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KR20090058404A - 융합 단백질을 사용하지 않는 인간 단백질 타이로신탈인산화 효소의 활성 도메인 대량 생산 방법 - Google Patents

융합 단백질을 사용하지 않는 인간 단백질 타이로신탈인산화 효소의 활성 도메인 대량 생산 방법 Download PDF

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KR20090058404A
KR20090058404A KR1020070125162A KR20070125162A KR20090058404A KR 20090058404 A KR20090058404 A KR 20090058404A KR 1020070125162 A KR1020070125162 A KR 1020070125162A KR 20070125162 A KR20070125162 A KR 20070125162A KR 20090058404 A KR20090058404 A KR 20090058404A
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Abstract

본 발명은 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP) 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 상기 PTP 활성 도메인을 예측하여 상기 도메인만을 융합 단백질을 사용하지 않고 활성 및 안정성을 지닌 형태로 발현할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 PTP는 신약개발을 위한 고효율 약물검색, 선택적 항체 제작을 위한 항원 단백질 및 PTP 구조 및 기능 연구를 위한 단백질로 이용될 수 있다.
단백질 타이로신 탈인산화 효소, 대량발현정제, 활성 도메인

Description

융합 단백질을 사용하지 않는 인간 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 활성 도메인 대량 생산 방법{Method for large scale preparation of the active domain of human protein tyrosine phosphatase without fusion protein}
본 발명은 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP) 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 PTP 활성 도메인을 예측하여 상기 도메인만을 융합 단백질을 사용하지 않고 활성 및 안정성을 지닌 형태로 발현할 수 있는 방법에 관한 것이다.
단백질 타이로신의 인산화-탈인산화 과정은 세포내 신호전달 체계에서 매우 중요한 수단으로 이용된다. 특히 세포 외부의 자극에 의한 세포의 반응, 세포의 성장, 분화 및 사멸에 단백질 타이로신의 인산화-탈인산화가 핵심적인 역할을 하고 있기 때문에, 상기와 같은 세포상태의 변화를 수반하는 암, 혈관질환, 면역질환 및 신경질환 등의 질환의 치료 표적 단백질로 단백질 타이로신 인산화 효소(protein tyrosine kinase; 이하, PTK; Curr Pharm Des 13:2751-65, 2007; Curr Med Chem 14:2214-34, 2007) 및 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP) 가 중요한 위치를 차지한다(Curr Cancer Drug Targets 6:519-32, 2006; Med Res Rev 27:553-73, 2007). 그 대표적인 예로 만성골수암의 치료제 신약으로 최근 각광을 받고 있는 글리벡은 PTK의 하나인 abl-PTK의 저해제이다(Curr Opin Drug Discov Devel 7:639-48, 2004). PTK에 비하여 PTP는 아직 많은 연구가 진행되어 있지는 않았으나, 이미 몇 가지 PTP는 암 및 당뇨병의 치료제 표적으로 활발한 연구가 진행되고 있고 앞으로 많은 PTP들이 질병 표적 단백질로 사용될 것으로 예측되고 있다(Curr Cancer Drug Targets 6:519-532, 2006; Med Res Rev 27:553-73, 2007).
세포내 신호전달 체계의 파괴는 쉽게 질병으로 이어지기 때문에 실제로 많은 PTP들이 질병과 관계되어 있다는 것이 알려져 왔고 몇몇 PTP들은 신약 개발의 표적이 되어 왔다. 인간에게는 약 100여 종의 PTP가 존재하며(Cell 117:699-711, 2004), 이들 중 20여 종은 질병과의 관련이 밝혀져 신약개발 표적으로 사용되고 있다. 나머지 80여 종도 질병과 관련이 있을 것으로 생각되고 있다. 그러나 효과적인 신약을 개발하려면 표적으로 하는 PTP의 활성만 저해하고 다른 PTP에는 영향을 주지 않아야 하는데 PTP는 활성부위 구조가 비슷해서 하나의 PTP의 활성을 저해하는 화합물이 다른 PTP의 활성도 저해하는 경우가 많다. 이런 경우에는 세포의 신호전달 네트워크를 무작위적으로 교란할 가능성이 있어서 약물의 부작용이 나타나게 된다. 특히 아직 세포기능이 잘 알려져 있지 않은 PTP의 경우 그 위험성이 더욱 크다.
따라서 PTP 단백질의 저해제 개발에는 가능한 한 모든 PTP 단백질의 활성을 한꺼번에 조사해서 특정 PTP에만 선택적으로 작용하는 화합물을 발굴하는 것이 중요한데, 이는 각 PTP의 활성형 단백질을 확보해야만 가능한 일이다. 또한 이러한 활성형 단백질은 PTP의 질병관련 세포기능을 연구하거나 질병진단을 위하여 필요한 항체의 개발에 필요하다. 특히 상기 목적으로 PTP를 사용할 때 안정한 상태로 활성도를 장기간 유지할 수 있도록 하는 것이 필요하며 효과적인 항체의 제작을 위해서는 MBP 및 GST 같은 융합 단백질이 붙어 있지 않은 것이 유리하다.
그러나 아직까지 PTP 단백질군 100여 개 단백질에 대해서 대량발현을 성공시킨 예는 보고된 바가 없으며 본 발명자 그룹에서 MBP 융합을 이용하여 77개의 단백질을 대장균에게서 발현시킨 것이 유일하다(대한민국 등록특허 746993). MBP 융합 단백질의 경우 MBP를 제거하고 나면 단백질의 안정성이 저하되는 경우가 많아 저해제 개발을 위한 활성도 측정이나 선택적 항체 제작에 사용하기 용이치 않은 경우가 많았다.
이에 본 발명자들은 융합 단백질을 사용하지 않고 PTP 활성 도메인 단백질을 안정하게 발현하기 위하여, 컴퓨터를 이용한 단백질 구조 예측 기법으로 PTP 활성 도메인의 N-말단 및 C-말단을 정확히 예측하여 상기 부위를 클로닝 및 발현하여 60개의 PTP 활성 도메인을 융합 단백질 없이 안정하게 발현되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 현재까지 다른 그룹에서 산발적으로 활성 도메인을 발현하고 구조 및 기능 연구를 수행한 경우가 있으나 그 수가 약 20여 개에 그치고 있고 활성도 및 안정성의 측정이 제대로 보고되지 않았다. 본 발명에 의해 제조된 PTP 활성 도메인 단백질들은 높은 활성을 가지면서도 수십만 개의 화합물을 이용한 HTS(high throughput screening) 시스템에서도 안정된 활성을 유지할 수 있도록 발현되고 정제되었다.
