UA74768C2 - Method for preparing amides - Google Patents
Method for preparing amides Download PDFInfo
- Publication number
- UA74768C2 UA74768C2 UA2000021040A UA2000021040A UA74768C2 UA 74768 C2 UA74768 C2 UA 74768C2 UA 2000021040 A UA2000021040 A UA 2000021040A UA 2000021040 A UA2000021040 A UA 2000021040A UA 74768 C2 UA74768 C2 UA 74768C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- microorganisms
- nitrile
- strain
- amide
- genus
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 title claims abstract description 28
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 64
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 47
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 23
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 claims description 23
- GZPHSAQLYPIAIN-UHFFFAOYSA-N 3-pyridinecarbonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CN=C1 GZPHSAQLYPIAIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 108010024026 Nitrile hydratase Proteins 0.000 claims description 21
- -1 aliphatic nitrile Chemical class 0.000 claims description 15
- 101100502029 Zea mays EZ1 gene Proteins 0.000 claims description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 9
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 125000005245 nitryl group Chemical group [N+](=O)([O-])* 0.000 abstract 4
- 241000187643 Amycolatopsis Species 0.000 abstract 3
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 25
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 17
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 17
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 16
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 14
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 13
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 11
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 11
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MLIREBYILWEBDM-UHFFFAOYSA-N cyanoacetic acid Chemical compound OC(=O)CC#N MLIREBYILWEBDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 6
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 5
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 5
- HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 2-methyl-3-[(2e,6e,10e,14e)-3,7,11,15,19-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaenyl]naphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 0.000 description 4
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 150000001869 cobalt compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- BEOUGZFCUMNGOU-UHFFFAOYSA-N tuberculostearic acid Chemical compound CCCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O BEOUGZFCUMNGOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 4
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 4
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZONJATNKKGGVSU-UHFFFAOYSA-N 14-methylpentadecanoic acid Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCC(O)=O ZONJATNKKGGVSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JAUPUQRPBNDMDT-UHFFFAOYSA-N 2-chloropyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClC1=NC=CC=C1C#N JAUPUQRPBNDMDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGHSBPIZNUXPLA-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)=O JGHSBPIZNUXPLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N adiponitrile Chemical compound N#CCCCCC#N BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N butanamide Chemical compound CCCC(N)=O DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004227 calcium gluconate Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 2
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 2
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFMPMSCZPVNPEM-UHFFFAOYSA-N 2-bromobenzonitrile Chemical compound BrC1=CC=CC=C1C#N AFMPMSCZPVNPEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFKYQYMHJANOTR-UHFFFAOYSA-N 2h-pyrimidine-1-carbonitrile Chemical compound N#CN1CN=CC=C1 BFKYQYMHJANOTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DUJMVKJJUANUMQ-UHFFFAOYSA-N 4-methylpentanenitrile Chemical compound CC(C)CCC#N DUJMVKJJUANUMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEDJUAKXFJRZSG-UHFFFAOYSA-N 7-[3-[(3-acetylphenoxy)methyl]-1,5-dimethylpyrazol-4-yl]-3-(3-naphthalen-1-yloxypropyl)-1H-indole-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)c1cccc(OCc2nn(C)c(C)c2-c2cccc3c(CCCOc4cccc5ccccc45)c([nH]c23)C(O)=O)c1 GEDJUAKXFJRZSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- GYCMBHHDWRMZGG-UHFFFAOYSA-N Methylacrylonitrile Chemical compound CC(=C)C#N GYCMBHHDWRMZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N Pentanenitrile Chemical compound CCCCC#N RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 1
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005219 aminonitrile group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000008430 aromatic amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940011182 cobalt acetate Drugs 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940044175 cobalt sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000361 cobalt sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L cobalt(2+) sulfate Chemical compound [Co+2].[O-]S([O-])(=O)=O KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAHREYKOYSIQPH-UHFFFAOYSA-L cobalt(II) acetate Chemical compound [Co+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O QAHREYKOYSIQPH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NKKMVIVFRUYPLQ-NSCUHMNNSA-N crotononitrile Chemical compound C\C=C\C#N NKKMVIVFRUYPLQ-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- DFJYZCUIKPGCSG-UHFFFAOYSA-N decanedinitrile Chemical compound N#CCCCCCCCCC#N DFJYZCUIKPGCSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- FRKBLBQTSTUKOV-UHFFFAOYSA-N diphosphatidyl glycerol Natural products OP(O)(=O)OCC(OP(O)(O)=O)COP(O)(O)=O FRKBLBQTSTUKOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZTOMUSMDRMJOTH-UHFFFAOYSA-N glutaronitrile Chemical compound N#CCCCC#N ZTOMUSMDRMJOTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- QVNPFPNWMSOJCP-UHFFFAOYSA-N nitroso 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)ON=O QVNPFPNWMSOJCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXOYPGTWWXJFDI-UHFFFAOYSA-N nonanedinitrile Chemical compound N#CCCCCCCCC#N QXOYPGTWWXJFDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLZZPPHAMDJOSR-UHFFFAOYSA-N nonanenitrile Chemical compound CCCCCCCCC#N PLZZPPHAMDJOSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IPWFJLQDVFKJDU-UHFFFAOYSA-N pentanamide Chemical compound CCCCC(N)=O IPWFJLQDVFKJDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N propionitrile Chemical compound CCC#N FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- GPHQHTOMRSGBNZ-UHFFFAOYSA-N pyridine-4-carbonitrile Chemical compound N#CC1=CC=NC=C1 GPHQHTOMRSGBNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- IAHFWCOBPZCAEA-UHFFFAOYSA-N succinonitrile Chemical compound N#CCCC#N IAHFWCOBPZCAEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Опис винаходуDescription of the invention
Даний винахід стосується нових мікроорганізмів родів Асііпотадига, Атусоіаюрвзіз і Кподососсив, а також 2 нового способу одержання амідів з використанням цих мікроорганізмів, відповідно з використанням екстракту ферментів цих мікроорганізмів.This invention relates to new microorganisms of the genera Asiipotadiga, Atusoiyurvzis and Kpodosossiv, as well as 2 new methods of obtaining amides using these microorganisms, respectively using the extract of enzymes of these microorganisms.
Для одержання амідів, таких, як, наприклад, амід нікотинової кислоти, який є важливим для тварин і людей вітаміном комплексу вітамінів В, уже відомі численні біотехнологічні способи. Широко відомо, що мікроорганізми, які містять нітрилгідратазу, перетворюють нітрили на відповідні аміди. Так, (в ЕР-А 0188316) 70 описано спосіб одержання аміду нікотинової кислоти з З-ціанпіридину з використанням мікроорганізмів родівNumerous biotechnological methods are already known for obtaining amides, such as, for example, nicotinic acid amide, which is an important vitamin of the B vitamin complex for animals and humans. It is widely known that microorganisms containing nitrile hydratase convert nitriles into the corresponding amides. Thus, (in EP-A 0188316) 70 the method of obtaining nicotinic acid amide from 3-cyanopyridine using microorganisms of the genera
КПподососсиз, Агіпгобасіег або мікобактерій.KPpodososis, Agipgobasieg or mycobacteria.
Вадою цього способу є те, що дані мікроорганізми мають лише незначну активність щодо перетворенняThe disadvantage of this method is that these microorganisms have only a slight conversion activity
З-ціанпіридину на аміднікотинову кислоту.of z-cyanopyridine to amidnicotinic acid.
ІВ ЕР-А 0307926| описано перетворення З-ціанпіридину на амід нікотинову кислоту за допомогою 12 мікроорганізмів виду КПодососсивз гподоспгоие 01. Для того щоб ці мікроорганізми каталізували потрібне перетворення, їх слід індукувати.IV ER-A 0307926| described the conversion of 3-cyanopyridine to amide nicotinic acid with the help of 12 microorganisms of the species KPodosossivz gpodospgoie 01. In order for these microorganisms to catalyze the necessary transformation, they should be induced.
Ще однією вадою цього способу є те, що Кподососсиз гподоспгоиз У1 має червоне забарвлення і внаслідок цього відбувається фарбування продукту. Крім того, цей мікроорганізм має лише незначну теплостійкість і інгібується, наприклад, субстратом З-ціанпіримідином.Another disadvantage of this method is that Kpodosossiz gpodospgoiz U1 has a red color and as a result the product is stained. In addition, this microorganism has only a slight heat resistance and is inhibited, for example, by the substrate 3-cyanopyrimidine.
Ще один спосіб одержання аміду нікотинової кислоти з З-ціанпіридину за допомогою мікроорганізмів видуAnother method of obtaining nicotinic acid amide from 3-cyanopyridine with the help of microorganisms of the species
КПподососсив гподоспгоиз 21 описано Ів ЕР-А 0362829). Щоб підвищити питому активність мікроорганізмів, які містять нітрилгідратазу, у середовище для культивування у функції індуктора додають сечовину або похідне сечовини. При використанні цього способу, так само як і способу, описаного вище, відбувається фарбування продукту. с 29 Далі Ів УМО 95/17505) описано спосіб одержання ароматичних амідів з відповідних нітрилів за допомогою Ге) мікроорганізмів виду Кподососсиз гподоспгоиз МЗ3З Вадою цього способу є червоне забарвлення Кподососсиз гподоснгоиз М33, а також високе значення Км для субстрату З-ціанпіридину.KPpodosossiv gpodospgoiz 21 is described in EP-A 0362829). To increase the specific activity of microorganisms that contain nitrile hydratase, urea or a urea derivative is added to the culture medium as an inducer. When using this method, as well as the method described above, the product is dyed. p. 29 Further in IV UMO 95/17505) the method of obtaining aromatic amides from the corresponding nitriles using Ge) microorganisms of the species Kpodosossiz gpodosngoiz MZ3Z is described. The disadvantage of this method is the red color of Kpodosossiz gpodosngoiz M33, as well as a high value of Km for the substrate 3-cyanopyridine.
Завдання даного винаходу - усунути згадані вади і розробити такий спосіб одержання амідів, який забезпечував би одержання відповідних амідів з високим виходом і високим ступенем чистоти. соThe task of this invention is to eliminate the mentioned defects and to develop such a method of obtaining amides, which would ensure obtaining the corresponding amides with a high yield and a high degree of purity. co
Зазначене завдання вирішується за допомогою нових мікроорганізмів за п.п.1 і З, а також за допомогою Ге) способу за п.6.The specified task is solved with the help of new microorganisms according to clauses 1 and 3, as well as with the help of Ge) method according to clause 6.
Суть способу за винаходом полягає в тому, що використовуваний як субстрат нітрил перетворюють на - відповідний амід за допомогою мікроорганізмів роду Асііпотадига, Атусоіайорзіз або КПодососсив, за «І допомогою екстракту ферментів цих мікроорганізмів або за допомогою очищеної нітрилгідратази з 3о мікроорганізмів роду Атусоіаюрвзів або Асііпотадига. вThe essence of the method according to the invention is that the nitrile used as a substrate is converted into the corresponding amide with the help of microorganisms of the genus Asiipotadiga, Atusoiyorziz or KPodosossiv, with the help of the enzyme extract of these microorganisms or with the help of purified nitrile hydratase from 30 microorganisms of the genus Atusoiyurvziv or Asiipotadiga. in
Застосовувані для біотрансформації нітрили, такі, як, наприклад, З-ціанпіридин, являють собою сполуки, наявні у продажу.Nitriles used for biotransformation, such as, for example, 3-cyanopyridine, are commercially available compounds.
