KR20170116812A

KR20170116812A - 융합 단백질 및 이를 포함하는 세포주기 조절제

Info

Publication number: KR20170116812A
Application number: KR1020160044896A
Authority: KR
Inventors: 강동민; 임정미
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2016-04-12
Filing date: 2016-04-12
Publication date: 2017-10-20
Anticipated expiration: 2036-04-12
Also published as: KR101826249B1

Abstract

본 발명은 중심체타겟 카탈라제 융합 단백질, 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 및 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오타이드 및 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

융합 단백질 및 이를 포함하는 세포주기 조절제{Fusion protein and composition for controlling cell cycle comprising the fusion protein}

중심체타겟 카탈라제 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포, 및 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 및 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

생체를 구성하는 세포들의 분열, 증식 및 분화는 생명 현상을 유지하는 기본적 메커니즘이다. 세포의 증식 및 성장은 정교한 세포내 신호전달 체계에 의해서 조절되며, 이러한 일련의 과정은 세포가 외부로부터 받은 신호를 여러 단백질(PLC, PKC, Shc, Grb2, Raf, MAPK, MEK 등)과 분자 매개체(GTP, cAMP 등)를 통해 핵내의 세포 시계로 전달시킴으로써 수행된다. 이러한 과정 중에서 어느 한 부분에 이상이 발생하게 되면 대부분의 경우에는 질병으로 발전하게 된다. 특히, 세포내 핵에서 일어나는 세포주기는 세포들의 생명유지를 조절하는 중요한 과정 중의 하나이다.

세포주기는 Gap1(G1), DNA 합성단계(S), Gap2(G2) 및 분열기(M)로 이루어진다. 상기 세포주기 이외에도 세포가 높은 밀도로 존재하거나, 낮은 농도의 성장 인자의 환경에서 장기간 방치되면, 세포는 휴면기라고 불리는 성장 멈춤(Go) 상태로 들어가게 된다.

여러 가지 요인으로 인하여 세포 주기의 조절 메커니즘에 장애가 발생하는 경우, 유전 물질의 불안정성을 증가시켜 조절되지 않은 세포 성장을 야기하게 되고, 암과 같은 무절제한 세포 성장을 유도하게 된다.

따라서, 세포 주기를 조절함으로써, 무절제한 세포 성장으로 인한 암과 같은 질병의 치료할 수 있을 것으로 예측되며, 이와 관련된 기술의 개발이 요구된다.

한국특허공개 제2010-0124625호

본 발명의 일 예는 중심체타겟 카탈라제 융합 단백질을 제공한다. 상기 융합 단백질은 세포주기 조절활성을 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

다른 예는 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 제공한다.

다른 예는 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 및 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 및 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 개체에 접촉시키는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 및 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 세포주기 조절용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 및 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 세포 주기 조절을 필요로 하는 개체에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 주기 조절 방법을 제공한다.

본 명에서에서 체세포 분열의 시작이 중심체 주변의 H₂O₂의 농도에 의해 조절되며, 중심체 주변의 H₂O₂의 농도가 낮아지는 경우 체세포 분열이 저해되는 것이 확인되었다. 이를 통해, H₂O₂를 분해하여 물과 산소를 생성하는 반응을 촉매하는 카탈라아제(catalase)를 중심체로 타겟팅 하여 발현시키는 경우 세포분열기로의 진행을 인위적으로 억제할 수 있음을 제안한다. 이는 활성산소가 정상세포에 비하여 과대하게 증가되어있는 암세포에서 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는,

(1) 카탈라제 (catalase) 또는 카탈라제 단편; 및

(2) 중심체 타겟 도메인

을 포함하는, 중심체타겟 카탈라제 융합 단백질을 제공한다. 상기 융합 단백질은 세포주기 조절활성을 갖는다.

상기 카탈라제는 과산화수소를 물로 분해하는 효소로서, 포유 동물에서 광범위하게 발견되며, 생체 내의 다양한 대사 반응에서 지속적으로 생성되는 과산화물의 축적을 억제하고 과산화물로 인한 손상으로부터 세포 또는 조직을 보호하는 역할을 한다. 상기 카탈라제는 인간을 포함한 포유류 유래의 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 카탈라제는 인간 유래의 것일 수 있으며, 예컨대 NCBI accession number NP_001743.1 (서열번호 1)의 아미노산 서열 또는 NCBI accession number NM_001752.2(cDNA)의 코딩염기서열 (CDS: NM_001752.2의 84-1667 부위: 서열번호 5; 527 a.a.)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 카탈라제 단편은 적어도 카탈라제 활성에 필수적인 부위를 포함하는 모든 폴리펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 1의 아미노산 서열의 1번째부터 523번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 523개 내지 527개 또는 523 내지 526개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 특별한 언급이 없는 한, 카탈라제는 상기 전장 카탈라아제 및 상기 카탈라제 단편 중에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것일 수 있다.

상기 중심체 타겟 도메인은 세포 분열시의 중심체를 표적하는 폴리펩타이드로서, 상기카탈라제 또는 카탈라제 단편을 중심체로 타겟팅하는 역할을 한다. 일 예에서, 상기 중심체 타겟 도메인은 예컨대, PACT (pericentrin-AKAP450 centrosomal targeting) 도메인 또는 PACT 도메인 단편일 수 있다. 상기 PACT 도메인은 포유류에 보존된 중심체 타겟팅 도메인으로서, 인간을 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 PACT 도메인은 Human AKAP450 단백질 (NCBI Accession No. CAB40713.1)의 3644번째(N)부터 3811번째(T)까지의 168개 아미노산(3644N-3811T) 또는 3643번째(A)부터 3811번째(T)까지의 169개 아미노산 (3643A-3811T)을 포함하는 영역일 수 있다. 예컨대, 상기 PACT 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 6의 염기서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열의 N 말단에 Ala를 추가로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 PACT 도메인 단편은 PACT 도메인 중 중심체 타겟팅을 위한 필수적인 영역을 포함하는 PACT 도메인의 일부분을 의미한다. 상기 PACT 도메인의 중심체 타겟팅을 위한 필수적 영역은 예컨대, 다음의 2개의 모티프를 포함할 수 있다: 서열번호 2의 아미노산 서열 중, 62번째(K)부터 105번째(P)까지의 영역 (모티프 1; 서열번호 16) 및/또는 122번째(R)부터 143번째(W)까지의 영역 (모티프 2; 서열번호 17). 따라서, 상기 PACT 도메인 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열 중, 62번째(K)부터 105번째(P)까지의 영역 (서열번호 16)을 포함하는 44개 내지 168개 또는 44개 내지 167개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드, 122번째(R)부터 143번째(W)까지의 영역 (서열번호 17)을 포함하는 연속하는 22개 내지 168개 또는 22개 내지 167개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드, 또는 62번째(K)부터 105번째(P)까지의 영역 (서열번호 16) 및 122번째(R)부터 143번째(W)까지의 영역 (서열번호 18)을 모두를 포함하는 66개 내지 168개 또는 66개 내지 167개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 예컨대, 상기 PACT 도메인 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 62번째(K; CAB40713.1 아미노산 서열 기준으로 3705번째 아미노산)부터 143번째(W; CAB40713.1 아미노산 서열 기준으로 3786번째 아미노산)까지의 아미노산 (서열번호 18)을 포함하는 연속하는 82개 내지 168개 또는 82개 내지 167개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.

