고;
d) 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 대해서 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하며;
e) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 대해서 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 항체에 보유될 필요가 있는 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에 대해서 평가하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H35, H50, H52, H52A, H53, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, H34, L50, L52, L53, L55, L91, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, 바람직하게는 p70 p40/p35 이종이량체의 측면에서 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 다른 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체의 측면에서 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 선택적인 돌연변이유발을 위한 잔기는 H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 다른 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체의 측면에서 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹으로부터 선택되며 다른 특성은 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체의 측면에서 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 개선된 활성 및 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득할때까지,
a) 파아지 디스플레이 시스템에서 선택에 의해 수득되지만 이의 활성은 파아지 디스플레이 시스템에서 돌연변이유발에 의해 추가로 개선되지 않은, 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이를 위한 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하여 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하며;
c) 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 두 개 이상의 아미노산 잔기로 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제조하고, 이를 비-파아지 디스플레이 시스템에서 발현시키고;
d) 모 항체 또는 항원 결합부에 대해서, 일단의 돌연변이된 항체, 또는 항원 결합부의 활성을 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하며;
e) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 대해서, 개선된 활성 및 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득할 때까지, 보유될 필요가 있는 하나 이상의 특성 또는 특징에 대해서 일단의 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하며 평가하고;
f) 우선 선택적 돌연변이 유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 대해 단계 a) 내지 e)를 반복하며;
g) 모항체 또는 이의 항원 결합부에, 활성이 개선되고 하나 이상의 특성 또는 특징이 보유된 것으로 밝혀진 2개 이상의 활성 증진 아미노산 잔기를 조합하여 조합 항체 또는 항원 결합부를 형성시키고;
h) 조합 항체 또는 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 항원 결합부와 비교하고 평가하여 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키기 위한 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 다른 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체의 측면에서 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체의 측면에서 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 선택적인 돌연변이유발을 위한 잔기는 H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하여 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해서, 개선된 활성 및 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득할때 까지,
a) 파아지 디스플레이 시스템에서 선택에 의해서 수득되지만, 이의 활성은 파아지 디스플레이 시스템에서 돌연변이유발에 의해 추가로 개선되지 않은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이를 위한 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하여 선택된 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하며;
c) 선택된 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 각각 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고 이를 비-파아지 디스플레이 시스템에서 발현시키고;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하며;
e) 보유할 필요가 있는 하나 이상의 특성 또는 특징에 대해서, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키기 위한 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 선택적인 돌연변이유발을 위한 잔기는 H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해서 개선된 활성 및 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득할 때까지,
a) 파아지 디스플레이 시스템에서 선택에 의해 수득되지만, 이의 활성은 파아지 디스플레이 시스템에서 돌연변이유발에 의해서 추가로 개선되지 않은, 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이를 위한 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하여 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하며;
c) 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고 이를 비-파아지 디스플레이 시스템에서 발현시키고;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하며;
e) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 대해서 개선된 활성 및 하나 이상의 보유된 특성 및 특징을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득할 때까지, 보유될 필요가 있는 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에 대해서, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여,
f) 하나 이상의 다른 선택적인 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 대해서 단계 a) 내지 e)를 반복하고;
g) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 개선된 활성 및 하나 이상의 보유된 다른 특징을 갖는 것으로 밝혀진 두 개 이상의 각각의 활성 증진 아미노산 잔기를조합하여 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부를 형성시키며;
h) 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키기 위한 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 선택적인 돌연변이유발을 위한 잔기는 H30, H31, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94로 이루어진 그룹으로부터 선택되며 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다. 보다 바람직한 양태에서, 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹으로부터 선택되며 다른 특성들은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 개선된 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득할 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역에서 돌연변이를 위한 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96 이외의 아미노산 잔기를 선택하 고;
c) 선택적인 부위를 두 개 이상의 다른 아미노산으로 각각 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고;
d) 일단의 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하고;
e) 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에서의 변화에 대하여, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키기 위한 방법을 제공한다.
바람직하게는, 다른 특성 또는 특징은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해서 개선된 활성을 갖는 항체, 또는 항원 결합부를 수득할 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)내에서 돌연변이를 위한 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96 이외의 아미노산 잔기를 선택하고;
c) 선택적인 부위를 두 개 이상의 다른 아미노산으로 각각 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하며;
d) 일단의 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하고;
e) 단계 b)하에서 선택된 부위 또는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96의 부위도 아닌 하나 이상의 다른 CDR 부위에 대해서 단계 b) 내지 d)를 반복하고;
f) 개선된 활성을 갖는 것으로 밝혀진 두 개 이상의 각각의 활성 증진 아미노산 잔기를 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 조합하여 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부를 형성시키며;
g) 두 개의 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해서 개선된 활성을 갖는 항체, 또는 항원 결합부를 수득할 때까지,
a) 파아지 디스플레이 시스템에서 선택에 의해 수득되지만 이의 활성은 파아지 디스플레이 시스템에서 돌연변이유발에 의해서 추가로 개선될 수 없는, 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)내에서 돌연변이를 위한 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 이외의 아미노산 잔기를 선택하며;
c) 선택된 부위를 두 개 이상의 다른 아미노산으로 각각 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고 이를 비-파아지 디스플레이 시스템에서 발현시키고;
d) 일단의 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하며;
e) 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에서의 변화에 대해서, 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 다른 특징 또는 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해서 개선된 활성을 갖는 항체, 또는 항원 결합부를 수득할 때까지,
a) 파아지 디스플레이 시스템에서 선택에 의해 수득되지만 이의 활성은 파아지 디스플레이 시스템에서 돌연변이유발에 의해서 추가로 개선될 수 없는, 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)내에서 돌연변이를 위한 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98; H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96 이외의 아미노산 잔기를 선택하며;
c) 선택된 부위를 두 개 이상의 다른 아미노산으로 각각 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고 이를 비-파아지 디스플레이 시스템에서 발현시키고;
d) 일단의 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하며;
e) 단계 b)하에서 선택된 부위 또는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98; H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94의 부위도 아닌 하나 이상의 다른 CDR 부위에 대해서 단계 b) 내지 d)를 반복하고;
f) 개선된 활성을 갖는 것으로 밝혀진 두 개 이상의 각각의 활성 증진 아미노산 잔기를 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 조합하여 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부를 형성시키며;
g) 두 개의 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 다른 특징 또는 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해서 개선된 활성 및 하나 이상의 유지된 특성 또는 특징을 갖는 항체, 또는 항원 결합부를 수득할 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)내에서 돌연변이를 위한 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96 이외의 아미노산 잔기를 선택하며;
c) 선택적인 부위를 두 개 이상의 다른 아미노산으로 각각 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고;
d) 일단의 돌연변이된 항체, 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하며;
e) 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에 대해서, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하고;
f) 단계 b)하에서 선택된 부위 또는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96의 부위도 아닌 하나 이상의 다른 CDR 부위에 대해서 단계 b) 내지 e)를 반복하고;
g) 개선된 활성을 갖지만 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에는 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀진 두 개 이상의 각각의 활성 증진 아미노산 잔기를 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 조합하여 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부를 형성시키며;
h) 두 개의 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 개선된 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득할 때까지,
a) 파아지 디스플레이 시스템에서 선택에 의해 수득되지만 이의 활성이 파아지 디스플레이 시스템에서의 돌연변이유발에 의해서 추가로 개선되지는 않는, 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이를 위해 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, H34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96 이외의 아미노산 잔기를 선택하며;
c) 선택된 부위를 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 각각 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고 이를 비-파아지 디스플레이 시스템에서 발현시키고;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하고;
e) 하나 이상의 다른 특징 또는 특성에서의 변화에 대해서, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여, 항체 또는 항원 결합부의 친화도를 개선시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해서 개선된 활성 및 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징으로 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득할 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이를 위해 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L94 및 L96 이외의 아미노산 잔기를 선택하며;
c) 선택된 부위를 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 각각 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하며;
e) 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에 대해서, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하고;
f) b)하에서 선택된 부위 또는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96 이외의 하나 이상의 다른 CDR 부위에 대해서, 단계 b) 내지 e)를 반복하며;
g) 개선된 활성을 갖지만, 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에는 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀진 두 개 이상의 각각의 활성 증진 아미노산 잔기를 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 조합하여 하나 이상의 유지된 특성 또는 특징을 갖는 조합 항체, 또는 이의 항원 결합부를 형성시키고;
h) 두 개의 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성 및 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키기 위한 방법을 제공한다.
바람직하게는, 다른 특징 또는 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하고 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해서 개선된 활성 및 다른 특성 또는 특징을 보유하는 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득할 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이를 위해 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96 이외의 아미노산 잔기를 선택하며;
c) 선택된 부위를 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 각각 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하며;
e) 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에서의 변화에 대해서, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키고 다른 특성들에는 영향을 미치지 않는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 개선된 활성 및 하나 이상의 다른 보유된 특징 또는 특성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득할 때까지,
a) 파아지 디스플레이 시스템에서 선택에 의해 수득되지만 이의 활성이 파아지 디스플레이 시스템에서 돌연변이유발에 의해서는 추가로 개선되지 않는, 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고;
b) 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이를 위해서 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96 이외의 아미노산 잔기를 선택하며;
c) 선택된 부위를 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 각각 돌연변이시켜 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고 이를 비-파아지 디스플레이 시스템에서 발현시키고;
d) 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 개선된 활성 및 하나 이상의보유된 다른 특징 또는 특성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하며;
e) 단계 b)하에서 선택된 부위 또는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96 이외의 하나 이상의 다른 CDR 부위에 대해서, 단계 b) 내지 d)를 반복하고;
f) 개선된 활성을 갖으나 하나 이상의 다른 특징 또는 특성에 영향을 미치지 않는 두개 이상의 각각의 활성 증진 아미노산 잔기를 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 조합하여 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키며;
g) 두 개의 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성 및 하나 이상의 보유된 다른 특징 또는 특성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하고 평가하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 다른 특징 또는 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 에피토프 인식의 보존, 즉, p70 p40/p35 이종이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하여 유리된 가용성 p40으로부터 결합 방해를 예방 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
도 1A 및 1B는 배선 서열 Cos-3/JH3 및 Dpl18 Lv1042에 비해서, 사람 IL-12에 결합하는 일련의 사람 항체의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 배열을 나타낸다. 카뱃(Kabat) 번호는 아미노산 부위를 확인하기 위해서 사용한다. Joe 9 야생형에 있어서, 전장(full-length) 서열을 나타낸다. 다른 항체들에 있어서, 단지 Joe 9 야생형과 상이한 아미노산 부위만을 나타낸다.
도 1C 및 1D는 사람 IL-12에 결합하는 일련의 사람 항체의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 배열을 나타낸다. 카뱃 번호는 아미노산 부위를 확인하기 위해서 사용한다. Joe 9 야생형에 있어서, 전장 서열을 나타낸다. 다른 항체들에 있어서, 단지 Joe 9 야생형과 상이한 아미노산 부위만을 나타낸다.
도 2A 내지 2E는 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 돌변변이된 Y61 항체의 중쇄에서 CDR 부위를 나타내며, 각 부위에서 각각의 아미노산이 치환된다. 도면의 우측 그래프는 돌연변이되지 않은 Y61(흰 막대)과 비교하여 치환된 아미노산(검은 막대)에 대한 오프 속도를 나타낸다.
도 2F 내지 2H는 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 돌연변이된 Y61 항체의 경쇄에서 CDR 부위를 나타내며, 각 부위에서 각각의 아미노산이 치환된다. 도면의 우측 그래프는 돌연변이되지 않은 Y61(흰 막대)과 비교하여 치환된 아미노산(검은 막대)에 대한 오프 속도를 나타낸다.
도 3은 사이노몰거스 원숭이에서 혈장 네오프테린 수준에서 사람 항-IL-12 항체 J695의 생체내 효능을 입증한다.
도 4는 콜라겐을 사용하여 마우스를 면역화시킨 후 평균 관절염 득점 대 경과 일수의 그래프를 나타내며, 이는 C17.15를 사용한 처리가 랫트 IgG를 사용한 처리와 비교하여, 관절염-관련 증상을 현저하게 감소시킴을 입증한다.
본 발명을 보다 용이하게 이해시키기 위해서, 특정 용어를 우선 정의한다.
용어 "활성 증진 아미노산 잔기"는 항체의 활성을 개선시키는 아미노산 잔기를 포함한다. 활성 증진 아미노산 잔기는 접촉, 과돌연변이화 또는 우선 선택적 돌연변이유발 부위에서 아미노산 잔기를 치환시킬 수 있으며, 추가로 하나 이상의 활성 증진 아미노산 잔기는 하나 이상의 CDR에 존재할 수 있다. 활성 증진 아미노산 잔기는 항체의 결합 특이성/친화도, 예를 들면, 사람 IL-12에 결합하는 항-사람 IL-12 항체의 결합 특이성/친화도를 개선시키는 아미노산 잔기를 포함한다. 활성 증진 아미노산 잔기는 또한 항체의 중화 잠능, 예를 들면, 사람 IL-12를 억제하는 사람 IL-12 항체의 중화 잠능을 개선시키는 아미노산 잔기를 포함함을 의미한다.
용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 쇄, 이황화 결합에 의해 쇄내 결합된 두 개의 중(H) 쇄 및 두 개의 경(L) 쇄를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 접촉 부위를 포함한다. 중쇄 접촉 부위는 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL로 약술됨) 및 경쇄 접촉 부위를 포함한다. 경쇄 접촉 부위는 하나의 도메인, 즉 CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 보다 보존된 영역, 즉 골격 영역(FR)과 함께 초가변성 영역, 즉 상보성 결정 영역(CDR)으로 추가로 세분할 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR을 포함하며, 이는 아미노 말단에서 카복실 말단으로 순서대로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된다.
용어 항체(또는 "항체 일부")의 "항원 결합부"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편을 포함한다(예를 들면, hIL-12). 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 보인다. 용어 항체의 "항원 결합부"내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 일가 단편인, Fab 단편, (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결되는 두 개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인, F(ab')2 단편, (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546], 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 각각의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 이들을 단일 단백질 쇄(이때, VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 일가 분자를 형성한다)로서 제조할 수 있게 하는 합성 링커에 이해 재조합 방법으로 결합시킬 수 있다[참조: 예를 들면, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]. 상기 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원 결합부"내에 포함되는 것으로 의도된다. 다이아바디(diabody) 같은 단일쇄 항체의 다른 형태도 또한 포함된다. 다이아바디는, VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄로 발현되지만, 동일쇄 상에서 두 도메인 사이를 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커(linker)를 사용하여 결과적으로 도메인들이 서로 다른 쇄의 상보적인 영역과 쌍을 이루게 하여 두 개의 항원 결합부를 생성시키는, 이가 이특이성 항체이다[참조: 예를 들면, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al.(1994) Structure 2:1121-1123]. 또한, 항체 또는 이의 항원 결합부는 항체 또는 항체 일부과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드의 공유결합성 또는 비-공유결합성 연결에 의해 형성된, 보다 큰 면역흡착 분자의 일부일 수 있다. 상기 면역흡착 분자의 예는 스트렙토아비딘 코어 영역을 사용하여 사량체 scFv 단편[Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101]을 제고하는 것 및 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그를 사용하여 이가 및 바이오티닐화된 scFv 분자를 제조하는 것[Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058]을 포함한다. Fab 및 F(ab')2 같은 항체 일부는 각각, 파파인 또는 펩신 절단 같은 통상적인 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체 일부 및 면역흡착 분자는 본원에 기술되는 바와 같은, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 바람직한 항원 결합부는 완전한 도메인 또는 완전한 도메인의 쌍이다.
용어 "역돌연변이화"는 사람 항체의 체세포적으로 돌연변이된 아미노산의 일부 또는 모두가 상동성 배선 항체 서열로부터 상응하는 배선 잔기로 교체되는 과정을 의미한다. 본 발명의 사람 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 각각 최고의 상동성으로 서열을 확인하기 위해서 VBASE 데이타베이스내에서 배선 서열과 함께 배열시킨다. 본 발명의 사람 항체에서 차이점은 상기 상이한 아미노산을 암호화하는 정의된 뉴클레오타이드 부위를 돌연변이시킴으로써 배선 서열로 복귀시킨다. 역돌연변이화를 위한 후보로서 확인된 각각의 아미노산의 역할은 항원 결합에서 직접적인 또는 간접적인 역할에 대해서 조사되어야 하며 돌연변이화후 사람 항체의 모든 바람직한 특성에 영향을 미치는 것으로 확인된 모든 아미노산은 최종적인 사람 항체에 포함되지 않아야 한다: 예를 들면, 선택적인 돌연변이유발 방법에 의해서 확인된 활성 증진 아미노산은 역돌연변이화되지 않을 것이다. 제2 배선 서열은 당해 아미노산의 양측에서 10개 이상, 바람직하게는 12개 이상의 아미노산 정도가 본 발명의 사람 항체의 서열과 동일하거나 일치한다는 가정하에서, 이의 아미노산 부위가 가장 가까운 배선 서열과 상이하지만 제2 배선 서열에서 상응하는 아미노산과 동일한 것으로 확인되는 역돌연변이화되는 아미노산 수를 최소화시키는 것이 가능할 수 있다. 역돌연변이화는 항체 최적화의 모든 단계에서 일어날 수 있으며, 바람직하게는, 역돌연변이화는 선택적인 돌연변이유발 방법의 직전 또는 직후에 일어난다. 보다 바람직하게는, 역돌연변이화는 선택적인 돌연변이유발 방법 직전에 일어난다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "사람 인터류킨 12"(hIL-12 또는 IL-12로 약술됨)는 대식세포 및 수상 세포에 의해 주로 분비된다. 상기 용어는 이황화 결합에 의해 함께 결합되는 35kD 서브유니트(p35) 및 40kD 서브유니트(p40)을 포함하는 이종이량체 단백질을 포함한다. 사람 IL-12의 구조는 추가로 예를 들면, 문헌[Kobayashi, et al. (1989) J. Exp. Med. 170:827-845; Seder, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp. Med. 154:116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237]에 기술된다. 용어 '사람 IL-12'는 재조합 사람 IL-12(rh IL-12)를 포함하는 것으로 의도되며, 이는 표준 재조합 발현 방법으로 제조할 수 있다.
용어 "카뱃 번호", "카뱃 정의" 및 "카뱃 표지"는 상호교환적으로 본원에서 사용된다. 이러한 용어는 당해 분야에서 인지되며 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기 보다 더 가변적인(즉, 초가변성) 아미노산 잔기의 번호를 매기는 시스템을 의미한다[Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 and, kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]. 중쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 31 내지 35 부위, CDR2에 있어서 아미노산 50 내지 56 부위, 및 CDR3에 있어서 아미노산 95 내지 102 부위의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 24 내지 34 부위, CDR2에 있어서 아미노산 50 내지 56 부위, 및 CDR3은 아미노산 89 내지 97 부위의 범위이다.
카뱃 번호는 본원에서 본 발명의 항체에서 변형된 아미노산의 부위를 지시하는 것으로 사용된다. 예를 들면, Y61 항-IL-12 항체는 중쇄 CDR1의 31 부위에서 세린(S)이 글루탐산(E) (H31S⇒E)으로, 또는 경쇄 CDR3의 94 부위에서 글리신(G)이 티로신(Y) (L94G⇒Y)으로 돌연변이될 수 있다.
용어 "사람 항체"는 문헌[참조: Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Services, NIH Publication No. 91-3242]에 기술된 바와 같이 사람 배선 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 접촉 부위를 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 사람 항체는 예를 들면, CDR1 및 특히 CDR3에서, 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해서 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 랜덤 또는 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해서 또는 생체내 체세포성 돌연변이화에 의해서 도입된 돌연변이화)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이화는 본원에 기술된 "선택적인 돌연변이유발 방법"을 사용하여 도입된다. 사람 항체는 아미노산 잔기, 예를 들면, 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 활성 증진 아미노산 잔기로 교체된 하나 이상의 부위를 가질 수 있다. 사람 항체는 최고 20개 부위까지 사람 배선 면역글로불린 서열의 일부가 아닌 아미노산 잔기로 교체시킬 수 있다. 다른 양태에서, 10개 이하, 5개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하의 부위가 교체된다. 바람직한 양태에서, 이러한 교체는 하기 보다 상세히 기술되는 바와 같이 CDR 영역내에 존재한다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "사람 항체"는 마우스 같은 또 다른 포유동물 종의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 사람 골격 서열내로 이식되는 항체를 포함하지는 않는 것으로 의도된다.
용어 "재조합 사람 항체"는 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체(하기 II부에서 추가로 기술됨), 재조합 순열 사람 항체 라이브러리(하기 III부에서 추가로 기술됨), 사람 면역글로불린 유전자에 대해서 형질전환되는 동물(예를 들면, 마우스)로부터 분리된 항체[참조: 예를 들면, Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295], 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것과 관련되는 모든 다른 수단에 의해 제조, 발현, 야기 또는 분리된 항체 같은 재조합 방법으로 제조, 발현, 야기 또는 분리된 사람 항체를 포함한다. 상기 재조합 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 접촉 부위를 갖는다[참조: Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Servies, NIH Publication No. 91-3242]. 그러나, 특정 양태에서, 상기 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발시켜(또는, 사람 Ig 서열을 형질전환시킨 동물을 사용하는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발), 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열이 사람 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되거나 이와 관련된 서열인 반면, 생체내에서 사람 항체 배선 레퍼토리내에 천연적으로 존재하지는 않을 것이다. 그러나, 특정 양태에서 상기 재조합 항체는 선택적인 돌연변이유발 방법 또는 역돌연변이화 또는 둘 모두의 결과이다.
"분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체로부터 실질적으로 유리된 항체(예를 들면, hIL-12에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 hIL-12 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체로부터 실질적으로 유리된다)를 포함한다. hIL-12에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종의 IL-12 분자에 결합할 수 있다(하기에서 추가로 논의됨). 또한, 분리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질로부터 실질적으로 유리될 수 있다.
"중화 항체"(또는 "hIL-12 활성을 중화시키는 항체")는 hIL-12의 생물학적 활성의 억제를 초래하는 hIL-12에 결합하는 항체를 포함한다. hIL-12의 생물학적 활성의 이러한 억제는 식물성 혈구응집소 모세포 증식 분석(PHA)에서 사람 식물성 혈구응집소 모 세포 증식의 억제, 또는 사람 IL-12 수용체 결합 분석에서 수용체 결합의 억제(실시예 3: 인터페론-γ 유도 분석 참조) 같은 hIL-12 활성의 하나 이상의 지표를 측정함으로써 평가할 수 있다. 이러한 hIL-12 생물학적 활성의 지표는 당해 분야에 공지된 시험관내 또는 생체내 분석법에서 하나 이상의 수 개의 표준으로 평가할 수 있따(실시예 3 참조).
용어 "활성"은, 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도, 예를 들면, IL-12 항원에 결합하는 항-hIL-12 항체 및/또는 항체의 중화 잠능, 예를 들면, hIL-12에 결합하는 항-hIL-12 항체는 hIL-12의 생물학적 활성을 억제, 예를 들면, PHA 모세포 증식을 억제 또는 사람 IL-12 수용체 결합 분석에서 수용체 결합을 억제한다(실시예 3 참조).
용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들면, BIAcore 시스템(제조원: Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 사용하여, 생체센서 매트릭스내에서 단백질 농도의 변화를 검출함으로써 실시간 생체특이적인 상호작용의 분석을 가능케 하는 광학 현상을 포함한다. 추가의 기술에 대해서는, 실시예 5 및 문헌[Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Jonsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277]을 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Koff"는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리에 대한 오프 속도 상수를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미하는 것이다.
용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있지만, 이본쇄 DNA가 바람직하다.
hIL-12에 결합하는 항체 또는 항체 일부(예를 들면, VH, VL, CDR3)("분리된 항체" 포함)을 암호화하는 핵산에 대한 참조로 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분리된 핵산 분자"는, 항체 또는 항체 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hIL-12 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 항체 일부를 암호화하는 다른 뉴클레오타이드 서열을 비함유하는 핵산 분자를 포함하며, 상기 다른 서열은 사람 게놈 DNA에서 상기 핵산에 천연적으로 플랭킹(flanking)할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 항-IL-12 항체의 VH 영역을 암호화하는 본 발명의 분리된 핵산은 IL-12 이외의 항원에 결합하는 다른 VH 영역을 암호화하는 어떠한 다른 서열도 함유하지 않는다. 여구 "분리된 핵산 분자"는 또한 VH 및 VL 영역이 다이아바디(diabody)의 서열 이외의 어떠한 다른 서열도 함유하지 않는 다이아바디 같은 이가(divalent) 이특이성 항체를 암호화하는 서열을 포함한다.
용어 "벡터"는 이에 결합된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 이에 부가적인 DNA 단편이 결합될 수 있는 환형 이본쇄 DNA 루프를 의미한다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스성 벡터이며, 이때 부가적인 DNA 절편이 바이러스성 게놈내에 결합될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들면, 세균성 복제 오리진을 갖는 세균성 벡터 및 에피솜성 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들면, 비-에피솜성 포유동물 벡터)는 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈내로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 결합된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히, "발현 벡터")로서 인용한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이는 플라스미드는 가장 일반적으로 사용되는 벡터 유형이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 하는, 바이러스성 벡터(복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)같은 발현 벡터의 다른 형태를 포함한다.
용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히, "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 포함한다. 이는 상기 용어가 특정 당해 세포 뿐만 아니라 상기 세포의 자손 세포들도 의미하는 것으로 의도됨을 이해해야 한다. 돌연변이화또는 환경적인 영향으로 인해, 특정 변형이 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 상기 자손 세포들은 사실 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위내에 또한 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변형되는"은 항체 또는 이의 항원 결합부에서 하나 이상의 아미노산이 변화되는 것을 의미한다. 상기 변화는 하나 이상의 부위에서 아미노산의 부가, 치환 또는 결실에 의해서 생성될 수 있다. 상기 변화는 PCR 돌연변이유발 같은 공지된 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다.
용어 "접촉 부위"는 26개 공지된 항체-항원 구조 중 하나에서 항원과 접촉하는 아미노산에 의해서 점령되는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에서의 아미노산 부위를 포함한다. 항체-항원 복합체의 26개 공지의 규명된 구조 중 어느 하나에서 CDR 아미노산이 항원과 접촉하는 경우, 상기 아미노산은 접촉 부위를 점령하는 것으로 이해할 수 있다. 접촉 부위는 비-접촉 부위 보다 항원과 접촉하는 아미노산에 의해 보다 점령될 가능성이 높다. 바람직하게는, 접촉 부위는 26개 구조 중 3개 이상(> 11.5%)에서 항원과 접촉하는 아미노산을 함유하는 CDR 부위이다. 가장 바람직하게는, 접촉 부위는 25개 구조 중 8개 이상(> 32%)에서 항원과 접촉하는 아미노산을 함유하는 CDR 부위이다.
용어 "과돌연변이화 부위"는 항체의 생체내 친화도 성숙 동안 체세포성 과돌연변이화에 대한 높은 빈도 또는 가능성을 갖는 것으로 생각되는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역내의 부위를 점령하는 아미노산을 포함한다. "체세포성 과돌연변이화에 대한 높은 빈도 또는 가능성"은 항체의 생체내 친화도 성숙 동안 잔기가 체세포성 과돌연변이를 진행하게 되는 5 내지 약 40% 변화의 빈도 또는 가능성을 포함한다. 이는 상기 언급된 범위내의 모든 범위, 예를 들면, 5 내지 약 30%, 5 내지 약 15%, 또는 15 내지 약 30%는 본 발명의 일부로 의도됨을 이해해야 한다.
용어 "우선 선택적 과돌연변이 유발 부위"는 접촉 부위 및 과돌연변이화 부위 모두로서 생각될 수 있는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역내 부위를 점령하는 아미노산을 포함한다.
용어 "선택적인 돌연변이유발 방법"은 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 과돌연변이화 및/또는 접촉 부위 하나 이상에서 CDR 아미노산을 선택하고 각각 돌연변이시킴으로써 항체의 활성을 개선시키는 방법을 포함한다. "선택적으로 돌연변이시킨" 사람 항체는 선택적인 돌연변이유발 방법을 사용하여 선택된 부위에서 돌연변이를 함유하는 항체이다. 또 다른 양태에서, 선택적인 돌연변이유발 방법은 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3(이후, 각각 H1, H2, 및 H3) 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3(이후, 각각 L1, L2 및 L3)에서 선택된 각각의 아미노산 잔기를 바람직하게 돌연변이시키는 방법을 제공함을 의미한다. 아미노산 잔기는 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이 유발 부위에서 선택될 수 있다. 각각의 아미노산은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에서의 이의 부위에 기초하여 선택된다. 이는 과돌연변이화 부위가 또한 접촉 부위일 수 있다는 것을 이해해야 한다. 한 가지 양태에서, 선택적인 돌연변이유발 방법은 "표적화된 방법"이다. 용어 "표적화된 방법"은 표적화된 방식, 예를 들면, "그룹형 표적화된 방법" 또는 "CDR형 표적화된 방법"으로 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에서 선택된 각각의 아미노산 잔기를 바람직하게 돌연변이시키는 방법을 포함한다. "그룹형 표적화된 방법"에서, 특정 그룹내 각각의 아미노산 잔기를 그룹 I(L3 및 H3 포함), II(H2 및 L1 포함) 및 III(L2 및 H1 포함)[그룹은 표적화를 위해 바람직한 순서로 목록화한다]을 포함하는 선택적인 돌연변이를 위해 표적화시킨다. "CDR형 표적화 방법"에서, 특정 CDR내 각각의 아미노산 잔기는 H3, L3, H2, L1, H1 및 L2의 표적화에 바람직한 순서로 선택적인 돌연변이에 대해서 표적화된다. 선택된 아미노산 잔기는 예를 들면, 두 개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이되며 항체 활성에서의 돌연변이유발효과를 측정한다. 활성은 항체의 결합 특이성/친화도 및/또는 항체의 중화 잠능에서의 변화로서 측정한다. 선택적인 돌연변이유발 방법은 파아지 디스플레이, 사람 IgG 배선 유전자를 사용하여 형질전환된 동물, 사람 B 세포로부터 분리된 사람 항체를 포함하는 모든 공급원으로부터 유래된 모든 항체의 최적화를 위해서 사용할 수 있다. 바람직하게는, 선택적인 돌연변이유발 방법은 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 추가로 최적화시킬 수 없는 항체상에서 사용한다. 파아지 디스플레이, 사람 IgG 배선 유전자를 사용하여 형질전환된 동물, 사람 B 세포로부터 분리된 사람 항체를 포함하는 모든 공급원으로부터의 항체가 선택적인 돌연변이유발 방법 전 또는 후에 역돌연변이시킬 수 있음을 이해해야 한다.
용어 "활성 증진 아미노산 잔기"는 항체의 활성을 개선시키는 아미노산 잔기를 포함한다. 활성 증진 아미노산 잔기는 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 아미노산 잔기를 교체시킬 수 있고 추가로 하나 이상의 활성 증진 아미노산 잔기는 하나 이상의 CDR 내에 존재할 수 있음을 이해해야 한다. 활성 증진 아미노산 잔기는 항체의 결합 특이성/친화도, 예를 들면, 사람 IL-12에 결합하는 항-사람 IL-12 항체의 결합 특이성/친화도를 개선시키는 아미노산 잔기를 포함한다. 활성 증진 아미노산 잔기는 또한 항체의 중화 잠재능, 예를 들면, 사람 IL-12를 억제하는 사람 IL-12 항체의 중화 잠재능을 개선시키는 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 다양한 양상이 아래 항목에서 보다 상세히 기술될 것이다.
1. 사람 IL-12에 결합하는 사람 항체
본 발명은, 사람 IL-12에 결합하는 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 사람 항체는 재조합된 중화 사람 항-hIL-12 항체이다. 사람 IL-12에 결합하는 본 발명의 항체는, 예를 들면 실시예 1에 기술된 바와 같은 파아지 디스플레이 기술에 의해, hIL-12를 사용하여 하나 이상의 사람 VL 및 VH cDNA 라이러브리를 스크리닝하는 방법으로 선별될 수 있다. 사람 VL 및 VH cDNA 라이러브리의 스크리닝을 통해 처음에 일련의 항-IL-12 항체가 확인되었으며, 이중 본원에서 "Joe 9"(또는 "Joe 9 야생형")으로 지칭되는 하나의 항체가 추가 개발을 위해 선별된다. Joe 9는 비교적 낮은 친화성의 사람 IL-12 항체(예: Koff 약 0.1초-1)이지만, 특이적으로 hIL-12에 결합하여 이를 검출하는데 유용하다. Joe 9 항체의 친화성은, 중쇄 및 경쇄 CDR의 돌연변이유발을 수행하여, "혼합 및 정합되고(mix and match)" 또한 돌연변이된 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 패널을 생성시켜, 다수의 추가적 항-hIL-12를 유도하여 hIL-12의 친화성을 증가시킴으로써 향상될 수 있다[참조: 실시예 1, 표 2(별첨 A) 및 도 1A 내지 D의 서열 정렬 참조].
