JPH0753103B2 - 細菌の培養法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性の高いロドコッカ
ス属ロドクロウス種の菌体を高収量で生産する方法に関
する。

近年、微生物、酵素またはそれらを固定化して種々の単
位化学反応や複合化学反応の触媒として利用しようとす
る動きが盛んになってきている。

ニトリルヒドラターゼはニトリル類を水和して相当する
アミド類を生成させる酵素として、本発明者の中から山
田らにより見出されており〔Agric.Biol.Chem.46 1165
（1982）参照〕、その具体的利用例としてニトリルヒド
ラターゼを有する細菌を用いてニトリル類からアミド類
を製造する方法が提案されている〔特公昭59−37951号
公報参照〕。

さらに、本発明者らは先に、本発明のロドコッカス属ロ
ドクロウス種の細菌を用いた、特に芳香族ニトリル類か
らのアミド類の製造に適した、アミド類の製造方法を提
案している〔特願昭63−72766号明細書参照〕。このよ
うな場合に、ニトリルヒドラターゼ活性の高いロドコッ
カス属ロドクロウス種の細菌菌体が高収率で取得できれ
ば裨益するところは大きい。

〔発明の概要〕

要 旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、該細
菌の培養に際して、培地中に特定の物質、すなわち尿素
およびコバルトイオン、を存在させることによって、こ
の目的を達成しようとするものである。

従って、本発明によるニトリルヒドラターゼ活性の高い
ロドコッカス属ロドクロウス種の細菌の培養方法は、ロ
ドコッカス属ロドクロウス種（Rhodococcus rhodochrou
s）に属してニトリルヒドラターゼを産生する能力を有
する細菌を培養してニトリルヒドラターゼ酵素活性を有
する細菌菌体を製造するに際し、クロトンアミドを含ま
ない培地中に尿素およびコバルトイオンを存在させるこ
と、を特徴とするものである。

効 果 クロトンアミドを含まない培地中に尿素およびコバルト
イオンを存在させてロドコカッカス属ロドクロウス種の
細菌の培養を行なうと、単位培養液当りのニトリルヒド
ラターゼ活性が極めて顕著に増大する。

この単位培養液当りのニトリルヒドラターゼ活性の増大
は、菌体の濃度（すなわち、菌体の収量）および（また
は）菌体の活性（すなわち、菌体内のニトリルヒドラタ
ーゼの量）の増大に因るものと解される。

本発明において、尿素およびコバルトイオンの存在は特
に後者に有効である。

〔発明の具体的説明〕

1.ロドコッカス属ロドクロウス種細菌 本発明において使用する細菌は、ニトリルヒドラターゼ
活性を有し、ニトリルを（特に芳香族ニトリルをも）水
和して対応アミドを生成させることができるロドコッカ
ス属ロドクロウス種の細菌である。具体的には、例え
ば、前記特願昭63−72766号明細書に記載のロドコッカ
ス・ロドクロウスＪ−１株（Rhodococcus rhodochrous
J−１）微工研条寄第1478号（FERM BP−1478）を挙げる
ことができる。この菌の詳細は、前記特願昭62−72766
号明細書に記載されていて、具体的には下記の通りであ
る。

（１）由来および寄託 Ｊ−１株は、本発明者らが京都市左京区の土壌から採取
したものであって、昭和62年９月18日に工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されて、FERM BP−1478号の受
託番号を得ている。

（２） 菌学的性質 （ａ）形態 （１）細胞の形および大きさ 0.9〜1.0μ×３〜10μ （２）細胞の多形性の有無 培養初期に長桿状を呈し、
棍棒状で湾曲なくスナッピングを伴った発育を示し、の
ちに短桿菌状に断裂する （３）運動性 なし （４）胞子の有無 なし （５）グラム染色性 陽性 （６）抗酸性 陰性 （７）異染小体 認められる （ｂ）各培地における生育状態（30℃） （１）肉汁寒天平板培養 直径1mm（48時間）円形、不
規則、平滑で表面乾き気味、扁平、不透明、淡オレンジ
ピンク色 （２）肉汁寒天斜面培養 糸状、表面平滑、断面はやや
隆起状で乾き気味、淡オレンジピンク色 （３）肉汁液体培養 菌膜を形成し、旺盛に発育する。
生育するにしたがって、中程度の濁り、沈澱を生ずる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 表面に良く生育、穿刺部
にそってロート状に発育するが、下層部にはほとんど発
育しない。ゼラチンは、液化は認められない。

