CN112206309A

CN112206309A - 双靶点血管抑制剂在制备预防或治疗纤维化药物中的用途

Info

Publication number: CN112206309A
Application number: CN201910622564.1A
Authority: CN
Inventors: 姜静; 寇相英; 孙业盈; 李慎军
Original assignee: Rongchang Biopharmaceutical Yantai Co Ltd; Binzhou Medical College
Current assignee: Rongchang Biopharmaceutical Yantai Co Ltd; Binzhou Medical College
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2021-01-12
Also published as: WO2021004549A1

Abstract

本发明涉及应用双靶点血管抑制剂治疗纤维化疾病领域，更具体而言，涉及双靶点血管抑制剂在制备用于预防或治疗纤维化疾病药物的用途。

Description

双靶点血管抑制剂在制备预防或治疗纤维化药物中的用途

技术领域

本发明涉及应用双靶点血管抑制剂治疗纤维化疾病领域，更具体而言，涉及双靶点血管抑制剂药物在抗纤维化疾病的新用途。

背景技术

纤维化的过程，是指成纤维细胞迁徙增殖和细胞外基质成分积聚的过程。肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损伤经过异常修复导致结构异常(疤痕形成)。特发性肺纤维化(IPF)是肺纤维化病变中最常见的表现形式。其特征为弥漫性肺泡炎症和纤维化性肺病。其临床表现是运动时呼吸困难，呼吸衰竭和心力衰竭，最终可导致死亡。多肽介质和生长因子包括转化生长因子(TGF)-β、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-2、血小板衍生生长因子(PDGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子因子、趋化因子配体-18和内皮素(ET)-1被认为是促进纤维化过程的关键因素。

血管生成是组织损伤反应的基本部分，组织损伤涉及纤维化的发展。最近的研究表明，血管生成在慢性肝病的纤维化进展中发挥关键作用，并且在实验和临床研究中抑制病理性血管生成可以使肝纤维化消退或逆转。血管新生过程也受到生长因子、生长因子受体以及细胞和细胞外基质间相互作用的调控。在生长因子及其受体中，血管内皮生长因子(VEGF)对血管新生的作用最为突出。其他一些生长因子，如PDGF、bFGF、TGF-β及它们的受体等，也在血管新生、成熟和重建中发挥重要作用。近来有研究报道，贝伐单抗(Bevacizumab，Avastin)可以与人VEGF结合阻断其生物学活性，能显著降低四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠血清中天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、总胆红素的含量，下调肝组织中α-SMA、转化生长因子β的表达，亦可抑制HSC的活化和迁移，从而阻止或延缓肝脏纤维化。转染可溶性VEGF受体(sflt-1)基因导致博来霉素诱导的肺病小鼠模型中肺纤维化的减弱，表明通过抑制VEGF可能会提供合适的抗肺部纤维化治疗效果。

纤维化进程中，成纤维细胞生长因子(FGF)可刺激成纤维细胞向损伤部位迁徙增殖，增加胶原蛋白和纤维连接蛋白合成，抑制金属蛋白酶对细胞外基质的降解作用，促进纤维化的发生和发展。早期报道显示，FGF-2在纤维化肾组织表达增加，FGF-2表达促进成纤维细胞增殖,均提示FGF-2与肾间质纤维化相关。FGF靶向调节可能为抗肾间质纤维化治疗的策略之一。

目前针对VEGF和FGF的上市药物主要是小分子化学药，如Nintedanib、Lenvatinib。其中Nintedanib是一种有效的三重血管激酶抑制剂，作用于VEGFR1/2/3，FGFR1/2/3和PDGFRα/β，已被FDA批准用于特发性肺纤维化(IPF)的治疗(刘佳梅等，特发性纤维化药物治疗进展临床药物治疗杂志第13卷，第3期，2015年5月)。总体来看，目前上市的几种药物治疗效果存在提升的需求，并且还可能伴随有比较严重的副作用，例如：尼达尼布(Nintedanib)在使用过程中最常见不良反应(≥5％)是：腹泻，恶心，腹痛，呕吐，肝酶升高，食欲减退，头痛，体重减轻，和高血压，少数病人(0.3％)甚至产生胃穿孔症状(尼达尼布(Ofev，Nintedanib)FDA官方说明书，批准日期：2014年10月15日；公司：勃林格殷格翰制药公司)。

在中国专利CN102219859B中公开了一种靶向VEGF和FGF的双特异性融合蛋白(参见权利要求1，14)，由衍生自VEGFR胞外区的部分和FGFR胞外区的部分与免疫球蛋白Fc片段融合而成；所述衍生自VEGFR胞外区的部分包含：VEGFR1的第二Ig样结构域和VEGFR2的第三Ig样结构域，所述衍生自FGFR胞外区的部分由以下组成：源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域和FGFR第三Ig样结构域，其中所述FGFR Ig样结构域中间功能性序列区是FGFR蛋白中第一Ig样结构域和第二Ig样结构域之间的序列，并且所述源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分对应于SEQ ID NO：1(同本申请序列表中SEQID NO：1)中起点为选自第119至151位的氨基酸至终点为第162位氨基酸的氨基酸序列，上述结构域和/或部分之间直接连接和/或通过接头连接。所述免疫球蛋白Fc区进一步可优选为人IgG1Fc区。进一步优选的，所述VEGFR1第二Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：2第151至214位相对应的氨基酸序列，所述VEGFR2第三Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：3第224至320位相对应的氨基酸序列，所述FGFR1第二Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：1第163至247位相对应的氨基酸序列，和所述FGFR1第三Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：1第270至359位相对应的氨基酸序列。所述融合蛋白从N端到C端依次包含：衍生自VEGFR胞外区的部分和衍生自FGFR胞外区的部分。进一步的，所述的融合蛋白中所述VEGFR胞外区的部分从N端到C端依次包含：VEGFR1的第二Ig样结构域和VEGFR2的第三Ig样结构域；所述FGFR胞外区的部分从N端到C端依次包含：源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域和FGFR第三Ig样结构域。

