KR20010029352A

KR20010029352A - 인간세포의 인산화 효소 ｊｎｋ의 활성 조절인자로 작용하는 마우스의 ｓｋｉｐ 단백질 및 ｓｋｉｐ 유전자

Info

Publication number: KR20010029352A
Application number: KR1019990042118A
Authority: KR
Inventors: 한평림; 최의주; 이고운; 이자경; 최인영; 이시형
Original assignee: 복성해; 한국생명공학연구원
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2001-04-06
Anticipated expiration: 2019-09-30
Also published as: KR100337189B1

Abstract

본 발명은 다양한 종류의 스트레스에 의하여 활성화되는 사람 세포 내의 인산화 효소인 JNK/SAPK (c-Jun N-terminal kinase/Stress-Activated Protein Kinase)의 활성을 선택적으로 억제하거나 조절할 수 있는 마우스의 SKIP (SAPK-interacting protein) 단백질, SKIP 유전자 및 그 용도에 관한 것으로, 본 발명의 마우스 SKIP 단백질 또는 SKIP 유전자는 사람의 JNK/SAPK 활성에 대한 선택적인 저해제로 사용하거나 치매 등의 퇴행성 뇌신경계 질환, 뇌졸중, 면역계 질환 등의 치료, 예방, 진단 또는 그 연구 과정 등에 이용할 수 있다.

Description

인간 세포의 인산화 효소 ＪＮＫ의 활성 조절인자로 작용하는 마우스의 ＳＫＩＰ 단백질 및 ＳＫＩＰ 유전자 {Mouse SKIP protein and SKIP gene as a regulator of human JNK}

＜110＞ Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

＜120＞ Mouse SKIP protein and gene as a regulator of human JNK activity

＜130＞ 9p-08-06

＜160＞ 15

＜170＞ KOPATIN 1.5

＜210＞ 1

＜211＞ 2458

＜212＞ DNA

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 1

ccgggcaggt cgcatctgag ggttgggcca ggaagagttg gggctggggc ctgggtcggc 60

agctgcggcc tcctctctgg cccatctatt tttaatgagc tccccaggct tctgcagccg 120

gccggatgca gaaaggcagg cccagttggt ggaggccaga agtcccagcc ctgccttgag 180

ctctggcccc cctacccttc tgggcatgag agggcagccc tggagccccg cagccccctg 240

gccgggcagg gctcttcatg cagctggtac tgaagatgga ttcgagccca gacaatgaca 300

gctggttgga ggatcagtgg gagcactggc tcacccatga catcagcctg gaggagtttg 360

aggatgaaga cctttcggag atcactgacg agtgtggcat cagcctgcag tgcaaagaca 420

ccctgtctct ccggatggac ctgatcgacg cggcaggtga cactccgggc gccgaggacg 480

acgaggagga ggaggacgac gagctcgctg cccaacgacc aggagtgggg cctcccaaag 540

cggagtccaa ccaggatccg gcgcctcgca gccagggcca gggcgcgaca ggcagcggag 600

acacctaccg acccaagagg cctaccacgc tcaacctttt cccgcaggtg ccgcggtctc 660

aggacacgct gaataataac tctttaggca aaaagcacag ttggcaggac cgtgtgtctc 720

gatcatcctc ccctctgaag acaggagaac agacgcctcc acatgaacac atctgcctga 780

gtgatgagct gccaccccag ggcagtcctg ttcccaccca ggaccgcggc acttccaccg 840

acagcccttg tcgccgaagt gcagccaccc agatggcacc tccaagcggt ccccctgcca 900

ctgcgcctgg tggccggggc cactcccatc gagaccgaat ccactaccag gcagatgtgc 960

ggctcgaggc gactgaggag atctacctga ccccagtgca gaggccccca gaccctgcag 1020

aacccacctc caccttcatg ccacccacgg agagccggat gtcagttagc tccgatccag 1080

accctgccgc ttactctgta actgcggggc ggccacaccc ctccatcagt gaagaggatg 1140

agggcttcga ctgcctgtca tccccagagc gagctgagcc accaggtgga gggtggcggg 1200

gaagcctcgg ggagccacca ccgcctccac gggcctcact gagctcggac accagcgcac 1260

tgtcctacga ctcggtcaag tacacactgg tggtggatga acatgcccag cttgagttgg 1320

tgagcctgcg gccgtgcttt ggagattaca gtgacgaaag cgactctgcc actgtctatg 1380

acaactgtgc ctctgcctcc tcgccctacg agtcagccat tggtgaggag tatgaggagg 1440

cccctcagcc ccggcctccc acctgcctct cagaggactc caccccggat gagcctgatg 1500

tccacttctc taagaagttt ctgaatgtct tcatgagtgg ccgctctcgt tcctccagtg 1560

ctgagtcctt tgggctgttc tcctgcgtca tcaatgggga ggagcatgag caaacccatc 1620

gggctatatt caggtttgtg cctcggcatg aagatgaact tgagctggaa gtggatgacc 1680

ccctgctggt ggagctgcag gcagaagact attggtatga ggcctataac atgcgcaccg 1740

gagcccgcgg ggtcttccct gcctactatg ccattgaggt caccaaggag cctgagcaca 1800

tggcagccct tgccaaaaac agcgactgga ttgaccagtt ccgggtgaag ttcctggggt 1860

ctgtccaggt tccttatcac aagggcaatg atgtcctctg tgctgctatg caaaagatcg 1920

ccaccacccg cccccggctc accgtgcact ttaacccgcc ctccagctgt gtccttgaga 1980

tcagtgtcag gggtgtcaag ataggcgtca aagctgatga tgctctggag gccaagggaa 2040

ataaatgtag ccacttcttc cagctaaaga acatctcttt ctgtggatac catccaaaga 2100

ataacaagta ctttgggttt atcactaagc accctgctga ccaccggttt gcctgccatg 2160

tctttgtgtc tgaagattcc accaaagccc tggcggagtc tgtggggcgt gcatttcagc 2220

agttctacaa gcagtttgtg gagtatacct gtcctacaga agatatctac ttggagtagc 2280

agcaccccca ctctctgcag cccctcagcc ccaagccagt gcaaggacag ctggctgctg 2340

acaggatgtg gtactgccac aaaagaatgg gggaatgagg gctgttgggt cgggggggcc 2400

ggggtttggg gagaggcaga tgcagtttat tgtaatatat ggggttagat taatctat 2458

＜210＞ 2

＜211＞ 673

＜212＞ PRT

＜213＞ Mus musculus

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (127)..(281)

＜223＞ JNK Binding Domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (320)..(324)

＜223＞ Proline-rich domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (448)..(510)

＜223＞ SH3 domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (493)..(558)

＜223＞ Helix-Loop-Helix motif

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (527)..(662)

＜223＞ Phosphotyrosine Interaction Domain

＜400＞ 2

Met Gln Leu Val Leu Lys Met Asp Ser Ser Pro Asp Asn Asp Ser Trp

1 5 10 15

Leu Glu Asp Gln Trp Glu His Trp Leu Thr His Asp Ile Ser Leu Glu

20 25 30

Glu Phe Glu Asp Glu Asp Leu Ser Glu Ile Thr Asp Glu Cys Gly Ile

35 40 45

Ser Leu Gln Cys Lys Asp Thr Leu Ser Leu Arg Met Asp Leu Ile Asp

50 55 60

Ala Ala Gly Asp Thr Pro Gly Ala Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Asp

65 70 75 80

Asp Glu Leu Ala Ala Gln Arg Pro Gly Val Gly Pro Pro Lys Ala Glu

85 90 95

Ser Asn Gln Asp Pro Ala Pro Arg Ser Gln Gly Gln Gly Ala Thr Gly

100 105 110

Ser Gly Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe

115 120 125

Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr Leu Asn Asn Asn Ser Leu Gly

130 135 140

Lys Lys His Ser Trp Gln Asp Arg Val Ser Arg Ser Ser Ser Pro Leu

145 150 155 160

Lys Thr Gly Glu Gln Thr Pro Pro His Glu His Ile Cys Leu Ser Asp

165 170 175

Glu Leu Pro Pro Gln Gly Ser Pro Val Pro Thr Gln Asp Arg Gly Thr

180 185 190

Ser Thr Asp Ser Pro Cys Arg Arg Ser Ala Ala Thr Gln Met Ala Pro

195 200 205

Pro Ser Gly Pro Pro Ala Thr Ala Pro Gly Gly Arg Gly His Ser His

210 215 220

Arg Asp Arg Ile His Tyr Gln Ala Asp Val Arg Leu Glu Ala Thr Glu

225 230 235 240

Glu Ile Tyr Leu Thr Pro Val Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Glu Pro

245 250 255

Thr Ser Thr Phe Met Pro Pro Thr Glu Ser Arg Met Ser Val Ser Ser

260 265 270

Asp Pro Asp Pro Ala Ala Tyr Ser Val Thr Ala Gly Arg Pro His Pro

275 280 285

Ser Ile Ser Glu Glu Asp Glu Gly Phe Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu

