CN105530949A - 人类受试者中的肌抑素拮抗作用 - Google Patents

Abstract

本文中公开了治疗或调节前列腺癌患者的恶病质和/或提高瘦体重和/或增大下肢肌肉大小的方法，包括施用治疗有效量的肌抑素拮抗剂。还公开了肌抑素拮抗剂的肽体序列及肽体的制剂。

Description

人类受试者中的肌抑素拮抗作用

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/799,928的权益，因此将其全部按引用并入。

关于联邦政府赞助或开发的声明

不适用。

序列表

本申请含有已经通过EFS-Web提交的序列表并且因此将其全部按引用并入。2014年3月13日生成的所述ASCII副本命名为26324PCT_sequencelisting.txt并且大小为200,000字节。

技术领域

本发明涉及使用肌抑素(myostatin)拮抗剂(例如，肌抑素结合肽体(peptibody))治疗前列腺癌患者的恶病质的方法。

背景技术

生长因子的转化生长因子(TGF)β超家族由大量调节肌肉组织发育和体内平衡的生长和分化因子组成。肌抑素，TGF-β超家族的成员，几乎专门地在骨骼肌中表达，并且作为肌肉生长的负调节剂发挥作用(Roth和Walsh，2004；Thomas等，2000)。肌抑素通过引起细胞周期蛋白-依赖性激酶(CDK)抑制剂(例如，p21)的上调(这随后导致CDK2的下调和G0/G1细胞周期停滞)而抑制成肌细胞增殖。此外，肌抑素通过降低的MyoD表达负向调节成肌细胞分化(Langley等，2002)。

从具有肌抑素基因的失能突变的小鼠和牛的观察(Roth和Walsh，2004；Grobet等，1998；Szabó等，1998；Grobet等，1997；Kambadur等，1997；McPherron和Lee，1997；McPherron等，1997)以及描述具有影响两个肌抑素等位基因的失能突变的人类幼儿的最近病例报告(Schuelke等，2004)提供了肌抑素在调节围产期骨骼肌发育中起着重要作用的有力证据(McCroskery等，2003)。在成年小鼠肌肉中，肌抑素似乎抑制再生性卫星细胞的激活(McCroskery等，2003)。特别令人感兴趣的是，通过肌肉特异性的条件性肌抑素基因灭活方法，可以在小鼠中产后诱导一般肌肉肥大，达到与组成型肌抑素缺陷敲除小鼠中相似的程度(Grobet等，2003)。

骨骼肌萎缩是多种病症和病状中是普遍的并且在临床上是有影响的，所述病症和病状如癌症恶病质、雄激素剥夺、由于末期肾病引起的肾恶病质、慢性阻性塞肺病、心脏恶病质、HIV/AIDS、类固醇诱导的肌病、废用性萎缩、老年人肌少症和术后不能活动(Muscaritoli等，2006；Alibhai等，2006；Morley等，2006；MacDonald等，2003；Roubenoff等，1997)。骨骼肌萎缩导致降低的肌力、身体和心理失能及受影响的生活质量(Muscaritoli等，2006；Roubenoff等，1997)。目前用于疾病或不能活动的情况中的肌肉萎缩的治疗选项(包括食欲刺激、营养支持、皮质类固醇、合成代谢类固醇和生长激素)实用性受到限制并且可能与显著的全身性副作用相关(Muscaritoli等，2006；MacDonald等，2003)。

前列腺癌是男性中最常见的恶性肿瘤并且是美国男性中癌症相关死亡的第二大诱因(AmericanCancerSociety，2005)。通过施用促性腺激素-释放激素(GnRH)激动剂的雄激素剥夺疗法(ADT)是用于转移性前列腺癌治疗的主流(Sharafi等，JAMA2005)。新辅助/辅助ADT提高了针对中等风险和高风险早期前列腺癌接受放疗的男性的存活。辅助ADT还与患有淋巴结阳性疾病的男性前列腺切除术后提高的存活率相关。在当前的临床实践中，使用GnRH激动剂的长期治疗(通常用于生化复发)是雄激素剥夺疗法的最常见形式(Sharafi等，JAMA2005)。

ADT具有多种副作用，包括体重增加、提高的脂肪量、降低的瘦体重和疲劳(HematolOncolClinNorthAm，2006年8月，20(4):909-23)。在前瞻性临床研究中，ADT与降低的瘦体重和肌肉大小以及提高的脂肪量相关(Smith等，2002；Smith等，2001)。在治疗头六个月内，身体组成的改变是明显的，并且似乎在长期治疗过程中持续改变(Smith等，JCO2012)。降低的肌肉质量和强度可能引起患有前列腺癌男性的整体疲劳和降低生活质量。治疗相关的身体组成的变化还可以引起ADT降低的胰岛素敏感性和与ADT相关的糖尿病的更高风险(Smith等2006JCEM；Keating等2006JCO；Braga-Basaria等2006)。

AMG745是新的抗-肌抑素肽体。结构上，其是在N-端具有人Fc和在C-端具有肌抑素中和的生物活性肽的融合蛋白。AMG745和/或AMG745/Mu-S(AMG745的鼠替代品)已经在多种小鼠模型中进行了测试，包括正常的小鼠、免疫缺陷型小鼠、MDX小鼠(Duchenne肌营养不良模型)、带有结肠-26肿瘤的小鼠(癌症恶病质模型)、后肢悬吊小鼠(废用性萎缩模型)和睾丸切除小鼠(雄激素缺陷模型)。AMG745和/或AMG745/Mu-S在这些模型中的作用包括与对照小鼠相比提高的体重增加、提高或增强的骨骼肌质量的维持和提高的强度。睾丸切除小鼠(特征在于与雄激素缺乏相关的肌肉损失和脂肪累积的性腺机能减退疾病模型)中的临床前研究证明了AMG745/Mu-S的施用显著减轻了瘦体重的损失和脂肪的累积，如通过核磁共振(NMR)成像所评定的，并且此外，证明了体内肌抑素抑制可以通过雄激素无关的机制增强骨骼肌生长。

肌抑素拮抗剂及其用途描述于作为WO/2004/058988公开的和于2003年12月19日提交的国际专利申请no.PCT/US2003/040781及作为WO/2004/067616公开的和于2006年12月6日提交的国际专利申请no.PCT/US2006/046546以及相关的国家阶段专利申请中。

发明内容

本文中描述了治疗或调节需要的人类受试者的恶病质和/或提高瘦体重和/或降低脂肪量和/或增大下肢肌肉大小的方法，包括施用与药物学上可接受的载体混合的治疗有效量的肌抑素拮抗剂于受试者，其中所述人类受试者患有前列腺癌并且正接受雄激素剥夺治疗；肌抑素拮抗剂由肽体组成，该肽体包括由SEQIDNO:635(MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGAQLADHGQCIRWPWMCPPEGWE)的氨基酸序列组成的多肽；肌抑素拮抗剂在10mM醋酸钠，9％(w/v)蔗糖，0.004％(w/v)聚山梨酸酯20，pH4.75中配制；并且肌抑素拮抗剂以0.3mg/kg，1.0mg/kg或3.0mg/kg的剂量皮下施用，每周一次，持续4周。

还描述了治疗或调节需要的人类受试者的恶病质和/或提高瘦体重和/或降低脂肪量和/或增大下肢肌肉大小的方法，包括施用与药物学上可接受的载体混合的治疗有效量的肌抑素拮抗剂于受试者，其中所述人类受试者患有前列腺癌并且正接受雄激素剥夺治疗，并且肌抑素拮抗剂包括由SEQIDNO:311(LADHGQCIRWPWMCPPEGWE)中所示氨基酸序列组成的多肽。在一些实施方案中，肌抑素拮抗剂由肽体组成，该肽体包括由SEQIDNO:635(MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGAQLADHGQCIRWPWMCPPEGWE)中所示氨基酸序列组成的多肽。在其他实施方案中，肌抑素拮抗剂由肽体组成，所述肽体由与SEQIDNO:635中所示氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成。

所述方法中使用的肌抑素拮抗剂可以是在大肠杆菌的不溶性包涵体中表达并通过细胞收获、细胞裂解、包涵体的溶解、重折叠、浓缩和色谱纯化来分离的肽体。

在一些实施方案中，肌抑素拮抗剂与其他化合物偶联。

在一些实施方案中，肌抑素拮抗剂在药物组合物中配制。实例包括但不限于包含缓冲剂、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质、螯合剂、稳定剂或赋形剂的药物组合物。例如，制剂可以是10mM醋酸钠，9％(w/v)蔗糖，0.004％(w/v)聚山梨酸酯20，pH4.75。

方法可以使用例如为肠胃外或口服或皮下的施用。

在一些实施方案中，肌抑素拮抗剂以0.01至10.0mg/kg的剂量施用，包括0.01mg/kg和10.0mg/kg，或者以0.3至3.0mg/kg的剂量施用，包括0.3mg/kg至3.0mg/kg，或者以0.3、1.0或3.0mg/kg的剂量施用。肌抑素拮抗剂可以例如每天两次、每天一次、每周两次、每周一次、每月两次或每月一次施用。在一些实施方案中，肌抑素拮抗剂每周给药一次，持续4周。

在一些实施方案中，将肌抑素拮抗剂与其他药剂(例如，抗前列腺癌剂)共同施用。

附图说明

图1显示了使用以下实施例中描述的C2C12pMARE荧光素酶试验，通过表达的营养素酶活性(y-轴)vs.TN8-19肽QGHCTRWPWMCPPY(SEQIDNO:32)和TN8-19肽体(pb)的浓度(x-轴)测量的肌抑素活性，以测定各自的IC50。与该肽相比，肽体具有较低的IC50值。

图2是显示了如实施例8中所述的，与使用huFc对照处理的小鼠相比，在十四天期间用递增剂量的1xmTN8-19-21肽体处理的CD1nu/nu小鼠的总体重增加的图。

图3A显示了图2(实施例8)中处理的小鼠尸检时，腓肠肌质量的增加。图3B显示了如在第0天通过NMR测定的瘦体重的增加，与实施例8中所述试验的第13天相比。

图4显示了用每两周注射一次递增剂量的1xmTN8-19-21肽体处理的CD1nu/nu小鼠的瘦体重的增加，如在实施例8中所述试验的第0天和第13天通过NMR测定的。

图5A显示了如实施例8中所述的35天内，与2xmTN8-19-7和对照动物相比，每两周注射一次1xmTN8-19-7处理的CD1nu/nu小鼠的体重的增加。图5B显示了与接受媒介(huFc)的动物(对照)相比，1mg/kg和3mg/kg的1x和2x形式在尸检时瘦酮体重量的增加。

图6A显示了每隔一天皮下施用10mg/kg，持续三个月的亲和力成熟的1xmTN8-19-33肽体或huFc媒介处理的老年mdx小鼠的瘦肌肉质量vs.体重的增加。图6B显示了3个月处理后，如通过NMR测定的，相同小鼠脂肪质量与体重相比的变化。

图7显示了用肽体2xmTN8-19-21/muFc或muFc媒介处理的胶原蛋白诱导关节炎(CIA)动物以及正常非-CIA动物随着时间的体重变化(以克计)。

图8显示了用肽体2xmTN8-19-21/muFc或muFc媒介对照处理的链脲霉素(STZ)诱导糖尿病小鼠中随着时间的相对体重变化。

图9显示了用肽体2xmTN8-19-21/muFc或muFc媒介处理后，链脲霉素(STZ)诱导糖尿病小鼠和年龄匹配的正常小鼠中的肌酐清除率。

图10A显示了用肽体2xmTN8-19-21/muFc或muFc媒介处理后，链脲霉素(STZ)诱导糖尿病小鼠和年龄匹配的正常小鼠中的尿白蛋白排泄。图10B显示了用肽体2xmTN8-19-21/muFc或muFc媒介处理后，链脲霉素(STZ)诱导糖尿病小鼠和年龄匹配的正常小鼠中的24小时尿量。

图11显示了4组C57B1/6小鼠随着时间的体重变化；2组用肽体2xmTN8-19-21/muFc预处理1周，然后用5-氟尿嘧啶(5-Fu)或媒介(PBS)处理；和2组用2xmTN8-19-21/muFc预处理2周，然后用5-氟尿嘧啶或媒介(PBS)处理。沿着图底部的三角形显示了2xmTN8-19-21/muFc的2周预处理的给药时间，2xmTN8-19-21/muFc的1周预处理的给药时间和5-Fu的给药时间。

图12显示了以上图11中描述的动物的存活率百分比，显示了没有处理的正常小鼠、只用5-Fu处理的动物、用2xmTN8-19-21/muFc预处理1周并随后用5-Fu处理的动物和用2xmTN8-19-21/muFc预处理2周并随后用5-Fu处理的动物。

图13显示了用AMG745或安慰剂治疗的人类受试者中总瘦体重相对于基线的百分变化。安慰剂组在EOS和FUP各自的左侧；AMG745组在EOS和FUP各自的右侧。

具体实施方式

本发明提供了通过施用包括肌抑素结合肽SEQIDNO:311的肌抑素拮抗剂(例如，SEQIDNO:635组成的肽体)治疗接受雄激素治疗的前列腺癌患者的恶病质的方法。

肌抑素

肌抑素，也称为GDF-8的一种生长因子，是TGF-β家族的成员。已知肌抑素是骨骼肌组织的负调节剂。肌抑素作为无活性的前蛋白原(preproprotein)合成，其通过蛋白水解切割激活(Zimmers等，上文(2002))。前体蛋白质被切割以产生NH₂-端无活性前结构域和约25kDa的同型二聚体形式的大约109个氨基酸的COOH-端蛋白质，其是成熟的活性形式(Zimmers等，上文(2002))。现在认为该成熟二聚体作为结合前肽的无活性潜复合物在血液中循环(Zimmers等，上文(2002))。

如本文中使用的，术语“全长肌抑素”是指McPherron等，PNASUSA94，12457(1997)中描述的全长人前蛋白原序列，以及相关的全长多肽，包括等位基因变体和种间同源物(McPherron等，上文(1997))。如本文中使用的，术语“前结构域”或“前肽”是指无活性的NH₂-端蛋白质，其被切割掉以释放活性的COOH-端蛋白质。如本文中使用的，术语“肌抑素”或“成熟肌抑素”是指成熟的、生物活性COOH-端多肽，为单体、二聚体、多聚体形式或其他形式。“肌抑素”或“成熟肌抑素”还指生物活性成熟肌抑素的片段，以及相关的多肽，包括等位基因变体、剪接变体以及融合肽和多肽。已经报道了成熟肌抑素COOH-端蛋白质在许多物种间具有100％序列同一性，包括人、小鼠、鸡、猪、火鸡和大鼠(Lee等，PNAS98，9306(2001))。肌抑素可以包括或不包括其他末端残基，如靶向序列，或甲硫氨酸和赖氨酸残基和/或标签或融合蛋白序列，取决于其是如何制备的。

肌抑素拮抗剂

本文中描述的治疗方法使用包括肌抑素结合肽SEQIDNO:311的肌抑素拮抗剂，例如，包括至少一个由SEQIDNO:635组成的多肽的肽体，例如，肽体AMG-745。

如本文中使用的，术语“肌抑素拮抗剂”与“肌抑素抑制剂”可互换使用。根据本发明的肌抑素拮抗剂抑制或阻断肌抑素的至少一种活性，或可选地，阻断肌抑素或其受体的表达。例如，可以通过使用一种或多种干扰肌抑素与其受体结合和/或阻断由肌抑素与其受体结合产生的信号转导的抑制剂来实现抑制或阻断肌抑素活性。拮抗剂包括结合肌抑素自身的试剂，或结合肌抑素受体的试剂。

肌抑素拮抗剂的其他实例包括但不限于卵泡抑素(follistatin)、肌抑素前结构域、生长和分化因子11(GDF-11)前结构域、前结构域融合蛋白、结合肌抑素的拮抗性抗体、结合激活素IIB型受体的拮抗性抗体或抗体片段、可溶性激活素IIB型受体、可溶性激活素IIB型受体融合蛋白、可溶性肌抑素类似物(可溶性配体)、寡核苷酸、小分子、肽模拟物和肌抑素结合剂。以下更详细地描述了这些。

如例如Amthor等，DevBiol270，19-30(2004)和美国专利6,004,937(将这两篇文献按引用并入本文中)中所述，卵泡抑素抑制肌抑素。其他抑制剂包括，例如，TGF-β结合蛋白，包括生长和分化因子相关血清蛋白-1(GASP)，如Hill等，Mol.Endo.17(6):1144-1154(2003)中所述。肌抑素拮抗剂包括肌抑素的前肽区和相关的GDF蛋白，包括GDF-11，如PCT公开WO02/09641中所述，将其按引用并入本文中。肌抑素拮抗剂进一步包括修饰的和稳定的前肽，包括例如，Bogdanovisch等，FASEBJ19，543-549(2005)中所述的前结构域的Fc融合体。其他肌抑素拮抗剂包括结合并抑制或中和肌抑素的抗体或抗体片段，包括肌抑素前蛋白和/或成熟蛋白(其是单体或二聚体形式)。这样的抗体描述于例如美国专利申请US2004/014383和美国专利申请2003/103842，以及PCT公开WO2005/094446，PCT公开WO2006/116269中，将其全部按引用并入本文中。拮抗性肌抑素抗体进一步包括结合肌抑素前蛋白并防止其切割成成熟的活性形式的抗体。

如本文中使用的，术语“抗体”是指完整抗体，包括多克隆抗体(参见，例如Antibodies:ALaboratoryManual(抗体：实验室手册)，Harlow和Lane(编辑)，ColdSpringHarborPress，(1988))，和单克隆抗体(参见，例如，美国专利No.RE32,011、4,902,614、4,543,439和4,411,993，以及MonoclonalAntibodies:ANewDimensionin BiologicalAnalysis(单克隆抗体：生物分析中的新维度)，PlenumPress，Kennett，McKearn和Bechtol(编辑)，(1980))。如本文中使用的，术语“抗体”还指抗体的片段，如F(ab)、F(ab’)、F(ab’)₂、Fv、Fc和单链抗体，或这些的组合，其通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶或化学切割来产生。术语“抗体”还指双特异性或双功能性抗体，其是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法来产生，包括杂交瘤的融合或Fab’片段的连接(参见Songsivilai等，Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)，Kostelny等，J.Immunol.148:1547-1553(1992))。如本文中使用的，术语“抗体”还指嵌合抗体，即，具有与一个或多个非人可变抗体免疫球蛋白结构域偶联的人恒定抗体免疫球蛋白结构域的抗体，或其片段(参见，例如，美国专利No.5,595,898和美国专利No.5,693,493)。“抗体”还指“人源化”抗体(参见，例如，美国专利No.4,816,567和WO94/10332)、minibodies(WO94/09817)、单链Fc-Fv融合体(Powers等,JImmunol.Methods251:123-135(2001))和通过转基因动物产生的抗体，其中含有一部分人抗体产生基因但缺乏内源性抗体产生的转基因动物能够产生人抗体(参见，例如，Mendez等，NatureGenetics15:146-156(1997)，和美国专利No.6,300,129)。术语“抗体”还包括多聚抗体，或蛋白质的高阶复合物，如杂二聚抗体。“抗体”还包括抗独特型抗体。

肌抑素拮抗剂进一步包括结合肌抑素并抑制至少一种活性的可溶性受体。如本文中使用的，术语“可溶性受体”包括能够特异性地结合肌抑素并阻断或抑制肌抑素信号转导的肌抑素受体的截短形式或片段，修饰的或另外的。肌抑素受体的这些截短形式，例如，包括天然产生的可溶性结构域，以及由于N-或C-末端的蛋白水解导致的变化。可溶性结构域包括受体胞外结构域的全部或部分，单独或与其他的肽或修饰连接。肌抑素结合激活素受体，包括激活素IIB型受体(ActRIIB)和激活素IIA型受体(ActRIIA)，如Lee等，PNAS98(16)，9306-9311(2001)中所述。可溶性受体融合蛋白也可以作为拮抗剂，例如美国专利申请公开2004/023966和PCT公开WO2006/012627中所述的可溶性受体Fc，将这两篇文献都按引用并入本文中。

肌抑素拮抗剂进一步包括可溶性配体，其与肌抑素竞争结合肌抑素受体。如本文中使用的，术语“可溶性配体拮抗剂”是指能够结合肌抑素激活素IIB型受体(或ActRIIA)并通过与肌抑素竞争阻断肌抑素-受体信号转导的可溶性肽、多肽或肽模拟物。可溶性配体拮抗剂包括肌抑素的变体，也称为“肌抑素类似物”，其维持基本上与配体同源但没有配体活性，包括氨基酸序列的截短(如N-或C-末端截短)、置换、删除和其他改变，如用非氨基酸肽模拟物替换氨基酸残基。例如，可溶性配体拮抗剂可能能够结合受体，但不允许信号转导。对于本发明的目的，如果一种蛋白质与另一种蛋白质的氨基酸序列至少80％，优选至少约90％，更优选至少约95％彼此相同，则它们“基本上相似”。

肌抑素拮抗剂进一步包括多核苷酸拮抗剂。这些拮抗剂包括反义或有义寡核苷酸，包括能够结合靶mRNA(有义)或DNA(反义)序列的单链多核苷酸序列(RNA或DNA)。根据本发明，反义或有义寡核苷酸包括编码肌抑素或其受体的靶标多核苷酸序列、转录因子或涉及肌抑素或其受体的表达的其他多核苷酸的片段。这样的片段通常包括至少约14个核苷酸，通常约14至约30个核苷酸。基于编码给定蛋白质的核酸序列衍生反义或有义寡核苷酸的能力描述于例如Stein和Cohen,CancerRes.48:2659，1988及vanderKrol等，BioTechniques6:958，1988中。反义或有义寡核苷酸与靶核酸序列的结合导致双链体的形成，其通过几种方式中的一种阻断或抑制蛋白质表达，包括通过RNAseH增强的mRNA的降解、剪接的抑制、转录或翻译的过早终止或者通过其他方式。因此反义寡核苷酸可以用于阻断蛋白质的表达。反义或有义寡核苷酸进一步包括具有修饰的糖-磷酸二酯主链(或其他糖连接，如WO91/06629中所述的那些)的寡核苷酸，并且其中这样的糖连接对内源性核酸酶具有抗性。具有抗性糖连接的这类寡核苷酸在体内是稳定的(即，能够抵抗酶降解)，但保持能够结合标核苷酸序列的序列特异性。有义或反义寡核苷酸的其他实例包括共价连接有机部分(如WO90/10448中所述的那些)和提高寡核苷酸对靶核酸序列的亲和力的其他部分(如，聚-(L)-赖氨酸)的那些寡核苷酸。再进一步，插入剂，如玫瑰树碱(ellipticine)，及烷化剂或金属复合物，可以连接有义或反义寡核苷酸以修饰反义或有义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。