在专利CN102219859B的同族专利US9522949B2中也公开了一种靶向VEGF和FGF的双特异性融合蛋白(参见权利要求1)，由衍生自VEGFR胞外区的部分和FGFR胞外区的部分与免疫球蛋白Fc片段融合而成；所述的VEGFR的胞外区的部分包括：i)VEGFR1或VEGFR2第二Ig样结构域，所述结构域包含的序列与SEQ ID NO:2(同本申请序列表中SEQ ID NO：2)的151至214位氨基酸序列具有至少90％的同一性；或与SEQ ID NO:3(同本申请序列表中SEQ IDNO：3)的141至207氨基酸序列具有至少90％的同一性；和ii)VEGFR1或VEGFR2第三Ig样结构域，所述结构域包含的序列与SEQ ID NO:2的第230至327位氨基酸的具有至少90％的同一性，或与SEQ ID NO:3的第224至320位氨基酸序列具有至少90％的同一性；以及所述FGFR胞外区部分，包括:i)衍生自FGFR Ig样结构域的中间功能性序列区部分，ii)FGFR第二Ig样结构域，所述结构域包含的序列与SEQ ID NO:1第163至247位氨基酸具有至少90％的同一性，和/或，iii)FGFR第三Ig样结构域，所述结构域包含的序列与SEQ ID NO:1(同本申请序列表中SEQ ID NO：1)第270至359位氨基酸具有至少90％的同一性；所述衍生自FGFR Ig样结构域的中间功能性序列区部分为FGFR序列第一Ig样结构域和FGFR第二Ig样结构域之间的序列，与SEQ ID NO:1的第118－162位具有至少90％的同一性；所述融合蛋白还进一步包含Fc区，其中所述Fc区比上述两部分更靠近融合蛋白的C-末端。

在专利CN102219859B(参见说明书24-27页)和US9522949B2(参见说明书第29－30栏)中的一个具体的示例融合蛋白为其中的28^#融合蛋白(以下简称VF28，氨基酸序列SEQID NO：4。研究结果表明VF28融合蛋白具有良好的生物学活性，能够有效的靶向VEGF和FGF靶点，在治疗或预防肿瘤和/或眼科血管新生性疾病方面有显著的疗效。

人FGFR1蛋白的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO：1)：

MWSWKCLLFW AVLVTATLCT ARPSPTLPEQ AQPWGAPVEV ESFLVHPGDL LQLRCRLRDD 60

VQSINWLRDG VQLAESNRTR ITGEEVEVQD SVPADSGLYA CVTSSPSGSD TTYFSVNVSD 120

ALPSSEDDDD DDDSSSEEKE TDNTKPNPVA PYWTSPEKME KKLHAVPAAK TVKFKCPSSG 180

TPNPTLRWLK NGKEFKPDHR IGGYKVRYAT WSIIMDSVVP SDKGNYTCIV ENEYGSINHT 240

YQLDVVERSP HRPILQAGLP ANKTVALGSN VEFMCKVYSD PQPHIQWLKH IEVNGSKIGP 300

DNLPYVQILK TAGVNTTDKE MEVLHLRNVS FEDAGEYTCL AGNSIGLSHH SAWLTVLEAL 360

EERPAVMTSP LYLEIIIYCT GAFLISCMVG SVIVYKMKSG TKKSDFHSQM AVHKLAKSIP 420

LRRQVTVSAD SSASMNSGVL LVRPSRLSSS GTPMLAGVSE YELPEDPRWE LPRDRLVLGK 480

PLGEGCFGQV VLAEAIGLDK DKPNRVTKVA VKMLKSDATE KDLSDLISEM EMMKMIGKHK 540

NIINLLGACT QDGPLYVIVE YASKGNLREY LQARRPPGLE YCYNPSHNPE EQLSSKDLVS 600

CAYQVARGME YLASKKCIHR DLAARNVLVT EDNVMKIADF GLARDIHHID YYKKTTNGRL 660

PVKWMAPEAL FDRIYTHQSD VWSFGVLLWE IFTLGGSPYP GVPVEELFKL LKEGHRMDKP 720

SNCTNELYMM MRDCWHAVPS QRPTFKQLVE DLDRIVALTS NQEYLDLSMP LDQYSPSFPD 780

TRSSTCSSGE DSVFSHEPLP EEPCLPRHPA QLANGGLKRR 820

VEGFR1的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO：2):

