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BRPI0620601A2 - anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção ligante ao antìgeno do mesmo, composição, imunoconjugado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, método para preparar um anticorpo anti-o8e e método para tratar ou prevenir uma doença definida pelo crescimento de células tumorais expressando o8e - Google Patents

anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção ligante ao antìgeno do mesmo, composição, imunoconjugado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, método para preparar um anticorpo anti-o8e e método para tratar ou prevenir uma doença definida pelo crescimento de células tumorais expressando o8e Download PDF

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BRPI0620601A2
BRPI0620601A2 BRPI0620601-8A BRPI0620601A BRPI0620601A2 BR PI0620601 A2 BRPI0620601 A2 BR PI0620601A2 BR PI0620601 A BRPI0620601 A BR PI0620601A BR PI0620601 A2 BRPI0620601 A2 BR PI0620601A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
seq
variable region
chain variable
human
Prior art date
Application number
BRPI0620601-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Alan J Korman
Mark J Selby
Li-Sheng Lu
Alison Witte
Haichun Huang
Original Assignee
Medarex Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
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Application filed by Medarex Inc filed Critical Medarex Inc
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Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO OU UMA PORçãO LIGANTE AO ANTIGENO DO MESMO, COMPOSIçãO, IMUNOCONJUGADO, MOLéCULA DE ACIDO NUCLéICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSAO, CéLULA HOSPEDEIRA, MéTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-OSE E MéTODO PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENçA DEFINIDA PELO CRESCIMENTO DE CéLULAS TUMORAIS EXPRESSANDO 08E. A presente invenção provê anticorpos monoclonais isolados, particularmente anticorpos monoclonais humanos que se ligam, especificamente, ao 08E com alta afinidade. As moléculas de ácido nucléico codificantes dos anticorpos desta invenção, vetores de expressão, células hospedeiras e métodos para expressão dos anticorpos destainvenção também são providos. Também são providos, imunoconjugados, moléculas biespecíficas e composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos desta invenção. Esta invenção também provê métodos para tratamento de câncer.

Description

"ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO OU UMA PORÇÃO LIGANTE AO ANTÍGENO DO MESMO, COMPOSIÇÃO, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-08E E MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENÇA DEFINIDA PELO CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS EXPRESSANDO 08E" .
Campo da invenção
A presente invenção refere-se genericamente ao campo da imunologia e da biologia molecular. Mais especificamente, são providos aqui anticorpos monoclonais anti-08E humano, ácidos nucléicos codificando os anticorpos monoclonais anti-08E humanos, métodos para preparar anticorpos monoclonais anti-08E humanos e métodos para o tratamento de doenças, tais como câncer,. caracterizados pelo crescimento de células que expressam 08E.
Histórico da invenção
Os cânceres de mama e de ovários são os responsáveis, respectivamente, pela segunda e a quarta causa que conduzem à morte por câncer as mulheres nos Estados Unidos ("American Câncer Society, 2005 - Câncer facts and figures"). A Sociedade Americana do Câncer estimou que, nos Estados Unidos, aproximadamente 4 0,0 00 de mulheres irão morrer 'de câncer de mama e ce de 16,000 irão morrer de câncer de ovário em 7/Os tumores da superfície epitelial contam acim? .' 80% de todos os tumores malignos de ovário, o que inoíui tumores serosos, tumores, tumores mucionosos, tumores endometrióides e carcinomas de células claras ("Seidman ET AL.,
Blaustein's Pathology of the Female Genital Tract", 791-4 (Kurman, editor, 5th edition, New York, Springer-Verlag, 2002)). Os cânceres de ovário apresentam, freqüentemente, em um estágio avançado onde a doença mestástica espalhou para sítios regionais e distantes (Petterson, (1994), "Int. Fed. Of Gyn and Obstetrics", Vol. 22; e Heintz et al, (2001) - J. Epidermiol., Biostat., 6:107-38). Assim, embora a probabilidade de vida do desenvolvimento de câncer de mama é significativamente maior do que para àquele câncer de ovário.
As moléculas do tipo B7 pertencem a super-família das imunoglobulinas (Ig). A porção extracelular das moléculas do tipo B7 contém domínios IgV e IgC simples e compartilha ~20%-40% da identidade dos aminoácidos. As moléculas do tipo B7 participam de regras críticas no controle e no ajuste fino das respostas imune específicas do antígeno. 08E, conhecido também como B7H4, B7x e B7S1, é um membro da família B7 e acredita-se participar de uma regra em ambas as respostas da célula T de estimulo e de regulação inibitória (Carreno et al., (2000) Ann. Rev. Immunol., 20:29-53 e Khoury et al. , (2004), Immunity 20:529-538) . 08E humano foi mapeado no cromossomo 1 e compreende seis exons e cinco introns envergando 66kb, dos quais o exon 6 é utilizado para anelamento alternativo para produzir dois transcritos diferentes (Choi ETAL., (2003) J. Immunol. 171:4650-4654). 08E exerce sua função fisiológica por ligação a um receptor na célula T, que no returno induz a retenção do ciclo celular e inibe a secreção de citocinas, o desenvolvimento de citotoxicidade e da produção de citocinas das células CD4+ e CD8+ (Prasad et al. , (2003) Immunity 18:863-873; Sica et al. , (2003) Immunity 18:849- 861; Wang et al., (2004) Microbes Infect., 6:759-66; e Zang et al. , (2003), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S. A. 100:10388-10392) . Foi sugerido que o 08E pode ser um atenuador da resposta inflamatória e pode servir como uma grega na baixa-regulação das respostas anti-tumor e na resposta imune antígeno específica (Zang et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 100:10388-10392; Prasad et al. (2003) Immunity 18:863-873; Sica et al. (2003) Immunity 18:849-861; Choi et al.(2003) J. Immunol., 171:4650-4654; e Carreno et al. (2003) Trends Immunol., 24:524-7).
O mRNA do 08E mas não a expressão da proteína foi detectado em uma faixa ampla de tecidos somáticos normais, incluindo fígado, músculo esquelético, rim, pâncreas e intestino delgado (Sica et al. (2003) Immunity, 18^:849-61 e Choi et al. (2003) J. Immunol. 171:4650-4). 08E é induzido no estímulo das células t, células B, monócitos e células dendríticas; entretanto, a análise imunohistoquímica revelou uma pequena expressão em vários tecidos periféricos com exceção da coloração positiva em alguns cânceres de ovário e pulmão (Id.). Em adição, 08E é consistentemente super-expresso no câncer de mama primário e metástico, independente do grau ou do estágio do tumor, sugerindo uma regra crítica para esta proteína na biologia do câncer de mama (Tringler et al.
(2005) Clinicai Câncer Res., 11:1842-48). Ver, também as patentes norte-americanas U.S. 6,962,980; 6,699,664; 6,468,546; 6,488,931; 6,670,463; e 6,528,253, cada uma das quais sendo incorporada aqui por referência em sua íntegra.
Uma ampla variedade de modalidades terapêuticas estão disponíveis para o tratamento de cânceres avançados de mama e de ovário incluindo, radioterapia, quimioterapia convencional com agentes anti-tumor citotóxicos, terapia hormonal (inibidores aromatase, análogos de hormônios liberados do hormônio luteinizante), bisfosfanatos e inibidores do sinal de transdução (Smith (2002)) Lancet, 360:790-2). Infelizmente, entretanto, muitos pacientes ou respondem pobremente ou não respondem a nada de qualquer uma destas modalidades terapêuticas. Assim, existe uma necessidade de identificar novos marcadores moleculares para e agentes terapêuticos contra cânceres de mama e de ovário. Consequentemente, 08E representam um alvo valioso para o tratamento do câncer, incluindo os cânceres de ovário e de mama e uma variedade de outras doenças caracterizadas pela expressão de 08E. Sumário da invenção A presente invenção provê anticorpos monoclonais isolados, em particular seqüências de anticorpos monoclonais humanos, que se ligam ao 08E (a/k/a B7H4, B7S1, B7x) e que exibem numerosas propriedades desejáveis. Essas propriedades incluem ligação de alta afinidade ao O8E humano. Também são providos métodos para tratar uma variedade de doenças mediadas por 08E usando os anticorpos e as composições desta descrição.
Em um aspecto, esta invenção refere-se a um anticorpõ monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo:
(a) liga-se ao 08E humano com um K0 de 1x110"7M ou menos; e
(b) liga-se a linha de célula CHO humana transfectadas com do 08E.
Em determinada configuração, o anticorpo se liga a uma linha de célula de tumor de carcinoma de célula mamária, tais como a linha de célula SKBR3 (ATCC número de acesso:
HTB-30).
Tipicamente, o anticorpo é um anticorpo humano, embora em configurações alternativas o anticorpo possa ser um anticorpo de murino, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado.
Em uma configuração, o anticorpo liga-se ao O8E humano com um Kd de 5 χ 10"8 M ou menos, liga-se ao O8E humano com um Kd de 2 χ 10"8 M ou menos, liga-se ao O8E humano com um Kd de 1 χ 10"8 M ou menos, liga-se ao O8E humano com um Kd de 5 χ 10"9 M ou menos, liga-se ao O8E humano com um Kd de 4 χ 10"9 M ou menos, liga-se ao O8E humano com um Kd de 3 χ 10"9 M ou menos, ou liga-se ao O8E humano com um Kd de 2 χ 10"9 M ou menos.
Em uma outra configuração, o anticorpo é internalizado por meio das células do tumor de carcinoma de células mamárias SKBR3 após a ligação ao O8E expresso naquelas células.
Ainda em uma outra configuração, esta descrição provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, de modo que o anticorpo faz competição cruzada para ligar-se ao O8E com um anticorpo de referência, onde o anticorpo de referência: (a) liga-se ao 08E com um Kd de 1 χ 10"7M ou menos; e (b) liga-se às linhas de células CHO humana transfectadas com 08E. Em várias configurações, o anticorpo de referência compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 1; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO:6.
Ou o anticorpo de referência compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 2; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO:7.
Ou o anticorpo de referência compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 3; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO:8.
Ou o anticorpo de referência compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 4; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO:9.
Ou o anticorpo de referência compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a 25 seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 5; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO:10.
Em um aspecto, esta invenção provê um anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é
o produto de ou derivada de um gene Vh 4-34 humano (o produto da proteína da qual é apresentado aqui como SEQ. ID. NO: 51), onde o anticorpo liga-se, especificamente, ao 08E. Esta invenção também provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene Vh 3-53 humano (o produto da proteína que é apresentado aqui como SEQ.ID.NO:52), onde o anticorpo liga-se, especificamente, ao 08E. Esta invenção também provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de uma combinação de genes Vh 3-9/D3-10/JH6b (o produto da proteína que é apresentado aqui como SEQ.ID.NO:53), onde o anticorpo liga-se, especificamente, ao O8E.
A invenção ainda provê, adicionalmente, um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é produto de ou derivada de um gene Vk A2 7 humano (produto da proteína que é apresentado aqui como SEQ.ID.NO:54), onde o anticorpo liga-se especificamente ao 08E. Esta invenção provê ainda, um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de uma combinação de genes VK L16/JK1 humano (o produto da proteína que é apresentado como SEQ.ID.NO:55), onde o anticorpo liga-se especificamente ao 08E.
Em um outro aspecto, esta invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo:
(a) uma região variável de cadeia pesada de um gene Vh 4- 34, um gene 3-53 ou um gene 3-9 humano; e
(b) uma região variável de cadeia leve de um gene Vk A2 7 ou VK L6 humano.
Em uma configuração relacionada, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene VH 4-34 humano, e uma região variável de cadeia leve de um gene VK A2 7 humano. Em uma outra configuração relacionada, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene VH 3-53 humano e uma região variável de cadeia leve de um gene VK A27 humano. Ainda, em uma outra configuração relacionada, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene Vh 3-9 humano e uma região variável de cadeia leve de um gene Vk L6 humano.
Ainda, em outro aspecto, a presente invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo:
- uma região variável de cadeia pesada que compreenda as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3; e uma região variável de cadeia leve que compreende as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 onde:
(a) a região variável da cadeia pesada da seqüência CDR3 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionados do grupo consistindo dos aminoácidos das seqüências SEQ. ID. Nos: 21, 22, 23, 24 e 25 e modificações conservativas dos mesmos;
(b) a região variável da cadeia leve da seqüência CDR3 compreende (a) a região variável da cadeia pesada da seqüência CDR3 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionados do grupo consistindo dos aminoácidos das seqüências SEQ.ID.Nos: 21, 22, 23, 24 e 25 e modificações conservativas dos mesmos;
(c) o anticorpo liga-se ao 08e humano com um Kd de IxlO"7 M ou menos;
(d) liga-se as células CHO humanas transfectadas com 08E.
Tipicamente, a região variável de cadeia pesada da seqüência CDR2 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionados do grupo consistindo de seqüências de aminoácidos de SEQ.ID.Nos: 16, 17, 18, 19 e 20 e modificações conservativas dos mesmos; a região variável da cadeia leve da seqüência CDR2 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionados do grupo consistindo de seqüências de aminoácidos de SEQ.ID.Nos: 31, 32, 33, 34 e e modificações conservativas dos mesmos.
Tipicamente, a região variável de cadeia pesada da seqüência CDRl compreende uma seqüência de aminoácidos selecionados do grupo consistindo de seqüências de aminoácidos de SEQ.ID.Nos: 11, 12, 13, 14 e 15 e modificações conservativas dos mesmos; a região variável da cadeia leve da seqüência CDRl compreende uma seqüência de aminoácidos selecionados do grupo consistindo de seqüências de aminoácidos de SEQ.ID.Nos: 26, 27, 28, 29 e 30 e modificações conservativas dos mesmos. Uma combinação particular compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.NO:11;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.NO:16;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.NO:21;
de cadeia
de cadeia
pesada pesada
de cadeia leve de cadeia leve
cadeia pesada pesada
(d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ.ID.NO:26;
(e) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ.ID.NO:31; e
(f) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ.ID.NO:3 6.
Uma outra combinação particular compreende:
(a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.NO:12;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.NO:17;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.NO:22;
(d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ.ID.NO:27;
(e) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ.ID.NO:32; e
(f) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ.ID.NO:37.
Uma outra combinação particular compreende:
(a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:13;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.N0: 18;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO: 23;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:28;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:33; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:38.
Uma outra configuração particular compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:14;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:19;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:24;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO: 2 9;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:34; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:39.
Uma outra combinação particular compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:15;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:20;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:2 5;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:3 0;
e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:35; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:40.
Outros anticorpos particulares desta invenção ou porções ligantes do antígeno do mesmo compreendem:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 1; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 6. Uma outra combinação particular compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 2; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 7.
Uma outra combinação particular compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 3; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 8.
Uma outra combinação particular compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 4; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 9.
Uma outra combinação particular compreende:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 5; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 10.
Em um outro aspecto desta invenção, os anticorpos ou as porções ligantes ao antígeno dos mesmos, são providos de modo que haja competição para ligação ao 08E com qualquer um dos anticorpos acima mencionados.
Os anticorpos desta invenção podem ser, por exemplo, anticorpos de extensão completa, por exemplo, de um isotipo de IgGl, IgG2 ou IgG4. Alternativamente, os anticorpos podem ser fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos de Fab, Fab', ou Fab72 ou anticorpos de cadeia simples (por exemplo, scFv).
Esta invenção também provê um imunoconjugado compreendendo um anticorpo desta invenção ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, ligado a um agente terapêutico, tal como uma citotoxina ou um isótopo radioativo. Esta invenção também provê uma molécula biespecífica compreendendo um anticorpo ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, desta invenção, ligado a uma segunda porção funcional tendo uma especificidade de ligação diferente daquela do referido anticorpo ou porção ligante ao antígeno do mesmo.
As composições compreendendo um anticorpo ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo ou imunoconjugado ou molécula biespecífica desta invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável também são providas. As moléculas de ácido nucléico codificando os anticorpos ou porções ligantes ao antígeno dos mesmos, desta invenção também estão abrangidas por esta descrição, bem como vetores de expressão compreendendo os referidos ácidos nucléicos, células hospedeiras, os referidos vetores de Expressão e métodos para fazer anticorpos anti-08E usando as referidas células hospedeiras. Além disso, esta invenção provê um camundongo transgênico compreendendo transgenes de cadeia leve e pesada da imunoglobulina humana, de modo que o camundongo expresse um anticorpo desta invenção, bem como hibridomas preparados a partir do referido camundongo, onde o hibridoma produz o anticorpo desta invenção. Ainda, em um outro aspecto, esta invenção provê um método para tratar ou prevenir uma doença caracterizada pelo crescimento de células tumorais expressando 08E, compreendendo, administrar ao indivíduo, um anticorpo anti-08E humano da presente invenção em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir a doença. A doença pode ser um câncer, por exemplo, câncer de carcinoma de célula mamária.
Ainda um outro aspecto, esta invenção provê um método para tratar um distúrbio autoimune, compreendendo administrar a um indivíduo um anticorpo anti-08E humano da presente invenção em uma quantidade eficaz para tratar o distúrbio autoimune.
Outras características e vantagens da presente invenção serão aparentes a partir da descrição detalhada a seguir e dos exemplos que não deverão ser entendidos como limitativos. O conteúdo de todas as referências, entradas em GenBank, patentes e pedidos de patentes publicados citados durante todo o pedido de patente, são expressamente incorporados como referência.
Breve descrição das figuras e seqüências identificadoras: A Figura IA mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ.ID.NO:41) e a seqüência de aminoácidos (SEQ.ID.NO:1) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano IGll. São descritas as regiões CDRl (SEQ.ID.NO:11), CDR2 (SEQ.ID.NO:16) e CDR3 (SEQ.ID.NO:21) e são indicadas as derivações de linha germinal V e J; A Figura IB mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ.ID.NO:46) e a seqüência de aminoácidos (SEQ.ID.NO:6) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano IGll. São descritas as regiões CDRl (SEQ.ID.NO:26), CDR2 (SEQ.ID.NO:31) e CDR3 (SEQ.ID.NO:36) e são indicadas as derivações de linha germinal V e J;
A Figura 2A mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ.ID.NO:42) e a seqüência de aminoácidos (SEQ.ID.NO:2) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 2A7. São descritas as regiões CDRl (SEQ.ID.NO:12), CDR2 (SEQ.ID.NO:17) e CDR3 (SEQ.ID.NO:22) e são indicadas as derivações de linha germinal V, D e J;
A Figura 2B mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ.ID.NO:47) e a seqüência de aminoácidos (SEQ.ID.NO:7) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 2A7. São descritas as regiões CDRl (SEQ.ID.NO:27), CDR2 (SEQ.ID.NO:32) e CDR3 (SEQ.ID.NO:37) e são indicadas as derivações de linha germinal V e J;
A Figura 3A mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ.ID.NO:43) e a seqüência de aminoácidos (SEQ.ID.NO:3) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 2F9. São descritas as regiões CDRl (SEQ.ID.NO:13), CDR2 (SEQ.ID.NO:18) e CDR3 (SEQ.ID.NO:23) e são indicadas as derivações de linha germinal V, D e J; A Figura 3B mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ.ID.NO:48) e a seqüência de aminoácidos (SEQ.ID.NO:8) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 2F9. São descritas as regiões CDRl (SEQ.ID.NO:28), CDR2 (SEQ. ID.NO : 33) e CDR3 (SEQ. ID.NO : 38) e são indicadas as derivações de linha germinal V e J;
A Figura 4A mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ.ID.NO:44) e a seqüência de aminoácidos (SEQ.ID.NO:4) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 12E1. São descritas as regiões CDRl (SEQ.ID.NO:14), CDR2 (SEQ.ID.NO:19) e CDR3 (SEQ.ID.NO:24) e são indicadas as derivações de linha germinal V, D e J; A Figura 4B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ.ID.NO:49) e a seqüência de aminoácidos (SEQ.ID.NO:9) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 12E1. São descritas as regiões CDRl (SEQ.ID.NO:29), CDR2 (SEQ.ID.NO:34) e CDR3 (SEQ.ID.NO:39) e são indicadas as derivações de linha germinal V e J; A Figura 5A mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ.ID.NO:45) e a seqüência de aminoácidos (SEQ.ID.NO:5) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 13D12. São descritas as regiões CDRl (SEQ.ID.NO:15), CDR2 (SEQ.ID.NO:20) e CDR3 (SEQ.ID.NO:25) e são indicadas as derivações de linha germinal V, D e J; A Figura 5B mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ.ID.NO:50) e a seqüência de aminoácidos (SEQ.ID.NO:10) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 13D12. São descritas as regiões CDRl (SEQ.ID.NO:30), CDR2 (SEQ.ID.NO:35) e CDR3 (SEQ.ID.NO:40) e são indicadas as derivações de linha germinal V e J;
A Figura 6 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de IGll e 13D12 com a seqüência de aminoácidos Vh 4-34 da linha germinal humana (SEQ.ID.NO:51); A Figura 7 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 2A7 e 2F9 com a seqüência de aminoácidos VH 3-53 da linha germinal humana (SEQ.ID.NO:52);
A Figura 8 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 12E1 com a seqüência de aminoácidos VH 3-9/D3-10/JH6b da linha germinal humana combinada (SEQ.ID.NO:53);
A Figura 9 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de IG11, 2A7, 2F9 e 13D12 com a seqüência de aminoácidos Vk A2 7 da linha germinal humana (SEQ.ID.NO:54);
A Figura 10 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 12E1 com a seqüência de aminoácidos Vk L6/JK1 da linha germinal humana combinada (SEQ.ID.NO:55);
As Figuras 11A e 11B mostram os resultados dos experimentos de ELISA demonstrando que os anticorpos monoclonais humanos contra o 08E humano que se ligam especificamente ao O8E. A figura 11 A mostra os resultados a partir da placa de ELISA revestida com os anticorpos anti-O8E seguido por adição da proteína 08E purificada e pela detecção com antisoro anti-O8E de coelho. A figura 11B mostra os resultados a partir da placa de ELISA revestida com o Fc anti-camundongo seguido por anti-C9 monoclonal (0,6 μg/ml), então titulada com a proteína Penta-08E como indicado e seguido pelos anticorpos anti-08E em 1 μg/ml;
A Figura 12 mostra os resultados dos experimentos de citometria de fluxo demonstrando que os anticorpos monoclonais humanos anti-O8E 2A7 ligam-se às células CHO transfectadas com O8E;
A Figura 13 mostra os resultados de experimentos de citometria de fluxo demonstrando a expressão de 08E em células de carcinoma mamário SKBR3 bem como células SK0V3 e HEK transfectadas com O8E;
A Figura 14 mostra os resultados de experimentos de internaiização Hum-Zap demonstrando que os anticorpos monoclonais humanos contra o O8E humano podem ser internalizados dentro das células CHO O8E+; A Figura 15 mostra os resultados de experimentos de internalização Hum-Zap demonstrando que os anticorpos monoclonais humanos contra o 08E humano podem ser internalizados dentro das células SKBR3 08E+;
A Figura 16 mostra os resultados de experimentos de citometria de fluxo que o anticorpo HuMAb 69A7 contra o 08E humano liga-se de uma maneira dependente da concentração das linhas de célula (RCC) do carcinoma de células renais;
A Figura 16 mostra os resultados dos estudos de mapeamento de epitopo com vários anticorpos monoclonais anti-08E humano incluindo IGll, 2A7, 2F9 e 13D12;
A Figura 17 mostra os resultados dos ensaios da citotoxidade celular dependente do anticorpo (ADCC) demonstrando que os anticorpos monoclonais anti-08E humano matam a linha de célula de câncer mamário SKBR3 de uma maneira dependente do ADCC;
A Figura 18 mostra os resultados dos ensaios da citotoxidade celular dependente do anticorpo (ADCC) demonstrando que os anticorpos monoclonais anti-08E humano matam as células SK0V3 transfectadas com 08E de uma maneira dependente do ADCC;
A Figura 19 mostra os resultados dos ensaios da citotoxidade celular dependente do anticorpo (ADCC) demonstrando que os anticorpos monoclonais anti-08E humano matam a linha de célula de câncer mamário SKBR3 em uma concentração e de uma maneira dependente do ADCC; e
A Figura 20 mostra os resultados de estudos in vivo em camundongo SCID demonstrando que a inibição do crescimento do tumor de tumores HEK-B7H4 pelos anticorpos anti-08E.