290 295 300

Arg Ala Glu Pro Pro Gly Gly Gly Trp Arg Gly Ser Leu Gly Glu Pro

305 310 315 320

Pro Pro Pro Pro Arg Ala Ser Leu Ser Ser Asp Thr Ser Ala Leu Ser

325 330 335

Tyr Asp Ser Val Lys Tyr Thr Leu Val Val Asp Glu His Ala Gln Leu

340 345 350

Glu Leu Val Ser Leu Arg Pro Cys Phe Gly Asp Tyr Ser Asp Glu Ser

355 360 365

Asp Ser Ala Thr Val Tyr Asp Asn Cys Ala Ser Ala Ser Ser Pro Tyr

370 375 380

Glu Ser Ala Ile Gly Glu Glu Tyr Glu Glu Ala Pro Gln Pro Arg Pro

385 390 395 400

Pro Thr Cys Leu Ser Glu Asp Ser Thr Pro Asp Glu Pro Asp Val His

405 410 415

Phe Ser Lys Lys Phe Leu Asn Val Phe Met Ser Gly Arg Ser Arg Ser

420 425 430

Ser Ser Ala Glu Ser Phe Gly Leu Phe Ser Cys Val Ile Asn Gly Glu

435 440 445

Glu His Glu Gln Thr His Arg Ala Ile Phe Arg Phe Val Pro Arg His

450 455 460

Glu Asp Glu Leu Glu Leu Glu Val Asp Asp Pro Leu Leu Val Glu Leu

465 470 475 480

Gln Ala Glu Asp Tyr Trp Tyr Glu Ala Tyr Asn Met Arg Thr Gly Ala

485 490 495

Arg Gly Val Phe Pro Ala Tyr Tyr Ala Ile Glu Val Thr Lys Glu Pro

500 505 510

Glu His Met Ala Ala Leu Ala Lys Asn Ser Asp Trp Ile Asp Gln Phe

515 520 525

Arg Val Lys Phe Leu Gly Ser Val Gln Val Pro Tyr His Lys Gly Asn

530 535 540

Asp Val Leu Cys Ala Ala Met Gln Lys Ile Ala Thr Thr Arg Pro Arg

545 550 555 560

Leu Thr Val His Phe Asn Pro Pro Ser Ser Cys Val Leu Glu Ile Ser

565 570 575

Val Arg Gly Val Lys Ile Gly Val Lys Ala Asp Asp Ala Leu Glu Ala

580 585 590

Lys Gly Asn Lys Cys Ser His Phe Phe Gln Leu Lys Asn Ile Ser Phe

595 600 605

Cys Gly Tyr His Pro Lys Asn Asn Lys Tyr Phe Gly Phe Ile Thr Lys

610 615 620

His Pro Ala Asp His Arg Phe Ala Cys His Val Phe Val Ser Glu Asp

625 630 635 640

Ser Thr Lys Ala Leu Ala Glu Ser Val Gly Arg Ala Phe Gln Gln Phe

645 650 655

Tyr Lys Gln Phe Val Glu Tyr Thr Cys Pro Thr Glu Asp Ile Tyr Leu

660 665 670

Glu

＜210＞ 3

＜211＞ 2340

＜212＞ DNA

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 3

ccgggcaggt cccggatggc cagggctgca ccccggaatg gcggagcgag agagcggcct 60

gggcgggggc gccgcgtccc caccggccgc ttccccattc ctgggactgc acatcgcgtc 120

gcctcccaat ttcaggctca cccatgacat cagcctggag gagtttgagg atgaagacct 180

ttcggagatc actgacgagt gtggcatcag cctgcagtgc aaagacaccc tgtctctccg 240

gcccccgcgc gccgggctgc tgtctgcggg tagcagcggc agcgcgggga gccggctgca 300

ggcggagatg ctgcagatgg acctgatcga cgcggcaggt gacactccgg gcgccgagga 360

cgacgaggag gaggaggacg acgagctcgc tgcccaacga ccaggagtgg ggcctcccaa 420

agcggagtcc aaccaggatc cggcgcctcg cagccagggc cagggcgcga caggcagcgg 480

agacacctac cgacccaaga ggcctaccac gctcaacctt ttcccgcagg tgccgcggtc 540

tcaggacacg ctgaataata actctttagg caaaaagcac agttggcagg accgtgtgtc 600

tcgatcatcc tcccctctga agacaggaga acagacgcct ccacatgaac acatctgcct 660

gagtgatgag ctgccacccc agggcagtcc tgttcccacc caggaccgcg gcacttccac 720

cgacagccct tgtcgccgaa gtgcagccac ccagatggca cctccaagcg gtccccctgc 780

cactgcgcct ggtggccggg gccactccca tcgagaccga atccactacc aggcagatgt 840

gcggctcgag gcgactgagg agatctacct gaccccagtg cagaggcccc cagaccctgc 900

agaacccacc tccaccttca tgccacccac ggagagccgg atgtcagtta gctccgatcc 960

agaccctgcc gcttactctg taactgcggg gcggccacac ccctccatca gtgaagagga 1020

tgagggcttc gactgcctgt catccccaga gcgagctgag ccaccaggtg gagggtggcg 1080

gggaagcctc ggggagccac caccgcctcc acgggcctca ctgagctcgg acaccagcgc 1140

actgtcctac gactcggtca agtacacact ggtggtggat gaacatgccc agcttgagtt 1200

ggtgagcctg cggccgtgct ttggagatta cagtgacgaa agcgactctg ccactgtcta 1260

tgacaactgt gcctctgcct cctcgcccta cgagtcagcc attggtgagg agtatgagga 1320

ggcccctcag ccccggcctc ccacctgcct ctcagaggac tccaccccgg atgagcctga 1380

tgtccacttc tctaagaagt ttctgaatgt cttcatgagt ggccgctctc gttcctccag 1440

tgctgagtcc tttgggctgt tctcctgcgt catcaatggg gaggagcatg agcaaaccca 1500

tcgggctata ttcaggtttg tgcctcggca tgaagatgaa cttgagctgg aagtggatga 1560

ccccctgctg gtggagctgc aggcagaaga ctattggtat gaggcctata acatgcgcac 1620

cggagcccgc ggggtcttcc ctgcctacta tgccattgag gtcaccaagg agcctgagca 1680

catggcagcc cttgccaaaa acagcgactg gattgaccag ttccgggtga agttcctggg 1740

gtctgtccag gttccttatc acaagggcaa tgatgtcctc tgtgctgcta tgcaaaagat 1800

cgccaccacc cgcccccggc tcaccgtgca ctttaacccg ccctccagct gtgtccttga 1860

gatcagtgtc aggggtgtca agataggcgt caaagctgat gatgctctgg aggccaaggg 1920

aaataaatgt agccacttct tccagctaaa gaacatctct ttctgtggat accatccaaa 1980

gaataacaag tactttgggt ttatcactaa gcaccctgct gaccaccggt ttgcctgcca 2040

tgtctttgtg tctgaagatt ccaccaaagc cctggcggag tctgtggggc gtgcatttca 2100

gcagttctac aagcagtttg tggagtatac ctgtcctaca gaagatatct acttggagta 2160

gcagcacccc cactctctgc agcccctcag ccccaagcca gtgcaaggac agctggctgc 2220

tgacaggatg tggtactgcc acaaaagaat gggggaatga gggctgttgg gtcggggggg 2280

ccggggtttg gggagaggca gatgcagttt attgtaatat atggggttag attaatctat 2340

2340

＜210＞ 4

＜211＞ 707

＜212＞ PRT

＜213＞ Mus musculus

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (127)..(281)

＜223＞ JNK Binding Domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (354)..(358)

＜223＞ Proline-rich Domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (482)..(544)

＜223＞ SH3 domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (528)..(592)

＜223＞ Helix-Loop-Helix motif

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (561)..(696)

＜223＞ Phosphotyrosine Interaction Domain

＜400＞ 4

Met Ala Glu Arg Glu Ser Gly Leu Gly Gly Gly Ala Ala Ser Pro Pro

1 5 10 15

Ala Ala Ser Pro Phe Leu Gly Leu His Ile Ala Ser Pro Pro Asn Phe

20 25 30

Arg Leu Thr His Asp Ile Ser Leu Glu Glu Phe Glu Asp Glu Asp Leu

35 40 45

Ser Glu Ile Thr Asp Glu Cys Gly Ile Ser Leu Gln Cys Lys Asp Thr

50 55 60

Leu Ser Leu Arg Pro Pro Arg Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gly Ser Ser

65 70 75 80

Gly Ser Ala Gly Ser Arg Leu Gln Ala Glu Met Leu Gln Met Asp Leu

85 90 95

Ile Asp Ala Ala Gly Asp Thr Pro Gly Ala Glu Asp Asp Glu Glu Glu

100 105 110

Glu Asp Asp Glu Leu Ala Ala Gln Arg Pro Gly Val Gly Pro Pro Lys

115 120 125

Ala Glu Ser Asn Gln Asp Pro Ala Pro Arg Ser Gln Gly Gln Gly Ala

130 135 140

Thr Gly Ser Gly Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn

145 150 155 160

Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr Leu Asn Asn Asn Ser

165 170 175

Leu Gly Lys Lys His Ser Trp Gln Asp Arg Val Ser Arg Ser Ser Ser

180 185 190

Pro Leu Lys Thr Gly Glu Gln Thr Pro Pro His Glu His Ile Cys Leu

195 200 205

Ser Asp Glu Leu Pro Pro Gln Gly Ser Pro Val Pro Thr Gln Asp Arg

210 215 220

Gly Thr Ser Thr Asp Ser Pro Cys Arg Arg Ser Ala Ala Thr Gln Met

225 230 235 240

Ala Pro Pro Ser Gly Pro Pro Ala Thr Ala Pro Gly Gly Arg Gly His

245 250 255

Ser His Arg Asp Arg Ile His Tyr Gln Ala Asp Val Arg Leu Glu Ala

260 265 270

Thr Glu Glu Ile Tyr Leu Thr Pro Val Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala

275 280 285

Glu Pro Thr Ser Thr Phe Met Pro Pro Thr Glu Ser Arg Met Ser Val

290 295 300

Ser Ser Asp Pro Asp Pro Ala Ala Tyr Ser Val Thr Ala Gly Arg Pro

305 310 315 320

His Pro Ser Ile Ser Glu Glu Asp Glu Gly Phe Asp Cys Leu Ser Ser

325 330 335

Pro Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly Gly Gly Trp Arg Gly Ser Leu Gly

