CN110520152A - 与靶向组织因子的igg3免疫缀合物有关的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与免疫缀合物有关的方法和组合物。特别公开了免疫缀合物，所述免疫缀合物包含IgG3的Fc部分以及因子VII轻链或因子VII。还公开了免疫缀合物蛋白，其中所述免疫缀合物蛋白包含缀合到因子VII的IgG1和IgG3免疫球蛋白的杂合Fc区。这些免疫缀合物能够靶向表达组织因子(TF)的细胞。

Description

与靶向组织因子的IGG3免疫缀合物有关的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年3月14日提交的美国临时申请号62/471,045；2017年10月24日提交的美国临时申请号62/576,278；以及2018年1月29日提交的美国临时申请号62/623,269的权益，所有这三份临时申请据此全文以引用方式并入本文。

政府支持条款

本发明是在由国家转化科学促进中心(National Center for AdvancingTranslational Sciences)授予的批准号UL1TR001070的政府资助下完成的。政府对本发明拥有一定的权利。

背景技术

组织因子(“TF”)是作为凝血级联主要引发剂的跨膜糖蛋白。在正常生理状况下，活性TF不与血液接触。在血管损伤期间，内皮下TF和胶原暴露于血液会导致凝血因子和血小板活化，并且随后引起止血栓子形成。多种临床环境中TF表达的不当诱导能够引起危及生命的血栓形成和/或促成病理性并发症。据信斑块破裂后的TF暴露会引起血栓性闭塞，从而引起急性心肌梗塞和中风。在这些环境中，凝血因子所活化的促炎信号通路还会促成水肿形成和梗塞面积增加。与血管成形术相关的血管损伤引起SMC上的TF上调，据信这会诱导与再狭窄相关的细胞信号通路。癌症和革兰氏阴性脓毒症中的TF过表达引起危及生命的血栓形成以及炎性通路的活化。

TF是病理性血管生成的调节剂。体内研究表明，TF也是体内唯一病理性血管生成血管内皮细胞(VEC)表面受体，这是因为其在体内选择性表达于患者或动物模型的肿瘤血管(Contrino等人，1996年；Folkman等人，1996年；Hu等人，1999年；Hu等人，2001年；Cheng等人，2011年；Duanmu等人，2011年)、眼部(Bora等人，2003年)和异位子宫内膜(Krikun等人，2010年)新生血管中的血管生成VEC上。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成依赖性癌和非恶性人疾病(Ferrara等人，2002年)诸如黄斑变性(Klagsbrun等人，1987年)、类风湿性关节炎(Afuwape等人，2002年)和子宫内膜异位(Fujimoto等人，1999年)中起着中心作用。具体地讲，VEGF通过结合于这些血管生成依赖性疾病的病理性新生血管(通常为微血管或毛细血管)中VEC上的VEGR受体来刺激血管生成(Hu等人，《血管生成》(Angiogenesis)，2016年)。通过使用VEGF诱导的体外血管生成血管内皮模型，证实了TF是血管生成特异性受体及因子VII靶向治疗的靶标，从而表明TF靶向剂能够具有治疗癌(实体癌和白血病)、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、子宫内膜异位和类风湿性关节炎的治疗潜能。

TF是一种常见又有特异性的生物标志物，而且是实体癌中的癌细胞、癌干细胞(CSC)(Hu等人，《肿瘤靶标》(Oncotarget)，2016年)和肿瘤血管内皮细胞的治疗靶标。TF在这些癌细胞中高表达，例如，乳腺癌中表达率为80％-100％，三阴性乳腺癌中表达率为50％-85％(Hu等人，《癌症免疫研究》(Cancer Immunol Res)，2018年)，肺癌中表达率为40％-80％，并且卵巢癌中表达率为84％。这三种类型的癌症不仅难以控制，而且是美国和全世界的主要死因且通常会形成基于CSC的化疗和放疗抗性(Vidal等人，2014年；Moncharmont等人，2012年；Koch等人，2010年)。除了乳腺、肺和卵巢癌之外，TF还以高百分比表达于许多其他人实体癌以及白血病和肉瘤中(Hu，《抗体》(Antibodies)，2018年)，例如原发性黑色素瘤中表达率为95％且转移性黑色素瘤中表达率为100％，胰腺癌中表达率为53％-90％，结肠直肠癌中表达率为57％-100％，肝细胞癌中表达率为63％-100％，原发性和转移性前列腺癌中表达率为60％-78％，并且神经胶质瘤中表达率为47％-75％。最近已证实，乳腺、肺和卵巢癌中的癌干细胞表达了TF，并且TF靶向剂能够根除这些表达TF的癌干细胞而不出现药物抗性(Hu等人，《肿瘤靶标》(Oncotarget)，2016年)。

还已证实，实验动物的一种AMD模型脉络膜新生血管(CNV)表达了TF(Bora等人，2003年)。最近已证实，异位子宫内膜病灶中的血管生成血管内皮细胞表达了TF(Krikun等人，2010年)。

需要的是与免疫靶向剂有关的方法和组合物，该免疫靶向剂特异性地靶向表达TF的血管生成VEC和癌细胞，并且表现出相比于靶向表达TF的细胞的其他试剂更强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。

发明内容

本文公开了包含免疫缀合物蛋白的组合物，其中所述免疫缀合物蛋白包含缀合到因子VII轻链或全长(含或不含K341A)的IgG3免疫球蛋白的Fc区。这些免疫缀合物在本文中称为第三代靶向组织因子的ICON，分别被命名为L-ICON3和ICON3。还公开了使用L-ICON3和ICON3的方法和试剂盒。

本文还公开了包含免疫缀合物蛋白的组合物，其中所述免疫缀合物蛋白包含缀合到因子VII轻链或全长(含或不含K341A)的IgG1和IgG3免疫球蛋白的杂合Fc区。这些免疫缀合物在本文中称为第四代靶向组织因子的ICON，分别被命名为L-ICON4和ICON4。

在附图和下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据下面的描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目标和优点将显而易见。

附图说明

并入本说明书中并且构成本说明书一部分的附图示出了本公开的若干方面，并与说明书一起用于解释本公开的原理。

图1A至图1C示出了靶向组织因子的免疫缀合物(ICON)的第三代和第四代的示意图和表征。1A示出了靶向TF的免疫缀合物(ICON)的第一代、第二代、第三代(L-ICON3和ICON3)和第四代(L-ICON4和ICON4)的示意图。1B示出了ICON1、L-ICON1、L-ICON3和ICON3的分子量。1C示出了L-ICON1和L-ICON3的荧光蛋白印迹。注意：L-ICON1和ICON1蛋白的上样量为3μg/泳道，并且L-ICON3蛋白的量为L-ICON1和ICON1的约一半(1.5μg)。

图2示出了重组L-ICON1和L-ICON3蛋白之间的亲和纯化差异。将从L-ICON1或L-ICON3的CHO生产细胞获取的、补充有1μg/ml维生素K1的1ml无血清培养基(SFM4CHO)(西格玛公司(Sigma))与蛋白A或蛋白G磁微珠(伯乐公司(Bio-Rad))一起温育，并且将所捕获的蛋白在1×SDS上样缓冲液中洗脱并通过SDS-PAGE进行分析，然后使用1:10,000稀释的抗人IgG HRP缀合物(西格玛公司(Sigma))和ECL试剂(Peirce公司)进行蛋白印迹。不含L-ICON蛋白的新鲜无血清培养基(SFM)用作阴性培养基对照。

图3A至图3F示出了L-ICON3蛋白能够结合鼠和人癌细胞两者，这允许从动物研究转化成人临床试验并且表明L-ICON3疗法具有治疗多种实体癌的治疗潜能。(ns：不显著)。

图4A和图4B示出了L-ICON3能够引发ADCC和CDC(补体依赖性细胞毒作用)以杀伤靶癌细胞。图4A示出了L-ICON3相比于L-ICON1在体外能更有效地介导ADCC以杀伤人卵巢癌细胞。图4B示出了CDC。人IgG(hIgG)用作同种型阴性对照。

图5A至图5B示出了L-ICON1相比于ICON在体外对癌细胞(MDA-MB-231)具有更强的结合力，并且在体内能更有效地治疗CB-17SCID小鼠的原位小鼠模型中的人癌(MDA-MB-231)。通过每周瘤内注射(箭头)来施用编码ICON、L-ICON1的腺病毒载体或未编码插入片段而作为对照(AdBlank)。图5B中每组有5只小鼠。

图6A至图6C示出了L-ICON3相比于L-ICON1在体内鼠TNBC的原位小鼠模型中更有效。图6A示出了L-ICON3蛋白能够结合于鼠三阴性乳腺癌(TNBC)4T1细胞。图6B示出了L-ICON3相比于L-ICON1在体内鼠TNBC 4T1的原位小鼠模型中更有效。图6C示出了所有小鼠在L-ICON1和L-ICON3治疗之后存活下来，而所有对照小鼠在开始瘤内注射腺病毒载体之后的第11天死亡。图6B至图6C中每组有5只小鼠。

图7示出了L-ICON3能有效地治疗CB-17SCID小鼠的原位患者源性异种移植物(PDX)小鼠模型中的患者的TNBC。在第0天通过以下方式生成原位TNBC PDX模型：将含BRCA-1突变的TNBC PDX从供体NSG小鼠(NOD SCID gamma)(杰克逊实验室(JacksonLaboratory)，JAX TM00089，乳腺肿瘤标志物：TNBC ER-/PR-/HER2-、BRCA1 V757fs)移植到4周龄雌性CB-17SCID(Taconic Farms公司)的左侧第四乳腺脂肪垫中。当肿瘤达到130mm³的平均体积(第9天)时，将这些小鼠随机分为对照组和L-ICON3组(每组中n＝5)，并且分别用AdBlank(对照载体)和AdL-ICON3腺病毒载体的1×10¹⁰个病毒颗粒(VP)进行瘤内(i.t.)注射。在第13、17和20天进行额外i.t.注射。用卡尺以毫米(mm)为单位测量肿瘤宽度(W)和长度(L)并且使用公式(W)²×L/2(mm³)计算肿瘤体积(mm³)，以此确定治疗功效。数据以平均值±SEM呈现，并且使用Prism软件(GraphPad公司)通过统计显著性的t检验进行分析。