본 명세서에서, 특별한 언급이 없는 한, PACT 도메인은 상기 전장 PACT 도메인 및 상기 PACT 도메인 단편을 모두 의미하는 것일 수 있다.

상기 아미노산 서열의 일 예를 아래의 표 1에 정리하였다:

서열번호	명명	아미노산 서열(5'->3')	설명
1	Cat	MADSRDPASDQMQHWKEQRAAQKADVLTTGAGNPVGDKLNVITVGPRGPLLVQDVVFTDEMAHFDRERIPERVVHAKGAGAFGYFEVTHDITKYSKAKVFEHIGKKTPIAVRFSTVAGESGSADTVRDPRGFAVKFYTEDGNWDLVGNNTPIFFIRDPILFPSFIHSQKRNPQTHLKDPDMVWDFWSLRPESLHQVSFLFSDRGIPDGHRHMNGYGSHTFKLVNANGEAVYCKFHYKTDQGIKNLSVEDAARLSQEDPDYGIRDLFNAIATGKYPSWTFYIQVMTFNQAETFPFNPFDLTKVWPHKDYPLIPVGKLVLNRNPVNYFAEVEQIAFDPSNMPPGIEASPDKMLQGRLFAYPDTHRHRLGPNYLHIPVNCPYRARVANYQRDGPMCMQDNQGGAPNYYPNSFGAPEQQPSALEHSIQYSGEVRRFNTANDDNVTQVRAFYVNVLNEEQRKRLCENIAGHLKDAQIFIQKKAVKNFTEVHPDYGSHIQALLDKYNAEKPKNAIHTFVQSGSHLAAREKANL	카탈라제 전체 서열
2	PACT	NIEAIIASEKEVWNREKLTLQKSLKRAEAEVYKLKAELRNDSLLQTLSPDSEHVTLKRIYGKYLRAESFRKALIYQKKYLLLLLGGFQECEDATLALLARMGGQPAFTDLEVITNRPKGFTRFRSAVRVSIAISRMKFLVRRWHRVTGSVSININRDGFGLNQGAEKT	PACT 서열 (굵은 글씨: 중심체 타겟팅을 위한 필수적인 영역)
3	Cat-PACT	MADSRDPASDQMQHWKEQRAAQKADVLTTGAGNPVGDKLNVITVGPRGPLLVQDVVFTDEMAHFDRERIPERVVHAKGAGAFGYFEVTHDITKYSKAKVFEHIGKKTPIAVRFSTVAGESGSADTVRDPRGFAVKFYTEDGNWDLVGNNTPIFFIRDPILFPSFIHSQKRNPQTHLKDPDMVWDFWSLRPESLHQVSFLFSDRGIPDGHRHMNGYGSHTFKLVNANGEAVYCKFHYKTDQGIKNLSVEDAARLSQEDPDYGIRDLFNAIATGKYPSWTFYIQVMTFNQAETFPFNPFDLTKVWPHKDYPLIPVGKLVLNRNPVNYFAEVEQIAFDPSNMPPGIEASPDKMLQGRLFAYPDTHRHRLGPNYLHIPVNCPYRARVANYQRDGPMCMQDNQGGAPNYYPNSFGAPEQQPSALEHSIQYSGEVRRFNTANDDNVTQVRAFYVNVLNEEQRKRLCENIAGHLKDAQIFIQKKAVKNFTEVHPDYGSHIQALLDKYNAEKPKNAIHTFVQSGSHLAAREQASNSAVDANIEAIIASEKEVWNREKLTLQKSLKRAEAEVYKLKAELRNDSLLQTLSPDSEHVTLKRIYG KYLRAESFRKALIYQKKYLLLLLGGFQECEDATLALLARMGGQP AFTDLEVITNRPKGFT *RFRSAVRVSIAISRMKFLVRRW* HRVTGSVSININRDGFGLNQGAEKTGSTGSR	융합 단백질 서열 ("QASNSAVDA"(밑줄로 표시): 링커, 이 중에서 마지막 잔기 A는 결실되어도 무방함; C 말단의 펩타이드 "GSTGSR"(밑줄로표시): 클로닝 과정에서 삽입된 것으로, 융합단백질에는 포함되지 않아도 무방함)
4	Cat-delPACT	MADSRDPASDQMQHWKEQRAAQKADVLTTGAGNPVGDKLNVITVGPRGPLLVQDVVFTDEMAHFDRERIPERVVHAKGAGAFGYFEVTHDITKYSKAKVFEHIGKKTPIAVRFSTVAGESGSADTVRDPRGFAVKFYTEDGNWDLVGNNTPIFFIRDPILFPSFIHSQKRNPQTHLKDPDMVWDFWSLRPESLHQVSFLFSDRGIPDGHRHMNGYGSHTFKLVNANGEAVYCKFHYKTDQGIKNLSVEDAARLSQEDPDYGIRDLFNAIATGKYPSWTFYIQVMTFNQAETFPFNPFDLTKVWPHKDYPLIPVGKLVLNRNPVNYFAEVEQIAFDPSNMPPGIEASPDKMLQGRLFAYPDTHRHRLGPNYLHIPVNCPYRARVANYQRDGPMCMQDNQGGAPNYYPNSFGAPEQQPSALEHSIQYSGEVRRFNTANDDNVTQVRAFYVNVLNEEQRKRLCENIAGHLKDAQIFIQKKAVKNFTEVHPDYGSHIQALLDKYNAEKPKNAIHTFVQSGSHLAAREQASNSAVDANIEAIIASEKEVWNREKLTLQKSLKRAEAEVYKLKAELRNDSLLQTLSPDSEHVTLKRIYGHRVTGSVSININRDGFGLNQGAEKT GSTGSR	중요 PACT 부위 (서열번호 3에서 이탤릭체로 표시: 서열번호 18)가 제거된 융합 단백질 서열
16	Motif 1	KYLRAESFRKALIYQKKYLLLLLGGFQECEDATLALLARMGGQP	PACT 서열 중 중심체 타겟팅에 필수적인 motif
17	Motif 2	RFRSAVRVSIAISRMKFLVRRW	PACT 서열 중 중심체 타겟팅에 필수적인 motif
18		KYLRAESFRKALIYQKKYLLLLLGGFQECEDATLALLARMGGQPAFTDLEVITNRPKGFTRFRSAVRVSIAISRMKFLVRRW	Motif 1+2 영역

상기 융합 단백질에 있어서, 상기 카탈라제 또는 카탈라제 단편과 PACT 도메인 또는 PACT 도메인 단편의 위치는 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 상기 카탈라제 또는 카탈라제 단편은 N-말단 쪽에 위치 (융합 단백질 내의 N-말단 부위; 즉, PACT 도메인 또는 PACT 도메인 단편의 N-말단에 연결)하고, 상기 PACT 도메인 또는 PACT 도메인 단편은 C-말단 쪽에 위치 (융합 단백질 내의 C-말단 부위; 즉, 카탈라제 또는 카탈라제 단편의 C-말단에 연결)하는 것일 수 있다.