MVSYWDTGVL LCALLSCLLL TGSSSGSKLK DPELSLKGTQ HIMQAGQTLH LQCRGEAAHK 60

WSLPEMVSKE SERLSITKSA CGRNGKQFCS TLTLNTAQAN HTGFYSCKYL AVPTSKKKET 120

ESAIYIFISD TGRPFVEMYS EIPEIIHMTE GRELVIPCRV TSPNITVTLK KFPLDTLIPD 180

GKRIIWDSRK GFIISNATYK EIGLLTCEAT VNGHLYKTNY LTHRQTNTII DVQISTPRPV 240

KLLRGHTLVL NCTATTPLNT RVQMTWSYPD EKNKRASVRR RIDQSNSHAN IFYSVLTIDK 300

MQNKDKGLYT CRVRSGPSFK SVNTSVHIYD KAFITVKHRK QQVLETVAGK RSYRLSMKVK 360

AFPSPEVVWL KDGLPATEKS ARYLTRGYSL IIKDVTEEDA GNYTILLSIK QSNVFKNLTA 420

TLIVNVKPQI YEKAVSSFPD PALYPLGSRQ ILTCTAYGIP QPTIKWFWHP CNHNHSEARC 480

DFCSNNEESF ILDADSNMGN RIESITQRMA IIEGKNKMAS TLVVADSRIS GIYICIASNK 540

VGTVGRNISF YITDVPNGFH VNLEKMPTEG EDLKLSCTVN KFLYRDVTWI LLRTVNNRTM 600

HYSISKQKMA ITKEHSITLN LTIMNVSLQD SGTYACRARN VYTGEEILQK KEITIRDQEA 660

PYLLRNLSDH TVAISSSTTL DCHANGVPEP QITWFKNNHK IQQEPGIILG PGSSTLFIER 720

VTEEDEGVYH CKATNQKGSV ESSAYLTVQG TSDKSNLELIT LTCTCVAAT LFWLLLTLFI 780

RKMKRSSSEI KTDYLSIIMD PDEVPLDEQC ERLPYDASKW EFARERLKLG KSLGRGAFGK 840

VVQASAFGIK KSPTCRTVAV KMLKEGATAS EYKALMTELK ILTHIGHHLN VVNLLGACTK 900

QGGPLMVIVE YCKYGNLSNY LKSKRDLFFL NKDAALHMEP KKEKMEPGLE QGKKPRLDSV 960

TSSESFASSG FQEDKSLSDV EEEEDSDGFY KEPITMEDLI SYSFQVARGM EFLSSRKCIH1020

RDLAARNILL SENNVVKICD FGLARDIYKN PDYVRKGDTR LPLKWMAPES IFDKIYSTKS1080

DVWSYGVLLW EIFSLGGSPY PGVQMDEDFC SRLREGMRMR APEYSTPEIY QIMLDCWHRD1140

PKERPRFAEL VEKLGDLLQA NVQQDGKDYI PINAILTGNS GFTYSTPAFS EDFFKESISA1200

PKFNSGSSDD VRYVNAFKFM SLERIKTFEE LLPNATSMFD DYQGDSSTLL ASPMLKRFTW1260

TDSKPKASLK IDLRVTSKSK ESGLSDVSRP SFCHSSCGHV SEGKRRFTYD HAELERKIAC1320

CSPPPDYNSV VLYSTPPI 1338

VEGFR2的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO：3)：

MQSKVLLAVA LWLCVETRAA SVGLPSVSLD LPRLSIQKDI LTIKANTTLQ ITCRGQRDLD 60

WLWPNNQSGS EQRVEVTECS DGLFCKTLTI PKVIGNDTGA YKCFYRETDL ASVIYVYVQD 120

YRSPFIASVS DQHGVVYITE NKNKTVVIPC LGSISNLNVS LCARYPEKRF VPDGNRISWD 180

SKKGFTIPSY MISYAGMVFC EAKINDESYQ SIMYIVVVVG YRIYDVVLSP SHGIELSVGE 240

KLVLNCTART ELNVGIDFNW EYPSSKHQHK KLVNRDLKTQ SGSEMKKFLS TLTIDGVTRS 300

DQGLYTCAAS SGLMTKKNST FVRVHEKPFV AFGSGMESLV EATVGERVRI PAKYLGYPPP 360

EIKWYKNGIP LESNHTIKAG HVLTIMEVSE RDTGNYTVIL TNPISKEKQS HVVSLVVYVP 420

PQIGEKSLIS PVDSYQYGTT QTLTCTVYAI PPPHHIHWYW QLEEECANEP SQAVSVTNPY 480

PCEEWRSVED FQGGNKIEVN KNQFALIEGK NKTVSTLVIQ AANVSALYKC EAVNKVGRGE 540

RVISFHVTRG PEITLQPDMQ PTEQESVSLW CTADRSTFEN LTWYKLGPQP LPIHVGELPT 600

PVCKNLDTLW KLNATMFSNS TNDILIMELK NASLQDQGDY VCLAQDRKTK KRHCVVRQLT 660

VLERVAPTIT GNLENQTTSI GESIEVSCTA SGNPPPQIMW FKDNETLVED SGIVLKDGNR 720

NLTIRRVRKE DEGLYTCQAC SVLGCAKVEA FFIIEGAQEK TNLEIIILVG TAVIAMFFWL 780

LLVIILRTVK RANGGELKTG YLSIVMDPDEL PLDEHCERL PYDASKWEFP RDRLKLGKPL 840

GRGAFGQVIE ADAFGIDKTA TCRTVAVKMLK EGATHSEHR ALMSELKILI HIGHHLNVVN 900

LLGACTKPGG PLMVIVEFCK FGNLSTYLRSK RNEFVPYKT KGARFRQGKD YVGAIPVDLK 960

RRLDSITSSQ SSASSGFVEE KSLSDVEEEEA PEDLYKDFLT LEHLICYSF QVAKGMEFLA1020

SRKCIHRDLA ARNILLSEKN VVKICDFGLAR DIYKDPDYVR KGDARLPLK WMAPETIFDR1080

VYTIQSDVWS FGVLLWEIFS LGASPYPGVKI DEEFCRRLKE GTRMRAPDY TTPEMYQTML1140

DCWHGEPSQR PTFSELVEHL GNLLQANAQQD GKDYIVLPIS ETLSMEEDS GLSLPTSPVS1200

CMEEEEVCDP KFHYDNTAGI SQYLQNSKRKS RPVSVKTFED IPLEEPEVK VIPDDNQTDS1260

GMVLASEELK TLEDRTKLSP SFGGMVPSKSR ESVASEGSNQ TSGYQSGYH SDDTDTTVYS1320

SEEAELLKLI EIGVQTGSTA QILQPDSGTTL SSPPV 1355

VF28的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO：4)：

在VF28融合蛋白的基础上，通过对VF28氨基酸序列进行部分改构，我们进一步开展了氨基酸改构后的稳定性研究，获得了一种改构的靶向VEGF和FGF的融合蛋白RC28-05(氨基酸序列SEQ ID NO：5)，RC28-E比VF28少了17个氨基酸，二者氨基酸序列同一性为97％(具体序列对比参见表3)。RC28-05不仅具有与VF28相似的良好生物学活性(生物活性数据比较见表1，表2)。通过长期稳定性试验发现，RC28-05原液在-80℃±10℃稳定，RC28-05冻干品在5℃±3℃条件(至少12个月)、25℃±2℃条件(至少1个月)条件下储存性质稳定，其相同条件下稳定储存时间大幅长于VF28。RC28-05制备的产品保存稳定，不易降解，对储藏温度、环境等要求较低。

表1 RC28-05与VF28的亲和力比较结果统计

样品	因子	平衡常数KD(M)	结合常数kon(1/Ms)	解离常数kdis(1/s)	N
						RC28-05	rhVEGF165	2.70E-10±1.28E-10	2.30E+05±0.64E+05	5.65E-05±0.75E-05	3
VF28	rhVEGF165	2.51E-10±5.65E-11	2.76E+05±7.94E+04	6.68E-05±1.31E-05	3
						RC28-05	rhFGF2	3.28E-09±1.60E-09	2.66E+04±1.01E+04	7.96E-05±2.42E-05	3
VF28	rhFGF2	5.24E-09±2.07E-09	1.90E+04±1.74E+03	9.78E-05±3.26E-05	3

