SK12242001A3 - Histidínproteínfosfatáza - Google Patents

Description

Vynálež sa týka nového enzýmu, histidínproteínfosfatázy, ktorá je odvodená z cicavčích zdrojov a je hómológovým variantom. Vynález sa týka ďalej sekvencií DNA kódujúcich uvedené proteíny, spôsobov ich prípravy a protilátok zameraných proti nim. Nová fosfatáza môže byť použitá na diagnózu patologických stavov regulácie buniek a rastu buniek a ako farmaceutická droga, ktorá môže byť podávaná v súvislosti s patologickými poruchami súvisiacimi so špatnou funkciou uvedeného enzýmu. Osobitne sa vynález týka použitia uvedeného enzýmu v diagnostike, v liečení chorôb, agonistov a antagonistov pri identifikácii faktorov, ktoré fungujú v histidínovej fosforylácii, i agonistov a antagonistov, ktoré sú potenciálne užitočné pri liečení.

Doterajší stav techniky

Proteínová fosforylácia je základný biologický proces, ktorý často má klúčový význam v transdukcii signálov a v reguláci aktivity proteínov. Fosforylácia serínu, treonínu a tyrozínu je bežná v cestách transdukcie eukaryotických signálov.

O biologických spôsoboch detekcie fosforylácie serínu, treonínu a tyrozínu na neznámych proteínoch existuje rozsiahla literatúra. Keď sú napríklad kultivované bunky cicavcov spracované rastovými faktormi, cytokinmi, drogami, peptidmi alebo inými stimulačnými molekulami, ako je PDGF, NGF, IL-2, môže sa lahko zistiť fosforylácia proteínov na seríne,, treoníne a tyrozíne inkubáciou buniek s rádioaktívne značeným fosfátom, izolovaním proteínov po spracovaní rastovým faktorom, separácii proteínov SDS polyakrylamidovou gélovou eketroforézou, fixovaním gélu a vykonaním autorádiografie na identifikáciu proteínových pásov obsahujúcich značený fosfát. Alebo sa proteíny zo spracovaných a nespracovaných buniek môžu separovať pomocou > r c

- 2 dvojrozmerného systému a môžu byt porovnané pozície proteínových škvŕn. Zdanlivý pohyb škvŕn môže indikovat zmenu v modifikačnom stave, ktorý je výsledkom ošetrenia. Pri inom spôsobe sú proteíny podrobované kyslej hydrolýze na získanie aminokyselín, ktoré sa potom môžu podrobit chromatografii v tenkej vrstve a skúšat na prítomnost rádioaktívne značeného fosforu.

Tieto spôsoby proteínovej chémie používajú stavy, v ktorých sú fosforylovaný histidín, lyzín a arginin nestále. Predovšetkým fosfohistidín sa spontánne štiepi pri polčase približne 5 až 100 minút pri nízkej hodnote pH, avšak pri neutrálnej hodnote pH má fosfohistidín polčas dne až týždne (Matthews, H.R., Pharmac. Ther. 67, str. 323 až 350, 1995). Napríklad po elektroforéze sú polyakrylamidové gély na separáciu proteínov všeobecne fixované za kyslých podmienok. Podobne vedú kyslé podmienky pre hydrolýzu aminokyselín tiež k štiepeniu fosfohistidínu.

Ukázalo sa, že fosforylovaný histidín má rozhodujúcu úlohu v transdukcii signálu v baktériách. Také cesty regulujú veľa aspektov bakteriálneho metabolizmu. Napríklad systém ArcA/ArcB ovláda aeróbny a anaeróbny metabolizmus E. coli (Luchi S., Weiner L., J. Biochem. (Tokyo) 120, str. 1055 až 1063, 1996). OmpR a OmpF riadia odozvu na rôzne osmotické podmienky (Pratt L.A., Hsing W., Gibson K.E., Šilhavý T.J. Mol Microbiol. 20, str. 911 až 7, 1996). CheA a CheZ sa podieľajú na chemitaxii (Alon U., Náture 397, str. 168 až 171, 1999).

Všetky tieto proteíny boli napred identifikované genetickými prostriedkami: mutácia v zodpovedajúcich génoch spôsobuje zaujímavé fenotypy a výsledný proteín môže byt identifikovaný po klonovaní príslušných génov.

Podobne sa v poslednom čase zistilo, že eukaryonty S. cere visiae a Arabidopsis thaliana majú signálne transdukčné systémy s proteínmi, ktoré zahŕňajú fosŕoryláciu histidínu (Loomis

- 3 a kol., J. Celí Science 110, str. 1141 až 1145, 1997). Napríklad proteín Slní má extracelulárnu senzorovú doménu, cytoplazmou doménu histidínkinázy a doménu transdukcie aspartátu. ETR1 horčicovej rastliny Arabidopsis thaliana bol tiež identifikovaný mutantmi, ktoré zlyhávajú v odozve na etylén. Gén ETR1 sa potom klonoval a študoval sa proteín, čo viedlo k objavu, že tento proteín je histidínkinázou. S. cerevisiae a Arabidopsis thaliana sú geneticky sledovatelné organizmy a ich proteíny vedú k histidínovej fosforylácii, ako sú Slní a Etrl, ktoré sa zvyčajne identifikujú genetickými prostriedkami.

Súčasné spôsoby zahŕňajú všeobecne separáciu podlá velkostí bud proteínov alebo fosfoaminokyselín.

Cicavčia N-fosforylácia je významná v metabolizme energie a mení sa v rôznych typoch rakoviny. Napríklad proteín Nm23 je nukleozidná difosfátkináza, ktorá môže využit ATP generovaného glykolýzou a oxidačnou fosforyláciou na premenu nukleoziddifosfátu a deoxynukleoziddifosfátu na trifosfáty. Nm23 sa stáva prechodne fosforylovaný na Histidín 118 ako súčasť ping-pongového reakčného mechanizmu. Nm23 je tiež schopný meniť svoju fosfátovú skupinu na histidínové zvyšky v ATP-citrátovej lyáze a sukcinylCoA syntetáze. Histidínová fosforylácia má preto významnú úlohu v energetickom metabolizmu v bunkách.

Ľudia majú niekolko proteínov Nm23. V prípade vysoko metastatických rakovín sú tieto proteíny Nm23 často expresované pri nízkych hladinách. Na základe týchto výsledkov sa považuje Nm23 za antionkogén. Okrem toho sa pri niektorých rakovinách nachádzajú mutácie práve v proteínoch Nm23. Tieto mutácie ovplyvňujú často mieru fosforylácie a defosforylácie Nm23.