본 발명의 목적은 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP)를 대량생산하는 데에 있어서 PTP 활성 도메인을 예측하여 상기 도메인만을 융합 단백질을 사용하지 않고 활성 및 안정성을 지닌 형태로 발현할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP)를 서브그룹별 상동성 조사를 수행하여 유사도가 가장 높은 부분을 선정하는 단계;
2) 단계 1)의 선정된 부분이 각 서브그룹별로 이미 2차 및 3차 구조가 규명된 표준 단백질의 활성 도메인에 해당되는지 확인하는 단계;
3) 단계 1)의 선정된 부분에 대한 2차 구조를 분석하여 2차 구조상 헬릭스 또는 시트를 가지지 않는 위치를 활성 도메인의 경계로 나누는 단계;
4) 단계 3)의 결정된 활성 도메인의 아미노산 분석을 통해 활성 도메인의 N-말단 및 C-말단이 가용성질일 수 있도록 N-말단 및 C-말단의 경계를 결정하는 단계;
5) 단계 4)의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레 오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
6) 단계 5)의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
7) 단계 6)의 형질전환체를 배양하여 재조합 활성 도메인의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 PTP 활성 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 PTP 활성 도메인을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 포함하는 PTP 저해제 또는 촉진제 검색용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 이용하여 제조한 상기 재조합 PTP 활성 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 상기 재조합 PTP 활성 도메인에 PTP 특이적 기질 및 후보 물질을 처리하고 흡광도 변화를 측정하는 단계; 및
2) 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 재조합 PTP 활성 도메인의 활성을 감소시키거나 증진시킨 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 PTP 활성 저해제 또는 촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 시료에 본 발명의 항체를 첨가하여 PTP와 결합시키는 단계; 및,
2) 단계 1)의 항체와 결합한 PTP의 양을 측정하는 단계를 포함하는 PTP 발현량 측정 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
"PTP 활성 도메인"은 PTP 단백질의 전장이 아닌 본 발명의 방법에 의해 결정된 기능성 단편을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP)를 서브그룹별 상동성 조사를 수행하여 유사도가 가장 높은 부분을 선정하는 단계;
2) 단계 1)의 선정된 부분이 각 서브그룹별로 이미 2차 및 3차 구조가 규명된 표준 단백질의 활성 도메인에 해당되는지 확인하는 단계;
3) 단계 1)의 선정된 부분에 대한 2차 구조를 분석하여 2차 구조상 헬릭스 또는 시트를 가지지 않는 위치를 활성 도메인의 경계로 나누는 단계;
4) 단계 3)의 결정된 활성 도메인의 아미노산 분석을 통해 활성 도메인의 N- 말단 및 C-말단이 가용성질일 수 있도록 N-말단 및 C-말단의 경계를 결정하는 단계;
5) 단계 4)의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
6) 단계 5)의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
7) 단계 6)의 형질전환체를 배양하여 재조합 활성 도메인의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 PTP 활성 도메인의 제조방법을 제공한다.
대표적인 PTP 활성 도메인(PTP1B)의 삼차구조를 도 1의 리본그림으로 나타내었다. PTP는 몇 개의 알파-헬릭스가 가운데의 베타-시트를 둘러싸고 있는 구조로 되어 있으며 100여 개의 PTP가 비슷한 구조로 되어 있을 것이다. 본 발명에서는 안정한 형태의 PTP를 생산하기 위하여 구조가 알려진 PTP를 바탕으로 구조가 안 알려진 PTP의 아미노산 잔기를 비교하여 안정한 형태의 활성화 도메인이 아미노산 서열상 어디에 해당하는지 예측하여 발현하는 방법을 사용하였다(도 3 및 도 4 참조).
단계 1)의 상동성 조사는 ClustalX, KALIGN(At Karolinska Institute or at EB), MAFFT(At Kyushu University, EBI or at MyHits) 및 Muscle(At Berkeley or at BioAssist) 등의 프로그램으로 수행될 수 있다. 또한, 단계 1)의 서브그룹은 리셉터(receptor), 비-리셉터(non-receptor), MKP(Mitogen-Activated protein Kinase phosphatase), DUSP(Dual-specificity phosphatases) 및 CDC14(Cell division cycle 14) 상동체(homologue)의 5 종류로 구성된다. 이들 5개 그룹은 아미노산 서열 및 활성도메인의 구조가 비교적 유사한 PTP들로 구성되어 있어서, 각 그룹에서 이미 구조가 규명된 PTP의 삼차구조를 활용하여 같은 그룹의 다른 PTP들의 이차구조 및 삼차구조를 예측할 수 있었다. 각 그룹에서 사용한 기존에 알려진 삼차구조 및 PDB(Protein Data Bank) 접근 코드(accession code)는 다음과 같다: 리셉터(receptor): RPTPα(1YFO) 및 LAR(1LAR); 비-리셉터(non-receptor): PTP1B(2HNQ) 및 TCPTP(1L8K); MKP: PYST1(1MKP); DUSP: VHR(1VHR); CDC14: CDC14B(1FPZ).
또한, 단계 3)의 2차 구조 분석은 GOR IV SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(), PHDsec (http://www.predictprotein.org/), Jpred() 등의 프로그램으로 수행될 수 있다.
또한, 단계 4)의 N-말단과 C-말단 경계는 PTP 활성 도메인의 N-말단과 C-말단의 2 내지 3개의 아미노산이 가용성질의 아미노산으로 이루어지고, 단백질의 접힘이 일어나는 시작과 끝이 구조적으로 표면에 노출되며, 또한 이차구조상 헬릭스(helix)나 시트(Sheet)구조를 가지지 않도록 수행되는 것이 바람직하다. 상기 가용성질의 아미노산은 작은 아미노산 또는 전하를 가진 아미노산이고, 상기 작은 아미노산에는 세린 또는 글리신이 포함되고, 전하를 가진 아미노산에는 라이신, 아르기닌, 글루타민, 아스파라긴, 글루탐산 및 아스파르트산 등이 포함된다.
N-말단과 C-말단이 가용성질일 경우 상기 말단이 수용성 외부에 노출되기 쉬우며 수용액에서 안정하게 발현될 수 있고, 주로 단백질의 접힘에 중요한 역할을 하는 헬릭스나 시트 구조가 도메인의 말단에 위치하면 단백질의 접힘이 제대로 일어나지 않고 안정한 상태로 수용액상에 있기가 어렵기 때문이다.
이에 본 발명자들은 ExPASy 서버(Swiss Institute of Bioinformatics)의 ProtScale(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)를 이용하여 아미노산의 소수성질 및 이차구조의 구성을 분석하였다(도 5 참조).
상기 활성 도메인 경계를 결정은 수득한 재조합 PTP 활성 도메인의 활성 및 안정성을 확인한 후(도 6 및 도 7 참조), 그 활성 및 안정성이 낮을 경우 프로테아제 처리에 의해 PTP 활성 도메인의 경계가 재설계되는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 트립신 또는 키모트립신을 이용하여 활성 및 안정성을 유지하는 PTP 활성 도메인을 재설계할 수 있었다. 예측된 경계가 한번에 안정된 형태의 도메인으로 발현되는 것은 드물고 N-말단 및 C-말단 부위를 변경한 여러 도메인을 발현하는 시도 후에 최적의 도메인을 찾을 수 있었다. 도 8에서는 최종적으로 안정한 형태의 활성형 도메인의 발현에 사용된 경계를 표시하였다. 이에 PTP 활성 도메인 경계 내부의 서열번호 113 내지 168의 아미노산 서열을 수득하였다.
단계 3)의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 도 2에 나타난 바와 같다. 상기 PTP 발현 시 융합 단백질, 분리정제용 태그 또는 절단효소 인식부위와의 인위적 연결을 포함하지 않도록 하기 위해서 PTP 활성 도메인만 발현되었다. 단계 1) 및 단계 2)의 단백질 구조 예측을 통해 PTP 단백질의 구조적 접힘이 안정하게 일어날 수 있는 부위를 결정 하여 발현함으로써 구조적 접힘이 되는 도메인 아미노산 이외의 인위적 연결부위 등이 없어도 단백질이 수용성으로 안정하게 발현될 수 있었다(도 9 참조).
