[go: up one dir, main page]

RS56169B1 - Jedinjenja tubulisina, metode pripreme i primena - Google Patents

Jedinjenja tubulisina, metode pripreme i primena

Info

Publication number
RS56169B1
RS56169B1 RS20170659A RSP20170659A RS56169B1 RS 56169 B1 RS56169 B1 RS 56169B1 RS 20170659 A RS20170659 A RS 20170659A RS P20170659 A RSP20170659 A RS P20170659A RS 56169 B1 RS56169 B1 RS 56169B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
compound
unsubstituted
substituted
group
mmol
Prior art date
Application number
RS20170659A
Other languages
English (en)
Inventor
Heng Cheng
Qiang Cong
Sanjeev Gangwar
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of RS56169B1 publication Critical patent/RS56169B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

Opis
STANJE TEHNIKE
[0001] Ovaj predmetni pronalazak odnosi se na jedinjenja strukturno slična tubulisinima, njihove konjugate sa ligandom, metode za pravljenje i upotrebu takvih jedinjenja i konjugata, i kompozicije koje sadrže takva jedinjenja i konjugate.
[0002] Tubulisini su citotoksini koji su originalno izolovani iz kultura miksobakterija Archangium gephyra ili Angiococcus disciformis, pri čemu svaki organizam proizvodi različitu smešu tubulisina (Sasse et al. 2000; Reichenbach et al. 1998). Njihova kristalna struktura i biosintetski put su razjašnjeni (Steinmetz et al.2004) i njihovi biosintetski geni su sekvencirani (Hoefle et al. 2006b). Pretubulisin, biosintetski prekursor tubulisina, takođe je prikazano da poseduje neko dejstvo (Ullrich et al.2009). (Kompletne reference za dokumenta koja su ovde citirana po prvom autoru ili pronalazaču i godina navedeni su na kraju ove specifikacije.)
[0003] Tubulisini pripadaju grupi antimitotičnih polipeptida i depsipeptida koji se javljaju u prirodi koja uključuje fomopsine, dolastatine, i kriptoficine (Hamel 2002). Antimitotički agensi osim polipeptida ili depsipeptida takođe postoje, na primer paklitaksel, maitansini, i epotiloni. U toku mitoze, ćelijske mikrotubule se reorganizuju da formiraju mitotsko vreteno, proces koji zahteva brzo sklapanje i rasklapanje mikrotubularnih sastavnih proteina α- i βtubulina. Antimitotički agensi blokiraju ovaj proces i sprečavaju da ćelija prolazi kroz mitozu. Na molekularnom nivou tačan mehanizam blokiranja može da se razlikuje od jednog do drugog antimitotičkog agensa. Tubulisini sprečavaju sklapanje tubulina u mikrotubule, prouzrokujući da se pogođene ćelije akumuliraju u G2/M fazi i podležu apoptozi (Khalil et al.
2006). Paklitaksel ima isti krajnji rezultat vezujući se za mikrotubule i sprečavajući njihovo rasklapanje.
[0004] Tubulisini imaju tetrapeptidil skelu koja je izgrađena od jedne proteinogene i tri neproteinogenih aminokiselinskih podjedinica kao što je prikazano u formuli (A): N-metilpipekolna kiselina (Mep), izoleucin (Ile), tubuvalin (Tuv), i ili tubufenilalanin (Tup, R' jednako H) ili tubutirozin (Tut, R je jednako OH). Među bolje poznatim tubulisinima koji se javljaju u prirodi (označeni sa A, B, itd.), mesta strukturne varijacije su na ostacima R', R" i R"' formule (A), kao što je prikazano u T
[0005] Dodatno, drugi tubulisini koji se javljaju u prirodi su identifikovani (Chai et al.2010).
[0006] Kaur et al. 2006. je proučavao antiproliferativna svojstva tubulisina A i pronašao je da je potentniji od drugih antimitotičkih agenasa kao što je paklitaksel i vinblastin i da je bio aktivan u testovima sa ksenograftima za različite kancerske ćelijske linije. Dalje, tubulisin A je indukovao apoptozu u kancerskim ćelijama ali ne u normalnim ćelijama i pokazao je značajna potencijalna antiangiogenska svojstva u in vitro testovima. Antimitotička svojstva drugih tubulisina su takođe bila ocenjena i generalno je utvrđeno da su povoljniji u poređenju sa onima koji nisu antimitotički agensi tubulisina (videti, na primer, Balasubramanian et al.
2009; Steinmetz et al. 2004; Wipf et al.2004). Iz ovih razloga, postoji značajno interesovanje za tubulisine kao anti-kancerogene agense (videti, na primer, Domling et al. 2005c; Hamel 2002).
[0007] Brojne publikacije opisuju napore usmerene na sintezu tubulisina, uključujući: Balasubramanian et al. 2009; Domling et al. 2006; Hoefle et al. 2003; Neri et al. 2006; Peltier et al. 2006; Sani et al.2007; Sasse et al.2007; Shankar et al. 2009; Shibue et al. 2009 i 2010; i Wipf et al. 2004. Druge publikacije opisuju studije odnosa strukture i aktivnosti (SAR), putem pripreme i evaluacije analoga tubulisina ili derivata: Balasubramanian et al.
2008 i 2009; Chai et al. 2011; Domling 2006; Domling et al. 2005a; Ellman et al. 2013; Hoefle et al. 2001 & 2006a; Pando et al.2011; Patterson et al.2007 & 2008; Richter 2012a, 2012b, i 2012c; Shankar et al. 2013; Shibue et al. 2011; Sreejith et al. 2011; Vlahov et al.
2010a; Wang et al.2007; Wipf et al. 2007 i 2010; i Zanda et al.2013. SAR studije uglavnom ispituju strukturne varijacije u Mep prstenu, ostacima R" i R"' Tuv podjedinice, i aromatičnom prstenu ili alifatičnom ugljenikovom lancu Tup/Tut podjedinice.
[0008] Domling et al. 2005 stavlja na uvid javnosti konjugate tubulisina sa partnerskim molekulom koji je generalno opisan kao polimer ili biomolekul, ali sa primerima koji su ograničeni na polietilen glikol (PEG) kao partnerski molekul. Cheng et al. 2011 takođe stavlja na uvid javnosti analoge tubulisina koji su adaptirani za primenu u konjugatima. Drugi dokumenti koji stavljaju na uvid javnosti konjugate tubulisina su Boyd et al. 2008 i 2010; Jackson et al. 2013; Vlahov et al.2008a, 2008b i 2010b; Leamon et al.2008 i 2010; Reddy et al. 2009; i Low et al. 2010. Leung et al. 2002 stavljaju na uvid javnosti polianjonske polipeptide koji mogu da budu konjugovani sa lekovima (uključujući tubulisine) da poboljšaju njihovu bioaktivnost i rastvorljivost u vodi.
[0009] Davis et al.2008 i Schluep et al. 2009 stavljaju na uvid javnosti formulacije bazirane na ciklodekstrinu u kojima su tubulisini kovalentno vezani za ciklodekstrin pomoću hidraziddisulfidne povezujuće grupe koja je vezana za Tup/Tut karboksilnu grupu. EP2292639 i WO2001/069116 stavljaju na uvid javnosti derivate tubulisina i njihovu sintezu.
[0010] Deacetilacija Tuv podjedinice (tj., R" u formuli (A) je hidroksil umesto acetil) navodno vodi do gubitka biološke aktivnosti (Domling et al. 2006). U studiji tubulisina U i V, koji se razlikuju po tome što je prvi acetilovan a drugi deacetilovan, objavljeno je da je tubulisin V manje potentan za oko 200X do 600X, u zavisnosti od testa (Balasubramanian et al. 2009). Zato što je acetatna grupa podložna hidrolizi, deacetilacija u R" poziciji predstavlja problem, kao centar potencijalne nestabilnosti koji vodi do gubljenja aktivnosti, za razvoj analoga tubulisina za farmaceutske primene.
KRATAK REZIME PREDMETNOG PRONALASKA
[0011] Otkrili smo da je moguće zaštiti se od gubitka biološke aktivnosti koja je povezana sa deacetilacijom kao što je objašnjeno iznad zamenom acetata na R" poziciji sa karbamatnom grupom. Karbamatna grupa kao što je ovde opisano ne izaziva značajni gubitak biološke aktivnosti ali je ipak stabilnija.
[0012] U skladu sa tim, u jednom aspektu, ovaj predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje ima strukturu predstavljenu formulom (I)
gde
R<1>
je H, nesupstituisani ili supstituisani C1-C10 alkil, nesupstituisani ili supstituisani C2-C10 alkenil, nesupstituisani ili supstituisani C2-C10 alkinil, nesupstituisani ili supstituisani aril, nesupstituisani ili supstituisani heteroaril, nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C1-C10alkil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C2-C10alkenil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C2-C10 alkinil), (CH2)1-2OC(=O)(C1-C10 alkil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2OC(=O)(C2-C10alkenil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-
2OC(=O)(C2-C10alkinil), nesupstituisani ili supstituisani C(=O)(C1-C10alkil), nesupstituisani ili supstituisani C(=O)(C2-C10 alkenil), nesupstituisani ili supstituisani C(=O)(C2-C10 alkinil), nesupstituisana ili supstituisana ciklo nesupstituisana ili supstituisana heterocikloalifatična grupa, nesupstituisani ili supstituisani arilalkil, ili nesupstituisani ili supstituisani alkilaril;
R<2>
je H, nesupstituisani ili supstituisani C1-C10 alkil, nesupstituisani ili supstituisani C2-C10alkenil, nesupstituisani ili supstituisani C2-C10alkinil, nesupstituisani ili supstituisani aril, nesupstituisani ili supstituisani heteroaril, nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C1-C10alkil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C2-C10 alkenil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C2-C10alkinil), (CH2)1-2OC(=O)(C1-C10alkil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2OC(=O)(C2-C10alkenil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-
2OC(=O)(C2-C10 alkinil), nesupstituisani ili supstituisani C(=O)(C1-C10 alkil), nesupstituisani ili supstituisani C(=O)(C2-C10 alkenil), nesupstituisani ili supstituisani C(=O)(C2-C10 alkinil), nesupstituisana ili supstituisana cikloalifatična grupa, nesupstituisana ili supstituisana heterocikloalifatična grupa, nesupstituisani ili supstituisani arilalkil, nesupstituisani ili supstituisani alkilaril, ili
gde svako R<2a>je nezavisno H, NH2, NHMe, Cl, F, Me, Et, ili CN;
R<3a>i R<3b>
su nezavisno H, C1-C5 alkil, CH2(C5-C6 cikloalkil), CH2C6H5, C6H5, ili CH2CH2OH; R<4>je
ili
gde R<4a>je H ili C1-C3 alkil; i Y je H, OH, Cl, F, CN, Me, Et, NO2, ili NH2;
R<5>je H, C1-C5alkil, C2-C5alkenil, C2-C5alkinil, CO(C1-C5alkil), CO(C2-C5alkenil), ili CO(C2-C5alkinil);
W je O ili S (poželjno O); i
N je 0, 1, ili 2;
ili farmaceutski prihvatljiva so tog jedinjenja.
[0013] U drugom rešenju, ovaj predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat koji sadrži jedinjenje u skladu sa formulom (I) koje je kovalentno vezano za ciljnu grupu koja se specifično ili prvenstveno vezuje za hemijski entitet na ciljnoj ćeliji, čija ciljna ćelija je poželjno kancerska ćelija. Poželjno, ciljna grupa je antitelo – poželjnije monoklonsko antitelo i čak poželjnije humano monoklonsko antitelo – ili njegov antigen-vezujući deo i hemijski entitet je antigen povezan sa tumorom. Antigen povezan sa tumorom može da bude onaj koji je prikazan na površini kancerske ćelije ili onaj koji je izlučen od strane kancerske ćelije u okolni ekstraćelijski prostor.
[0014] U drugom rešenju, obezbeđena je kompozicija materije koja sadrži jedinjenje ovog predmetnog pronalaska i povezujuću grupu koja ima reaktivnu funkcionalnu grupu, pogodnu za konjugaciju sa ciljnom grupom.
[0015] U drugom rešenju, obezbeđeno je jedinjenje ovog predmetnog pronalaska za primenu u metodi lečenja kancera kod subjekta koji pati od takvog kancera, koji sadrži administriranje terapijski efikasne količine jedinjenja ovog predmetnog pronalaska subjektu ili njegovog konjugata sa ciljnom grupom (obično antitelom). U drugom rešenju, obezbeđeno je jedinjenje ovog predmetnog pronalaska ili njegov konjugat sa ciljnom grupom (obično antitelom) za primenu u pripremanju leka za lečenje kancera kod subjekta koji pati od takvog kancera. Kancer može da bude bubrežni, kancer želuca, plućni, ili kancer jajnika.
KRATAK OPIS NACRTA
[0016]
Slike. 1, 2a-2b, i 3 prikazuju, u kombinaciji, shemu za sintezu jedinjenja (III-1).
Sl. 4 prikazuje shemu za sintezu jedinjenja (III-2).
Sl. 5 prikazuje shemu za sintezu jedinjenja (1-2) i (I-3).
Slike 6a-6c prikazuju u kombinaciji shemu za sintezu jedinjenja (III-4) i (III-5).
Sl. 7 prikazuje shemu za sintezu jedinjenja (I-1).
Sl. 8 prikazuje shemu za sintezu jedinjenja (1-4).
Slike 9a i 9b prikazuju u kombinaciji shemu za sintezu jedinjenja (III-6).
Slike 10 i 11 prikazuju sheme za sintezu intermedijera korisnih za pravljenje jedinjenja ovog pronalaska.
Sl. 12 prikazuje sheme za sintezu dodatnih jedinjenja ovog pronalaska.
Slike 13a-13d prikazuju biološku aktivnost nekih jedinjenja ovog pronalaska.
Sl. 14 prikazuje in vitro dejstvo konjugata ovog pronalaska.
Sl. 15 prikazuje in vivo dejstvo konjugata ovog pronalaska.
Slike 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, i 20 prikazuju dodatne in vivo podatke o aktivnosti konjugata ovog pronalaska.
Slike 21 i 22 prikazuju sheme za sintezu dodatnih jedinjenja ovog pronalaska, ilustrujući strukturne varijacije na karbamatnoj grupi.
Sl. 23 prikazuje shemu za sintezu jedinjenja ovog predmetnog pronalaska koja je pogodna za konjugaciju putem "klik" hemije.
Sl. 24 prikazuje shemu za sintezu jedinjenja ovog predmetnog pronalaska koja je pogodna za konjugaciju putem alifatične amin grupe.
DETALJAN OPIS PREDMETNOG PRONALASKA DEFINICIJE
[0017] "Antitelo" označava cela antitela i bilo koji antigen vezujući fragment (tj., "antigenvezujući deo") ili njegove pojedinačne lančane varijante. Celo antitelo je protein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca koji su međusobno povezani disulfidnim vezama. Svaki težak lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i konstantni region teškog lanca koji sadrži tri domena, CH1, CH2 and CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (VL ili Vk) i konstantni region lakog lanca koji sadrži pojedinačni domen, CL. VHi VLregioni mogu dalje da budu podeljeni na regione hipervarijabilnosti, koji su nazvani regionima za određivanje komplementarnosti (CDR), koji su podeljeni sa više konzerviranih okvirnih regiona (FRs). Svako VH i VL sadrži tri CDR i četiri FR, koji su raspoređeni od amino- do karboksi-terminusa po sledećem redu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4. Varijabilni regioni sadrže vezujući domen koji intereaguje sa antigenom. Konstantni regioni mogu da posreduju vezivanju antitela za tkivo domaćina ili faktora, uključujući različite ćelije imunog sistema (na primer, efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa. Za antitelo se kaže da se "specifično vezuje" za antigen X ako se antitelo vezuje za antigen X sa KD pri 5 x 10<-8>M ili manje, poželjnije 1 x 10<-8>M ili manje, poželjnije 6 x 10<-9>M ili manje, poželjnije 3 x 10<-9>M ili manje, čak još poželjnije 2 x 10<-9>M ili manje. Antitelo može da bude himerno, humanizovano, ili, poželjno, humano. Konstantni region teškog lanca može da bude izgrađen tako da utiče na tip ili obim glikolizacije, da produži polu-život antitela, da poboljša ili smanji interakcije sa efektorskim ćelijama ili sistemom komplementa, ili da moduliše neku drugu karakteristiku. Izgrađivanje može da bude praćeno zamenom, dodavanjem, ili brisanjem jedne ili više amino kiselina ili zamenom domena sa domenom iz drugog imunoglobulinskog tipa, ili kombinacijom prethodno navedenog.
[0018] "Antigen vezujući fragment" i "antigen vezujući deo" antitela (ili jednostavno "deo antitela" ili "fragment antitela") označava jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen. Pokazano je da antigen-vezujuća funkcija antitela može da bude izvedena pomoću fragmenata antitela koje je pune dužine, kao što je (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab')2 fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta koji su povezani disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fab' fragment, koji je u suštini Fab sa delom zglobnog regiona (videti, na primer, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th Ed., Saunders Elsevier 2007); (iv) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (v) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, (vi) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VHdomena; (vii) izolovan region za određivanje komplementarnosti (CDR); i (viii) nanotelo, varijabilni region teškog lanca koji sadrži jedan varijabilni domen i dva konstantna domena. Poželjni antigen vezujući fragmenti su Fab, F(ab')2, Fab', Fv, i Fd fragmenti. Dalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana pomoću odvojenih gena, oni mogu da budu spojeni, korišćenjem rekombinantne metode, pomoću sintetičkog veznika koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kojem se VLi VHregioni sparuju da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jedan lanac Fv, ili scFv); videti, na primer, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takva antitela sa jednim lancem su takođe obuhvaćeni u okviru termina "antigen-vezujući deo" antitela.
[0019] "Izolovano antitelo" označava antitelo koje je suštinski oslobođeno od drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičn olovano antitelo koje specifično vezuje antigen X je suštinski oslobođeno od antitela koja specifično vezuju druge antigene osim antigena X). Izolovano antitelo koje specifično vezuje antigen X može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima, kao što je antigen X molekula iz drugih vrsta. U određenim rešenjima, izolovano antitelo se specifično vezuje za humani antigen X i ne reaguje unakrsno sa drugim (ne-humanim) antigenom X antigena. Takođe, izolovano antitelo može da bude suštinski oslobođeno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.
[0020] "Monoklonsko antitelo" ili "kompozicija monoklonskog antitela" znači pripremanje molekula antitela jedne molekularne kompozicije, koja ispoljava jedinstvenu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop.
[0021] "Humano antitelo" označava antitelo koje ima varijabilne regione u kojima i okvir i CDR regioni (i konstantni region, ako postoji) su izvedeni od sekvenci humanog embrionskog imunoglobulina. Humana antitela mogu da uključuju kasnije modifikacije, uključujući prirodne ili sintetičke modifikacije. Humana antitela mogu da uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama humanog embrionskog imunoglobulina (na primer, mutacije uvedene slučajnom ili mesto-specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Međutim, "humano antitelo" ne uključuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz embriona drugih vrsta sisara, kao što je miš, koja su kalemljena na humanim sekvencama okvira.
[0022] "Humano monoklonsko antitelo" označava antitelo koje prikazuje jedinstvenu vezujuću specifičnost, koje ima varijabilne regione u kojima su i okvir i CDR regioni izvedeni od sekvenci humanog embrionskog imunoglobulina. U jednom rešenju, humana monoklonska antitela su proizvedena pomoću hibridoma koji uključuje B ćeliju koja je dobijena iz transgenske ne-humane životinje, na primer, transgenskog miša, koja ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen lakog lanca fuzionisan sa besmrtnom ćelijom.
[0023] "Alifatična" označava prav- ili razgranat- lanac, zasićenu ili nezasićenu, nearomatičnu ugljovodoničnu grupu koja ima specifičan broj ugljenikovih atoma (na primer, kao u "C3alifatična," "C1-C5 alifatična," ili "C1 do C5 alifatična," poslednje dve navedene fraze su sinonimi za alifatičnu grupu koja ima od 1 do 5 ugljenikovih atoma) ili, gde broj ugljenikovih atoma nije eksplicitno naveden, od 1 do 4 ugljenikovih atoma (2 do 4 ugljenika u slučaju nezasićenih alifatičnih grupa).
[0024] "Alkil" označava zasićenu alifatičnu grupu, sa istom konvencijom za označavanje broja ugljenikovih atoma koja se primenjuje. Putem ilustracije, C1-C4alkil grupe uključuju, ali nisu ograničene na, metil, etil, propil, izopropil, izobutil, t-butil, 1-butil, 2-butil, i slično. "Alkilen" označava dvovalentni duplikat alkil grupe, kao što je CH2CH2, CH2CH2CH2, i CH2CH2CH2CH2.
[0025] "Alkenil" označava alifatičnu grupu koja ima najmanje jednu ugljenik-ugljenik dvostruku vezu, sa istom konvencijom za označavanje broja ugljenikovih atoma koja se primenjuje. Putem ilustracije, C2-C4 alkenil grupe uključuju, ali nisu ograničene na, etenil (vinil), 2-propenil (alil ili prop-2-enil), cis-1-propenil, trans-1-propenil, E- (ili Z-) 2-butenil, 3-butenil, 1,3-butadienil (but-1,3-dienil) i slično.
[0026] "Alkinil" označava alifatičnu grupu koja ima najmanje jednu ugljenik-ugljenik trostruku vezu, gde je primenljiva ista konvencija za označavanje brojeva ugljenikovih atoma. Kao ilustracija, C2-C4 alkinil grupe uključuju etinil (acetilenil), propargil (prop-2-inil), 1-propinil, but-2-inil, i slično.
[0027] "Cikloalifatični" označava zasićenu ili nezasićenu, nearomatičnu ugljovodoničnu grupu koja ima od 1 do 3 prstena, svaki prsten ima od 3 do 8 (poželjno od 3 do 6) ugljenikovih atoma. "Cikloalkil" označava cikloalifatičnu grupu u kojoj je svaki prsten zasićen. "Cikloalkenil" označava cikloalifatičnu grupu u kojoj najmanje jedan prsten ima najmanje jednu ugljenik-ugljenik dvostruku vezu. "Cikloalkinil" označava cikloalifatičnu grupu u kojoj najmanje jedan prsten ima najmanje jednu ugljenik-ugljenik trostruku vezu. Kao ilustracija, cikloalifatične grupe uključuju, ali nisu ograničene na, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklopentenil, cikloheksil, cikloheksenil, cikloheptil, ciklooktil, i adamantil. Poželjne cikloalifatične grupe su one cikloalkilne, posebno ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, i cikloheksil. "Cikloalkilen" označava dvovalentni duplikat cikloalkilne grupe.
[0028] "Heterocikloalifatična" označava cikloalifatičnu grupu gde, u najmanje jednom njegovom prstenu, do tri (poželjno 1 do 2) ugljenika su zamenjeni sa heteroatomom koji je nezavisno odabran od N, O, ili S, gde N i S opciono mogu da budu oksidovani i N opciono može da bude kvaternizovan. Slično, "heterocikloalkil," "heterocikloalkenil," i "heterocikloalkinil" označava cikloalkil, cikloalkenil, ili cikloalkinil grupu, redom, u kojoj najmanje jedan njen prsten je bio tako modifikovan. Primeri heterocikloalifatične grupe uključuju aziridinil, azetidinil, 1,3-dioksanil, oksetanil, tetrahidrofuril, pirolidinil, piperidinil, piperazinil, tetrahidropiranil, tetrahidrotiopiranil tetrahidrotiopiranil sulfon, morfolinil, tiomorfolinil, tiomorfolinil sulfoksid, tiomorfolinil sulfon, 1,3-dioksolanil, tetrahidro-1,1-dioksotienil, 1,4-dioksanil, tietanil, i slično. "Heterocikloalkilen" označava dvovalentni duplikat heterocikloalkilne grupe.
[0029] "Alkoksi," "ariloksi," "alkiltio," i "ariltio" znače -O(alkil), -O(aril), -S(alkil), i -S(aril), redom. Primeri su metoksi, fenoksi, metiltio, i feniltio, redom.
[0030] "Halogen" ili "halo" znači fluorin, hlorin, bromin ili jod.
[0031] "Aril" označava ugljovodoničnu grupu koja ima mono-, bi-, ili triciklični prstenasti sistem gde svaki prsten ima od 3 do 7 ugljenikovih atoma i najmanje jedan prsten je aromatičan. Prstenovi u prstenastom sistemu mogu da budu fuzionisani jedan sa drugim (kao u naftilu) ili vezani jedan sa drugim (kao u bifenilu) i mogu da budu fuzionisani ili vezani za nearomatične prstenove (kao u indanilu ili cikloheksilfenilu). Putem dalje ilustracije, aril grupe uključuju, ali nisu ograničene na, fenil, naftil, tetrahidronaftil, indanil, bifenil, fenantril, antracenil, i acenaftil. "Arilen" označava dvovalentni duplikat arilne grupe, za primer 1,2-fenilen, 1,3-fenilen, ili 1,4-fenilen.