Descrição detalhada
A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais isolados, particularmente aos anticorpos monoclonais humanos, que se ligam especificamente ao 08E (a/k/a B7H4, B7S1 e B7x) com alta afinidade. Em certas configurações, os anticorpos desta invenção são derivados de seqüências de linhas germinais de cadeias pesada e leve específicas e/ou compreende características estruturais particulares tais como regiões CDR compreendendo as seqüências de aminoácidos particulares. Esta descrição provê anticorpos isolados, métodos para fazer os referidos anticorpos, imunoconjugados e moléculas biespecíficas compreendendo os referidos anticorpos e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas biespecíficas desta invenção. Esta invenção também se refere aos métodos de uso dos anticorpos, tais como para detectar 08E, bem como para tratar doenças associadas com a expressão de 08E, tal como câncer. Consequentemente, esta descrição também provê métodos de uso dos anticorpos anti-08E desta invenção para tratar vários cânceres, por exemplo, no tratamento de carcinomas de células mamárias, cânceres de seios com metástase, carcinomas de células ovarianas, cânceres ovarianos com metástases e carcinomas de células renais.
De modo que a presente descrição possa ser mais facilmente entendida, determinados termos são definidos. Definições adicionais estão representadas durante a descrição detalhada da invenção.
Os termos "08E", "B7H4", "B7x" e "B7S1" são usados aqui intercaladamente e incluem variantes, isoformas, homólogos, ortólogos e parálogos de 08E humano. Por exemplo, anticorpos específicos para 08E podem, em certos casos, ter reação cruzada com 08E de outras espécies além da humana. Em outra configuração, os anticorpos específicos para o 08E humano podem ser completamente específicos para o 08e humano e pode não existir espécies ou outros tipos de reatividade cruzada. 0 termo "08E humano" refere-se às seqüências 08E humanas, tais como seqüências de aminoácidos completas de 08E humano tendo o número de acesso no GenBank NP_078902 (SEQ.ID.NO:56). 08E é também conhecido da técnica como, por exemplo, BL-CAM, B3, Leu-14 e Lyb-8. A seqüência do 08E humano pode diferir do 08E humano da SEQ. ID.NO: 56 por ter, por exemplo, mutações conservadas ou mutações em regiões não- conservadas e o CD22 ter, substancialmente, a mesma função biológica como o 08e humano da SEQ.ID.NO:56. Por exemplo, uma função biológica do 08E humano é àquela tendo um epítopo no domínio extracelular de 08e que é ligado, especificamente, por um anticorpo do exemplo da descrição ou uma função biológica do 08e humano inclui, por exemplo, a inibição da proliferação da célula T7 inibição da produção de citocinas, inibição da produção do ciclo celular, ou da ligação aos receptores da célula T.
Uma seqüência de 08e humana particular terá, geralmente, pelo menos 90% de identidade na seqüência de aminoácidos em relação ao 08E humano da SEQ.ID.NO:56 e contém resíduos de aminoácidos que identificam a seqüência de aminoácidos como sendo humana quando comparado com as seqüências de aminoácidos 08E de outras espécies (por exemplo, murino). Em certos casos, um 08e humano pode ter pelo menos 95%, ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade na seqüência de aminoácidos com relação ao O8e da SEQ.ID.NO:56. Em certas configurações, uma seqüência 08E humana irá participar de não mais que 10 aminoácidos diferentes daqueles de 08E da SEQ.ID.NO:56. Em certas configurações, o O8e humano pode participar com não mais do que 5, ou mesmo não mais que 4, 3, 2 ou 1 aminoácido diferente daquele de 08E da SEQ.ID.NO:56. A identidade percentual pode ser determinada como descrito aqui.
O termo "resposta imune" refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células apresentando antígeno, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento) que resulta em danos seletivos a, destruição de ou eliminação do corpo humano, de patógenos invasores, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerígenas ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanos normais.
Uma "via de transdução de sinal" refere-se à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. Conforme aqui utilizado, a frase "receptor de superfície celular" inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e a transmissão de tal sinal através da membrana plasmática de uma célula. Um exemplo de um "receptor de superfície celular" da presente invenção é o receptor 08E.
O termo "anticorpo", conforme aqui citado, inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento ligante ao antígeno (ou seja, "porção ligante ao antígeno") ou cadeias simples dos mesmos. Um "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações bissulfeto ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, ChI , CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um único domínio, Cl. As regiões Vh e Vl podem ser ainda, subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR) . Cada Vh e Vl é composta por três CDRs e quatro FRs, arranjadas do terminal-amino para o terminal-carboxi na seguinte ordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 . As regiões variáveis de cadeias leves e pesadas contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo diversas células do sistema imune (ex: células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.
O termo "porção ligante ao antígeno" de um anticorpo (ou "porção de anticorpo"), conforme aqui utilizado, refere- se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantém a capacidade de ligar-se especificamente a um antígeno (ex: 08E). Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada através de fragmentos de um anticorpo de extensão completa. Exemplos de fragmentos ligantes abrangidos pelo termo "porção ligante ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios Vl, Vh, Cl e CHi; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de bissulfeto na região de dobra ("hinge"); (iii) um fragmento Fab' , que é essencialmente um Fab com parte da região de dobra (ver, "Fundamental Immunology (Paul ed., 3rd ed. , 1993); (iv) um fragmento Fd consistindo dos domínios Vh e VHi; (v) um fragmento Fv consistindo dos domínios Vl e Vh de um braço único de um anticorpo; (vi) um fragmento dAb (Ward et al. , (1989) Nature 341:544-546), que consiste de um domínio VH; e (vii) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR); e (viii) um nanocorpo, uma região variável de cadeia pesada contendo um domínio variável único e dois domínios constantes. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, Vl e Vh, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, através de um ligante sintético que permite que sejam preparados como uma cadeia de proteína simples na qual as regiões Vl e Vh emparelham-se para formar moléculas monovalentes (conhecidas como cadeia simples Fv (scFv); vide, por exemplo, Bird et al(1988) Science 242:423-426; e Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples também pretendem ser abrangidos pelo termo "porção ligante ao antígeno" de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando-se técnicas convencionais conhecidas pelos habilitados na técnica, e os fragmentos são identificados quanto à utilidade da mesma forma que os anticorpos intactos.
Um "anticorpo isolado", conforme aqui utilizado, pretende se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (ex: um anticorpo isolado que especificamente liga-se ao 08E é substancialmente livre de anticorpos que se liga especificamente aos antígenos que não o 08E) . Um anticorpo isolado que se ligam especificamente a 08E pode, porém, ter reatividade cruzada a outros antígenos, tais como moléculas de 08E de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou químico. Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" conforme aqui utilizados, referem- se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular simples. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidade de ligação simples e afinidade por um epítopo particular.
O termo "anticorpo humano" ou "anticorpo de seqüência humana", conforme aqui utilizado, pretende incluir anticorpos que possuem regiões variáveis nas quais tanto as regiões estruturais como as regiões CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Além disso, se o anticorpo tiver uma região constante, a região constante também é derivada de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir modificações posteriores, incluindo modificações naturais ou sintéticas. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana (ex: mutações introduzidas por metagênese aleatória ou sítio-específicas in vitro ou através de mutação somática in vivo). Porém, o termo "anticorpo humano", conforme aqui utilizado, não pretende incluir anticorpos nos quais as seqüências CDR derivadas da linha germinal, de outras espécies de mamíferos, tal como um camundongo, foi enxertado em seqüências estruturais humanas.
O termo "anticorpo monoclonal humano", que pode incluir o termo "seqüência" após "humano", refere-se a anticorpos que exibem uma especificidade de ligação simples que possuem regiões variáveis nas quais tanto as regiões estruturais como as regiões CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em uma configuração, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não-humano transgênico, como por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene humano de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humano fundido com uma célula imortalizada.
O termo "anticorpo recombinante humano", conforme aqui utilizado, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressados, criados ou isolados através de meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (ex: um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado com o mesmo (descrito abaixo), (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de um banco de anticorpo humano recombinante, combinatorial e, (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de quaisquer outros meios que envolvem alinhamento de seqüências gênicas de imunoglobulina humana com outras seqüências de DNA. Tais anticorpos recombinantes humanos possuem regiões variáveis nas quais as regiões estruturais e CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em certas configurações, porém, tais anticorpos recombinantes humanos podem ser submetidos a mutagênese in vitro (ou quando for utilizado um animal transgênico para seqüências Ig humana, mutagênese somática in vivo) e, assim as seqüências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que, embora derivadas de e relacionadas com seqüências VL e VL de linha germinal humana, não podem existir naturalmente dentro do repertório de linha germinal de anticorpo humano in vivo.
Conforme aqui utilizado, "isotipo" refere-se à classe de anticorpo (ex: IgM ou IgGl) que é codificada pelos genes da região constante de cadeia pesada.
As frases "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são utilizadas intercaladamente aqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".
O termo "derivado de anticorpo humano" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humano, por exemplo, um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo.
O termo "anticorpo humanizado" pretende referir-se a anticorpos nos quais as seqüências CDR derivadas da linha germinal de outra espécie de mamífero, tal como, um camundongo, foi enxertado em seqüências estruturais humanas. Modificações adicionais da região estrutural podem ser feitas dentro das seqüências estruturais humanas.
O termo "anticorpo quimérico" pretende se referir aos anticorpos nos quais as seqüências de região variável são derivadas de uma espécie e as seqüências de região constante são derivadas de outra espécie, tal como um anticorpo, no qual às seqüências de região variável são derivadas de um anticorpo de camundongo e as seqüências de região constante são derivadas de um anticorpo humano. Conforme aqui utilizado, um anticorpo que "liga-se especificamente ao 08E humano" pretende referir-se a um anticorpo que se liga ao 08E humano com um K0 de 1 χ IO"7 M ou menos, mais preferivelmente 5 χ IO-8M ou menos, mais preferivelmente 3 χ IO"8 M ou menos, mais pref erivelmente 1 χ IO"9 M ou menos, ainda mais preferivelmente entre 5 χ IO"9 M ou menos.
O termo wnão substancialmente ligado" a uma proteína ou células, conforme utilizado aqui, significa não estar ligado ou não se ligar com uma alta afinidade a uma proteína ou célula, ou seja, ligar-se à proteína ou célula com um K0 de 1 χ IO"6 M ou mais, mais preferivelmente, 1 χ IO"5 M ou menos, mais preferivelmente de 1 χ IO"4 M ou mais, mais preferivelmente de 1 χ IO"3 M ou mais, ainda mais preferivelmente, 1 χ IO"2 M ou mais.
O termo "KaSsoc" ou "Ka", conforme aqui utilizado, pretende se referir a taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno específica, ao passo que o termo "KdIs" ou "Ka" conforme aqui utilizado, pretende se referir à taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno específica. O termo "KD" conforme aqui utilizado, pretende se referir à constante de dissociação, que é obtida da relação de Kd para Ka (ou seja, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M) . Valores Kd para anticorpos podem ser determinados utilizando-se métodos estabelecidos no estado da técnica. Um método preferido para determinar o K0 de um anticorpo consiste em utilizar ressonância de plásmon de superfície, preferivelmente, utilizando um sistema biosensor tal como um sistema Biacore®.
Conforme aqui utilizado, o termo "alta afinidade" por um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo com um Kd de Ix 10"7 M ou menos, mais preferivelmente 5 χ 10"8 M ou menos, mais tipicamente 1 χ 10"9 M ou menos, e ainda mais preferivelmente 5 χ 10"9 M ou menos, para um antígeno alvo. Porém, a ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, ligação de "alta afinidade" por um isotipo IgM refere-se a um anticorpo com um Kd de 10"6 M ou menos, mais preferivelmente 10"7 M ou menos, ainda mais preferivelmente 10-8 M ou menos.
Conforme aqui utilizado, o termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não-humano. 0 termo "animal não-humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não-mamí feros, tais como primatas não- humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, frangos, anfíbios, peixes, répteis, etc.
Como utilizado aqui, o termo "08E" é utilizado sinonimamente com os termos "B7H4", "B7S1" e "B7x", estes termos aparecem várias vezes na literatura científica. A seqüência de aminoácidos de 08E (B7H4) está em domínio público, com referência ao número de acesso do GenBank Nos.: AAZ174 06, AAS13400, AAP37283, CAI12739 e CAI12737 e por referência a Prasad et al. , (2003) "Immunity", 18:863-873; Sica et al. , (2003), "Immunity", 18:849-861; e na Patente U.S. No.: 6,891,030 cada um dos quais sendo incorporado aqui por referência em sua íntegra.
Diversos aspectos do relatório são descritos em maiores detalhes nas subseções seguintes.
Anticorpos anti-O8E
Os anticorpos desta invenção são caracterizados por características funcionais particulares ou propriedades dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos se ligam especificamente ao 08E humano. Tipicamente, um anticorpo esta descrição liga-se ao 08E com alta afinidade, por exemplo, com um K0 de 1 χ 10-7 M ou menos. Os anticorpos anti-08E desta invenção apresentam tipicamente uma ou mais das seguintes características:
(a) liga-se ao 08e humano com um Kd de 1 χ 10-7 M ou menos;
(b) liga-se as células CHO humana transfectadas com O8E. Tipicamente, o anticorpo liga-se ao O8e humano com um Kd de 5 χ 10-8 M ou menos, liga-se ao O8E humano com um Kd de 2 χ 10-8 M ou menos, liga-se ao O8e humano com um Kd de 5 χ 10-9 M ou menos, liga-se ao O8E com um Kd de 4 χ 10-9 M ou menos, liga-se ao O8E humano com um Kd de 3 χ 10-9 M ou menos, liga-se ao O8E humano com um Kd de 2 χ 10-9 M ou menos, ou liga-se ao 08E humano com um KD de 1 x 10"9 M ou menos.
Os ensaios padrões para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos em relação ao 08e são conhecidos da técnica, incluindo, por exemplo, ELISAs, Western blots, RIAs e Análise de citometria de fluxo. Os ensaios apropriados estão descritos em detalhes nos Exemplos. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos também pode ser analisada por ensaios padrões conhecidos da técnica, tais como Análise de sistema por ELISA, Scatchard e Biacore®. Como um outro exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ligar- se a uma linha de célula de tumor de carcinoma de mama, por exemplo, a linha de célula SKBR3.
Anticorpos monoclonais IG11, 2A7, 12E1 e 13D12 Exemplos de anticorpos desta invenção incluem os anticorpos monoclonais humanos IG11, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 isolados e caracterizados estruturalmente como descrito nos Exemplos 1 e 2. As seqüências de aminoácidos de Vh de IG11, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 estão mostrados na SEQ.ID.NOs: 1, 2, 3, 4 e 5, respectivamente. As seqüências de aminoácidos de VL de IG11, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 estão demonstradas na SEQ.ID.Nos: 6, 7, 8, 9 e 10, respectivamente.
Considerando que cada um destes anticorpos pode ser ligar ao O8E, as seqüências de VH e VL podem ser "misturadas e combinadas" para criar outras moléculas de ligação anti- 08e desta invenção. A ligação de 08E dos referidos anticorpos "misturados e combinados" podem ser testados usando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, FACS ou ELISAs). Tipicamente, quando cadeias VH e VL são misturadas e combinadas, uma seqüência Vh de um par de VH/VL particular é substituída com uma seqüência V11 estruturalmente similar. De outro modo, tipicamente uma seqüência VL de um emparelhamento VH/VL particular é substituída com uma seqüência VL estruturalmente similar. Consequentemente, em um aspecto, esta invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.Nos: 1, 2, 3, 4 e 5; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.Nos: 6, 7, 8, 9 e 10; de modo que o anticorpo se liga especificamente ao 08E, o 08E tipicamente humano. Combinações preferidas da cadeia leve e da cadeia pesada incluem:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 1, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 6; ou
(b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 2, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 7; ou
(c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 3, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 8;
(d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 4, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 9; ou
(e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 5, e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 10.
Um outro aspecto, esta invenção provê anticorpos que compreende a cadeia pesada e a cadeia leve, CDRls, CDR2s e CDR3s de IGll, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 ou combinações dos mesmos. As seqüências de aminoácidos de Vh CDRls de IGll, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 estão demonstradas nas SEQ.ID.Nos: 11, 12, 13, 14 e 15, respectivamente. As seqüências de aminoácidos de VH CDR2s de 1G11, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 estão demonstradas nas SEQ.ID.Nos: 16, 17, 18, 19 e 20, respectivamente. As seqüências de aminoácidos de VH CDR3s de 1G11, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 estão demonstradas nas SEQ.ID.Nos: 21, 22, 23, 24 e 25, respectivamente. As seqüências de aminoácidos de Vk CDR1s de 1G11, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 estão demonstradas nas SEQ.ID.Nos: 26, 27, 28, 29 e 30, respectivamente. As seqüências de aminoácidos de Vk CDR2s de 1G11, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 estão demonstrados nas SEQ.ID.Nos: 31, 32, 33, 34 e 35, respectivamente. As seqüências de aminoácidos de Vk CDR3s de 1G11, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 estão demonstrados nas SEQ.ID.Nos: 36, 37, 38, 39 e 40, respectivamente. As regiões CDR são delineadas usando o sistema Kabat (Kabat, Ε. A., et al., (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Edition, U.S. Departamento de Saúde e Serviços Humanos, NIH Publicação No. 91-3242).
Cada uma das seqüências de aminoácidos e de ácidos nucléicos citada acima, dos anticorpos humanos designados aqui, como 1G11, 2 A7, 2F9, 12E1 e 13D12 estão apresentados na tabela 1 a seguir e na Listagem de Seqüências. Tabela 1
<formula>formula see original document page 29</formula> <table>table see original document page 30</column></row><table> <table>table see original document page 31</column></row><table> <table>table see original document page 32</column></row><table> <table>table see original document page 33</column></row><table> <table>table see original document page 34</column></row><table> <table>table see original document page 35</column></row><table> <table>table see original document page 36</column></row><table> <table>table see original document page 37</column></row><table> <table>table see original document page 38</column></row><table> <table>table see original document page 39</column></row><table> <table>table see original document page 40</column></row><table> <table>table see original document page 41</column></row><table> <table>table see original document page 42</column></row><table> Dado que cada um desses anticorpos humanos designados IGll, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 podem ligar-se ao 80E e que a especificidade de ligação ao antígeno é provida primariamente pelas regiões CDRl, CDR2 e CDR3, as seqüências Vh de CDRl, CDR2 e CDR3, e as seqüências Vk de CDRl, CDR2 e CDR3 pode ser "misturadas e combinadas" (ou seja, CDRs diferentes dos anticorpos podem ser misturados e combinados, apesar que cada um dos anticorpos deve conter uma Vh de CDRl, CDR2 e CDR3 e uma Vk de CDRl, CDR2 e CDR3) para criar outras moléculas de ligação ao anti- 08E da invenção. A ligação ao 08E de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada utilizando-se os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (ex: sistemas de análises FACS, ELISAs, Biacore®).