Súhrnne naznačujú tieto výsledky, že N-fosforylácia má významnú úlohu v energetickom metabolizme a v rakovine. Preto proteíny alebo drogy, ktoré modulujú N-fosforyláciu alebo defosforyláciu by mohli byť významné pri liečení rakoviny alebo

- 4 metabolických porúch, ako je obezita, anorexia, upadnutost spôsobená rakovinou, HIV alebo ostatné choroby. Okrem toho, pretože má N-fosforylácia významnú úlohu v rozmanitých biologických javoch v iných organizmoch, je možné, že N-fosforylácia má úlohu v ostatných chorobách a poruchách cicavcov, ako sú napríklad poruchy imunity, vírusová infekcia, genetické poruchy, ochorenia srdca.

Cicavce však rastú značne pomalejšie ako baktérie, S. cerevisiae a Arabidopsis thaliana, a je preto obťažné identifikovať proteíny účastniace sa histidínovej, lyzínovej a arginínovej fosforylácie rovnakým genetickým prístupom ako pri týchto jednoduchších organizmoch. Okrem toho nie sú biochemické techniky na identifikáciu proteínov, ktoré sú fosforylované na seríne, treoníne a tyrozíne všeobecne použiteiné na identifikáciu proteínov, ktoré sú fosforylované na hystidíne, lyzíne a arginíne. Je teda v odbore potrebné vyvinúť spôsoby a biochemické reakčné činidlá na štúdium N-fosforylácie.

Histidínfosfatázy a histidínkinázy sú enzýmy pôsobiace protichodne. Histidínkináza ovplyvňuje fosforyláciu určitých histidínových zvyškov v proteínoch, zatiai čo histidínfosfatázy túto fosforyláciu obracajú. Obidva enzýmy majú pravdepodobne významnú úlohu v transdukcii signálov, v apoptóze, v riadení rastu buniek a v diferenciácii buniek. Sú známe ochorenia založené na poruchách týchto bunkových funkcií. Vynález sa teda týka činidla, ktoré môže byt použité na skúmanie príčin patofyziologických porúch a prípadne na ich liečenie.

Hormóny alebo peptidy stimulujú bunkové povrchové receptory na bunkách a vyvolávajú bunkové účinky cestou signálnej transdukcie. Reverzibilná fosforylácia špecifických proteínových substrátov regulačnými proteínovými kinázami a fosfatázami má podstatný význam v predávaní intracelulárnych signálov. Viazané na receptor, na membránu a intracelulárne proteínové kinázy a fosfatázy regulujú procesy bunkovej proliferácie, di- 5 ferenciácie buniek a imunitný systém. Špatná funkcia týchto regulátorov alebo ich aktivita je rozhodujúca pre velký počet patofyziologických javov. Proteínové kinázy éi fosfatázy a signálne transdukčné cesty, ktorých sa účastnia, predstavujú preto potenciálne ciele pre procesy objavovania drôg.

Transdukcia signálov u cicavcov zahŕňa reverzibilnú fosforyláciu Ser/Thr/Tyr. Hoci je známe, že v cicavcoch je prítomný hystidínfosfát (Crovello CS, Fúrie BC, Fúrie BCell 82: str.

279 až 286, 1995), nebolo dosial možné identifikovať: ani zodpovedajúcu kinázy ani príslušné fosfatázy. Problémom je napríklad skutočnosť, že histidínfosfatáza je nestabilná voči hydrolýze a jej detekcia pri štandardných analýzach fosfoaminokyseliny je nemožná.

Funkcia His kináz a His fosfatáz v baktériách bola skúmaná velmi dôkladne. Ich zahrnutie v chemotaxii a adaptácii z nich robí slubné body ošetrovania bakteriálnych chorôb.

Podstata vynálezu

Polypeptid majúci biologickú aktivitu histidínfosfatázy, ktorý má vysokú špecifickosť pre fosfohistidín a molekulovú hmotnosť 13 000 až 15 000, je podlá vynálezu získatelný izoláciou z tkaniva cicavcov stupňom aspoň jednej anexovej chromatografie, jednej gélovej filtrácie a jednej afinitnej chromatografie.

Vynález sa týka histidínproteínfosfatázy, najmä histidínproteínfosfatázových polypeptidov a histidínproteínfosfatázových polynukleotidov, rekombinantných materiálov a spôsobu ich výroby. Také polypeptidy a polynukleotidy sú zaujímavé v súvislosti so spôsobmi liečenia niektorých chorôb, vrátane, avšak bez zámeru na akékolvek obmedzenie, rakoviny a metabolických porúch, kardiovaskulárnych chorôb a chorôb centrálneho nervového systému, ktoré sú tu súhrnne označované ako choroby podlá

- 6 vynálezu. Vynález sa takisto týka spôsobov identifikácie agonistov a antagonistov (napríklad inhibítorov) používajúcich materiály podlá vynálezu a liečebných stavov súvisiacich s nerovnováhou N-fosforylácie identifikovanými zlúčeninami. Ešte dalej sa vynález týka diagnostických skúšok na detekciu chorôb súvisiacich s nesprávnou aktivitou alebo úrovňou histidínproteínfosfatázy.

Vynález podobne zahŕňa zodpovedajúce varianty a mutanty, produkované napríklad náhodnou alebo riadenou substitúciou, rôznym štiepením, vypúšťaním alebo prísadou jedného alebo niekolkých nukleotidov alebo aminokyselín s biologickou aktivitou v podstate zachovanou.

Úlohou vynálezu je teda poskytnúť polypeptid majúci biologickú aktivitu histidínfosfatázy, ktorý má vysokú špecifickosť pre fosfohistidín a molekulovú hmotnosť 13 000 až 15 000, je podlá vynálezu získatelný izoláciou z tkaniva cicavcov aspoň stupňom jednej anexovej chromatografie, jednej gélovej filtrácie a jednej afinitnej chromatografie. Výhodné cicavčie tkanivo pochádza zo srdca, obličiek, pečene, pankreasu, kostrového svalstva a vajec. Výhodnými cicavcami sú ludia, králičí < a potkany.

Vynález bližšie objasňujú nasledujúce príklady praktického uskutočnenia a pripojené obrázky.