340 345 350

Glu Pro Pro Pro Pro Pro Arg Ala Ser Leu Ser Ser Asp Thr Ser Ala

355 360 365

Leu Ser Tyr Asp Ser Val Lys Tyr Thr Leu Val Val Asp Glu His Ala

370 375 380

Gln Leu Glu Leu Val Ser Leu Arg Pro Cys Phe Gly Asp Tyr Ser Asp

385 390 395 400

Glu Ser Asp Ser Ala Thr Val Tyr Asp Asn Cys Ala Ser Ala Ser Ser

405 410 415

Pro Tyr Glu Ser Ala Ile Gly Glu Glu Tyr Glu Glu Ala Pro Gln Pro

420 425 430

Arg Pro Pro Thr Cys Leu Ser Glu Asp Ser Thr Pro Asp Glu Pro Asp

435 440 445

Val His Phe Ser Lys Lys Phe Leu Asn Val Phe Met Ser Gly Arg Ser

450 455 460

Arg Ser Ser Ser Ala Glu Ser Phe Gly Leu Phe Ser Cys Val Ile Asn

465 470 475 480

Gly Glu Glu His Glu Gln Thr His Arg Ala Ile Phe Arg Phe Val Pro

485 490 495

Arg His Glu Asp Glu Leu Glu Leu Glu Val Asp Asp Pro Leu Leu Val

500 505 510

Glu Leu Gln Ala Glu Asp Tyr Trp Tyr Glu Ala Tyr Asn Met Arg Thr

515 520 525

Gly Ala Arg Gly Val Phe Pro Ala Tyr Tyr Ala Ile Glu Val Thr Lys

530 535 540

Glu Pro Glu His Met Ala Ala Leu Ala Lys Asn Ser Asp Trp Ile Asp

545 550 555 560

Gln Phe Arg Val Lys Phe Leu Gly Ser Val Gln Val Pro Tyr His Lys

565 570 575

Gly Asn Asp Val Leu Cys Ala Ala Met Gln Lys Ile Ala Thr Thr Arg

580 585 590

Pro Arg Leu Thr Val His Phe Asn Pro Pro Ser Ser Cys Val Leu Glu

595 600 605

Ile Ser Val Arg Gly Val Lys Ile Gly Val Lys Ala Asp Asp Ala Leu

610 615 620

Glu Ala Lys Gly Asn Lys Cys Ser His Phe Phe Gln Leu Lys Asn Ile

625 630 635 640

Ser Phe Cys Gly Tyr His Pro Lys Asn Asn Lys Tyr Phe Gly Phe Ile

645 650 655

Thr Lys His Pro Ala Asp His Arg Phe Ala Cys His Val Phe Val Ser

660 665 670

Glu Asp Ser Thr Lys Ala Leu Ala Glu Ser Val Gly Arg Ala Phe Gln

675 680 685

Gln Phe Tyr Lys Gln Phe Val Glu Tyr Thr Cys Pro Thr Glu Asp Ile

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Tyr Leu Glu

705

＜210＞ 5

＜211＞ 2403

＜212＞ DNA

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 5

ccgggcaggt cccagttggt ggaggccaga agtcccagcc ctgccttgag ctctggcccc 60

cctacccttc tgggcatgag agggcagccc tggagccccg cagccccctg gccgggcagg 120

gctcttcatg cagctggtac tgaagatgga ttcgagccca gacaatgaca gctggttgga 180

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cctttcggag atcactgacg agtgtggcat cagcctgcag tgcaaagaca ccctgtctct 300

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caccggagcc cgcggggtct tccctgccta ctatgccatt gaggtcacca aggagcctga 1740

gcacatggca gcccttgcca aaaacagcga ctggattgac cagttccggg tgaagttcct 1800

ggggtctgtc caggttcctt atcacaaggg caatgatgtc ctctgtgctg ctatgcaaaa 1860

gatcgccacc acccgccccc ggctcaccgt gcactttaac ccgccctcca gctgtgtcct 1920

tgagatcagt gtcaggggtg tcaagatagg cgtcaaagct gatgatgctc tggaggccaa 1980

gggaaataaa tgtagccact tcttccagct aaagaacatc tctttctgtg gataccatcc 2040

aaagaataac aagtactttg ggtttatcac taagcaccct gctgaccacc ggtttgcctg 2100

ccatgtcttt gtgtctgaag attccaccaa agccctggcg gagtctgtgg ggcgtgcatt 2160

tcagcagttc tacaagcagt ttgtggagta tacctgtcct acagaagata tctacttgga 2220

gtagcagcac ccccactctc tgcagcccct cagccccaag ccagtgcaag gacagctggc 2280

tgctgacagg atgtggtact gccacaaaag aatgggggaa tgagggctgt tgggtcgggg 2340

gggccggggt ttggggagag gcagatgcag tttattgtaa tatatggggt tagattaatc 2400

tat 2403

＜210＞ 6

＜211＞ 698

＜212＞ PRT

＜213＞ Mus musculus

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (118)..(272)

＜223＞ JNK Binding Domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (345)..(349)

＜223＞ Proline-rich domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (473)..(535)

＜223＞ SH3 domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (518)..(583)

＜223＞ Helix-Loop-Helix motif

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (552)..(685)

＜223＞ Phosphotyrosine Interaction Domain

＜400＞ 6

Met Gln Leu Val Leu Lys Met Asp Ser Ser Pro Asp Asn Asp Ser Trp

1 5 10 15

Leu Glu Asp Gln Trp Glu His Trp Leu Thr His Asp Ile Ser Leu Glu

20 25 30

Glu Phe Glu Asp Glu Asp Leu Ser Glu Ile Thr Asp Glu Cys Gly Ile

35 40 45

Ser Leu Gln Cys Lys Asp Thr Leu Ser Leu Arg Pro Pro Arg Ala Gly

50 55 60

Leu Leu Ser Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ala Gly Ser Arg Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Met Leu Gln Met Asp Leu Ile Asp Ala Ala Gly Asp Thr Pro Gly

85 90 95

Ala Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Leu Ala Ala Gln Arg

100 105 110

Pro Gly Val Gly Pro Pro Lys Ala Glu Ser Asn Gln Asp Pro Ala Pro

115 120 125

Arg Ser Gln Gly Gln Gly Ala Thr Gly Ser Gly Asp Thr Tyr Arg Pro

130 135 140

Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln

145 150 155 160

Asp Thr Leu Asn Asn Asn Ser Leu Gly Lys Lys His Ser Trp Gln Asp

165 170 175

Arg Val Ser Arg Ser Ser Ser Pro Leu Lys Thr Gly Glu Gln Thr Pro

180 185 190

Pro His Glu His Ile Cys Leu Ser Asp Glu Leu Pro Pro Gln Gly Ser

195 200 205

Pro Val Pro Thr Gln Asp Arg Gly Thr Ser Thr Asp Ser Pro Cys Arg

210 215 220

Arg Ser Ala Ala Thr Gln Met Ala Pro Pro Ser Gly Pro Pro Ala Thr

225 230 235 240

Ala Pro Gly Gly Arg Gly His Ser His Arg Asp Arg Ile His Tyr Gln

245 250 255

Ala Asp Val Arg Leu Glu Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Leu Thr Pro Val

260 265 270

Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Glu Pro Thr Ser Thr Phe Met Pro Pro

275 280 285

Thr Glu Ser Arg Met Ser Val Ser Ser Asp Pro Asp Pro Ala Ala Tyr

290 295 300

Ser Val Thr Ala Gly Arg Pro His Pro Ser Ile Ser Glu Glu Asp Glu

305 310 315 320

Gly Phe Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly Gly

325 330 335

Gly Trp Arg Gly Ser Leu Gly Glu Pro Pro Pro Pro Pro Arg Ala Ser

340 345 350

Leu Ser Ser Asp Thr Ser Ala Leu Ser Tyr Asp Ser Val Lys Tyr Thr

355 360 365

Leu Val Val Asp Glu His Ala Gln Leu Glu Leu Val Ser Leu Arg Pro

370 375 380

Cys Phe Gly Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Asp Ser Ala Thr Val Tyr Asp