可以通过任何基因转移方法，包括，例如，脂转染、CaPO₄-介导的DNA转染、电穿孔，或通过使用基因转移载体，如Epstein-Barr病毒或腺病毒，将反义或有义寡核苷酸引入含有靶核酸的细胞中。如WO91/04753中所述的，通过形成与配体结合分子的偶联物，也可以将有义或反义寡核苷酸引入含有靶核酸的细胞中。合适的配体结合分子包括，但不限于，细胞表面受体、生长因子、其他细胞因子或结合细胞表面受体的其他配体。优选地，配体结合分子的偶联基本上不干扰配体结合分子结合其对应分子或受体的能力或阻止有义或反义寡核苷酸或其偶联的形式进入细胞。可选地，如WO90/10448中所述，可以通过形成寡核苷酸-脂质复合物将有义或反义寡核苷酸引入含有靶核酸的细胞中。优选通过内源性脂酶在细胞内解离有义或反义寡核苷酸-脂质复合物。

用于防止肌抑素或肌抑素受体表达的其他方法是通过特异性小干扰RNA(siRNA)的引入产生的RNA干扰(RNAi)，例如，如Bosher等，NatureCellBiol2,E31-E36(2000)中所述的。

肌抑素拮抗剂进一步包括小分子拮抗剂，其结合肌抑素或其受体。通过针对与肌抑素或其受体的结合进行筛选，接着通过与本文中所述的结合剂选择相似的特异性和非特异性洗脱来选择小分子。

如本文中所述的，术语“能够结合肌抑素”或“具有对肌抑素的结合亲和力”是指结合肌抑素的肌抑素拮抗剂，如本文中所述的结合剂，如通过以下实施例中所述的噬菌体ELISA试验、或KinExA^TM试验所证明的。

如本文中所述的，术语“能够改变肌抑素活性”是指试剂针对肌抑素的至少一种生物活性的作为激动剂或拮抗剂的作用。如本文中使用的，“激动剂”或“模拟的”活性是指具有相比于与目标蛋白相互作用的蛋白的生物活性的试剂，如例如2001年5月2日提交的国际申请WO01/83525中所述的，将其按引用并入本文中。

如本文中使用的，术语“抑制肌抑素活性”或“拮抗肌抑素活性”是指肌抑素拮抗剂降低或阻断肌抑素活性或信号传导的能力，如通过体外试验，例如，基于pMAREC2C12细胞的肌抑素活性试验，或通过如以下所述的体内动物测试所证明的。

肌抑素结合剂

本发明的方法中使用的肌抑素拮抗剂包括肌抑素结合剂，例如，包括至少一种肌抑素结合肽(例如，SEQIDNO:311)，例如，肽体AMG-745。

在一个实施方案中，本发明的结合剂包括至少一种共价连接至少一种媒介(如聚合物或Fc结构域)的肌抑素结合肽。肌抑素结合肽与至少一种媒介的连接打算用来通过提高药剂的生物活性和/或降低体内降解，提高体内半衰期，降低体内毒性或免疫原性，来提高结合剂作为治疗剂的有效性。结合剂可以进一步包含连接肽和媒介的接头序列。一个或多个肽通过接头序列在肽的N-端、C-端或氨基酸侧链处直接或间接连接媒介。在这个实施方案中，本发明的结合剂具有以下结构：

(X¹)_a-F¹-(X²)_b，或其多聚体；

其中F¹是媒介，并且X¹和X²各自独立地选自：

-(L¹)_c-P¹；

-(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²；

-(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_e-P³；

和-(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_e-P³-(L⁴)_f-P⁴；

其中P¹、P²、P³和P⁴是能够结合肌抑素的肽；和

L¹、L²、L³和L⁴各自是接头；并且a、b、c、d、e和f各自独立地是0或1，只要a和b中的至少一个是1。

含有半胱氨酰基残基的任何肽可以与另一个含有Cys的肽交联，其中任一个或两个可以连接媒介。具有超过一个Cys残基的任何肽也可以形成肽内二硫键。

在一个实施方案中，媒介是Fc结构域，如以下限定的。将这个实施方案称为“肽体”。如本文中使用的，术语“肽体”是指包括连接至少一个肽的抗体Fc结构域的分子。肽体的产生概括地描述于2000年5月4日公开的PCT公开WO00/24782中，将其按引用并入本文中。示例性肽体作为分别具有肽的一个拷贝和两个拷贝(串联)的1x和2x构型来提供，如以下实施例中所述的。

肽

在一个实施方案中，本发明的方法使用了包括由SEQIDNO:311组成的肽的肌抑素拮抗剂。

如本文中使用的，术语“肽”是指通过肽键连接的约5个至约90个氨基酸的分子。本发明的肽优选长度为约5个至约50个氨基酸，更优选长度约10个至约30个氨基酸，并且最优选长度约10至25个氨基酸，并且能够结合肌抑素蛋白。

本发明的肽可以包括天然产生蛋白质的序列的部分，可以是源自天然产生蛋白质的随机化序列，或可以是完全随机化的序列。本发明的肽可以通过本领域已知的任何方法来产生，包括化学合成、蛋白质消化或重组技术。噬菌体展示和RNA-肽筛选及其他亲和性筛选技术对于产生能够结合肌抑素的肽特别有用。

噬菌体展示技术描述于例如Scott等，Science249:386(1990)；Devlin等，Science249:404(1990)；1993年6月29日授权的美国专利No.5,223,409；1998年3月31日授权的美国专利No.5,733,731；1996年3月12日授权的美国专利No.5,498,530；1995年7月11日授权的美国专利No.5,432,018；1994年8月16日授权的美国专利No.5,338,665；1999年7月13日授权的美国专利No.5,922,545；1996年12月19日公开的WO96/40987；和1998年4月16日公开的WO98/15833，将其各自按引用并入本文中。使用噬菌体文库，随机肽序列通过与丝状噬菌体的外壳蛋白的融合来展示。通常，展示的肽相对靶分子特异性或非特异性地亲和性洗脱。可以通过连续几轮亲和性纯化和再繁殖来富集保留的噬菌体。选择最佳结合的肽用于进一步的分析，例如，通过使用以下所述的噬菌体ELISA和随后测序。任选地，可以形成诱变文库并筛选以进一步优化最佳结合体的序列(Lowman，AnnRevBiophysBiomolStruct26:401-24(1997))。

产生肌抑素结合肽的其他方法包括本领域已知的其他亲和性选择技术。肽文库可以在lac阻遏物的羧基端融合并在大肠杆菌中表达。另一种基于大肠杆菌的方法允许通过与肽聚糖相关脂蛋白(PAL)的融合在细胞的外膜上展示。在下文中，将这些和相关方法统称为“大肠杆菌展示”。在另一种方法中，在核糖体释放之前停止随机RNA的翻译，形成其相关RNA仍然相连的多肽的文库。在下文中，将这种和相关方法统称为“核糖体展示”。其他方法使用肽与RNA的化学连接。参见，例如，Roberts和Szostak，ProcNatlAcadSciUSA，94:12297-303(1997)。在下文中，将这种和相关方法统称为“RNA-肽筛选”。酵母双杂交筛选方法也可以用于鉴别结合肌抑素的本发明的肽。此外，已经研发了化学衍生的肽文库，其中将肽固定于稳定的、非生物的材料上，如聚乙烯棒或溶剂可渗透的树脂。另一种化学衍生的肽文库使用照相平版印刷术(photolithography)来扫描固定于载玻片上的肽。在下文中，将这些和相关方法统称为“化学-肽筛选”。化学-肽筛选可以是有利的，因为其允许使用D-氨基酸和其他类似物，以及非-肽元件。生物和化学方法都综述于Wells和Lowman，CurrOpinBiotechnol3:355-62(1992)中。

另外，选择的能够结合肌抑素的肽可以通过所使用“合理设计”来进一步改进。在这种方式中，对肽序列进行逐步变化，并且在合适的试验中观察置换对肽的结合亲和力或特异性或肽的一些其他特性的影响。这种技术的一个实例是一次用丙氨酸置换单个残基，称为“丙氨酸步进”或“丙氨酸扫描”。当替换两个残基时，称为“双重丙氨酸步进”。所得到的含有氨基酸置换的肽针对增强的活性或一些其他有利特性进行测试。

此外，还使用了蛋白质-蛋白质相互作用的结构分析来提示模拟较大蛋白质的相互作用的肽。在这样的分析中，蛋白质的晶体结构可以表明蛋白质关键残基的身份和相对定向，从该蛋白质可以设计肽。参见，例如，Takasaki等，NatureBiotech15:1266(1977)。这些方法还可以用于研究靶标蛋白和通过噬菌体展示或其他亲和性选择方法选择的肽之间的相互作用，由此表明肽的进一步修饰以提高结合亲和力和肽抑制蛋白质活性的能力。

在一个实施方案中，肽作为相关肽的家族产生。示例性肽由SEQIDNO:1至132来表示。这些示例性肽可以通过选择方法来衍生，其中通过噬菌体展示技术产生的最佳结合体通过噬菌体ELISA进一步分析以通过亲和性选择技术(如本文中所述的噬菌体展示技术)获得候选肽。然而，可以通过多种已知方法，包括以下所述的化学合成，来产生本发明的肽。

可以通过“亲和力成熟”的方法来进一步改进肽。这一程序针对使用噬菌体展示或其他选择技术来提高本发明的肽和肽体的亲和力或活性。基于共有序列，例如，可以产生定向的第二噬菌体展示文库，其中“核心”氨基酸(从共有序列确定)保持恒定或在发生的频率中有偏向。或者，单个肽序列可以用于产生有偏的、定向噬菌体展示文库。这样的文库在更严格条件下的淘选可以产生具有与肌抑素的增强结合、与肌抑素的选择性结合或具有一些其他所需特性的肽。然而，具有亲和力成熟序列的肽然后可以通过多种已知方法(包括化学合成或通过重组)来产生。这些肽用于产生结合剂，如在基于细胞的试验中和体内试验中呈现更高抑制活性的各种构型的肽体。

以下实施例6描述了产生亲和力成熟的肽的以上描述的“第一轮”肽的亲和力成熟。示例性的亲和力成熟的肽体呈现于表IV和V中。然后针对结合亲和力、中和肌抑素活性的能力、与特定的其他TGF-β家族成员(如激活素)相对的对肌抑素的特异性以及针对如以下所述的其他体外和体内活性，进一步表征从这些肽制备所得的1x和2x肽体。通过在其家族名称前的前缀“m”来指亲和力成熟的肽和肽体以将其与相同家族的第一轮肽区分开来。

根据本发明的选择用于进一步亲和力成熟的示例性第一轮肽包括以下肽：

TN8-19QGHCTRWPWMCPPY(SEQIDNO:33)

线性-2MEMLDSLFELLKDMVPISKA(SEQIDNO:104)

线性-15HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV(SEQIDNO:117)

线性-17,RATLLKDFWQLVEGYGDN(SEQIDNO:119)

线性-20YREMSMLEGLLDVLERLQHY(SEQIDNO:122)

线性-21HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ(SEQIDNO:123)

线性-24EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN(SEQIDNO:126)。

这些中每个的亲和力成熟的家族呈现于以下的表IV和V中。

本发明的肽还包括选定的肽的变体和衍生物，其能够结合肌抑素。如本文中使用的，术语“变体”是指具有初始氨基酸序列中插入、删除或置换的一个或多个氨基酸的肽，并且其仍然能够结合肌抑素。插入和置换变体可以含有天然氨基酸以及非天然产生的氨基酸。如本文中使用的，术语“变体”包括仍然保留结合肌抑素的能力的肽片段。如本文中使用的，术语“衍生物”是指已经以不同于插入、删除和置换变体的一些方式进行化学修饰的肽。以下更全面地描述本发明的肽和肽体的变体和衍生物。

媒介

如本文中使用的，术语“媒介”是指可以连接本发明的一个或多个肽的分子。优选，媒介赋予本发明的结合剂至少一种所需的特性。单独的肽很可能在体内通过肾过滤、通过网状内皮系统中的细胞清除机制或通过蛋白水解降解被除去。与媒介的连接通过降低结合剂的降解和/或提高半衰期、降低毒性、降低免疫原性和/或提高结合剂的生物活性来提高结合剂的治疗价值。

示例性媒介包括Fc结构域；线性聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚赖氨酸、葡聚糖；支链聚合物(参见例如1981年9月15日授权的Denkenwalter等的美国专利No.4,289,872；1993年7月20日授权的Tam的美国专利No.5,229,490；Frechet等的1993年10月28日公开的WO93/21259)；脂质；胆甾醇基团(如类固醇)；碳水化合物或寡糖；或任何天然或合成的结合挽救受体(salvagereceptor)的蛋白质、多肽或肽。

在一个实施方案中，本发明的肌抑素结合剂具有至少一个通过肽的N-端、C-端或一个氨基酸残基的侧链连接于至少一种媒介(F¹、F²)的肽。也可以使用多种媒介，如每个末端的Fc结构域或者在末端的Fc结构域和在另一末端或侧链的PEG基团。

Fc结构域

Fc结构域是一种优选的媒介。如本文中使用的，术语“Fc结构域”包括以下限定的天然Fc及Fc变体分子和序列。如本文中使用的，术语“天然Fc”是指通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生的抗体的非抗原结合片段或该片段的氨基酸序列。优选的Fc是完全人Fc且可以源自任何免疫球蛋白，如IgG1和IgG2。然而，本文中也包括部分人的或源自非人物种的Fc分子。天然Fc分子由可以通过共价(即，二硫键)和非共价结合连接成二聚或多聚形式的单体多肽构成。天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目范围为1至4，这取决于类别(例如，IgA、IgB、IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)。天然Fc的一个实例是从IgG的木瓜蛋白酶消化得到的二硫键键合的二聚体(参见Ellison等(1982)，NuclAcidsRes10:4071-9)。如本文中使用的术语“天然Fc”用来指单体、二聚体和多聚体形式。

如本文中使用的，术语“Fc变体”是指天然Fc序列的修饰形式，只要保持与挽救受体的结合，如例如WO97/34631和WO96/32478中所述的，将这两篇文献都按引用并入本文中。例如，可以通过置换或删除残基、插入残基或截断含有该位点的部分来构建Fc变体。插入或置换的残基也可以是改变的氨基酸，如肽模拟物或D-氨基酸。Fc变体出于一些原因可能是需要的，以下描述了其中几个原因。示例性Fc变体包括以下分子和序列：

1.去除涉及二硫键形成的位点。这样的去除可以避免与用于产生本发明分子的宿主细胞中存在的其他含半胱氨酸的蛋白质的反应。为此目的，可以截断N-端的含半胱氨酸区段或者可以删除半胱氨酸残基或用其他氨基酸(例如，丙氨酰基、丝氨酰基)置换。即使在除去半胱氨酸残基时，单链Fc结构域仍然可以形成非共价地保持在一起的二聚Fc结构域。

2.修饰天然Fc以使其与选定的宿主细胞更相容。例如，可以除去靠近典型天然Fc的N-端的PA序列，其可以被大肠杆菌中的消化酶(如脯氨酸亚氨基肽酶)识别。还可以添加N-端甲硫氨酰基残基，尤其是当分子在细菌细胞(如大肠杆菌)中重组表达时。

3.除去天然Fc的N-端的一部分以防止在选定的宿主细胞中表达时的N-端异质性。为此目的，可以删除N-端的头20个氨基酸残基的任何一个，特别是位置1、2、3、4和5处的那些。

4.除去一个或多个糖基化位点。通常被糖基化的残基(例如，天冬酰胺)可以赋予细胞溶解反应。这样的残基可以删除或用未糖基化的残基(例如，丙氨酸)置换。

5.除去涉及与补体的相互作用的位点，如C1q结合位点。例如，可以删除或置换人IgG1的EKK序列。补体募集对于本发明的分子可能不是有利的，并且因此可以使用这样的Fc变体避免。

6.除去影响与挽救受体以外的其他Fc受体结合的位点。天然Fc可能具有本发明的融合分子不需要的并且因此可以除去的与特定白细胞的相互作用位点。

7.除去ADCC位点。ADCC位点是本领域已知的。关于IgG1中的ADCC位点，参见，例如，MolecImmunol29(5):633-9(1992)。这些位点也是本发明的融合分子不需要的，并且因此可以除去。

8.当天然Fc源自非人抗体时，可以将天然Fc人源化。通常，为了人源化天然Fc，将用人天然Fc中通常发现的残基置换非人天然Fc中选择的残基。用于抗体人源化的技术是本领域公知的。

术语“Fc结构域”包括单体或多聚体形式的分子，不管是从完整抗体消化或是通过其他方式产生。如本文中使用的，应用于Fc结构域或包括Fc结构域的分子的术语“多聚体”是指具有共价地、非共价地或通过共价和非共价两种相互作用结合的两个或更多个多肽的分子。IgG分子通常形成二聚体；IgM，五聚体；IgD，二聚体；和IgA，单体、二聚体、三聚体或四聚体。多聚体可以通过利用Fc的天然Ig源的序列和所得活性或通过衍生化这样的天然Fc来形成。应用于Fc结构域或包括Fc结构域的分子的术语“二聚体”是指具有共价或非共价地结合的两个多肽链的分子。

非Fc媒介

另外，根据本发明的可选媒介是能够结合挽救受体的非-Fc结构域蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段或小分子(例如，肽模拟化合物)。例如，可以将多肽用作媒介，如Presta等的1998年4月14日授权的美国专利No.5,739,277中所述的。也可以针对与FcRn挽救受体的结合通过噬菌体展示来选择肽。这样的挽救受体-结合化合物也包括在“媒介”的含义内并且在本发明的范围内。应当针对提高的半衰期(例如，通过避免被蛋白酶识别的序列)和降低的免疫原性(例如，通过促进非免疫原性序列，如抗体人源化中发现的)来选择这样的媒介。

此外，聚合物媒介也可以用于构建本发明的结合剂。用于连接可用作媒介的化学部分的各种方式是目前可用的，参见，例如，发明名称为“N-TerminallyChemicallyModifiedProteinCompositionsandMethods”的专利合作条约(“PCT”)国际公开No.WO96/11953，将其全部按引用并入本文中。这篇PCT公开特别公开了水溶性聚合物与蛋白质的N-端的选择性连接。

优选的聚合物媒介是聚乙二醇(PEG)。PEG基团可以是任何适宜的分子量并且可以是线性或分支的。PEG的平均分子量范围优选为约2kDa至约100kDa，更优选约5kDa至约50kDa，最优选约5kDa至约10kDa。PEG基团通常将经由通过PEG部分上的反应性基团(例如，醛、氨基、硫醇或酯基)与本发明化合物上的反应性基团(例如，醛、氨基或酯基)的酰化作用或还原性烷化作用连接于本发明的化合物。用于合成肽的PEG化的有用策略由通过在溶液中形成偶联物连接来组合肽和PEG部分组成，其各自带有彼此互相反应性的特定官能性。可以用本领域已知的常规固相合成来容易地制备肽。用特定位点处的合适官能团将肽“预活化”。在与PEG部分反应之前，纯化并充分表征前体。肽与PEG的接合通常在水相中发生，并且可以通过反相分析型HPLC容易地监测。可以通过制备型HPLC来容易地纯化PEG化的肽并通过分析型HPLC、氨基酸分析和激光解吸质谱来表征。

多糖聚合物是可以用于蛋白质修饰的另一种类型的水溶性聚合物。葡聚糖是由主要通过a1-6键连接的单个葡萄糖亚基组成的多糖聚合物。葡聚糖自身可以以许多分子量范围来利用，并且容易地以约1kDa至约70kDa的分子量来利用。葡聚糖是自身作为媒介或结合另一种媒介(例如，Fc)用于本发明中的合适的水溶性聚合物。参见，例如，WO96/11953和WO96/05309。已经报道了与治疗或诊断免疫球蛋白偶联的葡聚糖的使用；参见，例如，欧洲专利公开No.0315456，将其按引用并入本文中。在将葡聚糖用作根据本发明的媒介时，约1kDa至约20kDa的葡聚糖是优选的。

接头

本发明中使用的肌抑素激动剂可以任选进一步包含“接头”基团。在一个实施方案中，接头由序列GGGGGAQ(SEQIDNO:636)组成。

接头主要用作肽和媒介之间或本发明的结合剂的两个肽之间的间隔物。在一个实施方案中，接头由通过肽键连接在一起的氨基酸组成，优选通过肽键连接的1至20个氨基酸，其中氨基酸选自20个天然产生的氨基酸。这些氨基酸中的一个或多个可以是糖基化的，如本领域技术人员所理解的。在一个实施方案中，1至20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。优选地，接头由大部分非空间位阻的氨基酸如甘氨酸和丙氨酸组成。因此，示例性接头是聚甘氨酸(特别是(Gly)₅、(Gly)₈)、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。如本文中使用的，命名“g”是指甘氨酸同型肽(homopeptide)接头。如表II中所示，“gn”是指N端处的5xgly接头，而“gc”是指C端的5xgly接头。还优选Gly和Ala的组合。用于构建本发明的结合剂的一种示例性接头序列如下：gsgsatggsgstassgsgsatg(SEQIDNO:305)。这种接头序列称为“k”或1k序列。如表II中发现的，命名“kc”是指C-端的k接头，而命名“kn”是指N-端的k接头。

本发明的接头还可以是非肽接头。例如，可以使用烷基接头，如-NH-(CH₂)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头可以进一步被任何非空间位阻基团如低级烷基(例如，C₁-C₆)低级酰基、卤素(例如，Cl、Br)、CN、NH2、苯基等取代。示例性非肽接头是PEG接头，并且具有100至5000kDa的分子量，优选100至500kDa。可以以如上相同的方式改变肽接头来形成衍生物。

示例性肌抑素拮抗剂，例如，结合剂

本文中所述方法中使用的肌抑素激动剂，例如，结合剂，包括至少一个能够结合肌抑素的肽，例如，由SEQIDNO:311中所示氨基酸序列组成的肽。

在一个实施方案中，肌抑素结合肽长度为约5至约50个氨基酸，在另一个实施方案中，长度约10至30个氨基酸，并且在另一个实施方案中，长度约10至25个氨基酸。在一个实施方案中，肌抑素结合肽包含氨基酸序列WMCPP(SEQIDNO:633)。在其它实施方案中，肌抑素结合肽包含氨基酸序列Ca₁a₂ Wa₃ WMCPP(SEQIDNO:352)，其中a₁、a₂和a₃选自中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸。在另一个实施方案中，肌抑素结合肽包含氨基酸序列Cb₁b₂ Wb₃ WMCPP(SEQIDNO:353)，其中b₁选自氨基酸T、I或R中的任何一个；b₂选自R、S、Q中的任何一个；b₃选自P、R和Q中的任何一个，并且其中肽长度是10至50个氨基酸，及其生理学上可接受的盐。