Prehíad obrázkov na výkresoch

Obr.l Schéma čistenia použitého na izoláciu histidínfosfatázy

Obr.2 Identifikácia anorganického fosfátu ako produktu reakcie štiepení histidínfosfatázy. Doštičky ukazujú chromatograf iu v tenkej vrstve (PEI celulóza, 0,8 M LiCl); lavý stĺpec: spracovanie alumíniummolybdátm, pravý stĺpec f r- 7 spracovanie autorádiografiou; 1:[³²P]his-cheA,2; produkt reakcie, 3: ATP 1-3; fosfát (NaH₂PO₄)

Obr.3 Čas a proteín závislé na defosforylácii substrátu cheA; íavý stĺpec: degradácia po 0, 20 a 40 minútach, pravý stĺpec: uvoínenie radiačné značeného fosfátu (íavá osa y: %, pravá osa y: radiačná aktivita) rôznych množstiev substrátu (osa x: ng proteínu)

Obr.4 Analýza frakcie s aktívnou histidínfosfatázou (SDS-PAGE); AF: aktívna frakcia; 1,2: BSA (^g, 0,5 μg), 3:AF;4,5: molekulové markéry.

Obr.5 Hmotová analýza histidínfosfatázy. Osa y: načítanie, oxa x: hmotnosť (m/z).

Obr.6 Reverzná fázová chromatografická separácia histidínfosfatázy po enzymatickéj fragmentácii; elučné činidlo A: 0,1 % trif luóroctovej kyseliny vo vode a elučné činidlo B: 20 % , 0,1% trif luóroctovej kyseliny vo vode, 80 % acetonitrilu; UV stanovenie pri 214 nm.

Obr.7a (parciálna) Nukleotidová sekvencia králičej histidínproteínfosfatázy.

Obr.7b Translatovaná úplná aminokyselinová sekvencia králičej histidínproteínfosfatázy.

Obr.8a Rozdelenie nádorovej bunkovej línie histidínproteínfosfatázy.

Obr.8b Tkanivové rozdelenie histidínproteínfosfatázy v tkanivu nádoru.

Obr.8c Tkanivové rozdelenie histidínproteínfosfatázy v normálnom tkanivu.

- 8 Príklady uskutočnenia vynálezu

Polypeptid podlá vynálezu sa skladá najmenej z motívu sekvencie aminokyselín (SEQ.ô.3) DCECLGGGRISHQSQD. V inom uskutočnení vynálezu obsahuje polypeptid aspoň jeden motív sekvencie aminokyselín (SEQ.č. 4)

DCECLGGGRISHQSQDX¹KIHVYGYSMX²YGX³AQH, kde

X¹ = K alebo R, X² = A alebo G a X³ = P alebo R.

V ďalšom uskutočnení vynálezu obsahuje polypeptid aspoň jeden motív sekvencie aminokyselín (SEQ.č. 5) ' YHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM.

Všetky tieto parciálne sekvencie sú vysoko konzervované vnútri úplnej enzýmovej sekvencie aminokyselín a predpokladá sa, že sa podielajú na aktívnom mieste uvedeného enzýmu alebo majú iný biologický alebo farmaceutický význam pre cicavcov.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu má polypeptid biologickú aktivitu histidínfosfatázy, ktorá má vysokú špecifickosť pre fosfohistidín a molekulovú hmotnosť 13 000 až 15 000 a obsahuje nasledujúcu sekvenciu aminokyselín (SEQ.č.2):

(M) AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGD MQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTÉKIKAKYPDYEVTWANDGY

Metionínový zvyšok na N-zakončení sekvencie nie je nezbytný. Uvedená sekvencia je ludského pôvodu.

Vynález sa však týka takisto zvláštnych homologových variantov uvedených sekvencii. Úlohou vynálezu je ďalej poskytnúť polypeptid majúci biologickú aktivitu histidínfosfatázy, ktorý má vysokú špecifickosť pre fosfohistidín a molekulovú r >· r r

- 9 hmotnosť 13 000 až 15 000, sekvenciu aminokyselín, z ktorých má homológiu 64 až 99 %, s výhodou 75 až 99 %, v porovnaní so skvenciou hore uvedenou. Ako je uvedené v dalšom texte, týka sa vynález mnohých ďalších homológových polypeptidov, ktoré všetky majú biologickú aktivitu histidínproteínfosfatázy.

Ďalšou úlohou vynálezu je poskytnúť sekvencie DNA, ktoré kódujú polypeptid uvedený hore a dole. Osobitne sa vynález týka DNA majúcich nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu (SEQ.č.l):

(ATG) GCGGTGGCGGACCTCGCTCTCATTCCTGATGTGGACATCGACTCCGACGGCGTCTTCÄAG TATGTGCTGATCCGAGTCCACTCGGCTCCCCGCTCCGGGGCTCCGGCTGCAGAGAGCAAGGAGAT CGTGCGCGGCTACAÄGTGGGCTGAGTACCATGCGGACATCTACGACAAÄGTGTCGGGCGACATGC agaagcaaggctgcgactgtgagtGtctgggcggcgggcgcatctcccaccagagtcaggacaag AAGATTCACGTGTACGGCTATTCCATGGCCTATGGTCCTGCCCAGCACGCCATTTCAÄCTGÁGAA aatcaaagccaagtačcccgactäcgaggtcacctgggctaacgacggctac

Vynález sa týka tiež protilátok, s výhodou raonoklonáIných protilátok, ktoré sú zamerané na polypeptidy podlá vynálezu.

Úlohou vynálezu je konečne farmaceutický prostriedok obsahujúci hore a dole definované polypeptidy, prípadne s vhodnými excipientmi, s nosičmi a s inými účinnými látkami.

(A) Izolácia a čistenie

Histidínproteínová fosfatáza sa izoluje z králičej pečene. Príprava pečene začína rozkrájaním približne 110 g materiálu na malé kúsky, ktoré sa zmiešajú s homogenizačným tlmivým roztokom (220 ml 30 mM systému trietanolamín/chlorovodíková kyselina, hodnota pH 7,5, 1 mM etyléndiamíntetraoctovej kyseliny, 300 mM sacharózy, 0,1 mM benzamidínu, 0,1 % 2-sulfanyletanolu) a rozmelnia sa v homogenizátore pri chladení ladom. Po prvom odstredení (10 minút pri 3800 g, 4°C), sa supernatant odstreduje (1 hodinu pri 48000 g, 4°C). Tento supernatant sa sfiltruje cez gázu a zmrazí sa v 20 ml podieloch pri teplote -80°C.

t · r r r r r « * C * r e r r f _c · r C r- _{r r}

- 10 Spôsob separácie stĺpcovou chromatografiou

Histidínfosfatáza sa izoluje v troch izolačných stupniach (obr. 1).