Мікроорганізми за винаходом мають здатність перетворювати використовувані як субстрат нітрили на « відповідні аміди. Бажано, щоб ці мікроорганізми мали здатність рости в середовищах, які містять нітрили або З 70 аміди як єдині джерела вуглецю і/або азоту. с Мікроорганізми за винаходом одержують шляхом відповідного відбору, наприклад, із зразків грунту, мулу абоMicroorganisms according to the invention have the ability to convert nitriles used as a substrate into the corresponding amides. It is desirable that these microorganisms have the ability to grow in media that contain nitriles or C 70 amides as the only sources of carbon and/or nitrogen. c Microorganisms according to the invention are obtained by appropriate selection, for example, from samples of soil, sludge or
Із» стічних вод за допомогою звичайних мікробіологічних методів. Доцільно здійснювати відбір мікроорганізмів шляхом вирощування в середовищі, яке в бажаному варіанті містить нітрили або аміди як єдині джерела вуглецю й азоту, в присутності іонів кобальту. Придатні для здійснення відбору нітрили й аміди являють собою насамперед нітрили, які також застосовують як субстрат для наступної біотрансформації, і відповідні це. одержувані з них аміди. Придатні для росту середовища також відомі спеціалістові в даній галузі; наприклад, «їз» може використовуватися середовище, подане в таблиці 1.From" wastewater using conventional microbiological methods. It is advisable to carry out the selection of microorganisms by growing in an environment, which in the preferred version contains nitriles or amides as the only sources of carbon and nitrogen, in the presence of cobalt ions. Nitriles and amides suitable for selection are primarily nitriles that are also used as a substrate for subsequent biotransformation, and corresponding to this. amides obtained from them. Suitable growth media are also known to those skilled in the art; for example, "iz" can use the environment given in Table 1.
Як правило, мікроорганізми до здійснення власне біотрансформації культивують (вирощують) у тих самих 7 умовах, застосовуючи при цьому вищезазначені середовища.As a rule, microorganisms are cultivated (raised) in the same 7 conditions before carrying out the actual biotransformation, using the above-mentioned environments.
Ге»! 20 Як відомо спеціалістам, нітрилгідратаза утвориться тільки тоді, коли середовище для росту містить іони кобальту як кофактор. Придатними "кобальтовими сполуками, що утворюють іони кобальту", є солі, які містять со Со?" або Со?", Прикладами солей, які містять Со 2" або Со?", є хлорид кобальту, сульфат кобальту й ацетат кобальту.Gee! 20 As is known to those skilled in the art, nitrile hydratase will only form when the growth medium contains cobalt ions as a cofactor. Suitable "cobalt compounds that form cobalt ions" are salts containing Co 2 " or Co 1 ", examples of salts containing Co 2 " or Co 1 " are cobalt chloride, cobalt sulfate and cobalt acetate.
У функції кобальтової сполуки доцільно застосовувати сіль, яка містить Со 2", таку, як, наприклад, Сосі ».As a cobalt compound, it is advisable to use a salt that contains Co 2", such as, for example, Sosi".
Вирощування можна також здійснювати в присутності вітаміну В» разом із металевим кобальтом або іншими (Ф) кобальтовими сполуками, які іп зйи дають іони кобальту. Доцільно застосовувати кобальтову сполуку в г кількості від 1 до 1Омг/л, бажано від 1 до Змг/л.Cultivation can also be carried out in the presence of vitamin B" together with cobalt metal or other (F) cobalt compounds, which also give cobalt ions. It is advisable to use a cobalt compound in g in the amount from 1 to 1Omg/l, preferably from 1 to Zmg/l.
Як правило, вирощування здійснюють при температурі від 20 до 502С і при значенні рН у діапазоні від 5 во до 8, бажано при температурі від 30 до 452 і значенні рН у діапазоні від 5,5 до 7,5.As a rule, cultivation is carried out at a temperature from 20 to 502C and at a pH value in the range from 5 to 8, preferably at a temperature from 30 to 452 and a pH value in the range from 5.5 to 7.5.
Власне біотрансформацію можна здійснювати за допомогою мікроорганізмів родів Асііпотадига,Biotransformation itself can be carried out with the help of microorganisms of the genus Asiipotadiga,
Атусоіаїрзіз, з використанням екстракту ферментів цих мікроорганізмів або з використанням очищеної нітрилгідратази з цих мікроорганізмів. Доцільно здійснювати біотрансформацію з використанням мікроорганізмів виду Асііпотадига зрадіх, наприклад, ізолятів Асііпотадига зрадіх ЕЗ3733, Асііпотадига зрадіх ЕЗ37З6, 65 Асііпотадига зрадіх 45А32, Асііпотадига зрадіх 4501 або Асііпотадига зрадіх С15. Бажано біотрансформацію здійснювати з використанням мікроорганізмів, які належать до видів Атусоіаїрвзгіз МЕЗ1 і Атусоіаїюрвзіз МА40,Atusoiairziz, using an extract of enzymes of these microorganisms or using purified nitrile hydratase from these microorganisms. It is advisable to carry out biotransformation using microorganisms of the Asiipotadiga zradih species, for example, isolates of Asiipotadiga zradih EZ3733, Asiipotadiga zradih EZ37Z6, 65 Asiipotadiga zradih 45A32, Asiipotadiga zradih 4501 or Asiipotadiga zradih C15. It is desirable to carry out biotransformation using microorganisms that belong to the species Atusoiairvziz MEZ1 and Atusoiairvziz MA40,
або їх функціонально еквівалентних варіантів і мутантів. Особливо бажано застосовувати мікроорганізми, які належать до виду Атусоіаїрзіз МА40. Мікроорганізми зазначених видів, згідно з Будапештським договором, було депоновано 03.06.1997р. у Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (Оецізспе Заттішпу мопor their functionally equivalent variants and mutants. It is especially desirable to use microorganisms that belong to the species Atusoiairziz MA40. Microorganisms of the specified species, in accordance with the Budapest Treaty, were deposited on June 3, 1997. in the German collection of microorganisms and cell cultures (Oecizspe Zattispu mop
Мікгоогдапізтеп па 7ейкийигеп (тр, Мазспегодеплед ІБ, О0-38124, Брауншвейг, Німеччина) під назвамиMikgoogdapiztep pa 7eykyygep (tr, Mazspegodepled IB, О0-38124, Braunschweig, Germany) under the names
Атусоіаїюрзіз МЕЗ1 і АтусоїІаюрзіз МА40, вони дістали реєстраційні номери О5М7 11616 і відповідно О5М2 11617. Обидва ці мікроорганізми було точніше ідентифіковано і зараховано до ще не описаних в літературі видів роду Атусоїарзвів.Atusoiyurziz MEZ1 and AtusoiIyurziz MA40, they got the registration numbers О5М7 11616 and О5М2 11617, respectively. Both of these microorganisms were more precisely identified and included among the species of the genus Atusoiarzvi not yet described in the literature.
Таким чином, винахід також стосується мікроорганізмів роду Атусоіаїорзіз або Асііпотадига, які мають /о Здатність перетворювати амід на нітрил, насамперед мікроорганізмів, які мають назву Атусоіафрзіз МА4О (05М7 11617) і Атусоіаюрвіз МЕЗ1 (05МА 11616).Thus, the invention also relates to microorganisms of the genus Atusoiorziz or Asiipotadiga, which have the ability to convert an amide into a nitrile, first of all, microorganisms named Atusoiorziz MA4O (05М7 11617) and Atusoiorviz MEZ1 (05МА 11616).
При створенні винаходу далі було встановлено, що деякі мікроорганізми роду КПодососсиз мають кращі характеристики щодо перетворення нітрилів на аміди в порівнянні з Кподососсив гподоспгоив 1, (описаним вDuring the creation of the invention, it was further established that some microorganisms of the genus Kpodosossiz have better characteristics regarding the conversion of nitriles to amides in comparison with Kpodosossiv gpodospgoiv 1, (described in
ЕР-А 0362829)|. Цими мікроорганізмами є КПодососсиз (СЕ674, КПподососсиз ОЕ578, КПподососсиз ОГ473, 7/5 КПодососсиз 5270 (05МИ 12211) І КПодососсиз 5ЕЗ376 (05МИ 12175) або їх функціонально еквівалентні варіанти і мутанти. Згідно з Будапештським договором, в Німецьку колекцію мікроорганізмів і клітинних культур 15.05.1998р. було поміщено мікроорганізм, який має реєстраційний номер ЮО5М2 12175, а 08.06.1998р. було поміщено мікроорганізм, який має реєстраційний номер ОМА 12211.ER-A 0362829)|. These microorganisms are KPodosossiz (СЕ674, KPodosossiz OE578, KPodosossiz OG473, 7/5 KPodosossiz 5270 (05МИ 12211) and KPodosossiz 5ЕЗ376 (05МИ 12175) or their functionally equivalent variants and mutants. According to the Budapest Treaty, in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures 15.05 In 1998, a microorganism with registration number ЮО5М2 12175 was placed, and on June 8, 1998, a microorganism with registration number ОМА 12211 was placed.
Штами Кподососсив СЕ270, СЕЗ376, СЕ473, СЕ578 і ОГ674 після ідентифікації зараховано до ще не описанихKpodosossiv strains СЕ270, СЕЗ376, СЕ473, СЕ578 and ОГ674 after identification were included in the not yet described
В науковій літературі видів роду КПодососсив. Таким чином, винахід також стосується мікроорганізмівIn the scientific literature, species of the genus KPodosossiv. Thus, the invention also relates to microorganisms
КПподососсиз СЕ270, Кподососсив СЕ376, Кподососсиз СЕ473, Кподососсиз СЕ578 і Кподососсиз Е674.Kpodosossiz CE270, Kpodosossiv CE376, Kpodosossiz CE473, Kpodosossiz CE578 and Kpodosossiz E674.
На відміну від мікроорганізмів роду Асііпотадига, відповідно Атусоіайрзіз мікроорганізми родуIn contrast to microorganisms of the genus Asiipotadiga, respectively, microorganisms of the genus Atusoiairziz
КПподососсиз доцільно індукувати перед їхнім використанням для власне біосинтезу. Як індуктори придатні (описані в ЕР-А 0307926) індуктори, такі, як, наприклад, ацетамід, амід масляної кислоти, метакриламід, амід сч пропіонової кислоти, кротонамід і амід валеріанової кислоти.It is advisable to induce KPodosossiz before using them for actual biosynthesis. Suitable inducers (described in EP-A 0307926) are inducers such as, for example, acetamide, butyric acid amide, methacrylamide, propionic acid amide, crotonamide and valeric acid amide.