상기 카탈라제 또는 카탈라제 단편과 PACT 도메인 또는 PACT 도메인 단편은 링커 없이 직접 연결되거나 링커(예컨대, 펩타이드 링커)를 통하여 연결된 것일 수 있다. 상기 "연결"은 펩타이드 결합 등의 공유결합에 의하여 연결된 것을 의미한다. 상기 펩타이드 링커는 포함된 아미노산 종류 및 길이에 특별한 제한이 없지만, 융합단백질의 구조에 영향을 미치지 않는 것이 바람직하므로, 약 20개 이하, 약 18개 이하, 약 15개 이하, 약 12개 이하, 약 10개 이하의 아미노산, 예컨대, 1 내지 20개, 1 내지 18개, 1 내지 15개, 1 내지 12개, 1 내지 10개, 2 내지 20개, 2 내지 18개, 2 내지 15개, 2 내지 12개, 2 내지 10개, 5 내지 20개, 5 내지 18개, 5 내지 15개, 5 내지 12개, 또는 1 내지 10개의 아미노산을 포함하는 것 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 융합 단백질은 C-말단, 예컨대 PACT 도메인의 C-말단에 약 20개 이하, 약 18개 이하, 약 15개 이하, 약 12개 이하, 약 10개 이하의 아미노산, 예컨대, 1 내지 20개, 1 내지 18개, 1 내지 15개, 1 내지 12개, 1 내지 10개, 2 내지 20개, 2 내지 18개, 2 내지 15개, 2 내지 12개, 2 내지 10개, 5 내지 20개, 5 내지 18개, 5 내지 15개, 5 내지 12개, 또는 1 내지 10개의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함되는 아미노산의 종류는 제한이 없다. 일 예에서, 상기 추가로 포함되는 아미노산은 클로닝 과정에서 삽입된 것 또는 PACT 도메인이 포함된 Human AKAP450 단백질 (NCBI Accession No. CAB40713.1)으로부터 유래한 것 (예컨대, Human AKAP450 단백질의 3812번째부터 연속하는 1 내지 20개, 1 내지 18개, 1 내지 15개, 1 내지 12개, 1 내지 10개, 2 내지 20개, 2 내지 18개, 2 내지 15개, 2 내지 12개, 2 내지 10개, 5 내지 20개, 5 내지 18개, 5 내지 15개, 5 내지 12개, 또는 1 내지 10개의 아미노산)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 중심체타겟 카탈라제 (Cat-PACT) 융합 단백질은,

N-말단 쪽에 서열번호 1의 아미노산 서열의 1번째부터 523번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 523개 내지 527개 또는 523 내지 526개의 아미노산을 포함하는 카탈라제 또는 카탈라제 단편; 및

C-말단 쪽에 서열번호 2의 아미노산 서열 중 62번째부터 105번째까지의 영역 (서열번호 16)을 포함하는 44개 내지 168개 또는 44개 내지 167개의 아미노산, 122번째부터 143번째까지의 영역 (서열번호 17)을 포함하는 연속하는 22개 내지 168개 또는 22개 내지 167개의 아미노산, 또는 62번째부터 143번째까지의 영역 (서열번호 18)을 포함하는 연속하는 82개 내지 168개 또는 82개 내지 167개의 아미노산을 포함하는 PACT 도메인 또는 PACT 도메인 단편을 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 예는 상기 중심체타겟 카탈라제 (Cat-PACT) 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 앞서 설명한 카탈라제 또는 카탈라제 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 PACT 도메인 또는 PACT 도메인 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

상기 카탈라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 카탈라제 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5의 염기서열의 1번째에서 1,569번째의 염기를 포함하는 연속하는 1,569개 내지 1584개의 뉴클레오타이드로 이루어진 염기 서열일 수 있다.

상기 PACT 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 중심체타겟 카탈라제 (Cat-PACT) 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

또 다른 예는 상기 중심체타겟 카탈라제 (Cat-PACT) 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

일 예에서, 상기 재조합 벡터는 도 1에 개시된 개열지도를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 재조합 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터일 수 있다.

상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 헬퍼-의존형 아데노바이러스, 레트로바이러스 벡터 등 일수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS), IRES (Internal Ribosome Entry Site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 프로모터로서 상기한 융합 폴리뉴클레오타이드 (융합 프로모터)를 갖도록 통상적인 유전공학적 방법으로 조작된 것일 수 있다. 상기 벡터는 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열 (예를 들어, 인핸서 등)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 제공한다.

상기 세포는 포유동물의 세포 일 수 있으며, 상기 포유동물 세포는 인간 (예를 들어, Hela, HEK-293, 망막-유래 PER-C6, 이배체 섬유모세포로부터 유래된 세포, 골수종 세포, HepG2 등) 등에서 선택된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 벡터의 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예컨대, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 (gene bombardment) 등을 사용할 수 있으며, 예를 들어 리포좀-매개 형질감염법 (Lipofector reagent사용)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 중심체타겟 카탈라제 (Cat-PACT) 융합 단백질은 중심체 주변의 H₂O₂를 제거 (물로 분해)하여 H₂O₂의 농도를 낮춤으로써 세포 주기를 제어할 수 있다. 이와 같은 작용에 의하여 암과 같은 제어되지 않은 세포 증식과 관련된 질병의 치료가 가능하다.

또 다른 예는 중심체타겟 카탈라제 (Cat-PACT) 융합단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종이상을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 융합 단백질, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 재조합 벡터는 위에서 설명한 것과 같다.

상기 암은 대장, 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 정소, 전립선, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 혈액, 뼈, 뇌, 또는 피부의 암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 적절한 형태로 제제화되어 제공될 수 있다. 상기 제제는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

또한, 상기 제제는 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.

보다 상세하게, 상기 제제는 상기 약학 조성물(유효성분)에 추가하여 이를 제형화하기 위한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 결합제, 활탁제, 현탁용제, 가용화제, 완충제, 보존제, 윤활제, 등장제, 부형제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있다.