通过使用对L-ICON1和L-ICON3具有特异性的引物进行PCR，图8A和图8B示出了L-ICON3插入片段cDNA在制作血清型9腺相关病毒(AAV9)之前的质粒DNA(pAAV-CMV)中以及在完整AAV9病毒载体(AAV9-L-ICON3)中以正确大小存在。M：以千碱基(Kb)为单位的DNA梯状条带。eGFP：作为阴性对照载体的增强型绿色荧光蛋白。

图9示出了经由AAV9-L-ICON3(n＝5)的单次静脉内注射的L-ICON3疗法能有效地治疗原位小鼠模型中的患者的TNBC PDX，如图7所述。AAV9-eGFP是阴性对照载体(n＝2)。

图10A至图10B示出了由因子VII人源比色法活性检测确定的L-ICON1和ICON的促凝活性。fVII的活性形式(FVIIa)(American Diagnostica公司)作为阳性凝血对照；FVIIa-FFR：活性位点受抑制的FVIIa(American Diagnostica公司)作为凝血非活性对照。表1中也列出了它们的凝血活性。代表性数据以来自两个独立实验的平均值±SEM呈现。图10A至图10B示出了L-ICON1没有可检测的促凝活性，而ICON具有FVIIa(100％)的约5-6％促凝活性。图10表明用非凝血轻链修饰ICON从L-ICON1和L-ICON3完全去除了促凝活性。

图11是血管生成依赖性人疾病以及巨噬细胞相关人疾病中组织因子的选择性表达的流程图示例。

具体实施方式

定义

本文所用的冠词“一个”和“一种”是指冠词的语法对象中的一个或超过一个(即，至少一个)。以举例的方式，“元素”意指一个元素或超过一个元素。

如本文所用，“约”在涉及可测量的值(诸如，量、时距等)时，旨在涵盖偏离指定值的+-20％或+-10％，更优选地+-5％，甚至更优选地+-1％，并且还更优选地+-0.1％的变化，因为此类变化对于执行所公开的方法是合适的。

“预防性”治疗是向不表现出疾病病征或仅表现出疾病的早期病征的受试者施用以用于降低发展病变的风险的目的的治疗。本发明的化合物可作为预防性治疗给予，以减少发展病变的可能性或如果发展则使病变的严重性最小化。

“治疗性”治疗是向表现出病变的病征或症状的受试者施用，以用于减少或消除那些病征或症状的目的的治疗。病征或症状可以是生物化学、细胞、组织学、功能性、主观或客观的。

多肽的“片段”是指比全长多肽或蛋白质表达产物小的多肽的任何部分。在一个方面，片段是全长多肽的缺失类似物，其中一个或多个氨基酸残基已从全长多肽的氨基末端和/或羧基末端移除。因此，“片段”是下文所述的缺失类似物的子集。

可互换使用的“类似物”或“衍生物”是指与天然存在的分子在结构上基本上类似且具有相同生物活性(尽管在某些情况下程度有所不同)的化合物，例如肽或多肽。基于涉及以下方面的一个或多个突变，类似物具有与衍生该类似物的天然存在的多肽相比不同的氨基酸序列组成：(i)多肽的一个或多个末端和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域处缺失一个或多个氨基酸残基、(ii)多肽的一个或多个末端(通常为“添加”类似物)和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域(通常为“插入”类似物)处插入或添加一个或多个氨基酸、或(iii)天然存在的多肽序列中的一个或多个氨基酸置换为其他氨基酸。

当在生物体、组织、细胞或其组分的上下文中使用时，术语“异常”是指与显示“正常”(预期)相应特性的那些生物体、组织、细胞或其组分在至少一个可观察或可检测特征方面(例如，年龄、治疗、当日时间等)不同的那些生物体、组织、细胞或其组分。对于一个细胞或组织类型是正常或预期的特征对于不同的细胞或组织类型可能是异常的。

如本文所用，“减轻”疾病意指降低疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重性。

“核酸”是指多核苷酸并且包括多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸。根据本发明的核酸可包括嘧啶和嘌呤碱基(优选地分别为胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以及腺嘌呤和鸟嘌呤)的任何聚合物或低聚物。(参见Albert L.Lehninger，Principles of Biochemistry(《生物化学原理》)，第793-800页(沃斯出版公司(Worth Pub.)，1982年)，该文献全文并入本文以用于所有目的)。实际上，本发明设想了任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分以及它们的任何化学变体，诸如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。这些聚合物或低聚物在组成上可为异质或均质的，并且可从天然存在的来源分离或可通过人工的方式或合成的方式产生。另外，这些核酸可为DNA或RNA或它们的混合物，并且可以以单链或双链形式(包括同源双链体、异源双链体和杂合状态)永久或短暂存在。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两种氨基酸，并且不限于能够包含蛋白质序列或肽序列的最大氨基酸数。多肽包括任何肽或蛋白质，其包含通过肽键彼此接合的两个或更多个氨基酸。如本文所用，术语是指短链，其也通常在本领域中被称为例如肽、低聚肽和低聚物，并且指长链，其一般在本领域中被称为蛋白质，所述蛋白质具有许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源多肽、低聚肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽、或它们的组合。

如本文所用，“多核苷酸”包括cDNA、RNA、DNA/RNA杂合体、反义RNA、小发夹RNA(shRNA)、核酶、基因组DNA、合成形式和混合聚合物、正义和反义链两者，并且可经过化学或生物化学修饰而包含非天然或衍生、合成或半合成核苷酸碱基。另外，设想了野生型或合成基因的改变，包括但不限于一个或多个核苷酸的缺失、插入、置换或与其他多核苷酸序列的融合。

如本文所用，术语“诊断”是指确定疾病或病症的存在。在本发明的一些实施方案中，提供了用于作出诊断的方法，所述方法允许确定特定疾病或病症的存在。

“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则受试者的健康持续恶化。相比之下，受试者的“病症”是其中受试者能够维持体内平衡，但其中受试者的健康状态比其没有病症时可能的健康状态较不利的健康状态。如果不及时治疗，病症并不一定会导致受试者的健康状态进一步下降。

如本文所用，术语“疗法”或“治疗方案”是指用于减轻或改变病症或疾病状态的那些活性物质，例如旨使用药理学、外科、饮食和/或其他技术减少或消除疾病或病症的至少一种病征或症状的治疗过程。治疗方案可包括一种或多种药物或手术的处方剂量。治疗将通常是有益的并且减少或消除病症或疾病状态的至少一种病征或症状，但在一些情况下，疗法的效果将具有不可取的作用或副作用。疗法的效果还将受到受试者的生理状态的影响，例如，年龄、性别、遗传、体重、其他疾病状况等。使用本文所公开的组合物进行的本文所公开的治疗能够用作独立的疗法或与手术、放疗、化疗、其他形式的免疫治疗(包括但不限于免疫检查点阻断、CAR-NK和-T细胞、细胞因子、自然杀伤细胞、光动力学疗法等)联用。

术语“治疗有效量”是指将引起正在被研究人员、兽医、医师或其他临床医生寻找的组织、系统或受试者的生物或医学响应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时，足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种病征或症状发展或在一定程度上减轻的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重性和待治疗的受试者的年龄、体重等而有所不同。

“治疗”疾病作为术语用于本文，意指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重性。

除非特别指明，否则如本文所用，术语“细胞”还指单个细胞、细胞系、原代培养物或来源于此类细胞的培养物。“培养物”是指包含相同或不同类型的分离细胞的组合物。细胞系是一种特定类型的细胞的培养物，其能够无限期地复制，因此使得细胞系“永生”。细胞培养物能够为诸如琼脂的培养基上生长的细胞群。原代细胞培养物是来自细胞或直接取自活生物体的培养物，其不是永生的。

术语“生物样品”是指组织(例如，组织活检)、器官、细胞(包括保持在培养物中的细胞)、细胞裂解物(或裂解物级分)、来源于细胞或细胞物质的生物分子(例如，多肽或核酸)或来自受试者的体液。体液的非限制性示例包括血液、尿液、血浆、血清、泪液、淋巴液、胆汁、脑脊液、间质液、水性或玻璃体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、精液、渗出液、流出物和滑液。

范围：在整个本公开中，本发明的各个方面能够以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当理解为对本发明范围的不可改变的限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，应当认为范围诸如1至6的描述已经具体地公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围宽度如何，这都适用。

根据本文教导的方法，向受试者施用有效量的试剂。术语有效量和有效剂量可互换使用。术语有效量被定义为产生期望的生理应答所需的任何量。用于施用试剂的有效量和时间表可凭经验确定，并且进行此类测定在本领域技术的范围内。用于施用的剂量范围为足够大以产生影响(例如，减少或延迟)疾病或病症的一种或多种症状的期望效果的那些。剂量不应大到引起显著不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随年龄、状况、性别、疾病类型、疾病或病症的程度、给药途径或该方案中是否包括其他药物而变化，并且能够由本领域技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，个体医师能够调整剂量。剂量能够变化，并且能够在一天或几天内每天施用一次或多次剂量施用。对于给定类别的药物产品，能够在文献中找到关于适当剂量的指导。

如本文所用，术语“治疗”(treatment、treat或treating)是指减少疾病或病症的作用或者疾病或病症的症状的方法。因此，在所公开的方法中，治疗能够是指已造成的疾病或病症的严重性或者该疾病或病症的症状减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，与对照相比，如果受试者的疾病的一种或多种症状减少10％，则治疗病症的方法被认为是治疗。因此，与天然或对照水平相比，减少能够是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或在10％和100％之间的任何百分比的减少。应当理解，治疗不一定是指治愈或完全消除疾病、病症、或者该疾病或病症的症状。

