CZ20013172A3

CZ20013172A3 - Histidinproteinfosfatáza

Info

Publication number: CZ20013172A3
Application number: CZ20013172A
Authority: CZ
Inventors: Susanne Klumpp; Roland Kellner
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 2000-03-02
Publication date: 2001-12-12
Also published as: BR0008607A; EP1159430B1; ATE393827T1; JP2002537814A; CN1201009C; EP1159430A1; AU3808000A; CN1342205A; NO20014261D0; US6812015B1; HUP0200241A2; AU762809B2; WO2000052175A1; ZA200108129B; AR022836A1; HK1042729A1; ES2303813T3; KR20020002400A; NO20014261L; RU2281973C2

Description

Vynález se týká nového enzymu, histidinproteinfosfa tázy, která je odvozena ze savčích zdrojů a je homologovou variantou. Vynález se týká dále sekvencí DNA kódujících uvedené proteiny, způsobů jejich přípravy a protilátek zaměřených proti nim. Nové fosfatázy může být použito k diagnóze patologických stavů regulace buněk a růstu buněk a jako farmaceutické drogy, která může být podávána v souvislosti s patologickými poruchami souvisejícími se špatnou funkcí uvedeného enzymu. Zvláště se vynález týká použití uvedeného enzymu v diagnostice, v léčení nemocí, agonistů a antagonistů při identifikací faktorů, které fungují v histidinové fosforylaci, i agonistů a antagonistů, které jsou potenciálně užitečné při léčení.

Dosavadní stav techniky

Proteinová fosforylace je základním biologickým procesem, který často má klíčový význam v transdukci signálů a v regulaci aktivity proteinů. Fosforylace šeřinu, threoninu a tyrosinu je běžná v cestách transdukce eukaryotických signálů. O biologických způsobech detekce fosforylace šeřinu, threoninu a tyrosinu na neznámých proteinech je rozsáhlá literatura. Jsou-1 i například kultivované buňky savců zpracovány růstovými faktory. cytokiny, drogami, peptidy nebo jinými stimulačními molekulami, jako je PDGF, NGF, IL-2, může se snadno zjistit fosforylace proteinů na šeřinu, threoninu a tyrosinu inkubací buněk s radiačně značeným fosfátem, izolováním proteinů po zpracování růstovým faktorem, separaci proteinů SDS polyakrylamidovou gelovou eketroforézou, fixováním gelu a provedením autoradiografie k identifikaci proteinových pásů obsahujících značený

fosfát. Nebo se proteiny ze zpracovaných a nezpracovaných buněk mohou separovat pomocí dvourozměrného systému a mohou být porovnány pozice proteinových skvrn. Zdánlivý pohyb skvrn může indikovat změnu v modifikačním stavu, který je výsledkem ošetření. Při jiném způsobu jsou proteiny podrobovány kyselé hydro lýze k získání aminokyselin, které se pak mohou podrobit chromatografi i v tenké vrstvě a zkoušet na přítomnost radiačně značeného fosforu.

Tyto způsoby proteinové chemie používají stavů, ve kterých jsou fosforylováný histidin, lysin a arginin nestálé. Zvláště fosfohistidin se spontánně štěpí při poločase přibližně 5 až 100 minut nízké hodnotě pH, avšak při neutrální hodnotě pH má fosfohistidin poločas dny až týdny (Matthews, H.R., Pharmac. Ther. 67, str. 323 až 350, 1995). Například po elektroforéze jsou polyakrylamidové gely pro separaci proteinů obecně fixovány za kyselých podmínek. Podobně vedou kyselé podmínky pro hydrolýzu aminokyselin také k štěpení fosfohistidinu.

Ukázalo se, že fosforylovaný histidin má rozhodující úlohu v transdukci signálu v bakteriích. Takové cesty regulují mnohé aspekty bakteriálního metabolismu. Například systém ArcA/ArcB ovládá aerobní a anareobní metabolismus E. coli (Luchi S., Weiner L., J. Biochem. (Tokyo) 120, str. 1055 až 1063, 1996). OmpR a OmpF řídí odezvu na různé osmotické podmínky (Pratt L.A., Hsing W., Gibson K.E., Šilhavý T.J. Mol Microbiol. 20, str. 911 až 7, 1996). CheA a CheZ se podílí na chemitaxi (Alon U., Nátuře 397, str. 168 až 171, 1999).

Všechny tyto proteiny byly napřed identifikovány genetickými prostředky: mutace v odpovídajících genech způsobuje zajímavé fenotypy a výsledný protein může být identifikován po klonování příslušných genů.

Podobně se v poslední době zjistilo, že eukaryoty S. cerevisiae a Arabidopsis thaliana mají signální transdukčnísysté3 • · ···· · · «· · · ·· · · · · · ··· • · ··· ······ · • · · · ·· ·· ·· ··· my s proteiny, které zahrnují fosforylaci histidinu

J. Cell Science 110, str. 1141 až 1145, 1997).

(Loomis a

Například protein Slnl má extracelulární senzorovou doménu, cytoplasmovou doménu histidinkinázy a doménu transdukce aspartátu. ETR1 hořčicové rostliny Arabidopsis thaliana byl také identifikován mutanty, které selhávají v odezvě na ethylen. Gen ETR1 se pak klonoval a studoval se protein, což vedlo k objevu, že tento protein je histidinkinázou. S. cerevisiae a Arabidopsis thaliana jsou geneticky sledovatelné organismy a jejich proteiny vedou k histidinové fosforylaci, jako jsou Slnl a Etrl, které se obvykle identifikují genetickými prostředky.