상기 제제를 인간에게 적용하는 구체예에 있어서, 상기 제제는 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다.

예를 들면, 상기 제제를 비경구용으로 제공하는 경우, 일 예로 액제, 겔(gel)제, 세정 조성물, 삽입용 정제, 좌제 형태, 크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제등의 국소 투여제, 용액형, 현탁형, 유제형 등의 액상 제형일 수 있으며, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 크림, 연고, 젤리, 거품, 세척제 또는 삽입물, 바람직하게는 액제, 겔(gel)제, 세정 조성물, 삽입용 정제 등의 피부 외용제가 포함될 수 있다. 상기 제형은 일 예로 멸균수에 용해보조제, 유화제, pH 조절을 위한 완충제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 제제를 경구용으로 제공하는 경우, 일 예로 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다.

상기 제제의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.001 내지 10000 ㎎/kg, 0.01 내지 10000 ㎎/kg, 0.1 내지 10000 ㎎/kg, 0.5 내지 10000 ㎎/kg, 0.001 내지 1000 ㎎/kg, 0.01 내지 1000 ㎎/kg, 0.1 내지 1000 ㎎/kg, 0.5 내지 1000 ㎎/kg, 0.001 내지 500 ㎎/kg, 0.01 내지 500 ㎎/kg, 0.1 내지 500 ㎎/kg, 0.5 내지 500 ㎎/kg, 0.001 내지 300 ㎎/kg, 0.01 내지 300 ㎎/kg, 0.1 내지 300 ㎎/kg, 또는 0.5 내지 300 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.

상기 제제의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 좋다.

상기 제제의 투여 대상은 인간 등의 포유류, 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있다.

다른 예는 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 및 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 세포주기 조절용 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 벡터, 및 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 세포 주기 조절을 필요로 하는 개체에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 주기 조절 방법을 제공한다.

상기 개체는 인간을 제외한 포유류, 인간을 포함한 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있다.

상기 세포 주기 조절은 세포 주기를 정상화 (세포 주기 정지를 유도)하여 무절제 또는 비정상적인 세포 분열 또는 세포 증식을 제어하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명은 본 발명은 세포주기 조절활성을 갖는 중심체타겟 카탈라제 (Cat-PACT) 융합 단백질을 제공함으로써, 보다 효과적인 암의 예방 및/또는 치료를 가능하게 한다.

도 1은 Cat-PACT 포함 플라스미드 (pCat-PACT)의 개열지도이다.
도 2은 Cat-PACT와 Cat-delPACT의 단백질 서열의 모식적 그림이다.
도 3는 Cat-PACT의 중심체로 타겟팅을 보여주는 공초점 현미경 사진이다.
도 4는 Cat-PACT 또는 Cat-delPACT를 retrovirus를 이용하여 발현시키고 G1/S 상태의 세포를 mitosis로 진행시킨 후의 세포 라운딩에 기초하여 세포 분열기로 진입한 세포비율을 보여주는 그래프이다.
도 5는 Cat-PACT 또는 Cat-delPACT를 retrovirus를 이용하여 발현시키고 G1/S 상태의 세포를 mitosis로 진행시킨 후의 DNA 염색체의 응축에 기초하여 세포 분열기로 진입한 세포의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 6는 Cat-PACT와 Cat-delPACT 발현시킨 세포에서 Cdk1의 inhibitory 인산화 (pY¹⁵-Cdk1), Histone H3의 인산화 (pHH3), Cdk1, Actin를 각기 특이적 항체로 탐지한 면역블롯 결과이다.
도 7는 실시예의 Cat-PACT와 Cat-delPACT 발현시킨 세포에서 Cdk1의 inhibitory 인산화 (pY¹⁵-Cdk1), Histone H3의 인산화 (pHH3), Cdk1, Actin를 각기 특이적 항체로 탐지한 면역블롯 강도를 정량화한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예의 Cat-PACT 융합 단백질 또는 Cat-delPACT 융합 단백질이 발현된 세포에서의 시간에 따른 H2B-GFP 발현 모양 변화로 세포주기 진입시간을 정량화한 그래프이다.
도 9은 Cat-PACT 융합 단백질 또는 Cat-delPACT 융합 단백질이 발현된 세포에서 Cyclin B 항체를 사용하여 관찰한 공초점 현미경 사진(왼쪽)과 중심체에서 Cyclin B의 강도를 정량화한 그래프(오른쪽)이다.
도 10은 Cat-PACT 융합 단백질 또는 Cat-delPACT 융합 단백질이 발현된 세포에서 Plk1 항체를 사용하여 관찰한 공초점 현미경 사진 (왼쪽)과 중심체에서 Plk1의 강도를 정량화한 그래프(오른쪽)이다.
도 11은 Cat-PACT 융합 단백질 또는 Cat-delPACT 융합 단백질이 발현된 세포에서 Aurora A 항체를 사용하여 관찰한 공초점 현미경 사진 (왼쪽)과 중심체에서 Aurora A의 강도를 정량화한 그래프(오른쪽)이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 플라스미드의 제조

pCat-PACT 융합 단백질을 발현하기 위한 플라스미드를 제조하기 위해서, pdsRed-PACT(provided by D.S. Hwang, Seoul National University, Seoul, South Korea; pdsRed-C1 플라스미드에 dsRed 유전자의 C-terminal에 PACT가 연결되어있음)를 모벡터 (parental vector)로 이용하여, dsRed 유전자를 인간 catalase 암호화 유전자 (서열번호 5) 중에서 C-terminal 아미노산 'KANL' 암호화 부위가 제거된 인간 catalase 절편 암호화 염기서열로 교환하였다.

상기 인간 catalase 절편 암호화 염기서열 포함 플라스미드 (S.W. Kang, Ewha Woman's University, Seoul, South Korea)에서 프라이머쌍(서열번호 10 및 11번; 표 2 참조)을 이용하여 catalase 절편 (서열번호 1의 아미노산 서열에서 C-terminal 'KANL' 아미노산 서열부위 제거) 암호화 염기서열을 PCR 증폭을 한 후에 AgeI/HindIII 효소를 이용하여 pdsRed-PACT에 삽입하여 pCat-PACT 발현용 플라스미드를 제작하였다 (도 1 개열 지도 참조). 상기 pCat-PACT 발현용 플라스미드는 pCat-PACT 융합 단백질 (서열번호 3)을 암호화하는 서열번호 7의 염기서열을 포함한다.