Preferivelmente, quando as seqüências Vh CDR são misturadas e combinadas, as seqüências CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência Vh particular é substituída com uma seqüência CDR estruturalmente similar. Da mesma forma, quando as seqüências Vk CDR são misturadas e combinadas, as seqüências CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência Vk particular é substituída com uma seqüência CDR estruturalmente similar. Deverá ser facilmente aparente aos técnicos no assunto que as novas seqüências Vh e Vl podem ser criadas por substituição de uma ou mais seqüências das regiões CDR de Vh e/ou Vl com seqüências estruturalmente similares das seqüências CDR descritas aqui para os anticorpos monoclonais IGll, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12.
Conseqüentemente, em um outro aspecto, esta invenção provê um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo compreendendo:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs: 11, 12, 13, 14 e 15;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19 e 20; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24 e 25;
(d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29 e 30;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 31, 32, 33, 34 e 35; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39 e 40; sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E, preferivelmente o 08E humano.
Em uma configuração preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 11;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 16;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 21;
(d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 26;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 31; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 36.
Em outra configuração preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 12;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 17;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 22;
(d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 27;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 32; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 37.
Em outra configuração preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDR1 de região variável cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 13;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 18;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 23;
(d) uma CDR1 de região variavel de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 28;
(e) uma CDR2 de região variavel de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 33; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 38.
Em outra configuração preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 14;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 19;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 24;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 29;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 34; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 39.
Em outra configuração preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 15;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 20;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 25;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 30;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 35; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 40.
É bastante conhecido no estado da técnica que o domínio CDR3, independentemente do(s) domínio(s) CDRl e/ou CDR2, isoladamente pode determinar a especificidade de ligação de um anticorpo por ura antígeno cognato e que anticorpos múltiplos podem previsivelmente ser produzidos tendo a mesma especificidade de ligação baseada em uma seqüência CDR3 comum. Ver, por exemplo, Klimka et al., British J. of Câncer 83_(2) :252-260 (2000) (descrevendo a produção de um anticorpo anti-CD30 humanizado utilizando apenas o domínio variável de cadeia pesada CDR3 de anticorpo anti- CD30 murino Ki-4); Beiboer et al.,J.Mol.Biol. 296:833-849 (2000) (descrevendo anticorpos de glicoproteína-2 epitelial recombinante (EGP-2) anticorpos utilizando apenas a seqüência CDR3 de cadeia pesada do anticorpo anti- EGP-2 MOC-31 murino parental) ; Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:8910-8915 (1998) (descrevendo um painel de anticorpos av/33 anti - integrina humanizados utilizando um domínio CDR3 variável de cadeia leve e pesada de um anticorpo LM609 αν/33 anti-integrina murino, sendo que cada anticorpo membro compreende uma seqüência distinta fora do domínio CDR3 e capaz de ligar o mesmo epítopo como o anticorpo murino parental com afinidades tão altas ou mais altas que o anticorpo murino parental); Barbas et al., J. Am. Chem. Soe. 116:2161-2162 (1994) (revelando que o domínio CDR3 provê a contribuição mais significativa para ligação ao antígeno); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 92:2529-2533 (1995) (descrevendo o enxerto de seqüências CDR3 de cadeia pesada de três Fabs (SI-1, SI-40 e SI-32) contra DNA placentário humano sobre a cadeia pesada de um Fab toxóide anti-tetânico, substituindo assim a CDR3 de cadeia pesada existente e demonstrando que o domínio CDR3 isoladamente conferiu a especificidade de ligação); e Ditzel et al., J. Immunol., 157-739-749 (1996) (descrevendo estudos de enxerto em que a transferência apenas de CDR3 de cadeia pesada de um Fab LNA3 poli- específico parental para uma cadeia pesada de um anticorpo Fab p313 ligante ao toxóide tetânico IgG mono- específico foi suficiente para reter a especificidade de ligação do Fab parental) . Cada uma dessas referências é aqui incorporada por referência em sua íntegra. Conseqüentemente, em certos aspectos, a presente invenção provê anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não-humano, tal como um anticorpo de rato ou de camundongo, sendo que o anticorpo monoclonal é capaz de ligar-se especificamente ao O8E. Dentro de determinadas configurações, a presente invenção provê anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia leve e/ou pesada a partir de anticorpos não- humanos, que (a) são capazes de competir para ligação com; (b) mantém as características funcionais; (c) ligam- se ao mesmo epítopo; e/ou (d) possuem uma afinidade de ligação similar à do anticorpo parental não-humano correspondente.
Dentre outros aspectos, a presente invenção provê anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um primeiro anticorpo humano, tal como, por exemplo, um anticorpo humano obtido de um animal não-humano, sendo que o anticorpo humano é capaz de ligar-se especificamente ao O8E. Em outros aspectos, a presente invenção provê anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve a partir de um primeiro anticorpo humano (a) capaz de competir por ligação com; (b) manter as características funcionais; (c) ligar-se ao mesmo epítopo; e/ou (d) possuir uma afinidade de ligação similar à afinidade de ligação como a do primeiro anticorpo humano parental correspondente. Anticorpos tendo Seqüências de Linha Germinal particulares
Em determinadas configurações, um anticorpo desta invenção compreende uma região variável de cadeia pesada a partir de um gene de imunoglobulina de cadeia pesada de linha germinal particular e/ou uma região variável de cadeia leve de um gene de imunoglobulina de cadeia leve de linha germinal particular.
Por exemplo, em uma configuração preferida, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene Vh 4-34 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E. Em outra configuração preferida, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene Vh 3-53 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E. Ainda, em outra configuração preferida, esta invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene Vh 3-9/D3- 10/JH6b humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E.
Em outra configuração preferida, esta invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene Vk A27, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E. Em outra configuração preferida ainda, esta invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene Vk L6/JK1 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E.
Ainda, em outra configuração preferida, esta invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo:
(a) compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene Vh 4-34 humano um gene Vh 3-53 ou um gene Vh 3 - 9/D3 -10/JH6b humano combinado (que codifica as seqüências de aminoácidos representadas nas 3EQ.ID.NOs: 51, 52 e 53, respectivamente);
(b) compreende uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene Vk A2 7, ou um gene Vk L6/JK1 humano combinado (que codifica as seqüências de aminoácido representadas nas SEQ.ID.NOs: 54 e 55, respectivamente); e
(c) o anticorpo que se liga especificamente ao 08E, particularmente, o 08E humano.
Exemplos de anticorpos tendo Vh e Vk de Vh 4-34 e Vk A2 7, respectivamente são IGll e 13D12. Exemplos de anticorpos tendo Vh e Vk de Vh de 3-53 e Vk A2 7, respectivamente, são 2A7 e 2F9. Um exemplo de anticorpo tendo Vh e Vk de Vh 3- 9/D3-10/JH6b e Vk L6/JK1, respectivamente é 12E1.
Conforme aqui utilizado, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve que é "o produto de" ou "derivado de" uma seqüência de linha germinal particular se as regiões variáveis do anticorpo forem obtidas de um sistema que utiliza genes de imunoglobulina de linha germinal humana. Tais sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico portando genes de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou identificar um banco de gene de imunoglobulina humana exibindo um fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é "produto de" ou "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina de linha germinal humana pode ser identificado como tal comparando-se a seqüência de aminoácidos do anticorpo humano com as seqüências de aminoácidos de imunoglobulinas de linha germinal humana e selecionando-se a seqüência de imunoglobulina de linha germinal humana que está mais próxima em seqüência (ou seja, com a maior % de identidade) da seqüência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina de linha germinal humana particular pode conter diferenças de aminoácidos se comparada com a seqüência de linha germinal, devido a, por exemplo, a mutações somáticas de ocorrência natural ou a introdução intencional de mutação sítio-direcionada. Porém, um anticorpo humano selecionado é tipicamente pelo menos 90% idêntico em seqüência de aminoácidos a uma seqüência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina de linha germinal humana e contém resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com as seqüências de aminoácido de imunoglobulina de linha germinal de outras espécies (ex: seqüências de linha germinal de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95%, ou ainda pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico em seqüência de aminoácidos à seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinal. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma seqüência de linha germinal humana particular poderá exibir não mais que 10 aminoácidos diferentes da seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinal.
Em certos casos, o anticorpo humano pode apresentar não mais que 5 ou ainda não mais que 4, 3, 2 ou 1 aminoácidos diferentes daquela seqüência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina de linha germinal.
Anticorpos Homólogos
Em outra configuração ainda, um anticorpo desta invenção compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo seqüências de aminoácidos que são homólogas às seqüências de aminoácido dos anticorpos preferidas aqui descritas, e sendo que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-08E da invenção.
Por exemplo, esta invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, sendo que:
(a) a região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga à
seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ.ID.NOs: 1, 2, 3, 4 e 5;
(b) a região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga à seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs: 6, 7, 8, 9 e 10;
(c) o anticorpo liga-se ao 08E humano com um Kd de 1 χ 10-7 M ou menos; e
(d) o anticorpo liga-se as células CHO humanas transfectadas com 08E.
Em várias configurações, o anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.
Em outra configuração, as seqüências de aminoácido Vh e/ou Vl podem ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogas às seqüências acima citadas. Um anticorpo tendo regiões Vh e Vl com alta homologia (ou seja, de 80% ou mais) com as regiões Vh e Vl das seqüências acima citadas, pode ser obtido através de mutagênese (ou seja, mutagênese sítio-direcionada ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucléico codificando SEQ.ID.NOs: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50, seguido pelo teste do anticorpo codificado alterado quanto às funções retidas (ou seja, as funções representadas em (c) e (d) acima), usando os ensaios funcionais descritos aqui.
Conforme aqui utilizada, a homologia percentual entre as seqüências de aminoácidos é equivalente ao percentual de identidade entre as duas seqüências. O percentual de identidade entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (ou seja, % homologia # de posições idênticas/total de # posições χ 100), levando em consideração o número de espaços ("gaps") e a extensão de cada espaço, que precisam ser introduzidos para um alinhamento ótimo das duas seqüências. A comparação das seqüências e a determinação do percentual de identidade, entre as duas seqüências, podem ser realizadas utilizando-se um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não restritivos abaixo.
0 percentual de identidade entre as duas seqüências de aminoácidos pode ser determinado utilizando-se o algoritmo de E.Meyers e W.Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), utilizando a tabela de resíduo de peso PAM12 0, uma penalidade de extensão de espaços de 12 e uma penalidade por inserção de espaço de 4. Além disso, o percentual de identidade entre as duas seqüências de aminoácidos pode ser determinado utilizando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch (J.Mol.Biol.48 : 444-453 (1970) ) que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software CGC (disponível em www.gcg.com), utilizando ou uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM2 50 e um peso de espaço de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de extensão de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.
Adicional ou alternativamente, as seqüências de proteína da presente descrição podem ser ainda utilizadas como "seqüência de pesquisa/consulta ("query")" para realizar uma busca em bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar seqüências relacionadas. Tais buscas podem ser efetuadas utilizando-se o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al.(1990) J.Mol.Biol., 215:403-10.
As buscas BLAST de proteína podem ser efetuadas com o programa XBLAST, escore =50, extensão de palavra = 3 para obter seqüências de aminoácido homólogas às moléculas de anticorpo desta invenção. Para obter alinhamentos com espaços para fins de comparação, o "Gapped BLAST" pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25 (17) :3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e "Gapped BLAST", podem ser utilizados os parâmetros de valor padrão dos respectivos programas (ex: XBLiAST e NBLAST) . Vide HTTP ://www. ncbi . nlm.nih. gov. Anticorpos com Modificações Conservativas
Em certas configurações, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, sendo que uma ou mais dessas seqüências CDR compreendem seqüências de aminoácido especificadas com base nos anticorpos preferidos aqui descritos (ex: 1G11, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12) ou suas modificações conservativas, e sendo que os anticorpos mantêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-08E da invenção. Conseqüentemente, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, onde: (a) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ. ID. NOs: 21, 22, 23, 24 e 25, e suas modificações conservat ivas;
(b) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüência de aminoácidos de SEQ. ID.NOs: 36, 37, 38, 39 e 40 e suas modificações conservativas;
(c) o anticorpo liga-se ao 08E humano, com um K0 de 1 x 10"7 M ou menos; e
(d) o anticorpo liga-se às células CHO humana transfectadas com 08E.
Em uma configuração preferida, a seqüência CDR2 da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ.ID.NOs: 16, 17, 18, 19 e 20 e suas modificações conservativas; e a seqüência CDR2 da região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ.ID.NOS: 31, 32, 33, 34 e 35 e suas modificações conservativas. Em outra configuração preferida, a seqüência CDRl da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüências de aminoácidos de SEQ.ID.NOs: 11, 12, 13, 14 e 15, e suas modificações conservativas; e a seqüência CDRl da região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ.ID.NOs: 26, 27, 28, 29 e 30 e suas modificações conservativas. Em várias configurações, o anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou anticorpos quiméricos.
Conforme aqui utilizado, o termo "modificações conservativas de seqüência" pretende referir-se a modificações de aminoácidos que não afetam nem alteram significativamente as características de ligação do anticorpo contendo a seqüência de aminoácidos. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo desta invenção através de técnicas padrão conhecidas no estado da técnica, tais como mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediada por PCR. Substituições conservativas de aminoácidos são aquelas em que o resíduo aminoácido ê substituído por um resíduo aminoácido que possui uma cadeia lateral similar.
Famílias de resíduos aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas no estado da técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (ex: lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (ex: ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (ex: glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não-polares (ex: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais com ramificação beta (ex: treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (ex: tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um ou mais resíduos aminoácido dentro das regiões CDR de um anticorpo desta invenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado quanto à função retida.
Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo como anticorpos anti-08E desta invenção
Em outra configuração, a invenção provê anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo em 08E humano como qualquer um dos anticorpos monoclonais 08E desta invenção (ou seja, anticorpos que possuem a capacidade de fazer competição cruzada para ligar-se ao 08E com qualquer um dos anticorpos monoclonais da invenção). Em configurações preferidas, o anticorpo de referência para estudos de competição cruzada pode ser o anticorpo monoclonal IGll (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ.ID.NOs: 1 e 6, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 2A7 (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ.ID.NOs: 2 e 7, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 2F9 (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ.ID.NOs: 3 e 8, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 12E1 (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ.ID. NOs: 4 e 9 respectivamente) , ou o anticorpo monoclonal 13D12 (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ.ID.NOs:5 e 10, respectivamente). Tais anticorpos de competição cruzada podem ser identificados com base em sua capacidade de fazer competição cruzada com IGll, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12 em ensaios padrão de ligação ao 08E.
Por exemplo, o sistema de análise BIAcore®, ensaios ELISA ou a citometria de fluxo podem ser usados para demonstrar a competição cruzada com os anticorpos da presente invenção. A capacidade de um anticorpo de teste inibir a ligação de, por exemplo, IGll, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12 ao 08E humano demonstra que o anticorpo de teste pode competir com IGll, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12 para ligar-se ao 08E humano e assim liga-se ao mesmo epítopo em 08E humano como IGll, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12. Em uma configuração preferida, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em 08E humano como IGll, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12 é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados conforme descrito nos Exemplos. Anticorpos Construídos e Modificados
Um anticorpo desta invenção pode ser ainda preparado utilizando-se um anticorpo que possua uma ou mais das seqüências Vh e/ou Vl aqui descritas pode ser usado como material de partida para construir um anticorpo modificado que pode ter propriedades alteradas em relação ao anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser construído modificando-se um ou mais resíduos dentro de uma ou de ambas as regiões variáveis (ou seja, Vh e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões estruturais. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser construído modificando-se resíduos dentro da região(s) constante (s), por exemplo, para alterar a função(ões) efetora(s) do anticorpo.
Um tipo de construção em região variável que pode ser realizada é o enxerto em CDR. Os anticorpos interagem com os antígenos alvo predominantemente através de resíduos aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada e leve. Por essa razão, as seqüências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as seqüências fora das CDRs. Uma vez que as seqüências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antigeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades de anticorpos específicos de ocorrência natural construindo-se vetores de expressão que incluam seqüências CDR do anticorpo específico de ocorrência natural enxertado nas seqüências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L.et al. (1998) Nature 332:323- 327; Jones, P. et al.(1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad., Ver U.S.A. 86:10029- 10033; Patente americana No.: U.S. 5,225,539 para Winter, e as Patentes americanas Nos. U.S. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 e 6,180,370 a Queen et al.').
Conseqüentemente, uma outra configuração esta invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou a uma porção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende seqüências CDRl, CDR2, e CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ. ID. NOs: 11, 12, 13, 14 e 15, SEQ.ID.NOS: 16, 17, 18, 19 e 20, e SEQ.ID.NOs: 21, 22, 23, 24 e 25, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve compreendendo seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs: 26, 27, 28, 29 e 30, SEQ.ID.NOs: 31, 32, 33, 34 e 35, e SEQ.ID.NOs: 36, 37, 38, 39 e 40, respectivamente. Assim, tais anticorpos contêm as seqüências CDR Vh e Vl de anticorpos monoclonais IGll, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12, podendo ainda conter seqüências estruturais diferentes desses anticorpos.
Tais seqüências estruturais podem ser obtidas de bancos de dados públicos de DNA ou de referências publicadas que incluam seqüências gênicas de anticorpos de linha germinal. Por exemplo, as seqüências de DNA de linha germinal para genes humanos da região variável de cadeia pesada e leve podem ser encontradas no banco de dados de seqüência de linha germinal humana "VBase" (disponível na internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, E.A. et al.(1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91- 3242; Tomlinson, I.M.,et al.(1992) "The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol., 227:776-798; e Cox, J.P.L.et al. (1994) "A Directory of Human Germ-Iine Vh Segments Reveals a Strong Bias in Their Usage", Eur. J. Immunol., 2A_·. 827-836; cujo conteúdo de cada um foi aqui expressamente incorporado por referência. Como um outro exemplo, as seqüências de DNA de linha germinal para os genes de regiões variáveis de cadeias pesadas e leves podem ser encontradas em bancos de dados de seqüências Genbank. Por exemplo, as seqüências da linha germinal de cadeia pesada encontrada no camundongo HCo7 HuMAb, estão disponíveis no Genbank acompanhando os números de acesso: 1-69 (NG_0010109, NT_024 63 7 e BC070333), 3-33 (NG_0010109 e NT_024637) e 3- 7 (NG_0010109 e N_024637). Como um outro exemplo, as seqüências de cadeia pesada de linha germinal a seguir encontradas em camundongos Hcol2 HuMAb estão disponíveis em bancos de seqüências GenBank acompanhando os números de acesso: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 5-51 (NG_0010109 e NT_024637) , 4-34 (NG_0010109 e NT-24637), 3-30,3 (CAJ556644) e 3-23 (A-J406678).
Seqüências das proteínas dos anticorpos são comparadas com um banco de dados de seqüencias de proteínas compiladas usando um método de pesquisa de seqüências por similaridade denominado "Gapped BLAST" (Altschul et al., (1997), wNucleic Acids Research" 25:3389-3402), que é bem conhecido do testado da técnica. BLAST é um algoritmo heurístico no qual um alinhamento estatisticamente significante entre as seqüencias de anticorpo e a seqüência do banco de dados é provável conter pares de segmentos com alta afinidade (HSP) de partes alinhadas.
Os pares de segmentos que se classificam não podem ser melhorados por extensão ou por acompanhamento é denominado de nhit". Resumidamente, as seqüências de nucleotídeos de origem VBASE (http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.php) são transladadas e a região entre e incluindo as regiões estruturais de FRl até FR3 são retidas. As seqüências da base de dados têm um comprimento médio de 98 resíduos. As seqüências em duplicata que são combinações exatas em relação comprimento total da proteína são removidas. Uma busca BLAST para proteínas usando o programa Blastp com parâmetros de falha, padrões, com exceção do filtro de baixa complexidade, que é fechado/desligado, e a matriz de substituição de BLOSUM62, filtros para as 5 "hits" de topo resultantes das seqüências combinadas. As seqüências de nucleotídeos são transladadas em todas as seis estruturas e a estrutura com ou sem os códons de parada no segmento combinado da seqüência da base de dados é considerada um hit potencial. Isto está em confirmação com a utilização do programa tblastx de BLAST, que translada a seqüência do anticorpo em todas as seis estruturas e compara com àquelas translações das seqüências de nucleotídeos VBASE transladados dinamicamente em todas as seis estruturas.
A identidade são combinações de aminoácidos exatas entre a seqüência de anticorpo e a base de dados de proteína dobre a extensão completa da seqüência. Os positivos (identidade + combinação por substituição) não são idênticos, mas as substituições dos aminoácidos são guiadas pela matriz de substituição BLOSUM62. Se a seqüência de aminoácidos combinar com duas seqüências da base de dados com a mesma identidade, o hit com mais positivos será decidido por ser um hit da seqüência combinada.
Seqüências estruturais preferidas para uso nos anticorpos desta invenção são estruturalmente similares às seqüências estruturais utilizadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo, similares às seqüências estruturais Vh 4-34 (SEQ.ID.NO:51) e/ou as seqüências estruturais Vh 3-53 (SEQ.ID.NO:52) e/ou as seqüências estruturais combinadas Vh 3-9/D3-10/JH6b (SEQ.ID. NO:53) e/ou as seqüências estruturais Vk A27 (SEQ.ID.NO:54), e/ou as seqüências estruturais combinadas Vk L6/JK1 (SEQ.ID.NO.:55) , utilizadas por anticorpos monoclonais preferidos desta invenção. As seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 Vh e as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 Vk podem ser enxertadas em regiões estruturais que possuam a seqüência idêntica à encontrada no gene de imunoglobulina de linha germinal do qual deriva a seqüência estrutural, ou as seqüências de CDR podem ser enxertadas em regiões estruturais que contenham uma ou mais mutações se comparadas com as seqüências de linha germinal. Por exemplo, descobriu-se que em certos casos, é benéfico alterar resíduos dentro das regiões estruturais para manter ou aumentar a capacidade de ligação do anticorpo ao antígeno (vide, por exemplo, as patentes americanas U.S 5,53 0,101; U.S. 5,585,089; U.S. 5,693,762 e U.S. 6,180,370 para Queen et al).