385 390 395 400

Asn Cys Ala Ser Ala Ser Ser Pro Tyr Glu Ser Ala Ile Gly Glu Glu

405 410 415

Tyr Glu Glu Ala Pro Gln Pro Arg Pro Pro Thr Cys Leu Ser Glu Asp

420 425 430

Ser Thr Pro Asp Glu Pro Asp Val His Phe Ser Lys Lys Phe Leu Asn

435 440 445

Val Phe Met Ser Gly Arg Ser Arg Ser Ser Ser Ala Glu Ser Phe Gly

450 455 460

Leu Phe Ser Cys Val Ile Asn Gly Glu Glu His Glu Gln Thr His Arg

465 470 475 480

Ala Ile Phe Arg Phe Val Pro Arg His Glu Asp Glu Leu Glu Leu Glu

485 490 495

Val Asp Asp Pro Leu Leu Val Glu Leu Gln Ala Glu Asp Tyr Trp Tyr

500 505 510

Glu Ala Tyr Asn Met Arg Thr Gly Ala Arg Gly Val Phe Pro Ala Tyr

515 520 525

Tyr Ala Ile Glu Val Thr Lys Glu Pro Glu His Met Ala Ala Leu Ala

530 535 540

Lys Asn Ser Asp Trp Ile Asp Gln Phe Arg Val Lys Phe Leu Gly Ser

545 550 555 560

Val Gln Val Pro Tyr His Lys Gly Asn Asp Val Leu Cys Ala Ala Met

565 570 575

Gln Lys Ile Ala Thr Thr Arg Pro Arg Leu Thr Val His Phe Asn Pro

580 585 590

Pro Ser Ser Cys Val Leu Glu Ile Ser Val Arg Gly Val Lys Ile Gly

595 600 605

Val Lys Ala Asp Asp Ala Leu Glu Ala Lys Gly Asn Lys Cys Ser His

610 615 620

Phe Phe Gln Leu Lys Asn Ile Ser Phe Cys Gly Tyr His Pro Lys Asn

625 630 635 640

Asn Lys Tyr Phe Gly Phe Ile Thr Lys His Pro Ala Asp His Arg Phe

645 650 655

Ala Cys His Val Phe Val Ser Glu Asp Ser Thr Lys Ala Leu Ala Glu

660 665 670

Ser Val Gly Arg Ala Phe Gln Gln Phe Tyr Lys Gln Phe Val Glu Tyr

675 680 685

Thr Cys Pro Thr Glu Asp Ile Tyr Leu Glu

690 695

＜210＞ 7

＜211＞ 2304

＜212＞ DNA

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 7

ccgggcaggt cccgcatctg agggttgggc caggaagagt tggggctggg gcctgggtcg 60

gcagctgcgg cctcctctct ggcccatcta tttttaatga gctacccatg acatcagcct 120

ggaggagttt gaggatgaag acctttcgga gatcactgac gagtgtggca tcagcctgca 180

gtgcaaagac accctgtctc tccggccccc gcgcgccggg ctgctgtctg cgggtagcag 240

cggcagcgcg gggagccggc tgcaggcgga gatgctgcag atggacctga tcgacgcggc 300

aggtgacact ccgggcgccg aggacgacga ggaggaggag gacgacgagc tcgctgccca 360

acgaccagga gtggggcctc ccaaagcgga gtccaaccag gatccggcgc ctcgcagcca 420

gggccagggc gcgacaggca gcggagacac ctaccgaccc aagaggccta ccacgctcaa 480

ccttttcccg caggtgccgc ggtctcagga cacgctgaat aataactctt taggcaaaaa 540

gcacagttgg caggaccgtg tgtctcgatc atcctcccct ctgaagacag gagaacagac 600

gcctccacat gaacacatct gcctgagtga tgagctgcca ccccagggca gtcctgttcc 660

cacccaggac cgcggcactt ccaccgacag cccttgtcgc cgaagtgcag ccacccagat 720

ggcacctcca agcggtcccc ctgccactgc gcctggtggc cggggccact cccatcgaga 780

ccgaatccac taccaggcag atgtgcggct cgaggcgact gaggagatct acctgacccc 840

agtgcagagg cccccagacc ctgcagaacc cacctccacc ttcatgccac ccacggagag 900

ccggatgtca gttagctccg atccagaccc tgccgcttac tctgtaactg cggggcggcc 960

acacccctcc atcagtgaag aggatgaggg cttcgactgc ctgtcatccc cagagcgagc 1020

tgagccacca ggtggagggt ggcggggaag cctcggggag ccaccaccgc ctccacgggc 1080

ctcactgagc tcggacacca gcgcactgtc ctacgactcg gtcaagtaca cactggtggt 1140

ggatgaacat gcccagcttg agttggtgag cctgcggccg tgctttggag attacagtga 1200

cgaaagcgac tctgccactg tctatgacaa ctgtgcctct gcctcctcgc cctacgagtc 1260

agccattggt gaggagtatg aggaggcccc tcagccccgg cctcccacct gcctctcaga 1320

ggactccacc ccggatgagc ctgatgtcca cttctctaag aagtttctga atgtcttcat 1380

gagtggccgc tctcgttcct ccagtgctga gtcctttggg ctgttctcct gcgtcatcaa 1440

tggggaggag catgagcaaa cccatcgggc tatattcagg tttgtgcctc ggcatgaaga 1500

tgaacttgag ctggaagtgg atgaccccct gctggtggag ctgcaggcag aagactattg 1560

gtatgaggcc tataacatgc gcaccggagc ccgcggggtc ttccctgcct actatgccat 1620

tgaggtcacc aaggagcctg agcacatggc agcccttgcc aaaaacagcg actggattga 1680

ccagttccgg gtgaagttcc tggggtctgt ccaggttcct tatcacaagg gcaatgatgt 1740

cctctgtgct gctatgcaaa agatcgccac cacccgcccc cggctcaccg tgcactttaa 1800

cccgccctcc agctgtgtcc ttgagatcag tgtcaggggt gtcaagatag gcgtcaaagc 1860

tgatgatgct ctggaggcca agggaaataa atgtagccac ttcttccagc taaagaacat 1920

ctctttctgt ggataccatc caaagaataa caagtacttt gggtttatca ctaagcaccc 1980

tgctgaccac cggtttgcct gccatgtctt tgtgtctgaa gattccacca aagccctggc 2040

ggagtctgtg gggcgtgcat ttcagcagtt ctacaagcag tttgtggagt atacctgtcc 2100

tacagaagat atctacttgg agtagcagca cccccactct ctgcagcccc tcagccccaa 2160

gccagtgcaa ggacagctgg ctgctgacag gatgtggtac tgccacaaaa gaatggggga 2220

atgagggctg ttgggtcggg ggggccgggg tttggggaga ggcagatgca gtttattgta 2280

atatatgggg ttagattaat ctat 2304

＜210＞ 8

＜211＞ 617

＜212＞ PRT

＜213＞ Mus musculus

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (37)..(191)

＜223＞ JNK Binding Domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (264)..(268)

＜223＞ Proline-rich Domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (392)..(454)

＜223＞ SH3 Domain

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (437)..(502)

＜223＞ Helix-Loop-Helix motif

＜220＞

＜221＞ DOMAIN

＜222＞ (471)..(606)

＜223＞ Phosphotyrosine Interaction Domain

＜400＞ 8

Met Leu Gln Met Asp Leu Ile Asp Ala Ala Gly Asp Thr Pro Gly Ala

1 5 10 15

Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Leu Ala Ala Gln Arg Pro

20 25 30

Gly Val Gly Pro Pro Lys Ala Glu Ser Asn Gln Asp Pro Ala Pro Arg

35 40 45

Ser Gln Gly Gln Gly Ala Thr Gly Ser Gly Asp Thr Tyr Arg Pro Lys

50 55 60

Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp

65 70 75 80

Thr Leu Asn Asn Asn Ser Leu Gly Lys Lys His Ser Trp Gln Asp Arg

85 90 95

Val Ser Arg Ser Ser Ser Pro Leu Lys Thr Gly Glu Gln Thr Pro Pro

100 105 110

His Glu His Ile Cys Leu Ser Asp Glu Leu Pro Pro Gln Gly Ser Pro

115 120 125

Val Pro Thr Gln Asp Arg Gly Thr Ser Thr Asp Ser Pro Cys Arg Arg

130 135 140

Ser Ala Ala Thr Gln Met Ala Pro Pro Ser Gly Pro Pro Ala Thr Ala

145 150 155 160

Pro Gly Gly Arg Gly His Ser His Arg Asp Arg Ile His Tyr Gln Ala

165 170 175

Asp Val Arg Leu Glu Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Leu Thr Pro Val Gln

180 185 190

Arg Pro Pro Asp Pro Ala Glu Pro Thr Ser Thr Phe Met Pro Pro Thr

195 200 205

Glu Ser Arg Met Ser Val Ser Ser Asp Pro Asp Pro Ala Ala Tyr Ser

210 215 220

Val Thr Ala Gly Arg Pro His Pro Ser Ile Ser Glu Glu Asp Glu Gly

225 230 235 240

Phe Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly Gly Gly

245 250 255

Trp Arg Gly Ser Leu Gly Glu Pro Pro Pro Pro Pro Arg Ala Ser Leu

260 265 270

Ser Ser Asp Thr Ser Ala Leu Ser Tyr Asp Ser Val Lys Tyr Thr Leu

275 280 285

Val Val Asp Glu His Ala Gln Leu Glu Leu Val Ser Leu Arg Pro Cys

290 295 300

Phe Gly Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Asp Ser Ala Thr Val Tyr Asp Asn

305 310 315 320

Cys Ala Ser Ala Ser Ser Pro Tyr Glu Ser Ala Ile Gly Glu Glu Tyr

325 330 335

Glu Glu Ala Pro Gln Pro Arg Pro Pro Thr Cys Leu Ser Glu Asp Ser

340 345 350

Thr Pro Asp Glu Pro Asp Val His Phe Ser Lys Lys Phe Leu Asn Val

355 360 365

Phe Met Ser Gly Arg Ser Arg Ser Ser Ser Ala Glu Ser Phe Gly Leu

370 375 380

Phe Ser Cys Val Ile Asn Gly Glu Glu His Glu Gln Thr His Arg Ala

385 390 395 400

Ile Phe Arg Phe Val Pro Arg His Glu Asp Glu Leu Glu Leu Glu Val

405 410 415

Asp Asp Pro Leu Leu Val Glu Leu Gln Ala Glu Asp Tyr Trp Tyr Glu

420 425 430

Ala Tyr Asn Met Arg Thr Gly Ala Arg Gly Val Phe Pro Ala Tyr Tyr

435 440 445

Ala Ile Glu Val Thr Lys Glu Pro Glu His Met Ala Ala Leu Ala Lys

450 455 460

Asn Ser Asp Trp Ile Asp Gln Phe Arg Val Lys Phe Leu Gly Ser Val

465 470 475 480

Gln Val Pro Tyr His Lys Gly Asn Asp Val Leu Cys Ala Ala Met Gln

485 490 495

Lys Ile Ala Thr Thr Arg Pro Arg Leu Thr Val His Phe Asn Pro Pro

500 505 510

Ser Ser Cys Val Leu Glu Ile Ser Val Arg Gly Val Lys Ile Gly Val

515 520 525

Lys Ala Asp Asp Ala Leu Glu Ala Lys Gly Asn Lys Cys Ser His Phe

530 535 540

Phe Gln Leu Lys Asn Ile Ser Phe Cys Gly Tyr His Pro Lys Asn Asn

545 550 555 560

Lys Tyr Phe Gly Phe Ile Thr Lys His Pro Ala Asp His Arg Phe Ala

565 570 575

Cys His Val Phe Val Ser Glu Asp Ser Thr Lys Ala Leu Ala Glu Ser

580 585 590

Val Gly Arg Ala Phe Gln Gln Phe Tyr Lys Gln Phe Val Glu Tyr Thr

595 600 605

Cys Pro Thr Glu Asp Ile Tyr Leu Glu

610 615

＜210＞ 9

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ 5' RACE primer

＜400＞ 9

ccatcctaat acgactcact atagggc 27

＜210＞ 10

＜211＞ 23

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ 3' RACE primer

＜400＞ 10

gagcgtggta ggcctcttgg gtc 23

＜210＞ 11

＜211＞ 32

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ PCR primer with HindIII site

＜400＞ 11

cccaagcttc caccatgcag ctggtactga ag 32

＜210＞ 12

＜211＞ 29

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ PCR primer with XbaI site

＜400＞ 12

gctctagact actccaagta gatatcttc 29

본 발명은 다양한 종류의 스트레스에 의하여 활성화되는 사람 세포내의 인산화 효소인 JNK (c-Jun N-terminal kinase)의 활성을 선택적으로 억제하거나 조절할 수 있는 마우스의 SKIP 단백질, 이를 코딩하는 유전자 및 그 용도에 관한 것이다.