pCat-delPACT 플라스미드를 제조하기 위해서, 서열번호 2의 PACT 도메인 (암호화 유전자: 서열번호 6) 중에서 2개의 모티프(motif) (Motif 1: K62-P105 (KYLRAESFRKALIYQKKYLLLLLGGFQECEDATLALLARMGGQP; 서열번호 16); Motif 2: R122-W143 (RFRSAVRVSIAISRMKFLVRRW; 서열번호 17))가 모두 제거된 PACT 단편 (K62부터 W143까지의 아미노산 (서열번호 18)이 제거된 PACT 절편)을 암호화하는 염기서열을 dsRed-PACT로부터 증폭하였다. 상기 2개의 모티프 포함 부분이 제거된 PACT 절편 암호화 염기서열(이하, delPACT)의 증폭을 위하여, 프라이머쌍 (서열번호 12 및 15, 및 서열번호 13 및 14; 표 2 참조)를 이용하여 각각 증폭한 1차 PCR 산물을 기질(template)로 하고 프라이머쌍 (서열번호 12 및 13; 표 2 참조)를 이용하여 2차 PCR 증폭한 산물을 SaI/HpaI 효소를 이용하여 pCat-PACT 발현용 플라스미드에 삽입하여, pCat-delPACT 발현용 플라스미드를 제작하였다. 상기 플라스미드는 K62부터 W143까지 제거된 PACT 절편을 포함하는 pCat-delPACT 융합 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 8의 염기서열을 포함한다. 이와 같은 중간 부분 제거를 통하여 상기 제거된 부분이 중심체 타겟팅을 위한 필수적 부위임을 입증하고자 한다.

상기 사용된 dsRed-PACT, PACT cDNA, 및 프라이머의 염기서열을 하기 표 2에 나타내었으며, 상기 플라스미드에 의해 발현되는 융합 단백질의 모식도를 도 2에 나타내었다.

서열번호	명명	염기서열(5'->3')
5	Cat (카탈라제 암호화 염기 서열)	Atggctgacagccgggatcccgccagcgaccagatgcagcactggaaggagcagcgggcc gcgcagaaagctgatgtcctgaccactggagctggtaacccagtaggagacaaacttaat gttattacagtagggccccgtgggccccttcttgttcaggatgtggttttcactgatgaa atggctcattttgaccgagagagaattcctgagagagttgtgcatgctaaaggagcaggg gcctttggctactttgaggtcacacatgacattaccaaatactccaaggcaaaggtattt gagcatattggaaagaagactcccatcgcagttcggttctccactgttgctggagaatcg ggttcagctgacacagttcgggaccctcgtgggtttgcagtgaaattttacacagaagat ggtaactgggatctcgttggaaataacacccccattttcttcatcagggatcccatattg tttccatcttttatccacagccaaaagagaaatcctcagacacatctgaaggatccggac atggtctgggacttctggagcctacgtcctgagtctctgcatcaggtttctttcttgttc agtgatcgggggattccagatggacatcgccacatgaatggatatggatcacatactttc aagctggttaatgcaaatggggaggcagtttattgcaaattccattataagactgaccag ggcatcaaaaacctttctgttgaagatgcggcgagactttcccaggaagatcctgactat ggcatccgggatctttttaacgccattgccacaggaaagtacccctcctggactttttac atccaggtcatgacatttaatcaggcagaaacttttccatttaatccattcgatctcacc aaggtttggcctcacaaggactaccctctcatcccagttggtaaactggtcttaaaccgg aatccagttaattactttgctgaggttgaacagatagccttcgacccaagcaacatgcca cctggcattgaggccagtcctgacaaaatgcttcagggccgcctttttgcctatcctgac actcaccgccatcgcctgggacccaattatcttcatatacctgtgaactgtccctaccgt gctcgagtggccaactaccagcgtgacggcccgatgtgcatgcaggacaatcagggtggt gctccaaattactaccccaacagctttggtgctccggaacaacagccttctgccctggag cacagcatccaatattctggagaagtgcggagattcaacactgccaatgatgataacgtt actcaggtgcgggcattctatgtgaacgtgctgaatgaggaacagaggaaacgtctgtgt gagaacattgccggccacctgaaggatgcacaaattttcatccagaagaaagcggtcaag aacttcactgaggtccaccctgactacgggagccacatccaggctcttctggacaagtac aatgctgagaagcctaagaatgcgattcacacctttgtgcagtccggatctcacttggcg gcaagggagaaggcaaatctgtga
6	PACT (PACT 암호화 염기서열)	aacattgaagccatcattgcctctgaaaaagaagtatggaacagagaaaaattgactctccagaaatctttgaaaagggcagaggctgaagtatacaaactgaaagctgaactaagaaatgactctttacttcaaactctgagccctgattctgaacatgtcactttaaagagaatttatggtaaatacttgagggcagaaagttttcgaaaggctctcatttaccagaagaaatacctgctgctgttactgggtgggttccaggaatgtgaagatgccaccttggccctgcttgcccggatgggggggcagccagctttcacggatctagaggtgatcaccaatcgcccaaagggcttcaccaggtttcggtcggccgtcagagtatccattgcaatttccagaatgaaatttttggttcgacggtggcatcgagtcacaggttctgtttccatcaatattaacagagatggctttggactgaatcaaggtgcagaaaagact
7	Cat-PACT (융합 단백질 암호화 염기 서열)	tcaatattaacagagatggctttggactgaatcaaggtgcagaaaagactggatccaccggatctagataa
8	Cat-delPACT (중요 PACT부위가 제거된 융합 단백질 암호화 염기 서열)	cattgaggccagtcctgacaaaatgcttcagggccgcctttttgcctatcctgacactcaccgccatcgcctgggacccaattatcttcatatacctgtgaactgtccctaccgtgctcgagtggccaactaccagcgtgacggcccgatgtgcatgcaggacaatcagggtggtgctccaaattactaccccaacagctttggtgctccggaacaacagccttctgccctggagcacagcatccaatattctggagaagtgcggagattcaacactgccaatgatgataacgttactcaggtgcgggcattctatgtgaacgtgctgaatgaggaacagaggaaacgtctgtgtgagaacattgccggccacctgaaggatgcacaaattttcatccagaagaaagcggtcaagaacttcactgaggtccaccctgactacgggagccacatccaggctcttctggacaagtacaatgctgagaagcctaagaatgcgattcacacctttgtgcagtccggatctcacttggcggcaagggagcaagcttcgaattctgcagtcgacgccaacattgaagccatcattgcctctgaaaaagaagtatggaacagagaaaaattgactctccagaaatctttgaaaagggcagaggctgaagtatacaaactgaaagctgaactaagaaatgactctttacttcaaactctgagccctgattctgaacatgtcactttaaagagaatttatggtcatcgagtcacaggttctgtttccatcaatagagatggctttggactgaatcaaggtgcagaaaagactggatccaccggatctagataa
9	dsRed-PACT	gggggggcagccagctttcacggatctagaggtgatcaccaatcgcccaaagggcttcaccaggtttcggtcggccgtcagagtatccattgcaatttccagaatgaaatttttggttcgacggtggcatcgagtcacaggttctgtttccatcaatattaacagagatggctttggactgaatcaaggtgcagaaaagactggatccaccggatctagataa
10	Cat Primer_F	CTA CCGGTA TGG CTG ACA GCC
11	Cat Primer_R	CGA AGC TTG CTC CCT TGC CGC CAA GTG A
12	PACT Primer_F	GAG CAA GCT TCG AAT TCT GC
13	PACT Primer_R	ACA AGT TAA CAA CAA CAA TTG CA
14	delPACT Primer_F	AAG AGA ATT TAT GGT CAT CGA GTC ACA GGT TCT GT
15	delPACT Primer_R	ACC ATA AAT TCT CTT TAA AGT GAC