Outro tipo de modificação na região variável consiste em mutar os resíduos aminoácidos dentro das regiões CDRl, CDR2 e/ou CDR3 Vh e/ou Vk melhorando, assim, uma ou mais propriedades de ligação (ex: afinidade) do anticorpo de interesse. A mutagênese sítio-direcionada ou a mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito sobre a ligação ao anticorpo, ou em outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliada em ensaios in vitro ou in vivo, conforme aqui descrito e fornecido nos Exemplos. São introduzidas modificações conservativas preferidas (conforme discutido acima). As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácidos, porém, são preferivelmente substituições. Além disso, tipicamente não são alterados mais que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR.
Conseqüentemente, em outra configuração, a invenção provê anticorpos monoclonais anti-08E isolados ou porções ligantes ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma região CDRl Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs:11, 12, 13, 14 ou 15, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido, se comparada com as SEQ.ID.NOs: 11, 12, 13, 14 ou 15; (b) uma região CDR2 Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de.SEQ.ID.NOS: 16, 17, 18, 19 e 20, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, se comparada com as SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19 e 2 0; (c) uma região CDR3 Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs: 21, 22, 23, 24 e 25, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos se comparada com SEQ.ID.NOs: 21, 22, 23, 24 e 25; (d) uma região CDRl Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs: 26, 27, 28, 29 e 30, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos se comparada com SEQ.ID.NOs: 26, 27, 28, 29 e 30; (e) uma região CDR2 Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs: 31, 32, 33, 34 e 35, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, se comparada com SEQ.ID.NOS: 31, 32, 33, 34 e 35; e (f) uma região CDR3 Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs: 36, 37, 38, 39 e 40, ou uma seqüência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, se comparada com SEQ.ID.NOS: 36, 37, 38, 39 e 40.
Anticorpos construídos da invenção incluem aqueles cujas modificações foram efetuadas em resíduos estruturais em VH e/ou VK( por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações estruturais são feitas para reduzir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, um método consiste em fazer retro-mutação ("backmutate") em um ou mais resíduos estruturais para a seqüência de linha germinal correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que tiver sido submetido à mutação somática poderá conter resíduos estruturais que diferem da seqüência da linha germinal da qual deriva o anticorpo. Tais resíduos podem ser identificados comparando-se as seqüências estruturais do anticorpo com as seqüências de linha germinal da qual deriva o anticorpo.
Por exemplo, para IGll, o resíduo de aminoácido #71 (dentro de FR3) de Vh é uma alanina sendo que este resíduo na seqüência de linha germinal Vh 4-34 correspondente é uma valina. Para retornar as seqüências de região estrutural para sua configuração de linha germinal, às mutações somáticas podem ser retro-mutadas ("backmutated") para a seqüência de linha germinal, por exemplo, através de mutagênese sítio-direcionada ou mediada por PCR (ex: resíduo #71 de FR3 de Vh de IGll podem ser retro-mutadas de alanina para valina) . Tais anticorpos "retro-mutados" também estão abrangidos por esta invenção
Como outro exemplo, para IGll, o resíduo aminoácido #81 (dentro de FR3) de Vh é uma arginina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal Vh 4-34 correspondente é uma lisina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #81 de FR3 da Vh de IGll pode ser retro-mutado ("backmutated") de arginina para lisina. Os referidos anticorpos "retro-mutados" também pretendem estar dentro do escopo de proteção desta invenção.
Como outro exemplo, para 13D12, o resíduo aminoácido #83 (dentro de FR3) de Vh é uma asparagina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal Vh 4-34 correspondente é uma serina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #83 de FR3 de Vh de 13D12 pode ser retro-mutado de asparagina para serina. Os referidos anticorpos retro-mutados também estão abrangidos por esta invenção.
Como outro exemplo, para 2A7, o resíduo aminoácido #67 (dentro de FR3) de Vh é uma valina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal Vh 3-53 correspondente é uma fenilalanina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #67 de FR3 de Vh de 2A7 pode ser retro-mutado de lisina para fenilalanina.
Os referidos anticorpos "retro-mutados" estão abrangidos por esta invenção.
Como outro exemplo, para 2F9, o resíduo aminoácido #2 8 (dentro de FRl) de Vh é uma isoleucina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal Vh 3-53 correspondente é uma treonina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #2 8 de FRl de Vh de 2A7 pode ser retro-mutado de serina para treonina. Os referidos anticorpos "retro-mutados" estão abrangidos por esta invenção.
Como outro exemplo, para 12E1, o resíduo aminoácido #23 (dentro de FRl) de Vh é uma valina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal Vh 3-9 correspondente é uma alanina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #23 de FRl de Vh de 12E1 pode ser retro-mutado de leucina para alanina. Os referidos anticorpos "retro-mutados" estão abrangidos por esta invenção.
Como outro exemplo, para IGll, o resíduo aminoácido #7 (dentro de FRl) de Vh é uma fenilalanina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal Vk A2 7 correspondente é uma serina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #7 de FR1 de VH de 1G11 pode ser retro-mutado de arginina para serina. Os referidos anticorpos "retro-mutados" estão abrangidos por esta invenção.
Como outro exemplo, para 1G11, o resíduo aminoácido #47 (dentro de FR2) de Vk é uma leucina, sendo que esse resíduo na seqüência de linha germinal Vk A2 7 correspondente é uma leucina. Para retornar as seqüências da região estrutural à sua configuração de linha germinal, por exemplo, o resíduo #27 de FR2 de Vk de 1G11 pode ser retro-mutado de treonina para leucina. Os referidos anticorpos "retro-mutados" estão abrangidos por esta invenção.
Outros tipos de modificação estrutural envolvem mutar um ou mais resíduos dentro da região estrutural, ou até mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover os epítopos de célula T para assim reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esse método é também designado "desimunização" e está descrito em maiores detalhes na publicação de patente americana No. 2003/0153043 por Carr et al.
Os anticorpos construídos da presente invenção também incluem àqueles nos quais a modificação foi feita para o resíduo de aminoácido aumentar ou diminuir a resposta imunogênica por meio das modificações do aminoácido que alteram a interação com o epítopo da célula T no anticorpo (ver, por exemplo, as patentes U.S. Nos.: 6,835,550; 6,897 e 6,936,249).
Adicional ou alternativamente às modificações efetuadas dentro das regiões estruturais ou CDR, os anticorpos da invenção podem ser construídos para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como a meia- vida sérica, fixação de complemento, ligação a receptor Fc, e/ou citotoxicidade celular antígeno-dependente. Além disso, um anticorpo desta invenção pode ser quimicamente modificado (ex: uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessas configurações é descrita em maiores detalhes abaixo. A numeração dos resíduos na região Fc é a do índice EU de Kabat.
Em uma configuração, a região de dobra de CHl é modificada de forma tal que o número de resíduos cisteína na região de dobra é alterado, como por exemplo, aumentado ou reduzido. Esse método é descrito mais detalhadamente na patente americana No. 5,677,425 de Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de dobra de CHl é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou para aumentar ou reduzir a estabilidade do anticorpo.
Em outra configuração, a região de dobra Fc de um anticorpo é mutada para reduzir à meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de dobra-Fc, até que o anticorpo tenha danificado a ligação da proteína A estafilocócica (SpA) em relação à ligação para o SpA de domínio de dobra Fc nativo. Esse método é descrito mais
detalhadamente na patente americana No. US 6,165,745 de Ward et al.
Em outra configuração, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Diversos métodos são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, conforme descrito na patente americana No. 6,277,375 de Ward. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CHl ou Cl para conter um epítopo ligante ao receptor de resgate tomado de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito nas patentes americanas Nos. 5,869,046 e 6,121,022, de Presta et al. Em outras configurações ainda, a região Fc é alterada substituindo-se pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) função(ões) efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, de forma que o anticorpo tenha uma afinidade alterada por um ligante efetor, mas que mantenha a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo parental. O ligante efetor no qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente Cl de complemento. Esse método é descrito com maiores detalhes nas patentes americanas Nos. 5,624,821 e 5,648,260, ambas de Winter et al.
Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos por um resíduo aminoácido diferente, de forma que o anticorpo altere a ligação a Clq e/ou reduza ou anule a citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Esse método é descrito com maiores detalhes na patente americana No. 6,194,551 de Idusogie et al. Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido nas posições de aminoácido 231 e 239 são alterados para assim alterar a capacidade de o anticorpo fixar o complemento. Esse método é descrito na publicação PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.
Em outro exemplo ainda, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade de o anticorpo mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo por um receptor Fcy modificando um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Esse método é descrito mais detalhadamente na Publicação PCT WO 00/42 072 de Presta.
Além disso, os sítios de ligação em IgGl humana para FcyRl, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e as variantes com ligação melhorada foram descritas (vide Shields, R.L.et al.(2001) J. Biol. Chem., 276 :6591-6604) . Mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 demonstraram melhorar a ligação ao FcyRIII. Além disso, as seguintes combinações de mutantes demonstraram melhorar a ligação a FcyRIII : T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.
Em outra configuração, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, pode-se preparar um anticorpo aglicosilado (ou seja, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, alterando-se um ou mais sítios de glicosilação dentro da seqüência do anticorpo. Por exemplo, podem ser feitas uma ou mais substituições de aminoácido que resultem em eliminação de um ou mais sítios de glicosilação na região estrutural variável para assim eliminar a glicosilação naquele sítio. Essa aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Tal método é descrito mais detalhadamente nas patentes americanas Nos. 5,714,350 e 6,350,861 de Co et al.
Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode ser preparado de modo que tenha um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos fucosila ou um anticorpo com estruturas GlcNac bisegmentantes aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterada demonstraram aumentar a capacidade de ADCC dos anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser efetuadas, por exemplo, expressando-se o anticorpo em uma célula hospedeira com maquinário de glicosilação alterada. As células com maquinário de glicosilação alterado estão descritas no estado da técnica e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais são expressos os anticorpos recombinantes da invenção, para assim produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, as linhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709 carecem do gene de fucosiltransferase, FUT8 (alfa(1,6) fucosiltransferase) , de forma que os anticorpos expressos nas linhagens celulares Ms704, Ms705, e Ms709 carecem de fucose em seus carboidratos. As linhagens celulares Ms704, Ms705, e Ms709FUT8~/_ foram criadas pelo rompimento direcionado do gene FUT8 em células CHO/DG44 utilizando dois vetores de substituição (ver a Publicação de patente americana No. 2004/0110704 de Yamana et al e Yamame- Ohnuki et al (2004) Biotechnol Bioeng. 87:614-22). Outro exemplo, a patente EP 1,176,195 de Hanai et al. descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente rompido, que codifica uma fucosil transferase, de forma que os anticorpos expressos em tal linhagem celular exibem hipofucosilação mediante redução ou eliminação da enzima relacionada à ligação alfa 1,6. Hanai et al. também descrevem as linhagens celulares que possuem baixa atividade enzimática para adicionar fucose à N- acetilglucosamina que se liga à região Fc do anticorpo ou que não possuem a atividade enzimática, por exemplo a linhagem celular de mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL 1662).
A Publicação PCT WO 03/035835 de Presta descreve uma linhagem celular CHO variante, células Lecl3, com capacidade reduzida de ligar fucose a carboidratos ligados a Asn(297), o que também resulta em hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (ver também Shields, R.L. et al(2002) J. Biol. Chem., 277:26733-26740). A publicação PCT WO 99/54342 de Umana et al. , descreve linhagens celulares construídas para expressar glicosil transferases modificadoras de glicoproteína (ex: beta(l,4)-N-
acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII) de forma que os anticorpos expressos nas linhagens celulares construídas exibam estruturas GlcNac bisegmentantes aumentadas, o que resulta em atividade aumentada de ADCC dos anticorpos (ver também Umana et al. (1999) Nat. Biotech., 3^7:176-180). Alternativamente, os resíduos de fucose do anticorpo podem ser clivados utilizando-se uma enzima fucosidase. Por exemplo, a fucosidase alfa-L- fucosidase remove os resíduos fucosila de anticorpos (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23). Outra modificação dos anticorpos prevista na presente invenção é a peglicosilação ("pegylation") . Um anticorpo pode ser submetido à peglicosilação para, por exemplo, aumentar a meia-vida biológica (ex: sérica) do anticorpo. Para tratar com peglicosilação o anticorpo, o anticorpo ou o fragmento do mesmo é tipicamente reagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, sob condições nas quais um ou mais grupos PEG ficam ligados ao anticorpo ou ao fragmento de anticorpo. Preferivelmente, a peglicosilação é conduzida via reação de acilação ou reação de alquilação com uma molécula de PEG reativo (ou um polímero reativo análogo solúvel em água). Conforme aqui utilizado, o termo "polietileno glicol" pretende abranger qualquer uma das formas de PEG que tenha sido utilizada para derivatizar outras proteínas, tais como mono(Cl- C10)alcoxi- ou ariloxi-polietileno glicol ou polietileno- glicol-maleimida. Em certas configurações, o anticorpo a ser tratado com PEG é um anticorpo aglicosilado. Métodos para tratar proteínas com PEGlicosilação são conhecidos no estado da técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Ver, por exemplo, EP 0 154 316 de Nishimura et al. e EP 0 401 384 de Ishikawa et al. Métodos para Construir Anticorpos
Conforme discutido acima, os anticorpos anti-08E tendo seqüências Vh e Vk aqui descritos podem ser usados para criar novos anticorpos anti-08E modificando-se as seqüências Vh e/ou VK, ou a(s) região (ões) constantes a elas ligadas. Assim, em outro aspecto da invenção, as características estruturais de um anticorpo anti-08E da invenção, por exemplo, IG11, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12, são usadas para criar anticorpos anti-08E estruturalmente relacionados que retenham pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos desta invenção, tal como ligação ao 08E humano. Por exemplo, uma ou mais regiões CDR de IG11, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12, ou suas mutações, podem ser combinadas recombinantemente com regiões estruturais conhecidas e/ou com outras CDRs conhecidas para criar anticorpos anti-08E adicionais recombinantemente construídos da invenção, conforme discutido acima. Outros tipos de modificações incluem àquelas descritas na seção anterior. O material de partida para o método de construção é uma ou mais das seqüências Vh e/ou Vk aqui providas, ou uma ou mais de suas regiões CDR. Para criar o anticorpo construído, não é necessário efetivamente preparar (ou seja, expressar como proteína) um anticorpo tendo uma ou mais das seqüências Vh e/ou Vk aqui providas, ou uma ou mais de suas regiões CDR das mesmas. Em vez disso, as informações contidas na(s) seqüência(s) são utilizadas como o material de partida para criar uma seqüência(s) de "segunda geração" derivada(s) da seqüência(s) original e então a seqüência(s) de "segunda geração" é preparada e expressa como uma proteína. Conseqüentemente, em outra configuração, a invenção provê um método para preparar um anticorpo anti-08E compreendendo:
(a) prover: (i) uma seqüência de anticorpo de região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência CDRl selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs.: 11, 12, 13, 14 e 15, uma seqüência CDR2 selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs.: 16, 17, 18, 19 e 20 e/ou uma seqüência CDR3 selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs.: 21, 22, 23, 24 e 25; e/ou (ii) uma seqüência de anticorpo de região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência CDRl selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs: 26, 27, 28, 29 e 30, uma seqüência CDR2 selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs: 31, 32, 33, 34 e 35 e/ou uma seqüência CDR3 selecionada do grupo consistindo de SEQ.ID.NOs: 36, 37, 38, 39 e 40;
(b) alterar pelo menos um resíduo aminoácido dentro da seqüência de anticorpo da região variável de cadeia pesada e/ou da seqüência de anticorpo da região variável de cadeia leve para criar pelo menos uma seqüência de anticorpo alterado; e
(c) expressar a seqüência de anticorpo alterado como uma proteína.
Técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadas para preparar e expressar a seqüência de anticorpo alterado.
Preferivelmente, o anticorpo codificado pela(s) seqüência(s) de anticorpo alterado(s) é aquele que retêm uma, algumas ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos anti-08E aqui descritos, cujas propriedades funcionais incluem, porém não se restringem a:
(a) ligar-se ao 08E humano com um Kd de 1 χ 10-7 M ou menos;
(b) ligar-se às células CHO humanas transfectadas com O8E.
As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas utilizando-se ensaios padrão disponíveis no estado da técnica e/ou aqui descritos, tais como os estabelecidos nos Exemplos (ex: citometria de fluxo, ensaios de ligação).
Em certas configurações dos métodos para construir anticorpos da invenção, mutações podem ser introduzidas aleatória ou seletivamente ao longo de toda ou de parte de uma seqüência de codificação de anticorpo anti-08E e os anticorpos anti-08E modificados resultantes podem ser identificados quanto à atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais conforme aqui descrito. Métodos de mutação foram descritos no estado da técnica. Por exemplo, a publicação PCT WO 02/092780 de Short descreve métodos para criar e identificar mutações de anticorpos utilizando mutagênese de saturação, montagem de ligação sintética, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 de Lazar et al. , descreve métodos para utilizar métodos computacionais de identificação para otimizar as propriedades físico-químicas dos anticorpos.
Moléculas de ácido nucléico que codificam anticorpos da invenção
Um outro aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico que codificam os anticorpos desta invenção. Os ácidos nucléicos podem estar presentes em células completas, em um lisado de células ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura.
Um ácido nucléico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado separadamente de outros componentes celulares ou outros contaminantes, como por exemplo, outros ácidos nucléicos celulares ou proteínas, através de técnicas padrão, incluindo o tratamento alcalino/SDS, bandeamento CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outras técnicas muito conhecidas no estado da técnica. Vide, F.Ausubel et al. , ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Um ácido nucléico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter seqüências intrônicas. Em uma configuração preferida, o ácido nucléico é uma molécula de cDNA.
Os ácidos nucléicos da invenção podem ser obtidos utilizando-se técnicas padrão de biologia molecular. Para anticorpos expressos por hibridomas (ex: hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos portando genes de imunoglobulina humana conforme descrito logo abaixo) cDNAs codificando as cadeias leve e pesada do anticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidos através de técnicas padrões de amplificação PCR de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos de um banco de gene de imunoglobulina (ex: utilizando técnicas de exibição de fago), o ácido nucléico codificador do anticorpo pode ser recuperado do banco.
As moléculas preferidas de ácido nucléico da invenção são àquelas codif icadoras das seqüências Vh e Vl dos anticorpos monoclonais IGll, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12 . As seqüências de DNA codif icantes das seqüências Vh de 1G11, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12 estão mostradas nas seqüências SEQ. ID. Nos: 41, 42, 43, 44 e 45, respectivamente. As seqüências de DNA codif icantes das seqüências Vl de IGl 1, 2A7, 2F9, 12E1 ou 13D12 estão mostradas nas SEQ.ID.Nos: 46, 47, 48, 49 e 50, respectivamente.
Uma vez que os fragmentos de DNA codificantes dos segmentos Vh e Vl são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser então manipulados por técnicas padrões de DNA recombinante, por exemplo, para converter os genes da região variável para os genes da cadeia de extensão completa do anticorpo, para o gene do fragmento Fab ou para um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA codificante de Vl- ou Vh é operativamente ligado a um outro fragmento de DNA codificante de uma outra proteína, tal como uma região constante do anticorpo ou um ligante flexível. O termo "operativamente ligado" como utilizado neste contexto, pretende significar que os dois fragmentos de DNA estão ligados de modo que as seqüências de aminoácidos, codificadas pelos dois fragmentos de DNA que permaneçam na estrutura.
O DNA isolado codificante da região Vh pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de extensão completa por ligação operativa com o DNA codificante de Vh em uma outra molécula de DNA codificante das regiões constantes de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As seqüências dos genes de região constante de cadeia pesada humana são conhecidas do estado da técnica (ver, por exemplo, Kabt, Ε.Α., et al. , (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas mais preferivelmente, é uma região constante de IgGl ou IgG4. Para o gene de cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA codificante de Vh pode ser ligado operativamente a uma outra molécula de DNA codificante apenas da região constante de CHl de cadeia pesada. O DNA isolado codificante da região de Vll pode ser convertido em um gene de cadeia leve de extensão completa (bem como um gene de cadeia leve do fragmento Fab) por ligação operativa do DNA codificante de Vl a uma outra molécula de DNA codificante da região constante de cadeia leve, CL. As seqüências de genes de região constante de cadeia leve humana são conhecidas do estado da técnica (ver, por exemplo, Kabt, E.A. et al. , (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante Kappa ou Lambda, mas mais preferivelmente, é uma região constante de Kappa. Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA codificantes de Vh e Vl são operativamente ligados a um outro fragmento codificante de uma ligação flexível, por exemplo, codificante de seqüência de aminoácidos (Gly4- Ser)3, de modo que as seqüências Vh e Vl possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contínua, com as regiões Vh e Vl ligadas por uma ligação flexível (ver, por exemplo, Bird et al. , (1988) Science 242 :423 -426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879- 5883; Mc Cafferty et al. , (1990) Nature 348:552-554) . Produção de anticorpos monoclonais desta invenção Os anticorpos monoclonais (mAbs) da presente invenção podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo a metodologia convencional de anticorpo monoclonal, como por exemplo, a técnica padrão de hibridação de célula somática de Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495. Embora os procedimentos de hibridação de célula somática sejam preferidos, em princípio, outras técnicas para produzir anticorpo monoclonal podem ser empregadas, como por exemplo, a transformação viral ou oncogênica dos linfócitos B. 0 sistema animal preferido para preparar hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos no estado da técnica. Pares de fusão (ex: células de mieloma murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.
Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados com base na seqüência de um anticorpo monoclonal murino preparado conforme acima descrito. O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia leve e pesada pode ser obtido do hibridoma não-humano de interesse e construído para conter seqüências de imunoglobulina humana utilizando as técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, regiões murinas variáveis podem ser ligadas a regiões humanas constantes utilizando os métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, a patente americana No. 4,816,567 de Cabilly et al.) . Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR murinas podem ser inseridas em uma estrutura humana utilizando os métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, a patente americana No. 5,225,539 de Winter, e as patentes americanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 e 6,180,370 de Queen et al.) .
Em uma configuração preferida, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra 08E podem ser gerados utilizando camundongos transgênicos ou transcromossômicos que carregam partes do sistema imune humano em vez do sistema camundongo. Esses camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos designados como camundongos HuMAb® e KM mice®, respectivamente, e são coletivamente designados aqui como "camundongos contendo Ig humana".
O camundongo HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.) contém mini- sítios ("miniloci") do gene de imunoglobulina humana que codificam seqüências de imunoglobulina humana não re- arranjadas de cadeia pesada (μ e γ) e leve κ, juntamente com mutações direcionadas que inativam os sítios de cadeia μ e κ endógena (vide, por exemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474):856-859). Conseqüentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou κ de camundongo e, em resposta à imunização, os transgenes humanos de cadeia pesada e leve introduzidos sofrem mudança de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais humanos IgG/e de alta afinidade (Lonberg, N.et al.(1994), supra; revisado em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49- 101; Lonberg N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol., .13:65-93 e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci., 764:536-546). A preparação e o uso de camundongos HuMAb bem como as modificações genômicas carregadas por tais camundongos, são ainda descritas em Taylor, L.et al.(1992) Nucleic Acids Research 20:6287- 6295; Chen, JH.et al.(1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90:3720-3724; Choi et al.(1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J.et al.(1993) EMBO J.12:821-830; Tuaillon et al.(1994) J.Immunol., .152:2 912-2 92 0; Taylor, 35 L.et al. (1994) International Immunology 6:579-591; e Fishwild, D.et al.(1996) Nature Biotechnology 14:845- 851, cujos conteúdos foram aqui incorporados especificamente por referência em sua totalidade. Vide, ainda, as patentes americanas Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; e 5,770,429; todos de Lonberg e Kay; a patente americana No. 5,545,807 de Surani et al. ; as Publicações de Pedidos PCT Nos.: WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todos de Lonberg e Kay; e a Publicação do Pedido PCT No. WO 01/14424 de Korman et al.
Em outra configuração, os anticorpos humanos desta invenção podem ser produzidos utilizando um camundongo que carrega seqüências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomos, tal como um camundongo que carrega um transgene humano de cadeia pesada e um transcromossomo humano de cadeia leve. Tais camundongos, aqui designados camundongos "KM mice®" são descritos detalhadamente na Publicação do Pedido PCT WO 02/43478 de Ishida et al.
Adicionalmente, os sistemas animais transgênicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis no estado da técnica e podem ser usados para produzir anticorpos anti-08E da invenção. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo designado Xenomouse (Abgenix, Inc.) pode ser usado; tais camundongos são descritos, por exemplo, nas patentes americanas Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 e 6,162,963 de Kucherlapati et al. Além disso, sistemas animais transcromossômicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis no estado da técnica e podem ser usados para produzir os anticorpos anti-08E desta invenção. Por exemplo, os camundongos carregando tanto um transcromossomo humano de cadeia pesada como um transcromossomo humano de cadeia leve, designados como "camundongos TC" podem ser usados; tais camundongos são descritos em Tomizuka et al.(2000) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 97:722-727. Além disso, vacas portando os transcromossomos humanos de cadeia leve e pesada foram descritas no estado da técnica (Kuroiwa et al.(2002) Nature Biotechnology 20): 88 9-894) e podem ser usadas para produzir anticorpos anti-08E desta invenção.
Anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados utilizando métodos de exibição de fago para identificar bancos de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de exibição de fago para isolar anticorpos humanos são estabelecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, as patentes americanas Nos. 5,223,409; 5,403,484; e 5,571,698 de Ladner et al; Patentes americanas Nos. 5,427,908 e 5,580,717 de Dower et al.; Patentes Americanas Nos. 5, 969,108 e 6,172,197 de McCafferty et al.; e patentes americanas Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915, e 6,593,081 de Griffiths et al.
Os anticorpos monoclonais humanos desta invenção também podem ser preparados utilizando camundongos SCID nos quais as células imunes humanas foram reconstituídas de forma que uma resposta do anticorpo humano possa ser gerada quando da imunização. Tais camundongos são descritos, por exemplo, nas patentes americanas NOs. 5,476,996 e 5,698,767 de Wilson et al.
Imunização de Camundongos com Ig Humana Quando camundongos com Ig humana são utilizados para produzir anticorpos humanos da invenção, tais camundongos podem ser imunizados com uma linha de células expressando O8E, uma preparação purificada ou enriquecida de antígeno O8E e/ou um 08E recombinante, ou uma proteína de fusão O8E, conforme descrito por Lonberg N.et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al.(1996) Nature Biotechnology 14:845-851; e publicação do PCT WO 98/24884 e WO 01/14424. Preferivelmente, os camundongos terão de 6-16 semanas de vida quando da primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purificada ou recombinante (5- 50μg) de antígeno 08E pode ser utilizada para imunizar o camundongo com Ig humana intraperitonealmente. Procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para 08E são descritos no Exemplo 1 abaixo. A experiência cumulativa com diversos antigenos tem demonstrado que os camundongos transgênicos respondem, quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP), com o antígeno adjuvante de Freund completo seguido por imunizações IP semana sim, semana não, (até um total de 6) com antígeno em adjuvante de Freund incompleto. Porém, outros adjuvantes que não o de Freund também se mostraram eficazes. Além disso, células completas na ausência do adjuvante demonstraram ser altamente imunogênicas. A resposta imune pode ser monitorada durante o curso do protocolo de imunização com amostras de plasma sendo obtidas por sangramentos retro- orbitais. O plasma pode ser identificado através de teste ELISA e os camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-08E podem ser usados para as fusões (conforme descrito no Exemplo 1 abaixo). Os camundongos podem receber antígeno intravenosamente 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Espera-se que precisem ser realizadas de 2-3 fusões para cada imunização. Entre 6 e 24 camundongos são tipicamente imunizados para cada antígeno. Geralmente, são utilizadas tanto as cepas HCo7 como HCol2. A produção de cepas de camundongo Hco7 e Hcol2 está descrita na patente U.S. No. 5,770,42 9 e no Exemplo 2 da Publicação Internacional do PCT - WO 01/09187, respectivamente. Além disso, tanto o transgene HCo7 como HCol2 pode ser gerado junto em um único camundongo que tenha dois transgenes humano diferente de cadeia pesada (HCo7/HCol2). Alternativa ou adicionalmente, a cepa do KM Mouse® pode ser usada, como descrito na Publicação do PCT WO 02/43478.
Geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos desta invenção
Para gerar hibridomas que produzam os anticorpos monoclonais humanos da invenção, esplenócitos e/ou células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos a uma linhagem celular imortalizada apropriada, tal como uma linhagem celular de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser identificados quanto à produção de anticorpos antígeno-específico. Por exemplo, suspensões celulares simples de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem ser fundidas até um terço do número de células de mieloma de camundongo não-secretoras sp2/0 (ATCC, CRL 1581) com PEG a 50%. Alternativamente, a suspensão de células únicas dos linfócitos esplênicos de camundongos imunizados pode ser fundida para um número igual de células de mieloma de camundongo Sp2/0 usando um método de eletrofusão baseado em campo elétrico, usando um eletroporador de fusão celular com uma câmara de Cyto Pulse grande ("Cyto Pulse Sciences", Inc., Glen Burnie, MD). As células são plaqueadas em aproximadamente 1 χ IO5 em uma placa de microtitulação de fundo plano, seguido de incubação por duas semanas em um meio seletivo contendo soro bovino fetal a 10% (Hyclone, Logan, UT) , P388dl a 10% (ATCC, CRL TIB-63) meio condicionador, Origen 3-5% (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com alto teor de glicose, L-glutamina e piruvato de sódio) e mais 5 mM de HEPES, 0,055 mM 2-mercaptoetanol, 50mg/ml de gentamicina e Ix HAT (Sigma, CRL P-7185) . Após aproximadamente 1-2 semanas, as células podem ser cultivadas em meio no qual HAT é substituído por HT. Os poços individuais podem então ser identificados através de ELISA ou FACS quanto aos anticorpos monoclonais humanos IgM e IgG. Os clones positivos podem então ser identificados para anticorpos 08E positivos na proteína recombinante 08E por ELISA ou em células expressando 08E, por exemplo, células CH0-08E transfectadas, por FACS. Ocorrido o crescimento extensivo do hibridoma, o meio pode ser observado geralmente após 10-14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpos podem ser re-plaqueados, identificados novamente, e se ainda forem positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes limitando-se a diluição. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.
Para purificar os anticorpos monoclonais humanos, hibridomas selecionados podem ser crescidos em frascos tipo "spinner" de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia por afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser examinada através de eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para garantir a pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS e a concentração pode ser determinada por OD280 utilizando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.
Geração de anticorpos monoclonais Produtores de transfectomas desta invenção
Os anticorpos da invenção podem ser também produzidos em um transfectoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção gênica conforme é conhecido no estado da técnica (ex: Morrison, S. (1985) Science 229 :1202).
Por exemplo, para expressar anticorpos, ou os fragmentos de anticorpos dos mesmos, os DNAs que codificam cadeias leves e pesadas de extensão parcial ou completa, podem ser obtidos através de técnicas padrão de biologia molecular (ex: amplificação PCR ou clonagem cDNA utilizando um hibridoma que expresse o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão de forma que os genes sejam operativamente ligados às seqüências de controle transcricionais e translacionais. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" pretende significar que um gene de anticorpo é ligado num vetor de forma que as seqüências de controle transcricionais e translacionais dentro do vetor realizem sua função pretendida de regular a transcrição e a translação do gene de anticorpo. 0 vetor de expressão e as seqüências de controle de expressão são selecionados para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. 0 gene de cadeia leve e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes podem ser inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão através de métodos padrão (ex: ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ou ligação da extremidade enfraquecida ("blunt-end ligation") se nenhum sítio de restrição estiver presente). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos aqui descritos podem ser utilizadas para criar genes de anticorpo de extensão completa de qualquer isótopo de anticorpo inserindo-os em vetores de expressão que já codificam regiões constantes de cadeia pesada e de cadeia leve do isótopo desejado, de forma que o segmento Vh seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) Ch dentro do vetor e o segmento Vk seja operativamente ligado ao segmento Cl dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilite a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. 0 gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de forma que o peptídeo sinal seja ligado na estrutura ("in- frame") ao terminal amino do gene de cadeia de anticorpo. 0 peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (ou seja, um peptídeo sinal de uma proteína não-imunoglobulina). Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes desta invenção carregam seqüências regulatórias que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. 0 termo "seqüência regulatória" pretende incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (ex: sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou a translação dos genes de cadeia de anticorpo. Tais seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) ) . Será apreciado pelos técnicos no assunto que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências regulatórias, podem depender de fatores tais como a seleção da célula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão da proteína desejada, etc. As seqüências regulatórias preferidas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem os elementos virais que dirigem altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como os promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio (SV40), adenovírus (ex: o promotor tardio maior do adenovírus (AdMLP)e polioma). Alternativamente, as seqüências regulatórias não-virais podem ser usadas, tal como o promotor de ubiquitina ou promotor de β- globina. Outrossim, os elementos regulatórios compostos de seqüências de fontes diferentes, tal como o sistema promotor SRa, que contém seqüências do promotor precoce SV4 0 e o terminal de repetição longa do vírus de leucemia de célula T humana do tipo 1 (Takebe, Y. et al.(1988) Mol Cell Biol.8:466-472).
Além dos genes de cadeia de anticorpo e das seqüências regulatórias, os vetores de expressão recombinante da invenção podem carregar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (ex: origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. 0 gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (vide, por exemplo, as patentes americanas Nos. 4,399,216, 4,634,665 e 5,179,017, todos de Axel et al.) . Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene de dihidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o neo-gene (para seleção de G418).
Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão que codificam as cadeias leve e pesada é transfectado numa célula hospedeira através de técnicas padrão. As diversas formas do termo "transfecção" pretendem abranger uma ampla variedade de técnicas comumente utilizadas para a introdução de DNA exógeno dentro de uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, como por exemplo, eletroporação, precipitação cálcio-fosfato, transfecção DEAE-dextrano e similares. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucariót icas, e o mais pref erivelmente em células hospedeiras de mamífero, é a mais preferida pois tais células eucarióticas e, em especial, células de mamífero, têm mais probabilidade de montar e secretar um anticorpo adequadamente revelado e imunologicamente ativo do que as células procarióticas. A expressão procariótica de genes de anticorpo foi reportada como ineficaz para produção de altos rendimentos de anticorpo ativo (Boss, M.A. e Wood, C.R.(1985) Immunology Today 6:12-13).
Células hospedeiras de mamífero preferidas para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem células de Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77:4216-422 0, utilizadas com um marcador selecionável DHFR, como por exemplo, conforme descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol., 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em especial, para uso com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão gênica GS descrito em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando os vetores de expressão recombinante codificando genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são crescidas.
Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura utilizando-se métodos padrão de purificação de proteína. Caracterização de Ligação do Anticorpo ao Antígeno Os anticorpos desta invenção podem ser testados quanto à ligação ao 08E por, por exemplo, por citometria de fluxo.
Resumidamente, as células expressando 08E são colhidas recentemente a partir da cultura de tecido em frascos e uma suspensão de células única foi preparada. As suspensões de célula expressando 08E foram também coradas com o anticorpo primário diretamente ou após a fixação com 1% de paraformaldeído em PBS. Aproximadamente, um milhão de células foram suspensas em PBS contendo 0,5% de BSA e 50-200 μg/ml do anticorpo primário, e incubadas em gelo por 3 0 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 0,1% de BSA, 0,01% de NaN3, re-suspensas em 100 μl de uma IgG de cabra-anti-humana FITC-conjugada diluída em 1:100 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) e incubada em gelo por um período adicional de 30 minutos. As células foram novamente lavadas duas vezes, re-suspensas em 0,5 ml de tampão aquoso e analisadas para coloração fluorescentes em um citômetro FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA).
Alternativamente, os anticorpos da invenção podem ser testados quanto à ligação ao 08E por ELISA padrão. Resumidamente, as placas de microtitulação são revestidas com 08E purificado a 0,25μg/ml em PBS, e então bloqueadas com albumina de soro bovino a 5% em PBS. As diluições de anticorpo (ex: diluições de plasma de camundongos imunizados com 08E) são adicionadas em cada poço e incubadas durante 1-2 horas a 37°C. As placas são lavadas com PBS/Tween e então incubadas com um reagente secundário (ex: para anticorpos humanos, um reagente policlonal Fc-específico IGc anti-humano de cabra) conjugado a fosfatase alcalina durante 1 hora a 37°C. Após lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato pNPP (1 mg/ml) e analisadas em OD de 405-650. Preferivelmente, os camundongos que desenvolverem as titulações mais altas serão usados nas fusões.
Um ensaio ELISA ou FACS, conforme acima descrito, pode também ser usado para identificar hibridomas que mostram reatividade positiva com imunógeno 08E. Hibridomas que se ligam com alta avidez ao 08E são subclonados e então caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retém a reatividade das células parentais (por ELISA ou FACS), pode ser selecionado para preparar um banco de células de 5-10 frascos armazenados a -140°C e para purificação de anticorpo.
Para purificar anticorpos anti-08E, hibridomas selecionados podem ser crescidos em frascos tipo "spinner" de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia Piscataway, NJ) . A IgG eluída pode ser verificada através de eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para garantir a pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS e a concentração pode ser determinada por OD280 utilizando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C. Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-08E selecionados ligam-se a um único epítopo, cada anticorpo pode ser biotinilado utilizando reagentes disponíveis no mercado (Pierce, Rockford, IL). Os estudos de competição utilizando anticorpos monoclonais não marcados e anticorpos monoclonais biotinilados podem ser conduzidos utilizando-se placas ELISA revestidas com 08E conforme acima descrito. A ligação a mAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda de estrepvidina-fosfatase alcalina. Alternativamente, os estudos de competição podem ser realizados usando um anticorpo radio-marcado e anticorpos de competição não marcados podem ser detectados em uma análise Scatchard, como descrito ainda nos exemplos abaixo.
Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, ensaios ELISA de isotipo podem ser conduzidos utilizando reagentes específicos para anticorpos de um isotipo específico. Por exemplo, para determinar o isotipo de um anticorpo monoclonal humano, os poços das placas de microtitulação podem ser revestidas com ^g/ml de imunoglobulina anti-humana da noite para o dia a 4°C.
Após o bloqueio com BSA 1%, as placas são reagidas com lμg/ml ou menos de anticorpos monoclonais de teste ou controles de isotipos purificados, à temperatura ambiente por uma ou duas horas. Os poços podem então ser reagidos com IgGl humana ou sondas de conjugado de fosfatase alcalina IgM-específica humana. As placas são desenvolvidas e analisadas conforme descrito acima. IgGs anti-08E humanas podem ainda ser testadas quanto à reatividade com o antígeno 08E através do método de Western Blotting. Resumidamente, o 08E pode ser preparado e submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio. Após a eletroforese, os antígenos separados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com soro fetal bovino a 10%, e sondadas com os anticorpos monoclonais a serem testados.
A ligação a IgG humana pode ser detectada utilizando fosfatase alcalina de IgG anti-humana e desenvolvida com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem.Cp., St.Louis, Mo).
Propriedades Físicas do Anticorpo
Os anticorpos da presente invenção podem ser ainda caracterizados pelas várias propriedades físicas dos anticorpos anti-08E. Diversos ensaios podem ser usados para detectar e/ou diferenciar classes diferentes de anticorpos com base nessas propriedades físicas.
Em algumas configurações, os anticorpos da presente invenção podem conter um ou mais sítios de glicosilação na região variável de cadeia leve ou pesada. A presença de um ou mais sítios de glicosilação na região variável pode resultar em imunogenicidade aumentada do anticorpo ou numa alteração do pK do anticorpo devido à ligação ao antígeno alterado (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA e Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al. (1988), J.Exp Med 168:1099- 109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al.(2000) Mol Immunol. 32:697-706). Sabe-se que a glicosilação ocorre em padrões contendo uma seqüência N-X-S/T. A glicosilação em região variável pode ser testada utilizando um ensaio Glycoblot que cliva o anticorpo para produzir um Fab7 e que então testa a glicosilação utilizando um ensaio que mede a oxidação de periodato e a formação de base Schiff.
Alternativamente, a glicosilação em região variável pode ser testada utilizando-se cromatografia de luz Dionex (Dionex-LC) que cliva sacarídeos de um Fab em monossacarídeos e analisa o teor de sacarídeo individual.
Em alguns casos, é preferido ter um anticorpo anti-CD19 que não contenha glicosilação na região variável. Isso pode ser obtido selecionando-se anticorpos que não contenham o padrão de glicosilação na região variável ou mutando-se resíduos dentro do padrão de glicosilação utilizando técnicas padrão conhecidas no estado da técnica.
Em uma configuração preferida, os anticorpos da presente invenção não contêm sítios de isomerismo de asparagina.
Um efeito de desamidação ou de ácido iso-aspártico pode ocorrer em seqüências N-G ou D-G, respectivamente. O efeito de desamidação ou de ácido iso-aspártico resulta na criação de ácido iso-aspártico que reduz a estabilidade de um anticorpo, criando uma estrutura dobrada fora de um terminal carboxi de cadeia lateral ao invés de na cadeia principal. A criação de ácido iso- aspártico pode ser medida utilizando-se um ensaio iso- quântico que utiliza uma HPLC de fase reversa para testar o ácido aspártico.
Cada anticorpo terá um ponto isoelétrico inédito (pl) , mas geralmente os anticorpos enquadram-se na faixa de pH de 6 e 9,5. 0 pi para um anticorpo IgGl enquadra-se tipicamente na faixa de pH de 7-9,5 e o pi para um anticorpo IgG4 enquadra-se tipicamente na faixa de pH de 6-8. Os anticorpos podem ter um pi que esteja fora dessa faixa. Embora os efeitos sejam geralmente desconhecidos, existe uma especulação de que os anticorpos com um pi fora da faixa normal podem apresentar alguma não-dobra e instabilidade nas condições in vivo. 0 ponto isoelétrico pode ser testado utilizando-se um ensaio de focalização isoelétrica capilar que cria um gradiente de pH e que pode utilizar focalização a laser para aumentar a precisão (Janini et al.(2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75:89; Hunt et al. (1998) J.Chromatogr A 800:355-67) . Em alguns casos, é preferido ter um anticorpo anti-08E que contenha um valor de pi enquadrado na faixa normal. Isso pode ser obtido selecionando-se anticorpos com um pi na faixa normal, ou mutando-se resíduos de superfície carregada, utilizando técnicas padrão bastante conhecidas no estado da técnica. Cada anticorpo terá uma temperatura de fusão indicativa de estabilidade térmica (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol !3:361"71)· Uma estabilidade térmica mais alta indica maior estabilidade global do anticorpo in vivo. 0 ponto de fusão de um anticorpo pode ser medido utilizando-se técnicas tais como calorimetria diferencial de varredura (Chen et al. (2003) Pharma Res 20 :1952-60 ; Ghirlando et al (1990) Immunol Lett 68 : 47-52) . TMi indica a temperatura de não-dobra inicial do anticorpo. TM2 indica a temperatura de não-dobra completa do anticorpo. Geralmente, é preferido que a Tmi de um anticorpo da presente invenção seja superior a 60°C, preferivelmente superior a 65°C, e ainda mais preferivelmente superior a 70°C. Alternativamente, a estabilidade térmica de um anticorpo pode ser medida utilizando-se dicroismo circular (Murray et al.(2002) J.Chromatogra Sci 40:343-9).