[0032] "Heteroaril" označava grupu koja ima mono-, bi-, ili triciklični prstenasti sistem gde svaki prsten ima od 3 do 7 ugljenikovih atoma i najmanje jedan prsten je aromatični prsten koji sadrži od 1 do 4 heteroatoma nezavisno odabranih od N, O, ili S, gde N i S po izboru mogu da budu oksidirani i N opciono može da bude kvaternizovan. Tako najmanje jedan heteroatom koji sadrži aromatični prsten može da bude fuzionisan sa drugim tipovima prstenova (kao u benzofuranilu ili tetrahidroizohinolil) ili direktno vezan za druge tipove prstenova (kao u fenilpiridil ili 2-ciklopentilpiridil). Putem dalje ilustracije, heteroaril grupe uključuju pirolil, furanil, tiofenil (tienil), imidazolil, pirazolil, oksazolil, izoksazolil, tiazolil, izotiazolil, triazolil, tetrazolil, piridil, N-oksopiridil, piridazinil, pirimidinil, pirazinil, hinolinil, izohinolinil, hinazolinil, cinolinil, hinozalinil, naftiridinil, benzofuranil, indolil, benzotiofenil, oksadiazolil, tiadiazolil, fenotiazolil, benzimidazolil, benzotriazolil, dibenzofuranil, karbazolil, dibenzotiofenil, akridinil, i slično. "Heteroarilen" označava dvovalentni duplikat aril grupe.
[0033] Gde je naznačeno da grupa može da bude supstituisana, kao što je primenom formulisanja "nesupstituisani ili supstituisani" ili "opciono supstituisani" kao u "nesupstituisani ili supstituisani C1-C5 alkil" ili "opciono supstituisani heteroaril," takva grupa može da ima jedan ili više nezavisno odabranih supstituenata, poželjno jedan do pet u broju, poželjnije jedan ili dva u broju. Supstituenti i šabloni supstitucije mogu da budu odabrani od strane prosečnog poznavaoca oblasti, uzimajući u obzir grupu za koju je supstituent vezan, da obezbedi jedinjenja koja su hemijski stabilna i koja mogu da budu sintetisana tehnikama koje su poznate u stanju tehnike kao i metodama koje su ovde navedene.
[0034] "Arilalkil," (heterocikloalifatični)alkil," "arilalkenil," "arilalkinil," "biarilalkil," i slično označavaju alkil, alkenil, ili alkinil grupu, kao što može da bude slučaj, supstituisanu sa aril, heterocikloalifatičnom, biaril, itd., grupom, kao što može da bude slučaj, sa otvorenom (nezadovoljnom) valencom na alkil, alkenil, ili alkinil grupi, na primer kao u benzil, fenetil, N-imidazoiletil, N-morfolinoetil, i slično. Obrnuto, "alkilaril," "alkenilcikloalkil," i slično označava aril, cikloalkil, itd., grupu, kao što može da bude slučaj, supstituisanu sa alkil, alkenil, itd., grupom, kao što može da bude slučaj, na primer kao u metilfenil (tolil) ili alilcikloheksil. "Hidroksialkil," "haloalkil," "alkilaril," "cijanoaril," i slično označavaju alkil, aril, itd., grupu, kao što može da bude slučaj, supstituisanu sa jednim ili više identifikovanih supstituenata (hidroksil, halo, itd., kao što može da bude slučaj).
[0035] Na primer, dozvoljeni supstituenti uključuju, ali nisu ograničeni na, alkil (posebno metil ili etil), alkenil (posebno alil), alkinil, aril, heteroaril, cikloalifatičnu grupu, heterocikloalifatičnu grupu, halo (posebno fluoro), haloalkil (posebno trifluorometil), hidroksil, hidroksialkil (posebno hidroksietil), cijano, nitro, alkoksi, -O(hidroksialkil), -O(haloalkil) (posebno -OCF3), -O(cikloalkil), -O(heterocikloalkil), -O(aril), alkiltio, ariltio, =O, =NH, =N(alkil), =NOH, =NO(alkil), -C(=O)(alkil), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alkil), -C(=O)O(hidroksialkil), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(alkil), -C(=O)N(alkil)2, -OC(=O)(alkil), -OC(=O)(hidroksialkil), -OC(=O)O(alkil), -OC(=O)O(hidroksialkil), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(alkil), -OC(=O)N(alkil)2, azido, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), -NH(hidroksialkil), -NHC(=O)(alkil), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(alkil), -NHC(=O)N(alkil)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(alkil), -SH, -S(alkil), -S(aril), -S(cikloalkil), -S(=O)alkil, -SO2(alkil), -SO2NH2, -SO2NH(alkil), -SO2N(alkil)2, i slično.
[0036] Gde je grupa koja je supstituisana alifatična grupa, poželjni supstituenti su aril, heteroaril, cikloalifatična grupa, heterocikloalifatična grupa, halo, hidroksil, cijano, nitro, alkoksi, -O(hidroksialkil), -O(haloalkil), -O(cikloalkil), -O(heterocikloalkil), -O(aril), alkiltio, ariltio, =O, =NH, =N(alkil), =NOH, =NO(alkil), -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alkil), -C(=O)O(hidroksialkil), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(alkil), -C(=O)N(alkil)2, -OC(=O)(alkil), -OC(=O)(hidroksialkil), -OC(=O)O(alkil), -OC(=O)O(hidroksialkil), -OC(=O)NH2, OC(=O)NH(alkil), -OC(=O)N(alkil)2, azido, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), -NH(hidroksialkil), -NHC(=O)(alkil), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(alkil), -NHC(=O)N(alkil)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(alkil), -SH, -S(alkil), -S(aril), -S(=O)alkil, -S(cikloalkil), -SO2(alkil), -SO2NH2, -SO2NH(alkil), i -SO2N(alkil)2. Poželjniji supstituenti su halo, hidroksil, cijano, nitro, alkoksi, -O(aril), =O, =NOH, =NO(alkil), -OC(=O)(alkil), -OC(=O)O(alkil), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(alkil), -OC(=O)N(alkil)2, azido, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), -NHC(=O)(alkil), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(alkil), -NHC(=O)N(alkil)2, i -NHC(=NH)NH2. Posebno poželjni su fenil, cijano, halo, hidroksil, nitro, C1-C4alkioksi, O(C2-C4alkilen)OH, i O(C2-C4alkilen)halo.
[0037] Tamo gde je grupa koja je supstituisana cikloalifatična, heterocikloalifatična, aril, ili heteroaril grupa, poželjni supstituenti su alkil, alkenil, alkinil, halo, haloalkil, hidroksil, hidroksialkil, cijano, nitro, alkoksi, -O(hidroksialkil), -O(haloalkil), -O(aril), -O(cikloalkil), -O(heterocikloalkil), alkiltio, ariltio, -C(=O)(alkil), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alkil), -C(=O)O(hidroksialkil), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(alkil), -C(=O)N(alkil)2, -OC(=O)(alkil), -OC(=O)(hidroksialkil), -OC(=O)O(alkil), -OC(=O)O(hidroksialkil), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(alkil), -OC(=O)N(alkil)2, azido, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), -NH(hidroksialkil), -NHC(=O)(alkil), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(alkil), -NHC(=O)N(alkil)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(alkil), -SH, -S(alkil), -S(aril), -S(cikloalkil), -S(=O)alkil, -SO2(alkil), -SO2NH2, -SO2NH(alkil), i -SO2N(alkil)2. Poželjniji supstituenti su alkil, alkenil, halo, haloalkil, hidroksil, hidroksialkil, cijano, nitro, alkoksi, -O(hidroksialkil), -C(=O)(alkil), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alkil), -C(=O)O(hidroksialkil), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(alkil), -C(=O)N(alkil)2, -OC(=O)(alkil), -OC(=O)(hidroksialkil), -OC(=O)O(alkil), -OC(=O)O(hidroksialkil), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(alkil), -OC(=O)N(alkil)2, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), -NHC(=O)(alkil), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(alkil), -NHC(=O)N(alkil)2, i -NHC(=NH)NH2. Posebno poželjni su C1-C4alkil, cijano, nitro, halo, i C1-C4alkoksi.
[0038] Tamo gde je naveden opseg, kao u "C1-C5 alkil" ili "5 do 10%," takav opseg uključuje krajnje tačke opsega, kao u C1 i C5 u prvom slučaju i 5% i 10% u drugom slučaju.
[0039] Sve dok određeni stereoizomeri nisu specifično naznačeni (na primer, pomoću podebljane ili isprekidane veze na relevantnom stereocentru u strukturnoj formuli, pomoću prikaza dvostruke veze kao da ima E ili Z konfiguraciju u strukturnoj formuli, ili primenom nomenklature za označavanje stereohemije), svi stereoizomeri su uključeni u obim predmetnog pronalaska, kao čista jedinjenja kao i njihove smeše. Sve dok nije drugačije naznačeno, individualni enantiomeri, diastereomeri, geometrijski izomeri, i njihove kombinacije i smeše su sve obuhvaćene ovim predmetnim pronalaskom.
[0040] Prosečni prosečni poznavaoci oblasti će ceniti što jedinjenja mogu da imaju tautomerne oblike (na primer, keto i enol oblike), oblike rezonance, i cviterjonske oblike koji su ekvivalentni onima koji su prikazani u strukturnim formulama ovde korišćenim i da strukturne formule obuhvataju takve tautomerne, rezonantne, ili cviterjonske oblike.
[0041] "Farmaceutski prihvatljiv estar" označava estar koji hidrolizira in vivo (na primer u humanom telu) da proizvede osnovno jedinjenje ili njegovu so ili ima per se dejstvo slično onom kod osnovnog jedinjenja. Pogodni estri uključuju C1-C5 alkil, C2-C5 alkenil ili C2-C5 alkinil estre, posebno metil, etil ili n-propil.
[0042] "Farmaceutski prihvatljiva so" označava so jedinjenja pogodnu za farmaceutsku formulaciju. Gde jedinjenje ima jednu ili više osnovnih grupa, so može da bude kisela adiciona so, kao što je sulfat, hidrobromid, tartrat, mezilat, maleat, citrat, fosfat, acetat, pamoat (embonat), hidrojodid, nitrat, hidrohlorid, laktat, metilsulfat, fumarat, benzoat, sukcinat, mezilat, laktobionat, suberat, tozilat, i slično. Gde jedinjenje ima jednu ili više kiselih grupa, so može da bude kao što je so kalcijuma, so kalijuma, so magnezijuma, so meglumina, so amonijuma, so cinka, so piperazina, so trometamina, so litijuma, so holina, so dietilamina, 4-so fenilcikloheksilamina, so benzatina, so natrijuma, so tetrametilamonijuma, i slično. Polimorfni kristalni oblici i solvati su takođe obuhvaćeni obimom ovog predmetnog pronalaska.
KOMPOZICIJE
[0043] U formuli (I), koja je ponovljena ispod radi preglednosti,
grupa R<1>poželjno je Me, Et, n-Pr, i-Pr, ili
poželjnije ovo drugo.
[0044] Takođe u formuli (I), grupa R<2>poželjno je C1-C5alkil, C1-C5alkenil, C1-C5alkinil, CH2OC(=O)C1-C5 alkil, CH2OC(=O)C1-C5 alkenil, CH2OC(=O)C1-C5 alkinil,
[0045] Takođe u formuli (I), poželjne grupe N(R<3a>)(R<3b>) su:
osim toga posebno je poželjno da jedan od R<3a>i R<3b>je H i da je drugi Me. U drugim poželjnim rešenjima, R<3a>i R<3b>su oba H ili oba Me, ili jedan od R<3a>i R<3b>je H i drugi je C6H5.
[0046] U drugom poželjnom rešenju, R<3a>i R<3b>su nezavisno H, C1-C5 alkil, CH2(C5-C6 cikloalkil), CH2C6H5, ili CH2CH2OH.
[0047] U definicijama R<1>i R<2>u formuli (I), gde je grupa definisana kao da je i nesupstituisana ili supstituisana, poželjno je da je nesupstituisana.
[0048] U formulama ove specifikacije, veza koja prolazi kroz fenilni prsten između dva ugljenika fenilnog prstena znači da grupa vezana za vezu može da bude smeštena na bilo kojoj orto, meta, ili para poziciji fenilnog prstena. Putem ilustracije, formula
predstavlja
[0049] Sinteza duplikata tubulisinskih podjedinica Tuv i Tup sa različitim R<2>i R<4>grupama je proučena od strane Cheng et al.2011.
[0050] U poželjnom rešenju jedinjenja u skladu sa formulom (I), R<1>je
R<2>je C1-C5alkil (posebno Me ili n-Pr) ili
jedan od R<3a>i R<3b>je H i drugi je Me; R<4>je
gde Y je H ili NO2 i R<4a>je H, Me, ili Et;
R<5>je Me; W je O, i n je 1.
[0051] U drugom poželjnom rešenju jedinjenja u skladu sa formulom (I), n je 1, W je O, Y u R<4>je H ili NO2 (poželjno H), i R<2>je
i poželjnije
[0052] Jedinjenje u skladu sa ovim poželjnim rešenjem je predstavljeno formulom (Ia)
gde Y je H ili NO2; R<4a>je H, Me, ili Et; i R<3a>i R<3b>su nezavisno H, C6H5, Me, ili Et; ili farmaceutski prihvatljiva so tog jedinjenja.
[0053] Još poželjnije, jedinjenje ima strukturu predstavljenu formulom (Ia'):
gde R<4a>je H, Me, ili Et; i R<3a>i R<3b>su nezavisno H, C6H5, Me, ili Et; ili farmaceutski prihvatljiva so tog jedinjenja.
[0054] U još jednom poželjnom rešenju, W je O, Y je NH2, n je 1, i obe grupe R<2a>u R<2>su osim NH2. Jedinjenje u skladu sa ovim rešenjem je predstavljeno formulom (Ib):
gde R<4a>je H, Me, ili Et; R<3a>i R<3b>su nezavisno H, C6H5, Me, i Et; i R<6>je C1-C5 alkil, CH2OC(=O)C1-C5alkil, ili (CH2)1-2C6H5; ili farmaceutski prihvatljiva so tog jedinjenja.
[0055] U još jednom poželjnom rešenju, jedinjenje ima strukturu predstavljenu formulom (Ib'):
gde R<4a>je H, Me, ili Et (poželjno H) i R<6>je Me ili n-Pr; ili farmaceutski prihvatljiva so tog jedinjenja.
[0056] Poželjno, u formuli (Ia), (Ia'), i (Ib), jedan od R<3a>i R<3b>je H i drugi je Me. U drugim poželjnim rešenjima, R<3a>i R<3b>su oba H ili oba Me, ili jedan od R<3a>i R<3b>je H i drugi je C6H5. U još drugim poželjnim rešenjima, R<3a>i R<3b>su nezavisno H, Me, ili Et
[0057] Specifični primeri jedinjenja ovog predmetnog pronalaska uključuju jedinjenja prikazana odmah iza, zajedno sa njihovim farmaceutski prihvatljivim solima:
[0058] Jedinjenja (I-2), (I-7), (I-8) i (I-9) su poželjna
KONJUGATI
[0059] Opciono, jedinjenja ovog predmetnog pronalaska mogu da budu konjugovana sa ciljnom grupom koja se specifično ili prvenstveno vezuje za hemijski entitet na kancerskoj ćeliji. Poželjno, ciljna grupa je antitelo ili njegov antigen vezujući deo i hemijski entitet je antigen povezan sa kancerom. Poželjno, konjugacija se vrši posredstvom hemijske veze sa funkcionalnom grupom u Tuv ili Tup podjedinici, kao što je amino grupa.
[0060] U drugom rešenju, obezbeđen je konjugat koji sadrži citotoksično jedinjenje u skladu sa ovim predmetnim pronalaskom i ligand, predstavljen formulom (II)
[D(X<D>)aC(X<Z>)b]mZ (II)
gde Z je ligand; D je citotoksično jedinjenje u skladu sa ovim predmetnim pronalaskom (na primer, jedinjenje u skladu sa formulom (I), (Ia), (Ia'), ili (Ib)); i -(X<D>)aC(X<Z>)b- kolektivno se nazivaju kao "vezujuća grupa" ili "veznik" zato što oni vezuju Z i D. U okviru veznika, C je grupa koja može da se iscepa odabrana da bude iscepana na ili blizu mesta nameravane biološke aktivnosti jedinjenja D; X<D>i X<Z>se odnose na grupe koje razdvajaju (ili "razdvojnici") zato što se oni prostiru između D i C i C i Z, redom; indeksi a i b su nezavisno 0 ili 1 (to jest, prisustva X<D>i/ili X<Z>su opciona); i indeks m je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 (poželjno 1, 2, 3, ili 4). D, X<D>, C, X<Z>i Z su potpunije opisani u nastavku.
[0061] Ligand Z – na primer antitelo – služi za funkciju ciljanja. Pomoću vezivanja za ciljano tkivo ili ćeliju gde je njegov antigen ili receptor smešten, ligand Z usmerava konjugat tamo. Poželjno, ciljno tkivo ili ćelija je kancersko tkivo ili ćelija i antigen ili receptor je antigen povezan sa tumorom, to jest, antigen koji je jedinstveno eksprimiran putem kancerskih ćelija ili je prekomerno eksprimiran pomoću kancerskih ćelija, upoređeno sa ne-kancerskim ćelijama. Cepanje grupe C na ciljnom tkivu ili ćeliji oslobađa jedinjenje D da pojača svoje citotoksično dejstvo lokalno. U nekim slučajevima, konjugat je internalizovan u ciljnu ćeliju pomoću endocitoze i razdvajanje se odvija u okviru ciljne ćelije. Na ovaj način, precizna isporuka jedinjenja D je postignuta na mestu nameravanog dejstva, smanjujući dozu koja je potrebna. Takođe, jedinjenje D je normalno biološki neaktivno (ili značajno manje aktivno) u svom konjugovanom stanju, time smanjujući neželjenu toksičnost na tkiva ili ćelije koje nisu ciljane. Pošto su antikancerski lekovi često visoko toksični za ćelije generalno, ovo je veoma važno zapažanje.
[0062] Kao što se ogleda u indeksu m, svaki molekul liganda Z može da se konjuguje sa više od jednim jedinjenjem D, u zavisnosti od broja slobodnih mesta koje ligand Z ima za konjugaciju i eksperimentalnih uslova koji su korišćeni. Prosečni poznavaoci oblasti će ceniti da, dok je svaki individualni molekul liganda Z konjugovan sa celim brojem jedinjenja D, pripremanje konjugata može da analizira ne celi broj odnosa jedinjenja D sa ligandom Z, odražavajući statistički prosek. Ovaj odnos je označen kao odnos supstitucije (SR) ili, alternativno, u slučaju konjugata antitelo-lek, odnos lek-antitelo (DAR).
Ligand Z i njegova konjugacija
[0063] Poželjno, ligand Z je antitelo. Radi preglednosti i sažetosti i ne ograničenja, detaljna naknadna diskusija ovde o konjugaciji liganda Z je napisana u kontekstu njegovog antitela, ali prosečnim poznavaocima oblasti će biti jasno da drugi tipovi liganda Z mogu da budu konjugovani, mutatis mutandis. Na primer, konjugati sa folnom kiselinom kao ligand mogu da ciljaju ćelije koje imaju receptor folata na njihovim površinama (Vlahov et al. 2008; Leamon et al. 2008). Iz istog razloga, detaljna diskusija ispod je prvenstveno napisana u smislu 1:1 odnosa antitela Z u odnosu na jedinjenje D (m = 1).
[0064] Poželjno, ligand Z je antitelo za antigen povezan sa tumorom, koji dozvoljava konjugatu koji sadrži takav ligand Z da selektivno cilja kancerske ćelije. Primeri takvih antigena uključuju: mezotelin, membranski antigen specifičan za prostatu (PSMA), CD19, CD22, CD30, CD70, B7H4 (takođe poznat kao O8E), proteinsku tirozin kinazu 7 (PTK7), glipikan-3, RG1, CTLA-4, i CD44. Antitelo može da bude životinjsko (na primer, mišje), himerno, humanizovano, ili, poželjno, humano. Antitelo poželjno je monoklonsko, posebno monoklonsko humano antitelo. Pripremanje humanih monoklonskih antitela za neke prethodno navedene antigene je stavljeno na uvid javnosti u Korman et al., US 2009/0074660 A1 (B7H4); Rao-Naik et al., 8,097,703 B2 (CD19); King et al., US 2010/0143368 A1 (CD22); Keler et al., US 7,387,776 B2 (2008) (CD30); Terrett et al., US 8,124,738 B2 (CD70); Korman et al., US 6,984,720 B1 (2006) (CTLA-4); Korman et al., US 8,008,449 B2 (2011) (PD-1); Huang et al., US 2009/0297438 A1 i Cardarelli et al., US 7,875,278 B2 (PSMA); Terrett et al., US 2010/0034826 A1 (PTK7); Terrett et al., US 2010/0209432 (A1) (glipikan-3); Harkins et al., US 7,335,748 B2(2008) (RG1); Terrett et al., US 8,268,970 B2 (2012) (mezotelin); i Xu et al., US 2010/0092484 A1 (CD44).
[0065] Ligand Z može takođe da bude fragment antitela ili mimetik antitela, kao što je afitelo, domensko antitelo (dAb), nanotelo, unitelo, DARPin, antikalin, versatelo, duokalin, lipokalin, ili avimer.
[0066] Bilo koja od nekoliko različitih reaktivnih grupa na ligandu Z može da bude mesto konjugacije, uključujući ε-amino grupe u ostacima lizina, viseće (privezak) ugljeno hidratne grupe, grupe karboksilne kiseline, grupe disulfida, i grupe tiola. Svaki tip reaktivne grupe predstavlja kompromis, koji ima neke prednosti i neke nedostatke. Za mišljenja o reaktivnim grupama antitela koje su pogodne za konjugaciju, videti, na primer, Garnett, Adv. Drug Delivery Rev. 53 (2001), 171-216 and Dubowchik and Walker, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123.
[0067] U jednom rešenju, ligand Z je konjugovan pomoću ε-amino grupe lizina. Većina antitela imaju višestruko izložene ε-amino grupe lizina, koje mogu da budu konjugovane pomoću amidnih, urea, tiourea, ili karbamatnih veza korišćenjem tehnika poznatih u stanju tehnike, uključujući modifikaciju sa heterobifunkcionalnim agensom (kao što je dalje opisano u nastavku). Međutim, teško je kontrolisati koja i koliko ε-amino grupa reaguje, vodeći do potencijalne varijabilnosti od serije do serije u pripremanjima konjugata. Takođe, konjugacija može da izazove neutralizaciju protinisane ε-amino grupe koja je važna za održavanje urođene konformacije antitela ili mogu da zauzmu mesto u blizini lizina ili na mestu vezujućeg antigena, pri čemu nijedno nije poželjna pojava.
[0068] U drugom rešenju, ligand Z može da bude konjugovan pomoću ugljenohidratnog bočnog lanca, kao što su mnoga antitela glikozilirana. Bočni lanac ugljenohidrata može da bude oksidovan sa perjodatom da generiše aldehidne grupe, koja zauzvrat može da reaguje sa aminima da formira imin grupu, kao što je u semikarbazonu, oksimu, ili hidrazonu. Ako je željeno, imin grupa može da bude pretvorena u stabilniju amin grupu smanjenjem sa natrijum cijanoborohidridom. Za dodatne objave o konjugaciji putem bočnih lanaca karbohidrata, videti, na primer, Rodwell et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 2632-2636 (1986); čija objava je ovde uključena putem reference. Kao i sa ε-amino grupama lizina, postoji zabrinutost u pogledu ponavljanja lokacije mesta konjugacije i stehiometrije.
[0069] U još drugom rešenju, ligand Z može da bude konjugovan putem karboksilne grupe. U jednom rešenju, grupa terminalne karboksilne kiseline je funkcionalizovana da generiše karbohidrazid, koji zatim reaguje sa konjugacionom grupom koja nosi aldehid. Videti Fisch et al., Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 147-153
[0070] U još jednom rešenju, antitelo Z može da bude konjugovano putem disulfidne grupe koja premošćuje ostatak cisteina na antitelo Z i sumpor na drugi deo konjugata. Nekim antitelima nedostaju slobodne tiolne (sulfhidril) grupe ali imaju disulfidne grupe, na primer u zglobnom regionu. U takvom slučaju, slobodne tiolne grupe mogu da budu generisane redukcijom nativne disulfidne grupe. Tiolne grupe tako generisane mogu onda da budu korišćene za konjugaciju. Videti, na primer, Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548-3552; King et al., Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994); i Doronina et al., Nature Biotechnol.
21(7), 778-784 (2003). Ponovo, postoji beriga u vezi sa lokacijom mesta konjugacije i stehiometrijom i mogućim poremećajem nativne konformacije antitela.
[0071] Brojne metode su poznate za uvođenje slobodnih tiolnih grupa u antitela bez razbijanja prirodnih disulfidnih veza, čije metode mogu da budu praktikovane sa ligandom Z ovog predmetnog pronalaska. U zavisnosti od primenjenog metoda, moguće je da se uvede predvidljiv broj slobodnih sulfhidrilana na unapred određenim mestima. U jednom pristupu, pripremljena su mutirana antitela u kojima je cistein supstituisan sa drugom amino kiselinom. Videti, na primer, Eigenbrot et al., US 7,521,541 B2 (2009); Chilkoti et al., Biokonjugat Chem. 1994, 5, 504-507; Urnovitz et al., US 4,698,420 (1987); Stimmel et al., J. Biol. Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000); Bam et al., US 7,311,902 B2 (2007); Kuan et al., J. Biol. Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994); Poon et al., J. Biol. Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995). U drugom pristupu, dodatni cistein je dodat C-terminusu. Videti, na primer Cumber et al., J. Immunol., 149, 120-126 (1992); King et al, Cancer Res., 54, 6176-6185 (1994); Li et al., Biokonjugat Chem., 13, 985-995 (2002); Yang et al., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003); i Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004). Poželjni metod za uvođenje slobodnih cisteina je onaj prikazan od strane Liu et al., WO 2009/026274 A1, u kojem amino kiselinska sekvenca koja nosi cistein je dodat C-terminusu teškog lanca antitela. Ovaj metod uvodi poznati broj ostataka cisteina (jedan po teškom lancu) na poznatom mestu daleko od mesta vezivanja antigena.