실시예 2. 중심체에서 Cat-PACT 융합 단백질의 발현 확인

실시예 1에서 제작된 플라스미드를 도입하기 위해, HeLa 세포(American Type Culture Collection [ATCC], USA)에 상기 제작된 각각의 플라스미드를 리포좀 주입법으로 도입한 후, 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum; FBS (Gibco, 미국))과 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Hyclone, 미국)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 배양하였다.

그 다음, 공초점 면역형광 현미경(confocal immunofluorescence microscopy, A1R; Nikon, 일본)을 사용하여 중심체 주변에 Cat-PACT 융합 단백질이 발현되었는지 확인하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다. Cat-PACT 융합 단백질은 중심체로 타겟팅 잘 되는 반면, Cat-delPACT 융합 단백질은 중심체로 타겟팅 되지 않음을 확인하였다.

실시예 3. Cat-PACT 융합 단백질의 세포주기 활성 억제 효과

3-1. 세포 라운딩(cell rounding) 및 염색체 응축을 측정

Cat-PACT 융합 단백질이 세포 주기 활성 억제 효과를 나타내는지 확인하기 위해, Cat-PACT 플라스미드, Cat-delPACT 플라스미드, 대조군으로 공벡터(empty vector) 각각을 상기 실시예 2와 같은 방법으로 GFP-H2B stable HeLa 세포 (J.H. Lee, Ajou University, Suwon, South Korea, pEGFP-N1 벡터에 인간 Histone H2B 유전자가 삽입됨)에 도입하고 10시간 동안 37℃에서 배양하였다.

그 다음, 세포 주기를 G1-S로 동일하게 맞추기 위해, 2mM 티미딘(thymidine)이 포함된 배지에서 18시간 동안 배양 후, 티미딘이 제거된 배지에서 3시간동안 S기 상태로 방치한 다음, 100ng/ml의 노코다졸(nocodazole)(시그마-알드리지, 미국)이 포함된 배지에서 10시간 동안 처리하였다.

그 다음, 세포 라운딩(cell rounding) 및 염색체 응축을 측정하였다. 세포분열기 세포는 간기(interphase) 세포에 비하여 원형의 공과 같은 모양을 하고 (세포 라운딩), 염색체가 응축되어 강한 GFP 신호를 나타낸다. Confocal 현미경을 이용하여 bright 영상과 GFP 영상을 얻어서 전체 세포에서 세포 라운딩을 나타내는 세포와 염색체 응축을 보이는 세포의 비율을 정량하였다. 그 결과를 도 4 (세포 라운딩) 및 5 (염색체 응축), 및 표 3 및 4에 나타내었다.

세포 라운딩 측정 결과

	Cell Rounding (%)
Empty	61.8
Cat-PACT	36.2
Cat-delPACT	54.5

염색체 응축 측정 결과

	Condensed chromosome(%)
Empty	62.5
Cat-PACT	35.3
Cat-delPACT	55.8

상기 표 3 및 4, 및 도 4 및 5에 나타난 결과는 Cat-PACT를 발현하여 중심체에서 H₂O₂가 감소되어 있는 세포는 대조군 벡터와 Cat-delPACT를 발현시킨 세포에 비하여 G1기에서 세포분열기로 세포주기 진행이 억제됨을 나타낸다. 이 결과는 세포분열기로의 진행에 중심체 H₂O₂가 필요하며, 인위적으로 중심체의 H₂O₂를 감소시키는 것은 세포주기 진행을 방해할 수 있음을 의미한다.

3-2. 인산화된 Cdk1 측정을 통한 확인

Cat-PACT와 대조군 Cat-delPACT를 retrovirus를 이용하여 소량 발현시킨 HeLa 세포를 3-1과 동일한 조건으로 배양한 후에 각 세포를 얻고 분쇄한 후에 15,000xg에서 30분간 원심 분리하여 상층액의 cell lysates 를 얻었다. Cell lysates의 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 후에 항 catalase 항체 (Young In Frontier), 항 pY¹⁵-Cdk1 항체 (Cell Signailing Technology), 항 Cdk1 항체 (Santa Cruz), 항 pHistone H3 (pHH3) 항체 (Millipore), 항 Actin 항체 (Sigma)를 이용하여 면역블롯 실험을 하였다. 상기 면역 블롯 결과를 도 6에 나타내고, 이를 정량화하여 아래의 표 5 및 도 7에 나타내었다.

		Relavitivi band intensity
Cdk1	Empty	1.03
	Cat-PACT	1.13
	Cat-delPACT	1.13
pY15-Cdk1	Empty	1.00
	Cat-PACT	3.28
	Cat-delPACT	1.68
pHH3	Empty	1.00
	Cat-PACT	0.49
	Cat-delPACT	0.82

상기 표 5 및 도 6 및 도 7에서 확인되는 바와 같이, Cat-PACT가 발현된 세포는 Cdk1의 불활성화를 나타내는 pY¹⁵-Cdk1 양이 대조군 empty 벡터와 Cat-delPACT르 발현시킨 세포보다 증가되고, pHH3가 감소됨을 알 수 있다. 이 결과는 생화학적 방법을 통한 Cdk1 활성 분석에서 중심체의 H₂O₂가 세포분열기로의 진행에 중요하고 인위적으로 중심체 H₂O₂를 감소시킬 경우 Cdk1 활성이 감소함을 나타낸다.

3-3. 실시간 세포영상 분석을 통한 분석

Cat-PACT와 대조군 Cat-delPACT를 retrovirus를 이용하여 소량 발현시킨 GFP-H2B stable HeLa 세포를 실시예 3-1과 유사한 조건으로 배양하면서 티미딘이 제거된 배지에서 live cell 배양기가 장착된 confocal microscopy에서 세포분열기로 진행을 20시간동안 30분간격으로 영상을 취득하여 분석하였다. Cat-PACT 발현 90개 세포와 Cat-delPACT 발현 70개 세포를 조사하여, 세포분열기로의 진행을 염색체 응축과 세포 라운딩으로 분석하였다. 상기 시험 결과 얻어진 세포 분열기로 진입한 세포 비율을 표 6 및 도 8에 나타내었다.