Em uma configuração preferida, são selecionados os anticorpos que não se degradam rapidamente. A fragmentação de um anticorpo anti-08E pode ser medida utilizando-se eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS, conforme é entendido no estado da técnica (Alexander AJ e Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
Em outra configuração preferida, são selecionados os anticorpos que possuam efeitos de agregação mínimos. A agregação pode levar à ativação de uma resposta imune indesejada e/ou a propriedades farmacocinéticas alteradas ou desfavoráveis. Geralmente, são aceitáveis os anticorpos com agregação de 25% ou menos, preferivelmente 20% ou menos, ainda mais preferivelmente de 15% ou menos, ainda mais preferivelmente 10% ou menos ou ainda mais preferivelmente 5% ou menos. A agregação pode ser medida através de diversas técnicas bastante conhecidas no estado da técnica, incluindo cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com coluna de exclusão por dimensão (SEC) e dispersão de luz para identificar monômeros, dímeros, trímeros ou multímeros.
Imunoconj ugado
Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza um anticorpo anti-08E ou um fragmento do mesmo, conjugado a uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Tais conjugados são aqui designados como "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são designados "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja nocivo (por exemplo, que mate) às células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- dehidrostestosterona, glucocorticóides, procaina, tetracaína, lidocaína, propanolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos. Agentes terapêuticos também incluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo: metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes, (por exemplo: mecloretamina, tiotepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo: daunorubicina (formalmente denominada daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo: dactinomicina (formalmente Actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC) e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina) . Outros exemplos preferidos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas a um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas, caliqueamicinas, matansinas e auristatinas, e seus derivados. Um exemplo de conjugado de anticorpo de caliqueamicina está disponível no mercado (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
As citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos da invenção utilizando tecnologia de ligante disponível no estado da técnica. Exemplos de tipos de ligante que foram utilizados para conjugar uma citotoxina a um anticorpo incluem, porém não se restringem a hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfetos, e ligantes contendo peptídeo. Pode- se selecionar um ligante que seja, por exemplo, suscetível à clivagem por pH baixo dentro do compartimento lisossômico ou suscetível à clivagem por proteases, tais como proteases, preferencialmente, expressa em tecido tumoral tal como catepsinas (por exemplo, catepsinas Β, C, D).
Para mais discussão sobre os tipos de citotoxinas, ligantes e métodos para agentes terapêuticos conjulgados aos anticorpos, vide também Saito, G. et al.(2003) Adv Drug Deliv.Rev. 55:199-215; Trail, P.A.et al.(2003) Câncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne G.(2003) Câncer Cell 3^:207-212; Allen, T.ML (2002) Nat Rev.Câncer 2:750-763; Pastan, I. e Kreitman, R.J. (2002) Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. e Springer, C.J.(2001) Adv.Drug Delivery Rev. 53:247-264.
Os anticorpos da presente invenção podem também ser conjugados a um isótopo radioativo para gerar radiofarmacêuticos citotóxicos, também designados radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados a anticorpos para uso diagnóstico ou terapêutico incluem, porém não se restringem a iodo131, iodo125, índio111, ítrio90 e lutécio177. O método para preparar radioimunoconjugados está estabelecido no estado da técnica. Exemplos de radioimunoconjugados estão disponíveis no mercado, inclusive Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) e
Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals) e métodos similares podem ser usados para preparar radioimunoconjugados utilizando os anticorpos da invenção. Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usados para modificar uma determinada resposta biológica e, a porção de fármaco não deve ser interpretada como limitada aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou um polipeptídio que possua uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou um fragmento ativo da mesma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina de dif teria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral ou interferon-γ; ou modificadores de resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-l"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulante de colônias de macrófagos e granulócitos ("GM-CSF"), fator estimulante de colônia de granulócitos ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.
Técnicas para conjugar tal porção terapêutica a anticorpos são conhecidas, vide, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Câncer Therapy" in Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Reisfeld et al.(eds), pp.243-56 (Alan R.Liss, Inc.1985); Hellstrom et al. , "Antibodies for Drug Delivery" in Controlled Drug Delivery (2nd.ed), Robinson et al.(eds.), pp.623-53 (Mareei Dekker, Inc.1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Câncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai Applications, Pinchera et al (eds), pp.475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, Baldwin et al.(eds.) pp.303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al. , "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol.Rev. 62:119-58 (1982).
Moléculas Biespecíficas
Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti- O8E, ou um fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpo da invenção ou porções ligantes ao antígeno do mesmo, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, como por exemplo, a outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se ligue à, pelo menos, dois sítios de ligação diferentes ou a moléculas alvo. O anticorpo da invenção pode, de fato, ser derivatizado ou ligado a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois sítios de ligação diferentes e/ou a moléculas alvo; tais moléculas multiespecíficas também pretendem serem abrangidas pelo termo "moléculas biespecíficas" conforme aqui utilizado. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não- covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras moléculas ligantes, tal como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimética de ligação, de forma a resultar numa molécula biespecífica.
Conseqüentemente, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para 08E e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo.
Em uma configuração específica da invenção, o segundo epítopo alvo é um receptor Fc, como por exemplo, FcyRI humano (CD64) ou um receptor Fca humano (CD8 9) . Portanto, a invenção inclui moléculas biespecíficas capazes de ligar-se a células efetoras expressando tanto FcyR quanto FcaR (por exemplo, monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)) e a células alvo expressando 08E. Essas moléculas biespecíficas direcionam as células expressando 08E à célula efetora e disparam atividades de célula efetora mediada por receptor Fc, tal como a fagocitose de células expressando 08E, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), liberação de citocinas, ou geração de ânion super-óxido.
Em uma configuração da invenção, na qual a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-08E. Em uma configuração, a terceira especificidade de ligação é uma porção de fator anti-intensificador (EF) , como por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína superficial envolvida em atividade citotóxica e assim aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A "porção de fator anti- intensif icador" pode ser um anticorpo, um fragmento de anticorpo funcional ou um ligante que se liga a uma determinada molécula, como por exemplo, um antígeno ou um receptor, e assim resulta numa intensificação no efeito dos determinantes de ligação para o receptor Fc ou para o antígeno de célula alvo. A "porção de fator anti- intensificador" pode ligar-se a um receptor Fc ou a um antígeno de célula alvo. Alternativamente, a porção de fator anti-intensificador pode ligar-se a uma entidade que seja diferente da entidade à qual a primeira e segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção de fator anti-intensificador pode ligar-se a uma célula T citotóxica (por exemplo, via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD4 0, ICAM-1 ou outra célula imune que resulte numa resposta imune aumentada contra a célula alvo).
Em uma configuração, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como especificidade de ligação a pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb ou um Fv de cadeia simples. O anticorpo pode também ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou um construto de cadeia simples, conforme descrito na patente americana No. 4.946.778 de Ladner et al. cujo conteúdo foi aqui incorporado expressamente por referência.
Em uma configuração, a especificidade de ligação para um receptor Fcy é provida por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não é bloqueada pela imunoglobulina G humana (IgG). Conforme aqui utilizado, o termo "receptor de IgG" refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia-γ localizados no cromossomo 1. Esses genes codificam um total de doze isoformas transmembrânicas ou de receptor solúvel que são agrupadas em três classes de receptor Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16). Em uma configuração preferida, o receptor Fcy é um FcyRI humano de alta afinidade. 0 FcyRI humano é uma molécula de 72 kDa, que mostra alta afinidade pela IgG monomérica (10^8 - 109 M-1).
A produção e caracterização de certos anticorpos monoclonais anti-Fcy preferidos são descritas na Publicação PCT WO 88/00052 e na patente americana No. 4.954.617 de Fanger et al. , cujos ensinamentos são aqui totalmente incorporados por referência. Esses anticorpos ligam-se a um epítopo de FcγRI, FcγRII ou FcγRIII em um sítio que é distinto do sítio de ligação Fcy do receptor e, assim, sua ligação não é bloqueada substancialmente por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcyRI específicos úteis na presente invenção são mAb 22, mAb32, mAB 44, mAb 62 e mAb 197. O hibridoma que produz mAb 32 está disponível na American Type Culture Collection, registro ATCC No. HB94 69. Em outras configurações, o anticorpo de receptor anti-Fcγ é uma forma humanizada de anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e a caracterização do anticorpo H22 é descrita em Graziano, R.F.et al. (1995) J.Immunol 155 (10) :4996-5002 e Publicação PCT WO 94/10332. A linhagem celular produtora de anticorpo H22 foi depositada no "American Type Culture Collection" sob a designação HA022CL1 e tem o número de registro CRL 11177.
Em outras configurações preferidas ainda, a especificidade de ligação para um receptor Fc é provida por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humana, como por exemplo, receptor Fc-alfa (FcαRI(CD89)), cuja ligação é preferivelmente não bloqueada por imunoglobulina A humana (IgA). O termo "receptor de IgA" pretende incluir o produto gênico de um α-gene (FcαRI) localizado no cromossomo 19. Esse gene é conhecido por codificar diversas isoformas transmembrânicas alternativamente alinhadas de 55 a 110 kDa. FcαRI (CD89) é constitutivamente expresso em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, porém não em populações de células não-efetoras. O FcαRI possui uma afinidade média (≈5 χ 107M-1) tanto para IgA1 como para IgA2, que aumenta mediante exposição a citocinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al(1996) Criticai Review in Immunology 16:423-440) . Quatro anticorpos monoclonais FcaRI-específicos, identificados como A3, A59, A62 e A7 7, que se ligam a FcaRI fora do domínio de ligação a ligante IgA, foram descritos (Monteiro, R.C. et al. (1992) J.Immunol., 148:1764) .
FcaRI e FcyRI são receptores de ativação para uso nas moléculas biespecíficas da invenção, pois eles são (1) expressos principalmente em células efetoras imunes como, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos, e células dendríticas; (2) expressas em altos níveis (por exemplo, 5.000-100.000 por célula); (3) mediadores de atividades citotóxicas (ex: ADCC, fagocitose); e (4) mediam a apresentação aumentada de antígenos, incluindo os auto- antígenos, a eles direcionados.
Embora os anticorpos monoclonais humanos sejam preferidos, outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.
As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas conjugando-se as especificidades de ligação constituintes, como, por exemplo, as especificidades de ligação anti-FcR e anti-08E, utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e então conjugada entre si. Quando as especificidades de ligação forem proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes acoplantes ou reticuladores pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes reticuladores incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5"-ditiobis(2-ácido nitrobenzóico) (DTNB), o- fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2- piridiltio)propionato (SPDP) e sulfosuccinimidil 4-(N- maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (vide, por exemplo, Karpovsky et al.(1984) J.Exp.Med 160:1686; Liu, MA et al.(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648). Outros métodos incluem os descritos em Paulus (1985) Behring Ins.Mitt.No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, e Glennie et al.(1987) J.Immunol., 139 : 2367-2375). Agentes conjugantes preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis na Pierce Chemical Co.(Rockford, IL).
Quando as especificidades de ligação forem anticorpos, eles podem ser conjugados via ligação de sulfidrila das regiões de dobra de terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma configuração especialmente preferida, a região de dobra é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrila, preferivelmente um, antes da conjugação.
Alternativamente, ambas especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Esse método é especialmente útil quando a molécula biespecífica for um mAb χ mAb, mAb χ Fab, Fab χ F(ab')2 ou ligante χ proteína de fusão Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia simples compreendendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Métodos para preparar moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, nas patentes americanas Nos. 5 .260 .2 03; 5.455.03 0; 4 . 881. 175; 5.132.405; 5.091.513; 5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; e 5.482.858. A ligação das moléculas biespecíficas a seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, através do ensaio por enzimas imuno-adsorvidas (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento) ou ensaio de Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos proteína-anticorpo de interesse específico empregando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos de anticorpo FcR podem ser detectados utilizando, por exemplo, um anticorpo ligado à enzima ou um fragmento de anticorpo que reconheça e que especificamente ligue-se aos complexos de anticorpo-FcR.
Alternativamente, os complexos podem ser detectados utilizando-se qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser radioativamente marcado e utilizado em um radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B.,
Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, aqui incorporado por referência). O isótopo radioativo pode ser detectado por meios tais como o uso de contador γ ou um contador de cintilação ou através de auto-radiografia.
Composições Farmacêuticas
Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinações de anticorpos monoclonais, ou porção(ões) ligantes ao antígeno dos mesmos, da presente invenção, formulada juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se ligam a diferentes epítopos no antígeno alvo ou que tenham atividades complementares.
Composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapias combinadas, ou seja, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-08E da presente invenção combinado com pelo menos um outro agente antiinflamatório ou imunossupressor. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados na terapia de combinação são descritos em maiores detalhes abaixo na seção que trata dos usos dos anticorpos da invenção.
Conforme aqui utilizado, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e agentes retardantes de absorção, e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. Preferivelmente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (ex: por injeção ou infusão). Dependendo da rota de administração, o composto ativo, ou seja, o anticorpo, imunoconjugado, ou molécula biespecíf ica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e de outras condições naturais que possam inativar o composto. Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parental e que não causa nenhum efeito toxicológico indesejado (vide, por exemplo, Berge, S.M.et al (1977) J.Pharm.Sci. 66:1- 19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácido incluem os derivados de ácidos inorgânicos atóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrômico, hidro-iódico, fosforoso e similares, bem como de ácidos orgânicos atóxicos tais como os ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituídos com fenila, ácido hidroxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similares. Sais de adição de base incluem os derivados de sais metálicos alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio, e similares, bem como de aminas orgânicas atóxicas, tais como N,N'- dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.
Uma composição farmacêutica da invenção pode também incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil gaiato, alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes quelantes metálicos, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.
Exemplos de veículos aquosos e não-aquosos apropriados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas apropriadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, mediante o uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões, e mediante o uso de surfactantes.
Essas composições podem também conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser garantida tanto pelos procedimentos de esterilização acima citados como pela inclusão de diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol ácido sórbico, e similares. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e similares nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser obtida pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como o monoestearato de alumínio e a gelatina. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pó estéril para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. 0 uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido no estado da técnica. Exceto se qualquer meio ou agente convencional for incompatível com o composto ativo, é previsto o uso dos mesmos nas composições farmacêuticas da invenção. Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados às composições.
As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada na forma de uma solução, micro-emulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e similares) e suas misturas apropriadas.
A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, mediante o uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e mediante o uso de surfactantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoóis, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida incluindo-se na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
Soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas incorporando-se o composto ativo na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de micro-filtração para esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo num veículo estéril que contenha um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles citados acima. No caso de pós-estéreis para a preparação de soluções estéreis injetáveis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liof ilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer outro ingrediente desejado de uma solução previamente filtrada-esterilizada do mesmo.
A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo a ser tratado, e do modo específico de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única será geralmente aquela quantidade da composição que produza um efeito terapêutico. Geralmente, de 100(cem) por cento, essa quantidade variará de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento do ingrediente ativo, preferivelmente de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, o mais preferivelmente de cerca de 1 por cento a cerca de 3 0 por cento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Regimes de dosagem são ajustados para prover a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica).
Por exemplo, um bolus simples pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma unitária de dosagem para facilitar a administração e a uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem, conforme aqui utilizada, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada do composto ativo calculada para produzir um efeito terapêutico desejado em associação com um veículo farmacêutico requerido. A especificação para as formas unitárias de dosagem da invenção é ditada por e diretamente dependente(s) (a) das características inéditas do composto ativo e o efeito terapêutico específico a ser obtido, e (b) das limitações inerentes à técnica de se combinar tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Para administração do anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kg do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg. Dosagens maiores, por exemplo, 15 mg/kg do peso corporal, 20 mg/kg do peso corporal, ou 25 mg/kg do peso corporal podem ser utilizadas quando necessário. Um regime de tratamento representativo envolve a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada três meses, ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem particulares para um anticorpo anti-08E da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal via administração intravenosa, com o anticorpo sendo administrado utilizando-se um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) a cada quatro semanas para seis dosagens, e então a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg peso corporal uma vez seguida de 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.
Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais anti-08E da invenção, com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, e neste caso a dosagem de cada anticorpo administrado enquadra-se nas faixas indicadas. O anticorpo é geralmente administrado em ocasiões múltiplas. Intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Os intervalos podem ser também irregulares conforme indicado medindo-se os níveis sangüíneos de anticorpo em relação ao antígeno alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração plasmática de anticorpo de cerca de 1-1000 μg/ml e em alguns métodos de cerca de 25- 300 μg/ml.
Em outros métodos, um ou mais anticorpos monoclonais anti-08E desta invenção são administrados simultaneamente com um anticorpo tendo especificidade de ligação distinta tal como, por exemplo, anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1, em dito caso, a dosagem de cada um dos anticorpos administrado está dentro das faixas indicadas. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, onde é necessária a administração menos freqüente. A dosagem e a freqüência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguido dos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos não-humanos. A dosagem e freqüência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente não freqüentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto da vida. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é às vezes necessária até que a progressão da doença seja reduzida ou extinta, e preferivelmente, até que o paciente mostre melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Em seguida, o paciente pode receber um regime profilático.
Os níveis efetivos de dosagem dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem variar de forma a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições específicas da presente invenção empregadas, ou do és ter, sal ou amida das mesmas, da rota de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto específico que estiver sendo empregado; da duração do tratamento; de outros fármacos; compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições específicas empregadas, da faixa etária, do sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico prévio do paciente sendo tratado, e fatores similares bastante conhecidos na área médica.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-08E da invenção preferivelmente resulta em redução na severidade dos sintomas da doença, em um aumento na freqüência e duração dos períodos livres de sintomas da doença, ou na prevenção de deficiência ou incapacidade devido à aflição causada pela doença. Por exemplo, para o tratamento de tumores mediados por 08E+, uma "dosagem terapeuticamente eficaz" preferivelmente inibe o crescimento celular ou o crescimento tumoral em cerca de pelo menos 20%, mais pref erivelmente em cerca de pelo menos 40%, ainda mais pref erivelmente em cerca de pelo menos 60%, e ainda mais pref erivelmente em cerca de pelo menos 80% em relação aos indivíduos não tratados. A capacidade de um composto inibir o crescimento tumoral pode ser avaliada num sistema de modelo animal previsível de eficácia em tumores humanos. Alternativamente, essa propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando-se a capacidade de o composto inibir o crescimento celular, tal inibição podendo ser medida in vitro através de ensaios conhecidos no estado da técnica. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode reduzir o tamanho do tumor, ou de outra forma melhorar sintomas num indivíduo. Um habilitado na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores tais como, tamanho do indivíduo, severidade dos sintomas do indivíduo, e a composição específica ou via de administração escolhida. Uma composição da presente invenção pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração utilizando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica. Conforme será apreciado por um técnico no assunto, a rota e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados. As rotas preferidas de administração para anticorpos da invenção incluem as vias intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias parenterais de administração, como por exemplo, através de injeção ou infusão. A expressão "administração parenteral" conforme aqui utilizada significa os modos de administração que não a administração enteral e tópica, geralmente através de injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinhal, epidural e intraesternal.
Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado através de uma via não parenteral, tal como a via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.
Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protejam o composto contra liberação rápida, tal como formulação de liberação controlada, incluindo os implantes, adesivos transdérmicos, e sistemas de liberação micro-encapsulados. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed. Mareei Dekker, Inc.New York, 1978 .
As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, em uma configuração preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tais como os dispositivos descritos nas patentes americanas Nos. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos úteis na presente invenção incluem: patente americana No. 4.487.603 que descreve uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação a uma taxa controlada; a patente americana No. 4.486.194, que descreve um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; a patente americana No. 4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicação para liberar medicação a uma taxa de infusão precisa; a patente americana 4.447.224 que descreve um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para liberação contínua de fármaco; a patente americana No. 4.439.196 que descreve um sistema osmótico de liberação de fármaco tendo compartimentos de câmaras múltiplas; e a patente americana No. 4.475.196, que descreve um sistema osmótico de liberação de fármaco. Essas patentes são aqui incorporadas por referência. Muitos outros desses implantes, sistemas de liberação, e módulos são conhecidos no estado da técnica.
Em certas configurações, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para garantir a distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira hemato-encefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticos da invenção atravessem a barreira hemato-encefálica (BBB) (se desejado) eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de preparação de lipossomas, vide, por exemplo, as patentes americanas Nos. 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas para dentro de células ou órgãos específicos, para assim aumentar a liberação direcionada de fármaco (vide, por exemplo, V.V.Ranade (1989) J.Clin.Pharmacol.29:685) . Exemplos de porções direcionadoras incluem o folato ou a biotina (vide, por exemplo, a patente americana No. 5.416.016 de Low et al.); manosídeos (Umezawa et al. , (1988) Biochem.Biophys.Res.Commun. 153:1038) ; anticorpos (P.G.Bloeman et al.(1995) FEBS Lett.357:140; M.Owais et al.(1995) Antimicrob.Agents Chemother. 3_9:180) ; receptor de proteína A de surfactante (Briscoe et al. (1995) Am.J.Physiol., 1233:134) ; pl20 (Schreier et al. (1994) J.Biol.Chem., 269:9090) ; vide também K. Keinanen; M.L.Laukkanen (1994) FEBS Lett., 346:123 ; J.J.Killion; I.J.Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Usos e Métodos da Invenção
Os anticorpos, particularmente os anticorpos humanos, composições de anticorpos e métodos da presente invenção possuem numerosas utilidades terapêuticas e de diagnósticos in vitro e in vivo, envolvendo, por exemplo, detecção de 08E, tratamento de câncer ou responda imune melhorada pelo bloqueio de 08E. Em uma configuração preferida, os anticorpos da presente invenção são anticorpos humanos. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou em indivíduos humanos, por exemplo, in vivo, para tratar, para prevenir e para diagnosticar uma variedade de distúrbios ou para melhorar a imunidade em uma variedade de situações.
