RU2760738C1 - Бифункциональный ингибитор ангиогенеза и его применение - Google Patents
Бифункциональный ингибитор ангиогенеза и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2760738C1 RU2760738C1 RU2020131764A RU2020131764A RU2760738C1 RU 2760738 C1 RU2760738 C1 RU 2760738C1 RU 2020131764 A RU2020131764 A RU 2020131764A RU 2020131764 A RU2020131764 A RU 2020131764A RU 2760738 C1 RU2760738 C1 RU 2760738C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- retinal
- angiogenesis
- polynucleotide
- bifunctional
- angiogenesis inhibitor
- Prior art date
Links
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 title claims abstract description 30
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 78
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 30
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 15
- 206010057430 Retinal injury Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 206010012688 Diabetic retinal oedema Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 201000011190 diabetic macular edema Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 5
- 208000000208 Wet Macular Degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000011325 dry age related macular degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract 5
- 206010038903 Retinal vascular occlusion Diseases 0.000 claims abstract 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 22
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 claims description 4
- 210000001210 retinal vessel Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 3
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007135 Retinal Neovascularization Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 210000005157 neural retina Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 2
- 230000004233 retinal vasculature Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 claims 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims 1
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 claims 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 42
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 46
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 45
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 34
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 29
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 25
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 24
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 24
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 20
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 20
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 12
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 12
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 10
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 9
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 8
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 8
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 8
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108010081667 aflibercept Proteins 0.000 description 6
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 4
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000851018 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 3
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F Chemical compound Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100023593 Fibroblast growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710182386 Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 229940051306 eylea Drugs 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100023600 Fibroblast growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710182389 Fibroblast growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100027844 Fibroblast growth factor receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000827746 Homo sapiens Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000917134 Homo sapiens Fibroblast growth factor receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000851030 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700036276 KH902 fusion Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100033179 Vascular endothelial growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229960002833 aflibercept Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008721 basement membrane thickening Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000004378 blood-retinal barrier Effects 0.000 description 1
- 210000004155 blood-retinal barrier Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 210000004240 ciliary body Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229950005748 conbercept Drugs 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 102000055705 human FGFR1 Human genes 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012432 intermediate storage Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000000554 iris Anatomy 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229940076783 lucentis Drugs 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000003733 optic disk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006884 regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 description 1
- PNVNVHUZROJLTJ-UHFFFAOYSA-N venlafaxine Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(CN(C)C)C1(O)CCCCC1 PNVNVHUZROJLTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 208000029257 vision disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
- A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Birds (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине, в частности к бифункциональному ингибитору ангиогенеза. Изобретение также раскрывает полинуклеотид, кодирующий указанный ингибитор, вектор, клетку-хозяин, фармацевтическую композицию, содержащие указанный ингибитор, а также способ его получения и применения. Ингибитор ангиогенеза согласно изобретению может быть использован в получении лекарственного средства для уменьшения повреждения сетчатки у субъекта с диабетом, в получении лекарственного средства для ингибирования вызванной двумя факторами VEGF и FGF или вызванной высоким уровнем глюкозы пролиферации клеток эндотелия сосудов сетчатки, а также в получении лекарственного средства для лечения связанных с ангиогенезом заболеваний глаз, причем связанные с ангиогенезом заболевания глаз выбраны из группы, состоящей из: возрастной макулодистрофии, такой как сухая форма ВМД и влажная форма ВМД, диабетической ретинопатии, такой как непролиферативная ДР, пролиферативная ДР и ДМО, диабетический макулярный отек, ретинопатии недоношенных и окклюзии сосудов сетчатки. Настоящее изобретение позволяет повысить биологическую активность и эффективность воздействия на мишени VEGF и FGF ингибиторов ангиогенеза при увеличении времени хранения обладает. 15 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 25 табл., 3 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение относится к бифункциональному ингибитору ангиогенеза и его применению, в частности, к слитому белку, обладающему VEGF-ингибирующей активностью и FGF-ингибирующей активностью, а также к его применению в ингибировании вызванной двумя факторами VEGF и FGF или вызванной повышенным уровнем глюкозы пролиферации клеток, миграции клеток и/или формирования просвета, таком как ингибирование ангиогенеза в сетчатке, связанных с ангиогенезом заболеваний глаз, диабетической ретинопатии, возрастной макулодистрофии и т.п.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Неоваскуляризация глазного дна представляет собой серьезное осложнение различных заболеваний глаз. Неоваскуляризация может происходить практически во всех тканях глаза, таких как роговица, цилиарное тело радужной оболочки, сосудистая оболочка, сетчатка, желтое пятно и диск зрительного нерва, вызывая серию патологических изменений, таких как кровоизлияние в ткани, экссудацию и гиперплазию этих областей, нарушая, таким образом, структуру и функцию глазного яблока и вызывая серьезное нарушение зрительной функции. Эта серия заболеваний глазного дна включает диабетическую ретинопатию (ДР), ретинопатию недоношенных (РН), возрастную макулодистрофию (ВМД) и т.п., которые серьезно влияют на зрение и даже вызывают слепоту.
[0003] Исследования показали, что VEGF в настоящее время известен как наиболее специфический и эффективный фактор роста для ангиогенеза. С 1990-х годов лекарственные средства, направленно воздействующие на VEGF и ингибирующие ангиогенез в глазном дне путем блокирования сигнального пути VEGF, стали активным направлением для разработки. Ранибизумаб (торговое название Луцентис) может специфично связываться с VEGF-A, и был одобрен FDA США для лечения влажной формы возрастной макулодистрофии и диабетического макулярного отека. VEGF Trap-Eye (афлиберцепт или Эйлеа) представляет собой рекомбинантный белок против VEGF, разработанный Regeneron Pharmaceuticals в США, и была подана дополнительная заявка на лечение ДМО, поскольку по результатам клинических исследований была продемонстрирована удовлетворительная эффективность при ДМО (диабетическом макулярном отеке). KH902 (конберцепт) представляет собой VEGFR-Fc рекомбинантный белок, разработанный компанией Chengdu Kanghong Company для лечения возрастной макулодистрофии (ВМД), который был одобрен для выпуска в продажу в декабре 2013 года. Успешное применение ранибизумаба с VEGF в качестве мишени в клинических исследованиях и клиническое применение при ДР показывает, что VEGF является одной из основных эффективных мишеней при ДР.
[0004] Хотя лекарственные средства, направленно воздействующие на VEGF, претерпели существенный клинический прогресс, регуляция ангиогенеза является очень сложным процессом с динамическим балансом, поскольку ангиогенез регулируется множеством факторов. Из-за значительных ограничений существующих лекарственных средств в клиническом лечении, способы дополнительного улучшения эффекта клинического лечения средствами против ангиогенеза не только представляют проблему, которую необходимо решить исследователям, но и являются предметом исследований и разработок следующего поколения антиангиогенных средств.
[0005] Фактор роста фибробластов (FGF), который представляет собой семейство факторов роста, которые связываются с гепарином, играет важную роль в различных биологических функциях, таких как пролиферация клеток, дифференцировка, миграция, ангиогенез и туморогенез. Он выполняет свои различные биологические функции при связывании и активации рецепторов FGF (FGFR) на клеточной поверхности. Рецептор фактора роста фибробластов (FGFR) представляет собой рецептор, который связывается с членами семейства факторов роста фибробластов (FGF), и часть которого участвует в патологическом процессе.