이들 항체중, 본원에서 Y61로서 지칭되는 사람 항-hIL-12 항체가 결합 친화성측면에서 상당히 향상됨이 입증되었다(예: Koff 약 2 x 10-4 초-1). Y61 항-hIL-12 항체를, 중쇄 및 경쇄 CDR내의 특정 아미노산 잔기를 각각 돌연변이시켜, 추가적 친화성 성숙에 대해 선별한다. Y61의 아미노산 잔기는, 바람직한 선별적 돌연변이유발 부위, 접촉 및/또는 과돌연변이화 부위를 점하는 아미노산 잔기를 기초로 한 부위-특이적 돌연변이(선별 돌연변이유발법)에 대해 선별한다. 중쇄 및 경쇄 CDR내의 선택된 부위에서의 치환에 관한 요약은 도 2A 내지 2H에 제시되어 있다. 본원에서 J695로서 지칭되는 바람직한 본 발명의 재조합 중화 항체는, Y61의 경쇄 CDR2의 부위 50에서의 Gly로 부터 Tyr로의 치환, 및 Y61의 경쇄 CDR3의 부위 94에서의 Gly로 부터 Tyr로의 치환의 결과로 생성된다.
본 발명의 항-IL-12 항체의 패널의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 정렬이, Joe 9 야생형 내지 J695 계열에 대해, 도 1A 내지 1D에 도시되어 있다. 서열 정렬을 통해, hIL-12에 결합하는 본 발명의 바람직한 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 보존 영역 서열 뿐만 아니라 CDR3, CDR2, 및 CDR1에 대한 보존 영역 서열의 확인이, Joe 9 야생형 내지 J695 계열에 대해, 가능하게 되었다. 게다가, 도 2A 내지 2H에 요약된 Y61 돌연변이유발 분석을 통해, hIL-12에 결합하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 보존 영역 서열 뿐만 아니라 hIL-12에 결합하는 CDR3, CDR2, 및 CDR1에 대한 보존 영역 서열의 확인이, Y61로 부터 변형되었으나 여전히 양호한 hIL-12 결합 특성을 보유하는 서열을 포함하는 Y61 내지 J695 계열에 대해, 가능하게 되었다. 첨부된 서열 목록에서 서열 확인 식별인자에 의해 확인된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 CDR, VH 및 VL 서열(보존 영역 서열 포함)이 아래에 요약되어 있다.
Figure 112001024650765-pct00001
Figure 112001024650765-pct00002
Figure 112001024650765-pct00003

Joe 9 야생형의 친화성 성숙으로 부터 생성된 항체는 표면 플라스몬 공명(suface plasmon resonance) 분석에 의해 Kd 및 Koff 속도를 측정함으로써 기능적 특징이 결정된다. 약 0.1s-1 내지 약 1x10-5s-1의 범위, 보다 바람직하게는 약 1x10-4s-1 내지 1x10-5s-1의 범위 내의 Koff를 갖는 일련의 항체가 생성된다. 또한, 실시예 3에 기술된 바와 같이, 항체는 식물성 혈구응집소(PHA) 모세포(blast) 증식을 억제할 수 있는 이들의 능력에 대한 시험관내 특징이 결정된다. 약 1x10-6M 내지 약 1x10-11M의 범위, 보다 바람직하게는 약 1x10-10M 내지 1x10-11M의 범위내의 IC50 값을 갖는 일련의 항체가 생성된다.
따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 분리된 사람 IL-12에 결합하는 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 이들은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 0.1s-1의 Koff 속도 상수로서 사람 IL-12로 부터 해리되거나, 시험관내 식물성 혈구응집소 모세포 증식 분석 (PHA)에서 1x10-6M 이하의 IC50 값으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제한다. 바람직한 양태에서, 분리된 사람 IL-12 항체, 또는 이의 항원 결합부는 1x 10-2s-1 이하의 Koff 속도 상수로서 사람 IL-12로 부터 해리되거나, 시험관내 PHA 분석에서 1x10-7M 이하의 IC50 값으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제한다. 보다 바람직한 양태에서, 분리된 사람 IL-12 항체, 또는 이의 항원 결합부는 1x 10-3s-1 이하의 Koff 속도 상수로서 사람 IL-12로 부터 해리되거나, 시험관내 PHA 분석에서 1x10-8M 이하의 IC50 값으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제한다. 보다 더욱 바람직한 양태에서, 분리된 사람 IL-12 항체, 또는 이의 항원 결합부는 1x 10-4s-1 이하의 Koff 속도 상수로서 사람 IL-12로 부터 해리되거나, 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50 값으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제한다. 보다 더 바람직한 양태에서, 분리된 사람 IL-12 항체, 또는 이의 항원 결합부는 1x 10-5s-1 이하의 Koff 속도 상수로서 사람 IL-12로 부터 해리되거나, 시험관내 PHA 분석에서 1x10-10M 이하의 IC50 값으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제한다. 보다 더욱 바람직한 양태에서, 분리된 사람 IL-12 항체, 또는 이의 항원 결합부는 1x 10-5s-1 이하의 Koff 속도 상수로서 사람 IL-12로 부터 해리되거나, 시험관내 PHA 분석에서 1x10-11M 이하의 IC50 값으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제한다.
IL-12 항체의 해리 속도 상수(Koff)는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 수 있다(실시예 5 참조). 일반적으로, 표면 플라스몬 공명 분석은, BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 리간드(바이오센서 매트릭스상에 고정된 재조합 사람 IL-12)와 피분석물(용액중의 항체)사이의 실시간 결합 상호작용을 측정한다. 또한, 표면 플라스몬 분석은 피분석물(바이오센서 매트릭스상의 항체)을 고정하고 리간드(용액중의 재조합 IL-12)를 제시하는 방법으로 수행될 수 있다. IL-12 항체 또는 이의 항원 결합부의 중화 활성은 하나 이상의 적절한 시험관내 분석을 사용하여 산정할 수 있다(실시예 3 참조).
항체 중쇄 및 경쇄 CDR은 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에 있어서 중요한 역할을 한다는 것이 익히 공지되어 있다. 따라서, 본 발명은 Joe 9의 경쇄 및 중쇄 CDR을 갖는 사람 항체 뿐만 아니라, 항체의 결합 특이성/친화성이 향상되도록 변형된 CDR을 갖는 다른 항체도 포함한다. 실시예 1에서 입증되는 바와 같이, 경쇄 및 중쇄 CDR에 대한 일련의 변형은 사람 항-hIL-12 항체의 친화성 성숙을 초래한다. 사람 IL-12에 결합하는 Joe 9 야생형 내지 J695에 이르는 일련의 사람 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 정렬이 도 1A 내지 1D에 도시되어 있다. 항체의 CDR에 대한 보존 영역 서열 모티프는 서열 정렬로 부터 결정될 수 있다(상기 표에 요약되어 있는 바와 같음). 예를 들면, Joe 9 내지 J695 계열의 VH CDR3에 대한 보존 영역 모티프는 아미노산 서열 (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y)(서열 1)(이는 서열 7에 제시된 보존 영역 HCVR의 부위 95 내지 102의 아미노산을 포함한다)을 포함한다. VL CDR3에 대한 보존 영역 모티프는 아미노산 서열 Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)-(L/F/T/S)-(R/S/T/W/H)-(G/P)-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L-V/I/T/M/L)(서열 2)(이는 서열 8에 제시된 보존 영역 lCVR의 부위 89 내지 97의 아미노산을 포함한다)을 포함한다.
따라서, 또 다른 양상에서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-6M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고,
b) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR를 가지며,
c) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 갖는 특징을 지니는 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 양태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G(서열 3)(이는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 보존 영역 HCVR의 부위 50 내지 65의 아미노산을 포함한다)을 포함하는 VH CDR2를 추가로 포함하고, 아미노산 서열 (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S (서열 4)(이는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 보존 영역 LCVR의 부위 50 내지 56의 아미노산을 포함한다)를 포함하는 VL CDR2를 추가로 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H(서열 5)(이는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 보존 영역 HCVR의 부위 27 내지 35의 아미노산을 포함한다)을 포함하는 VH CDR1을 추가로 포함하고, 아미노산 서열 (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H) (서열 6)(이는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 보존 영역 LCVR의 부위 24 내지 34의 아미노산을 포함한다)를 포함하는 VL CDR1를 추가로 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체는, 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
추가적 보존 영역 모티프는, J695 항체로 유도되는 Y61상에서 수행된 돌연변이화분석을 토대로 결정될 수 있다(도 2A 내지 2H에 요약되어 있음). 도 2A 내지 2H에 도시된 그래프에 의해 입증되는 바와 같이, Y61의 중쇄 및 경쇄의 특정 잔기는 항체의 hIL-12 결합 특성을 크게 손상시키지 않으면서 치환될 수 있다. 예를 들면, CDR H1중의 부위 30을 12개의 상이한 아미노산 잔기로 각각 치환하여도 항체의 Koff 속도가 크게 감소하지 않는데, 이는 각종 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있는 부위임을 나타낸다. 따라서, 돌연변이화연구(즉, 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있는 Y61내의 부위)를 토대로 하여, 보존 영역 모티프를 결정한다. 중쇄 및 경쇄 CDR3에 대한 보존 영역 모티프는 각각 서열 9 및 10에 제시되어 있으며, 중쇄 및 경쇄 CDR2에 대한 보존 영역 모티프는 각각 서열 11 및 12에 제시되어 있고, 중쇄 및 경쇄 CDR1에 대한 보존 영역 모티프는 각각 서열 13 및 서열 14에 제시되어 있다. VH 및 VL에 대한 보존 영역 모티프는 각각 서열 15 및 16에 제시되어 있다.
따라서, 하나의 양상으로서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하며,
b) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 갖고,
c) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는 특징을 지니는 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 양태에서, 상기 항체는, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 추가로 포함하고, 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2를 추가로 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 상기 항체는, 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1을 추가로 포함하고, 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1을 추가로 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체는, 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, 및 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
본 발명의 바람직한 항체인, 사람 항-hIL-12 항체 Y61은 CDR3의 PCR 돌연변이유발법에 의한 Joe 9 야생형의 친화성 성숙에 의해 생성된다(실시예 1 참조). Y61은 표면 플라스몬 공명 및 시험관내 중화 분석에 의해 측정된 바에 따르면 향상된 특이성/결합 친화성을 갖는다. Y61의 중쇄 및 경쇄 CDR은 각각 서열 17 및 18에 제시되어 있으며, Y61의 중쇄 및 경쇄 CDR2는 각각 서열 19 및 20에 제시되어있으며, Y61의 중쇄 및 경쇄 CDR1은 서열 21 및 22에 제시되어있다. Y61의 VH는 서열 23의 아미노산 서열을 가지며, Y61의 VL은 서열 24의 아미노산 서열을 갖는다(이들 서열은 또한 도 1A 내지 1D에, Joe9와 함께 정렬되어 도시되어 있다).
따라서, 또 다른 양상으로서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하며,
b) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 갖고,
c) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는 특징을 지니는 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 가진다.
또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 가진다.
또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 양태에서, 전체 길이의 항체는 중쇄 접촉 부위, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 접촉 부위, 및 이들내의 임의의 동종이형(allotype) 변이체를 포함한다[참조 문헌: Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunnological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human and Human Services, NIH Publication No. 91-3245]. 바람직하게는, 상기 항체의 중쇄 접촉 부위는 IgG1 중쇄 접촉 부위이다. 달리, 항체 일부는 Fab 단편, F(ab'2) 단편, 또는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다.
Y61의 각각의 잔기의 변형은 도 2A 내지 2H에 도시된 일단의 항체의 생성을 유도한다. 각 항체의 특이성/결합 친화성은 표면 플라스몬 공명 및/또는 시험관내 중화 분석에 의해 결정된다.
따라서, 또 다른 양상으로서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고,
b) 서열 404 내지 서열 469로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 가지며,
c) 서열 534 내지 서열 579로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 335 내지 서열 403으로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 506 내지 서열 533으로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 가진다.
또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 288 내지 서열 334로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR1, 및 서열 470 내지 서열 505로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 가진다.
또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 23의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 양태에서, 전체 길이의 항체는 중쇄 불변 영역, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역, 및 이들내의 임의의 동종이형 변이체를 포함한다[참조 문헌: Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunnological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human and Human Services, NIH Publication No. 91-3245]. 바람직하게는, 상기 항체의 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역이다. 달리, 일부 항체는 Fab 단편, F(ab'2) 단편, 또는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 재조합 중화 항체인 J695는 항체 Y61의 접촉성 및 과돌연변이화성 아미노산 잔기의 부위-특정 돌연변이유발에 의해 생성된다[참조: 실시예 2 및 이하 III부). J695는, 경쇄 CDR2의 부위 50에서 Y61중의 Gly가 Tyr로 치환되고, 경쇄 CDR3의 부위 94에서 Gly가 Tyr로 치환되는 점에서 Y61과는 상이하다. J695의 중쇄 및 경쇄 CDR3는 각각 서열 25 및 26에 제시되어 있고, J695의 중쇄 및 경쇄 CDR2는 각각 서열 27 및 28에 제시되어 있으며, J695의 중쇄 및 경쇄 CDR1은 각각 서열 29 및 30에 제시되어 있다. J695의 VH는 서열 31의 아미노산 서열을 가지며, J695의 VL은 서열 32의 아미노산 서열을 갖는다(이들 서열은 또한 도 1A 내지 1D에, Joe9과 함께 정렬되어 도시되어 있다).
따라서, 또 다른 양상으로서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하며,
b) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 갖고,
c) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 27의 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 가진다.
또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 29의 아미노산을 포함하는 중쇄 CDR1, 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 가진다.
또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 서열 31의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 양태에서, 전체 길이의 항체는 중쇄 불변 영역, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역, 및 이들내의 임의의 동종이형 변이체를 포함한다[참조 문헌: Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunnological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human and Human Services, NIH Publication No. 91-3245]. 바람직하게는, 상기 항체의 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역이다. 달리, 항체 일부는 Fab 단편, F(ab'2) 단편, 또는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다.
Joe 9 내지 J695 계열, 또는 Y61 내지 J695 계열에 있어서, CDR3, CDR2, 및 CDR1에 대한 바람직한 보존 영역 서열중에 추가로 돌연변이를 형성시킴으로써, 본 발명의 항-IL-12 항체를 추가로 제공한다. 이러한 변형 방법은 표준 분자생물학 기술, 예를 들면, 경쇄 및/또는 중쇄 CDR중의 접촉 아미노산 잔기 또는 과돌연변이화 아미노산 잔기 각각을 표적으로 하는 PCR 돌연변이유발법을 사용한 후, 본원에 기술된 변형된 항체의 역학적 및 기능적 분석(예: 실시예 3에 기술된 중화 분석, 및 실시예 5에 기술된 BIAcore 분석)에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 또 다른 양상으로서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-6M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고,
b) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 우선 선택적 돌연변이유발 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 이의 돌연변이체(이들 돌연변이체는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함하는 항체 보다 10배 이하로 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하며,
c) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 우선 선택적 돌연변이유발 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산 이 치환된 돌연변이체(이들 돌연변이체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 포함하는 항체 보다 10배 이하로 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
또 다른 양상으로서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고,
b) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 이의 돌연변이체(이들 돌연변이체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함하는 항체 보다 10배 이하로 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하며,
c) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 돌연변이체(이들 돌연변이체는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 포함하는 항체 보다 10배 이하로 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
또한, 당업자는 예를 들면 Y61 또는 J695에 본 발명의 항체의 CDR 영역에 대한 추가적 돌연변이를 형성시켜 본 발명의 추가적 항-IL-12 항체를 제공할 수 있다고 생각할 것이다. 이러한 변형 방법은 상기한 바와 같은 표준 분자생물학 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 변형된 항체의 기능적 및 역학적 분석은 각각 실시예 3 및 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. J695의 확인으로 이어지는 Y61의 개개의 잔기의 변형은 도 2A 내지 2H에 도시되어 있고, 실시예 2에 기술되어 있다.
따라서, 또 다른 양상으로서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고,
b) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 우선 선택적 돌연변이유발 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 이의 돌연변이체(이들 돌연변이체는 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함하는 항체 보다 10배 이하로 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하며,
c) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 우선 선택적 돌연변이유발 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 이의 돌연변이체(이들 돌연변이체는 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 포함하는 항체 보다 10배 이하로 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
따라서, 또 다른 양상으로서, 본 발명은,
a) 시험관내 PHA 분석에서 1x10-9M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고,
b) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 우선 선택적 돌연변이유발 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 이의 돌연변이체(이들 돌연변이체는 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함하는 항체 보다 10배 이하로 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하며,
c) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 우선 선택적 돌연변이유발 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 이의 돌연변이체(이들 돌연변이체는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 포함하는 항체 보다 10배 이하로 높은 Koff 속도를 갖는다)를 포함하는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 사람 IL-12, 및 비비 IL-12, 마모셋 IL-12, 챔팬지 IL-12, 사이노몰구스 IL-12 및 레서스 IL-12로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 영장류 IL-12의 활성을 중화시키나, 마우스 IL-12의 활성을 중화시키지 않는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
II. 재조합 사람 항체의 선별
본 발명의 재조합 사람 항체는, 사람 림프구로 부터 유래된 mRNA로 부터 제조된 사람 VL 및 VH cDNA를 사용하여 제조된, 재조합 조합성 항체 라이브러리, 바람직하게는 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리될 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 제조하기 위한 시판중인 키트(예: Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카달로그 제27-9400-01호; 및 Stra태그ene SurfZAPTM 파아지 디스플레이 키트. 카달로그 제240612호)에 부가하여, 항체 디스플레이 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는데 특히 사용될 수 있는 방법 및 시약의 예를 다음 문헌에서 찾아 볼 수 있다: 참조: Kang et al., PCT 공개공보 WO 92/18619; Winter et al. PCT 공개공보 WO 92/20791; Breitling et al., PCT 공개공보 WO 93/01288; McCafferty et al. PCT 공개공보 WO 92/01047; Garrard et al. PCT 공개공보 WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCaffety et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:33576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; and Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982.
이러한 방법에서 사용된 항체 라이브러리는 바람직하게는 사람 VL 및 VH cDNA로 부터 제조된 scFv 라이브러리이다. scFv 항체 라이브러리는 바람직하게는 재조합 사람 IL-12를 항원으로서 사용하여, IL-12에 대해 결합 활성을 갖는 사람 중쇄 및 경쇄 서열을 선별하여 스크리닝한다. IL-12의 p35 서브유니트 또는 p70 이종이량체에 특이적인 항체를 선별하기 위하여, 스크리닝 분석을 과량의 유리 p40 서브유니트의 존재하에 수행한다. 서브유니트 선호는, 실시예 1에 기술된 바와 같이, 예를 들면 미세-프리구엣(Friguet) 적정에 의해 결정될 수 있다.
일단 초기 사람 VL 및 VH 절편이 선택되면, 선택된 VL 및 VH 절편의 상이한 쌍을 IL-12 결합에 대해 스크리닝하는 "혼합 및 정합(mix and match)" 실험을 수행하여 바람직한 VL/VH 쌍 조합체를 선별한다(참조 실시예 1). 추가로, hIL-12 결합에 대한 친화성을 더욱 향상시키고/거나 hIL-12 결합에 대한 해리 속도 상수를 저하시키기 위해, 바람직한 VL/VH 쌍의 VL 및 VH 절편을, 천연 면역 반응중에 항체의 친화성 성숙에 관여하는 생체내 체세포 돌연변이화과정과 유사한 과정에서, 바람직하게는 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역내에서 무작위로 돌연변이시킨다. 이러한 시험관내 친화성 성숙은 VH CDR3 또는 VL CDR3에 상보적인 PCR 프라이머를 각각 사용하여 VH 및 VL 영역을 증폭시킴으로써 달성될 수 있으며, 이때 프라이머는 특정 부위에서 4개의 뉴클레오타이드 염기의 무작위 조합물과 스파이킹(spiking)되어, 생성된 PCR 생성물은 무작위 돌연변이가 VH 및/또는 VL CDR3 영역내에 도입되어진 VH 및 VL 절편을 암호화하게 된다. 이들 무작위로 돌연변이된 VH 및 VL 절편을 hIL-12에 대한 결합에 대해 재선별하고 재스크리닝하고, IL-12 결합에 대해 높은 친화성 및 낮은 해리 속도를 나타내는 서열을 선별한다. 표 2(별첨 A)는, 시험관내 친화성 성숙의 결과로서 생성된, 변형된 결합 특이성/친화성을 나타내는 항체를 제시한다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로 부터 본 발명의 항-hIL-12 항체를 선별, 분리 및 스크리닝한 후, 선별된 항체를 암호화하는 핵산을 파아지 입자(예: 파이지 게놈)로 부터 회수하여, 표준 재조합 DNA 기술에 의해 다른 발현 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 경우에 따라, 핵산을 추가로 조작하여, 본 발명의 다른 항체형(예: 추가적 불변 영역과 같은 추가적 면역글로불린 도메인을 암호화하는 핵산에 연결된 형)을 작제할 수 있다. 조합 라이브러리를 스크리닝하여 분리된 재조합 사람 항체를 발현시키기 위하여, 후술되는 IV부에서 상세히 기술되는 바와 같이, 당해 항체를 암호화하는 DNA를 재조합 발현 벡터에 클로닝하고 포유동물 숙주 세포에 도입한다.
파이지 디스플레이 기술에 의해 사람 IL-12 조합 항체를 선별하는 방법, 및 CDR 영역의 무작위 또는 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 선별된 항체의 친화성 성숙은 실시예 1에 보다 상세히 기술되어 있다.
실시예 1에 기술된 바와 같이, 사람 VL 및 VH cDNA 라이브러리의 스크리닝에 의해, 일련의 항-IL-12 항체가 확인되며, 이중 Joe 9 항체가 추가 개발을 위해 선별된다. Joe 9의 중쇄 가변 영역과 VBASE 데이타베이스로 부터 선택된 중쇄 배선 서열과의 비교를 통해, Joe 9이 COS-3 배선 서열과 유사하다는 것이 밝혀졌다. COS-3은 배선 서열의 VH3 계열에 속한다.
VH3 계열은, 뉴클레오타이드 서열 상동성을 기준으로, 7개의 계열, VH1 내지 VH7의 그룹으로 분류되는 사람 VH 배선 레퍼토리의 일부이다[참조 문헌: Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 and Cook et al. (1995) Immunology Today, 16, 237-242]. VH3 계열은 가장 많은 수의 구성원을 포함하고, 배선 레포토리에서 가장 큰 역할을 한다. 임의의 주어진 사람 VH3 배선 항체 서열의 경우, 전체 VH3 계열내의 아미노산 서열 동일성이 높다[참조 문헌: Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 and Cook et al. (1995) Immunology Today, 16, 237-242]. VH3 계열의 임의의 두 개의 배선 VH 서열사이의 아미노산 서열 동일성의 범위는 약 100개 VH 잔기중 69 내지 98개 잔기로 다양하다(즉, 임의의 두 개의 배선 VH 서열사이의 69 내지 98% 아미노산 서열 상동성). 대부분의 배선 서열의 쌍의 경우, 80개 이상의 동일한 아미노산 잔기가 존재한다(즉, 80% 이상의 아미노산 서열 상동성). VH3 계열 구성원간의 고도의 아미노산 서열 상동성은 CDR, 및 VH 쇄의 골격 영역내의 주요 부위에 존재하는 특정 아미노산 서열로 인한 것이다. 이들 아미노산 잔기는 CDR에 구조적 특징을 부여한다.
항체 구조의 연구로 부터, CDR 입체형태가, CDR 및 골격 영역내의 특정 부위를 점유하는 주요 아미노산 잔기를 기준으로 하여, 표준 CDR 구조의 계열로 분류될 수 있다. 결과적으로, 주요 아미노산 잔기를 포함하는 표준 구조를 갖는 상이한 항체중에 유사한 국소 CDR 입체형태가 존재한다[Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917 and Chothia et al. (1989) Nature, 342, 877-833]. VH3 계열내에는, CDR1 및 CDR2 표준 구조에 대한 주요 부위에 아미노산 잔기 동일성이 보존된다[Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 799-817].
COS-3 배선 VH 유전자는 VH3 계열의 구성원이고, 3-30(DP-49) 배선 VH 대립유전자의 변이체이다. COS-3은 단지 부위 5에서 Joe9 VH 아미노산 서열과 상이하다. 또한, Joe9 VH와 COS-3간, 및 Joe9 VH와 다른 VH3 계열 구성원간의 고도의 아미노산 서열 상동성은 고도의 CDR 구조 상동성을 부여한다[Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 799-817; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917 and Chothia et al. (1989) Nature, 342, 877-883].
당업자는, Joe 9에 대한 고도의 아미노산 서열 및 표준 구조적 유사성을 기초로 하여, 다른 VH3 계열이 사람 IL-12에 결합하는 항체를 제조하는데 사용될 수 있다고 생각할 것이다. 이는, 예를 들면 쇄-셔플링(chain-shuffling) 기술[Winter et al. (1994) Annual Rev. Immunol., 12, 433-55]에 의해 적당한 VL을 선택하거나, 본 발명의 항체로 부터의 CDR을 포함하여 설치류 또는 다른 사람 항체로 부터의 CDR을 VH3 계열 골격에 이식함으로써 수행될 수 있다.
사람 V 람다 배선 레포토리는 뉴클레오타이드 서열 상동성을 기준으로 하여 10개의 계열로 분류될 수 있다[Williams et al. (1996) J.Mol., 264, 220-232]. Joe9의 경쇄 가변 영역을 VBASE 데이타베이스로 부터 선택된 경쇄 배선 서열과 비교함으로써, Joe 9이 DPL8 람다 배선과 유사하다는 것이 밝혀졌다. Joe9 VL은 단지 4곳의 골격 부위에서만 DPL8과 상이하고, 다른 Vλ1 계열 구성원의 골격 서열과 매우 상동성이다. Joe 9에 대한 고도의 아미노산 서열 상동성과 표준 구조 유사성을 기초로 하여, 다른 Vλ1 계열 구성원도 또한 사람 IL-12에 결합하는 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 이는, 예를 들면 쇄-셔플링 기술[Winter et al. Supra]에 의해 적당한 VH을 선택하거나, 본 발명의 항체로 부터의 CDR을 포함하여 설치류 또는 다른 사람 항체로 부터의 CDR을 Vλ1 계열 골격에 이식함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은, 배선 서열의 VH3 계열의 구성원으로 부터 유래된 중쇄 가변 영역, 및 배선 서열의 Vλ1 계열의 구성원으로 부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는, hIL-12에 결합하는 재조합 항체를 포함하고자 하는 것이다. 또한, 당업자는 VH3 계열 중쇄 서열의 임의의 구성원이 Vλ1 계열 경쇄 서열의 임의의 구성원과 조합될 수 있다고 생각할 것이다.
또한, 당업자는, 배선의 아미노산 서열에 변화를 초래하는 DNA 서열 다형성(polymorphism)이 집단(예: 사람 집단)내에 존재할 수 있다고 생각할 것이다. 이러한 배선 서열의 유전적 다형성은 천연 대립유전자 변이에 기인하여 집단내의 개체중에 존재할 수 있다. 이러한 천연 대립유전자 변이는 통상적으로 유전자의 뉴클레오타이드 서열중의 1 내지 5% 변이를 초래할 것이다. 임의의 모든 이러한 뉴클레오타이드 변이, 및 천연 대립유전자 변이의 결과로서 배선 서열중에 생성된 아미노산 다형성은 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 본다.
따라서, 또 다른 양상으로서, 본 발명은,
a) 사람 IL-12에 결합하고, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 0.1s-1이하의 Koff 속도 상수로서 사람 IL-12로 부터 해리되거나, 시험관내 식물성 혈구응집소 모세포 증식 분석 (PHA 분석)에서 1x10-6M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고;
b) VH3 배선 계열의 구성원으로 부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(여기서, 중쇄 가변 영역은 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 돌연변이를 갖는다)을 가지며;
c) Vλ1 배선 계열의 구성원으로 부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(여기서, 경쇄 가변 영역은 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 돌연변이를 갖는다)을 갖는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 중쇄 CDR3중에 돌연변이를 갖는다.
또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 경쇄 CDR3중에 돌연변이를 갖는다.
또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 중쇄 CDR2중에 돌연변이를 갖는다.
또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 경쇄 CDR2중에 돌연변이를 갖는다.
또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 중쇄 CDR1중에 돌연변이를 갖는다.
또 다른 바람직한 양태에서, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부는 중쇄 CDR1중에 돌연변이를 갖는다.
당업자는, VH3 배선 계열의 구성원간, 또는 경쇄 Vλ1 배선 계열의 구성원간의 고도의 아미노산 서열 유사성을 기초로 하여, 배선 서열에 대한 돌연변이가 사람 IL-12에 결합하는 추가적 항체를 제공할 수 있다고 생각할 것이다. 표 1(별첨 A)는 VH3 계열 구성원의 배선 서열을 제시하고, 계열 구성원내의 상당한 서열 상동성을 입증한다. Joe 9의 중쇄 및 경쇄 서열이 비교를 위해 제공된다. VH3 또는 Vλ1 계열 구성원의 배선에 대한 돌연변이는, 예를 들면 본 발명의 항체에 생성된 것(Joe9내의 돌연변이)과 동일한 아미노산 부위에서 생성될 수 있다. 당해 변형은, PCR 돌연변이유발과 같은 표준 분자생물학 기술을 이용하고, 배선 서열에 개개의 아미노산 잔기를 표적화한 후, 본원에 기술된 바와 같은 변형된 항체의 역학적 및 기능적 분석(예: 실시예 3에 기술된 중화 분석, 및 실시예 5에 기술된 BIAcore 분석)에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 또 다른 양상으로서, 본 발명은,
a) 서열 595 내지 667로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(여기서, 중쇄 가변 영역은 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 바람직한 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 돌연변이를 갖는다)을 가지며;
b) 서열 669 내지 675로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(여기서, 경쇄 가변 영역은 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 바람직한 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 돌연변이를 갖는다)을 갖는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
당업자는, Joe9과 COS-3 중쇄 배선 서열간, 및 Joe9과 DPL8 λ 배선 서열간의 고도의 아미노산 서열 유사성을 기초로 하여, 이들 배선 서열의 CDR 영역에 대한 돌연변이가 사람 IL-12에 결합하는 추가적 항체를 제공할 수 있다고 생각할 것이다. 이러한 변형 방법은 상기와 같은 표준 분자생물학 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
따라서, 또 다른 양상으로서, 본 발명은,
a) 사람 IL-12에 결합하고, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 0.1s-1이하의 Koff 속도 상수로서 사람 IL-12로 부터 해리되거나, 시험관내 식물성 혈구응집소 모세포 증식 분석 (PHA 분석)에서 1x10-6M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하고;
b) COS-3 배선 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(여기서, 중쇄 가변 영역은 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 바람직한 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 돌연변이를 갖는다)을 가지며;
c) DPL8 배선 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(여기서, 경쇄 가변 영역은 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 돌연변이를 갖는다)을 갖는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역내의 CDR 및 골격 영역내의 주요 부위를 점유하는 특정 아미노산 잔기로 인해, 구조적 특징은 이들 영역에 부여된다. 특히, CDR2 및 CDR1 영역을 표준 구조적 분류에 적용시킨다. 계열 구성원간에는 고도의 아미노산 서열 상동성이 존재하기 때문에, 이들 표준 특징은 계열 구성원간에 존재한다. 당업자는, 이러한 표준 구조를 부여하는 아미노산 잔기에서 변형에 의해 IL-12에 결 합하는 추가적 항체가 생성될 것이라고 생각할 것이다. 당해 변형법은 상기한 바와 같은 표준 분자생물학 기술을 이용하여 수행할 수 있다.
따라서, 또 다른 양상으로서, 본 발명은,
a) 사람 IL-12에 결합하고, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정되는 바와 같이 0.1s-1이하의 Koff 속도 상수로서 사람 IL-12로 부터 해리되거나, 시험관내 식물성 혈구응집소 모세포 증식 분석 (PHA 분석)에서 1x10-6M 이하의 IC50으로서 식물성 혈구응집소 모세포 증식을 억제하며;
b) VH3 배선 계열의 구성원중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(여기서, 중쇄 가변 영역은 다른 VH3 배선 계열 구성원으로 부터의 CDR2와 구조적으로 유사한 CDR2, 및 다른 VH3 배선 계열 구성원으로 부터의 CDR1과 구조적으로 유사한 CDR1을 포함하고, 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 돌연변이를 갖는다)을 갖고;
c) Vλ1 배선 계열의 구성원중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(여기서, 경쇄 가변 영역은 다른 Vλ1 배선 계열 구성원으로 부터의 CDR2와 구조적으로 유사한 CDR2, 및 다른 Vλ1 배선 계열 구성원으로 부터의 CDR1과 구조적으로 유사한 CDR1을 포함하고, 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 돌연변이를 갖는다)을 갖는, 분리된 사람 항체, 또는 이의 항원 결합부를 특징으로 한다.