如本文所用，术语“预防(prevent、preventing和prevention)疾病或病症”是指在受试者开始表现出疾病或病症的一种或多种症状之前或几乎在受试者开始表现出疾病或病症的一种或多种症状的同一时间发生的动作，例如，施用治疗剂，该动作抑制或延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或恶化。如本文所用，提及降低、减少或抑制包括与对照水平相比，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的变化。此类术语能够包括但不一定包括完全消除。

概述

此前已报道了靶向表达TF的血管生成血管内皮细胞(VEC)和癌细胞的第一代试剂。第一代称为免疫缀合物试剂(Immuno-Conjugate agent，被命名为ICON)，其由融合到IgG1的Fc区的含K341A突变的鼠或人因子VII(1-406aa，组织因子的天然配体)组成(图1A)(Hu等人，1999年，美国专利申请2005/0214298，该专利申请全文以引用方式并入本文)。经由第341位赖氨酸残基的靶向性突变(K341A)显著消除了ICON编码的酶原因子VII的促凝作用(Hu等人，2001年)。能够经由重组蛋白的静脉内注射或腺病毒载体的病灶内注射来施用ICON。实验性黑色素瘤、前列腺和头颈部肿瘤的病灶内ICON免疫治疗引起了显著的肿瘤抑制，并且在一些情况下完全根除而不影响正常组织(Hu等人，《BMC免疫学》(BMCImmunology)，2010年；Hu等人，《美国国家科学院院刊》(PNAS)，2000年)。在结合于表达TF的癌细胞后，ICON能够介导自然杀伤细胞(NK)细胞依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)作为其作用机制。为了实现靶向TF的PDT，Hu等人将单体fVII肽与光敏剂(PS)维替泊芬(VP)和Sn(IV)二氢卟吩e6(SnCe6)缀合在一起(分别称为fVII-VP和fVII-SnCe6)并证实靶向fVII的PDT在体外和体内人乳腺的小鼠模型中可选择性且有效地杀伤血管生成血管内皮细胞和癌细胞(Duanmu等人，2011年；Hu等人，《BMC癌症》(BMC Cancer)，2010年；Hu等人，2011年)和肺癌(Cheng等人，2011年)。

ICON具有相对较大的分子量(210kDa)，这能够限制其渗透到肿瘤组织中的能力。为了使ICON的分子量(MW)更小且对于免疫治疗更安全(去除其凝血活性)，设计了第二代ICON(本文中称为L-ICON1(基因库登记号KX760097))，其仅由融合到IgG1Fc的fVII轻链(1-152aa)组成(图1a)。L-ICON1的分子量为约100kDa(为了更好地渗透到肿瘤微环境中)，该分子量仅是IgG1抗体的分子量的三分之二并且相比于ICON减小超过50％(图1b)；L-ICON1没有任何凝血活性(在体内更安全)(图7和表1)，而在凝血活性位点含有突变(K341A)的第一代ICON仍然保留FVIIa的5％凝血活性(图7和表1)。L-ICON1相比于ICON更有效地治疗原位小鼠模型中的三阴性乳腺癌。

本文公开了第三代靶向TF的ICON蛋白(ICON)(本文中称为L-ICON3和ICON3)，其中因子VII(fVII)轻链或含K341A的全长fVII通过重组DNA技术融合到IgG3 Fc(图1a)。图1中显示，第三代L-ICON3和第二代L-ICON1对表达组织因子(TF)的细胞(诸如癌细胞)具有类似的结合活性，但L-ICON3相比于第二代L-ICON1能够在体外引发对癌细胞的更强ADCC细胞毒作用。

本文公开了SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其表示L-ICON3。还公开了SEQ ID NO:1，其是编码L-ICON3的核酸。

本文公开了SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其表示ICON3。还公开了SEQ ID NO:4，其是编码ICON3的核酸。

人IgG3在所有IgG亚类中表现出最强的效应子功能，但具有短半衰期，原因不明。IgG3结合于IgG-补救受体(FcRn)，但在存在IgG1的情况下FcRn介导的IgG3转运和挽救会由于IgG1和IgG3之间的细胞内竞争而受到抑制。已证实之所以发生这种现象是因为第435位的单个氨基酸差异，在该位置，IgG3具有精氨酸而不是所有其他IgG亚类中发现的组氨酸。因此，为了在体内增加血液循环中的L-ICON3蛋白的半衰期，能够通过定点诱变程序向L-ICON3的IgG3 Fc结构域引入R435H突变。(Kim等人，1999年；Stapleton等人，2011年)。

重要的是要注意，L-ICON3的因子VII轻链与组织因子的结合不会引起弥散性血管内凝血。因此L-ICON3不会引发血液凝结(与L-ICON1中的fVII轻链类似；参见图7和表1)。

能够向对其有需要的受试者施用所有第三(L-ICON3和ICON3)和第四(L-ICON4和ICON4)ICON。施用可为局部或全身的，具体取决于该疗法涉及到的病理状况的类型。施用能够经由本领域已知的任何方法进行，诸如例如静脉内、肌内、瘤内、皮下、滑膜内、眼内、斑块内或皮内注射纯化的重组免疫缀合物蛋白或复制缺陷型腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)或其他携带编码免疫缀合物分泌形式的cDNA的病毒载体。

靶向TF的ICON能够用作独立的疗法并可与手术、放疗、化疗、其他治疗性抗体、抗体-药物缀合物、免疫检查点阻断、嵌合抗原受体(CAR)-T和NK细胞、树突细胞、疫苗、溶瘤病毒、细胞因子和/或去除免疫抑制细胞如髓源性抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)等联用。组合免疫治疗能够靶向一些或所有主要肿瘤腔隙(包括但不限于癌细胞、肿瘤新生血管、癌干细胞、MDSC、Treg和TAM)上的不同分子，或在理想情况下靶向由这些主要肿瘤腔隙共同表达的相同分子。

其他施用途径能够为流体的肠胃外施用等。能够通过以下方式治疗受试者：静脉内或瘤内注射或在其他位点注射一种或多种免疫缀合物蛋白，或者静脉内或瘤内注射或在其他位点注射携带编码一种或多种免疫缀合物蛋白的分泌形式的cDNA的一个或多个表达载体。在一些实施方案中，能够通过以下方式治疗受试者：静脉内或瘤内注射有效量的一个或多个复制缺陷型腺病毒载体、或携带编码一类或多类免疫缀合物蛋白的分泌形式的cDNA的一个或多个腺相关载体。许多典型实施方案涉及瘤内和/或肌内注射有效量的编码免疫缀合物分泌形式的载体。

实现治疗性治疗所必需的L-ICON3的量本身不是固定的，并且必定取决于与药物载体联合施用的组合物中的成分的浓度、所施用的组合物中增强免疫系统反应的辅助性化合物(下文将更全面地说明)以及待治疗的患者的年龄、体重和临床状况。优选的组合物以有效量递送一种或多种免疫缀合物而不会对患者产生不可接受的毒性。

本发明的药物组合物或制剂还可包含其他载体、辅助剂、稳定剂、防腐剂、分散剂以及与所讨论的制剂类型有关的其他本领域常规试剂。

当应用于癌时，本发明采用免疫缀合物，这些免疫缀合物具有特异性地靶向人肿瘤细胞、CSC或肿瘤血管内皮细胞或所有三种肿瘤腔隙的靶向结构域，以及激活针对靶细胞的细胞溶解性免疫反应或细胞毒作用的效应子结构域。

在癌治疗中，抗肿瘤免疫缀合物用于治疗并预防多种癌(实体癌、白血病和淋巴瘤)，特别是原发性或转移性实体瘤，包括黑色素瘤、肾、前列腺、乳腺、卵巢、脑、神经母细胞瘤、头颈部、胰腺、膀胱和肺癌。免疫缀合物可用于靶向肿瘤血管，特别是血管内皮细胞、CSC和/或肿瘤细胞。肿瘤血管为免疫治疗提供如下若干优点。(i)一些血管靶标(包括组织因子)对于所有肿瘤应是相同的。(ii)靶向血管的免疫缀合物不必浸润肿瘤团块就能到达其靶标。(iii)靶向肿瘤血管应产生放大的治疗反应，因为每根血管滋养许多肿瘤细胞，这些肿瘤细胞的活力取决于血管的功能完整性。(iv)血管不可能对免疫缀合物形成抗性，因为这将需要对血管内壁的整个内皮层进行修饰。与此前所述抑制新血管生长的抗血管生成方法不同，L-ICON3能够引发对新生血管的细胞溶解反应。应当注意，本文所公开的组合物能够特异性地治疗转移癌，或能够预防癌转移。

L-ICON3还能够有效地治疗患有类风湿性关节炎、渗出性(“湿性”)黄斑变性、子宫内膜异位、病毒感染、动脉粥样硬化、血栓形成以及与新生血管相关的其他疾病的患者。

在一个实施方案中，光敏剂或药物能够偶联到L-ICON3以用于靶向TF的光动力学疗法(PDT)或抗体-药物缀合物(ADC)疗法。能够缀合到靶向分子的光敏剂包括光动力学染料。该染料在暴露于适当类型的放射(例如，一定波长(通常在约630nm和约750nm之间)的光)之后应能够引起靶组织损伤。能够使用多种可用光动力学染料中的任何一种，诸如美国专利号6,693,093和6,443,976所述的那些，这些光动力学染料包括血卟啉，包括其衍生物，诸如二血卟啉醚以及血卟啉的二聚体和三聚体(其示例描述于美国专利号4,968,715和5,190,966中)及对其所作的改善，后者的示例描述于美国专利号5,028,621、4,866,168、4,649,151和5,438,071中；作为光动力学化合物来源的氨基酮戊酸(血卟啉的前体)，如美国专利号5,079,262中描述和举例说明；卟啉，包括硼化卟啉、苯并卟啉及其衍生物，如由美国专利号4,883,790、4,920,143、5,095,030和5,171,749所述的绿卟啉进一步举例说明；部花青；卟啉烯；卟吩姆钠；维替泊芬(Vysudine^TM，视康公司(CIBA Vision))；Photofrin II^TM；PH-10^TM；二氢卟吩，如由内消旋-四(羟基苯基)-二氢卟吩和细菌二氢卟吩举例说明，后者在美国专利号5,171,741、5,173,504中举例说明；酞菁锌，如美国专利号5,166,197所述；红紫素，诸如锡乙基初红紫素(SnET2^TM，Miravant公司)；脱镁叶绿酸盐，其示例描述于美国专利号5,198,460、5,002,962和5,093,349中；和上述每一者的单克隆抗体-染料缀合物，以及任选地上述任何一者或全部的混合物。