[0006] Заявители в патенте CN201110131029.X раскрыли биспецифический слитый белок, направленно воздействующий на VEGF и FGF (слитый белок 28# в патенте CN 201110131029.X, далее кратко обозначаемый как VF28), результаты исследований показали, что слитый белок VF28 обладает хорошей биологической активностью и может эффективно воздействовать на мишени VEGF и FGF, оказывая значимый эффект при лечении или профилактике опухолей и/или заболеваний, связанных с глазным ангиогенезом. Однако в ходе исследования было обнаружено, что активность полученного VF28 становилась нестабильной при увеличении времени хранения. В длительных тестах 3 партий стоковых растворов VF28 (в условиях длительного теста при -80°C±10°C) анализ активности связывания (метод ИФА) проводили после хранения в течение 0 часа, 1 месяца, 3 месяцев, 6 месяцев, при этом данные показали, что результаты тестов активности связывания 1 партии, 2 партий и 3 партий стоковых растворов VF28 соответственно не соответствовали требованиям критериев оценки в каждой точке времени мониторинга через 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев (из-за несоответствия активности связывания в конце FGF). В тесте на стабильность трех партий готовых продуктов VF28 в условиях ускоренного теста анализ клеточной активности проводили после помещения на один месяц в условия ускоренного теста при 25°C±2°C. Результаты показали, что результаты теста клеточной активности одной из трех партий готовых продуктов VF28 превышали критерии оценки и не соответствовали критериям оценки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] В ответ на вышеуказанные проблемы настоящее изобретение относится к бифункциональному ингибитору ангиогенеза с модифицированной структурой, RC28-05, направленно воздействующему на VEGF и FGF, который не только обладает хорошей биологической активностью и может эффективно ингибировать ангиогенез в сетчатке, оказывая заметное терапевтическое действие при заболеваниях глаз, таких как диабетическая ретинопатия, возрастная макулодистрофия, но также и продукты, полученные на его основе, являются стабильными при хранении, не разлагаются и имеют низкие требования к температуре при хранении и окружающей среде.
[0008] В частности, настоящее изобретение относится к бифункциональному ингибитору ангиогенеза, имеющему аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1.
[0009] Кроме того, бифункциональный ингибитор ангиогенеза имеет VEGF-ингибирующую активность и FGF-ингибирующую активность.
[0010] Кроме того, бифункциональный ингибитор ангиогенеза может ингибировать вызванную двумя факторами VEGF и FGF или вызванную высоким уровнем глюкозы пролиферацию клеток, миграцию клеток и/или формирование просвета.
[0011] Настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для ингибирования ангиогенеза в сетчатке.
[0012] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для лечения связанных с ангиогенезом заболеваний глаз.
[0013] Предпочтительно связанные с ангиогенезом заболевания глаз выбраны из группы, состоящей из: возрастной макулодистрофии, такой как сухая форма ВМД и влажная форма ВМД, диабетической ретинопатии, такой как непролиферативная ДР, пролиферативная ДР и ДМО, диабетического макулярного отека, ретинопатии недоношенных и окклюзии сосудов сетчатки.
[0014] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в лекарственном средстве для уменьшения повреждения сетчатки у субъекта с диабетом.
[0015] Предпочтительно повреждение сетчатки является кратковременным повреждением сетчатки.
[0016] Кроме того, кратковременное повреждение сетчатки выбрано из группы, состоящей из сокращения количества апоптотических клеток в сосудистой сети сетчатки, уменьшения проникновения через гемато-ретинальный барьер, ингибирования реактивной пролиферации глиальных клеток сетчатки и улучшения ультраструктуры невральной сетчатки и кровеносных сосудов сетчатки.
[0017] Предпочтительно повреждение сетчатки является долговременным повреждением сетчатки.
[0018] Кроме того, долговременное повреждение сетчатки выбрано из группы, состоящей из уменьшения проникновения через ретинальный барьер и ингибирования утолщения базальной мембраны капилляров.
[0019] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для улучшения области аваскулярной перфузии сетчатки или уменьшения количества ядер клеток ретинальной неоваскуляризации у субъекта с ретинопатией. Предпочтительно субъект с ретинопатией является недоношенным ребенком.
[0020] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для уменьшения пролиферации эндотелиальных клеток сосудов сетчатки, миграции и/или формирования просвета у субъекта.
[0021] Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую бифункциональный ингибитор ангиогенеза, где аминокислотная последовательность бифункционального ингибитора ангиогенеза показана в SEQ ID NO: 1, а нуклеотидная последовательность показана в SEQ ID NO:3.
[0022] Настоящее изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, включающей вышеуказанный полинуклеотид, где полинуклеотид функционально связан с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые направляют продукцию полипептида в хозяине экспрессии.
[0023] Настоящее изобретение также относится к вектору, включающему вышеуказанный полинуклеотид, предпочтительно вектор является вектором экспрессии, где полинуклеотид функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, которые направляют продукцию полипептида в хозяине экспрессии.
[0024] Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, включающей вышеуказанную полинуклеотидную конструкцию или нуклеиновую кислоту, или вектор экспрессии, где полинуклеотид функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, которые направляют продукцию полипептида. Предпочтительно клетка является клеткой млекопитающего или гуманизированной клеткой. Более предпочтительно клетка является клеткой CHO.
[0025] Настоящее изобретение также относится к способу получения бифункционального ингибитора ангиогенеза, включающему культивирование клетки-хозяина, описанной в любом из предыдущих пунктов, при условиях, обеспечивающих экспрессию бифункционального ингибитора ангиогенеза, и выделение ингибитора.
[0026] Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей полипептид и/или вектор, описанный в любом из предыдущих абзацев.
[0027] Настоящее изобретение также относится к набору, включающему вышеуказанную композицию.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0028] Фиг. 1. Ингибиторные эффекты VF28 и RC28-05 в отношении пролиферации клеток HUVEC, стимулированных VEGF165.
[0029] Фиг. 2. Ингибиторные эффекты VF28 и RC28-05 в отношении пролиферации клеток HUVEC, стимулированных bFGF.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0030] Определения:
[0031] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют свои обычные значения, известные средним специалистам в данной области. По поводу определений и терминов в уровне техники специалисты в данной области могут, в частности, обратиться к Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel). Сокращенные обозначения аминокислотных остатков являются стандартными 3-буквенными и/или 1-буквенными кодами, используемыми в данной области для обозначения одной из 20 обычно используемых L-аминокислот.
[0032] Хотя числовые диапазоны и приближенные значения параметров показаны в широком объеме настоящего изобретения, числовые значения, показанные в конкретных примерах, записаны с максимальной точностью. Однако любое числовое значение должно содержать некоторую ошибку, которая вызвана стандартным отклонением соответствующих измерений. Кроме того, следует понимать, что все раскрытые в настоящем изобретении диапазоны охватывают любые возможные поддиапазоны, входящие в них. Например, записанный диапазон "от 1 до 10" следует рассматривать как включающий любые возможные поддиапазоны между минимальным значением 1 и максимальным значением 10 (включая конечные точки); то есть все поддиапазоны, начинающиеся с минимального значения 1 или больше, например от 1 до 6,1, и поддиапазоны, заканчивающиеся максимальным значением 10 или меньше, например от 5,5 до 10. Кроме того, любую ссылку, указанную как "включенную в настоящий документ", следует понимать как включенную во всей своей полноте.
[0033] При использовании в настоящем изобретении термин "растворимый" белок относится к белку, который растворяется в водном растворе при биологических значениях температуры, уровня рН и осмотического давления. В некоторых конкретных технических решениях слитый белок согласно настоящему изобретению является растворимым слитым белком.
[0034] При использовании в настоящем изобретении термин "выделенный" относится к следующим веществам и/или соединениям, которые: (1) отделены от по меньшей мере некоторых компонентов, первоначально связанных с ним (в естественном окружении и/или в условиях теста), и/или (2) получены, изготовлены и/или произведены искусственно. Отделенные вещества и/или соединения могут быть отделены по меньшей мере от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, по существу 100% или 100% других компонентов, первоначально связанных с ними. В некоторых конкретных технических решениях слитый белок согласно настоящему изобретению является выделенным слитым белком.
[0035] Термин "VEGF" при использовании в настоящем изобретении относится к фактору роста эндотелия сосудов. Термин "VEGFR" при использовании в настоящем изобретении относится к рецептору фактора роста эндотелия сосудов, которым может быть VEGFR1, VEGFR2 и/или VEGFR3. Предпочтительно VEGFR в настоящем изобретении представляет собой VEGFR1 и/или VEGFR2, предпочтительно VEGFR человека.