Stávající způsoby zahrnují obecně separaci podle velikostí buď proteinů nebo fosfoaminokyselin.

Savčí N-fosforylace je významná v metabolismu energie a mění se v různých typech rakoviny. Například protein Nm23 je nukleosidní difosfátkináza, která může využít ATP generovaného glykolýzou a oxidační fosforylaci k převedení nukleosiddifosfátu a deoxynukleosiddifosfátu na tri fosfáty. Nm23 se stává přechodně fosforylován na Histidin 118 jako součást pig-pongového reakčního mechanismu. Nm23 je také schopen převádět svou fosfátovou skupinu na histidinové zbytky v ATP-citrátové lyáze a succinylCoA synthetáze. Histidinová fosforylace má tudíž významnou úlohu v energetickém metabolismu v buňkách.

Lidé mají několik proteinů Nm23. V případě vysoce metastatických rakoviny jsou tyto proteiny Nm23 často expresovány při nízkých hladinách. Na základě těchto výsledků se považuje Nm23 za antionkogen. Kromě toho se u některých rakovin nacházejí mutace právě v proteinech Nm23. Tyto mutace ovlivňují často míru fosforylace a defosforylace Nm23.

Souhrnně naznačují tyto výsledky, že N-fosforylace má významnou úlohu v energetickém metabolismu a v rakovině. Proto proteiny nebo drogy, které modulují N-fosforylaci nebo defosforylaci by mohly být významné při léčení rakoviny nebo metabolických poruch, jako je obezita, anorexie, sešlost způsobená rakovinou, HIV nebo ostatní nemoci. Kromě toho, jelikož má N-fosforylace významnou úlohu v rozmanitých biologických jevech v jiných organismech, je možné, že N-fosforylace má úlohu v ostatních nemocech a poruchách savců, jako jsou například poruchy imunity, virová infekce, genetické poruchy, nemoci srdce.

Savci však rostou značně pomaleji než bakterie, S-cerevisiae a Arabidopsis thaliana, je proto obtížné ident i f ikovat proteiny účastňující se histidinové, fosforylace stejným genetickým přístupem lysinové a argininové jako u těchto jednodušších organismů. Kromě toho nejsou biochemické techniky k i dentifikaci proteinů, které jsou fosforylované na šeřinu, threoninu a tyrosinu obecně použitelné k identifikaci proteinů, které jsou fosforylováné na hystidinu, lysinu a argininu. Je tedy v oboru potřeba vyvinout způsoby a biochemická reakční činidla pro studium N-fosforylace.

Histidinfosfatázy a hístidinkinázy jsou enzymy působící protichůdně. Histidinkináza ovlivňuje fosforylaci určitých histidinových zbytků v proteinech, zatímco histidinfosfatázy tuto fosforylaci obracejí. Oba enzymy mají pravděpodobně významnou úlohu v transdukci signálů, v apoptóze, v řízení růstu buněk a v diferenciaci buněk. Jsou známa onemocnění založená na poruchách těchto buněčných funkcí. Vynález se tedy týká činidla, kterého může být použito ke zkoumání příčin pathofyziologických poruch a případně k jejich léčení.

Hormony nebo peptidy stimulují buněčné povrchové receptory na buňkách a vyvolávají buněčné účinky cestou signální transdukce. Reversibilní fosforylace specifických proteinových substrátů regulačními proteinovými kinázami a fosfatázami má pod5 statný význam v předávání intracelulárních signálů. Vázané na receptor, na membránu a intracelulární proteinové kinázy a fosfatázy regulují procesy buněčné proliferace, diferenciace buněk a imunitní systém. Spatná funkce těchto regulátorů nebo jejich aktivita je rozhodující pro velký počet pathofyziologických jevů. Proteinové kinázy a fosfatázy a signální transdukční cesty, kterých se účastní, představují proto potenciální cíle pro procesy objevování drog.

Transdukce signálů u savců zahrnuje reversibilní fosfory láci Ser/Thr/Tyr. Ačkoli je známo, že v savcích je přítomen hystidinfosfát (Crovello CS, Fúrie BC, Fúrie BCell 82: str. 279 až 286, 1995), nebylo dosud možno identifikovat ani odpovídající kinázy ani příslušné fosfatázy. Potíží je například skutečnost, že histidinfosfatáza je nestabilní vůči hydrolýze a její detekce při standardních analýzách fosfoaminoaminokyselíny je nemožná.

Funkce His kináz a His fosfatáz v bakteriích byla zkoumána velmi důkladně. Jejich zahrnutí v chemotaxi a adaptaci z nich činí slibné body ošetřování bakterálních chorob.

