JP2021534825A - 二機能血管新生阻害剤及びその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＶＥＧＦ阻害活性及びＦＧＦ阻害活性を有し、ＶＥＧＦ及びＦＧＦの二因子又は高グルコースによって誘導される細胞増殖、細胞遊走及び／又は管腔形成を阻害できる二機能血管阻害剤に関する。本発明は、さらに、網膜血管新生を阻害するための前記二機能血管阻害剤の用途、例えば、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性などに関する。【選択図】図１

Description

本発明は、二機能血管新生阻害剤及びその用途に関し、具体的には、ＶＥＧＦ阻害活性及びＦＧＦ阻害活性を持つ融合タンパク質、並びにＶＥＧＦ及びＦＧＦの２つの因子又は高グルコースによって誘導される細胞増殖、細胞遊走及び／又は管腔形成の阻害におけるその用途、例えば、網膜血管新生及び血管新生に関連する眼疾患、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性などの阻害に関する。

眼内血管新生は、多くの眼疾患の重篤な合併症であり、血管新生は、角膜、虹彩、毛様体、脈絡膜、網膜、黄斑及び視神経円板などのほぼすべての眼内組織で発生し、これらの部分で組織の出血、滲出、過形成などの一連の病理学的変化を引き起こし、眼球の構造及び機能に損傷を与え、視覚機能を著しく損なう可能性がある。この一連の眼底疾患は、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ、ＤＲ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ、ＲＯＰ）、加齢黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＡＭＤ）などを含み、視力に深刻な影響を及ぼし、ひいては失明を引き起こす。
研究によると、ＶＥＧＦは、血管新生で知られている最も特異的で効果的な成長因子であることを示している。１９９０年代以降、ＶＥＧＦを標的とし、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を遮断することにより眼底血管新生を阻害する薬物は、開発のホットスポットになる。ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ、商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）は、ＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合することができ、滲出型加齢黄斑変性症及び糖尿病性黄斑浮腫の治療薬として米国ＦＤＡによって承認されている。ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ−Ｅｙｅ（アフリベルセプト又はＥｙｌｅａ）は、米国のリジェネロン・ファーマシューティカルズ社によって開発された抗ＶＥＧＦ組換えタンパク質であり、臨床研究の結果は、ＤＭＥ（糖尿病性黄斑浮腫）への治療効果が十分であり、ＤＭＥの治療のための補足申請が提出されている。ＫＨ９０２（コンバセプト、Ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ）は、成都康弘公司によって開発された加齢黄斑変性（ＡＭＤ）に対するＶＥＧＦＲ−Ｆｃ組換えタンパク質であり、ＡＭＤの治療のために２０１３年１２月に販売が承認されている。ＤＲの臨床的研究及び臨床的応用におけるＶＥＧＦを標的とするラニビズマブなどの成功は、ＶＥＧＦがＤＲの主な効果的な標的の１つであることを示している。

ＶＥＧＦを標的とする薬物は、臨床的に大きな進歩を遂げているが、血管新生は複数の因子によって調節されるため、血管新生の調節は非常に複雑な動的平衡プロセスである。既存の薬物は、臨床的な治療に大きな限界があるため、抗血管新生の臨床治療効果をさらに改善する方法は研究者が解決する必要のある問題になり、次世代の抗血管新生薬の研究開発の焦点でもある。

線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、ヘパリン結合性の増殖因子のファミリーであり、例えば、細胞増殖、分化、遊走、血管新生及び腫瘍形成などの様々な生物学的機能において重要な役割を果たす。細胞表面のＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）に結合して活性化することにより、複数の生物学的機能を発揮する。線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦＧＦＲ）は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーに結合する受容体であり、その一部は疾患プロセスに関与する。

出願人は、特許ＣＮ２０１１１０１３１０２９．ＸにＶＥＧＦ及びＦＧＦを標的とする二重特異性融合タンパク質（特許ＣＮ ２０１１１０１３１０２９．Ｘに係る２８^＃融合タンパク質、以下、単にＶＦ２８と称される）を開示しており、研究結果は、ＶＦ２８融合タンパク質が良好な生物的活性を有し、ＶＥＧＦ及びＦＧＦを効果的に標的とする可能で、腫瘍及び／又は眼科血管新生疾患の治療又は予防において有意な治療効果があることを示す。しかし、研究過程では、調製されたＶＦ２８が保存期間の延長により活性が不安定である問題があることを発見しており、実行されたＶＦ２８ストック溶液長期保存試験（−８０℃±１０℃長期保存試験条件）の３ロットにおいて、０時間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月放置し、結合活性（ＥＬＩＳＡ法）の分析を行ったデータは、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月の各モニタリング時点でそれぞれ１ロット、２ロット、３ロットのＶＦ２８ストック溶液の結合活性試験結果は、評価基準の要件を満たしていなく（ＦＧＦ末端の結合活性の不合格による）、実行されたＶＦ２８完成品の加速試験条件下の安定性試験の３ロットにおいて、２５℃±２℃の加速試験条件下で１ヶ月放置し、細胞生存率分析を行う。結果は、ＶＦ２８完成品の３つのロットのうち、１つのロットの細胞生存率試験結果が評価基準の要件を超え、評価基準の要件を満たしていないことを示す。

上記の問題に対応して、本発明は、構造変更された、ＶＥＧＦ及びＦＧＦを標的とする二機能血管新生阻害剤ＲＣ２８−０５を提供し、これは、良好な生物的活性を有するだけでなく、網膜血管新生を効果的に阻害することができ、例えば、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性などの眼疾患に顕著な治療効果をもたらし、しかも、調製された製品は、保存安定性があり、分解しにくく、保管温度、環境などに対する要求が低い。