[0036] Термин "FGF" при использовании в настоящем изобретении относится к фактору роста фибробластов. Термин "FGFR" при использовании в настоящем изобретении относится к рецептору фактора роста фибробластов, которым может быть FGFR1, FGFR2, FGFR3 и/или FGFR4. Предпочтительно FGFR в настоящем изобретении представляет собой FGFR1, более предпочтительно FGFR1 человека.
[0037] Термин "субъект" при использовании в настоящем изобретении включает млекопитающих, таких как человек, таких как домашние животные (такие как собаки, кошки и т.п.), домашних животных (таких как коровы, овцы, свиньи, лошади и т.п.) или лабораторных животных (таких как обезьяны, крысы, мыши, кролики, морские свинки и т.п.).
[0038] Слитый белок согласно настоящему изобретению может дополнительно включать посттрансляционные модификации. Такие модификации включают, без ограничения, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование. В результате модифицированный белок может включить неаминокислотные компоненты, такие как полиэтиленгликоль, липиды, полисахариды или моносахариды и фосфорную кислоту. Влияние таких неаминокислотных компонентов на функцию белка можно тестировать, как описано в настоящем изобретении. В случае продукции белков в клетках, посттрансляционный процессинг также может быть важен для правильного фолдинга и/или функции слитого белка. Различные клетки (такие как CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 или HEK293) имеют специфический клеточный аппарат и уникальные механизмы для такой посттрансляционной активности, и для обеспечения правильной модификации и процессинга белков могут быть выбраны разные клетки.
[0039] Белки, описанные в настоящем изобретении, могут быть получены любым способом, известным в уровне техники. Например, они могут быть получены с помощью химического синтеза или при экспрессии нуклеиновой кислоты. Пептиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть легко получены в соответствии с хорошо известными стандартными методами жидкофазного или, предпочтительно, твердофазного пептидного синтеза, известными в данной области (см., например, J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), в M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)). Слитый белок можно получить при использовании известных в данной области методик образования одной или более внутримолекулярных поперечных связей между остатками цистеина, расположенными в полипептидной последовательности, которая, как ожидается, будет включена в белок (см., например, патент США 5478925). Кроме того, слитый белок, описанный в настоящем изобретении, может быть стандартно модифицирован путем добавления цистеинов или биотинов на C-конец или N-конец гибридного белка.
[0040] Термин "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" при использовании в настоящем изобретении относится к дозе, достаточной для демонстрации своего действия субъекту, которому будут ее вводить. Фактическое количество, а также частота и график введения будут зависеть от собственного состояния субъекта и тяжести состояния. Назначение лечения (например, определение дозы и т.п.), в конечном счете, является сферой ответственности врачей общей практики и других врачей и зависит от принятия ими решения, обычно с учетом заболевания, подлежащего лечению, состояния отдельного пациента, участка доставки, способа введения и других факторов, известных врачам.
[0041] При использовании в настоящем изобретении термин "VF28" означает определенный слитый белок VEGFR-FGFR, включающий второй Ig-подобный домен VEGFR1, третий Ig-подобный домен VEGFR2 и часть, полученную из промежуточной функциональной области последовательности Ig-подобного домена FGFR, второго Ig-подобного домена FGFR, третьего Ig-подобного домена FGFR и Fc-фрагмента. VF28 является сокращенным обозначением 28# слитого белка в китайском патенте 201110131029.X, способ конструирования которого и другую соответствующую информацию можно найти в описании китайского патента 201110131029.X. В частности, аминокислотная последовательность VF28 показана в SEQ ID NO:2.
[0042] При использовании в настоящем изобретении термин "стоковый раствор" относится к раствору слитого белка, очищенному и фасованному в контейнере для промежуточного хранения. Стоковый раствор в настоящем изобретении получают с помощью афинной хроматографии, обработки с целью удаления вируса, грубой фильтрации и хроматографии, а также тонкой фильтрации раствора клеточной культуры. Термин "готовый продукт" при использовании в настоящем изобретении относится к раствору слитого белка, полученному путем стерилизации и фильтрации стокового раствора с его последующим фасованием в стерильный конечный контейнер и упаковкой. Готовый продукт в настоящем патенте получают путем стерилизации и фильтрации стокового раствора с добавлением в некотором соотношении вспомогательных материалов (дигидрофосфата натрия, хлорида натрия, сахарозы, полисорбата 80).
[0043] При использовании в настоящем изобретении термин "FGF-Trap" относится к слитому белку FGFR-Fc, который может использоваться в качестве ловушки (англ. trap) FGF, антагонистически воздействуя, таким образом, на FGF. В частности, FGF-Trap, используемый в примерах настоящего изобретения, представляет собой слитый белок 26# FGFR, способ конструирования которого и другую соответствующую информацию можно найти в CN102219860A.
[0044] Термин "VEGF-Trap" при использовании в настоящем изобретении относится к слитому белку VEGFR-Fc, который может использоваться в качестве ловушки VEGF, антагонистически воздействуя, таким образом, на VEGF. В частности, VEGF-Trap, используемый в примерах настоящего изобретения, представляет собой рекомбинантный белок против VEGF (EYLEA, Эйлеа), разработанный компанией Regeneron Pharmaceutical, США, который доступен в продаже.
[0045] Примеры используются для более подробного описания и пояснения настоящего изобретения и не должны рассматриваться в качестве ограничения настоящего изобретения.
[0046] Пример 1: Выбор клеток-хозяев
[0047] Клетки яичника китайского хомячка (CHO/dhfr-), дефицитные по гену дигидрофолатредуктазы (DHFR), были приобретены в ATCC, США под номером в каталоге CRL-9096 и номером партии 3916620. Клетки CHO/dhfr культивировали в полной среде IMDM с добавлением гипоксантина и тимидина (HT) и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки были полигональными и росли адгерентно. После 3 пассажей клетки замораживали в жидком азоте для хранения. Для получения клеток CHO/dhfr, адаптированных к бессывороточной суспензионной культуре, пробирку с замороженными клетками размораживали в водяной бане при 37°C и суспендировали в среде Ex-Cell 302 CHO (Sigma), содержащей 10% FBS и HT, затем адгерентно выращивали во флаконе для культур клеток. Если клетки росли хорошо, их суспендировали в 30 мл среды Ex-Cell 302 CHO, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки, для культивирования во встряхиваемом флаконе. Когда клетки вырастали до 1-2×106/мл, клетки переносили в среду для культивирования клеток Ex-Cell 302 CHO, содержащую 2,5% фетальной бычьей сыворотки, для культивирования во встряхиваемом флаконе. Таким образом, поэтапно проводили адаптацию в среде Ex Cell 302, содержащей 1,5% и 0,5% фетальной телячьей сыворотки, соответственно, при культивировании во встряхиваемом флаконе. Наконец, клетки суспендировали в бессывороточной среде Ex Cell 302 CHO для культивирования во встряхиваемом флаконе. Если клетки росли хорошо, клетки собирали с помощью центрифугирования, суспендировали в среде Ex-Cell 302 CHO, содержащей 10% ДМСО, и замораживали в жидком азоте для хранения, получив банк исходных клеток CHO, адаптированных в бессывороточной культуре. Клетки СНО, адаптированные в бессывороточной культуре, были круглыми или почти круглыми в условиях суспензионной культуры.