단계 5)의 재조합 PTP 활성 도메인을 수득하는 단계는 산화환원 조건을 유지하는 상태에서 수행되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 DTT 또는 베타-머캅토에탄올을 5 내지 20 mM을 사용하여 상기 산화환원 조건을 유지할 수 있었다. 상기 방법으로 수득한 재조합 PTP 활성 도메인 약 30개의 안정화된 PTP 활성형 도메인을 발현하여 정제한 후 단백질의 순도를 SDS-PAGE에 의해서 확인하였고(도 9 참조), 그 활성 및 안정성이 유지되는 것으로 확인되었다(도 7 참조).
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 PTP 활성 도메인을 제공한다.
본 발명의 PTP 활성 도메인은 높은 활성 및 안정성을 지니고 있어서(도 7 참조), 수십만 개의 화합물을 이용한 HTS 시스템에서도 안정한 활성을 나타내면서 다양한 세포기능 연구 및 질병 진단에 사용가능할 수 있다. 상기 재조합 PTP 활성 도메인은 서열번호 113 내지 168 및 서열번호 169 내지 177의 아미노산 서열로 기재되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
뼈대 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드가 연결되어 포함되며, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 뼈대 벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 113 내지 168 및 서열번호 169 내지 177의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 폴리펩티드를 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 내부에 포함되지 않은 제한 효소 부위를 다중 클로닝 부위에 많이 포함하는 벡터가 바람직하다. pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a, pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용할 수 있고, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pET28a 벡터에 서열번호 113 내지 168의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 폴리펩티드를 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 연결함으로써(도 2 참조), 서열번호 113 내지 168의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 아미노산을 발현하는 pET28a-PTP1 내지 pET28a-PTP56의 발현벡터를 제작하였다.
또한, 본 발명의 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 형질전환체는 다양한 세포기능 연구 및 질병 진단에 사용가능한 PTP 활성 도메인의 대량 생산을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 포함하는 PTP 저해제 또는 촉진제 검색용 키트를 제공한다.
상기 재조합 PTP 활성 도메인은 고체 담체에 고정된 형태로 포함될 수 있다. 상기 키트는 상기 PTP 활성 도메인의 활성 측정용 기질, 반응 완충용액 및 반응 종결 시약 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 기질은 DiFMUP(6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate)이 사용되었다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 이용하여 제조한 상기 재조합 PTP 활성 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공한다.
상기 항체는 단일 항체 또는 다클론성 항체일 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 이미 알려져 있는 항체 제조방법을 통해 본 발명의 재조합 PTP 활성 도메인을 항원으로 이용하여 용이하게 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 상기 재조합 PTP 활성 도메인에 PTP 특이적 기질 및 후보 물질을 처리하고 흡광도 변화를 측정하는 단계; 및
2) 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 재조합 PTP 활성 도메인의 활성을 감소시키거나 증진시킨 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 PTP 활성 저해제 또는 촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 시료에 본 발명의 항체를 첨가하여 PTP와 결합시키는 단계; 및,
2) 단계 1)의 항체와 결합한 PTP의 양을 측정하는 단계를 포함하는 PTP 발현량 측정 방법을 제공한다.
단계 1)의 시료는 혈액, 조직 및 분비물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 또한, 단계 2)의 측정 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 PTP는 신약개발을 위한 고효율 약물검색, 선택적 항체 제작을 위한 항원 단백질 및 PTP 구조 및 기능 연구를 위한 단백질로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> PTP 활성 도메인의 N-말단 및 C-말단 경계 결정
<1-1> PTP 아미노산 서열의 비교 및 구조 예측
PTP의 활성 도메인을 크게 리셉터(receptor), 비-리셉터(non-receptor), MKP(Map kinase phosphatase), DUSP(Dual-specificity phosphatases) 및 CDC14(Cell division cycle 14) 상동체(homologue)와 같이 5종류의 그룹으로 나누어 아미노산 서열을 서로 비교분석 하였다. 상기 5종류의 그룹은 아미노산 서열의 유사성에 의해 비슷한 구조가 예측되어 일반적으로 PTP의 서브그룹(subgroup)을 나누는데 사용되고 있다(Alonso et al ., Cell 117:699-711, 2004). 각 그룹은 이미 알려진 삼차구조[리셉터: RPTPα(1YFO); 비-리셉터: PTP1B(2HNQ) 및 TCPTP(1L8K); MKP: PYST1(1MKP); DUSP: VHR(1VHR); CDC14: CDC14B(1FPZ)]를 기반으로 하여 Clustal X 프로그램을 이용하여 아미노산 서열을 서로 정렬하였다(도 3). 구체적으로 11종의 MKP를 Clustal X 프로그램으로 분석하여 가장 유사성이 있는 부분(빨간색 화살표)을 선택하였고 삼차구조가 알려져 있는 MKP3(pk9)의 이차구조 및 삼차구조를 이용하여 활성도메인을 결정하였다.
또한 동시에 GOR IV SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(http://pbil.ibcp.fr/)를 이용하여 이차구조를 예측하였으며, 도 4는 여러 PTP 중 MKP3(pk9) 전장 단백질의 이차구조예측결과를 나타내었다. 파란색 막대는 알파 헬릭스, 빨간색 막대는 베타 시트 그리고 보라색 막대는 루프 또는 유동성 있는(flexible) 영역, 파란색 화살표는 실제 3차 구조의 경계를 표시한 것이다. 상기 결과를 통해 PTP 의 활성도메인의 대략적인 경계를 알 수 있었다.
<1-3> PTP 활성 도메인의 N-말단 및 C-말단 경계 결정
수용액에서 안정하게 발현이 되기 위해서는 단백질의 N-말단 및 C-말단이 수 용성 아미노산으로 이루어져 있는 것이 유리하기 때문에 ExPASy 서버(Swiss Institute of Bioinformatics)의 ProtScale(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)를 이용하여 아미노산의 소수성질 및 이차구조의 구성을 분석하였다(도 5). 예를 들어 MKP3(pk9)의 아미노산서열의 친수성/소수성 부분을 ExPASy 서버로 예측해본 결과(도 5)를 토대로 친수성질(빨간색화살표)의 경계면을 도메인으로 선택하였다. 상기 방법으로 선택된 도메인은 N-말단 및 C-말단이 헬릭스(helix)나 시트(Sheet)구조의 이차구조를 갖고 있을 확률이 작으며 따라서 구조적 접힘(folding)이 되어 있는 부분을 피할 수 있다. 구조적 접힘이 있는 부분을 발현의 말단으로 선택할 경우 발현된 단백질이 제대로 구조적 접힘이 일어나지 않고 수용액에서 안정한 상태를 가지지 못하기 때문이다. 단백질의 접힘이 일어나는 시작과 끝은 구조적으로 표면에 노출되어야 유리하며, N-말단과 C-말단의 시작과 끝은 적어도 2 내지 3 아미노산이 반드시 표면에 노출되기 위해서 가용성질을 지닌 아미노산이 유리하며, 또한 이차구조상 헬릭스(helix)나 시트(Sheet)구조를 가지지 않도록 수행되는 것이 바람직하다. 이에, 본 발명자들은 가용성질을 가진 2 내지 3개의 아미노산을 가지고 이차구조상 헬릭스(helix)나 시트(Sheet)구조를 가지지 않는 부분을 N-말단 및 C-말단으로 선정하였다. 그 이유는 헬릭스나 시트 구조는 주로 단백질의 접힘에 중요한 역할을 하고 그런 부위에 도메인의 말단이 오게 되면 단백질의 접힘이 제대로 일어나지 않고 안정한 상태로 수용액상에 있기가 어렵기 때문이다. 또한 N-말단이나 C-말단의 끝 부분은 세린 또는 글리신과 같은 작은 아미노산, 전하를 가진 아미노산 및 가용성 질의 아미노산이 안정한 도메인 형성에 N-말단이나 C-말단의 아미노산이 영향을 덜 주게 된다.