Під "функціонально еквівалентними варіантами і мутантами" розуміють мікроорганізми, які походять із і) вищевказаних організмів-попередників і володіють в основному такими ж властивостями і функціями, що й останні. Такі варіанти і мутанти можуть виникати випадково, наприклад, у результаті опромінення ультрафіолетовим світлом, або під дією хімічних речовин, які викликають мутації. со зо Ідентифікація Атусоіаїрвзіз МА4О (Се)"Functionally equivalent variants and mutants" means microorganisms that come from i) the above-mentioned predecessor organisms and have basically the same properties and functions as the latter. Such variants and mutants can arise accidentally, for example, as a result of exposure to ultraviolet light, or under the action of chemicals that cause mutations. Identification of Atusoiairvziz MA4O (Se)
Колір повітряного міцелію білий їм-The color of the aerial mycelium is white to
Колір субстратного міцелію жовто-гарячийThe color of the substrate mycelium is yellow-hot
Колір пігменту, який дифундував - «ІThe color of the pigment that diffused - "I
Спектр цукрів МSpectrum of sugars M
АРА хARA h
ГАЛ хGAL h
МАД -MAD -
Кси - « глю сліди шщ с РИБ ж ц Тип А "» ДАП пі.Ksi - « глю traces шщ с РИБ ж ц Type A "» DAP pi.
Менахінон (у 95)Menaquinone (in 95)
ВА - - | 9/0 9/2 х ть 9/А вк -і 9/6 - 9/8 -VA - - | 9/0 9/2 h t 9/A vk -i 9/6 - 9/8 -
Ф Гомологія 165-Р.ДНК 96,95 со Фосфоліпіди, такі як ФЕ, ОН-ФЕ, лізо-ФЕ, мет-ФЕ, ФХ, ФГА, ФИ, ФИМ, ФГ, ДФГ, ГЛ не досліджувалиF Homology 165-R.DNA 96.95 co Phospholipids, such as FE, OH-FE, lyso-FE, met-FE, FH, FHA, FI, FIM, FG, DFG, GL were not studied
Жирні кислоти ізо-16 ж ізо-15 й ізо-17 (У о антеізо-15 (У о антеїізо-17 (У 10-Ме-16 - 60 10-Ме-17 - 2-0ОН-15 я 2-ОН-16 яFatty acids iso-16 and iso-15 and iso-17 (U o anteiso-15 (U o antheiiso-17 (U 10-Me-16 - 60 10-Me-17 - 2-0OH-15 and 2-OH- 16 me
Тип ЗгType Zg
Мк - б5Mk - b5
Ідентифікація Атусоіаїрзів МЕЗ1Identification of Atusoiairz MEZ1
Колір повітряного міцелію білийThe color of aerial mycelium is white
Колір субстратного міцелію жовтогарячийThe color of the substrate mycelium is yellow-hot
Колір пігменту, який дифундував -The color of the pigment that diffused -
Спектр цукрівSpectrum of sugars
АРА кARA k
ГАЛ кGAL k
МАД -MAD -
КсИи -KsIy -
Глю слідиLook at the tracks
РИБ кFISH k
Тип АType A
ДАП рDAP r
Менахінон (у 95) 8/4 - 9/0 9/2 к 9/А жк 9/6 й 9/8 -Menaquinone (in 95) 8/4 - 9/0 9/2 k 9/A zhk 9/6 and 9/8 -
Гомологія 165-Р.ДНК 96,195Homology 165-R.DNA 96,195
Фосфоліпіди, такі, як ФЕ, ОН-ФЕ, лізо-ФЕ, мет-ФЕ, ФХ, ФГА, ФИ, ФИМ, ФГ, ДФГ, ГЛ не досліджувалиPhospholipids such as FE, OH-FE, lyso-FE, met-FE, FH, FHA, FI, FIM, FG, DFG, GL were not studied
Жирні кислоти се ізо-16 вк о ізо-15 к ізо-17 (У антеізо-15 (У антеїізо-17 (У со 10-Ме-1б - «соFatty acids se iso-16 vk o iso-15 k iso-17 (U anteiso-15 (U antheiiso-17 (U so 10-Me-1b - "so
Ю-Ме-17 к 2-ОнА5 « ї- 2-ОН-16 я «ЇїYu-Me-17 k 2-OnA5 " i- 2-ON-16 i "Her
Тип Зг мк Й і -Type Zg mk Y and -
Скорочення і пояснення, які використовувалися при ідентифікації (9 1-5990 « 40 . Б1Бо; ші с жк 15-3096 ч нижня 230 " » ДАЛ діамінопімедінова кислотаAbbreviations and explanations used for identification (9 1-5990 « 40 . B1Bo; shi s zhk 15-3096 h lower 230 " » DAL diaminopimedic acid
АРА арабінозаARA arabinose
ГАЛ галактоза - МАД мадуроза «» Кси ксилоза глю глюкоза ш- РИБ рибоза (Ге) 20 Типи цукрів дані згідно з І еспемаїіег й ін., 1971GAL galactose - MAD madurose "" Xy xylose Glu glucose sh- RYB ribose (He) 20 Types of sugars given according to I espemaiieg and others, 1971
Типи жирних кислот дані згідно з Кгоррепвіваії, 1985 і 1992 і42) 9/4 МК-9 (На) 9/6 МК-9 (Нв) 9/8 МК-9 (Нв) й йThe types of fatty acids are given according to Kgorrepvivaii, 1985 and 1992 and42) 9/4 MK-9 (Na) 9/6 MK-9 (Nv) 9/8 MK-9 (Nv) and
Мк міколові кислотиMk mycolic acids
ГФ) ФЕ фосфатидилетаноламін ко ОН-ФЕ гідрокси-ФЕ мет-ФЕ фосфатидилметилетаноламін 60 ох фосфатидилхолінHF) FE phosphatidylethanolamine ko OH-FE hydroxy-FE met-FE phosphatidylmethylethanolamine 60 oh phosphatidylcholine
ФГА фосфатидилглюкозамінFGA phosphatidylglucosamine
ФІ фосфатидилінозитолFI phosphatidylinositol
ФІМ фосфатидилінозитолманозидFIM phosphatidylinositol mannoside
ФГ фосфатидилгліцерин 65 дФг дифосфатидилгліцерин гл гліколіпідFG phosphatidylglycerol 65 dFG diphosphatidylglycerol gl glycolipid
Жирні кислоти ізо-16 ізогексадеканові кислоти або 14-метилпентадеканові кислоти 10-Ме-18 туберкулостеаринова кислота 2-0нН-16 2-гідроксипальмітинова кислотаFatty acids iso-16 isohexadecanoic acid or 14-methylpentadecanoic acid 10-Me-18 tuberculostearic acid 2-0nH-16 2-hydroxypalmitic acid
Ідентифікація штамів СЕ270, СЕ376, СЕ473, СЕ578 і СЕ674Identification of strains CE270, CE376, CE473, CE578 and CE674
Ідентифікацію цих штамів проводили на основі 5 незалежних один від одного характеристик 1. Морфологія і колір колоній: Короткі розгалужені гіфи, що розпадаються на елементи, які нагадують )0 палички і спори. Колонії штамів ЗЕ270 і СЕ376 мають рожево-червоний колір (КАГ. 3022), а колонії штамів СЕ578 і СЕ674 мають яскраво-червоний колір (КАГ. 3012). 2. Діамінокислоти пептидогліканів: Мезодіамінопімелінова кислота.The identification of these strains was carried out on the basis of 5 mutually independent characteristics 1. Morphology and color of colonies: Short branched hyphae breaking up into elements that resemble )0 rods and spores. Colonies of strains CE270 and CE376 have a pink-red color (KAG. 3022), and colonies of strains CE578 and CE674 have a bright red color (KAG. 3012). 2. Diamino acids of peptidoglycans: Mesodiaminopimelic acid.
З. Міколові кислоти: міколові кислоти КПодососсив: Визначення міколової кислоти з довгим ланцюгом здійснювали за допомогою високотемпературної газової хроматографії. Профілі елюювання міколових кислот штамів СЕ270 і БЕ376, а також штамів ЗЕ473, ЗЕ578 і ЗЕ674 були ідентичними. Ланцюги міколових кислот штамів СЕ270 і СЕЗ376 містили 38-46 атомів вуглецю, а ланцюги міколових кислот штамів СЕ473, 5Е578 і СЕ674 містили 40-48 атомів вуглецю. Характеристики міколових кислот порівнювали із характеристиками міколових кислот штамів Кподососсив. Штам СЕ270 було ідентифіковано з дуже низьким коефіцієнтом кореляції (0,086) як належний до виду КПподососсиз гподоспгоив; СЕ376 не можна було ідентифікувати цим методом. Інші три ізолятиC. Mycolic acids: Mycolic acids KPodosossiv: Determination of long-chain mycolic acid was carried out using high-temperature gas chromatography. The elution profiles of mycolic acids of strains CE270 and BE376, as well as strains ZE473, ZE578 and ZE674 were identical. The chains of mycolic acids of strains CE270 and SEZ376 contained 38-46 carbon atoms, and the chains of mycolic acids of strains CE473, 5E578 and CE674 contained 40-48 carbon atoms. The characteristics of mycolic acids were compared with the characteristics of mycolic acids of Kpodosossiv strains. Strain CE270 was identified with a very low correlation coefficient (0.086) as belonging to the species KPpodosossiz gpodospgoiv; CE376 could not be identified by this method. The other three isolates
Сг473, БЕ578 і ОЕб674 було ідентифіковано з дуже низьким коефіцієнтом кореляції як належні до видуСг473, БЕ578 and ОЕб674 were identified with a very low correlation coefficient as belonging to the species
КПподососсиз гибег. 4. Спектр жирних кислот: Нерозгалужені насичені і ненасичені жирні кислоти, включаючи туберкулостеаринову кислоту. Спектр жирних кислот є діагностичною ознакою для представників усіх родівKPpodosossiz hybeg. 4. Spectrum of fatty acids: Unbranched saturated and unsaturated fatty acids, including tuberculostearic acid. The spectrum of fatty acids is a diagnostic feature for representatives of all genera
КПподососсиз і споріднених родів Місорасіегішт, Мосагаїа, Оівеїгіа, ТгиКатигеїІа і деяких видів коринебактерій. счKPpodosossis and related genera Misorasiegisht, Mosagaia, Oiveigia, TgyKatigeiIa and some species of corynebacteria. high school
Ідентифікацію на видовому рівні здійснювали на основі кількісних і якісних розходжень характеристик жирних кислот штамів СЕ270, СЕЗ376, СЕ473, СЕ578 і ОБ674 і жирних кислот видів Кподососсив. о 5. Часткові послідовності 168-РДНК штамів СЕ270 і СЕЗ376 були ідентичними (10095), хоча порівняння їх з послідовностями штамів Кподососсиз виявило подібність тільки на 99,195 із найбільш спорідненим видомIdentification at the species level was carried out on the basis of quantitative and qualitative differences in the characteristics of fatty acids of strains СЕ270, СЕЗ376, СЕ473, СЕ578 and ОБ674 and fatty acids of Kpodosossiv species. o 5. The partial sequences of 168-rDNA of strains CE270 and SEZ376 were identical (10095), although their comparison with the sequences of Kpodosossiz strains revealed a similarity of only 99.195 with the most closely related species
КПподососсиув гподоспгоив. со зо Штами ОГЕ473 і СЕ578 мали ідентичні послідовності 168-РДНК (10095). Штам СЕ674 мав відмінність від штамуKPpodosossiuv gpodospgoiv. strain ОГЭ473 and СЕ578 had identical sequences of 168-RDNK (10095). The CE674 strain was different from the strain
СЕ578 тільки в одній парі основ із 500 (99,895). Усі три ізоляти мали лише віддалену родинну подібність із іс),CE578 in only one base pair out of 500 (99.895). All three isolates were only distantly related to is),
КПподососсиз соргорпйиз (98,490). чнKPpodosossiz sorghorpyiz (98,490). chn
На основі хемотаксичних і молекулярно-біологічних даних можна зробити висновок про те, що Е270 іBased on chemotactic and molecular biological data, it can be concluded that E270 and
СЕЗ376, з одного боку, і ЗЕ473, БЕ578 і БЕб674, з іншого боку, являють собою штами двох нових видів «SEZ376, on the one hand, and ZE473, BE578 and BEb674, on the other hand, are strains of two new species "
КПподососсив. За своїми послідовностями 168-ЯДНК штами СОЕ270 і 5Е376б є спорідненими з Кподососсив їч- гподоснгоиз (99,195), а штами ЗЕ473, СЕ578 і зЕ674 мають лише віддалену родинну подібність із Кподососсиз соргорпйиз (98,4905).KPPodosossiv According to their 168-DNA sequences, strains SOE270 and 5E376b are related to Kpodosossis ych-hpodosngoiz (99.195), and strains ZE473, CE578, and ZE674 have only a distant family resemblance to Kpodosossis sorhorpyiz (98.4905).