具体的には、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を持つ二機能血管新生阻害剤を提供する。

さらに、前記二機能血管新生阻害剤は、ＶＥＧＦ阻害活性及びＦＧＦ阻害活性を持つ。

さらに、前記二機能血管新生阻害剤は、ＶＥＧＦ及びＦＧＦの二因子又は高グルコースによって誘導される細胞増殖、細胞遊走及び／又は管腔形成を阻害することができる。

本発明は、上記二機能血管新生阻害剤の、網膜血管新生を阻害するための薬物の調製における用途を提供する。

さらに、上記二機能血管新生阻害剤の、血管新生に関連する眼疾患を治療するための薬物の調製における用途を提供する。

好ましくは、前記血管新生に関連する眼疾患は、例えば、乾性ＡＭＤ及び湿性ＡＭＤのような加齢黄斑変性、例えば、非増殖型ＤＲ、増殖型ＤＲ及びＤＭＥのような糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症及び網膜静脈閉塞症から選ばれる。さらに、糖尿病患者対象の網膜損傷を改善させるための薬物における上記二機能血管新生阻害剤の用途を提供する。

好ましくは、前記網膜損傷は、短期間の網膜損傷である。

さらに、前記短期間の網膜損傷は、網膜血管網のアポトーシス細胞数の減少、血液網膜関門の破綻の低減、網膜グリア細胞の反応性増殖の阻害、神経網膜及び網膜血管の超微細構造の改善から選ばれる。

好ましくは、前記網膜損傷は、長期間の網膜損傷である。

さらに、前記長期間の網膜損傷は、網膜関門漏出の改善、及び毛細血管基底膜肥厚の阻害から選ばれる。

さらに、上記二機能血管新生阻害剤の網膜症対象における網膜無灌流領域を改善させるか、又は網膜新生血管細胞核の数を低減させるための薬物の調製における用途を提供し、好ましくは、網膜症対象は、未熟児である。

さらに、上記二機能血管新生阻害剤の対象における網膜血管内皮細胞の増殖、移行及び／又は管腔形成を低減させるための薬物の調製における用途を提供する。

本発明は、さらに、二機能血管新生阻害剤をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記二機能血管新生阻害剤のアミノ酸配列は、配列番号１に示され、そのヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるポリヌクレオチドを提供する。

本発明は、さらに、上記ポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、前記ポリヌクレオチドは、発現宿主における前記ポリペプチドの産生を指示する１つ又は複数の調節配列に動作可能に連結される、核酸構築物を提供する。

本発明は、さらに、上記ポリヌクレオチドを含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターであり、前記ポリヌクレオチドは、発現宿主における前記ポリペプチドの産生を指示する１つ又は複数の調節配列に動作可能に連結される、ベクターを提供する。
本発明は、さらに、上記ポリヌクレオチド又は核酸構築物又は発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの産生を指示する１つ又は複数の調節配列に動作可能に連結される、宿主細胞を提供する。好ましくは、前記細胞は、哺乳動物細胞又はヒト由来細胞である。より好ましくは、前記細胞は、ＣＨＯ細胞である。

本発明は、さらに、前記二機能血管新生阻害剤を調製する方法であって、前記のいずれか１項に記載の宿主細胞を血管新生阻害剤の発現を許容する条件下で培養し、該阻害剤を回収することを含む、方法を提供する。

本発明は、さらに、前記のいずれか１項に記載のポリペプチド及び／又はベクターを含む医薬組成物を提供する。

本発明は、さらに、上記組成物を含むキットを提供する。

図１は、ＶＥＧＦ１６５によるＨＵＶＥＣｓ細胞増殖の刺激へのＶＦ２８及びＲＣ２８−０５の阻害効果を示す。 図２は、ｂＦＧＦによるＨＵＶＥＣｓ細胞増殖の刺激へのＶＦ２８及びＲＣ２８−０５の阻害効果を示す。

定義：
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての科学的および技術的用語は、当業者によって理解される通常の意味を有する。当分野の定義及び用語は、当業者は具体的にＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照できる。アミノ酸残基の略語は、当分野で使用される通常の２０種のＬ−アミノ酸の１つを指す標準的な３文字及び／又は１文字コードである。

本発明の広い範囲に示される数値範囲およびパラメータ近似値であるが、具体的な実施形態に示される数値は、可能な限り正確に記載される。しかしながら、いずれの数値にも必ず一定の誤差が含まれ、それぞれの測定に存在する標準偏差によって引き起こされる。また、本明細書に開示されるすべての範囲は、それに含まれる任意及びあらゆるサブ範囲を包含すると理解されるべきである。例えば、記載される「１〜１０」の範囲は、最小値１と最大値１０の間（端点を含む）での全てのサブ範囲、つまり、最小値１又はそれ以上から始まるすべてのサブ範囲、例えば、１〜６．１、及び最大値１０又はそれ以下まで終わるサブ範囲、例えば、５．５〜１０を含むことを理解すべきである。さらに、任意の「本明細書に組み込まれる」と呼ばれる参照は、その全体が組み込まれるものとして理解されるべきである。

本明細書で使用される「可溶性」タンパク質という用語は、生物学的に適切な温度、ｐＨレベル及び浸透圧で水溶液に溶解できるタンパク質である。ある特定の技術案では、本発明の融合タンパク質は、可溶性融合タンパク質である。