其他肌抑素结合肽包含式：

c₁c₂c₃c₄c₅c₆ Cc₇c₈ Wc₉ WMCPPc₁₀c₁₁c₁₂c₁₃(SEQIDNO:354)，其中：

c₁不存在或是任何氨基酸；

c₂不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

c₃不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

c₄不存在或是任何氨基酸；

c₅不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

c₆不存在或是中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸；

c₇是中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸；

c₈是中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸；

c₉是中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸；和

c₁₀至c₁₃是任何氨基酸；和其中肽长度是20至50个氨基酸，及其生理学上可接受的盐。

其他肌抑素结合肽包含式：

d₁d₂d₃d₄d₅d₆ Cd₇d₈ Wd₉ WMCPPd₁₀d₁₁d₁₂d₁₃(SEQIDNO:355)，其中

d₁不存在或是任何氨基酸；

d₂不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

d₃不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

d₄不存在或是任何氨基酸；

d₅不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

d₆不存在或是中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸；

d₇选自氨基酸T、I或R中的任何一个；

d₈选自氨基酸R、S、Q中的任何一个；

d₈选自氨基酸P、R和Q中的任何一个，和

d₁₀至d₁₃选自任何氨基酸，

并且其中肽长度是20至50个氨基酸，及其生理学上可接受的盐。

其他肌抑素结合肽包括以下肽中的至少一个：

(1)能够结合肌抑素的肽，其中该肽包含序列WYe₁e₂ Ye₃ G(SEQIDNO:356)，其中

e₁是P、S或Y，

e₂是C或Q，和

e₃是G或H，其中肽长度为7至50个氨基酸，及其生理学上可接受的盐。

(2)能够结合肌抑素的肽，其中该肽包含序列f₁ EMLf ₂ SLf₃f₄ LL(SEQIDNO:455)，其中

f₁是M或I，

f₂是任何氨基酸，

f₃是L或F，

f₄是E、Q或D；

并且其中肽长度是7至50个氨基酸，及其生理学上可接受的盐。

(3)能够结合肌抑素的肽，其中该肽包含序列Lg₁g₂ LLg₃g₄ L(SEQIDNO：456)，其中

g₁是Q、D或E，

g₂是S、Q、D或E，

g₃是任何氨基酸，

g₄是L、W、F或Y，并且其中肽长度为8至50个氨基酸，及其生理学上可接受的盐。

(4)能够结合肌抑素的肽，其中该肽包含序列h₁h₂h₃h₄h₅h₆h₇h₈h₉(SEQIDNO:457)，其中

h₁是R或D，

h₂是任何氨基酸，

h₃是A、T、S或Q，

h₄是L或M，

h₅是L或S，

h₆是任何氨基酸，

h₇是F或E，

h₈是W、F或C，

h₉是L、F、M或K，并且其中肽长度是9至50个氨基酸，及其生理学上可接受的盐。

其他肌抑素结合肽具有以下通用结构：(X¹)_a-F¹-(X²)_b，或其多聚体；

其中F¹是媒介；以及X¹和X²各自独立地选自

-(L¹)_c-P¹；

-(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²；

-(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_e-P³；

和-(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_e-P³-(L⁴)_f-P⁴；

其中P¹、P²、P³和P⁴是能够结合肌抑素的肽；和

L¹、L²、L³和L⁴各自是接头；和a、b、c、d、e和f各自独立地是0或1，只要a和b中的至少一个是1。

其他肌抑素结合肽具有这种通用结构，肽P¹、P²、P³和P⁴可以选自提供的肽，其可以选自包含以下任一个序列的一个或多个肽：SEQIDNO:633、SEQIDNO:352、SEQIDNO:353、SEQIDNO:354、SEQIDNO:355、SEQIDNO:356、SEQIDNO:455、SEQIDNO:456或SEQIDNO:457。在另一个实施方案中，P、P¹、P²、P³和P⁴独立地选自包含以下任一个序列的一个或多个肽：SEQIDNO:305至351和SEQIDNO:357至454。

在进一步的实施方案中，具有以上通式的结合剂的媒介是Fc结构域。因此将肽与Fc结构域融合(直接或间接地)，由此提供肽体。本发明的肽体显示出对肌抑素的高结合亲和力并且可以抑制肌抑素的活性，如通过体外试验和本文中提供的动物的体内测试所证明的。

肽和肽体的变体和衍生物

本文中所述的肌抑素激动剂，例如，结合剂，还包括本文中所述的肽和肽体的变体和衍生物。由于可以根据其氨基酸序列描述本发明的肽和肽体，因此术语“变体”和“衍生物”可以据说应用于单独的肽，或作为肽体组分的肽。如本文中使用的，术语“肽变体”是指原始氨基酸序列中具有一个或多个插入、删除或置换的氨基酸残基的肽或肽体，并且其保留结合肌抑素和改变其活性的能力。如本文中使用的，肽或肽体的片段包括在“变体”的定义内。

例如，方法中所用的肌抑素拮抗剂可以包括肽体，其包括至少一个具有与SEQIDNO:635中所示的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。

将理解任何给定的肽或肽体可以含有一个或两个或全部三种类型的变体。插入性和置换性变体可以含有天然氨基酸，以及非天然产生的氨基酸或两者。

肽和肽体变体还包括成熟肽和肽体，其中除去前导或信号序列，且所得的蛋白质具有附加的氨基末端残基，该氨基酸可以是天然的或非天然的。考虑在氨基酸位置-1处具有附加的甲硫氨酰基残基的肽体(Met^-1肽体)，同样考虑了在位置-2和-1处具有附加的甲硫氨酸和赖氨酸残基的肽体(Met^-2-Lys^-1-)。具有附加的Met、Met-Lys、Lys残基(或通常一个或多个碱性残基)的变体对于在细菌宿主细胞中增强的重组蛋白质生产特别有用。

本发明的肽或肽体变体还包括具有由使用特定的表达系统产生的附加氨基酸残基的肽。例如，使用表达作为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合产物的部分的所需多肽的商业上可购得的载体提供了在从所需的多肽切割GST组分后在氨基酸位置-1处具有附加的甘氨酸残基的所需多肽。还考虑了由在其他载体系统的表达得到的变体，包括其中将组氨酸标签并入氨基酸序列中的那些，通常在序列的羧基和/或氨基末端并入。

在一个实例中，提供了插入性变体，其中将一个或多个氨基酸残基(天然产生的或非天然产生的氨基酸)添加至肽氨基酸序列。插入可以位于蛋白质的任一端或两端，或可以位于肽体氨基酸序列的内部区域中。在任一端或两端具有附加的残基的插入性变体可以包括，例如，融合蛋白或包括氨基酸标签或标记的蛋白质。插入性变体包括其中将一个或多个氨基酸残基添加至肽氨基酸序列或其片段的肽。

插入性变体还包括其中肽或肽体的氨基和/或羧基末端与另一个多肽、其片段或通常没有被公认为任何特定蛋白质序列的部分的氨基酸融合的融合蛋白。这样的融合蛋白的实例是免疫原性多肽、具有长的循环半衰期的蛋白质(如免疫球蛋白恒定区)、标志物蛋白、促进所需肽或肽体的纯化的蛋白质或多肽和促进多聚蛋白质形成的多肽序列(如在二聚体形成/稳定性中有用的亮氨酸拉链基序)。

这种类型的插入性变体通常具有在N-或C-末端与第二多肽的全部或一部分连接的天然分子的全部或相当大部分。例如，融合蛋白通常使用来自其他物种的前导序列以允许蛋白质在异源宿主中重组表达。另一种有用的融合蛋白包括添加免疫学活性的结构域，如抗体表位，以促进融合蛋白的纯化。在融合连接处或附近包含切割位点将有助于纯化后外来多肽的去除。其他有用的融合包括功能性结构域的连接，如来自酶的活性位点、糖基化结构域、细胞靶标信号或跨膜区。

存在可以用于本发明的各种商业上可购得的融合蛋白表达系统。特别有用的系统包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)系统(Pharmacia)、麦芽糖结合蛋白系统(NEB，Beverley，MA)、FLAG系统(IBI，NewHaven，CT)和6xHis系统(Qiagen，Chatsworth，CA)。这些系统能够产生只带有少量附加的氨基酸的重组肽和/或肽体，其不可能显著影响肽或肽体的活性。例如，FLAG系统和6xHis系统只添加短序列，这两者已知抗原性较差并且没有不利地影响多肽折叠成其天然构象。认为有用的另一种N-末端融合是蛋白质或肽的N-端区域处Met-Lys二肽的融合。这样的融合可以产生蛋白质表达或活性的有益提高。

其他融合系统产生多肽杂合体，其中希望的是从所需的多肽或肽体切除融合伴体。在一个实施方案中，将融合伴体通过含有用于蛋白酶的特定识别序列的肽序列连接于重组肽体。合适序列的实例是被烟草蚀纹病毒蛋白酶(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)或因子Xa(NewEnglandBiolabs，Beverley，MA)识别的那些。

本发明还提供了与截短的组织因子(tTF)结合的包括本发明的肽或肽体的全部或部分的融合多肽。tTF是由作为肿瘤血管凝固剂发挥作用的截短形式的人血凝-诱导蛋白组成的血管靶向剂，如美国专利No.：5,877,289；6,004,555；6,132,729；6,132,730；6,156,321；和欧洲专利No.EP0988056中所述的。tTF与抗-肌抑素肽体或肽，或其片段的融合，有助于将抗-肌抑素拮抗剂递送至靶细胞，例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、前-脂肪细胞和可能的脂肪细胞。

在另一个方面中，本发明提供了删除变体，其中除去肽或肽体中的一个或多个氨基酸残基。可以在肽体的一端或两端实现删除，或可以在肽体氨基酸序列内除去一个或多个残基来实现。删除变体必然包括肽或肽体的全部片段。

在再另一个方面中，本发明提供了本发明的肽和肽体的置换变体。置换变体包括其中除去一个或多个氨基酸残基并用一个或多个可选氨基酸替代的那些肽和肽体，该氨基酸可以是天然产生或非天然产生的。置换性变体产生与原始肽或肽体“相似的”肽或肽体，因为两个分子具有特定百分比的相同氨基酸。置换变体包括肽或肽体内1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸的置换，其中置换的数量可以高达肽或肽体的10％氨基酸。在一个方面中，置换在性质上是保守性的，然而，本发明还包括非保守性的置换和还包括非常规氨基酸。

可以通过已知方法容易地计算相关肽和肽体的同一性和相似性。这样的方法包括，但不限于，ComputationalMolecularBiology，Lesk,A.M.等，OxfordUniversityPress,NewYork(1988)；Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.编辑，AcademicPress,NewYork(1993)；ComputerAnalysisofSequenceData,Part1,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑，HumanaPress,NewJersey(1994)；SequenceAnalysisinMolecularBiology，vonHeinje,G.，AcademicPress(1987)；SequenceAnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux,J.编辑，M.StocktonPress，NewYork(1991)；和Carillo等，SIAMJ.AppliedMath.,48:1073(1988)中描述的那些。

设计了测定两个肽或肽体，或者多肽和肽的相关性或同一性百分比的优选方法以获得所测试序列之间的最大匹配。测定同一性的方法描述于公众可利用的计算机程序中。测定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括GAP(Devereux等,Nucl.Acid.Res.,12:387(1984)；GeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsin，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.,215:403-410(1990))。BLASTX程序可以从NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)和其他来源(BLASTManual,Altschul等，NCB/NLM/NIHBethesda，MD20894；Altschul等，上文(1990))公开获得。公知的SmithWaterman算法也可以用于测定同一性。

用于比对两个氨基酸序列的特定比对方案可能导致仅两个序列的短区域匹配，并且这种小的比对区域可能具有非常高的序列同一性，即使两个全长序列之间没有显著相关性。因此，在特定的实施方案中，选定的比对方法将导致跨越待比较靶多肽的全长的至少10％的比对，即，在比较至少400个氨基酸的序列的情况中至少40个邻接的氨基酸，在比较至少300至约400个氨基酸的序列的情况中至少30个邻接的氨基酸，在比较200至约300个氨基酸的序列的情况中至少20个邻接的氨基酸以及在比较约100至200个氨基酸的序列的情况中至少10个邻接的氨基酸。例如，使用计算机算法GAP(GeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsin，Madison，WI)，待测定百分序列同一性的两个多肽进行比对以获得其相应氨基酸的最佳匹配(“匹配的跨度”，如通过算法测定的)。在特定的实施方案中，将空位开放罚分(其通常计算为3X的平均对角线；“平均对角线”是待使用的比较矩阵的对角线的平均；“对角线”是通过特定比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的评分或数值)和空位延伸罚分(其通常是空位开放罚分的1/10倍)以及比较矩阵，如PAM250或BLOSUM62，结合算法使用。在特定的实施方案中，算法还使用了标准比较矩阵(对于PAM250比较矩阵，参见Dayhoff等，AtlasofProteinSequenceandStructure,5(3)(1978)；对于BLOSUM62比较矩阵，参见Henikoff等，Proc.Natl.Acad.SciUSA,89:10915-10919(1992))。

在特定的实施方案中，例如，可以使用以下方式形成用于多肽序列比较的参数：算法：Needleman等，J.Mol.Biol.,48:443-453(1970)；比较矩阵：BLOSUM62，来自Henikoff等，上文(1992)；空位罚分12；空位长度罚分4；相似性阈值：0，以及对于末端空位没有罚分。

在特定的实施方案中，可以使用以下形成用于多核苷酸分子序列(如与氨基酸序列相对的)比较的参数：算法：Needleman等，上文(1970)；比较矩阵：匹配＝+10,失配＝0；空位罚分：50:空位长度罚分：3。

可以使用其他示例性算法、空位开放罚分、空位延伸罚分、比较矩阵、相似性阈值等，包括ProgramManual，WisconsinPackage，版本9，1997年9月中所列的那些。进行特定的选择对于本领域技术人员是显而易见的并且将取决于待进行的特定比较，如DNA-DNA比较、蛋白质-蛋白质比较、蛋白质-DNA比较；另外，不管比较是在给定的序列对之间(在该情况中，通常优选GAP或BestFit)或在一个序列和大的序列数据库之间(在该情况中，优选FASTA或BLATA)。

二十个常规(天然产生的)氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然产生的氨基酸如α-,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸，也可以是用于本发明的肽的合适组分。非天然产生的氨基酸的实例包括，例如：氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、氨基丁酸、piperidinicacid、氨基己酸(aminocaprioicacid)、氨基庚酸、氨基异丁酸、氨基庚二酸、二氨基丁酸、锁链素、二氨基庚二酸、二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸，以及其他相似的氨基酸和氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。

基于共同的侧链特性，天然产生的残基可以分成(重叠的)类别：

1)中性疏水性的：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Met、Phe；

2)中性极性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Gly；

3)酸性的：Asp、Glu；

4)碱性的：His、Lys、Arg；

5)影响链定向的残基：Gly、Pro；和

6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

氨基酸的置换可以是保守性的，其产生具有与原始肽的那些相似的功能和化学特征的肽。保守性氨基酸置换涉及将以上类别之一的成员交换成相同类别的另一个成员。保守性变化可以包括非常规的氨基酸残基，其通常是通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成来并入。这些包括肽模拟物和氨基酸部分的其他反向或倒转形式。

非保守性置换可以涉及这些类别之一的成员交换成另一个类别的成员。这些变化可以导致肽的功能和/或化学特征的实质性改变。在形成这样的改变中，根据特定实施方案，可以考虑氨基酸的水合指数(hydropathicindex)。基于其疏水性和电荷特征，每个氨基酸已经被赋予水合指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

本领域将理解氨基酸水合指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能中的重要性。Kyte等，J.Mol.Biol.，157:105-131(1982)。已知特定的氨基酸可以替换具有相似水合指数或评分的其他氨基酸并且仍然保持相似的生物活性。在特定的实施方案中，在基于水合指数进行改变时，包括水合指数在±2内的氨基酸置换。在特定的实施方案中，包括在±1内的那些，并且在特定的实施方案中，包括在±0.5内的那些。

本领域还将理解可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的置换，特别是在其中由此形成的生物功能性肽体或肽意图用于免疫学实施方案的情况中，如在本发明的情况中。在特定的实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性，如通过其邻接氨基酸的亲水性控制的，与其免疫原性和抗原性相关，即，与蛋白质的生物学性能相关。

以下亲水性值已经分配给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在特定的实施方案中，基于相似的亲水性值进行变化时，包括亲水性值在±2内的氨基酸置换，在特定的实施方案中，包括在±1内的那些，并且在特定的实施方案中，包括在±0.5内的那些。还可以基于亲水性从初级氨基酸序列鉴别表位。这些区域也称为“表位核心区”。

示例性氨基酸置换列于以下的表A中。

表A：氨基酸置换

本领域技术人员将能够通过例如随机置换来产生本发明的肽和肽体的变体，并使用本文中所述的试验测试所得到的肽或肽体的结合活性。

另外，本领域技术人员可以检查结构-功能研究或三维结构分析，以鉴别相似多肽中对活性或结构重要的残基。鉴于这样的比较，可以预测蛋白质中对应于相似蛋白质中对活性或结构重要的氨基酸残基的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择化学上相似的氨基酸置换用于这样预测的重要氨基酸残基。然后可以使用本文中所述的活性试验筛选变体。

多篇科学出版物已经致力于二级结构的预测。参见MoultJ.,Curr.Op.inBiotech.,7(4):422-427(1996)，Chou等，Biochemistry,13(2):222-245(1974)；Chou等，Biochemistry,113(2):211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.,47:45-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.,47:251-276和Chou等，Biophys.J.,26:367-384(1979)。此外，计算机程序目前可用于帮助预测二级结构。预测二级结构的一种方法是基于同源性建模。例如，具有大于30％的序列同一性，或大于40％的相似性的两个多肽或蛋白质常常具有相似的结构拓扑学。蛋白质结构数据库(PDB)的最近发展提供了增强的二级结构预测性，包括蛋白质结构内的潜在折叠数。参见，Holm等，Nucl.Acid.Res.,27(1):244-247(1999)。已经表明(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.,7(3):369-376(1997))在给定的蛋白质中存在有限数量的折叠并且一旦已经解析关键数量的结构，结构预测将变得明显更准确。

预测二级结构的其他方法包括“串线(threading)”(Jones,D.,Curr.Opin.Struct.Biol.,7(3):377-87(1997)；Sippl等，Structure,4(1):15-19(1996))、“谱分析(profileanalysis)”(Bowie等，Science，253:164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.,183:146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.,84(13):4355-4358(1987))和“进化连锁(evolutionarylinkage)”(参见Holm，上文(1999)和Brenner，上文(1997))。

在特定的实施方案中，肽或肽体变体包括糖基化变体，其中一个或多个糖基化位点如N-连接的糖基化位点已经添加至肽体。N-连接的糖基化位点的特征在于序列：Asn-X-Se或Asn-X-Thr，其中命名为X的氨基酸残基可以是除了脯氨酸外的任何氨基酸残基。形成这一序列的氨基酸残基的置换或添加提供了用于添加N-连接的碳水化合物链的潜在新位点。或者，消除这一序列的置换将除去现有的N-连接的碳水化合物链。还提供了N-连接的碳水化合物链的重排，其中消除一个或多个N-连接的糖基化位点(通常是天然存在的那些)并形成一个或多个新的N-连接位点。

衍生物

本发明还提供了本发明的肽或肽体的“衍生物”。如本文中使用的，术语“衍生物”是指除氨基酸残基的插入、删除或置换以外的或在氨基酸残基的插入、删除或置换之外的修饰，其保留结合肌抑素的能力。在一个实施方案中，肌抑素拮抗剂与其他化合物偶联。

优选地，对本发明的肽进行以产生衍生物的修饰性质上是共价的，并且包括例如，与聚合物、脂质、其他无机和有机部分的化学键合。可以制备本发明的衍生物以提高肽体的循环半衰期，或可以设计来提高将肽体靶向所需细胞、组织或器官的能力。

本发明进一步包括共价修饰的衍生物结合剂以包括一个或多个水溶性聚合物连接，如聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇，如美国专利No.：4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192和4,179,337中所述的。本领域已知的其他有用的聚合物包括单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其他基于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇，以及这些聚合物的混合物。特别优选的是用聚乙二醇(PEG)亚单元共价修饰的肽体。水溶性聚合物可以在特定的位置，例如，在肽体的氨基末端，键合，或随机连接多肽的一个或多个侧链。2000年10月17日授权的Gonzales等的美国专利No.6,133,426中描述了使用PEG提高结合剂(例如肽体)和特别地人源化抗体的治疗能力。

本发明还考虑了衍生化肌抑素结合剂的肽和/或媒介部分。这样的衍生物可以提高化合物的溶解性、吸收、生物半衰期等。所述部分可以可选地消除或减轻化合物的任何不希望的副作用等。示例性衍生物包括化合物，其中：

1.衍生物或其一些部分是环状的。例如，肽部分可以修饰来含有两个或更多个Cys残基(例如，在接头中)，其可以通过二硫键形成来环化。

2.衍生物是交联的或使得能够在分子间交联。例如，肽部分可以进行修饰以含有一个Cys残基并且因此能够与相似分子形成分子间二硫键。衍生物还可以通过其C-端来交联。

3.一个或多个肽酰基[-C(O)NR-]连接(键)被非肽酰基连接替代。示例性非肽酰基连接是-CH₂-氨基甲酸酯[-CH₂-OC(O)NR-]、膦酸酯、-CH₂-磺酰胺[-CH₂-S(O)₂NR-]、脲[-NHC(O)NH-]、-CH₂-仲胺和烷基化肽[-C(O)NR₆-，其中R₆是低级烷基]。

4.N-端被衍生化。通常，N-端可以是酰化的或修饰成取代的胺。示例性N-端衍生物基团包括-NRR₁(而不是-NH₂)、-NRC(O)R₁、-NRC(O)OR₁、-NRS(O)₂R₁、-NHC(O)NHR₁、琥珀酰亚胺或苄氧基羰基-NH-(CBZ-NH-)，其中R和R1各自独立地是氢或低级烷基，并且其中苯环可以被1至3个选自C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、氯和溴的取代基取代。

5.游离C-端被衍生化。通常，将C-端酯化或酰胺化。例如，可以使用本领域中所述的方法将(NH-CH₂-CH₂-NH₂)₂在C-端添加至本发明的化合物。类似地，可以使用本领域中所述的方法在C-端添加NH₂(或以基团“加帽”)至本发明的化合物。示例性C-端衍生物基团包括，例如，-C(O)R₂，其中R₂是低级烷氧基或-NR₃R₄，其中R₃和R₄独立地是氢或C₁-C₈烷基(优选C₁-C₄烷基)。

6.二硫键被另一个优选更稳定的、交联部分(例如，亚烃基)替代。参见，例如，Bhatnagar等，JMedChem39:3814-9(1996)，Alberts等，ThirteenthAmPepSymp，357-9(1993)。

7.一个或多个单独的氨基酸残基是修饰的。各种衍生剂已知与选定的侧链或末端残基特异性地反应，如以下详细描述的。

赖氨酰(lysinyl)残基和氨基末端残基可以与琥珀酸或其他羧酸酐反应，其反转了赖氨酰残基的电荷。其他合适的用于衍生化含α-氨基残基的试剂包括酰亚胺酯，如甲基吡啶亚氨酸酯(methylpicolinimidate)；吡哆醛磷酸酯；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2,4-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。