Екстракт ферментів можна отримати шляхом добре відомого фахівцям руйнування мікроорганізмів, наприклад, за допомогою ультразвуку, за допомогою преса типу Френч або з використанням лізозиму. « 20 Очевидно, що для здійснення способу цей екстракт ферментів, так само як і цілі клітини мікроорганізмів, можна ш-в імобілізувати на придатному носії, який являє собою полімер, або абсорбувати на придатному носії. с Ферменти за винаходом, які мають нітрилгідратазну активність, можна отримати із мікроорганізмів роду :з» Атусоіаюрзів, насамперед із штаму АтусоїЇаїрзіз МА4О (05М7 11617), і вони мають здатність перетворювати нітрил в амід.Enzyme extract can be obtained by destroying microorganisms well known to specialists, for example, using ultrasound, using a French press or using lysozyme. 20 It is obvious that for the implementation of the method, this extract of enzymes, as well as whole cells of microorganisms, can be immobilized on a suitable carrier, which is a polymer, or absorbed on a suitable carrier. c Enzymes according to the invention, which have nitrile hydratase activity, can be obtained from microorganisms of the genus Atusoiurzis, primarily from the strain Atusoiirzis MA4O (05М7 11617), and they have the ability to convert nitrile into amide.
Основними властивостями цих ферментів є такі: - а) рН-оптимум становить 6,5--1,0; б) температурний оптимум при рН7,0 має межі 35-4020; те в) значення Ку для субстрату З-ціанпіридину становить 41,7 --7,7м (202С, 45мММ фосфатний буфер, рН7,0), -і насамперед ферменти мають г) молекулярну масу 105кДа, що можна визначити, наприклад, за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ. б Як субстрат для біотрансформації можуть застосовуватися в принципі будь-які нітрили. Доцільно со застосовувати або аліфатичні нітрили, які містять від 17 до 10 атомів вуглецю, у разі потреби заміщені, наприклад, гідроксигрупою, аміногрупою, галогеном або карбоксигрупою, або заміщені чи незаміщені ароматичні нітрили, які містять від 4 до 10 атомів вуглецю в ароматичній кільцевій системі. Як аліфатичні нітрили, якіThe main properties of these enzymes are as follows: - a) pH-optimum is 6.5--1.0; b) the temperature optimum at pH7.0 has limits of 35-4020; that c) value of Ku for the substrate 3-cyanopyridine is 41.7-7.7m (202С, 45 mM phosphate buffer, pH7.0), and first of all enzymes have d) a molecular weight of 105 kDa, which can be determined, for example, using electrophoresis in DSN-PAGE. b In principle, any nitriles can be used as a substrate for biotransformation. It is convenient to use either aliphatic nitriles containing from 17 to 10 carbon atoms, optionally substituted by, for example, a hydroxy group, an amino group, a halogen or a carboxy group, or substituted or unsubstituted aromatic nitriles containing from 4 to 10 carbon atoms in the aromatic ring system . Like aliphatic nitriles, which
Містять від 1 до 10 атомів вуглецю, можуть застосовуватися динітрили, гідроксинітрили, амінонітрили, такі, як, наприклад, н-октаннітрил, ціаноцтова кислота, ізокапронітрил, н-валеронітрил, адипонітрил, глутаронітрил, іФ) сукцинонітрил, себаконітрил, пропіонітрил, кротонітрил, акрилнітрил, метакрилнітрил, нітрил н-масляної ко кислоти або азеланітрил. Як ароматичні нітрили, які містять від 4 до 10 атомів вуглецю, можуть застосовуватися нітрили загальних формул 60 б5 в? (СЯ--сх | або 5 ІїContaining from 1 to 10 carbon atoms, dinitriles, hydroxynitriles, aminonitriles can be used, such as, for example, n-octanenitrile, cyanoacetic acid, isocapronitrile, n-valeronitrile, adiponitrile, glutaronitrile, iF) succinonitrile, sebaconitrile, propionitrile, crotonitrile, acrylonitrile , methacrylonitrile, nitrile of n-butyric acid or azelanitrile. How can aromatic nitriles containing from 4 to 10 carbon atoms, nitriles of the general formulas 60 b5 b be used? (SYA--sh | or 5 Ii
МM
М де В її 2 позначають атом водню, атом галогену або С.--С;алкіл. Атом галогену може являти собою РЕ, Сі,M where B and 2 denote a hydrogen atom, a halogen atom or C.--C.alkyl. The halogen atom can be PE, Si,
Вг або .).Vg or .).
С.-Слалкіл може являти собою метил, етил, пропіл, ізопропіл, трет-пропіл, бутил, ізобутил або трет-бутил.C-Slalkyl can be methyl, ethyl, propyl, isopropyl, tert-propyl, butyl, isobutyl or tert-butyl.
Придатними представниками ароматичних нітрилів загальної формули І або || є 2-, 3- або 4-ціанпіридин, 75 бензонітрил, фтор-, хлор-, бромбензонітрил, наприклад, орто-, мета-, пара-хлорбензонітрил або 2-хлор-3-ціанпіридин. Бажано як ароматичний нітрил, який містить від 4 до 10 атомів вуглецю, застосовуватиSuitable representatives of aromatic nitriles of the general formula I or || is 2-, 3- or 4-cyanopyridine, 75 benzonitrile, fluoro-, chloro-, bromobenzonitrile, for example ortho-, meta-, para-chlorobenzonitrile or 2-chloro-3-cyanopyridine. It is preferable to use an aromatic nitrile containing from 4 to 10 carbon atoms
З-ціанпіридин.Z-cyanopyridine.
Біотрансформацію із застосуванням одноразового або безперервного завантаження субстрату доцільно проводити таким чином, щоб концентрація субстрату не перевищувала 4Омас.9о, бажано ЗОмас.9о.Biotransformation using one-time or continuous loading of the substrate should be carried out in such a way that the concentration of the substrate does not exceed 4Omas.9o, preferably ZOos.9o.
Спосіб доцільно здійснювати з використанням клітин-споживачів (які не ростуть).It is advisable to carry out the method using consumer cells (which do not grow).
Як середовища для біотрансформації придатні звичайні в даній галузі техніки середовища, такі, як, наприклад, низькомолярний фосфатний буфер, буфер НЕРЕ5 (М-2-гідроксіетилпіперазин-М'-2-етансульфонова кислота), цитратний буфер, боратний буфер, середовища, склад яких поданий у таблицях 1-3, або їхні модифіковані форми, такі як, наприклад, середовище, описане в прикладі 8(1), або буфер трис-НСЇ. ГаAs media for biotransformation, media techniques conventional in this field are suitable, such as, for example, low-molar phosphate buffer, HERE5 buffer (M-2-hydroxyethylpiperazine-M'-2-ethanesulfonic acid), citrate buffer, borate buffer, media whose composition presented in Tables 1-3, or modified forms thereof, such as, for example, the medium described in Example 8(1), or Tris-HCl buffer. Ha
Біотрансформацію доцільно проводити при температурі від О до 502С і при значенні рН у діапазоні від 4,5 до 10, бажано при температурі від 20 до 402С і при значенні рН у діапазоні від 4,5 до 10,0. оIt is advisable to carry out biotransformation at a temperature from 0 to 502C and at a pH value in the range from 4.5 to 10, preferably at a temperature from 20 to 402C and at a pH value in the range from 4.5 to 10.0. at
В оптимальному варіанті здійснення біотрансформацію можна проводити в присутності С 4-Саспиртів. ЯкIn the optimal variant of implementation, biotransformation can be carried out in the presence of C 4-Alcohols. As
С.-С/спирти можуть застосовуватися метанол, етанол, пропанол або бутанол. Бажано застосовувати метанол.C.-C/alcohols can be used methanol, ethanol, propanol or butanol. It is preferable to use methanol.
На закінчення перетворення відповідні аміди можна виділити за допомогою звичайних методів (ее) перероблення, наприклад, за допомогою кристалізації. сAt the end of the conversion, the corresponding amides can be isolated using conventional (ee) processing methods, for example, by crystallization. with
ПрикладиExamples
Приклад 1 ї-Example 1
Культивування мікроорганізмів родів Асііпотадига і Атусоіарзів « а) У різні зразки грунту, поміщені в збагачувальне середовище, склад якого наведено у таблиці 1, вносили різноманітні нітрили або аміди як джерела вуглецю й азоту й інкубували протягом 7-10 днів при 372С або 459 -Cultivation of microorganisms of the genera Asiipotadiga and Atusoiarzi "a) Various nitriles or amides were introduced as sources of carbon and nitrogen into various soil samples placed in the enrichment medium, the composition of which is given in Table 1, and incubated for 7-10 days at 372С or 459 -
Після цього культури пересівали в таке ж середовище і ще раз культивували протягом 7-10 днів при 3720. Весь процес повторювали тричі. Після цього культури розріджували і висівали на планшети для одержання окремих колоній. Планшети інкубували протягом 5 днів при 372С. Після цього різноманітні колонії піддавали тестуванню « на необхідну активність.After that, the cultures were transplanted into the same medium and cultivated again for 7-10 days at 3720. The whole process was repeated three times. After that, the cultures were diluted and sown on plates to obtain individual colonies. Tablets were incubated for 5 days at 372C. After that, the various colonies were tested for the required activity.