그 결과, 용해도 향상을 위해 경계가 재조정된 아미노산 서열 1 내지 52개를 수득하였다.
<1-4> 용해도 및 안정성을 향상시키기 위한 도메인 경계 재설계
<1-4-1> 용해도 및 안정성 확인
실시예 1의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인을 일정 시간 보관 후, 일정량 단백질용액과 동일양의 단백질용액을 초고속 원심분리 후, 상등액과 침전물로 분리하여 실시예 3과 동일한 SDS-PAGE 방법으로 침전물에 해당 단백질이 포함되는지 여부를 확인함으로서 용해도를 측정하였다.
<1-4-2> 안정한 활성 도메인 경계
실시예 1-4-1의 결과를 바탕으로 용해도 및 안정성이 낮은 PTP 활성 도메인을 트립신(Sigma, USA) 또는 키모트립신(Sigma, USA)의 프로테아제로 한번 반응에 1 ㎎/㎖ 농도의 PTP활성도메인 20 ㎍을 각각 1:1에서 1:1,000까지 반응 비율로 변화시키면서 37℃에서 30분 반응 후, 실시예 3과 동일한 SDS-PAGE 방법을 통하여 절단 정도를 확인하였다.
그 결과, T38의 경우 프로테아제 처리 후 프로테아제 농도가 증가하더라도 안정하게 유지되는 도메인을 찾을 수 있었다(도 8).
<1-4-3> 도메인 경계의 재설계
실시예 1-4-2의 방법으로 수득한 안정한 PTP 활성 도메인을 N-말단 시퀀싱과 질량분석 스펙트럼을 이용하여 재설계하고 제작하였다.
실시예 1-4-2의 방법으로 수득한 프로테아제에 의해 절단된 단백질의 밴드를 PVDF 멤브레인에 옮긴 후, 그 밴드를 절단하여 N-말단을 인식하여 자르는 시약처리 후 순차적으로 HPLC를 통해 아미노산의 순서를 정하였으며, 절단밴드를 빼내어 질량분석 스펙트럼을 이용하여 정확한 질량을 계산하여 안정한 도메인을 결정하였다. 아울러, 상기 방법으로 재설계된 도메인들을 실시예 4의 방법으로 다시 활성 및 안정성을 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 재설계된 도메인 pk7(MKP2)을 확인할 수 있었다. 구체적으로 도 9a에서 전장 pk7의 용해도 및 안정성이 낮은 반면, 도 9b에서 재설계된 pk7은 용해도 및 안정성이 높은 것을 확인하였다. 즉, 용해도가 좋지 않았던 최초 발현 시도에서부터 최종적으로 발현양 및 안정성이 좋은 PTP 활성도메인을 발현할 수 있었다. 상기 방법으로 재설계된 안정한 도메인을 표 1에 나타내었다.
재설계된 안정한 도메인
PTP 명 안정성저하 도메인 안정한도메인 서열번호
p18 299-457 306-450 158
pk14 1-210 27-210 145
pk17 35-211 35-211 155
pk32 1-360 63-360 130
T20 840-1400 890-1180 125
T23 1042-1305 1024-1335 117
T38 636-979 709-979 120
Eya2 339-514 244-514 168
pK7 1-394 174-338 136
< 실시예 2> PTP 활성 도메인의 대량발현 및 정제
<2-1> PTP 활성 도메인의 클로닝
실시예 1에 의해 PTP 활성 도메인 1 내지 56개를 융합 단백질의 도움 없이 발현할 수 있는 벡터를 제조하였다.
pET28a 벡터(Novagen, USA)의 다중 클로닝 부위는 PTP 활성 도메인(서열번호 113 내지 168)의 DNA 염기서열 내에 포함되지 않은 제한효소부위를 가장 많이 포함하고 있기에 본 발명의 뼈대 벡터로 사용하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 113 내지 168로 기재된 PTP 활성 도메인 1 내지 56의 DNA 염기서열을 증폭하기 위하여, 서열번호 1 내지 112로 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 Clontech사에서 구입한 뇌(brain), 근육(muscle), 정도(testis)등의 cDNA라이브러리를 주형 DNA로 하여 95℃ 5분, 95℃ 1분, 55-60℃ 1분, 72℃ 1분 30초, 30회 반복, 72℃ 10분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소NdeI, EcoRI 또는 BamHI으로 각각 처리하여 pET28a 벡터(Novagen, USA)의 제한효소 NdeI, EcoRI 또는 BamHI자리에 삽입하였고 이를 pET28a-PTP 1 내지 56이라고 명명하였다(도 2).
PTP 활성 도메인 1 내지 56의 염기서열 및 프라이머 쌍
번호 이름 아미노산 위치 (서열번호) 정방향 프라이머 서열번호
DNA 위치 역방향 프라이머
1 T4 225-793(113) CGCGACGCTAGCATGGCAGACGACAATAAGCTCTTC 1
673-2379 GCTGCGAAGCTTTACTTGAAGTTGGCATAATCTGA 2
2 T7 1684-1967(114) GGCACCCATATGCTAGTGGCTGTTGTTGCCTTATTG 3
5050-5901 GCGGGATCCTCAATGCCTTGAATAGACTGGATC 4
3 T48 1316-1897(115) GCCCCACATATGCGAGACCACCCACCCATCCCC 5
3946-5691 GGAAGATCTCTACGTTGCATAGTGGTCAAAGCTGCC 6
4 T8 821-1089(116) GCGCCATATGGCAGACAAGTACCAGCAACTCTCCCTG 7
2461-3267 GCGCGGATCCCTCGGCTGGGGCCTGGGCTGACTGTTG 8
5 T23 1024-1335(117) CCGTTACATATGGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTC 9
3070-4005 CCCGAATTCTTAGGCGATGTAACCATTGGTCTTTC 10
6 T39 879-1440(118) CACATTGCTAGCATGAAGACATCAGACAGCTATGGG 11
2635-4320 CGGCTCAAGCTTCTAAGATGATTCCAGGTACTCCAA 12
7 T5 848-1452(119) GCCCACCATATGGCCAGCGATACCAGCAGCCTG 13
2542-4356 GCGAGATCTTCAGCCAGAATTCAAGTATTCCAG 14
8 T38 709-979(120) GACCGGCATATGCTTGCCAAGGAGTGGCAGGCCCTC 15
2125-2935 CCGGGATCCTCACTGGGGCAGGGCCTTGAGGAT 16
9 T12 674-1015(121) CGCCAGCATATGGCCACGCGGCCACCAGACCGA 17
2020-3045 GCGGGATCCTCACTGGGGAAGGGCCTTGAGGAT 18
10 T15 851-1216(122) GAGCATGCTAGCATGGCTAGGGAGTGTGGAGCTGGT 19
2551-3648 GCGGGATCCCTAGGACTTGCTAACATTCTCGTATAT 20
11 T10 327-650(123) CCTTTCCATATGAAGCCCATAGGACTTCAAGAGAGAAG 21
979-1950 GACAGTAAGCTTTCAAAGTCTGCTCTCATACAGGCACA 22
12 T22 1367-1650(124) CGCGAACATATGCTTAGCCACCCGCCAATTCCC 23
4099-4950 GGCGGATCCTCAGCCCACGGCCTCCAGCAGGGCCTC 24
13 T20 890-1180(125) TTCGCTAGCGCCATCCGGGTGGCTGACTTG 25
2668-3540 GCGGGATCCCTAAAAGGAGCTTAAATATTCCAGTGCCA 26
14 PTP1B 1-299(126) ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATC 27
1-897 GTCAACATGTGCGTGGCTACGGTCCTCACG 28
15 T25 1-387(127) GCTCCCGCTAGCATGCCCACCATCGAGCGGGAG 29
1-1161 CGCGGATCCTTAGGTGTCTGTCAATCTTGGCCT 30
16 T41 157-537(128) TCAGAGCATATGGAGGAGAAGATCGAGGATGAC 31
469-1611 GTGGACGCTAGCATGAAATATTTGGGCAGTCCCATT 32
17 T18 1-595(129) GCCCCCCATATGGTGAGGTGGTTTCACCGAGAC 33
1-1785 CCGGAATTCTCACTTCCTCTTGAGGGAACCCTTG 34
18 pk32 63-360(130) GAACCCCATATGTCTGTGAACACACCCCGGGAGGTC 35