可以通过与几种常规试剂中的任何一种或组合的反应来修饰精氨酰残基，所述常规试剂包括苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。由于胍官能团的高pKa，精氨酰残基的衍生化需要在碱性条件中进行反应。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基基团反应。

已经专门研究了酪氨酰残基的特定修饰，特别关注通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷的反应将光谱标记引入酪氨酰残基中。更常见地，使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别形成O-乙酰基酪酰基物质和3-硝基衍生物。

可以通过与碳二亚胺(R’-N＝C＝N-R’)如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子(azonia)-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺的反应来选择性地修饰羧基侧链基团(天冬氨酰或谷氨酰)。此外，天冬氨酰或谷氨酰残基可以通过与铵离子的反应转化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。

谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基可以脱酰胺成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，将这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。这些残基的任一种形式落入本发明的范围内。

半胱氨酰残基可以被氨基酸残基或其他部分替代以消除二硫键键合，或相反地，以稳定交联。参见，例如，Bhatnagar等，(上文)。

用双功能剂的衍生化对于将肽或其功能性衍生物与水不溶性支持基质或其他大分子媒介交联是有用的。常用的交联剂包括，例如，1,1-双(二重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如，与4-叠氮唾液酸的酯)、同型双功能酰亚胺酯(包括二琥珀酰亚胺酯如3,3’-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷。衍生化剂，如甲基3-[(p-叠氮苯基)二硫代]丙亚氨酸酯(propioimidate)产生能够在光存在下形成交联的可光激活的中间体。或者，使用美国专利No.3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537和4,330,440中所述的反应性水不溶性基质如溴化氰-活化的碳水化合物和反应性基质用于蛋白质固定。

碳水化合物(寡糖)基团可以方便地连接已知是蛋白质中的糖基化位点的位点。通常，当丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基和天冬酰胺(Asn)残基是序列Asn-X-Ser/Thr的部分(其中X可以是任何氨基酸，除了脯氨酸)时，O-连接的寡糖连接丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基，而N-连接的寡糖连接天冬酰胺(Asn)残基。X优选是除了脯氨酸外的19种天然存在的氨基酸之一。每种类型中发现的N-连接的和O-连接的寡糖以及糖残基的结构是不同的。在两者中共同发现的一种类型的糖是N-乙酰基神经氨酸(称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接的和O-连接的寡糖两者的末端残基，且依靠其负电荷，可以赋予糖基化的化合物以酸性特性。可以在本发明的化合物的接头中并入这样的位点并且优选在多肽化合物的重组生产过程中由细胞糖基化(例如，在哺乳动物细胞中，如CHO、BHK、COS)。然而，这样的位点可以进一步通过本领域已知的合成或半合成过程糖基化。

其他可能的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化，Cys中硫原子的氧化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化[参见，例如，Creighton,Proteins:StructureandMoleculeProperties(W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco),pp.79-86(1983)]。

也可以在DNA水平改变本发明的化合物。将化合物的任何部分的DNA序列改变成与选择的宿主细胞更相容的密码子。对于大肠杆菌(其是优选的宿主细胞)，优化的密码子是本领域已知的。密码子可以替换以消除限制位点或包括沉默限制位点(silentrestrictionsite)，这可以有助于选择的宿主细胞中DNA的加工。媒介、接头和肽DNA序列可以进行修饰以包括前述序列改变中的任一种。

还考虑了包括提供稳定的结构或减少的生物降解的其他衍生物，包括非肽类似物。可以基于选定的抑制性肽通过用非肽部分替代一个或多个残基来制备肽模拟类似物。优选地，非肽部分允许肽保留其天然构象，或稳定优选的(例如，生物活性的)构象，其保留识别和结合肌抑素的能力。在一个方面中，所得到的类似物/模拟物呈现出提高的对肌抑素的结合亲和性。用于从肽制备非肽模拟类似物的方法的一个实例描述于Nachman等，RegulPept57:359-370(1995)中。如果需要，例如，可以通过本发明肽的糖基化、酰胺化、羧基化或磷酸化，或通过产生酸加成盐、酰胺、酯，特别是C-末端酯和N-酰基衍生物来修饰本发明的肽。也可以通过与其他部分形成共价或非共价复合物来修饰肽体以形成肽衍生物。可以通过将化学部分连接构成肽体的氨基酸的侧链上的官能团或连接在N-或C-末端处来制备共价结合的复合物。

特别地，预期肽可以与报告基团偶联，包括，但不限于，放射性标记、荧光标记、酶(例如，催化比色或荧光反应)、底物、固体基质或载体(例如，生物素或抗生物素蛋白)。本发明因此提供包含肽体分子的分子，其中该分子优选进一步包括选自反射性标记、荧光标记、酶、底物、固体基质和载体的报告基团。这样的标记是本领域技术人员公知的，例如，特别考虑生物素标记。此类标记的使用是本领域技术人员公知的，并且描述于例如美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,996,345和4,277,437中。有用的其他标记包括但不限于放射性标记、荧光标记和化学发光标记。关于使用此类标记的美国专利包括，例如，美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350和3,996,345。本发明的任一个肽体可以包括任何这些标记的一个、两个或更多个。

制备肽和肽体的方法

可以使用本领域已知的各种技术产生本文中所述的肌抑素激动剂和肽。在一个实施方案中，使用以下实施例17中所述的方法来产生肌抑素激动剂。

可以根据常规技术，在溶液中或在固体支持物上合成肽。各种自动化合成仪是商业上可购得的并且可以根据已知的实验方案来使用。参见，例如，Stewart和Young(上文)；Tam等，JAmChemSoc,105:6442(1983)；Merrifield,Science232:341-347(1986)；Barany和Merrifield,ThePeptides,Gross和Meienhofer编辑，AcademicPress,NewYork,1-284；Barany等，IntJPepProteinRes,30:705-739(1987)和美国专利No.5,424,398，将每一篇都按引用并入本文中。

固相肽合成方法使用含有0.1-1.0mM胺/g聚合物的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)。这些用于肽合成的方法采用α-氨基基团的丁氧基羰基(t-BOC)或9-芴基甲氧基-羰基(FMOC)保护。两种方法都涉及逐步合成，由此从肽的C-末端开始，在每个步骤添加单个氨基酸(参见，Coligan等，CurrProtImmunol,WileyInterscience,1991,Unit9)。在化学合成完成时，可以将合成的肽去保护以除去t-BOC或FMOC氨基酸封闭基团，并通过在降低温度下用酸处理从聚合物切割(例如，在0℃下，液体HF-10％茴香醚，持续约0.25至约1小时)。试剂蒸发后，使用1％乙酸溶液从聚合物中提取肽，随后将其冻干以产生粗制材料。这通常可以使用5％乙酸作为溶剂通过如SephadexG-15上的凝胶过滤这样的技术来纯化。柱的合适级分的冻干将产生均质的肽或肽衍生物，其随后可以通过如氨基酸分析、薄层色谱、高效液相色谱、紫外吸收光谱、摩尔旋光度、溶解性这样的标准技术来表征，并通过固相Edman降解来定量。

噬菌体展示技术在鉴别如上所述的本发明的肽中特别有效。简而言之，制备噬菌体文库(使用例如ml13、fd或λ噬菌体)，展示4至约80个氨基酸残基的插入片段。插入片段可以表示例如完全简并或偏倚的阵列。选择带有结合所需抗原的插入片段的噬菌体，并且通过结合所需抗原的噬菌体的几个重新选择循环来重复这个过程。进行DNA测序来鉴别所表达的肽的序列。可以以这种方式确定结合所需抗原的序列的最小线性部分。可以使用含有插入片段的偏倚文库重复该程序，所述插入片段含有部分或全部的最小线性部分加其上游或下游的一个或多个其他的简并残基。这些技术可以鉴别比本文中已经鉴别的试剂对肌抑素仍具有更高结合亲和性的本发明的肽。

与其中制备肽的方式无关，可以使用标准重组DNA过程产生编码每个这样的肽的核酸分子。可以考虑核酸编码的简并性以及特定宿主细胞中的密码子偏好按照需要操纵此类分子的核苷酸序列而不改变它们编码的氨基酸序列。

本发明还提供了包含编码本发明的肽和肽体的多核苷酸序列的核酸分子。这些核酸分子包括含有编码本发明的肽和肽体以及肽和肽体变体和衍生物的多核苷酸的载体和构建体。以下实施例中提供了示例性核酸分子。

重组DNA技术还提供了用于制备本发明的全长肽体和其他大的多肽结合剂或其片段的便利方法。可以将编码肽体或片段的多核苷酸插入表达载体中，其随后可以插入用于产生本发明的结合剂的宿主细胞中。以下实施例2中描述了本发明的示例性肽体的制备。

多种表达载体/宿主系统可以用于表达本发明的肽和肽体。这些系统包括但不限于微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染的或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。一种优选的宿主细胞系是大肠杆菌株2596(ATCC#202174)，用于以下实施例2中所述的肽体的表达。重组蛋白生产中有用的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。

术语“表达载体”是指用于从多核苷酸序列表达多肽的质粒、噬菌体、病毒或载体。表达载体可以包含转录单元，其包括以下的组件：(1)一个或多个在基因表达中具有调控作用的遗传元件，例如，启动子或增强子，(2)编码结合剂的结构或序列，其转录成mRNA并翻译成蛋白质和(3)合适的转录启动和终止序列。打算用于酵母或真核表达系统中的结构单元优选包括使宿主细胞能够胞外分泌翻译的蛋白质的前导序列。或者，在没有前导或转运序列下表达重组蛋白的情况中，可以包括氨基末端甲硫氨酰基残基。这个残基随后可以从表达的重组蛋白切割或不切割以提供最终的肽产物。

例如，可以使用商业上可购得的表达系统，例如，毕赤酵母表达系统(Invitrogen，SanDiego，CA)，按照制造商的说明在酵母中重组表达肽和肽体。这种系统还依赖于前-原序列(pre-pro-αsequence)来指导分泌，但插入片段的转录是在甲醇诱导时通过醇氧化酶(AOX1)启动子来驱动的。使用用于从细菌和哺乳动物细胞上清液中纯化肽的方法从酵母生长培养基纯化分泌的肽。

或者，可以将编码肽和肽体的cDNA克隆至杆状病毒表达载体pVL1393(PharMingen，SanDiego，CA)中。可以根据制造商的指导(PharMingen)使用这种载体来感染sF9无蛋白培养基中的草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞并且产生重组蛋白。可以使用肝素-琼脂糖柱(Pharmacia)从培养基中纯化和浓缩重组蛋白。

或者，可以在昆虫系统中表达肽或肽体。用于蛋白质表达的昆虫系统是本领域技术人员公知的。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可以用作载体以在草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。可以将肽编码序列克隆至病毒的非必需区域中，如多角体蛋白基因，并且置于多角体蛋白启动子的控制下。肽的成功插入将使得多角体蛋白基因失活并且产生缺乏外壳蛋白包衣的重组病毒。所述重组病毒可以用于感染其中表达肽的草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫(Smith等，JVirol46:584(1983)；Engelhard等，ProcNatAcadSci(USA)91:3224-7(1994))。

在另一个实例中，可以通过PCR扩增编码肽的DNA序列并克隆至合适的载体中，例如，pGEX-3X(Pharmacia)。将pGEX载体设计成产生包括由载体编码的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和由插入载体的克隆位点中的DNA片段编码的蛋白质的融合蛋白。可以产生用于PCR的引物以包括例如，合适的切割位点。在将融合部分单独用于促进表达或不需要另外作为目标肽的连接物的情况中，随后可以从融合蛋白的GST部分分裂出重组融合蛋白。将pGEX-3X/特异性结合剂肽构建体转化至大肠杆菌XL-1Blue细胞(Stratagene，LaJollaCA)中，并且分离单个转化体并生长。可以从单个转化体纯化质粒DNA，并使用自动化测序仪部分测序以证实正确定向的编码所需特定结合剂的核酸插入片段的存在。

可以如下纯化作为细菌中的不溶性包涵体产生的融合蛋白。通过离心收集宿主细胞；在0.15MNaCl，10mMTris，pH8，1mMEDTA中洗涤；并用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma，St.Louis，MO)在室温下处理15分钟。可以通过超声处理澄清溶解产物，并且细胞碎片可以通过在12,000Xg下离心10分钟来沉淀。可以将含有融合蛋白的沉淀物重悬浮于50mMTris，pH8和10mMEDTA中，在50％甘油上成层，并且在6000Xg下离心30min。可以将沉淀物重悬浮于不含Mg++和Ca++的标准磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中。通过将变性SDS-PAGE中重悬浮的沉淀物分级分离来进一步纯化融合蛋白(Sambrook等，上文)。可以将凝胶浸没在0.4MKCl中以可视化蛋白质，其可以切除并在缺少SDS的跑胶缓冲液中电洗脱。如果GST/融合蛋白在细菌中作为可溶性蛋白产生，其可以使用GST纯化模块(Pharmacia)来纯化。

融合蛋白可以接受消化以从本发明的肽切割GST。可以将0.5mlPBS中的消化反应(20-40mg融合蛋白，20-30单位人凝血酶(4000U/mg，Sigma)在室温下孵育16-48hr，并加载于变性SDS-PAG凝胶上以将反应产物分级分离。可以将凝胶浸没于0.4MKCl中以可视化蛋白质条带。可以使用自动化测序仪(AppliedBiosystemsModel473A，FosterCity，CA)通过氨基酸序列分析来证实对应于预期分子量的肽的蛋白质条带的身份。或者，可以通过进行肽的HPLC和/或质谱分析来证实身份。

或者，可以将编码肽的DNA序列克隆至含有所需启动子和任选的前导序列的质粒中(Better等，Science240:1041-43(1988))。可以通过自动化测序来证实这个构建体的序列。然后可以采用细菌的CaCl₂孵育和热休克处理使用标准程序(Sambrook等，上文)将质粒转化至大肠杆菌菌株MC1061中。转化的细菌可以在补充了羧苄青霉素的LB培养基中生长，并且可以通过在合适的培养基中生长来诱导表达蛋白质的产生。如果存在，前导序列可以影响肽的分泌并在分泌过程中切割掉。

用于重组肽和肽体表达的哺乳动物宿主系统是本领域技术人员公知的。可以针对加工表达的蛋白质或产生在提供蛋白质活性中有用的特定翻译后修饰的特定能力来选择宿主细胞株。这样的蛋白质修饰包括，但不限于，乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。不同的宿主细胞，如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等，对于这样的翻译后活性具有特定的细胞机制和特征性机理，并且可以选择以确保引入的外源蛋白的正确修饰和加工。

优选将转化的细胞用于长期的、高产量蛋白质生产。一旦用含有可选择标记以及所需表达盒的载体转化这样的细胞，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天，随后将其转换至选择培养基。选择标记设计为允许成功表达引入序列的细胞的生长和回收。可以使用适用于所用细胞系的组织培养技术来增殖稳定转化细胞的抗性团块。

多种选择系统可以用于回收已经为重组蛋白产生而转化的细胞。这样的选择系统包括，但不限于，分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。此外，抗代谢物抗性也可以用作选择基础，其中dhfr赋予对氨甲喋呤的抗性；gpt赋予对霉酚酸的抗性；neo赋予对氨基糖苷G418的抗性和赋予对氯磺隆的抗性；以及hygro赋予对潮霉素的抗性。其他可能有用的选择基因包括trpB，其允许细胞利用吲哚替代色氨酸，或hisD，其允许细胞利用组氨醇(histinol)替代组氨酸。给予用于鉴别转化体的视觉指示的标志物包括花青素、β-葡糖醛酸酶及其底物(GUS)以及荧光素酶及其底物(荧光素)。

结合剂的纯化和重折叠

在一些情况中，肌抑素激动剂，例如，结合剂，如本发明的肽和/或肽体，可能需要“重折叠”和氧化成正确的三级结构和产生二硫键以在生物上是有活性的。在一个实施方案中，使用以下实施例17中所述的方法纯化和重折叠肌抑素激动剂。

可以使用本领域公知的多种程序来完成重折叠。这样的方法包括，例如，在离液剂的存在下，将溶解的多肽剂暴露于通常高于7的pH。离液剂的选择与用于包涵体溶解的选择相似；然而，通常在较低浓度下使用离液剂。示例性离液剂是胍和脲。在大部分情况中，重折叠/氧化溶液还将含有特定比例的还原剂加其氧化形式，以产生允许发生二硫键重组的特定氧化还原电势，以形成半胱氨酸桥接。一些常用的氧化还原电对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫代双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT和2-巯基乙醇(bME)/二硫代-bME。在许多情况中，可以使用助溶剂来提高重折叠的效率。常用的助溶剂包括甘油、各种分子量的聚乙二醇和精氨酸。

可能需要纯化本发明的肽和肽体。蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术在一个水平涉及蛋白质和非蛋白质性级分的粗分级分离。在已经从其他蛋白质中分离肽和/或肽体的情况下，可以使用色谱和电泳技术进一步纯化目标肽或多肽以实现部分或完全纯化(或纯化至均一)。特别适用于本发明的肽体和肽的制备的分析方法包括离子交换色谱、排阻色谱；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。特别有效的纯化肽的方法是快速蛋白质液相色谱或甚至HPLC。

本发明的特定方面涉及本发明的肽体或肽的纯化，并且在特别的实施方案中，涉及基本上纯化。如本文中使用的术语“纯化的肽体或肽”用来指可从其他组分分离的组合物，其中将肽体或肽纯化至相对于其天然可获得状态的任何程度。纯化的肽或肽体因此也指从其可以天然产生的环境中脱离的肽体或肽。

通常，“纯化的”将指已经接受分级分离来除去各种其他组分的肽或肽体组合物，并且该组合物基本上保留其表达的生物活性。在使用术语“基本上纯化的”的情况中，这一名称将指其中肽体或肽形成组合物的主要成分的肽或肽体组合物，如构成组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更高。

用于定量肽或肽体的纯化程度的各种方法是本领域技术人员根据本发明公开内容已知的。这些包括，例如，通过SDS/PAGE分析测定活性级分的特异性结合活性，或评估级分内的肽或肽体的量。用于评估肽或肽体级分纯度的优选方法是计算级分的结合活性，将其与初始提取物的结合活性相比并且因此计算纯化的程度，本文中通过“-纯化倍数”来评估。用于表示结合活性量的实际单位当然将取决于选择来进行纯化的特定试验技术及肽体或肽是否呈现出可检测的结合活性。

适用于纯化的各种技术将是本领域技术人员公知的。这些包括，例如，使用硫酸铵、PEG、抗体(免疫沉淀)等或通过热变性来沉淀，接着离心；色谱步骤，如亲和性色谱(例如，蛋白A-琼脂糖)、离子交换、凝胶过滤、反相、羟磷灰石和亲和性色谱；等电聚焦；凝胶电泳；以及此类和其他技术的组合。如本领域通常已知的，据信进行各种纯化步骤的顺序可以改变，或特定步骤可以省略，并且仍然形成用于制备基本上纯化的结合剂的合适方法。

不存在本发明的结合剂总是以其最纯化的状态来提供的一般要求。实际上，考虑在特定的实施方案中，基本上不太纯的结合剂产物将具有实用性。可以通过组合使用较少的纯化步骤，或通过利用不同形式的相同总体纯化方案来完成部分纯化。例如，应理解利用HPLC装置进行的阳离子-交换柱色谱通常将获得比利用低压色谱系统的相同技术更高的“-倍”纯化。呈现较低相对纯化程度的方法在肽或肽体的总体回收率中或在维持肽或肽体的结合活性中具有优势。

已知使用不同的SDS/PAGE条件，肽或多肽的迁移可能发生改变，有时候是显著改变(Capaldi等，BiochemBiophysResComm,76:425(1977))。因此将理解在不同电泳条件下，纯化或部分纯化的结合剂表达产物的表观分子量可能不同。

肌抑素结合剂和其他拮抗剂的活性

可以测试包括本文中所述的结合剂的拮抗剂结合肌抑素并抑制或阻断肌抑素活性的能力。可以实用许多试验或动物测试来测定试剂抑制或阻断肌抑素活性的能力。以下实施例中描述了用于表征本发明的肽和肽体的几个试验。一个试验是C2C12pMARE-luc试验，其利用以含有肌抑素/激活素应答元件(MARE)的荧光素酶受体载体转染的肌抑素反应性细胞系(C2C12成纤维细胞)。通过用肌抑素预先孵育一系列肽体稀释物，并且随后将细胞暴露于孵育混合物来测试示例性肽体。测定所得的荧光素酶活性，并且从该系列的肽体稀释物产生滴定曲线。然后测定IC₅₀(如通过荧光素酶活性测量的，获得50％肌抑素活性抑制的肽体浓度)。以下所述的第二试验是测定肌抑素结合剂和其他拮抗剂(如，能够结合肌抑素及其受体的抗体)的动力学参数k_a(缔合速率常数)、k_d(解离速率常数)和K_D(解离平衡常数)的试验来。较低解离平衡常数(以nM表示的K_D)表明肽体对肌抑素的亲和力较高。其他试验包括阻断试验以确定结合剂(如肽体)是否是中和的(阻止肌抑素与其受体的结合)或非中和的(不阻止肌抑素与其受体的结合)；选择性试验，其确定本发明的结合剂是否选择性地结合肌抑素和是否不结合特定的其他TGF-β家族成员；以及KinExA^TM试验或基于溶液的平衡试验，其也测定K_D并且认为在一些情况中更灵敏。这些试验描述于实施例3中。

图1显示了与来自肽的肽体的IC₅₀相比的肽的IC₅₀。这证明了在抑制肌抑素活性上，肽体明显比单独的肽更有效。此外，与亲本肽和肽体相比，亲和力成熟的肽体通常呈现出提高的IC₅₀和K_D值。以下实施例7表VII中显示了多种示例性亲和力成熟的肽体的IC₅₀值。另外，在一些情况中，制备肽体的2x形式(其中两个肽串联)在体外和体内都提高了肽体的活性。

在以下实施例中证明了体内活性。结合剂的活性包括但不限于，相对于处理的动物模型中总体重提高的瘦肌肉质量、提高的肌肉强度和降低的脂肪量。本文中所述的体内活性进一步包括动物模型中瘦肌肉质量和强度萎缩的减轻，所述动物模型包括性腺机能减退、类风湿性恶病质、癌症恶病质和不活动的模型。

治疗方法

本发明提供了通过施用治疗量的肌抑素拮抗剂，例如，包括肌抑素结合肽SEQIDNO:311的结合剂，例如，包括至少一个由SEQIDNO:635组成的多肽的肽体，用于正经受雄激素剥夺治疗的前列腺癌患者中的恶病质的方法和治疗。

如本文中使用的，术语“恶病质”是指由多种疾病(如前列腺癌)引起的加速的肌肉萎缩和瘦体重损失的状况。如以下实施例中所示，肌抑素拮抗剂，如本文中所述的示例性肽体，急剧提高瘦肌肉质量、降低脂肪量、改变肌肉-脂肪比例和提高肌肉强度。