보다 상세하게 본 발명은 사람 세포의 JNK에 대한 선택적인 조절인자인 마우스 SKIP 단백질 및 그 전사 변이 단백질들; 이를 코딩하는 SKIP 유전자 및 그 변이형 cDNA; 상기 단백질 또는 유전자를 미지의 단백질 또는 유전자의 탐색, 유전자 치료, SAPK/JNK 활성의 선택적 저해에 사용하는 용도; 및 상기 단백질 또는 유전자를 퇴행성 뇌신경계 질환, 뇌졸중, 암, 면역계 질환, 염증 등 세포사멸 관련 질병의 치료 등에 사용하는 용도에 관한 것이다.

포유동물 세포에서 세포분열 촉진물질에 의해서 활성화되는 단백질 키나아제 (mitogen-activated protein kinase; 이하 "MAPK"로 약칭함)들은 세포증식, 분화, 사멸 등에 있어서 매우 중요한 역할을 한다. MAPK 중의 한 종류인 SAPK/JNK (stress activasted protein kinase/c-Jun N-terminal kinse)는 열충격, 염증 유발 싸이토카인, 삼투압 교란자극, 저산소증, 흥분독성, 산화성 래디칼에 의한 자극, 단백질 합성 억제제 등에 의해서 쉽게 활성화되며, 활성화된 SAPK/JNK는 전사조절인자인 c-Jun, ATF2, Elk-1 등의 핵단백질을 인산화시켜 이들의 전사조절 활성을 증가시킨다. 여러 가지 증거들에 의하면 SAPK는 세포에 유해한 자극을 포함하는 각종 스트레스에 의하여 활성화되며, 특히 세포의 사멸과 관련한 신호전달 과정에서 매우 중요한 역할을 담당하는 것으로 보인다 (Davis, Trends Biochem. Sci., 19:470-473, 1994). 최근들어 치매, 파킨슨 병 등의 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중 등에 있어서도 SAPK 활성화와 신경세포의 사멸이 매우 밀접히 연관되어 있다는 증거들이 보고되고 있다 (Reynolds 등,J Neurochem., 68:1736-44, 1997; Ko 등, J. Neurochem., 71:1390-1395, 1998).

최근 들어 지금까지 치매와 같은 퇴행성 뇌신경계 질환, 뇌졸중 등은 단순한 노화의 과정이 아니라 질병으로 간주하여 이를 예방 또는 치료하려는 노력이 있어 왔으나, 아직 이와 같은 질환에 대해 임상적으로 이들 질병에 대한 적절한 치료수단이 마련되고 있는 것은 아니다. 다행히 최근의 연구 결과들에 따르면 뇌질환과 관련한 신경세포의 세포사멸에 있어서 SAPK/JNK가 매우 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있으며, 그에 따라 SAPK/JNK의 효과적인 조절 수단을 ??으려는 노력이 경주되고 있다.

이와 같은 사실에 착안하여 본 발명자들은 사람의 SAPK/JNK를 효과적으로 조절할 수 있는 물질을 탐색한 결과, 지금까지 알려지지 않은 새로운 물질인 마우스의 SKIP (SAPK-interacting protein) cDNA를 분리하였으며, 이로부터 생산된 마우스 SKIP 단백질의 생물학적 특성을 밝혀내어 상기 유전자 및 단백질이 미지 유전자의 탐색, 뇌질환 등의 치료제 등에 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 다양한 종류의 스트레스에 의하여 활성화되는 인산화 효소인 사람의 SAPK/JNK의 활성을 조절할 수 있는 새로운 물질을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 마우스 SKIP 단백질 및 이를 코딩하는 cDNA를 제공한다.

또한 본 발명은 마우스 SKIP 유전자 또는 마우스 SKIP 단백질을 탐침으로 이용하여, SKIP 단백질과 상호작용하는 핵산 또는 단백질; SKIP 유전자의 유사체 (analogs); 또는 SKIP 단백질의 유사체를 탐색하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 마우스 SKIP 유전자를 포함하는 유전자 콘스트럭트 (gene construct)를 유효성분으로 하는 유전자 치료제를 제공한다.

또한 본 발명은 마우스 SKIP 단백질을 포함하는 SAPK 활성의 저해제 및 세포사멸 관련 질병의 치료제를 제공한다.

도 1은 마우스 SKIP 유전자의 발현 양상 및 발현량을 탐지한 노던 블럿 분석 결과를 나타내고,

도 2는 성체 마우스의 뇌조직에서 마우스 SKIP 유전자가 발현되는 양상을 나타낸 인시튜 혼성화법 (in situ hybridization) 결과이고,

A: 마우스 뇌의 횡단면 (coronal section)에 대하여 각 SKIP 유전자의 공통적 서열의 안티센스 탐침 (antisense probe)을 사용하여 조사한 것;

B: 마우스 뇌의 종단면 (sagittal section)에 대하여 각 SKIP 유전자의 공통적 서열의 안티센스 탐침 (antisense probe)을 사용하여 조사한 것;

C: 마우스 뇌의 종단면 (sagittal section)에 대하여 센스 탐침 (sense probe)을 사용하여 조사한 것;

D: 마우스 뇌의 횡단면 (coronal section)에 대하여 마우스 SKIP-2 cDNA에 특이적 서열의 안티센스 탐침 (antisense probe)을 사용하여 조사한 것;

E: 마우스 뇌의 종단면 (sagittal section)에 대하여 마우스 SKIP-2에 특이적 서열의 안티센스 탐침 (antisense probe)을 사용하여 조사한 것;

F: 마우스 소뇌의 횡단면 (coronal section)에 대하여 마우스 SKIP-2에 특이적 서열의 안티센스 탐침 (antisense probe)을 사용하여 조사한 것;

hc: 해마 (hippocampus); cbl: 소뇌 (cerebellum);

de: 치상이랑 (dentate gyrus); ha: 유(紐, habenula),

도 3은 마우스 배아에서 마우스 SKIP-2에 특이적인 부위를 탐침으로 사용하여 SKIP 유전자가 발현되는 양상을 탐지한 인시튜 혼성화법 (in situ hybridization) 결과이고,

도 4는 마우스의 뇌조직 및 인간세포 HEK293 에서 SAPK/JNK의 활성이 강하게 나타난다는 것을 확인한 면역침전법 (immunoprecipitation) 조사 결과이고,

CX: 대뇌피질; CB: 소뇌;

Kd: 신장,

도 5는 마우스의 다양한 SKIP유전자의 전사 변이 단백질이 모두 JNK의 활성을 억제할 수 있음을 나타낸 인산화 단백질 활성 조사 결과이고,

도 6은 마우스 SKIP 단백질의 세포 내 미세 분포양상을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7로 기재되는 마우스 SKIP 유전자, 그 상동형 유전자 (homologs) 및 그 변이형 유전자 (variants)를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8로 기재되는 마우스 SKIP 단백질 또는 그 변이형 단백질 (variants)을 제공한다.

상기 마우스 SKIP 유전자의 "상동형 유전자 (homologs)"는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8로 기재되는 마우스 SKIP 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 유전자를 뜻한다. 따라서, 상기 상동형 유전자의 범주에는 발현시 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8로 기재되는 마우스 SKIP 단백질을 생산할 수 있는 모든 종류의 유전자가 포함된다.

상기 마우스 SKIP 단백질의 "변이형 단백질 (variants)"은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8로 기재되는 마우스 SKIP 단백질 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실, 부가, 삽입 또는 치환시킨 것을 의미한다. 단, 상기 변이형 단백질은 서열번호 2의 522 내지 570번 아미노산 잔기에 해당하는 부분에서 부분적으로 적어도 90 % 이상의 상동성 (homology)을 가지고, 전체적으로는 80 % 이상의 상동성을 가지는 것으로 정의된다.

상기 마우스 SKIP 유전자의 "변이형 유전자 (variants)"는 마우스 SKIP 단백질의 변이형 단백질을 코딩하는 모든 유전자를 의미한다.

최근 본 발명자들은 SAPK/JNK의 신호전달 경로를 조절하는 새로운 단백질들을 탐색하기 위하여 효모 2-융합 시스템 (yeast two-hybrid system)을 이용하여 SAPK/JNK와 반응하는 랫트 SKIP 단백질의 유전자를 분리하였다 (Kim 등, J. Neurochem., 72: 1335-1343, 1999). 본 발명에서는 상기 랫트 SKIP 유전자를 탐침으로 이용하여 마우스의 SKIP 유전자를 분리하였다. 마우스는 유전자이식동물 (transgenic animals)의 생산 및 유전자 표적법 (gene targeting)에 의한 돌연변이 연구에 빈번히 사용되므로 마우스 SKIP 유전자는 상기 연구에 용이하게 사용될 수 있다.