表2 RC28-05与VF28对VEGF₁₆₅/bFGF刺激下HUVECs细胞增殖的抑制作用

RC28-05的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO：5)：

VF28融合蛋白与改进后的RC28-05的氨基酸序列比对结果如表3所示。

表3 VF28与RC28-05氨基酸序列比对

VF28和RC28-E融合蛋白中的免疫球蛋白Fc片段为TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：6)。

本发明通过大量的研究进一步发现双靶点血管抑制剂通过同时阻断VEGFR和FGF-2，能够改善纤维化病症、改善纤维化进程中相关标志物的表达，如：减少纤维化引起的间质胶原沉积、降低纤维化引起的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、羟脯氨酸(HYP)水平升高等，从而在预防或治疗纤维化有明显的作用。基于此，本发明发现VEGFR和FGF-2双靶点血管抑制剂通过同时阻断VEGFR和FGF-2从而抑制纤维化的发生发展，在预防或治疗纤维化相关疾病方面取得了显著的治疗效果。

发明内容

本发明的一个方面提供了针对VEGF和FGF-2的双功能血管生成抑制活性的融合蛋白用于制备治疗纤维化疾病的药物中的应用。

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白由衍生自VEGFR胞外区的部分和FGFR胞外区的部分与免疫球蛋白Fc片段融合而成；所述衍生自VEGFR胞外区的部分包含：VEGFR1的第二Ig样结构域和VEGFR2的第三Ig样结构域，所述衍生自FGFR胞外区的部分由以下组成：源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域和FGFR第三Ig样结构域，其中所述FGFR Ig样结构域中间功能性序列区是FGFR蛋白中第一Ig样结构域和第二Ig样结构域之间的序列，并且所述源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分对应于SEQID NO：1中起点为选自第119至151位的氨基酸至终点为第162位氨基酸的氨基酸序列，上述结构域和/或部分之间直接连接和/或通过接头连接。所述融合蛋白进一步包含免疫球蛋白Fc区，进一步可优选为人IgG1Fc区。进一步优选的，所述VEGFR1第二Ig样结构域具有：与SEQID NO：2第151至214位相对应的氨基酸序列，所述VEGFR2第三Ig样结构域具有：与SEQ IDNO：3第224至320位相对应的氨基酸序列，所述FGFR1第二Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：1第163至247位相对应的氨基酸序列，和所述FGFR1第三Ig样结构域具有：与SEQ ID NO：1第270至359位相对应的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述Fc区域序列可选自人或动物的免疫球蛋白Fc或进行部分改构的Fc序列，所述Fc区域进一步优选是Fc全长或是部分序列，Fc进一步选自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，优选IgG1，进一步优选自人IgG1。

在一些实施方案中，所述的融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：4或5相比同一性大于90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。

在一些实施方案中，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：4或5。

另一方面，所述纤维化疾病包括：心肌纤维化、肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、脑纤维化、眼睛纤维化、肠道纤维化、腹膜及腹膜后纤维化、胰腺纤维化和皮肤纤维化、癌症放、化疗引发的纤维化。所述肺纤维化任选为特发性肺纤维化(IPF)。

另一方面，所述药物包含治疗有效量的所述抑制剂和药学可接受的载体。所述药物优选为冻干剂或液体制剂；所述载体包括稳定剂、保护剂、缓冲液、冻干保护剂、活性保护剂、表面活性剂、吸附载体、吸收促进剂中的一种或多种。所述药物包括口服制剂或注射制剂，进一步优选注射剂；

所述药物进一步优选通过鼻内、皮下、皮内、肌内或静脉内施用。

在一些实施方案中，可以替换VF28或RC28-05的Fc区域，所述替换的Fc区域序列可选自人或动物的免疫球蛋白Fc或进行部分改构的Fc序列，包括Fc全长或是部分序列，Fc选自IgG，IgM，IgD，IgA，每种免疫球蛋白类型包括各亚型，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，优选IgG1。

本发明所述的RC28-05融合蛋白可与药学上可接受的载体；所述药物优选为冻干剂或液体制剂；所述载体包括稳定剂、保护剂、缓冲液、冻干保护剂、活性保护剂、表面活性剂、吸附载体、吸收促进剂中的一种或多种。

本发明所述药物可制成临床上可接受的各种剂型，包括但不限于口服制剂或注射制剂，优选注射剂。所述药物可通过鼻内、皮下、皮内、肌内或静脉内施用。

附图说明

图1：免疫组化法检测α-SMA在小鼠肺脏组织中表达切片示意图

图2：免疫组化法检测α-SMA在小鼠肺脏组织中的表达情况

注：#与正常对照组比较，P<0.05；与模型组比较，*，P<0.05，**，P<0.01

图3：小鼠肺脏组织病理切片HE染色结果

图4：小鼠肺脏组织Masson染色显微镜观察结果

图5：小鼠肺脏组织碱水法测定羟脯氨酸(HYP)含量

图6：RT-PCR检测双靶点血管抑制剂(RC28-05)对TGF-β刺激的人皮肤成纤维细胞α-SMA表达情况

图7：流式细胞术检测双靶点血管抑制剂(RC28-05)对TGF-β刺激的人皮肤成纤维细胞α-SMA表达情况

此外，图中各个治疗组如果未明确标引，其使用剂量默认为：

RC28-05-H治疗组：50mg/kg；RC28-05-M治疗组：15mg/kg；

RC28-05-L治疗组：5mg/kg；RC28-C1治疗组：35mg/kg；

RC28-C2治疗组：35mg/kg；

具体实施方式

定义：除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的通常含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。

本文使用的术语“VEGF”是指血管内皮生长因子。本文使用的术语“VEGFR”是指血管内皮生长因子受体，其可以是VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3。优选地，本发明中的VEGFR是VEGFR1和/或VEGFR2，优选人的VEGFR。