Podstata vynálezu

Polypeptid mající který má vysokou specifičnost pro fosfohistidin a molekulovou hmotnost 13 000 až 15 000, je podle vynálezu získatelný izolací ze tkáně savců stupněm alespoň jedné anexové chromatografie, jedné gelové

Vynález se týká histidinproteinfosfatázy, zejména histidinproteinfosfatázových polypeptidů a histidinproteinfosfatázových polynukleotidů, rekombinantních materiálů a způsobu jejich výroby. Takové polypeptidy a polynukleotidy jsou zajímavé v souvislosti se způsoby léčení některých chorob, včetně, ·· φφφφ ·· ·· φφ · • · · · φ · φ φφφφ • · φ · · · φ φ φ · • · φφφφ φφφ φφφ φ • ΦΦΦΦ· φφφφ ·· ·· ·· ·· φφ φφφ avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, rakoviny a metabolických poruch, kardiovaskulárních nemocí a chorob centrálního nervového systému, které jsou zde souhrnně označovány choroby podle vynálezu. Vynález se také týká způsobů. identifikace agonistů a antagonistů (například inhibitorů) používajících materiály podle vynálezu a léčebných stavů souvisejících s nerovnováhou N-fosforylace identifikovanými sloučeninami. Ještě dále se vynález týká diagnostických zkoušek k detekci chorob souvisejících s nesprávnou aktivitou nebo úrovní histidinproteinfosfatázy.

Vynález podobně zahrnuje odpovídající varianty a mutanty, produkované například náhodnou nebo řízenou substitucí, různým štěpením, vypouštěním nebo přísadou jednoho nebo několika nukleotidů nebo aminokyselin s biologickou aktivitou v podstatě zachovanou.

Úkolem vynálezu tedy je poskytnout polypeptid mající biologickou aktivitu histidinfosfatázy, který má vysokou specifičnost pro fosfohistidin a molekulovou hmotnost 13 OOO až 15 000, je podle vynálezu získatelný izolací ze tkáně savců alespoň supněm jedné anexové chromatografie, jedné gelové filtrace a jedné afin i tni chromatografie. Výhodná savčí tkáň pochází ze srdce, ledvin, jater, pankreasu, kosterního svalstva a varlat. Výhodnými savci jsou lidé, králíci a krysy.

Vynález blíže objasňují následující příklady praktického provedení a připojené obrázky.

Přehled obrázků na výkresech

Obr.l Schéma čištění použité k izolaci histidinfosfatázy

Obr.2 Identifikace anorganického fosfátu jako produktu reakce štěpení histidinfosfatázy. Destičky ukazují chromato7 ·· ···· «· ·· ·· ·· · · · · · ·«· • · · · · · · ♦ · • · · · · ······ · • · · · · · · · ·

Obr

Obr.

Obr

Obr.

graf i i v tenké vrstvě (PEI celulóza, 0,8 M LiCl): levý sloupec: zpracování aluminiummolybdátem, pravý sloupec zpracování autoradiografií: 1:[³²P]his-cheA,2: produkt reakce, 3: ATP 1-3: fosfát (NaHaPO-a)

Doba a protein závislé na defosforylaci substrátu cheA: levý sloupec: degradace po O, 20 a 40 minutách, pravý sloupec: uvolnění radiačně značeného fosfátu (levá osa y: %, pravá osa y: radiační aktivita) různých množství substrátu (osa x:ng proteinu)

Analýza frakce s aktivní histidinfisfatázou (SDS-PAGE): AF: aktivní frakce: 1,2= BSA ( lyg, 0,5 jag) , 3:AF:4,5:molekulové markéry.

Hmotová analýza histidinfosfatázy. Osa y: načtení, oxa χ: hmotnost (m/z).

Reversní fázová chromatografická separace histidinfosfatázy po enzamatické fragmentaci: eluční činidlo A= 0,1 % trif1uoroctové kyseliny ve vodě a eluční činidlo B: 20 % 0,1% trifluoroctové kyseliny ve vodě, 80 % acetonitrilu: UV stanovení při 214 nm.

7a (parciální) Nukleotidní sekvence králičí histidinproteinfosfatázy.

7b Translatovaná úplná aminokyselinová sekvence králičí hi st idinprote i nfosfatázy.

8a Rozdělení nádorové buněčné linie histidinproteinfosfatázy.

8b Tkáňové rozdělení histidinproteinfosfatázy ve tkáni nádoru .

• ♦ · · · 0 · · · · ·· · • · · · · · · · · · · ··· ··«· ··· • · 9 9 9 9 999 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 9 9 99 9

Obr.8c Tkáňové rozdělení histidinproteinfosfatázy v normální tkán i.

Příklady provedení vynálezu

Polypeptid podle vynálezu sestává nejméně z motivu sekvence aminokyselin (SEQ.č.3) DCECLGGGRISHOSOD. V jiném provedení vynálezu obsahuje polypeptid alespoň jeden motiv sekvence aminokyselin (SEQ.č. 4) dceclgggrishqsqdx¹kihvygysmx²ygx³aqh

X¹ = K nebo R, X³ = A nebo G a X³ = P nebo R.

V dalším provedení vynálezu obsahuje polypeptid alespoň jeden motiv sekvence aminokyselin (SEQ.č. 5)

YHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM.