마우스의 SKIP 유전자를 분리하기 위해, 마우스의 뇌신경계 cDNA 라이브러리로부터 준비한 0.5×10⁶개의 파지 플라크 (phage plagues)를 검색하여 랫트의 SKIP 유전자와 상호 유사성이 매우 높은 2.1 Kb 및 1.0 Kb 크기의 마우스 cDNA 클론을 2개 얻었다. 5' 지역이 완전한 마우스 cDNA 클론을 확보하기 위하여 마우스의 뇌신경계 cDNA를 주형으로 삼아 5'-RACE (5'-rapid amplification of cDNA ends)를 시행함으로써 랫트 SKIP 유전자와는 다른 염기서열 및 아미노산 서열을 갖는 SKIP cDNA 클론을 4종류 확보하였다. 이들 마우스 cDNA 클론들은 각각 mskip-2b (서열번호 1), mskip-1b (서열번호 3), mskip-2a (서열번호 5), mskip-3 (서열번호 7)라고 명명하였다. 각각의 cDNA 클론은 707, 698, 673, 617개의 아미노산을 갖는 ORF(open reading frame)을 가지며, 이들로부터 얻은 아미노산 서열은 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8로 기재된다. 각각의 ORF는 서열번호 1의 경우 258 ~ 2279번의 염기서열, 서열번호 3의 경우 38 ~ 2161번의 염기서열, 서열번호 5의 경우 128 ~ 2224번의 염기서열, 서열번호 7의 경우 272 ~ 2125번의 염기서열에 해당된다.

마우스 SKIP 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 랫트의 SKIP-2a와 비교할 때 DNA 염기서열을 기준으로 95% 이상의 상동성이 있었다 (Kim 등, J. Neurochem., 72: 1335-1343, 1999). 랫트 SKIP의 경우와 유사하게 마우스 SKIP-2b 단백질의 중간 후반부에는 1개의 SH3 도메인이 있으며, C-말단에는 1개의 인산화티로신 반응 도메인 (phosphotyrosine interaction domain)이 존재한다 (서열목록 참조).

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 유전자의 일부가 삽입된 발현벡터 pcDNA3-mskip-2B 및 상기 발현벡터를 포함하는 대장균 균주 E. coli XL1-blue/pcDNA3-mskip-2B를 제공한다.

상기 발현벡터는 pcDNA3 벡터 (Invitrogen사)의 외래 유전자 삽입 부위에 서열번호 1로 기재되는 유전자의 ORF 부분인 258bp 부터 2279bp 까지의 염기서열을 삽입한 것이다. 그러나, 상기 발현벡터의 제조에 이용된 pcDNA3 벡터 이외에도 다양한 원핵세포용 또는 진핵세포용 발현벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 pcDNA3 벡터 이외에 다른 발현벡터를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 발현벡터의 외래 유전자 삽입부위에 삽입되는 유전자의 크기, 염기서열 등도 공지의 기술에 의해 다양하게 변화시킬 수 있다.

상기 대장균 균주는 대장균 균주 E. coli XL1-blue에 상기 발현벡터를 도입하여 제조할 수 있으며, 그 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열충격법, 전기천공법 등을 통해 도입할 수 있고, 상기 대장균 균주 E. coli XL1-blue 이외에도 다양한 형질전환용 대장균이 사용될 수 있다. 상기 대장균 균주 E. coli XL1-blue/pcDNA3-mskip-2B는 1999년 9월 3일 생명공학연구소 부설 유전자은행에 수탁번호 KCTC 8962P로 기탁되었다.

또한, 본 발명에서는 상기 마우스의 SKIP 유전자, 그 상동형 유전자, 그 변이형 유전자, 마우스 SKIP 단백질 또는 그 변이형 단백질을 탐침으로 이용하여, SKIP 단백질과 상호작용하는 핵산 또는 단백질, SKIP 유전자의 유사체 (analogs) 또는 SKIP 단백질의 유사체를 탐색하는 방법을 제공한다.

상기 "유사체"는, 서열번호 1로 기재되는 SKIP 유전자 또는 서열번호 2로 기재되는 SKIP 단백질과 비교할 때, 임의로 선택된 30 bp 또는 10 아미노산 잔기에서 80% 이상의 서열 상동성을 보이는 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 또한 상기 "상호작용하는"이란 표현은 SKIP 단백질과 직접적 또는 간접적으로 물리적인 결합을 할 수 있는 상태를 의미한다. 상기 "탐침 (probe)"이라는 용어는 통상의 서던 블럿 분석, 노던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 파 웨스턴 블럿 (far Western blot) 분석, 젤 이동성 변화 (gel mobility shift) 분석, 라이브러리 탐색 (library screening), 친화 크로마토그래피 등에 사용될 수 있는 탐침 뿐만 아니라 자동화된 기기를 이용한 DNA 칩 등에 사용될 수 있는 탐침과 중합효소연쇄반응 (PCR)에 이용되는 특이적 프라이머 등을 포함한다. 즉 핵산-핵산, 단백질-단백질, 단백질-핵산 간의 상호작용을 그 원리로 이용하는 모든 분석에서 사용되는 탐침을 지칭한다. 상기 탐침은 방사성 동위원소, 형광물질 등으로 표지하여 사용할 수도 있다.

따라서, 상기 핵산 또는 단백질의 탐색 방법은 상기에서 제시한 분석 방법 또는 탐색 방법대로 수행한다. 예를 들면, 본 발명의 SKIP 유전자 중 특이적인 일부 염기서열을 이용하여 PCR을 수행하고 이로부터 얻은 DNA 절편을 다시 탐침으로 이용하여 cDNA 라이브러리 탐색을 수행하여 SKIP 유전자의 유사체를 클로닝할 수 있다. 또다른 예로는, 본 발명의 SKIP 단백질을 친화크로마토그래피 칼럼의 레진에 고정시켜 특정한 조건에서 SKIP 단백질과 물리적으로 결합할 수 있는 단백질 등을 탐색할 수 있다.

상기 유전자 콘스트럭트는 이에 포함되는 SKIP 유전자, 그 상동형 유전자 또는 그 변이형 유전자를 효율적으로 발현시키기 위한 수단으로서, 유전자 치료의 구체적인 목적에 따라 그 구성 성분을 변형할 수 있다. 예를 들어, 내생적인 (endogenous) SKIP 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키기 위한 목적으로 유전자 치료를 수행하는 경우, 상기 유전자 콘스트럭트는 SKIP 유전자 주위에 동형 재조합을 위한 트랜스포존 (transposon) 서열을 포함시켜 제조할 수 있다. 다른 예로 외생적인 (exogenous) 마우스 SKIP 유전자를 효율적으로 발현시키기 위해, 상기 마우스의 SKIP 유전자, 그 상동형 유전자 또는 그 변이형 유전자에 강력한 프로모터를 연결하여 제조한 유전자 콘스트럭트를 사용할 수 있다. 한편, 상기 유전자 콘스트럭트의 구성은 구체적인 유전자 치료 수단에 따라서도 변형될 수 있는데, 이를 테면 재조합 바이러스를 이용하여 유전자 치료를 수행하는 경우, 레트로바이러스 등의 바이러스 게놈으로부터 유래된 공지의 벡터를 이용하여 본 발명의 유전자 치료제를 구성할 수 있다.

상기 유전자 치료제는 선천적 또는 후천적인 유전적 결함에 의해 SAPK 활성의 조절이 잘못되어 발생하는 질환의 치료뿐만 아니라, 암, 퇴행성 뇌신경계 질환, 중풍, 면역계 질환, 염증 등 세포사멸 과정의 조절이 잘못되어 발생하는 질환의 치료 등에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에서는 SKIP 유전자를 고발현하는 포유동물 세포주에서 SAPK의 활성이 저하됨을 확인함으로써, 본 발명의 유전자 치료제가 상기 질환에 유용함을 확인하였다.

상기 SAPK 활성의 저해제는 마우스 SKIP 단백질 또는 그 변이형 단백질을 유효 성분으로 포함하므로 SAPK 활성을 선택적으로 저해할 수 있으며, SAPK 활성이 관여하는 신호전달 과정을 선택적으로 저해하기 위한 목적으로도 이용될 수 있다.

상기 세포사멸 관련 질병은 세포사멸 (apoptosis) 과정의 조절이 비정상적으로 일어남으로써 발생하는 질병이며, 그 예로는 암, 퇴행성 뇌신경계 질환, 중풍, 면역계질환, 다양한 염증 등이 있다.

상기 SAPK 활성의 저해제 및 세포사멸 관련 질병의 치료제는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8로 기재되는 SKIP 단백질 또는 그 변이형 단백질을 유효성분으로 포함한다.

상기 저해제 및 치료제는 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 특히 비경구 주사 투여가 바람직하다. 즉, 상기 저해제 및 치료제는 실제 임상투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 SKIP 단백질 또는 그 변이형 단백질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

마우스 SKIP 단백질 및 그 변이형 단백질의 유효용량은 1∼20 mg/kg 이고, 바람직하기로는 5∼15 mg/kg 이다.

본 발명의 실시예에서는, 마우스의 SKIP 유전자 및 SKIP 단백질의 생물학적 특성을 밝힘으로써 상기 유전자 및 단백질의 바람직한 용도를 확인하였다.

구체적으로, 마우스 SKIP 유전자의 발현 양상을 노던 블럿 분석 및 인시튜 혼성화법 (in situ hybridization)으로 확인하였으며, 마우스 SKIP 단백질이 사람의 SAPK 활성을 저해함을 시험관내 단백질 키나아제 반응을 통해 확인하였다.