[0072] U još jednom rešenju, ε-amino grupe lizina mogu da budu modifikovane sa heterobifunkcionalnim reagensima kao što je 2-iminotiolan ili N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)-propionat (SPDP), pretvarajući ε-amino grupu u tiolnu ili disulfidnu grupu – stvaranjem cisteinskog surogata, takoreći. Međutim, ovaj metod podnosi isto mesto konjugacije i stehiometrijskih ograničenja povezanih sa ε-amino grupama odgovarajuće.
[0073] U još jednom poželjnom rešenju, ligand Z je konjugovan pomoću nukleofilnog adicionog proizvoda tiolne grupe za akceptorsku grupu. Poželjna akceptorska grupa je maleimidna grupa, čija je reakcija sa tiolnom grupom antitela generalno ilustrovana ispod. Tiolna grupa može da bude nativna, ili jedna uvedena kao što je opisano iznad.
[0074] Ligand Z može takođe da bude konjugovan pomoću funkcionalne grupe koja je prilagođena za upotrebu sa "klik" hemijom, kao što je diskutovano u nastavku.
Veznik -(X<D>)aC(X<Z>)b-[0075] Kao što je gore navedeno, vezujući deo konjugata ovog predmetnog pronalaska sadrži do tri elementa: grupu koja se može preseći C i opcione razdvojnike X<Z>i X<D>.
[0076] Grupa koja se može preseći C je grupa koja se može preseći pod fiziološkim uslovima, poželjno odabrana tako da je relativno stabilna dok je konjugat u opštoj cirkulaciji u krvnoj plazmi, ali je lako presečena kada konjugat dostigne mesto nameravanog dejstva, to jest, blizu, na, ili u okviru ciljane ćelije. Poželjno, konjugat je internalizovan pomoću endocitoze ciljanom ćelijom nakon vezivanja antitela Z za antigen prikazan na površini ciljane ćelije. Nakon toga, cepanje grupe C dešava se u vezikularnom telu ciljne ćelije (rani endozom, kasni endozom, ili, posebno, lizozom).
[0077] U jednom rešenju, grupa C je pH senzitivna grupa. pH u krvnoj plazmi je neznatno iznad neutralne, dok je pH unutar lizozoma kisela, otprilike 5. Stoga, grupa C čije cepanje je katalizovano kiselinom preseći će se na različite redove veličine brže unutar lizozoma nego u krvnoj plazmi. Primeri odgovarajućih grupa koje su osetljive na kiselinu uključuju cisakonitil amide i hidrazone, kao što je opisano u Shen et al., US 4,631,190 (1986); Shen et al., US 5,144,011 (1992); Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102, 1048-1054 (1981) and Yang et al., Proc. Natl Acad. Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988).
[0078] U drugom rešenju, grupa C je disulfidna. Disulfidi mogu da budu isečeni mehanizmom razmene tiola i disulfida, pri brzini koja zavisi od okolne tiolne koncentracije. Pošto je međućelijska koncentracija glutationa i drugih tiola viša nego njihove koncentracije seruma, brzina cepanja disulfida biće viša međućelijski. Dalje, brzina razmene tiola i disulfida može da bude modulisana podešavanjem steričnih i elektronskih karakteristika disulfida (na primer, alkil-aril disulfid isulfidu; supstitucija na arilnom prstenu, npr.), omogućavajući oblikovanje disulfidnih veza koje imaju povećanu stabilnost seruma ili posebnu brzinu cepanja. Za dodatne objave koje se odnose na disulfidne grupe koje se mogu preseći u konjugatima, videti, na primer, Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988); Santi et al., US 7,541,530 B2 (2009); Ng et al., US 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., WO 2002/096910 A1; Boyd et al., US 7,691,962 B2; i Sufi et al., US 2010/0145036 A1.
[0079] Poželjna grupa C sadrži peptidnu vezu koja je iscepana, poželjno pomoću proteaze na mestu koje je namenjeno za delovanje, umesto pomoću proteaze u serumu. Tipično, grupa C sadrži od 1 do 20 amino kiselina, poželjno od 1 do 6 amino kiselina, još poželjnije od 1 do 3 amino kiselina. Amino kiselina(e) mogu da budu prirodne i/ili neprirodne α-amino kiseline. Prirodne amino kiseline su enkodirane pomoću genetičkog koda, kao i amino kiseline proizvedene odatle, na primer, hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, citrulin, i O-fosfoserin. Termin amino kiselina takođe uključuje analoge amino kiseline i mimetike. Analozi su jedinjenja koja imaju istu generalnu H2N(R)CHCO2H strukturu prirodne amino kiseline, osim što R grupa nije pronađena među prirodnim amino kiselinama. Primeri analoga uključuju homoserin, norleucin, metionin-sulfoksid, i metionin metil sulfonium. Mimetična amino kiselina je jedinjenje koje ima strukturu različitu od generalne hemijske strukture α-amino kiseline ali funkcioniše na sličan način. Namenjeno je da termin "neprirodna amino kiselina" predstavlja "D" stereohemijski oblik, pri čemu su prirodne amino kiseline u "L" obliku.
[0080] Poželjno, grupa C sadrži amino kiselinsku sekvencu koja je sekvenca za prepoznavanje cepanja za proteazu. Mnoge sekvence za prepoznavanje cepanja su poznate u stanju tehnike. Videti, na primer, Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol.244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); i Bouvier et al. Meth. Enzymol.248: 614 (1995).
[0081] Za konjugate koji nisu namenjeni da ih ćelija internalizuje, grupa C može da bude izabrana tako da je presečena pomoću proteaze koja je prisutna u ekstracelularnom matriksu u blizini ciljnog tkiva, na primer, proteaza koja je oslobođena pomoću okolnih umirućih ćelija ili proteaze koja je povezana sa tumorom. Primeri ekstracelularnih proteaza koje su povezane sa tumorom su matriks metaloproteaze (MMP), timet oligopeptidaza (TOP) i CD10.
[0082] Za konjugate koji su dizajnirani da budu internalizovani ćelijom, grupa C poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu za sečenje pomoću endozomalne ili lizozomalne proteaze, posebno druge. Ne-ograničavajući primeri takvih proteaza uključuju katepsine B, C, D, H, L i S, posebno katepsin B. Katepsin B seče peptide u sekvenci -AA<2>-AA<1>- gde AA<1>je osnovna ili amino kiselina koja snažno vezuje vodonik (kao što je lizin, arginin, ili citrulin) i AA<2>je hidrofobna amino kiselina (kao što je fenilalanin, valin, alanin, leucin, ili izoleucin), na primer Val-Cit (gde Cit označava citrulin) ili Val-Lys. (Ovde, aminokiselinske sekvence su napisane u N-do-C smeru, kao u H2N-AA<2>-AA<1>-CO2H, sve dok u kontekst ne bude jasno naznačeno drugačije.) Za dodatne informacije u vezi sa katepsin grupom koja se može preseći, videti Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998); Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 83347-3352 (1998); i Dubowchik et al., Biokonjugat Chem.
13, 855-869 (2002). Drugi enzim koji može da bude iskorišćen za sečenje peptidil veznika je legumain, lizozomalna cisteinska proteaza koja se poželjno seče na Ala-Ala-Asn.
[0083] U jednom rešenju, grupa C je peptid koji sadrži dve amino kiselinske sekvence -AA<2>-AA<1>- gde u AA<1>je lizin, arginin, ili citrulin i AA<2>je fenilalanin, valin, alanin, leucin ili izoleucin. U drugom rešenju, C se sastoji od sekvence od jedne do pet amino kiselina, odabranih iz grupe koja se sastoji od Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Ala-Asn, Lys, Cit, Ser, i Glu.
[0084] Priprema i dizajn grupa koje se mogu preseći C koje se sastoje od jedne amino kiseline je stavljeno na uvid javnosti u Chen et al., US 2010/0113476 A1.
[0085] Grupa C može takođe može da bude fotoiscepana (iscepana fotolizom), na primer etar nitrobenzila koji je iscepan nakon izlaganja svetlosti.
[0086] Grupa C može da bude vezana direktno za antitelo Z ili jedinjenje D; to jest, razdvojnici X<Z>i X<D>, kao što može da bude slučaj, mogu da budu odsutni. Na primer, ako je grupa C disulfidna, jedan od dva sumpora može da bude cisteinski ostatak ili njegov surogat na antitelu Z. Ili, grupa C može da bude hidrazon vezan za aldehid na bočnom lancu karbohidrata antitela. Ili, grupa C može da bude peptidna veza formirana sa lizin ε-amino grupom antitela Z. U poželjnom rešenju, jedinjenje D je direktno vezano za grupu C putem peptidil veze za karboksilnu ili amin grupu u jedinjenju D.
[0087] Kada je prisutan, razdvojnik X<Z>obezbeđuje prostorno razdvajanje između grupe C i antitela Z, da se ne bi prvi prostorno mešao vezivanjem antigena za drugi ili drugi prostorno mešao sa cepanjem prvog. Dalje, razdvojnik X<Z>može da bude korišćen da ispolji povećanu rastvorljivost ili smanjenu agregaciju svojstva sa konjugatima. Razdvojnik X<Z>može da sadrži jedan ili više modularnih segmenata, koji mogu da budu sklapani u bilo kom broju kombinacija. Primeri pogodnih segmenata za razdvojnik X<Z>su:
i njihove kombinacije, gde indeks q je 0 ili 1 i indeks r je 1 do 24, poželjno 2 do 4. Ovi segmenti mogu da budu kombinovani, kao što je prikazano ispod:
[0088] Razdvojnik X<D>, ako je prisutan, obezbeđuje prostorno razdvajanje između grupe C i jedinjenja D, da se ne bi drugi mešao prostorno ili elektronski sa cepanjem prvog. Razdvojnik X<D>takođe može da posluži da uvede dodatnu masu molekula i hemijsku funkcionalnost u konjugat. Generalno, dodatna masa i funkcionalnost će uticati na polu život seruma i druga svojstva konjugata. Stoga, putem razumnog izbora razdvojničke grupe, polu-život seruma konjugata može da bude modulisan. Razdvojnik X<D>takođe može da bude sklopljen od modularnih segmenata, kao što je opisano iznad u kontekstu razdvojnika X<Z>.
[0089] Razdvojnici X<Z>i/ili X<D>, gde su prisutni, poželjno obezbeđuju linearno razdvajanje od 4 do 25 atoma, poželjnije od 4 do 20 atoma, između Z i C ili D i C, redom.
[0090] Ili razdvojnik X<Z>ili X<D>, ili oba, mogu da sadrže samoubilačku grupu. Samoubilačka grupa je grupa koja (1) je vezana za grupu C i ili antitelo Z ili citotoksin D i (2) ima strukturu takvu da sečenje od grupe C izaziva reakcionu sekvencu koja rezultira u samoubilačku grupu koja sama sebe odbacuje od antitela Z ili citotoksina D, kao što može da bude slučaj. Drugim rečima, reakcija na mestu distalnom od antitela Z ili citotoksina D (sečenje od grupe C) uzrokuje i razbijanje X<Z>-Z ili X<D>-D veze. Prisustvo samoubilačke grupe je poželjno u slučaju razdvojnika X<D>zato što, ako, nakon sečenja konjugata, razdvojnik X<D>ili njegov deo ostaju vezani za citotoksin D, biološka aktivnost poslednjeg može da bude oštećena. Primena samobilačke grupe je posebno poželjna gde grupa koja se može preseći C je polipeptid.
[0091] Primeri samoubilačkih grupa (i)-(v) koje su vezane za hidroksilnu ili amino grupu na partnerskom molekulu D su prikazani ispod:
[0092] Samoubilačka grupa je struktura između tačkastih linija a i b, sa susednim strukturnim karakteristikama prikazanim kako bi obezbedili kontekst. Samoubilačke grupe (i) i (v) su vezane za jedinjenje D-NH2 (tj., jedinjenje D je konjugovano pomoću amino grupe), dok samoubilačke grupe (ii), (iii), i (iv) su vezane za jedinjenje D-OH (tj., jedinjenje D je konjugovano putem hidroksilne ili karboksilne grupe). Sečenje amidne veze na tačkastoj liniji b oslobađa amidni azot kao aminski azot, inicirajući reakcionu sekvencu koja rezultuje u sečenju veze na tačkastoj liniji a i naknadnom oslobađanju D-OH ili D-NH2, kao što može da bude slučaj. Za dodatne objave u vezi sa samoubilačkim grupama, videti Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981); Carl et al., WO 81/01145 (1981); Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999); Firestone et al., US 6,214,345 B1 (2001); Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002); Doronina et al., Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941); Boyd et al., US 7,691,962 B2; Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Sufi et al., WO 2008/083312 A2; Feng, US 7,375,078 B2; i Senter et al., US 2003/0096743 A1.
[0093] U drugom rešenju, ciljna grupa antitela i citotoksično jedinjenje D su vezani pomoću veznika koji se ne može iscepati. Degradacija antitela eventualno smanjuje veznik na malu pridruženu grupu koja se ne meša sa biološkom aktivnošću citotoksičnog jedinjenja D.
Kompozicije Jedinjenje D-veznik
[0094] Konjugati ovog predmetnog pronalaska poželjno su pripremljeni prvo spajanjem jedinjenja D za veznik (X<D>)aC(X<Z>)b(gde X<D>, C, X<Z>, a, i b su kao što je definisano za formulu (II)) da se formira kompozicija lek-veznik d t lj f mulom (III):
D-(X<D>)aC(X<Z>)b-R<31>(III)
gde R<31>je funkcionalna grupa pogodna za reagovanje sa funkcionalnom grupom na antitelu Z da formira konjugat. Primeri pogodne grupe R<31>uključuju amino, azidnu, ciklooktin,
gde R<32>je Cl, Br, F, mezilat, ili tozilat i R<33>je Cl, Br, I, F, OH, -O-N-sukcinimidil, -O-(4-nitrofenil), -O-pentafluorofenil, ili -O-tetrafluorofenil. Hemija generalno korisna za pripremanje pogodnih grupa D-(X<D>)aC(X<Z>)b-R<31>je stavljena na uvid javnosti Ng et al., US 7,087,600 B2 (2006); Ng et al., US 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., US 7,129,261 B2 (2006); Ng et al., WO 02/096910 A1; Boyd et al., US 7,691,962 B2; Chen et al., US 7,517,903 B2 (2009); Gangwar et al., US 7,714,016 B2 (2010); Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Gangwar et al., US 7,847,105 B2 (2010); Gangwar et al., US 7,968,586 B2 (2011); Sufi et al., US 2010/0145036 A1; i Chen et al., US 2010/0113476 A1.
[0095] Poželjno reaktivna funkcionalna grupa-R<31>je -NH2, -OH, -CO2H, -SH, maleimido, ciklooktin, azido (-N3), hidroksilamino (-ONH2) ili N-hidroksisukcinimid. Posebno poželjne funkcionalne grupe -R<31>su izabrane iz grupe koja se sastoji od:
[0096] -OH grupa može da bude esterifikovana sa karboksi grupom na antitelu, na primer, na bočnom lancu asparaginske ili glutaminske kiseline.
[0097] -CO2H grupa može da bude esterifikovana sa -OH grupom ili amidirana sa amino grupom (na primer na bočnom lancu lizina) na antitelu.
[0098] N-hidroksisukcinimid grupa je funkcionalno aktivirana karboksilna grupa i može povoljno da bude amidovana pomoću reakcije sa amino grupom (na primer, od lizina).
[0099] Maleimidna grupa može da bude konjugovana sa -SH grupom na antitelu (na primer, od cisteina ili od hemijske modifikacije antitela da uvede funkcionalnost sulfhidrila), u reakciji Majklove adicije.
[0100] -SH grupa je posebno primenljiva za konjugaciju gde je antitelo modifikovano da se tu uvede maleimidna grupa, u Majkolovoj adicionoj reakciji koja je "lik u ogledalu" onoga što je opisano iznad. Antitela mogu da budu modifikovana tako da imaju maleimidnu grupu sa N-sukcinimidil 4-(maleimidometil)-cikloheksankarboksilatom (SMCC) ili sulfonovanu varijantu sulfo-SMCC, oba reagensa su dostupna iz Sigma-Aldrich.
[0101] Azid i ciklooktin su komplementarno funkcionalne grupe koje mogu da utiču na konjugaciju putem takozvane "klik hemije" bez prisustva bakra, u kojoj se azid dodaje putem napete alkin veze ciklooktina da formira 1,2,3-triazol prsten. Videti, na primer, Agard et al., J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571-6584. Azid može da bude reaktivna funkcionalna grupa R<31>u formuli (III) i ciklooktin može da bude smešten na antitelu ili njegovom antigen vezujućem delu, ili obratno. Ciklooktin grupa može da bude obezbeđena pomoću DIBO reagensa (dostupan iz Invitrogen/Molecular Probes, Eugene, Oregon).
[0102] Tehnike za uvođenje neprirodnih amino kiselina u antitela mogu da budu korišćene, sa neprirodnom amino kiselinom obezbeđujući funkcionalnost za konjugaciju sa reaktivnom funkcionalnom grupom. Na primer, neprirodna amino kiselina p-acetilfenilalanin može da bude inkorporirana u antitelo ili drugi polipeptid, kao što je prikazano u Tian et al., WO 2008/030612 A2 (2008). Keton grupa u p-acetilfenilalaninu može da bude mesto konjugacije formiranjem oksima sa hidroksilamino reaktivnom funkcionalnom grupom. Alternativno, neprirodna amino kiselina p-azidofenilalanin može da bude inkorporirana u antitelo da obezbedi azidnu funkcionalnu grupu za konjugaciju pomoću kilk hemije. Neprirodne amino kiseline mogu takođe da budu inkorporirane u antitelo ili drugi polipeptid korišćenjem slobodne ćelijske metode, kao što je prikazano u Goerke et al., US 2010/0093024 A1 (2010) and Goerke et al., Biotechnol. Bioeng.2009, 102 (2), 400-416.
[0103] Amin (NH2) grupa može da bude korišćena za konjugaciju korišćenjem enzima transglutaminaze, kao što je izloženo u Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995 -9997.
[0104] Konjugacija se takođe može izvršiti korišćenjem enzima Sortaze A, kao što je prikazano u Levary et al., PLoS One 2011, 6(4), e18342; Proft, Biotechnol. Lett.2010, 32, 1-10; Ploegh et al., WO 2010/087994 A2 (2010); i Mao et al., WO 2005/051976 A2 (2005). Motiv prepoznavanja sortaze A (tipično LPXTG, gde X je bilo koja prirodna amino kiselina) može da se nalazi na ligandu Z i nukleofilni akceptorski motiv (tipično GGG) može da bude grupa R<31>u formuli (III), ili obratno.
[0105] Grupa D u formuli [D(X<D>)aC(X<Z>)b]mZ a i D-(X<D>)aC(X<Z>)b-R<31>poželjno ima strukturu u skladu sa formulom (D-a)
ili formula (D-b)
gde u Y je H ili NO2; R<4a>je H, Me, ili Et; R<3a>i R<3b>su nezavisno H, Me, ili Et; i R<6>je C1-C5 alkil, CH2OC(=O)C1-C5 alkil, ili (CH2)1-2C6H5.
[0106] Primeri takve grupe D uključuju:
gde R<7>je H, Me, ili Et.
[0107] Primeri kompozicija u skladu sa formulom D-(X<D>)aC(X<Z>)b-R<31>uključuju one koje su prikazane odmah nakon toga; zajedno sa njihovim farmaceutski prihvatljivim solima:
[0108] Poželjno lek-veznik jedinjenje ima strukturu predstavljenu formulom (III-a):
gde
R<3a>i R<3b>
su nezavisno H, Me, ili Et;
R<6>je Me, Et, ili n-Pr;
AA<a>i svako AA<b>su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od alanin, β-alanin, γaminobuterna kiselina, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, γ-karboksiglutaminska kiselina, citrulin, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, norleucin, norvalin, ornitin, fenilalanin, prolie, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin;
p je 1, 2, 3, ili 4;
q je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 (poželjno 2, 3, ili 4);
r je 1, 2, 3, 4, ili 5;
s je 0 ili 1; i
R<31>je izabran iz grupe koja se sastoji od
ili farmaceutski prihvatljive soli tog jedinjenja.
[0109] U formuli (III-a), -AA<a>-[AA<b>]p- predstavlja polipeptid čija dužina je određena pomoću vrednosti p (na primer, dipeptid ako p je 1, tetrapeptid ako p je 3, itd.). AA<a>je na karboksi terminusu polipeptida i njegova karboksilna grupa formira peptidnu (amidnu) vezu sa anilino azotom leka. Obrnuto, poslednji AA<b>je na amino terminusu polipeptida i njegova alfa-amino grupa formira peptidnu vezu sa
ako s je 1 sa
ako s je 0.
[0110] Poželjnije lek-veznik jedinjenje im vljenu formulom (III-b):
gde
R<6>je Me ili n-Pr;
Q je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 (poželjno 2, 3, ili 4);
r je 1, 2, 3, 4, ili 5;
s je 0 ili 1; i
R<31>je izabran iz grupe koja se sastoji od
ili farmaceutski prihvatljive soli tog jedinjenja.
Priprema konjugata
[0111] Sledeće je ilustrativna procedura, bazirana na uvođenju slobodnih tiolnih grupa u antitelo reakcijom ε-amino grupa lizina sa 2-iminotiolanom, što je praćeno reakcijom sa lekveznik grupom koja sadrži maleimid kao što je opisano iznad. Inicijalno antitelo je pufer promenjen u 0.1 M fosfatni pufer (pH 8.0) koji sadrži 50 mM NaCl i 2 mM dietilen triamin pentasirćetne kiseline (DTPA) i koji je koncentrovan do 5-10 mg/mL. Tiolacija je postignuta kroz dodavanje 2-iminotiolana antitelu. Količina 2-iminotiolana koja će biti dodata može da bude određena pomoću preliminarnog eksperimenta i varira od antitela do antitela. U preliminarnom eksperimentu, titracija povećanja količina 2-iminotiolana je dodata antitelu, i prateći inkubaciju sa antitelom tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (sobna temperatura, otprilike 25 °C), antitelu je uklonjena so u 50 mM pH 6.0 HEPES puferu korišćenjem SEPHADEX™ G-25 kolone i broj uvedenih tiolnih grupa brzo je određen reakcijom sa ditiodipiridinom (DTDP). Reakcija tiolnih grupa sa DTDP rezultira u oslobođanju tiopiridina, što se može pratiti spektroskopski na 324 nm Uzorci u proteinskoj koncentraciji od 0.5-1.0 mg/mL su tipično korišćeni. Apsorpcija na 280 nm može da se koristi da se tačno odredi koncentracija proteina u uzorcima, i zatim alikvot svakog uzorka (0.9 mL) je inkubiran sa 0.1 mL DTDP (5 mM osnovnog rastvora u etanolu) tokom 10 min na sobnoj temperaturi. Prazni uzorci samog pufera plus DTDP su takođe inkubirani zajedno. Posle 10 min, apsorpcija na 324 nm je izmerena i broj tiolnih grupa je kvantifikovan korišćenjem koeficijenta ekstinkcije za tiopiridin od 19,800 M<-1>.
[0112] Tipično je poželjno da je nivo tiolacije od oko tri tiolne grupe po antitelu. Na primer, sa nekim antitelima ovo može da bude postignuto dodavanjem 15-strukog molarnog viška 2-iminotiolana što je praćeno inkubacijom na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Antitelo je zatim inkubirano sa 2-iminotiolanom pri željenom molarnom odnosu i zatim je uklonjena so u konjugacionom puferu (50 mM pH 6.0 HEPES pufer koji sadrži 5 mM glicina i 2 mM DTPA). Tiolovani materijal je održavan na ledu dok je broj uvedenih tiola kvantifikovan kao što je opisano iznad.
[0113] Posle verifikacije broja uvedenih tiola, lek-veznik grupa je dodata u 3-strukom molarnom višku po tiolu. Reakciji konjugacije je dozvoljeno da se nastavi u konjugacionom puferu koji takođe sadrži finalnu koncentraciju od 5% dimetilsulfoksida (DMSO), ili sličan alternativni rastvarač. Obično, osnovni rastvor leka-veznika je rastvoren u 100% DMSO. Osnovni rastvor je dodat direktno tiolovanom antitelu, koji ima dovoljno DMSO koji je dodat da dovede finalnu koncentraciju do 10%, ili prethodno razblažen u konjugacionom puferu koji sadrži finalnu koncentraciju od 10% DMSO, što je praćeno dodavanjem jednake zapremine tiolovanog antitela.
[0114] Konjugaciona reakciona smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata uz mešanje. Nakon inkubacije, reakciona smeša konjugacije je centrifugirana i filtrirana kroz filter od 0.2 µm. Prečiščavanje konjugata može da bude postignuto hromatografijom korišćenjem brojnih metoda. U jednoj metodi, konjugat je prečišćen korišćenjem ekskluzione hromatografije na SEPHACRYL™ S200 koloni koja prethodno uravnotežena sa 50 mM pH 7.2 HEPES pufer koji sadrži 5 mM glicina i 150 mM NaCl. Hromatografija je izvedena pri linearnoj brzini protoka od 28 cm/h. Frakcije koje sadrže konjugat su skupljene, sjedinjene i koncentrovane. U alternativnoj metodi, prečišćavanje može da bude postignuto kroz jonoizmenjivačku hromatografiju. Uslovi variraju od antitela do antitela i trebaju da budu optimizovani u svakom slučaju. Na primer, reakciona smeša antitelo-lek konjugata je primenjena na SP-SEPHAROSE™ koloni koja je prethodno uravnotežena u 50 mM pH 5.5 HEPES koji sadrži 5mM glicina. Konjugat antitela je eluiran korišćenjem gradijenta od 0-1 M NaCl u ekvilibracionom puferu na pH 5.5. Relevantne frakcije koje sadrže konjugat su objedinjene i dijalizovane sa puferom za formulaciju (50 mM pH 7.2 HEPES pufer koji sadrži 5 mM glicina i 100 mM NaCl).