虽然上文具体参照化合物进行了描述，但也能够利用活性化合物的对映异构体、立体异构体、代谢物、衍生物和盐。用于合成这些化合物的方法是本领域技术人员已知的。药学上可接受的盐的示例包括但不限于碱性残基(诸如胺)的无机或有机酸盐以及酸性残基(诸如羧酸)的碱式盐或有机盐。药学上可接受的盐包括例如由非毒性无机或有机酸形成的母体化合物的常规非毒性盐或季铵盐。常规非毒性盐包括衍生自无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸的那些；以及由有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸和羟乙磺酸制备的盐。药学上可接受的盐能够通过常规化学方法由包含碱性或酸性部分的母体化合物来合成。一般来讲，此类盐能够通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当碱或酸在水或有机溶剂中或这两者的混合物中反应来制备；一般来讲，非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适盐的列表可见于《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)第17版(麦克出版公司(Mack PublishingCompany)，宾夕法尼亚州伊斯顿，1985年，第1418页)。

前药是在体内释放活性母体药物的共价键合的物质。前药通过以一定方式修饰化合物中存在的官能团来制备，使得修饰产物在常规操作中或在体内裂解而产生母体化合物。前药包括其中羟基或氨基基团键合到任何基团的化合物，当向哺乳动物受试者施用前药时，该羟基或氨基基团分别裂解形成游离羟基或游离氨基。前药的示例包括但不限于醇和胺官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物。

还设想了可对如SEQ ID NO:2表示的L-ICON3进行额外修饰。例如，能够制备表现出与未经修饰的型式相当的至少一种功能活性的经修饰的L-ICON3，但是经修饰的蛋白或多肽具有优于未经修饰的型式的额外优点，诸如生产起来更便宜，引起更少副作用和/或具有更好或更长的功效或生物利用率。

经修饰的L-ICON3能够具有氨基酸的缺失和/或置换；因此，具有缺失的蛋白、具有置换的蛋白以及具有缺失和置换的蛋白是经修饰的蛋白。在一些实施方案中，这些经修饰的蛋白还可包含插入或添加的氨基酸，例如诸如采用融合蛋白或具有接头的蛋白。

置换或替换变体通常包含多肽内的一个或多个位点处一个氨基酸交换为另一个氨基酸，并且可被设计为调节多肽的一种或多种特性，特别是其效应子功能和/或生物利用率。上文详述了这些实施方案的嵌合多肽中的某些特定氨基酸交换。另外的置换可能是或可能不是保守的，即，一个氨基酸被替换为类似形状和电荷的氨基酸。保守置换是本领域熟知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。

除了缺失或置换之外，经修饰的多肽还可具有残基插入，这通常涉及在多肽中添加至少一个残基。这可包括插入靶向多肽或简单地插入单个残基。下文将讨论末端添加(称为融合蛋白)。

还应当理解，氨基酸和核酸序列可包含额外残基，诸如额外N端或C端氨基酸或者5'或3'序列，但仍基本上如本文所公开的序列之一中示出的那样，只要该序列满足上文所示出的标准即可，包括在涉及蛋白表达的地方保留生物蛋白活性。添加末端序列特别适用于这样的核酸序列，其可例如包括在编码区的5'或3’部分任一者的旁侧的各种非编码序列，或可包括已知会在基因内出现的各种内部序列，即，内含子。

实施例

实施例1：L-ICON3和ICON3

如图1a所示，第三代(第3GEN)ICON(即L-ICON3和ICON3)由融合到人IgG3 Fc结构域的fVII轻链(1-152aa)或全长(含K341A突变的406aa)构成。L-ICON3(SEQ ID NO:1)和ICON3(SEQ ID NO:3)的mRNA序列已被保藏到基因库(分别为登记号KY223609和KY223610)。

L-ICON3和ICON3的分子量(MW)

L-ICON3肽的单体包含419个氨基酸残基(SEQ ID NO:2)。单体L-ICON3蛋白重量为47千道尔顿。二聚L-ICON3的估计的分子量为94kDa。SDS-PAGE中L-ICON3的实际分子量为约100kDa(图1b)。使用检测用抗人IgG抗体进行蛋白印迹，进一步验证L-ICON3中的Fc部分(图1c)。

ICON3肽的单体包含从“MVSQALRLLC”开始的673个残基(SEQ ID NO:4)。估计的单体ICON3蛋白重量为75kDa。

亲和纯化L-ICON3和ICON3的方法

为了建立亲和纯化L-ICON3和ICON3的方法，执行了免疫沉淀蛋白印迹(IP-WB)。图2中的结果表明，L-ICON3蛋白仅可由蛋白G亲和柱纯化，而L-ICON1可由蛋白A和蛋白G亲和柱纯化。类似地，ICON3能够由蛋白G亲和柱纯化。

L-ICON3蛋白对人和鼠癌细胞的结合活性

在使用TF高表达的人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行的癌细胞ELISA中，将L-ICON3的结合活性与L-ICON1的结合活性进行比较。图3a中的结果表明，L-ICON3和L-ICON1可等效地结合于MDA-MB-231细胞(ns，不显著)。癌细胞ELISA结果进一步表明，L-ICON3可结合人TNBC(图3a和图3b中的MDA-MB-231)、黑色素瘤(图3c中的SK-Mel-28)和卵巢癌(图3d中的OVCAR5)以及两种极强侵袭性的鼠癌细胞系，包括鼠TNBC(图3e中的4T1)和黑色素瘤(图3f中的B16F10)。

杀伤癌细胞的L-ICON3依赖性ADCC和CDC作用

图4a中的结果表明，L-ICON3蛋白可引发ADCC来杀伤靶癌细胞(人卵巢癌OVCAR5细胞)。实际上，L-ICON3依赖性ADCC相比于第2GEN ICON(L-ICON1)确实具有更强的作用(图4a)。图4b中的结果表明，L-ICON3能够引发补体依赖性细胞毒作用来杀伤靶癌细胞(MDA-MB-231细胞)并且该作用类似于L-ICON1(ns：不显著)。

实施例2：具有治疗血管生成依赖性人疾病以及巨噬细胞相关人疾病的潜能的、抗 组织因子的治疗性抗体样免疫缀合物

组织因子(TF)是47-kDa膜结合细胞表面受体(1-3)。它也称为凝血活酶、凝血因子III或CD142。在生理状况下，循环外周血淋巴细胞(PBL)和静息态血管内皮细胞不会表达TF。TF表达仅限于不与血液直接接触的细胞，诸如定位在内皮下血管壁中的周细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞，并且与循环凝血因子VII(fVII)隔离。在这些细胞中，大部分TF定位在细胞内池中(4)。在血管壁完整性被破坏后，周细胞和平滑肌细胞中的TF被释放并且能够与从血液循环中泄漏的fVII结合，从而引发凝血以便止血(5,6)。除了其作为主要凝血引发剂的作用之外，TF还是病理性血管生成的调节剂(7-9)。

血管生成(即，从既有血管形成新毛细血管)涉及到这两种生理状况(诸如再生和组织修复)以及超过20种人疾病(10)，包括但不限于癌(10,11)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、子宫内膜异位和类风湿性关节炎(RA)(12-14)。在癌中，血管生成由Hanahan和Weinberg(15,16)确定为“癌的标志”之一，这是由于已公认的是该过程在良性增生性结节向恶性病灶转变期间至关重要(11)。鉴定对血管生成血管内皮细胞(即，病理性新生血管的内层)具有特异性的靶分子对于发现和开发这些血管生成依赖性常见人疾病的新生血管靶向疗法十分关键。

癌、年龄相关性黄斑变性和子宫内膜异位的病理性新生血管中的组织因子

血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成依赖性癌和非恶性人疾病(17)诸如黄斑变性(18)、类风湿性关节炎(19)和子宫内膜异位(20)中起着中心作用。具体地讲，VEGF通过结合于这些血管生成依赖性疾病的病理性新生血管(通常为微血管或毛细血管)中VEC上的VEGR受体来刺激血管生成。此前已知VEGF能够诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(血管生成研究中的一种常用VEC模型)上的TF表达。应当注意，虽然VEGF受体以相对较高水平表达于肿瘤VEC上，但它们也由正常VEC表达(21)，这表明VEGF受体对新生血管内皮细胞没有特异性。为了更好地模拟病理性血管生成，理想的血管生成VEC模型应得自微血管或毛细血管。通过使用血管内皮生长因子诱导的体外血管生成血管内皮模型，报道了与VEGFR不同，TF是血管生成特异性受体并且是使用fVII-IgG1Fc免疫缀合物(被命名为下文所讨论的ICON)的靶向因子VII(fVII)的免疫治疗以及使用fVII缀合的光敏剂的光动力学疗法的靶标(22)。另外，TF也是体内唯一病理性血管生成内皮细胞表面受体，这是因为其在体内选择性表达于从动物模型到患者的肿瘤血管(7,23-27)、眼部(12)和异位子宫内膜(14)新生血管中的血管生成VEC。

癌的病理性新生血管中的组织因子

Contrino等人于1996年首次在7名乳腺癌患者的原发性肿瘤组织中报道了肿瘤血管内皮细胞上的TF表达(23)。重要的是，他们还报道了未在相邻乳腺组织的正常血管内皮细胞中检测到TF表达。Hu和Garen独立地报道了TF在体外和体内选择性地表达于人黑色素瘤异种移植物的肿瘤新生血管中(24,28)。文献进一步显示，TF在人肺(26)和化疗耐药性乳腺(27)肿瘤异种移植物中的肿瘤血管内皮细胞上特异性地表达，但不在小鼠脑、肺和脾中的静息血管内皮细胞上表达(26)。