세포분열기로 진입한 세포의 비율

Time	Cat-PACT (%)	Cat-delPACT (%)
06:00 - 07:59	3.19	1.43
08:00 - 09:59	0	6.27
10:00 - 10:59	4.12	20.74
11:00 - 11:59	6.34	27.37
12:00 - 12:59	14.89	15.39
13:00 - 13:59	15.45	8.06
14:00 - 14:59	21.69	7.70
15:00 - 15:59	12.82	4.47
16:00 - 16:59	12.40	1.43
17:00 - 17:59	7.36	2.86

표 6 및 도 8에서와 같이, Cat-PACT 발현세포는 Cat-delPACT 발현세포에 비하여 2-4시간 정도 세포분열기로의 진행이 억제됨을 확인할 수 있다. 이는 실시예 3-1 및 3-2의 결과와 함께 중심체 H₂O₂의 인위적인 감소는 세포주기 진행과 Cdk1 활성을 억제함을 나타낸다.

실시예 4. Cat-PACT 융합 단백질의 Cdk1 상위조절자의 단백질들의 안정성 조절

세포분열기에 중요한 인산화 효소인 Cdk1의 활성화는 중심체에서 시작된다. Cdk1 활성화에 중요한 단백질로는 Cyclin B, Plk1, Aurora A가 있으며, 이 단백질들의 양을 중심체에서 Cat-PACT가 발현되어 있는 세포에서 Cat-delPACT, 대조군 벡터를 발현시킨 세포에서 confocal microscopy를 이용한 면역염색법으로 관찰하고 중심체에서 각각 단백질의 양을 정량 비교하였다.

구체적으로, Cat-PACT, Cat-delPACT, 대조군 벡터를 발현시킨 HeLa를 이용하여 실시예 3-1과 동일한 방법으로 시료를 준비하였다. 각 시료들을 4% formaldehyde 또는 100% methanol로 고정한 후에 각각의 항체 (항 CyclinB 항체 (Santa cruz), 항 Plk1 항체(Invitrogen), 및 항 Aurora A 항체(Cell Signaling))를 이용하여 면역염색법으로 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 표 7 내지 9 및 도 9 내지 11에 나타내었다.

	CyclinB/pericentrin
Empty	1.00
Cat-PACT	0.42
Cat-delPACT	0.94

	Plk1/pericentrin
Empty	1.00
Cat-PACT	0.56
Cat-delPACT	0.80

	Aurora A/γ-tubulin
Empty	1.00
Cat-PACT	0.52
Cat-delPACT	0.85

도 9는 중심체에서 Cyclin B의 수준을 측정한 공초점 현미경 사진들 (왼쪽)과 상대 형광 강도를 보여주는 그래프(오른쪽)이다. 도 10은 Plk1의 수준을 측정한 공초점 현미경 사진(왼쪽)과 상대 형광 강도를 보여주는 그래프(오른쪽)이다. 도 11은 Aurora A의 수준을 측정한 공초점 현미경 사진(왼쪽)과 상대 형광 강도를 보여주는 그래프(오른쪽)이다.

표 7 내지 9 및 도 9 내지 11에서 확인할 수 있듯이, Cat-PACT 융합 단백질의 발현에 의해 Cyclin B, Plk1, 및 Aurora A의 중심체에서의 발현 수준이, Cat-delPACT 융합 단백질을 발현한 비교 예에 비해 각각 55, 30, 및 40% 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 중심체가 H₂O₂에 노출되는 것은 중심체에서 Cyclin B, Plk1, Aurora A 분해를 막기 위해 필요한 것임을 알 수 있었다.