Таким шляхом виділяли штами Атусоіаїрзів МА40 (055472 11617) і АтусоїІаїрвіз МЕЗ1 (05МА 11616) і потім З с вирощували їх в оптимізованому середовищі (таблиця 3) при струшуванні протягом 90-100год. при 37260. "» Для Атусоіаїюрзів МЕЗ1 (05М4М72 11616), Асіпотадига зрадіх Е3733 і Асіпотадига зрадіх Е3736 як джерело " вуглецю й азоту використовували адипонітрил, для Атусоіаїорзіз МА40О (0547 11617) і Асііпотадига зрадіх 45А32 як джерело вуглецю й азоту використовували азеланітрил, для Асііпотадига зрадіх 4501 як джерело вуглецю й азоту використовували н-октанітрил, а для Асііпотадига зрадіх С15 як джерело вуглецю й азоту і використовували ціаноцтову кислоту. ї» б) Штам Атусоїіаюрзіз МА40О культивували в середовищі, склад якого подано в таблиці 3. Культивування здійснювали в субкультурах (у пробірках об'ємом 4мл) і в "основній культурі" (у колбах об'ємом 500мл) вIn this way, the strains of Atusoiairz MA40 (055472 11617) and Atusoiairviz MEZ1 (05MA 11616) were isolated and then they were grown in an optimized environment (table 3) with shaking for 90-100 hours. at 37260. "» Adiponitrile was used as a source of carbon and nitrogen for Atusoiaiiurs MEZ1 (05М4М72 11616), Asipotadiga zaradih E3733 and Asipotadiga zaradih E3736, for Atusoiaiorziz MA40O (0547 11617) and Asipotadiga zaradih 45A32, carbon was used as a source of carbon and nitrogen. zradih 4501 used n-octanitrile as a source of carbon and nitrogen, and for Asiapotadig zradih C15 used cyanoacetic acid as a source of carbon and nitrogen. b) The strain Atusoiiaurzis MA40O was cultivated in the medium whose composition is given in Table 3. Cultivation was carried out in subcultures (in tubes with a volume of 4 ml) and in the "main culture" (in flasks with a volume of 500 ml) in
Ше аеробних умовах при температурі 372С протягом 2, відповідно 3-4 днів. Ріст клітин вимірювалиUnder aerobic conditions at a temperature of 372C for 2, respectively 3-4 days. Cell growth was measured
Ге) 20 турбідиметричним методом при довжині хвилі 6б1Онм і суху масу клітин обраховували в такий спосіб маса сухих со клітин (у мг/мл) хОГело нм х 0,277. о ю зо ідодативодудолірнеи-тЗ б5He) 20 by the turbidimetric method at a wavelength of 6b1Onm and the dry mass of cells was calculated in this way: the mass of dry cells (in mg/ml) xOHelo nm x 0.277. o yu zo idodativodudolirnei-tZ b5
Основне середовище додати воду до ббмлРНТО о 5 додати воду до ббмлі(г тоThe main medium add water to bbmlRNTO at 5 add water to bbml(g to
Приклад 2Example 2
Біотрансформація з використанням мікроорганізмів родів Асііпотадига і Атусоіаюрвзів (1) Для визначення нітрилгідратазної активності реакційну суміш (2мл), яка містить З3-ціанпіридин (1,0М, 1,Омл), калій-фосфатний буфер (рН7,0, О,1М, 0,5мл) і О,5мл суспензії клітин, інкубували при перемішуванні при 209 протягом ЗОхв. Реакцію припиняли шляхом додавання О0,2мл Зн. НСЇ. Після короткочасного центрифугування визначали вміст утвореного нікотинаміду за допомогою ЖХВР (система типу Зпітадги 5РО бА з С18-колонкою (ЮОемеїові 005-нНО-5, 4,6х 250см); розчинник: 10МмМ КНоРО,/НзРО, (рна2,в8)/ацетонітрил (в с 29 об'ємному співвідношенні 9:1); швидкість потоку: мл/хв; абсорбцію вимірювали при 23Онм). Питому активність (9 виражали у вигляді кількості (у мкмолях) утвореного нікотинаміду/мл/хв./ОГ 640 нм.Biotransformation using microorganisms of the genera Asiipotadiga and Atusoiyurves (1) To determine nitrile hydratase activity, a reaction mixture (2 ml) containing 3-cyanopyridine (1.0 M, 1.0 ml), potassium phosphate buffer (pH7.0, O.1 M, 0 .5 ml) and 0.5 ml of cell suspension, incubated with stirring at 209 for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 0.2 ml of Zn. NSI After short-term centrifugation, the content of the formed nicotinamide was determined by HPLC (Zpitadga 5PO baA type system with a C18 column (YuOemeiovi 005-nHO-5, 4.6x 250 cm); solvent: 10 mM KNoRO,/NzRO, (рна2,в8)/acetonitrile ( in 29 volume ratio 9:1); flow rate: ml/min; absorbance was measured at 23 Ohm). Specific activity (9) was expressed as the amount (in μmol) of nicotinamide formed/ml/min/OG 640 nm.
Швидкості перетворення аліфатичних нітрилів у збагачувальному середовищі (таблиця 1) з використанням виділених бактерій подано в таблиці 5, вплив індукторів і кофакторів, внесених в основне середовище (таблиця 2), подано в таблиці 4, а порівняння активності Атусоіаюрвзів і Кподососсив в основному середовищі (таблиця со 2) подано в таблиці б. Дані з таблиці 4 свідчать про те, що нітрилгідратаза з Атусоіайрзіз МА40 «со експресується конститутивним чином, проте для виявлення активності у функції кофактора потрібен кобальт. (2) Вплив температури на ріст штаму МА4О -The rates of conversion of aliphatic nitriles in the enrichment medium (table 1) using isolated bacteria are presented in table 5, the influence of inducers and cofactors introduced into the basic medium (table 2) is presented in table 4, and the comparison of the activity of Atusoiyurvs and Kpodosossivs in the basic medium (table so 2) is presented in table b. The data from Table 4 indicate that nitrile hydratase from Atusoiirziz MA40 is constitutively expressed, but cobalt is required to detect activity in the cofactor function. (2) The influence of temperature on the growth of strain MA4O -
Субкультури (2мл) інкубували в середовищі, поданому в таблиці З, протягом 2 днів при 3729С, потім їх «Ж пересівали в 20мл середовища, поданого в таблиці 3, яке міститься в струшувальних колбах. Культивування проводили при 37, 40, 45, 50 і 559С протягом 3-4 днів при струшуванні. Вимірювали ріст клітин і оцінювали - нітрилгідратазну активність при 2020. У таблиці 7 подано дані про вплив температури на нітрилгідратазну активність і ріст клітин. « 7 З - ї» сю 100111ю80000010001110656Subcultures (2 ml) were incubated in the medium given in Table C for 2 days at 3729C, then they were subcultured into 20 ml of the medium given in Table 3 contained in shake flasks. Cultivation was carried out at 37, 40, 45, 50 and 559C for 3-4 days with shaking. Cell growth was measured and nitrile hydratase activity was evaluated at 2020. Table 7 presents data on the effect of temperature on nitrile hydratase activity and cell growth. "7 Z - i" syu 100111ю80000010001110656
Еепролаюам| о6600000000950000010000000м45 4 - т -Eeprolayuam| o6600000000950000010000000m45 4 - t -
Ф ст юю со о т во 65F st yu so o t wo 65
50 ДТ ення (мкмолі/мл/хв.) 3-ціанпіридину50 DT (µmole/ml/min) of 3-cyanopyridine
ШИ іні війн вніс протеїну) " 3-ціанпіридину (3) Для визначення активності штаму МА4О щодо інших субстратів клітини із сухою масою 0,0388мМг інкубували в описаному вище буфері. Реакцію починали шляхом додавання відповідного субстрату і суміш інкубували при струшуванні протягом 1Охв. при 202С. Реакцію припиняли, додаючи 0,2мл 2н. НОЇ, і реакційну суміш центрифугували протягом короткого проміжку часу.(3) To determine the activity of the MA4O strain against other substrates, cells with a dry weight of 0.0388 mg were incubated in the buffer described above. The reaction was started by adding the appropriate substrate and the mixture was incubated with shaking for 1 hour at 202С The reaction was stopped by adding 0.2 ml of 2N NOA, and the reaction mixture was centrifuged for a short period of time.
Надосадову рідину аналізували за допомогою ЖХВР або газової хроматографії. У таблиці 8 наведено умови дослідів із визначення специфічності щодо субстрату, а в таблиці 9 подано дані щодо специфічності спочиваючих клітин штаму МА40 стосовно різних субстратів.The supernatant was analyzed by HPLC or gas chromatography. Table 8 shows the conditions of experiments to determine substrate specificity, and Table 9 shows data on the specificity of resting cells of the MA40 strain in relation to various substrates.
Відповідні умови дослідів узагальнено в таблиці 8, а результати - у таблиці 9. сч зв о с щ і м ч зв м ч 4 2 с . що - їх - | Примітка: орто-, мета-, пара-хлорбензонітрил і 2-хлор-3-ці«анпіридин додали в реакційну суміш у виглядіThe relevant conditions of the experiments are summarized in Table 8, and the results are summarized in Table 9. that - them - | Note: ortho-, meta-, para-chlorobenzonitrile and 2-chloro-3-cyanopyridine were added to the reaction mixture as
Ф 50 розчину в метанолі. со з о т бензонтрил 00000057 0000ацентрил/////17711-111 во ортосхлорбензонітрил | 96 00000 (нбутиронтрил 1111194 (4) Температурний оптимум клітин у спокої та їхня теплостійкістьF 50 solution in methanol. so z o t benzontrile 00000057 0000acentryl/////17711-111 in orthochlorobenzonitrile | 96 00000 (nbutyrontril 1111194 (4) Temperature optimum of resting cells and their heat resistance
Реакцію проводили протягом 1Охв. у стандартній реакційній суміші. Температурний оптимум був у діапазоні 65 Від 35 до 402С (мал.5). Після цього клітини інкубували протягом ЗОхв. при різноманітних температурах і оцінювали активність у стандартних реакційних умовах. Як видно з мал.4, теплостійкість зберігалася приблизно до 4096. (5) рН-оптимум і рН-стабільність клітин у спокоїThe reaction was carried out for 1 min. in a standard reaction mixture. The temperature optimum was in the range of 65 From 35 to 402C (Fig. 5). After that, the cells were incubated for 30 min. at various temperatures and activity was evaluated under standard reaction conditions. As can be seen from Fig. 4, the heat resistance remained approximately up to 4096. (5) pH-optimum and pH-stability of cells at rest
Для визначення цих характеристик проводили реакцію протягом 1Охв. у стандартній реакційній суміші, в якійTo determine these characteristics, the reaction was carried out for 1 hour. in a standard reaction mixture in which
Ккалій-фосфатний буфер заміняли різноманітними 0,1М буферами. Як видно з мал.б, оптимальне значення рн має діапазон від 4,5 до 10. Після інкубації клітинної суспензії протягом ЗОхв. при 20 «С при різноманітних значеннях рН клітини центрифугували. Потім клітини промивали і ресуспендували в 0,1М калій-фосфатному буфері з рН7,0. Реакцію проводили протягом 1Охв. у стандартних умовах, додаючи 3-ціанпіридину. Фермент залишався стабільним при значеннях рн у діапазоні від 4,5 до 10,0 (мал.7). (6) Накопичення нікотинаміду. одержуваного з З-ціанпіридину з використанням штаму МА40The potassium phosphate buffer was replaced by various 0.1M buffers. As can be seen from Fig.b, the optimal pH value ranges from 4.5 to 10. After incubation of the cell suspension for 30 minutes. at 20 °C at various pH values, the cells were centrifuged. Then the cells were washed and resuspended in 0.1M potassium phosphate buffer with pH7.0. The reaction was carried out for 1 min. under standard conditions by adding 3-cyanopyridine. The enzyme remained stable at pH values in the range from 4.5 to 10.0 (Fig. 7). (6) Accumulation of nicotinamide. obtained from Z-cyanopyridine using MA40 strain
Реакцію проводили в реакційній суміші (ЗОмл), яка містить 500мММ З-ціанпіридин, 4Ом калій-фосфатний буфер (рН7,О) і клітини у спокої (суха маса 2,3мг). У ході реакції 7 раз додали З-ціанпіридин (50Ом) відповідно до витрати попередньої порції. Таким чином, протягом 15год. було внесено 4,0 молі З-ціанпіридину, у результаті утворилося 3,89 молів (475г/л) нікотинаміду, який відповідає виходові 97,395. Нікотинова кислота не 75 утворювалася.The reaction was carried out in a reaction mixture (3 ml) containing 500 mM 3-cyanopyridine, 4 Ω potassium phosphate buffer (pH7.0) and cells at rest (dry weight 2.3 mg). During the reaction, 3-cyanopyridine (50 Ω) was added 7 times in accordance with the consumption of the previous portion. Thus, within 15 hours. 4.0 moles of Z-cyanopyridine were added, resulting in the formation of 3.89 moles (475g/l) of nicotinamide, which corresponds to a yield of 97.395. Nicotinic acid was not formed.
