RU1838408C

RU1838408C - Способ культивировани бактерий

Info

Publication number: RU1838408C
Application number: SU894742197A
Authority: RU
Inventors: Ямада Хидеаки; Нагасава Тору
Original assignee: Ямада Хидеаки; Нитто Кагаку Когио Кабусики Кайся
Priority date: 1988-10-06
Filing date: 1989-10-05
Publication date: 1993-08-30
Also published as: CZ280901B6; KR100187512B1; EP0362829A2; EP0362829B1; DE68923419T2; CN1041782A; CN1039030C; DE68923419D1; ATE124992T1; US5089411A; AR241936A1; CZ562189A3; AU4257389A; ES2076944T3; KR900006505A; PL161863B1; AU622489B2; EP0362829A3

Description

способностью продуцировать нитрил-гид- ратазу.

Давление, по крайней мере, одного из соединений: мочевины и производных мочевины формул (I)-(III); и иона кобальта и культуральную среду во врем культивировани бактерии Rhoclococcus rhodochrous значительно повышает нитрил-гидратазную активность указанной бактерии на единицу культура ль ной жидкости.

Это повышение нитрил-гпдратазной активности на единицу культуральной среды, веро тно, ведет к увеличению концентрации клеток (т.е., выходу) и/или клеточной активности (т.е., количеству нитрил-гидра- тазы в клетках);

При осуществлении насто щего изобретени добавление мочевины или ее производного особенно эффективно дл повышени клеточной активности. Подробное описание изобретени 1. Бактерии Rhodococcus rhodochrous В насто щем изобретении используютс бактерии Rhodococcus rhodochrous, обладающиенитрил-гидратазной активностью и способностью к гидратации нитрилов, в частности, ароматических нитрилов , до получени соответствующих амидов . Конкретным примером таких бактерий вл етс штамм 1-1 (FEPM ВР-1478) - Rhodococcus rhodochrous, описанный в за вке на понский патент № 231744/1988 и в за вке на патент США № 243936, упоминавшихс выше. Ниже привод тс подробное описание указанного штамма 1-1. вз тые из цитируемых за вок на патент.

1. Происхождение и депониросание Штамм I- был выделен за вител ми из почвы в Сакис-кю, Киото, Япони , и депонирован 18 сент бр 1987 г. Институтом Ферментных исследований, Агенством прикладных наук и технологии, Министерством международной торговли н промышленности Японии, где он находитс на хранении под номером допуска ГЕРМ ВР- 1478 в соответствии с Будапештским договором .

2. Бактериологические характеристики (а) Морфологические характеристики (2) Форма и размер клетки: 0,9-1,0 мк х 3-10 мк

(2) Полиморфизм: удлиненные клетки, имеющие форму палочек, в начальной стадии культивации растут до образовани пр мых палочек с изломом, а затем дел тс , образу короткую бацилл рную форму 3) Подвижность: Неподвижны

(4) Образование спор: не образуют

(5) Окрашивание: положительно

(6) Кислотоустойчивость: отрицательно

(7) Гетерофильный гранулоцит: наблюдаетс

(Ы Культурзльные характеристики различных культуральных сред 30°С

(1) Бульонна культура на чашках Петри с агаром: круг с диаметром 1 мм (48 часов), неправильный, довольно сухой на поверхности , плоский, непрозрачный, и бледно- оранжево-розового цвета.

(2) Бульонна культура на скошенном агаре: волокно с гладкой поверхностью и слегка выпуклой, довольно сухое в поперечном сечении и бледно-оранжево-розового цвета.

5(3) Бульонна культура о жидкой среде: обильный рост с образованием мембраны. Культуральнп жидкость становитс довольно мутной и образуетс преципитат в результате роста клеток

0 . (4) Бульонна культура из .столбиках желатины: хороший рост на поверхности в виде соронки вдоль поверхности столбика, но на нижней поверхности рост ограничен. Желатин не разжижен.