[0115] Prosečni poznavaoci oblasti će razumeti da uslovi i metodologija koji su opisani iznad služe kao primer i ne-ograničavajući su i da su drugi pristupi za konjugaciju poznati u stanju tehnike i mogu da se upotrebe u predmetnom pronalasku.
[0116] Konjugat je pripremljen pomoću procedure koja je iznad predstavljena formulom (II-1). To je konjugat jedinjenja (III-1) i anti-mezotelinsko antitelo 6A4 (Terrett et al.2012):
[0117] Prosečni poznavaoci oblasti će ceniti da takav preparat konjugata može da ima grupe sa različitim odnosima susptitucije, obično u rasponu od 1 do 5, i da takav preparat može da bude predstavljen formulom (II-1'):
gde R<6>je Me ili n-Pr i Ab je antitelo. Antitelo poželjno je anti-CD70, antimezotelinsko, ili anti-glipikan-3 antitelo.
FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE
[0118] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje predmetnog pronalaska, ili njegovog konjugata, formulisanu zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom. Po potrebi može da sadrži jedan ili više dodatnih farmaceutski aktivnih sastojaka, kao što je antitelo ili drugi lek. Farmaceutske kompozicije mogu da budu administrirane u kombinovanoj terapiji sa drugim terapijskim agensom, posebno drugim anti-kancerskim agensom.
[0119] Farmaceutska kompozicija može da sadrži jedan ili više ekscipijensa. Ekscipijensi koji mogu da budu korišćeni uključuju nosače, površinski aktivne agense, sredstva za zgušnjavanje i emulziju, čvrsta veziva, sredstva za disperziju i suspenziju, solubilizatore, sredstva za bojenje, sredstva za aromatizaciju, premaze, dezintegrišuće agense, lubrikante, zaslađivače, prezervative, izotonične agense, i njihove kombinacije. Odabir i primena pogodnih ekscipijenasa je proučavana u Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003).
[0120] Poželjno, farmaceutska kompozicija je pogodna za intravensku, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu administraciju (na primer, injekcijom ili infuzijom). U zavisnosti od puta administracije, aktivno jedinjenje može da bude obloženo materijalom koji ga štiti od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koja ga mogu dezaktivirati. Fraza "parenteralna administracija" označava načine administracije osim enteralne i topikalne administracije, obično pomoću injekcije, i uključuje, bez ograničenja, intravensko, intramuskularno, intraarterijalno, intratekalno, intrakapsularno, intraorbitalno, intrakardijalno, intradermalno, intraperitonealno, transtrahealno, subkutano, subkutikularno, intraartikularno, subkapsularno, subarahnoidno, intraspinalno, epiduralno i intrasternalno ubrizgavanje i infuziju. Alternativno, farmaceutska kompozicija može da bude administrirana neparenteralnim putem, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni put administracije, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno.
[0121] Farmaceutske kompozicije mogu da budu u obliku sterilnih vodenih rastvora ili disperzija. Oni takođe mogu da budu formulisani u mikroemulziji, lipozomu, ili drugoj uređenoj strukturikoja je pogodna za postianje visoke koncentracije leka. Kompozicije mogu se takođe obezbediti u obliku liofilata, za rekonstituciju u vodi pre administracije.
[0122] Količina aktivnog sastojka koja može da bude kombinovana sa materijalom nosača da proizvede jedinstveni dozni oblik variraće u zavisnosti od subjekta koji se tretira i određenog načina administracije i generalno će biti ta količina kompozicije koja proizvodi terapijski efekat. Generalno, od sto posto, ova količina kretaće se od oko 0.01 posto do oko 99 posto aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 posto do oko 70 posto, najpoželjnije od oko 1 posto do oko 30 posto aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0123] Režimi doziranja su podešeni da obezbede terapijski odgovor. Na primer, jedan bolus može da bude administriran, nekoliko podeljenih doza može da bude administrirano tokom vremena, ili doza može da bude proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno prema potrebama situacije. Posebno je pogodno da se formulišu parenteralne kompozicije u obliku dozne jedinice radi lakoće administracije i ravnomernosti doziranja. "Oblik dozne jedinice" odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinične doze za subjekte koji se tretiraju; svaku jedinicu koja sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunato da proizvede željeni terapijski odgovor, zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem.
[0124] Režimi doziranja od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i još uobičajnije 0.01 do 5 mg/kg, telesne mase domaćina. Na primer doziranje može da bude 0.3 mg/kg telesne mase, 1 mg/kg telesne mase, 3 mg/kg telesne mase, 5 mg/kg telesne mase ili 10 mg/kg telesne mase ili u okviru opsega od 1-10 mg/kg. Primeri režima lečenja su administracija jednom nedeljno, jednom na svake dve nedelje, jednom na svake tri nedelje, jednom na svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom na svaka tri meseca, ili jednom na svakih tri do 6 meseci. Poželjni dozni režimi uključuju 1 mg/kg telesne mase ili 3 mg/kg telesne mase putem intravenske administracije, korišćenjem jednog od sledećih rasporeda doziranja: (i) svake četiri nedelje za šest doziranja, zatim svaka tri meseca; (ii) svake tri nedelje; (iii) 3 mg/kg telesne mase nakon čega sledi 1 mg/kg telesne mase svake tri nedelje. U nekoj metodi, doziranje je podešeno da se postigne koncentracija plazme antitela od oko 1-1000 µg/mL i u nekoj metodi oko 25-300 µg /mL.
[0125] "Terapijski efikasna količina" jedinjenja predmetnog pronalaska poželjno rezultira u smanjenju ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanju frekvencije i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili prevenciji pogoršanja ili slabosti usled bolesti. Na primer, za lečenje subjekata koji nose tumor, "terapijski efikasna količina" poželjno inhibira rast tumora do najmanje oko 20%, poželjnije do najmanje oko 40%, čak poželjnije do najmanje oko 60%, i čak još poželjnije do najmanje oko 80% u odnosu na subjekte koji nisu podvrgnuti lečenju. Terapijski efikasna količina terapijskog jedinjenja može da smanji veličinu tumora, ili sa druge strane da ublaži simptome kod subjekta, koji je obično humani ali može da bude drugi sisar.
[0126] Farmaceutska kompozicija može da formulacija sa kontrolisanim ili produženim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere, i mikroenkapsulirane sisteme isporuke. Biorazgradivi, biokompatibilni polimeri mogu da budu korišćeni, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polimlečna kiselina. Videti, na primer, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0127] Terapijske kompozicije mogu da budu administrirane pomoću medicinskih sredstava kao što su (1) uređaji za potkožno ubrizgavanje bez igala (na primer, US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; i 4,596,556); (2) mikro-infuzione pumpe (US 4,487,603); (3) transdermalni uređaji (US 4,486,194); (4) infuzioni aparati (US 4,447,233 i 4,447,224); i (5) osmotski uređaji (US 4,439,196 i 4,475,196).
[0128] U određenim rešenjima, farmaceutska kompozicija može da bude formulisana da osigura pravilnu distribuciju in vivo. Na primer, da bi se osiguralo da terapijska jedinjenja predmetnog pronalaska pređu krvno-moždanu barijeru, oni mogu da budu formulisani u lipozomima, koji dodatno mogu da sadrže ciljne grupe da pojačaju selektivni transport do specifičnih ćelija ili organa. Videti, na primer US 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; i 5,399,331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol.
1233:134; Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett.346:123; i Killion and Fidler (1994) Immunometode 4:273.
PRIMENE
[0129] Jedinjenja ovog predmetnog pronalaska ili njihovi konjugati mogu da budu korišćeni za lečenje bolesti kao što su, ali nisu ograničeni na, hiperproliferativne bolesti, uključujući: kancere glave i vrata koji uključuju kancere glave, vrata, nosne šupljine, paranazalnih sinusa, nazofarinksa, oralne šupljine, orofarinksa, larinksa, hipofarinksa, pljuvačnih žlezda, i paragangliomi; kanceri jetre i bilijarnog stabla, posebno hepatocelularni karcinom; intestinalni kanceri, posebno kolorektalni kancer; kancer jajnika; sitnoćelijski i nesitnoćelijski kancer pluća (SCLC i NSCLC); sarkomi kancera dojke, kao što je fibrosarkom, maligni fibrozni histiocitom, embrionalni rabdomiosarkom, lejomiosarkom, neurofibrosarkom, osteosarkom, sinovialni sarkom, liposarkom i alveolarni sarkom mekog tkiva; leukemije kao što su akutna promijelocitna leukemija (APL), akutna mijelogenozna leukemija (AML), akutna limfoblastična leukemija (ALL), i hronična mijelogenozna leukemija (CML); neoplazme centralnih nervnih sistema, posebno moždani kancer; multipli mijelom (MM), limfomi kao što je Hodgkinov limfom, limfoplazmacitoidni limfom, folikularni limfom, limfom limfoidnog tkiva povezan sa mukozom, limfom mantle ćelija, limfom velikih B-ćelija Burkitov limfom, i T-ćelijski anaplastični limfom velikih ćelija. Klinički, izvođenje metoda i primena kompozicija koje su ovde opisane rezultiraće u smanjenju veličine ili broja kancerogenog rasta i/ ili smanjenju u povezanim simptomima (gde je primenljivo). Patološki, izvođenje metoda i primena kompozicija koje su ovde opisane proizvešće pataloški relevantni odgovor, kao što je: inhibicija proliferacije kancerskih ćelija, smanjenje veličine kancera ili tumora, prevencija od dalje metastaze, i inhibicija angiogeneze tumora. Metod lečenja takvih bolesti sadrži administriranje terapijski efikasne količine inventivne kombinacije subjektu. Metod može da bude ponovljen ako je potrebno. Posebno, kancer može da bude bubrežni, plućni, kancer želuca, ili kancer jajnika.
[0130] Jedinjenja ovog predmetnog pronalaska ili njihovi konjugati mogu da budu administrirani u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima, uključujući antitela, alkilirajuće agense, inhibitore angiogeneze, antimetabolite, agensi koji cepaju DNK, agensi za unakrsno povezivanje DNK, DNK interkalatori, agensi koji se vezuju za mali žljeb DNK, enedini, inhibitori proteina toplotnog šoka 90, inhibitori histon deacetilaze, imunomodulatori, stabilizatori mikrotubula, analozi nukleozida (purin ili pirimidin), inhibitori nuklearnog izvoza, inhibitori proteazoma, inhibitori topoizomeraze (I ili II), inhibitori tirozin kinaze, i inhibitori serin/treonin kinaze. Specifični terapijski agensi uključuju adalimumab, ansamitocin P3, auristatin, bendamustin, bevacizumab, bikalutamid, bleomicin, bortezomib, busulfan, kalistatin A, kamptotecin, kapecitabin, karboplatin, karmustin, cetuksimab, cisplatin, kladribin, citarabin, kriptoficini, dakarbazin, dasatinib, daunorubicin, docetaksel, doksorubicin, duokarmicin, dinemicin A, epotiloni, etopozid, floksuridin, fludarabin, 5-fluorouracil, gefitinib, gemcitabin, ipilimumab, hidroksiurea, imatinib, infliksimab, interferoni, interleukini, β-lapahon, lenalidomid, irinotekan, maitanzin, mehloretamin, melfalan, 6-merkaptopurin, metotreksat, mitomicin C, nilotinib, oksaliplatin, paklitaksel, prokarbazin, suberoilanilid hidroksaminska kiselina (SAHA), 6-tioguanidin, tiotep, tenipozid, topotekan, trastuzumab, trihostatin A, vinblastin, vinkristin, i vindezin.
PRIMERI
[0131] Izvođenje ovog predmetnog pronalaska može dalje da se razume pozivanjem na sledeće primere.
Primer 1 - Jedinjenje (III-1)
[0132] Ovaj primer opisuje sintezu jedinjenja (III-1), odgovarajuća shema je prikazana na kombinovanim slikama 1, 2a-2b, i 3.
[0133] Jedinjenje 2. Smeša jedinjenja 1 (6 g, 16.6 mmol; pripremljenog u skladu sa Peltier et al. 2006) i paraformaldehida (9.94 g, 331 mmol) u toluenu (150 mL) je zagrejana u zatvorenoj posudi na 70 °C tokom 24 sata. Tankoslojna hromatografija (TLC) pokazala je da je reakcija završena. Reakciona smeša je filtrirana kroz CELITE™ filter medijum i materijal zaostao na filteru je temeljno ispran toluenom. Posle evaporacije rastvora, sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-70% etil acetata (EtOAc) u dihlorometanu (DCM) da se dobije 4.76 g jedinjenja 2 kao svetlo žuto ulje MS: (+) m/z 375.2 (M+1).
[0134] Jedinjenje 3. Hlorovodonična kiselina (4.0 M u 1,4-dioksan, 12.24 mL, 50.8 mmol) je dodata kapima u rastvor jedinjenja 2 (4.76 g, 12.7 mmol) u acetonitrilu (62 mL) i metanolu (6.8 mL), u prisustvu cijanoborohidrid (MP-BH3CN) smole koja pomaže vezivanje (4.85 g, 12.7 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi (RT) tokom 3 sata. LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Smola je isfiltrirana i isprana sa smešom acetonitrila i metanola. Posle evaporacije rastvora, sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-10% metanola u DCM koji sadrži 1% NH4OH da se dobije sirovo jedinjenje 3.
[0135] Frakcije proizvoda su koncentrovane, razblažene sa EtOAc, i isprane sa zasićenim vodenim NaHCO3 da se ukloni višak amonijumovih soli. Vodena frakcija je ponovo ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovane organske faze su osušene i koncentrovane da se dobije 2.82 g jedinjenja 3 kao penasta čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 273.2 (M+1).
[0136] Jedinjenje 4. Polimerom vezan N-benzil-N-cikloheksilkarbodiimid (Aldrich, 4.5 g, 5.21 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 3 (1.42 g, 5.21 mmol), t-butanola (0.72 g, 5.32 mmol) i Boc-zaštićenog izoleucina 3a (1.27 g, 5.47 mmol) u DCM (48 mL) na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Smola je isfiltrirana i isprana sa DCM. Filtrat je koncentrovan, rastvoren sa EtOAc, i ispran sa zasićenim vodenim NaHCO3. Vodeni rastvor je ekstrahovan c. Kombinovani organski slojevi su osušeni, filtrirani i koncentrovani. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-10% metanola u DCM koji sadrži 1% NH4OH da se dobiju frakcije koje sadrže intermedijarni proizvod 3b.
[0137] Frakcije koje sadrže proizvod su kombinovane, koncentrovane, razblažene sa EtOAc, i isprane sa zasićenim vodenim NaHCO3da se ukloni višak amonijumovih soli. Vodena frakcija je ponovo ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovane organske faze su osušene i koncentrovane da se dobije intermedijarni proizvod 3b kao bela čvrsta supstanca.
[0138] Intermedijarni proizvod 3b u toluenu (50 mL) je zagrejan na 90 °C u zatvorenoj posudi preko noći, uz mešanje. LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-100% EtOAc u heksanima da se dobije 1.3 g jedinjenja 4 kao svetlo žuta čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 486.3 (M+1).
[0139] Jedinjenje 5. Trifluorosirćetna kiselina (TFA, 26 mL) je dodata smeši jedinjenja 4 u DCM (26 mL). Nakon mešanja na sobnoj temperaturi tokom 30 min, LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Rastvor je koncentrovan, razblažen sa EtOAC, i ispran sa zasićenim vodenim NaHCO3. Vodeni rastvor je ponovo ekstrahovan sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su osušeni, filtrirani, i koncentrovani da se dobije 1.03 g jedinjenja 5 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 386.3 (M+1).
[0140] Jedinjenje 6. DCC (0.664 g, 3.22 mmol) je dodat smeši jedinjenja 5 (1.03 g, 2.68 mmol), (R)-1-metilpiperidin-2-karboksilne kiseline 5a (0.4 g, 2.81 mmol; pripremljena u skladu sa Peltier et al. 2006), i t-butanola (0.369 g, 2.73 mmol) u DCM na 0 °C. Reakcionoj smeši je dozvoljeno da se zagreje do sobne temperature i mešana je na sobnoj temperaturi preko noći. Čvrsta supstanca je isfiltrirana, i filtrat je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u EtOAc i ispran jednom sa zasićenim vodenim NaHCO3. Vodeni rastvor je ponovo ekstrahovan dva puta sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su osušeni, filtrirani, i koncentrovani. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-20% metanola u DCM da se dobije 1.23 g jedinjenje 6 kao svetlo žuta čvsrta supstanca. MS: (+) m/z 511.4 (M+1).
[0141] Jedinjenje 7. Smeša N,N-diizopropiletilamina (DIEA, takođe nazvan DIPEA, 0.972 mL, 5.58 mmol), bis(4-nitrofenil) karbonata (BNPC, 1.698 g, 5.58 mmol) i jedinjenja 6 (0.57 g, 1.116 mmol) u N,N-dimetilformamidu (DMF, 10 mL) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. LCMS je pokazala da je reakcija kompletna Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu sa gradijentom od 0-20% metanola u DCM da se dobije 0.68 g jedinjenja 7 kao žuto ulje. MS: (+) m/z 676.4 (M+1).
[0142] Jedinjenje 8. Metilamin u metanolu (2.0 M, 0.089 mL, 0.178 mmol) je dodat jedinjenju 7 (0.1 g, 0.148 mmol) u metanolu (1 mL). Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 10 min, LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Rastvarač je evaporisan da se dobije 0.084 g jedinjenja 8. MS: (+) m/z 568.4 (M+1).
[0143] Jedinjenje 9. Litijum hidroksid (7.09 mg, 0.296 mmol) u vodi (0.5 mL) je dodat rastvoru jedinjenja 8 (0.084 g, 0.148 mmol) u 1,4-dioksanu (0.5 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-30% metanola u DCM da se dobije 0.075 g jedinjenje 9 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 554.4 (M+1).
[0144] Jedinjenje 10. Trietilamin (11.73 mL, 84 mmol) je dodat smeši dit-butildikarbonata (BOC2O, 10.57 mL, 46.0 mmol) i (S)-metil 2-amino-3-(4-nitrofenil)propanoat hidrohlorida 9a (10 g, 38.4 mmol) u acetonitrilu (300 mL) na 0 °C. Reakcionoj smeši je dozvoljeno da se zagreje do sobne temperature, i mešana je na sobnoj temperaturi preko noći. LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Reakciona smeša je koncentrovana, i proizvod je ponovo razblažen u 200 mL dietil etra. Čvrsta supstanca je isfiltrirana, i filtrat je koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom 0-50% EtOAc u heksanima da se dobije 11.3 g Boc zaštićeni intermedijer kao bela čvrsta supstanca.
[0145] Pd /C katalizator (10 mas %, 0.85 g, 7.99 mmol) je dodat rastvoru Boc zaštićenom intermedijaru (15 g, 46.2 mmol) u MeOH (200 mL). Reakciona smeša je mešana pod atmosferom vodonika preko noći. Pd/C katalizator je filtriran, i filtrat je koncentrovan da se dobije 13.6 g jedinjenja 10 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 195.2 (M+1-Boc).
[0146] Jedinjenje 11. Piridin (5.77 mL, 71.3 mmol) je dodat rastvoru benzil hloroformata (10.18 mL, 71.3 mmol) i jedinjenju 10 (17.5 g, 59.5 mmol) u DCM (185 mL) na 0 °C. Reakcionoj smeši je dozvoljeno da se zagreje do sobne temperature i mešana je na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija je kvenčovana dodavanjem zasićenog vodenog NaHCO3, i isprana je sa slanim rastvorom. Organski sloj je osušen, filtriran, i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-50% EtOAc u heksanima da se dobije 22.6 g jedinjenja 11 kao bezbojno ulje. MS: (+) m/z 329.2 (M+1-Boc).
[0147] Jedinjenje 12. Diizobutilaluminijum hidrid (DIBAL-H) u heksanima (1M, 26.5 mL, 26.5 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 11 (5.17 g, 12.07 mmol) u DCM (39 mL) na -78 °C. Reakciona smeša je mešana na -78 °C tokom 2 sata. Sirćetna kiselina (24 mL) i toluen (36 mL) su dodati na -78 °C. Reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature. Vinska kiselina (10% vd., 69 mL) je dodata reakcionoj smeši. Vodeni rastvor je ekstrahovan sa heksanima i EtOAc (v/v 1:1) smešom. Kombinovani organski slojevi su osušeni, filtrirani, i koncentrovani. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-50% EtOAc u heksanima da se dobije 3.12 g jedinjenja 12 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 299.2 (M+1-Boc).
[0148] Jedinjenje 13. Dibutil(((trifluorometil)sulfonil)oksi)boran (Bu2BOTf, 1M u DCM, 8.61 mL, 8.61 mmol) i DIEA (1.637 mL, 9.40 mmol) su dodati rastvoru (S)-4-izopropil-3-propioniloksazolidin-2-on 12a (1.450 g, 7.83 mmol) u DCM (7.8 mL) na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 45 min. Rastvor jedinjenja 12 (3.12 g, 7.83 mmol) u DCM (7.8 mL) je dodat reakcionoj smeši na -78 °C. Reakcionoj smeši je dozvoljeno da se zagreje do sobne temperature preko noći. Pufer natrijum fosfata (pH 7, 29 mL) je dodat. Vodeni rastvor je ekstrahovan sa DCM. Kombinovani organski slojevi su isprani sa slanim rastvorom, osušeni, filtrirani, i koncentrovani.
[0149] Ostatak je ponovo razblažen u metanolu (130 mL) i ohlađen do 0 °C. Vodeni H2O2 (30%, 39.7 mL) je dodat reakcionoj smeši na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 4 sata. Voda (39 mL) je dodata. Neki od rastvarača (MeOH) je evaporisan. Vodeni rastvor je ekstrahovan sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su isprani sa 5% NaHCO3 rastvorom i slanim rastvorom, osušeni, filtrirani, i koncentrovani. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-50% EtOAc u heksanima da se dobije 4.23 g jedinjenja 13 kao bezbojno ulje. MS: (+) m/z 484.3 (M+1-Boc).
[0150] Jedinjenje 14. Di(1H-imidazol-1-il)metantion (1.5 g, 8.42 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 13 (2.46 g, 4.21 mmol) u THF (20 mL). Reakciona smeša je refluksovana preko noći. LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu sa gradijentom od 0-50% EtOAc u heksanima da se dobije 1.25 g jedinjenja 14 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 694.3 (M+1).
[0151] Jedinjenje 15. (E)-2,2'-(diazen-1,2-diil)bis(2-metilpropannitril) (AIBN, 0.016 g, 0.095 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 14 (178 g 257 mmol) i tributilstanana (Bu3SnH, 1.380 mL, 5.13 mmol). Reakciona smeša je refluksovana za 30 min (temperatura uljanog kupatila na 142 °C). Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-33% EtOAc u heksanima da se dobije 0.84 g jedinjenja 15 kao svetlo žuto ulje. MS: (+) m/z 468.3 (M+1-Boc).
[0152] Jedinjenje 16. LiOH (0.071 g, 2.96 mmol) u vodi (3.7 mL) je dodat rastvoru jedinjenja 15 (0.84 g, 1.480 mmol) u tetrahidrofuranu (THF, 11.4 mL), što je praćeno dodavanjem 30% vodenog H2O2(0.271 mL, 8.88 mmol) na 0 °C. Nakon što je reakciona smeša mešana na 0 °C tokom 4 sata, 20 mL od 1.33 M vodenog Na2SO3 je dodato da bi se kvenčovala reakcija. Hlorovodonična kiselina (1 M) je dodata da se podesi pH na 2-3. Rezultirajući vodeni rastvor je ekstrahovan sa DCM. Kombinovani organski slojevi su osušeni, filtrirani, i koncentrovani. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-75% EtOAc u heksanima da se dobije 0.53 g jedinjenja 16 kao bezbojno ulje. MS: (+) m/z 357.3 (M+1-Boc).
[0153] Jedinjenje 17. Koncentrovana hlorovodonična kiselina (4 kapi) je dodata rastvoru 2,2-dimetoksipropana (3.53 mL, 28.7 mmol) i jedinjenja 16 (0.53 g, 1.161 mmol) u metanolu (17.7 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. LCMS je takođe pokazala stvaranje nekog nezaštićenog sporednog proizvoda 16a. Rastvarač je evaporisan.
[0154] Trietilamin (2.2 vodeni, 0.36 mL) je dodat rastvoru iznad pomenutog ostatka i BOC2O (1.2 vodeni, 304.3 mg) u acetonitrilu na sobnoj temperaturi, da se ponovo zaštiti sporedni proizvod 16a. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Rastvarač je evaporisan. Voda (7 mL) je dodata, i vodeni rastvor je ekstrahovan sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su osušeni, filtrirani, i koncentrovani. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-50% EtOAc u heksanima da se dobije 0.3 g jedinjenja 17 kao bezbojno ulje. MS: (+) m/z 371.3 (M+1-Boc).
[0155] Jedinjenje 18. Smeša jedinjenja 17 (0.223 g, 0.474 mmol) i Pd/C 10 mas % (20 mg, 0.474 mmol) u metanolu (6 mL) je mešana pod H2 preko noći. Pd/C katalizator je isfiltriran, i filtrat je koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-50% EtOAc u heksanima da se dobije 0.112 g jedinjenja 18 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 237.2 (M+1-Boc).