본 발명의 재조합 사람 항체는, VBASE 데이타베이스로 부터 선택된 사람 배선 면역글로불린 서열과 상동성인 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 재조합 사람 항체에 대한 돌연변이(예를 들면 무작위 돌연변이 유발 또는 PCR 돌연변이 유발에 의함)은 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노상 서열을 초래한다. 또한, 사람 공여자로 부터 유래된 재조합 항체의 라이브러리는, B-세포 발생중에 일어나는 체세포 돌연변이의 정상적인 과정으로 인해, 이들의 상응하는 배선 서열과는 상이한 항체 서열을 함유할 것이다. PCR 증폭에 의해 수득된 "배선" 서열이 진정한 배선 형태로 부터 골격 영역의 아미노산 상이성(즉, 진정한 배선 서열과 비교하여 증폭된 서열에서의 상이성)을 암호화하는 경우, 이들 아미노산 상이성을 진정한 배선 서열로 다시 돌연변이(즉, 배선 형태로의 골격 잔기의 "역돌연변이")시키는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 본 발명은 임의로 역돌연변이화 단계를 포함할 수 있다. 이를 수행하기 위하여, (VBASE 데이타베이스중에서 예를 발견할 수 있는 바와 같은) 배선에 의해 암호화된 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 먼저 돌연변이된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 골격 아미노산 서열과 비교하여, 가장 근접한 배선 서열과 상이한 돌연변이된 면역글로불린 골격 서열중의 아미노산 잔기를 확인한다.
따라서, 돌연변이된 면역글로불린 서열의 적당한 뉴클레오타이드를, 어느 뉴클레오타이드를 변화시켜야 하는지 결정하기 위하여 유전암호를 사용하여, 배선 서열에 상응하도록 역으로 돌연변이시킨다. 돌연변이된 면역글로불린 골격 서열의 돌연변이유발은, PCR-매개된 돌연변이유발(이 경우, 돌연변이된 뉴클레오타이드가 PCR 프라이머에 삽입되어, PCR 생성물이 돌연변이를 포함한다) 또는 부위-지시된 돌연변이유발과 같은 표준 방법에 의해 수행된다. 역돌연변이를 위한 후보로서 확인된 각 아미노산의 역할을 항원 결합에서의 직접적 또는 간접적 역할에 대해 조사해야하고, 사람 항체의 임의의 바람직한 특성에 영향을 주는 돌연변이화후 발견되는 임의의 아미노산은 최종 사람 항체에 포함되어서는 안된다; 예를 들면, 선택적 돌연변이유발 방법에 의해 확인된 활성 증진 아미노산 잔기는 역돌연변이에 적용되지 않을 것이다. 돌연변이유발로 부터 생성된 항체의 특징을 결정하기 위한 분석으로는 ELISA, 경쟁적 ELISA, 시험관내 및 생체내 중화 분석(실시예 3 참조) 및/또는 각종 공급원(사람, 영장류 및/또는 기타 종 포함)으로 부터의 조직 절편을 이용한 면역조직화학술이 포함된다.
역돌연변이에 적용될 아미노산의 수를 최소화하기 위하여, 가장 유사한 배선 서열과는 상이하나, 제2 배선 서열중의 상응하는 아미노산과는 동일한 것으로 밝혀진 이들 아미노산 부위를 유지시킬 수 있는데, 단 제2 배선 서열은 해당 아미노산의 양측에서 10개, 바람직하게는 12개 아미노산에 대해 본 발명의 사람 항체의 서열과 동일하고 동일선상에 있다. 이는, 본 발명의 사람 항체로 치료한 피험자에서 전문적 항원 제시 세포에 의해 면역계에 제공된 임의의 펩티드 에피토프가 자가-항원, 즉 상기 제2 배선 서열에 의해 암호화된 면역글로불린에 이질적이지 않고 동일할 것이다. 역돌연변이는 항체 최적화의 임의의 단계에 일어날 수 있다; 바람직하게는, 역돌연변이는 선택적 돌연변이유발 방법의 직전 또는 직후에 일어난다. 보다 바람직하게는, 역돌연변이는 선택적 돌연변이유발 방법의 직전에 일어난다.
III. 바람직한 돌연변이유발 부위, 접촉 및/또는 과돌연변이화 부위에 대한 변형
전형적으로, 향상된 친화성을 갖는 항체의 선택은 상기 II 부에서 기술한 바와 같이, 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 이는 CDR 잔기의 조합체를 무작위로 돌연변이시키고, 상이한 서열의 항체를 포함하는 대형 라이브러리를 제조함으로써, 달성될 수 있다. 그러나, 수행하고자 하는 이들 선택 방법의 경우에, 항체-항원 반응은 평형을 이루어, 시간이 경과함에 따라, 항원에 대한 높은 친화성 항체의 우선적인 결합이 허용되어야 한다. 확립될 평형을 허용하는 선택 조건은, 달성된 특정 수준의 친화성(즉, 항체 Y61의 친화성)을 수득하고자, 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 선택된 항-IL-12 항체의 친화성을 개선시키는 경우, 결정될 수 없다(아마도, 항원과 파아지 입자간의 추가적 비-특이적 상호작용 때문이다). 따라서, 보다 높은 친화성을 갖는 항체는 파아지 디스플레이 방법에 의해 선택될 수 없다. 따라서, 적어도 특정 항체 또는 항원에 대하여, 파아지 디스플레이 방법은 매우 향상된 결합 특이성/친화성을 갖는 항체를 선택하는 이들의 능력에 있어서 제한적이다. 따라서, 항체의 파아지 디스플레이 친화성 성숙을 요구하지 않는 선택적 돌연변이유발 방법이 이러한 제한을 극복하기 위하여 확립되었고, 본 발명에 의해 제공된다. 비록 이러한 선택적 돌연변이유발 방법이 파아지 디스플레이 시스템을 사용하는 단점을 극복하기 위하여 개발되었어도, 이러한 방법이 파아지 디스플레이 시스템과 함께 사용될 수 있음에 주목해야 한다. 더우기, 선택적 돌연변이유발 방법을 사용하여 임의의 항체의 활성을 향상시킬 수 있다.
항체의 활성(친화성 또는 중화 활성)을 향상시키기 위하여, 이상적으로는, 중쇄 및 경쇄 모두의 모든 CDR 부위를 모든 가능한 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시키는 것이 바람직할 것이다. 그러나, 평균적으로 항체내에는 70개의 CDR 부위가 존재하기 때문에, 이러한 방법은 대단히 시간 소모적이고 노동 집약적일 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은, 중쇄 및/또는 경쇄 CDR내의 선택된 특정 잔기만을 돌연변이시킴으로써 항체의 활성을 향상시킬 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법은 항체의 다른 바람직한 특성에 영향을 주지 않으면서 항체의 활성을 향상시킬 수 있다.
항체 가변 영역의 어느 아미노산 잔기가 항원과 접촉하는지를 결정하는 것은 가변 영역내의 1차 서열 또는 이들의 부위를 토대로 하여서는, 정확하게 예견될 수 없다. 그럼에도 불구하고, 카뱃(Kabat)등에 의해 수행된 상이한 특이성을 갖는 항체로 부터의 서열의 정렬을 통해, 항체중에서 상당히 상이한 가변 영역내의 국소 영역으로서 CDR이 확인되었다[Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-393, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]. 구조 연구를 통해, 항원 결합 표면이 CDR에 존재하는 아미노산 잔기에 의해 형성된다는 것이 밝혀졌다. CDR 외부의 다른 아미노산 잔기도 또한 구조적 역할을 하거나, 항원 결합에 직접적으로 관련이 있다고 공지되어 있다. 따라서, 각각의 항원-항체 쌍의 경우에, CDR의 내부 및 외부의 아미노산 잔기가 중요할 수 있다.
톰리슨(Tomlison) 등에 의한 서열 정렬 연구를 통해, 중쇄 및 경쇄 CDR1 및 CDR2, 및 체세포 돌연변이의 흔한 부위인 카파 쇄 CDR3의 부분에서 수 많은 부위가 확인되었다[Tomlison et al (1996) J. Mol. Biol. 256: 813-817). 특히, 부위 H31, H31B, H33, H33B, H52B, H56, H58, L30, L31, L31A, L50, L53, L91, L92, L93 및 L94가 체세포 돌연변이에 대한 흔한 부위로서 확인되었다. 그러나, 이러한 분석은 항체 결합부의 중심에 부위 위치하여, 항원과의 중요한 상호작용을 잠정적으로 제공하는 것으로 공지된 중요한 중쇄 CDR3 영역, 및 경쇄 CDR3의 절편을 배제하고 있다. 더우기, 톰리슨 등은, 체세포 다양성 만으로는 항원 결합에 있어서의 특정 아미노산의 역할을 반드시 예견할 수 없다고 제안하고, 항원과 접촉하는 보존된 아미노산 잔기, 및 항원과 접촉하지 않는 다양한 아미노산 잔기를 제시한다. 이러한 결론은 항체 친화성에 대한 체세포 돌연변이의 역할에 관한 돌연변이화연구에 의해 더욱 지지된다[Sharon, (1990), PNAS, 87:4814-7]. 고친화성 항-p-아조페닐아르소네이트 (Ars) 항체중의 19개의 체세포 돌연변이를 동시에 이들의 상응하는 배선 잔기로 치환하여, 활성이 200배 상실된 항-Ars 항체의 배선 형태를 제조한다. 항-Ars 항체의 완전한 친화성이 19개의 체세포 돌연변이중 단지 3개를 복귀시킴으로써 회복될 수 있는데, 이로써, 항원 결합 활성에 기여하지 않는 다수의 체세포 돌연변이가 허용될 수 있음이 입증된다.
당해 결과는 항체 다양성 그 자체의 특성에 의해 부분적으로 설명될 수 있다. 미성숙 B-세포는 수 많은 자가-항원 또는 비-자가-항원을 인식하는 저 친화성 항체를 초기에 생성할 수 있다. 또한, 항체는 자가-반응성을 야기할 수 있는 친화 성 성숙 서열 변이의 과정을 겪을 수 있다. 이러한 저 친화성 항체의 과돌연변이화는 자가-반응성을 제거하고("음성적 선택"), 외래 항원에 대한 친화성을 증가시키는 작용을 할 수 있다. 따라서, 다수의 항체에 대한 1차적 및 구조적 데이타의 분석이, (1) 친화성 성숙 과정 대 원치않는 항원에 대한 친화성을 저하시키는 과정에서의 과돌연변이화 부위의 역할을 예견하거나, (2) 주어진 아미노산이 특정 항원-항체 쌍의 특성에 어떻게 관여하는지를 예견하는 방법을 제공하지는 않는다.
항원 인식에서 특정 아미노산 잔기의 역할을 설명하기 위한 다른 시도가 다수의 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 방법으로 수행되었다{[MacCallum et al, (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745]. CDR의 내부 및 외부에 존재하는 부위의 잠정적 역할이 지적되었다. 분석된 26개의 구조중에서 10개 이상에서 항원 결합에 관여하는 CDR내의 부위로는, 중쇄내의 H31, H33, H50, H52, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98 및 H100, 및 경쇄내의 L30A, L32, L91, L92, L93, L94, L96이 포함된다. 그러나, 상기 저자들은 이들 구조 데이타 및 다른 구조 데이타를 이용한 항원 접촉의 예견이 접촉 부위를 과대 및 과소 예견할 수 있다는 것에 주목하고, 상이한 방법을 상이한 항원에 적용해야 한다는 생각에 이르게 되었다.
피니(Pini) 등은 대형 파아지 디스플레이 라이브러리중의 항체 CDR 서열내의 다수의 잔기를 램덤화함으로써 항체 친화성이 급속히 증가한다고 기술하고 있다[Pini et al. (1998) J. Biol Chem. 273:21769-21776]. 그러나, 피니 등에 의해 기술된 높은 친화성 항체는 총 8개 부위에 돌연변이를 가지며, 항체의 친화성을 개선시키는데 변화가 절대적으로 요구되는 감소적(reductionary) 분석은, 요구된 가장 적은 수의 아미노산에 대해 시험하고자 하는 가능한 조합의 수가 너무 많기 때문에, 비실용적이 되었다.
더우기, 다수 잔기의 램덤화가 상기 항체의 표적하는 다른 특성을 반드시 보존하지는 않을 것이다. 항체의 바람직한 특성 또는 특징은 당업계에서 인지되어 있고, 이러한 것의 예로는, 예를 들면 다른 단백질 또는 사람 조직과 비-교차 반응성의 보존성, 및 사람 면역글로불린 서열과 유사한 항체 서열의 보존성, 중화능의 향상이 포함된다. 다른 바람직한 특성 또는 특징으로는 종 교차 반응성 보존능, 에피토프 특이성 보존능, 및 포유동물 세포내에서의 단백질의 고발현 수준의 보존능이 포함된다. 바람직한 특성 또는 특징은, ELISA, 경쟁적 ELISA, 시험관내 및 생체내 중화 분석(실시예 3 참조), 사람, 영장류 또는 필요할 경우 다른 공급원을 포함하는 상이한 공급원으로 부터의 조직 절편을 이용하는 면역조직화학기술, 및 일시적 발현 또는 안정한 발현을 이용하는 포유동물 세포에서의 발현의 연구를 포함하나, 이에 제한되지 않는 당업계에 인지된 기술을 사용하여 관찰되거나 측정될 수 있다.
또한, 피니 등의 방법은 친화성을 개선시키는데 실제 요구되는 최소 수 보다 많은 변화를 도입하여, 사람 피험체내에 항체 촉발 항-사람-항체(HAMA) 형성을 유도할 것이다. 또한, 그외 논의된 바와 같이, 본원에서 입증된 파아지 디스플레이, 또는 다른 관련 방법(예: 리보솜 디스플레이)은 항원과 항체간의 특정 친화성에 도달하면 적절히 기능할 수 없으며, 평형에 도달하는데 요구되는 조건은, 다른 파아지 또는 리보솜 및 항원과의 상호작용을 포함하는 추가적 상호작용 때문에, 적절한 시간 범위내에 확립될 수 없다.
당업자는 상기한 참조 문헌의 교시로 부터 항체 다양성의 기원에 관한 흥미로운 과학적 정보를 수집할 수 있다. 그러나, 본 발명은 특이적 항원-항체 쌍의 항체 친화성을 증가시키면서, 항체의 다른 관련 특징 또는 바람직한 특징은 보존하는 방법을 제공한다. 이는, 항원 결합을 포함하는 특이적 항체에 다수의 상이한 특성을 부여하는 바람직한 면을 고려할 때 특히 중요하다.
출발 항체가 보유될 필요가 있는 바람직한 특성 또는 특징을 갖는 경우, 선택적 돌연변이유발 방법은, 항체의 활성을 향상시키면서 이들 바람직한 특성을 보존하기 위한 가장 우수한 방법일 수 있다. 예를 들면, Y61의 돌연변이유발에서, 목표는 hIL12에 대한 친화성을 증가시키고, 표적하는 특성을 보존하면서 항체의 중화능을 개선시키는 것이다. Y61의 표적하는 특성에는, (1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차 반응성의 보존성, (2) 미세 에피토프 특이성의 보존성, 즉 p70(p40/p35) 이종이량체와 관련하여 바람직하게는 p40 에피토프를 인식하고, 이로써 유리 가용성 p40로 부터의 결합 장애를 방지함; (3) 각각의 배선 면역글로불린 서열과 가능한한 유사한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체의 발생이 포함된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은, 친화성 및/또는 중화능을 향상시키기 위해 바람직한 특성 또는 특징을 보존하는 방법으로서 선택적 돌연변이유발 방법을 제공한다. "선택적 돌연변이유발 방법"이란 용어는 위에서 정의된 바와 같고, 이에는 선택된 아미노산 잔기를 개별적으로 돌연변이시키는 방법이 포함된다. 돌연 변이될 아미노산 잔기를 먼저 바람직한 선택적 돌연변이유발 부위로 부터 선택한 후, 접촉 부위로 부터 선택한 다음, 과돌연변이화 부위로 부터 선택한다. 각각 선택된 부위는 2 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있고, 항체의 표적하는 특성 및 항체 활성의 향상 모두에 있어서의 효과를 결정한다.
선택적 돌연변이유발 방법은, 후보 부위인 1) 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 2) 접촉 부위, 3) 과돌연변이화부위를 순차적으로 선택하고, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역내의 부위의 위치를 기초로 하여 당해 부위의 순위를 정하는 단계(CDR1 보다 CDR2가 우선하고, CDR2 보다 CDR3가 우선함);
후보인 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 과돌연변이화 및/또는 접촉 부위를 각각 순위에 따라, 모든 가능한 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시키고, 항체의 활성에 미치는 각각의 돌연변이의 효과를 분석하여, 활성 증진 아미노산 잔기를 결정하는 단계;
필요한 경우, 각각의 활성 증진 아미노산 잔기를 단계적으로 조합하여, 항체의 활성에 미치는 다양한 조합의 효과를 분석하는 단계; 및
활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 돌연변이 항체를 선택하고, 면역원성 잠재능에 관한 아미노산 치환의 부위 및 동일성을 기초로 하여 돌연변이 항체의 순위를 결정하는 단계를 포함한다. 가장 높은 순위는, 배선 데이타베이스에 기술된 가변 영역 서열과 거의 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 다른 사람 항체에 필적할 만한 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 항체에 주어진다. 낮은 순위는, 배선 서열 또는 다른 사람 항체의 서열에서 드물게 발생하는 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 항체에 주어진다. 가장 낮은 순위는, 배선 서열 또는 다른 사람 항체의 서열에서 발생하지 않는 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 항체에 주어진다. 상기한 바와 같이, CDR3에 존재하는 하나 이상의 활성 증진 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이 항체가, CDR1 보다 선호되는 CDR2 보다 선호된다. 중쇄 가변 영역의 CDR이 경쇄 가변 영역의 CDR 보다 선호된다.
돌연변이 항체는, 예를 들면 상응하는 모(母) 항체와 비교하여, 활성의 향상에 대해 연구될 수 있다. 돌연변이 항체의 활성의 향상은, 예를 들면 중화 분석, 또는 표면 플라스몬 공명 분석(실시예 3 참조)에 의한 결합 특이성/친화성에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 활성의 향상은 모 항체 보다 2 내지 20배 이상 높을 수 있다. 활성의 향상은 모 항체 보다 "x1 내지 x2"배 이상 높을 수 있는데, 이때 x1 및 x2는, 출발 범위(예: 2-15, 예: 5-10)내의 범위를 포함하는 2 내지 20의 정수이다.
또한, 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 돌연변이 항체를 연구하여, 하나 이상의 바람직한 특성이 돌연변이 후 유지되는가를 결정한다. 예를 들면, 항-hIL-12 항체를 이용하여, (1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차 반응성의 보존성, (2) 에피토프 인식의 보존성, 즉 p70(p40/p35) 이종이량체와 관련하여 바람직하게는 p40 에피토프를 인식하고, 이로써 유리 가용성 p40로 부터의 결합 장애를 방지함; 및 (3) 각각의 배선 면역글로불린 서열과 가능한한 유사한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체의 발생에 대하여 시험하고, 배선 서열로 부터의 상이성의 수를 기초로 하여, 어느 것이 사람 면역 반응을 유도할 것인가를 결정한다. 하나 이상의 활성 증진 아미노산 잔기, 예를 들면 2 또는 3 이상의 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 항체에 관해 동일한 관찰을 수행하여, 바람직한 특성 또는 특징이 보유되는 지를 결정한다.
Y61의 돌연변이유발에서 "선택적 돌연변이유발 방법"을 사용하는 예가 후술될 것이다. 각각의 돌연변이화 H31S→E, L50→Y, 또는 L94G→Y는 항체의 중화 활성을 각각 향상시킨다. 그러나, 조합 클론을 시험하는 경우, 조합된 클론 H31S→E + L50→Y + L94G→Y의 항체가 L50→Y + L94G→Y(J695) 보다 우수하지 않다. 따라서, CDR1의 부위 31에서 배선 아미노산 잔기 Ser을 Glu로 치환하는 것은 Y61에 비해 J695의 활성을 개선시키는데는 불필요하다. 따라서, 선택적 돌연변이유발 방법에 의해 최종 활성에 관여하는 변화의 최소 수가 확인되며, 이로써 최종 항체의 면역원성 잠재능이 감소되고 항체의 다른 표적하는 특성이 보존된다.
선택적 돌연변이유발 방법에 의해 생성된 VH 및 VL을 암호화하는 분리된 DNA는, IV 부에서 기술된 바와 같이, 전체 길이의 항체 쇄 유전자로, scFV 유전자의 경우에 Fab 단편으로 전환될 수 있다. 선택적 돌연변이유발에 의해 생성된 VH 및 VL 영역의 발현에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터를, IV부에서 상세히 기술되는 바와 같이, 각종 숙주 세포에 형질감염시킬 수 있다. 바람직한 숙주 세포에는 원핵 숙주 세포(예: 이. 콜라이), 또는 진핵 숙주 세포(예: 에스. 세레비지애(S. cerevisae)와 같은 효모)가 포함된다. 가장 바람직한 진핵 숙주 세포는 IV부에 기술된 포유동물 숙주 세포이다.
선택적 돌연변이유발 방법은, 다른 수단에 의한 앞선 친화성 성숙을 수반하지 않으면서, 활성이 향상된 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 선택적 돌연변이유발 방법은 역돌연변이에 적용된, 친화성이 향상된 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 선택적 돌연변이유발 방법은 친화성 성숙된 항체의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
당업자는, 선택적 돌연변이유발 방법이 당업계에서 공지된 표준 항체 조작 기술에 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예로서, CDR 이식된 항체, 키메라 항체, scFV 단편, 전체 길이의 항체의 Fab 단편, 및 다른 공급원(예: 유전자전이된 마우스)로 부터의 사람 항체가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
항체의 신속한 대규모의 돌연변이화분석에는 리보솜 디스플레이 기술을 이용하는 시험관내 전사 및 해독이 포함된다[참조 문헌: Hanes et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:4937-4942; Dall Acqua et al., (1998) Curr. Opin. Struc. Biol. 8: 443-450; He et al., (1997) Nucleic Acid Res. 25: 5132-5134; 미국 특허 제5,643,768호(Kawasaki)]. 또한, 선택적 돌연변이유발 방법은 리보솜 디스플레이 기술을 사용하여 선택될 수 있는 활성이 향상된 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는, HCVR 및/또는 LCVR의 CDR내의 각각의 부위를 변화시킴으로써 추가로 변형될 수 있다. 비록 이들 변형체가 파아지-디스플레이된 항체에서 제조될 수 있으나, 본 방법이, 다른 유형의 숙주 시스템, 예를 들면 세균, 효모 또는 포유동물 세포 발현 시스템에서 발현되는 항체 를 사용하여 수행될 수 있다는 점에서 유리하다.
본원에서 정의된 바람직한 접촉 부위 및 과돌연변이화 부위는 표 3(별첨 A)에 제시되어 있으며, 본 발명의 방법에 따른 이들의 변형이 실시예 2에 상세히 기술되어 있다. 바람직한 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 바람직한 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 보다 바람직한 아미노산 잔기("우선 선택적 돌연변이유발 부위"로서 지칭됨)는 접촉 및 과돌연변이화 부위 모두이며, H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 특히 바람직한 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
바람직한 활성 증진 아미노산 잔기는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96로 이루어진 그룹중에서 선택된 부위에 존재하는 아미노산 잔기를 대체한다. 보다 바람직한 활성 증진 아미노산 잔기는 부위 H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 및 L94에 존재하는 아미노산 잔기를 대체한다, 특히 바람직한 활성 증진 아미노산 잔기는 L50 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택된 부위에 존해하는 아미노산 잔기를 대체한다.
일반적으로, 본 발명의 방법은, 표적하는 모 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 또는 경쇄의 CDR내의 특정 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 및/또는 과돌연변이화 부위를 선택하는 단계; 각각의 부위를 무작위로 돌연변이시키거나(예를 들면, 변형된 항체의 미니-라이브러리를 제조하기 위한 돌연변이원성 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 유전적 수단에 의함), 하나의 부위를 표적하는 특정 아미노산으로 돌연변이시켜 활성 증진 아미노산 잔기 발현을 확인하는 단계; 변형된 항체(예: 비-파아지 디스플레이 숙주 시스템내)를 정제하는 단계; 항원에 대한 변형된 항체의 활성을 측정하는 단계(예를 들면, BIAcore 분석에 의해 koff 속도를 측정함); 필요한 경우, 다른 CDR 부위에 대한 상기 단계를 반복하는 단계; 활성을 개선시키는 것으로 밝혀진 각각의 돌연변이를 조합하는 단계; 및 당해 조합체(들)이 모 항체 또는 이의 항원 결합부 보다 더욱 높은 활성(예: 친화성 또는 중화능)을 갖는 항체를 발생시키는 지를 시험하는 단계를 포함한다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은, 모 항체에 비해 활성이 향상된 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 상보성 결정 영역(CDR)내의 1) 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 2) 접촉 부위, 또는 3) 과돌연변이화 부위를 순차적으로 선택하여, 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하는 단계;
c) 상기한 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 2 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계;
e) 임의로, 하나 이상의 다른 우선 선택적 돌연변이유발 부위 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 대하여 단계 a) 내지 d)를 반복하는 단계;
f) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 활성을 개선시키는 것으로 밝혀진 각각의 돌연변이를 조합하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계; 및
g) 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 선택된 항체(들)은 상기한 바와 같은 모 항체의 하나 이상의 바람직한 특징 또는 특성을 상실하지 않거나 보유하면서, 향상된 활성을 갖는다. 바람직한 특징 또는 특성은 당업계에 인지된 기술을 사용하는 당업자에 의해 측정될 수 있다.
바람직한 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 바람직한 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 보다 바람직한 우선 선택적 돌연변이유발 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 특히 바람직한 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 활성이 향상된 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 상보성 결정 영역(CDR)내의 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하는 단계;
c) 상기한 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 2 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하여, 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계;
e) 임의로, 하나 이상의 다른 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 대하여 단계 a) 내지 d)를 반복하는 단계;
f) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 활성을 개선시키는 것으로 밝혀진 2개의 각각의 활성 증진 아미노산 잔기를 조합하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계; 및
g) 2개의 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직한 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 바람직한 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 보다 바람직한 우선 선택적 돌연변이유발 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 특히 바람직한 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 활성이 향상된 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 상보성 결정 영역(CDR)내의 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하는 단계;
c) 상기한 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 2 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하여, 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계;
e) 임의로, 하나 이상의 다른 우선 선택적 돌연변이유발 부위 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 대하여 단계 a) 내지 d)를 반복하는 단계;
f) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 활성을 개선시키는 것으로 밝혀진 3개의 각각의 활성 증진 아미노산 잔기를 조합하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계; 및
g) 2개의 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 활성 증진 아미노산 잔기는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹중에서 선택된 부위에 존재하는 아미노산 잔기를 대체한다.
각각의 선택된 부위의 돌연변이유발 후, 돌연변이된 클론의 서열을 분석하여, 어느 아미노산 잔기가 각각의 클론의 선택된 부위에 도입되었는지를 확인할 수 있다. 소수의 클론(예: 약 24개)을 선택하여 서열분석할 수 있으며, 이 경우 통계적으로 10 내지 15개의 특유의 항체가 산출되는 반면, 더 많은 수의 클론(예: 60개 이상)을 서열분석하여, 선택된 부위에서 모든 가능한 치환을 갖는 항체가 확인될 수 있도록 한다.
하나의 양태에서, 먼저, 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR3 영역내의 접촉 및/또는 과돌연변이화 부위를 돌연변이유발을 위해 선택한다. 그러나, 파아지 디스플레이 선택을 통해 CDR3 영역의 무작위 돌연변이유발에 의해 시험관내에서 이미 친화성 돌연변이되어진 항체의 경우에, 먼저, 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR1 또는 CDR2내의 접촉 및/또는 과돌연변이화 부위를 선택하는 것이 바람직할 것이다.
보다 바람직한 양태에서, 먼저, 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR3 영역내의 우선 선택적 돌연변이유발 부위를 돌연변이유발을 위해 선택한다. 그러나, 파아지 디스플레이 선택을 통해 CDR3 영역의 무작위 돌연변이유발에 의해 시험관내에서 이미 친화성 돌연변이되어진 항체의 경우에, 먼저, 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR1 또는 CDR2내의 우선 선택적 돌연변이유발 부위를 선택하는 것이 바람직할 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 선택적 돌연변이유발 방법에 의해 선택된 항체의 최적화는 다음과 같이 순차적으로 수행된다: H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위를 먼저 2개 이상의 다른 아미노산(바람직하게는 5 내지 14개의 다른 아미노산)으로 각각 돌연변이시키고, 생성된 항체를 증가된 친화성, 중화능, ( 및 아마도 또한, 그외 기술된 하나 이상의 보유된 다른 특징 또는 특성)에 대한 특성을 결정한다. 하나의 우선 선택적 돌연변이유발 부위의 돌연변이가 친화성 또는 중화능을 전혀 또는 충분히 증가시키지 못하는 경우, 및 우선 선택적 돌연변이유발 부위내의 아미노산을 대체하는 다수의 활성 증진 아미노산 잔기의 조합이 표적 활성(예: 친화성 및/또는 중화능)을 충족하는 조합 항체를 형성시키지 못하는 경우, 추가적 아미노산 잔기를 선택적 돌연변이유발을 위해 H35, H50, H53, H54, H95, H96, H98, L30A 및 L96으로 이루어진 그룹으로 부터 선택하여, 2개 이상의 다른 아미노산(바람직하게는 5 내지 14개의 다른 아미노산)으로 각각 돌연변이시키고, 생성된 항체를 증가된 친화성, 중화능 (및 아마도 또한, 그외 기술된 하나 이상의 보유된 다른 특징 또는 특성)에 대한 특성을 결정한다.
H35, H50, H53, H54, H95, H96, H98, L30A 및 L96으로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 하나의 아미노산 잔기의 돌연변이가 활성(예: 친화성 및/또는 중화능)을 전혀 또는 충분히 증가시키지 못하는 경우, 및 상기 부위내의 아미노산을 대체하는 다수의 활성 증진 아미노산 잔기의 조합이 표적 활성(예: 친화성 및/또는 중화능)을 충족하는 조합 항체를 형성시키지 못하는 경우, 추가적 아미노산 잔기를 선택적 돌연변이유발을 위해 H33B, H52B 및 L31A로 이루어진 그룹으로 부터 선택하여, 2개 이상의 다른 아미노산(바람직하게는 5 내지 14개의 다른 아미노산)으로 각각 돌연변이시키고, 생성된 항체를 증가된 친화성, 중화능 (및 아마도 또한, 그외 기술된 하나 이상의 보유된 다른 특징 또는 특성)에 대한 특성을 결정한다.
상기 연속적인 선택적 돌연변이유발 방법은, 표적하는 활성(친화성 및 중화능)을 갖는 항체가 확인되어지면, 상기 개괄된 어느 단계에서도 종료될 수 있음을 이해해야 한다. 예비선택된 부위의 돌연변이유발이 활성 증진 아미노산 잔기를 확인할 수는 있으나 조합 항체는 여전히 표적 활성을 충족하지 못하는 경우, 및/또는 확인된 활성 증진 아미노산 잔기가 또한 다른 표적하는 특징에 영향을 미쳐 허용될 수 없는 경우, 나머지 CDR 잔기를 돌연변이유발시킨다(IV 부 참조).
본 발명의 방법을 사용하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 향상시키고, 예정된 표적 활성(예: 예정된 친화성 및/또는 중화능, 및/또는 표적하는 특성 또는 특징)을 수득할 수 있다.