也可以预防性地施用肌抑素拮抗剂以保护需要这样治疗的受试者对抗将来的肌肉萎缩和相关的病症。

本发明的肌抑素拮抗剂可以单独使用或结合其他药剂使用以增强其治疗作用或降低潜在的副作用。

药物组合物

在一些实施方案中，本发明的方法使用在药物组合物中配制的肌抑素拮抗剂。药物组合物可以包括，例如，缓冲剂、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质、螯合剂、稳定剂或赋形剂。在一个实施方案中，肌抑素拮抗剂在10mM醋酸钠，9％(w/v)蔗糖，0.004％(w/v)聚山梨酸酯20，pH4.75中配制。

这样的组合物包含与药物学上可接受的试剂混合的一种或多种治疗或预防有效量的肌抑素拮抗剂。药物组合物包含与药物学上可接受的试剂混合的部分或完全抑制肌抑素的拮抗剂。通常，拮抗剂将充分纯化以用于施用于患者。

药物组合物可以含有用于改变、维持或保持例如pH、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、解离或释放速率、组合物的吸附或渗透的制剂材料。合适的制剂材料包括，但不限于，氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、其他有机酸)；膨胀剂(如甘露糖醇或甘氨酸)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；复合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖、二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂；调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(如钠)；防腐剂(如杀藻胺、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普郎尼克类(pluronics)、PEG、山梨聚糖酯、聚山梨酸酯(如聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80)、曲通、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)；递送媒介；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂(Remington’sPharmaceuticalSciences，第18版，A.R.Gennaro编辑，MackPublishingCompany，1990)。

本领域技术人员将根据例如计划的给药途径、递送形式和所需剂量来确定最佳药物组合物。参见，例如，Remington’sPharmaceuticalSciences，上文。这样的组合物可以影响结合剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

药物组合物中的主要媒介(vehicle)或载体(carrier)性质上可以是水性的或非水性的。例如，合适的媒介或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充了用于非肠胃外给药的组合物中常见的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外示例性的媒介。其他示例性药物组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液，或约pH4.0-5.5的醋酸盐缓冲液，其可以进一步包括山梨糖醇或因此合适的替代品。在本发明的一个实施方案中，可以通过将具有所需纯度水平的选定组合物与任选的配制剂(Remington’sPharmaceuticalSciences，上文)混合，以冻干饼或水溶液形式制备用于储存的结合剂组合物。此外，可以使用合适的赋形剂如蔗糖将结合剂产物配制成冻干产物。

药物组合物可以选择用于肠胃外递送，例如，皮下。或者，组合物可以选择用于吸入或用于肠道递送，如通过口、耳、眼睛、直肠或阴道递送。这样的药物学上可接受组合物的制备在本领域的技能范围内。

制剂组分以给药部位可接受的浓度存在。例如，缓冲剂用于将组合物维持在生理pH或略低的pH下，通常在约5至约8的pH范围内。

考虑肠胃外给药时，用于本发明中的治疗组合物可以是在药物学上可接受的媒介中包含所需结合剂的无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式。用于肠胃外注射的特别合适的媒介是无菌蒸馏水，其中将结合剂配制成适当防腐的无菌的、等渗溶液。再另一种制备物可以涉及用如可注射微球、生物可蚀颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠或脂质体(其提供产物的受控或持续释放)的试剂来配制所需的分子，其随后可以通过积存注射来递送。也可以使用透明质酸，并且这具有促进循环中的持久的持续时间的作用。用于引入所需分子的其他合适方式包括可植入药物递送装置。

在另一个方面中，可以在水性溶液中，优选在生理学上可接受的缓冲液如Hanks’溶液、ringer’s溶液或生理缓冲盐水中，配制适用于肠胃外施用的药物制剂。水性注射悬浮液可以含有提高悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。另外，可以将活性化合物的悬浮液制成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油，如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。非脂质聚阳离子氨基聚合物也可以用于递送。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或用来提高化合物的溶解性和允许制备高度浓缩的溶液的试剂。在另一个实施方案中，可以将药物组合物配制用于吸入。例如，可以将结合剂配制成用于吸入的干粉。也可以使用用于气溶胶递送的推进剂来配制多肽或核酸分子吸入溶液。在再另一个实施方案中，可以将溶液雾化。肺部给药进一步描述于PCT申请No.PCT/US94/001875中，其描述了化学修饰蛋白质的肺部递送。

还考虑了可以口服施用的特定制剂。在本发明的一个实施方案中，以这种方式施用的结合剂分子可以用或不用固体剂型(如片剂和胶囊)的复合中常规使用的那些载体来配制。例如，当生物利用率最大化并且前-系统降解最小化时，胶囊可以设计成在胃肠道中的某个点释放制剂的活性部分。可以包括另外的试剂来促进结合剂分子的吸收。还可以使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。

还可以使用本领域公知的适用于口服施用的药物学上可接受的载体来配制用于口服施用的药物组合物。这样的载体使药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖锭、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等等，用于患者的摄入。

可以通过将活性化合物与固体赋形剂混合，并加工所得到的颗粒混合物(任选，研磨后)来获得片剂或糖锭核心而获得用于口服使用的药物制剂。如果需要，可以添加合适的辅剂。合适的赋形剂包括碳水化合物或蛋白质填充剂，如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇；来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；和蛋白质，如明胶或胶原蛋白。如果需要，可以加入崩解剂或增溶剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂和海藻酸或其盐，如海藻酸钠。

糖锭核心可以结合合适的包衣如浓缩糖溶液来使用，其也可以含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡巴浦尔凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加入片剂或糖锭包衣中用于产品识别或表征活性化合物的含量，即，剂量。

可以口服使用的药物制剂还包括由明胶制得的推入-配合胶囊，以及由明胶和包衣(如甘油或山梨糖醇)制得的软质的、密封的胶囊。推入-配合胶囊可以含有与填充剂或粘合剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮液合适的液体如脂肪油、液体或液体聚乙二醇中，含有或不含稳定剂。

另一种药物组合物可以涉及与适用于制造片剂的无毒赋形剂的混合物中的有效量的结合剂。通过将片剂溶解于无菌水或其他合适媒介中，可以将溶液制成单位剂型。合适的赋形剂包括，但并不限于，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或结合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

另外的药物组合物将是本领域技术人员显而易见的，包括涉及持续-或控制-递送制剂中的结合剂分子的制剂。用于配制多种其他持续-或控制-递送方式(如脂质体载体、生物可蚀微粒或多孔珠和积存注射)的技术也是本领域技术人员已知的。参见，例如，PCT/US93/00829，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的受控释放。持续释放制剂的其他实例包括成型物体形式的半渗透性聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚交酯(U.S.3,773,919，EP58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等，Biopolymers,22:547-556(1983))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer等，Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等，上文)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。持续释放组合物还包括脂质体，其可以通过本领域已知的几种方法中的任何一种来制得。参见，例如，Eppstein等，PNAS(USA)，82:3688(1985)；EP36,676；EP88,046；EP143,949。

用于体内施用的药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过经由无菌过滤膜的过滤来实现。在将组合物冻干的情况中，使用这种方法的灭菌可以在冻干和重建之前或之后进行。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或在溶液中储存。此外，通常将肠胃外组合物放入具有无菌入口的容器中，例如，具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶。

一旦药物组合物已经配制，它可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。这样的制剂可以以即用形式或以施用前需要重建的形式(例如，冻干的)来储存。

在特定的实施方案中，本发明涉及用于产生单剂量施用单位的试剂盒。试剂盒可以各自含有具有干燥蛋白质的第一容器和具有含水制剂的第二容器。本发明范围内还包括含有单和多室的预填充注射器(例如，液体注射器和lyosyringes)的试剂盒。

剂量

治疗上待使用的药物组合物的有效量将取决于例如治疗的环境和对象。本领域技术人员将认识到用于治疗的合适剂量水平因此将部分地根据递送的分子、待使用结合剂分子的适应症、给药途径以及患者的尺寸(体重、体表面或器官尺寸)和状况(年龄和一般健康)而改变。因此，临床医生可以滴定剂量并改变给药途径以获得最佳治疗效果。根据以上提及的因素，典型的剂量范围为约0.1mg/kg至高达约100mg/kg或更高。在其他实施方案中，剂量范围可以为0.1mg/kg至高达约100mg/kg；或1mg/kg至高达约100mg/kg；或5mg/kg至约100mg/kg。

在本文中所述的治疗方法的一个实施方案中，以0.01至10.0mg/kg的剂量(包括端点)施用肌抑素拮抗剂，或0.3至3.0mg/kg的剂量(包括端点)，或0.3、1.0或3.0mg/kg的剂量施用。

对于任何化合物，可以最初在细胞培养物试验或动物模型(如小鼠、大鼠、兔子、狗、猪或猴)中估算治疗有效剂量。动物模型还可以用于确定合适的浓度范围和施用途径。这样的信息随后可以用于确定用于人类施用的有用剂量和途径。

精确的剂量将根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定。调整剂量和给药以提供足够水平的活性化合物或维持所需效应。可以考虑的因素包括病况的严重程度，受试者的一般健康，受试者的年龄、体重和性别，施用的时间和频率，药物组合，反应敏感性和对治疗的反应。根据特定制剂的半衰期和清除速率，长效药物组合物可以每3至4天，每周或每两周施用。

在一些实施方案中，肌抑素拮抗剂每日施用两次，每日一次，每周两次，每周一次，每月两次或每月一次。例如，肌抑素拮抗剂每周施用一次，持续4周。

给药的频率将取决于所用制剂中的结合剂分子的药代动力学参数。通常，施用组合物直至达到获得所需效果的剂量。组合物因此可以作为单一剂量或作为随着时间的多个剂量(相同或不同浓度/剂量)，或作为连续输注来施用。按照常规进行合适剂量的进一步优化。可以通过使用合适的剂量-反应数据来确定合适的剂量。

药物组合物的施用途径是根据已知的方法，例如，口服、皮下、通过静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、肝门内(inraportal)、病灶内途径注射、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、经肠、局部、舌下、尿道、阴道或直肠方式，通过持续释放系统或通过植入装置。在需要的情况中，可以通过浓注施用或通过输注连续地施用或通过植入装置施用。

替换地或另外地，可以通过植入其上已经吸收或包封所需分子的膜、海绵或另一种合适的材料来局部施用组合物。在使用植入装置的情况中，可以将该装置植入任何合适的组织或器官中，并且所需分子的递送可以经由扩散、定时释放弹丸或连续施用。

在一些情况中，可能希望以离体方式使用药物组合物。在这样的情况中，将已经从患者中取出的细胞、组织或器官暴露于药物组合物，之后将细胞、组织和/或器官随后植回患者中。

在其他情况中，可以通过植入已经使用如本文中所述的那些方法遗传工程化以表达和分泌多肽的特定细胞来递送肌抑素拮抗剂如肽体。这样的细胞可以是动物或人细胞，或可以是自体的、异源的或异种的。任选地，可以使细胞永生化。为了降低免疫反应的机会，可以将细胞包封以避免周围组织的浸润。包封材料通常是生物相容的、半渗透聚合物外壳或膜，其允许蛋白质产物的释放，但防止细胞被患者的免疫系统或被其他来自周围组织的有害因子破坏。

已经描述了本发明，作为说明提供以下实施例，但并不限于此。

实施例

实施例1：肌抑素结合肽的鉴别

使用三个丝状噬菌体文库，TN8-IX(5X10⁹个独立的转化体)、TN12-I(1.4X10⁹个独立的转化体)和线性(2.3X10⁹个独立的转化体)(DyaxCorp.)来选择肌抑素结合噬菌体。将每个文库在肌抑素-涂覆的表面上孵育并且接受不同的淘选条件：非特异性洗脱，和使用重组人激活素受体IIB/Fc嵌合体(R&DSystems，Inc.，Minneapolis，Minnesota)的特异性洗脱，或以下所述的肌抑素原肽洗脱。对于全部三个文库，对于第一轮选择，噬菌体以非特异性方式洗脱，同时将受体和原肌抑素用于第二轮和第三轮选择中。按照以下所述的进行选择程序。

肌抑素的制备

如下，在大肠杆菌K-12株2596(ATCC#202174)中重组产生肌抑素蛋白。通过按照公开的国际专利申请WO00/24782中所述的程序，将编码人原肌抑素分子的多核苷酸克隆至pAMG21表达载体(ATCCNo.98113)(其源自表达载体pCFM1656(ATCCNo.69576))和美国专利No.4,710,473中所述的表达载体系统中。编码原肌抑素的多核苷酸获自哺乳动物表达载体。使用标准PCR方法和以下PCR引物扩增编码区以引入用于NdeI和BamHI的限制性位点。

5’引物:5’-GAGAGAGAGCATATGAATGAGAACAGTGAGCAAAAAG-3’(SEQIDNO:292)

3’引物:5’-AGAGAGGGATCCATTATGAGCACCCACAGCGGTC-3’(SEQIDNO:293)

用两种酶消化PCR产物和载体，混合并连接。将连接的产物转化至大肠杆菌菌株#2596中。通过显微镜检查单个克隆的包涵体形式的重组蛋白表达。分离质粒，并通过重组基因的编码区测序以验证遗传保真度。

在37℃下使用分批方法从10L发酵产生细菌糊。在9.6OD₆₀₀的细胞密度下用HSL诱导培养物，并且在六小时后在104OD₆₀₀的密度下收获。将糊储存在-80℃下。表达原肌抑素的大肠杆菌糊在16,000psi下在微流化器中裂解，离心以分离不溶性包涵体部分。将包涵体重悬浮于含有二硫苏糖醇的盐酸胍中，并在室温下溶解。然后将其在水性缓冲液中稀释30倍。然后将重折叠的原肌抑素浓缩和缓冲液交换到20mMTrispH8.0中，并施加于阴离子交换柱。用递增的氯化钠梯度洗脱阴离子交换柱。将含有原肌抑素的级分汇合。大肠杆菌中产生的原肌抑素失去前23个氨基酸并且在残基24天冬酰胺前从甲硫氨酸开始。为了产生成熟肌抑素，在前肽和成熟肌抑素C末端之间酶促切割汇合的原肌抑素。然后使用递增梯度的含有0.1％三氟乙酸的乙腈将所得到的混合物施加于C4-rpHPLC柱。将含有成熟肌抑素的级分汇合并在真空离心蒸发浓缩器(speed-vac)中干燥。

在以下所述的基于成肌细胞C2C12的试验中测试从大肠杆菌产生的重组成熟肌抑素，并且发现与商业上在哺乳动物细胞系统中产生的重组鼠肌抑素(R&DSystems，Inc.,Minneapolis，Minnesota)比较时是完全活性的。在以下所述的噬菌体展示和筛选试验中使用大肠杆菌产生的成熟肌抑素。

肌抑素-涂覆的管的制备

在1ml0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)中以8μg肌抑素蛋白质的浓度将肌抑素固定于5mlImmuno^TM管(NUNC)上。肌抑素涂覆的Immuno^TM试管在室温下伴随环形振荡孵育1小时。肌抑素涂覆的Immuno^TM管然后通过加入5ml2％牛奶-PBS，并在室温下伴随旋转孵育1小时来封闭。然后用PBS将所得到的肌抑素涂覆的Immuno^TM管洗涤三次，接着进行选择程序。还制备了另外的Immuno^TM管用于负向选择(无肌抑素)。对于每种淘选条件，将五至十个Immuno^TM管经历以上的程序，除了用1ml2％BSA-PBS替代肌抑素蛋白涂覆Immuno^TM管。

负向选择

对于每种淘选条件，针对TN8-IX和TN12-I文库从文库储液等分约100个随机文库等价物(对于TN8-IX为5X10¹¹pfu，对于TN12-I为1.4X10¹¹pfu)，和对于线性文库，约10个随机文库等价物(2.3X10¹⁰pfu)，并用PBST(含有0.05％吐温-20的PBS)稀释至1ml。将1ml稀释的文库储液加入为负向选择制备的Immuno^TM管，并在室温下伴随环形振荡孵育10分钟。抽出噬菌体上清液并添加到第二Immuno^TM管中用于另一个负向选择步骤。这样，进行了五至十个负向选择步骤。

针对肌抑素结合的选择

在以上最后一个负向选择步骤后，将噬菌体上清液加入制备的肌抑素涂覆的Immuno^TM管中。在室温下伴随环形振荡将Immuno^TM管孵育一小时，允许特定的噬菌体结合肌抑素。丢弃上清液后，对于全部三个文库(TN8-IX、TN12-I和线性文库)的三轮选择，用2％牛奶-PBS洗涤Immuno^TM管约15次，用PBST洗涤10次并用PBS洗涤两次，而，除了对于TN8-IX和TN12-I文库的第二轮选择，Immuno^TM管用2％牛奶-PBS洗涤约14次，用2％BSA-PBS洗涤两次，用PBST洗涤10次并用PBS洗涤一次。

非特异性洗脱

最后一个洗涤步骤后，通过加入1ml100mM三乙胺溶液(Sigma，St.Louis，Missouri)，用环形振荡条件下孵育10分钟，从Immuno^TM管洗脱结合的噬菌体。然后用0.5ml的1MTris-HCl(pH7.5)中和含噬菌体溶液的pH。

结合的噬菌体的受体(人激活素受体)洗脱

对于第2轮和第3轮，最后一个洗涤步骤后，通过加入1ml的1μM受体蛋白(重组人激活素受体IIB/Fc嵌合体，R&DSystems，Inc.，Minneapolis，Minnesota)，对于每个条件孵育1小时，从Immuno^TM管洗脱结合的噬菌体。

结合的噬菌体的前肽洗脱

对于第2轮和第3轮，最后一个洗涤步骤后，通过加入1ml的1μM前肽蛋白(按照以上所述的制得)，对于每个条件孵育1小时，从Immuno^TM管洗脱结合的噬菌体。

噬菌体扩增

将新鲜大肠杆菌(XL-1BlueMRF’)培养物在含有12.5μg/ml四环素的LB培养基中生长至OD₆₀₀＝0.5。对于每种淘选条件，将20ml这种培养物在冰上冷却并离心。将细菌沉淀物重悬浮于1ml的minA盐溶液中。

将来自不同洗脱方法的每种混合物加入浓缩的细菌样品中并在37℃下孵育15分钟。将2mlNZCYM培养基(2xNZCYM，50μg/ml氨苄青霉素)加入每种混合物中，并在37℃下孵育15分钟。将所得到的4ml溶液平铺于大的含有50μg/ml氨苄青霉素的NZCYM琼脂平板上，并在37℃下孵育过夜。

将在大的NZCYM琼脂平板上生长过夜的各细菌/噬菌体混合物刮到35ml的LB培养基中，并用另外的35mlLB培养基进一步冲洗琼脂平板。将所得到的LB培养基中的细菌/噬菌体混合物离心以沉淀细菌。将50μl噬菌体上清液转移至新鲜管中，并加入12.5mlPEG溶液(20％PEG8000，3.5M醋酸铵)和在冰上孵育2小时以沉淀噬菌体。将沉淀的噬菌体离心并重悬浮于6ml的噬菌体重悬缓冲液中(250mMNaCl，100mMTrispH8，1mMEDTA)。这一噬菌体溶液通过离心掉剩余的细菌和通过加入1.5mlPEG溶液第二次沉淀噬菌体来进一步纯化。离心步骤后，将噬菌体沉淀物重悬浮于400μlPBS中。将这一溶液接受最终离心以除去剩余的细菌碎片。通过标准斑块形成试验(MolecularCloning，Maniatis等，第3版)滴定所得到的噬菌体制剂。

附加轮的选择和扩增

在第二轮中，将来自第一轮的扩增的噬菌体(10¹¹pfu)用作进行选择和扩增步骤的输入噬菌体。随后将来自第二轮的扩增的噬菌体(10¹¹pfu)用作进行第三轮的选择和扩增的输入噬菌体。第三轮的洗脱步骤后，将小部分洗脱的噬菌体如在以上的斑形成试验中涂布。挑取单个斑块，并且放入每个孔中含有100μlTE缓冲液的96孔微滴定板中。将这些主平板在4℃下孵育过夜以允许噬菌体洗脱至TE缓冲液中。

克隆分析

噬菌体ELISA

将噬菌体克隆接受噬菌体ELISA并且随后测序。按照以下讨论的将序列分级。

如下进行噬菌体ELISA。将大肠杆菌XL-1BlueMRF’培养物生长至OD₆₀₀达到0.5。将30μl这种培养物等分至96孔微滴定板的每个孔中。将10μl洗脱的噬菌体加入每个孔中，并允许细菌在室温下进行感染15min。将约120μl含有12.5μg/ml四环素和50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基加入每个孔中。然后将微滴定板在37℃下振荡孵育过夜。使肌抑素蛋白(0.1M碳酸钠缓冲液中的2μg/ml，pH9.6)涂覆在96孔Maxisorp^TM平板(NUNC)上，在4℃下过夜。作为对照，用PBS中制备的2％BSA涂覆单独的Maxisorp^TM平板。

在第二天，丢弃蛋白质涂覆的Maxisorp^TM平板中的液体，用PBS洗涤三次，并在室温下用300μl2％牛奶溶液封闭每个孔1小时。丢弃牛奶溶液，并且用PBS溶液将孔洗涤三次。最后一个洗涤步骤后，将约50μlPBST-4％牛奶加入蛋白质涂覆的Maxisorp^TM平板的每个孔中。将96孔微滴定平板中每个孔的约50μl过夜培养物转移至肌抑素涂覆平板以及对照2％BSA涂覆平板的相应孔中。将两种平板中的100μl混合物在室温下孵育1小时。丢弃Maxisorp^TM平板的液体，并且用PBST将孔洗涤约三次，接着用PBS洗涤两次。将HRP-偶联的抗-M13抗体(AmershamPharmaciaBiotech)稀释至约1:7,500，并且将100μl稀释的溶液加入Maxisorp^TM平板的每个孔中以在室温下孵育1小时。再次丢弃液体，并且用PBST洗涤孔约三次，接着用PBS洗涤两次。将100μlLumiGlo^TM化学发光底物(KPL)加入Maxisorp^TM平板的每个孔中，并孵育约5分钟使反应发生。在平板阅读器(LabSystem)上阅读Maxisorp^TM平板的化学发光单位。

噬菌体克隆的测序

对于每个噬菌体克隆，通过PCR方法来制备测序模板。使用以下寡核苷酸对来扩增500个核苷酸的片段：引物#1：5’-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3’(SEQIDNO:294)和引物#2：5’-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3’(SEQIDNO:295)。对于每个克隆，制备了以下混合物。

试剂	体积(μL)/试管
		蒸馏H2O	26.25
50％甘油	10
		10X PCR缓冲液(w/o MgCl2)	5
25mM MgCl2	4
		10mM dNTP混合物	1
100μM引物1	0.25
		100μM引物2	0.25
Taq聚合酶	0.25
		TE中的噬菌体(选择4)	3
最终反应体积	50