[0156] Jedinjenje 19. Smeša jedinjenja 18 (0.204 g, 0.606 mmol), N-Etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida (EDC, 0.174 g, 0.910 mmol), i Fmoczaštićenog citrulina 18a (0.361 g, 0.910 mmol) u DMF (12.4 mL) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Zasićeni NH4Cl rastvor (20 mL) je dodat da bi se reakcija kvenčovala. Vodeni rastvor je ekstrahovan sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su osušeni, filtrirani, i koncentrovani. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu sa gradijentom 0-30% MeOH u DCM da se dobije 0.25 g jedinjenja 19 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 716.4 (M+1).
[0157] Jedinjenje 20. Piperidin (0.5 mL, 5.06 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 19 (0.25 g, 0.349 mmol) u DMF (5 mL). Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 min, rastvarač je evaporisan da se dobije Fmoc-zaštićeni intermedijer kao ostatak.
[0158] DIEA je dodat rastvoru (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)-amino)-3-metilbutanoične kiseline 19a (0.142 g, 0.418 mmol) i N,N,N',N'-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uranijum heksafluorofosfata (HATU, 0.146 g, 0.383 mmol) u DMF (2 mL), podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 min, ostatak opisan iznad u DMF (1 mL) i DIEA su dodati reakcionoj smeši, podešavanjem pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 min, 20 mL vode koja sadrži 8 mL od 0.1% TFA vode je dodato. Vodeni rastvor je ekstrahovan sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su osušeni, filtrirani, i koncentrovani. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-20% MeOH u DCM da se dobije 0.24 g jedinjenja 20 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 815.4 (M+1).
[0159] Jedinjenje 21. Piperidin (0.3 mL) je dodat rastvoru jedinjenja 20 u DMF (3 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Rastvarač je evaporisan.
[0160] Litijum hidroksid (0.028 g, 1.176 mmol) u vodi (2 mL) je dodat rastvoru prethodno pomenutog ostatka u THF (4 mL). Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 sata, vodeni HCl (0.1N) je dodat da zakiseli reakcionu smešu (pH 2-3). Rastvarač je delimično evaporisan, i liofiliziran da se dobije jedinjenje 21 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 579.4 (M+1).
[0161] Jedinjenje 22. DIEA je dodat smeši hidroksisukcinimid estra ε-maleimidokaproinske kiseline N- 21a (Tokyo Chemical Industry 647 mg 0210 mmol) i jedinjenja 21 (81 mg, 0.14 mmol) u DMF (3 mL), podešavajući pH 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, 10 mL od 1:1 (v/v) smeše acetonitrila i vode koja sadrži 0.1% TFA je dodato. Proizvod 22 je prečišćen preparativnom tečnom hromatografijom visoke performanse (HPLC). MS: (+) m/z 772.5 (M+1).
[0162] Jedinjenje 23. 2,2,2-Trifluorosirćetna kiselina (0.7 mL, 0.013 mmol) je dodata smeši jedinjenja 22 (30 mg, 0.039 mmol) u DCM (1 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 10 min, LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Rastvarač je evaporisan, obezbeđujući jedinjenje 23. MS: (+) m/z 672.4 (M+1).
[0163] Jedinjenje (III-1). DIEA je dodat rastvoru jedinjenja 9 (23.66 mg, 0.043 mmol) i HATU (14.77 mg, 0.039 mmol) u DMF (1 mL). pH reakcione smeše je podešen na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 10 min, jedinjenje 23 (26.1 mg, 0.039 mmol) u DMF (1 mL) i DIEA su dodati. pH reakcionog rastvora je podešen na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 10 min, LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Reakcija je kvenčovana dodavanjem 10 mL od 1:1 (v/v) smeše vode koja sadrži 0.1% TFA i acetonitrila. Proizvod jedinjenja (III-1) je prečišćen preparativnom HPLC. MS: (+) m/z 1207.7 (M+1).
[0164] Jedinjenja kao što je (III-1), koja imaju maleimidnu grupu, mogu da se koriste da se pripreme konjugati pomoću reakcije sa sulfhidrilnom grupom na antitelu ili drugom ligandu. Sulfhidrilna grupa može da bude jedna iz ostatka smole ili jedna dobijena derivatizatizacijom lizinskog ostatka sa 2-iminotiolanom.
Primer 2 - Jedinjenje (III 2)
[0165] Ovaj primer opisuje sintezu jedinjenja (III-2), odgovarajuća shema je prikazana na slici 4.
[0166] Jedinjenje 24. N-Etil-N-izopropilpropan-2-amin (0.556 mL, 3.19 mmol) je dodat rastvoru glicin terc-butil estar hidrohlorida 23a (0.209 g, 1.596 mmol), Fmocaminoksisirćetne kiseline 23b (0.5g, 1.596 mmol) i HATU (0.607 g, 1.596 mmol) u DMF (5 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, 0.1% vodeni TFA (20 mL) je dodat. Vodeni rastvor je ekstrahovan sa EtOAc, i kombinovani organski slojevi su osušeni, filtrirani, i koncentrovani. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-70% EtOAc u heksanima da se dobije 0.45 g jedinjenja 24 k b b j lje. MS: (+) m/z 449.2 (M+23).
[0167] Jedinjenje 25. TFA (3 mL, 1.437 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 24 (0.45 g, 1.055 mmol) u DCM (0.5 mL) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-30% MeOH u DCM da se dobije 0.39 g jedinjenja 25 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 371.1 (M+1).
[0168] Jedinjenje 26. N,N'-metandiilidendicikloheksanamin (DCC, 0.261 g, 1.267 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 25 i 1-hidroksipirolidin-2,5-dion (0.146 g, 1.267 mmol) u DCM (6 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi preko noći, čvrsta supstanca je isfiltrirana. Filtrat je zatim koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-100% EtOAc u heksanima da se dobije 0.43 g jedinjenja 26 kao bezbojno ulje.
[0169] Jedinjenje 27. DIEA je dodat rastvoru jedinjenja 21 (50 mg, 0.086 mmol) i jedinjenja 26 (60.6 mg, 0.130 mmol) u DMF na sobnoj temperaturi, podešavanjem pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 sata, reakcija je kvenčovana dodavanjem 10 mL od 1:1 smeše od 0.1 % vodenog TFA i acetonitrila. Prečišćavanje preparativnom HPLC daje 55 mg jedinjenja 27 kao belu čvrstu supstancu, MS: (+) m/z 931.4 (M+1).
[0170] Jedinjenje 28. TFA (1 mL, 0.059 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 27 (55 mg, 0.059 mmol) u DCM (2 mL) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 10 min. Rastvarač je evaporisan.
[0171] DIEA je dodat rastvoru jedinjenja 9 (32.7 mg, 0.059 mmol) i HATU (22.47 mg, 0.059 mmol) u DMF (1 mL). pH reakciona smeše je podešena na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 10 min, DMF (2 mL) i DIEA su dodati. pH reakcionog rastvora je podešen na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 10 min, LCMS je pokazala da je reakcija kompletna. Reakcija je kvenčovana dodavanjem 20 mL 1:1 (v/v) smeše vode koja sadrži 0.1% TFA i acetonitrila. Prečišćavanje preparativnom HPLC dalo je 70 mg jedinjenja 28 kao belu čvrstu supstanca. MS: (+) m/z 684.1 (M/2+1).
[0172] Jedinjenje (III-2). Piperidin je dodat rastvoru jedinjenja 28 (70 mg, 0.051 mmol) u DMF (4 mL). Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 min, 1:1 smeša acetonitrila i 0.1% vodenog TFA (40 mL) je dodata. Prečišćavanje preparativnom HPLC daje 46 mg jedinjenja (III-2) kao belu čvrstu supstancu. MS: (+) m/z 1144.6 (M+1).
[0173] Jedinjenja kao što je (III-2), koja imaju hidroksilamin grupu, mogu da budu korišćena da formiraju konjugate sa antitelom ili drugim ligandom koji ima funkcionalnost aldehida ili ketona, na primer inkorporacijom neprirodne amino kiseline 4-acetilfenilalanin.
Primer 3 - Jedinjenja (I-2) i (I-3)
[0174] Sinteza jedinjenja (I-2) i (I-3) je prikazana šematski na slici 5.
[0175] Jedinjenje (I-3). DIEA je dodat rastvoru jedinjenja 9 (10 mg, 0.018 mmol) i HATU (6.87 mg, 0.018 mmol) u DMF (0.3 mL), podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 10 min, jedinjenje 29 (pripremljeno u skladu sa Cheng et al. 2011, primer 17; 4.56 mg, 0.018 mmol) u DMF (0.5 mL) i DIEA su dodati, podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 min, reakcija je kvenčovana dodavanjem 4 mL od 1:1 smeše acetonitrila i 0.1 % vodeni TFA. Prečišćavanje preparativnom HPLC je dalo 12 mg jedinjenja (I-3) (I-2) kao belu čvrstu supstancu. MS: (+) m/z 788.4 (M+1).
[0176] Jedinjenje (I-2). Smeša jedinjenja (I-3) (12 mg, 0.015 mmol) i Pd/C, 10 mas % (4 mg, 0.015 mmol) u metanolu (0.5 mL) je mešana pod H2atmosferom preko noći. Katalizator je isfiiltriran, i filtrat je koncentrovan. Prečišćavanje preparativnom HPLC je dalo 8.1 mg jedinjenja (I-2) kao belu čvrstu supstancu. MS: (+) m/z 758.4 (M+1).
[0177] Jedinjenje (I-1) se može analogno pripremiti zamenom jedinjenja 29 sa jedinjenjem koje ima mešanu stereohemiju na alfa-metil položaju (Cheng et al.2011).
Primer 4 - Jedinjenje (III-4)
[0178] Slike 6a do 6c u kombinaciji prikazuju šematski sintezu jedinjenja (III-4).
[0179] Jedinjenje 32. Jedinjenje 30 (Aldrich, 3.5g, 13.9 mmol) je rastvoreno u 50 mL DCM. Ovom rastvoru je dodat Des-Martinov perjodinan (11.8 g, 27.9 mmol) na 5 °C. Posle 10 min smeša je zagrejana do sobne temperature. Posle drugog sata reakcija je kvenčovana sa zasićenim vodenim NaHCO3i zasićenim vodenim NaS2O3. Nakon ekstrakcije sa etrom, ekstrakt etra je ispran sa vodenim NaHCO3 i zatim slanim rastvorom i osušen i evaporisan u lepljivo ulje. Ulje je rastvoreno u 50 mL od DCM, čemu je dodato komercijalno dostupno jedinjenje 31 (5.05 g, 13.93 mmol). Posle 10 min reakciona smeša je ubačena u EtOAc, isprana sa vodenim NaHCO3 i zatim slanim rastvorom i osušena, filtrirana i rastvarač je evaporisan. Posle hromatografije na koloni (EtOAc: heksan, 0-20% gradijent) jedinjenje 32 (2.3 g, 6.90 mmol, 49.5 % prinos) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca. Jedinjenje je imalo NMR spektar konzistentan sa literaturom (Wipf et al.2004a).
[0180] Jedinjenje 33. Hlorovodonična kiselina (7.80 mL, 31.2 mmol, 4M u dioksanu) je dodata na 5 °C DCM rastvoru jedinjenja 32 (5.2 g, 15.60 mmol). Nakon što je reakcija uklanjanja zaštite završena, reakciona smeša je evaporisana i jedinjenje 33 (4.21 g, 15.60 mmol, 100 % prinos, hidrohlorid) je dobijeno kao bela čvrsta supstanca, koja je iskorišćena za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
[0181] Jedinjenje 35. Rastvoru jedinjenja 34 (pripremljeno po Sani et al. 2007, 4.00 g, 11.6 mmol) u 20 mL DMF na 5 °C je dodat HATU (4.61 g, 12.12 mmol) i DIPEA (6 ml, 34.4 mmol). Posle 10 min jedinjenje 33 (2.71 g, 11.60 mmol) je dodato. Posle drugih pola sata smeša je ubačena u EtOAc, što je isprano sa 10% vodene limunske kiseline, zasićeno vodenim NaHCO3i slanim rastvorom. Nakon sušenja i filtriranja, organska faza je evaporisana da se dobije jedinjenje 35 (6.49 g, 11.60 mmol, 100 % prinos, [M+Na]<+>, izračunato 582.3, pronađeno 582.3) kao ulje, koje je iskorišćeno za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
[0182] Jedinjenje 36. NaBH4(4.66 g, 123 mmol) je dodat, u delovima, 100 mL metanol rastvoru jedinjenja 35 (6.49 g, 11.6 mmol) i NiSO4(H2O)6 (6.48 g, 24.66 mmol) na 5 °C. (Oprez: Hidrogen je generisan.) Posle 30 min, zasićeni vodeni NaHCO3 je dodat, što je praćeno sa EtOAc. Nakon filtracije kroz CELITE™, organska faza je odvojena od vodene faze, isprana sa slanim rastvorom, osušena, filtrirana i evaporisana da se dobije jedinjenje 36 (5.6 g, 9.97 mmol, 81 % prinos, [M+1]<+>, izračunato 562.3, pronađeno 562.4), koje je iskorišćeno za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
[0183] Jedinjenje 37. Jedinjenje 36 (5.6 g, 9.97 mmol) je rastvoreno u 30 mL piridina na 5 °C. Sirćetni anhidrid (4 g, 39.2 mmol) je dodat ovom rastvoru. Posle 10 min smeša je zagrejana do sobne temperature. Posle oko sat vremena reakciona smeša je koncentrovana. Rezultirajući ostatak je stavljen u EtOAC i organska faza je isprana sa 10% vodenom sirćetnom kiselinom, zasićenim vodenim NaHCO3, i slanim rastvorom, sekvencijalno. Organska faza je osušena, filtrirana i koncentrovana da se dobije jedinjenje 37 (5.8 g, 9.61 mmol, 100 % prinos, [M+1]<+>, izračunato 604.3, pronađeno 604.4), koje je iskorišćeno za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
[0184] Jedinjenja 38a i 38b. Jedinjenje 37 (0.8 g, 1.3 mmol) je rastvoreno u 5 mL metanola na -78 °C. Ovom rastvoru je dodat NaOMe (331 uL 133 mmol, 4M u MeOH). Smeši je dozvoljeno da se zagreje do sobne temperature preko 1 sata. Smeša je ubačena u EtOAc, isprana sa 10% vodenom sirćetnom kiselinom, zasićenim vodenim NaHCO3rastvorom, i slanim rastvorom. Odvojena organska faza je osušena, filtrirana i evaporisana da se dobije smeša estara etila i metila (jedinjenja 38a i 38b, redom). Smeša estara nije odvojena tokom sledećih nekoliko koraka, sve dok oba nisu hidrolizovana u karboksilnu kiselinu u kasnijem koraku.
[0185] Jedinjenja 40a i 40b. Smeša jedinjenja 38a i 38b iz reakcije iznad je rastvorena u 20 mL DCM. Ovom rastvoru je dodat 4-nitrofenil karbonohloridat 39 (524 mg, 2.6 mmol) i piridin (210 µl, 2.6 mmol) na 5 °C. Temperaturi je dozvoljeno da raste do sobne temperature posle 1 sata i metilamin (1.950 mL, 3.9 mmol, 2M u THF) je dodat. Posle 10 min rastvarač je evaporisan i ostatak je prošao kroz hromatografsku kolonu da se dobije smeša jedinjenja 40a i 40b (etil i metil estri, redom; 420 mg, 40a/40b odnos 3:1 od HPLC, oko 53% prinos za dva koraka, [M+1]<+>: izračunato 603.3, pronađeno 603.4 za 40a; izračunato 589.3, pronađeno 589.4 za 40b).
[0186] Jedinjenja 41a i 41b. Smeša jedinjenja 40a i 49b (420 mg, oko 0.68 mmol) je rastvorena u 3 mL DCM, kojoj je dodata HCl (4.8 mmol, 1.2 mL, 4N u dioksanu). Posle 1 sata na 5 °C rastvarač je evaporisan i smeša jedinjenja 41a (etil estar) i 41b (metil estar), odnos oko 3:1, je korišćena za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
[0187] Jedinjenja 43a i 43b. Smeša jedinjenja 41a i 41b (400 mg, ≈0.72 mmol), jedinjenje 42 (komercijalno dostupno od Anichem, 170 mg, 0.721 mmol) i sirćetna kiselina (0.041 mL, 0.721 mmol) su mešani u DCM na 5 °C. Natrijum triacetoksiborohidrid (306 mg, 1.44 mmol) je dodat. Smeša je ubačena u EtOAc posle 30 min. Nakon što je isprana sa 7% vodenog K2CO3 i slanim rastvorom, organska faza je osušena, filtrirana i evaporisana da se dobije ostatak. Nakon prečišćavanja hromatografijom na koloni (MeOH: DCM, 0-7% gradijent), jedinjenja 43a (etil estar) i 43b (metil estar) su dobijena (310 mg, približno 0.42 mmol, približno 58.3 % prinos, 43a:43b odnos oko 3:1, [M+1]<+>, izračunato 738.4, pronađeno 738 za 43a; izračunato 724.4, pronađeno 724 za 43b).
[0188] Jedinjenja 45a i 45b. Smeša jedinjenja 43a i 43b (310 mg, približno 0.42 mmol) je rastvorena u 5 mL DCM na sobnoj temperaturi. Ovom rastvoru je dodat 2,6-di-tercbutilpiridin (161 mg, 0.840 mmol) i 2 mL DCM rastvora jedinjenja 44 (pripremljeno po Peltier et al. 2006, 73.8 mg, 0.420 mmol). Nakon pola sata Et3N (58.6 µl, 0.420 mmol) je dodat. Smeša je ubačena u EtOAc, što je isprano sa 10% vodenom sirćetnom kiselinom, zasićenim vodenim NaHCO3 rastvorom i slanim rastvorom. Organska faza je osušena, filtrirana i evaporisana do ostatka. Nakon prečišćavanja hromatografijom na koloni, jedinjenja 45a i 45b su dobijena (294 mg, približno 0.334 mmol, 80 % prinos, 45a:45b odnos 3:1, [M+1]<+>, izračunato 877.5, pronađeno 877 za 45a; izračunato 863.5 pronađeno 863 za 45b) kao lepljivo ulje.
[0189] Jedinjenja 46a i 46b. Smeša jedinjenja 45a i 45b (100 mg, približno 0.114 mmol) je dodata suspenziji Pd/C (65 mg, 10%) u 20 mL MeOH. HCl (28.5 µL, 0.114 mmol, 4M u dioksanu) je dodata. Sud je evakuisan i ponovo napunjen sa H2, ovaj proces je ponovljen tri puta. Posle 2 sata suspenzija je filtrirana i rastvarač je evaporisan da se dobije ostatak. Suspenzija jedinjenja 5a (19.59 mg, 0.137 mmol) u 500 uL DMF, HATU (43.4 mg, 0.114 mmol) i DIPEA (49.8 µl, 0.285 mmol) su dodati na 5 °C. Nakon što je suspenzija postala homogenena prethodno pomenuti ostatak je dodat kao DMF (1 mL) rastvor. Više DIPEA je dodato da se podesi pH do oko 12. Posle 10 min smeša je ubačena u EtOAc, što je isprano sa 10% vodenom limunskom kiselinom, zasićenim vodenim NaHCO3 i slanim rastvorom. Odvojena organska faza je osušena, filtrirana i evaporisana. Rezultujući ostatak je prošao kroz hromatografsku kolonu da se dobije smeša jedinjenja 46a i 46b (etil i metil estri, redom, 80 mg, oko 0.082 mmol, 71.9 % prinos, 46a:46b odnos 3:1, [M+1]<+>, izračunato 976.5, pronađeno 976.5 za 46a; izračunato 962.5, pronađeno 962.5 za 46b).
[0190] Jedinjenja 47a i 47b. HCl (256 µl, 1.024 mmol, 4M u dioksanu) je dodata 2 mL MeOH rastvoru jedinjenja 46a i 46b (200 mg, 0.205 mmol) na 5 °C. Nakon 1 sata rastvor je evaporisan i osušen pri visokom vakumu preko noći da se dobije lepljivo ulje. Ovo lepljivo ulje, Fmoc-zaštićen citrulin 18a (81 mg, 0.205 mmol), i DIPEA (179 µl, 1.024 mmol) su rastvoreni u 2 mL DMF na sobnoj temperaturi. Anhidrid propilfosfonske kiseline (T3P, 178 µL, 0.410 mmol, 2.3 M u EtOAc) je dodat. Nakon što je reakciona smeša 1 sat ubačena u EtOAc, što je isprano sa zasićenim vodenim NaHCO3 rastvorom i slanim rastvorom. Nakon odvajanja, sušenja i evaporisanja, rezultujući ostatak je prošao kroz hromatografsku kolonu (MeOH: DCM, 0-10% gradient) da se dobije smeša jedinjenja 47a i 47b (etil i metil estri, redom, 150 mg, približno 0.119 mmol, oko 58.3 % prinos, 47a:47b odnos 3:1, [M+1]<+>, izračunato 1255.6, pronađeno 1255.6 za 47a; izračunato 1241.6, pronađeno 1241.6 za 47b).
[0191] Jedinjenje 49. Smeša jedinjenja 47a i 47b (200 mg, oko 0.165 mmol) je rastvorena u 5 mL DMF (sa 5% piperidina) na sobnoj temperaturi. Rastvor je evaporisan do suva posle 30 min. Rezultujući ostatak je pomešan sa Boc-zaštićenim valin N-hidroksisukcinimid estrom 48 (61.9 mg, 0.198 mmol), 5 mL DMF i DIPEA (87 µL, 0.496 mmol). Nakon dozvoljavanja reakciji da se nastavi preko noći, reakciona smeša je evaporisana do suva. Rezultujuća smeša je rastvorena u 5 mL smeše od MeOH, THF i vode (1:1:1). NaOH je dodat i pH krajnjeg rastvora bio je 14. Nakon dozvoljavanja reakciji da se nastavi preko noći na sobnoj temperaturi, smeša je zakišeljena sa HCl sa pH od 3 i evaporisana pod visokim naponom. Dobijena čvrsta supstanca je tretirana sa TFA i smeša je evaporisana posle 10 min, dajući jedinjenje 49 (80 mg, 0.072 mmol, 43.8 % prinos, [M+1]<+>, izračunato 1104.6, pronađeno 1104.6) nakon prečiščavanja preparativnom HPLC.
[0192] Jedinjenje (III-4). Jedinjenje 49 (80 mg, 0.072 mmol), komercijalno dostupno jedinjenje 21a (Aldrich, 26.6 mg, 0.087 mmol) i DIPEA (38.0 µl, 0.217 mmol) su rastvoreni u 2 mL DMF. Nakon što je reakciji dozvoljeno da se nastavi preko noći, smeša je evaporisana i ostatak je prečičćen preparativnom HPLC da bi se dobio glavni izomer (15 mg, 16% prinos, 1/2[M+2]<2+>, izračunato 649.3, pronađeno 649.5) i manji izomer (3.7 mg, 4% prinos, 1/2[M+2]<2+>, izračunato 649.3, pronađeno 649.5)). Glavni izomer je eksperimentalno označen kao (III-4), koji ima prirodnu stereohemiju tubulisina na alfa-metilu Tup podjedinice i manji izomer je označen kao jedinjenje (III-5), koji tamo ima obrnutu stereohemiju.
Primer 5 - Jedinjenja (I-5), (I-6), i (I-7)
[0193] Mali deo lepljivog ulja koje je opisano iznad iz tretiranja jedinjenja 46a i 46b sa HCl nije kuplovan za jedinjenje 18a ali je umesto toga rastvoren u smešu THF, MeOH i vode (1:1:1). pH reakcione smeše je podešen na 14. Nakon dozvoljavanja da se reakcija nastavi preko noći, polovina reakcione smeše je evaporisana i prečišćena preparativnom hromatografijom da se dobiju jedinjenja (I-5) (1 m;, M+1, 876.6), (I-6) (1 mg; M+1, 862.5) i (I-7) (1 mg; M+1, 848.5).
Primer 6 - Jedinjenje (I-1)
[0194] Shema za sintezu jedinjenja (I-1) je prikazana na slici 7.
[0195] Jedinjenje 51. HCl (6 N, 0.2 mL) je dodat rastvoru jedinjenja 50 (Cheng et al. 2011; 50 mg, 0.198 mmol) i 2,2-dimetoksipropana (0.244 mL, 1.982 mmol) u MeOH (1 mL). Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi preko noći, rastvarač je evaporisan da se dobije 52.8 mg jedinjenja 51. MS: (+) m/z 267.2 (M+1).
[0196] Jedinjenje 52. Smeša jedinjenja 51 (52.8 mg, 0.198 mmol) i paladijuma na ugljeniku (10 mas%, 8 mg) u MeOH (1 mL) je mešana pod H2atmosferom preko noći. Katalizator je zatim isfiltriran i rastvarač je evaporisan da se dobije 46.9 mg jedinjenja 52. MS: (+) m/z 237.3 (M+1).
[0197] Jedinjenje (I-1). Smeša pentafluorofenola (2.493 mg, 0.014 mmol), 1,3-dicikloheksilkarbodiimida (2.049 mg, 9.93 µmol), i jedinjenja 9 (5 mg, 9.03 µmol) u DCM (0.5 mL) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvarač je zatim evaporisan.
[0198] Rastvoru rezultujućeg ostatka (6.50 mg, 9.03 µmol) i jedinjenja 52 (4.27 mg, 18.06 µmol) u DMF (0.2 mL) je dodat DIEA (1 kap). Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 10 min, reakcija je kvenčovana dodavanjem 1:1 smeše acetonitrila i vode koja sadrži 0.1% TFA (4 mL). Prečišćavanjem preparativnom HPLC dobija se 2.5 mg jedinjenja (I-1) kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 772.5 (M+1).
Primer 6 - Jedinjenje (I-4)
[0199] Sl.8 prikazuje shemu za sintezu jedinjenja (I-4).