Všechny tyto parciální sekvence jsou vysoce konzervovány uvnitř úplné enzymové sekvence aminokyselin a má se zato, že se podílejí na aktivním místě uvedeného enzymu nebo mají jiný biologický nebo farmaceutický význam pro savce.

Ve výhodném provedení vynálezu má polypeptid biologickou aktivitu histidinfosfatázy, která má vysokou specifičnost pro f osfohist idin a molekulovou hmotnost 13 000 až 15 000 a obsahuje následující sekvenci aminokyselin (SEQ.č.2):

(M) AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGD

MQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEKIKAKYPDYEVTWANDGY

Methioninový zbytek na N-zakončení sekvence není nezbytný. Uvedená sekvence je lidského původu.

Vynález se však týká také zvláštních homologových variant uvedených sekvencí. Úkolem vynálezu dále je poskytnout polypeptid mající biologickou aktivitu histidinfosfatázy, který má vysokou specifičnost pro fosfohistidin a molekulovou hmotnost ·· ····

000 až 15 000, sekvenci aminokyselin, z nichž má homologii 64 až 99 %, s výhodou 75 až 99 %, ve srovnání se skvencí shora uvedenou. Jak je uvedeno v dalším textu, týká se vynález mnoha dalších homologových polypeptidů, které všechny mají biologickou akt i v i tu hist i di nprote i nfosfatázy.

Dalším úkolem vynálezu je poskytnout sekvence DNA, které kódují polypeptid uvedený shora i níže. Obzvláště se vynález týká DNA majících následující nukleotidovou sekvenci (SEQ.č.l):

(ATG) GCGGTGGCGGACCTCGCTCTCATTCCTGATGTGGACATCGACTCCGACGGCGTCTTCAAG TATGTGCTGATCCGAGTCCACTCGGCTCCCCGCTCCGGGGCTCCGGCTGCAGAGAGCAAGGAGAT CGTGCGCGGCTACAAGTGGGCTGAGTACCATGCGGACATCTACGACAAAGTGTCGGGCGACATGC AGAAGCAAGGCTGCGACTGTGAGTGTCTGGGCGGCGGGCGCATCTCCCACCAGAGTCAGGACAAG AAGATTCACGTGTACGGCTATTCCATGGCCTATGGTCCTGCCCAGCACGCCATTTCAACTGAGAA AATCAAAGCCAAGTACCCCGACTACGAGGTCACCTGGGCTAACGACGGCTAC

Vynález se týká také protilátek, s výhodou monoklonálηích protilátek, které jsou zaměřeny na polypeptidy podle vynálezu.

Úkolem vynálezu je konečně farmaceutický prostředek obsahující shora a níže definované polypeptidy, případně s vhodnými excipienty, s nosiči a s jinými účinnými látkami.

(A) Izolace a čištění

Histidinproteinová fosfatáza se izoluje z králičích jater. Příprava jater začíná rozkrájením přibližně 110 g materiálu na malé kousky, které se smíchají s homogenizačním pufrem (220 ml 30 mM systému triethanolamin/chlorovodíková kyselina, hodnota pH 7,5, 1 mM ethylendiamitetraoctové kyseliny, 300 mM sacharózy, 0,1 mM benzamidinu, 0,1 % 2-sulfanylethanolu) a rozmělní se v homogenizátoru při chlazení ledem. Po prvním odstředění (10 minut při 3800 g, 4 °C), se supernatant odstředďuje (1 ho10 • φ * · · φ ο

dinu při 48000 g, 40. Tento supernatant se zfiltruje přes gázu a zmrazí se ve 20 ml podílech při teplotě -80 C.

Způsob separace sloupcovou chromatografií

Histidinfosfatáza se izoluje ve třech izolačních stupních (obr. 1).

1. Anexová chromatografie

Surový jaterní extrakt se znovu odstřeďuje (30 minut při 48 000 g) . Supernatant se vpraví na sloupec Source Q 30 (Pharmacia, Freiburg) vyvážený pufrem A (20 mlí triethanolamin/kyselina chlorovodíková, hodnota pH 8,0, lmM ethylendiamintetraoctové kyseliny, 0, 1 % 2-sulfanylethanolu, 0,02 % nitritu sodného). Elučním činidlem je 200 mM chlorid sodný v pufru A při průtočné rychlosti 1 ml/min.

2. Filtrace gelu

Aktivní frakce (viz determinaci aktivity) se míchá a chladí během přísady síranu amonného (11,2 g, 17 ml). Získaná peo léta odstředěním (20 minut, 48 000 g, 4 C) se resuspenduje v pufru A a vpraví se na sloupec Superdex 75 26/60 1,6 x 60 cm (Farmacia, Freiburg). Filtrace gelu probíhá s přísadou 50 mM chloridu sodného do pufru A při 1 ml/minutu.

