CN111471655B - 抗人il12/23稳转细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗人IL12/23稳转细胞株及其构建方法和应用，所述的细胞株被命名为抗人IL12/23 CHO‑S稳转细胞株，于2020年3月11日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.C202050。本发明的抗人IL12/23稳转细胞株CHO‑S的抗人IL12/23抗体产量可达到2.9g/L，是现有的抗人IL12/23抗体表达细胞株的6倍；不同生产批次之间抗体产量稳定、抗体质量高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗人IL12/23稳转细胞株及其构建方法和 应用。
背景技术
IL12/23(白细胞介素12/白细胞介素23)是在炎症和免疫应答中自然出现的细胞因子， 被认为在免疫介导的炎症性疾病中发挥了关键作用，包括斑块型银屑病、银屑病关节炎、克 罗恩病、系统性红斑狼疮等。
抗人IL12/23单抗能够通过与IL-12和IL-23所共有的p40亚单位相结合，阻止其与细胞 表面的受体IL-12β1相结合，来抑制这2种前炎性细胞因子，降低因IL12/23过量产生和释 放引发的炎症反应，对于治疗由IL12/23过量产生引发的疾病具有重要的临床意义。抗人 IL12/23单抗(乌司奴单抗)是一种可自我注射的生物治疗药物，它在国家食品药品监督管理总 局(CFDA)获批了1个适应症，银屑病的治疗。
分泌单克隆抗体细胞株的传统制备方法为免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合法，包括抗 原免疫、细胞融合、细胞株筛选、细胞库构建等过程。由于小鼠抗体相对于人体为异种抗原， 因此当小鼠单克隆抗体注入人体后会引发机体严重的排斥反应。同时，传统方法制备的融合 细胞株容易产生染色体丢失、基因缺失等现象，严重影响单克隆抗体生产过程中不同批次之间的稳定性，影响产品质量。此外，融合细胞株还存在抗体产量低、细胞培养困难等问题。
发明内容
本申请的发明目的是提供一种具有较高的抗人IL12/23抗体产量的抗人IL12/23稳转细胞 株及其构建方法和应用。
为实现上述发明目的，本申请的技术方案如下：
一种抗人IL12/23稳转细胞株，所述的细胞株被命名为抗人IL12/23CHO-S稳转细胞株， 于2020年3月11日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. C202050。
所述的抗人IL12/23稳转细胞株的构建方法包括以下步骤：
(1)制备含有抗人IL12/23抗体重链基因的质粒和含有抗人IL12/23抗体轻链基因的质 粒，并将上述两种质粒共转染亲代CHO-S细胞；
(2)对转染完成的CHO-S细胞进行Puromycin/G418筛选，获得稳转细胞；
具体地，所述的Puromycin/G418筛选包括：将转染完成的细胞培养于完全培养液中，48 h后将完全培养液更换为含有10ug/mL puromycin和800ug/mL G418的筛选培养液，并每隔 3-4天更换一次筛选培养液，直至细胞稳定生长；
作为优选，所述的筛选培养液中puromycin和G418的终浓度分别为10ug/mL和800ug/mL。
作为优选，所述的Puromycin/G418筛选还包括：将在筛选培养液中稳定生长的细胞接种 至完全培养液中继续培养，获得已成功转染的稳转细胞。
作为优选，将在筛选培养液中稳定生长的细胞接种至完全培养液中继续培养2-3天，接 种后，完全培养液中的细胞密度为5×105cells/mL。
(3)对稳转细胞进行单克隆细胞株分选，获得所述的抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S。
具体地，所述的单克隆细胞株分选包括：将稳转细胞中的单克隆细胞株一一接种至完全 培养液中，继续培养12-14天后检测各单克隆细胞株的抗人IL12/23抗体产量，获得所述的抗 人IL12/23稳转细胞株CHO-S。
本发明还提供了所述的抗人IL12/23稳转细胞株在制备抗人IL12/23抗体中的应用，该应 用包括以下步骤：
(a)将所述的抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S接种到含有完全CD培养液的摇瓶中，置 于37℃，5％CO2的环境中，于120rpm下进行传代培养；
(b)传代培养完成后，将细胞转移至较大体积培养摇瓶内，细胞接种后初始密度要大于 3×105cells/mL；为了使培养液中有更高的溶氧量，培养摇瓶内培养液的体积不要超过培养瓶 总体积的1/5；
(c)待细胞密度达到1×106cell/mL后，切断二氧化碳供应，将摇床转速调节至130-135 rpm；
(d)继续培养6-8天，收集培养液，离心并经0.45μm滤膜过滤，获得细胞培养上清液， 依次对细胞培养上清液进行纯化和洗脱，获得抗人IL12/23抗体。
作为优选，步骤(a)中，至少传代2次，传代培养过程中，培养液中的细胞密度不超过 2×106cells/mL。
本发明的抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S的抗人IL12/23抗体产量可达到3g/L，是现有 的抗人IL12/23抗体表达细胞株的6倍。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明的抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S的抗人IL12/23抗体产量可达到3g/L，是现有的抗人IL12/23抗体表达细胞株的6倍；不同生产批次之间抗体产量稳定、抗体质量高。
(2)本发明的抗人IL12/23稳转细胞株构建方法步骤简便，易于实施。
附图说明
图1为GE AKTA Pure蛋白质分离纯化系统对纯化后细胞培养上清液进行洗脱的洗脱曲 线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
本实施例一种抗人IL12/23稳转细胞株的构建方法，该构建方法包括以下步骤：
(1)制备含有抗人IL12/23抗体重链基因的质粒和含有抗人IL12/23抗体轻链基因的质 粒，并将上述两种质粒共转染亲代CHO-S细胞；