[0200] DIEA je dodat rastvoru jedinjenja 9 (10.69 mg, 0.019 mmol) i HATU (7.34 mg, 0.019 mmol) u DMF (0.3 mL), podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 10 min, jedinjenje 53 (4 mg, 0.019 mmol; pripremljen u skladu sa Sani et al. 2007) u DMF (0.5 mL) i DIEA su dodati, podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 20 min, reakcija je kvenčovana dodavanjem 1:1 smeše acetonitrila i vode koja sadrži 0.1% TFA (4 mL). Prečišćavanje preparativnom HPLC daje 12.5 mg jedinjenja (I-4) kao belu čvrstu supstancu. MS: (+) m/z 743.4 (M+1).
Primer 7 - Tiokarbamati
[0201] Jedinjenja u skladu sa formulom (I) u kojoj W je S (to jest, tiokarbamati) mogu da budu napravljena tretiranjem odgovarajućeg prekursora kao što je jedinjenje 6 (sl. 1) sa natrijum hidridom i zatim tioizocijanat, kao što je prikazano ispod:
Primer 8 - Jedinjenje (III-6)
[0202] Shema za sintezu jedinjenja 56 je prikazana na slikama 9a i 9b.
[0203] Jedinjenje 56. 1,3-Dicikloheksilkarbodiimid (DCC, 0.160 g, 0.778 mmol) je dodat rastvoru terc-butil 1-amino-3,6,9,12-tet 5-oat 54 (Quanta Biosciences, 0.25 g, 0.778 mmol) i 2-(((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-oksi)sirćetna kiselina 55 (Chem-Impex, 0.244 g, 0.778 mmol) u DCM (5 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi preko noći, precipitat je isfiltriran. Filtrat je zatim koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-10% metanola u DCM da se dobije 0.30 g jedinjenja 56 kao bezbojno ulje. MS: (+) m/z 617.4 (M+1).
[0204] Jedinjenje 57. Rastvor jedinjenja 56 (0.303 g, 0.491 mmol) u TFA (2 mL, 0.662 mmol) je mešan na sobnoj temperaturi 2 sata. Nakon što je rastvor koncentrovan, ostatak je ispran heksanima da se dobije 0.28 g jedinjenja 57. MS: (+) m/z 561.3 (M+1).
[0205] Jedinjenje 58. DCC (0.199 g, 0.963 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 57 (0.27 g, 0.482 mmol) i 1-hidroksipirolidin-2,5-dion (takođe poznat kao N-hidroksisukcinimid ili NHS, 0.111 g, 0.963 mmol) u DCM (5 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi preko noći, čvrsta supstanca je isfiltrirana. Filtrat je zatim koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-100% etil acetata u heksanima da se dobije 0.12 g jedinjenja 58 kao bezbojno ulje. MS: (+) m/z 658.3 (M+1).
[0206] Jedinjenje 59. DIEA (2 kapi) je dodat rastvoru jedinjenja 58 (0.12 g, 0.182 mmol) i jedinjenja 21 (0.106 g, 0.182 mmol) u DMF (2 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, reakcija je kvenčovana dodavanjem smeše acetonitrila i vode koja sadrži 0.1% TFA. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 0.12 g jedinjenja 59 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 1121.6 (M+1).
[0207] Jedinjenje 60. TFA (0.5 mL) je dodat rastvoru jedinjenja 59 (20 mg, 0.018 mmol) u DCM (1 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 20 min, rastvor je koncentrovan da se dobije 18.2 mg jedinjenja 60. MS: (+) m/z 1021.6 (M+1).
[0208] Jedinjenje 61. DIEA je dodat rastvoru jedinjenja 9 (9.87 mg, 0.018 mmol) i HATU (6.78 mg, 0.018 mmol) u DMF (0.4 mL). pH reakcione smeše je podešen na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 10 min, jedinjenje 60 (18.2 mg, 0.018 mmol) u DMF (1 mL) i DIEA su dodati. pH reakcione smeše je podešen na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 10 min, reakcija je kvenčovana dodavanjem 10 mL 1:1 (v/v) smeše vode koja sadrži 01 % TFA i acetonitrila. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 25 mg jedinjenja 61 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 779.0 (M/2+1).
[0209] Jedinjenje (III-6). Jedna kap piperidina je dodata rastvoru jedinjenja 61 (25 mg, 0.016 mmol) u DMF (1 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, reakcija je kvenčovana dodavanjem smeše acetonitrila i vode koja sadrži 0.1% TFA. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 20 mg jedinjenja (III-6) kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 668.0 (M/2+1). Jedinjenje (III-6) ima hidroksilamin grupu, koja može da bude korišćena za konjugaciju formiranjem oksima, na primer sa keton grupom ostatka p-acetilfenialanina koji je uveden u protein, kao što je razmatrano iznad.
[0210] Konjugat jedinjenja (III-6) i anti-mezotelinsko antitelo modifikovano da sadrži ostatak p-acetilfenilalanina ispoljili su EC50od 0.14 za N87 kancerske ćelije želuca, korišćenjem testa inkorporacije<3>H timidina.
[0211] U jednom rešenju, ovaj predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat jedinjenja (III-6) i anti-mezotelinsko antitelo koje je modifikovano da sadrži keton grupu. Poželjno, modifikacija je pomoću inkorporacije ostatka p-acetilfenilalanina u polipeptidni lanac antitela. Takođe, poželjno, antitelo tako modifikovano je 6A4.
Primer 9 – Intermedijer jedinjenja 69
[0212] Sl. 10 prikazuje shemu za sintezu jedinjenja 69, koje može da bude korišćeno kao intermedijer za jedinjenja ovog predmetnog pronalaska.
[0213] Jedinjenje 63. Jedinjenje 62 (Chem-Impex, 5 g, 23.8 mmol) je dodato u rastvor SOCl2 (3.47 mL, 47.6 mmol) u 20 mL MeOH na 5 °C. Nakon dozvoljavanja da se reakcija nastavi preko noći, reakciona smeša je zagrevana pola sata na 45 °C. Isparljivi materijali su evaporisani i ostatak je rastvoren u 20 mL DCM. Boc2O (7.8 g, 35.7 mmol) je dodat. Et3N je korišćen da se prilagodi pH rastvora na 9 (testiran sa navlaženim pH papirom). Posle nekoliko sati je stavljen u EtOAc. EtOAc rastvor je ispran sa 10% rastvorom limunske kiseline, zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3 i slanim rastvorom. Organska faza je osušena, odvojena i evaporisana. Krajnji ostatak iz evaporacije osušene organske faze je propušten kroz kolonu da bi se dobilo jedinjenje 63 (5 g, 65% prinos, [M+1-Boc]<+>, izračunato 225.1, nađeno 225.2).
[0214] Jedinjenje 65. U 20 mL DCM rastvora jedinjenja 63 (2 g, 6.2 mmol) je dodat DIBAL-H (12.4 mL, 12.4 mmol, 1M u DCM) pola sata, MeOH je korišćen za kvenčovanje reakcije. HCl je korišćena za podešavanje pH rastvora na oko 2. Smeša je stavljena u EtOAc, što je isprano sa 10% sirćetnom kiselinom, slanim rastvorom, osušeno, izdvojeno i evaporisano. Ostatak je rastvoren u 30 mL DCM. Jedinjenje 64 (2.4g, 6.2 mmol, US 4,894,386) je dodato na 0 °C. Smeša je evaporisana posle 1 sata na sobnoj temperaturi, ostatak je propušten kroz kolonu da bi se dobilo jedinjenje 65 (2 g, 79% prinos, [M+1-Boc]<+>, izračunato 307.2, nađeno 307.1).
[0215] Jedinjenje 66. Jedinjenje 65 (600 mg, 1.48 mmol) je rastvoreno u 75 mL EtOAc na sobnoj temperaturi. Rastvor je prebačen u sud napunjen sa N2 i Pd/C (600 mg, 10%). Boca je ispražnjena i ponovo napunjena sa H2; Ciklus je ponovljen tri puta. Posle 1 sata rastvor je filtriran i evaporisan da se dobije jedinjenje 66 (560 mg, 100% prinos, [M+1]<+>, izračunato 379.3, nađeno 379.3) kao smeša epimera. Ova smeša nije odvojena sve do kasnije.
[0216] Jedinjenje 67. Jedinjenje 66 (1.30 g, 3.43 mmol), Fmoc-zaštićen citrulin 18a (1.6 g, 4.12 mmol) i 2-etoksi-1-etoksikarbonil-1,2-dihidrohinolin (EEDQ, 1.06 g, 4.3 mmol) su rastvoreni u smeši DCM i MeOH (22 mL, 10:1). Nakon dozvoljavanja da se reakcija nastavi preko noći, smeša je evaporisana i ostatak je propušten kroz kolonu (MeOH:DCM, 0-5% gradient) da se dobije jedinjenje 67 ([M+1]<+>, 7 izračunato 758.4, pronađeno 758.4) kao smeša epimera (≈4:1 od HPLC analize). Korišćeno je za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
[0217] Jedinjenje 68α. Smeša jedinjenja 67 iz prethodne reakcije je rastvorena u 10 mL DMF (sa 5% piperidinom) na sobnoj temperaturi. Posle 30 min, smeša je evaporisana i osušena sa visoko vakumskom pumpom preko noći. Ostatak je izmešan sa jedinjenjem 48 (1.5 g, 3.45 mmol) u 5 mL DMF. Et3N je korišćen da se prilagodi pH rastvora na 12. Nakon što je 1 sat reakciona smeša ubačena u EtOAc, što je isprano sa 10% limunske kiseline, zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i slanim rastvorom. Organska faza je osušena, filtrirana i evaporisana do suva. Ostatak je nezaštićen sa 5% piperidina u DMF na isti način kao deprotekcija jedinjenja 67. Amin dobijen u ovom koraku i jedinjenje 21a (1 g, 3.27 mmol) su mešani u 10 mL DMF. Et3N je korišćen da se prilagodi pH rastvora na 12 na sobnoj temperaturi. Nakon dozvoljavanja da se reakcija nastavi preko noći, smeša je ubačena u EtOAc, što je isprano sa 10% limunske kiseline, zasićenim vodenim NaHCO3 i slanim rastvorom. Organska faza je osušena, filtrirana i evaporisana da se dobije ostatak. Ostatak je prošao kroz regularnu silika kolonu da se dobije smeša jedinjenja 68a i 68b (1g, 35% prinos jedinjenja 66, [M+1]<+>, izračunato 828.5, pronađeno 828.5). Nakon razdvajanja na preparativnoj HPLC koloni, dobijeno je 600 mg glavnog epimera (struktura eksperimentalno određena kao jedinjenje 68a, sa jedinjenjem 68b koji je određen kao jedan manji).
[0218] Jedinjenje 69. Jedinjenje 68a (600 mg, 0.72 mmol) je rastvoreno u 5 mL smeše DCM i TFA (1:1). Posle 2 sata, reakciona smeša je evaporisana da se dobije jedinjenje 69 (kvantitativni prinos, [M+1], izračunato 672.4, pronađeno 672.4).
Primer 10-Intermedijara jedinjenja 75
[0219] Sl. 11 prikazuje shemu za sintezu intermedijara jedinjenja 75, koji može da bude korišćen za sintezu jedinjenja ovog predmetnog pronalaska.
[0220] Jedinjenje 71. Jedinjenje 70 (Cheng et al. 2011, 25 mg, 0.044 mmol), N,N'-diizopropilkarbodiimid (DIC, 0.014 mL, 0.088 mmol), 4-(dimetilamino)piridin (DMAP, 10.78 mg, 0.088 mmol) i MeOH (0.036 mL, 0.882 mmol) su mešani na sobnoj temperaturi. Posle jednog sata, reakciona smeša je evaporisana i prošla je kroz kolonu da se dobije jedinjenje 71 (10 mg, 39% prinos, M+1, 581.4).
[0221] Jedinjenje 72. Jedinjenje 71 (122 mg, 0.210 mmol, iz druge sintetičke serije) je rastvoreno u MeOH (2 mL) na 5 °C. NaOMe (0.441 mL, 0.221 mmol) je dodat. Posle 0.5 sata smeša je neutralizovana sa HCl (4M u dioksanu) i evaporisana da se dobije jedinjenje 72 (m+1, 539.4), koje je korišćeno za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
[0222] Jedinjenje 73. Jedinjenje 72 (60 mg, 0.111 mmol) je rastvoreno u DCM (1.5 mL) na 5 °C. Piridin (0.045 mL, 0.557 mmol). 4-Nitrofenilkarbonhloridat 72a (67.3 mg, 0.334 mmol, Aldrich) u 0.5 mL DCM je polako dodat. Nakon dozvoljavanja da se reakcija nastavi preko noći, smeša je evaporisana i prečišćena pomoću hromatografije na koloni da se dobije jedinjenje 73 (42 mg, 0.060 mmol, 53.6 % prinos) (m+1, 704.4).
[0223] Jedinjenje 74. Jedinjenje 73 (42 mg, 0.060 mmol) je rastvoreno u DCM (1 mL) na 5 °C. Metilamin (1.853 mg, 0.060 mmol) je dodat. Posle 0.5 h smeša je evaporisana i ostatak je prošao kroz hromatografsku kolonu (MeOH:DCM, 0-15% gradijenta, proizvod se eluira na 7-10%) da se dobije jedinjenje 74 (35 mg, 0.059 mmol, 98 % prinos) (m+1, 596.4).
[0224] Jedinjenje 75. Jedinjenje 74 (93 mg, 0.156 mmol) je rastvoreno u THF (1 mL) na 5 °C. LiOH (7.47 mg, 0.94 mmol) u 0.34 mL vode je dodat. Nakon što je reakcija završena, reakciona smeša je neutralizovana sa HCl (4M u dioksanu) i osušena u visokom vakumu da se dobije jedinjenje 75 (m+1, 582.3), koje je korišćeno za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
Primer 11 - Jedinjenja (III-7) i (III-8)
[0225] Sl.12 prikazuje šeme za sintezu jedinjenja (III-7) i (III-8).
[0226] Jedinjenje (III-7'). Jedinjenje 75 (11 mg, 0.019 mmol) je aktivirano u DMF (0.5 mL) sa HATU (6.83 mg, 0.018 mmol) i DIEA (14.86 µl, 0.085 mmol). Jedinjenje 69 (15.24 mg, 0.023 mmol) je zatim dodato. Nakon što je 10 min reakciona smeša ubačena u DMSO i prečišćena preparativnom hromatografijom da se dobije jedinjenje (III-7) (12 mg, 9.71 µmol, 51.4 % prinos) (m+1, 1235.7).
[0227] Jedinjenje (III-8). Jedinjenje 75 (10 mg, 0.017 mmol) je aktivirano u DMF (0.5 mL) sa HATU (6.21 mg, 0.016 mmol) i DIEA (0.014 mL, 0.077 mmol). Jedinjenje 23 (13.86 mg, 0.021 mmol) je zatim dodato. Nakon što je 10 min reakciona smeša ubačena u DMSO i prečišćena preparativnom hromatografijom da se dobije jedinjenje (III-8) (13 mg, 10.52 µmol, 61.2 % prinos) (m+1, 1235.7).
Primer 12 - Jedinjenja (I-8) i (I-9)
[0228] U principu, jedinjenja (I-8) i (I-9) mogu da se dobiju tretiranjem jedinjenja (III-7) i (III-8), redom, sa proteazom katepsin B, za koju dipeptid Val-Cit predstavlja supstratni motiv. Jedinjenje (III-7), sa svojom orto-amino grupom, može da bude izloženo većem broju prostornih prepreka protiv cepanja.
Primer 13 – Biološka aktivnost jedinjenja
[0229] Slike 13a i 13b pokazuju biološku aktivnost jedinjenja (I-4) i (I-2) ovog predmetnog pronalaska za kancer pluća H226 i 786-O bubrežne kancerske ćelije, redom, korišćenjem testa ATP luminescencije. Kao kontrole, doksorubicin i tubulisinski analog jedinjenja A, koji sadrži acetatnu grupu umesto karbamatne grupe u Tuv podjedinici, su korišćeni. Jedinjenje A može da bude pripremljeno u skladu sa upustvima Cheng et al.2011.
[0230] Za ćelije H226, EC50 vrednosti su: doksorubicin, 115.4 nM; jedinjenje A, 2.4 nM; i jedinjenje (I-4), 12.1 nM. Za 786-O ćelije, EC50vrednosti su: doksorubicin, 68.9 nM; jedinjenje A, 1.2 nM, i jedinjenje (I-4), 7.1 nM.
[0231] Slike 13c i 13d predstavljaju sličnu vrstu podataka za jedinjenja (I-5), (I-6), i (I-7). Jedinjenja koja su se upoređivala su doksorubicin i tubulisin D. EC50vrednosti za ćelije H226 su: doksorubicin, 115.4 nM; tubulisin D, 0.05 nM; jedinjenje (I-5), 19.5 nM; jedinjenje (I-6), 9.9 nM; i jedinjenje (I-7), 15.4 nM. Za 786-O ćelije, vrednosti su EC50: doksorubicin, 68.9 nM; tubulisin D, 0.02 nM; jedinjenje (I-5), 22.9 nM; jedinjenje (I-6), 22.8 nM; i jedinjenje (I-7), 12.5 nM.
[0232] Kancerske ćelijske linije su dobijene iz American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA, i kultivisane su u skladu sa ATCC instrukcijama. Ćelije su zasađene u količini od 1.0 x 10<3>ćelija po bunariću u ploči sa 96 bunarića tokom 3 sata za ATP testove. Serijska razblaženja 1:3 jedinjenja su dodata u bunariće. Pločama je dozvoljeno da se inkubiraju tokom 24 do 72 sata. ATP nivoi u ATP pločama su izmereni korišćenjem kita za merenje ćelijske vijabilnosti luminescencijom CELLTITER-GO<®>praćenjem uputstva proizvođača i čitanjem na GLOMAX<®>20/20 luminometru (oba su iz Promega, Madison,WI, USA). EC50 vrednosti – koncentracija pri kojoj agens inhibira ili smanjuje ćelijsku proliferaciju do 50% - su određene korišćenjem RISM™ softvera, verzija 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).
Primer 14 - In Vitro aktivnost konjugata
[0233] Slika 14 prikazuje in vitro aktivnost konjugata (II-1), za kancerske ćelije želuca N87 (American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA).
[0234] Ćelije su zasađene u količini od 1.0 x 10<4>ćelija po bunariću u ploči sa 96 bunarića tokom 3 sata za<3>H timidin testove, redom. Serijska razblaživanja (1:3) konjugata (II-1) su dodata u bunariće. Pločama je dozvoljeno da se inkubiraju tokom 120 sata. Ploče su pulsirane sa 1.0 µCi od<3>H-timidina po bunariću za poslednjih 24 sata totalnog perioda inkubacije, prikupljene, i pročitane na Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments, Meriden, CT). Vrednost EC50 – koncentracija pri kojoj agens inhibira ili smanjuje ćelijsku proliferaciju do 50% maksimalne inhibicije – je određena korišćenjem PRISM™ softvera, verzija 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) da bude 0.2 nM
[0235] Upoređivanje EC50 vrednosti od slika 13a-13d i slike 14 ilustruje dve cilja. Prvi je poboljšanje potencije koja je povezana sa ciljanom isporukom citotoksina putem konjugata i zatim aktivni mehanizam internalizacije aktiviran vezivanjem komponente antitela konjugata za njegov antigen (Schrama et al. 2006). Drugo, nekonjugovani toksini su relativno polarna jedinjenja i, u odsustvu aktivnog mehanizma internalizacije, imaju teškoću difuziranja kroz ćelijsku membranu, što rezultuje većim (niža potentnost) izmerenim EC50vrednostima.
Primer 15 - In Vivo aktivnost konjugata
[0236] U ovom primeru, in vivo aktivnost konjugata (II-1) je upoređena sa onom kod konjugata B (Cheng et al. 2011), koji je strukturno identičan konjugatu (II-1), osim što ima acetat u Tuv podjedinici umesto karbamata:
[0237] Pet miliona OVCAR3 kancerskih ćelija jajnika, ponovo supsendovanih u 0.1 mL fosfatom puferovan fiziološki rastvor ("PBS") plus 0.1 mL matrigela, je implantirano subkutano u region slabine SCID miševa. Merenja tumora počinju 28 dana kasnije, i miševi su randomizovani u grupe od 7 miševa svaki sa tumorom prosečne veličine od 60 mm<3>koja su procenjena pomoću LWH/2 tumora. 29 dana posle implantacije tumora, miševima su intraperitonealno pojedinačno dozirana testirana jedinjenja. Slika 15 pokazuje da, za ksenografte OVCAR3, konjugat (II-1) sprečava rast tumora efikasnije od konjugata B. Razlika je posebno primetna posle 20 dana.
[0238] Slike 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, i 20 predstavljaju dodatne in vivo podatke o efikasnosti za konjugate ovog predmetnog pronalaska, generisane po protokolu koji je opisan iznad, mutatis mutandis.
[0239] Slika 16a pokazuje podatke za OVCAR3 (kancer jajnika) zapreminu tumora u odnosu na vreme za seriju konjugata jedinjenja (III-1) sa anti-CD70 antitelom 1F4 ili antimezotelinskim antitelom 6A4. Legenda obezbeđuje, po redu, DAR (na primer, "2.7") i doziranje u µmol/kg (na primer, "0.1"). U svakom slučaju način administracije bio je intraperitonealan, u pojedinačnoj dozi (SD), osim za poslednji set podataka (◆), za koji je konjugat bio administriran Q7Dx3. Slika 16b prikazuje promenu telesne mase za isti eksperiment.
[0240] Priprema i karakterizacija humanog monoklonskog antitela 6A4 je opisana u Terrett et al. 2012, predmetna objava koja je inkorporirana ovde pomoću reference. VH CDR1, CDR2, i CDR3 i VK CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence za antitelo 6A4 su date u SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, i SEQ ID NO:6, redom. VHi VKsekvence varijabilnog regiona antitela 6A4 su obezbeđene u SEQ ID NO:7 i SEQ ID NO:8, redom.
[0241] Priprema i karakterizacija humanog monoklonskog antitela 1F4 je opisana u Coccia et al. 2010, predmetna objava koja je inkorporirana ovde pomoću reference. VHCDR1, CDR2, i CDR3 i VK CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence za antitelo 1F4 su date u SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, i SEQ ID NO:14, redom. VH i VK sekvence varijabilnog regiona antitela 1F4 su obezbeđene u SEQ ID NO:15 i SEQ ID NO:16, redom.
[0242] Slike 17a i 17b predstavljaju rezultate za sličan eksperiment, ali sa konjugatima jedinjenja (III-8) i anti-mezotelinskog antitela 6A4. U svakom slučaju, pojedinična doza je administrirana intraperitonealno.
[0243] Efikasnost konjugata jedinjenja (III-1) i anti-mezotelinskog antitela 6A4 za H226 (kancer pluća) tumora je predstavljena na slikama 18a i 18b, sa DAR i informacije doziranja pronađene ponovo u legendama. U svakom slučaju konjugat je administriran intraperitonealno u pojedinačnoj dozi.
[0244] Slike 19a i 19b predstavljaju H226 podatke za konjugat jedinjenja (III-8) i antimezotelinsko antitelo 6A4. U prvom setu podataka (●) administracija je bila pojedinačna doza, dok za poslednja dva seta podataka (▼ i ◆) režim administriranja je bio Q7Dx3.
[0245] Slika 20 prikazuje podatke o efikasnosti za konjugate jedinjenja (III-1) sa antimezotelinskim antitelom 6A4 ili anti-CD70 antitelom 1F4 za N87 tumore želudačnog kancera.
[0246] Antitela, posebno kada su korišćena u konjugatima, mogu da imaju ili prirodni konstantni region ili projektovani (modifikovani), dizajniran da smanji ili eliminiše funkcije efektora kao što je ADCC. Primeri takvih modifikovanih konstantnih regiona antitela su obezbeđeni pomoću polipeptida SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:26. SEQ ID NO:25 je konstantni region IgG4 izotopa koji je modifikovan sa određenim supstitucijama amino kiselina. SEQ ID NO:26 je konstantni region hibridnog IgG1/IgG4. U obe SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:26 prisustvo C-terminalnog lizina je opciono.
Primer 16 – Studije stabilnosti
[0247] U ovom primeru, stabilnost mišjeg seruma konjugata (II-1) i konjugata B, sa njihovom odgovarajućom karbamatnom i acetatnom grupom, su upoređeni.
[0248] Konjugat je ubrizgan kod miša u dozi od 0.1 µmol/kg. U slučaju konjugata (II-1) koncentracija administracije je bila 3.4 mg/mL i konjugat je imao odnos supstitucije (SR) od 4.2. U slučaju konjugata B koncentracija administracije je bila 1.2 mg/mL i SR je bila 2.3. Približno 100 uL od seruma od svake 3 životinje u svakom trenutku je uzeto za analizu.
[0249] Uzorci seruma iz različitih životinja bili su udruženi, dajući 200-300 uL u svakom trenutku. Objedinjena zapremina je centrifugirana da se uklone čvrste supstance i supernatant je korišćen za analizu. Konjugat je izolovan iz seruma pomoću imuno-afinitetnog hvatanja korišćenjem anti-idiotipičnog monoklonskog antitela koje je kuplovano sa SEPHAROSE™ perlama. Nakon hvatanja, konjugat je eluiran izlaganjem niskoj pH što je praćeno neutralizacijom sa Tris bazom. Citotoksin koji je prisutan na konjugatu je oslobođen dodavanjem aktiviranog katepsina B kako bi se sjedinio Cit-Val peptidni veznik. Digestija katepsina B je urađena na 37 °C tokom 3 sata, što je praćeno dodavanjem 1 zapremine hladnog metanola. Citotoksin ekstrahovan sa rastvorom je analiziran pomoću LC-MS korišćenjem ESI-TOF MS u skladu sa UPLC sa hromatografijom sa reverznom fazom (Acquity HSS T32.1 X 50mm).