本明細書で使用されるように、「単離された」という用語は、以下の物質及び／又は実体を指し、即ち、（１）最初に発生した時に（自然環境及び／又は試験環境で）それに関連する少なくとも幾つかの成分から分離されるか、及び／又は（２）人工生産、作製及び／又は製造によるものである。単離された物質及び／又は実体は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、基本的に１００％又は１００％の最初に関連付けられている他の成分から分離される。ある特定の技術案では、本発明の融合タンパク質は、単離された融合タンパク質である。

本明細書で使用される「ＶＥＧＦ」という用語とは、血管内皮増殖因子である。本明細書で使用される「ＶＥＧＦＲ」という用語とは、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦＲ３であってもよい血管内皮増殖因子受容体である。好ましくは、本発明に係るＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１及び／又はＶＥＧＦＲ２であり、好ましくは、ヒトＶＥＧＦＲである。

本明細書で使用される「ＦＧＦ」という用語とは、線維芽細胞増殖因子である。本明細書で使用される「ＦＧＦＲ」という用語とは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及び／又はＦＧＦＲ４であってもよい線維芽細胞増殖因子受容体である。好ましくは、本発明に係るＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ１であり、よりこのましくは、ヒトＦＧＦＲ１である。

本明細書で使用される「対象」という用語とは、ヒトなどの哺乳動物、愛玩動物（例えば、犬、猫など）、家畜（例えば、牛、羊、豚、馬など）又は実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含む。

本発明の融合タンパク質は、さらに、翻訳後修飾を含むことができる。そのような修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。結果は、修飾されたタンパク質は、非アミノ酸成分、例えば、ポリエチレングリコール、脂質、多糖又は単糖及びリン酸を含むことができる。タンパク質機能に対するこのような非アミノ酸成分の作用は、本明細書に記載されるように試験されることができる。タンパク質が細胞内で産生される場合には、翻訳後修飾は正しい折りたたみ及び／又は融合タンパク質の機能に重要である可能性がある。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３又はＨＥＫ２９３）は、これらの翻訳後活性に対する特定の細胞機構及び独立したメカニズムを持ち、且つタンパク質の正しい修飾及び加工を確保するために異なる細胞を選択することができる。

本明細書に記載のタンパク質は、当技術分野で知られている任意の方法により製造されることができる。例えば、化学合成又は核酸発現により製造されることができる。本発明で使用されるペプチドは、当分野で周知の標準的な液相合成又は好ましい固相ペプチド合成法に従って容易に調製されることができる（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ及びＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９８４）、ｉｎ Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ及びＡ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）を参照）。融合タンパク質は、上記タンパク質に含まれると予想されるポリペプチド配列内のシステイン残基間に１つまたは複数の分子内架橋を形成するように、当技術分野で知られている技術を使用して生産されることができる（例えば、米国特許Ｎｏ．５４７８９２５を参照）。また、本明細書に記載の融合タンパク質は、通常、前記融合タンパク質のＣ末端又はＮ末端にシステイン又はビオチンを付加することにより修飾される。

本明細書で使用される「治療有効量」又は「有効量」という用語は、それが投与される対象にその利益を示すのに十分な用量を指す。投与される実際量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療される個人の状態および重症度に依存する。治療処方（例えば、用量の決定など）は、最終的に一般開業医や他の医師の責任であり、それらに頼んで決定され、通常、治療される疾患、患者の状況、伝達部位、投与方法及び医師にすでに知られている他の要因を考慮する。

本明細書で使用される「ＶＦ２８」という用語は、ＶＥＧＦＲ１の２番目のＩｇ様ドメイン、ＶＥＧＦＲ２の３番目のＩｇ様ドメイン、ＦＧＦＲ Ｉｇ様ドメインの中間機能配列領域に由来する部分、ＦＧＦＲの２番目のＩｇ様ドメイン、ＦＧＦＲの３番目のＩｇ様ドメイン及びＦｃフラグメントを含む特定のＶＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ融合タンパク質を意味する。ＶＦ２８は、中国特許２０１１１０１３１０２９．Ｘに係る２８^＃融合タンパク質の略語であり、その構築過程及び他の情報は、中国特許２０１１１０１３１０２９．Ｘの公開文書を参照する。具体的には、ＶＦ２８のアミノ酸配列は、配列番号２で示される。

本明細書で使用される「ストック溶液」という用語は、精製された後、中間貯蔵容器に詰められた融合タンパク質液を意味し、本発明に係るストック溶液は、細胞培養液にアフィニティークロマトグラフィー、ウイルス除去処理、粗ろ過クロマトグラフィー、精製を施して得られたものであり、本明細書で使用される「完成品」という用語は、ストック溶液を滅菌および濾過して滅菌最終容器に分取して封止された融合タンパク質液を意味し、本発明に係る完成品は、ストック溶液に一定の配合比の添加剤（リン酸二水素ナトリウム、塩化ナトリウム、スクロース、ポリソルベート８０）を加えた後、滅菌してろ過することにより得られたものである。
本明細書で使用される「ＦＧＦ−Ｔｒａｐ」という用語とは、ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を意味し、ＦＧＦのＴｒａｐとして使用されることによりＦＧＦを拮抗することができる。具体的には、本発明の実施例で使用されるＦＧＦ−Ｔｒａｐは、２６＃ＦＧＦＲ融合タンパク質であり、その構築過程及び他の情報は、ＣＮ１０２２１９８６０Ａを参照する。