使用热循环仪(GeneAmpPCRSystem9700，AppliedBiosystem)来运行以下程序：[94℃持续5min；94℃持续30sec，55℃持续30sec，72℃持续45sec.]x30个循环；72℃持续7min；冷却至4℃。按照制造商的实验方案，使用QIAquickMultiwellPCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化来自每个反应的PCR产物。通过在1％琼脂糖凝胶上运行与1μl染料(10XBBXS琼脂糖凝胶加载染料)混合的10μl每种PCR反应来检查PCR清理产物。随后按照制造商推荐的实验方案，使用ABI377测序仪(PerkinElmer)将剩余的产物测序。

序列分级和分析

将从核苷酸序列翻译的肽序列与ELISA数据相关联。鉴别在肌抑素涂覆的孔中显示出高化学发光单位和在2％BSA-涂盖的孔中显示出低化学发光单位的克隆。鉴别出现多次的序列。将基于这些标准选择的候选序列作为肽体进行进一步分析。分析了大约1200个单独的克隆。其中选择了大约132个肽用于产生本发明的肽体。这些显示于以下的表I中。将具有SEQIDNO:1至129的肽用于产生相同名称的肽体。表1中显示的具有SEQIDNO:130至141的肽包括通过接头序列连接的来自SEQIDNO:1至132的两个或更多个肽。SEQIDNO:130至141也用于产生相同名称的肽体。

针对TN-8衍生的肽组测定了共有序列。这些如下：

KDXCXXWHWMCKPX(SEQIDNO:142)

WXXCXXXGFWCXNX(SEQIDNO:143)

IXGCXWWDXXCYXX(SEQIDNO:144)

XXWCVSPXWFCXXX(SEQIDNO:145)

XXXCPWFAXXCVDW(SEQIDNO:146)

对于以上所有共有序列，每个共有序列的加下划线的“核心序列”是总是在该位置出现的氨基酸。“X”是指任何天然产生的或修饰的氨基酸。核心序列中包含的两个半胱氨酸是TN8-IX文库中的固定氨基酸。

表I：肽体名称和肽序列

实施例2：产生肽体

编码肽-Fc融合蛋白的DNA的构建

能够结合肌抑素的肽单独使用或彼此结合以构建其中肽与人IgG1的Fc结构域融合的融合蛋白。每个肽体的Fc部分的氨基酸序列如下(从氨基末端至羧基末端)：

肽以N构象(肽连接Fc区的N-末端)、C构象(肽连接Fc区的C-末端)或N,C构象(肽连接Fc区的N和C末端)融合。使用单独的载体来表达N-端融合体和C-端融合体。通过将寡核苷酸对(“oligos”)与选定的噬菌体核酸退火以产生编码肽的双链核苷酸序列来构建每个肽体。这些多核苷酸分子构建为ApaL至XhoI片段。将片段连接到用于N-末端定向的pAMG21-FcN-末端载体中或连接到用于C-末端定向的pAMG21-FcC-末端载体中，其之前已经用ApaLI和XhoI消化。使用标准程序，通过电穿孔将所得到的连接混合物转化至大肠杆菌菌株2596或4167细胞(2596菌株细胞的hsdR-变体)中。筛选克隆产生重组蛋白质产物和具有含正确核苷酸序列的基因融合体的能力。针对各个修饰的肽选择单个这样的克隆。

使用称为pAMG21-2xBs-N(ZeoR)Fc的可选载体形成许多构建体。这种载体与上述载体相似，除了用BsmBI进行载体的消化。一些构建体在Fc的两端融合肽序列。在那些情况中，载体是pAMG21-2xBs-N(ZeoR)Fc和pAMG21-2xBs-C-Fc的复合体。

pAMG21的构建

通过按照公开的国际专利申请WO00/24782中所述的程序，表达质粒pAMG21(ATCCNo.98113)源自表达载体pCFM1656(ATCCNo.69576)和美国专利No.4,710,473中所述的表达载体系统，将该文献全部按引用并入本文中。

FcN-末端载体

使用pAMG21Fc_Gly5_Tpo载体作为模板构建FcN-末端载体。设计了5’PCR引物(以下)来除去pAMGTpoGly5中的Tpo肽序列并用含有ApaLI和XhoI位点的多接头替代。使用这个载体作为模板，使用以下的5’引物和通用3’引物，用ExpandLongPolymerase进行PCR：

将所得到的PCR产物凝胶纯化并用限制酶NdeI和BsrGI消化。使用Qiagen(Chatsworth，CA)凝胶纯化旋转柱将质粒和编码目标肽与其接头一起的多核苷酸进行凝胶纯化。然后使用标准连接程序连接质粒和插入片段，并将所得到的连接混合物转化至大肠杆菌细胞(株2596)中。选择单个克隆并进行了DNA测序。鉴别正确的克隆并将这用作载体源，用于本文中所述的修饰的肽。

FcC-末端载体的构建

使用pAMG21Fc_Gly5_Tpo载体作为模板构建FcC-末端载体。设计了3’PCR引物来除去Tpo肽序列并用含有ApaLI和XhoI位点的多接头替代。使用通用5’引物和3’引物，用ExpandLongPolymerase进行了PCR：

5’引物:5’-CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG-3’(SEQIDNO:299)

3’引物:5’-TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCTTTCTGTGCACCACCACCTCCACCTTTAC-3’(SEQIDNO:300)

将所得到的PCR产物凝胶纯化并用限制酶BsrGI和BamHI消化。通过Qiagen凝胶纯化旋转柱将质粒和编码具有其接头的每个目标肽的多核苷酸进行凝胶纯化。然后使用标准连接程序连接质粒和插入片段，并将所得到的连接混合物转化至大肠杆菌细胞(菌株2596)中。菌株2596(ATCC#202174)是经修饰以含有lux启动子和两个λ温敏阻遏物，cI857s7和lacI^Q阻遏物的大肠杆菌K-12菌株。选择单一克隆并进行了DNA测序。鉴别正确的克隆并用作本文中所述的每个肽体的来源。

大肠杆菌中的表达

将大肠杆菌菌株2596中的pAMG21-Fc融合构建体中每个的培养物在Terrific肉汤培养基中在37℃下生长(参见Tartof和Hobbs,“Improvedmediaforgrowingplasmidandcosmidclones”,BethesdaResearchLabsFocus,Volume9,12页,1987,上述Sambrook等中引用的参考文献)。将合成的自体诱导剂，N-(3-氧代己酰基)-DL-同型丝氨酸内酯，加入培养基中至20纳克/毫升(ng/ml)的终浓度后，实现了从luxPR启动子的基因产物表达的诱导。将培养物在37℃下再孵育六小时。然后通过显微镜检查细菌培养物的包涵体的存在并通过离心收集。在诱导的培养物中观察到了折光包涵体，表明最可能在大肠杆菌的不溶性部分中产生Fc-融合体。通过重悬浮于含有10％β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中来直接裂解细胞沉淀物，然后通过SDS-PAGE来分析。在大多数情况中，在SDS-PAGE凝胶上观察到了合适分子量的强考马斯染色的条带。

折叠和纯化肽体

通过高压均质化(15,000PSI下3轮)在水中(1/10体积/体积)破坏细胞，并且通过离心收获包涵体(J-6B中4000RPM，持续30分钟)。将包涵体以1/10比例在6M胍，50mMTris，8mMDTT，pH8.0中在环境温度下溶解包涵体。将溶解的混合物在4M脲，20％甘油，50mMTris,160mM精氨酸，3mM半胱氨酸，1mM胱胺，pH8.5中稀释25倍。将混合物中孵育过夜。然后将混合物相对10mMTrispH8.5，50mMNaCl，1.5M脲进行渗析。过夜渗析后，用醋酸将渗析物的pH调节至pH5。通过离心除去沉淀物并将上清液4℃下加载于在10mMNaAc，50mMNaCl，pH5中平衡的SP-SepharoseFastFlow柱上。加载后，用10mMNaAc，50mMNaCl，pH5.2将柱洗涤至基线。用醋酸盐缓冲液中20柱体积的50mM-500mMNaCl梯度来开发柱。或者，洗涤至基线后，用5柱体积的10mM磷酸钠pH7.0来洗涤柱，并用磷酸盐缓冲液中15柱体积的0-400mMNaCl梯度来开发柱。通过SDS-PAGE分析柱级分。将含有二聚肽体的级分汇合。还通过凝胶过滤分析级分以确定是否存在任何聚集体。

从表I的肽制得多种肽体。将肽连接到人IgG1Fc分子以形成表II中的肽体。关于表II中的肽体，C构象表明所命名的肽在Fc的C-末端连接。N构象表明所命名的肽在Fc的N-末端连接。N,C构象表明一个肽在每个Fc分子的N-末端连接和一个肽在C-末端连接。2x命名表示所命名的两个肽彼此串联并且也在Fc的N或C末端或者在N、C两端连接，通过所示的接头分隔。通过接头分隔的串联的两个肽例如表示为肌抑素-TN8-29-19-8g，这表示TN8-29肽通过(gly)₈接头连接于TN8-19肽。肽通过(gly)₅接头序列连接Fc，除非另外指出。在一些情况中，肽通过k接头连接。命名为k或1k的接头是指gsgsatggsgstassgsgsatg(SEQIDNO:301)接头序列，kc是指连接Fc的C-端的接头，而kn是指连接Fc的N-端的接头。在以下的表II中，第4栏是指将Fc连接第一个肽的接头序列，而第五栏是指构象N或C或两者。

由于Fc分子在溶液中二聚化，因此构建为具有一个肽的肽体实际上将是具有两个肽拷贝和两个Fc分子的二聚体，并且具有串联的两个肽的2X形式实际上将是具有四个肽拷贝和两个Fc分子的二聚体。

由于表II中给出的肽体是在大肠杆菌中表达，因此第一氨基酸残基是Met(M)。因此，例如，N构象的肽体是Met-肽-接头-Fc，或Met-肽-接头-肽-接头-Fc。例如，C构象的肽体排列为Met-Fc-接头-肽或Met-Fc-接头-肽-接头-肽。C,N构象的肽体是两者的组合，例如，Met-肽-接头-Fc-接头-肽。

以下表II中提供了编码示例性肽体的核苷酸序列。编码本发明的示例性肽体的多核苷酸序列包括例如如下的编码Fc多肽序列的核苷酸序列：

此外，包括例如如下的编码五个甘氨酸ggggg接头的多核苷酸：

5’-GGTGGAGGTGGTGGT-3’(SEQIDNO:302)

编码肽体的核苷酸序列还包括编码甲硫氨酸的密码子ATG和终止密码子如TAA。

因此，表II中的第一肽体的结构是具有C构象的TN8-Con1，及(gly)₅接头如下：M-Fc-GGGGG-KDKCKMWHWMCKPP(SEQIDNO:303)。编码这个肽体的示例性多核苷酸是：

5’-ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTAAGACAAATGCAAAATGTGGCACTGGATGTGCAAACCGCCG-3’(SEQIDNO:304)

表II：肽体名称、肽序列、核苷酸序列、接头和末端

实施例3：体外试验

基于C2C12细胞的肌抑素活性试验

该试验通过测量肌抑素与其受体的结合受到抑制的程度证明待测试的抑制剂的肌抑素中和能力。

通过用pMARE-luc构建体转染C2C12成肌细胞(ATCCNo:CRL-1772)产生肌抑素-应答性报告细胞系。通过克隆十二个CAGA序列的重复片段制得了pMARE-luc构建体，其表示在TATA盒上游的进入pLuc-MCS报告载体(Stratagenecat#219087)中的肌抑素/激活素应答元件(Dennler等，EMBO17:3091-3100(1998))。成肌细胞C2C12细胞天然地在其细胞表面上表达肌抑素/激活素受体。肌抑素结合细胞受体时，激活了Smad途径，并且磷酸化的Smad结合应答元件(Macias-Silva等，Cell87:1215(1996))，导致荧光素酶基因的表达。然后根据制造商的实验方案，使用商业荧光素酶报告分析试剂盒(cat#E4550，Progema，Madison，WI)测量了荧光素酶活性。根据以下的程序，将已经用pMARE-luc(C2C12/pMARE克隆#44)转染的稳定的C2C12细胞系用于测量肌抑素活性。

将等量的报告细胞(C2C12/pMARE克隆#44)涂布于96孔培养中。用固定在4nM的肌抑素浓度进行了使用两个肽体稀释的第一轮筛选。将重组的成熟肌抑素在室温下分别用40nM和400nM的肽体预先孵育2小时。在有或没有肽体的情况下，用肌抑素处理报告细胞培养物六小时。通过测定处理过的培养物中的荧光素酶活性测量肌抑素活性。将这个试验用于最初鉴别在报告体分析中抑制肌抑素信号传导活性的肽体命中物。随后，用固定在4nM的肌抑素浓度产生了九点滴定曲线。将混合物加入报告细胞培养物之前，肌抑素用以下九个肽体浓度中的每一个预孵育两小时：0.04mM、0.4nM、4nM、20nM、40nM、200nM、400nM、2uM和4uM。表III中提供了针对多个示例性肽体的IC₅₀值，针对亲和力成熟肽体的IC₅₀值显示于表VIII中。

试验

在3000(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)上进行了每个候选肌抑素肽体的亲和力分析，这是使用传感器芯片CM5和使用0.005％P20表面活性剂(Biacore，Inc.)作为运行缓冲液的装置。根据制造商建议的实验方案，使用AmineCoupling试剂盒(Biacore，Inc.)将重组的成熟肌抑素蛋白通过伯胺基团固定于研究级CM5传感器芯片(Biacore，Inc.)。

使用直接结合试验来筛选肽体，并以其结合固定的肌抑素的能力的顺序来分级。通过在3分钟内以50μl/min的流速将两个浓度(40和400nM)的每个候选肌抑素-结合肽体注射至固定的肌抑素表面来进行结合试验。3分钟的解离时间后，将表面再生。针对结合信号强度以及针对解离速率，定性地比较结合曲线。使用BIA评估3.1计算机程序(Biacore，Inc.)测定了包括k_a(结合速率常数)、k_d(解离速率常数)和K_D(解离平衡常数)的肽体结合动力学参数。解离平衡常数(以nM表示)越低，肽体对肌抑素的亲和力越高。表III和表VI针对以下亲和力成熟的肽体显示了肽体K_D值的实例。

ActRIIB/Fc表面上的阻断试验

使用试验系统，在肽体的存在和不存在的情况下使用固定的ActRIIB/Fc(R&DSystems，Minneapolis，MN)和肌抑素进行了阻断试验。将试验用于将肽体分类为非中和的(不阻止肌抑素结合ActRIIB/Fc的那些)或中和的(阻止肌抑素结合ActRIIB/Fc的那些)。首先在不存在任何肽体的情况下测定基线肌抑素-ActRIIB/Fc结合。

对于早期筛选研究，将肽体在样品缓冲液中稀释至4nM、40nM和400nM，并用4nM肌抑素(也在样品缓冲液中稀释)孵育。使肽体:配体混合物在室温下达到平衡(至少5小时)，且然后以10μl/min的流速20至30分钟内注射到固定的ActRIIB/Fc表面上。提高的结合反应(超过没有肽体的对照结合)表明结合肌抑素的肽体是非中和的。降低的结合反应(与对照相比)表明结合肌抑素的肽体阻断了肌抑素与ActRIIB/Fc的结合。使用全浓度系列的阻断试验来进一步表征选定的肽体以得出IC₅₀值(对于中和肽体)或EC₅₀(对于非中和肽体)。将肽体样品在样品缓冲液中从200nM系列稀释至0.05nM，并在室温下用4mM肌抑素孵育以达到平衡(最少五小时)，接着以10μl/min的流速在20至30分钟内注射到固定的ActRIIB/Fc表面上。样品注射后，允许结合的配体从受体解离3分钟。将结合信号vs.肽体浓度作图，计算在4nM肌抑素存在下每种肽体的IC₅₀值。例如，发现了肽体TN8-19、L2和L17在基于细胞的试验中抑制肌抑素活性，但TN-8-19的结合不阻断肌抑素/ActRIIB/Fc相互作用，表明TN-8-19结合不同于对于其他两种肽体观察到的表位。

肽体的表位分级(binning)

将纯化的肽体固定于BIAcore芯片上以捕获肌抑素，接着注射第二肽体，并且测定结合于捕获的肌抑素的第二肽体的量。仅具有不同表位的肽体将结合捕获的肌抑素，因此使得能够将具有相似或不同表位结合特性的肽体分级。例如，显示出肽体TN8-19和L23结合肌抑素上的不同表位。

选择性试验

使用技术进行这些试验以测定肽体与其他TGFβ家族成员结合的选择性。根据制造商建议的试验方案，将ActRIIB/Fc、TGFβRIIB/Fc和BMPR-1A/Fc(全部获自R&DSystems,Minneapolis,MN)共价偶联于研究级传感器芯片。因为BIAcore试验检测折射率的变化，用在固定的受体表面上的注射检测到的反应与在不存在任何肽体的情况下用在对照表面上的注射检测到的反应相比的差异分别表示激活素A、TGFβ1、TGFβ3和BMP4与受体的实际结合。使用肽体和TGFβ分子的预孵育，结合反应中的变化(提高或降低)表明肽体与分子的TGFβ家族的结合。本发明的肽体全部结合肌抑素，但不结合激活素A、TGFβ1、TGFβ3或BMP4。

KinExA^TM平衡试验

将使用KinExA^TM技术(SapidyneInstruments，Inc.)的基于溶液的平衡结合试验用于测定肌抑素结合肽体分子的解离平衡(K_D)。据认为这种基于溶液的试验在一些情况中比BIAcore试验更灵敏。用约50μg/ml肌抑素预涂覆Reacti-Gel^TM6X过夜，且然后用BSA封闭。在室温下用样品缓冲液中的各种浓度(0.5pM至5nM)的肌抑素孵育30pM和100pM的肽体样品8小时，接着通过肌抑素-涂覆的珠运行。通过superblock中1mg/ml的荧光(Cy5)标记的山羊抗人Fc抗体来定量珠结合的肽体的量。使用给定的肌抑素浓度，结合信号与平衡时游离肽体的浓度成比例。使用KinExA^TM软件(SapidyneInstruments，Inc.)中提供的双重曲线一位点均相结合模型从竞争曲线的非线性回归获得K_D。

实施例4：肌抑素抑制剂的比较

将三种示例性的第一轮肽体结合(K_D)和抑制(IC₅₀)的能力与对于可溶性受体融合蛋白actRIIB/Fc(R&DSystems,Inc.，Minneapolis,Minn.)获得的K_D和IC₅₀值进行比较。使用实施例3中所述的基于pMAREluc细胞的试验测定了IC₅₀值，并使用实施例3中所述的试验测定了K_D值。

表III：抑制剂的IC50和Kd值

抑制剂	IC50(nM)	KD(nM)
			ActRIIB/Fc	～83	～756 -->
2xTN8-19-kc	～9	～2
			TN8-19	～23	～2
TN8-29	～26	～60
			TN12-34	～30	-----
线性-20	～11	-----

肽体具有优于受体/Fc抑制剂的IC₅₀以及在两个肽体中与受体/Fc相当的结合亲和性。

实施例5：肽和肽体抑制肌抑素的能力的比较

根据以上实施例2中所述的程序，将以下肽序列：QGHCTRWPWMCPPY(TN8-19)(SEQIDNO:33)用于构建相应的肽体TN8-19(pb)。使用以上实施例3中所述的基于C2C12的试验，针对肌抑素抑制活性对单独的肽和肽体都进行了筛选。从图1可以看到，肽体的IC₅₀(肌抑素百分之五十抑制的有效浓度)显著低于肽的IC₅₀，并且因此通过将其置于肽体构型中，肽抑制肌抑素活性的能力得到实质性的提高。

实施例6：亲和力成熟的肽和肽体的产生

用于肽体产生的几个第一轮肽选择用于亲和力成熟。选定的肽包括以下的：半胱氨酸限制的TN8-19，QGHCTRWPWMCPPY(SEQIDNO:33)以及线性肽线性-2MEMLDSLFELLKDMVPISKA(SEQIDNO:104)；线性-15HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV(SEQIDNO:117)；线性-17RATLLKDFWQLVEGYGDN(SEQIDNO:119)；线性-20YREMSMLEGLLDVLERLQHY(SEQIDNO:122)，线性-21HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ(SEQIDNO:123)，线性-24EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN(SEQIDNO:126)。基于共有序列，产生了定向的二级噬菌体展示文库，其中“核心”氨基酸(从共有序列确定的)保持恒定或在出现频率中有偏倚。或者，单个肽序列可以用于产生偏倚的、定向噬菌体展示文库。在更严格条件下此类文库的淘选可以产生具有增强的肌抑素结合、选择性结合肌抑素或具有一些其他所需特性的肽。

用于文库的掺杂寡核苷酸(dopedoligos)的产生

在DNA合成仪中合成寡核苷酸，其在核心序列处91％“掺杂的”，即，每个溶液是91％的所表示的碱基(A、G、C或T)，和3％的其他3种核苷酸中的每一种。对于TN8-19家族，例如，用于二级噬菌体文库构建的91％掺杂的寡核苷酸如下：

5’-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKcaKggKcaKtgKacKcgKtgKccKtgKatKtgKccKccKtaKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3’(SEQIDNO:634)

其中“N”表示四种核苷酸A、T、C和G中的每一种相等地表示，K表示G和T相等地表示，且小写字母表示91％的所示碱基和3％每种其他碱基的混合物。将以这种方式制备的寡核苷酸家族如上所述进行PCR扩增，连接到噬菌粒载体中，例如，修饰的pCES1质粒(Dyax)，或根据上述实验方案任何可得的噬菌粒载体。产生的二级噬菌体文库全部是91％掺杂的并且具有1至6.5x10⁹个之间的独立转化体。如上所述淘选文库，但使用以下条件：

第1轮淘选：

输入噬菌体数量：10¹²-10¹³cfu的噬菌粒

选择方法：NuncImmuno管选择

负向选择：2X，各用2％BSA10min涂覆的NuncImmuno管

淘选涂覆：用1ml的0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)中的1μg肌抑素蛋白涂覆

结合时间：3小时

洗涤条件：6X2％-牛奶-PBST；6XPBST；2XPBS

洗脱条件：100mMTEA洗脱

第2轮淘选：

输入噬菌体数量：10¹¹cfu的噬菌粒

选择方法：NuncImmuno管选择

负向选择：2X，各用2％BSA30min涂覆的NuncImmuno管

淘选涂覆：用1ml0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)中的1μg肌抑素蛋白涂覆

结合时间：1小时

洗涤条件：15X2％-牛奶-PBST，1X2％-牛奶-PBST持续1hr，10X2％-BSA-PBST，1X2％-BSA-PBST持续1hr，10XPBST和3XPBS

洗脱条件：100mMTEA洗脱

第3轮淘选：

输入噬菌体数量：10¹⁰cfu的噬菌粒

选择方法：NuncImmuno管选择

负向选择：6X，各用2％BSA10min涂覆的NuncImmuno管

淘选涂覆：用1ml0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)中的1μg肌抑素蛋白涂覆

结合时间：1小时

洗涤条件：15X2％-牛奶-PBST，1X2％-牛奶-PBST持续1hr，10X2％-BSA-PBST，1X2％-BSA-PBST持续1hr，10XPBST和3XPBS