Приклад ЗExample C
Ідентифікація мікроорганізмів роду АтусоіарзівIdentification of microorganisms of the genus Atusoiarz
Ідентифікація грунтувалася на використанні таких 5 хемотаксономічних маркерів: 1. Діагностична амінокислота пептидоглікану: мезо-діамінопімелінова кислота. 2. Діагностичні цукри: арабіноза і галактоза.Identification was based on the use of the following 5 chemotaxonomic markers: 1. Diagnostic amino acid of peptidoglycan: meso-diaminopimelic acid. 2. Diagnostic sugars: arabinose and galactose.
З. Міколові кислоти: міколових кислот немає. 4. Менахінон: МК-9 (Ну). 5. Спектр жирних кислот: ізо/антеізо-розгалужені і 2-гідроксижирні кислоти, крім того, виявлено незначні кількості 10-метилрозгалужених жирних кислот. Такий спектр жирних кислот виявлено у всіх представників роду єQ. Mycolic acids: no mycolic acids. 4. Menaquinone: MK-9 (Nu). 5. Spectrum of fatty acids: iso/antheiso-branched and 2-hydroxy fatty acids, in addition, small amounts of 10-methyl branched fatty acids were detected. Such a range of fatty acids was found in all representatives of the genus
Атусоїіаюрзіз (спектр жирних кислот Зі).Atusoiiaurziz (spectrum of fatty acids Z).
Комбінація цих хімічних ознак достатня для виявлення всіх видів роду Атусоіайорзвгів. і)The combination of these chemical features is sufficient to identify all species of the genus Atusoiayorzvgi. and)
Характеристики жирних кислот обох культур порівнювали з інформацією, наявною в банку даних жирних кислот, з використанням аналізу основних компонентів. За допомогою цього методу виявилося можливим зарахувати як штам МЕЗ1, так і штам МА40 до роду Атусоїіайорзіз, проте здійснити видову ідентифікацію ее виявилося неможливим, тому що коефіцієнт кореляції був надто низьким. Проте на основі порівняння спектра жирних кислот обох штамів було встановлено, що вони являють собою два штами, які належать до ї-оі різноманітних видів. ч-The fatty acid characteristics of both crops were compared with information available in the Fatty Acid Data Bank using principal component analysis. With the help of this method, it turned out to be possible to include both strain MEZ1 and strain MA40 in the genus Atusoiiajorziz, but species identification was impossible because the correlation coefficient was too low. However, based on the comparison of the spectrum of fatty acids of both strains, it was established that they are two strains that belong to different species. h-
Цей факт було підтверджено результатами аналізу послідовності 165-6ДНК. У цьому випадку також було встановлено належність до роду Аптусоіайорвзіз, однак належність до жодного з описаних видів роду ЗThis fact was confirmed by the results of the analysis of the 165-6 DNA sequence. In this case, it was also established that it belongs to the genus Aptusoiyorvzis, but it does not belong to any of the described species of the genus C
Атусоіаюрвзів не було встановлено. За допомогою цього методу шляхом прямого секвенування було визначено ч- послідовність 165-РДНК, отримана в результаті ампліфікації з використанням ПЦР гена 165-рДНК. Діагностичну частину послідовності 165-рДНК порівнювали з послідовностями типових представників видів родуNo attorneys have been established. Using this method, the h-sequence of 165-rDNA obtained as a result of PCR amplification of the 165-rDNA gene was determined by direct sequencing. The diagnostic part of the 165-rDNA sequence was compared with the sequences of typical representatives of the species of the genus
Атусоіаїрзіз і родинних таксонів. Результати показали, що штам належить до роду Атусоїіарвзів. Було « виявлено найбільшу подібність з Атусоіа(орвіз теїпапоїїса, що становить для штаму МА40 96,995 і для штаму МЕЗ1 96,195. Подібність послідовностей обох штамів між собою становила 99,095. Дослідження заявників, - с проведені на представниках роду Атусоїіайрзіз, свідчать про те, що для надійної ідентифікації видів ц коефіцієнт кореляції повинен бути вищим ніж 99,595. Оскільки розмір 96,995 істотно менший ніж 99,595, то можна "» припустити, що обидва ізоляти не належать до представників відомих видів Атусоіафорзвів.Atusoiairziz and related taxa. The results showed that the strain belongs to the genus Atusoiiarvsi. The greatest similarity with Atusoia (orviz teipapoiis) was found, which is 96.995 for the MA40 strain and 96.195 for the MEZ1 strain. The sequence similarity of both strains was 99.095. species identification, the correlation coefficient should be higher than 99.595. Since the size of 96.995 is significantly smaller than 99.595, it can be assumed that both isolates do not belong to representatives of known species of Atusoiaphorzv.
На основі поданих результатів ізоляти не можна зарахувати до будь-якого з відомих видів Атусоіаорзів.Based on the presented results, the isolate cannot be assigned to any of the known species of Atusoiaorz.
Заявники виходили з того, що МА40 і МЕЗ1 являють собою штами двох нових, дотепер не описаних видів роду -І Атусоіафрзвів. ї» Ідентифікаційні характеристики мікроорганізмів соду Атусоїафоозів -і Колір повітряного міцеліюThe applicants assumed that MA40 and MEZ1 are strains of two new, so far undescribed species of the genus -I Atusoiafrzvi. і» Identification characteristics of microorganisms of soda Atusoiaphooziv -i Color of aerial mycelium
Колір субстратного міцеліюThe color of the substrate mycelium
Ме, Колір пігменту, який дифундував о Спектр цукрів кMe, The color of the pigment that diffused o Spectrum of sugars k
АРАAra
ГАЛ хGAL h
МАД -MAD -
Кси - і) глю У іме) РИБ яKsi - i) glu In the name) FISH i
Тип А 60 ДАП рі.Type A 60 DAP ri.
Менахінон (у 95)Menaquinone (in 95)
ВА - 9/0 (9 9/2 х б5 9/4 жк 9/6 -VA - 9/0 (9 9/2 x b5 9/4 zhk 9/6 -
Гомологія 168-РДНК 299,59Homology 168-RDNK 299.59
ФосфоліпідиPhospholipids
ФЕ хFe h
ОН-ФЕ я лізо-ФЕ - мет-ФЕ -ON-FE I lyso-FE - met-FE -
Фх -Fx -
ФГА -FHA -
ФІ хFI x
ФІМ іFIM and
ФГ х дФг х гл «FG x dFG x hl «
Тип ПЕОН-ФЕPEON-FE type
Жирні кислоти ізо-16 ж ізо-15 к ізо-17 (ю) антеізо-15 к антеїізо-17 (У 10-Ме-16 (9 10-Ме-17 - с 29 2-ОН-15 - о 2-ОН-16 яFatty acids iso-16 and iso-15 k iso-17 (u) antheiso-15 k antheiiso-17 (U 10-Me-16 (9 10-Me-17 - with 29 2-OH-15 - o 2-OH - 16 me
Тип ЗгType Zg
Мк - сMk - p
Приклад 4 «соExample 4 "co
Очищення нітрилгідратази з мікроорганізму штаму МА40Purification of nitrile hydratase from the microorganism strain MA40
Штам культивували при 372С протягом З днів у середовищі, склад якого наведено у таблиці 3. Клітини в. 2-літрової культури збирали центрифугуванням і потім ресуспендували в 0,8595-ому розчині Масі. Після цього « клітини переносили в 0,1М калій-фосфатний буфер (рН7,0), який містить 44мМ н-масляну кислоту, і обробляли 3о ультразвуком. Екстракт клітин центрифугували і відокремлювали клітинний дебрис. Цей екстракт застосовували - для очищення ферменту.The strain was cultivated at 372C for 3 days in the medium, the composition of which is given in Table 3. Cells in A 2-liter culture was collected by centrifugation and then resuspended in 0.8595 Massey's solution. After that, the cells were transferred to 0.1M potassium phosphate buffer (pH7.0), which contains 44mM n-butyric acid, and treated with 3o ultrasound. The cell extract was centrifuged and the cellular debris was separated. This extract was used to purify the enzyme.