187-1080 CGGGATCCTCAGGGGCTGGGTTCCTCAGGCAG 36
19 pk28 1-526(131) CCGCGGCATATGGAACATCACGGGCAATTAAAA 37
1-1578 CGGGATCCTCACCTGCAGTGCACCACGACCGG 38
20 T32 2095-2490(132) GCAGTACATATGAATGGGAAGTTATCAGAAGAG 39
6283-7468 GGCGGATCCTCACTTCAGAAGCTGAGGCTGCTGTTTTT 40
번호 이름 아미노산 위치 (서열번호) 정방향 프라이머 서열번호
DNA 위치 역방향 프라이머
21 T40 866-1187(133) GAGCAGCATATGGCAGGCCTGGAGGCACAGAAG 41
2596-3561 CGCGGATCCTTAAATGAGTCTGGAGTTTTGGAG 42
22 T2 839-1174(134) CTAGGGCATATGAAAAAGACTCGAGTAGATGCA 43
2515-3522 CGCGGATCCTTAGATGAGCCTGGAGCTTTTCAG 44
23 pk4 173-323(135) AGGCCGCATATGGTCATGGAAGTGGGCACCCTG 45
517-969 GGCGGATCCTCAGCTCCCAGCCTCTGCCGAACAG 46
24 pk7 174-338(136) GTTCATATGAGTGCCACAGAGCCCTTGGAC 47
520-1012 GCGGGATCCTCAGGACGTGGCCAGCACCTGGGACTC 48
25 pk8 178-321(137) GCGGACCATATGGGCCCAGTTGAAATCCTTCCCTTC 49
532-962 GCGAGATCTTCACGTGGAGGGCAGGATCTCAGATTCG 50
26 pk9 205-348(138) GGCAGCCATATGTCCTTCCCAGTGGAGATCTTGCCC 51
613-1044 CGCGGATCCTCAGCTGAGTCCCAGCGTCCTCTCGAA 52
27 pk10 192-338(139) GCTGGCCATATGTTGCGCCGCCTGCGCAAGGGC 53
574-1014 CGGGATCCTCACGTGGACTCCAGCGTATTGAG 54
28 T33 160-312(140) TGCCCCCATATGGCTGGGGACCGGCTCCCGAGG 55
478-934 GCGGGATCCTCATGAGGGGGTGCCCGGGTCGCCCTG 56
29 pk12 201-351(141) CGATCGCATATGGAGGGTCTGGGCCGCTCGTG 57
601-1053 CGGGATCCCTAGGTGGGGGCCAGCTCGAAGG 58
30 pk13 320-467(142) CTGGACCATATGCAGCGGCTGAACATCGGCTAC 59
958-1401 CGGGATCCTCACACAACCGTCTCCACTCCCATC 60
31 T27 192-339(143) GTTGCCCATATGGGGCCAACCCGAATTCTTC 61
574-1017 GGATCCTTATGATGCTCCAGTCTGGTTC 62
32 pk6 1-185(144) GCCGCCCATATGTCGGGCTCGTTCGAGCTCTCG 63
1-555 CGGGATCCCTAGGGTTTCAACTTCCCCTCC 64
33 pk14 27-210(145) GCCAAGCATATGGGCGGAAACCACATCCCCGAAAGG 65
79-628 GCGGGATCCTCAGGAATTCCAATTCTTTCTGATAGG 66
34 pk15 21-340(146) AGCGCCCATATGGTCAGCTGTGCCGGGCAGATGCTG 67
61-1020 CGGGATCCTCATATTTTTCCTGTTTGTGATCC 68
35 pk33 1-188(147) GGCTGGCATATGGCTGAGACCTCTCTCCCAGAG 69
1-564 CGGGATCCTCAGCTCTGGCCGGCACCCCGC 70
36 p44 1-198(148) TCCCACCATATGGACTCACTGCAGAAGCAGGAC 71
1-601 GCCAAGGGTCAGGGATCCTGGCTG 72
37 p21 1-157(149) CCCGGGCATATGGGCAATGGCATGACCAAGGTAC 73
1-471 GCGGGATCCTCACTTGCCGCCCTTGCGGGACAG 74
38 pk35 1-188(150) GCGGGATCCTCACTTGCCGCCCTTGCGGGACAG 75
1-564 CGGGATCCTCACAGTGGAATCATCAAACGGAC 76
39 NE1 1-217(151) CCAGGGGCTAGCCGCTAACTGGAAAGAAAA 77
1-651 GTCGGATCCTTAGCTTTCTTTGCCCTCTTG 78
40 p19 1-190(152) ATGACAGCATCCGCGTCCTCCTTTTC 79
1-570 TTACATTGATATCATCATACGTAG 80
41 pk18 1-184(153) GCAGCCCATATGGGGAATGGGATGAACAAGATC 81
1-552 CGGGATCCTTACAGTCTTCTGAGAAAGGCCCAG 82
42 p12 31-211(154) GGGAAGCATATGGGTCGGGCGCACCGGGACTGG 83
91-603 GGCACCAAGCTTTCAGAACTCTTTAAGAACATCCAGCT 84
43 pk17 35-211(155) CTGGAGCATATGCCAACCGTTCAACATCCTTTCC 85
103-633 GCGGGATCCTCATGCTTCCAGACCCTGCCGCAGC 86
번호 이름 아미노산 위치 (서열번호) 정방향 프라이머 서열번호
DNA 위치 역방향 프라이머
44 p16 1-150(156) GCGGCGGCTAGCATGGGCGTGCAGCCCCCCAACTTC 87
1-450 CGCGCCTCGAGTTTCGTTCGCTGGTAGAACTGGAA 88
45 T16 1-210(157) GGCGGCGCTAGCATGGCTCACAACAAGATCCCGCCG 89
1-630 TGAGGATCCTTATGATTCCTTCTTTCCATCCTCATC 90
46 p18 306-450(158) CCGGGACATATGGACAAGCCCTCCCTTATCTTC 91
916-1350 GCGGGATCCTCAGCTTGCATCCAAGATGCCTTC 92
47 NE3 306-350(159) CTTGGTCATATGGATAGCCCTACACAGATATTTG 93
916-1350 GCGGGATCCTCACCTTGCCAGCAAGATCCCCTG 94
48 pk3 4-163(160) GCGGCTCATATGAACCGCCCAGCTCCTGTGGAA 95
10-489 GCGGGATCCTCAGGAATCTTTGAAACGCAGCCGCAT 96
49 p49 14-167(161) CGCCGAGCTAGCATGCGTTTTCTGATAACTCACAAC 97
40-501 CGGGATCCCTACTGAACACAGCAATGCCCATTG 98
50 p26 4-161(162) GCGACCCATATGGCCCCGGTGGAGGTGAGCTACA 99
10-483 CGCGGATCCTCAGGTCTTGTGCGTGTGTGGGTCTTTG 100
51 T29 37-391(163) GGCGGCCATATGTCGTCGACCTCGCCGGGTGTGAAG 101
109-1173 GCCGGATCCTTATTTGGAGAAGGCTGCTCTGTGTTGTC 102
52 T46 1-157(164) ATGGCGGAACAGGCTACCAAGTCCGTG 103
1-471 TCAGTGGGCCTTCTCCAAGAACGCTCTGC 104
53 pk1 336-523(165) GCTCTAGACTTATAGGAGACTTCTCCAAGGG 105
1006-1569 GCCCTAGGTCAGAGCTTCTTCAGACGACTGTAC 106
54 T47 378-566(166) GACCACCATATGCTGATTGGAGATTACTCTAAGGCC 107
1132-1701 CCGGGATCCTCACTGGTCCTGCAGCCGGCTACA 108
55 T45 207-400(167) GATTCTGCTAGCGGGCACCTGATTGGTGATTTTTCC 109
619-1200 CCGGGATCCTCATGGGCTCATGTCCTTCACCAG 110
56 Eya2 244-514(168) GACAATCATATGGAGCGTGTGTTCGTGTGGGAC 111
730-1542 GAATTCTTATAAATACTCCAGCTCCAGGGCGTG 112
<2-2> 활성도 및 안정성을 유지하기 위한 대량발현 조건
하나한(Hanahan)이 기술한 방법(Hanahan D, DNA Cloning vol.1 109-135, IRS press 1985)에 의해 실시예 2-1에서 제조한 56개의 벡터를 대장균에 각각 형질전환 하였다.