（５）リトマスミルク 変化しない （ｃ）生理学的性質 （１）硫酸塩の還元 陽性 （２）脱室反応 陰性 （３）MRテスト 陰性 （４）VPテスト 陰性 （５）インドールの生成 陽性 （６）硫化水素の生成 陽性 （７）デンプンの加水分解 陰性 （８）クエン酸の利用 コーサーの培地：陰性 クリステンセンの培地：陽性 （９）無機窒素源の利用 硝酸塩：陽性 アンモニウム塩：陽性 （10）色素の生成 陰性 （11）ウレアーゼ 陽性 （12）オキシダーゼ 陰性 （13）カタラーゼ 陽性 （14）セルロースの加水分解 陰性 （15）生育の範囲 pH:5〜10 温度:10〜41℃ （16）酸素に対する態度 好気性 （17）チロシンの分解 陽性 （18）アデニンの分解 陽性 （19）ホスファターゼ 陽性 （20）Tween80加水分解 陽性 （21）Ｏ−Ｆテスト ０（弱い） （22）耐熱性（10％スキムミルク中72℃、15分） なし （23）糖から酸およびガスの生成 酸の生成 ガスの生成 Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース ＋ − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース ＋ − 麦芽糖 ＋ − ショ糖 ＋ − 乳 糖 − − トレハロース − − Ｄ−ソルビット ＋ − Ｄ−マンニット ＋ − グリセリン ＋ − （24）単一炭素源としての生育 イノシトール − 麦芽糖 ＋ Ｄ−マンニット ＋ ラムノース − Ｄ−ソルビット ＋ ｍ−ハイドロキシ安息香酸 ＋ アジピン酸ナトリウム ＋ 安息香酸ナトリウム ＋ クエン酸ナトリウム ＋ 乳酸ナトリウム ＋ テストテトロン ＋ Ｌ−チロシン ＋ グリセリン（１％）（W/V） （＋） トレハロース （＋） ｐ−ハイドロキシ 安息香酸（１％）（W/V） ＋ （＋）弱いが陽性である。

（25）脂肪酸と細胞壁分析 不飽和、飽和直鎖脂肪酸、
およびツベルクロステアリン酸を含む。ミコール酸のTL
Cは単一スポットを与える。

以上の菌体的性質をバージーの細菌分類書（Bergy's Ma
nual of Systematic Bacteriology）（1986）に基づい
て分類すると、Ｊ−１株は、好気性、グラム陽性、弱抗
酸性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌であ
り、鞭毛を着生しない。また、発育の初期過程で長桿菌
状で菌糸状を呈し、枝分れ（Branching）を伴なった発
育を示し、後に短桿菌状に断裂することよりノカルディ
ア型の細菌に属するものと認められる。

脂肪酸組成の分析は、ツベルクロスステアリン酸を含む
不飽和、飽和の直鎖脂肪酸を含む。ミコール酸のTLCは
標準菌Rodoccocus rhodochrous（IFO 3338）と同じRfを
示す単一スポットを与えることから、Mycobacterium属
とは区別される。またミコール酸の組成（炭素数）から
Nocardia属とは区別される。その他生化学的諸性質の検
討から、本菌はRhodococcus rhodochousと認められる。

2.尿 素 本発明において尿素は酵素誘導剤として作用するが、本
発明のようにニトリルヒドラターゼの誘導に尿素が有効
であることは、従来の知見からは全く意外なことであ
る。しかも、その効果が、特に尿素を他の酵素誘導剤と
併用せず単独で用いた場合、従来の酵素誘導剤に比べて
はるかに高いことは驚くべきことである。また、尿素は
他の酵素誘導剤に比べて安価であるため、本発明を工業
化するに際して経済的に有利である。

尿素を培地中に存在させるには、これを培地に一時に、
あるいは遂次的に添加する。「遂次的」とは、連続的ま
たは間歇的いずれをも意味するものである。

3.コバルトイオン 上記の酵素誘導剤である尿素を培地に存在させてもニト
リルヒドラターゼは得られないので、本発明では培地に
コバルトイオンを存在させることが必須である（本発明
の細菌のニトリルヒドラターゼの産生にコバルトイオン
の存在が必須であることは、前記特願昭63−72766号明
細書に記載の通りである）。

コバルトイオンは、培地が水性であるところより、水溶
性コバルト化合物を培地に添加することによって生成さ
せることがふつうである。水溶性のコバルト化合物は化
学辞典類の明らかにするところであり、適当なものを選
択使用することは当業者にとって容易であろう。代表的
なコバルト化合物は例えばCo⁺⁺またはCo⁺⁺⁺を与えるも
の、特に、CO⁺⁺を与えるもの、であって、具体的には塩
化コバルト、硫酸コバルト、酢酸コバルト、臭化コバル
ト、硼酸コバルトを例示することができる。

この他、本発明ではビタミンB₁₂および金属コバルトも
コバルト源として使用することができる。ビタミンB₁₂
中にはコバルトが錯体として含まれており、培養の際イ
オン化する。また、金属コバルトは培養中微生物による
酸化力でイオン化する。

4.培養／ニトリルヒドラターゼの産生 本発明のロドコッカス属ロドクロウス種細菌の培養は、
培地に尿素およびコバルトイオンを存在させるというこ
とを除けば、他の条件に関してはそれが合目的的なもの
である限り制限はない。