[0250] Za konjugat (II-1), prisustvo hidroksilnog jedinjenja iz hidrolize karbamatne grupe nije prepoznato u bilo kom trenutku, kroz vremenske tačke do 240 sata. Jedino je jedinjenje karbamata pronađeno.
[0251] Obrnuto, za konjugat B, proizvod hidrolize se može prepoznati posle 6 sati i oko 50 procenata hidrolize se dogodilo do 72 sata. Tabela 2 ispod prikazuje relativne količine acetatnih i hidroksilnih jedinjenja, koja su bazirana na intenzitetima masenog spektra za odgovarajuće dvostruko naelektrisane jon (M[H<2+>] 3722 Da i 351.2 Da):
[0252] Ovi rezultati pokazuju da zamena acetatne grupe na neko vreme u Tuv podjedinici vodi do mnogo stabilnijeg jedinjenja, koje međutim dalje zadržava značajnu biološku aktivnost.
Primer 17 - Jedinjenja 72a, 72b, i 72c
[0253] Ovaj primer opisuje pripremu i svojstva jedinjenja ovog predmetnog pronalaska koja imaju strukturne varijacije u karbamatnoj grupi. Pozivamo se na Sl.21 za shemu sinteze.
[0254] Jedinjenje 70a. Amonijak u MeOH (2M, 0.089 mL, 0.178 mmol) je dodat jedinjenju 7 (0.1 g, 0.148 mmol) u MeOH (2 mL). Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 20 min, LCMS je pokazala da reakcija nije kompletna. Rastvarač je evaporisan.
Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-15% MeOH u DCM da se dobije 55 mg jedinjenja 70a kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 554.3 (M+1).
[0255] Jedinjenje 71a LiOH (4.41 mg, 0.184 mmol) u vodi (0.5 mL) je dodat rastvoru jedinjenja 70a (51 mg, 0.092 mmol) u THF (1 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 2 sata, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-30% MeOH u DCM da se dobije 47 mg jedinjenja 71a kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 540.3 (M+1).
[0256] Jedinjenje 72a. DIEA (6.45 µL, 0.037 mmol) je dodato rastvoru jedinjenja 71a (20 mg, 0.037 mmol) i HATU (14.09 mg, 0.037 mmol) u DMF (0.5 mL). pH reakcione smeše je podešena na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 20 min, jedinjenje 23 (24.9 mg, 0.037 mmol) u DMF (1 mL) i DIEA (6.45 µL, 0.037 mmol) su dodati. pH reakcionog rastvora je podešena na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi sledećih 20 min, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Reakcija je kvenčovana dodavanjem 10 mL 1:1 (v/v) smeše vode koja sadrži 0.1 % TFA i acetonitrila koji sadrži 0.1 % TFA. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 35.2 mg jedinjenja 72a kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 1193.6 (M+1). Jedinjenje 72a je takođe ovde označeno iznad kao jedinjenje (III-9).
[0257] Konjugat jedinjenja 72a i anti-CD70 antitelo 1F4 imaju EC50 od 0.19 nM za 786-O bubrežne kancerske ćelije. Konjugat jedinjenja 72a i antitelo anti-mezotelina 6A4 imaju EC50 0.16 nM za N87 kancerske ćelije želuca. U oba slučaja, test inkorporacije<3>H-timidina je korišćen.
[0258] Jedinjenje 70b. Rastvor jedinjenja 7 (0.1 g, 0.148 mmol) i anilina (0.041 mL, 0.444 mmol) u DMF (1.8 mL) je zagrejan na 50 °C preko noći. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-15% MeOH u DCM da se dobije 58 mg jedinjenja 5 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 630.4 (M+1).
[0259] Jedinjenje 71b. LiOH (4.03 mg, 0.168 mmol) u vodi (0.5 mL) je dodat rastvoru jedinjenja 70b (53 mg, 0.084 mmol) u THF (1 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 2 sata, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-30% MeOH u DCM da se dobije 43 mg jedinjenja 71b kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 616.3 (M+1).
[0260] Jedinjenje 72b. DIEA(5.66 µL, 0.032 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 71b (20 mg, 0.032 mmol) i HATU (12.35 mg, 0.032 mmol) u DMF (0.5 mL). pH reakcione smeše je podešena na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 20 min, jedinjenje 23 (21.82 mg, 0.032 mmol) u DMF (1 mL) i DIEA (5.66 µL, 0.032 mmol) su dodati. pH reakcionog rastvora je podešena na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi sledećih 20 min, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Reakcija je kvenčovana dodavanjem 10 mL 1:1 (v/v) smeši vode koja sadrži 0.1 % TFA i acetonitrila koji sadrži 0.1 % TFA. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 35 mg jedinjenja 72b kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 1269.7 (M+1). Jedinjenje 72b je takođe ovde označeno iznad kao jedinjenje (III-10).
[0261] Konjugat jedinjenja 72b i anti-CD70 antitelo 1F4 imaju EC50od 0.58 nM za 786-O bubrežne kancerske ćelije. Konjugat jedinjenja 72b i anti-mezotelinsko antitelo 6A4 imaju EC50od 0.47 za N87 kancerske ćelije želuca. U oba slučaja test inkorporacije<3>H timidina je korišćen.
[0262] Jedinjenje 70c. Dimetilamin u DMF (1 mL, 0.148 mmol) je dodat u kapima rastvoru jedinjenja 7 (0.1 g, 0.148 mmol) u DMF (1 mL) na sobnoj temperaturi, dok reakcija ne bude kompletna. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-15% MeOH u DCM da se dobije 56 mg jedinjenja 70c kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 582.3 (M+1).
[0263] Jedinjenje 71c. LiOH (8.23 mg, 0.344 mmol) u vodi (0.5 mL) je dodat rastvoru jedinjenja 70c (0.1 g, 0.172 mmol) u THF (1 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 2 sata, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-30% MeOH u DCM da se dobije 50.8 mg jedinjenja 71c kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 568.3 (M+1).
[0264] Jedinjenje 72c. DIEA (6.14 µL, 0.035 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 71c (20 mg, 0.035 mmol) i HATU (13.39 mg, 0.035 mmol) u DMF (0.5 mL). pH reakcione smeše je podešena na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 20 min, jedinjenje 23 (23.67 mg, 0.035 mmol) u DMF (1 mL) i DIEA (6.14 µL, 0.035 mmol) su dodati. pH reakcionog rastvora je podešena na 89 Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi sledećih 20 min, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Reakcija je kvenčovana dodavanjem 10 mL 1:1 (v/v) smeše vode koja sadrži 0.1 % TFA i acetonitrila koja sadrži 0.1 % TFA. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 23.8 mg jedinjenja 72c kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 1221.6 (M+1). Jedinjenje 72c je takođe ovde označeno iznad kao jedinjenje (III-11).
[0265] Konjugat jedinjenja 72c i anti-CD70 antitelo 1F4 imali su EC50 od 0.32 nM za 786-O bubrežne kancerske ćelije. Konjugat jedinjenja 72c i anti-mezotelinsko antitelo 6A4 imali su EC50 od 0.34 nM za N87 kancerske ćelije želuca. U oba slučaja test inkorporacije<3>H timidina je korišćen.
Primer 18 - Jedinjenja 75a, 75b, i 75c
[0266] Ovaj primer opisuje pripremu analoga tubulisina iz prethodnog primera, ali bez pridruženih vezujućih grupa. Pozivamo se na Sl.22 za shemu sinteze.
[0267] Jedinjenje 73. LiOH (0.071 g, 2.97 mmol) u vodi (5 mL) je dodat rastvoru jedinjenja 18 (0.25 g, 0.743 mmol) u THF (5 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 2 sata, rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-20% MeOH u DCM da se dobije 0.22 g jedinjenja 73 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 223.3 (M+1-Boc).
[0268] Jedinjenje 74. Smeša jedinjenja 73 (0.2 g, 0.620 mmol) i 4N HCl u 1,4-dioksanu (4 mL, 0.620 mmol) je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Rastvarač je evaporisan. Bela čvrsta supstanca jedinjenja 74 je isprana heksanima dva puta. MS: (+) m/z 223.3 (M+1).
[0269] Jedinjenje 75a. DIEA (3.23 µL, 0.019 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 71a (10 mg, 0.019 mmol) i HATU (7.05 mg, 0.019 mmol) u DMF (0.5 mL), podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 20 min, DIEA (3.23 µL, 0.019 mmol) i jedinjenje 74 (5.35 mg, 0.024 mmol) u DMF (0.5 mL) su dodati, podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Reakcija je kvenčovana dodavanjem 10 mL 1:1 (v/v) smeše acetonitrila i vode koja sadrži 0.1 % TFA. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 6.0 mg jedinjenja 75a kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 744.4 (M+1). Jedinjenje 75a je takođe ovde označeno iznad kao jedinjenje (I-10).
[0270] Jedinjenje 75a je imalo EC50od 75.8 nM za N87 kancerske ćelije želuca, korišćenjem testa ATP luminescencije.
[0271] Jedinjenje 75b. DIEA (2.83 µL, 0.016 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 71b (10 mg, 0.016 mmol) i HATU (6.17 mg, 0.016 mmol) u DMF (0.5 mL), podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 20 min, DIEA (2.83 µL, 0.016 mmol) i jedinjenje 74 (4.69 mg, 0.021 mmol) u DMF (0.5 mL) su dodati, podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Reakcija je kvenčovana dodavanjem 10 mL 1:1 (v/v) smeše acetonitrila i vode koja sadrži 0.1 % TFA. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 7.6 mg jedinjenja 75b kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 820.4 (M+1). Jedinjenje 75b je takođe ovde označeno iznad kao jedinjenje (I-11).
[0272] Jedinjenje 75b je imalo EC50od 0.39 nM za N87 kancerske ćelije želuca, korišćenjem testa ATP luminescencije.
[0273] Jedinjenje 75c. DIEA (3.07 µL, 0.018 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 71c (10 mg, 0.018 mmol) i HATU (6.70 mg, 0.018 mmol) u DMF (0.5 mL), podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 20 min, DIEA (3.07 µL, 0.018 mmol) i jedinjenje 74 (5.09 mg, 0.023 mmol) u DMF (0.5 mL) su dodati, podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Reakcija je kvenčovana dodavanjem 10 mL 1:1 (v/v) smeše acetonitrila i vode koja sadrži 0.1 % TFA. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 7.6 mg jedinjenja 75c kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 772.5 (M+1). Jedinjenje 75c je takođe ovde označeno iznad kao jedinjenje (I-12).
[0274] Jedinjenje 75c je imalo EC50 od 5.4 nM za N87 kancerske ćelije želuca, korišćenjem testa ATP luminescencije.
Primer 19 - Jedinjenje 80
[0275] Ovaj primer opisuje sintezu jedinjenja 80 pogodnog za konjugaciju putem "klik" hemije, koje ima ciklooktin grupu koja može da reaguje sa azidnom grupom u partnerskom molekulu. Odgovarajuća shema sinteze je prikazana na Sl.23.
[0276] Jedinjenje 77. DCC (22.40 mg, 0.109 mmol) je dodat rastvoru DBCO-PEG4-kiseline 76 (50 mg, 0.090 mmol, kupljena od Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) i N-hidroksisukcinimida (NHS, 20.83 mg, 0.181 mmol) u DCM (1 mL) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Čvrsta supstanca je isfiltrirana, i filtrat je koncentrovan da se dobije jedinjenje 77. MS: (+) m/z 650.3 (M+1).
[0277] Jedinjenje 78. DIEA je dodat rastvoru jedinjenja 77 (58.8 mg, 0.091 mmol) i jedinjenja 21 (57.6 mg, 0.100 mmol) u DMF (1 mL) na sobnoj temperaturi, podešavajući pH na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 20 mg jedinjenja 78 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 1113.6 (M+1).
[0278] Jedinjenje 79. TFA (0.5 mL, 6.53 mmol) je dodat smeši jedinjenja 78 (17.2 mg, 0.015 mmol) u DCM (1 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Rastvarač je evaporisan da se dobije jedinjenje 79. MS: (+) m/z 1013.5 (M+1).
[0279] Jedinjenje 80. DIEA (2.96 µL, 0.017 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 9 (8.55 mg, 0.015 mmol) i HATU (5.87 mg, 0.015 mmol) u DMF (0.4 mL). pH reakcione smeše je podešena na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 20 min, jedinjenje 79 (15.65 mg, 0.015 mmol) u DMF (1 mL) i DIEA (2.96 µL, 0.017 mmol) su dodati. pH reakcione smeše je podešena na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi sledećih 20 min, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod se ponovo rastvara u 1 mL DMSO, i prečišćen je preparativnom HPLC da se dobije jedinjenje 80 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 775.0 (M/2+1). Jedinjenje 80 je takođe ovde označeno iznad kao jedinjenje (III-12).
[0280] Konjugat jedinjenja 80 i sedam varijanti anti-glipikan 3 antitela 4A6 modifikovanih da imaju azidnu grupu na različitim lokacijama ispoljavaju EC50's od 1.4, 0.17, 0.13, 0.22, 0.14, 0.064, i 0.25 nM za N87 kancerske ćelije želuca, korišćenjem testa inkorporacije<3>H timidina.
[0281] Priprema i karakterizacija antitela 4A6 je opisana u Terrette et al.2010, čije stavljanje na uvid javnosti je ovde uključeno kao referenca. Sekvence VH CDR1, CDR2, i CDR3 i VK CDR1, CDR2, i CDR3 za antitelo 4A6 su date u SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, i SEQ ID NO:22, redom. Varijabilni region sekvenci VH i VK su obezbeđeni u SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:24, redom.
[0282] U jednom rešenju, ovaj predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat jedinjenja 80 i polipeptid, poželjno antitelo, modifikovano da uključi azidnu grupu.
Primer 20 - Jedinjenje 88
[0283] Ovaj primer opisuje sintezu jedinjenja 88, koje ima funkcionalnost alkil primarnog amina koji može da bude korišćen za kon o primer sheme sinteze sa sl. 24.
[0284] Jedinjenje 82. Smeša terc-butil 1-amino-3,6,9,12-tetraoksapentadekan-15-oat 54 (0.285 g, 0.888 mmol, kupljen od VWR; videti takođe primer 8) i 2,5-diokso-pirolidin-1-il 6-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)heksanoata 81 (0.4 g, 0.888 mmol, kupljen od Chem-Impex) u DMF (3 mL) je mešana na sobnoj temperaturi 2 sata. Rastvarač je evaporisan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijentom od 0-10% MeOH u DCM da se dobije 0.4 g jedinjenja 82 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 657.4 (M+1).
[0285] Jedinjenje 83. Smeša jedinjenja 82 (0.258 g, 0.393 mmol) u TFA (2 mL, 0.393 mmol) je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Rastvarač je evaporisan. Jedinjenje 83 (bela čvrsta supstanca) je dva puta isprana heksanima i bez daljeg prečišćavanja.
[0286] Jedinjenje 84. DCC (0.162 g, 0.786 mmol) je dodat smeši jedinjenja 83 (0.236 g, 0.393 mmol) i NHS (0.090 g, 0.786 mmol) u DCM (5 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi preko noći, čvrsta supstanca je isfiltrirana, i filtrat je koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom eluiranjem na silika gelu sa gradijetom od 0-100% EtOAc u heksanima da se dobije 0.195 g jedinjenja 84 kao bezbojno ulje. MS: (+) m/z 698.3 (M+1).
[0287] Jedinjenje 85. DIEA je dodat rastvoru jedinjenja 21 (0.162 g, 0.279 mmol) i jedinjenja 84 (0.195 g, 0.279 mmol) u DMF (1.5 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, reakcija je kvenčovana dodavanjem 6 mL 1:1 smeše acetonitrila i vode koja sadrži 0.1% TFA. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 0.292 g jedinjenje 85 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 1161.6 (M+1).
[0288] Jedinjenje 86. TFA (0.5 mL) je dodat smeši jedinjenja 85 (22.1 mg, 0.019 mmol) u DCM (1 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 20 min, rastvarač je evaporisan da se dobije jedinjenje 86. MS: (+) m/z 1061.6 (M+1).
[0289] Jedinjenje 87. DIEA je dodat rastvoru jedinjenja 9 (10.53 mg, 0.019 mmol) HATU (7.23 mg, 0.019 mmol) u DMF (0.4 mL). pH reakcione smeše je podešena na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 10 min, jedinjenje 86 (20.19 mg, 0.019 mmol) u DMF (1 mL) i DIEA su dodati. pH reakcionog rastvora je podešena na 8-9. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 10 min, LCMS je pokazala da je reakcija gotova. Reakcija je kvenčovana dodavanjem 10 mL 1:1 (v/v) smeše vode (0.1 % TFA) i acetonitrila. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 27.3 mg jedinjenja 87 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 799.1 (M/2+1).
[0290] Jedinjenje 88. Piperidin je dodat rastvoru jedinjenja 87 (27.3mg, 0.017 mmol) u DMF (2 mL) na sobnoj temperaturi, podešavajući pH na 9-10. Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, reakcija je kvenčovana dodavanjem 6 mL 1:1 smeše acetonitrila i vode koja sadrži 0.1 % TFA. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC da se dobije 22.5 mg jedinjenja 88 kao bela čvrsta supstanca. MS: (+) m/z 688.1 (M/2+1). Jedinjenje 88 je takođe ovde označeno iznad kao jedinjenje (III-13).
[0291] U jednom rešenju, obezbeđen je konjugat u kojem je jedinjenje 88 konjugovano sa polipeptidom, koji je poželjno antitelo, amidnim formiranjem između alkil primarnog amina jedinjenja 88 i karboksilne grupe na bočnom lancu ostatka amino kiseline - poželjno glutaminske kiseline - u polipeptidu. Ovaj predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metod pravljenja takvog konjugata, koji sadrži kombinovanje jedinjenja 88 i polipeptida u prisustvu enzima transglutaminaze.
REFERENCE
[0292] Kompletna citiranja za reference koje su navedene u skraćenom obliku po prvom autoru (ili pronalazaču) i datumu ranije u ovoj specifikaciji su obezbeđena ispod.
Abe et al., WO 97/21712 (1997).
Boyd et al., US 2008/0279868 A1 (2008).
Boyd et al., US 7,691,962 B2 (2010).
Balasubramanian et al., Bioorg. Med. Chem. Lett.2008, 18, 2996-2999.
Balasubramanian et al., J. Med. Chem.2009, 52 (2), 238-240.
Chai et al., Chem. & Biol.2010, 17(3), 296-309.
Chai et al., US 2011/0245295 A1 (2011).
Cheng et al., US 2011/0027274 A1 (2011).
Coccia et al., US 2010/0150950 (2010)
Davis et al., US 2008/0176958 A1 (2008).
Domling, DE 102004 030 227 A1 (2006).
Domling et al., US 2005/0239713 A1 (2005) [2005a].
Domling et al., US 2005/0249740 A1 (2005) [2005b].
Domling et al., Mol. Diversity 2005, 9, 141-147 [2005c].
Domling et al., Ang. Chem. Int. Ed.2006, 45, 7235-7239.
Ellman et al., US 8,476,451 B2 (2013).
Hamel et al., Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents 2002, 2, 19-53. Hoefle et al., DE 10008 089 A1 (2001).
Hoefle et al., Pure Appl. Chem. 2003, 75 (2-3), 167-178.
Hoefle et al., US 2006/0128754 A1 (2006) [2006a].
Hoefle et al., US 2006/0217360 A1 (2006) [2006b].
Jackson et al., US 2013/0224228 A1 (2013).
Kaur et al., Biochem. J.2006, 396, 235-242.
Khalil et al., ChemBioChem 2006, 7, 678-683.
Leamon et al., Cancer Res.2008, 68 (23), 9839-9844.
Leamon et al., US 2010/0323973 A1 (2010).
Leung et al., US 2002/0169125 A1 (2002).
Low et al., US 2010/0324008 A1 (2010).
Lundquist et al., Org. Lett.2001, 3, 781-783.
Neri et al., ChemMedChem 2006, 1, 175-180.
Pando et al., J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 7692-7696.
Patterson et al., Chem. Eur. J.2007, 13, 9534-9541.
Patterson et al., J. Org. Chem. 2008, 73, 4362-4369.
Peltier et al., J. Am. Chem. Soc.2006, 128, 16018-16019.
Reddy et al., Mol. Pharmaceutics 2009, 6 (5), 1518-1525.
Reichenbach et al. WO 98/13375 A1 (1998).
Richter, US 2012/0129779 A1 (2012) [2012a]
Richter, US 2012/0252738 A1 (2012) [2012b].
Richter, US 2012/0252739 A1 (2012) [2012c].
Sani et al., Angew. Chem. Int. Ed.2007, 46, 3526-3529.
Sasse et al., J. Antibiotics 2000, 53 (9) 879885
Sasse et al., Nature Chem. Biol.2007, 3 (2), 87-89.
Schluep et al., Clin. Cancer Res.2009, 15 (1), 181-189.
Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc.2006, 5, 147-159.
Shankar et al., SYNLETT 2009, 8, 1341-1345.
Shankar et al., Org. Biomol. Chem., 2013, 11(14), 2273-2287.
Shibue et al., Tetrahedron Lett.2009, 50, 3845-3848.
Shibue et al., Chemistry Eur. J., 2010, 16(38), 11678-11688.
Shibue et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21, 431-434.
Sreejith et al., SYNLETT 2011, No.12, 1673-1676x.
Steinmetz et al., Angew. Chem. Int. Ed.2004, 43, 4888-4892.
Terrett et al., US 8,268,970 B2 (2012).
Terrette et al., US 2010/0209432 A1 (2010).
Ullrich et al., Angew. Chemie Int. Ed.2009, 48, 4422-4425.
Vlahov et al., Bioorg. Med. Chem. Lett.2008, 18 (16), 4558-4561 [2008a].
Vlahov et al., US 2008/0248052 A1 (2008) [2008b].
Vlahov et al., US 2010/0240701 A1 (2010) [2010a].
Vlahov et al., US 2010/0048490 A1 (2010) [2010b].
Wang et al., Chem. Biol. Drug. Des 2007, 70, 75-86.
Wipf et al., Org. Lett.2004, 6 (22), 4057-4060.
Wipf et al., Org. Lett.2007, 9 (8), 1605-1607.
Wipf et al., US 2010/0047841 A1 (2010).
Zanda et al., US 8,580,820 B2 (2013).
LISTA SEKVENCI
[0293] Ovde je inkorporirana pomoću refrence u celini Lista sekvenci pod nazivom "SEQT_12026WOPCT.txt," koja sadrži SEQ ID NO:1 kroz SEQ ID NO:26, što uključuje sekvence nukleinske kiseline i/ili amino kiselina koje su ovde stavljene na uvid javnosti. Lista sekvenci je ovde izložena u ASCII tekstualnom formatu putem EFS-Web, i na taj način predstavlja i svoju papirnu i kompjutersku čitljivu formu. Lista sekvenci je prvo kreirana korišćenjem PatentIn 3.54. januara, 2014, i približno je veličine 15 KB.
[0294] Sledeća tabela 3 rezimira opise sekvenci koje su stavljene na uvid javnosti u ovoj prijavi.
LISTA SEKVENCI
[0295]
<110> Bristol-Myers Squibb Company
<120> TUBULISIN JEDINJENJA, METODE PRIPREME I PRIMENA
<130> 12026-WO-PCT
<150> US 61/764825
< 151> 2013-02-14
<160> 26
<170> PatentIn verzija 3.5
<210> 1
< 211> 5
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
< 211> 17
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 2
<210> 3
< 211> 13
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 3
<210> 4
< 211> 11
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 4
<210> 5
< 211> 7
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 5
<210> 6
< 211> 9
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 6
<210> 7
< 211> 122
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 7
<210> 8
< 211> 107
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 8
<210> 9
< 211> 5
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 9
<210> 10
< 211> 17
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 10
<210> 11
<211> 11
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 11
<210> 12
< 211> 12
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 12
<210> 13
< 211> 7
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 13
<210> 14
< 211> 9
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 14
<210> 15
< 211> 120
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 15
<210> 16
< 211> 108
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 16
<210> 17
< 211> 5
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 17
<210> 18
< 211> 17
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 18
<210> 19
< 211> 8
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 19
<210> 20
< 211> 12
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 20
<210> 21
< 211> 7
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 21
<210> 22
< 211> 8
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 22
<210> 23
< 211> 117
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24
< 211> 107
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens <400> 24
<210>25
< 211> 327
< 212> PRT
< 213> Veštačka sekvenca
<220>
< 223> Konstantni region modifikovanog antitela <400> 25
<210> 26
< 211> 330
< 212> PRT
< 213> Veštačka sekvenca
<220>
< 223> Konstantni region modifikovanog antitela <400> 26

Claims (15)

  1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje koje ima strukturu predstavljenu formulom (I)
    gde R<1>je H, nesupstituisani ili supstituisani C1-C10alkil, nesupstituisani ili supstituisani C2-C10alkenil, nesupstituisani ili supstituisani C2-C10alkinil, nesupstituisani ili supstituisani aril, nesupstituisani ili supstituisani heteroaril, nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C1-C10alkil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C2-C10alkenil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C2-C10alkinil), (CH2)1-2OC(=O)(C1-C10alkil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2OC(=O)(C2-C10 alkenil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1- 2OC(=O)(C2-C10 alkinil), nesupstituisani ili supstituisani C(-O)(C1-C10 alkil), nesupstituisani ili supstituisani C(-O)(C2-C10alkenil), nesupstituisani ili supstituisani C(=O)(C2-C10alkinil), nesupstituisana ili supstituisana cikloalifatična grupa, nesupstituisana ili supstituisana heterocikloalifatična grupa, nesupstituisani ili supstituisani arilalkil, ili nesupstituisani ili supstituisani alkilaril; R<2>je H, nesupstituisani ili supstituisani C1-C10alkil, nesupstituisani ili supstituisani C2-C10 alkenil, nesupstituisani ili supstituisani C2-C10 alkinil, nesupstituisani ili supstituisani aril, nesupstituisani ili supstituisani heteroaril, nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C1-C10alkil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C2-C10alkenil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2O(C2-C10 alkinil), (CH2)1-2OC(=O)(C1-C10 alkil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1-2OC(=O)(C2-C10 alkenil), nesupstituisani ili supstituisani (CH2)1- 2OC(=O)(C2-C10alkinil), nesupstituisani ili supstituisani C(=O)(C1-C10alkil), nesupstituisani ili supstituisani C(=O)(C2-C10 alkenil), nesupstituisani ili supstituisani C(=O)(C2-C10 alkinil), nesupstituisana ili supstituisana cikloalifatična grupa, nesupstituisania ili supstituisana heterocikloalifatična grupa, nesupstituisani ili supstituisani arilalkil, nesupstituisani ili supstituisani alkilaril, ili
    gde svako R<2a>je nezavisno H, NH2, NHMe, Cl, F, Me, Et, ili CN; R<3a>i R<3b>su nezavisno H, C1-C5 alkil, CH2(C5-C6 cikloalkil), CH2C6H5, C6H5, ili CH2CH2OH; R<4>je
    ili
    gde R<4a>je H ili C1-C3 alkil; i Y je H, OH, Cl, F, CN, Me, Et, NO2, ili NH2; R<5>je H, C1-C5alkil, C2-C5alkenil, C2-C5alkinil, CO(C1-C5alkil), CO(C2-C5alkenil), ili CO(C2-C5 alkinil); W je O ili S; i n je 0, 1, ili 2; ili farmaceutski prihvatljiva so tog jedinjenja.