Conforme aqui utilizado, o termo "indivíduo" pretende incluir animais humanos e não-humanos. 0 termo "animais não-humanos" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não-mamí feros, tais como primatas não- humanos, carneiros, cães, gatos, vacas, cavalos, frangos, anfíbios e répteis. Indivíduos preferidos incluem pacientes humanos tendo distúrbios associados com a expressão de 08E ou necessitando de uma resposta imune melhorada. Os métodos são particularmente apropriados para tratar pacientes humanos tendo um distúrbio associado com a expressão anormal de 08E. Os métodos são responsáveis pelo aumento da resposta imune mediada pela célula T. Para conseguir uma melhora na imunidade antígeno-específico, os anticorpos anti-08E podem ser administrados junto com um antígeno de interesse. Quando os anticorpos ao 08E são administrados juntamente com um outro agente, os dois podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente.
Dada a ligação específica dos anticorpos da invenção para o 08E, os anticorpos da invenção podem ser utilizados para detectar, especificamente, a expressão de 08E na superfície das células e, além disso, podem ser utilizados para purificação do O8E, através da purificação por imuno-afinidade.
Câncer
O O8E é expresso em uma variedade de cânceres humano, incluindo carcinoma de células renais, câncer de mama com metástase, carcinomas de célula de ovário, cânceres de ovário com metástase e carcinomas de célula renal (Tringler et al., (2005) Clinicai Câncer Res. 11:1842-48; Salceda et al., (2005) Exp. Cell Rs. 306:128-41; Tringler et al., (2 006) Gynecol Oncol. 100:44-52; Krambeck et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 103 :10391-6; Chen et al. , (2006) Kidney Int. Epub; Sun et al. , (2006) Lung Câncer 53_: 143-51; Bignotti et al. , (2006) Gynecol Oncol., 103:405-16; Kryczek et al. , (2006) J. Exp. Med. 203 :871- 81; Simon et al. , (2006) Câncer Res., 66:1570-5). Um anticorpo anti-08E pode ser utilizado sozinho para inibir o crescimento dos tumores cancerígenos. Alternativamente, um anticorpo anti-08E pode ser utilizado em conjunto com outros agentes imunogênicos, tratamentos padrões de cânceres ou outros anticorpos, como descrito abaixo. O atenuador de linfócitos BeT (BTLA) foi descoberto por ser o receptor para 08E e ter um efeito inibitório em respostas imunes, similar à do antígeno-4 do linfócito T citotóxico (CTLA-4) e morte-1 programada (PD-I) (Carreno e Collins (2003) Trends Immunol. 24:524-7). As funções de 08E pela imunidade da célula T regulada negativamente pela inibição da proliferação da célula T, produção de citocinas e a produção do ciclo celular (Choi et al., (2003) J. Immunol. 171:4650-4). Uma proteína de fusão 08E-Ig inibe a ativação da célula T, enquanto o bloqueia do 08E pelo anticorpo pode melhorar a resposta imune no paciente (Sica et al.,(2003) Immunity 18:849-61).
Em um aspecto, a presente descrição refere-se ao tratamento de um indivíduo in vivo usando um anticorpo anti-08E de modo que o crescimento de tumores cancerígenos seja inibido. Um anticorpo anti-08E pode ser utilizado sozinho para inibir o crescimento de tumores cancerígenos. Alternativamente, um anticorpo anti-08E pode ser utilizado em conjunto com outros agentes imunogênicos, tratamentos padrões de câncer ou com outros anticorpos, como descrito a seguir.
Conseqüentemente, em uma configuração, esta invenção provê um método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-08E (tal como qualquer um dos anticorpos 08E anti-humano descritos aqui). Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo anti- 08E quiméricos ou humanizados.
Cânceres preferidos cujo crescimento pode ser inibido utilizando-se os anticorpos da invenção incluem cânceres tipicamente responsivos a imunoterapia. Exemplos não restritivos de cânceres preferidos para tratamento incluem câncer de mama (por exemplo, carcinoma de células mamárias), câncer de ovário (por exemplo, carcinoma de célula de ovário) e carcinoma de células renais (RCC). Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados utilizando os métodos desta invenção incluem, melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastástico), câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de osso, câncer pancreático, câncer de pele, câncer cerebral, leucemias crônicas ou agudas, incluindo leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crônica, linfomas (por exemplo, linfoma de Hodgkin e não- Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma CNS primário, linfoma de célula T) carcinoma nasofaringeal, câncer de cabeça e pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer testicular, câncer das trompas de Falópio, uterino, carcinoma de vagina, carcinoma da vulva, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glande paratireóide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos em crianças, câncer da bexiga, câncer do rim ou do ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, câncer epidermóide, câncer de células escamosas, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo os induzidos por amianto, por exemplo, mesotelioma e combinações dos referidos cânceres.
Opcionalmente, os anticorpos para 08E podem ser combinados com um agente imunogênico, tais como células cancerosas, antígenos de tumor purificados (incluindo proteínas recombinantes, peptídeos e moléculas de carboidratos) , células e células transfectadas com genes codificando as citocinas estimulantes da resposta imune (He et al., J. Immunol. 173:4919-28 (2004)). Exemplos não limitativos de vacinas de tumor que podem ser utilizadas incluem, peptídeos de antígenos de melanoma, tais como os peptídeos de gplOO, antígenos MAGE, Trp-2, MARTl e/ou tirosinase ou células de tumor transfectadas para expressar a citocina GM-CSF.
Em humanos, alguns tumores têm demonstrado ser imunogênicos tais como melanomas. Isto é antecipado pelo fato de elevar o limiar da ativação da célula T pelo 08E bloqueado, os tumores pode ser ativado em respostas nos hospedeiros.
0 08E bloqueado é provavelmente mais eficaz quando combinado com um protocolo de vacina. Muitas estratégias experimentais para vacinação contra os tumores foram divisadas (ver, Rosenberg, "Developmento of Câncer Vaccines", ASCO Educacional Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000); Khayat, ASCO Educacional Book Spring: 414-428 (2000); Foon, ASCO Educacional Book Spring: 730-738 (2000) ; ver também Restifo e Sznol, Câncer Vaccines, Ch. 61, PP. 3023-3043 em DeVita et al., (ed.) Câncer: Principies and Practice of Oncology, Fifth Edition (1997)). Em uma destas estratégias, uma vacina é preparada usando células de tumores autólogos ou alogênicos. Tipicamente, estas vacinas celulares são mais eficazes quando as células tumorais são transduzidas para expressar GM-CSF. A GM-CSF tem demonstrado ser um ativador potente da preservação do antígeno para a vacinação tumoral (Dranoff et al. , "Proc. Natl. Acad. Sci.", U.S.A. 90:3539-43 (1993)).
0 estudo da expressão gênica e o padrão de expressão gênica, em ampla escala, em vários tumores conduz à definição de assim chamado antígenos de tumores específicos (Rosenberg, Immunity ^0:281-7(1999)). Em muitos casos, estes antígenos específicos para tumores serem antígenos de diferenciação expressos em tumores e nas células nas quais esses tumores surgem, por exemplo, antígenos de melanócitos gplOO, antígenos MAGE e Trp-2. Mais importante ainda, muitos destes antígenos podem demonstrar ser alvos das células T tumor específicas encontradas no hospedeiro. 0 08E bloqueado pode ser utilizado em conjunto com uma coleção de proteínas recombinantes e/ou peptídeos expressos em um tumor de modo a produzir uma resposta imune para estas proteínas. Estas proteínas são normalmente vistas pelo sistema imune como auto-antígeno e são, portanto, tolerantes a eles. 0 antígeno do tumor pode também incluir a proteína telomerase, que é requerido para a síntese de telômeros dos cromossomos e os quais são expressos em mais que 85% dos cânceres humanos e em apenas um número limitado de tecidos somáticos (Kim et al., "Science", 266:2011-2013 (1994)). (Estes tecidos somáticos podem ser protegidos do ataque imune por vários meios). O antígeno do tumor pode também ser "neo-antígenos" expressos em células de câncer devido as mutações somáticas que alteram a seqüência de proteína ou para criar as proteínas de fusão entre duas seqüências não-relacionadas (ou seja, b cr-abl no cromossomo Philadelphia) ou idiotipo dos tumores de célula B.
Outras vacinas para tumor podem incluir as proteínas de viroses implicadas nos cânceres humanos, tais como um Vírus do Papiloma Humano (HPV), Vírus da Hepatite (HBV e HCV) e Vírus do Sarcoma de Herpes de Kaposi (KHSV) . Uma outra forma de antígeno tumor específico que pode ser utilizado em conjunto com o 08E bloqueado é purificar a proteína de choque térmico (HSP isolada do tecido tumoral em si. Estas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas das células tumorais e estes HSPs são altamente eficientes na liberação do antígeno presentes nas células para retirar a imunidade do tumor (Suot e Srivastava "Science", 269:1585-1588 (1995)); Tamura et al., "Science", 278:117-120 (1997)).
As células dendríticas (DC) são antígenos potentes apresentando células que podem ser utilizadas para iniciar as respostas antígeno-especificas. As DC's podem ser produzidas ex vivo e são carregadas com várias proteínas e antígenos de peptídeos bem como extratos de células tumorais (Nestle, F. et al. , (1998), Nature Medicine 4:328-332). As DCs podem também ser transduzidas por meios genéticos para expressar estes antígenos tumorais bem como. As DCs também são fundidas diretamente às células tumorais para o propósito de imunização (Kugler, A. et al., (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como um método de vacinação, a imunização de DC pode ser efetivamente combinada com o PD-I bloqueado para ativar respostas imunes anti-tumorais mais potentes. O O8E bloqueado pode também ser combinado com tratamentos de câncer padrão. O O8E bloqueado pode ser efetivamente combinado com regimes quimio-terapêuticos. Nestes exemplos, pode ser possível reduzir a dose de reagente quimio-terapêutico administrado (Mokyr, M. et al., (1998) "Câncer Research", 58^5301-5304). Um exemplo da referida combinação é um anticorpo anti-08E em combinação com decarbazina para o tratamento de vários cânceres. Um outro exemplo da referida combinação é um anticorpo anti- O8E em combinação com interleucina-2 (IL-2) para o tratamento de vários cânceres. A razão científica atrás do uso combinado do 08E bloqueado e da quimioterapia é que a célula morre, isto ocorre em conseqüência da ação citotóxica de muitos compostos quimio-terapêuticos, resultando em um nível aumentado dos antígenos tumorais na via de apresentação do antígeno. Outras terapias combinadas que podem resultar em sinergia com o 08E bloqueado através da morte celular é a radiação, cirurgia e deprivação hormonal. Cada um destes protocolos cria uma fonte de antígeno tumoral no hospedeiro. Os inibidores de angiogênese podem também ser combinado com o 08E bloqueado. A inibição da angiogênese conduz à morte da célula tumoral que pode alimentar o antígeno tumoral dentro das vias de apresentação do antígeno no hospedeiro.
Os anticorpos bloqueadores de 08E podem também ser utilizados em combinação com anticorpos biespecíficos que buscam o Fc-alfa ou as células efetoras expressando o receptor Fc-gama para as células tumorais (ver, por exemplo, as patentes americanas U.S. Nos.: 5,922,845 e 5,837,243). Os anticorpos biespecíficos podem ser utilizados para buscar dois antígenos separados. Por exemplo, receptor anti-Fc/antígeno anti-tumoral (por exemplo, Her-2/neu) anticorpos biespecíficos foram utilizados para buscar os macrófagos nos sítios tumorais.
Esta verificação pode ativar, mais efetivamente, as respostas tumorais específicas. A arma da célula T destas respostas seria pelo aumento do uso do 08E bloqueado. Alternativamente, o antígeno pode ser liberado diretamente para as DCs pelo uso dos anticorpos biespecíf icos que se ligam ao antígeno tumoral e um marcador de superfície de células específico para as células dendríticas.
Os tumores esquivam-se da vigilância do sistema imune do hospedeiro por uma ampla variedade de mecanismos. Muitos destes mecanismos podem ser contornados pela inativação das proteínas que são expressas pelos tumores e que são imuno-supressivas. Estas incluem, dentre outras, TGF-beta (Kehrl, J, et al. , (1986), J. Exp. Med. 163 :1037-1050) , IL-10 (Howard, M & O'Garra, A. (1992) "Immunology Today", 13:198-200) e o ligante Faz (Hahne, M. et al. , (1996) "Science" 274:1363-1365). Os anticorpos para cada uma destas entidades podem ser utilizados em combinação com o anti-PD-I para contra-agir aos efeitos do agente imunossupressor e em favor das respostas imunes aos tumores pelo hospedeiro.
Outros anticorpos podem ser utilizados para ativar a responsividade do sistema imune do hospedeiro podem ser utilizados em combinação com o anti-08E. estes incluem moléculas na superfície das células dendríticas que ativam a função DC e a apresentação do antígeno. Os anticorpos anti-CD40 são capazes de substituir, efetivamente, a atividade dos auxiliares das células T (Ridge, J. et al., (1998) "Nature" 393:474-(478) , e podem ser utilizados em conjunto com os anticorpos 08E. Os anticorpos ativam as moléculas co-estimuladoras da célula T tais como CTLA-4 (por exemplo, a patente U.S. No.: 5,811,097), 0X-40 (Weinberg, A. et al., (2000) "Immunol.", 164:2160-2169), 4-1ΒΒ (Melero, I. et al., (1997)) "Nature Medicine" 3:682-685 (1997), PD-I (Del Rio, et al., (2005) "Eur. J. Immunol.", 35:3545-60) e ICOS (HutIoff, A. et al., (1999) "Nature", 397:262-266)) pode também prover para níveis aumentados de ativação da célula T.
O transplante da medula óssea está sendo atualmente utilizado para tratar uma variedade de tumores de origem hematopoiética. Embora os enxertos verso doença do hospedeiro seja uma conseqüência deste tratamento, o benefício terapêutico pode ser obtido a partir do enxerto versos resposta do tumor. O O8E bloqueado pode ser utilizado para aumentar a eficácia das células T tumorais específicas ao doador de enxerto.
Existem vários protocolos de tratamento experimentais severos que envolvem a ativação ex vivo e a expansão das células específicas do antígeno e a transferência adotiva destas células dentro dos receptores de modo que as células T antígeno-específico ajam contra o tumor (Greenberg, R. & Riddell, S. (1999) "Science" 285:546- 51). Estes métodos podem ser também utilizados para ativar as respostas das células T para os agentes infecciosos tais como CMV. A ativação ex vivo em presença dos anticorpos anti-O8E podem ser expressos para aumentar a freqüência e a atividade das células T transferidas adotivãmente.
Dada a expressão de O8E em várias células tumorais, os anticorpos humanos, as composições de anticorpos e os métodos da presente invenção podem ser utilizados para tratar um indivíduo com um distúrbio tumorigênico, por exemplo, um distúrbio caracterizado pela presença das células tumorais expressando 08E incluindo, por exemplo, câncer de mama (por exemplo, carcinoma de célula mamária), câncer de ovário (por exemplo, carcinoma de célula de ovário), e câncer renal. Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados usando os métodos da presente invenção incluem, melanoma (por exemplo, melanoma maligno com metástase), câncer de próstata, câncer de colo e câncer de pulmão, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma da cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, linfoma de não-Hodkin, leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de Burkitt, Iinfornas de células anaplásticas grandes (ALCL), mieloma múltiplo, linfoma de célula T cutânea, linfornas de células clivadas de pequenos nódulos, linfomas Iinfocíticos, linfomas de célula T periférica, linfoma de Lennert, linfomas imunoblásticos,
leucemia/linfomas de célula T (ATLL), leucemia de célula T adulta (T-ALL), câncer de linfoma folicular entroblástico/centrocítico (cb/cc), linfomas de células grandes difusas de linhagem B, linfoma de célula T do tipo linfoadenopatia angioimunoblástica (AILD), linfomas baseados na cavidade corpórea associado ao HIV, carcinomas embrionários, carcinomas não-diferenciados de rinofaringe (por exemplo, tumor de Schmincke), doença de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, e outros linfomas de célula B, cânceres de esôfago, cânceres de intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula da tiróide, cânceres da glândula paratireóide ], câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer de uretra, câncer de pênis, leucemia crônica ou aguda, incluindo leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, tumores sólidos em criança, linfoma linfocítico, câncer de bexiga, câncer de rim ou uretra, carcinoma da pelve renal, neoplasma do sistema nervoso central (CNS), linfoma primário CNS, glioblastoma, tumores cerebrais, carcinoma nasofaringeal, angiogênesis tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, câncer epidermóide, câncer de célula escamosa, Iinforna da célula T, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo aqueles induzidos por amianto, e combinações dos referidos cânceres. A presente invenção também é útil para o tratamento de cânceres com metástase.
Conseqüentemente, em uma configuração, esta invenção provê um método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-08E ou de uma porção ligante ao antígeno do mesmo. Tipicamente, o anticorpo é um anticorpo anti-08E humano (tal como qualquer um dos anticorpos anti-08E humano descritos aqui). Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo anti- 08E quimérico ou humanizado.
Doenças infecciosas
Outros métodos desta invenção são utilizados para tratar pacientes que foram expostos às toxinas ou patógenos particulares. Conseqüentemente, um outro aspecto desta invenção provê um método para tratar uma doença infecciosa em um indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo de um anticorpo anti-08E ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, de modo que o indivíduo é tratado para a doença infecciosa. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo anti-08E humano (tal como qualquer um dos anticorpos anti-08E humano descrito aqui) . Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou humanizado.
Similar à sua aplicação aos tumores como discutido acima, o anticorpo mediado pelo 08E bloqueado pode ser utilizado sozinho ou como um adjuvante, em combinação com vacinas, para estimular a resposta imune aos patógenos, toxinas e auto-antígenos. Exemplos dos patógenos para os quais este experimento terapêutico pode ser particularmente útil, incluindo patógenos para os quais não existe atualmente uma vacina eficaz ou patógenos para os quais as vacinas convencionais são menos completamente eficazes. Estes incluem, mas não se limitam ao HIV, Hepatite (A, B, & C) , Influenza, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas Aeruginosa. PD-I bloqueado é, particularmente, útil contra as infecções estabelecidas pelos agentes tais como HIV que apresentam antígenos alterados durante o curso da infecção. Estes novos epítopos são reconhecidos como exógenos no período de administração do 08E anti-humano provocando, assim, uma forte resposta das células T que não é amortecido pelos sinais negativos através do 08E.
Alguns exemplos de vírus patogênicos causadores de infecções tratáveis pelos métodos desta invenção incluem, HIV, hepatite (A, B ou C), vírus da herpes (por exemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II e CMV, vírus Epstein Barr), adenovírus, vírus Influenza, flavivírus, ecovírus, rinovírus, vírus Coxsackie, cornovírus, vírus sincitial respiratório, vírus de caxumba, rotavírus, vírus de sarampo, vírus da rubéola, parvovírus, vírus da vaccínia, vírus HTLV, vírus da dengue, papilomavírus, vírus de molusco, poliovírus, vírus da raiva, vírus JC e vírus de encefalite arboviral.
Alguns exemplos de bactérias patogênicas causadoras de infecções, tratáveis pelos métodos desta invenção incluem, clamídia, bactéria Ricketsia, micobactéria, Estafilococos, Estreptococos, Pneumococos, Meningococos e Conococos, Klebisiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, legionella, difteria, Salmonela, Bacilus, Cólera, Tetanus, Botulismo, Anthrax, Peste, Leptospirose, e bactéria da doença de Lymes.
Alguns exemplos de fungos patogênicos causadores de infecção tratáveis pelos métodos desta invenção incluem Candida (albicns, krusei, glabrata, tropicalis, etc..), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc..), gênero Mucorales (mucor, absidia, rhisophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Ccoeidioides immitis e Histoplasma eapsulatum.
Alguns exemplos de parasitas patogênicos causadores de infecções que são tratáveis pelos métodos desta invenção incluem Entamoeba histolítica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lâmia, Cryptosporidim sp. , Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi, Nippostrongylus brasiliensis.
Em todos os métodos acima, 08E bloqueado pode ser combinado com outras formas de imunoterapia tais como tratamento de citocinas (por exemplo, interferon, GM-CSF, G-CSF, IL-2) ou terapia do anticorpo biespecíficos, que provê uma apresentação melhorada dos antígenos tumores (ver, por exemplo, Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sei., USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121- 1123).
Reações Auto-imunes
Os anticorpos anti-08E pode provocar e amplificar as respostas auto-imunes. Ao contrário, a indução das respostas anti-tumor usando as células tumorais e as vacinas de peptídeos revelam que muitas das respostas anti-tumor envolvem uma anti-auto-reatividade (despigmentação observada em anti-CTLA-4 + GM-CSF- modifiçada B16 melanoma em van Elsas et al. , supra; despigmentação em camundongos vacinados com Trp-2 (Overwijk, W. et al. , (1999), "Proc. Natl. Acad. Sci.", U.S.A. 96:2982-2987); prostatites auto-imune evocada pelas vacinas de células tumorais TRAMP (Hurwitz, A. (2000) supra), vacinação para melanoma do antígeno peptídeo e vitiligo observado em triagem clínica humana (Rosenberg, AS e White, DE (1996) "J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol.", 1^9(1) :81-4) .