本明細書で使用される「ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ」という用語とは、ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を意味し、ＶＥＧＦのＴｒａｐとして使用されることによりＶＥＧＦを拮抗することができる。具体的には、本発明の実施例で使用されるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは、米国Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ製薬会社で開発された抗ＶＥＧＦ組換えタンパク質（ＥＴＬＥＡ、アイリーア）であり、市販として入手可能である。

実施例は、本発明をさらに説明及び解釈しているが、本発明の限定と見なされるべきではない。

実施例１：宿主細胞の選択
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子欠失のチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌ、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−）は、米国ＡＴＣＣから購入され、カタログ番号ＣＲＬ−９０９６、ロット番号（Ｌｏｔ ｎｕｍｂｅｒ）３６９１６２０である。ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を、ヒポキサンチン及びチミジン（ＨＴ）及１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が添加されたＩＭＤＭ完全培地に培養し、細胞は、多角形であり、培養容器に接着して成長し、３回継代した後、細胞を液体窒素に浸して凍結保存された。無血清浮遊培養に適したＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を得るために、凍結保存された細胞を１本取り出し、３７℃のウォーターバスで解凍し、細胞を１０％ＦＢＳ及びＨＴを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０２ ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ）に懸濁し、細胞培養フラスコで細胞を壁面に接着させて成長させ、細胞が十分に増殖した後、細胞を５％ウシ胎児血清を含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０２ ＣＨＯ培地３０ｍＬに懸濁させ、振とうフラスコを使用し培養した。細胞が１〜２×１０^６／ｍＬに増殖すると、２．５％ウシ胎児血清を含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０２ ＣＨＯ細胞培地に移し、振とうフラスコを使用し培養した。このようにそれぞれ順次に１．５％及び０．５％ウシ胎児血清を含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０２培地に振とうフラスコを使用し培養して適応させた。最後に、細胞を無血清Ｅｘ Ｃｅｌｌ ３０２ ＣＨＯ培地に懸濁し、振とうフラスコを使用し培養した。細胞が十分に増殖した後、遠心して細胞を収集し、細胞を１０％ＤＭＳＯを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０２ ＣＨＯ培地に懸濁し、液体窒素で凍結保存し、それは、無血清培養に適応したＣＨＯ細胞の元の細胞バンクである。無血清培養に適応したＣＨＯ細胞は、浮遊培養条件下で円形又は略円形である。

実施例２：標的遺伝子
ＲＣ２８−０５融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ及びＦＧＦＲの部分アミノ酸配列とヒト免疫グロブリンＦｃフラグメントとの融合により形成される、二機能血管新生阻害活性を持つ融合タンパク質であり、そのアミノ酸配列は、以下の通りである。（配列番号１に示される）：
GRPFVEMYSE IPEIIHMTEG RELVIPCRVT SPNITVTLKK FPLDTLIPDG KRIIWDSRKG 60
FIISNATYKE IGLLTCEATV NGHLYKTNYL THRQTNTIID VVLSPSHGIE LSVGEKLVLN 120
CTARTELNVG IDFNWEYPSS KHQHKKLVNR DLKTQSGSEM KKFLSTLTID GVTRSDQGLY 180
TCAASSGLMT KKNSTFVRVH EKPVAPYWTS PEKMEKKLHA VPAAKTVKFK CPSSGTPNPT 240
LRWLKNGKEF KPDHRIGGYK VRYATWSIIM DSVVPSDKGN YTCIVENEYG SINHTYQLDV 300
VERSPHRPIL QAGLPANKTV ALGSNVEFMC KVYSDPQPHI QWLKHIEVNG SKIGPDNLPY 360
VQILKTAGVN TTDKEMEVLH LRNVSFEDAG EYTCLAGNSI GLSHHSAWLT VLEADKTHTC 420
PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN 480
AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP 540
QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL 600
YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K 641

ＲＣ２８−０５のヌクレオチド配列は、以下の通りである。（１９２３ｂｐ）（配列番号３に示される）：
ggtagaccat tcgtagagat gtacagtgaa atccccgaaa ttatacacat gactgaagga 60
agggagctcg tcattccctg ccgggttacg tcacctaaca tcactgttac tttaaaaaag 120
tttccacttg acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaagggc 180
ttcatcatat caaatgcaac gtacaaagaa atagggcttc tgacctgtga agcaacagtc 240
aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac aatcatagat 300
gtggttctga gtccgtctca tggaattgaa ctatctgttg gagaaaagct tgtcttaaat 360
tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata cccttcttcg 420
aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtctgg gagtgagatg 480
aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540
acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600
gaaaaacccg tagctccata ttggacatcc ccagaaaaga tggaaaagaa attgcatgca 660
gtgccggctg ccaagacagt gaagttcaaa tgcccttcca gtgggacccc aaaccccaca 720
ctgcgctggt tgaaaaatgg caaagaattc aaacctgacc acagaattgg aggctacaag 780
gtccgttatg ccacctggag catcataatg gactctgtgg tgccctctga caagggcaac 840
tacacctgca ttgtggagaa tgagtacggc agcatcaacc acacatacca gctggatgtc 900
gtggagcggt cccctcaccg gcccatcctg caagcagggt tgcccgccaa caaaacagtg 960
gccctgggta gcaacgtgga gttcatgtgt aaggtgtaca gtgacccgca gccgcacatc 1020
cagtggctaa agcacatcga ggtgaatggg agcaagattg gcccagacaa cctgccttat 1080
gtccagatct tgaagactgc tggagttaat accaccgaca aagagatgga ggtgcttcac 1140
ttaagaaatg tctcctttga ggacgcaggg gagtatacgt gcttggcggg taactctatc 1200
ggactctccc atcactctgc atggttgacc gttctggaag ccgacaaaac tcacacatgc 1260
ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 1320
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 1380
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1440
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1500
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1560
gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1620
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1680
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1740
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1800
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1860
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1920
aaa 1923