[0048] Пример 2: Ген, представляющий интерес
[0049] Слитый белок RC28-05 является слитым белком с бифункциональной, ингибирующей ангиогенез активностью, который состоит из неполных аминокислотных последовательностей VEGFR и FGFR, слитых с Fc-фрагментом иммуноглобулина человека, аминокислотная последовательность которого показана ниже (как показано в SEQ ID NO:1):
GRPFVEMYSE IPEIIHMTEG RELVIPCRVT SPNITVTLKK FPLDTLIPDG KRIIWDSRKG 60
FIISNATYKE IGLLTCEATV NGHLYKTNYL THRQTNTIID VVLSPSHGIE LSVGEKLVLN 120
CTARTELNVG IDFNWEYPSS KHQHKKLVNR DLKTQSGSEM KKFLSTLTID GVTRSDQGLY 180
TCAASSGLMT KKNSTFVRVH EKPVAPYWTS PEKMEKKLHA VPAAKTVKFK CPSSGTPNPT 240
LRWLKNGKEF KPDHRIGGYK VRYATWSIIM DSVVPSDKGN YTCIVENEYG SINHTYQLDV 300
VERSPHRPIL QAGLPANKTV ALGSNVEFMC KVYSDPQPHI QWLKHIEVNG SKIGPDNLPY 360
VQILKTAGVN TTDKEMEVLH LRNVSFEDAG EYTCLAGNSI GLSHHSAWLT VLEADKTHTC 420
PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN 480
AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP 540
QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL 600
YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K 641
[0050] Нуклеотидная последовательность RC28-05 показана ниже (1923 пн) (как показано в SEQ ID NO: 3):
ggtagaccat tcgtagagat gtacagtgaa atccccgaaa ttatacacat gactgaagga 60
agggagctcg tcattccctg ccgggttacg tcacctaaca tcactgttac tttaaaaaag 120
tttccacttg acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaagggc 180
ttcatcatat caaatgcaac gtacaaagaa atagggcttc tgacctgtga agcaacagtc 240
aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac aatcatagat 300
gtggttctga gtccgtctca tggaattgaa ctatctgttg gagaaaagct tgtcttaaat 360
tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata cccttcttcg 420
aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtctgg gagtgagatg 480
aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540
acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600
gaaaaacccg tagctccata ttggacatcc ccagaaaaga tggaaaagaa attgcatgca 660
gtgccggctg ccaagacagt gaagttcaaa tgcccttcca gtgggacccc aaaccccaca 720
ctgcgctggt tgaaaaatgg caaagaattc aaacctgacc acagaattgg aggctacaag 780
gtccgttatg ccacctggag catcataatg gactctgtgg tgccctctga caagggcaac 840
tacacctgca ttgtggagaa tgagtacggc agcatcaacc acacatacca gctggatgtc 900
gtggagcggt cccctcaccg gcccatcctg caagcagggt tgcccgccaa caaaacagtg 960
gccctgggta gcaacgtgga gttcatgtgt aaggtgtaca gtgacccgca gccgcacatc 1020
cagtggctaa agcacatcga ggtgaatggg agcaagattg gcccagacaa cctgccttat 1080
gtccagatct tgaagactgc tggagttaat accaccgaca aagagatgga ggtgcttcac 1140
ttaagaaatg tctcctttga ggacgcaggg gagtatacgt gcttggcggg taactctatc 1200
ggactctccc atcactctgc atggttgacc gttctggaag ccgacaaaac tcacacatgc 1260
ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 1320
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 1380
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1440
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1500
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1560
gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1620
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1680
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1740
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1800
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1860
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1920
aaa 1923
[0051] Обычный вектор экспрессии встраивали после введения двух сайтов расщепления на оба конца последовательности гена-мишени RC28-05. Клетки CHO трансфицировали общим методом для отбора штамма клеток, экспрессирующих RC28-05, и проводили экспрессию слитого белка RC28-05.
[0052] Пример 3: Анализ аффинности слитого белка
[0053] VF28 и RC28-05 тестировали на аффинность при использовании ForteBio Octet (PALL). PBS (pH 7,4) добавляли в виде сбалансированного раствора в каждую лунку колонки 1 планшета для детектирования A-E, датчик погружали в раствор и активировали в течение 10 мин; RC28-05 и VF28 соответственно разбавляли PBS до концентрации 50 нМ и добавляли в колонку 2 рядов A-E 96-луночного планшета для анализа с помощью программы, установленной на нанесение, в течение 300 сек; PBS добавляли в качестве сбалансированного раствора в каждую лунку колонки 3 рядов A-E планшета для детектирования, с помощью программы, установленной на базовый уровень, в течение 180 сек; rhVEGF (R&D) и rhFGF (R&D) разбавляли соответственно до концентрации 500 нМ и 400 нМ при использовании PBS в качестве разбавителя, а затем серийно разводили в соотношении 1:2 для трех градиентов (всего четыре градиента) до концентрации 62,5 нМ и 50 нМ. Серийные разведения образцов добавляли в колонку 4 рядов A-D 96-луночного планшета, тогда как разведение добавляли в колонку 4 ряда E в качестве отрицательного контроля, с помощью программы, установленной на связывание, в течение 600 сек; PBS добавляли в качестве раствора для диссоциации в каждую лунку в колонке 5 рядов A-E с помощью программы, установленной на диссоциацию, в течение 1800 сек; добавляли 10 мМ глицина (pH 1,5) и PBS в качестве раствора для регенерации и раствора для нейтрализации в колонки 6 и 7 рядов A-E, соответственно, с помощью программ, соответственно установленных на регенерацию и нейтрализацию, по 15 сек каждая, с повтором 5 раз. Всего протестировали 3 цикла, данные анализировали с помощью программы Data analysis 7.0. Значение равновесной константы (KD) вычисляли с вычитанием фона при использовании соответствующего несвязанного с rhVEGF/rhFGF сенсора в качестве контроля. Результаты показаны в Таблице 1. Результаты показали, что RC28-05 и VF28 обладают хорошей аффинностью к rhVEGF и rhFGF.
Таблица 1. Статистика результатов сравнения аффинности RC28-05 и VF28
| Образцы | Факторы | Равновесная константа KD (M) | Константа связывания kon (1/Мс) | Константа диссоциации kdis (1/с) | N |
| RC28-05 | rhVEGF165 | 2,70E-10±1,28E-10 | 2,30E+05±0,64E+05 | 5,65E-05±0,75E-05 | 3 |
| VF28 | rhVEGF165 | 2,51E-10±5,65E-11 | 2,76E+05±7,94E+04 | 6,68E-05±1,31E-05 | 3 |
| RC28-05 | rhFGF2 | 3,28E-09±1,60E-09 | 2,66E+04±1,01E+04 | 7,96E-05±2,42E-05 | 3 |
| VF28 | rhFGF2 | 5,24E-09±2,07E-09 | 1,90E+04±1,74E+03 | 9,78E-05±3,26E-05 | 3 |
[0054] Пример 4: Исследование активности слитого белка в клетках
[0055] Клетки HUVEC после 10 пассажей инокулировали в 96-луночный планшет в количестве 100 мкл/лунка (т.е. 5000 клеток/лунка) при плотности, доведенной до 5×104 клеток/мл. После прикрепления клеток добавляли кондиционированную среду или фактор VEGF165 или bFGF (40 нг/мл), или VEGF165+различные концентрации лекарственных средств RC28-05 или VF28 (конечные концентрации 0, 0,0125, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1, 5, 25 нМ) или bFGF+различные концентрации лекарственных средств RC28-05 или VF28 (конечные концентрации 0, 0,0156, 0,0625, 0,25, 0,5, 1, 2, 8, 32 нМ) в количестве 100 мкл/лунка с конечным объемом культуры 200 мкл/лунка, 3 экземпляра на образец; культивирование производили непрерывно при 37°C в инкубаторе с 5% CO2. Через 72 часа после добавления лекарственного средства культуральную среду в 96-луночном планшете удаляли досуха с помощью центрифугирования и в каждую лунку добавляли базальную среду для культивирования эндотелиальных клеток, содержащую 10% CCK-8, по 100 мкл/лунка. Инкубирование проводили при 37°C в течение 4 часов и определяли OD450 с помощью фотометра для микропланшетов. Степень ингибирования соответствующими лекарственными средствами пролиферации клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF при каждой концентрации, вычисляли как уровень ингибирования пролиферации клеток % = (OD фактор - OD (фактор+лекарственное средство))/OD фактор ×100. Значения IC50 лекарственных средств вычисляли с помощью программы Prism, и уровни ингибирования максимальной концентрации лекарственного средства тестировали с применением измеренных значений. Сравнивали различия между RC28-05 и VF28 в ингибировании пролиферации клеток HUVEC при стимуляции VEGF165/bFGF. Результаты ингибирования VF28 и RC28-05 пролиферации клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF, показаны на Фиг. 1 и Фиг. 2, и статистика максимального уровня ингибирования и значений IC50 представлена в Таблице 2. Результаты показали, что RC28-05 и VF28 обладали значимым ингибирующим действием на пролиферацию клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF.