따라서, 본 발명은, 예정된 표적 활성을 수득하기 위하여,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위를 선택하는 단계;
c) 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위를 각각 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 제1 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하는 단계;
d) 일단의 제1 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여, 하나의 선택적 돌연변이유발 부위의 돌연변이가 예정된 표적 활성 또는 일부 표적 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성시키는지를 결정하는 단계;
e) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 활성을 개선시키는 것으로 밝혀진 각각의 돌연변이를 단계적으로 조합하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계; 및
f) 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부가 예정된 표적 활성 또는 일부 표적 활성을 갖는지를 결정하는 단계;
g) 단계 d) 또는 단계 f)에 의해, 예정된 표적 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 형성되지 않거나, 단지 일부 활성만을 갖는 항체가 형성되는 경우, H35, H50, H53, H54, H95, H96, H98, L30A 및 L96으로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 추가적 아미노산 잔기를 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 제2 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하는 단계;
h) 일단의 제2 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여, H35, H50, H53, H54, H95, H96, H98, L30A 및 L96으로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 하나의 아미노산 잔기의 돌연변이가 예정된 표적 활성 또는 일부 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성시키는지를 결정하는 단계;
i) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 활성을 개선시키는 것으로 밝혀진 각각의 돌연변이를 단계적으로 조합하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계; 및
j) 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부가 예정된 표적 활성 또는 일부 표적 활성을 갖는지를 결정하는 단계;
k) 단계 h) 또는 단계 j)에 의해, 예정된 표적 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 형성되지 않거나, 단지 일부 활성만을 갖는 항체가 형성되는 경우, H33B, H52B 및 L31A로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 추가적 아미노산 잔기를 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 제3 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하는 단계;
l) 일단의 제3 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여, H33B, H52B 및 L31A로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 하나의 아미노산 잔기의 돌연변이가 예정된 표적 활성 또는 일부 활성을 갖고 예정된 표적 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성하는지를 결정하는 단계;
m) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 활성을 개선시키는 것으로 밝혀진 단계 k)의 각각의 돌연변이를 단계적으로 조합하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계; 및
n) 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 평가하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부가 예정된 표적 활성을 갖는지를 결정하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
예정된 표적 활성을 달성하기 위해 PCR 조립법, 쿤켈(Kunkel)(dut-ung-) 및 티오포스페이트(Amersham Sculptor kit) 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이유발을 포함하는 수 많은 돌연변이유발 방법이 사용될 수 있다.
세균, 효모, 바쿨로바이러스, 및 포유동물 발현 시스템 (및 파아지 디스플레이 발현 시스템)을 포함하여, 매우 다양한 숙주 발현 시스템을 사용하여 돌연변이된 항체를 발현시킬 수 있다. 적합한 세균 발현 벡터의 예는 pUC119(Sfi)이다. 다른 항체 발현 시스템은 당업계에 공지되어 있고/있거나 IV 부에서 후술될 것이다.
본 발명의 방법에 의해 생성된, 변형된 항체 또는 이의 항원 결합부는, 선택을 위한 파아지 디스플레이 방법을 이용하지 않고도 확인될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은, 파아지-디스플레이 시스템에서 선택에 의해 수득되나 파아지-디스플레이 시스템에서 돌연변이유발에 의해 활성이 추가로 향상되어질 수 없는, 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는데 특히 유리하다.
따라서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 활성이 향상된 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 파아지-디스플레이 시스템에서 선택에 의해 수득되나 활성이 파아지-디스플레이 시스템에서 돌연변이유발에 의해 추가로 향상되어질 수 없는, 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 상보성 결정 영역(CDR)내의 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하여, 선택된 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하는 단계;
c) 상기한 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고, 비-파아지 디스플레이 시스템에서 상기 일단의 돌연변이된 항체를 발현시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계;
e) 임의로, 하나 이상의 다른 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 대하여 단계 b) 내지 d)를 반복하는 단계;
f) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 활성을 개선시키는 것으로 밝혀진 각 각의 돌연변이를 조합하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계; 및
g) 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직한 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 바람직한 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 보다 바람직한 우선 선택적 돌연변이유발 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 특히 바람직한 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
이용가능한 방법에 의해, 결합 친화성 및 중화능이 증가되고, 상기한 바와 같은 항체의 다른 특성 또는 특징을 보유하는 항체를 유도하는 것은 불가능하거나 극히 곤란하다. 그러나, 본 발명의 방법은 이러한 항체를 용이하게 확인할 수 있다. 본 발명의 방법에 적용된 항체는 임의의 공급원으로 부터 유래될 수 있다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 활성이 향상되고 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 상보성 결정 영역(CDR)내의 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하여, 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하는 단계;
c) 상기한 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고, 적당한 발현 시스템에서 상기 일단의 돌연변이된 항체를 발현시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하여, 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계; 및
e) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를, 항체에 보유될 필요가 있는 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에 대하여 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹중에서 선택되고, 다른 특성은 (1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차 반응성의 보존성, (2) 에피토프 인식의 보존성, 즉 p70p40/p35 이종이량체와 관련하여 바람직하게는 p40 에 피토프를 인식하여, 유리 가용성 p40로 부터의 결합 장애를 방지함; 및/또는 (3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생성중에서 선택된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹중에서 선택되고, 다른 특성은, (1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차 반응성의 보존성, (2) 에피토프 인식의 보존성, 즉 p70p40/p35 이종이량체와 관련하여 바람직하게는 p40 에피토프를 인식하여, 유리 가용성 p40로 부터의 결합 장애를 방지함; 및/또는 (3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생성중에서 선택된다.
보다 바람직한 양태에서, 선택적 돌연변이유발을 위한 잔기는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 및 L94로 이루어진 그룹중의 우선 선택적 돌연변이유발 부위로 부터 선택되고, 다른 특성은, (1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차 반응성의 보존성, (2) 에피토프 인식의 보존성, 즉 p70p40/p35 이종이량체와 관련하여 바람직하게는 p40 에피토프를 인식하여, 유리 가용성 p40로 부터의 결합 장애를 방지함; 및/또는 (3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생성중에서 선택된다.
보다 바람직한 양태에서, 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택되고, 다른 특성은, (1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차 반응성의 보존성, (2) 에피토프 인식의 보존성, 즉 p70p40/p35 이종이량체와 관련하여 바람직하게는 p40 에피토프를 인식하여, 유리 가용성 p40로 부터의 결합 장애를 방지함; 및/또는 (3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생성중에서 선택된다.
따라서, 특이적 항원에 대한 항체의 친화성이 향상되어야 하나, 이 경우에 파아지 디스플레이(또는 리보솜 디스플레이를 포함하는 관련 시스템) 방법이 더 이상 적용될 수 없고, 다른 바람직한 특성 또는 특징이 보유되어야 하는 경우, 본 발명의 방법이 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 활성이 향상되고 하나 이상의 보유된 다른 특성 또는 특징을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 파아지-디스플레이 시스템에서 선택에 의해 수득되나 활성이 상기 파아지-디스플레이 시스템에서 돌연변이유발에 의해 추가로 향상되어질 수 없는, 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 상보성 결정 영역(CDR)내의 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하여, 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하는 단계;
c) 상기한 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고, 비-파아지 디스플레이 시스템에서 상기 일단의 돌연변이된 항체를 발현시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하여, 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계;
e) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 활성이 향상되고 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를, 항체에 보유될 필요가 있는 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에 대하여 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계;
f) 임의로, 하나 이상의 다른 우선 선택적 돌연변이유발 부위 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 대하여 단계 a) 내지 e)를 반복하는 단계;
g) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 활성을 개선시키는 것으로 밝혀진 2개 이상의 각각의 활성 증진 아미노산 잔기를 조합하여, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계; 및
h) 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹중에서 선택되고, 다른 특성은, (1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차 반응성의 보존성, (2) 에피토프 인식의 보존성, 즉 p70p40/p35 이종이량체와 관련하여 바람직하게는 p40 에피토프를 인식하여, 유리 가용성 p40로 부터의 결합 장애를 방지함; 및/또는 (3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생성중에서 선택된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹중에서 선택되고, 다른 특성은, (1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차 반응성의 보존성, (2) 에피토프 인식의 보존성, 즉 p70p40/p35 이종이량체와 관련하여 바람직하게는 p40 에피토프를 인식하여, 유리 가용성 p40로 부터의 결합 장애를 방지함; 및/또는 (3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생성중에서 선택된다.
보다 바람직한 양태에서, 선택적 돌연변이유발을 위한 잔기는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 및 L94로 이루어진 그룹중의 우선 선택적 돌연변이유발 부위로 부터 선택되고, 다른 특성은, (1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차 반응성의 보존성, (2) 에피토프 인식의 보존성, 즉 p70p40/p35 이종이량체와 관련하여 바람직하게는 p40 에피토프를 인식하여, 유리 가용성 p40로 부터의 결합 장애를 방지함; 및/또는 (3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생성중에서 선택된다.
보다 바람직한 양태에서, 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹중에서 선택되고, 다른 특성은, (1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차 반응성의 보존성, (2) 에피토프 인식의 보존성, 즉 p70p40/p35 이종이량체와 관련하여 바람직하게는 p40 에피토프를 인식하여, 유리 가용성 p40로 부터의 결합 장애를 방지함; 및/또는 (3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생성중에서 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 활성이 향상되고 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 파아지-디스플레이 시스템에서 선택에 의해 수득되나 활성이 상기 파아지-디스플레이 시스템에서 돌연변이유발에 의해 추가로 향상되어질 수 없는, 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 상보성 결정 영역(CDR)내의 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 선택하여, 선택된 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하는 단계;
c) 상기한 선택된 우선 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 각각 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하고, 비-파아지 디스플레이 시스템에서 상기 일단의 돌연변이된 항체를 발현시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하여, 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계; 및
e) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를, 보유될 필요가 있는 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에 대하여, 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직한 양태에 있어서, 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나, 다른 특징은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 다른 특징은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
보다 바람직한 양태에 있어서, 선택적 돌연변이 유발에 대한 잔기는 H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 및 L94로 이루어진 그룹으로부터의 바람직한 선택적 돌연변이 유발 부위로부터 선택되고, 다른 특징은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
보다 바람직한 양태에 있어서, 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 다른 특징은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 향상된 활성 및 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 파아지-디스플레이 시스템내에서의 선택에 의해 수득되나, 이의 활성은 상기 파아지-디스플레이 시스템내에서의 돌연변이 유발에 의해 추가로 향상될 수 있는, 재조합 모 항체 또는 이의 항체-결합부를 제공하는 단계;
b) 바람직한 선택적 돌연변이 유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 돌연변이에 대한 상보성 결정 부위(CDR)내에서 선택하고, 이에 의해 선택된 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 확인하는 단계;
c) 선택된 바람직한 선택적 돌연변이 유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 개별적으로 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 이에 의해 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성시키고, 이를 비-파아지 디스플레이 시스템내에서 발현시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하고, 이에 의해 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계;
e) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 향상된 활성 및 하나 이상의 보유된 특성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지, 보유할 필요가 있는 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에 대해 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계;
f) 임의로, 단계 a) 내지 e)를 하나 이상의 다른 바람직한 선택적 돌연변이 유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 대해 반복하는 단계;
g) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 향상된 활성 및 하나 이상의 보유된 다른 특징을 갖는 것으로 밝혀진 2개 이상의 별개의 활성 증진 아미노산 잔기에 결합시켜, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계, 및
h) 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직한 양태에 있어서, 접촉 부위는 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96으로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나, 다른 특징은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 과돌연변이화 부위는 H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 및 L93으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 다른 특징은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
보다 바람직한 양태에 있어서, 선택적 돌연변이 유발에 대한 잔기는 H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 및 L94로 이루어진 그룹으로부터의 바람직한 선택적 돌연변이 유발 부위로부터 선택되고, 다른 특징은 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
보다 바람직한 양태에 있어서, 접촉 부위는 L50 및 L94로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 다른 특징,은 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
IV. 다른 CDR 잔기의 변형
궁극적으로는, 제공된 항체-항원 쌍에서의 모든 CDR 잔기는 활성 증진 아미노산 잔기로서 필요로 하고/하거나 항원에 직접적으로 또는 간접적으로 결합시키고/시키거나 항체의 다른 바람직한 특성 또는 특징을 보유하는데 필요한 임의의 수단에 의해 확인된다. 이러한 CDR 잔기는 "바람직한 선택적 돌연변이 유발 부위"로 칭한다. 특정 환경에서 바람직한 선택적 돌연변이 유발 잔기를 항체 및 항체의 공동-결정화 및 모델링을 포함한 다른 수단에 의해서도 확인할 수 있음을 주지하여야만 한다.
상기한 바람직한 선택적 돌연변이 유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 집중된 활성 증진 아미노산을 확인하기 위한 바람직한 시도가 소진된 경우나, 추가의 향상이 필요한 경우에, 잔류하는 CDR 잔기를 하기한 바와 같이 변형시킨다. 항체를 상기한 양태에 따라 임의의 하나 이상의 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 이미 변형시킬 수 있으나, 추가의 향상이 필요할 것이라는 사실을 이해하여야 한다. 따라서, 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 향상된 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 아미노산 잔기를 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96 이외의 상보성 결정 부위(CDR)내에서 선택하는 단계;
c) 선택된 부위를 개별적으로, 예를 들어, 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 돌연변이된 항체, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성시키는 단계;
d) 돌연변이된 항체, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하고, 이에 의해 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계 및
e) 돌연변이된 항체, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를, 하나 이상의 특성 또는 특징의 변화에 대해, 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는 다른 특징 또는 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
단일 잔기의 돌연변이 유발이 충분하지 않을 경우에, 다른 잔기를 포함시킬 수 있으며, 따라서, 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 향상된 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 아미노산 잔기를 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96 이외의 상보성 결정 부위(CDR)내에서 선택하는 단계;
c) 선택된 부위를 개별적으로 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하고, 이에 의해 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계;
e) 단계 b) 내지 d)를 b)하에 선택된 부위도 아니고 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96의 부위도 아닌 하나 이상의 CDR 부위에 대해 반복하는 단계;
f) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 향상된 활성을 갖는 것으로 밝혀진 2개 이상의 별개의 활성 증진 아미노산 잔기를 결합시켜, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계 및
g) 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
상기한 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 집중된 활성 증진 아미노산을 확인하기 위한 바람직한 시도가 소진된 경우나, 추가의 향상이 필요하고, 당해 항체를 돌연변이 유발 및 파아지 디스플레이(또는 관련된 리보솜 디스플레이) 방법에 의해 추가로 최적화시킬 수 없는 경우에, 잔류하는 CDR 잔기를 하기한 바와 같이 변형시킨다. 항체를 상기한 양태에 따라 임의의 하나 이상의 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에서 이미 변형시킬 수 있으나, 추가의 향상이 필요할 것이라는 사실을 이해하여야 한다.
따라서, 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 향상된 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 파아지-디스플레이 시스템내에서의 선택에 의해 수득되나, 이의 활성은 상기 파아지-디스플레이 시스템내에서의 돌연변이 유발에 의해 추가로 향상시킬 수 없는 재조합 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 아미노산 잔기를 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96 이외의 상보성 결정 부위(CDR)내에서 선택하는 단계;
c) 선택된 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위를 개별적으로 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성시키고, 이를 비-파아지 디스플레이 시스템내에서 발현시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하고, 이에 의해 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계 및
e) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 하나 이상의 특성 또는 특징의 변화에 대해 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는 다른 특징 또는 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
단일 잔기의 돌연변이 유발이 충분하지 않을 경우에, 다른 잔기를 포함시킬 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 향상된 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 파아지-디스플레이 시스템내에서의 선택에 의해 수득되나, 이의 활성은 상기 파아지-디스플레이 시스템내에서의 돌연변이 유발에 의해 추가로 향상시킬 수 없는 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 아미노산 잔기를 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96 이외의 상보성 결정 부위(CDR)내에서 선택하는 단계;
c) 선택된 부위를 개별적으로 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 이에 의해 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성시키고, 비-파아지 디스플레이 시스템내에서 발현시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하고, 이에 의해 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계;
e) 단계 b) 내지 d)를 b)하에 선택된 부위도 아니고 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96에서의 부위도 아닌 하나 이상의 다른 부위에 대해 반복하는 단계;
f) 모 항체 또는 이의 항원 결합에, 향상된 활성을 갖는 것으로 밝혀진 2개 이상의 별개의 활성 증진 아미노산 잔기를 결합시켜 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계 및
g) 2개의 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성 및 다른 특성 또는 특징을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는 다른 특징 또는 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
상기한 바람직한 선택적 돌연변이 유발 부위, 접촉 부위 또는 과돌연변이화 부위에 집중된 활성 증진 아미노산을 확인하기 위한 바람직한 시도가 소진될 수 있거나, 추가의 향상이 필요할 수 있으며, 항체의 다른 특성 또는 특징을 유지시키는 것이 중요하다.
따라서, 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 향상된 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 아미노산 잔기를 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96 이외의 상보성 결정 부위(CDR)내에서 선택하는 단계;
c) 선택된 부위를 개별적으로 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하고, 이에 의해 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계 및
e) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를, 하나 이상의 특성 또는 특징의 변화에 대해, 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 또 다른 특성에 영향을 미치지 않고 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는 다른 특징 또는 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
단일 잔기의 돌연변이 유발이 충분하지 않을 경우에, 다른 잔기를 포함시킬 수 있으며, 따라서, 또 다른 양태에 있어서 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 향상된 활성 및 하나 이상의 보유된 다른 특성 또는 특징을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 아미노산 잔기를 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96 이외의 상보성 결정 부위(CDR)내에서 선택하는 단계;
c) 선택된 부위를 개별적으로 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하고, 이에 의해 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계;
e) 하나 이상의 다른 특성 또는 특징의 변화에 대해, 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 비교하고 평가하는 단계;
f) 단계 b) 내지 d)를 b)하에 선택된 부위도 아니고 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96에서의 부위도 아닌 하나 이상의 CDR 부위에 대해 반복하는 단계;
g) 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 향상된 활성을 갖는 것으로 밝혀진 2개 이상의 별개의 활성 증진 아미노산 잔기와 결합시켜, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계 및
h) 2개의 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성 및 하나 이상의 보유된 특성 또는 특징을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
우선 선택적 돌연변이 유발 부위, 접촉 및 과돌연변이화 잔기의 돌연변이 유발은 충분히 항체의 친화성을 증가시킬 수 없으며, 돌연변이 유발 및 파아지 디스플레이(또는 관련된 리보솜 디스플레이) 방법은 더 이상 유용하지 않을 수 있고, 항체의 하나 이상의 다른 특징 또는 특성을 보유시켜야만 한다.
따라서, 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 향상된 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 파아지-디스플레이 시스템내에서의 선택에 의해 수득되나, 이의 활성은 상기 파아지-디스플레이 시스템내에서의 돌연변이 유발에 의해 추가로 향상시킬 수 없는 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 아미노산 잔기를 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96 이외의 상보성 결정 부위(CDR)내에서 선택하는 단계;
c) 선택된 부위를 개별적으로 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성시키고, 비-파아지 디스플레이 시스템내에서 발현시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하고, 이에 의해 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계 및
e) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를, 하나 이상의 특성 또는 특징의 변화에 대해, 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는 다른 특징 또는 특성은, 1) 다른 단백질 또는 사람 조직과의 비-교차반응성의 보존, 2) 바람직하게는 결합 방해를 유리 가용성 p40으로부터 방지하는 p70 p40/p35 이종성이량체와 관련하여 p40 에피토프를 인식하는 에피토프 인식의 보존 및/또는 3) 배선 면역글로불린 서열과 유사한 항체의 생산으로부터 선택된다.
단일 잔기의 돌연변이 유발이 충분하지 않을 경우에, 다른 잔기를 포함시킬 수 있으며, 따라서, 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은, 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 비해 향상된 활성 및 하나 이상의 다른 보유된 특징 또는 특성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합부가 수득될 때까지,
a) 파아지-디스플레이 시스템내에서의 선택에 의해 수득되나, 이의 활성은 상기 파아지-디스플레이 시스템내에서의 돌연변이 유발에 의해 추가로 향상시킬 수 없는 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는 단계;
b) 돌연변이를 위해 아미노산 잔기를 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96 이외의 상보성 결정 부위(CDR)내에서 선택하는 단계;
c) 선택된 부위를 개별적으로 2개 이상의 다른 아미노산 잔기로 돌연변이시켜, 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부를 생성시키고, 비-파아지 디스플레이 시스템내에서 발현시키는 단계;
d) 일단의 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성 또는 보유된 하나 이상의 다른 특성 또는 특징을 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하고, 이에 의해 활성 증진 아미노산 잔기를 확인하는 단계;
e) 단계 b) 내지 d)를 b)하에 선택된 부위도 아니고 H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, 93, L94 및 L96에서의 부위도 아닌 하나 이상의 다른 부위에 대해 반복하는 단계;
f) 모 항체 또는 이의 항원 결합부에, 향상된 활성을 가지고 하나 이상의 다른 특성 또는 특징에 영향을 주지 않는 것으로 밝혀진 2개 이상의 별개의 활성 증진 아미노산 잔기를 결합시켜, 조합 항체 또는 이의 항원 결합부를 형성시키는 단계 및
g) 2개의 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 조합 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을, 모 항체 또는 이의 항원 결합부와 비교하여 평가하는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
V. 항체의 발현
본 발명의 항체 또는 항체 일부는 숙주 세포내에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조할 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포내에서 발현되도록, 바람직하게는 숙주 세포가 배양되는 배지내로 분비되어, 당해 배지로부터 항체를 회수하도록, 숙주 세포를 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 보유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질감염시킨다. 표준 재조합 DNA 방법을 이용하여, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이들 유전자를 재조합 발현 벡터내에 혼입하고, 벡터를 문헌[참조: Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al., (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 및 미국 특허 제4,816,397호(Boss et al.)]에 기술된 바와 같은 숙주 세포내에 도입한다.
Joe 9 wt 또는 Joe 9 wt-관련 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA 단편을 수득하기 위해, 사람 IL-12에 대해 특이적인 항체를 상기 II부에 기술된 바와 같이 사람 라이브러리로부터 선별하여 돌연변이시킨다. Joe 9 wt 또는 Joe 9 wt-관련된 VH 및 VL 절편을 암호화하는 DNA 단편이 일단 수득되면, 이들 서열의 돌연변이 유발을 표준 방법, 예를 들어, PCR 부위 지시된 돌연변이 유발(돌연변이된 뉴클레오타이드를 PCR 프라이머내로 혼입하여, PCR 산물이 돌연변이를 함유하도록 하는 PCR-매개된 돌연변이 유발) 또는 다른 부위-지시된 돌연변이 유발 방법에 의해 수행한다. 바람직한, 예를 들어, J695인 활성 및 결합 특이성/친화성의 수준을 나타내는 사람 IL-12 항체를 추가로 표준 재조합 DNA 기법에 의해 조작하여, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 또는 scFv 유전자로 전환시킨다. 이러한 조작에 있어서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편을 다른 단백질을 암호화하는 또 다른 DNA 단편, 예를 들어, 항체 불변 영역 또는 가요성 링커에 작동적으로 연결시킨다. 본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된"은 2개의 DNA 단편이 이에 의해 암호화된 아미노산이 프레임을 유지하도록 결합되어 있음을 의미한다.
VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시켜 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 사람 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며[참조: Kobat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913-3242], 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역, 및 문헌[참조: Kobat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]에 기술된 바와 같은 임의의 동종이형 변이체일 수 있으나, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA를 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시킬 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 사람 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며[참조예: Kobat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913-3242], 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 람다 불변 영역이다.
scFv 유전자를 생성시키기 위해, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편을 가요성 링커를 암호화하는, 예를 들어, 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 암호화하는 또 다른 단편에 작동적으로 연결시켜, VH 및 VL 서열을 인접하는 단일쇄 단백질로서 발현시킬 수 있다[참조예: Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCaggerty et al., Nature (1990) 348:552-554].
본 발명의 항체 또는 항체 일부를 발현시키 위해, 상기한 바와 같이 수득된, 부분적 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 발현 벡터내에 삽입하여, 유전자를 전사 및 해독 조절 서열에 작동적으로 연결시킨다. 이때 용어 "작동적으로 연결되는"은 항체 유전자를 벡터에 연결시켜, 벡터내의 전사 및 해독 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 해독을 조절하는 의도된 기능을 하도록 함을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 적합하도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터에 삽입시킬 수 있거나, 보다 전형적으로는 2개의 유전자 모두 동일한 발현 벡터내에 삽입시킨다. 항체 유전자를 표준 방법(예를 들어, 상보적 제한 부위의 항체 유전자 단편 및 벡터 상에의 연결, 또는 제한 부위가 존재하지 않을 경우에는 평활 말단 연결)에 의해 발현 벡터내에 삽입시킨다. J695 또는 J695-관련된 경쇄 또는 중쇄 서열의 삽입 전에, 발현 벡터는 미리 항체 불변 영역 서열을 보유할 수 있다. 예를 들어, J695 또는 J695-관련된 VH 및 VL 서열을 전장 항체 유전자로 전환시키는 한가지 접근법은 이들을 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 각각 미리 암호화하는 발현 벡터내에 삽입시켜, VH 절편을 벡터내에서 CH 절편에 작동적으로 연결시키고, VL 절편을 벡터내에서 CL 절편에 작동적으로 연결시키는 것이다. 또한, 재조합 발현 벡터는 항체 쇄의 숙주 세포로부터의 분비를 용이하게 하는 시그널 펩타이드를 암호화한다. 항체 쇄 유전자를 벡터내로 클로닝시켜, 시그널 펩타이드를 항체 쇄 유전자의 아미노산 말단에 프레임으로 연결시킬 수 있다. 시그널 펩타이드는 면역글로불린 시그널 펩타이드 또는 이종성 시그널 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 시그널 펩타이드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포내에 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 해독을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 인자(예를 들어, 폴리아데닐화 시그널)을 포함하는 것으로 나타낸다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 문헌[참조: Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)]에 기술되어 있다. 조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터의 디자인은 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 바람직한 단백질 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위해 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포내에서 단백질 발현의 고 수준을 지시하는 바이러스성 인자, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40(SV40)로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들어, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마를 포함한다. 바이러스성 조절 인자 또는 이의 서열의 추가의 기술에 대해서는, 미국 특허 제5,168,062호(Stinski), 미국 특허 제4,510,245호(Bell et al.), 미국 특허 제4,968,615호(Schaffner et al.), 미국 특허 제5,464,759호(Bujard et al.) 및 미국 특허 제5,654,168호(Bujard et al.)를 참조한다.
항체 쇄 유전자 및 조절 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들어, 숙주 세포내에서 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기원) 및 선택가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다[참조예: 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호(Axel et al.)]. 예를 들어, 전형적으로는 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에서 약물, 예를 들어, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 제공한다. 바람직한 선택가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 갖는 dhfr- 숙주 세포내에서 사용하기 위해) 및 neo 유전자(G418 선택의 경우)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)를 표준 기법에 의해 숙주 세포내로 형질감염시킨다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA의 원핵 또는 진핵 숙주 세포로의 도입에 통상적으로 사용되는 다양한 기법, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-인산염 침전법, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함함을 의미한다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포내에서 발현시키는 것이 이론적으로 가능하다 하더라도, 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포내에서의 항체의 발현이, 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적합하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블링하고 분비하기에 적합하기 때문에 가장 바람직하다. 본 발명의 재조합 항체를 발현시키기에 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포[예를 들어, 문헌(참조: R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621)에 기술된 바와 같은 DHFR 선택가능한 마커와 함께 사용되는, 문헌(참조: Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220)에 기술된 dhfr- CHO 세포 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 발현시키는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포내에 도입할 경우에, 항체는 숙주 세포내에서 항체를 발현시키거나, 또는 보다 바람직하게는 항체를 숙주 세포가 성장할 배양 배지내로 분비시키기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양시킴으로써 제조한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
또한, 숙주 세포를 사용하여, 무손상 항체의 부분, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포를 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄(둘 다는 아님)를 암호화하는 DNA로 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 사용하여, hIL-12A에 결합하는데 필수적이지 않은 경쇄 또는 중쇄 또는 둘 다를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전체를 제거할 수 있다. 이러한 절단된 DNA 분자로부터 발현된 분자는 또한 본 발명의 항체에 의해 포함된다. 또한, 특정 중쇄 및 특정 경쇄가 본 발명의 항체이고, 또 다른 중쇄 및 경쇄가 hIL-12 이외의 항원에 대해 특이적인 이작용성 항체를, 본 발명의 항체를 표준 화학적 교차결합 방법에 의해 제2 항체에 교차결합시킴으로써 제조할 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합부의 재조합 발현에 바람직한 시스템에 있어서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 인산칼슘-매개된 형질감염에 의해 dhfr- CHO 세포내에 도입한다. 재조합 발현 벡터내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 인핸서/프로모터 조절 인자(예를 들어, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유래된 것, 예를 들어, CMV 인핸서/adMLP 프로모터 조절 인자 또는 SV40 인핸서/adMLP 프로모터 조절 인자)에 각각 작동적으로 연결시켜, 유전자의 고 수준 전사를 유도시킨다. 재조합 발현 벡터는 또한 메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 분비를 가능하게 하는 DHFR 유전자를 보유한다. 분비된 형질전환 숙주 세포를 배양시켜, 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 가능하게 하고, 무손상 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기법을 사용하여, 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체에 대해 선택하고, 숙주 세포를 배양시키고, 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 사람 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환성인 동물(예를 들어, 마우스)내에서 발현시킬 수 있다[참조예: Taylor, L.D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295]. 식물 세포를 또한 변형시켜, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현시키는 형질전환 식물을 생성시킬 수 있다.
상기한 관점에서, 본 발명의 또 다른 국면은 본 발명의 항체 및 항체 일부의 재조합 발현에 사용할 수 있는 핵산, 벡터 및 숙주 세포 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 J695의 CDR 또는 J695의 완전 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 핵산을 특징으로 한다. 따라서, 한 양태에 있어서, 본 발명은 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 J695 중쇄 CDR3을 암호화하는 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 핵산을 특징으로 한다. 바람직하게는, 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 J695 중쇄 CDR2를 추가로 암호화한다. 보다 바람직하게는, 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 J695 중쇄 CDR1을 추가로 암호화한다. 보다 더 바람직하게는, 당해 분리된 핵산은 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역(J695의 완전 VH 영역)을 암호화한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 J695 경쇄 CDR3을 암호화하는 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 핵산을 특징으로 한다. 바람직하게는, 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 J695 중쇄 CDR2를 추가로 암호화한다. 보다 바람직하게는, 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 J695 경쇄 CDR1을 추가로 암호화한다. 보다 더 바람직하게는, 당해 분리된 핵산은 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역(J695의 완전 VL 영역)을 암호화한다.
또한, 본 발명은 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 둘 다 암호화하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 한 양태에 있어서, 본 발명은
a) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체 중쇄 및
b) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체 경쇄를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이고, 보다 바람직 하게는 숙주 세포는 CHO 세포, NS0 세포 또는 COS 세포이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 적합한 배양 배지내에서 본 발명의 재조합 사람 항체가 합성될 때까지 배양시킴으로써 본 발명의 재조합 사람 항체를 합성하는 방법을 추가로 제공한다. 당해 방법은 재조합 사람 항체를 배양 배지로부터 분리함을 추가로 포함할 수 있다.
VI. 약제학적 조성물 및 약제학적 투여
본 발명의 항체 및 항체 일부를 환자에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물내에 혼입할 수 있다. 전형적으로는, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 일부 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 특정 및 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항살균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 중의 하나 이상, 및 이의 배합물을 포함한다. 다수의 경우에, 등장성 제제, 예를 들어, 슈가, 폴리알콜, 예를 들어, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 조성물내에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 항체 또는 항체 일부의 반감기 또는 효능을 증진시키는, 미량의 보조 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 일부를 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물내에 혼입할 수 있다. 바람직하게는 항체 또는 항체 일부를 항체 0.1 내지 250mg/ml를 함유하는 주사가능한 용제로서 제조할 수 있다. 주사가능한 용제는 플린트 또는 호박색 바이알, 앰풀 또는 예비 충전된 주사기내에 액체 또는 동결건조된 투여형으로 구성될 수 있다. 완충제는 pH 5.0 내지 7.0(최적으로 pH 6.0)에서 L-히스티딘(1-50mM), 최적으로 5-10mM일 수 있다. 다른 적합한 완충제는, 석신산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 염화나트륨을 사용하여, 0 내지 300mM(액체 투여 형태에 경우 최적으로 150mM)의 농도에서 용제의 독성을 개질시킬 수 있다. 동결방지제, 주로 0-10% 수크로즈(최적으로 0.5-1.0%)을 동결건조된 투여 형태의 경우에 포함시킬 수 있다. 다른 적합한 동결방지제는 트레할로즈 및 락토즈를 포함한다. 벌킹제, 주로 1-10% 만니톨(최적으로 2-4%)을 동결건조된 투여 형태의 경우에 포함시킬 수 있다. 안정화제, 주로 1-50mM L-메티오닌(최적으로 5-10mM)을 액체 및 동결건조된 투여 형태 둘 다에 사용할 수 있다. 다른 적합한 벌킹제는 글리신 및 아르기닌을 포함한다. 계면활성제는 0-0.05% 폴리소르베이트-80(최적으로 0.005-0.01%)으로서 포함될 수 있다. 또 다른 계면활성제는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
바람직한 양태에 있어서, 약제학적 조성물은 항체를 약 0.01 내지 10mg/kg의 투여량으로 포함한다. 항체의 보다 바람직한 투여량은 매주 투여되는 1mg/kg 또는 매주 투여되는 0.3mg/kg을 포함한다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예를 들어, 액체 용제(예를 들어, 주사가능하고 주입가능 한 용제), 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료학적 용도에 따라 달라진다. 전형적인 바람직한 조성물은 사람의 다른 항체와의 수동 면역화에 사용되는 것들과 유사한 조성물과 같이 주사가능하거나 주입가능한 용제 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 양태에 있어서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여한다.