ＲＣ２８−０５の標的遺伝子配列の両端にダブルダイジェストの切断部位を組み込めた後に通常の発現ベクターを挿入し、通用した方法を使用してＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、ＲＣ２８−０５発現細胞株をスクリーニングし、ＲＣ２８−０５融合タンパク質を発現させた。

実施例３：融合タンパク質の親和性実験
ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ（ＰＡＬＬ公司）を使用してＶＦ２８、ＲＣ２８−０５の親和性を検出し、プレートの行Ａ〜Ｅの１列目の各ウェルにＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を加えて平衡塩溶液とし、それにプローブを浸入して１０分間活性化させ、ＲＣ２８−０５及びＶＦ２８をそれぞれＰＢＳで濃度５０ｎＭに希釈し、９６ウェルプレートの行Ａ〜Ｅの２列目に追加し、プログラムをＬｏａｄｉｎｇ、３００ｓに設定し、プレートの行Ａ〜Ｅの３列目の各ウェルにＰＢＳを加えて平衡塩溶液とし、プログラムをＢａｓｅｌｉｎｅ、１８０ｓに設定し、ＰＢＳを希釈液とし、ｒｈＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）及びｒｈＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を濃度５００ｎＭ及び４００ｎＭにそれぞれ希釈し、次いで、３階段（合計４階段）で濃度６２．５ｎＭ及び５０ｎＭに希釈倍率１：２で階段希釈し、階段希釈サンプルをそれぞれ９６ウェルプレートの行Ａ〜Ｄの４列目に加え、同時に希釈液を行Ｅの４列目に加えて陰性対照とし、プログラムをＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、６００ｓに設定し、行Ａ〜Ｅの５列目の各ウェルにＰＢＳを加えて解離液とし、プログラムをＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１８００ｓに設定し、行Ａ〜Ｅの６及び７列目にそれぞれ１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）及びＰＢＳを加えて再生溶液及び中和液とし、プログラムをそれぞれＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ及びＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ、各１５ｓ、５回繰り返しに設定した。合計３サイクルの測定を行った。Ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ７．０ソフトウェアを使用してデータの解析を行った。対応する非結合ｒｈＶＥＧＦ／ｒｈＦＧＦのセンサーをコントロールとしてバックグラウンドを差し引き、平衡定数（ＫＤ）値を計算した。結果は、表１に示し、結果は、ＲＣ２８−０５及びＶＦ２８がｒｈＶＥＧＦ、ｒｈＦＧＦといずれも良好な親和性を有することを示した。

実施例４：融合タンパク質の細胞生存率実験
１０継代以内のＨＵＶＥＣｓ細胞を採取し、密度が５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェル（即ち、５０００ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種した。細胞が壁面に接着した後、馴化培養液又はＶＥＧＦ１６５又はｂＦＧＦ因子（４０ｎｇ／ｍＬ）又はＶＥＧＦ１６５＋異なる濃度のＲＣ２８−０５又はＶＦ２８薬物（最終的濃度が０、０．０１２５、０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、１、５、２５ｎＭ）又はｂＦＧＦ＋異なる濃度のＲＣ２８−０５又はＶＦ２８薬物（最終的濃度が０、０．０１５６、０．０６２５、０．２５、０．５、１、２、８、３２ｎＭ）を１００μＬ／ウェルで加え、最終的培養容量２００μＬ／ウェル、各サンプルにｔｒｉｐｌｉｃａｔｅし、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養し続けた。薬剤を添加してから７２時間後、９６ウェルプレート中の培養液をスピンドライし、各ウェルに１０％ＣＣＫ−８を含む内皮細胞基礎培地を１００μＬ／ウェルで加えた。３７℃で４時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を検出した。細胞増殖阻害率％＝（ＯＤ因子−ＯＤ（因子＋薬物））／ＯＤ因子×１００によりＶＥＧＦ１６５／ｂＦＧＦによるＨＵＶＥＣｓの増殖促進への各濃度で対応する薬物の阻害率を計算し、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して薬物のＩＣ５０値を計算し、薬物最大濃度の阻害率を測定し、実測値を採用し、ＶＥＧＦ１６５／ｂＦＧＦの刺激によるＨＵＶＥＣｓの細胞増殖に対するＲＣ２８−０５とＶＦ２８の阻害効果の違いを比較した。ＶＥＧＦ１６５／ｂＦＧＦの刺激によるＨＵＶＥＣｓの細胞増殖に対するＶＦ２８及びＲＣ２８−０５の阻害効果を図１及び図２に示し、最大阻害率及びＩＣ５０値の統計は、表２に示した。結果は、ＲＣ２８−０５及びＶＦ２８は、ＶＥＧＦ１６５／ｂＦＧＦの刺激によるＨＵＶＥＣｓの細胞増殖に対して有意な阻害効果を有することを示した。