Таблица 2. Ингибирующее действие RC28-05 и VF28 на пролиферацию клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF
| Лекарственные средства | Стимулирующие факторы | IC 50 (нМ) | Максимальный уровень ингибирования (%) |
| VF28 | VEGF165 | 0,48 | 82,34±1,83 |
| bFGF | 3,20 | 70,16±2,79 | |
| RC28-05 | VEGF165 | 0,43 | 80,19±0,27 |
| bFGF | 1,50 | 70,40±1,05 |
[0056] Пример 5: Получение стоковых растворов RC28-05 и готовых продуктов
[0057] Способ получения стоковых растворов RC28-05 и готовых продуктов был таким же, как для VF28, который, в частности, был следующим:
1) После центрифунгирования раствора клеточной культуры супернатант собирали для афинной хроматографии с белком A;
2) После обработки всего собранного элюата органическими растворителями/детергентами (S/D), к элюату добавляли 1% полисорбата 80 (в/об) и 0,3% трибутилфосфата (в/об) и помещали на 20-25°C в течение 6 ч для инактивации вирусов с липидной оболочкой;
3) После вышеуказанной обработки катионообменную хроматографию на сефарозе использовали для удаления сопутствующих примесей, таких как полимеры и продукты деградации;
4) Анионообменную хроматографию проводили со всеми собранными элюатами для удаления небольшого количества агрегатов, белков клеток-хозяев (CHO), хозяйской ДНК и эндотоксинов и т.п.;
5) Пермеат после вышеуказанной хроматографии собирали и затем фильтровали на наномембране для удаления вирусов, не имеющих липидной оболочки;
6) После ультрафильтрации и концентрирования белкового раствора после наномембранной фильтрации до некоторой концентрации (10-15 мг/мл), буферный раствор в объеме 10-12 объемов концентрированного белка (0,02 моль/л дигидрофосфата натрия, 0,015 моль/л хлорида натрия, 0,2 моль/л сахарозы, pH 6,8) использовали для диализа с заменой буфера, после чего белковый раствор концентрировали (40-45 мг/мл). После добавления 0,02% (в/об) полисорбата 80 и перемешивания до растворения, производили фильтрацию с использованием мембраны с порами 0,45+0,2 мкм и получаемый в результате белковый раствор представлял собой стоковые растворы RC28-05 с концентрацией белка 40-45 мг/мл.
[0058] 7) Получение готовых продуктов: Способ получения 1000 пробирок готовых продуктов с концентрацией 40 мг/мл (0,2 мл/пробирка) был следующим. Концентрацию белка RC28-05 в вышеуказанных стоковых растворах белка определяли и обозначали как C мг/мл, при этом в общей сложности требовалось получить 220 мл раствора белка с учетом 10% потери при заполнении. При этом общее требуемое количество белка составило 220 мл*40 мг/мл*0,2 мл=8,8 г белка, и требуемый объем стокового раствора белка составил V=8,8/C*1000 (мл). Буферный раствор (0,02 моль/л дигидрофосфата натрия, 0,015 моль/л хлорида натрия, 0,2 моль/л сахарозы, 0,02% (в/об) полисорбата 80) добавляли к V мл стокового раствора белка до получения объема 220 мл и перемешивали до гомогенного состояния. Фильтрацию производили с использованием фильтрующей мембраны с размером пор не больше 0,22 мкм для стерилизации. После фасования, закатывания алюминиевой мембраной и упаковки получали готовые продукты RC28-05.
[0059] Пример 6: Исследование стабильности RC28-05 (стоковые растворы/готовые продукты)
[0060] 1. Анализ стабильности стоковых растворов RC28-05
[0061] (1) Анализ чистоты при различном времени хранения (-80°C±10°C)
[0062] 
метод ЭВЭЖХ
[0063] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331), помещали в условия длительного теста при -80°C±10°C на 0 часов, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев для анализа чистоты (метод ЭВЭЖХ). Результаты анализа чистоты тестируемых образцов с помощью эксклюзионной хроматографии в каждой контрольной точке времени показали, что все основные пики составляли ≥95,0%. Для получения более подробной информации см. Таблицу 14.
Таблица 14. Результаты анализа чистоты ЭХ стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Чистота ЭХ % | |||
| T0 | 6 мес | 9 мес | 12 мес | |
| RC28-05-YY20160329 | 98,4 | 98,2 | 98,5 | 100,0 |
| RC28-05-YY20160330 | 98,0 | 97,9 | 98,1 | 99,8 |
| RC28-05-YY20160331 | 97,7 | 97,5 | 97,8 | 99,2 |
|
Примечание: Критерием оценки чистоты после ЭХ являлся основной пик ≥95,0%;
"мес" означает "месяц". |
||||
[0064] 
метод ДСН-ПААГЭ
[0065] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331) помещали в условия длительного теста при -80°C±10°C на 0 часов, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев для анализа чистоты (метод ДСН-ПААГЭ). Результаты показаны в Таблице 15. Данные показали, что при увеличении времени хранения все результаты анализа ДСН-ПААГЭ снижения чистоты стоковых растворов RC28-05 были выше 90%.
Таблица 15. Результаты анализа чистоты ДСН-ПААГЭ стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Снижение чистоты согласно ДСН-ПААГЭ % | |||
| T0 | 6 мес | 9 мес | 12 мес | |
| RC28-05-YY20160329 | 98,1 | 98,3 | 97,7 | 97,6 |
| RC28-05-YY20160330 | 98,1 | 98,1 | 97,8 | 97,5 |
| RC28-05-YY20160331 | 98,8 | 98,2 | 97,1 | 97,8 |
|
Примечание: Критерием оценки чистоты после ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;
"мес" означает "месяц". |
||||
[0066] (2) Исследование активности в клетках стоковых растворов при разном времени хранения (-80°C±10°C)
[0067] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331), помещали в условия длительного тестирования при -80°C±10°C на 12 месяцев для анализа активности в клетках; результаты показали, что с помощью анализа активности в клетках стоковых растворов RC28-05, помещенных при -80°C±10°C на 12 месяцев, было обнаружено, что относительная активность клеток в каждую контрольную точку времени в период тестирования соответствовала требованиям качества. См. подробную информацию в Таблице 16.
Таблица 16. Результаты тестов относительной активности в клетках стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Относительная активность в клетках % | |||
| T0 | 6 мес | 9 мес | 12 мес | |
| RC28-05-YY20160329 | 85,1 | 92,8 | 81,8 | 103,3 |
| RC28-05-YY20160330 | 93,0 | 88,1 | 77,7 | 95,7 |
| RC28-05-YY20160331 | 86,7 | 100,5 | 92,7 | 106,0 |
|
Примечание: Критерием оценки активности в клетках являлось значение активности, которое должно было составлять 70-130%;
"мес" означает "месяц". |
||||
[0068] (3) Эксперимент на активность связывания стоковых растворов при разном времени хранения (-80°C±10°C)
[0069] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331), помещали в условия длительного тестирования при -80°C±10°C на 12 месяцев для анализа активности связывания (метод ИФА); результаты показали, что с помощью анализа относительной активности связывания стоковых растворов RC28-05, помещенных при -80°C ±10°C на 12 месяцев, было обнаружено, что относительная активность клеток в каждой контрольной точке времени в период тестирования соответствует требованиям качества. См. подробную информацию в Таблице 17.