其中，抗人IL12/23抗体重链基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，抗人IL12/23抗体 轻链基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，质粒的制备方法则根据QIAGEN试剂盒的说明 进行；质粒的转染步骤则根据Invitrogen试剂盒的说明进行。
抗人IL12/23抗体重链基因核苷酸序列SEQ ID No.1为：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGAGAGAGCCTG AAGATCAGCTGTAAGGGGAGCGGATATAGTTTCACAACATATTGGCTGGGATGGGTGAGGCAGATGCCCGGAAAAGGACTGGACTGGATCGGAATTATGTCACCCGTGGACAGCG ACATCAGATACAGCCCATCCTTTCAGGGGCAGGTGACCATGAGCGTGGATAAGAGCATCACAACAGCCTACCTGCAGTGGAACAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCCATGTACTAC TGCGCCAGAAGGAGACCCGGCCAGGGGTACTTCGATTTCTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCCAGCAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCC AAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA CGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
抗人IL12/23抗体轻链基因核苷酸序列SEQ ID No.2为：
GACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGACAGA GTGACCATCACCTGCAGAGCCAGCCAGGGCATCTCCAGCTGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGAGAAGGCCCCAAAAAGCCTGATCTACGCCGCCAGTAGCCTGCAGAGCG GAGTGCCCAGCAGATTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAG CAGCCTGCAGCCCGAAGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACATCTACCCCT ACACCTTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCC TGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG GGAGAGTGTTGA
(2)对转染完成的CHO-S细胞进行Puromycin/G418筛选，获得稳转细胞；
具体包括：
(2.1)将转染完成的细胞培养于完全培养液中，48h后将完全培养液更换为含有10ug/mL puromycin和800ug/mL G418的筛选培养液，并每隔3-4天更换一次筛选培养液，直至细胞稳 定生长；
(2.2)将在筛选培养液中稳定生长的细胞接种至完全培养液中，接种后，完全培养液中 的细胞密度为5×105cells/mL；继续培养2-3天后检测细胞的抗人IL12/23抗体产量，以确定 质粒是否成功转染、Puromycin/G418筛选是否成功，最终获得稳转细胞(多克隆)；
(3)对稳转细胞进行单克隆细胞株分选，获得抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S。
具体包括：
(3.1)将稳转细胞经多次稀释后接种至96孔板中，每孔中含有200μL完全培养液，并 确保每孔中只含有一个稳转单克隆细胞株；
(3.2)将96孔板中的细胞培养7天左右，时常用显微镜观察细胞生长状态，并对各单 克隆细胞株培养孔作标记；
(3.3)继续培养12-14天后检测各单克隆细胞株的抗人IL12/23抗体产量，选取高产量 的单克隆细胞株转入24孔板中，继续培养12-14天，并检测各孔内单克隆细胞株的抗人 IL12/23抗体产量；继续从24孔板中选取高产量的单克隆细胞株转入6孔板中，继续培养12-14 天，并检测各孔内单克隆细胞株的抗人IL12/23抗体产量，从中选取抗人IL12/23抗体产量最 高的单克隆细胞株，即为本实施例的抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S；
(3.4)将上述的抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S冻存保种。
从抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S的细胞培养上清液与标准抗体蛋白IgG的PAGE凝胶 电泳结果(如图1所示)可以看出，抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S的细胞培养上清液中抗人IL12/23抗体的含量比160μg/mL的IgG含量还要高。
实施例2
本实施例采用实施例1获得的抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S生产抗人IL12/23抗体， 该生产方法包括以下步骤：
(1)(a)将抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S(以下简称细胞株CHO-S)转移至含有30mL完全CD培养液的125mL摇瓶内，将摇瓶放置于37℃，5％CO2摇床内，于120rpm下震荡培 养；
冻存的抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S需要预先复苏，复苏方法为：将细胞株CHO-S从液氮罐中取出，并在37℃水浴锅内迅速解冻，随后将细胞液离心、去除上清，而后用PBS进行清洗；
初始培养时，每隔2-3天对细胞株CHO-S进行传代培养，至少需传代2次以上，传代培 养过程中注意避免细胞密度过高(不得大于2×106cell/mL)；
(b)传代培养完成后，将细胞转移至较大体积培养摇瓶内，细胞接种后初始密度要大于 3×105cells/mL；为了使培养液中有更高的溶氧量，培养摇瓶内培养液的体积不要超过培养瓶 总体积的1/5；