実施例５：ＲＣ２８−０５ストック溶液及び完成品の調製
ＲＣ２８−０５ストック溶液及び完成品の調製は、ＶＦ２８の調製方法と同様であり、具体的には、
１）細胞培養液を遠心した後、上清液を収集してプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを行い、
２）収集されたすべての溶出液を有機溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）で処理した後、処理された溶出液に１％ポリソルベート８０（Ｗ／Ｖ）及び０．３％リン酸トリブチル（Ｗ／Ｖ）を加え、２０〜２５℃で６ｈ放置し、エンベロープウイルスを不活性化させ、
３）上記の処理後、さらに、セファロース陽イオン交換クロマトグラフィーによりポリマーや分解生成物などの関連する不純物を除去し、
４）収集されたすべての溶出液をさらに陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、少量の凝集体、ＣＨＯ宿主細胞タンパク質、宿主ＤＮＡ及び細胞内毒素などを除去し、
５）上記のクロマトグラフィー後の溶離液を収集し、さらに、ナノ粒子濾過メンブレンによりろ過してノンエンベロープウイルスを除去し、
６）ナノ粒子濾過メンブレンでろ過されたタンパク質溶液を限外ろ過して一定の濃度（１０〜１５ｍｇ／ｍＬ）に濃縮した後、濃縮タンパク質体積の１０〜１２倍の緩衝液（０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、０．０１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／Ｌスクロース、ＰＨ ６．８）を使用して置換透析し、さらに、タンパク質溶液を濃縮し（４０〜４５ｍｇ／ｍＬ）、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０を添加して撹拌して溶解させた後、０．４５＋０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過したタンパク質溶液は、ＲＣ２８−０５ストック溶液であり、タンパク質の濃度は、４０〜４５ｍｇ／ｍＬである。
７）完成品の調製：仕様が４０ｍｇ／ｍＬ（０．２ｍｌ／本）の完成品１０００本の調製方法は、以下の通りであり、上記のタンパク質のストック溶液中でのＲＣ２８−０５タンパク質の濃度を測定し、Ｃｍｇ／ｍＬとして定義され、１０％の充填損失を考慮すると、合計２２０ｍｌのタンパク質溶液を調製する必要がある。必要なタンパク質の全量は、２２０ｍｌ＊４０ｍｇ／ｍＬ＊０．２ｍｌ＝８．８ｇである。必要なタンパク質のストック溶液の体積は、Ｖ＝８．８／Ｃ＊１０００（ｍＬ）であり、タンパク質のストック溶液Ｖ ｍＬを採取し、それに緩衝液（０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、０．０１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／Ｌスクロース、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０）を２２０ｍＬになるまでに加え、均一に混合し、孔径が０．２２μｍ以下のフィルター膜で滅菌し、分割し、アルミ製カバーで封止し、ケースに詰めてＲＣ２８−０５完成品を得た。

実施例６：ＲＣ２８−０５（ストック溶液／完成品）の安定性試験
１．ＲＣ２８−０５ストック溶液の安定性試験
（１）異なる保管時間（−８０℃±１０℃）の純度分析
〔１〕ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法
ＲＣ２８−０５ストック溶液の３ロット（ロット番号：ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３２９、ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３３０、ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３３１）を−８０℃±１０℃の長期保存試験条件下で０時間、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月放置し、純度（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法）の分析を行い、各モニタリング時点でＳＥＣによりサンプルの純度を検出した結果は、メインピークはいずれも９５．０％以上であり、詳しく表１４に示した。

〔２〕ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法
ＲＣ２８−０５ストック溶液の３ロット（ロット番号：ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３２９、ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３３０、ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３３１）を−８０℃±１０℃の長期保存試験条件下で０時間、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月放置し、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）の分析を行った結果は、表１５に示し、データは、保管時間が長くなると、ＲＣ２８−０５ストック溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）による純度試験結果は、いずれも９０％を超えることを示した。

（２）異なる保管時間（−８０℃±１０℃）におけるストック溶液の細胞生存率実験
ＲＣ２８−０５ストック溶液の３ロット（ロット番号：ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３２９、ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３３０、ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３３１）を−８０℃±１０℃の長期保存試験条件下で１２ヶ月放置し、細胞生存率の分析を行った結果は、ＲＣ２８−０５ストック溶液が−８０℃±１０℃の条件下で１２ヶ月放置し、細胞生存率を分析し、試験サイクル内での各検出時点の相対細胞生存率はいずれも品質要件を満たすことを示した。詳しくは表１６に示した。

（３）異なる保管時間（−８０℃±１０℃）ストック溶液の結合活性実験
ＲＣ２８−０５ストック溶液の３ロット（番号：ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３２９、ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３３０、ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３３１）を−８０℃±１０℃の長期保存試験条件下で１２ヶ月放置し、結合活性（ＥＬＩＳＡ法）の分析を行った結果は、ＲＣ２８−０５ストック溶液が−８０℃±１０℃の条件下で１２ヶ月放置され、相対結合活性を測定及び分析し、試験サイクル内での各検出時点の相対細胞生存率はいずれもを満たすことを示した。詳しくは表１７に示した。

２．ＲＣ２８−０５完成品の安定性試験
（１）異なる保管時間の純度分析
〔１〕ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法
ＲＣ２８−０５完成品の３ロット（ロット番号：ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−１、ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−２、ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−３）をそれぞれ５℃±３℃の長期保存試験条件下で１２ヶ月放置し、２５℃±２℃の加速試験条件下で１ヶ月放置し、純度（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法）の分析を行い、実験結果は、５℃±３℃の長期保存試験条件下で１２ヶ月放置し、純度（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法）を分析し、実験サイクル内での各測定時点で検出されたサンプルのＳＥＣによる純度試験結果はいずれも約９５％であり、２５℃±２℃の加速試験条件下で１ヶ月放置した時に、各モニタリング時点で検出されたサンプルのＳＥＣによる純度試験結果は、メインピークはいずれも９５．０％以上であることを示し、詳しくは表１８及び表１９に示した。