洗脱条件：100mMTEA洗脱

二级文库的淘选产生了对肌抑素具有增强结合的肽。将单个选择的克隆进行噬菌体ELISA，如上所述，并测序。

以下表IV中显示了以下亲和力成熟的TN8-19肽家族。

表IV：亲和力成熟的TN*-19肽体的肽序列

源自以上显示的亲和力成熟TN-8-19-1至Con2(排除mTN8con6序列)的共有序列为：Ca₁a₂ Wa₃ WMCPP(SEQIDNO:352)。所有这些肽包含序列WMCPP(SEQIDNO:633)。加下划线的氨基酸表示所有实施方案中存在的核心氨基酸，并且a₁、a₂和a₃选自中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸。在这种共有序列的一个实施方案中，Cb₁b₂ Wb₃ WMCPP(SEQIDNO:353)，b₁选自氨基酸T、I或R中的任何一个；b₂选自R、S、Q中的任何一个；和b₃选自P、R和Q中的任何一个。所有肽包含序列WMCPP(SEQIDNO:633)。包含SEQIDNO:352的亲和力成熟的TN8序列的更详细分析提供了下式：

c₁c₂c₃c₄c₅c₆ Cc₇c₈ Wc₉ WMCPPc₁₀c₁₁c₁₂c₁₃(SEQIDNO:354)，其中：

c₁不存在或是任何氨基酸；

c₂不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

c₃不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

c₄不存在或是任何氨基酸；

c₅不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

c₆不存在或是中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸；

c₇是中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸；

c₈是中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸；

c₉是中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸；和其中

c₁₀至c₁₃是任何氨基酸。

在以上式的一个实施方案中，b₇选自氨基酸T、I或R中的任何一个；b₈选自R、S、Q中的任何一个；和b₉选自P、R和Q中的任何一个。这提供了以下序列：

d₁d₂d₃d₄d₅d₆ Cd₇d₈ Wd₉ WMCPPd₁₀d₁₁d₁₂d₁₃(SEQIDNO:355)。

d₁不存在或是任何氨基酸；

d₂不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

d₃不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

d₄不存在或是任何氨基酸；

d₅不存在或是中性疏水性、中性极性或酸性氨基酸；

d₆不存在或是中性疏水性、中性极性或碱性氨基酸；

d₇选自氨基酸T、I或R中的任何一个；

d₈选自R、S、Q中的任何一个；

d₉选自P、R和Q中的任何一个；

和d₁₀至d₁₃选自任何氨基酸。

mTN8con6系列的共有序列是WYe₁e₂ Ye₃ G(SEQIDNO:356)，其中e₁是P、S或Y；e₂是C或Q，和e₃是G或H。

除了TN-19亲和力成熟的家族，其他亲和力成熟的肽从线性L-2、L-15、L-17、L-20、L-21和L-24第一轮肽产生。这些家族呈现于以下表V中。

表V：其他亲和力成熟的肽

然后将表IV和V中提供的亲和力成熟的肽装配成如上所述的肽体并使用体内实验进行分析。

亲和力成熟的L2肽包含f₁ EMLf ₂ SLf₃f₄ LL(SEQIDNO:455)的共有序列，其中f₁是M或I；f₂是任何氨基酸；f₃是L或F；和f₄是E、Q或D。

亲和力成熟的L15肽家族包含序列Lg₁g₂ LLg₃g₄ L(SEQIDNO:456)，其中g₁是Q、D或E，g₂是S、Q、D或E，g₃是任何氨基酸和g₄是L、W、F或Y。亲和力成熟的L17家族包含序列：h₁h₂h₃h₄h₅h₆h₇h₈h₉(SEQIDNO:457)，其中h₁是R或D；h₂是任何氨基酸；h₃是A、T、S或Q；h₄是L或M；h₅是L或S；h₆是任何氨基酸；h₇是F或E；h₈是W、F或C；和h₉是L、F、M或K。还针对以上显示的肽的mL20、mL21和mL24家族确定了共有序列。

如以上实施例2中所述的，使用在Fc的N-末端(N构型)、C末端(C构型)或N和C末端两端(N,C构型)连接于具有SEQIDNO:296的人IgG1的Fc结构域的接头，从如上所述的这些亲和力成熟的肽构建肽体。将命名的肽通过5甘氨酸(5G)、8甘氨酸或k接头序列连接于C或N末端。在2X肽体形式中，肽使用如5gly、8gly或k的接头来连接。例如，用小写的“m”来命名亲和力成熟的肽和肽体，如mTN8-19-22。本发明的肽体进一步含有两个剪接位点，其中肽剪接到噬菌粒载体中。这些剪接位点的位置是AQ-肽-LE。肽体通常包括这些另外的氨基酸(尽管它们不包括在表中所列的肽序列中)。在一些肽体中，从肽序列中除去LE氨基酸。将这些肽体命名为-LE。

以下表VI中提供了示例性肽体和编码它们的示例性多核苷酸序列。该表包括肽体序列的实例(与只有肽相反)，如2xmTN8-19-7(SEQIDNO:615)和LE序列删除的肽体(SEQIDNO:617)。作为解释，2x形式中的接头序列是指串连肽之间的接头。这些肽体序列含有Fc、接头、AQ和LE序列。除AQ/LE接头序列(如果存在)以外，伴随的核苷酸序列还编码肽序列，但不编码命名的接头。

表VI：肽体名称、肽、核苷酸序列、接头和末端

实施例7：亲和力成熟的肽体的体外筛选

根据以上列出的实验方案筛选以下的示例性肽体以获得以下的K_D和IC₅₀值。表VII显示了与亲本肽体相比的所选择亲和力成熟的肽体的K_D值的范围，如通过基于KinExA^TM溶液的试验或试验测定的。这些值证明与亲本肽体相比的亲和力成熟的肽体对肌抑素提高的结合亲和性。表VIII显示了多种亲和力成熟的肽体的IC₅₀值。这个表中给出了值的范围。

表VII：肽体K_D

肽体	KD75 -->
		TN8-19(亲本)	>1nM
2xmTN8-19(亲本)	>1nM
		1x mTN8-19-7	10pM
2x mTN8-19-7	12pM
		1x mTN8-19-21	6pM
2x mTN8-19-21	6pM
		1x mTN8-19-32	9pM
1x mTN8-19-33	21pM
		2x mTN8-19-33	3pM
1x mTN8-19-22	4pM
		1x mTN8-19-con1	20pM

表VIII：肽体IC₅₀

实施例8：示例性肽体的体内合成代谢活性

使用CD1nu/nu小鼠模型(CharlesRiverLaboratories，Massachusetts)来测定本发明肽体的体内功效，该肽体包括人Fc区(huFc)。这一模型以快速合成代谢反应应答本发明的抑制剂，这与提高的干肌肉质量和肌原纤维蛋白的增加有关，但与身体水含量的累积无关。

在一个实例中，通过以下实验证明了1x肽体mTN8-19-21体内的功效。用1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量(皮下注射)，每周两次或每周一次处理一组10只8周大的CD1nu/nu小鼠。10只8周大的CD1nu/nu小鼠的对照组每周两次接受(皮下)注射10mg/kg的huFc(媒介)。每隔一天将动物称重，并且在第0天和第13天通过NMR测定瘦体重。然后在第14天处死动物，并且测定了腓肠肌的大小。结果显示于图2和3中。图2显示了针对各种剂量的肽体在14天内小鼠的总体重与对照相比的增加。如可以从图2看到的，所有剂量显示出与对照相比的体重增加，并且到第14天全部剂量显示出高于对照的统计学显著的增加。图3显示了第0天和第13天的瘦体重的变化，如通过核磁共振(NMR)成像(EchoMRI2003，EchoMedicalSystems，Houston，Tx)测定的，以及在第14天从动物切除的腓肠肌的重量变化。

在另一个实例中，将1xmTN8-19-32肽体以每两周注射一次1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg施用于CD1nu/nu小鼠，与huFc对照(媒介)相比。与第0天相比，肽体处理的动物显示出在第13天总体重(未显示)以及瘦体重的增加，如通过NMR测量测定的。瘦体重的增加显示于图4中。

在另一个实例中，针对体内合成代谢效率，将1x亲和力成熟的肽体与2x亲和力成熟的肽体进行比较。用每周两次注射1mg/kg和3mg/kg的1xmTN8-19-7和2xmTN8-19-7处理CD1nu/nu雄性小鼠(10只动物/组)，持续35天，而对照组(10只动物)每周两次接受huFc的注射(3mg/kg)。如图5中所示，用2x肽体处理与1x肽体或对照相比获得了更高的体重增加和尸检时的瘦酮体重量。

实施例9：肌肉强度的提高

正常的年龄匹配的4个月大的雄性C57B1/6小鼠用每周注射两次，每周皮下注射5mg/kg的2xmTN8-19-33、2xmTN8-19-7和huFc载体对照组(10只动物/组)处理30天。使动物恢复而没有任何进一步的注射。在恢复期的第18天测量握力。使用1027dsm型ColumbiaInstruments计(Columbus，Ohio)测量握力。肽体处理导致了握力的显著提高，2xmTN8-19-33预处理的动物与对照处理的小鼠相比显示出14％的握力提高，而2xmTN8-19-7与对照处理的小鼠相比显示出15％的握力提高。

实施例10：药代动力学

使用没有LE序列的代表性肽体进行了体内药代动力学实验。将10mg/kg和5mg/kg剂量施用于CD1nu/nu小鼠并且测定了以下参数：Cmax(μg/ml)、曲线下面积(AUC)(μg-hr/mL)和半衰期(hr)。发现2x形式的亲和力成熟的肽体具有显著长于1x形式的半衰期。例如，1x亲和力成熟的mTN8-19-22在动物中具有约50.2小时的半衰期，而2xmTN8-19-22具有约85.2小时的半衰期。亲和力成熟的1xmTN8-7具有约65小时的半衰期，而2xmTN8-19-7具有约106小时的半衰期。

实施例11：mdx小鼠的治疗

本发明的肽体已经显示出在动物中提高瘦肌肉质量，并且可用于涉及肌肉萎缩的多种失调的治疗。肌营养不良是这些失调之一。用于Duchenne’s肌营养不良的小鼠模型是Duchennemdx小鼠(JacksonLaboratories，BarHarbor，Maine)。年老的(10个月大)mdx小鼠注射肽体1xmTN8-19-33(n＝8只/组)或媒介huFc蛋白(N＝6只/组)，持续三个月的时间。给药时间表是每隔一天，皮下注射10mg/kg。肽体治疗对提高和维持年老mdx小鼠的体重具有积极作用。如图6A中所示，与hu-Fc处理的对照组相比，在肽体处理组中观察到显著的体重增加。此外，NMR分析揭示了与对照组相比，作为肽体处理的结果，年老mdx小鼠的瘦体重-脂肪质量比也显著提高，并且如图6B中所示，与对照组相比，肽体处理的小鼠中体重的脂肪百分比降低。

实施例12：CIA关节炎小鼠模型的处理

胶原蛋白诱导的关节炎小鼠模型被广泛用作用于类风湿性关节炎的模型。在实验的第1天和第21天，用100μg牛胶原蛋白II(Chrondex，Redmond，WA)在尾巴基部免疫8周大的DBA/1J小鼠(JacksonLabs，BarHarbor，Maine)以诱导关节炎。通过关节和爪发红和/或肿胀对小鼠的关节炎状况评分，并且以此为基础选择动物。建立了三组动物：未接受胶原蛋白的正常动物(正常，12只动物)、接受胶原蛋白加鼠Fc媒介的动物(CIA/媒介，6只动物)和接受胶原蛋白加连接于鼠Fc的肽体2xmTN8-19-21(2xmTN8-19-21/muFc，也称为2x-21)的动物(CIA/肽体，8只动物)。这些实验和以下实施例中使用的鼠Fc是来自鼠IgG的Fc。CIA/媒介动物和CIA/肽体动物在第1天和第21天接受胶原蛋白外，从第8天开始并持续至第50天，每周两次皮下注射(s.c.)5mg/kg的肌抑素肽体2xmTN8-19-21/muFc或单独的鼠Fc媒介。动物每四天称重。结果显示于图7中。图7显示了与体重减轻的CIA/载体动物相比，CIA/肽体(2x21)动物的体重增加，表明包括本文中所述肽体的肌抑素拮抗剂可以抵抗对照动物中呈现的类风湿性恶病质。

实施例13：睾丸切除的(Orchietomized)小鼠的处理

以下实施例描述了用示例性肽体处理睾丸切除C57B1/6小鼠。用鼠Fc或用肽体2xmTN8-19-21/muFc(每组11只动物)处理两组年龄和重量匹配的六个月大的外科手术睾丸切除的C57B1/6小鼠(CharlesRiverLaboratories，Wilmington，MA)。将两组小鼠每周IP注射3mg/kg肽体或鼠FcIP2x。处理在外科手术后3周开始并持续10周。对每只活的动物进行核磁共振(NMR)成像以评价研究开始时、7周和10周时的瘦体重。如在下表中可以看到的，用鼠Fc处理的睾丸切除小鼠到第10周时开始失去瘦体重。接受肽体的睾丸切除组与Fc媒介相比表明与用鼠Fc处理的动物相比，肽体提高了睾丸切除动物中的瘦体重量增加。这一结果显示于下表中。

表VIII：睾丸切除小鼠处理后的瘦体重

此外，用抗-肌抑素肽体处理睾丸切除小鼠没有导致睾酮水平的提高。这些结果表明肌抑素拮抗剂如本文中所述的肽体可以用于治疗雄激素剥夺状态。

实施例14：TNF-α水平的降低

在LPS激发前一天，用PBS对照或10mg/kg的肽体2xmTN8-19-21/muFc预处理雌性BLAB/c小鼠，8-10周大(CharlesRiverLaboratories，Wilmington，MA)。每组存在5只动物。在第1天，静脉内施用0.5mg/kg的LPS(来自大肠杆菌055的脂多糖，B5(Sigma))(10ug/小鼠)。LPS施用后30分钟收集血清样品。测量了mTNF-α(肿瘤坏死因子α)水平。结果表明了用肽体预处理的动物在其血液中具有降低水平的mTNF-α。PBS处理的动物在其血液中平均大约为380pg/ml的mTNF-α。肽体处理的动物在其血液中平均大约仅120pg/ml的mTNF-α。这证明了肌抑素拮抗剂可以降低至少一种造成炎症的细胞因子，导致该拮抗剂在治疗类风湿性关节炎和其他免疫失调中的有效性。

实施例15：STZ-诱导的糖尿病模型

以下实验的目的是测定肌抑素拮抗剂在链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病动物模型中的作用。此外，实验设计为测定肌抑素拮抗剂是否将延迟或防止糖尿病性肾病的进展或发展。使用的肽体是连接鼠Fc的2xmTN8-19-21(2xmTN8-19-21/muFc或2x-21)。对照媒介是单独的鼠Fc。

链脲霉素诱导的糖尿病：

通过多次低剂量链脲霉素注射形成了糖尿病动物模型。八周大的C57B1/6小鼠购自CharlesRiverLaboratory。所有动物在单独的笼中圈养一周。测量了动物体重，然后随机分成2组(n＝20/组)。20只小鼠注射40mg/kg的低剂量链脲霉素(STZ，SigmaCo.)(溶解于0.1ml的柠檬酸盐缓冲液中)，连续5天。另一组20只小鼠注射媒介(0.1ml柠檬酸盐缓冲液)，连续5天。使用葡萄糖氧化酶方法(GlucometerElite，BayerCorp.，Elkhart，IN)测量了血糖水平。通过血糖水平的测量限定了糖尿病的诱导。高于11mmol/L或200mg/dl的血糖水平被认为是高血糖。然后将糖尿病小鼠和年龄匹配的正常小鼠再饲养四个月。每月测量体重、食物摄入量和血糖水平。STZ注射后四个月，20只小鼠中的16只产生了糖尿病，且将这些用于之后的研究中。根据其体重将糖尿病小鼠分成两个处理组。年龄匹配的正常小鼠也分成了两个处理组。

实验设计：

在第0天开始，给两个糖尿病组皮下注射5mg/kg的媒介(mu-Fc)或2xmTN8-19-21，每周3次，持续6周。每周3次测量体重和食物摄入量。使用相同剂量和相同时间表用媒介(muFc)处理未注射STZ的非糖尿病小鼠，持续6周。在第0天、第15天、第30天和研究结束时，使用葡萄糖氧化酶方法测量血糖水平。

表IX：研究设计

为了评价用2xmTN8-19-21/muFc处理的糖尿病和年龄匹配的正常小鼠中瘦体重和脂肪量的变化，在开始时(第0天)、2周(第15天)、4周(第30天)和研究结束时(第45天)使用BrukerMinispecNMR(EchoMedicalSystems,Houston,TX)测量了身体组成。

在研究结束时(第45天)，将小鼠留置在单个代谢笼中24小时用于尿液收集。通过测重测量了24-h尿液体积，并且使用鼠微白蛋白-尿分析试剂盒(AlphaDiagnostic，SanAntonio，TX)，使用酶联免疫吸附试验测定了尿白蛋白浓度。

通过计算肌酐清除率评价了肾功能。使用自动分析仪Hitachi717ClinicalChemistryAuto分析仪(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)，通过酶方法(CRE，Mizuhomedy，Saga，Japan)测量了血浆和尿肌酐水平。通过使用自动分析仪测量了血尿素氮水平。

在研究完成时(第46天)处死所有动物。将小鼠在CO₂室中安乐死，并且收集心血样品，并进行了整个身体组织解剖。将血清样品储存在-80℃下用于生化分析。测量了血糖、血尿素氮(BUN)、肌酐水平的血清水平。在安乐死后立即取出腓肠肌和瘦酮体物质并称重。用异戊烷N₂溶液固定右肾的半中间部分，并且包埋于石蜡中。用H&E和PSA(高碘酸-Schiff)将切片染色用于分析肾小球结构。

将结果表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。进行非配对t-检验以确定组之间的统计学差异。p值小于0.05时，认为是统计学显著的。

结果：STZ诱导糖尿病小鼠中的体重和血糖变化

基于C57B1/6小鼠的体重和血糖的多次低剂量STZ注射导致STZ处理的小鼠具有明显高于年龄匹配的正常小鼠组的血糖水平，20只动物的平均在平均约120mg/dl的20只动物的平均血糖的正常水平开始，STZ注射后第2周时提高至平均约250-280mg/dl，并且在注射后8-18周高达350mg/dl。在开始抗-肌抑素肽体处理前的整个4个月期间，在STZ处理和对照组之间发现了体重变化的统计学显著差异。对照组稳定地增加体重，在20周内平均体重增加高达40％(20周后平均25g增加至34或35克)，而STZ组在20周期间增加很少重量，在20周内仅增加约12至14％(20周后从25g至约28或29g)。

在STZ糖尿病小鼠和年龄匹配的正常小鼠中用2xmTN-8-19-12/muFc和媒介的六周处理。持续6周的处理导致与媒介处理的糖尿病组相比，2x-21处理的STZ糖尿病小鼠中显著提高的体重增加。与接受媒介的小鼠相比，接受2x-21的STZ处理的小鼠总体重另外增加达约1.5克。与各自的第0天基线值比较，用2xmTN-8-19-12/muFc或媒介处理6周后，Δ体重作为体重净变化呈现。这显示于图8中。2x-21的6周处理显著减弱了糖尿病动物中的体重减轻。

用2x-21处理的STZ糖尿病和年龄匹配的正常小鼠的身体组成变化

与其第0天基线值相比，2x-21或媒介的6周处理后，将瘦体重呈现为瘦体重的净变化。这些值呈现于下表中。与媒介处理的对照小鼠(0.94±1.94g和1.60±1.28g)相比，2x-21处理显著提高了(p<0.05)STZ糖尿病小鼠和年龄匹配的正常小鼠中的瘦体重的净增加(6.16±0.81g和8.56±0.75g)。脂肪量的％变化表示与每个组中的第0天基线值相比，2x-21或媒介处理6周后的净变化(参见以下第二表)。STZ糖尿病小鼠中％脂肪量增加在2x-21处理组(-15.60±7.01)和媒介处理组(-21.59±6.84)之间没有显著差异。2x-21处理降低了年龄匹配的正常小鼠中的净脂肪量增加(-1.53±3.42vs7.13±3.38)，但没有达到统计学显著的量。

表X：2X-21对STZ诱导糖尿病小鼠和年龄匹配的正常小鼠的瘦体重的作用(NMR测量)

瘦体重

表XI.2X-21对STZ诱导糖尿病小鼠和年龄匹配的正常小鼠的体脂量的作用(NMR测量)

用2x-21处理的STZ糖尿病和年龄匹配的正常小鼠中的血糖变化

下表显示了2xmTN8-19-21/muFc对STZ糖尿病和年龄匹配的正常小鼠中的血糖变化的作用。在STZ糖尿病小鼠或年龄匹配的正常小鼠中，2x-21处理的和媒介处理的组之间血糖水平没有显著差异。

表XII.2X-21对STZ诱导糖尿病小鼠和年龄匹配的正常小鼠中的血糖水平的作用

肾重/体重：

STZ糖尿病小鼠中的高血糖似乎与肾肥大相关。STZ糖尿病小鼠的肾重与体重比高于年龄匹配的正常小鼠(0.98±0.04vs.0.67±0.02)。2x-21处理6周将肾/体重比从0.98±0.04显著降至媒介处理的糖尿病小鼠中的0.84±0.04的值(p<0.05)。

肌酐清除率

与非糖尿病正常对照小鼠相比，糖尿病小鼠存在提高肌酐清除率的趋势(图9)。糖尿病小鼠的平均肌酐清除率比年龄匹配的正常小鼠高两倍多。与媒介处理的糖尿病小鼠相比，2x-21处理降低了糖尿病小鼠中的肌酐清除率，如图9中所示，表明了肾功能。

24-小时尿量和尿白蛋白排泄：

尿白蛋白排泄和24-小时尿量在糖尿病性肾病早期过程中确定肾损伤方面是非常重要的生物标志物。结果证明与年龄匹配的正常小鼠相比，尿白蛋白排泄(图10A)和24小时尿量在STZ糖尿病小鼠中增加。2x-21处理降低了糖尿病小鼠中的尿白蛋白水平，并且也降低了24小时尿量(图10B)。这证明了肾功能的正常化。

肌抑素肽体2xmTNF8-19-21/muFc的施用显著减弱了STZ诱导糖尿病小鼠中的体重减轻并且保持了骨骼肌质量和瘦体重。除了骨骼肌和瘦体重的提高，2xmTNF8-19-21/muFc减轻了STZ诱导糖尿病小鼠中的肾肥大，肌酐清除率提高，以及降低了24小时尿量和尿白蛋白排泄。这表明糖尿病性肾病发展早期中提高的肾功能。