本文使用的术语“FGF”是指成纤维细胞生长因子。本文使用的术语“FGFR”是指成纤维细胞生长因子受体，其可以是FGFR1、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4。优选地，本发明中的FGFR是FGFR1，更优选人FGFR1。

本文所使用的术语“对象”包括哺乳动物人类等哺乳动物如家养动物(如狗、猫等)，家畜(如牛、羊、猪、马等)或实验动物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。

本发明的融合蛋白还可包含翻译后修饰。这样的修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。结果，经修饰的蛋白可包含非氨基酸组分，例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖以及磷酸。这样的非氨基酸组分对蛋白功能的作用可如本文所述的方法或现有技术中常用的方法进行测试。当蛋白在细胞中产生时，翻译后加工对于正确折叠和/或融合蛋白功能可能也是重要的。不同的细胞(例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)拥有针对这些翻译后活性的特定细胞机器和特有机制，并且可以选择不同的细胞以确保蛋白的正确修饰和加工。

本文所述的蛋白可通过任何本领域已知的方法产生。例如化学合成或从核酸表达来产生。可根据本领域已知的完善的标准液体或优选固相肽合成方法容易地制备用于本发明的肽(参见，例如J.M.Stewart和J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2ndedition,Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois(1984),in M.Bodanzsky和A.Bodanzsky,The Practice of Peptide Synthesis,Springer Verlag,New York(1984))。可以使用本领域已知技术产生所述融合蛋白以在位于预期包含在所述蛋白中的多肽序列内的半胱氨酸残基之间形成一个或多个分子内交联(参见例如美国专利No.5478925)。另外，本文所述融合蛋白可以通过在所述融合蛋白的C端或N端添加半胱氨酸或生物素进行常规修饰。

对本发明来说，两种核酸或者氨基酸序列间的“一致性”、“同一性”或“相似性”是指，在最佳比对(最优比对)后所获得的、待比较的两序列之间相同核苷酸或相同氨基酸残基的百分数，该百分数是纯粹统计学的并且两种序列间的差异随机分布并覆盖其全长。两种核酸或者氨基酸序列之间的序列比较通常是在以最优方式使它们匹配以后，通过比较这些序列而进行，所述比较能够通过区段或者通过“比较窗”实施。除了能够手工实施外，用于比较序列的最优比对，还能够通过Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2：482]的局部同源性算法、通过Neddleman和Wunsch的(1970)[J.MoI.Biol.48：443]局部同源性算法、通过Pearson和Lipman的(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)相似性搜索方法、通过使用这些算法的计算机软件实施(GAP、BESTFIT、FASTA、TFASTA in the Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI，或者通过BLAST N or BLAST P比较软件)。

本文使用的术语“治疗有效量”或“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。

本文所使用的RC28-C1和RC-C2分别是VEGF和bFGF阻断剂，为专利CN102219859B中的12#和26#融合蛋白(参见说明书第24-28页)。实施例中使用这两种阻断剂作为对照。本文所使用的RC28-05-H、RC28-05-M、RC28-05-L分别代表使用RC28-05的高剂量组、中剂量组以及低剂量组；

实施例是对本发明进行进一步的阐述和解释，而不应被看作是对本发明的限制。

实施例1:

双靶点血管抑制剂(RC28-05)对由博来霉素导致的肺纤维化C57BL/6小鼠的影响

为了提供更直观的对比实验数据，我们将单一阻断VEGF或bFGF的单靶点拮抗剂RC28-C1(阻断VEGF)和RC28-C2(阻断bFGF)作为对照，RC28-C1(对应CN102219859B的序列15)和RC28-C2(对应CN102219859B的序列71)的序列及制造参照专利CN102219859B中的12#和26#融合蛋白，其氨基酸序列分别如下：

RC28-C1

RC28-C2

1.1实验方法

博来霉素(Invitrogen，R25001)诱导建立肺纤维化模型：C57BL/6小鼠在温度控制环境(24℃)保持12h的亮暗周期和自由摄食，清醒状态之下用雾化器将0.25％(w/w)博来霉素雾化，通过雾化管喷入笼中，每次30min,共6次。随机分为8组，每组7只，即

组1：正常对照组；

组2：模型组(生理盐水):博来霉素雾化造模后第2天开始，模型组每周3次进行腹腔注射生理盐水，注射体积为20ml/kg,干预周期为3周；

组3:阳性对照组(吡啡尼酮50mg/kg)：博来霉素雾化后第2天开始，每天一次灌胃给予50mg/kg的吡啡尼酮(吡啡尼酮溶于0.5％羧甲基纤维素钠中配置成2.5mg/ml浓度)，给药周期为3周；

组4:RC28-05-H治疗组(50mg/kg)：博来霉素雾化造模后第2天开始，50mg/kg剂量，每周3次腹腔注射给药；

组5:RC28-05-M治疗组(15mg/kg)：博来霉素雾化造模后第2天开始，15mg/kg剂量，每周3次腹腔注射给药；

组6:RC28-05-L治疗组(5mg/kg)：博来霉素雾化造模后第2天开始，5mg/kg剂量，每周3次腹腔注射给药；

组7:单靶标药物治疗组RC28-C1(FGF拮抗剂)治疗组(35mg/kg)：博来霉素雾化造模后第2天开始，每周3次腹腔注射给予35mg/kg；

组8:RC28-C2(VEGF拮抗剂)治疗组(35mg/kg)：博来霉素雾化造模后第2天开始，每周3次腹腔注射给予35mg/kg；。

实验周期为3周，治疗期结束后，取肺脏，称重记录，将肺组织即刻-80℃或液氮保存。

1.2实验结果

1.2.1实验期间各组小鼠的一般状态

造模期间，除了正常组之外，各组小鼠饮食饮水均明显减少，精神状态欠佳，拱背，被毛不顺滑,少光泽，随着后期给药的进行，各组小鼠的变化如下：

正常对照组小鼠正常饮食，大小便正常，被毛顺滑有光泽，精神状态良好。模型组小鼠的饮食饮水量无明显改善，大小便变少，行动迟缓，精神萎靡，至实验结束时小鼠异常消瘦。

阳性药对照组小鼠从给药第三天起精神状态逐渐恢复，饮食饮水量逐渐增加，粪便量较模型组增多，实验结束时，状态较模型组明显恢复。阳性药对照组小鼠有3(3/8)只颈部有脱毛现象。