치료학적 조성물은 전형적으로는 제조 및 저장 조건하에 무균적이고 안정하여야만 한다. 당해 조성물은 용제, 미세유제, 분산제, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 지시된 구조로서 제형화시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용제는 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체 일부)을, 필요한 경우에 상기한 성분 중의 하나 또는 배합물과 함께 필요량으로 적합한 용매내에 혼입시킨 다음, 여과 멸균시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로는, 분산제는 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기한 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클내에 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사가능한 용제의 제조를 위한 멸균, 동결건조된 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 분무 건조법이다. 용제의 적합한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 피복물의 사용에 의해, 분산제의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물내에 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 일부를 당해 분야의 다양한 방법에 의해 투여할 수 있으나, 다수의 치료학적 용도의 경우에, 투여의 바람직한 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자에 의해 자명한 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 표적하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 특정 양태에 있어서, 활성 화합물은 당해 화합물을 신속한 방출에 대해 보호할 수 있는 담체와 함께, 예를 들어, 삽입물, 경피 패치 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한 조절된 방출 제형과 같이 제조할 수 있다. 생체내분해가능하고, 생체적합성 중합체, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 상기 제형을 제조하는 다수의 방법은 특허출원되었거나 당해 분야의 숙련가에게 일반적으로 공지되어 있다[참조예: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed. Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].
특정 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부를, 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구적으로 투여할 수 있다. 화합물(및 필요한 경우에 다른 성분)을 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐내에 봉입하거나, 정제로 압축하거나, 환자의 식이에 직접적으로 혼입할 수도 있다. 경구용 치료학적 투여의 경우에, 화합물을 부형제와 함께 혼입하여, 섭취가능한 정제, 거환 정제, 트로키, 캡슐제, 엘릭시르, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼 등의 형태로 사용할 수 있다. 비경구 투여 이외의 방식에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물을 이의 불활성화를 방지하는 재료로 피복시키거나, 이와 함께 공투여하는 것이 필 요할 수 있다.
보충적인 활성 화합물을 또한 조성물내에 혼입할 수도 있다. 특정 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 IL-12 활성이 손상되는 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가의 치료제(예를 들어, 다른 사이토카인을 결합시키거나 세포 표면 분자를 결합시키는 항체)와 함께 공동제형화시키고/거나 공투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 2종 이상의 치료제와 함께 사용할 수 있다. 이러한 병용 요법은 유리하게는 투여된 치료제의 보다 낮은 투여량을 이용하여, 다양한 단독요법과 관련된 가능한 독성 또는 복잡함은 방지할 수 있다. 본 발명의 항체를 병용 요법의 일부로서 사용할 경우에, 항체를 단독으로 환자에게 투여하는 경우보다 낮은 투여량의 항체가 바람직할 수 있음(예를 들어, 상승작용성 치료학적 효과는 교대로 보다 낮은 투여량의 항체의 사용이 표적하는 치료학적 효과를 달성하게 하는 병용 요법의 사용에 의해 달성할 수 있다)은 숙련가에게 명백할 것이다.
인터류킨 12는 면역 및 염증성 인자를 포함한 다양한 질병과 관련된 병리학에서 중요한 역할을 한다. 이들 질병은, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 크론 질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질병, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질병, 건선, 피부염, 피부경화증, 아토피성 피부염, 이식편 대 숙주 질병, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질병, 유육종증, 죽상경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 결절성 다발 동맥염, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇼엔라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 쇼그렌 증후군, 포도막염, 패혈증, 패혈성 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질병, 기생충 질병, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 중증근무력증, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전증, 심근경색, 애디슨병, 산발성 질병, 다분비선 제I형 결핍증 및 다분비선 제II형 결핍증, 슈미트 증후군, 성인성(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청반응 음성 관절증, 관절증, 라이터병, 건선성 관절증, 궤양성 대장염성 관절증, 장병증성 활막염, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절병, 클라미디아증, 죽종 질병/죽상경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질병, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선상 IgA 질병, 자가면역 용혈성 빈혈, 크움즈 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 소아 악성 빈혈, 근통성 뇌염/로얄 프리(Royal Free) 질병, 만성 점막 피부 칸디다증, 거세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 질병 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질병, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 감마글로불린저혈증), 확장형 심근증, 여성 불임증, 난소 부전증, 조기 난소 부전증, 섬유성 폐 질병, 잠복성 섬유조직 폐포염, 후-염증성 간질성 폐렴, 간질성 폐렴, 결합 조직 질병 관련 간질성 폐 질병, 조합성 결합 조직 질병 관련 폐 질병, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질병, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐 질병, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질병, 피부근염/다발성 근염 관련 폐 질병, 쇼그렌 질병 관련 폐 질병, 강직성 척추염 관련 폐 질병, 혈관염 범발성 폐 질병, 혈철증 관련 폐 질병, 약물-유도된 간질성 폐 질병, 방사선 섬유증, 폐색성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤성 폐 질병, 감염후 간질성 폐 질병, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(전형적 자가면역 또는 루포이드 간염), 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 극세포증에 따른 B형 인슐린 저항성, 부갑상선 기능저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질병, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질병, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구감소증, 신장 질병 NOS, 사구체신염, 라임병, 원판양 홍반성 낭창, 남성 불임증 특발증 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 인슐린-의존성 당뇨병, 교감성 안염, 결합 조직 질병에 속발성인 폐 고혈압증, 구드패스튜어 증후군, 결절성 다발성 동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 열, 류마티스성 척추염, 스틸씨 병, 전신성 경화증, 다카야스 병/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질병, 갑상선 기능항진증, 갑상선종증 자가면역 갑상선 기능저하증(하시모토 병), 위축성 자가면역 갑상선 기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염 및 백반증을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 사람 항체 및 항체 일부를 사용하여, 자가면역 질병, 류마티스성 척추염, 알레르기, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염을 포함한, 특히 염증과 관련된 질병을 치료하는데 사용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 VII부에 보다 상세하게 기술한 바와 같이 류마티스성 관절염, 크론병, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 진성 당뇨병 및 건선을 치료하는데 사용한다.
본 발명의 사람 항체 또는 항체 일부를 또한 자가면역 및 염증성 질병의 치료에 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 투여할 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 단독으로 또는 배합물로 상기 질병을 치료할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 단독으로 또는 의도된 표적을 위해 숙련가에 의해 선택된 추가의 제제, 예를 들어, 치료제와 배합하여 사용할 수 있음을 이해하여야만 한다. 예를 들어, 추가의 제제는 본 발명의 항체에 의해 치료할 질병 또는 상태를 치료하는데 유용한 것으로 당해 분야에 인지된 치료제일 수 있다. 추가의 제제는 또한 치료학적 조성물에 유익한 특성을 제공하는 제제, 예를 들어, 조성물의 점도에 영향을 주는 제제일 수 있다.
또한, 본 발명내에 포함될 수 있는 조성물은 이들의 의도된 표적에 유용한 배합물임을 이해하여야만 한다. 아래에 기재된 제제는 상기 표적에 대해 예시적인 것이지, 이로써 한정되지는 않는다. 본 발명의 일부인 배합물은 본 발명의 항체 및 아래에 기재된 것으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 제제일 수 있다. 당해 배합물은 또한 하나 이상의 추가의 제제, 예를 들어, 배합물이 형성된 조성물이 이의 의도된 기능을 수행할 수 있도록 할 경우에, 2종 또는 3종의 추가의 제제를 포함할 수 있다.
바람직한 배합물은 이부프로펜과 같은 약물을 포함하는 NSAIDS로도 불리는 비-스테로이드계 항-염증성 약물이다. 다른 바람직한 배합물은 프레드니솔론을 포함한 코르티코스테로이드이고, 스테로이드 사용의 익히 공지된 부작용은 본 발명의 항-IL-12 항체와 함께 사용하여 환자를 치료할 경우에 필요로 하는 스테로이드 투여량을 점감시킴으로써 감소시키거나 심지어 배제할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 일부과 병용할 수 있는 류마티스성 관절염 치료제의 비제한적인 예는 다음과 같다: 사이토카인 억제 항-염증성 약물(CSAID); 다른 사람 사이토카인 또는 성장 인자, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF에 대한 항체 또는 이의 길항제를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 세포 표면 분자, 예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90 또는 C154(gp39 또는 CD40L)을 포함한 이의 리간드에 대한 항체와 배합할 수 있다.
치료제의 바람직한 배합물은 자가면역 및 후속적인 염증성 연쇄증폭반응에서 상이한 지점에서 방해할 수 있으며, 바람직한 예는 키메라, 사람화 또는 사람 TNF 항체, D2E7(1996년 2월 9일에 출원된 미국 특허원 제08/599,266호), cA2(Remicade™), CDP 571, 항-TNF 항체 단편(예를 들어, CDP870) 및 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이의 유도체, p75TNFR1gG(Enbrel™) 또는 p55TNFR1gG(Lenercept), 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)와 같은 TNF 길항제, 및 또한 TNFα 전환 효소(TACE) 억제제를 포함하며, 유사하게는, IL-1 억제제(예를 들어, 인터류킨-1-전환 효소 억제제, 예를 들어, Vx740 또는 UL-1RA 등)가 동일한 이유로 효과적일 수 있다. 다른 바람직한 배합물은 인터류킨 11, 항-P7s 및 p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL)를 포함한다. 또 다른 바람직한 배합물은 IL-12 기능에 상당하게, 이에 의존적으로 또는 이와 동시에 작용할 수 있는 자가면역 반응의 다른 주요 기능제이며, IL-18 항체 또는 가용성 IL-18 수용체를 포함한 IL-18 길항제, 또는 IL-18 결합 단백질이 특히 바람직하다. IL-12 및 IL-18이 오버랩핑되기는 하나, 독특한 기능 및 둘 다에 대한 길항제의 배합물이 가장 효과적인 것으로 제시되어 있다. 또 다른 바람직한 배합물은 비-결핍 항-CD4 억제제이다. 또 다른 바람직한 배합물은 항체, 가용성 수용체 또는 길항성 리간드를 포함한 공-자극적 경로 CD80(B7.1) 또는 CD86(B7.2)의 길항제를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 또한 제제, 예를 들어, 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린, 설파살라진, 메살라진, 올살라진 클로로퀴닌/하이드록시클로로퀸, 펜실라민, 아우로티오말레이트(근육내 및 경구), 아자티오프린, 코치신, 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국부 주사), 베타-2 아드레노수용체 효능제(살부타몰, 테르부탈린, 살메테랄), 크산틴(테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트, 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들어, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들어, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노소신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린성 제제, 프로염증성 사이토카인, 예를 들어, TNFα 또는 IL-1에 의한 시그널 전달을 방해하는 제제(예를 들어, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환 효소 억제제(예를 들어, Vx740), 항-P7s, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TNFα 전환 효소(TACE) 억제제, T-세포 시그널링 억제제, 예를 들어, 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체 및 이의 유도체(예를 들어, p55 또는 p75 TNF 수용체 및 유도체 p75TNFIgG(Enbrel™) 및 p55TNFRIgG(Lenercept), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)) 및 소염성 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ)과 배합할 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 일부과 배합할 수 있는 염증성 장 질병용 치료제의 비제한적인 예는 부데노사이드; 상피 성장 인자; 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 설파살라진; 아미노살리실레이트; 6-머캅토퓨린; 아자티오프린; 메트로니다졸; 리폭시게나제 억제제; 메살라민; 올살라진; 발살라자이드; 항산화제; 트롬복산 억제제; IL-1 수용체 길항제; 항-IL-1β 모노클로날 항체; 항-IL-6 모노클로날 항체; 성장 인자; 엘라스타제 억제제; 피리디닐-이미다졸 화합물; 다른 사람 사이토카인 또는 성장 인자, 예를 들어, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF에 대한 항체 또는 이의 길항제를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 세포 표면 분자, 예를 들어, CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는 이의 리간드에 대한 항체와 배합할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 제제, 예를 들어, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들어, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들어, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린성 제제, 프로염증성 사이토카인, 예를 들어, TNFα 또는 IL-1에 의한 시그널 전달을 방해하는 제제(예를 들어, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환 효소 억제제(예를 들어, Vx740), 항-P7s, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TNFα 전환 효소(TACE) 억제제, T-세포 시그널링 억제제, 예를 들어, 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체 및 이의 유도체(예를 들어, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)) 및 소염성 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ)과 배합할 수도 있다.
항체 또는 이의 항원 결합부과 배합할 수 있는 크론병용 치료제의 바람직한 예는, TNF 길항제, 예를 들어, 항-TNF 항체, D2E7(1996년 2월 9일에 출원된 미국 특허원 제08/599,266호), cA2(Remicade™), CDP 571, 항-TNF 항체 단편(예를 들어, CDP870), TNFR-Ig 작제물(p75TNFR1gG(Enbrel™) 또는 p55TNFR1gG(Lenercept)), 항-P7s, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), 가용성 IL-13 수용체(sIL-13) 및 PDE4 억제제를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 코르티코스테로이드, 예를 들어, 부데노사이드 및 덱사메타손과 배합할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합을 또한 제제, 예를 들어, 설파살라진, 5-아미노살리실산 및 올살라진, 및 프로염증성 사이토카인, 예를 들어, IL-1의 합성 또는 작용을 방해하는 제제, 예를 들어, IL-1β 전환 효소 억제제(예를 들어, Vx740) 및 IL-1ra와 배합할 수도 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 또한 T-세포 시그널 전달 억제제, 예를 들어, 티로신 키나제 억제제 6-머캅토퓨린과 함께 사용할 수도 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 IL-11과 배합할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 일부를 배합할 수 있는 다발성 경화증용 치료제의 비제한적인 예는 코르티코스테로이드; 프레드니솔론; 메틸프레드니솔론; 아자티오프린; 사이클로포스파미드; 사이클로스포린; 메토트렉세이트; 4-아미노피리딘; 티자니딘; 인터페론-β1a(Avonex; Viogen); 인터페론-β1b(Betaseron; Chiron/Berlex); Copolymer 1(Cop-1; Copaxone; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압 산소; 정맥내 면역글로불린; 클라브리빈; 다른 사람 사이토카인 또는 성장인자, 예를 들어, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF에 대한 항체 또는 이의 길항제를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 세포 표면 분자, 예를 들어, CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 또는 이의 리간드에 대한 항체와 배합할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 제제, 예를 들어, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들어, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들어, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린성 제제, 프로염증성 사이토카인, 예를 들어, TNFα 또는 IL-1에 의한 시그널링을 방해하는 제제(예를 들어, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환 효소 억제제(예를 들어, Vx740), 항-P7s, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TNFα 전환 효소(TACE) 억제제, T-세포 시그널 전달 억제제, 예를 들어, 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체 및 이의 유도체(예를 들어, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)) 및 소염성 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ)과 배합할 수도 있다.
항체 또는 이의 항원 결합부와 배합할 수 있는 다발성 경화증 치료제의 바람직한 예는 인터페론-β, 예를 들어, IFNβ1a 및 IFNβ1b; 코팍손, 코르티코스테로이드, IL-1 억제제, TNF 억제제, 및 CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 일부의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량은 목적하는 치료학적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 및 투여 시간 동안 유효한 양을 의미한다. 항체 또는 항체 일부의 치료학적 유효량은 환자의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 표적하는 반응을 유도하는 항체 또는 항체 일부의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 항체 또는 항체 일부의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유리한 효과보다 덜 한 양이다. "예방학적 유효량"은 표적하는 예방학적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 및 시간 동안 유효한 양을 의미한다. 전형적으로는, 예방학적 투여량은 질병의 직전에 또는 초기에 환자에게 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량 미만일 것이다.
투여 계획을 조정하여, 최적의 표적하는 반응(예를 들어, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공할 수 있다. 예를 들어, 단일 일시 주사로 투여할 수 있거나, 다수의 분할된 투여량을 경시적으로 투여할 수 있거나, 투여량을 치료학적 상태의 필요성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 비경구 조성물로 제형화시키는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료할 포유동물 환자에 대한 단일 투여량으로서 적합화된 물리적으로 별개의 단위를 의미하며, 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 표적하는 치료학적 효과를 생성시키기 위해 계산된 활성 화합물의 예정된 양을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 상술은 (a) 활성 화합물의 특유의 특성 및 달성할 특정한 치료학적 또는 예방학적 효과 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위해 상기한 활성 화합물을 화합하는 분야에서의 고유의 제한에 의해 및 이에 직접적으로 의존하여 지시된다.
본 발명의 항체 또는 항체 일부의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 0.01-20mg/kg, 보다 바람직하게는 1-10mg/kg, 보다 더 바람직하게는 0.3-1mg/kg이다. 투여량 수치는 완화시킬 상태의 유형 및 증증도에 따라 달라질 수 있음을 주지하여야 한다. 또한, 임의의 특유의 환자에 대해, 구체적인 투여량 계획을 개체의 필요성 및 조성물을 투여하고 이의 투여를 지시하는 사람의 전문적인 판단에 따라 경시적으로 조정하여야 하고, 본원에 기재된 투여량 범위는 단지 예시적인 것이지, 청구된 조성물의 범주 또는 시행을 제한하고자 하는 것이 아님을 추가로 이해하여야만 한다.
VII. 본 발명의 항체의 용도
hIL-12에 결합하는 능력이 제공될 경우, 본 발명의 항-hIL-12 항체 또는 이의 부분을 사용하고, 통상적인 면역분석법, 예를 들어, 효소 연결된 면역흡착 분석법(ELISA), 방사성면역분석법(RIA) 또는 조직 면역조직화학을 이용하여, (예를 들어, 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈청 또는 혈장내에서) hIL-12를 검출할 수 있다. 본 발명은 생물학적 샘플을 본 발명의 항체 또는 항체 일부과 접촉시키고, hIL-12에 결합된 항체(또는 항체 일부) 또는 결합된 항체(또는 항체 일부)을 검출하여, 생물학적 샘플내에서 hIL-12를 검출함을 포함하여, 생물학적 샘플내에서 hIL-12를 검출하는 방법을 제공한다. 항체를 검출가능한 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지시켜, 결합되거나 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 한다. 적합한 검출가능한 물질은 다양한 효소, 인공 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시아제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고, 적합한 인공 그룹 복합체의 예는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고, 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고, 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고, 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
항체를 표지시키는 대안으로, hIL-12를 분석가능한 물질로 표지된 rhIL-12 표준물 및 미표지된 항-hIL-12 항체를 이용하는 경쟁 면역분석법에 의해 생물학적 유체내에서 분석할 수 있다. 이러한 분석법에 있어서, 생물학적 샘플, 표지된 rhIL-12 표준물 및 항-hIL-12 항체를 배합하고, 미표지된 항체에 결합된 표지된 rhIL-12 표준물의 양을 측정한다. 생물학적 샘플내의 hIL-12의 양은 항-hIL-12 항체에 결합된 표지된 rhIL-12 표준물의 양에 반비례한다.
또한, 본 발명의 Y61 및 J695 항체를 사용하여, 사람 이외의 종으로부터의 IL-12, 특히 영장류로부터의 IL-12를 검출할 수 있다. 예를 들어, Y61을 사용하여, 사이노몰거스 원숭이 및 레서스 원숭이내에서 IL-12를 검출할 수 있다. J695를 사용하여, 사이노몰거스 원숭이, 레서스 원숭이 및 비비내에서 IL-12를 검출할 수 있다. 그러나, 항체는 마우스나 래트 IL-12와 교차반응하지 않는다(실시예 3, 서브섹션 F 참조).
본 발명의 항체 및 항체 일부는 시험관내에서(실시예 3 참조) 및 생체내에서(실시예 4 참조) hIL-12 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 일부를 사용하여, IL-12 활성을, 예를 들어, hIL-12를 함유하는 세포 배양물, 사람 환자 또는 본 발명의 항체가 교차반응할 수 있는 IL-12를 갖는 다른 포유동물 환자(예를 들어, 비비, 사이노몰거스 및 레서스와 같은 영장류)내에서 억제할 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 사람 IL-12와, 비비 IL-12, 마모셋 IL-12, 침팬지 IL-12, 사이노몰거스 IL-12 및 레서스 IL-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 영장류 IL-12의 활성을 중화시키나, 마우스 IL-12의 활성은 중화시키지 않는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 바람직하게는, IL-12는 사람 IL-12이다. 예를 들어, 세포 hIL-12를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 세포 배양물내에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 배양 배지에 가하여, 배양물내에서 hIL-12 활성을 억제할 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 IL-12 활성이 손상된 장애를 앓는 환자에서 IL-12의 활성을 억제하는 방법을 제공한다. IL-12는 다양한 장애의 병리학에 관련되어 있다[참조: Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996; Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism. 41:306-314; Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 193:347-367; Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology. 112:1169-1178 및 Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152:667-672; Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150:823-832]. 본 발명은 환자에게 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 투여하여, 환자에서 IL-12 활성을 억제함을 포함하여, 상기 장애를 앓고 있는 환자에서 IL-12 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, IL-12는 사람 IL-12이고, 환자는 사람 환자이다. 또는, 환자는 본 발명의 항체가 교차반응하는 IL-12를 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한, 환자는 (hIL-12의 투여 또는 hIL-12 형질전환 유전자의 발현에 의해) hIL-12를 도입시킨 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료학적 표적(아래에 추가로 논의됨)을 위해 사람 환자에게 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 항체가 수의학적 표적을 위해 또는 사람 질병의 동물 모델로서 교차반응하는 IL-12를 발현시키는 비-사람 포유동물에게 투여할 수 있다. 후자와 관련하여, 상기 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료학적 효능을 평가(예를 들어, 투여량 및 투여 시간의 시험)하는데 유용할 수 있다.
본원에 사용된 문장 "IL-12 활성이 손상되는 장애"는 장애를 앓고 있는 환자에서 IL-12의 존재가 장애의 병리생리학에 대한 원인이거나 장애의 악화에 기여하는 인자인 것으로 나타나거나 의심되는 질병 및 다른 장애를 포함하고자 한다. 따라서, IL-12 활성이 손상되는 장애는 IL-12 활성의 억제가 장애의 증상 및/또는 장애의 진행을 완화시키는 것으로 예상되는 장애이다. 이러한 장애는, 예를 들어, 상기한 바와 같은 항-IL-12 항체를 사용하여 검출할 수 있는, 예를 들어, 당해 장애를 앓고 있는 환자의 생물학적 체액내에서의 IL-12 농도의 증가(예를 들어, 환자의 혈청, 혈장, 활액에서의 IL-12의 농도의 증가)에 의해 나타날 수 있다. IL-12 활성이 손상되는 장애의 예는 다수 존재한다. 한 양태에 있어서, 항체 또는 이의 항체-결합부를 본원에서 기술된 질병 또는 장애를 치료하는 요법에서 사용할 수 있다. 또 다른 양태에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 본원에 기술된 질병 또는 장애 치료용 약제를 제조하기 위한 제조방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 및 항체 일부의 소수의 비제한적인 구체적 용도는 아래에 추가로 논의한다:
A. 류마티스성 관절염:
인터류킨-12는 류마티스성 관절염과 같은 염증성 질병에서의 작용과 관련되어 있다. 유도가능한 IL-12 p40 메시지는 류마티스성 관절염 환자로부터의 활액으로부터 검출되었고, IL-12는 류마티스성 관절염을 앓고 있는 환자로부터/환자의 활액내에 존재하는 것으로 제시되었다[참조예: Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism 41:306-314]. IL-12 양성 세포는 류마티스성 관절염 활액의 서브라이닝 층내에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 사람 항체 및 항체 일부를, 예를 들어, 류마티스성 관절염, 소아 만성 관절염, 라임 관절염, 류마티스성 척추염, 골관절염 및 통풍성 관절염을 치료하는데 사용할 수 있다. 전형적으로는, 항체 또는 항체 일부를 전신 투여할 수 있으나, 특정 장애의 경우에는, 항체 또는 항체 일부의 국부 투여가 유리할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 또한 자가면역 질병에 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 투여할 수 있다.
류마티스성 관절염에 대한 콜라겐 유도된 관절염(CIA) 마우스 모델에 있어서, 관절염 전에 항-IL-12 mAb(래트 항-마우스 IL-12 모노클로날 항체, C17.15)로 마우스를 치료할 경우에, 질병의 발현이 완전하게 억제되고, 발생 및 중증도가 감소된다. 관절염의 발현 전에 항-IL-12 mAb를 이용한 치료는 중증도를 감소시키나, 질병의 발현 후에 마우스를 항-IL-12 mAb로 치료할 경우에는 질병 중증도에 미세한 영향을 미친다.
B. 크론질병
인터류킨-12는 또한 염증성 장 질병, 크론병에서 작용을 한다. IFN-γ 및 IL-12의 증가된 발현은 크론병을 앓고 있는 환자의 장 점막에서 발생한다[참조예: Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Parronchi et al., (1997) Amer. J. Pathol. 150: 823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178; Berrebi et al., (1998) Amer. J. Pathol. 152: 667-672]. 항-IL-12 항체는 대장염의 마우스 모델, 예를 들어, TNBS 유도된 대장염 IL-2 녹아웃 마우스, 최근에는 IL-10 녹아웃 마우스에서 질병을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 일부를 염증성 장 질병의 치료에 사용할 수 있다.
C. 다발성 경화증
인터류킨-12는 다발성 경화증의 주요한 매개인자로서 관련되어 있다. 유도가능한 IL-12 p40 메시지 또는 IL-12 자체의 발현은 다발성 경화증을 앓고 있는 환자의 병소에서 입증될 수 있다[참조: Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996; Drulovic et al., (1997) J. Neurol. Sci. 147: 145-150]. 다발성 경화증을 앓고 있는 만성 진행성 환자는 IL-12의 순환 수준이 증가된다. 다발성 경화증을 앓고 있는 환자로부터의 T-세포 및 항원 제시 세포(APC)를 사용한 조사에 의해 Th1-형 면역 반응을 유발하는 진행성 다발성 경화증의 기초로서 자가-영속하는 일련의 면역 반응을 밝혀내었다. T-세포로부터의 IFN-γ의 증가된 분비는 APC에 의해 증가된 IL-12 생산을 유도하고, 이는 Th-1형 면역 활성화 및 질병의 만성 상태를 유도하는 사이클을 영속시킨다[참조: Balashov et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 599-603]. 다발성 경화증에서의 IL-12의 역할은 다발성 경화증의 래트 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE) 모델을 이용하여 조사하였다. 마우스의 다발성 경화증의 재발-경감 EAE 모델에 있어서, 항-IL-12 mAb로의 예비처리는 마비를 지연시키고, 임상적 점수를 감소시킨다. 마비의 피크에서 또는 후속적인 경감 기간 동안의 항-IL-12 mAb로의 처리는 임상적 점수를 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 사람에서 다발성 경화증과 관련된 증상을 완화시키는 작용을 할 것이다.
D. 인슐린-의존성 당뇨병
인터류킨-12는 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM)의 중요한 매개인자로서 관련되어 있다. IDDM은 NOD 마우스에서 IL-12의 투여에 의해 유도되고, 항-IL-12 항체는 IDDM의 입양 전달 모델에서 보호성이다. 조기 발현 IDDM 환자는 종종 특정의 잔류하는 소도 세포 기능이 유지되는 동안 소위 "허니문 기간"을 겪는다. 이들 잔류하는 소도 세포는 인슐린을 생산하고, 투여된 인슐린보다 우수한 혈당 수준을 조절한다. 항-IL-12 항체를 사용한 이들 조기 발현 환자의 치료는 소도 세포의 추가의 파괴를 억제하여, 인슐린의 내인성 공급원을 유지할 수 있다.
E. 건선
인터류킨-12는 건선의 주요 매개인자로서 관련되어 있다. 건선은 TH1-형 사이토카인 발현 프로파일과 관련된 급성 및 만성 피부 병소를 포함한다[참조: Hamid et al., (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1:225-231; Turka et al., (1995) Mol. Med. 1:690-699]. IL-12 p35 및 p40 mRNA가 질병을 앓고 있는 사람 피부 샘플에서 검출된다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부가 건선과 같은 만성 피부 장애를 완화시키는 작용을 할 것이다.
본 발명은 어떠한 방식으로든 제한으로서 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다. 본원을 통해 언급된 바와 같은, 참고 문헌, 허여된 특허 및 공개된 특허원을 포함한 모든 언급된 참고문헌의 내용은 참고로 명백하게 본원에 인용한다. 이에 관련하여 첨부된 모든 표(첨부자료 A 참조)의 내용은 참고로 인용된 것임을 또한 이해하여야만 한다.
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실시예 1: 항-IL-12 항체의 분리
A. IL-12 조합 항체에 대한 선별
hIL-12에 대한 항체를 사람 편도선로부터 유래된 사람 VL 및 VH cDNA, 편도선과 말초혈 림프구(PBL), 및 골수-유래된 림프구를 사용하여 제조된 3종의 별개의 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리(각각 scFv 1, scFv 2 및 scFv 3으로 칭함)를 선별함으로써 분리한다. 라이브러리의 작제 및 선택 방법은 문헌[참조: Vaughan et al. (1996) Nature Biotech. 14: 309-314]에 기술되어 있다.
상기 라이브러리를 항원, 사람 IL-12 p70 서브유니트, 사람 IL-12 p40 서브유니트, 키메라 IL-12(마우스 p40/사람 p35), 마우스 IL-12, 비오티닐화 사람 IL-12 및 비오티닐화 키메라 IL-12를 사용하여 선별한다. IL-12 특이적 항체는 표준 방법을 이용하여 항원을 면역튜브 위에 피복시킴으로써 선택한다[참조: Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597]. scFv 라이브러리 2를 IL-2 또는 비오티닐화-IL-12를 사용하여 선별하고, 유의한 수의 IL-12 특이적 결합제를 생성시킨다. 5종의 상이한 클론형을 선택하고, BstN1 효소 분해 패턴에 의해 측정하고, DNA 서열화에 의해 확인한다. 주요한 클론형은 VHDP58/VLDPL11, VHDP77/VLDPK31, VHDP47/VL 및 VHDP77/VLDPK31이며, 이들 모두 IL-12의 p40 서브유니트를 인식한다.
IL-12 p70을 사용한 BMDL 라이브러리의 선별은 3종의 상이한 클론형을 생성시킨다. 이들 중 2종은 교차반응성 클론인 것으로 밝혀졌다. 우세한 클론을 서열 결정하는데, VHDP35/VLDP로 이루어져 있다. 당해 클론은 IL-12의 p40 서브유니트를 인식한다. IL-12 p70을 사용한 scFv 라이브러리 1의 선별은 특이적 IL-12 항체를 생성시키지 않는다.
p40 서브유니트보다는 IL-12의 p70 이종성이량체 또는 p35 서브유니트에 우선적으로 결합하는 IL-12 항체를 확인하기 위해, 연합된 scFv 1 + 2 라이브러리 및 BMDL 라이브러리를 사용한다. p70 이종성이량체 또는 p35 서브유니트를 인식하는 IL-12 항체를 선택하기 위해, 파아지 라이브러리를 예비배양시키고, 유리 p40의 존재하에 선택한다. 분리된 클론의 서열화에 의해 9종의 상이한 항체 계열이 밝혀졌다. 서브유니트 우선도는 "마이크로-프리구엣(micro-Friguet)" 적정에 의해 추가로 분석한다. scFv를 함유하는 상등액을 ELISA법으로 비오틴-포획된 IL-12 상에서 적정하고, ED50을 측정한다. 50% ED를 생성시키는 scFv의 농도를 유리 p70 또는 p40(억제제)의 농도를 증가시키면서 예비배양시킨다. 이는 p70 및 p40과 관련하여 각각의 클론에 대해 IC50을 제공한다. 양쪽 서브유니트에 대한 적정이 중복될 경우, scFv는 p40과 p70 둘 다에 결합한다. 이로부터의 임의의 변동은 p40을 능가하는 p70의 우선도를 제공한다.