年龄相关性黄斑变性的新生血管中的组织因子

年龄相关性黄斑变性(AMD)是导致发达国家和发展中国家中的老年人群(年龄为55及以上)失明的主要原因。中心视力严重丧失常常随渗出性(湿性)AMD发生，这是由于形成了会损伤视网膜黄斑区的病理性脉络膜新生血管(CNV)。在其在路易维尔大学(University of Louisville)任职期间与卡普兰实验室(Kaplan laboratory)合作下，Bora,Hu等人于2003年报道了猪模型中CNV膜的内皮细胞选择性地表达TF(12)，而正常视网膜血管内皮不表达TF。正常脉络膜内皮也不表达TF(12)。在另一项研究中，Grossniklaus等人在取自年龄在27至84岁范围内的七名女性和三名男性的10份手术切除的中心凹下CNV标本中以及在取自年龄在74至99岁范围内的四名女性和六名男性的10只带中心凹下CNV的眼库眼中对VEGF和TF表达进行了免疫染色。他们发现，VEGF在巨噬细胞中程度不一地表达并且在视网膜色素上皮(RPE)中强表达，视网膜色素上皮是死后眼睛和手术标本两者中的CNV的主要组分。VEGF也在成纤维细胞和光感受器中表达。TF在巨噬细胞中强表达，并且在RPE中程度不一地表达。与炎症非活性的手术切除CNV相比，炎症活性的手术切除CNV中的VEGF和TF的染色更强(29)。

子宫内膜异位的新生血管中的组织因子

子宫内膜异位是以子宫内膜组织(即，子宫内层)存在于子宫外部为特征的妇科病症。子宫内膜病灶主要位于盆腔腹膜和卵巢上，但也能够位于心包、胸膜、肺、甚至脑中。该疾病影响多达10％的所有育龄期妇女并且在不孕妇女中盛行率升高到20–50％。洛克伍德博士实验室(Dr.Lockwood laboratory)已广泛检查了子宫内膜异位中的TF表达(30-33)。在正常子宫内膜中，TF表达仅限于分泌期的基质细胞，腺上皮中的表达低得多。然而，在子宫内膜异位中，TF在腺上皮和基质细胞两者中大幅过表达。有趣的是，在异位子宫内膜组织中的巨噬细胞上观察到最强的TF免疫染色。2010年，在与洛克伍德团队合作下，Krikun,Hu等人报道了异位子宫内膜病灶中的内皮细胞高度表达TF(14)，而在患者的在位增生期子宫内膜中的腺细胞、基质细胞、内皮细胞和血管壁上未检测到TF(14)。

癌中的组织因子表达

实体癌、白血病和肉瘤的癌细胞上的组织因子表达

除了其在肿瘤新生血管上的表达之外，TF还在许多类型实体癌(34-36)和白血病(AML和ALL)(36)的癌细胞上高表达。例如，在80％-100％乳腺癌患者、40％-80％肺癌患者和84％卵巢癌患者的癌细胞上检测到TF表达(36)。与乳腺、肺和卵巢癌类似，TF也以高百分比表达于许多其他人实体癌中(36,37)，例如原发性黑色素瘤中表达率为95％且转移性黑色素瘤中表达率为100％，胰腺癌中表达率为53％-90％，结肠直肠癌中表达率为57％-100％，肝细胞癌中表达率为63％-100％，原发性和转移性前列腺癌中表达率为60％-78％，并且神经胶质瘤中表达率为47％-75％。

白血病是起源于骨髓并浸润外周血且通常还浸润脾、肝和淋巴结的造血组织的恶性肿瘤。急性白血病(包括AML和ALL)以未成熟细胞或原始细胞的增殖为特征。如果未经治疗，大多数情况下通常会在6个月内发生死亡。ALL是最常见的儿童恶性肿瘤和第二最常见的成人白血病，并且AML是第二最常见的儿童恶性肿瘤。据报道，TF表达于人白血病HL-60(38-42)、Molt-4(43)、THP-1(43)细胞系上，并且表达于AML(38,44-48)和ALL(39,49)患者的白血病细胞上。除非受到内毒素或其他细胞因子刺激，TF不表达于正常外周单核细胞上(41)，也不表达于髓样前体细胞上(45)。在白血病患者的血浆中(39,49)以及在HL-60培养基中(39)也检测到TF。

在肉瘤中，在小鼠Meth-A肉瘤细胞(50)、大鼠骨肉瘤细胞(51)和血管源性卡波西肉瘤(52)上也检测到TF表达。仍然在研究TF是否表达于人肉瘤中。

癌干细胞上的组织因子表达

除了癌细胞和肿瘤新生血管之外，癌干细胞(CSC)也是肿瘤微环境中的重要肿瘤腔隙。CSC促成了肿瘤血管生成、对多种疗法的抗性(53,54)以及转移(53,55,56)。靶向CSC疗法能够从根源上治疗癌，并且可克服药物抗性、复发和转移。已证实，TF也表达于CD133+和CD24-CD44+癌起始干细胞上，并且TF能够用作从人癌细胞系(诸如乳腺、肺、卵巢、头颈部癌)、肿瘤异种移植物和乳腺癌患者分离的CSC的新型肿瘤靶标。此外，靶向TF的免疫治疗剂ICON能够根除CSC而不出现药物抗性(37)。

综合起来，似乎TF是癌细胞、肿瘤新生血管和癌干细胞的共同而又有选择性的癌治疗靶标，并且TF靶向疗法代表能够选择性且有效地靶向并消除这三种主要肿瘤腔隙的新型治疗方法。这些发现可解释ICON效果显著而不出现复发和药物抗性的观察结果，即完全根除人和鼠前列腺、黑色素瘤和头颈部癌小鼠模型中明确的原发性肿瘤(多达600mm³)和转移(25,28,57)。

类风湿性关节炎中的组织因子

类风湿性关节炎(RA)是一种病因不明的慢性、通常进行性的全身性炎性病症。其特征在于向滑膜组织中的单核细胞浸润(T细胞、B细胞、浆细胞和巨噬细胞)以及外周关节的对称性、侵蚀性关节炎，但其也可引起全身表现。肿瘤坏死因子α(TNFα)在RA发病机制中起着重要作用(58)。

患关节炎的关节中的TF表达

Busso等人(59)对取自10名RA患者的滑膜组织标本进行了免疫组织化学染色，并且报道了在成纤维细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞中检测到TF表达，但未在内皮细胞中检测到TF表达。Chen等人(60)观察到了Ki-67阳性滑膜细胞、B细胞和内皮细胞上的TF表达。与RA中的内皮细胞上的TF表达有关的有争议的结果可能是由于评估TF表达的时间点的原因。已证实，内皮细胞(HMVEC和HUVEC)上的TNFα对TF的诱导是短暂的，峰值出现在与TNFα一起温育后的4-6小时。因此，似乎在促炎细胞因子和生长因子受到刺激后，内皮细胞在RA早期(急性期)表达TF，并且然后内皮TF表达可在RA后期(慢性期)降低或甚至消失。因此，RA中的巨噬细胞、B细胞、Ki-67阳性滑膜细胞和血管生成VEC表达了TF。

RA中的血管生成和血管生成内皮TF。RA还与血管生成相关，血管生成实现了白细胞跨内皮迁移到发炎滑膜组织中(10,61-70)。RA滑膜中有许多血管生成介质(诸如TNFα和VEGF)和内源性抑制剂，它们在关节炎中失衡而造成增加的毛细血管形成。具体地讲，血管内皮细胞(VEC)参与滑膜炎症相关的多种机制(71)。血管生成VEC在RA发生和进展期间负责增加血管通透性、白细胞血管渗出(炎症的关键特征)并分泌许多炎症介质。并且已测试了抗血管生成对治疗RA的效果(61)。许多促炎细胞因子和生长因子(诸如TNFα、IL-1和VEGF)是在VEC上诱导TF的已知刺激物(72)。因此血管生成VEC能够用作RA的TF靶向疗法的靶标。

RA中表达TF的巨噬细胞。研究已充分证实，巨噬细胞在RA发生和进展中起着若干作用。第一，巨噬细胞能够用作抗原递呈细胞之一以异常地递呈自身抗原，从而引起自身反应性T细胞的活化。第二，巨噬细胞产生并分泌促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和酶，诸如TNFα、IL-1、IL-6、IL-18、IL-15和IL-32，以进一步活化其他细胞，从而促成疾病进展。第三，巨噬细胞刺激滑膜细胞释放诸如胶原酶和蛋白酶的酶，这可引起软骨和骨损伤。靶向巨噬细胞代表治疗RA的新型治疗方法。研究已证实，类风湿性关节炎滑膜中的巨噬细胞表达了TF(59,60)。重要的是，未受刺激的单核细胞不能正常表达TF(73,74)，但包括细菌LPS(75)、TNFα(76)和IL-1(77)在内的炎症介质能够在单核细胞上诱导TF。

RA中表达TF的成纤维细胞。研究证实，TF表达于人成纤维细胞系(78,79)和人胚胎成纤维细胞(80)上。滑膜成纤维细胞经由分泌多种多样的细胞因子、趋化因子、生长因子和酶(诸如MMP)来参与RA发病机制。研究已表明，抑制滑膜成纤维细胞的生长能够降低炎症性关节炎的严重性(81)。因此，经由结合于TF来靶向成纤维细胞能够促使治疗RA的新型治疗剂的开发。

RA中表达TF的B细胞。B细胞是RA中患关节炎的关节中的另一种浸润免疫细胞。B细胞在RA发病机制中起着重要作用，不仅用作产生自身抗体的浆细胞的前体，而且参与抗原呈递、T细胞活化和细胞因子产生(82)。因此，B细胞导向疗法在治疗RA方面可提供治疗效果(83-85)。最近的一项研究表明，人RA中的B细胞表达TF(60)，而正常B细胞不表达TF(86)。RA相关B细胞表达TF的原因尚不得而知。其可能是由于炎性细胞因子和趋化因子中的一者或混合物起到诱导作用。作为证据，正常人B细胞的亚群(CD19+CD79b+CD38+CD40+CD5-)(代表所有B细胞的30％)在卟啉波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)诱导之后表达了TF(86,87)。有趣的是，即使在经由LPS或PMA刺激之后，T细胞和NK细胞也不会表达TF(86)。已观察到，NK细胞是在体外和体内癌动物模型中介导靶向TF的ICON免疫治疗的ADCC作用的主要效应细胞(57)。NK细胞上的阴性TF表达的发现非常重要，这不仅能更好理解临床试验中靶向TF的免疫缀合物的功效，而且确保了靶向TF的免疫缀合物的安全性。