RC28-05-H治疗组小鼠从给药第三天起，小鼠的精神状况有所恢复，饮食饮水量也有所增加，粪便量也有所增加，至实验结束时基本接近正常状态。

RC28-05-M治疗组小鼠从给药第七天起精神状态有所改善，饮食饮水量也有所增加，粪便量也有所增加，但至实验结束时，未完全恢复正常，次于RC28-05-H治疗组小鼠。

RC28-05-L治疗组小鼠从给药第十四天起精神状态有所改善，饮食饮水量也有所增加，粪便量也有所增加，至实验结束时，状态恢复次于RC28-05-M治疗组小鼠。

RC28-C1治疗组小鼠可见随着给药时间的延长，小鼠的精神状状况、饮食、饮水及粪便量有少量改善。

RC28-C2治疗组小鼠从给药第五天起，小鼠的精神状况有所恢复，饮食饮水量也有所增加，粪便量也有所增加，至实验结束时基本接近正常状态。但在给药第5天及第6天各死亡一只，解剖可见小鼠肺组织发白，有轻微充血现象。

1.2.2将各组小鼠的肺脏分别进行固定、取材、脱水、切片，免疫组化法检测α-SMA在8组实验组织中的表达

具体表达情况参见图1和图2：正常对照组α-SMA蛋白表达变化不明显；与正常对照组相比，模型组α-SMA蛋白表达明显增加(P<0.01)；阳性对照组(吡啡尼酮50mg/kg)、RC28-05-H治疗组(50mg/kg)、RC28-05-M治疗组(15mg/kg)、RC28-05-L治疗组(5mg/kg)、RC28-C1治疗组(35mg/kg)中α-SMA蛋白表达均低于模型组且有显著性差异(P<0.01，P<0.05)；RC28-C2治疗组(35mg/kg)中α-SMA蛋白表达低于模型组，但无统计学差异(P>0.05)。

1.2.3将各组小鼠的肺脏分别进行固定、取材、脱水、切片，HE染色观察肺组织病理改变

根据图3所示：HE染色结果如下：

正常对照组：肺组织结构完整清晰，肺泡壁薄而光滑，肺泡腔透亮，腔内无渗出物，未见炎细胞浸润，无成纤维细胞增生，未见肿胀、充血、出血等现象，肺泡间隔无增宽；

模型组：肺泡结构破坏或萎陷，部分肺泡腔消失，肺泡壁显著增厚，肺泡间隔明显增厚，部分肺泡间隔断裂，炎细胞浸润，肺间质胶原沉积；阳性对照组(吡啡尼酮50mg/kg)、RC28-05-H治疗组(50mg/kg)、RC28-05-M治疗组(15mg/kg)、RC28-05-L治疗组(5mg/kg)、RC28-C1治疗组(35mg/kg)、RC28-C2治疗组(35mg/kg)炎症较轻，炎性细胞较少，肺间质胶原沉积较少，纤维化程度减轻。

1.2.4将各组小鼠的肺脏分别进行固定、取材、脱水、切片，Masson染色，显微镜下结果可见(x40)：

如图4所示，结果显示：

正常对照组：肺泡间隔可见少量蓝色的胶原纤维沉积，无明显的纤维化；

模型组：肺泡大量融合，大量胶原纤维束呈片状沉积在间质内，形成典型的纤维化改变；

阳性对照组：肺泡少部分融合，有少量蓝色胶原纤维束沉积在肺间质中，肺纤维程度明显改善；

RC28-05-H治疗组：肺泡少部分融合，有蓝色胶原纤维束沉积在肺间质中，肺纤维化程度明显改善；

RC28-05-M组：肺泡部分融合，有蓝色胶原纤维束沉积在肺间质中，肺纤维化程度也比较显著改善，仅次于RC28-05-H组；

RC28-05-L组：肺泡大量融合，大量胶原纤维束呈片状沉积在间质内，肺纤维程度也得到了改善，次于模型组；

RC28-C1治疗组：肺泡部分融合，有蓝色胶原纤维束沉积在肺间质中，肺纤维化程度比较明显，次于RC28-05-M组；

RC28-C2治疗组：肺泡仅极少部分融合，有蓝色胶原纤维束沉积在肺间质中，肺纤维程度明显改善。

1.2.5碱水法测定羟脯氨酸(HYP)含量

HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织及纤维化程度的一项重要指标。如图5所示，羟脯氨酸(HYP)含量检测结果：模型组织中羟脯氨酸(HYP)含量明显高于正常组(P<0.01)；在药物治疗组中，RC28-05-H治疗组(50mg/kg)、RC28-05-M治疗组(15mg/kg)、RC28-C1治疗组(35mg/kg)、RC28-C2治疗组(35mg/kg)羟脯氨酸(HYP)含量明显低于模型组(P<0.05或P<0.01)。RC28-05-L治疗组(5mg/kg)羟脯氨酸(HYP)含量没有明显变化；由此我们可以得出结论：双靶点血管抑制剂(RC28-05)在大于15mg/kg的剂量条件下能够降低组织中羟脯氨酸(HYP)含量，能够改善肺部纤维化。RC28-05-H治疗组明显优于对照治疗组(RC28-C1、RC28-C2),且不存在安全问题。

实施例2：

双靶点血管抑制剂(RC28-05)对TGF-β刺激的人皮肤成纤维细胞α-SMA表达的影响

2.1实验方法

人皮肤成纤维细胞用含10％胎牛血清的MEM培养基，常规培养于5％的CO₂，37℃人工培养箱中，细胞呈贴壁生长。当细胞生长融合至80％～90％，用无血清培养基肌饿24h,换新鲜培养基，将传代的人皮肤成纤维细胞分为：(1)阴性对照组；(2)TGF-β处理组(10ng/ml作用时间72h)；(3)TGF-β处理组(10ng/ml作用时间72h)+RC28-05 2000nM；(4)TGF-β处理组(10ng/ml作用时间72h)+RC28-C1 2000nM；(5)TGF-β处理组(10ng/ml作用时间72h)+RC28-C2 2000nM；培养的细胞进行TRIzol裂解，提取总RNA，然后进行PCR逆转录成cDNA,然后再进行荧光定量PCR检测α-SMA的表达；流式细胞术检测α-SMA的表达。数据用x±s表示，以组间t检验进行统计学处理。