노던 블럿 분석에 의하면 SKIP 유전자는 3.0 Kb와 3.3 Kb의 유전자 전사물(transcripts)을 만들며, mskip-2과 mskip-3은 뇌신경계에 특이적으로, mskip-1는 뇌신경계 및 신장에 특이적으로 발현되었다 (도 1 참조). 한편, 마우스 SKIP cDNA 절편을 α-³²P로 표지하여 성체의 마우스 뇌조직 절편에 대해 인시튜 혼성화법을 수행한 결과 SKIP 유전자는 뇌신경계 전반에 걸쳐 두루 분포하며, 그 중에서도 특히 대뇌 피질, 해마, 소뇌 등에 강하게 발현되는 것이 확인되었다. 뇌신경계에 특이적으로 발현되는 mskip-2a의 경우 해마 부위의 치상이랑 (dentate gyrus), 유 (habenula), 소뇌 등에서 강하게 발현되었다 (도 2 참조). 또한 SKIP cDNA 절편을 α-³²P로 표지하여 발생 배에 대한 인시튜 혼성화법을 실시한 결과 SKIP 유전자는 신경세포의 발생과정에서도 중요한 역할을 할 가능성이 제시되었다 (도 3 참조). 이와 같은 사실들은 신경세포의 사멸에 중요한 역할을 하는 SAPK/JNK의 활성 조절이 특히 뇌신경계에서 매우 중요하다는 것을 암시하며, SKIP의 생화학적, 유전자 발현 정도를 조절함으로써 뇌신경계 기능을 변환할 수 있음을 암시한다. 실제로 뇌신경계에서의 SAPK/JNK의 유전자 발현 양상을 조사한 결과 대뇌 피질, 해마 등의 부위에서 매우 강하게 발현되는 것을 알 수 있었다 (도 4 참조).

마우스의 SKIP 유전자가 SAPK의 활성을 효과적으로 조절할 수 있는지 조사하기 위해 사람 유래의 배양 세포주인 HEK293 세포주에 여러 종류의 SKIP cDNA 클론을 과발현시켜 조사한 결과, 조사한 모든 마우스 SKIP cDNA 클론이 SAPK/JNK 활성을 강력히 억제하는 것을 확인하였다 (도 5 참조). 이러한 사실은 마우스의 SKIP이 사람의 SAPK/JNK의 활성 조절에 효율적으로 이용될 수 있음을 보여준다. 본 발명자들은 SKIP에 의한 SAPK/JNK의 활성 억제 작용이 SKIP과 SAPK/JNK의 직접적인 단백질간 결합에 의해 조절되는 것으로 밝힌 바 있다 (Kim 등, J. Neurochem., 72: 1335-1343, 1999). 또한 SKIP의 C-말단 부위에 플래그 에피토프 (Flag-epitope)를 부착한 클론을 HEK 293 세포주, CHO 세포주 등에 발현시켜 본 결과 SKIP이 세포질 내에 분포함을 확인하였다 (도 6 참조).

상기 실시예들의 결과에 의하면, 마우스의 SKIP 유전자도 랫트의 SKIP 유전자의 경우처럼 SAPK/JNK의 활성을 효과적으로 억제하는 성질을 가지며, 특히 SKIP 유전자는 뇌신경계에서 강하게 발현되고 그 중에서도 대뇌 피질, 해마, 소뇌 등과 같이 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중 등을 관장하는 뇌신경세포에서 강하게 발현된다는 사실이 확인되었다. 따라서, 본 발명이 제공하는 유전자 치료제, SAPK 저해제 또는 세포사멸 관련 질병의 치료제는 마우스 SKIP 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하고 있으므로, SAPK가 관여하는 다양한 생리적 반응과 질환에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 설명한다.

단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞ 마우스의 SKIP 유전자 분리

SAPK를 조절하는 세포내 인자를 찾기 위해, 본 발명자들이 분리한 랫트 SKIP 유전자의 1.8 Kb cDNA 절편 (Kim 등, J. Neurochem., 72: 1335-1343, 1999)을³²P 방사성동위원소로 표지한 탐침으로 마우스 뇌의 cDNA 라이브러리 (Clontech사, 미국)를 탐색하였다. 마우스 뇌의 cDNA 라이브러리 파지 플라크를 찍은 필터를 60℃의 전혼성화 완충액 (prehybridization buffer: 5×SSPE, 5×Denhardt's solution, 0.5% SDS, 100 ㎍/㎖ salmon sperm DNA)에 2시간 동안 담궈둔 후 14시간 이상 동안 65℃에서 상기 탐침과 함께 혼성화하여 양성 파지 클론을 분리하여 분석하였다.

그 결과 1.0 Kb와 1.7 Kb 크기의 2개의 마우스 클론을 얻었으며, 이들은 서로 중복되는 부분을 포함하여 총 2.1 Kb에 이르는 SKIP cDNA를 형성하는 것을 확인하였다.

5' 지역의 SKIP cDNA를 얻기 위하여 마우스 뇌조직에서 분리한 전체 mRNA에 대하여 제작된 cDNA를 주형으로 삼아 5'-RACE (5'-rapid amplification of cDNA ends, Clontech사, 미국)를 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 마라톤-레디 cDNA 키트 (Marathon-ready cDNA Kit, Clontech사)에 포함된 어댑터 프라이머 #1 (서열번호 9)와 서열번호 10으로 기재되는 합성 올리고뉴클레오타이드였으며, 그 방법은 상기 키트의 설명서를 그대로 따랐다.

그 결과 4종의 서로 다른 5' 지역을 갖는 마우스의 SKIP cDNA 클론을 확보하였다. 구체적으로, 동일 종류의 약 2.1 Kb cDNA에 더하여 5'-지역이 다른 4 종류의 SKIP cDNA, 즉 mskip-2b (서열번호 1), mskip-1b (서열번호 3), mskip-2a (서열번호 5), mskip-3 (서열번호 7)을 클로닝하였으며, 각각의 cDNA 염기서열이 포함한 ORF의 분석 결과 각각의 ORF는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8로 기재되는 마우스 SKIP 단백질을 코딩함을 확인하였다.

＜실시예 2＞ 마우스 SKIP 유전자의 조직별 발현 특성의 확인

마우스의 SKIP 유전자가 만드는 전사 산물의 크기와 분포 양상을 확인하기 위하여, 다양한 마우스 조직으로부터 준비한 mRNA 블럿과 동위 원소로 표지한 SKIP cDNA 탐침을 이용하여 노던 블럿 분석을 수행하였다.

구체적으로, 노던 블럿 분석에 사용할 탐침은 각각의 전사체에 특이적인 지역, 즉 mskip-1b의 경우 서열번호 3의 염기서열에서 1-134bp 지역을, mskip-2b의 경우 서열번호 1의 염기서열에서 1-330bp 지역을, mskip-3의 경우 서열번호 7의 염기서열에서 1-104bp 지역을 PCR로 준비한 다음 무작위 시발법 (random-priming)에 의해³²P로 표지하여 사용하였다. RNA 분리 키트 (Promega사, 미국 및 Invitrogen사, 미국)를 이용하여 마우스로부터 mRNA 또는 총 RNA를 분리하였으며, 필요시 mRNA를 구입 (Clontech, 미국)하여 RNA 블럿을 준비하였다. mRNA 블럿을 전혼성화 완충액 (6×SSPE, 10×Denhardt's solution, 50% formamide, 0.5% SDS, 200㎍ denatured salmon sperm DNA)에 넣고 37℃에서 4시간 동안 전혼성화시켰다. 이후 혼성화 과정은 상기 탐침을 1×10⁶~2×10⁶cpm/ml의 농도로 전혼성화 완충액에 첨가한 뒤 60℃에서 하룻밤 동안 진행하였다. 혼성화 반응이 끝난 막은 세척 완충액 (0.1×SSC, 0.5% SDS)으로 60℃에서 씻은 후 X선 필름에 노출시켰다.

그 결과, SKIP 유전자는 3.0 Kb와 3.3 Kb의 유전자 전사물(transcripts)을 만들며, mskip-2과 mskip-3은 뇌신경계에 특이적으로, mskip-1는 뇌신경계 및 신장에 특이적으로 발현되었다 (도 1 참조).

＜실시예 3＞ 인시튜 혼성화법을 이용한 마우스 SKIP 유전자의 발현 분석

마우스 뇌신경계에서 마우스 SKIP 유전자의 발현 양상을 보다 상세히 조사하기 위해, 마우스의 뇌신경 조직에 대한 인시튜 혼성화법 (in situ hybridization)을 수행하였다.

구체적으로, 마우스 (BALB/c)의 뇌를 취하여 즉시 -50℃의 이소펜텐 (isopentene)에 저장한 후 동결절편기 (Leica사, 독일) 14 ㎛ 두께로 잘라 폴리라이신 (poly-lysine) 처리한 슬라이드 글래스 위에 부착하였다. 이어 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 15분 동안 고정하고, 0.25% 무수아세트산을 포함한 0.1 M 트리에탄올라민 (triethanolamine)으로 처리한 후, 여러 번 씻고 탈수시켰다. 뇌절편은 먼저 전혼성화 완충액 (prehybridization buffer: 50% formamide, 0.3M NaCl, 50 mM Tris, pH 8.0, 5mM EDTA, 1×Denhardt's solution, 10% dextran sulphate, 10 mM DTT)에 넣어 52℃에서 1시간 동안 처리하고 동위원소로 표지한 RNA 탐침과 함께 혼성화 완충액에서 14-16 시간 반응시켰다. 뇌절편은 2×SSC와 0.1×SSC에서 차례대로 여러 번 씻고 탈수시킨 후 건조시켜 5일 동안 X선 필름에 노출시켰다. 한편 상기 탐침을 제조하기 위해서, T7 중합효소 및 T3 중합효소와³⁵S-UTP를 이용하여 시험관내 전사 반응을 수행하였다. 이때 시험관내 전사 반응의 주형으로 이용한 염기서열은, 마우스 SKIP 유전자의 공통적 서열을 인식하는 탐침의 경우 (도 2에서 A, B) 마우스 SKIP-2a의 640-bp 절편 (서열번호 5의 1220-1860 bp 지역)을 사용하였고, 마우스 SKIP-2a 유전자에 특이적인 서열을 인식하는 탐침의 경우 (도 2에서 D, E, F) 1-330을 사용하였다.