3. Afinitní chromatografie

Aktivní frakce z filtrace gelu se zředí v poměru 1:3 pufrem B (20 mM triethanolamin/kysel ina chlorovodíková, hodnota pH 8,0, 0,1 mM ethylendiamintetraoctové kyseliny, 0,1 % 2-sulfanylethanolu, 0,02 % nitritu sodného) a nastaví se na 10 mM v chloridu hořečnatém. Vzorek se vnese na sloupec modré Sepharózy 6 25x510 mm (Pharmacia, Freiburg). Elučním činidlem je

ΦΦ

Φ Φ

Φ Φ ΦΦΦ

Φ Φ Φ Φ Φ

Φ Φ Φ Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ φφ φφφφ

ΦΦ

Φ Φ Φ • Φ Φ φφφ pufr Β obsahující 200 mM chloridu sodného při průtočné rychlosti 1 ml/min.

(B) Detekce specifické aktivity

Aktivita rozpustné histidinfosfatázy se stanoví z defosforylace histidinfosforylováného proteinu značeného 32p (CheA) jako substrátu. CheA rekombinantni bakteriální histidinautoki náza (Bilves AM, Alex LA, Crane BR, Simon MI Cell 96, str. 131 až 141, 1999); C-koncová kinázová doména fosforyluje N-zakončení His48. Volný fosfát je produktem reakce a identifikuje se chromatografií v tenké vrstvě (destičky polyethylenimi nové celulózy, 0,5 M chloridu lithného jako mobilní fáze). Detekce se provádí jednak pomocí molybdátu amonného, jednak autoradiografi i (obr. 2). Nedochází k přenosu fosfátu na jiné proteiny, ani se nevyskytuje jakékoli štěpení substrátu na peptidové fragmenty. Produktem je fosfát což znamená, že je obsažena fosfohist idinprote infosfatáza.

Izolovaný protein vykazuje histidinovou defosforylaci ³²P-fosforylované CheA, závislou na čase, teplotě, hodnotě pH a na proteinu (obr.3).

Stab i 1 i ta

Čištěný protein vykazuje stálost při uskladnění v surovém homogenizátu a v částečně čištěných frakcích.

Enzymová zkouška

Substrátová preparace (³²P značení CheA)

Rekombinantni CheA (5 yl) se smísí s 0,5 jul 100 mM fenylmethylsulfonylfluoridu v dimethylsulfoxidu a 5 μΐ 500 mM HEPES hodnota pH 8,0 a s 1 mM chloridu hořečnatého. Přidá se 108 pCurie ³²P-g adenosintri fosfátu, 5 μΐ 10 μΜ adenosintrifosfáo tu a 50 μΐ vody a inkubuje se 3 hodiny při teplotě 37 C

· »000 • · 0

Stanovení aktivity

Substrát (10 μΐ ³²P-CheA) se smísí s 10 nl žkušebního pufru (100 M triethanolamin/kyše 1 ina chlorovodíková, hodnota pH 8,0, % 2-sulfanylethanolu, 0,02 % nitritu sodného) a s roztokem enzymu. Reakce probíhá 30 minut při teplotě 37 °C. Přidají se pl 500 mM ethylendiamintetraoctové kyseliny a 126 μΐ směsi methanol/aceton 1=1. Po odstřeďování (5 minut při 15 800 g) se supernatant vyjme a měří se scintilačním čítačem.

Popsaná fosfatáza je tak oddělena od ostatních proteinfosfatáz na bázi

1) specifičnosti fosfohistidinu (tabulka I), histidinfosfatáza nehydrolyzuje například p-nitrofenylfosfát,

2) aktivita není inhibitována okadaovou kyselinou nebo vanadátem (tabulka II),

3) molekulová hmotnost je značně menší.

Tabulka I

Hydrolyza novou histidinproteinfosfatázou

Azocol1	-
[gama³²-P] ATP	-
p-ni trofenylfosfát	-
[gama³²-P] Ser/Thr-kase in	-
Tyr-xxx	-
[gama³²-P] His-nukleosidi fosfátkináza	-

[gama³²-P] His-che A • Φ φφφφ

Tabulka II ·· ΦΦ ·· • · · Φ · Φ Φ · • Φ · · Φ φ · » φ • · ΦΦΦΦ φφφ φ φ φ • ΦΦΦ ΦΦ Φ ΦΦ

ΦΦ ·· ·· ΦΦ ··

Reakční činidla ovlivňující histidinfosfatáaové aktivity
Reakční činidlo	Koncentrace	Akt i v i ta (%)
íosf át	10 mM	0
okadová kyselina	10 μΜ	108
mikrocyst in	5 nM	110
tautomyc i n	0, 5 nM	90
inhibitorprotein li	1 nM	120
molybdát	10 μΜ	71
vanadát	10 μΜ	62
f1uor i d	5 mM	105
EDTA	5 mM	108
EGTA	5 mM	91
Mg^{2 +}	1 mM	142
Mg^{2 +}	10 mM	226
Ca^{2 +}	1 mM	165
Ca^{2 +}	10 mM	240

100 % = χχχ nmol/min χ mg^-1

0000 • 00

0 0

00* • ·*· • 0 00

0000 • 0 0 0 00

0 0 0 00

0 000 000

0 0 00

0· 000* ( C) Charakterizace histidinprotei níosfatázy

Izolovaná proteinová frakce obsahuje definované pásmo se zdánlivou molekulovou hmotností 14 000 podle analýzy SDS gelovou elektroforézou (obr.4). Hmotová analysa udává molekulovou hmotnost proteinu 13 768 (obr.5). Histidinproteinfosfatáza je N-koncově blokovaná acetylovou skupinou. Sekvenční informace není proto dostupná Edmanovou degradací a k charakterizaci proteinu je nutné proteolytické štěpení.