결론적으로 중심체로 타겟팅되는 catalase인 Cat-PACT 융합 단백질은 암세포에서 세포분열기로의 진행을 억제하고 Cdk1 활성화를 억제함을 생화학적, 세포영상학적 방법으로 확인하였다. Cat-PACT 융합 단백질은 활성산소가 증가되어 있는 많은 암세포에서 세포진행 억제와 이와 관련된 일련의 과정의 억제를 통한 세포사멸을 유도할 수 있으며, 다양한 형태의 암치료에 응용될 수 있으리라 기대된다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Fusion protein and composition for controlling cell cycle comprising the fusion protein <130> DPP20154296KR <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 527 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of catalase <400> 1 Met Ala Asp Ser Arg Asp Pro Ala Ser Asp Gln Met Gln His Trp Lys 1 5 10 15 Glu Gln Arg Ala Ala Gln Lys Ala Asp Val Leu Thr Thr Gly Ala Gly 20 25 30 Asn Pro Val Gly Asp Lys Leu Asn Val Ile Thr Val Gly Pro Arg Gly 35 40 45 Pro Leu Leu Val Gln Asp Val Val Phe Thr Asp Glu Met Ala His Phe 50 55 60 Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly 65 70 75 80 Ala Phe Gly Tyr Phe Glu Val Thr His Asp Ile Thr Lys Tyr Ser Lys 85 90 95 Ala Lys Val Phe Glu His Ile Gly Lys Lys Thr Pro Ile Ala Val Arg 100 105 110 Phe Ser Thr Val Ala Gly Glu Ser Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp 115 120 125 Pro Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Asp Gly Asn Trp Asp 130 135 140 Leu Val Gly Asn Asn 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gagagagttg tgcatgctaa aggagcaggg 240 gcctttggct actttgaggt cacacatgac attaccaaat actccaaggc aaaggtattt 300 gagcatattg gaaagaagac tcccatcgca gttcggttct ccactgttgc tggagaatcg 360 ggttcagctg acacagttcg ggaccctcgt gggtttgcag tgaaatttta cacagaagat 420 ggtaactggg atctcgttgg aaataacacc cccattttct tcatcaggga tcccatattg 480 tttccatctt ttatccacag ccaaaagaga aatcctcaga cacatctgaa ggatccggac 540 atggtctggg acttctggag cctacgtcct gagtctctgc atcaggtttc tttcttgttc 600 agtgatcggg ggattccaga tggacatcgc cacatgaatg gatatggatc acatactttc 660 aagctggtta atgcaaatgg ggaggcagtt tattgcaaat tccattataa gactgaccag 720 ggcatcaaaa acctttctgt tgaagatgcg gcgagacttt cccaggaaga tcctgactat 780 ggcatccggg atctttttaa cgccattgcc acaggaaagt acccctcctg gactttttac 840 atccaggtca tgacatttaa tcaggcagaa acttttccat ttaatccatt cgatctcacc 900 aaggtttggc ctcacaagga ctaccctctc atcccagttg gtaaactggt cttaaaccgg 960 aatccagtta attactttgc tgaggttgaa cagatagcct tcgacccaag caacatgcca 1020 cctggcattg aggccagtcc tgacaaaatg cttcagggcc gcctttttgc ctatcctgac 1080 actcaccgcc atcgcctggg acccaattat cttcatatac ctgtgaactg tccctaccgt 1140 gctcgagtgg ccaactacca gcgtgacggc ccgatgtgca tgcaggacaa tcagggtggt 1200 gctccaaatt actaccccaa cagctttggt gctccggaac aacagccttc tgccctggag 1260 cacagcatcc aatattctgg agaagtgcgg agattcaaca ctgccaatga tgataacgtt 1320 actcaggtgc gggcattcta tgtgaacgtg ctgaatgagg aacagaggaa acgtctgtgt 1380 gagaacattg ccggccacct gaaggatgca caaattttca tccagaagaa agcggtcaag 1440 aacttcactg aggtccaccc tgactacggg agccacatcc aggctcttct ggacaagtac 1500 aatgctgaga agcctaagaa tgcgattcac acctttgtgc agtccggatc tcacttggcg 1560 gcaagggagc aagcttcgaa ttctgcagtc gacgccaaca ttgaagccat cattgcctct 1620 gaaaaagaag tatggaacag agaaaaattg actctccaga aatctttgaa aagggcagag 1680 gctgaagtat acaaactgaa agctgaacta agaaatgact ctttacttca aactctgagc 1740 cctgattctg aacatgtcac tttaaagaga atttatggtc atcgagtcac aggttctgtt 1800 tccatcaata gagatggctt tggactgaat caaggtgcag aaaagactgg atccaccgga 1860 tctagataa 1869 <210> 9 <211> 1248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of dsRed-PACT <400> 9 atggacaaca ccgaggacgt catcaaggag ttcatgcagt tcaaggtgcg catggagggc 60 tccgtgaacg gccactactt cgagatcgag ggcgagggcg agggcaagcc ctacgagggc 120 acccagaccg ccaagctgca ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180 ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240 gactacatga agctgtcctt ccccgagggc ttcacctggg agcgctccat gaacttcgag 300 gacggcggcg tggtggaggt gcagcaggac tcctccctgc aggacggcac cttcatctac 360 aaggtgaagt tcaagggcgt gaacttcccc gccgacggcc ccgtaatgca gaagaagact 420 gccggctggg agccctccac cgagaagctg tacccccagg acggcgtgct gaagggcgag 480 atctcccacg ccctgaagct gaaggacggc ggccactaca cctgcgactt caagaccgtg 540 tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcaaccact acgtggactc caagctggac 600 atcaccaacc acaacgagga ctacaccgtg gtggagcagt acgagcacgc cgaggcccgc 660 cactccggct cccagtccgg actcagatct cgagctcaag cttcgaattc tgcagtcgac 720 gccaacattg aagccatcat tgcctctgaa aaagaagtat ggaacagaga aaaattgact 780 ctccagaaat ctttgaaaag ggcagaggct gaagtataca aactgaaagc tgaactaaga 840 aatgactctt tacttcaaac tctgagccct gattctgaac atgtcacttt aaagagaatt 900 tatggtaaat acttgagggc agaaagtttt cgaaaggctc tcatttacca gaagaaatac 960 ctgctgctgt tactgggtgg gttccaggaa tgtgaagatg ccaccttggc cctgcttgcc 1020 cggatggggg ggcagccagc tttcacggat ctagaggtga tcaccaatcg cccaaagggc 1080 ttcaccaggt ttcggtcggc cgtcagagta tccattgcaa tttccagaat gaaatttttg 1140 gttcgacggt ggcatcgagt cacaggttct gtttccatca atattaacag agatggcttt 1200 ggactgaatc aaggtgcaga aaagactgga tccaccggat ctagataa 1248 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cat Primer_F <400> 10 ctaccggtat ggctgacagc c 21 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cat Primer_R <400> 11 cgaagcttgc tcccttgccg ccaagtga 28 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PACT Primer_F <400> 12 gagcaagctt cgaattctgc 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PACT Primer_R <400> 13 acaagttaac aacaacaatt gca 23 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> delPACT Primer_F <400> 14 aagagaattt atggtcatcg agtcacaggt tctgt 35 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> delPACT Primer_R <400> 15 accataaatt ctctttaaag tgac 24 <210> 16 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Motif 1 (aa 62-105) of PACT domain <400> 16 Lys Tyr Leu Arg Ala Glu Ser Phe Arg Lys Ala Leu Ile Tyr Gln Lys 1 5 10 15 Lys Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Gly Gly Phe Gln Glu Cys Glu Asp Ala 20 25 30 Thr Leu Ala Leu Leu Ala Arg Met Gly Gly Gln Pro 35 40 <210> 17 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Motif 1 (aa 122-143) of PACT domain <400> 17 Arg Phe Arg Ser Ala Val Arg Val Ser Ile Ala Ile Ser Arg Met Lys 1 5 10 15 Phe Leu Val Arg Arg Trp 20 <210> 18 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Motif 1 (aa 62-143) of PACT domain <400> 18 Lys Tyr Leu Arg Ala Glu Ser Phe Arg Lys Ala Leu Ile Tyr Gln Lys 1 5 10 15 Lys Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Gly Gly Phe Gln Glu Cys Glu Asp Ala 20 25 30 Thr Leu Ala Leu Leu Ala Arg Met Gly Gly Gln Pro Ala Phe Thr Asp 35 40 45 Leu Glu Val Ile Thr Asn Arg Pro Lys Gly Phe Thr Arg Phe Arg Ser 50 55 60 Ala Val Arg Val Ser Ile Ala Ile Ser Arg Met Lys Phe Leu Val Arg 65 70 75 80 Arg Trp

Claims

서열번호 1의 1번째부터 523번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 523 내지 527개의 아미노산으로 이루어진 카탈라제; 및
서열번호 62번째부터 105번째까지의 영역 (서열번호 16)을 포함하는 44개 내지 168개의 아미노산, 122번째부터 143번째까지의 영역 (서열번호 17)을 포함하는 연속하는 22개 내지 168개의 아미노산, 또는 62번째부터 143번째까지의 영역 (서열번호 18)을 포함하는 연속하는 82개 내지 168개의 아미노산을 포함하는 PACT (pericentrin-AKAP450 centrosomal targeting) 도메인
을 포함하는 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
제1항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
제3항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도로 표현되는 것인, 재조합 벡터.
제5항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
제8항에 있어서, 상기 세포는 포유동물의 세포인 것인, 재조합 세포.
제1항의 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기 서열을 포함하는 것인, 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 암은 대장, 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 정소, 전립선, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 혈액, 뼈, 뇌, 또는 피부의 암인, 약학 조성물.
제1항의 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 인간을 제외한 포유류, 또는 인간을 포함한 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 주기 조절 방법.