B. IL-12에 대해 특이적인 항체 계열(Joe 9)의 친화성 성숙
클론을 IL-12가 수용체에 결합하는 것을 억제하는 능력에 대해 IL-12 결합 분석법(RBA로 칭함)으로 시험하고, 실시예 3에 기술된, PHA 자극된 사람 모 세포(PHA 분석법)의 IL-12 유도된 증식을 억제하는 능력에 대해 시험한다. 클론 Joe 9가 RBA 및 PHA 분석법에서 가장 낮은 IC50 값을 가지며, 양쪽 분석법에서 1 x 10-6M의 IC50 값을 갖는다. 또한, Joe 9의 중쇄 가변 영역(VH)은 VBASE 데이터베이스로부터 확인된 가장 근접한 배선 서열 COS-3과 비교하여 가장 적은 수의 변화를 갖는다. 표 1(첨부자료 A 참조)은 COS-3의 배선 서열의 VH3 계열이 배선 서열의 Vλ1 계열의 구성원일 뿐만 아니라 구성원들임을 제시한다. 따라서, Joe 9는 친화성 성숙에 대해 선택된다. Joe9 야생형(Joe9 wt)의 VH 및 VL의 아미노산 서열은 도 1A 내지 1D에 제시되어 있다.
Joe 9의 친화성을 증가시키기 위해, 중쇄 및 경쇄 둘 다의 상보성 결정 부위 3(CDR3)을 다양하게 변이시킨다. CDR3 변이체를 각각의 CDR3에서 평균 3개의 염기 치환("스파이크"로 칭함)을 갖는 중쇄 CDR3("H3"으로 칭함) 또는 경쇄 CDR3("L3"으로 칭함)에 대해 특이적인 축퇴 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 부위-지시된 PCR 돌연변이 유발에 의해 생성시킨다. 중쇄 CDR3의 PCR 돌연변이 유발을 4가지 뉴클레오타이드의 모두의 무작위 조합물을 함유하는 축퇴 중쇄 올리고뉴클레오타이드, 5'TGTCCCTTGGCCCCA(G)(T)(A)(G)(T)(C)(A)(T)(A)(G)(C)(T)(C)(C)(C)(A)(C)(T)GGTCGTACAGTAATA3'(서열 580), 및 올리고뉴클레오타이드 pUC 역배향 태그(Reverse 태그) GAC ACC TCG ATC AGC GGA TAA CAA TTTCAC ACA GG(서열 581)를 사용하여 수행하여, 중쇄 CDR3 돌연변이체의 레퍼토리를 생성시킨다. 모 경쇄를 Joe 9 역배향 올리고뉴클레오타이드(5'TGG GGC CAA GGG ACA3')(서열 582) 및 fdteteseq 24+21 올리고뉴클레오타이드(5'-ATT CGT CCT ATA CCG TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT-3')(서열 583)를 사용하여 증폭시킨다.
2개의 PCR 산물 사이의 상보성을 사용하여, PCR 어셈블리 반응으로 2개의 단편의 어닐링을 유도시키고, 전장 재조합된 scFv 라이브러리를 pUC 역배향 태그(서열 581) 및 fd태그 5'-ATT CGT CCT ATA CCG TTC-3'(서열 584)를 사용하여 증폭시킨다. 경쇄의 PCR 돌연변이 유발은 4가지 뉴클레오타이드 모두의 조합물을 함유하는 경쇄 올리고뉴클레오타이드 5'GGTCCCAGTTCCGAAGACCCTCGAACC(C)(C)(T)(C)(A)(G)(G)(C) (T)(G)(C)(T)(G)(T)(C)ATATGACTGGCAGTAA태그TCAGC3'(서열 585) 및 Joe 9 역배향 올리고뉴클레오타이드 5'TGG GGC CAA GGG ACA3'(서열 586)를 사용하여 수행하여, 경쇄 CDR3 돌연변이체의 레퍼토리를 생성시킨다. 모 중쇄를 pUC 역배향 태그(서열 581) 및 HuJH3FOR 올리고뉴클레오타이드 5'TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3'(서열 587)를 사용하여 증폭시킨다. 2개의 PCR 산물 사이의 상보성을 사용하여, PCR 어셈블리 반응으로 2개의 단편의 어닐링을 유도시키고, 전장 재조합된 scFv 라이브러리를 역배향 태그 GAC ACC TCG ATC AGC G(서열 588) 및 HuJλ 2-3 FOR NOT 올리고뉴클레오타이드 5'GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC 태그 GAC GGT CAG CTT GGT CCC3'(서열 589)를 사용하여 증폭시킨다.
중쇄 CDR3 돌연변이체는 1nM 비오티닐화 IL-12를 사용하여 선택하고, 유리 IL-12 또는 p40을 7nM의 농도로 함유하는 PBS로 실온에서 1시간 동안 세척한다. 클론을 파아지 ELISA에 의해 분석하고, IL-12에 결합된 것을 저밀도 IL-12 칩을 사용하는 BIAcore 카이네틱 결합 연구(실시예 5에서 BIAcore 분석에 대한 과정 참조)로 시험한다. 일반적으로는, BIAcore 분석은 리간드(바이오센서 매트릭스 상에 공정화된 재조합 사람 IL-12)와 분석물(용액 중의 항체)간의 실시간 결합 상호작용을 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)을 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정한다. 당해 시스템은 SPR의 광학 특성을 이용하여, 덱스트란 바이오센서 매트릭스내에서의 단백질 농도의 변화를 검출한다. 단백질은 기지의 농도에서 덱스트란 매트릭스에 공유 결합한다. 항체를 덱스트란 매트릭스를 통과하여 주사하고, 주사된 항체와 고정화된 리간드 사이의 특이적 결합은 증가된 매트릭스 단백질 농도 및 SPR 시그널의 결과적인 변화를 유발시킨다. 이러한 SPR 시그널에 있어서의 변화를 공명 단위(RU)로서 기록하고, 센서그램의 y축을 따라 시간에 대해 나타낸다. 오프 속도(koff), 온 속도(kon), 결합 속도(Ka) 및 해리 속도(Kd) 상수를 측정하기 위해, BIAcore 카이네틱 평가 소프트웨어(버젼 2.1)를 사용한다. Koff 속도에서의 향상을 입증하는 클론을 IL-12의 이의 수용체에의 결합의 항체에 의해 유도된 억제(RBA 분석법), IL-12-유도된 증식의 PHA 자극된 사람 모 세포에서의 억제(PHA 분석법) 및 인터페론 γ 생산의 사람 모 세포에 의한 억제(IFN γ 분석법)를 유도하는 중화 분석법에 의해 분석한다. 중쇄 CDR3 스파이킹된 클론 70-1 내지 70-13의 중화 분석으로부터의 해리 속도 및/또는 IC50 치의 요약은 표 2에 제시한다(첨부자료 A 참조). 클론 70-1은 모 Joe 9 클론보다 우수한 koff 속도를 나타내고, 2.0 x 10-7M의 가장 낮은 IC50 값을 갖는다. 따라서, 클론 70-1은 완전한 IgG1로의 전환에 대해 선택한다.
경쇄 CDR3 돌연변이체는 1nM 비오틴-IL-12를 사용하여 선택하고, 7nM 유리 p40을 함유하는 PBS로 세척한다. 클론을 파아지 ELISA에 의해 분석하고, IL-12에 결합된 것을 저밀도 IL-12 칩을 사용하는 BIAcore 결합 분석법으로 시험한다. 모 Joe 9 클론보다 우수한 오프 속도를 나타내는 클론을 IL-12 수용체 결합의 억제 또는 PHA 모 세포 증식의 억제를 측정하는 중화 분석법에서 시험한다. 경쇄 CDR3 돌연변이체 클론, 78-34 내지 79-1의 중화 분석으로부터의 해리 속도 및/또는 IC50 값의 요약은 표 2에 제시한다(첨부자료 A 참조).
koff 속도를 기준으로 하여, 클론 78-34 및 78-35는 모 Joe 9와 비교하여 향상된 koff 속도를 나타낸다. 이들 클론 둘 다를 중쇄 돌연변이체를 사용하는 결합 분석에 대해 선택한다.
C. 조합 클론
가장 우수한 결합 특성을 나타내는 돌연변이체 경쇄 및 중쇄 클론을 scFv의 결합 및 어셈블리에 사용한다. 향상된 효능 특성을 갖는 돌연변이체 클론을 상기한 바와 같은 돌연변이된 VH 및 VL 절편의 PCR 중첩 증폭 및 연장에 의해 결합시킨다. 표 2(첨부자료 A 참조)에 제시된 클론 101-14 내지 26-1은 중쇄 돌연변이체(70-2, 70-13 및 70-1)와 경쇄 돌연변이체(78-34, 78-35 및 79-1)와의 결합체로부터 생성된다. 이들 클론에 대한 중화 분석으로부터의 koff 속도 및/또는 IC50 치는 표 2에 제시한다.
BIAcore 결합 분석에 의해 오프 속도가 0.0045s-1인 중쇄 CDR3 돌연변이체 클론 70-1과 경쇄 CDR3 돌연변이체 클론 78-34와의 결합체로부터 생성된 클론 101-11을 확인한다. 상기 koff 속도는 중쇄 CDR3 돌연변이화 클론 70-1(0.0134s-1) 또는 경쇄 CDR3 돌연변이체 클론 78-34(0.0164s-1) 단독에 대한 koff 속도와 비교하여 상당히 개선된다. 또한, 클론 101-11은 중화 분석에서 상당한 개선을 나타낸다. 따라서, 클론 101-11을 하기한 바와 같이 친화성 성숙에 대해 선택한다.
D. 클론 101-11의 친화성 성숙
클론 101-11의 추가의 친화성 성숙은 스파이킹된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 중쇄 및 경쇄 CDR3 둘 다의 PCR 돌연변이의 반복 사이클로 이루어져 있다. 당해 클론은 비오티닐화된 IL-12(bio-IL-12)의 농도를 감소시키면서 선택한다. 돌연변이된 클론의 결합 특성은 BIAcore 결합 분석 및 RBA, PHA 중화 분석에 의해 평가한다. 클론 136-9 내지 170-25의 koff 속도 및/또는 IC50 치는 표 2(첨부자료 A 참조)에 제시한다. 클론 103-14는 수용체 결합 분석 및 PHA 모 분석 둘 다에서 향상된 IC50 치를 나타낸다. 클론 103-14는 또한 낮은 koff 속도를 나타내어, 추가의 친화성 성숙에 대해 선택한다.
E. 클론 103-14 경쇄 CDR3의 무작위 라이브러리의 생성 및 선택
클론 103-14의 경쇄 CDR3(QSYDRGFTGSMV(서열 590))을 아래에 약술된 3종의 상이한 라이브러리(여기서, X는 서열 NNS의 무작위 코돈에 의해 암호화되고, N은 임의의 뉴클레오타이드가고, S는 데옥시사이토신 또는 데옥시구아니딘이다)를 사용하여 3개의 절편에서 체계적으로 무작위시킨다.
L3.1=XXXXXXFTGSMV(서열 591)
L3.2=QSYXXXXXXSMV(서열 592)
L3.3=QSYDRGXXXXXX(서열 593)
클론 103-14의 3종의 경쇄 CDR(L3.1, L3.2 및 L3.3으로 칭함) 모두의 무작위 돌연변이 유발을 수행한다. 클론 103-14의 중쇄 CDR3(H3으로 칭함)은 돌연변이시키지 않는다. 클론 103-14를 기본으로 하는 4종의 무작위 라이브러리(H3 및 L3.1, L3.2 & L3.3)를 작제하여, 제한 항원 농도 및 과잉의 유리 항원(p40 및 p70)의 존재 또는 부재를 이용함을 포함하는 다양한 선택 조건에 적용시킨다. 선택으로부터의 산출물(클론 73-B1 내지 99-G11)을 주로 BIAcore에 의해 및 때때로 RBA에 의해 선별하고, 표 2(첨부자료 A)에 제시한다.
103-14의 경쇄 CDR의 무작위 돌연변이 유발은 클론 Y61을 생성시키고, 이는 모 클론 103-14와 비교하여 상당히 개선된 IC50 값을 나타낸다. Y61을 전체 IgG1으로의 전환에 대해 선택한다. 전체 Y61-IgG1은 PHA 분석법에 의해 측정된 바, 약 130pM의 IC50 값을 갖는다. IC50 값은 유리 p40의 50배 몰 과량에 의해 영향을 받지 않으며, 이는 유리 p40이 Y61 항-IL-12 항체와 교차반응하지 않아, 이종성이량체에의 항체 결합을 감소시킴을 입증한다. Y61 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 전장 서열을 아래에 제시한다.
Y61 중쇄 가변 영역 펩타이드 서열
Figure 112001024650765-pct00018

Y61 경쇄 가변 영역 펩타이드 서열
Figure 112001024650765-pct00019

CDR 잔기는 카뱃 정의에 따라 지정한다.
실시예 2: 과돌연변이화 및 접촉 부위에서의 Y61의 돌연변이
전형적으로는, 향상된 친화성을 갖는 재조합 항체의 선택을 파아지 디스플레이 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 이는 CDR 잔기의 배합물을 무작위로 돌연변이시켜, 상이한 서열의 단일쇄 항체를 함유하는 대형 라이브러리를 생성시킴으로써 달성한다. 전형적으로는, 향상된 친화성을 갖는 항체를 항체-항원 반응에서 평형에 이르는 이들의 능력을 기초로 하여 선택한다. 그러나, Y61 scFV를 파아지 표면 상에서 발현시키고, IL-12와 함께 배양시킬 경우에, 시스템을 정상 항체-항원 평형에 이르도록 하는 선택 조건을 발견할 수 없다. 정제된 Y61 scFv는 정상 해리 카이네틱을 나타내기 때문에, scFV-파아지는 추정적으로 비-특이적 상호작용으로 인해 IL-12에 여전히 결합되어 있다. Y61에 대한 파아지-디스플레이 친화성 성숙의 통상적인 방법(즉, 다수의 CDR 잔기의 돌연변이 유발에 의한 라이브러리 생성 및 선택)을 이용할 수 없기 때문에, 각각의 CDR 부위를 돌연변이시키는 새로운 방법을 개발하였다.
이러한 방법은 돌연변이에 적합한 CDR 부위의 선택을 포함하고, 바람직한 선택적 돌연변이 유발 부위, 접촉 부위 및/또는 과돌연변이화 부위인 아미노산의 확인 및 선택을 기초로 한다. 접촉 부위는 항원이 항체와 상호작용할 경우에 항원과 접촉하는 높은 가능성을 갖는 잔기로서 정의되는 한편, 과돌연변이화 부위는 항체의 생체내 친화성 돌연변이화동안 체세포 과돌연변이화의 높은 가능성을 갖는 것으로 고려되는 잔기로서 정의된다. 바람직한 선택적 돌연변이화부위는 접촉 및 과돌연변이화 부위 둘 다인 CDR 부위이다. Y61 항체는 실시예 1에서 기술된 과정을 이용하여 CDR3 부위에서 미리 적합화시키며, 따라서, 파아지-디스플레이 선택 방법을 이용하여 항체 결합부의 중심에 존재하는 부위를 추가로 개선시키는 것은 어렵다. 활성에 있어서의 보다 큰 향상은 유해한 항원-항체 접촉을 제거하거나 새로운 접촉을 조작함으로써 CDR3 부위 외부에서의 잠재적인 접촉 부위의 돌연변이에 의해 수득한다.
항원과의 접촉 지점이 고려된 Y61의 아미노산 잔기 및 생체내 친화성 성숙 동안 체세포 과돌연변이화의 부위인 CDR 부위를 표 3(첨부자료 A)에 제시한다. Y61 친화성 성숙의 경우에, CDR3의 외부에서의 15개 잔기, L3 루프내의 3개 잔기 및 H3 루프내의 5개 잔기를 PCR 돌연변이 유발에 대해 선택한다.
Y61 scFv 유전자를 돌연변이 유발을 위해 pUC119(Sfi) 플라스미드내로 클로닝시킨다. 올리고뉴클레오타이드를 디자인하고 무작위 코돈을 사용하여 합성하여, 각각의 선택된 부위를 돌연변이시킨다. PCR 돌연변이 유발 이후에, 소수의 클론(24개 이하)을 서열화시키고, 숙주 세포, 예를 들어, 세균, 효모 또는 포유동물 숙주 세포내에서 발현시킨다. 발현된 항체를 정제하고, BIAcore 시스템을 이용하여 koff 속도를 측정한다. 이어서, Y61과 비교하여 향상된 오프 속도를 갖는 클론을 중화 분석법으로 시험한다. 다른 CDR 부위에 대해 상기 과정을 반복한다. 향상된 중화 활성을 갖는 것으로 제시된 개별적 돌연변이를 합하여, 보다 높은 중화 효능을 갖는 항체를 생성시킨다.
중화 효능을 향상시키기 위해 돌연변이된 Y61 CDR 부위 및 각각의 부위에서 의 개개의 아미노산 치환을 도 2A 내지 2H에 도시한다. BIAcore 분석에 의해 측정된 오프 속도를 제시한다. 이들 오프 속도는 또한 각각의 표의 우측에 히스토그램으로 제시한다.
부위 H30, H32, H50, H53, H54, H58, H95, H97, H101, L50, L92 및 L93에서의 이들 치환의 결과는 조사된 모든 아미노산 치환이 Y61보다 불량한 오프 속도를 갖는 항체를 생성시킴을 입증한다. 부위 H52, L32 및 L50에서, 단지 하나의 아미노산 치환은 Y61의 오프 속도를 개선시키는 것으로 밝혀졌고, 모든 다른 변화는 활성에 악영향을 미친다. L50에 대해, 이러한 단일 Gly→Tyr 변화는 Y61의 중화 효능을 상당히(5 내지 10배) 향상시킨다. 이러한 결과는 이들 부위가 Y61 활성에 대해 중요함을 입증하고, 대부분의 경우에 파아지-디스플레이가 최적 잔기에 대해 선택할 수 있음을 제시한다. 그러나, 부위 H31, H56, L30 및 L94에서, 수개의 치환이 Y61 오프 속도를 개선시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 이들 부위가 항원 결합에 대해 중요한, 파아지 디스플레이 접근법이 최적 잔기의 선택은 가능하게 하지 않는다는 것을 제시한다.
Y61의 접촉 및 과돌연변이 부위의 선택적 돌연변이는 경쇄 CDR2에서 아미노산 잔기 L50, 및 Y61의 중화 능력을 향상시킨 경쇄 CDR3의 잔기 L94를 확인한다. 이들 돌연변의 결합은 중화 능력에 있어서 상당한 증가를 나타내는 항체인 J695를 생성시키는 부가적인 효과를 생성시킨다. J695 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열의 전장 서열을 아래에 제시한다.
J695 중쇄 가변 영역 펩타이드 서열
Figure 112001024650765-pct00020
J695 경쇄 가변 영역 펩타이드 서열
Figure 112001024650765-pct00021

CDR 잔기는 카뱃 정의에 따라 지정한다.
Joe9로부터 J695까지의 경로 상에 있는 클론의 계열 발생을 나타내는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 정렬의 요약을 도 1A 내지 1D에 도시한다. CDR 및 잔기 넘버링은 카뱃에 따른다.
실시예 3: 항-hIL-12 항체의 기능성 활성
본 발명의 항-사람 IL-12 항체의 기능성 활성을 조사하기 위해, IL-12 활성을 억제하는 항체의 능력을 측정하는 다수의 분석법에서 항체를 사용한다.
A. 사람 PHA-활성화 림프아세포의 제조
사람 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 문헌[참조: Current Protocols in Immunology, Unit 7.1]에 기술된 바와 같이 1500rpm에서 45분 동안의 피콜-하이팍(Ficoll-Hypaque) 구배 원심분리에 의해 건강한 제공자로부터 수집된 류코팍으로부터 분리한다. 혈액 수용액과 림프구 분리 매질과의 계면에서 PBMC를 1500rpm에서 15분 동안의 원심분리에 의해 수집하여, 인산염-완충 염수(PBS)로 3회 세척하여, 피콜-팍 입자를 제거한다.
이어서, PBMC를 활성화시켜, 문헌[참조: Current Protocols in Immunology, Unit 6.16]에 기술된 바와 같이 림프아세포를 형성시킨다. 세척된 PBMC를 0.2%(v/v) PHA-P(Difco, Detroit, MI)가 보충된 RPMI 완전 배지(RPMI 1640 배지, 10% 태아 소 혈청(FBS), 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신)에 0.5-1x106개 세포/ml로 재현탁시키고, 5% CO2 대기하에 37℃에서 4일 동안 배양시킨다. 4일 후에, 세포 배양물을 0.2%(v/v) PHA-P 및 50U/ml 재조합 사람 IL-2가 보충된 RPMI 완전 배지에서 용적 기준으로 1:1로 분할한다. 재조합 사람 IL-2를 사람 IL-2 cDNA를 보유하는 발현 벡터를 COS 세포로 형질감염시켜 제조하고[참조: Kaufman et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4484-4490], PCT/US96/01382에 기술된 바와 같이 정제한다. 이어서, 세포 배양물을 추가로 1일 내지 3일 동안 배양시킨다. PHA 모 세포를 수거하고, RPMI 완전 배지로 2회 세척하고, 10x106개 세포/ml에서 95% FBS, 5% DMSO내에서 동결시킨다.
IL-12 수용체 결합 분석(섹션 B 참조)용으로 사용되는 PHA 모세포(blast cell)를 IL-2의 존재하에 1일 동안 배양한 후 수집하고, PHA 모세포 증식 분석(섹션 C 참조) 및 인터페론-감마 유도 분석(섹션 D 참조)용으로 사용되는 PHA 모세포를 IL-2의 존재하에 3일 동안 배양한 후 수집한다.
B. IL-12 수용체 결합 분석
방사성 표지된 IL-12가 PHA 모세포상의 IL-12 수용체에 결합하는 것을 억제하는 항-IL-12의 능력을 다음과 같이 분석한다. 다양한 농도의 항-IL-12를 50 내지 100pM의 125I-hIL-12(요오드화 hIL-12를 볼튼-헌터 표지 방법을 사용하여 20 내지 40mCi/mg의 특이적 활성 내지 NEN-Dupont로 제조함)와 함께 37℃에서 1시간 동안 결합 완충액(RPMI 1640, 5% FBS, 25mM Hepes pH 7.4)중에서 예비배양한다. 상기 기술한 바와 같이 분리한 PHA 모세포를 1회 세척하고 결합 완충액중에 2×107의 세포 밀도로 재현탁시킨다. PHA 모세포(1×106 세포)를 항체 125I-hIL-12 조합물에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 당해 분석 조합물을 실온에서 30초 동안 원심분리하고, 액체를 흡인하며 0.1㎖의 결합 완충액으로 세척한 후에 4℃에서 4분 동안 10,000xg에서 원심분리함으로써 세포 결합 방사능을 유리 125I-hIL-12로부터 분리한다. 세포 펠릿을 감마 계수기(counter)를 사용하여 세포 결합 방사능에 대하여 검사한다. 전체 결합을 항체의 부재하에 측정하고, 비특이적 결합을 당해 분석에서 25nM의 비표지된 IL-12의 혼입에 의해 측정한다. 배양은 2회 실시했다.
Y61 및 J695 사람 항-IL-12 항체를 사용하는 IL-12 수용체 결합 분석에서, 두 항체는 IL-12 수용체 결합을 동일하게 억제함을 입증한다. Y61은 IC50 값이 약 1.6×10-11M이 되도록 IL-12 수용체 결합을 억제하는 한편, J695는 약 1.1×10-11M의 IC50 값이 갖는다.
C. 사람 PHA 모세포 증식 분석
항-IL-12 항체는 PHA 모세포 증식(증식은 IL-2에 의해 자극됨)을 억제하는 이의 능력에 대하여 평가한다. 항-IL-12 항체의 일련의 희석액을 37℃, 5%의 CO2에서 200 내지 400pg/㎖의 hIL-12와 함께 미세역가 플레이트(U-bottom, 96-웰, 제조원: Costar, Cambridge, MA)중의 100㎖의 RPMI 완전 배지에서 예비배양한다. PHA 모세포(100㎖, 3×104개의 세포)를 항체/hIL-12 조합물에 첨가하고, 37℃에서 5%의 CO2에서 배양하고 4 내지 6시간 동안 0.5mCi/웰(3H)-티미딘(제조원: Amersham, Arlington Heights, IL)으로 표지한다. 세포 수집기(harvester; 제조원: Tomter, Orange, CT)를 사용하여 배양 내용물을 유리 섬유 필터상에서 수집하고 세포 DNA로의 (3H)-티미딘의 혼입은 액체 섬광 계수(liquid scintillation counting)를 사용하여 측정한다. 모든 샘플은 이중으로 분석한다.
다양한 농도의 p70:p40(즉, IL-12 이종이량체 대 유리 p40 서브유니트의 비율)의 존재하에 중화시킨 결과는 표 4에 나타낸다(부록 A 참조)
PHA 모세포 증식 분석에서, Y61 사람 항-IL-12 항체의 분석은 과량의 p40 없이(p70:p40의 비율은 1:0) IL-12 p70만의 존재하에 약 1.8×10-10M의 IC50 값으로서 항체가 PHA 모세포 증식을 억제한다는 것을 입증한다. 50배 과량의 유리 p40의 존재(p70:p40의 비율은 1:0)하에, Y61 항체는 약 1.8×10-10M의 IC50 값으로서 약 1.PHA 모세포 증식을 억제한다. 이러한 결과는 모세포 증식을 억제하는 Y61의 능력은 과량의 p40 존재에 의해 손상되지 않는다는 것을 입증한다.
사람 항-IL-12 항체인 J695는 1:0 비율의 p70:p40의 존재하에 약 1.0×10-11M의 IC50 값으로서 PHA 모세포 증식을 억제한다. 1:50 비율의 p70:p40의 존재하에, 당해 항체는 약 5.8±2.8×10-10M의 IC50 수치(n=2)로서 PHA 모세포 증식을 억제하며 과량의 p40은 항체에 단지 약간의 억제 효과를 미친다는 것을 입증한다. 종합적인 결과는 Y61과 비교하여, L50 및 L94에서의 돌연변이로 인해 J695의 중화 활성이 개선되었음을 입증한다.
D. 인터페론-감마 유도 분석
PHA에 의한 IFNγ생산(생산은 IL-12에 의해 자극됨)을 억제하는 항-IL-12 항체의 능력을 다음과 같이 분석한다. 다양한 농도의 항-IL-12 항체를 37℃, 5%의 CO2에서 200 내지 400pg/㎖의 hIL-12와 함께 미세역가 플레이트(U-bottom, 96-웰, 제조원: Costar)내의 100㎖의 RPMI 완전 배지에서 예비배양한다. 상기 기술한 바와 같이 분리한 PHA 모세포를 1회 세척하고 RPMI 완전 배지중에 1×107의 세포 밀도로 재현탁시킨다. PHA 모세포(100㎕의 1×106 세포)를 항체/hIL-12 조합물에 첨가하고 37℃ 및 5%의 CO2에서 18시간 동안 배양한다. 배양 후에, 150㎕의 무세포 상청액을 각각의 웰로부터 회수하고 생성된 사람 IFNγ의 수준을 ELISA(엔도겐 인터페론 γ ELISA, 제조원: Endogen, Cambridge, MA)을 사용하여 측정한다. 각각의 상청액은 2회 분석한다.
당해 분석에서, 사람 항-hIL-12 항체인 Y61의 분석은 Y61이 약 1.6×10-10M의 IC50 값으로서 사람 IFNγ생성을 억제하는 한편, 사람 항-hIL-12 항체인 J695는 약 5.0±2.3×10-12M의 IC50 수치(n=3)로 사람 IFNγ생성을 억제한다는 것을 입증한다. 당해 결과는 L50 및 L94에서의 변형의 결과로서 J695의 친화도가 현저하게 개선됨을 입증한다.
E. 분리된 PBMC로부터 비-사람 IL-12의 유도
사람 항-hIL-12 항체와 다른 종으로부터의 IL-12와의 교차 반응성을 시험하기 위하여, 비-사람 IL-12를 다음과 같이 제조한다. 사이노몰구스 원숭이, 비비 및 개 PBMC용 lymphoprep(제조원: Nycomed, Oslo, Norway), 개 PBMC용 Accu-paque 또는 랫트 PBMC용 Lympholyte-랫트(제조원: Accurate Chemical & Sci. Comp., Westbury, NY)를 사용하여 상기 기술한 바와 같이 밀도 구배 원심분리함으로써 PBMC를 새로이 헤파린 처리된 혈액으로부터 분리한다.
이어서, 기술한 바와같이 PBMC를 IL-12를 생산하도록 유도한다[참조 문헌: D'Andrea et al., (1992) J.Exp. Med 176, 1387-1398, Villinger et al., (1995) J. Immunol. 155, 3946-3954, Buettner et al., (1998) Cytokine 10, 241-248]. 세척된 PBMC를 RPMI 완전 배지중에 1×106세포/㎖으로 재현탁시키고, 0.0075%(wt/vol)의 SAC(판소르빈; 제조원: Calbiochem-Behring CO., La Jolla, CA) 또는 ConA(제조원: Sigma Chemical Co., ST. Louis, MO)과 0.0075%의 SAC로 보충하고 37℃에서 5%의 CO2 대기중에서 18시간 동안 배양한다. 무세포 배지 및 무SAC 배지를 원심분리하고 0.2mm 필터를 통해 여과함으로써 수집한다.
레서스 원숭이로부터의 IL-12는 기관[Emory University School of Medicine, Atlanta, GA]으로부터의 재조합 레서스 원숭이 IL-12로서 수득한다.
F. 쥐 2D6 세포 증식 분석
쥐 T 세포 클론 2D6은 IL-2, IL-14, IL-17 및 IL-12에 반응하여 증식한다[참조 문헌: Maruo et al., (1997) J. Leukocyte Biol. 61, 346-352). 랫트 IL-12를 함유하는 랫트 PBMC 상청액에 대한 반응으로 현저한 증식을 또한 검출한다. 당해 세포는 개, 사이노몰구스, 비비 및 사람 IL-2에 반응하지 않는다. 쥐 2D6 세포는 50mM의 베타-머캅토에탄올(βME) 및 30ng/㎖의 쥐 IL-12로 보충된 RPMI 완전 배지에서 증식시킨다. 분석하기 1일 전에, 쥐 IL-12를 세척하고 세포를 βME가 첨가된 RPMI 완전 배지에서 밤새 배양한다.
항-IL-12 항체의 일련의 희석액을 37℃에서 5%의 CO2에서 쥐 IL-12 40pg/㎖와 함께 미세역가 플레이트(U-bottom, 96-웰, 제조원: Costar, Cambridge, MA)중의 βME가 첨가된 100㎖의 RPMI 완전 배지에서 1 시간 동안 예비배양한다. 2D6 세포를 1회 세척하고 βME를 함유하는 RPMI 완전 배지중에 1×105의 세포 밀도로 재현탁시킨다. 2D6 세포(100㎕, 1×104 세포)를 항체/hIL-12 조합물에 첨가하고, 37℃에서 5%의 CO2에서 3일 동안 배양하고 4 내지 6시간 동안 0.5mCi/웰(3H)-티미딘으로 표지한다. 배양 내용물을 수집하고 액체 섬광 계수를 사용하여 계산한다. 모든 샘플은 2회 분석한다.
G. J695와 비사람 IL-12과의 종 교차반응성
J695와 비사람 IL-12과의 종 교차반응성을 일부 비-사람 종으로부터 분리된 PBMC를 사용하여 분석한다. 랫트, 개, 사이노몰구스 및 비비 PBMC 상청액에서의 비사람 IL-12 활성의 존재는, 상기 기술한 일부 생물학적 분석, 예를 들어, 쥐2D6 세포 증식 분석, 사람 PHA 모세포 증식 분석 및 인터페론-감마 유도 감정을 사용하여 쥐 및/또는 사람 IL-2에 대한 쥐 및/또는 양 폴리클로날 항체로 비사람 PBMC 유도된 반응을 차단함으로써 확인한다. 이어서, 사람 항-hIL-12 항체 Y61 및 J695와 PBMC 상청액중의 비사람 IL-12 또는 정제된 쥐 및 레서스 IL-12의 교차반응성은 50%의 반응 억제가 관찰되는 J695 항체 농도를 측정함으로써 상기 동일한 생물학적 분석에서 평가한다. 종 교차 반응성 결과는 표 5에 요약되어 있다. 당해 결과는 Y61 및 J695가 원숭이로부터의 IL-12(예: Y61에 대한 사이노몰구스 및 레서스 IL-12, 및 J695에 대한 레서스 및 비비 IL-12)를 각각 인식할 수 있으며, J695는 개 IL-12에 있어 약 35배 미만의 활성이며 Y61뿐 아니라 J695도 마우스 또는 랫트 IL-12와 교차 반응하지 않는다는 것을 입증한다.