Таблица 17. Результаты тестов относительной активности связывания стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Относительная активность связывания | ||||
| T0 | 6 мес | 9 мес | 12 мес | ||
| VEGF | FGF | ||||
| RC28-05-YY20160329 | 87,6 | 97,4 | 101,4 | 114,6 | 92,9 |
| RC28-05-YY20160330 | 120,2 | 109,6 | 99,6 | 105,0 | 105,6 |
| RC28-05-YY20160331 | 103,0 | 94,5 | 101,5 | 103,6 | 118,9 |
|
Примечание: Критерием оценки относительной активности связывания являлось значение относительной активности связывания, которое должно было составлять 70-130%;
T0 являлось анализом в двойной системе, тогда как остальные точки времени являлись анализом в одиночной системе "мес" означает "месяц". |
|||||
[0070] 2. Анализ стабильности готового продукта RC28-05
[0071] (1) Анализ чистоты при разном времени хранения
[0072] метод ЭВЭЖХ
[0073] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3) помещали в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, в условия ускоренного тестирования при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа чистоты (метод ЭВЭЖХ). Результаты эксперимента показали, что с помощью анализа чистоты (метод ЭВЭЖХ) готового продукта, помещенного в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все результаты испытаний чистоты ЭХ тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени в течение экспериментального периода составляли приблизительно 95%; тогда как в случае, когда готовый продукт был помещен в условия ускоренного тестирования при 25°C±2°C на 1 месяц, результаты испытаний чистоты испытательных образцов с помощью ЭХ в каждой контрольной точке времени показали, что все основные пики были ≥95,0%. См. подробную информацию в Таблице 18 и Таблице 19.
Таблица 18. Результаты тестов чистоты ЭХ готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Чистота согласно ЭХ | ||||
| T0 | 3 мес | 6 мес | 9 мес | 12 мес | |
| RC28-05-20160401-1 | 98,4 | 98,4 | 97,4 | 96,9 | 97,9 |
| RC28-05-20160401-2 | 98,1 | 98,1 | 97,0 | 96,6 | 97,1 |
| RC28-05-20160401-3 | 97,7 | 97,7 | 96,7 | 96,4 | 96,9 |
|
Примечание: Критерием оценки чистоты ЭХ являлся основной пик ≥95,0%;
"мес" означает "месяц". |
|||||
Таблица 19. Результаты тестов чистоты ЭХ готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Чистота согласно ЭХ | |||
| 0 д | 10 д | 20 д | 30 д | |
| RC28-05-20160401-1 | 98,4 | 96,6 | 96,1 | 96,6 |
| RC28-05-20160401-2 | 98,1 | 96,3 | 95,8 | 96,1 |
| RC28-05-20160401-3 | 97,7 | 96,2 | 95,6 | 95,9 |
|
Примечание: Критерием оценки чистоты ЭХ являлся основной пик ≥95,0%;
"мес" означает "месяц". |
||||
[0074] метод ДСН-ПААГЭ
[0075] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3), помещали в условия длительного тестирования при 5°C ±3°C на 12 месяцев, при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа чистоты (метод ДСН-ПААГЭ). Результаты показали, что с помощью анализа чистоты (ДСН-ПААГЭ) готового продукта RC28-05, помещенного при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все результаты анализа снижения чистоты тестируемых образцов с помощью ДСН-ПААГЭ в каждой контрольной точке времени в течение теста были больше 90,0%; посредством анализа чистоты (ДСН-ПААГЭ) готового продукта RC28-05, помещенного при 25°C±2°C на 6 месяцев было обнаружено, что снижение чистоты тестируемых образцов согласно ДСН-ПААГЭ в каждой контрольной точке времени стремилось к уменьшению, тогда как результаты всех тестов были больше 90,0%. См. подробную информацию в Таблице 20 и Таблице 21.
Таблица 20. Результаты тестов чистоты ДСН-ПААГЭ готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Снижение согласно ДСН-ПААГЭ | ||||
| 0 ч | 3 мес | 6 мес | 9 мес | 12 мес | |
| RC28-05-20160401-1 | 98,9 | 97,7 | 97,0 | 96,9 | 95,7 |
| RC28-05-20160401-2 | 97,9 | 97,6 | 96,7 | 97,7 | 95,9 |
| RC28-05-20160401-3 | 98,0 | 97,6 | 97,0 | 96,9 | 96,3 |
|
Примечание: Критерием оценки чистоты ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;
"мес" означает "месяц". |
|||||
Таблица 21. Результаты тестов снижения чистоты ДСН-ПААГЭ готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Снижение согласно ДСН-ПААГЭ | |||
| 0 д | 10 д | 20 д | 30 д | |
| RC28-05-20160401-1 | 98,9 | 96,3 | 97,5 | 97,8 |
| RC28-05-20160401-2 | 97,9 | 96,1 | 97,4 | 97,6 |
| RC28-05-20160401-3 | 98,0 | 96,0 | 96,8 | 98,1 |
|
Примечание: Критерием оценки чистоты ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;
"д" означает "день". |
||||
[0076] (2) Исследование активности в клетках готовых продуктов при разном времени хранения
[0077] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3) помещали в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа активности в клетках. Результаты показали, что с помощью анализа активности в клетках готового продукта, помещенного при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все относительные результаты активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени в течение теста удовлетворяли требованиям критериев оценки; все результаты тестов относительной активности в клетках в каждой контрольной точке времени в течение теста отвечали требованиям качества согласно анализу активности в клетках готового продукта, помещенного при 25°C±2°C на 1 месяц. См. подробную информацию в Таблице 22 и Таблице 23.
Таблица 22. Результаты тестов относительной активности в клетках готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Относительная активность в клетках | ||||
| 0 ч | 3 мес | 6 мес | 9 мес | 12 мес | |
| RC28-05-20160401-1 | 120,8 | 125,1 | 111,8 | 85,4 | 100,2 |
| RC28-05-20160401-2 | 104,3 | 125,1 | 96,1 | 85,0 | 103,4 |
| RC28-05-20160401-3 | 105,2 | 111,7 | 100,5 | 93,7 | 100,3 |
|
Примечание: Критерием оценки относительной активности в клетках являлось то, что относительная активность в клетках должна была составлять 70-130%;
"мес" означает "месяц". |
|||||
Таблица 23. Результаты тестов относительной активности в клетках готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Относительная активность в клетках | |||
| 0 д | 10 д | 20 д | 30 д | |
| RC28-05-20160401-1 | 120,8 | 103,4 | 88,7 | 110,0 |
| RC28-05-20160401-2 | 104,3 | 93,4 | 90,6 | 108,4 |
| RC28-05-20160401-3 | 105,2 | 94,4 | 88,0 | 104,1 |
|
Примечание: Критерием оценки чистоты ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;
"д" означает "день". |
||||
[0078] (3) Исследование активности связывания готовых продуктов при разном времени хранения
[0079] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3), помещали в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа активности связывания. Результаты показали, что с помощью анализа активности связывания готовых продуктов, помещенных при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все результаты относительной активности связывания тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени в течение теста удовлетворяли требованиям критериев оценки; посредством анализа активности связывания готовых продуктов при 25°C±2°C в течение 1 месяца, все результаты тестов относительной активности связывания (конец VEGF и конец FGF) в каждой контрольной точке времени в течение теста отвечали требованиям качества. См. подробную информацию в Таблице 24 и Таблице 25.