  2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, koje ima strukturu predstavljenu formulom (Ia)
    gde Y je H ili NO2R<4a>je H, Me, ili Et; i R<3a>i R<3b>su nezavisno H, Me, ili Et.
  3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, koje ima strukturu predstavljenu formulom (Ib):
    gde R<4a>je H, Me, ili Et; R<3a>i R<3b>su nezavisno H, Me, i Et; i R<6>je C1-C5alkil, CH2OC(=O)C1-C5 alkil, ili (CH2)1-2C6H5.
  4. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 3, koje ima strukturu predstavljenu formulom (Ib'):
    gde R<4a>je H, Me, ili Et i R<6>je Me ili n-Pr.
  5. 5. Konjugat koji sadrži jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 kovalentno vezano za ciljnu grupu koji se specifično ili poželjno vezuje za antigen povezan sa tumorom.
  6. 6. Konjugat prema patentnom zahtevu 5, koji ima strukturu predstavljenu formulom (II-1'):
    gde R<6>je Me ili n-Pr i Ab je antitelo koj je poželjno anti-CD70, anti-mezotelin, ili anti-glipikan 3 antitelo.
  7. 7. Konjugat prema patentnom zahtevu 5, koji ima strukturu predstavljenu formulom (II) [D(X<D>)aC(X<Z>)b]mZ (II) gde Z je ciljna grupa koja je poželjno antitelo; X<D>je prva grupa koja razdvaja; X<Z>je druga grupa koja razdvaja; C je grupa koja se može preseći; indeksi a i b su nezavisno 0 ili 1; indeks m je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10; i D je u skladu sa formulom (D-a)
    ili formulom (D-b)
    gde Y je H ili NO2; R<4a>je H, Me, ili Et; R<3a>i R<3b>su nezavisno H, Me, ili Et; i R<6>je C1-C5 alkil, CH2OC(=O)C1-C5 alkil, ili (CH2)1-2C6H5; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
  8. 8. Lek-veznik jedinjenje koje ima strukturu u skladu sa formulom (III) D-(X<D>)aC(X<Z>)b-R<31>(III) gde R<31>je reaktivna funkcionalna gru X<D>je prva grupa koja razdvaja; X<Z>je druga grupa koja razdvaja; C je grupa koja se može preseći; indeksi a i b su nezavisno 0 ili 1; indeks m je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10; i D je u skladu sa formulom (D-a)
    ili formulom (D-b)
    gde Y je H ili NO2; R<4a>je H, Me, ili Et; i R<3a>i R<3b>su nezavisno H, Me, ili Et; i R<6>je C1-C5alkil, CH2OC(=O)C1-C5alkil, ili (CH2)1-2C6H5; ili farmaceutski prihvatljiva so tog jedinjenja.
  9. 9. Lek-veznik jedinjenje prema patentnom zahtevu 8, koje ima strukturu predstavljenu formulom (III-a):
    gde R<3a>i R<3b>su nezavisno H, Me, ili Et; R<6>je Me, Et, ili n-Pr; AA<a>i svako AA<b>su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od alanina, β-alanina, γ-aminobuterne kiseline, arginina, asparagina, asparaginske kiseline, γ-karboksiglutaminske kiseline, citrulina, cisteina, glutaminske kiseline, glutamina, glicina, histidina, izoleucina, leucina, lizina, metionina, norleucina, norvalina, ornitina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofana, tirozina, i valina; p je 1, 2, 3, ili 4; q je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10; r je 1, 2, 3, 4, ili 5; s je 0 ili 1; i R<31>je izabran iz grupe koja se sastoji od
  10. 10. Lek-veznik jedinjenje prema patentnom zahtevu 8, koje ima strukturu predstavljenu formulom (III-b):
    gde R<6>je Me ili n-Pr; q je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10; r je 1, 2, 3, 4, ili 5; s je 0 ili 1; i R<31>je izabrano iz grupe koja se sastoji od
  11. 11. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, ili konjugat tog jedinjenja sa ciljnom grupom, za primenu u lečenju tumora kod subjekta koji pati od takvog kancera.
  12. 12. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 11, gde je jedinjenje konjugovano sa ciljnom grupom koja je antitelo koje se vezuje za antigen koji je overeksprimiran ili jedinstveno eksprimiran u kanceru.
  13. 13. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 11, gde je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera bubrega, pluća, želudca i jajnika.
  14. 14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, ili konjugat tog jedinjenja sa ciljnom grupom, i farmaceutski prihvatljivi nosač.
  15. 15. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 14, gde jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 je konjugovano sa ciljnom grupom koja je antitelo.
RS20170659A 2013-02-14 2014-02-10 Jedinjenja tubulisina, metode pripreme i primena RS56169B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361764825P 2013-02-14 2013-02-14
EP14706743.3A EP2956173B1 (en) 2013-02-14 2014-02-10 Tubulysin compounds, methods of making and use
PCT/US2014/015503 WO2014126836A1 (en) 2013-02-14 2014-02-10 Tubulysin compounds, methods of making and use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56169B1 true RS56169B1 (sr) 2017-11-30

Family

ID=50179943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170659A RS56169B1 (sr) 2013-02-14 2014-02-10 Jedinjenja tubulisina, metode pripreme i primena

Country Status (27)

Country Link
US (5) US9109008B2 (sr)
EP (1) EP2956173B1 (sr)
JP (1) JP6302490B2 (sr)
KR (1) KR102215954B1 (sr)
CN (1) CN105073139B (sr)
AR (1) AR094784A1 (sr)
AU (1) AU2014216539B2 (sr)
BR (1) BR112015019432A2 (sr)
CA (1) CA2900854C (sr)
CY (1) CY1119005T1 (sr)
DK (1) DK2956173T3 (sr)
EA (1) EA030830B1 (sr)
ES (1) ES2628156T3 (sr)
HR (1) HRP20170888T1 (sr)
HU (1) HUE033626T2 (sr)
IL (1) IL240475B (sr)
LT (1) LT2956173T (sr)
MX (1) MX356698B (sr)
PL (1) PL2956173T3 (sr)
PT (1) PT2956173T (sr)
RS (1) RS56169B1 (sr)
SG (1) SG11201506243XA (sr)
SI (1) SI2956173T1 (sr)
SM (1) SMT201700294T1 (sr)
TW (1) TW201443083A (sr)
UY (1) UY35322A (sr)
WO (1) WO2014126836A1 (sr)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1789391B1 (en) 2004-07-23 2017-06-28 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
WO2008112873A2 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Endocyte, Inc. Binding ligand linked drug delivery conjugates of tubulysins
WO2009002993A1 (en) 2007-06-25 2008-12-31 Endocyte, Inc. Conjugates containing hydrophilic spacer linkers
US9877965B2 (en) 2007-06-25 2018-01-30 Endocyte, Inc. Vitamin receptor drug delivery conjugates for treating inflammation
RU2604196C2 (ru) 2011-03-16 2016-12-10 арДЖЕН-ИКС Н.В. Антитела против cd70
WO2013126797A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Purdue Research Foundation Cholecystokinin b receptor targeting for imaging and therapy
US20140080175A1 (en) 2012-03-29 2014-03-20 Endocyte, Inc. Processes for preparing tubulysin derivatives and conjugates thereof
MX2015004757A (es) 2012-10-16 2015-07-17 Endocyte Inc Conjugados de suministro de farmacos que contienen aminoacidos no naturales y metodo para usarlos.
PT2956173T (pt) * 2013-02-14 2017-06-26 Bristol Myers Squibb Co Compostos de tubulisina, métodos de produção e utilização
WO2014177771A1 (en) 2013-05-02 2014-11-06 Glykos Finland Oy Conjugates of a glycoprotein or a glycan with a toxic payload
EP3086815B1 (en) 2013-12-27 2022-02-09 Zymeworks Inc. Sulfonamide-containing linkage systems for drug conjugates
AU2014373640B2 (en) 2013-12-27 2018-08-30 Var2 Pharmaceuticals Aps VAR2CSA-drug conjugates
CN106795214B (zh) 2014-03-20 2022-09-02 百时美施贵宝公司 稳定化的基于纤连蛋白的支架分子
KR102359214B1 (ko) 2014-04-04 2022-02-07 델 마 파마슈티컬스 폐의 비소세포 암종 및 난소암을 치료하기 위한 디안하이드로갈락티톨 및 이의 유사체 또는 유도체
KR20160142392A (ko) * 2014-04-11 2016-12-12 메디뮨 엘엘씨 튜부리신 유도체
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
GB201416960D0 (en) 2014-09-25 2014-11-12 Antikor Biopharma Ltd Biological materials and uses thereof
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
EP3221346B1 (en) 2014-11-21 2020-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
UY36404A (es) 2014-11-21 2016-06-01 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware ANTICUERPOS MONOCLONALES (Ab) COMO DETECTORES DE CD73 E INHIBIDORES DE SU ACTIVIDAD ENZIMÁTICA, Y COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN
CA2969067A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Novel pd-l1 binding polypeptides for imaging
CR20170438A (es) 2015-02-25 2018-01-30 Univ Rice William M Desacetoxitubulisina h y análogos de esta
US10676773B2 (en) 2015-03-10 2020-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies conjugatable by transglutaminase and conjugates made therefrom
WO2016196228A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against ox40 and uses thereof
US10584160B2 (en) 2015-09-23 2020-03-10 Bristol-Myers Squibb Company Glypican-3-binding fibronectin based scaffold molecules
TWI852735B (zh) * 2015-12-04 2024-08-11 美商思進公司 四級胺化妥布賴森(tubulysin)化合物之結合物
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
AU2016377371A1 (en) 2015-12-21 2018-08-09 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
CA3016187A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy with anti-cd73 antibodies
US20170326249A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugate of an anti-glypican-3 antibody and a tubulysin analog, preparation and uses
JP2019518013A (ja) 2016-05-10 2019-06-27 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 安定性が向上したツブリシン類似体の抗体薬物結合体
WO2017218724A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Bristol-Myers Squibb Company Process and intermediates for making tubulysin analogs
KR102493853B1 (ko) 2016-08-19 2023-01-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 세코-시클로프로파피롤로인돌 화합물, 그의 항체-약물 접합체, 및 제조 및 사용 방법
WO2018048975A1 (en) 2016-09-09 2018-03-15 Bristol-Myers Squibb Company Use of an anti-pd-1 antibody in combination with an anti-mesothelin antibody in cancer treatment
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
WO2018075842A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Bristol-Myers Squibb Company Condensed benzodiazepine derivatives and conjugates made therefrom
WO2018218056A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Birstol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
GB2567613A (en) * 2017-06-16 2019-04-24 Argenx Bvba Treatment for acute myeloid leukaemia
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
MX2020005473A (es) 2017-11-27 2020-08-27 Purdue Pharma Lp Anticuerpos humanizados que se dirigen al factor tisular humano.
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
WO2019209811A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (tlr7) agonists
IL278938B2 (en) 2018-05-29 2024-09-01 Bristol Myers Squibb Co Modified self-immolating moieties for use in prodrugs and conjugates and methods of using and making
US11020490B2 (en) 2018-06-22 2021-06-01 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugate with a tubulysin analog warhead having a stabilized acetate group in the TUV subunit
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
CN113348177A (zh) 2018-11-28 2021-09-03 百时美施贵宝公司 包含经修饰的重链恒定区的抗体
CN113453725A (zh) 2018-11-30 2021-09-28 百时美施贵宝公司 包含含有谷氨酰胺的轻链c末端延伸的抗体、其缀合物以及方法和用途
US12478686B2 (en) 2018-12-12 2025-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies modified for transglutaminase conjugation, conjugates thereof, and methods and uses
TWI848030B (zh) 2018-12-18 2024-07-11 比利時商阿根思公司 Ｃｄ７０組合治療
WO2020132658A2 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tubulysins and protein-tubulysin conjugates
CN109796358A (zh) * 2019-01-17 2019-05-24 深圳市老年医学研究所 一种Tubulysin家族化合物中间体TUP的合成方法
US20240377413A1 (en) 2019-09-16 2024-11-14 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
KR20210033435A (ko) 2019-09-18 2021-03-26 메콕스큐어메드 주식회사 아자린 생산이 가능한 신규 균주 및 이의 용도
CN111454230B (zh) * 2020-04-26 2021-12-14 深圳市老年医学研究所 一种天然抗癌药物Tubulysins的关键中间体Tuv的合成方法
CA3185601A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tubulysins and protein-tubulysin conjugates
KR20220037729A (ko) 2020-09-18 2022-03-25 메콕스큐어메드 주식회사 튜블라이신 생산이 가능한 신규 균주 및 이의 용도
CN116789733B (zh) * 2022-07-05 2025-01-24 上海药明合联生物技术有限公司 偶联连接子
WO2025038646A1 (en) * 2023-08-14 2025-02-20 Intellia Therapeutics, Inc. Cd70 car-t compositions and methods for cell-based therapy
WO2025188693A1 (en) 2024-03-05 2025-09-12 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic tlr7 agonists and uses thereof
US20250282786A1 (en) 2024-03-05 2025-09-11 Bristol-Myers Squibb Company Tricyclic TLR7 Agonists and Uses Thereof

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4631190A (en) 1981-06-26 1986-12-23 Shen Wei C Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
US5144011A (en) 1981-06-26 1992-09-01 Boston University Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4698420A (en) 1985-02-25 1987-10-06 Xoma Corporation Antibody hybrid molecules and process for their preparation
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US4894386A (en) 1987-04-15 1990-01-16 Ici Americas Inc. Aliphatic carboxamides
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
TW420681B (en) 1995-12-08 2001-02-01 Lederle Japan Ltd Carbapenem-3-carboxylic acid ester derivatives
DE19638870B4 (de) 1996-09-23 2009-05-14 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Tubulysine, Verfahren zu ihrer Gewinnung und sie enthaltende Mittel
CA2589418A1 (en) 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
DE10008089A1 (de) 2000-02-22 2001-10-31 Biotechnolog Forschung Gmbh Syntheseverfahren zur Herstellung von Tubulysinen
PE20020908A1 (es) 2001-03-21 2002-10-26 Cell Therapeutics Inc Produccion recombinante de polimeros polianionicos y uso de de los mismos
KR20030033007A (ko) 2001-05-31 2003-04-26 코울터 파머수티컬, 인코포레이티드 세포독소, 약물전구체, 링커 및 이에 유용한 안정화제
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
KR100668538B1 (ko) 2002-01-09 2007-01-16 메다렉스, 인코포레이티드 Ｃｄ３０에 대한 인간 모노클로날 항체
US7776814B2 (en) 2002-07-09 2010-08-17 R&D-Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysin conjugates
WO2004005327A1 (de) 2002-07-09 2004-01-15 Morphochem Ag Komb Chemie Neue tubulysinanaloga
DE10241152A1 (de) 2002-09-05 2004-03-18 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Tubulysin-Biosynthese-Gene
DE10254439A1 (de) 2002-11-21 2004-06-03 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Tubulysine, Herstellungsverfahren und Tubulysin-Mittel
JP4753867B2 (ja) 2003-04-15 2011-08-24 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー ヒトｉｌ−１８を含むコンジュゲートおよびその置換変異体
WO2005010048A2 (en) 2003-07-22 2005-02-03 Schering Aktiengesellschaft Rg1 antibodies and uses thereof
WO2005051976A2 (en) 2003-11-20 2005-06-09 Ansata Therapeutics, Inc. Protein and peptide ligation processes and one-step purification processes
WO2005082023A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
CA2564076C (en) 2004-05-19 2014-02-18 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
DE102004030227A1 (de) 2004-06-23 2006-01-26 Dömling, Alexander, Dr. Wirkstoffe mit antiangiogenetischen Eigenschaften
BRPI0516284A (pt) 2004-09-23 2008-09-02 Genentech Inc anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto
PL1851250T3 (pl) 2005-02-18 2012-10-31 Squibb & Sons Llc Ludzkie przeciwciało monoklonalne przeciwko antygenowi błony komórkowej komórek prostaty (PSMA)
WO2006089231A2 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies against prostate specific membrane antigen (psma) lacking in fucosyl residues
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
MX2007013978A (es) 2005-05-09 2008-02-22 Ono Pharmaceutical Co Anticuerpos monoclonales humanos a muerte programada 1 (pd-1) y metodos para tratamiento de cancer utilizando anticuerpos anti-pd-1 solos o en combinacion con otros inmunoterapeuticos.
CA2611814A1 (en) 2005-06-20 2007-01-04 Medarex, Inc. Cd19 antibodies and their uses
CA2617660C (en) 2005-08-19 2014-03-25 Endocyte, Inc. Multi-drug ligand conjugates
ES2527961T3 (es) 2005-09-26 2015-02-02 Medarex, L.L.C. Anticuerpos monoclonales humanos para CD70
BRPI0617546A2 (pt) 2005-09-26 2011-07-26 Medarex Inc conjugado de fÁrmaco-anticorpo, formulaÇço farmacÊutica, mÉtodo para matar uma cÉlula de tumor, mÉtodo para retardar ou interromper o crescimento de um tumor em um sujeito mamÍfero e composto
JP5116686B2 (ja) 2005-10-26 2013-01-09 メダレックス インコーポレイテッド Ｃｃ−１０６５類似体の調製方法及び調製用化合物
CA2627190A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
BRPI0620601A2 (pt) 2005-12-08 2011-11-16 Medarex Inc anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção ligante ao antìgeno do mesmo, composição, imunoconjugado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, método para preparar um anticorpo anti-o8e e método para tratar ou prevenir uma doença definida pelo crescimento de células tumorais expressando o8e
JP5401639B2 (ja) 2005-12-08 2014-01-29 メダレックス エル．エル．シー． タンパク質チロシンキナーゼ７（ｐｔｋ７）に対するヒトモノクローナル抗体およびそれらの使用
KR100869414B1 (ko) 2005-12-13 2008-11-21 야마하 가부시키가이샤 건반식 음판 타악기용의 음판 및 그 제조방법, 음판타악기의 음원 유닛 및 건반식 타악기
ES2415635T3 (es) 2006-06-29 2013-07-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Síntesis acelular de proteínas que contienen aminoácidos no naturales
KR20090057072A (ko) 2006-09-08 2009-06-03 암브룩스, 인코포레이티드 척추동물 세포에 의한 비천연 아미노산의 부위 특이적 도입
JP5398538B2 (ja) 2006-12-01 2014-01-29 メダレックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー Ｃｄ２２に結合するヒト抗体およびその使用
EP2097534A4 (en) 2006-12-14 2010-05-12 Medarex Inc HUMAN ANTIBODIES BINDING TO CD70 AND USES THEREOF
UY30776A1 (es) 2006-12-21 2008-07-03 Medarex Inc Anticuerpos cd44
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
JP2010516625A (ja) 2007-01-24 2010-05-20 インサート セラピューティクス， インコーポレイテッド 制御された薬物送達のためのテザー基を有するポリマー−薬物コンジュゲート
CN101616911A (zh) 2007-02-21 2009-12-30 梅达莱克斯公司 具有单个氨基酸的化学连接物及其偶联物
US20100047841A1 (en) 2007-02-27 2010-02-25 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Synthesis of desacetoxytubulysin h and analogs thereof
WO2008112873A2 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Endocyte, Inc. Binding ligand linked drug delivery conjugates of tubulysins
US8980833B2 (en) 2007-05-10 2015-03-17 R&D-Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysine derivatives
WO2009002993A1 (en) 2007-06-25 2008-12-31 Endocyte, Inc. Conjugates containing hydrophilic spacer linkers
AU2008275985B2 (en) 2007-07-17 2013-09-19 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Monoclonal antibodies against Glypican-3
US8476451B2 (en) 2007-07-20 2013-07-02 The Regents Of The University Of California Tubulysin D analogues
EP3388086B1 (en) 2007-08-17 2020-10-07 Purdue Research Foundation Psma binding ligand-linker conjugates and methods for using
EP2185188B1 (en) 2007-08-22 2014-08-06 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
CA2700860C (en) 2007-10-01 2016-07-19 Jonathan A. Terrett Human antibodies that bind mesothelin, and uses thereof
JP2011500835A (ja) 2007-10-25 2011-01-06 エンドサイト，インコーポレイテッド チューブリシン類および調製プロセス
EP2174947A1 (en) 2008-09-25 2010-04-14 Universität des Saarlandes Bioactive pre-tubulysins and use thereof
WO2010087994A2 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
IT1394860B1 (it) * 2009-07-22 2012-07-20 Kemotech S R L Composti farmaceutici
US8394922B2 (en) * 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
ES2581207T3 (es) 2009-11-12 2016-09-02 Tube Pharmaceuticals Gmbh Inhibidores de la tubulina
EP2322537A1 (en) 2009-11-12 2011-05-18 R & D Biopharmaceuticals Gmbh Tubulin inhibitors
WO2011069116A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 Endocyte, Inc. Binding ligand linked drug delivery conjugates of tubulysins
EP2409983A1 (en) * 2010-07-19 2012-01-25 Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie (IPB) Tubulysin analogues
CA2857398A1 (en) 2011-12-05 2013-06-13 Igenica Biotherapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods
PT2956173T (pt) * 2013-02-14 2017-06-26 Bristol Myers Squibb Co Compostos de tubulisina, métodos de produção e utilização

Also Published As

Publication number Publication date
US20170260232A1 (en) 2017-09-14
EA201591317A1 (ru) 2015-12-30
KR20150119086A (ko) 2015-10-23
SG11201506243XA (en) 2015-09-29
US9109008B2 (en) 2015-08-18
US20140227295A1 (en) 2014-08-14
PL2956173T3 (pl) 2017-09-29
WO2014126836A1 (en) 2014-08-21
CN105073139A (zh) 2015-11-18
EA030830B1 (ru) 2018-10-31
JP2016509021A (ja) 2016-03-24
IL240475A0 (en) 2015-09-24
BR112015019432A2 (pt) 2017-08-22
SMT201700294T1 (it) 2017-07-18
CA2900854A1 (en) 2014-08-21
EP2956173A1 (en) 2015-12-23
AU2014216539A1 (en) 2015-10-01
US20150132324A1 (en) 2015-05-14
AU2014216539B2 (en) 2017-03-23
AR094784A1 (es) 2015-08-26
HK1212209A1 (en) 2016-06-10
SI2956173T1 (sl) 2017-06-30
LT2956173T (lt) 2017-06-26
EP2956173B1 (en) 2017-03-29
CY1119005T1 (el) 2018-01-10
US20160264624A1 (en) 2016-09-15
US9382289B2 (en) 2016-07-05
UY35322A (es) 2014-08-29
US20140227298A1 (en) 2014-08-14
US9688721B2 (en) 2017-06-27
HUE033626T2 (en) 2017-12-28
DK2956173T3 (en) 2017-07-17
MX356698B (es) 2018-06-11
CA2900854C (en) 2017-08-22
TW201443083A (zh) 2014-11-16
ES2628156T3 (es) 2017-08-01
CN105073139B (zh) 2019-01-11
JP6302490B2 (ja) 2018-03-28
US8980824B2 (en) 2015-03-17
IL240475B (en) 2018-03-29
KR102215954B1 (ko) 2021-02-15
MX2015010079A (es) 2016-01-25
HRP20170888T1 (hr) 2017-09-22
PT2956173T (pt) 2017-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2956173T3 (en) TUBULYSIS RELATIONSHIPS, METHODS OF PRODUCING AND USING THEREOF
CA2864420C (en) Enediyne compounds, conjugates thereof, and uses and methods therefor
TWI469794B (zh) 抗細胞增殖化合物及其共軛物及其方法及用途
HK1212209B (en) Tubulysin compounds, methods of making and use