H. J695의 사람 사이토카인 특이성
J695의 특이성을 사람 사이토카인 패널을 사람 IL-12를 고정시키는 가용성 J695의 결합을 방해하는 이의 능력에 대하여 시험하는 경쟁적 ELISA에서 시험한다. 사람 사이토카인의 패널에는 IL-1α및 IL-β(제조원: Genzyme, Boston, MA), IL-2(제조원: Endogen), IL-4, IL-10, IL-17, IFN-감마, 및 TGF-β1(제조원: R&D, Minneapolis, MN), IL-8(제조원: Calbiochem), PDGF, IGF-Ⅰ 및 IGF-Ⅱ(제조원: Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN), TNFα 및 림포톡신, IL-6, 가용성 IL-6 수용체, IL-11, IL-12 p70, IL-12 p40, M-CSF 및 LIF가 포함된다. B 림프구의 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 감염에 의해 유도되는, EBI-3 및 IL-12 p40 관련 단백질[참조 문헌: Devergne et al., (1996) J. Virol. 70, 1143-1153]을 사람 IgG-Fc 키메라(EBI-3/Fc)로서 발현시킨다. 일본쇄의 연어 정자 DNA(제조원: Sigma)도 또한 시험한다.
종 교차 반응 데이터
IC50(M)
항체 마우스 IL-12 랫트 IL-12 개 IL-12 시노 IL-12 레서스 IL-12 비비 IL-12 사람 IL-12
명칭 특이성 정제됨 PBMC 상청액 PBMC 상청액 PBMC 상청액 정제됨 PBMC 상청액 정제됨
C17.15 랫트-αmuIL12 3.0×10-11
R03B03 래빗-αmuIL12 1.5×10-10 6.0×10-10
C8.6.2 마우스-αhuIL12 1.2×10-10 1.0×10-11 2.0×10-10 5.0×10-11
Y61 사람-αhuIL12 비중화 2.2×10-10 1.0×10-11 1.7×10-10
J695 사람-αmuIL12 비중화 비중화 3.5×10-10 1.0×10-11 1.0×10-11 1.5×10-11 5.0×10-12
ELISA 면역분석 미세역가 환저 플레이트(96 웰, 높은 결합성, 제조원: Costar)를 4℃에서 밤새 사람 IL-12 0.1㎖(0.1M의 탄산 피복 완충액(0.1M의 NaHCO3 4용적을 0.1M의 NaHCO3 8.5용적에 첨가한다)중에서 0.2㎍/㎖)로 피복한다. 상기 플레이트를 0.05%의 트윈 20(Tween 20; PBS-T)를 함유하는 PBS로 2회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 PBS-T중의 1㎎/㎖의 소 혈청 알부민 200㎕로 차단하고, 다시 PBS-T로 2회 세척한다. 50㎍/㎖의 BSA를 함유하는 PBS-T(PBS-T/BSA)중의 IL-12 항체 J695(100ng/㎖) 및 각각의 사이토카인(2nM)을 함유하는 샘플(100㎕)을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 플레이트를 4회 세척하고 실온에서 1시간 동안 마우스 항-사람 람다-HRP(PBS-T/BSA중에서 1:500, 제조원: Southern Biotech. Ass. Inc., Birmingham, AL)와 함께 배양한다. 플레이트를 4회 세척하고, 암실에서 20 내지 30분 동안 ABTS를 사용하여 현상한다. OD450nm은 마이크로플레이트 리더(microplate reader, 제조원: Molecuoal Deveices, Menlo Park, CA)를 사용하여 판독한다. 임의 가용성 사이토카인의 부재하에 플레이트에 피복된 IL-2에 대한 J695 결합에 대하여 결합 비율(%)을 측정한다.
당해 결과는 고정된 사람 IL-12에 대한 J695 결합은 오직 사람 IL-12 p70에 의해 차단되며 사람 IL-12 p40에 의해 보다 적은 범위까지 차단되며 시험한 다른 사이토카인 중의 어느 하나에 의해서도 차단되지 않는다는 것을 입증한다.
I. 신규한 IL-12 분자에 결합
p35 서브유니트가 신규한 p19분자에 의해 치환된 대체적 IL-12 이종이량체를 기술한 바 있다. p19를 3D IL-6/IL-2 계열 구성원을 탐색하는 3D 상동성을 사용하여 확인하고, 활성화 수상(樹狀)을 사용하여 합성한다. p19는 p40에 결합하여 IL-12 유사 활성을 갖으나 IFN-γ 유도에서의 p35/p40만큼 효력이 있지 않은 p19/p40 이량체를 형성한다. p40만을 인식하나, 바람직하게는 p70 분자의 범주를 인식하는 항체는 p35/p40 분자 및 p19/p40 분자 둘다를 또한 중화시킬 것으로 예상한다.
실시예 4: 항-hIL-12 항체의 생체내 활성
IL-12 유도된 반응에 대한 IL-12 항체의 생체내 영향을 브리(Bree) 등에 의해 사용된 모델로부터 변형된 모델에서 검사하여 사이노몰구스 원숭이에 말초 혈 사람 IL-12의 영향을 연구한다[참조:Bree et al.,(1994) Biochem Biophys Res. Comm. 204: 1150-1157]. 앞선 연구에서, 5일 동안 1μg/kg/일로 사람 IL-12를 투여한 결과, 백혈구 수(WBC), 특히, 24시간 후에 림프구 및 단핵구의 서브세트(subset)가 감소하였다. 혈소판 수의 감소는 72시간 후에 관찰되었다. IFN-γ에 대한 반응으로서 단핵구 활성화의 마커인 혈장 네오프테린(neopterin)의 수준은 24시간에서 상승하고 72시간일 때 최대에 도달한다.
사람 항 hIL-12 항체를 사용한 첫번째 연구에서, 평균 중량이 5kg인 15마리의 건강한 사이노몰구스 원숭이를 진정제로 진정시키고 5개 그룹(n= 3)으로 나눈다. 그룹 1에 사람의 정맥내 면역글로불린(IVIG, Miles, Eckhart, IN, 단백질 A 세파로스를 사용하여 정제됨) 10mg/kg을 정맥내 투여한다. 그룹 2에 C8.6.2.(중화된 쥐 항-사람 IL-12 모노클로날 항체) 1mg/kg을 정맥내 투여한다. 그룹 3에 C8.6.2. 10mg/kg을 정맥내 투여한다. 그룹 4에 Y61(사람 항-사람 IL-12 항체, CHO 세포 설정된 매질로부터 정화된) 1gm/kg을 정맥내 투여한다. 그룹 5에 Y61 10mg/kg을 정맥내 투여한다.
항체 투여를 한 다음 1시간 후에 모든 동물에 사람 IL-12(1μg/kg)의 단일 피하(SC)주사를 한다. 혈액 표본을 기본선 8, 24, 48, 96 및 216시간인 시점에서 취득하고 완전 혈액 세포를 분석하기 위해 특이형태의 수를 세묘 혈청 화학을 실시한다. 혈청 사람 IL-12, C8.6.2 항체, Y61 항체, 원숭이 IFN-γ, 원숭이 IL-10, 원숭이 IL-6 및 혈장 네오프테린 수준도 관찰한다.
IL-12와 IVIG 대조 항체(그룹 1)을 함께 처리한 동물은 WBC, 혈소판, 림프구 수 및 단핵구 수의 감소를 포함하는 많은 예상된 혈액학적 변화를 보여준다. 이들의 감소는 1 내지 10mg/kg(그룹 2 내지 5)에서 C8.6.2 또는 Y61 항체로 처리한 동물에서는 전혀 관찰되지 않거나 거의 관찰되지 않는다.
혈청 또는 혈장 표본을 원숭이 IFN-γ 및 원숭이 IL-10(제조원:Biosource International, Camarillo, CA), 원숭이 IL-6(Emdogen) 및 혈장 네오프테린(제조원:ICN Pharmaceuticals. Orangeburg. NY)에 특이한 ELISA에 의해 분석한다. IFN-γ, IL-10 또는 IL-6은 IL-12와 IVIG로 함께 처리한 대조 동물을 포함하는 임의의 IL-12 처리된 동물에서는 감지되지 않는다. 이것은 IL-12에 대한 낮은 수준의 노출때문일 것이다(1회 투여량에 오직 1μg/kg). 그러나, 혈장 네오프테린 수준은 IL-12와 IVIG로 처리된 동물에서는 약 3배 감소하지만 더 낮은 1회 투여량(1μg/kg) Y61로 처리된 동물을 포함하는 모든 C8.6.2 또는 Y61로 처리된 동물에서는 변화가 없으며 따라서, Y61은 IL-12에 대한 이러한 예민한 반응을 생체내에서 차단하는데 효율적이다.
두번째 연구에서, 사이노몰구스 원숭이에 J695의 생체내 활성 및 약물역학(PD)을 외인성 rhIL-12를 투여하고 J695가 rhIL-12 투여와 관련된 반응을 정상적으로 차단하거나 감소시킬 수 있는 경우를 측정함으로써 연구한다. 숫컷 사이노몰구스 원숭이(그룹당 3마리)를 1일 1회 투여량으로 J695 0.05, 0.2 또는 1.0mg/kg 또는 정맥내 면역글로불린(IVIG) 1mg/kg을 복재정맥을 통한 일시 정맥(IV)주사 또는 등쪽 피부의 피하주사로서 투여한다. J695 또는 IVIG 투여 1시간 후, 모든 동물의 등쪽 피부에 단일 SC 1회 복용량 1μg/kg rhIL-12를 주사한다. 혈청을 각각의 혈액 표본으로부터 추출하고 IL-12, J695, IFN-γ 및 항-J695 항체에 대한 분석을 ELISA에 의해 실시한다. 네오프테린을 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석한다.
네오프테린의 수준에 대해서는, J695 또는 rhIL-12의 투여 전에 측정한 중화된 네오프테린의 수준을 표 3에 나타낸다. 그룹간의 네오프테린의 억제를 비교하기 위해, 네오프테린 수준에 대한 중화된 곡선하 면적(AUC)을 각각의 동물에 대하여 계산한다(표 6). 네오프테린 노출(AUC)은 ⅣIG 대조군과 비교하여 Ⅳ 그룹내의 약 71 내지 93% 및 SC 그룹내의 71 내지 100%가 투여량-의존 방식으로 억제된다. 이러한 결과는 네오프테린 반응을 50% 억제하는데 필요한 J695의 투여량(ED50)은 Ⅳ 또는 SC 경로에 의해 투여되는 경우 0.05mg/kg 미만이다.
사이노몰구스 원숭이에서 J695에 의한 IL-12 유도된 네오프테린의 투여량-의존 억제
IVIG 또는 J695 및 rhIL-12의 투여 경로 J695 투여량 (mg/kg) IVIG 투여량 (mg/kg) 정상화된 네오프테린 수준의 AUC 대조군과 비교하여 네오프테린 AUC의 감소 %
1회 정맥내 주사한지 1시간후 사람 IL-12 - 0.05 0.2 1.0 1.0 - - - 1745 ± 845 502 ± 135 199 ± 316 128 ± 292 0 71.3 88.6 92.7
1회 피하내 주사한지 1시간후 사람 IL-12 - 0.05 0.2 1.0 1.0 - - - 1480 ± 604 426 ± 108 395 ± 45.9 0 ± 109 0 71.2 73.3 100

J695를 사용한 처리는 또한 일반적으로 rhIL-12 투여와 관련된 혈액학에서의 변화(백혈구감소증 및 혈소판감소증)를 방지하거나 감소시킨다. rhIL-12를 투여한지 24시간 후, 림프구 수는 대조 Ⅳ 및 SC ⅣIG 처리된 그룹에서의 기준 수치와 비교한 경우 약 50% 만큼 감소한다. SC 또는 Ⅳ에 J695를 모든 3가지 투여량 수준으로 투여하는 것은 이러한 감소를 방지하여 24시간 후의 림프구 수는 기준 수치와 거의 동일하게 된다. IL-12 투여하고 48시간 후,Ⅳ 및 SC ⅣIG로 처리한 그룹의 팰릿의 수는 기준 수치와 비교하여 약 25% 만큼 감소한다.
90% 효과 수준의 이상의 혈청 수준을 유지하는 것을 표적으로 하는 실시예 투여량 스케줄은 Ⅳ 및 SC 1mg/kg를 격주로 투여하거나 매주 0.3mg/kg를 투여하는 것으로, 반복되는 투여시 약간의 축적을 가정한다. 당해 연구는 항체를 이러한 투여량으로 원숭이에게 안전하게 투여할 수 있다는 것을 입증한다. 독립적인 독성 연구에서, 100mg/kg 이하의 항체를 원숭이에게 안정하게 투여할 수 있다는 것이 추가로 밝혀졌다.
J695는 또한, 쥐 p35 서브유니트와 사람 IL-12 p40 서브유니트를 결합시킨 분자인 키메라 IL-12로 처리된 쥐에서 IFN-γ생산을 방지하는데 효과적이다. 마우스에서 생물학적으로 비활성인 사람 IL-12와는 반대로, 이러한 키메라 IL-12는 IFN-γ의 유도를 포함하여 쥐에서 생물학적 기능을 유지한다. 또한, 사람 p40 서브유니트는 분자가 결합되게 하며 J695에 의해 중화되게 한다. 0.05mg/kg 용량의 키메라 IL-12를 5회 1일 투여량으로서 0일째, 1일째, 2일째, 3일째 및 4일째에 암컷 C3H/HeJ 마우스(10마리/실험군)에 복강내 투여한다. J695는 0일째, 2일째 및4일째에 IL-12를 주사하기 30초 전에 0.05, 0.01, 0.0004, 0.00008 및 0.000016mg/kg의 용량으로 복강내 투여한다. 대조 hulgG1γ은 0일째, 2일째 및 4일째에 0.05mg/kg의 용량을 복강내 투여한다. 마우스는 5일째 되는 날 혈액을 채취하여 혈청 IFN-γ의 수준을 ELISA에 의해 측정한다. 당해 결과는 J695가 약 0.001mg/kg의 ED50으로서 IFN-γ생산의 용량-의존 억제를 유발한다는 것을 입증한다. 종합적으로, 이러한 결과는 J695가 생체내에서 IL-12 활성의 강력한 억제제임을 입증한다.
실시예 5: 재조합 사람 IL-12(rhIL-12)에 결합하는 사람 항체의 카이네틱 분석
포획된 리간드(바이오센서 매트릭스상에 포획된 사람 항-rhIL-12 항체 J695)와 분석물(용액중의 rhil12)간의 실시간 결합 상호 작용을 비아코아 시스템(BIAcore system, 제조원: Biacore AB, Uppsala, Swnden)을 사용하는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)에 의해 측정한다. 상기 시스템은 SPR의 광학적 성질을 이용하여 덱스트란 바이오센서 매트릭스내에서 단백질 농도의 변화를 감지한다. 단백질은 공지된 농도에서 덱스트란 매트릭스에 공유결합된다. 항체를 덱스트란 매트릭스를 관통하여 주사하여 주사된 항체와 고정된 리간드간의 특이적 결합은 매트릭스 단백질 농도를 증가시키며 SPR 시그널에서 변화를 야기한다. SPR 시그널에서의 이러한 변화를 공명 단위(RU)로서 기록하고 센소그램(sensorgram)의 y-축에 따른 시간에 대하여 디스플레이한다.
바이오센서 매트릭스상에서 염소 항-사람 IgG(제조원: Southern Biotechnology Associates, Car. No. 2040-01, Birmingham, AL)의 고정화를 촉진하기 위해, 염소 항-사람 IgG는 N-하이드록시석신이미드(NHS) 100mM 및 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(EDC)로 카복실 그룹을 첫번재로 활성화시킴으로써 유리 아민 그룹을 통해 덱스트란 매질에 공유 결합시킨다. 이어서, 염소 항-사람 IgG를 활성화된 매질중에 주사한다. pH4.5의 아세트산 나트륨중에 희석된 35㎖의 염소 항-사람 IgG(25㎍/㎖)을 활성화된 바이오센서에 주사하고 단백질의 유리 아민을 활성화된 카복실 그룹에 직접 결합시킨다. 비처리된 매질 EDC-에스테르는 에탄올아민 1M을 주사하여 비활성화시킨다. 표준 아민 커플링 키트가 시판된다(제조원: Biacore AB, Cat. No. BR-1000-50, Uppsala, Swnden).
J695를 HBS 유출 완충액(제조원: Biacore AB, Cat. No. BR-1001-88, Uppsala, Sweden) 중에 희석시켜 염소 항-사람 IgG를 통해 매질상에 포획한다. 고정화된 염소 항-사람 IgG에 결합하는 rhIL-12-특이적 항체의 능력을 측정하기 위해, 다음과 같이 결합 분석을 실시한다. J695의 분취액(25㎕/㎖; 25㎕의 분취액)을 염소 항-사람 IgG 폴리클로날 항체 커플링된 덱스트란 매트릭스 속에 5㎕/분의 유속으로 주사한다. 단백질의 주사 전 및 주사 직후에, 단독 HBS 완충액을 각각의 유동 세포를 관통하여 유출시킨다. 기준 및 J695의 주사를 완료하고 약 30초 후에 상응하는 점간의 시그날의 실질적 차이는 결합된 IgGI J695의 양(약, 1200RU)을 나타낸다. 가용성 rhIL12에 직접 결합하는 rhIL12 특이적 항체를 측정한다. 사이토카인을 HBS 유출 완충액 속에 희석시키고 분취액 50㎕을 고정화된 단백질 매트릭스 속에 5㎕/분의 유속으로 주사한다. 사용되는 rhIL-12의 농도는 10, 20, 25, 40, 50, 80, 100, 150 및 200nM이다. rhIL-12의 주사 전 및 즉시 후에, HBS 완충액만이 각각의 유동 세포를 통하여 유동한다. 기준 시그널 및 사이토카인 주사의 완료 후의 시그널간의 실질적 차이는 특정 샘플의 결합 수치를 나타낸다. 바이오센서 매트릭스를 다음의 샘플을 주사하기 전에 100mM의 HCL을 사용하여 재생시킨다. 해리 상수() 및 결합 상수를 측정하기 위해, 비아코아 카이네틱 평가 소프트웨어(버전 2.1)을 사용한다.
COS 유래된 J695와 비교한 rhIL-12에 결합하는, CHO 유래된 J695의 대표적인 결과는 표 7에 나타낸다.
rhIL-12에 대한 CHO 또는 COS 유래된 J695의 결합
공급원 rhIL12(nM) 결합된 rhIL12(RU) 결합된 Ab(Ru) rhIL12/AB
CHO 200 1112 1613 1.48
CHO 150 1033 1525 1.45
CHO 100 994 1490 1.43
CHO 80 995 1457 1.40
CHO 50 912 1434 1.36
CHO 40 877 1413 1.33
CHO 25 818 1398 1.25
CHO 20 773 1382 1.20
CHO 10 627 1371 0.98
공급원 rhIL12(nM) 결합된 rhIL12(RU) 결합된 Ab(RU) rhIL12/AB
COS 200 1172 1690 1.49
COS 150 1084 1586 1.46
COS 100 1024 1524 1.44
COS 80 985 1489 1.42
COS 50 932 1457 1.37
COS 40 894 1431 1.34
COS 25 833 1409 1.27
COS 20 783 1394 1.20
COS 10 642 1377 1.00

포획된 J695 및 가용성 rhIL-12간의 분자 카이네틱 상호작용은 비아코아 기술을 사용하여 정량적으로 분석한다. 일부 독립 실험을 수행하고 표 8에 나타낸 바와 같이 결과를 시판되는 비아코아 수학적 분석 소프트웨어에 의해 분석하여 속도 상수를 추론한다.
rhIL-12에 대한 J695의 겉보기 카이네틱 속도 및 친화도 상수
항체 공급원 결합 속도(M-1s-1) 해리 속도(s-1) 평균 Kd(M)
J695 CHO 3.52E+05 4.72E-05 1.34E-10
J695 COS 3.40E+05 2.61E-05 9.74E-11
CHO 유래된 J695(Kd=1.34-10M-1) 항체 및 COS 유래된 J695(Kd=9.74×10-11M-1) 항체간의 상호작용에 대하여 산출된 겉보기 상수(Kd)에는 약간의 차이가 있다. J695 및 rhIL12간의 겉보기 해리 상수(Kd)는 관찰된 속도 상수로부터 반응식 Kd=/을 사용하여 산출한다.
J695 및 rhIL-12 간의 상호작용에 대한 겉보기 결합 속도 상수 및 해리 속도 상수를 측정하기 위해, 일정량의 J695(2㎕/㎖)를 사용하고 rhIL-12의 농도를 변화시키면서 몇개의 결합반응을 수행한다. 포획된 J695 및 가용성 rhIL-12간의 실시간 결합 상호작용 센소그램은 항체의 두 형태가 결합상 및 해리상에 있어서 매우 유사하다는 것을 나타낸다.
가용성 재조합 사이토카인에 결합하는 포획된 IgG1 J695 mA의 능력을 추가로 평가하기 위해, 직접 비아코아 방법을 사용한다. 이러한 방법에서, 염소 항-사람 IgG(25㎍/㎖) 커플링된 카복시메틸 덱스트란 센서 표면을 IgG1 J695(2㎕/㎖)로 피복하고, 이어서 재조합 사이토카인을 첨가한다. 가용성 rhIL12를 CHO 또는 COS 유리된 IgG1 J695로 포획된 바이오센서 표면을 관통하여 주사하는 경우, 용액 중의 사이토카인의 농도가 증가함에 따라서 시그널의 양은 증가한다. rmIL12(제조원: R&D Systems, Cat. No. 419- ML, Minneapolis, MN) 또는 rhIL12의 경우에 결합은 관찰되지 않았으며, 시험된 모든 농도는 1000nM 이하이다. 이러한 결과는 IgG1 J695 항체가 rhIL-12상의 별개의 결정요소를 인식한다는 결론을 뒷받침 한다.
표 9는 사람 IgG1 J695는 오직 가용성 rhIL12에만 결합하며 다른 재조합 사이토카인에는 결합하지 않는다는 것을 입증하는, 비아코아를 사용하는 실험의 결과를 나타낸다.
비아코아(BIAcore) 기술을 사용하는 J695의 에피토프 지도화
포획된 리간드 COS J695 포획된 리간드 CHOJ695
가용성 분석물
재조합 사람 IL12 양성 양성
재조합 쥐 il12 음성 음성

실시예 6: IL-12에 대한 J695 친화도의 추가 연구
J659 항체와 삶 IL-12간의 분자 카이네틱 상호작용을 비아코아 플라스몬 공명 기술을 사용하여 정량적으로 분석하여 겉보기 카이네틱 속도를 추론한다.
비아코아 기술을 사용하여 J695가 포획된 고체상에 대한 가용성 rhIL-12의 결합을 측정한다. 염소 항-사람 IgG 항체를 바이오센서 칩에 고정시키고, 이어서 고정량의 J695를 주사하고 표면에 포획시킨다. rhIL-12의 농도를 변화시키면서 적용하고, J695에 대한 상이한 농도의 IL-12의 결합을 시간의 함수로서 측정한다. 0차 해리 카이네틱 및 1차 결합 카이네틱뿐 아니라 J695 및 IL-12간의 단순한 1: 1 분자 상호작용을 가정하여 겉보기 해리 및 결합 속도 상수를 산출한다. 3개의 독립 실험을 수행하고, 나타낸 수치는 3개의 실험에 대한 평균이다. 이러한 측정값으로부터, 겉보기 해리(kd, 해리 속도) 및 결합(ka, 결합 속도) 속도 상수를 추론하여 상호작용에 대한 Kd 수치를 계산하는데 사용한다(표 10 참조). 결과는 J695가 rhIL-12에 대한 높은 친화성을 갖는다는 것을 나타낸다.
J695 및 사람 IL-12간의 상호작용에 대한 카이네틱 매개변수
카이네틱 매개변수 수치
kd 3.71±0.40×10-5s-1
ka 3.81±0.48×105M-1s-1
Kd 9.74×10-11M(14ng/㎖)
실시예 7: 쥐 인터루킨-12에 대한 C17.15 및 랫트 모노클로날 항체의 특징 및 중화 활성
사람 질병에서의 방법과 유사한 쥐 IL-12에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 염증 및 자가면역 질병의 쥐 모델에서의 IL-12 처리 연구의 타당성을 평가하기 위해, C17.15 및 랫트 항 쥐-IL-12 모노클로날 항체와 쥐 IL-12의 상호작용을 검사한다. PHA 모세포 검정에서 쥐 IL-12를 중화시키며, 쥐 IL-12가 세포 표면 수용체에 결합하는 것을 차단하는 C17.15의 능력을 C17.15-쥐 IL-12 결합 상호 작용의 카이네틱에서와 같이 평가한다.
사람 PHA 모세포 증식 분석(실시예 3 참조)에서, C17.15 또는 랫트 IgG2a(대조 항체)의 일련의 희석액을 쥐 IL-23와 함께 37℃에서 1시간 동안 예비배양한다. PHA-자극된 모세포를 항체-IL-12 조합물에 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 배양한다. 후속적으로, 세포를 1μCi/웰[3H]-티미딘으로 6시간 동안 표지한다. 배양물을 수집하고 [3H]-티미딘 혼입을 측정한다. 배경 비특이적 증식은 쥐 IL-12를 첨가하여 측정한다. 모든 샘플은 2회 분석한다. 당해 분석에서, 동일한 조건하에 재조합 사람 IL-12에 대한 J69에 대하여 관찰된 5.8×10-12의 IC50 수치와 비교하는 경우 재조합 쥐 IL-12에 대한 C17.15의 IC50(M)는 1.4×10-11인 것으로 확인된다(표 11 참조)
항-사람 IL-12 모노클로날 항체 J695와 랫트 항 마우스 IL-12 모노클로날 항체 C 17.15의 특성 비교
항체 에피토프 생물분자 상호작용 분석 수용체 결합 분석 PHA 모세포 분석
Ka,결합 속도(M-1s-1) Kd,해리 속도(s-1) Kd(M) IC50(M) IC50(M)
J695 Hu p40 3.81×105 3.71×10-5 9.74×10-11 1.1×10-11 5.8×10-12
C17.15 Mu p40 3.80×105 1.84×10-5 4.80×10-5 1.5×10-10 1.4×10-11
쥐 IL-12가 세포 수용체에 결합하는 것을 억제하는 C17.15의 능력을 또한 측정한다. C17.15의 일련의 희석액을 37℃에서 1시간 동안 100pM[125I]-쥐 IL-12와 함께 결합 완충액에서 예비배양한다. 2D6 세포(2×106)를 항체/[125I]-쥐 IL-12 조합물에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 세포-결합 방사능을 유리 [125I]-IL-12로부터 분리시키고, 잔류 세포-결합 방사능을 측정한다. 2D6 세포의 수용체에 대한 표지된 쥐 IL-12의 전체 결합을 항체의 부재하에 측정하고, 비특이적 결합을 당해 분석의 25nM의 비표지된 쥐 IL-12를 봉입하여 측정한다. 특이적 결합을 전체 결합에서 비특이적 결합을 감함으로써 계산한다. 배양은 2회 실시한다. 결과는 C17.15가 1.5×10-10의 IC50(M)로서 쥐 IL-12가 세포 수용체에 결합하는 것을 억제한다는 것을 나타낸다.
재조합 쥐 IL-12에 대한 C17.15의 친화도는 생물분자 상호작용 분석을 사용하여 평가한다. 염소 항-랫트 IgG 항체를 바이오센서 침에 고정화시킨 후, 일정량의 C17.15 항체를 주사하며 칩의 표면상에 C17.15를 포획한다. 재조합 쥐 IL-12의 농도를 변화시키면서 C17.15 표면에 적용하고 고정화된 C17.15에 대한 쥐 IL-12의 결합을 시간의 함수로서 측정한다. 겉보기 해리 및 결합 속도 상수는, 0차 해리 및 1차 결합 속도론뿐 아니라 고정화된 C17.15와 쥐 IL-12간의 단순한 1:1 분자 상호작용을 가정하여 계산한다. 이러한 측정으로부터, 겉보기 해리(Kd, 해리 속도) 및 결합(ka, 결합 속도) 속도 상수를 계산한다. 이러한 결과를 사용하여 상호작용에 대한 Kd 수치를 계산한다. 3.8×105의 결합 속도, 1.84×10-4의 해리 속도 및 4.8×10-10의 Kd를 재조합 쥐 IL-12-C17.15 상호작용에 대하여 관찰한다.
쥐 IL-12 활성의 중화 및 세포 표면 수용체에 대한 결합에서 관찰된 C17.15의 활성뿐 아니라 쥐 IL-12에 대한 C17.15의 결합 속도론은 J695-rhIL-12 상호작에 대한 유사한 측정과 관련된다. 이는 랫트 항-마우스 IL-12 항체 C17.15 및 항-사람 IL-12 항체 J695의 작용 방식이 결합 속도, 해리 속도, Kd, IC50 및 PHA 분석에 기초하여 거의 동일하다는 것을 나타낸다. 따라서, C17.15를 염증 및 자가면역 질병의 쥐 모델의 J695에 대한 동종성 항체로서 사용하여 이들 모델 동물에서 질병의 개시 또는 진행에 있어 IL-12 차단의 효과를 연구한다(실시예 8 참조)
실시예 8: α-쥐 IL-12 항체 투여에 의한 마우스에서의 자가면역 또는 염증 계열 질병의 치료
A. α-IL-12 항체 C17.15에 의한 쥐에서의 콜라겐-유도된 관절염의 억제
IL-12 및 류마티스 관절염(RA)간의 관계가 입증되었다. 예를 들어, 건강한 대조군과 비교하여 상승된 수치의 IL-12 p70가 RA 환자의 활액에서 검출되었다[참조 문헌: Morita et al (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-314]. 따라서, 마우스에서 콜라겐-유도된 관절염을 억제하는 항-마우스 IL-12 항체인 C17.15의 능력을 평가한다.
수컷 DBA/1 마우스(10/그룹)을 0일째에 Ⅱ형 콜라겐으로 고정화시키고, 1일 전(콜라겐을 고정화시키기 1일 전)부터 12일째까지 격일로 10mg/kg의 C17.15 또는 대조 랫트 IgG를 복강내 처리한다. 동물을 90일째까지 발에서 관절염의 발전에 대하여 임상적으로 모니터한다. 관절염은 다음과 같이 등급을 정한다: 0-정상, 1-한 곳의 관절에 편중된 관절염, 2-한 곳 이상의 관절이 관련되나 발 전체는 아님, 3-발 전체가 관련됨; 4-발의 변형;5-관련 관절의 강직. 마우스의 관절염 스코어는 마우스의 각각의 개별적인 발의 관절염 등급의 합계이다(최대값은 20). 당해 결과는 각 그룹의 평균±SEM으로 표현한다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 결과는, 관절염 스코어가 후-처리 50일 후에나 C17.15-처리된 마우스에서 측정가능하며 C17.15-처리된 마우스에서 수득되는 관절염 스코어를 의미하는 피크가 IgG-처리된 마우스에서 측정된 피크의 5배 이하임을 나타낸다. 이는 랫트 항-마우스 IL-12 항체 C17.15가 마우스에서 콜라겐-유도된 관절염의 발달을 방지한다는 것을 입증한다.
B. 마우스에서 랫트 α-쥐 IL-12 항체 C17.15에 의한 대장염의 억제
IL-12가 또한 대장염의 발달/병리학에서 역할을 한다는 것이 또한 입증되었다. 예를 들어, 항-IL-12 항체는 대장염의 마우스 모델, 예를 들어, TNBS 유도된 대장염 IL-12 녹아웃 마우스에서 질병을 억제하는 것으로 나타났다[참조 문헌: Simpson et al., (1998) J. Exp. Med. 187(8): 1225-34]. 유사하게, 항-IL-12 항체는 IL-12 녹아웃 마우스에서 대장염 형성을 억제하는 것으로 입증되었다. 마우스에서 TNBS를 억제하는 랫트 항-마우스 IL-12 항체인 C17.15의 능력을 두 연구에서 평가한다[참조 문헌: J. Immunol. 161(6): 3143-9].