1. Anexová chromatografia

Surový pečeňový extrakt sa opätovne odstred’uje (30 minút pri 48 000 g). Supernatant sa vpraví na stĺpec Source Q 30 (Pharmacia, Freiburg) vyvážený tlmivým roztokom A (20 mM trietanolamín/kyselina chlorovodíková, hodnota pH 8,0, lmM etylén· diamíntetraoctovej kyseliny, 0,1 % 2-sulfanyletanolu, 0,02 % nitritu sodného). Elučným činidlom je 200 mM chlorid sodný v tlmivom roztoku A pri prietokovej rýchlosti 1 ml/min.

2. Filtrácia gélu

Aktívna frakcia (pozri determináciu aktivity) sa mieša a chladí počas prísady síranu amónneho (11,2 g, 17 ml). Získaná peleta odstredením (20 minút, 48 000 g, 4^eC) sa resuspenduje v tlmivom roztoku A a vpraví sa na stĺpec Superdex 75 26/60 1,6 x 60 cm (Farmacia, Freiburg). Filtrácia gélu prebieha s prísadou 50 mM chloridu sodného do tlmivého roztoku A pri 1 ml/minútu.

3. Afinitná chromatografia

Aktívne frakcie z filtrácie gélu sa zriedia v pomere 1:3 tlmivým roztokom B (20 mM trietanolamín/kyselina chlorovodíková, hodnota pH 8,0, 0,1 mM etyléndiamíntetraoctovej kyseliny, 0,1 % 2-sulfanyletanolu, 0,02 % nitritu sodného) a nastaví sa na 10 mM v chloride horečnatom. Vzorka sa vnesie na stĺpec modrej Sepharózy 6 25x510 mm (Pharmacia, Freiburg). Elučným činidlom je tlmivý roztok B obsahujúci 200 mM chloridu sodného pri prietokovej rýchlosti 1 ml/min.

(B) Detekcia špecifickej aktivity

Aktivita rozpustnej histidínfosfatázy sa stanoví z defosforylácie histidínfosforylovaného proteínu značeného ³²P (CheA) ako substrátu. CheA rekombinantné bakteriálna histidínautokináza (Bilwes AM, Alex LA, Crane BR, Šimon MI Celí 96, str. 131 až 141, 1999); c-koncová kinázová doména fosforyluje N-zakončenie His48. Volný fosfát je produktom reakcie a identifikuje sa chromatografiou v tenkej vrstve (doštičky polyetylénimínovej celulózy, 0,5 M chloridu lítneho ako mobilnej fázy). Detekcia sa vykonáva jednak pomocou molybdátu amónneho, jednak autorádiografiou (obr. 2). Nedochádza k prenosu fosfátu na iné proteíny, ani sa nevyskytuje akékolvek štiepenie substrátu na peptidové fragmenty. Produktom je fosfát čo znamená, že je obsiahnutá fosfohistidínproteínfosfatáza.

Izolovaný proteín vykazuje histidínovú defosforyláciu ³²P-fosforylovaného CheA, závislú od času, teploty, hodnoty pH a od proteínu (obr.3).

Stabilita

Čistený proteín vykazuje stálosf pri uskladnení v surovom homogenizáte a v čiastočne čistených frakciách.

Enzýmová skúška

Substrátová preparácia (³²P značenie CheA)

Rekombinantný CheA (5 μΐ) sa zmieša s 0,5 μΐ 100 mM fenylmetylsulfonylfluoridu v dimetylsulfoxide a 5 μΐ 500 mM HEPESbhodnota pH 8,0 a s 1 mM chloridu horečnatého. Pridá sa 108 μΰπΓΐε ³²P-g adenozíntrifosfátu, 5 μΐ 10 μΜ adenozíntrifosfátu a 50 μΐ vody a inkubuje sa 3 hodiny pri teplote 37’C

Stanovenie aktivity

Substrát (10 μΐ ³²P-CheA) sa zmieša s 10 μΐ skúšobného tlmivého roztoku (100 M trietanolamín/kyselina chlorovodíková, hodnota pH 8,0, l % 2-sulfanyletanolu, 0,02 % nitritu sodného) a s roztokom enzýmu. Reakcia prebieha 30 minút pri teplote 37°C. Pridajú sa 2 μΐ 500 mM etyléndiamíntetraoctovej kyseliny a 126 μΐ zmesi metanol/acetón 1:1. Po odstreďovaní (5 minút pri 15 800 g) sa supernatant vyberie a merí sa scintilačným počítačom.

Opísaná fosfatáza je tak oddelená od ostatných proteínfosfatáz na báze

1) špecifickosti fosfohistidínu (tabulka I), histidínfosfatáza nehydrolyzuje napríklad p-nitrofenylfosfát,

2) aktivita nie je inhibovaná okadaovou kyselinou alebo vanadátom (tabulka II),

3) molekulová hmotnosi je značne menšia.

Tabulka I

Hydrolýza novou histidínproteínfosfatázou

Azocoll
[gama32-P] ATP	-
p-nitrofenylfosfát	-
[gama32-P] Ser/Thr-kazeín	-
Tyr-xxx	-
[gama32-P] His-nukleoziddifosfátkináza	-

[gama³²-P] His-che A +

Γ Γ r r r r C r e ľ t· r '

- 13 Tabulka II

Reakčné činidlá ovplyvňujúce histidínfosfatázové aktivity
Reakčné činidlo	Koncentrácia	Aktivita (%)
fosfát	10	mM	0
okadová kyselina	10	μΜ	108
mikrocystín	5	nM	110
tautomycín	0	,5 nM	90
inhibitorproteín Ij	1	nM	120
molybdát	10	μΜ	71
vanadát	10	μΜ	62
fluorid	5	mM	105
EDTA	5	mM	108
EGTA	5	mM	91
Mg2+	1	mM	142
Mg2+	10	mM	226
Ca2+	1	mM	165
Ca2+	10	mM	240

100 % = xxx nmol/min x mg

9 r

n t o r r.

p e e - r p f ŕ P r C

C ** ť r p r r. .- 14 (C) Charakterizácia histidínproteínfosfatázy

Izolovaná proteínová frakcia obsahuje definované pásmo so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 14 000 pódia analýzy SDS gélovou elektroforézou (obr.4). Hmotová analýza udáva molekulovú hmotnosť proteínu 13 768 (obr.5). Histidínproteínfosfatáza je N-koncovo blokovaná acetylovou skupinou. Sekvenčná informácia nie je preto dostupná Edmanovou degradáciou a na charakterizáciu proteínu je nutné proteolytické štiepenie.