例えば、下記のような基本培地に尿素およびコバルトイ
オンを所定量存在させて15〜50℃程度、好ましくは20〜
45℃程度、特に好ましくは30℃前後、の温度で、pH7〜
９で、約30時間以上、好ましくは40時間以上（上限は例
えば120時間）、培養を行なえばよい。

培地中の尿素の濃度は１〜30g/リットル、好ましくは２
〜20g/リットル、より好ましくは５〜15g/リットル、程
度およびコバルトイオンの濃度はCoCl₂換算で５〜15mg/
リットル程度である。

基本培地： 培地Ａ成 分 量（培地１リットル中） K₂HPO₄ 13.4g KH₂PO₄ 6.5g NaCl 1.0g MgSO₄・7H₂O 0.2g ビタミン混合物^*1 0.1ml 蒸溜水 残部（pH7.0） *1 組成（溶液１リットル中） ビオチン 2.0μｇ パントテン酸カルシウム 0.4mg イノシトール 2.0mg ニコチン酸 0.4mg 塩酸チアミン 0.4mg 塩酸ピリドキシン 0.4mg ｐ−アミノ安息香酸 0.2ng リボフラビン 0.2mg 葉 酸 0.01ng 蒸留水 残部 培地Ｂ K₂HPO₄ 0.5g KH₂PO₄ 0.5g MgSO₄・7H₂O 0.5g イーストエキス 3.0g 蒸留水 残部（pH7.2） 培地Ｃ グルコース 10g K₂HPO₄ 0.5g KH₂PO₄ 0.5g MgSO₄・7H₂O 0.5g イーストエキス 1.0g ペプトン 7.5g 蒸留水 残部（pH7.2） 5.実験例 活性の測定および定義 （１）ニトリルヒドラターゼ活性の測定法 ニトリルヒドラターゼ活性は、基質としてベンゾニトリ
ル（20mM）1.0ml、３−シアノピリジン（1M）1.0mlまた
はアクリロニトリル（1M）1.0ml、リン酸カリウムバッ
ファー（0.1M、pH7.0）0.5mlおよび所定量の菌体（培養
液から分離したもの）を含む反応混合液2mlについて、2
0℃で所定時間反応を行なわせてから0.2mlの1N HC1を
添加して反応を停止させることによって測定した。

（２）活性の定義 活性は、比活性（S.A.）および全活性（T.A.）について
調べた。これらは、下記の通り定義される。

S.A.:μモル各アミド/mg−菌体・分 T.A.:μモル各アミド/ml−培地・分 実施例１ CoCl₂ 10mg/リットルを含む前記基本培地Ｃに所定量の
尿素を添加し、それぞれの培地60mlにロドコッカス・ロ
ドクロウスＪ−１株（FERM BP−1478）の前培養液（前
記基本培地Ｃ使用）4mlを加えて、28℃で96時間振盪培
養を行なった。

なお、比較のため、尿素またはCoCl₂のみを添加したも
のについても同様に培養を行なった。

結果を表−１に示した。

これより、尿素およびCoCl₂両者の添加がニトリルヒド
ラターゼの生産増大に必須であることが分かる。

実施例２ 前記培地Ａ、ＢおよびＣについて、表−２に示すように
CoCl₂および酵素誘導剤（尿素、アセトニトリル、クロ
トンアミド）を所定量添加あるいは添加せずに、実施例
１と同様にしてＪ−１株の培養を28℃で48〜120時間行
なった。

表−２には、その間の活性の測定において、それぞれ最
高の全活性（T.A.）が得られたときの数値を示した。

これより、酵素誘導剤として尿素の単独使用がニトリル
ヒドラターゼの生産増大に極めて有効であることが分か
る。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ロドコッカス属ロドクロウス種（Rhodococ
   cus rhodochrous）に属してニトリルヒドラターゼを産
   生する能力を有する細菌を培養してニトリルヒドラター
   ゼ酵素活性を有する細菌菌体を製造するに際し、クロト
   ンアミドを含まない培地中に尿素およびコバルトイオン
   を存在させることを特徴とする、ロドコッカス属ロドク
   ロウスの細菌の培養法。
2. 【請求項２】ロドコッカス属ロドクロウス種に属してニ
   トリルヒドラターゼを産生する能力を有する細菌が、ロ
   ドコッカス属ロドクロウスＪ−１株（FERM BP−1478）
   である、請求項１記載の細菌の培養法。
3. 【請求項３】培地中の尿素の濃度が１〜30g/リットルで
   ある、請求項１〜２いずれか１項記載の細菌の培養法。
4. 【請求項４】培地中のコバルトイオンの濃度がCoCl₂換
   算で５〜15mg/リットルである、請求項１〜３のいずれ
   か１項記載の細菌の培養法。