实施例16：5-氟尿嘧啶化疗诱导恶病质的鼠模型中肌抑素拮抗剂的作用

化合物5-氟尿嘧啶(5-Fu)通常在结直肠、乳腺、胃或胰腺癌患者中用作化疗剂。5-Fu治疗的副作用是体重减轻和肌肉萎缩。研究了抗-肌抑素拮抗剂治疗在治疗5-Fu诱导的恶病质中的潜在治疗益处。使用的肽体是2xmTNF8-19-21/muFc(也称为2x-21)或连接鼠Fc的2xmTNF8-19-21。对照媒介是单独的鼠Fc。

在这个研究中，将正常雄性C57Bl/6小鼠分成4组(n＝24)并连续5天(第0天至第4天)接受腹膜内(IP)施用的5-Fu(45至50mg/kg)或媒介磷酸盐缓冲溶液(PBS)。用2x21预处理两组，10mg/kg，每周两次，在5-Fu治疗开始(第0天)前2周(第-13天)或1周(第-6天)开始，并在5-Fu治疗后持续至第24天研究结束。在5-Fu治疗前后，每周两次或更频繁地监测体重、瘦体重和食物摄入量。在为了终止研究最后一次给药后0、2、24、96、168、336小时时收集血清。

在第0天和5-FU治疗之前，用2x21预处理1或2周的组的平均体重增加分别为12.6％和13.9％，与5-Fu对照组的6.4％相比(两者p<0.0001)。这与用肽体预处理1或2周的组中14.7％和16.2％的瘦体重增加平行，与仅5-Fu组中的7.4％增加相比(p＝0.001和p<0.0001)。在5-Fu给药后第6天，1或2周2x21预处理组的体重变化为-1.9％和-1.4％，与仅5-Fu组中的-8.6％相比(两者p值<0.0001)；瘦体重变成-1.3％和-0.9％，与仅5-Fu组中的-8.8％相比(两者p值<0.0001)。在恢复过程的第8天，1或2周2x21预处理组的体重变化分别显著提高至6.8％和8.5％，与仅5-Fu组中的0.6％增加相比(p＝0.0006和p<0.0001)。相似地，1或2周2x21预处理组中瘦体重变成4.9％和6.0％，与仅5-Fu组中的-3.3％相比(分别p＝0.001和p<0.0001)。结果总结于图11中。

从第8天至第24天，几乎全部小鼠产生了重度嗜中性白血球减少症，并且一些小鼠由于严重的副作用而死亡。在5-Fu施用前用2x21预处理1或2周的组的存活率为46％，与仅5-Fu组中的13％存活率相比(分别p＝0.001和p＝0.009)。存活结果总结于图12中。

使用ANOVA重复测量方法的统计学分析表明了在5-Fu处理前用2x21肽体预处理1或2周的组与仅5-Fu处理的组相比，在从第-13天至第8天的整个研究过程中具有显著更高的体重和瘦体重(两者p值都小于0.0001)。

来自这个研究的结果证明了用10mg/kg的抗-肌抑素肽体2x21每周两次预处理1或2周在显著缓解C57Bl/6小鼠中5-Fu诱导的体重减轻和肌肉萎缩中是有效的。此外，肽体预处理提高了存活率和应答5-Fu化疗的持续时间。因此，肌抑素拮抗剂如本发明的肌抑素结合剂可以在用化疗剂或其他化学剂治疗之前和期间使用来防止或缓解化学恶病质。

实施例17：接受雄激素剥夺治疗的前列腺癌人类患者中肌抑素药理抑制后的瘦体重和下肢肌肉尺寸增加

为了研究肌抑素抑制在人体中的潜能，在经历ADT的前列腺癌患者中用AMG745进行了研究。研究的目标包括AMG745的安全性、耐受性、药代动力学(PK)和药效学(PD)评价。

材料和方法

一般研究设计

这是在接受ADT的前列腺癌男性中的多中心、随机化、双盲、安慰剂对照、递增多剂量研究。试验设计为评价AMG745的安全性、耐受性、PK和药效学。

AMG745

AMG745是新的抗-肌抑素肽体。肽体表示组分肽(“pepti-”)和类似抗体的整体结构中免疫球蛋白的Fc部分(“-body”)。在这种形式中，肽“弹头”与肌抑素相互作用并且通过其受体抑制信号传导。第二结构域，Fc组分，在身体中稳定复合物，允许内皮细胞转胞吞作用(trancytosis)和通过FcRn1再循环，并将停留时间延长至治疗有用的范围。来自该研究的数据表明肌抑素的抑制可以诱导靶标组织中相关的生理作用。

AMG745由2条相同多肽链组成，其通过二硫键共价连接。每条链的N-端部分由人IgG1Fc序列组成，其在C-端通过甘氨酸(五个甘氨酸加AQ)接头融合抗-肌抑素肽。每条多肽链由255个氨基酸组成，从氨基酸甲硫氨酸开始并以谷氨酸结束。在每条多肽链上的残基Cys⁴²-Cys¹⁰²、Cys¹⁴⁸-Cys²⁰⁶和Cys²⁴²-Cys²⁴⁹之间存在三个链内二硫键连接，和在Cys⁷ _链1-Cys⁷ _链2和Cys¹⁰ _链1-Cys¹⁰ _链2之间存在2个链间二硫键连接。构成AMG745分子的510个氨基酸产生了57,099道尔顿的理论分子量。作为通过微生物表达的蛋白质，AMG745没有糖基化。

以下显示了AMG745的每条多肽链的255个残基氨基酸序列(SEQIDNO:635)。序列的标准字体部分表示IgG1Fc序列(SEQIDNO:296)。粗体字体部分表示五个甘氨酸加AQ接头序列(SEQIDNO:636)。序列的粗斜体部分表示抗-肌抑素肽(SEQIDNO:311)。

表达和制备

如本文中所述的，AMG745通过大肠杆菌的发酵作为不溶性包涵体来表达。发酵通常进行诱导后12至16小时，接着用盘栈式离心机收获细胞。用高压均质化分裂细胞分离了包涵体。洗涤和离心后，将所得到的双重洗涤的包涵体浆(DWIB)存储在-30±10℃直至纯化。

DWIB溶解后，AMG745在含有脲、甘油、精氨酸和氧化还原对半胱氨酸/胱胺的溶液中重折叠。重折叠后，将产物浓缩并通过超滤和透析(UF/DF)处理除去重折叠试剂。将透析的产物酸化，接着澄清。随后将产物通过3个不同的色谱步骤纯化：2个阴离子交换(QSepharoseFastFlow)柱，一个以流通模式运行和一个以结合和洗脱模式运行，以及HIC(ButylSepharoseFastFlow)柱。然后将产物进一步浓缩并使用UF/DF处理透析至配制缓冲液中。然后将配制的产物通过0.2μm滤器过滤至散装容器中并在-30±10℃下冷冻。

对于临床药物物质处理，对纯化方法增加另外的色谱步骤以除去宿主细胞相关的杂质。

制剂

30mg/mL的AMG745的最终剂量配方为10mM醋酸钠，9％(w/v)蔗糖，0.004％(w/v)聚山梨酸酯20，pH4.75。

剂量和受试者

0.3mg/kg、1.0mg/kg和3.0mg/kg的皮下剂量各自一周一次施用，持续4周，并且在顺序群体中评价。在0.3mg/kg剂量群组和1.0mg/kg剂量群组中登记了八名受试者，其以3:1分配比随机分配到AMG745或安慰剂组。为了评价4个每周剂量的安全性、耐受性、PK和对瘦体重的作用，在3.0mg/kg剂量群组中登记了总共三十八名受试者，其以1:1分配比随机分配到AMG745或安慰剂组。

在前述群组中登记的最后一名受试者已经在接受第三剂研究产物后跟踪至少14天后，并且基于所有可得不良事件、生命指征和实验室数据的盲法评估进行剂量递增决定。

该研究通过当地伦理审查委员会(InstitutionalReviewBoard)的批准，并且根据FDA和ICH良好临床实践指导进行。在研究启动之前，所有受试者提供了书面知情同意书。

研究受试者

合格受试者是具有确认的前列腺癌病史的男性；在入组时没有确认的远处转移；在入组前接受ADT(雄激素剥夺治疗)作为前列腺癌主要、辅助或挽救治疗至少6个月；如果ADT间歇施用，在筛选时血清总睾酮水平<50ng/dL；如通过研究者测定的稳定的前列腺特异性抗原(PSA)；无原发性肌肉疾病、肌病或神经病的病史；体重≤137kg(300lbs)和身高≤78英寸；筛选时东部肿瘤协作组(ECOG)性能状态为0；无临床明显升高的肌氨酸磷酸激酶(CPK)；肾小球过滤率(GFR)>40mL/min；天冬氨酸转氨酶(AST)或丙氨酸转氨酶(ALT)<2.5x正常上限。

研究程序

对于所有群组在研究前和研究过程中周期性地进行以下程序：身体检查，生命指征、心电图、血液学、化学、尿分析、抗-AMG745抗体筛选和用于PK的抽血。对于3mg/kg群组，在给药前和研究第29天(研究结束)以及一个月随访时进行了DXA和下肢CT扫描。所有DXA扫描在HologicorGELunar扫描仪上进行。将相同的扫描仪用于单个受试者的所有访问。将所有DXA扫描发送至中心阅读机构用于审查和分析。

使用膝部延伸仪，基于一次重复(1-RM)提升的最大重量评价下肢强度。在之前2周内和/或直至第2天、第29天和1个月随访时进行了这种评价。

在之前2周内和/或直至第1天、第29天和1个月随访时进行了短身体性能测验组(ShortPhysicalPerformanceBattery)(SPPB)。SPPB包括站立平衡、定时行走测试和五次坐站重复。

在所有研究访问时记录不良事件和伴随用药。

统计学分析

在0.3mg/kg剂量群组和1.0mg/kg剂量群组中登记了八名受试者，以3:1分配比随机分配到AMG745或安慰剂组，来鉴定多剂量施用后的安全性和PK。为了表征安全性/PK且另外地研究AMG745对整个身体组成的作用，计划在3.0mg/kg剂量群组中登记38名受试者，以1:1分配比随机分配到AMG745或安慰剂组。这个计划的登记假设从基线至第5周的瘦体重百分变化(2.1的标准偏差；Smith等，2001)治疗组之间1.5％差异的次级终点，并以10％显著性水平对于1-侧检验提供了80％的能力。使用方差分析(ANOVA)来比较治疗组之间(3mg/kgAMG745vs.安慰剂)从基线的百分变化。

药物动力学分析包括可以对其评估药代动力学参数的所有治疗的受试者。使用非房室法估算了药代动力学参数。针对每个药代动力学参数产生了按剂量群组的概括统计量。制备了单个受试者的血清AMG745浓度-时间分布和每个剂量的平均值的图。

对于安全性分析，包括接受了AMG745或安慰剂的所有受试者，并且将来自所有群组的安慰剂治疗的受试者合并以形成复合安慰剂组。

结果

总共54名受试者接受了研究产物(31名接受AMG745，23名接受安慰剂)，并且这些受试者全部完成了研究。接受了研究产物的54名受试者中五十三名接受了全部4个计划的剂量。由于腹部红斑的不良事件，一名受试者(AMG7453-mg/kg)在第二个剂量后被研究者中断；这名受试者保留在研究中并且完成了研究随访评估。研究群体的人口统计学和基线特征总结于表1中。

大部分受试者(87％)是白人/高加索人。接受AMG745的受试者的平均(SD)年龄为73.1(6.8)岁，和接受安慰剂的受试者的平均(SD)年龄为73.5(6.7)岁。与肿瘤负荷和治疗相关的基线身高、体重、身体质量指数(BMI)和基线特征总结于表2中。所有这些基线特征通常在接受AMG745的受试者和接受安慰剂的受试者之间良好平衡。

药代动力学结果

在0.3至3mg/kg的剂量范围中，4次每周SC剂量给药后，AMG745呈现出剂量-线性药物动力学。第一剂后中值t_max范围大约为24至72小时，第四剂后大约为24至48小时；第四剂后估算的平均表观血清清除(CL/F)范围为1.89至2.29mL/hr/kg(表2)。

抗-AMG745抗体结果

对于完成了研究的54名受试者，针对抗-AMG745(完整分子)结合抗体，通过基于表面等离子共振的生物传感器免疫试验分析了血清样品。来自2名受试者的样品在1或多个免疫试验中给出了阳性结果：

接受了AMG745的受试者中抗-AMG745(完整分子)结合抗体的出现率为1/31(3％)。抗-AMG745抗体阳性在这些受试者中没有显示出影响AMG745暴露。

中和抗体由于生物试验的技术问题而不能评价。

药效学结果

药效学作用的分析限于3-mg/kg剂量群组，并且研究设计为具有检测瘦体重百分变化的治疗组间的统计学显著性的80％能力。

瘦体重

对于AMG745受试者，瘦体重从基线至EOS(第29天)的百分变化(最小二乘平均数[SE])为1.5％(0.5％)，和对于安慰剂受试者为-0.7％(0.5％)，而组间差异为2.2％(0.8％)，其是统计学显著的(p＝0.008)。在第29天后1个月的随访时保持这种效应：对于AMG745受试者，瘦体重的百分变化是1.9％(0.5％)，和对于安慰剂受试者，为0.2％(0.5％)，1.7％(0.7％)的组间差异是统计学显著的(p＝0.023)(表3；图13)。

右腿加左腿瘦体重从基线至EOS(第29天)的百分变化(最小二乘平均数[SE])对于AMG745受试者是阳性的(1.3％[0.9％])，而对于安慰剂受试者是阴性的(-1.0％[0.9％])，且差异(最小二乘平均数[SE])为2.3％[1.3％])(p＝0.084)。在随访时(第29天后1个月)，右腿加左腿瘦体重从基线至随访时的百分变化(最小二乘平均数[SE])对于AMG745受试者是阳性的(1.6％[0.8％])，而对于安慰剂受试者是阴性的(-0.6％[0.8％])，并且差异(最小二乘平均数[SE])为2.1％[1.1％])(p＝0.065)(表3)。

脂肪体重的百分变化

对于AMG745受试者，脂肪体重从基线至EOS(第29天)的百分变化为-0.7％(0.2％)，和对于安慰剂受试者为0.3％(0.2％)，并且组间差异为-1.0％(0.3％)，其是统计学显著的(p＝0.005)。对于AMG745受试者，脂肪体重从基线至随访(第29天后1个月)的百分变化为-0.8％(0.3％)，而对于安慰剂受试者为0.0％(0.3％)，并且组间的差异为-0.7％[0.4％])(p＝0.068)(表3)。

下肢肌肉大小

对于AMG745受试者，下肢肌肉大小从基线至EOS(第29天)的百分变化为1.2％(0.7％)，和对于安慰剂受试者为-0.7％(0.7％)，并且组间差异为1.8％(1.0％)(p＝0.065)。对于AMG745受试者，下肢肌肉大小从基线至随访(第29天后1个月)的百分变化为2.7％(0.7％)，而对于安慰剂受试者为-0.1％(0.7％)，并且组间2.8％(1.0％)的差异是统计学显著的(p＝0.007)(表3)。

体重和身体质量指数

与观察到的瘦体重增加和伴随的脂肪量降低一致，对体重或BMI没有总体影响。

身体功能(SPPB)和下肢强度(1-RM膝延伸)

对于SPPB或1-RM膝延伸，没有进行从基线的变化的统计分析，但通常，AMG745相关的作用在四个剂量的这种短期研究中不明显。

生化参数

关于禁食血糖、胰岛素、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白或甘油三酯，治疗组(AMG745vs.安慰剂)之间不存在明显差异。

安全性

对接受了任何剂量的AMG745的31名受试者(81％)中的25名和接受了安慰剂的23名受试者中的12名(52％)报告了不良事件(表4)。在受试者不良事件发生率和AMG745的剂量之间没有明显关系。

对于2名受试者报告了超过四个不良事件：腹泻(AMG745，4/31＝13％；安慰剂，2/23＝9％)；疲劳(AMG745，4/31＝13％；安慰剂，1/23＝4％)；青肿(全部是AMG745[3/31＝10％])；和注射部位瘀伤(AMG745，2/31＝6％；安慰剂，1/23＝4％)。

所有不良事件报告为轻度或中度的严重程度且是不严重的，除了1例严重的晕厥不良事件(3-mg/kg剂量群组中接受AMG745并且先前具有晕厥发作史的受试者)，研究者认为其与治疗不相关。在最后一剂后2周内出现所述事件。

对于接受了任何剂量的AMG745的31名受试者中的7名(23％)和接受了安慰剂的23名受试者中的1名(4％)报告了治疗相关的不良事件。没有治疗相关不良事件对于超过1名受试者报告。

对于3-mg/kg剂量群组中接受了AMG745的1名受试者，由于腹部红斑的不良事件，第二剂后中断研究产品施用，该不良事件报告为中等严重程度(CTCAEv3.02级)降至轻度(CTCAEv3.01级)，并与研究产品相关。

概括而言，AMG对实验室变量、ECG、生命指征、睾酮水平或前列腺特异性抗原水平的临床重要作用不明显。作为接受AMG475(0.3mg/kg)的1名受试者的不良事件，报告了略微升高的肝功能测试值(最高的天冬氨酸转氨酶[AST]，丙氨酸转氨酶[ALT]和碱性磷酸酶[AP]分别是正常上限(ULN)的2.2、1.7和1.5倍)，并且与以上所述的严重的昏厥不良事件相关，报告了心电图变化的不良事件(中等严重程度[CTCAEv3.0等级2])。不良事件的总结显示于表5中。

接受ADT的前列腺癌男性中的这一随机化、双盲、安慰剂对照、多剂量研究证明了作为4个每周SC剂量施用的AMG745，高达3.0mg/kg，通常是良好耐受的。该结果还提供了药理学抑制肌抑素的药效学作用的首个临床证据：提高的瘦体重、降低的脂肪量和增大的下肢肌肉大小。

这个研究中用ADT治疗患有前列腺癌男性中获得的数据证明用AMG745药理上抑制肌抑素提高了瘦体重并降低了脂肪量，甚至在29天的短治疗时间后。

表1.基线人口统计学资料

表1.基线特征(续表)

表1.基线特征(续表)

表2.每周一次SC施用0.3、1或3mg/kgAMG745于接受雄激素剥夺治疗的前列腺癌男性后的平均(SD)药代动力学参数

表3.瘦体重、整体脂肪和下肢肌肉大小从基线的百分变化

表4.对于强度评估和功能测试的基线、随访和从基线的变化的总结

表5.不良事件的总结

本发明的范围不受本文中描述的特定实施方案(所述特定实施方案打算作为本发明单个方面的单一说明)及功能上等价的方法和组分的限制。实际上，除了本文中显示和描述的那些，本发明的各种改变从之前的描述和附图将对本领域技术人员变得显而易见。这样的改变意图落入所附权利要求的范围内。

Claims (20)

1.一种在需要的人类受试者中治疗或调节恶病质和/或提高瘦体重和/或降低脂肪量和/或增大下肢肌肉大小的方法，包括施用与药物学上可接受的载体混合的治疗有效量的肌抑素拮抗剂于所述受试者，其中

所述人类受试者患有前列腺癌并且正接受雄激素剥夺治疗；

所述肌抑素拮抗剂由肽体组成，所述肽体包括至少一个由SEQIDNO:635(MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGAQLADHGQCIRWPWMCPPEGWE)的氨基酸序列组成的多肽；

所述肌抑素拮抗剂在10mM醋酸钠，9％(w/v)蔗糖，0.004％(w/v)聚山梨酸酯20，pH4.75中配制；和

所述肌抑素拮抗剂以0.3mg/kg、1.0mg/kg或3.0mg/kg的剂量皮下施用，每周一次，持续4周。

2.一种在需要的人类受试者中治疗或调节恶病质和/或提高瘦体重和/或降低脂肪量和/或增大下肢肌肉大小的方法，包括施用与药物学上可接受的载体混合的治疗有效量的肌抑素拮抗剂于所述受试者，其中所述人类受试者患有前列腺癌并且正接受雄激素剥夺治疗，并且所述肌抑素拮抗剂包括由SEQIDNO:311(LADHGQCIRWPWMCPPEGWE)中所示的氨基酸序列组成的多肽。

3.权利要求2的方法，其中所述肌抑素拮抗剂由肽体组成，所述肽体包括至少一个由SEQIDNO:635(MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGAQLADHGQCIRWPWMCPPEGWE)中所示氨基酸序列组成的多肽。

4.权利要求2的方法，其中所述肌抑素拮抗剂由肽体组成，所述肽体包括至少一个由与SEQIDNO:635中所示氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成的多肽。

5.权利要求2的方法，其中所述肌抑素拮抗剂是在大肠杆菌中的不溶性包涵体中表达的肽体，并且通过细胞收集、细胞裂解、包涵体的溶解、重折叠、浓缩和色谱纯化来分离。

6.权利要求2-5的方法，其中所述肌抑素拮抗剂与另外的化合物偶联。

7.权利要求2-6的方法，其中所述肌抑素拮抗剂在药物组合物中配制。

8.权利要求2-6的方法，其中所述肌抑素拮抗剂在包含缓冲剂、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质、螯合剂、稳定剂或赋形剂的药物组合物中配制。

9.权利要求2-6的方法，其中所述肌抑素拮抗剂在10mM醋酸钠，9％(w/v)蔗糖，0.004％(w/v)聚山梨酸酯20，pH4.75中配制。

10.权利要求2-9的方法，其中所述肌抑素拮抗剂肠胃外或口服施用。

11.权利要求2-9的方法，其中所述肌抑素拮抗剂皮下施用。

12.权利要求2-10的方法，其中所述肌抑素拮抗剂以0.01至10.0mg/kg的剂量施用，包括0.01mg/kg和10.0mg/kg。

13.权利要求2-10的方法，其中所述肌抑素拮抗剂以0.3至3.0mg/kg的剂量施用，包括0.3mg/kg和3.0mg/kg。

14.权利要求2-10的方法，其中所述肌抑素拮抗剂以0.3、1.0或3.0mg/kg的剂量施用。

15.权利要求2-14的方法，其中所述肌抑素拮抗剂每日两次、每日一次、每周两次、每周一次、每月两次或每月一次施用。

16.权利要求2-14的方法，其中所述肌抑素拮抗剂每周一次施用，持续4周。

17.权利要求2-16的方法，其中所述肌抑素拮抗剂与其他药剂共同施用。

18.权利要求2-16的方法，其中所述肌抑素拮抗剂与包括抗前列腺癌剂的其他药剂共同施用。

19.肌抑素拮抗剂用于治疗或调节患有前列腺癌并正接受雄激素剥夺治疗的人类受试者的恶病质和/或提高瘦体重和/或增大下肢肌肉大小或者在药物制备中的用途，所述肌抑素拮抗剂包括由SEQIDNO:311中所示氨基酸序列组成的多肽。

20.肌抑素拮抗剂用于治疗或调节患有前列腺癌并正接受雄激素剥夺治疗的人类受试者的恶病质和/或提高瘦体重和/或增大下肢肌肉大小或者在药物制备中的用途，所述肌抑素拮抗剂由肽体组成，所述肽体包括由SEQIDNO:635中所示的氨基酸序列组成的多肽。