5(5) Лакмусовое молоко: бе.з изменений. (с) Физиологические озойствз:

(1) Снижениз нитрата: положительно

(2) Денитрификаци : отрицательно

(3) MR - тест: отрицательно 0(4) VP - тест: отрицательно

(5) Образование индола: положительно

(6) Образование ссроиодореда: положительно

(7) Гидролиз крахмала: отрицательно 5(8) использование лимонной кислоты:

культурзльн;1Я среда Косич: отрицательно

культурально среда christeuseu: положительно

0(9) Использование неорганических источников азота:

нитрат: положительно

соль аммони : положительно

(10) Образование пигментов: отрица- 5 тельно

(11) Урсэзэ: положительно

(12) Окскдаза; отрицательно

(13) Каталаза: положительно

(14) Гидролиз целлюлозы: отрицательно 0 (15) Услови роста: рН: 5-10 температура: 10-41°С

(16)-Реакци на кислород: аэробна

(17) Разложение тирозина: положительно

(18) Разложение аденина: положительно 5(19) Фосфотазь: положительно

(20) Гидролиз Тонна 80: положительно

(21)0-Р-тест: О (слабый)

(22) Термостойкость (в 10% сепарированном молоке при 72°С в течение 15 мин) отсутствует

(23) Образование кислоты и газа из сахарида:

КислотаГаз L-Арабиноза D-Ксилоэа D-Глюкоза + D-Манноза - . - D-Фруктоза + Мальтоза + Сахароза + Лактоза Трегалоза D-Сорбит + D-Маннит + Глицерин +

(24) Рост в одном источнике углерода: Инозит

Мальтоза4 D-Маннит + Рамноза

D-Сорбит+ т-оксобензойна кислота + Адмпат натри + Бензоат натри + Цитрат натри . + Лактат натри + Тестотетрон + L-Тирозин . + Глицерин (1 %) (вес/об,) (+) Трегалоза (+) р-оксибензойна кислота (.1%) (вес/об.) + (+): слегка положительно

(25) Анализ жирных кислот и клеточной стенки: клетка содержит ненасыщенные и насыщенные с пр мой цепью. ТСХ миколо- вой кислоты дает хроматограмму с единичным п тном.

Согласно оценке вышеперечисленных бактериологических свойств в соответствии с Руководством по систематической бактериологии Берги (1986), штамм 1-1 вл етс аэробной, Грамположительной, обладающей слабой устойчивостью к кислотам, ката- лазо-положительной и не образующей эндоспор палочкой без жгутиков. Этот штамм имеет форму продолговатой палочки и мицелий о начальной стадии роста, растет с ветслением, а затем делитс с образованием коротких палочек. В соответствии с указанными признаками, штамм (-1 подпадает под тип бактерии Nocardia.

Анализ на состав жирных кислот обнаружил , что бактери содержит ненасыщенные и насыщенные жирные кислоты с пр мой цепью, включающих туберкулостез- риновую кислоту. Поскольку ТСХ миколовой кислоты дает единичное п тно, имеющее такое же значение Pf как и стандартна бактери Rhodococcus rhodochrous (IFO 3338), эта бактери не вл етс бактерией рода Мусо bacterium. Эта бактери также отличаетс от бактерии Nocordia по составу (числу 5 атомов углерода) миколовой кислоты,

В результате исследовани других биохимических свойств указанна бактери била идентифицирована как Rhodococcus rhodochrous. 0 II. Мочевина и ее производные

В соответствии с насто щим изобретением , мочевина и производные мочевины, имеющие формулы ()-( II); как было указано выше, выполн ют функции индукторов фер- 5 ментов. Может показатьс совершенно неожиданным , если учесть тот факт, что до - насто щего времени типичными индукторами ферментов считались нитрилы или амиды , например, кротонамид, что мочевина и 0 ее производные могут эффективно индуцировать нитрил-гидратазу. При этом было обнаружено , что мочевина и ее производные если и использовать не в комбинации с другими индукторами ферментов, а отдельно, 5 показывают значительно более высокую эффективность , чем стандартные индукторы ферментов. Кроме того, мочевина вл етс менее дорогосто щим продуктом по сравнению с другими индукторами, но с эконо- 0 мической точки зрени способ насто щего изобретени может быть с успехом применен в промышленности.

Примерами соединений формулы (I), используемых в насто щем изобретении мо- 5 гут служить метилмочевина, этилмочевина, 1,1-диметилмочевина и 1,3-диметилмочеви- . на.

Примерами соединений формулы (II) вл ютс уретан и метилуретан, 0 Примером соединени формулы (III) вл етс тиомочевина.