RA、子宫内膜异位和肿瘤微环境中的细胞因子和生长因子有助于TF和血管生成的诱导(《抗体》(Hu，Antibodies))，2018年，排印中)。类风湿性关节炎滑膜中(88)和/或RA患者的血浆中(89-91)存在许多细胞因子和趋化因子，包括促炎细胞因子(例如，IL-1、IL-6、TNF1996</Year><RecNum>88</RecNum><IFNn、GM-CSF等)、抗炎性细胞因子(IL-10、IL-1Rα、TGFβ、IL-11、IL-13等)、趋化因子(例如，IL-8、MIP-1L-8、MIP-1P-1P-110等)和生长因子(例如，VEGF、PDGF、FGF)。这些刺激物中的一些能够有助于血管生成和增加VEC的血管通透性(例如，VEGF)(19)和/或在VEC上(例如，TNF</A(92)或在单核细胞上诱导TF(LPS)(75)、TNFN(76)和IL-1(77)。其中的一些(例如，VEGF，一种强效生长因子)在血管生成依赖性癌和非恶性人疾病(17)诸如AMD(18)、RA(19)和子宫内膜异位(20)中起着中心和共同作用。

巨噬细胞相关人疾病中的组织因子

动脉粥样硬化中的组织因子

动脉粥样硬化是以中等至大型动脉(诸如冠状动脉)中脂质积累为特征的进行性疾病。在动脉粥样硬化期间，血管壁中形成动脉粥样硬化斑块会导致动脉管腔狭窄。动脉粥样硬化和继发性动脉粥样硬化血栓形成是导致世界上的主要死因。动脉粥样硬化斑块是高度促凝的，这主要是由于斑块中的巨噬细胞和血管平滑肌细胞上以及微泡(也称为微粒或胞外囊泡)和坏死核心内的泡沫细胞来源碎片上表达了高水平的TF。有趣的是，斑块内90％以上微泡是CD14阳性的(93)，这表明它们起源于单核细胞/巨噬细胞。包括Mackman团队在内的若干团队已简练地综述了动脉粥样硬化血栓形成(atherombosis)和动脉粥样硬化中的TF(94-99)。已在小鼠、兔、猪和非人灵长类中建立了动脉粥样硬化的动物模型，其中小鼠和兔是最常用的模型。重要的是，与人中的动脉粥样硬化类似，兔模型和Apoe^-/-小鼠模型的动脉粥样硬化病灶中也存在高水平的TF(参见Tatsumi和Mackman的综述)(95)。这些动物模型中的TF表达的发现非常重要。这是因为其不仅为基础科学研究提供了模拟人动脉粥样硬化的进展的动物模型，而且为测试人动脉粥样硬化治疗用TF靶向治疗剂提供了动物模型。另外，患有高脂血症和II型家族性高胆固醇血症的患者具有升高水平的表达TF的单核细胞和TF阳性微泡。重要的是，未受刺激的单核细胞不能正常表达TF(73,74)，但包括细菌脂多糖(LPS，也称为内毒素)(75)、TNFα(76)和IL-1(77)在内的炎症介质能够在单核细胞上诱导TF。

HIV感染的巨噬细胞上的组织因子表达

在发现人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)之后不久，发现了HIV-1在体内具有外周血中的两种主要靶细胞，即，T淋巴细胞(其已经过广泛研究)以及巨噬细胞(100,101)(其已被忽略，但基于下述观察结果，这值得广泛研究)。虽然病毒复制周期在T细胞中通常是迅速且致细胞病变的，但被感染的巨噬细胞在体外和体内存活数月并且积累包含感染性病毒颗粒的大空泡。因此，HIV感染的巨噬细胞中活跃地表达HIV基因并且组装病毒颗粒(100)。因此，巨噬细胞在HIV感染的发病机制中起着关键作用以用于宿主内的早期病毒传播和弥散以及更重要地作为病毒持续存在的贮主。另外，慢性HIV感染中的巨噬细胞选择性地表达细胞膜受体组织因子(TF)(102)。然而，未受刺激的单核细胞(73)以及血管壁中的其他静息态血细胞和血管内皮细胞(24,25,103-105)不能正常表达TF。巨噬细胞上升高的TF会促成体内凝血增加的风险，即，动脉和静脉血栓形成，这是高效抗逆转录病毒疗法(HAART)后HIV患者的常见不良反应(102)。另外，巨噬细胞TF的水平与血浆中的HIV水平相关(102)。细菌脂多糖(LPS)可在单核细胞上诱导TF表达(102)，该细菌脂多糖是可能来源于胃肠道的细菌产物并且在HIV慢性感染个体中具有高循环水平(106)。因此，HIV感染的巨噬细胞被认为是传播病毒的贮主，并且由于因组织因子表达而促成血管内血栓形成增加的风险。

博拉感染的巨噬细胞中的组织因子表达

埃博拉病毒能够由于严重出血热而引起急性死亡率，在人疫情中死亡率为约80％，并且在猴模型中死亡率几乎为100％。埃博拉出血热的凝血异常的潜在机制是埃博拉病毒能够在病毒复制期间诱导灵长类单核细胞和巨噬细胞中的TF表达(107)。在埃博拉出血热的恒河猴模型中，重组线虫抗凝蛋白c2(rNAPc2)对fVIIa/TF的阻断降低了TF活性的水平，并且显著增加了经治疗的非人灵长类的存活(108)。

T和自然杀伤(NK)细胞不表达组织因子

有趣的是，即使在经由LPS或PMA刺激之后，T细胞和NK细胞也不会表达TF(86)。我们此前已观察到，NK细胞是在体外和体内癌动物模型中介导靶向TF的ICON免疫治疗的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的主要效应细胞(57)。NK细胞上的阴性TF表达的发现非常重要，这不仅能更好理解临床试验中靶向TF的免疫缀合物的功效，而且确保了靶向TF的免疫缀合物的安全性。如上所讨论，未受刺激的单核细胞(73,74)和B细胞(86)不能正常表达TF，但包括LPS(75)、TNFα(76)和IL-1(77)在内的炎症介质能够在单核细胞上诱导TF，并且PMA可在B细胞上诱导TF(86,87)。

临床前研究中的靶向TF抗体和抗体样免疫缀合物

第二代和第三代靶向TF的抗体样免疫缀合物(L-ICON代表较轻ICON)

为了使L-ICON1更有效，生成了第三代ICON，其被命名为L-ICON3(基因库登记号KY223609)和ICON3(基因库登记号KY223610)。L-ICON3和ICON3由融合到IgG3 Fc的fVII轻链(最开始152aa)或全长(含或不含K341A)构成(第3GEN，图1a和图1b)。研究已充分证实，IgG3抗体相比于IgG1抗体能够引发更有效的ADCC和/或CDC作用。第3GEN L-ICON3和第2GENL-ICON1对癌细胞具有类似的结合活性，并且L-ICON3相比于第2GEN ICON(L-ICON1)在体外实际上能够引发更强的对癌细胞的ADCC细胞毒作用。在癌动物模型中，L-ICON3也相比于L-ICON1更有效。

第四代靶向TF的抗体样免疫缀合物

为了结合IgG1抗体(更长血清半衰期)和IgG3抗体(更强ADCC和/或CDC)的有益效果，IgG1和IgG3 Fc的杂合体融合到因子VII轻链或因子VII全长(含或不含K341A)的C端作为第四代ICON，分别被命名为L-ICON4和ICON4。此前已证实，IgG1/IgG3混合同种型的基因工程抗体中增强了ADCC和CDC活性(109)。

靶向TF的抗体和抗体-药物缀合物(ADC)

正在临床前和临床研究中研究若干人源化单克隆抗体(TF-HuMab)和/或抗体-药物缀合物(TF-ADC)(110,111)。荷兰的一个团队使用TF胞外结构域的纯化肽和表达TF的NSO细胞在人源化小鼠中生成了抗TF的人源化IgG1抗体(组织因子HuMab)(110)。其中三种抗体(被命名为TF-011、-098和-111)能够诱导TF:fVII依赖性细胞内信号传导、ADCC和快速受体内化的有效抑制，但在体外对TF促凝活性具有最小影响。他们将这些TF HuMab克隆与细胞毒剂MMAE或MMAF缀合在一起，并且证实TF-011-MMAE(HuMax-TF-ADC)是最强效的ADC且体内主导作用机制是澳瑞他汀介导的肿瘤细胞杀伤。在TF表达水平不同的患者源性异种移植物(PDX)模型中，TF-011-MMAE诱导了完全肿瘤消退。有趣的是，在其25％至50％肿瘤细胞中有TF表达的PDX模型中，靶向TF的ADC也有效。ADC在TF低表达肿瘤细胞模型中有功效的原因是靶向TF的ADC也可能靶向其他TF阳性肿瘤腔隙，诸如肿瘤新生血管和/或癌干细胞，它们可由靶向TF的ICON在体外(22,37)和在体外(24,28)单独地靶向和根除。ADC的结果独立地表明，使用ADC进行的靶向TF的免疫治疗可具有治疗多种实体癌的治疗潜能，即使其肿瘤细胞上的TF表达水平较低。

这一团队进一步将靶向TF的ADC的功效与靶向其他癌细胞受体诸如EGFR和HER2的那些进行了比较(112)。他们将TF、EGFR和HER2特异性抗体与多司他汀-3(duostatin-3，一种在抗体介导的内化后诱导强效细胞毒作用的毒素)缀合在一起。他们证实，在异种移植物小鼠模型中，TF-ADC在降低肿瘤生长方面比EGFR-和HER2-ADC相对强效。