(D) Analytické stanovení proteinu

Aktivní frakce (obr.4) se enzymaticky štěpí k určení aminokyselinové sekvence a výsledné peptidové fragmenty se sekvencují Edmanovou degradací a používá se hmotové spektrometrie o sobě známými způsoby popsanými v literatuře (Kellner R., Lottspeich F. Meyer HE Microcharacterization of Proteins, Willey-VCH, 1999).

Enzymatická fragmentace

Gelový pás se vyřízne skalpelem a vloží se do Eppendorfovy zkumavky. Enzymatická fragmentace probíhá po přidání trypsinu jako proteázy (1 ug trypsinu, 100 μΐ 0,5 M hydrogenuhličitanu amonného, 37 C, 12 hodin). Výsledné peptidové fragmenty se extrahují (50 % trif1uoroctové kyseliny, 50 % acetonitri 1u) . Extrakt se zkoncentruje ve vakuvé odstředivce.

Chromatografická seprace peptidových fragmentů

Peptidové fragmenty se rozpustí v elučním činidle A (0,1 % trif1uoroctové kyseliny ve vodě) a pro separaci se použije fázová reverzní chromatografie (eluční činidlo B= 20 % 0,1% trifluoroctové kyseliny ve vodě, 80 % acetonitrilu). Po frakcionaci, založené na UV stanovení při 214 nm (obr. 6), se separo15 - 99 9*9* *· ·9 99 * • · ♦ 9999 999· • · 9 ·«····· • · 9999 999 9999 ••99 99 9 999 ·· ·· ·· 9· 999 ·· váné peptidové fragmenty v rozpuštěné formě stanoví Edmanovým sekvencováním a hmotovou spektrometrií.

Edmanovo sekvencvání a hmotové spektrometrcké stanovení

Po chromatografické separaci se tekuté frakce 2 90 % použijí k Edmanovu sekvencování (standardní podmínky, zaařísení: model 494, PE-Applied Biosystems, Weiterstadt). Zbývající část frakce se použije pro hmotovou analýzu (MALDI-MS) (zařízení: Voyager STR, Perseptive Biosystems Wiesbaden).

Identifikované peptidové sekvence

Určí se následující peptidové sekvence (králičí) AAAGLAQIPD VDIDSDGVFK

YVLIR

VHAAPPSEAPGGESK

DIVR

WAEYHADIYDK

VSGELQK ISHQSQDR KIHVYGYSMGYGR YPDYEVTWADDGY Tyto peptidy vedou k enzymovému peptidu 2 králíků (SEQ.č.6) AAAGLAQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHAAPPSEAPGGESKDIVRGYKWAEYHADIYDKVSGELQK KGHDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIRAKYPDYEVTWADDGY (E) Sekvencování nukleotidů

Knihovna králičích DNA se skané sekvence aminokyselin pro otidovou sekvenci. Klonování a leotidovou sekvenci uvedenou na snímá primery vybranými ze zí hi st i di nprote i nf osfatázonukle sekvencování identifikuje nuk obr.7a.

4«		41··	v*		• 4
•	•	•	• >	• ·	• · ·
•	•	«	• «	• 4	• 4
♦	•	• 4	• ·	• 44 ·	• 4
•	•	• ·	• 4	•	4 ·
··		··	w·	Λ »	4 4 4

Provede se translace 327 bází pro sekvenci histidinproteinfosfatázoproteinovou sekvenci začínající v poloze 11 až 119 (obr. 7b) .

Analýza databáze

Hledání v databázi se provádí pomocí algorytmu BLAST. Homologové proteiny mohou být identifikovýny z C elegans, Drosofila melanogaster, Drosofila pseudoobscura v proteinových databáz í ch.

V nukleotidových databázích se EST se identifikuje v lidech, ve krysách a v myších. Lidský homolog nebyl dosud publikován. Podle těchto seznamů EST se zjistilo, že lidský histidinproteinfosfatázový protein má následující sekvenci (SEQ.č.2, bez methion inového zbytku) :

AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSC-APAAESKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGDMQK QGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQEAISTEKIKAKYPDYEVTWANDGY

Krysí homolog nebyl dosud publikován. Podle těchto seznamů EST se zjistilo, že krysí histidinproteinfosfatázový protein má následující sekvenci (SEQ.č.7):

nglnttrgkgssplgkdhqelelltpypavkfsvgptratraypeatlptsadiydkvsgelqkn

GYDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIKAKYPDYEVTWADDGY

Myší homolog nebyl dosud publikován. Podle těchto seznamů EST se zjistilo, že myší histidinproteinfosfatázový protein má následující sekvenci (SEQ.č.8):

MAADLGQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHLAEPSGDPAKECKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGELQR

NGYDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIKAKYPDYEVTWADDGY

17 -	··	····	99	• 9 99 <»
			•	•	♦	• 9 9 9	99
	•	•	•	•	•	• · · ·	9
	•	•	• *	•	•	• 9· · · 9	9
	• ·	• ·	•	•	• · ·	9
	··	··		9·	··	999

Tabulka III

Sekvenční homologie pro proteinhistidinproteázu z různých druhů udaná v % identity

	1	2	3	4	5	6	7
1	1 i dský 100	84, 0	65, 3	64, 3	68,2	38, 0	40, 3
2	králičí	100	72, 4	71,4	71,0	36, 0	42, 0
3	myší		100	67, 3	52, 7	32, 7	33, 3
4	krysí			100	51,6	30, 8	29, 5
5	zebra f i sh				100	33, 7	42, 1
6	C. elegns					100	39, 7
7	drosof i 1a						100

(E) Lokalizace proteinu a rozdělení tkání

Lidský histidinproteinfosfatázový gen je umístěn na chromosomu 9 (9q33)-Tel, markér sts-N90764, interval D9S159-qTEL). Použije se těchto zdrojů pro expresi cDNA: Mozek, prs, CNS, tlusté střevo, předkožka, vajíčko, srdce, ledvina, játra, plíce, svaly, pankreas, parathyroid, nahromaděná krev, prostata, slezina, varlata, štítná žláza, tonsily, děloha a celé embryo.

Z analysy rozdělení histidinproteinfosfatázy RNA je zvýšená hladina v normálních tkáních, jako je srdce, ledviny, játra, pankreas, kosterní svalstvo a varlata (obr. 9 a,b).

(F) Protilátky anti-histidinfosfatázy

Protilátky antihistidinfosfatázy byly vytvořeny proti třem rozdílným oblastem proteinu, jmenovitě n-zakončení, střední a koncové části zakončení molekuly. K tomu byly zuvoleny tři peptidové sekvence: peptid 1 - QIPDVDIDSD GVFKYV (16aa, SEQ.č.9) peptid 2 - CLGGGRISHQ SQDK (14aa, SEQ.č.10) peptid 3 - CTEKIKAKYP DYEV (14aa, SEQ.č.11)

Peptidy byly syntetizovány využitím standardní chemie FMOC. K imunizaci byly peptidy injektovány (4 injekce) dvěma králíkům a byly odebrány 4 vzorky krve. Konečný odběr krve byl po přibližně 3 měsících. Vytvořené protilátky jsou vhodné k detekci a lokalizaci histidinfosfatázy. Kromě toho mohou být individuálně analyzovány tři různé oblasti uvnitř molekuly. Obzvláště vysoce konzervovaná střední část histidinfosfatázy, obsahující následující sekvence aminokyselin: DCECLGGGRISHOSOD (seq.č.3) obsahuje podle předpokladu aktivní místo zodpovědné za funkci proteinů in vivo. Ant ipeptidová protilátka proti této oblasti je pro inhibiční a neutralizační použití.

Charakteristiky histidinproteinfosfatázy lze shrnout takto:

1. Sekvence aminokyselin lidské histidinproteinfosfatázy obsahuje přibližně 124 aminokyselin.

2. Sekvence aminokyselin histidinproteinfosfatázy je vysoce h omologická v C-zakončení, ale pouze slabá homologie je pro

N-zakončení.

3. Molekulová hmotnost je 13 800 + 100 (obr.5).

4. Histidinproteinfosfatáza je N-konec blokovaný acetylací.

Farmaceutické prostředky

Nativních i rekombinantních proteinů je možno používat jako léčiv, která se mohou pacientovi podávat přímo, nebo ve farmaceutických prostředcích. Vynález se tudíž týká rekombinantní ho nebo nativního zde definovaného proteinu použitelného jako léčivo a příslušných farmaceutických prostředků obsahují19

cích uvedený protein a farmaceuticky přijatelné ředidlo, nosič nebo excipient.

Přídavně mohou farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahovat další nejrůznější farmaceuticky účinné sloučeniny.

Pojmem farmaceuticky přijatelný nosič se zde rozumí inertní netoxické nebo tekuté plnidlo, ředidlo nebo zapouzdřovací materiál, neragující nepříznivě s účinnou sloučeninou nebo s pacientem. Vhodné, s výhodou kapalné nosiče jsou v oboru dobře známy, jako sterilní voda, solanka, vodná dextróza, cukerné roztoky, ethanol, glykol a oleje, včetně minerálního, živočišného, rostliného nebo syntetického původu, například podzemnicového, sojového a minerálního oleje.

Prostředky podle vynálezu se mohou podávat v jednotkových dávkách obsahujících běžné netoxické farmaceuticky přijatelné nosiče, ředidla, pomocná činidla a pojidla, které jsou typické pro parenterální podávání.