구체적으로, CaCl2로 처리한 대장균 BL21-DE3-RIL에 실시예 2-1의 벡터들을 열충격 방법으로 각각 형질전환시킨 후, 카나마이신(kanamycin; Sigma, USA) 이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 카나마이신 저항성을 나타내는 콜로니를 선별하였다. 상기 콜로니를 하룻밤 동안 LB 배지에서 배양한 종균 배양액의 일부를 30 ㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 LB 배지에 접종한 다음 대장균을 정지기(stationary phase) 전까지 배양하였다. 이후 배양액을 새 400 ㎖/flask의 LB 배지에 1:100의 희석비율로 접종하였고, 온도를 37℃에서 17℃까지 서서히 낮추면서 약 2 내지 3시간 동안 배양한 후, 17℃에서 200 rpm으로 배양하였다. 배양액의 OD600이 0.5에 이르렀을 때 IPTG를 가능한 낮은 농도(0.05 ~ 0.1 mM)로 첨가하여 20 내지 16-18 시간 배양하여 PTP 활성 도메인의 발현을 유도하였다.
<2-3> 활성도 및 안정성을 유지하는 정제 및 저장 조건
실시예 2-2의 방법으로 배양한 대장균을 4℃에서 6,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 균체 침전물을 회수한 후 5 ㎖의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 4℃에서 초음파 파쇄기를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액을 Ni-NTA 레진(Qiagen, USA)을 이용하여 4℃에서 약 3시간 동안 저농도 완충용액[20 mM Tris-HCl pH 7.5 0.2 M NaCl 1.0 mM PMSF, 4mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA)]에서 고농도 완충용액[저농도 완충용액에 0.5M 이미다졸 추가로 포함(Sigma, USA)]으로 선형농도구배법을 이용하여 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질의 N-말단의 히스티딘 태그는 프로테아제인 트롬빈(Sigma, USA)을 단백질 100 ㎍ 당 1 유닛의 트롬빈 비율로 처리하여 제거하였고, 이온교환 크로마토그래피(GE Healthcare, USA) 및 겔 여과 크로마토그래피(GE Healthcare, USA)를 이용하여 정제하였다. PTP 활성 도메인의 정제과정 중 10 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA) 또는 DTT(Promega, USA)를 완충용액에 10 mM의 농도로 계속 첨가하면서 정제하였고, 완충용액의 pH는 6.5 ~ 8.0으로 맞추었다. 상기 방법으로 정제된 PTP 활성 도메인은 10% 글리세롤을 단백질 용액[pH7.5-8.0 트리스 완충용액에 100-250 mM NaCl, 10 mM 환원제(β-머캅토에탄올 또는 DTT), 0.5~2 ㎍/㎖, 프로테아제 저해제(Sigma, USA)를 포함한 10% 글리세롤용액]에 첨가하여 4℃에서 보관하였다.
< 실시예 3> PTP 활성 도메인의 SDS - PAGE
실시예 2의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인의 정제 결과(단백질의 크기 및 순도)를 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
실시예 2의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인의 농도는 바이오-라드 단백질 분석 키트(Bio-Rad protein assay kit)를 이용하여 측정하였다. 상기 단백질을 5ㅧSDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 10% SDS-PAGE겔의 웰에 1-2 ㎍을 로딩하였고 125 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 각각의 재조합 단백질의 발현 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 예측되는 단백질 크기가 확인된 95% 이상의 순도로 정제된 PTP 활성 도메인을 확인하였다.
< 실시예 4> PTP 활성 도메인의 활성 및 안정성 평가
<4-1> DiFMUP 를 이용한 활성 측정
실시예 2의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인의 활성을 DiFMUP(Molecular probe, USA) 기질을 이용하여 측정하였다.
10mM DiFMUP(Molecular probe, USA) 현탁액을 반응 완충용액(20mM Tris-HCl pH8.0, 0.01% Triton X-100, 5mM DTT; sigma, USA)로 희석하여 최종 10 μM 기질을 0 또는 표 3에 나타난 바와 같은 최종농도로 실시예 2의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인과 90분 동안 상온에서 반응한 후, 1 mM sodium orthovanadate(Sigma, USA)를 가하여 반응을 종결하였다. 상기 90분 동안 일정 시간 간격으로 상대적인 형광도(Relative Fluorescence Unit, RFU)를 victor21420 multilabel counter plate reader(Perkin Elmer, USA) 를 이용하여 흡광도 355(여기)/460(방출) ㎚에서 형광값을 측정하였고, 기질만 있을 때의 값과 비교하여 활성을 측정하였다.
실제 반응한 PTP활성도메인의 최종농도(nM)
PTP 반응농도 PTP 반응농도 PTP 반응농도
T4 7.69 pk18 500 p26 526
T7 1.35 T10 17.24 T29 1219
T48 0.74 T22 1.47 T40 13.15
T8 8.06 T20 16.13 T2 658
T23 1.61 PTP1B 1.43 pk4 588
T39 7.69 T25 1.11 pk7 625
T5 7.14 T41 11.36 pk9 781
T38 161 T18 7.35 pk10 625
T12 1282 pk32 1.47 T33 882
T15 1.16 pk28 83.3 pk12 1178
pk6 75 T32 5.55 pk13 117
pk14 625 p12 52 T27 526
pk15 1351 pk17 2500 T46 277
pk33 9522 p16 156 pk1 108
p44 909 T16 2083 T47 91
p21 147 p18 588 T45 543
pk35 119 NE3 580 pk8 1250
NE1 300 pk3 2631
p19 119 p49 2941
그 결과, 도 7의 반응성 포화곡선(reaction saturation curve)에 나타난 바와 같이, 정제된 PTP는 정상적인 효소의 성질인 기질 분해성과 시간이 지남에 따라 반응성 포화(saturation)를 형성하는 것을 관찰할 수 있었고 반응성 포화가 20-30분 안에 일어나 실제 저해제 탐색 등 실험에 용이한 시간대임을 확인하였다.