Таблица 24. Результаты тестов относительной активности связывания готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Относительная активность связывания | ||||
| 0 ч （VEGF; FGF) | 3 мес | 6 мес | 9 мес | 12 мес | |
| RC28-05-20160401-1 | 72,8; 90,5 | 111,6 | 107,6 | 104,9 | 119,3 |
| RC28-05-20160401-2 | 76,9; 76,5 | 116,1 | 102,4 | 112,0 | 109,8 |
| RC28-05-20160401-3 | 85,5; 86,1 | 107,1 | 98,5 | 110,2 | 111,1 |
|
Примечание: Критерием оценки относительной активности связывания являлось то, что относительная активность связывания должна была составлять 70-130%;
0 ч являлось анализом в двойной системе, тогда как остальные точки времени являлись анализом в одиночной системе; "мес" означает "месяц". |
|||||
Таблица 25. Результаты тестов относительной активности связывания готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
|
Периоды
Партии |
Относительная активность связывания | |||
| 0 д （VEGF; FGF) | 10 д | 20 д | 30 д | |
| RC28-05-20160401-1 | 72,8; 90,5 | 112,4 | 104,5 | 95,7 |
| RC28-05-20160401-2 | 76,9; 76,5 | 109,4 | 120,5 | 101,2 |
| RC28-05-20160401-3 | 85,5; 86,1 | 107,8 | 118,6 | 113,1 |
|
Примечание: Критерием оценки относительной активности связывания являлось то, что относительная активность связывания должна была составлять 70-130%;
0 ч являлось анализом в двойной системе, тогда как остальные точки времени являлись анализом в одиночной системе; "д" означает "день". |
||||
[0080] 3. Выводы из экспериментов
[0081] Было исследовано хранение 3 партий стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331) в условиях длительного тестирования при -80°C±10°C. Были получены следующие результаты:
[0082] Исследовали хранение 3 партий готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3) при условиях 5°C±3°C, 25°C±2°C, соответственно. Были получены следующие результаты:
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 5°C±3°C на 12 месяцев с их чистотой ЭХ ≥90%;
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 25°C±2°C на 1 месяц с их чистотой ЭХ ≥90%.
3 партии RC28-05 готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 5°C±3°C на 12 месяцев со снижением их чистоты согласно ДСН-ПААГЭ ≥90%;
3 партии RC28-05 готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 25°C±2°C на 1 месяц со снижением их чистоты согласно ДСН-ПААГЭ ≥90%.
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 5°C±3°C на 12 месяцев, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки;
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 25°C±2°C на 1 месяц, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки.
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены при 5°C±3°C на 12 месяцев, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки;
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены при 25°C±2°C на 1 месяц, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки.
[0083] Из этого могут быть сделаны следующие выводы:
В заключение следует отметить, что стоковые растворы RC28-05 были стабильными при -80°C±10°C, тогда как готовые продукты RC28-05 стабильно хранились при условиях 5°C±3°C (в течение по меньшей мере 12 месяцев) и 25°C±2°C (в течение по меньшей мере 1 месяца), время хранения которых в стабильном состоянии было намного более длительным, чем у VF28 при таких же условиях.
[0084] Настоящее изобретение было проиллюстрировано различными конкретными примерами. Однако специалист в данной области техники сумеет понять, что настоящее изобретение не ограничивается каждым конкретным вариантом осуществления, при этом средний специалист в данной области сможет внести различные изменения или модификации в рамках объема настоящего изобретения, и любые технические признаки, указанные в каких-либо разделах настоящего описания, могут быть объединены друг с другом без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. Такие изменения и модификации входят в объем настоящего изобретения.
Claims (21)
1. Бифункциональный ингибитор ангиогенеза, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1.
2. Выделенный полинуклеотид для ингибирования ангиогенеза, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую бифункциональный ингибитор ангиогенеза, где аминокислотная последовательность бифункционального ингибитора ангиогенеза показана в SEQ ID NO: 1.
3. Полинуклеотид по п. 2, имеющий нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3.
4. Конструкция нуклеиновой кислоты для ингибирования ангиогенеза, включающая полинуклеотид по п. 2 или 3, где полинуклеотид функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, направляющими продукцию полипептида в хозяине экспрессии.
5. Вектор для ингибирования ангиогенеза, включающий полинуклеотид по п. 2 или 3, в котором полинуклеотид по п. 2 или 3 функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями.
6. Вектор по п. 5, где вектор является вектором экспрессии и регуляторная последовательность направляет продукцию полипептида в хозяине экспрессии.
7. Клетка-хозяин для ингибирования ангиогенеза, включающая полинуклеотид по п. 2 или 3 или конструкцию нуклеиновой кислоты по п. 4, или вектор экспрессии по п. 6, где полинуклеотид функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, направляющими продукцию полипептида.
8. Клетка-хозяин по п. 7, которая является клеткой млекопитающего или гуманизированной клеткой, где клетка млекопитающего предпочтительно является клеткой CHO.
9. Фармацевтическая композиция для ингибирования ангиогенеза, включающая бифункциональный ингибитор ангиогенеза по п. 1 или полинуклеотид по п. 2 или 3, или конструкцию нуклеиновой кислоты по п. 4, или вектор по п. 5 или 6.
10. Набор для ингибирования ангиогенеза, включающий фармацевтическую композицию по п. 9.
11. Применение бифункционального ингибитора ангиогенеза по п. 1 или полинуклеотида по п. 2 или 3, или конструкции нуклеиновой кислоты по п. 4, или вектора по п. 5 или 6 в получении лекарственного средства для ингибирования вызванной двумя факторами VEGF и FGF или вызванной высоким уровнем глюкозы пролиферации клеток эндотелия сосудов сетчатки.
12. Применение бифункционального ингибитора ангиогенеза по п. 1 или полинуклеотида по п. 2 или 3, или конструкции нуклеиновой кислоты по п. 4, или вектора по п. 5 или 6 в получении лекарственного средства для ингибирования вызванной двумя факторами VEGF и FGF или вызванной высоким уровнем глюкозы миграции клеток эндотелия сосудов сетчатки.
13. Применение бифункционального ингибитора ангиогенеза по п. 1 или полинуклеотида по п. 2 или 3, или конструкции нуклеиновой кислоты по п. 4, или вектора по п. 5 или 6 в получении лекарственного средства для ингибирования вызванной двумя факторами VEGF и FGF или вызванной высоким уровнем глюкозы формирования просвета сосудов сетчатки.
14. Применение бифункционального ингибитора ангиогенеза по п. 1 или полинуклеотида по п. 2 или 3, или конструкции нуклеиновой кислоты по п. 4, или вектора по п. 5 или 6 в получении лекарственного средства для ингибирования ангиогенеза в сетчатке.
15. Применение бифункционального ингибитора ангиогенеза по п. 1 или полинуклеотида по п. 2 или 3, или конструкции нуклеиновой кислоты по п. 4, или вектора по п. 5 или 6 в получении лекарственного средства для лечения связанных с ангиогенезом заболеваний глаз, причем связанные с ангиогенезом заболевания глаз выбраны из группы, состоящей из: возрастной макулодистрофии, такой как сухая форма ВМД и влажная форма ВМД, диабетической ретинопатии, такой как непролиферативная ДР, пролиферативная ДР и ДМО, диабетический макулярный отек, ретинопатии недоношенных и окклюзии сосудов сетчатки.
16. Применение бифункционального ингибитора ангиогенеза по п. 1 или полинуклеотида по п. 2 или 3, или конструкции нуклеиновой кислоты по п. 4, или вектора по п. 5 или 6 в получении лекарственного средства для уменьшения повреждения сетчатки у субъекта с диабетом.
17. Применение по п. 16, в котором повреждение сетчатки является кратковременным сетчаточным повреждением или долговременным повреждением сетчатки.
18. Применение по п. 17, в котором кратковременное повреждение сетчатки выбрано из группы, состоящей из уменьшения количества апоптотических клеток в сосудистой сети сетчатки, снижения проницаемости гематоретинального барьера, ингибирования реактивной пролиферации глиальных клеток сетчатки и улучшения ультраструктуры невральной сетчатки и кровеносных сосудов сетчатки, в случае кратковременного повреждения сетчатки; и долговременное повреждение сетчатки выбрано из группы, состоящей из уменьшения проницаемости гематоретинального барьера и ингибирования утолщения базальной мембраны капилляров.