〔２〕ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法
ＲＣ２８−０５完成品の３ロット（ロット番号：ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−１、ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−２、ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−３）をそれぞれ５℃±３℃の長期保存試験条件下で１２ヶ月放置し、２５℃±２℃で１ヶ月放置し、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）の分析を行った結果は、ＲＣ２８−０５完成品が５℃±３℃で１２ヶ月放置され、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を分析し、試験サイクル内での各測定時点で検出されたサンプルのＳＤＣ−ＰＡＧＥ（還元）による純度試験結果はいずれも９０．０％を超え、ＲＣ２８−０５完成品が２５℃±２℃で６ヶ月放置され、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を分析し、試験サイクル内での各測定時点で検出されたサンプルのＳＤＣ−ＰＡＧＥ（還元）による純度が低減する傾向があるが、試験結果はいずれも９０．０％を超えることを示した。詳しくは、表２０、表２１に示した。

（２）異なる保管時間の完成品の細胞生存率実験
ＲＣ２８−０５完成品の３ロット（ロット番号：ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−１、ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−２、ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−３）をそれぞれ５℃±３℃の長期保存試験条件下で１２ヶ月放置し、２５℃±２℃で１ヶ月放置し、細胞生存率の分析を行った。結果は、５℃±３℃の条件下で１２ヶ月放置し、細胞生存率を分析し、試験サイクル内での各モニタリング時点で検出されたサンプルの相対細胞生存率はいずれも評価基準を満たし、２５℃±２℃の条件下で１ヶ月放置し、細胞生存率を分析し、試験サイクル内での各モニタリング時点の相対細胞生存率の検出結果はいずれも品質要件を満たすことを示した。詳しくは、表２２、表２３に示した。

（３）異なる保管時間における完成品の結合活性実験
ＲＣ２８−０５完成品の３ロット（ロット番号：ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−１、ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−２、ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−３）をそれぞれ５℃±３℃の長期保存試験条件下で１２ヶ月放置し、２５℃±２℃で１ヶ月放置し、結合活性の分析を行った。結果は、５℃±３℃の条件下で１２ヶ月放置し、結合活性を分析し、試験サイクル内での各モニタリング時点で検出されたサンプルの相対結合活性が評価基準を満たし、２５℃±２℃の条件下で１ヶ月放置し、結合活性を分析し、試験サイクル内での各モニタリング時点の相対結合活性（ＶＥＧＦ端及びＦＧＦ端）の検出結果はいずれも品質要件を満たすことを示した。詳しくは、表２４、表２５に示した。

３．実験結果
−８０℃±１０℃の長期保存試験条件下でのＲＣ２８−０５ストック溶液の３ロット（ロット番号：ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３２９、ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３３０、ＲＣ２８−０５−ＹＹ２０１６０３３１）の保存を調査した結果は、以下の通りである。
〔１〕ＳＥＣによる純度：ＲＣ２８−０５ストック溶液の３ロットを−８０℃±１０℃の条件下で１２ヶ月放置し、そのＳＥＣによる純度はいずれも９０％以上である。
〔２〕ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）による純度：ＲＣ２８−０５ストック溶液の３ロットを−８０℃±１０℃の条件下で１２ヶ月放置し、その還元条件下の純度はいずれも９０％以上である。
〔３〕細胞生存率：ＲＣ２８−０５ストック溶液の３ロットを−８０℃±１０℃の条件下で１２ヶ月放置し、細胞生存率を分析し、試験サイクル内での各測定時点の相対細胞生存率はいずれも品質要件を満たす。
〔４〕結合活性：ＲＣ２８−０５ストック溶液の３ロットを−８０℃±１０℃の条件下で１２ヶ月放置し、細胞生存率を分析し、試験サイクル内での各測定時点の相対細胞生存率はいずれも品質要件を満たす。

ＲＣ２８−０５完成品の３ロットを（ロット番号：ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−１、ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−２、ＲＣ２８−０５−２０１６０４０１−３）のそれぞれ５℃±３℃、２５℃±２℃の条件下での保存を調査した結果は、以下の通りである。
〔１〕ＳＥＣによる純度：
ＲＣ２８−０５完成品の３ロットを５℃±３℃の条件下で１２ヶ月放置し、それらのＳＥＣ純度はいずれも９０％以上である。
ＲＣ２８−０５完成品の３ロットを２５℃±２℃の条件下で１ヶ月放置し、それらのＳＥＣ純度はいずれも９０％以上である。
〔２〕ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）による純度：
ＲＣ２８−０５完成品の３ロットを５℃±３℃の条件下で１２ヶ月放置し、それらのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）による純度はいずれも９０％以上である。
ＲＣ２８−０５完成品の３ロットを２５℃±２℃の条件下で１ヶ月放置し、それらのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）純度はいずれも９０％以上である。
〔３〕細胞生存率：
ＲＣ２８−０５完成品の３ロットを５℃±３℃の条件下で１２ヶ月放置し、各モニタリング時点で検出されたサンプル細胞生存率の検出結果はいずれも評価基準を満たす。
ＲＣ２８−０５完成品の３ロットを２５℃±２℃の条件下で１ヶ月放置し、各モニタリング時点で検出されたサンプル細胞生存率の検出結果はいずれも評価基準を満たす。
〔４〕結合活性：
ＲＣ２８−０５完成品の３ロットを５℃±３℃の条件下で１２ヶ月放置し、各モニタリング時点で検出されたサンプルの細胞生存率の検出結果はいずれも評価基準を満たす。
ＲＣ２８−０５完成品の３ロットを２５℃±２℃の条件下で１ヶ月放置し、各モニタリング時点で検出されたサンプルの細胞生存率の検出結果はいずれも評価基準を満たす。