Протягом усього очищення застосовували калій-фосфатний буфер (рнН7,0), який містить 44мММ н-масляну кислоту. Як видно з таблиці 10, фермент після трьох стадій очищення досягав гомогенного стану. « з -; с хз 11101011 | Загальнаактивність (одиниці) | Загальний протеїн (мг) | Питома активність (од/мг) | Збагачення : з в.Throughout the purification, a potassium phosphate buffer (pH7.0) containing 44 mM n-butyric acid was used. As can be seen from Table 10, the enzyme reached a homogeneous state after three stages of purification. « with -; с хз 11101011 | Total activity (units) | Total protein (mg) | Specific activity (units/mg) | Enrichment: from
ЧК»Cheka"
Приклад 5 і Вивчення властивостей нітрилгідратазиExample 5 and Study of the properties of nitrile hydratase
Ф 50 (1) Визначення молекулярної маси, структури субодиниць і вмісту іонів кобальтуF 50 (1) Determination of molecular weight, structure of subunits and content of cobalt ions
За допомогою хроматографії на колонках типу 53000 БМУУ (0,75х бОсм) із Т2К-гелем з використанням 0,1М со калій-фосфатного буфера (рнН7,0) із додаванням 0,2М КСІ ї 44мМ н-масляної кислоти було встановлено, що молекулярна маса дорівнює 10бкДа. Було виявлено, що фермент складається з 2 різних субодиниць А ів, молекулярні маси яких відповідно дорівнюють 30000 і 26000 Да. 59 На мал.1 показано діаграму визначення молекулярної маси за допомогою хроматографії на колонці 53000By means of chromatography on columns of type 53000 BMUU (0.75x bOsm) with T2K-gel using 0.1 M sodium phosphate buffer (pH7.0) with the addition of 0.2 M KSI and 44 mM n-butyric acid, it was established that the molecular the mass is 10 bkDa. It was found that the enzyme consists of 2 different A subunits, the molecular masses of which are 30,000 and 26,000 Da, respectively. 59 Figure 1 shows a diagram of molecular weight determination using chromatography on a 53000 column
ГФ) ЗМУ із Т2К-гелем.GF) ZMU with T2K-gel.
На мал.2 показано діаграму визначення молекулярної маси за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ. о На мал.3 показано спектр поглинання очищеного ферменту. Було виявлено широку смугу поглинання при 300-40Онм. 6о (2) Специфічність очищеного ферменту щодо субстратуFigure 2 shows a diagram of molecular weight determination using electrophoresis in SDS-PAGE. Figure 3 shows the absorption spectrum of the purified enzyme. A wide absorption band was found at 300-40 Ohms. 6о (2) Specificity of the purified enzyme with respect to the substrate
Визначення специфічності щодо субстрату проводили аналогічно до прикладу 2(1). Результати подано в таблиці 11. б5 Специфічність очищеної нітрилгідратази щодо субстратуDetermination of substrate specificity was carried out similarly to example 2(1). The results are presented in Table 11. b5 Specificity of the purified nitrile hydratase with respect to the substrate
Субстрат (М) (Загальна активність (мкмолімліхв)) 00000000 Відноснаактивність() 000000 о ртхлорбенюнтвии 015 1000022411010070101111119860 метахлоренюнтви! 015 100000159111011100111111111151 охлор-зціанлівидин ИБІ 16618016 ветнтя 00040 іSubstrate (M) (Total activity (µmmol)) 00000000 Relative activity() 000000 about rtchlorbenyuntvii 015 1000022411010070101111119860 metachlorbenyuntvii! 015 100000159111011100111111111151 ochlor-zcyanlividin IBI 16618016 vetntya 00040 and
У реакційну суміш (2,0мл) додали 1,7 одиниці ферменту. Реакційна суміш містила відповідний субстрат в 45ММ фосфатному буфері (рН70). (3) Визначення значення Ку1.7 units of enzyme were added to the reaction mixture (2.0 ml). The reaction mixture contained the appropriate substrate in 45 mM phosphate buffer (pH70). (3) Determination of the value of Ku
Значення Ку, яке визначали на основі діаграми І іпеу"'еамег-Вигк, для З-ціанпіридину становить 41,7мМ, а для акрилнітрилу З,7ММ. Порівняння зі штамом КПодососсуив гпподоспгоиз 21, в якого значення К у дляThe value of Ku, which was determined on the basis of the Ipeu"'eameg-Vigk diagram, for 3-cyanopyridine is 41.7 mM, and for acrylonitrile is 3.7 mM. Comparison with the strain KPodosossuiv gppodospgoiz 21, in which the value of K for
З-ціанпіридину становить 200мММ, показує, що даний параметр у штаму МА40 має істотно меншу величину. Це су одна з основних переваг штаму МА40. (4) Теплостійкість і температурний оптимум оC-cyanopyridine is 200 mM, which shows that this parameter is significantly lower in the MA40 strain. This is one of the main advantages of the MA40 strain. (4) Heat resistance and temperature optimum o
Очищений фермент інкубували при різних температурах протягом ЗОхв. при рН? і потім протягом їхв. при 209 оцінювали перетворення З-ціанпіридину на амід нікотинової кислоти. При температурі вище ніж 40 С фермент втрачав активність. (ее)The purified enzyme was incubated at different temperatures for 30 minutes. at pH? and then during their at 209, the conversion of 3-cyanopyridine to nicotinic acid amide was evaluated. At a temperature higher than 40 C, the enzyme lost its activity. (uh)
Теплостійкість, як і у випадку клітин у спокої, зберігалася приблизно до 402С, температурний оптимум був у с діапазоні від 35 до 402С (мал.5). (5) рН-оптимум і рН-стабільність оHeat resistance, as in the case of cells at rest, remained approximately up to 402C, the temperature optimum was in the range from 35 to 402C (Fig. 5). (5) pH-optimum and pH-stability o
Для визначення цих характеристик проводили реакцію перетворення З-ціанпіридину на амід нікотинову «т кислоту при 2092С в реакційній суміші (2,0мл), яка містить різні буфери (42,5мММ), 1,71 одиниці очищеногоTo determine these characteristics, the reaction of conversion of 3-cyanopyridine to nicotinic acid amide was carried out at 2092C in a reaction mixture (2.0 ml) containing various buffers (42.5 mM), 1.71 units of purified
Зо ферменту і Б00мМ З-ціанпіридин. рН-Оптимум становив приблизно 6,5--1,0 (мал.8). -From the enzyme and B00mM Z-cyanopyridine. pH-Optimum was approximately 6.5--1.0 (Fig. 8). -
Щоб оцінити рН-стабільність, інкубували 4,2 одиниці очищеного ферменту протягом год. при 202 в різних буферах (45мМ). Частина інкубованого розчину (1,71 одиниці) додали в стандартну реакційну суміш (порівн. приклад 2(1)). Оцінювали збережену активність. Фермент зберігав стабільність при значеннях рН у діапазоні від « 5 до 9. Результати подано на мал.9. 70 (6) Інгібітори 8 с Оцінювали вплив різноманітних інгібіторів. Результати узагальнено в таблиці 12. ;» ще в 00000000 гTo assess pH stability, 4.2 units of the purified enzyme were incubated for an hour. at 202 in different buffers (45 mM). Part of the incubated solution (1.71 units) was added to the standard reaction mixture (cf. example 2(1)). The preserved activity was evaluated. The enzyme remained stable at pH values in the range from 5 to 9. The results are shown in Fig. 9. 70 (6) Inhibitors 8 s The effect of various inhibitors was evaluated. The results are summarized in Table 12. ;" back in 00000000
В. ахлортутсенйна ета 00000000100059B. achlorotungsten eta 00000000100059
Фу со Фентдаино 00118 овтфеннтяяно 00000019Fu so Fentdyano 00118 ovtfenntyaino 00000019
Ф. ю во ідетилдитокарбамат 1 0111ввF. yu vo idetilditocarbamate 1 0111vv
Приклад 6Example 6
Вплив метанолу на клітини М спокої штаму МА4ОEffect of methanol on resting M cells of MA4O strain
Реакцію проводили протягом 1Охв. при різноманітних концентраціях (0-2006.95) метанолу в реакційних сумішах, склад яких наведено в таблиці 13. Як видно з таблиці 14, активність підвищується при додаванні 5-1595 бо метанолу.The reaction was carried out for 1 min. at various concentrations (0-2006.95) of methanol in the reaction mixtures, the composition of which is given in Table 13. As can be seen from Table 14, the activity increases with the addition of 5-1595 bo of methanol.
меня 00100013 блмліогмліолмт лют, о 61 20меня 00100013 blmliogmliolmt February, at 61 20
Приклад 7Example 7
Накопичення мікроорганізмів роду Кподососсив сч 25 Різні зразки грунту вносили в збагачувальне середовище, склад якого наведено в таблиці 1 і яке містило як о джерело вуглецю й азоту ціаноцтову кислоту, і згідно з методом, описаним в прикладі 1, виділяли мікроорганізми Кподососсив СЕ270, БЕ575, ОЕ473 і СЕЗ376.Accumulation of microorganisms of the genus Kpodosossiv ch 25 Different soil samples were introduced into the enrichment medium, the composition of which is shown in Table 1 and which contained cyanoacetic acid as a source of carbon and nitrogen, and according to the method described in example 1, microorganisms Kpodosossiv СЕ270, БЕ575, ОЕ473 were isolated and SEZ376.
Приклад 8Example 8
Біотрансформація з використанням мікроорганізмів роду Кподососсив со р рмац р роор роду 3о (1) Теплостійкість мікроорганізмів КпПодососсиз (3674. КПодососсиз (Е578. КПодососсиз СБ270 і «0Biotransformation using microorganisms of the genus Kpodosossiv so r rmats r roor genus 3o (1) Heat resistance of microorganisms KpPodosossiz (3674. KPodosossiz (E578. KPodosossiz SB270 and "0
Кподососсив СЕЗ376 порівняно з Кподососсив гподоспгоив .1.Kpodosossiv SEZ376 compared to Kpodosossiv gpodospgoiv .1.
Для визначення теплостійкості, перераховані вище мікроорганізми культивували в нижчеописаних ге середовищах. чІTo determine heat resistance, the microorganisms listed above were cultivated in the below-described he environment. ch.i
Штам Кподососсив гподоспгоиз 01 культивували протягом 72год. у середовищі, описаному в ЕР-А 0307926. 35 Мікроорганізми Кподососсиз СЕ674, Е578, ОЕ270 і СЕ376 культивували протягом проміжку часу до 9бгод. при - рнН7,О у таких середовищах.Strain Kpodosossiv gpodospgoiz 01 was cultivated for 72 hours. in the medium described in EP-A 0307926. 35 Microorganisms Kpodosossiz CE674, E578, OE270 and CE376 were cultivated for up to 9 hours. at - рН7,О in such environments.