(D) Analytické stanovenie proteínu

Aktívna frakcia (obr.4) sa enzymaticky štiepi na určenie aminokyselinovej sekvencie a výsledné peptidové fragmenty sa sekvenujú Edmanovou degradáciou a používa sa hmotová spektrometria známymi spôsobmi opísanými v literatúre (Kellner R., Lottspeich F. Meyer HE Microcharacterization of Proteins, Willey-VCH, 1999).

Enzymatická fragmentácia

Gélový pás sa vyreže skalpelom a vloží sa do Eppendorfovej skúmavky. Enzymatická fragmentácia prebieha po pridaní trypsínu ako proteázy (1 μg trypsínu, 100 μΐ 0,5 M hydrogenuhličitanu amónneho, 37°C, 12 hodín). Výsledné peptidové fragmenty sa extrahujú (50 % trifluóroctovej kyseliny, 50 % acetonitrilu). Extrakt sa skoncentruje vo vákuovej odstredivke.

Chromátografická separácia peptidových fragmentov

Peptidové fragmenty sa rozpustia v elučnom činidle A (0,1 % trifluóroctovej kyseliny vo vode) a na separáciu sa použije fázová reverzná chromátografia (elučné činidlo B:

% 0,1% trifluóroctovej kyseliny vo vode, 80 % acetonitrilu) Po frakcionácii, založenej na UV stanovení pri 214 nm (obr.

6), sa separované peptidové fragmenty v rozpustenej forme stanovia Edmanovým sekvenovaním a hmotovou spektrometriou.

Edmanovo sekvenovanie a hmotové spektrometrické stanovenie

Po chromatografickéj separácii sa tekuté frakcie z 90 % použijú na Edmanove sekvenovanie (štandardné podmienky, zariadenie: model 494, PE-Applied Biosystems, Weiterstadt). Zostávajúca časú frakcie sa použije na hmotovú analýzu (MALDI-MS) (zariadenie: Voyáger STR, Perseptive Biosystems Wiesbaden).

Identifikované peptidové sekvencie

Určia sa nasledujúce peptidové sekvencie (králičie)

AAAGLAQIPD VDIDSDGVFK

YVLIR

VHAAPPSEÄPGGESK

DIVR

WAEYHADIYDK

VSGELQK

ISHQSQDR

KIHVYGYSMGYGR

YPDYEVTWADDGY

Tieto peptidy vedú k enzýmovému peptidu z králikov (SEQ.č.6) AAAGLAQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHAAPPSEAPGGESKDIVRGYKWAEÝHADI YDKVSGELQK ' • KGHDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQKSVSTEKIRAKYPDYEVTWADDGY (E) Sekvenovanie nukleotidov

Knižnica králičích DNA εει sníma prajmermi vybranými zo získanej sekvencie aminokyselín pre histidínproteínfosfatázonukleotidovú sekvenciu. Klonovanie a sekvenovanie identifikuje nukleotidovú sekvenciu uvedenú na obr.7a.

Vykoná sa translácia 327 báz pre sekvenciu histidínproteínfosfatázoproteínovú sekvenciu začínajúcu v polohe 11 až 119 (obr. 7b).

Analýza databázy

Hľadanie v databáze sa uskutoční pomocou algoritmu BLAST. Homológové proteíny môžu byt identifikované z C. elegans, Drosofila melanogaster, Drosofila pseudoobscura v proteínových databázach.

V nukleotidových databázach sa EST identifikuje v ľuďoch, v potkanoch a v myšiach. Ľudský homológ nebol doposiaľ publikovaný. Podľa týchto zoznamov EST sa zistilo, že ľudský histidínproteínfosfatázový proteín má nasledujúcu sekvenciu (SEQ. č.2, bez metionínového zvyšku):

AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVKSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGDMQK qgcdceclgggrishqsqdkkihvygysmaygpaqhaistekikakypdyevtwandgy'

Potkaní homológ nebol doposiaľ publikovaný. Podľa týchto zoznamov EST sa zistilo, že potkaní histidínproteínfosfatázový proteín má nasledujúcu sekvenciu (SEQ.č.7):

nglnttrgkgssplgkdhqeľelltpypavkfsvgptraträypeatlptsadiydkvsgelqkn gydceclgggrishqsqdrkikvygysmgygraqhsvstekikakypdyevtwaddgy

Myší homológ nebol doposiaľ publikovaný. Podľa týchto zoznamov EST sa zistilo, že myší histidínproteínfosfatázový proteín má nasledujúcu sekvenciu (SEQ.č.8):

MAADLGQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHLAEPSGDPAKECKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGELQR

NGYDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIKAKYPDYEVTWADDGY r r

- 17 Tabulka III

Sekvenčná homológia pre proteínhistidínproteázu z rôznych druhov udaná v % identity

r. r c 7 r r r r* f- r r- r

		1	2	3	4	5	6	7
1	ludský	100	84,0	65,3	64,3	68,2	38,0	40,3
2	králičí		100	72,4	71,4	71,0	36,0	42,0
3	myší			100	67,3	52,7	32,7	33,3
4	potkaní				100	51,6	30,8	29,5
5	zebra fish					100	33,7	42,1
6	C. elegns						100	39,7
7	drozofila							100

(E) Lokalizácia proteínu a rozdelenie tkanív

Ľudský histidínproteínfosfatázový gén je umiestnený na chromozómu 9 (9q33)-Tel, markér sts-N90764, interval D9S159-qTEL). Použijú sa tieto zdroje na expresiu cDNA: Mozog, prsník, CNS, hrubé črevo, predkožka, vajíčko, srdce, oblička, pečeň, plúca, svaly, pankreas, paratyroid, nahromadená krv, prostata, slezina, vajcia, štítna žlaza, tonzily, maternica a celé embryo.

Z analýzy rozdelenia histidínproteínfosfatázy RNA je zvýšená hladina v normálnych tkanivách, ako je srdce, obličky, pečeň, pankreas, kostrové svalstvo a vajcia (obr. 9 a,b).