<4-2> 상온 및 저온에서의 저장 후 활성 평가
실시예 2의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인의 안정성을 측정하였다.
실시예 4-1의 방법으로 측정한 활성과 상온에서 다양한 시간 또는 저온(4℃)에서 다양한 농도로 다양한 시간 동안 보관 후 실시예 4-1의 방법과 동일하게 측정한 활성과 비교하였다. 반응 단백질의 농도 및 반응시간은 기질에 대해 서로 다르게 결정되므로 일정하지 않으나, 일반적으로 기질이 전부 반응생성물로 되지 않는 농도로 단백질의 농도를 정하였고, 도 7에서 확인한 바와 같이 일정농도의 단백질이 기질과 반응하여 반응생성물이 더 이상 생성되지 않는 시간이 약 20 내지 30분 사이가 되도록 반응 조건을 조절하였다.
그 결과, 상온에서 6시간 정도는 활성도가 일정하게 유지되었고, 저온 보관시 0.5 ~ 1.0 ㎎/㎖ 농도로 약 2주 정도 보관하여도 활성을 유지하였다.
도 1은 PTP 단백질의 활성 도메인 삼차구조를 나타낸다(PTP1B: 맨 처음 정제되고 특성이 확인된 PTP).
도 2는 PTP 활성 도메인을 삽입한 발현벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 3은 Clustal X 프로그램을 이용하여 아미노산 서열을 서로 정렬한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 GOR IV SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(http://pbil.ibcp.fr/)를 이용하여 이차구조를 예측한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 ExPASy 서버를 이용한 아미노산 서열의 친수성/소수성 예측한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 순수 정제된 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 DiFMUP를 이용한 PTP 활성 도메인(PTP1B)의 활성측정 결과를 나타낸 도이다(원: 기질만 있는 경우, 네모: PTP1B).
도 8은 프로테아제 처리 방법에 의한 안정한 도메인(T38) 설계를 나타낸 도이다(화살표 A: 프로테아제 처리전 불안정한 도메인의 위치, 화살표 B: 프로테아제 처리후 안정한 도메인의 위치):
레인 1: 프로테아제를 처리하지 않은 T38; 및,
레인 2 내지 13: 프로테아제 농도를 증가시키면서 처리한 T38.
도 9는 재설계 도메인[pk7(MKP2)]의 용해도 및 안정성 측정 결과를 나타낸 도이다(화살표: 전장 pk7의 위치).
a: 전장 pk7의 용해도 및 안정성 결과; 및,
(레인 1, 3, 4 및 6: 표준레인[pk7의 위치 확인용] ; 레인 2 및 5: 세포파쇄 후 상등액)
b: 재설계 도메인 pk7의 용해도 및 안정성 결과:
(레인 1, 3, 5, 6 및 8: 표준 레인; 레인 2: 마커; 레인 4 및 7: 세포파쇄 후 상등액).
<110> Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for large scale preparation of the active domain of human protein tyrosine phosphatase without fusion protein <130> 7P-10-50 <160> 168 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T4 Forward primer <400> 1 cgcgacgcta gcatggcaga cgacaataag ctcttc 36 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T4 Reverse primer <400> 2 gctgcgaagc tttacttgaa gttggcataa tctga 35 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 Forward primer <400> 3 ggcacccata tgctagtggc tgttgttgcc ttattg 36 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 Reverse primer <400> 4 gcgggatcct caatgccttg aatagactgg atc 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T48 Forward primer <400> 5 gccccacata tgcgagacca cccacccatc ccc 33 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T48 Reverse primer <400> 6 ggaagatctc tacgttgcat agtggtcaaa gctgcc 36 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T8 Forward primer <400> 7 gcgccatatg gcagacaagt accagcaact ctccctg 37 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T8 Reverse primer <400> 8 gcgcggatcc ctcggctggg gcctgggctg actgttg 37 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T23 Forward primer <400> 9 ccgttacata tggtggagaa ttttgaggcc tacttc 36 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T23 Reverse primer <400> 10 cccgaattct taggcgatgt aaccattggt ctttc 35 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T39 Forward primer <400> 11 cacattgcta gcatgaagac atcagacagc tatggg 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T39 Reverse primer <400> 12 cggctcaagc ttctaagatg attccaggta ctccaa 36 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T5 Forward primer <400> 13 gcccaccata tggccagcga taccagcagc ctg 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T5 Reverse primer <400> 14 gcgagatctt cagccagaat tcaagtattc cag 33 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T38 Forward primer <400> 15 gaccggcata tgcttgccaa ggagtggcag gccctc 36 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T38 Reverse primer <400> 16 ccgggatcct cactggggca gggccttgag gat 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T12 Forward primer <400> 17 cgccagcata tggccacgcg gccaccagac cga 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T12 Reverse primer <400> 18 gcgggatcct cactggggaa gggccttgag gat 33 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T15 Forward primer <400> 19 gagcatgcta gcatggctag ggagtgtgga gctggt 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T15 Reverse primer <400> 20 gcgggatccc taggacttgc taacattctc gtatat 36 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T10 Forward primer <400> 21 cctttccata tgaagcccat aggacttcaa gagagaag 38 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T10 Reverse primer <400> 22 gacagtaagc tttcaaagtc tgctctcata caggcaca 38 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T22 Forward primer <400> 23 cgcgaacata tgcttagcca cccgccaatt ccc 33 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T22 Reverse primer <400> 24 ggcggatcct cagcccacgg cctccagcag ggcctc 36 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T20 Forward primer <400> 25 ttcgctagcg ccatccgggt ggctgacttg 30 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T20 Reverse primer <400> 26 gcgggatccc taaaaggagc ttaaatattc cagtgcca 38 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTP1B Forward primer <400> 27 atggagatgg aaaaggagtt cgagcagatc 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTP1B Reverse primer <400> 28 gtcaacatgt gcgtggctac ggtcctcacg 30 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T25 Forward primer <400> 29 gctcccgcta gcatgcccac catcgagcgg gag 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T25 Reverse primer <400> 30 cgcggatcct taggtgtctg tcaatcttgg cct 33 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T41 Forward primer <400> 31 tcagagcata tggaggagaa gatcgaggat gac 33 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T41 Reverse primer <400> 32 gtggacgcta gcatgaaata tttgggcagt cccatt 36 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T18 Forward primer <400> 33 gccccccata tggtgaggtg gtttcaccga gac 33 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T18 Reverse primer <400> 34 ccggaattct cacttcctct tgagggaacc cttg 34 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk32 Forward primer <400> 35 gaaccccata tgtctgtgaa cacaccccgg gaggtc 36 <210> 36 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk32 Reverse primer <400> 36 cgggatcctc aggggctggg ttcctcaggc ag 32 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk28 Forward primer <400> 37 ccgcggcata tggaacatca cgggcaatta aaa 33 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk28 Reverse primer <400> 38 cgggatcctc acctgcagtg caccacgacc gg 32 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T32 Forward primer <400> 39 gcagtacata tgaatgggaa gttatcagaa gag 33 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T32 Reverse primer <400> 40 ggcggatcct cacttcagaa gctgaggctg ctgttttt 38 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T40 Forward primer <400> 41 gagcagcata tggcaggcct ggaggcacag aag 33 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T40 Reverse primer <400> 42 cgcggatcct taaatgagtc tggagttttg gag 33 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2 Forward primer <400> 43 ctagggcata tgaaaaagac tcgagtagat gca 33 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2 Reverse primer <400> 44 cgcggatcct