19. Применение бифункционального ингибитора ангиогенеза по п. 1 или полинуклеотида по п. 2 или 3, или конструкции нуклеиновой кислоты по п. 4, или вектора по п. 5 или 6 в получении лекарственного средства для улучшения области аваскулярной перфузии сетчатки или уменьшения количества ядер клеток ретинальной неоваскуляризации у субъекта с ретинопатией.
20. Применение по п. 19, в котором субъектом с ретинопатией является недоношенный ребенок.
21. Способ получения бифункционального ингибитора ангиогенеза по п. 1, включающий культивирование клетки-хозяина по пп. 7, 8 в условиях, обеспечивающих экспрессию бифункционального ингибитора ангиогенеза и выделение ингибитора.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811491023 | 2018-12-07 | ||
| CN201811491023.1 | 2018-12-07 | ||
| PCT/CN2019/122854 WO2020114411A1 (zh) | 2018-12-07 | 2019-12-04 | 一种双功能血管生成抑制剂及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2760738C1 true RU2760738C1 (ru) | 2021-11-30 |
Family
ID=70974494
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020131764A RU2760738C1 (ru) | 2018-12-07 | 2019-12-04 | Бифункциональный ингибитор ангиогенеза и его применение |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11629180B2 (ru) |
| EP (1) | EP3812402B1 (ru) |
| JP (2) | JP7516381B2 (ru) |
| KR (2) | KR20240014579A (ru) |
| CN (1) | CN111328336B (ru) |
| AU (1) | AU2019394227B2 (ru) |
| BR (1) | BR112021003275A2 (ru) |
| CA (1) | CA3092320C (ru) |
| RU (1) | RU2760738C1 (ru) |
| SG (1) | SG11202101354RA (ru) |
| TW (1) | TWI732372B (ru) |
| WO (1) | WO2020114411A1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007014123A2 (en) * | 2005-07-22 | 2007-02-01 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating disease with fgfr fusion proteins |
| CN1915427A (zh) * | 2006-03-31 | 2007-02-21 | 成都康弘生物科技有限公司 | Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用 |
| RU2560589C2 (ru) * | 2011-05-20 | 2015-08-20 | Яньтай Жунчан Байотекнолоджиз Ко., Лтд. | Слитный белок антиангиогенного индуцирующего фактора и его применение |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL99120A0 (en) | 1991-08-07 | 1992-07-15 | Yeda Res & Dev | Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| EP1214346A1 (en) * | 1999-09-15 | 2002-06-19 | Mogam Biotechnology Research Institute | A novel angiogenesis inhibitor |
| CN101219859B (zh) * | 2007-11-30 | 2011-09-28 | 华南理工大学 | 纳米油性ato隔热浆料与制备方法及其应用 |
| JP5787757B2 (ja) | 2008-08-04 | 2015-09-30 | ファイブ プライム セラピューティックス インコーポレイテッド | Ｆｇｆｒ細胞外ドメイン酸性領域突然変異タンパク質 |
| CN102219860B (zh) | 2011-05-20 | 2012-09-12 | 烟台荣昌生物工程有限公司 | FGFR-Fc融合蛋白及其用途 |
| CN112206309A (zh) | 2019-07-11 | 2021-01-12 | 滨州医学院 | 双靶点血管抑制剂在制备预防或治疗纤维化药物中的用途 |
-
2019
- 2019-12-04 CN CN201980005071.1A patent/CN111328336B/zh active Active
- 2019-12-04 AU AU2019394227A patent/AU2019394227B2/en active Active
- 2019-12-04 WO PCT/CN2019/122854 patent/WO2020114411A1/zh unknown
- 2019-12-04 JP JP2021534423A patent/JP7516381B2/ja active Active
- 2019-12-04 CA CA3092320A patent/CA3092320C/en active Active
- 2019-12-04 RU RU2020131764A patent/RU2760738C1/ru active
- 2019-12-04 US US16/981,652 patent/US11629180B2/en active Active
- 2019-12-04 KR KR1020247001354A patent/KR20240014579A/ko active Application Filing
- 2019-12-04 KR KR1020217007660A patent/KR20210087016A/ko active Search and Examination
- 2019-12-04 BR BR112021003275-4A patent/BR112021003275A2/pt unknown
- 2019-12-04 SG SG11202101354RA patent/SG11202101354RA/en unknown
- 2019-12-04 EP EP19892434.2A patent/EP3812402B1/en active Active
- 2019-12-06 TW TW108144682A patent/TWI732372B/zh active
-
2023
- 2023-01-25 JP JP2023009370A patent/JP2023052623A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007014123A2 (en) * | 2005-07-22 | 2007-02-01 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating disease with fgfr fusion proteins |
| CN1915427A (zh) * | 2006-03-31 | 2007-02-21 | 成都康弘生物科技有限公司 | Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用 |
| RU2560589C2 (ru) * | 2011-05-20 | 2015-08-20 | Яньтай Жунчан Байотекнолоджиз Ко., Лтд. | Слитный белок антиангиогенного индуцирующего фактора и его применение |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЩУКО А.Г. и др., Ингибиторы ангиогенеза в лечении различных видов сосудистой и неоваскулярной патологии глаза, Офтальмохирургия, No. 2, 2012, c. 30-35. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3092320C (en) | 2023-09-19 |
| EP3812402A1 (en) | 2021-04-28 |
| CN111328336A (zh) | 2020-06-23 |
| JP2023052623A (ja) | 2023-04-11 |
| AU2019394227A1 (en) | 2020-10-01 |
| EP3812402C0 (en) | 2024-11-20 |
| EP3812402A4 (en) | 2022-04-20 |
| US11629180B2 (en) | 2023-04-18 |
| WO2020114411A1 (zh) | 2020-06-11 |
| KR20210087016A (ko) | 2021-07-09 |
| KR20240014579A (ko) | 2024-02-01 |
| BR112021003275A2 (pt) | 2021-06-22 |
| EP3812402B1 (en) | 2024-11-20 |
| JP2021534825A (ja) | 2021-12-16 |
| TW202033562A (zh) | 2020-09-16 |
| CN111328336B (zh) | 2024-01-30 |
| SG11202101354RA (en) | 2021-03-30 |
| US20210324039A1 (en) | 2021-10-21 |
| TWI732372B (zh) | 2021-07-01 |
| JP7516381B2 (ja) | 2024-07-16 |
| AU2019394227B2 (en) | 2023-04-06 |
| CA3092320A1 (en) | 2020-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2021202382B2 (en) | Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease | |
| US20220118049A1 (en) | Methods for dosing an actriib antagonist and monitoring of treated patients | |
| US11260107B2 (en) | Methods and compositions for treating ulcers | |
| US10968262B2 (en) | Methods of increasing sarcolemmal utrophin | |
| AU2015320084B2 (en) | Recombinant fusion protein formulation | |
| CN108697793A (zh) | 治疗眼睛疾病的方法 | |
| TW200906849A (en) | Natriuretic fusion proteins | |
| KR20130118203A (ko) | 매트릭스 무기물화 장애의 처리방법, 조성물 및 키트 | |
| TW201006487A (en) | Use of GDF traps to increase red blood cell levels | |
| KR20170117107A (ko) | Vegf 및 pdgf의 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 | |
| US20240366722A1 (en) | Compositions and methods for treating renal diseases or conditions | |
| US12168683B2 (en) | Binders of TGFβ-superfamily ligands and uses thereof | |
| RU2760738C1 (ru) | Бифункциональный ингибитор ангиогенеза и его применение | |
| US12103959B2 (en) | Multispecific binders of TGFBeta-superfamily ligands and uses thereof | |
| CN110520152A (zh) | 与靶向组织因子的igg3免疫缀合物有关的方法和组合物 | |
| RU2791486C2 (ru) | Рекомбинантные белки robo2, композиции, способы и их применение |