2.2结果

2.2.1 RT-PCR检测双靶点血管抑制剂(RC28-05)对TGF-β刺激的人皮肤成纤维细胞α-SMA表达

双靶点血管抑制剂(RC28-05)对TGF-β刺激的人皮肤成纤维细胞α-SMA转录增高的抑制，结果如图6所示：TGF-β刺激人皮肤成纤维细胞72小时，α-SMA明显上升，而加入RC28-05(2000nM)后72小时，α-SMA明显下降。说明RC28-05可抑制人皮肤成纤维细胞α-SMA表达，减轻纤维化，并且其效果明显优于对照组的单靶拮抗治疗剂(RC28-C1、RC28-C2)。

2.2.2流式细胞术检测双靶点血管抑制剂(RC28-05)对TGF-β刺激的人皮肤成纤维细胞α-SMA表达

双靶点血管抑制剂(RC28-05)对TGF-β刺激的人皮肤成纤维细胞α-SMA表达的结果如图7所示：TGF-β刺激人皮肤成纤维细胞72小时，α-SMA表达明显上升，而加入RC28-05(2000nM)后72小时，α-SMA表达明显下降。说明RC28-05可抑制人皮肤成纤维细胞α-SMA表达，减轻纤维化，并且其效果明显优于对照组的单靶拮抗治疗剂(RC28-C1、RC28-C2)。

综合以上实验数据可以看出：1.相比于对照组，双靶点血管抑制剂(RC28-05)高中低三个剂量组(RC28-05-H、RC28-05-M、RC28-05-L)均能够有效改善实验模型小鼠的肺纤维化程度，改善肺纤维化，降低组织中羟脯氨酸(HYP)含量；2.针对人皮肤成纤维细胞实验表明：RC28-05可抑制人皮肤成纤维细胞α-SMA表达，减轻纤维化，其效果明显优于单靶拮抗剂(RC28-C1、RC28-C2)；由此可见，双靶点血管抑制剂(RC28-05)能够有效治疗和缓解以肺纤维化为代表的各类纤维化疾病，并且能够有效降低组织中羟脯氨酸(HYP)含量以及抑制纤维细胞α-SMA的表达，因此，能够在根源上抑制纤维化疾病的演进和加重，取得了预料不到的技术效果。

本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人员能够理解，本发明并不限于各个具体实施方式，普通技术人员在本发明的范文内可以作出各种改动或变型，并且在本说明书中各处提及的各个技术特征可以相互组合，而仍不背离本发明的精神和范围。这样的改动和变型均在本发明的范围之内。

序列表

<110> 荣昌生物制药（烟台）有限公司

<120> 双靶点血管抑制剂在制备预防或治疗纤维化药物中的用途

<130> 1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 820

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Trp Ser Trp Lys Cys Leu Leu Phe Trp Ala Val Leu Val Thr Ala

1 5 10 15

Thr Leu Cys Thr Ala Arg Pro Ser Pro Thr Leu Pro Glu Gln Ala Gln

20 25 30

Pro Trp Gly Ala Pro Val Glu Val Glu Ser Phe Leu Val His Pro Gly

35 40 45

Asp Leu Leu Gln Leu Arg Cys Arg Leu Arg Asp Asp Val Gln Ser Ile

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Gly Leu Tyr Ala Cys Val Thr Ser Ser Pro Ser Gly Ser Asp Thr Thr

100 105 110

Tyr Phe Ser Val Asn Val Ser Asp Ala Leu Pro Ser Ser Glu Asp Asp

115 120 125

Asp Asp Asp Asp Asp Ser Ser Ser Glu Glu Lys Glu Thr Asp Asn Thr

130 135 140

Lys Pro Asn Pro Val Ala Pro Tyr Trp Thr Ser Pro Glu Lys Met Glu

145 150 155 160

Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys

165 170 175

Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly

180 185 190

Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr

195 200 205

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210 215 220

Asn Tyr Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr

225 230 235 240

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245 250 255

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275 280 285

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Met Glu Val Leu His Leu Arg Asn Val Ser Phe Glu Asp Ala Gly Glu

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340 345 350

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355 360 365

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Thr Lys Lys Ser Asp Phe His Ser Gln Met Ala Val His Lys Leu Ala

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435 440 445

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450 455 460

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<210> 2

<211> 1338

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro

20 25 30

Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr

35 40 45

Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro

50 55 60

Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala

65 70 75 80

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85 90 95

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165 170 175

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

180 185 190

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195 200 205

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Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu Tyr Cys

900 905 910

Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe

915 920 925

Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys

930 935 940

Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Val

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Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gln Glu Asp Lys Ser

965 970 975

Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu

980 985 990

Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg

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Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala

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Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val Lys Ile Cys Asp

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Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe

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Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Leu

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Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Val Gln

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Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu Arg Glu Gly Met Arg Met Arg

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Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu Ile Tyr Gln Ile Met Leu Asp Cys

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Trp His Arg Asp Pro Lys Glu Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu

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Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gln Ala Asn Val Gln Gln Asp Gly Lys Asp

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Tyr Ile Pro Ile Asn Ala Ile Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr

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Ser Thr Pro Ala Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Ala

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Pro Lys Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala

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Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu

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Pro Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gln Gly Asp Ser Ser Thr

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Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser Lys

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Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Asp Leu Arg Val Thr Ser Lys Ser Lys

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Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys His Ser Ser

1285 1290 1295

Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr Tyr Asp His Ala

1300 1305 1310

Glu Leu Glu Arg Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro Pro Pro Asp Tyr Asn

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Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile

1330 1335

<210> 3

<211> 1356

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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1 5 10 15

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Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro

50 55 60

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65 70 75 80

Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn

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Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser

100 105 110

Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser

115 120 125

Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys

130 135 140

Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser

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Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg

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Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile

180 185 190

Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser

195 200 205

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210 215 220

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu

225 230 235 240

Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

245 250 255

Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu

260 265 270

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe

275 280 285

Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu

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Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr

305 310 315 320

Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met

325 330 335

Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala

340 345 350

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Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val

405 410 415

Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val

420 425 430

Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr

435 440 445

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Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr

465 470 475 480

Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys

485 490 495

Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys

500 505 510

Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr

515 520 525

Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser

530 535 540

Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln

545 550 555 560

Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser

565 570 575

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Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr

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Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly

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Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His

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Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val

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Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr

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Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg

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Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu

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Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu

900 905 910

Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu

915 920 925

Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg

930 935 940

Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys

945 950 955 960

Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly

965 970 975

Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro

980 985 990

Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr

995 1000 1005

Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys

1010 1015 1020

Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn

1025 1030 1035 1040

Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp

1045 1050 1055

Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met

1060 1065 1070

Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val

1075 1080 1085

Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser

1090 1095 1100

Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys

1105 1110 1115 1120

Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr

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Thr Ala Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg

1220 1225 1230

Pro Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu

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Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu

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Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu Ser Pro

1265 1270 1275 1280

Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser

1285 1290 1295

Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp

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Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu Ala Glu Leu Leu Lys

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Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser Thr Ala Gln Ile Leu Gln

1330 1335 1340

Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser Pro Pro Val

1345 1350 1355

<210> 4

<211> 658

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His

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Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro

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Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp

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Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys

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Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His

245 250 255

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260 265 270

Asp Ser Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Ile Val Glu

275 280 285

Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr Gln Leu Asp Val Val Glu

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Thr Val Ala Leu Gly Ser Asn Val Glu Phe Met Cys Lys Val Tyr Ser

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Ser Lys Ile Gly Pro Asp Asn Leu Pro Tyr Val Gln Ile Leu Lys Thr

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Asn Val Ser Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn

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Ser Ile Gly Leu Ser His His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Glu Ala

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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

435 440 445

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

625 630 635 640

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

645 650 655

Gly Lys

<210> 5

<211> 641

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His

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Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro

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Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser

50 55 60

Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val

65 70 75 80

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Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met

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Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp

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225 230 235 240

Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile

245 250 255

Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr Trp Ser Ile Ile Met Asp Ser

260 265 270

Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu

275 280 285

Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr Gln Leu Asp Val Val Glu Arg Ser

290 295 300

Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Lys Thr Val

305 310 315 320

Ala Leu Gly Ser Asn Val Glu Phe Met Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro

325 330 335

Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys His Ile Glu Val Asn Gly Ser Lys

340 345 350

Ile Gly Pro Asp Asn Leu Pro Tyr Val Gln Ile Leu Lys Thr Ala Gly

355 360 365

Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Met Glu Val Leu His Leu Arg Asn Val

370 375 380

Ser Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile

385 390 395 400

Gly Leu Ser His His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Glu Ala Asp Lys

405 410 415

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

420 425 430

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

435 440 445

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

450 455 460

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

465 470 475 480

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

485 490 495

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

500 505 510

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

515 520 525

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

530 535 540

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

545 550 555 560

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

565 570 575

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

580 585 590

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

595 600 605

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

610 615 620

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

625 630 635 640

Lys

<210> 6

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

Claims

1.针对VEGF和FGF-2的双靶点血管抑制剂在用于制备治疗纤维化疾病药物的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂由衍生自VEGFR胞外区的部分和FGFR胞外区的部分与免疫球蛋白Fc片段融合而成；所述衍生自VEGFR胞外区的部分包含：VEGFR1的第二Ig样结构域和VEGFR2的第三Ig样结构域，所述衍生自FGFR胞外区的部分由以下组成：源自FGFRIg样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域和FGFR第三Ig样结构域，其中所述FGFRIg样结构域中间功能性序列区是FGFR蛋白中第一Ig样结构域和第二Ig样结构域之间的序列，并且所述源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分对应于SEQ ID NO：1中起点为选自第119至151位的氨基酸至终点为第162位氨基酸的氨基酸序列，上述结构域和/或部分之间直接连接和/或通过接头连接。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述VEGFR1第二Ig样结构域具有：与SEQID NO：2第151至214位相对应的氨基酸序列，和/或所述VEGFR2第三Ig样结构域具有：与SEQID NO：3第224至320位相对应的氨基酸序列，和/或所述FGFR1第二Ig样结构域具有：与SEQID NO：1第163至247位相对应的氨基酸序列，和/或所述FGFR1第三Ig样结构域具有：与SEQID NO：1第270至359位相对应的氨基酸序列。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端依次包含：衍生自VEGFR胞外区的部分，衍生自FGFR胞外区的部分和Fc区。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的融合蛋白中所述VEGFR胞外区的部分从N端到C端依次包含：VEGFR1的第二Ig样结构域和VEGFR2的第三Ig样结构域；所述FGFR胞外区的部分从N端到C端依次包含：源自FGFR Ig样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR第二Ig样结构域和FGFR第三Ig样结构域。

6.根据权利要求2-5中任一项权利要求所述的应用，所述Fc区域序列可选自人或动物的免疫球蛋白Fc或进行部分改构的Fc序列，所述Fc区域进一步优选是Fc全长或是部分序列，Fc进一步选自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，优选IgG1，进一步优选自人IgG1，再进一步优选为氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列为与SEQ IDNO：4或5相比，同一性大于90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO：4或5。

9.根据以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述纤维化疾病包括：心肌纤维化、肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、脑纤维化、眼睛纤维化、肠道纤维化、腹膜及腹膜后纤维化、胰腺纤维化和皮肤纤维化、癌症放、化疗后的纤维化；所述肺纤维化进一步优选为特发性肺纤维化(IPF)。

10.根据以上任一权利要求所述的应用，所述药物包含治疗有效量的所述抑制剂和药学可接受的载体。

11.根据以上任一权利要求所述的应用，所述药物优选为冻干剂或液体制剂；所述载体包括稳定剂、保护剂、缓冲液、冻干保护剂、活性保护剂、表面活性剂、吸附载体、吸收促进剂中的一种或多种。

12.根据以上任一权利要求所述的应用，所述药物包括口服制剂或注射制剂，进一步优选注射剂；所述药物进一步优选通过鼻内、皮下、皮内、肌内或静脉内施用。