Мочевина или ее производные добавл ютс в культуральную среду в один прием, разом, или последовательно. Термин по- 5 следовательно в данном, случае означает непрерывно и с возрастанием. (Ill) Ион кобальта

Нитрил-гидратаза не может быть получена просто добавлением мочевины или ее 0 производных в культуральную среду, и добавление в культуральную среду иона кобальта вл етс важным фактором насто щего изобретени . (Присутствие иона кобальта вл етс важным дл полу;е- 5 нй нитрил-гидратазы при помощи бактерий , как было предложено в упоминавшихс ранее патентных за вках N; 231744/1086, Япони и № 238986, СЩА).

Обычно, ион кобальта образуетс при добавлении водорастворимого соединени

кобальта в водную культуральную среду. Водорастворимые соединени кобальта описаны в химических энциклопеди х, и поэтому специалист может легко выбр ать дл использовани одно из наиболее подхо- д щих соединений.

Типичными примерами кобальтовых соединений вл ютс соединени , которые дают Со или Со+++, особенно, Со, такие как хлорид кобальта, сульфат кобальта, аце- тат кобальта, бромид кобальта и бора кобальта .

Кроме того, о качестве источника кобальта могут быть использованы витамин В12 и металлический кобальт. Витамин Bi2 содержит кобальт в виде комплекса, который может быть ионизован при помощи об.- раб.ртки в автоклаве, а металлический кобальт может быть ионизован посредством ионизирующей функции микроорганиз- мов во врем культивации.

(IV). Культивирование/получение нит- рид-гидратазы

Бактери Rhodococcus rhodochrous в соответствии с насто щим .изобретением может культивироватьс при любых услови х , соответствующих цел м насто щего изобретени , за исключением того, что в культуральную среду добавл ютс мочевина или ее производные и ион кобальта.

Например, заранее определенные количества мочевины или ее производного и ионы кобальта добавл ют в основную питательную среду (описание основных сред см.ниже) и культивируют при температуре около 15-50°С, предпочтительно, около 20 45°С, а более предпочтительно, около 30°С, при рН от 7 до 9, в течение 30 часов или более, предпочтительно, в течение 40 часов или более (до, например, 120 часов).

Обща концентраци мочевины или ее производных в культуральной среде составл ет около 1-30 г/л, предпочтительно, около 2-20 г/л, а более предпочтительно, около 5-15 г/л, тогда как концентраци ионов ко- бальта составл ет около 5-15 мг/л (расчет проводилс исход из CoCte).

Основна питательна среда:

Культуральна среда А

Компонент Количество (в 1 л среды)

К2НР0413,4 г

КН2Р046,5 Г

NaCI1,0 г MgSOi7H20 0,2 г Витаминна смесь 0,1мл Дистиллированна остальное кол-во смесь (рН 7,0) Состав (в 1л раствора): Биотип 2,0 мкг

Пантотеиат кальци 0,4 мг

Инозит2,0 мг

Никотинова кислота 0,4 мг

Гидрохлорид тиамина 0,4мг

ПиридоксингидрохлориД0 ,4 мг

р-Аминобеизойна

кислота0,2 мг

Рибофлавин0,2 мг

Фолиева кислота0,01мг

Дистиллированна

водаостальное кол-во

Культуральна среда В

К2НР04 0,5 г

КН2Р040,5 г

MgS04 7H200,5 г

Дрожжевой экстракт -3,0 г

Дистиллированна остальное кол-во

. вода(рН 7,2) Культурэльна среда С Глюкоза 10 г К2НР04 0,5 г КН2Р04 0,5 г MgS04 7H20 . ,0,5 г Дрожжевой экстракт 1,0 г Пептон 7,5 г Дистиллированна остальное вода кол-во (рН 7,2) V. Экспериментальные примеры Изменение и определение феоментно.й

активности

(1) Метод измерени нитрил-гидратаз- ной активности

Нитрил-гидратазную активность определ ли следующим образом.

2 мл реакционного раствора, содержащего 1,0 мл бензонитрила (20 мм), 1,0 мл 3-цианопиридина (1 М)или 1,0 мл акрилнит- рила (1 М) в качестве субстрата; 0,5 мл калий-фосфатного буфера (0,1 М, рН 7.0); и заранее определенное количество бактериальных клеток (выделенных из культуральной жидкости), подвергали реагированию при 20°С в течение заранее определенного периода времени, а затем завершали реакцию добавлением 0,2 мл 1 н HCI.