tagatgagcc tggagctttt cag 33 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk4 Forward primer <400> 45 aggccgcata tggtcatgga agtgggcacc ctg 33 <210> 46 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk4 Reverse primer <400> 46 ggcggatcct cagctcccag cctctgccga acag 34 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk7 Forward primer <400> 47 gttcatatga gtgccacaga gcccttggac 30 <210> 48 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk7 Reverse primer <400> 48 gcgggatcct caggacgtgg ccagcacctg ggactc 36 <210> 49 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk8 Forward primer <400> 49 gcggaccata tgggcccagt tgaaatcctt cccttc 36 <210> 50 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk8 Reverse primer <400> 50 gcgagatctt cacgtggagg gcaggatctc agattcg 37 <210> 51 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk9 Forward primer <400> 51 ggcagccata tgtccttccc agtggagatc ttgccc 36 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk9 Reverse primer <400> 52 cgcggatcct cagctgagtc ccagcgtcct ctcgaa 36 <210> 53 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk10 Forward primer <400> 53 gctggccata tgttgcgccg cctgcgcaag ggc 33 <210> 54 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk10 Reverse primer <400> 54 cgggatcctc acgtggactc cagcgtattg ag 32 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T33 Forward primer <400> 55 tgcccccata tggctgggga ccggctcccg agg 33 <210> 56 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T33 Reverse primer <400> 56 gcgggatcct catgaggggg tgcccgggtc gccctg 36 <210> 57 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk12 Forward primer <400> 57 cgatcgcata tggagggtct gggccgctcg tg 32 <210> 58 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk12 Reverse primer <400> 58 cgggatccct aggtgggggc cagctcgaag g 31 <210> 59 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk13 Forward primer <400> 59 ctggaccata tgcagcggct gaacatcggc tac 33 <210> 60 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk13 Reverse primer <400> 60 cgggatcctc acacaaccgt ctccactccc atc 33 <210> 61 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T27 Forward primer <400> 61 gttgcccata tggggccaac ccgaattctt c 31 <210> 62 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T27 Reverse primer <400> 62 ggatccttat gatgctccag tctggttc 28 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk6 Forward primer <400> 63 gccgcccata tgtcgggctc gttcgagctc tcg 33 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk6 Reverse primer <400> 64 cgggatccct agggtttcaa cttcccctcc 30 <210> 65 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk14 Forward primer <400> 65 gccaagcata tgggcggaaa ccacatcccc gaaagg 36 <210> 66 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk14 Reverse primer <400> 66 gcgggatcct caggaattcc aattctttct gatagg 36 <210> 67 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk15 Forward primer <400> 67 agcgcccata tggtcagctg tgccgggcag atgctg 36 <210> 68 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk15 Reverse primer <400> 68 cgggatcctc atatttttcc tgtttgtgat cc 32 <210> 69 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk33 Forward primer <400> 69 ggctggcata tggctgagac ctctctccca gag 33 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk33 Reverse primer <400> 70 cgggatcctc agctctggcc ggcaccccgc 30 <210> 71 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p44 Forward primer <400> 71 tcccaccata tggactcact gcagaagcag gac 33 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p44 Reverse primer <400> 72 gccaagggtc agggatcctg gctg 24 <210> 73 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Claims (25)

1) 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP)를 서브그룹별 상동성 조사를 수행하여 유사도가 가장 높은 부분을 선정하는 단계;
2) 단계 1)의 선정된 부분이 각 서브그룹별로 이미 2차 및 3차 구조가 규명된 표준 단백질의 활성 도메인에 해당되는지 확인하는 단계;
3) 단계 1)의 선정된 부분에 대한 2차 구조를 분석하여 2차 구조상 헬릭스 또는 시트를 가지지 않는 위치를 활성 도메인의 경계로 나누는 단계;
4) 단계 3)의 결정된 활성 도메인의 아미노산 분석을 통해 활성 도메인의 N-말단 및 C-말단이 가용성질일 수 있도록 N-말단 및 C-말단의 경계를 결정하는 단계;
5) 단계 4)의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
6) 단계 5)의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
7) 단계 6)의 형질전환체를 배양하여 재조합 활성 도메인의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 PTP 활성 도메인의 제조방법.
제 1항에 있어서, 서브그룹은 PTP를 리셉터(receptor), 비-리셉터(non-receptor), MKP(Mitogen-Activated protein Kinase phosphatase), DUSP(Dual-specificity phosphatases) 및 CDC14(Cell division cycle 14) 상동체(homologue)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1)의 상동성 조사는 ClustalX, KALIGN(At Karolinska Institute or at EB), MAFFT(At Kyushu University, EBI or at MyHits) 및 Muscle(At Berkeley or at BioAssist)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프로그램으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 3)의 2차 구조 분석은 GOR IV SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(), PHDsec (http://www.predictprotein.org/), Jpred()으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프로그램으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 4)의 N-말단과 C-말단 경계는 PTP 활성 도메인의 N-말단과 C-말단의 2 내지 3개의 아미노산이 가용성질의 아미노산으로 이루어지는 것 을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 가용성질의 아미노산은 작은 아미노산 또는 전하를 가진 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서 작은 아미노산은 세린 또는 글리신인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 전하를 가진 아미노산은 라이신, 아르기닌, 글루타민, 아스파라긴, 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 수득한 재조합 PTP 활성 도메인의 활성 및 안정성이 낮을 경우 상기 재조합 PTP 활성 도메인에 프로테아제 처리를 하여 PTP 활성 도메인의 경계를 재설계하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 프로테아제는 트립신 또는 키모트립신인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 7)의 재조합 PTP 활성 도메인을 수득하는 단계는 산화환원 조건을 유지하는 상태에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 산화환원 조건은 DTT 또는 베타-머캅토에탄올을 5 내지 20 mM을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 방법에 의해 제조된 재조합 PTP 활성 도메인.
제 13항에 있어서, 재조합 PTP 활성 도메인은 서열번호 113 내지 168 및 서열번호 169 내지 177의 아미노산 서열로 기재되는 것을 특징으로 하는 도메인.
제 13항의 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 15항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제 16항의 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체.
제 13항의 재조합 PTP 활성 도메인을 포함하는 PTP 저해제 또는 촉진제 검색용 키트.
제 11항에 있어서, 키트는 PTP 활성 도메인의 활성 측정용 기질, 반응 완충용액 및 반응 종결 시약 등을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 19항에 있어서, 기질은 DiFMUP(6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate)인 것을 특징으로 하는 키트.
제 13항의 재조합 PTP 활성 도메인을 이용하여 제조한 상기 재조합 PTP 활성 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체.
1) 제 13항의 재조합 PTP 활성 도메인에 PTP 특이적 기질 및 후보 물질을 처리하고 흡광도 변화를 측정하는 단계; 및,
2) 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 재조합 PTP 활성 도메인의 활성을 감소시키거나 증진시킨 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 PTP 활성 저해제 또는 촉진제의 스크리닝 방법.
1) 피검체로부터 분리된 시료에 제 21항의 항체를 첨가하여 PTP와 결합시키는 단계; 및,
2) 단계 1)의 항체와 결합한 PTP의 양을 측정하는 단계를 포함하는 PTP 발현량 측정 방법.
제 23항에 있어서, 단계 1)의 시료는 혈액, 조직 및 분비물로 이루어진 군으 로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 23항에 있어서, 단계 2)의 측정 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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