(F) Protilátky anti-histidínfosfatázy

Protilátky antihistidínfosfatázy boli vytvorené proti trom rozdielnym oblastiam proteínu, menovito n-zakončeniu, strednej a koncovej časti zakončenia molekuly. Na to boli zvolené tri peptidové sekvencie:

peptid 1 - QIPDVDIDSD GVFKYV (16aa, SEQ.č.9) peptid 2 - CLGGGRISHQ SQDK (14aa, SEQ.č.10) peptid 3 - CTEKIKAKYP DYEV (14aa, SEQ.č.11)

Peptidy boli syntetizované využitím štandardnej chémie

FMOC. Na imunizáciu boli peptidy injektované (4 injekcie) dvom králikom a boli odobrané 4 vzorky krvi. Konečný odber krvi bol po približne 3 mesiacoch. Vytvorené protilátky sú vhodné na detekciu a lokalizáciu histidínfosfatázy. Okrem toho môžu byt individuálne analyzované tri rôzne oblasti vnútri molekuly. Predovšetkým vysoko konzervovaná stredná čast histidínfosfatázy, obsahujúca nasledujúce sekvencie aminokyselín: DCECLGGGRISHOSOD (SEQ.č.3) obsahuje pódia predpokladu aktívne miesto zodpovedné za funkciu proteínov in vivo. Antipeptidová protilátka proti tejto oblasti je na inhibičné a neutralizačné použitie.

Charakteristiky histidínproteínfosfatázy je možné zhrnút takto:

1. Sekvencia aminokyselín iudskej histidínproteínfosfatázy obsa huje približne 124 aminokyselín.

2. Sekvencia aminokyselín histidínproteínfosfatázy je vysoko homologická v C-zakončení, ale iba slabá homológia je pre N-zakončenie.

3. Molekulová hmotnost je 13 800 ± 100 (obr.5).

4. Histidínproteínfosfatáza je N-koniec blokovaný acetyláciou.

Farmaceutické prostriedky

Natívne i rekombinantné proteíny je možno používať; ako liečivá, ktoré sa môžu pacientovi podávať priamo, alebo vo farmaceutických prostriedkoch. Vynález sa preto týka rekombiΓ Λ

- 19 nantného alebo natívneho tu definovaného proteínu použiteľného ako liečivo a príslušných farmaceutických prostriedkov obsahujúcich uvedený proteín a farmaceutický prijateľné riedidlo, nosič alebo excipient.

Prídavné môžu farmaceutické prostriedky podľa vynálezu obsahovat ďalšie najrôznejšie farmaceutický účinné zlúčeniny.

Pojmom farmaceutický prijateľný nosič sa tu rozumie inertné netoxické alebo tekuté plnidlo, riedidlo alebo zapúzdrovací materiál, nereagujúci nepriaznivo s účinnou zlúčeninou alebo s pacientom. Vhodné, s výhodou kvapalné nosiče sú v odbore dobre známe, ako sterilná voda, solanka, vodná dextróza, cukrové roztoky, etanol, glykol a oleje, vrátane minerálneho, živočíšneho, rastlinného alebo syntetického pôvodu, napríklad podzemnicového, sójového a minerálneho oleja.

Prostriedky podlá vynálezu sa môžu podávať v jednotkových dávkach obsahujúcich bežné netoxické farmaceutický prijateľné nosiče, riedidlá, pomocné činidlá a spojivá, ktoré sú typické pre parenterálne podávanie.

Pojem parenterálny zahŕňa subkutánnu, intravenóznu, intraartikulárnu a intratracheálnu injekčnú a infúznu techniku. Vhodné sú tiež iné spôsoby podávania, ako orálne a topické. Parenterálne prostriedky a kombinácie sú najvýhodnejšie podávané intravenózne, buď v bolusovej forme alebo ako konštantná fúzia podlá známych spôsobov. Tablety a kapsuly na orálne podávanie obsahujú konvenčné excipienty, ako sú spojivá, plnidlá, riedidlá, tabletovacie činidlá, mazadlá, dezintegračné činidlá a namáčadlá. Tablety môžu byt potiahnuté v odbore známym spôsobom. Orálne kvapalné prostriedky môžu byť vo forme vodných alebo olejových suspenzií, roztokov, emulzií, sirupov a vodičiek, alebo môžu byť podávané ako suchý produkt na zmiešanie s vodou alebo s iným vhodným nosičom pred použitím. Také tekuté prostriedky môžu obsahovať obvyklé prísady, ako suspen20 začné činidlá, emulgátory, nevodné nosiče a konzervačné činidlá. Topické prostriedky môžu byt vo forme vodných alebo olejových suspenzií, roztokov, emulzií, želé a s výhodou emulzných mastí.

Jednotkové dávky podlá vynálezu môžu obsahovať denné potrebné množstvo proteínu podlá vynálezu, alebo jeho podiely na vytvorenie požadovanej dávky. Optimálna terapeuticky prijatelná dávka a rýchlosť pre daného pacienta (cicavca vrátane ludí) závisí od mnohých činitelov, ako sú účinnosť špecifickej použitej účinnej látky materiálu, veku, telesnej hmotnosti, celkového zdravotného stavu, pohlavia, diéty, času a cesty podávania, rýchlosť vylučovania, aktivity enzýmu (jednotiek/mg proteínu), účelu ošetrovania, to znamená terapie alebo profylaxie a povahy liečenej choroby.

Preto v prostriedkoch a kombináciách pre liečeného pacienta (in vivo) je farmaceutický účinná denná dávka proteínu podlá vynálezu približne 0,01 až 100 mg/kg telesnej hmotnosti (vztiahnuté k špecifickej aktivite 100 kU/mg), s výhodou 0,1 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti. Podlá formy podania môže jedna samotná dávka obsahovať 0,5 až 10 mg histidínproteínfosfatázy.

Priemyselná využitelnosť

Polypeptid na výrobu diagnostika, farmaceutických prostriedkov na liečenie chorôb, na výrobu agonistov a antagonistov pri identifikácii faktorov, ktoré fungujú v histidínovej fosforylácii, i agonistov a antagonistov, ktoré sú potenciálne užitočné pri liečení.

trr • ff < f f * ^f ♦ ŕ «- e ^r f ft r - p r ť r ^r ť f _r , r- >· r· C :

Claims (12)

1. Polypeptid majúci biologickú aktivitu histidínfosfatázy, ktorý má vysokú špecifickosť pre fosfohistidín a molekulovú hmotnost 13 000 až 15 000, získatelný izoláciou z tkaniva cicavcov stupňom aspoň jednej anexovej chromatografie, jednej gélovej filtrácie a jednej afinitnej chromatografie.

2. Polypeptid podlá nároku 1 obsahujúci aspoň jeden motív sekvencie aminokyselín

DCECLGGGRISHQSQD.

3. Polypeptid podlá nároku 1 obsahujúci aspoň jeden motív sekvencie aminokyselín dceclgggrishqsqdx¹kihvygysmx²ygx³aqh, kde X¹ = K alebo R, X² = A alebo G a X³ = P alebo R.