(2) Определение нитрил-гидратазной активности

Ниже приводитс активность, определенна в случае специфической активности С.А. и в случае общей активности О.А.:

С.А. мкМ амид/мг-клетки/мин

О.А. мкМ эмид/мл-культуральна среда/мин

Пример 1. Заранее определенное количество мочевины добавл ли в описанную выше основную среду С, содержащую 10 мг/л CoCl2. К каждым 60 мл полученной культуральной среды добавл ли 4 мм прекультуралыюй жидкости, содержащей Rhociococcus rhodochrous, штамм 1-1 (FEPM ВР-1478) полученной с использованием основной среды С, и культивировали, при этом встр хива , при 28°С в течение 96 часов,

В цел х сравнени , аналогичное культивирование проводили в среде, содержа- .щей либо мочевину, либо CoCl2 в отдельности,

Полученные результаты систематизиро- ваны в таблице 1.

Результаты, приведенные в таблице 1, показывают, что добавление мочевины в сочетании с CoCl2 ол етсл крайне важным дл увеличени проду роознил нитрил- гидрэтазы.

Пример .. Штзм И подвергали культивированию в сеотоетстрии с описанием Р. Примере 1, при 28°С. п течение 3-120 часов, п основной с радо С, в присутствии 10 мг/л CoCI, добавл или не добавл л заранее определенное количество-индукторов ферментов (мочевину и КРОТОНЭММД). к,к показано таблице 2,

Значени С А. и О.А., приведенные в таблице 2, были получены при максимальных значени х С.А. во врем измерений активности .

Как випно ..з таблицы: пспольгоелние в качестве кндуктора фермента лишь одной мочезины без крптон,мчд приводит к значительному увеличению продуцировании нитрил-гидрэтаз.ы.

Пример 3. Заранее определенное количество произеодкых мочевины доб-ЗЕ)- л ли в основную среду.С. содержащую 10 мг/л CoCi2. К каждым GO tf.n полученной культурэльной среды добавл ли -4 мл про- культуральном жидкости, содержащей Rhodococcur, rhodoclirous, гшзмм 1-1 (FEPM ВР-14.78} полученной с использованием основной среды С. 11 культивировали, потр хива , при 28°С п течени 96 ЧЗСОЕ.

В цел х сравнени , аналогичное культипи- рование проводили в среде, содер ащей либо метилмочевину, либо CoClz по отдельности.

Результаты приведены в таблице 3, в которой значени С.А. и О.А. были получены

при максимальных значени х С.А. во врем измерени активности, В этой таблице добавлены дл контрол результаты, полученные дл 7,5 г/л мочеоины.

Результаты, приведенные в таблице, показывают , что добавление производного мочевины и СоС(2 ведет к значительному повышению продуциропани нитрил-гидратазы.

Claims

Формула изобретени

1. Способ культивировани бактерий - штамма Rhociococcus rhodochrous. продуцирующего нитрил-гидратазу на питательней среде н присутствии индуктора фермента .при оптимальных услови х биосинтеза, о т- л и ч а ю щ и ft с тем, что, с целью повышени активности нитрмл-гидрэтэзы, в качестве штамма используют Rhociococcus rhoiioc.hrous 1-1 FHRM BP № 1/178, а г исходную питательную среду дополнительно внос т источник иочоп кобэпы а и используемые в ха ептпс икдукторо фор- мен га мочаги ну илм проиополноо мочеу.ины формулы (П. (М) и (II)

RiR.NCONR2R4(I) где RI, R2, Нз и R х.аждыО вл етс -Hi-СНз или . т исключением того, VTO зсо зз- местители не пплпютс -М;

Rr RoNCOOC2H

00

где RS и RG кач/дый .- рл етс.ч -Н; -СНл или Csh s;

NH.CSNH2 (ill)

., Способ по п.1, о т л w ч э ю щ и и с Р тем, что концентрацию мочэв лны или ое проилподнык в питательной средо устаи е- лиоают от 1 до 30 г/л.

3. Способ по п.1, о т л л ч V ю 1ц и & с тем, что источником /опои ксбзлыл пл ег- с хлористый кобальт в концентрации от Г до 15 мг/л.

Приоритет по признакам:

06.10.88 - признаки пунктов. 1, 2, 3, рас- крыолющие использование культурлльной среды, содержащей одновременно коны кобальта /. МОЧСЕМНу.

23.02.89 - признаки пунхтогз 1,2,3, ргскры- ааюш.ие использование хультургшьной среды, содержащей одновременно ион кобальта и производные мочевины формул 1, 2, 3.

Продолжение табл.1

Таблица 2

Т-а блица 3