结论

总之，TF在血管生成依赖性人疾病(尤其是实体癌、AMD、子宫内膜异位和RA)的新生血管中的血管生成血管内皮细胞上选择性地表达。在癌中，癌细胞(包括实体癌细胞、AML和ALL白血病细胞、肉瘤细胞以及癌干细胞)也会过表达TF。另外，肿瘤微环境中的TAM和MDSC(Hu等人，未发表数据)也可能会表达TF。在RA中，患关节炎的关节中的巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞和Ki-67阳性滑膜细胞也会在局部表达TF。在巨噬细胞相关人疾病中，动脉粥样硬化中的单核细胞源巨噬细胞和泡沫细胞以及HIV和埃博拉感染的巨噬细胞会异常地表达TF。这些表达TF的细胞(新生血管性VEC、癌细胞、CSC、巨噬细胞/泡沫细胞、成纤维细胞、B细胞)全都参与疾病进展，而正常VEC、单核细胞、T和NK细胞不表达TF。因此，靶向TF代表能够广泛地治疗这些临床显著的疾病的新型治疗方法。

如上所讨论，有两种制备抗TF的治疗性抗体的方法。一种方法是将fVII(TF的天然配体)融合到IgG1或IgG3 Fc，另一种方法是制备人抗体。含fVII的抗体样免疫缀合物(ICON和L-ICON)具有优于抗TF人源化抗体和抗体-药物缀合物(ADC)的优点，因为其对TF的亲和力更强并且不需要人源化。ICON和L-ICON分子被设计为通过使用TF的天然配体fVII(分别是含促凝活性位点突变(K341A)的全长肽，或完全去除促凝活性的轻链肽)来结合于TF，其亲和力和特异性远高于使用抗TF抗体时能够实现的亲和力和特异性。与抗TF Ab和TF-ADC相比，ICON和L-ICON具有若干重要优点：(i)fVII结合于TF的解离常数(Kd)高达10^-12M(113)，相比之下，抗TF抗体对于TF具有在10^-8至10^-9M范围内的Kd(114)。(ii)ICON和L-ICON由重组DNA技术产生，从而允许这些靶向TF的蛋白试剂由临床试验用人来源制备，而不需要单克隆抗体所需的人源化过程(110)。(iii)由于事实上ADC是通过将强效药物共价缀合到抗体而制备的，因此大多数ADC以非均相混合物的形式存在并且需要复杂的位点特异性缀合技术(115)。此外，ADC中这些抗TF的抗体所起作用更像抗体/抗原结合后经由内化将细胞毒剂递送到癌细胞中的靶向分子，而非经由ADCC和CDC起效的治疗性抗体。ADC方法类似于靶向fVII的光动力学疗法(36)，在光动力学疗法中，fVII用作靶向分子以经由内化(在fVII结合于TF后30分钟达到峰值内化)将光敏剂选择性地递送到表达TF的癌细胞(26,27,104,105)、肿瘤VEC(22,26,27,104,105)和CSC(22)(104)。

在三代靶向TF的ICON之中，数据显示，在体外介导ADCC治疗癌细胞方面(图4a)以及在体内治疗原位小鼠模型中的鼠乳腺癌4T1(动物IV期人乳腺癌)方面(图6b)，第2GEN L-ICON1相比于第1GEN ICON更有效(图5)并且第3GEN L-ICON3相比于第2GEN L-ICON1更有效。任何靶向TF的抗体样免疫缀合物或抗体的理想特征是它们只是结合TF而不具有促凝活性，因此它们不会在这些人疾病中引起弥散性血管内凝血障碍。就这一点而言，L-ICON3是理想的，这是由于其促凝活性已被完全去除。

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实施例3：第四代ICON

1.L-ICON4：L-ICON1与L-ICON3的组合

如上所讨论，存在三种L-ICON1蛋白，它们被命名为L-ICON1(SEQ ID NO 5)、L-ICON1(WT)(SEQ ID NO 6)和L-ICON1(E333A)(SEQ ID NO7)。它们的cDNA序列已分别以登记号KX760097、KX760098和KX760099保藏到基因库。

还存在两种L-ICON3蛋白，它们被命名为L-ICON3(WT)(SEQ ID NO1)或L-ICON3(基因库登记号KY223609)和L-ICON3(R435H)(SEQ ID NO 8)。

L-ICON4能够由三种L-ICON1蛋白中的每一者与两种L-ICON3蛋白中的每一者的组合衍生而来。这些蛋白列于表2中。

2.ICON4：ICON1与ICON3的组合

还存在两种ICON1蛋白，它们被命名为ICON1(WT)(SEQ ID NO 9)和ICON1(E333A)(SEQ ID NO 9)。这些新ICON1蛋白中的IgG1 Fc序列不同于初始ICON序列(人ICON基因库AF272774)。这些新ICON1的主要差异是与初始ICON(或称为ICON1，AF272774)相比，它们具有短6个氨基酸残基的铰链区。

存在两种ICON3蛋白，它们被命名为ICON3(WT)(基因库登记号KY223610)(以上SEQID NO 3)和ICON3(R435H)(SEQ ID NO 11)。

因此，ICON4能够由两种L-ICON1中的每一者与两种ICON3中的每一者的组合衍生而来(表3)。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中引述的出版物及其中引述的材料明确地以引用方式并入。

本领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来探知本文所述发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下权利要求书涵盖。

序列

SEQ ID NO:1人因子VII轻链-人IgG3 Fc(L-ICON3)mRNA，完整编码序列(基因库登 记号KY223609)。

(HindIII-EcoRI-Kozak-ATG-hfVIIL-BamHI-hIgG3Fc-Stop-NotI)

SEQ ID NO:2：L-ICON3肽的单体

SEQ ID NO:3：人因子VII(K341A)-人IgG3 Fc(ICON3)mRNA，完整编码序列(基因库 登记号KY223610)。

SEQ ID NO:4：ICON3肽的单体

SEQ ID NO:5：L-ICON3(R435H)

SEQ ID NO:6L-ICON3(R435H)的单体

SEQ ID NO:7：ICON3(R435H)

SEQ ID NO:8：ICON3(R435H)的单体

SEQ ID NO.9：ICON1(WT)：

SEQ ID NO:10：ICON1(WT)的单体：

SEQ ID NO.11：ICON1(E333A)

SEQ ID NO:12：ICON1(E333A)的单体

SEQ ID NO.13：L-ICON1(基因库KX760097)

SEQ ID NO:14：L-ICON1的单体

SEQ ID NO.15：L-ICON 1(WT)(基因库KX760098)

SEQ ID NO:16：L-ICON1(WT)的单体

SEQ ID NO.17：L-ICON1(E333A)(基因库KX760099)

SEQ ID NO：18：L-ICON1(E333A)的单体

表格

表1。L-ICON1、ICON(WT)和ICON(K341A)的凝血活性(IU/ml，平均值±SD)

^*为了与L-ICON1和ICON进行比较，10nM FVIIa的凝血活性被指定为100％。

^**FVIIa的浓度为1.00nM，而其他蛋白被稀释到1.25nM。

表2。以因子VII轻链作为靶向结构域的第四代靶向组织因子的ICON(L-ICON4)

表3。以因子VII K341A作为靶向结构域的第四代靶向组织因子的ICON(ICON4)

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序列表

<110> 俄亥俄州创新基金会

<120> 与靶向组织因子的IgG3免疫缀合物有关的方法和组合物

<130> 10336-305WO1

<160> 18

<170> PatentIn 3.5版本

<210> 1

<211> 1285

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

aagcttgaat tcgccaccat ggtctcccag gccctcaggc tcctctgcct tctgcttggg 60

cttcagggct gcctggctgc agtcttcgta acccaggagg aagcccacgg cgtcctgcac 120

ggcgccggcg cgccaacgcg ttcctggagg agctgcggcc gggctccctg gagagggagt 180

gcaaggagga gcagtgctcc ttcgaggagg cccgggagat cttcaaggac gcggagagga 240

cgaagctgtt ctggatttct tacagtgatg gtgaccagtg tgcctcaagt ccatgccaga 300

atgggggctc ctgcaaggac cagctccagt cctatatctg cttctgcctc cctgccttcg 360

agggccggaa ctgtgagacg cacaaggatg accagctgat ctgtgtgaac gagaacggcg 420

gctgtgagca gtactgcagt gaccacacgg gcaccaagcg ctcctgtcgg tgccacgagg 480

ggtactctct gctggcagac ggggtgtcct gcacacccac agttgaatat ccatgtggaa 540

aaatacctat tctagaaaaa agaaatgcca gcaagcccca agggcgagga tccgacacac 600

ctcccccgtg cccaaggtgc ccagcacctg aactcctggg aggaccgtca gtcttcctct 660

tccccccaaa acccaaggat acccttatga tttcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg 720

tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa gtggtacgtg gacggcgtgg 780

aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg ttccgtgtgg 840

tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg 900

tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggacagc 960

cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg 1020

tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga 1080

gcagcgggca gccggagaac aactacaaca ccacgcctcc catgctggac tccgacggct 1140

ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacatct 1200

tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgctt cacgcagaag agcctctccc 1260

tgtctccggg taaatgagcg gccgc 1285

<210> 2

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln

1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val

20 25 30

Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro

35 40 45

Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu

50 55 60

Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile

65 70 75 80

Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly

85 90 95

Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro

100 105 110

Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile

115 120 125

Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr

130 135 140

Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala

145 150 155 160

Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile

165 170 175

Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Gly Ser

180 185 190

Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

195 200 205

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

210 215 220

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

225 230 235 240

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

245 250 255

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe

260 265 270

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

275 280 285

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

290 295 300

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

305 310 315 320

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

325 330 335

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

340 345 350

Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro

355 360 365

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

370 375 380

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met

385 390 395 400

His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

405 410 415

Pro Gly Lys

<210> 3

<211> 2051

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

aagctttgca gagatttcat catggtctcc caggccctca ggctcctctg ccttctgctt 60

gggcttcagg gctgcctggc tgcagtcttc gtaacccagg aggaagccca cggcgtcctg 120

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gagtgcaagg aggagcagtg ctccttcgag gaggcccggg agatcttcaa ggacgcggag 240