첫 번째 연구에서, 대장염은 TNBS 0.2mg를 함유하는 50%의 에탄올 용액 150㎕를 소아 제(臍)동맥 카테터를 통하여 직장내로 전달함으로써 투여하여 무병원체 SJL 마우스에서 유도한다. 대조 동물을 50%의 에탄올 용액 150㎕만으로 처리한다. C17.15 1회 투여량의 0.75, 0.5, 0.25 또는 0.1mg 또는 대조 랫트 IgG2a 0.75mg를 꼬리 정맥을 통하여 11째에 정맥내 투여하고, 처리의 치료적 효과를 동물을 11째 및 17일째에 체중을 재고 17일째에 해부학적으로 측정함으로써 평가한다. C17.15로 처리된 마우스의 체중은 항체 처리 48시간 이내에 증가되며 처리 6일 후에 정상화된다. C17.15 처리 효과를 해부학적으로 확인한다. 추가로, 처리된 마우스의 비장 및 결장으로부터의 CD4+ T-세포에 의한 IFN-γ 분비 뿐만 아니라 처리된 마우스의 비장 또는 결장-유래된 대식세포로부터의 IL-12 수준도 평가한다(표 12 참조)
두번째 연구에서, 투여를 최적화하고 마우스는 전체 투여량의 0.1mg 또는 0.5mg의 C17.15 또는 0.1mg의 IgG2a를 12일째 내지 14일째에 나누어서 개별적으로 처리한다. C17.15를 1회 투여량으로 0.1mg/마우스 또는 0.25mg/마우스를 투여하는 것은 TNBS-유도된 대장염에서 단지 부분적으로 개선시키며 시험관내에서 IFN-γ의 CD4+ T 세포 생산을 현저하게 감소시키지 않으나 대조군과 비교하여 IL-12의 분비를 현저하게 감소시킨다는 것이 확인된다. 마우스당 0.5mg 이상의 1회 투여량에서 반응이 관찰된다. 시험된 항체의 최저 투여량을 취하고 이를 2회 나누어 (12일째 및 14일째에) 주사하여 투여하는 것은 투여 계획을 개선시키며, 수회의 적은 투여량이 단일 일시주사 투여량보다 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다. 수득된 데이터를 표 12에 나타낸다.
항-마우스 IL-12 mAb C17.15는 마우스에서 확립된 대장염을 억제한다
질병 유도 0일째 처리 11일째 중량(g) IFN-γ비장 CD4+ 세포 (U/㎖) IL-12 비장 대식세포 (pg/㎖)
11일째 17일째
TNBS+에탄올 IgG2a 0.75mg 대조군 16.0 15.26 3326 300
TNBS+에탄올 C17.15 0.75mg 16.0 20.21 1732 0
TNBS+에탄올 C17.15 0.5mg 16.36 19.94 1732 0
TNBS+에탄올 C17.15 0.25mg 16.28 17.7 3618 7
TNBS+에탄올 C17.15 0.1mg 16.2 17.98 3498 22
에탄올 대조군 - 20.76 21.16 1135 0
C17.15 모노클로날 항-IL-12를 전체 0.1mg/마우스 또는 0.05mg/마우스로 격일로 2회로 나눈 투여량으로 투여하는 것은 결장의 현미경적 외관 또는 웨이스팅(wasting)에 의해 측정한 바와 같이 대장염의 완벽한 전환을 유발한다. 또한, 이러한 투여량 스케줄은 IFN-γ의 T-세포 생산 및 IL-12의 대식세포 생산의 현저한 하위-조절을 야기하여 IL-12의 대식세포 생산은 TNBS-대장염을 나타내지 않는 대조군 에탄올-처리된 마우스에 나타난 수준과 유사하다. 따라서, TNBS 대장염에 대한 마우스 모델에 C17.15를 투여하는 것은 투여량-의존 방식으로 질병의 진행을 역전시킨다.
C. α-IL-12 항체에 의한 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 억제
IL-12는 다발성 경화증에서 역할을 한다고 통상적으로 사료된다. 유도성 IL-12 p40 메세지는 급성 환자에서 급성 플라크로 표현되는 것으로 나타났으나 염증성 뇌경색 병변으로서는 나타나지 않았다[참조 문헌: Windhagen, A, et al. (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996]. MS 환자로부터의 T 세포(대조 T 세포는 아님)는 비조절된 CD40L 발현을 통하여 항원 제시 세포로부터의 IL-12 생산을 자극한다[참조 문헌: Balashov, K. E. et al.(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:599-603]. 상승된 수준의 혈청 IL-12가 MS 환자에서 검출되나, 다른 신경계 질병에서는 검출되지 않는다[참조 문헌: Nicoletti, F. et al. (1996) J. Neuroimmunol. 7-:87-90]. 증가된 IL-12 생산은 MS 환자에서 질병 활성과 관련되는 것으로 나타났다[참조 문헌: Cormabella, M. et al. (1998) J. Clin. Invest. 102: 671-678]. 다발성 경화증 및 실험적 자가면역 뇌척수염의 쥐 모델에서 IL-12의 역할이 연구되었다[참조 문헌: Leonard, J.P et al.(1995) J. Exp. Med. 181:281-386; Banerjee, S et al. (1998) Arthritis Rheum. (1998)41:S33; 및 Segal, B.M. et al. (1998) J. Exp. Med. 187:537-546]. 이러한 모델의 질병은 TH1 서브세트의 T 세포에 의해 유도되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 급성 EAE의 발병을 방지하는 α-IL-12 항체의 능력을 평가한다.
α-IL-12 항체는 자가항원인 수초 기초 단백질로 면역화된 마우스에서 급성 EAE의 발병을 억제하며, 발병후에 질병을 억제하며, 재발의 심각성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: Banerjee, S. et al. (1998) Arthritis Ryeum. (1998) 41: S33]. 마우스에서 α-IL-12 항체 처리의 유리한 효과는 처리를 중단한 후에도 2달에 걸쳐서 지속된다. 항-IL-12 항체가 인입 전달에 의한 뇌척수염성 T 세포의 수여자인 마우스에서 질병을 억제한다는 것이 또한 입증되었다[참조 문헌: Leonard, J.P. et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 281-386].
실시예 9: J695의 임상적 약리학
이중 맹검 교차 연구에서, 64명의 건강한 사람 남성 대상자에게 J695 또는 위약의 투여량을 증가시키면서 투여한다. 투여 전 및 0.25시간 후의 보체 단편 C3a의 측정은 보체계의 활성을 입증하지 않는다. CRP 및 피브리노겐 수준은 동시 감염의 징후가 관찰된 대상자에서만 증가한다.
모든 대상자는 생존하며 J695의 전체 내성은 매우 양호하다. 유해 사례(AEs)로 인하여 처리를 중단해야 하는 경우는 없다. 가장 통상적으로 관찰된 AEs는 두통이며 감기/기관지염이며, 어떤것도 중증으로 분류되지 않는다.
연구 대상자 중에서, 33살의 노인 남성 한명은 연구 초반에 적상(滴狀)유건선을 앓았다. 무작위 연구 설계에 따라서, 상기 대상자는 SC 투여에 의해 J695 5mg/kg를 우연히 투여받게 된다. 항체 투여하기 10일 전에, 대상자는 팔 및 다리에 단지 작은 불연속 구진성 병반을 나타낸다. 항체를 투여하는 경우에, 대상자는 홍반성 플라크가 더욱 붉어지며 진해지고, 증가된 각질증을 나타낸다. J695 투여 1주일 후, 대상자는 병반의 둔화 및 각질의 감소를 포함하는 피부 상태의 개선을 보고한다. J695(5mg/kg Ⅳ)의 2차 투여 직후, 대상자의 피부는 임의 국소 처리하에 건선 병반이 완전히 제거된다. 항체의 2차 투여 후에, 예상된 J695 제거와 동시에 백색 각질로 덮힌 홍반성 플라크가 재발한다.
실시예 10: 2개의 CHO 세포주에 의해 생산된 J695의 비교
J695의 재조합 발현에 있어서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘다를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 인산칼슘-매개된 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포내로 도입한다[참조 문헌: Urlaub, G 및 Chasin, L.A.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]. 재조합 발현 벡터내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 각각 인핸서/프로모터 조절 인자(예를 들어, CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자와 같은 SV40, CMV 및 아데노바이러스 등으로부터 유래된)에 효과적으로 연결시켜 유전자가 고수준으로 전사되게 한다. 재조합 발현 벡터에는 또한 메토트렉세이트 선별/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염한 CHO 세포 선별을 가능하게 하는 DHFR 유전자를 포함된다.
사람 항체 J695의 펩타이드 서열을 암호화하는 발현 벡터 150㎍을 50㎖들이 원추형 시험관중의 물 2.7㎖속에 용해시킨다. 2.5M의 CaCl2 300㎍을 첨가하고 당해 DNA 조합물을 50㎖들이 원추형 시험관중의 2×HEPES 완충된 식염수 3㎖에 적가한다. 5초 동안 와동시키고 실온에서 20분 동안 배양한 후, 1㎖를 각각의 플레이트(F12 배지내)에 균일하게 분배하고 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 액체를 흡인에 의해 제거하고, F12중의 10%의 DMSO 2㎖를 각각의 플레이트에 첨가한다. DMSO를 PBS 5㎖를 각각의 플레이트에 첨가함으로써 희석한 후, DMSO 충격을 1분 동안 지속한다. 플레이트를 PBS 속에서 2회 세척한 후, H/T 및 5%의 FBS(DHFR을 발현하는 세포에 대하여 선택적임)로 보충된 알파 MEM 10㎖를 첨가하고 플레이트를 1주마다 배지를 교환하면서 37℃, 5%의 CO2에서 2주 동안 배양한다.
최종적인 배지 교환 5일 후에, 배양 상청액을 1:50으로 희석하고 사람 IgG 감마 쇄에 특이적인 ELISA를 사용하여 시험한다. 가장 높은 ELISA 시그널을 나타 내는 클론을 96-웰 플레이트로부터 알파 MEM의 1.5㎖/웰 + 5%의 투석된 혈청의 12-웰 플레로 옮긴다. 3일 후, 사람 IgG 감마 쇄에 특이적인 또 다른 ELISA를 수행하고 가장 큰 활성을 나타내는 12개의 클론을 알파 MEM + 5%의 투석된 혈청 및 20nM의 MTX로 분배하여 넣는다. 세포주 031898218는 20nM의 존재하에 겉보기 세포 사멸 또는 성장률의 감소없이 성장하며, 3일 동안의 분석에서 1.8㎍/㎖의 hIgG를 생산한다. MTX를 함유하는 배지에서 배지에서 성장하는 031898218의 T-25 배양물은 평균 11.9㎍/㎖의 J695를 생산한다. ALP903으로 명명한 세포주를 무혈청 조건하에서 현탁액에서 성장하도록 적응시키고, 이때 세포주는 7.5pg J695/세포/24h을 생산한다.
MEM/5% FBS/20nM MTX 배지에서의 초기 선별 후에, ALP903 세포를 20nM의 MTX에 다시 계대배양한다. 세포를 100nM의 MTX 선별하에 배양한 후, 30일 후에 500nM의 MTX에서 2회 계대배양한다. 이때, 세포는 32㎍J695/㎖/24h을 생산한다. 배양물을 희석액을 제한하여 서브클로닝한다. 서브클론 218-22는 2일 동안 96-웰 플레이트에서 16.5㎍/㎖를 생산하고 12-웰 디쉬에서 2일 동안 J695 50.3㎍/㎖를 생산한다. 클론 218-22를 알파 MEM/5% 투석된 FBS/500nM MTX에서 38일 동안 배양한 후, 상기와 같이 무혈청 교반 배양에 적응시킨다. ALP 905으로 명명한 무혈청 현탁액 배양의 평균 세포-특이적 생산성은 58pg/세포/24h이다.
J695(ALP 903)를 생산하는데 사용한 첫번째 세포주는 두번째 세포주인 ALP 905보다 낮은 수율의 배양물로부터의 항체를 생산한다. ALP 905로부터 생산된 J695가 ALP 903으로부터 생산된 J695와 기능적으로 동일하다는 것을 확인하기 위 해, 두 뱃치의 항체를 IL-12 친화도, IL-12가 세포 수용체에 결합하는 것을 차단하는 능력, IL-12에 의한 IFN-γ 유도를 억제하는 능력, 및 IL-12 매개된 PHA 모세포 증식을 억제하는 능력에 대하여 평가한다.
IL-12에 대한 J695 뱃치 ALP 903 및 ALP 905의 친화도는, 표면 플라스몬 공명 연구(비아코아 분석)에 의해 IL-12에 대한 반응의 카이네틱 속도 상수를 측정함으로써 측정한다. rhIL-12에 대한 결합에 대하여 항체 뱃치 ALP903 및 ALP905의 해리 속도 상수(Kd) 및 결합 속도 상수(Ka)를 (실시예 3에서 기술한 바와 같이) 3개의 실험에서 측정한다. IL-12에 대한 결합의 친화도 및 Kd를 해리 속도 상수를 결합 속도 상수로 나눔으로써 계산한다. Kd를 각각의 별도 실험에 대하여 계산하고 평균을 산출한다. 결과는 rhIL-12에 대한 결합에 대하여 측정한 결합의 속도론 매개변수 및 친화도가 J695 뱃치 ALP 903 및 ALP 905와 매우 유사하다는 것을 나타내며, 뱃치 ALP903에 대한 계산된 Kd는 1.19±0.22×10-10M이며 ALP905에 대한 계산된 Kd는 1.49±0.47×10-10M이다(표 13 참조).
사람 PHA-활성화된 T-림프모세포구의 IL-12 수용체에 대한 rhIL-12의 결합을 차단하는, ALP903 및 ALP905 둘다로부터 유래된 J695의 능력을 평가한다(실시예 3 참조). J695의 각 샘플을 10배의 일련의 희석액을 사용하여 1×10-8의 농도로부터 출발하여 시험한다. 항체를 37℃에서 1시간동안 50pM의 [125I]-사람 IL-12와 함께 결합 완충액에서 배양한다. PHA 모세포를 항체/[125I]-사람 IL-12 조합물에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 세포 결합 방사능을 원심분리 및 세척 단계를 통하여 유리 [125I]-사람 IL-12로부터 분리시키고 억제율(%)을 계산한다. J695에 대한 IC50 수치를 4-매개변수 곡선 조정을 사용하여 억제 곡선으로부터 측정하고 2개의 독립 실험을 통하여 확인한다. 배양을 2회 수행한다. J695의 2개의 뱃치에 대한 결과는 매우 유사하다(표 13 참조).
시험관내에서, PHA-활성화 림프모구에 의한 rhIL-12 유도된 IFN-γ 생산을 억제하는, ALP903 및 ALP 905 둘다로부터 유래된 J695의 능력을 평가한다. J695의 일련의 희석액을 37℃에서 1시간 동안 200pg/㎖의 rhIL-12와 함께 예비배양한다. PHA 림프모구 세포를 첨가하고 37℃에서 18시간 동안 배양한다. 배양 후, 무세포 상청액을 수거하여 사람 IFN-γ의 수준을 ELISA를 사용하여 측정한다. 억제 곡선으로부터의 IC50 값을 4-매개변수 곡선 조정을 사용하여 항체 농도에 대한 그래프로 나타낸다. 결과는 IFN-γ 생산을 억제하는 2개의 뱃치의 능력이 매우 유사하다는 것을 입증한다.
시험관내 PHA 모세포 증식 분석을 사용하여 rhIL-12에 대한 ALP 903 및 ALP 905 J695의 중화능을 측정한다. 각 유형의 J695의 일련의 희석액을 37℃에서 1시간 동안 230pg/㎖의 사람 IL-12와 함께 예비배양한다. 이어서, PHA 모세포를 첨가하고 37℃에서 3일 동안 배양한다. 이어서, 세포를 γCi/웰[3H]-티미딘으로 6시간 동안 표지한다. 배양물을 수집하고 [3H]-티미딘 혼입을 측정한다. 비특이적 증식(배경)을 rhIL-12의 존재하에 측정한다. ALP 903 및 ALP 905 J695에 대한 IC50 수치는 배우 유사하다는 것을 확인하며 이를 표 13에 기재한다.
rhIL-12 활성을 중화시키고, IL-12가 세포 표면 수용체에 결합하는 것을 차단하며, rhIL-12에 결합하는데 있어, J695 항체의 작용은 뱃치 ALP 903 내지 ALP 905와 현저하게 다르지 않으며, 이들 두 상이한 세포형으로부터 생산된 항체는 동일하다.
J695로트 ALP 903 및 ALP 905의 특성의 비교
항체 Ka, 결합 속도 (M-1, s-1) Kd, 해리 속도 Kd(M) RB 분석 IC50(M) PHA 모세포 분석 IC50(M) IFN-γ 분석 IC50(M)
J695 ALP903 3.75×105 4.46×10-5 1.19×10-10 3.4×10-11 5.5×10-12 5.8×10-12
J695 ALP 905 3.91×105 5.59×10-5 1.49×10-10 3.0×10-11 4.4×10-12 4.3×10-12
등가물
당해 분야의 숙련가는 더이상 통상의 실험을 사용하지 않고 본원에서 기술하는 본 발명의 특정 양태에 대한 등가물을 인식하거나 확인하게될 것이다. 다음의 특허청구범위에 이러한 등가물을 포함시키고자 한다.
<110> Jochen, Salfeld et al. <120> Human Antibodies That Bind Human IL-12 And Methods For Producing <130> BBI-093CPPC <150> US 60/126,603 <151> March 25, 1999 <160> 675 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 1 could be either His or Ser <220> <223> Xaa at position 4 could be either Tyr or His <220> <223> Xaa at position 6 could be either Tyr, Asn or Thr <400> 1 Xaa Gly Ser Xaa Asp Xaa 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 2 could be either Ser or Thr <220> <223> Xaa at position 4 could be either Asp or Glu <220> <223> Xaa at position 5 could be either Ser, Arg or Lys <220> <223> Xaa at position 6 could be either Ser, Gly or Tyr <220> <223> Xaa at position 7 could be either Leu, Phe, Thr or Ser <220> <223> Xaa at position 8 could be either Arg, Ser, Thr, Trp or His <220> <223> Xaa at position 9 could be either Gly or Pro <220> <223> Xaa at position 10 could be either Ser, Thr, Ala or Leu <220> <223> Xaa at position 11 could be either Arg, Ser, Met, Thr or Leu <220> <223> Xaa at position 12 could be either Val, Ile, Thr, Met or Leu <400> 2 Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 1 could be either Gly or Tyr <220> <223> Xaa at position 3 could be either Asp or Ser <220> <223> Xaa at position 4 could be either Gln or Asn <400> 4 Xaa Asn Xaa Xaa Arg Pro Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa represents either Ser or Glu <400> 5 Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr Gly Met His 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 1 could be either Ser or Thr <220> <223> Xaa at position 3 could be either Ser or Gly <220> <223> Xaa at position 4 could be either Arg or Ser <220> <223> Xaa at position 8 could be either Gly or Val <220> <223> Xaa at position 9 could be either Ser or Ala <220> <223> Xaa at position 10 could be either Asn, Gly or Tyr <220> <223> Xaa at position 11 could be either Thr or Asp <220> <223> Xaa at position 13 could be either Lys or His <400> 6 Xaa Gly Xaa Xaa Ser Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa 1 5 10 <210> 7 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 6 could be either Gln or Glu <220> <223> Xaa at position 16 could be either Arg or Gly <220> <223> Xaa at position 31 could be either Ser or Glu <220> <223> Xaa at position 84 could be either Lys or Asn <220> <223> Xaa at position 97 could be either Thr, Ala or Lys <220> <223> Xaa at position 98 could be either Thr or Lys <220> <223> Xaa at position 99 could be either Ser or His <220> <223> Xaa at position 102 could be either Tyr or His <220> <223> Xaa at position 104 could be either Tyr, Asn or Thr <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Xaa Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Asx 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Xaa Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Gly Ser Xaa Asp Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 1 could be either Ser or Gln <220> <223> Xaa at position 2 could be either Tyr or Ser <220> <223> Xaa at position 13 could be either Thr or Ala <220> <223> Xaa at position 23 and 91 could be either Ser or Thr <220> <223> Xaa at position 25 could be either Gly or Ser <220> <223> Xaa at position 26 could be either Arg or Ser <220> <223> Xaa at position 30 could be either Gly or Val <220> <223> Xaa at position 31 could be either Ser or Ala <220> <223> Xaa at position 35 could be either Lys or His <220> <223> Xaa at position 51 could be either Gly or Lys <220> <223> Xaa at position 54 could be either Gln or Asn <220> <223> Xaa at position 79 could be either Val or Leu <220> <223> Xaa at position 93 could be either Asp or Glu <220> <223> Xaa at position 94 could be either Ser, Arg or Lys <220> <223> Xaa at position 95 could be either Ser, Gly or Tyr <220> <223> Xaa at position 96 could be either Leu, Phe, Thr or Ser <220> <223> Xaa at position 97 could be either Arg, Ser, Thr, Trp or His <220> <223> Xaa at position 98 could be either Gly or Pro <220> <223> Xaa at position 99 could be either Ser, Thr, Ala or Leu <220> <223> Xaa at position 100 could be either Arg, Ser, Met, Thr or Leu <220> <223> Xaa at position 101 could be either Val, Ile, Thr, Met or Leu <220> <223> Xaa at position 32 could be either Asn, Gly or Tyr <220> <223> Xaa at position 33 could be either Thr or Asp <220> <223> Xaa at position 53 could be either Asp or Ser <400> 8 Xaa Xaa Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Xaa Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Xaa Gly Xaa Xaa Ser Asn Ile Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Val Xaa Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Xaa Asn Xaa Xaa Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Xaa Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 2 could be either Gly, Val, Cys or His <220> <223> Xaa at position 3 could be either Ser or Thr <220> <223> Xaa at position 4 could be either His, Thr, Val, Arg, or Ile <220> <223> Xaa at position 5 could be either Asp or Ser <220> <223> Xaa at position 6 could be either Asn, Lys, Ala, Thr, Ser, Phe, Trp, or His <400> 9 His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 4 could be either Asp or Ser <220> <223> Xaa at position 5 represents any amino acid <220> <223> Xaa at position 6 could be either Gly, Asp, Gln, Leu, Phe, Arg, His, Asn or Tyr <400> 10 Gln Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 1 could be either Phe, Thr or Tyr <220> <223> Xaa at position 3 could be either Arg or Ala <220> <223> Xaa at position 5 could be either Asp, Ser, Glu or Ala <220> <223> Xaa at position 6 could be either Gly or Arg <220> <223> Xaa at position 8 represents any amino acid <220> <223> Xaa at position 10 could be either Tyr or Glu <400> 11 Xaa Ile Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Lys Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 1 could be either Gly, Tyr, Ser, Thr, Asn or Gln <400> 12 Xaa Asn Asp Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 4 and 5 represents any amino acid <220> <223> Xaa at position 6 could be either Tyr or His <220> <223> Xaa at position 7 could be either Gly, Met, Ala, Asn or Ser <400> 13 Phe Thr Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Met His 1 5 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 9 could be either Ser, Cys, Arg, Asn, Asp or Thr <220> <223> Xaa at position 10 could be either Asn, Met or Ile <220> <223> Xaa at position 11 could be either Thr, Tyr, Asp, His, Lys or Pro <400> 14 Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Xaa Xaa Xaa Val Lys 1 5 10 <210> 15 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 30 could be Ser or Glu <220> <223> Xaa at position 83 could be Lys or Asn <220> <223> Xaa at position 5 could be either Gln or Glu <400> 15 Gln Val Gln Val Xaa Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr Gly 20 25 30 Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 35 40 45 Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Xaa Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 1 could be either Ser or Gln <220> <223> Xaa at position 2 could be Tyr or Ser <220> <223> Xaa at position 13 could be either Thr or Ala <220> <223> Xaa at position 25 could be either Gly or Ser <220> <223> Xaa at position 51 and 95 could be either Gly or Tyr <220> <223> Xaa at position 79 could be either Val or Leu <400> 16 Xaa Xaa Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Xaa Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Xaa Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Xaa Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Xaa Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Xaa Thr 85 90 95 His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 His Gly Ser His Asp Asn 1 5 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Trp Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Thr 85 90 95 His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 His Gly Ser His Asp Asn 1 5 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gln Ser Tyr Asp Arg Tyr Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Tyr Asn Asp Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Lys 1 5 10 <210> 31 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Tyr Thr 85 90 95 His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 33 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Arg Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 35 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa at position 32 represents either Gly or Tyr <400> 36 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Xaa 20 25 30 Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 37 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Arg Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 39 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Trp Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 43 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly 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nucleotide and S being either deoxycytosine or deoxyguanidine <400> 591 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Thr Gly Ser Met Val 1 5 10 <210> 592 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa is encoded by a randomized codon of sequence NNS with N being any nucleotide and S being either deoxycytosine or deoxyguanidine <400> 592 Gln Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Met Val 1 5 10 <210> 593 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Xaa is encoded by a randomized codon of sequence NNS with N being any nucleotide and S being either deoxycytosine or deoxyguanidine <400> 593 Gln Ser Tyr Asp Arg Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 594 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 594 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val 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Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 658 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 658 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 659 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 659 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 660 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 660 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 661 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 661 Glu Asp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Pro Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Leu His Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Ile Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 662 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 662 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 663 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 663 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 664 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 664 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 665 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 665 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Met 50 55 60 Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg <210> 666 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 666 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 667 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 667 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr <210> 668 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 668 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala <210> 669 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 669 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Met Gly Asn Tyr 20 25 30 Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Trp 65 70 75 80 Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ala Trp Asp Thr Ser Pro 85 90 95 Arg Ala <210> 670 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 670 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly <210> 671 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 671 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly <210> 672 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 672 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly <210> 673 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 673 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Gln Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ala Trp Asp Asn Ser 85 90 95 Leu Asn Ala <210> 674 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 674 Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly <210> 675 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 675 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Arg Gly

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  15. a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 가지며;
    b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 갖는,
    분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
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  18. 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
  19. a) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 가지며;
    b) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 갖는,
    분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
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  22. 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, 분리된 사람 항체.
  23. a) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 가지며;
    b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 갖는,
    분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
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  26. 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
  27. 제26항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함하는, 분리된 사람 항체.
  28. 제27항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역이 IgG1인, 분리된 사람 항체.
  29. 제26항에 있어서, Fab 단편인, 분리된 사람 항체.
  30. 제26항에 있어서, F(ab')2 단편인, 분리된 사람 항체.
  31. 제26항에 있어서, 단일쇄 Fv 단편인, 분리된 사람 항체.
  32. a) 서열 404 내지 서열 469로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 335 내지 서열 403으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 288 내지 서열 334로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 가지고;
    b) 서열 534 내지 서열 579로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 506 내지 서열 533으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열 470 내지 서열 505로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 갖는,
    분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
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  41. a) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 가지며;
    b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 갖는,
    분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
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  44. 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
  45. 제44항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함하는, 분리된 사람 항체.
  46. 제45항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역이 IgG1인, 분리된 사람 항체.
  47. 제44항에 있어서, Fab 단편인, 분리된 사람 항체.
  48. 제44항에 있어서, F(ab')2 단편인, 분리된 사람 항체.
  49. 제44항에 있어서, 단일쇄 Fv 단편인, 분리된 사람 항체.
  50. 삭제
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  53. 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 암호화하는, 분리된 핵산.
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  55. 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2를 암호화하는, 분리된 핵산.
  56. 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 암호화하는, 분리된 핵산.
  57. 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는, 분리된 핵산.
  58. 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 암호화하는, 분리된 핵산.
  59. 삭제
  60. 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 암호화하는, 분리된 핵산.
  61. 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 암호화하는, 분리된 핵산.
  62. 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는, 분리된 핵산.
  63. 삭제
  64. 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 암호화하는, 분리된 핵산.
  65. 삭제
  66. 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2를 암호화하는, 분리된 핵산.
  67. 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 암호화하는, 분리된 핵산.
  68. 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는, 분리된 핵산.
  69. 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 암호화하는, 분리된 핵산.
  70. 삭제
  71. 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 암호화하는, 분리된 핵산.
  72. 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 암호화하는, 분리된 핵산.
  73. 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는, 분리된 핵산.
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  84. a) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체 중쇄 및
    b) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체 경쇄를 암호화하는 재조합 발현 벡터.
  85. 제84항에 따른 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포.
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  173. a) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정한 바와 같이, 1x10-3s-1 이하의 Koff 속도 상수로 사람 IL-12의 p40 서브유니트로 부터 해리되고;
    b) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 가지며;
    c) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 갖는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
  174. 제173항에 있어서, 사람 IL-12의 p40 서브유니트로 부터 1x10-4s-1 이하의 Koff 속도 상수로 해리되는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
  175. 제173항에 있어서, 사람 IL-12의 p40 서브유니트로 부터 1x10-5s-1 이하의 Koff 속도 상수로 해리되는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
  176. 사람 IL-12의 p40 서브유니트에 결합하고,
    a) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 도메인, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 및
    b) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 도메인, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함하는, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
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  202. 사람 IL-12의 p40 서브유니트에 결합하고 항체 J695인, 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부.
  203. 제202항에 따르는 분리된 사람 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창, 크론질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질병, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질병, 건선, 피부염, 피부경화증, 갑상선염, 이식편 대 숙주 질병, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질병, 유육종증, 죽상경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 결절성 다발성 동맥염, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇼엔라인 자반증, 신장의 미시적 혈관염, 만성 활성 간염, 쇼그렌 증후군, 포도막염, 패혈증, 패혈성 쇼크, 패혈증 증후군, 성인 호흡 곤란 증후군, 악액질, 감염성 질병, 기생충 질병, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 중증 근무력증, 헌팅톤 무도병, 파킨슨 질병, 알츠하이머 질병, 졸중, 원발성 담즙성 간경변, 섬유성 폐 질병, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전증 및 심근경색으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 사람 IL-12의 p40 서브유니트의 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  204. 제15항, 제18항, 제19항, 제22항, 제23항, 제26항 내지 제32항, 제41항, 제44항 내지 제49항 또는 제173항 내지 제176항 중의 어느 한 항에 따르는 항체 또는 이의 항원 결합부 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창, 크론질병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질병, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질병, 건선, 피부염, 피부경화증, 갑상선염, 이식편 대 숙주 질병, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질병, 유육종증, 죽상경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 결절성 다발성 동맥염, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇼엔라인 자반증, 신장의 미시적 혈관염, 만성 활성 간염, 쇼그렌 증후군, 포도막염, 패혈증, 패혈성 쇼크, 패혈증 증후군, 성인 호흡 곤란 증후군, 악액질, 감염성 질병, 기생충 질병, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 중증 근무력증, 헌팅톤 무도병, 파킨슨 질병, 알츠하이머 질병, 졸중, 원발성 담즙성 간경변, 섬유성 폐 질병, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전증 및 심근경색으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 사람 IL-12의 p40 서브유니트의 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  205. 제204항에 있어서, 추가의 제제를 포함하는 약제학적 조성물.
  206. 제205항에 있어서, 추가의 제제가 부데노사이드, 상피 성장 인자, 코르티코스테로이드, 메틸프레드니솔론, 사이클로포스파미드, 4-아미노피리딘, 타자니딘, 인터페론-β1a, 인터페론-β1b, 공중합체 1, 고압 산소, 정맥내 면역글로불린, 클라브리빈, 사이클로스포린, 설파살라진, 아미노살리실레이트, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 메트로니다졸, 리폭시게나제 억제제, 메살라민, 올살라진, 발살라자이드, 산화방지제, 트롬복산 억제제, IL-1 수용체 길항제, 항-IL-1β 모노클로날 항체, 항-IL-6 모노클로날 항체, 성장 인자, 엘라스타제 억제제, 피리디닐-이미다졸 화합물, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF의 항체 또는 효능제, CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90의 항체 또는 이의 리간드, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린성 제제, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP 키나제 억제제, IL-1β 전환 효소 억제제, TACE 억제제, 키나제 억제제, TNFα 전환 효소 억제제, T-세포 신호 전달 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체, 가용성 p55 TNF 수용체, 가용성 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, sIL-13R, 항-P7s, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), 소염성 사이토킨, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 치료제인 약제학적 조성물.
  207. 제205항에 있어서, 추가의 제제가 항-TNF 항체 및 이의 항체 단편, TNFR-Ig 작제물, TACE 억제제, PDE4 억제제, 코르티코스테로이드, 부데노사이드, 덱사메타손, 설파살라진, 5-아미노살리실산, 올살라진, IL-1β 전환 효소 억제제, IL-1ra, 티로신 키나제 억제제, 6-머캅토퓨린 및 IL-11로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 치료제인 약제학적 조성물.
  208. 사람 IL-12의 p40 서브유니트를 제15항, 제18항, 제19항, 제22항, 제23항, 제26항 내지 제32항, 제41항, 제44항 내지 제49항 또는 제173항 내지 제176항 중의 어느 한 항에 따르는 항체와 접촉하여 사람 IL-12의 p40 서브유니트의 활성이 억제되도록 함을 포함하는, 사람 IL-12의 p40 서브유니트의 활성의 시험관내 억제 방법.
  209. 삭제
  210. 삭제
  211. 제204항에 있어서, 장애가 크론 질병인 약제학적 조성물.
  212. 제204항에 있어서, 장애가 다발성 경화증인 약제학적 조성물.
  213. 제204항에 있어서, 장애가 류마티스성 관절염인 약제학적 조성물.
  214. 제15항, 제18항, 제19항, 제22항, 제23항, 제26항 내지 제32항, 제41항, 제44항 내지 제49항 또는 제173항 내지 제176항 중의 어느 한 항에 따르는 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는, 사람 IL-12를 검출하기 위한 진단학적 조성물.
  215. 제204항에 있어서, 장애가 건선인 약제학적 조성물.
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