以上より、以下の結論を取得した。即ち、
〔１〕ＲＣ２８−０５ストック溶液は、−８０℃±１０℃の条件下で少なくとも１２ヶ月間安定して保存されることができ、ＶＦ２８ストック溶液は、同様の条件下で６ヶ月後に活性要件を満たしていない。
〔２〕ＲＣ２８−０５完成品は、５℃±３℃の条件下での貯蔵性が少なくとも１２ヶ月間安定して維持されることができるが、ＶＦ２８は、同様の条件下で６ヶ月以内で貯蔵性が安定した。
〔３〕ＲＣ２８−０５完成品は、２５℃±２℃の条件下で貯蔵性が少なくとも１ヶ月安定し、ＶＦ２８ストック溶液は、同様の条件下で１／３ロットが活性要件を満たしていない。

前記から、ＲＣ２８−０５ストック溶液は、−８０℃±１０℃で安定し、ＲＣ２８−０５完成品は、５℃±３℃の条件下で（少なくとも１２ヶ月間）、２５℃±２℃の条件下で（少なくとも１ヶ月間）貯蔵性が安定することを示した。同様の条件下で安定した保存時間は、ＶＦ２８よりも遥かに長くなる。

本発明は、各々の具体的な実施例により説明されている。しかし、当業者は、本発明が各々の具体的な実施形態に限定されなく、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の明細書内に様々な改良又は変更を加えることができ、且つ本明細書で言及される技術的特徴のそれぞれを互いに組み合わせることもできることを理解すべきである。これらの改良及び変更は、いずれも本発明の範囲内にある。

Claims (20)

1. 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する二機能血管新生阻害剤。
2. 二機能血管新生阻害剤をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記二機能血管新生阻害剤のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるポリヌクレオチド。
3. 配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
4. 請求項２又は３に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、前記ポリヌクレオチドは、発現宿主における前記ポリペプチドの産生を指示する１つ又は複数の調節配列に動作可能に連結される、核酸構築物。
5. 請求項２又は３に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、請求項２又は３に記載のポリヌクレオチドは、１つ又は複数の調節配列に動作可能に連結されるベクター。
6. 前記ベクターは、発現ベクターであり、前記調節配列は、発現宿主における前記ポリペプチドの産生を指示する、請求項５に記載のベクター。
7. 請求項２又は３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載の核酸構築物又は請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの産生を指示する１つ又は複数の調節配列に動作可能に連結される、宿主細胞。
8. 前記細胞は、哺乳動物細胞又はヒト由来細胞であり、前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞であることがより好ましい、請求項７に記載の宿主細胞。
9. 請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２又は３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載の核酸構築物又は請求項５又は６に記載のベクターを含むことを特徴とする医薬組成物。
10. 請求項９に記載の医薬組成物を含むことを特徴とするキット。
11. 請求項１に記載の二機能血管新生阻害剤又は請求項２又は３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載の核酸構築物又は請求項５又は６に記載のベクターの、ＶＥＧＦ及びＦＧＦの二因子又は高グルコースによって誘導される細胞増殖、細胞遊走及び／又は管腔形成を阻害するための薬物の調製における用途。
12. 請求項１に記載の二機能血管新生阻害剤又は請求項２又は３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載の核酸構築物又は請求項５又は６に記載のベクターの、網膜血管新生を阻害するための薬物の調製における用途。
13. 請求項１に記載の二機能血管新生阻害剤又は請求項２又は３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載の核酸構築物又は請求項５又は６に記載のベクターの、血管新生に関連する眼疾患を治療するための薬物の調製における用途。
14. 前記血管新生に関連する眼疾患は、加齢黄斑変性、例えば、乾性ＡＭＤ及び湿性ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、例えば、非増殖型ＤＲ、増殖型ＤＲ及びＤＭＥ、糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症及び網膜静脈閉塞症から選ばれる、請求項１３に記載の用途。
15. 請求項１に記載の二機能血管新生阻害剤又は請求項２又は３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載の核酸構築物又は請求項５又は６に記載のベクターの、糖尿病患者対象における網膜損傷を改善させるための薬物の調製における用途。
16. 前記網膜損傷は、短期間の網膜損傷又は長期間の網膜損傷である、請求項１５に記載の用途。
17. 前記短期間の網膜損傷は、網膜血管網のアポトーシス細胞数の減少、血液網膜関門の破綻の低減、網膜グリア細胞の反応性増殖の阻害、及び神経網膜及び網膜血管の超微細構造の改善から選ばれ、前記長期間の網膜損傷は、網膜関門漏出の改善及び毛細血管基底膜肥厚の阻害から選ばれる、請求項１６に記載の用途。
18. 請求項１に記載の二機能血管新生阻害剤又は請求項２又は３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載の核酸構築物又は請求項５又は６に記載のベクターの、網膜症対象でにおける網膜無灌流領域を改善させるか、又は網膜新生血管細胞核の数を低減させるための薬物の調製における用途。
19. 前記網膜症対象は、未熟児である、請求項１８に記載の用途。
20. 請求項１に記載の二機能血管新生阻害剤を調製する方法であって、請求項７〜８のいずれか１項に記載の宿主細胞を前記二機能血管新生阻害剤の発現を許容する条件下で培養し、その阻害剤を回収することを含む、方法。

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