4. Polypeptid podlá nároku 1 obsahujúci aspoň jeden motív sekvencie aminokyselín

YHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM.

5. Polypeptid majúci biologickú aktivitu histidín fosfatá zy, ktorá má vysokú špecifickosť pre fosfohistidín a molekulovú hmotnost 13 000 až 15 000, obsahujúci nasledujúcu sekvenciu aminokyselín:

(M) AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYH j ÄDIYDKVSGDMQKQGCDCECÉGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEK i IKAKYPDYEVTWANDGY.

6. Polypeptid majúci biologickú aktivitu histidín fosfatázy, ktorá má vysokú špecifickosť pre fosfohistidín a molekur * t> r r ·- 22 lovú hmotnosť 13 000 až 15 000, ktorého sekvencia aminokyselín má homológiu 64 až 99% v porovnaní so sekvenciou podlá nároku

3.

7. Polypeptid podlá nároku 6, obsahujúci nasledujúcu sekvenciu aminokyselín:

i AAAGLAQIPDVDIDSDGVFKÝVĽIRVHAAPPSEAPGGESKDIVRGYKWAEYHADI * YĎKVSGELQKKGHDCECLGGGRISHQSQ'DRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKÍRA i · .....

‘ KYPDYEVTWADĎGÝ.

8. DNA kódujúca polypeptid podlá nároku 1 až 7.

9. DNA podlá nároku 8, obsahujúca nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu:

(ATG)GCGGTGGCGGACCTCGCTCTCATTCCTGÄTGTGGACATCGACTCCGACGG

CGTCTTCAAGTATGTGCTGATCCGAGTCCACTCGGCTCCCCGCTCCGGGGCTCCG

GCTGCAGAGAGCAAGGAGATCGTGCGCGGCTACAAGTGGGCTGAGTACCATGCGG

ÁCATCTACGACAAAGTGTCGGGCGACATGCAGAAGCAAGGCTGCGACTGTGA.GTG ' TCTGGGCGGCGGGCGCATCTCCCACCAGÄGTCAGGACAAGAAGATTCACGTGTAC GGCTATTCCATGGCCTATGGTCCŤGCCCAGCACGCCATTTCAACTGAGAAAATCA · AAGCCAAGTACCCCGACTACGAGGTCACCTGGGCTAACGACGGCTAC

10. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polypeptid podlá nároku 1 až 7 a prípadne vhodný excipient, nosič a iné aktívne zložky.

11. Protilátka zameraná na polypeptid podlá nároku 1 až 7.

1 l 10

OBR. 1 rozpustný extrakt zdroj Q 30

1 0.2 M NaCl (NH₄)₂SO₄ ppt .

1 95%

Superdex 75 1 14-18 kD modrá Sepharóza

10 mM Mg²* o'.2M'ŇaCf histidínfosfatá2a

2 / 10

x.

1 2 3

1: [³²P]his-cheA

2; reakčný produkt (supematant)

3; ATP

1-3: fosfát (NaH₂PO₄)

PEI celulóza 0.8 M LiCI

1 2 3 anión i ummo 1 ybdáb autorádiografia chromatografia v tenkej vrstve'

OBR. 2 r r P c Γ r

·.···* -r

3 / 10 t

0 20 40 min uvólnenie (1O³Cpm)

OBR. 3

4 / 10 : · ii/ú i 7 r'

OBR. 4 e 1*

5 / 10

OBR. 5

6 / 10 x'v. íj i / 7·»

7 / 10

OBR. 7a

GTGGACATCGACTCCGACGGCGTCTTCAAGTACGTíSCTGATTCGAGTC

CACGCGGCGCCGCCCTCCGÄAGCCCCGGGCGGCGAGAGCAAGGACATC

GTGCGTGGCTACAAGTGGGCCGAGTACCACGCCGACATCTACGACAAG

GTGTCGGGCGAGCTGCAGAAGAAGGGCCATGACTGCGAGTGCCTGGGC

GGCGGGCGCATCTCCCACCAGAGCCAGGACCGGAAGATCCACGTGTAC

OBR. 7b

AAAGLAQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHAAPPSEAPGGESKDIVRGYKW

AEYHÄDIYDKVSGELQKKGHDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGY

GRAQHSVSTEKIRAKYPDYEVTWADDGY r f e r r r e r

8 / 10

1,000

0_;9000,8000,7000,6000,500 0,4000,3000,200

0,100

0,000

CO 1 CTI LO Q CM CO —r O CO CO LO CT5 CM CM LO CO lo CM ur> «— o 1 h— LO <X a CZ? u. —J zzz ( r-* 5 Σ CO u- CO CO O) CO

* Π ľl fl.Fl ιί cn i

C—i

OBR. 8a r*·.

i

G~

So

SK-BR-3 et r '

V» ♦ ·

9 / 10

OBR. 8b žalúdok u žalúdok. j_u f f· f

10 / ίο

Zoznam sekvencií <110> Merck Patent GnbH <12O>. Histidxnproteínfosfatáza <160> íl <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <2U> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(375) <223> ľudská histidínproteínfosfatáza <400> 1

atg gcg gtg gcg gäc ctc get ccc att cct gat gtg gac atc gac tcc 48 Met Ala Val Ala Asp Leu Ala Leu íle Pro Asp Val Asp íle Asd Ser 1 5 10 15 gac ggc gtc ttc aag tat gtg ctg atc ega gtc cac tcg get ccc ege 96 Asp Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu íle Arg Val His Ser Ala Pro Arg 20 25 30 r. tcc ggg get ccg get oca gag age aag gag atc gtg ege ggc tac aag 144 Ser Gly Ala Pro Ala Ála Glu Ser Lys Glu íle Val Arg Gly Tyr Lys * 35 f 40 45 tgg gčt gag tac cat gcg gac atc tac gac aaa gtg tcg ggc gac atg 192 Trp Ala Glu Tyr His Ala Asp íle Tyr Asp Lys Val Ser Gly Asp Met 50 55 60 cag aag caa ggc tgc gac tgt gag tgt ctg ggc ggc ggg ege atc tcc 240 Gin Lys Gin Gly Cys Asd Cys Glu Cys Leu Glv Gly Gly Arg íle Ser 65 70 75 80 cac cag agt cag gac aag aag* att cac gtg tac ggc tat tcc atg gcc 288 His Gin· Ser Gin Asp Lys Lys íle His Väl Tyr Gly Tyr Ser Met Ala 85 90 95 tat ggt cct gcc cag cac gcc att tca act gag aaa atc aaa gcc aag 336 Tyr Gly Pro Ala Gin His Ala íle Ser Thr Glu Lys íle Lys Ala Lys 100 105 110 tac ccc gac tac gag gtc acc tgg get aac gac ggc tac 375 Tyr Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asn Asp Gly Tyr 115 120 125