분석 결과 SKIP 유전자는 성체 마우스의 뇌신경계 전반에 걸쳐 두루 분포하며, 그 중에서도 특히 대뇌 피질, 해마, 소뇌 등에서 강하게 발현되는 것이 확인되었다. 뇌신경계에 특이적으로 발현되는 mskip-2a의 경우 해마 부위의 치상이랑 (dentate gyrus), 유 (habenula), 소뇌 등에서 강하게 발현되었다 (도 2 참조).

한편 SKIP cDNA 절편을 α-³²P로 표지하여 발생 배에 대한 인시튜 혼성화법을 실시한 결과 SKIP 유전자는 신경세포의 발생과정에서도 중요한 역할을 할 가능성이 제시되었다 (도 3 참조).

＜참고예＞ 뇌신경계에서의 SAPK/JNK의 유전자 발현

성숙한 마우스 (BALB/c)의 두부를 절개한 후 뇌를 적출하여 균질화 완충액 (homogenation buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 % Nonidet P-40, 0.5 % deoxycholate, 0.1 % sodium dodecyl sulfate)에서 현탁시킨 후, 4℃에서 100,000×g로 4분 동안 원심분리하였다. 뇌조직, 신장 또는 배양세포 (HEK 293 세포주, 수탁번호: ATCC CRL-1573)로부터 분리한 약 1 mg의 단백질에 대하여 anti-SAPK 항체 (PharMingen사)를 이용하여 면역침전시킨 후 얻어진 면역 침전물을 용해 완충액 (lysis buffer)으로 3회, 완충액 A (25mM HEPES, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.2% (w/v) Triton X-100)로 1회 씻은 후, 20 ㎕의 키나아제 분석 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.5, 0.2 mM Na₂VO₄, 20mM DTT, 10 mM MgCl₂, 5 μCi[³²P]ATP) 에 2-3 ㎍의 GST-c-Jun 을 넣고 30℃에서 30분간 반응시켰다. 반응용액으로 10-12% SDS-PAGE를 수행한 후 X선 필름에 노출시켰다. HEK 293 세포주는 40J/m²자외선(UV-C)을 조사하여 SAPK의 활성을 증가시켜 조사하였다.

뇌신경계에서의 SAPK/JNK의 유전자 발현 양상을 조사한 결과 실제로 대뇌 피질, 해마 등의 부위에서 매우 강하게 발현되는 것을 알 수 있었다 (도 4 참조).

＜실시예 4＞ 발현벡터 pcDNA3-mskip-2B와 이를 포함하는 대장균 균주의 제조

SKIP 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하기 위해, pcDNA3 (Invitrogen사)의 외래 유전자 삽입 부위에 서열번호 1로 기재되는 SKIP 유전자를 삽입하여 발현벡터 pcDNA3-mskip-2B을 제조하였다.

구체적으로, 상기 발현벡터는 pcDNA3 벡터 (Invitrogen사)의 HindⅢ/XbaI 제한효소자리에 서열번호 1로 기재되는 유전자 중 258bp 부터 2279bp 까지의 염기서열을 삽입하여 제조하였다. 삽입할 유전자 단편을 제조하기 위해 PCR을 수행하되, HindⅢ 제한효소자리를 포함한 프라이머 (서열번호 11)와 XbaI 제한효소자리를 포함한 프라이머 (서열번호 12)를 이용하였고 그 주형으로는 서열번호 1로 기재되는 cDNA 서열을 이용하였다.

상기 발현벡터를 컴피턴트 대장균 균주 E. coli XL1-blue (Promega사, 미국)와 혼합한 후 얼음에 30분 방치한 후 42℃에서 40초 간 열충격을 가함으로써 형질전환된 균주를 제조하였다. 상기 재조합 대장균 균주 E. coli XL1-blue/pcDNA3-mskip-2B는 1999년 9월 3일 생명공학연구소 부설 유전자은행에 수탁번호 KCTC 8962P로 기탁되었다.

같은 방법으로 다른 마우스 SKIP 유전자들의 ORF 부분을 포유동물세포 발현 벡터인 pcDNA3 (Invitrogen, 네덜란드)에 각각 클로닝하여 pcDNA3-mskip-1B, pcDNA3-mskip-2A 및 pcDNA3-mskip-3라고 명명하였다.

＜실시예 5＞ 다양한 SKIP 유전자에 의한 사람의 SAPK/JNK 활성 억제 효과

상기 발현벡터 pcDNA3-mskip-2B, pcDNA3-mskip-1B, pcDNA3-mskip-2A 및 pcDNA3-mskip-3를 사람유래 배양세포인 HEK 293 세포에 과발현시킨 후 40J/m²자외선 (UV-C)에 의해 활성화되는 SAPK 활성에 대한 영향을 조사였다. UV를 조사한 다음 한 시간 후에 세포를 파쇄하여 사람 JNK1에 대한 단일 클론 항체 (PharMingen사)를 이용하여 SAPK를 면역 침전시켰다. SAPK의 활성을 측정하기 위하여 침전된 면역 복합체를 2 μCi [γ-³²P]ATP, 3 ㎍ 기질 단백질 GST-ATF-2과 함께 반응 용액 (20 mM Hepes, pH 7.5, 1 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0.2 mM Sodium Vanadate)에서 30℃에서 30분간 반응시키고, SDS-PAGE로 분리한 후 X선 필름에 노출시켜 확인하였다.

그 결과, 조사한 모든 마우스 SKIP cDNA 클론이 SAPK/JNK 활성을 강력히 억제하는 것을 확인하였다 (도 5 참조). 이러한 사실은 마우스의 SKIP이 사람의 SAPK/JNK의 활성 조절에 효율적으로 이용될 수 있음을 보여준다.

＜실시예 6＞ SKIP 유전자의 세포 내 분포

세포 내에서 SKIP 단백질의 분포양상을 알기 위하여 SKIP-2a 단백질의 C-말단에 Flag 에피토프를 부착한 pcDNA3-mskip-2a-flag을 제작하여 CHO 세포주 등에 트랜스펙션하였다. 1-2일 후 Flag에 대한 단일클론항체 (Kodak사, 미국)로 SKIP-flag이 세포 내에서 어떻게 분포하는지, UV 등과 같은 스트레스가 주어졌을 때 SKIP-flag의 분포상의 변화가 있는지 등을 조사하였다.

이를 위하여 pcDNA3-mskip-2a-flag을 트랜스펙션한 CHO 세포주를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, Flag에 대한 단일클론항체인 1차 항체 원액을 1×PBS (phosphate buffered saline)에 1:100으로 희석하여 세포에 2시간 동안 처리한 다음 1×PBS로 씻어주고 다시 발색 형광물질인 FITC로 표지한 마우스 IgG에 대한 단항체인 2차 단항체 (Sigma사, 미국)를 1×PBS에 1:200으로 희석하여 2시간 동안 처리한 후 씻어 준 후 UV를 광원으로 하는 형광현미경 시야에서 조사한 결과 Flag 에피토프가 표지된 SKIP은 대부분 세포질 내에 분포한다는 것을 확인하였다 (도 6 참조).

본 발명이 제공하는 신규의 마우스 SKIP 단백질 및 이를 코딩하는 유전자는 대뇌 피질, 해마, 소뇌 등 뇌신경계에서 특이적으로 발현되고 SAPK 단백질의 활성을 저해하므로, 마우스 SKIP 단백질은 SAPK 단백질의 활성을 선택적으로 억제하거나 세포사멸 관련 과정이 관여하는 질병을 치료하는데 있어 유용하게 사용될 수 있으며 SKIP 유전자는 상기 질병 등에 대한 유전자요법에 사용될 수 있다.

Claims

서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7로 기재되는 마우스 SKIP (SAPK-interacting protein) 유전자, 그 상동형 유전자 (homologs) 또는 그 변이형 유전자 (variants).
서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8로 기재되는 마우스 SKIP 단백질 또는 그 변이형 단백질 (variants).
pcDNA3 벡터의 외래 유전자 삽입 부위에 서열번호 1로 기재되는 유전자 중 258번부터 2279번까지의 염기서열이 삽입된 발현벡터 pcDNA3-mskip-2B.
제 3항의 발현벡터를 포함하는 대장균 균주 E. coli XL1-blue/pcDNA3-mskip-2B (수탁번호: KCTC 8962P).
제 1항의 유전자 또는 제 2항의 단백질을 탐침으로 이용하여, SKIP 단백질과 상호작용하는 핵산 또는 단백질; SKIP 유전자의 유사체 (analogs); 또는 SKIP 단백질의 유사체를 탐색하는 방법.
제 1항의 유전자를 포함하는 유전자 콘스트럭트 (gene construct)를 유효성분으로 하는 유전자 치료제.
제 2항의 단백질을 포함하는 SAPK 활성의 저해제.
제 2항의 단백질을 포함하는 세포사멸 관련 질병의 치료제.
제 8항에 있어서, 상기 세포사멸 관련 질병은 퇴행성 뇌신경계 질환, 뇌졸중, 암, 면역계 질환 또는 염증인 것을 특징으로 하는 치료제.