(c)培养48h后，用显微镜检测培养液中的细胞密度是否达到1×106cell/mL(应当达到 或高于)，待细胞密度达到1×106cell/mL后，切断二氧化碳供应，将摇床转速调节至130-135 rpm；
(d)继续培养6-8天(培养液中的细胞密度最高可达7-8×106cell/mL)，收集培养液， 离心并经0.45μm滤膜过滤，获得细胞培养上清液，采用GE AKTA Pure蛋白质分离纯化系统 依次对细胞培养上清液进行纯化和洗脱，洗脱曲线如图1所示。
由图1所示，洗脱液中抗人IL12/23抗体的响应值最高接近200，表明洗脱液中抗人IL12/23抗体具有较高的浓度。
制作蛋白浓度检测标准曲线，将100mL培养液抗体纯化，共得6mL抗体，将抗体稀释四个浓度梯度进行蛋白浓度监测，得如下表1所示结果：
表1
测得抗体终浓度为：4.82mg/mL。100mL培养液中抗体终产量为28.92mg。则预估该细胞 株抗体产量为2.9g/L。
委托上海生物科学研究所对获得的抗人IL12/23抗体进行测序，测序结果显示，抗人 IL12/23抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，抗人IL12/23抗体轻链的氨基酸序列如 SEQ ID No.4所示。由生物化学和细胞生物学研究所(Institute of Biochemistryand Cell Biology)、上海生物科学研究所(Shanghai Institutes For BiologicalSciences)和中国科学院 (Chinese Academy of Sciences)出具的肽段覆盖率分析结果表明，本发明的抗人IL12/23抗 体与乌司奴单抗的序列具有100％的一致性。
抗人IL12/23抗体重链氨基酸序列SEQ ID No.3为 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTTYWLGWVRQMPGKGLDWIGIMSPVDSDIRYSPSFQGQVTMSVDKSITTAYLQWNSLKASDTAMYYCARRRPGQGYFDFWGQGTLVT VSSSSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗人IL12/23抗体轻链氨基酸序列SEQ ID No.4为:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
序列表
<110> 浙江正熙生物医药有限公司
<120> 抗人IL12/23稳转细胞株及其构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
Claims (10)
1.一种抗人IL12/23稳转细胞株，其特征在于，所述的细胞株被命名为抗人IL12/23CHO-S稳转细胞株，于2020年3月11日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. C202050。
2.一种抗人IL12/23稳转细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备含有抗人IL12/23抗体重链基因的质粒和含有抗人IL12/23抗体轻链基因的质粒，并将上述两种质粒共转染亲代CHO-S细胞；
（2）对转染完成的CHO-S细胞进行Puromycin/G418筛选，获得稳转细胞；
（3）对稳转细胞进行单克隆细胞株分选，获得所述的抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S。
3.如权利要求2所述的抗人IL12/23稳转细胞株的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的Puromycin/G418筛选包括：将转染完成的细胞培养于完全培养液中，48 h后将完全培养液更换为含有10ug/mL puromycin和800ug/mL G418的筛选培养液，并每隔3-4天更换一次筛选培养液，直至细胞稳定生长。
4.如权利要求3所述的抗人IL12/23稳转细胞株的构建方法，其特征在于，所述的筛选培养液中puromycin和G418的终浓度分别为10ug/mL和800ug/mL。
5.如权利要求3所述的抗人IL12/23稳转细胞株的构建方法，其特征在于，所述的Puromycin/G418筛选还包括：将在筛选培养液中稳定生长的细胞接种至完全培养液中继续培养，获得已成功转染的稳转细胞。
6.如权利要求5所述的抗人IL12/23稳转细胞株的构建方法，其特征在于，将在筛选培养液中稳定生长的细胞接种至完全培养液中继续培养2-3天，接种后，完全培养液中的细胞密度为5×105 cells/mL。
7.如权利要求2所述的抗人IL12/23稳转细胞株的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的单克隆细胞株分选包括：将稳转细胞中的单克隆细胞株一一接种至完全培养液中，继续培养12-14天后检测各单克隆细胞株的抗人IL12/23抗体产量，获得所述的抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S。
8.如权利要求1中所述的抗人IL12/23稳转细胞株在制备抗人IL12/23抗体中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（a）将所述的抗人IL12/23稳转细胞株CHO-S接种到含有完全CD培养液的摇瓶中，置于37℃，5% CO2的环境中，于120rpm下进行传代培养；
（b）传代培养完成后，将细胞转移至较大体积培养摇瓶内，细胞接种后初始密度要大于3×105 cells/mL；为了使培养液中有更高的溶氧量，培养摇瓶内培养液的体积不要超过培养瓶总体积的1/5；
（c）待细胞密度达到1×106 cell/mL后，切断二氧化碳供应，将摇床转速调节至130-135rpm；
（d）继续培养6-8天，收集培养液，离心并经0.45μm滤膜过滤，获得细胞培养上清液，依次对细胞培养上清液进行纯化和洗脱，获得抗人IL12/23抗体。
10.如权利要求1中所述的抗人IL12/23稳转株细胞株在制备原料药，原料试剂或原料化妆品中的应用。
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