» · e « e r * » r r .<210> 2 ’<211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Ala Val Ala Asp Leu Ala Leu íle Pro Asp Val Asp íle Aso Ser 1 5 10 15 Asp Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu íle Arg Val His Ser Ala Pro Arg 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Ala Ala Glu Ser Lys Glu íle Val Arg Gly Tyr Lys 35 40 45 Trp Ala Glu Tyr His Ala Asp íle Tyr Asp Lys Val Ser Gly Asp Met _ 50 55 60 Gin Lys Gin Gly Cys Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg íle Ser 65 7*0 75 80 His Gin Ser Gin Asp Lys Lys íle His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Ala 85 90 95 Tyr Gly Pro Ala Gin His Ala íle Ser Thr Glu Lys íle Lys Ala Lys 100 105 110 Tyr Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asn A.sp Giv Tyr

115 120 125 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> cicavčŕ <22Ó>

<221> PEPTID· <222> (1)..(16) <223> zachovaná cicavčia sekvencia <400> 3

Asp Cys Glu Cys Leu Gly GÍy Gly Arg íle Ser His Gin Ser Gin As?

1 5 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> cicavčí <220> <221> PEPTID. <222> (1).·(33) <223> zachovaná cicavčia sekvencia <220> <221> SITE <222> (17) - <223> X = K alebo R

<220>

<221> SITE <222> (27) <223> χ - alebo G <220>

<221> SITE <222> (30) <223> χ = p alebo R <400> 4

Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg íle Ser His Gin Ser Gin Asp 1 ,5 10 · 15

Xaa Lys íle His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Xaa Tyr Gly Xaa Ala Gin 20 25 30

His <210> 5 <211> 44 <212> PRT <213> cicavčí <220>

<221> PEPTID.

<222> (1)..(44) <223> zachovaná cicavčia sekvencia 3 <400> 5

Tyr 1 His Ala Asp íle 5 Tyr Asp Lys Val Ser Gly 10 Asp Met Gin Lys Gin 15 Gly Cys Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg íle Ser His Gin Ser 20 25 30 Gin Asp Lys Lys íle His Val Tyr Gly Tyr Ser Met

35 40 <210> 6 <211> 124 <212> PRT <213> králik <220>

<221> PEPTIDE <222> (1)..(124) <223> králi čiahistidínproteínfosfatáza <400> 6

Ala Ala Ala Gly 1 Leu 5 Ala Gin íle Pro Asp 1*0 Val Asp íle Asp Ser 15 Asp Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu íle Arg Val His Ala Ala Pro Pro Ser 20 25 30 Glu Ala Pro Gly Gly Glu Ser Lys Asp íle Val Arg Gly Tyr Lys Trp

35 40 45 .J

Ala Glu Tyr His Ala Asp íle Tyr Asp Lys Val Ser Gly Glu Leu Gin 50 55 60 Lys Lys Gly His Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg íle Ser His 65 70 75 80 Gin Ser Gin Asp Arg Lys íle His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Gly Tyr 85 90 95 Gly Arg Ala Gin His Ser Val Ser Thr Glu Lys íle Arg Ala Lys Tyr 100 105 110 Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asp Asp Gly Tyr 115 120

<210> 7 <211> 123 <212> PRT <213> rat <220>

<221> PEPTID.

<222> (I)..(123) ^<223> potkania histidínproteínfosfatäza <400> 7

Asn Gly Leu Asn 1 Thr 5 Thr Arg Gly Lys Gly 10 Ser Ser Pro Leu Gly 15 Lys Asp His Gin Glu Leu Glu Leu Leu Thr Pro Tyr Pro Ala Val Lys Phe 20 25 30 Ser Val Gly Pro Thr Arg Ala Thr Arg Ala Tyr Pro Glu Ala Thr Leu 35 40 45 Pro Thr Ser Ala Asp íle Tyr Asp Lys Val' Ser Gly Glu Leu Gin Lys 50 55 60 Asn Gly Tyr Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg íle Ser His Gin 65 70 75 80 Ser Gin Asp Arg Lys íle His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Gly 85 90 95 Arg Ala Gin His Ser Val Ser Thr Glu Lys íle Lys Ala Lys Tyr Pro 100 105 110 Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asp Asp Gly Tyr 115 120

<210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> _mySf • ft <220>

-Ť<221> PEPTID' <222> (1)..(124) <223> inyšfe histidínproteínfosfatáza

<400 i> 8 Met Ala Ala Asp Leu Gly Gin íle Pro Asp Val Asp íle Asp Ser Asp 1 5 10 15 Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu íle Arg Val His Leu Ala Glu Pro Ser 20 25 30 Gly Asp Pro Ala Lys Glu Cys Lys Glu íle Val Arg Gly Tyr Lys Trp 35 40 45 Ala Glu Tyr His Ala Asp íle Tyr Asp Lys Val Ser Gly Glu Leu Gin 50 55 60 Arg Asn Gly Tyr Asp Cys ‘Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg íle Ser His 65 70 75 80 Gin Ser Gin Asp Arg . Lys íle His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Gly Tyr 85 90 95 Gly Arg Ala Gin His Ser Val Ser Thr Glu Lys íle Lys • Ala Lys Tyr 100 105 110 Pro Asp Tyr Glu Val Thr Tr? Ala Asp Asp Gly Tyr 115 120

<210> 9 <211> 16 <212> PRT > <213> .uraelá sekvencia <220>

2 2 2

Opis umelej sekvencie: peptid na generáciu protilátky zameranej proti histidínproteínfosfatáze <400> 9

Gin íle Pro Asd Val Asp Ilé Asp Ser Asp Gly Val Phe Lys Tyr Val 1 *5 10 ’ 15 .

<400> 10

Cys Leu Glv Gly Gly Arg íle Ser His Gin Ser Gin Asp Lys i ’ 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT

J <213> umelá sekvencia <220>

^<223> Opis umelej sekvencie: peptid na generáciu protilátky zameranej proti histidínproteínfosfatáze ^y r c r r <210> 11 •<211> 14 <212> PRT <213>; umelá sekvencia <220>

<223>

Opis umelej sekvencie: peptid na generáciu protilátky zameranej proti histidínproteínfosfatáze <400> 11

Cys Thr Glu Lys íle Lys Ala Lys Tyr Pro Aso Tyr Glu Val 1 5 10 *