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<210> 4

<211> 673

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln

1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val

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Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro

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Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu

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Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly

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Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro

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Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile

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Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala

145 150 155 160

Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile

165 170 175

Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val

180 185 190

Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu

195 200 205

Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile

210 215 220

Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg

225 230 235 240

Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly

245 250 255

Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr

260 265 270

Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln

275 280 285

Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg

290 295 300

Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser

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Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met

325 330 335

Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser

340 345 350

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355 360 365

Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Ala Gly Asp Ser Gly Gly

370 375 380

Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val

385 390 395 400

Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr

405 410 415

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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

545 550 555 560

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

565 570 575

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

580 585 590

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

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Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

645 650 655

Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

660 665 670

Lys

<210> 5

<211> 1286

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

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<210> 6

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

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1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val

20 25 30

Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro

35 40 45

Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu

50 55 60

Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile

65 70 75 80

Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly

85 90 95

Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro

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Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile

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Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Gly Ser

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Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

195 200 205

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

210 215 220

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

225 230 235 240

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

245 250 255

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe

260 265 270

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

275 280 285

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

290 295 300

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

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His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

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Pro Gly Lys

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<211> 2051

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

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gaggggtact ctctgctggc agacggggtg tcctgcacac ccacagttga atatccatgt 540

ggaaaaatac ctattctaga aaaaagaaat gccagcaagc cccaagggcg aattgtgggg 600

ggcaaggtgt gccccaaagg ggagtgtcca tggcaggtcc tgttgttggt gaatggagct 660

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ccgggcacca ccaaccacga catcgcgctg ctccgcctgc accagcccgt ggtcctcact 900

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agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acatcttctc atgctccgtg 1980

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<211> 673

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln

1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val

20 25 30

Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro

35 40 45

Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu

50 55 60

Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile

65 70 75 80

Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly

85 90 95

Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro

100 105 110

Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile

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Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr

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Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala

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Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile

165 170 175

Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val

180 185 190

Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu

195 200 205

Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile

210 215 220

Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg

225 230 235 240

Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly

245 250 255

Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr

260 265 270

Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln

275 280 285

Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg

290 295 300

Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser

305 310 315 320

Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met

325 330 335

Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser

340 345 350

Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala

355 360 365

Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Ala Gly Asp Ser Gly Gly

370 375 380

Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val

385 390 395 400

Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr

405 410 415

Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu

420 425 430

Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Gly Ser Asp Thr

435 440 445

Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

450 455 460

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

465 470 475 480

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

485 490 495

Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

500 505 510

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515 520 525

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

530 535 540

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

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Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

565 570 575

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

580 585 590

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

595 600 605

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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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Lys

<210> 9

<211> 2054

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 9

aagctttgca gagatttcat catggtctcc caggccctca ggctcctctg ccttctgctt 60

gggcttcagg gctgcctggc tgcagtcttc gtaacccagg aggaagccca cggcgtcctg 120

caccggcgcc ggcgcgccaa cgcgttcctg gaggagctgc ggccgggctc cctggagagg 180

gagtgcaagg aggagcagtg ctccttcgag gaggcccggg agatcttcaa ggacgcggag 240

aggacgaagc tgttctggat ttcttacagt gatggtgacc agtgtgcctc aagtccatgc 300

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cagttgtgtg gggggaccct gatcaacacc atctgggtgg tctccgcggc ccactgtttc 720

gacaaaatca agaactggag gaacctgatc gcggtgctcg gggagcacga cctcagcgag 780

cacgacgggg atgagcagag ccggcgggtg gcgcaggtca tcatccccag cacgtacgtc 840

ccgggcacca ccaaccacga catcgcgctg ctccgcctgc accagcccgt ggtcctcact 900

gaccatgtgg tgcccctctg cctgcccgaa cggacgttct ctgagaggac gctggccttc 960

gtgcgcttct cattggtcag cggctggggc cagctgctgg accgtggcgc cacggccctg 1020

gagctcatgg tcctcaacgt gccccggctg atgacccagg actgcctgca gcagtcacgg 1080

aaggtgggag actccccaaa tatcacggag tacatgttct gtgccggcta ctcggatggc 1140

agcaaggact cctgcgcggg ggacagtgga ggcccacatg ccacccacta ccggggcacg 1200

tggtacctga cgggcatcgt cagctggggc cagggctgcg caaccgtggg ccactttggg 1260

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<210> 10

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln

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Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val

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Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg

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Lys

<210> 11

<211> 2054

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

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gtgtacacca gggtctccca gtacatcgag tggctgcaaa agctcatgcg ctcagagcca 1320

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<210> 12

<211> 673

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

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Lys

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成构建体

<400> 13

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 14

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<211> 1289

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 16

Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln

1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val

20 25 30

Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro

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Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu

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Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile

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Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly

85 90 95

Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro

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Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile

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Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr

130 135 140

Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala

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Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile

165 170 175

Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Gly Ser

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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

195 200 205

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

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His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

260 265 270

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

275 280 285

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

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Tyr Ala Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

325 330 335

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

340 345 350

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

355 360 365

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

370 375 380

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

385 390 395 400

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

405 410 415

Pro Gly Lys

<210> 17

<211> 1289

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 17

aagcttggat tcgccaccat ggtctcccag gccctcaggc tcctctgcct tctgcttggg 60

cttcagggct gcctggctgc agtcttcgta acccaggagg aagcccacgg cgtcctgcac 120

cggcgccggc gcgccaacgc gttcctggag gagctgcggc cgggctccct ggagagggag 180

tgcaaggagg agcagtgctc cttcgaggag gcccgggaga tcttcaagga cgcggagagg 240

acgaagctgt tctggatttc ttacagtgat ggtgaccagt gtgcctcaag tccatgccag 300

aatgggggct cctgcaagga ccagctccag tcctatatct gcttctgcct ccctgccttc 360

gagggccgga actgtgagac gcacaaggat gaccagctga tctgtgtgaa cgagaacggc 420

ggctgtgagc agtactgcag tgaccacacg ggcaccaagc gctcctgtcg gtgccacgag 480

gggtactctc tgctggcaga cggggtgtcc tgcacaccca cagttgaata tccatgtgga 540

aaaataccta ttctagaaaa aagaaatgcc agcaagcccc aagggcgagg atccgacaaa 600

actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 660

ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 720

gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 780

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 840

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 900

gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gcgaaaacca tctccaaagc caaagggcag 960

ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1020

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1080

agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1140

tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1200

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1260

ctgtctccgg gtaaatgata agcggccgc 1289

<210> 18

<211> 418

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 18

Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln

1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val

20 25 30

Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro

35 40 45

Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu

50 55 60

Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile

65 70 75 80

Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly

85 90 95

Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro

100 105 110

Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile

115 120 125

Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr

130 135 140

Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala

145 150 155 160

Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro

165 170 175

Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Gly Ser Asp

180 185 190

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

195 200 205

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

210 215 220

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

225 230 235 240

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

245 250 255

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

260 265 270

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

275 280 285

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala

290 295 300

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

305 310 315 320

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

325 330 335

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

340 345 350

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

355 360 365

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

370 375 380

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

385 390 395 400

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

405 410 415

Gly Lys

Claims (35)

1.一种包含免疫缀合物蛋白的组合物，其中所述免疫缀合物蛋白包含缀合到因子VII的IgG3免疫球蛋白的Fc区。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述因子VII是因子VII轻链。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述因子VII是全长。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述因子VII包含K341A突变。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物靶向表达组织因子(TF)的细胞。

6.根据权利要求2所述的组合物，其中因子VII轻链包含人和鼠因子VII。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中IgG3包含R435H突变。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫缀合物蛋白包含SEQ ID NO:2。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫缀合物蛋白由包含SEQ ID NO:1的核酸编码。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫缀合物蛋白被编码为表达载体中的分泌分子。

11.根据权利要求6所述的组合物，其中所述表达载体是复制缺陷型腺病毒载体。

12.根据权利要求6所述的组合物，其中所述表达载体是腺相关表达载体。

13.根据权利要求1所述的组合物，其中光敏剂偶联到所述免疫缀合物。

14.根据权利要求10所述的组合物，其中所述光敏剂包含光动力学染料。

15.一种用于治疗或预防对其有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病与组织因子(TF)表达相关。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述疾病包括涉及已血管化的肿瘤、血栓形成、类风湿性关节炎、子宫内膜异位或黄斑变性的病理性新生血管。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病与表达TF的巨噬细胞相关。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病是病毒感染，诸如埃博拉或HIV。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病是动脉粥样硬化。

21.根据权利要求15所述的方法，其中根据权利要求1所述的组合物能够预防癌的转移。

22.根据权利要求15所述的方法，其中根据权利要求1所述的组合物能够治疗转移癌。

23.根据权利要求15所述的方法，其中通过施用药学上可接受的载体中的所述免疫缀合物蛋白来治疗所述受试者。

24.一种包含免疫缀合物蛋白的组合物，其中所述免疫缀合物蛋白包含缀合到因子VII的IgG1和IgG3免疫球蛋白的杂合Fc区。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述因子VII是因子VII轻链。

26.根据权利要求24所述的组合物，其中所述因子VII是全长。

27.根据权利要求24所述的组合物，其中所述因子VII包含K341A突变。

28.根据权利要求24所述的组合物，其中所述组合物靶向表达组织因子(TF)的细胞。

29.根据权利要求25所述的组合物，其中因子VII轻链包含人和鼠因子VII。

30.根据权利要求24所述的组合物，其中IgG3包含R435H突变。

31.根据权利要求24所述的组合物，其中所述免疫缀合物蛋白被编码为表达载体中的分泌分子。

32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述表达载体是复制缺陷型腺病毒载体。

33.根据权利要求31所述的组合物，其中所述表达载体是腺相关表达载体。

34.根据权利要求24所述的组合物，其中光敏剂偶联到所述免疫缀合物。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述光敏剂包含光动力学染料。