Штам Кподососсив СЕ674 культивували в середовищі, що містить 1,0г/л екстракту дріжджів, 5,Ог/л фруктози, 10,Ог/л солодового екстракту, 5,Ог/л ацетаміду, 2,0г/л КНоРО», 0,5г/л МазО»Х. 7Н2О і 10,Омг СосСі». 6НьО. Штам « 20 Кподососсиз СЕ578 культивували в середовищі, що містить 1,0г/л екстракту дріжджів, 15,Ог/л фруктози, 10,Ог/л -в солодового екстракту, 25,0г/л ацетаміду, 2,0 /л КНоРО), 0,5г/л М950; 7НЬО і 50Омг СоСі» 6НьЬО. Штам с Кподососсиз СЕ270 культивували в середовищі, що містить 12,5г/л екстракту дріжджів, 5,0г/л цитрату натрію, :з» 7,5г/л метакриламіду, 2,Ог/л КНоРО»), 0,5г/л Ма5зО, 7НьЬО і З0Омг СоСі» 6Н»О. Штам КПодососсуиз Е376 культивували в середовищі, що містить 1,0г/л екстракту дріжджів, 10,Ог/л цитрату натрію, 15,0г/л солодового екстракту, 7,5г/л бутираміду, 2,0Ог/л КНоРО», 0,5г/л Ма5зО, 7Н»2О і 15,0мг Сосі» 6Н2О. -1 Потім клітини у спокої інкубували протягом 15хв. при різноманітних температурах, після чого визначали збережену активність у стандартних реакційних умовах згідно з прикладом 2(1). т. При цьому було встановлено, що штам Кподососсиз СЕ674 при температурі 5023 має відносну активність, -1 близьку до 10095, а при 602С ще зберігає приблизно 1095 активності. Штам Кподососсиз СЕ578 при температурі 502С також має відносну активність, що становить 10090, і має відносну активність, що становить 2095 при 6020.The strain Kpodosossiv CE674 was cultivated in a medium containing 1.0 g/l yeast extract, 5.0 g/l fructose, 10.0 g/l malt extract, 5.0 g/l acetamide, 2.0 g/l KNoRO", 0.5 g /l MazO»Kh. 7H2O and 10,Omg SosSi". 6NhO. Strain "20 Kpodosossiz CE578 was cultivated in a medium containing 1.0 g/l of yeast extract, 15.0 g/l of fructose, 10.0 g/l of malt extract, 25.0 g/l of acetamide, 2.0 g/l of KNoRO) , 0.5 g/l M950; 7NO and 50Omg SoSi" 6NO. The strain Kpodosossiz CE270 was cultivated in a medium containing 12.5 g/l yeast extract, 5.0 g/l sodium citrate, 7.5 g/l methacrylamide, 2.0 g/l KNoRO), 0.5 g/l Ма5зО, 7ХНХО and З0Омг СоСи» 6Н»О. Strain KPodosossuiz E376 was cultivated in a medium containing 1.0 g/l of yeast extract, 10.0 g/l of sodium citrate, 15.0 g/l of malt extract, 7.5 g/l of butyramide, 2.0 g/l of KNoRO», 0, 5 g/l of Ма5зО, 7Н»2О and 15.0 mg of Sosi» 6Н2О. -1 Then the cells were incubated at rest for 15 minutes. at various temperatures, after which the retained activity was determined under standard reaction conditions according to example 2(1). t. At the same time, it was established that the strain Kpodosossiz CE674 at a temperature of 5023 has a relative activity of -1 close to 10095, and at 602С it still retains approximately 1095 of activity. Cpodosossiz strain CE578 at 502C also has a relative activity of 10090 and has a relative activity of 2095 at 6020.
Фо Штам Кподососсиз СЕ376 має 10095-у відносну активність при температурі до 502, 7095-у активність при 6020 с і при 702 зберігає ще приблизно 595-у відносну активність. Кподососсиз СЕ270 має майже 100965-у відносну активність при температурі до 609 і також ще зберігає при 70922 5965-у відносну активність. Порівняно з цим штам Кподососсив гподоспгоиз 91 зберігає до 502С 10095-у відносну активність, при 602 має 80905-у активність і при 702С повністю втрачає активність.Fo Strain Kpodosossiz CE376 has 10095th relative activity at temperature up to 502, 7095th activity at 6020 s and at 702 retains approximately 595th relative activity. Kpodosossiz CE270 has almost 100965th relative activity at temperature up to 609 and also still retains at 70922 5965th relative activity. Compared with this strain Kpodosossiv gpodospgoiz 91 retains 10095th relative activity up to 502С, at 602 it has 80905th activity and at 702С it completely loses activity.
ГФ! Таким чином, можна стверджувати, що штами КпПодососсиз (3ЗЕ270 і БЕ376 мають кращу теплостійкість порівняно зі штамом 1, при цьому штам СЕ270 має найвищу теплостійкість. о (2) Оптимальне значення рН для штамів КподососсивGF! Thus, it can be stated that KpPodosossis strains (3ZE270 and BE376 have better heat resistance compared to strain 1, while strain CE270 has the highest heat resistance. o (2) Optimal pH value for Kpodosossiv strains
Вплив значення рН на нітрилгідратазну активність штамів Кподососсив СЕ674, БЕ578, ЗЕ270 і СБЕ376 60 визначали аналогічно до прикладу 2(5).The influence of the pH value on the nitrile hydratase activity of strains Kpodosossiv CE674, BE578, ZE270 and СBE376 60 was determined similarly to example 2(5).
Оптимальне значення рН для штаму Кподососсив СЕ674 становить 7,5-9,5, для СЕ578 становить 8-8,5, дляThe optimal pH value for the strain Kpodosossiv CE674 is 7.5-9.5, for CE578 it is 8-8.5, for
СЕ270 становить 6-7,0 і для СЕЗ376 становить 6-8. (3) Специфічність штамів Кподососсив щодо субстратуCE270 is 6-7.0 and for CEZ376 is 6-8. (3) Substrate specificity of Kpodosossiv strains
Дані про специфічність щодо субстрату у вигляді значень відносної активності узагальнено в таблиці 15. 65 (4) Накопичення нікотинаміду штамами КподососсивData on substrate specificity in the form of relative activity values are summarized in Table 15. 65 (4) Accumulation of nicotinamide by Kpodosossiv strains
Штами Кподососсиз СЕ674, СЕ578, ОБ270 і ОБЗ376 культивували аналогічно до прикладу 2(6) з використанням як субстрат З-ціанпіридину (приблизно 500м). При цьому штам Кподососсив ЗЕ674 продукував протягом 25год. б6М нікотинаміду, штам СЕ578 продукував протягом 1Огод. 5,5М нікотинаміду, штам СЕ270 продукував протягом 20год. приблизно 8,5М нікотинаміду і штам ЗЕЗ376 продукував протягом 20год. 7,5М нікотинаміду. (5) Толерантність активності штамів Кподососсив щодо З-ціанпіридинуKpodosossiz strains CE674, CE578, OB270 and OBZ376 were cultivated similarly to example 2(6) using 3-cyanopyridine (approximately 500m) as a substrate. At the same time, the strain Kpodosossiv ZE674 produced within 25 hours. b6M of nicotinamide, strain CE578 produced within 1 hour. 5.5 M of nicotinamide, strain CE270 produced within 20 hours. approximately 8.5 M of nicotinamide and strain ZEZ376 produced within 20 hours. 7.5M of nicotinamide. (5) Tolerance of the activity of Kpodosossiv strains to 3-cyanopyridine
Для вивчення толерантності щодо З3-ціанпіридину клітини у спокої інкубували протягом 15хв. при 20 С при концентраціях З-ціанпіридину в діапазоні від 1 до 1095 (мас/об.), після чого клітини центрифугували. Після промивання клітин 0,8595-им Масі вимірювали збережену активність. 70 Толерантність щодо З-ціанпіридину як субстрат вивчали при різноманітних концентраціях субстрату. Було встановлено, що при концентрації субстрату 295 (мас/об.) нітрилгідратазна активність штаму КПодососсив гподоспгоив 41 знижується в 1,4 рази, нітрилгідратазна активність штаму Кподососсив СЕ674 знижується в 1,4 рази при концентрації субстрату 4905 (мас/об.), нітрилгідратазна активність штаму КПподососсиз СЕ578 залишається практично сталою аж до концентрації субстрату 895, нітрилгідратазна активність штаму 75 КПодососсив СЕ270 знижується в 1,7 рази при концентрації субстрату 490 (мас/об.) і нітрилгідратазна активність штаму Кподососсив СЕЗ376 знижується в 1,25 рази при концентрації субстрату 1095 (мас./об.).To study tolerance to C3-cyanopyridine, the cells were incubated at rest for 15 minutes. at 20 C at concentrations of 3-cyanopyridine in the range from 1 to 1095 (w/v), after which the cells were centrifuged. After washing the cells with 0.8595 Mass, the retained activity was measured. 70 Tolerance to 3-cyanopyridine as a substrate was studied at various substrate concentrations. It was established that at a substrate concentration of 295 (w/v) the nitrile hydratase activity of the Kpodosossiv gpodospgoiv 41 strain decreases by 1.4 times, the nitrile hydratase activity of the Kpodosossiv strain CE674 decreases by 1.4 times at a substrate concentration of 4905 (w/v), nitrile hydratase the activity of the KPodosossis strain CE578 remains practically constant up to a substrate concentration of 895, the nitrile hydratase activity of the KPodosossiv strain CE270 strain 75 decreases by 1.7 times at a substrate concentration of 490 (w/v) and the nitrile hydratase activity of the Kpodosossiv SEZ376 strain decreases by 1.25 times at the substrate concentration 1095 (wt./vol.).
Штами Кподососсив гподоспгоив 01 мають найгіршу толерантність щодо З3-ціанпіридину порівняно з іншими штамами Кподососсив. ю 7 Нводосоовув тодосьтююв л|Нподососси СЕБТЯВрогососси» СЕБТВ| Нподососсов СЕ2ТО|Кподососсив СЕЗТЕ, сч оKpodosossiv gpodospgoiv 01 strains have the worst tolerance to 3-cyanopyridine compared to other Kpodosossiv strains. 7 Nvodosoouv todostyuuv l|Npodosossy SEBTYAVRogosossy» SEBTV| Npodosossiv SE2TO|Kpodosossiv SEZTE, sch o
Зжлорбенюнти 00028001 я 00010000900010010000010000 ажлрбенюнти: 11101233001011001111101000100100110 со зоZzhlorbenyunts 00028001 i 00010000900010010000010000 azhlrbenyunts: 11101233001011001111101000100100110 so z
Фо м метакрилнтрит 77086176 1101 З і -Fo m methacrylnitrite 77086176 1101 Z i -
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAA200508810A UA83654C2 (en) | 1997-07-22 | 1998-07-22 | Process for preparation of amides using microorganisms of the rhodococcus species |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH177697 | 1997-07-22 | ||
| PCT/EP1998/004587 WO1999005306A1 (en) | 1997-07-22 | 1998-07-22 | Process for preparing amides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA74768C2 true UA74768C2 (en) | 2006-02-15 |
Family
ID=37455284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2000021040A UA74768C2 (en) | 1997-07-22 | 1998-07-22 | Method for preparing amides |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA74768C2 (en) |
-
1998
- 1998-07-22 UA UA2000021040A patent/UA74768C2/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR0134094B1 (en) | Process for biologica production | |
| RU1838408C (en) | Method of bacteria cultivating | |
| SU1512488A3 (en) | Method of producing amide | |
| KR0131276B1 (en) | Novel strain of rhodococcus rhodochrous producing nitrile hydraatase | |
| US7666635B2 (en) | Process for the preparation of amides | |
| KR100339723B1 (en) | Process for production of amide compounds using microorganism | |
| Leonova et al. | Nitrile hydratase of Rhodococcus: optimization of synthesis in cells and industrial applications for acrylamide production | |
| CN1316010C (en) | Microbiological method for producing amides | |
| UA74768C2 (en) | Method for preparing amides | |
| MXPA00000440A (en) | Process for preparing amides | |
| KR970000588B1 (en) | Microorganisms Producing 5'-Guanylic Acid | |
| Griffiths | The control of the synthesis of isocitrate lyase in a thermophilic Bacillus | |
| JPH02291283A (en) | Biological preparation of amide |