Pojem parenterální zahrnuje subkutánní, intravenoznί, intraartikulární a intratracheálηí injekční a infuzní techniku. Vhodné jsou též jiné způsoby podávání, jako orální a topické. Parenterální prostředky a kombinace jsou nejvýhodněji podávány intravenozně, buď v bolusové formě nebo jako konstantní fúze podle známých způsobů. Tablety a kapsle pro orální podávání obsahují konvenční excipienty, jako jsou pojivá, plnidla, ředidla, tabletovací činidla, mazadla, desintegrační činidla a smáčedla. Tablety mohou být povlečeny v oboru známým způsobem. Orální kapalné prostředky mohou být ve formě vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulzí, syrupů a vodiček, nebo mohou být podávány jako suchý produkt ke smísení s vodou nebo s jiným vhodným nosičem před použitím. Takové tekuté prostředky mohou obsahovat obvyklé přísady, jako suspenzační činidla, emulgátory, nevodné nosiče a konzervační činid20

la. Topické prostředky mohou být ve formě vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulsí, želé as výhodou emulžních mast í.

Jednotkové dávky podle vynálezu mohou obsahovat denní potřebné množství proteinu podle vynálezu, nebo jeho podíly k vytvoření požadované dávky. Optimální terapeuticky přijatelná dávka a rychlost pro daného pacienta (savce včetně lidí) závisí na mnoha činitelech, jako jsou účinnost specifické použité účinné látky materiálu, věk, tělesná hmotnost, celkový zdravotní stav, pohlaví, dieta, doba a cesta podávání, rychlost vylučování, aktivita enzymu (jednotek/mg proteinu), účel ošetřování, to znamená terapie nebo profylaxe a povaha léčené nemoci.

Proto v prostředcích a kombinacích pro léčeného pacienta (in vivo) je farmaceuticky účinná denní dávka proteinu podle vynálezu přibližně 0,01 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti (vztaženo ke specifické aktivitě 100 kU/mg), s výhodou 0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Podle formy podání může jedna samotná dávka obsahovat 0,5 až 10 mg histidinproteinfosfatázy.

Průmyslová využitelnost

Polypeptid pro výrobu diagnostika, farmaceutických prostředků pro léčení nemocí, pro výrobu agonistů a antagonistů při identifikaci faktorů, které fungují v histidinové fosforylaci, i agonistů a antagonistů, které jsou potenciálně užitečné při léčení.

Claims

1. Polypeptid mající biologickou aktivitu histidinfosfatázy, který má vysokou specifičnost pro fosfohistidin a molekulovou hmotnost 13 000 až 15 000, získatelný izolací ze tkáně savců stupněm alespoň jedné anexové chromatografie, jedné gelové filtrace a jedné afinitní chromatografie.

2. Polypeptid podle nároku 1 obsahující alespoň jeden motiv sekvence am i nokyse1 i n

DCECLGGGRISHQSQD

3. Polypeptid podle nároku 1 obsahující alespoň jeden motiv sekvence aminokyselin dceclgggrishqsqdx¹kihvygysmx²ygx³aqh kde X¹ = K nebo R, X² = A nebo G a X³ = P nebo R.

4. Polypeptid podle nároku 1 obsahující alespoň jeden motiv sekvence aminokyselin yhadiydkvsgdmqkqgcdceclgggrishqsqdkkihvygysm.

5. Polypeptid mající biologickou aktivitu histidin fosfatá- zy, která má vysokou specifičnost pro fosfohistidin a molekulovou hmotnost 13 000 až 15 000, obsahující následující sekvenci aminokyselin:

(M)AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYH ADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEK IKAKYPDYEVTWANDGY.

6. Polypeptid mající biologickou aktivitu histidin fosfatázy, která má vysokou specifičnost pro fosfohistidin a molekulovou hmotnost 13 000 až 15 000, jehož sekvence aminokyselin má homologii 64 až 99% ve srovnání se sekvencí podle nároku 3.

• · 9 9 ·· • 9 · · ··· ··

9 9 9 99

9 99 9 99 ·

7. Polypeptid podle nároku 6, obsahující následující sekvenci aminokyselin:

AAAGLAQIPDVDIDSDGVEKYVLIRVHAAPPSEAPGGESKDIVRGYKWAEYHADI

YDKVSGELQKKGHDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKÍRA KYPDYEVTWADDGY.

8. DMA kódující polypeptid podle nároku 1 až 7.

9. DNA podle nároku 8, obsahující následující nukleotidovou sekvenci ' (ATG)GCGGTGGCGGACCTCGCTCTCATTCCTGATGTGGACATCGACTCCGACGG

CGTCTTCAAGTATGŤGCTGATCCGAGTCCACTCGGCTCCCCGCTCCGGGGCTCCG

GCTGCAGAGAGCAAGGAGATCGTGCGCGGCTACAAGTGGGCTGAGTACCATGCGG

ACATCTACGACAAAGTGTCGGGCGACATGCAGAAGCAAGGCTGCGACTGTGAGTG

TCTGGGCGGCGGGCGCATCTCCCACCAGAGTCAGGACAAGAAGATTCACGTGTAC

GGCTATTCCATGGCCTATGGTCCTGCCCAGCACGCCATTTCAACTGAGAAAATCA

AAGCCAAGTACCCCGACTACGAGGTCACCTGGGCTAACGACGGCTAC

10. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m, že obsahuje polypeptid podle nároku 1 až 7 a popřípadě vhodný excipient, nosič a jiné akivní složky.

11 .

Protilátka zaměřená na polypeptid podle nároku 1 až 7.