Portanto, é possível considerar o uso do anti-08E bloqueado em conjunto com várias auto-proteínas de modo a dividir os protocolos de vacinação para produzir eficientemente, respostas imunes contra estas auto- proteínas para o tratamento da doença. Por exemplo, a doença de Alzheimer envolve o acúmulo imediato do peptídeo Ab em depósitos amilóides no cérebro; respostas dos anticorpos dentro dos amilóides são capazes de limpar estes depósitos de amilóides (Schenk et al. , (1999) "Nature", 400:173-177).
Outras auto-proteínas também podem ser utilizadas como alvos tais como IgE para o tratamento de alergia e asma e TNFa para a artrite reumatóide. Finalmente, a resposta dos anticorpos para vários hormônios pode ser induzida pelo uso do anticorpo anti-08E. A neutralização das respostas dos anticorpos aos hormônios reprodutivos pode ser utilizada para contracepção. A neutralização da resposta do anticorpo para os hormônios e outros fatores solúveis que são requeridos para o crescimento de tumores particulares pode também ser considerada como possíveis alvos para a vacinação.
Métodos análogos como descrito acima para o uso de anticorpos anti-08E podem ser utilizados para indução de respostas auto-imunes terapêuticas para tratar pacientes tendo um acúmulo inadequado de outros auto-antígenos, tais como depósitos de amilóides, incluindo Αβ na doença de Alzheimer, citocinas tais como TNFa e IgE.
Vacinas
Os anticorpos anti-08E podem ser utilizados para estimular respostas imunes antígeno-específico por co- administração de um anticorpo anti-08E com um antígeno de interesse (por exemplo, uma vacina) . Conseqüentemente, em um outro aspecto desta invenção é provido um método para melhorar uma resposta imune para um antígeno em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo: (i) do anticorpo; e (ii) um anticorpo anti-08E ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, de modo que uma resposta imune ao antígeno no indivíduo seja melhorada. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo 08E anti- humano humano (tal como qualquer um dos anticorpos anti- O8Ε humano descrito aqui). Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou humanizado. O antígeno pode ser, por exemplo, um antígeno tumoral, um antígeno viral, um antígeno bacteriano ou um antígeno a partir de um patógeno. Exemplos não limitativos dos referidos antígenos incluem àqueles discutidos nas seções acima, tais como os antígenos tumorais (ou vacinas tumorais) discutidas acima ou antígenos obtidos de vírus, bactérias ou outros patógenos descritos acima.
Rotas apropriadas de administração das composições de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da invenção, in vivo e in vitro, são bem conhecidas do estado da técnica e podem ser selecionadas pelos técnicos no assunto. Por exemplo, as composições de anticorpos podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). As dosagens apropriadas das moléculas utilizadas dependerão da idade e do peso do indivíduo e da concentração e/ou formulação da composição de anticorpos.
Como previamente descrito, os anticorpos anti-08E humanos da invenção podem ser co-administrados com um ou mais de outros agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunosupressivo. O anticorpo pode estar ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado de forma separada do agente. No último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou concomitantemente com o agente ou, pode ser co- administrado com outras terapias conhecidas, por exemplo, terapia anti-câncer, por exemplo, radiação. Os referidos agentes terapêuticos incluem, dentre outros, agentes anti-neoplásicos, tais como doxorubicina (adriamicina), sulfato de bleomicina cisplatina, carmustina, clorambucil, decarbazina e hidroxiuréia de ciclofosfamida que, por si mesmos, são eficazes apenas em níveis que são tóxicos ou sub-tóxicos ao paciente. A cisplatina é administrada intravenosamente em uma dosagem de 100 mg/dose uma vez a cada quatro semanas e a adriamicina é administrada intravenosamente em uma dosagem de 60-75 mg/dose uma vez a cada 21 dias. A co-administração dos anticorpos anti-08E humanos ou dos fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, da presente invenção com os agentes quimio-terapêuticos provêem dois agentes anti-câncer, que operam via mecanismos diferentes o que resulta em um efeito citotóxico para as células tumorais humanas. A referida co-administração pode resolver o problema devido ao desenvolvimento de resistência ao fármaco ou a uma alteração na antigenicidade das células tumorais que resultariam em uma não-reatividade deles com o anticorpo. Também dentro do escopo da presente invenção estão os kits compreendendo as composições de anticorpos da invenção (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas biespecíficas ou multiespecíficas ou imunoconjugados) e instruções para uso. O kit pode conter ainda pelo menos um reagente adicional ou um ou mais anticorpos humanos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo humano tendo uma atividade complementar que se liga a um epítopo no antígeno 08E distinto daquele do primeiro anticorpo humano). Os kits tipicamente incluem um marcador indicando a intenção de uso do conteúdo do kit. 0 termo marcador inclui qualquer material descrito ou registrado fornecido em ou com o kit ou que de outra forma acompanha o kit.
Terapia combinada
Em uma configuração, a presente invenção provê um método para tratar uma doença hiper-proliferativa, compreendendo a administração de um anticorpo 08E e um anticorpo CTLA-4 e/ou PD-I ao indivíduo. Em configurações adicionais, o anticorpo anti-08E é administrado em uma dose sub- terapêutica, o anticorpo anti-CTLA-4 e/ou PD-I é administrado em uma dose sub-terapêutica ou ambos são administrados em uma dosagem sub-terapêutica. Em uma outra configuração, a presente invenção provê um método para alterar um efeito colateral associado com o tratamento de uma doença hiper-proliferativa com um agente imunoestimulatório, compreendendo a administração de um anticorpo anti-08E e uma dose sub-terapêutica do anticorpo anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 a um indivíduo. Em certas configurações, o indivíduo é um humano. Em determinadas configurações, o anticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo monoclonal de seqüência humana 10Dl e o anticorpo anti-PD-1 é um anticorpo monoclonal de seqüência humana, tal como 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 e 4A11. O anticorpo monoclonal de seqüência humana IODl foi isolado e estruturalmente caracterizado, como descrito na patente americana U.S. No.: 6,984,720. Os anticorpos monoclonais da seqüência humana 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 e4 All foram isolados e estruturalmente caracterizados, como descrito no pedido de patente provisório No.: 60/679,466.
O anticorpo anti-08E, anti-CTLA-4 e os anticorpos monoclonais anti-PD-1 (mAbs) e os anticorpos de seqüência humana desta invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo a metodologia do anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização padrão de célula somática de Kohler e Milstein (1975), "Nature", 256:595. Qualquer técnica para produzir anticorpo monoclonal pode ser empregada, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B. Um sistema animal para preparo de hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridomas em camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos de 30 imunização e técnicas para isolamento dos esplenócitos imunizados para fusão também são conhecidos (ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York).
A combinação dos anticorpos é útil para melhorar a resposta imune contra uma doença hiperproliferativa pelo bloqueio de 08E e PD-1 e/ou CTLA-4. Em uma configuração preferida, os anticorpos da presente invenção são anticorpos humanos. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas âs células em cultura, in vitro e ex vivo ou para o indivíduo humano, por exemplo, in vivo, para melhorar a imunidade em uma variedade de situações. Conseqüentemente, em um aspecto, esta invenção provê um método para modificar uma resposta imune em um indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo de uma combinação de anticorpos ou uma combinação de porções ligantes ao antígeno dos mesmos, da invenção, de modo que a resposta imune do indivíduo seja modificada. Preferivelmente, a resposta é melhorada, estimulada ou super-regulada. Em uma outra configuração, em um exemplo da invenção é provido um método para alterar os efeitos colaterais associados com o tratamento de uma doença hiper-proliferativa com um agente terapêutico imunoestimulatório, compreendendo a administração de um anticorpo anti-08E e uma dose sub-terapêutica do anticorpo anti-CTLA-4 e anti-PD-1 a um indivíduo.
Com o 08E bloqueado, os anticorpos PD-I e CTLA-4 podem melhorar a resposta imune para as células cancerígenas em um paciente. Os cânceres cujo crescimento pode ser inibido utilizando os anticorpos da presente invenção incluem cânceres tipicamente responsivos à imunoterapia.
Exemplos representativos dos cânceres para tratamento com a terapia combinada da presente invenção incluem melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastástico), câncer renal, câncer de próstata, câncer mamário, câncer de cólon e câncer de pulmão. Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados utilizando os métodos da presente invenção incluem câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça e de pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intra-ocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer testicular, câncer das trompas de Falópio, uterino, carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, linfoma de não Hodgkins, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer da uretra, câncer do pênis, leucemias crônicas ou agudas, incluindo leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crônica, tumores sólidos em crianças, linfoma linfocítico, câncer da bexiga, câncer do rim ou do ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), linfoma CNS primário, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, câncer epidermóide, câncer de células escamosas, linfoma de células T, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo àqueles induzidos por amianto e combinações dos referidos cânceres. A presente invenção também é útil para o tratamento de cânceres com metástase.
Em determinadas configurações, a combinação de anticorpos terapêuticos discutidos aqui pode ser administrada concomitantemente como uma composição única em um veículo farmaceuticamente aceitável ou concomitantemente como composições separadas com cada um dos anticorpos em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra configuração, a combinação de anticorpos terapêuticos pode ser administrada seqüencialmente. Por exemplo, um anticorpo anti-08E e um anticorpo anti-PD-1 podem ser administrados seqüencialmente, de modo que o anti-08E seja administrado primeiro e o anti-PD-1 em segundo ou o anti-PD-1 seja administrado primeiro e o anti-08E em segundo. Além disso, se mais do que uma dose da terapia combinada for administrada seqüencialmente, a ordem a administração seqüencial pode ser intercalada ou mantida na mesma ordem em cada um dos períodos de administração, as administrações seqüenciais podem ser combinadas com administrações concomitantes ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, a primeira administração de uma combinação de anticorpo anti-08e e do anticorpo anti-PD-I pode ser concomitante, a segunda administração pode ser seqüencial com o anti-08E primeiro e o anti-PD-1 em segundo e a terceira administração pode ser seqüencial com o anti-PD-1 primeiro e o anti-08E em segundo, etc.. Um outro esquema de dosagem representativo envolve uma primeira administração que é seqüencial com o anti-PD-1 primeiro e o anti-08E em segundo e administrações subseqüentes podem ser concomitante.
Opcionalmente, a combinação de anti-08E e de anticorpos anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 pode ser, adicionalmente, combinada com um agente imunogênico, tal como, células cancerígenas, antígenos de tumor purificados (incluindo proteínas recombinantes, peptídeos e moléculas de carboidratos) , células e células transfectadas com genes codificantes das citocinas estimulantes da resposta imune (He et al., (2004), "J. Immunol.", 173:4919-28). Exemplos não limitativos de vacinas de tumor que podem ser utilizadas incluem peptídeos de antígenos de melanoma, tais como o peptídeo de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MARTl e/ou tirosinase ou células tumorais transfectadas para expressar a citocina GM-CSF (discutida ainda abaixo).
Um 08/e combinado e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueado podem ser combinados adicionalmente com um protocolo de vacinação. Muitas estratégias experimentais para vacinação contra tumores foram descritas (ver, Rosenber, S (2 000)) "Development of Câncer Vaccines", ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. (2000), ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K (2000) ASCO Educational Book Spring: 730-738; ver também Restifo e Sznol, "Câncer Vaccines", Ch. 61, PP. 3023-3043, em DeVita et al. , (Eds.), 1997, "Câncer: Principies and Practice of Oncology", Fifth Edition. Em uma destas estratégias, uma vacina é preparada usando as células tumorais autólogas ou alogênicas. Estas vacinas celulares foram demonstradas por serem mais eficazes quando as células tumorais são transduzidas para expressar GM-CSF. GM-CSF foi demonstrado por ser um potente ativador da apresentação do antígeno para a vacinação tumoral (Dranoff et al., (1993) "Proc. Natl. Acad. Sci.", U.S.A. 90:3539-43).
O estudo da expressão gênica e o padrão de expressão gênica em ampla escala, em vários tumores, foi conduzido para definição dos assim denominados antígenos específicos (Rosenberg (1999) "Immunity", 10:281-7). Em muitos casos, estes antígenos específicos para o tumor são antígenos diferenciados expressos nos tumores e nas células a partir das quais os tumores aparecem, por exemplo antígenos de melanócitos gplOO, antígenos MAGE e Trp-2. Mais importante, é que muitos destes antígenos podem demonstrar ser alvos das células T específicas para tumor encontrados nos hospedeiros. Em determinadas configurações, um 08E combinado e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueados usando as composições de anticorpos descritas aqui podem ser utilizadas em conjunto com uma coleção de proteínas recombinantes e/ou peptídeos expressos em um tumor de modo a produzir uma resposta imune destas proteínas. Estas proteínas são normalmente revistas sistema imune como auto-antígeno e são, portanto, tolerantes a ele. 0 antígeno do tumor pode também incluir a telomerase da proteína, que é requerida para a síntese do telômeros dos cromossomos e que são expressos em mais de 85% dos cânceres humanos e em apenas um número limitado dos tecidos somáticos (Kim et al., (1994) "Science", 266^:2011-2013). (Estes tecidos somáticos podem
ser protegidos a partir do ataque imune por vários meios) . O antígeno de tumor pode também ser "neo- antígeno" expresso em células de câncer devido as mutações somáticas que alteram a seqüência da proteína ou criam as proteínas de fusão entre duas seqüências não- relacionadas (ou seja, bcr-abl no cromossomo Philadelphia) ou idiotipo a partir dos tumores de célula B. Outras vacinas de tumor podem incluir as proteínas a partir de vírus implicados nos cânceres humanos tais como Vírus do Papiloma Humano (HPV), Vírus da Hepatite (HBV e HCV) e Vírus do Sarcoma de Herpes de Kaposi (KHSV). Uma outra forma de antígeno tumor específico que pode ser utilizado em conjunto com o 08E bloqueado é purificar a proteína de choque térmico (HSP) isolada do tecido tumoral em si. Estas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas das células tumorais e estes HSPs são altamente eficientes na liberação do antígeno presente nas células, para retirar a imunidade do tumor (Suot e Srivastava "Science", 269:1585-1588 (1995); Tamura et al., (1997) "Science", 278:117-120) . As células dendríticas (DC) são antígenos potentes apresentando células que podem ser utilizadas para iniciar as respostas antígeno-específicas. As DC's podem ser produzidas ex vivo e são carregadas com várias proteínas e antígenos de peptídeos bem como extratos de células tumorais (Nestle, F. et al., (1998), Nature Medicine 4:328-332). As DCs podem também ser transduzidas por meios genéticos para expressar estes antígenos tumorais bem como. As DCs também são fundidas diretamente às células tumorais para o propósito de imunização (Kugler, A. et al., (2000) Nature Medicine 6:332-336).
Como um método de vacinação, a imunização de DC pode ser efetivamente combinada com o PD-I bloqueado para ativar respostas imunes anti-tumorais mais potentes. Um 08E combinado e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueado podem também ser combinados com tratamentos padrões de câncer.
Por exemplo, um 08E combinado e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueado podem ser efetivamente combinados com regimes quimio-terapêuticos. Nestes exemplos, Omo é observado com a combinação dos anticorpos anti-08/e e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1, pode ser possível reduzir a dose do reagente quimio-terapêuticos administrado com a combinação dos exemplos da invenção (Mokyr, M. et al., (1998) "Câncer Research", 58:5301-5304). A razão científica atrás do uso combinado do 08E e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueado com a quimioterapia é que a célula morre, isto ocorre em conseqüência da ação citotóxica de muitos compostos quimio-terapêuticos, resultando em um nível aumentado dos antígenos tumorais na via de apresentação do antígeno. Outras terapias combinadas que podem resultar em sinergia com o 08E e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueado através da morte celular é a radiação, cirurgia e deprivação hormonal. Cada um destes protocolos cria uma fonte de antígeno tumoral no hospedeiro. Os inibidores de angiogêneses podem também ser combinados com um combinado 08E e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueado. A inibição da angiogêneses conduz à morte da célula tumoral, que pode também ser uma fonte de antígeno tumoral a ser alimentada dentro de uma via de apresentação do antígeno ao hospedeiro.
Uma combinação de anticorpos 08E e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueadores pode também ser utilizada em combinação com anticorpos biespecíficos que buscam o Fca ou as células efetoras expressando o receptor Fcy para as células tumorais (ver, por exemplo, as patentes americanas U.S. Nos.: 5,922,845 e 5,837,243). Os anticorpos biespecíficos podem ser utilizados para buscar dois antígenos separados. Por exemplo, receptor anti-Fc/antígeno anti- tumoral (por exemplo, Her-2/neu) anticorpos biespecíficos foram utilizados para buscar os macrófagos nos sítios tumorais. Esta verificação pode ativar, mais efetivamente, as respostas tumorais específicas. A arma da célula T destas respostas seria pelo aumento do uso de um 08E combinado e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueado.
Alternativamente, o antígeno pode ser liberado diretamente para as DCs pelo uso dos anticorpos biespecíficos que se ligam ao antígeno tumoral e um marcador de superfície de células específico para as células dendríticas.
Em um outro exemplo, uma combinação de anticorpos anti- PD-I e anti-CTLA-4 pode ser utilizada em conjunto com anticorpos anti-neoplásicos, tais como Rituxan® (rituximab) , Herceptin® (trastuzumab), Bexxar® (tositumomab) , Zevalin® (ibritumomab) , Compath® (alemtuzumab) , Lymphocide® (eprtuzumab) , Avastin® (bevacizumab) e Tarceva® (erlotinib) e do gênero. Através dos exemplos e não desejando se ligar à teoria, o tratamento com um anticorpo anti-câncer ou um anticorpo anti-câncer conjugado a uma toxina pode conduzir à morte das células cancerígenas (por exemplo, células tumorais) que potenciariam uma resposta imune mediada por 08E, CTLA-4 ou PD-I. Em uma configuração exemplificativa, um tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, um tumor cancerígeno) pode incluir um anticorpo anti- câncer em combinação com anticorpos anti-08E e anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-CTLA-4, concomitantemente ou seqüencialmente ou qualquer combinação do mesmo, que pode potencializar uma resposta imune anti-câncer pelo hospedeiro.
Os tumores fogem da vigilância da resposta imune do hospedeiro por uma grande variedade de mecanismos. Muitos destes mecanismos podem ser contornados pela inativação das proteínas, que são expressas pelos tumores e as quais são imuno-supressivas. Estas incluem, dentre outras, TGF- β(Kehrl, J. et al. , (1986) "J. Exp. Med.", 163 :1037- 1050), IL-10 (Howard, M. & 0'Garra, A. (1992) "Immunology Today", 13:198-200) e o ligante Faz (Hahne, M. et al. , (1996) "Science", 274:1363-1365). Em um outro exemplo, os anticorpos para cada uma destas entidades pode ser combinado ainda com um anticorpo anti-08E e anti-PD-1 e/ou combinação de anti-CTLA-4 para contra-agir aos efeitos dos agentes imunosupressivo e em favor das respostas imunes anti-tumor pelo hospedeiro.
Outros anticorpos que podem ser utilizados para ativar a resposta imune do hospedeiro podem ser utilizados ainda em combinação com uma combinação de anti-08E e anti-PD-1 e/ou combinação de anti-CTLA-4. Estas moléculas incluem as moléculas na superfície das células dendríticas que ativam a função DC e a apresentação do antígeno. Os anticorpos anti-CD40 são capazes de substituir efetivamente a atividade das células T auxiliares (Ridge, J. et al., (1998) Nature, 393:474-478) e tem demonstrado uma eficácia em conjunto com o anti-CTLA-4 (Ito, Ν., et al., (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). Os anticorpos ativam as moléculas co-estimulantes da célula T, tais como OX-40 (Weinberg, A., et al., (2000) Immunol 164:2160-2169), 4-1BB (Melero, I., et al., (1997) Nature Medicine 3:682-685 (1997), PD-I (Del Rio et al., (2005) Eur. J. Immunol., 35:3545-60)) e ICOS (Hutloff, A., et al., (1999) Nature 397:262-266) pode também prover níveis aumentados para a ativação da célula T.
O transplante da medula ósseo está sendo atualmente utilizado para tratar uma variedade de tumores de origem hematopoiética. Embora o enxerto versus a doença do hospedeiro é uma conseqüência deste tratamento, o benefício terapêutico pode ser obtido a partir do enxerto versus resposta tumoral. Um 08E combinado e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueado pode ser utilizado para aumentar a eficácia das células T específicas para o tumor enxertado do doador.
Existem também vários protocolos de tratamento experimentais que envolvem ativação ex vivo e a expansão das células T antígeno específicas e transferência adotiva destas células dentro do receptor de modo a ter as células T antígeno específicas contra o tumor (Greenberg, R. & Riddell, S. (1999) Science 285:546-51). Estes métodos podem ser também utilizados para ativar a resposta das células T para o agente infeccioso tal como CMV. A ativação ex vivo em presença de anticorpos anti- O8E e anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-CTLA-4 podem ser esperada por um aumento na freqüência e na atividade das células T transferidas adotivas.
Como representado aqui, os órgãos podem apresentar efeitos colaterais relacionados a resposta imune, após a terapia do anticorpo terapêutico imunoestimulatório, tal como o trato GI (diarréia e colite) e a pele (brotoeja e prurido) após o tratamento com o anticorpo anti-CTLA-4. Por exemplo, efeitos colaterais relacionados à resposta imune gastro-intestinal não colonizado tem sido observado no esôfago (esofagite), duodeno (duodenite) e íleo (ileíte) após o tratamento com o anticorpo anti-CTLA-4. Em determinadas configurações, a presente invenção provê um método para alterar um efeito adverso associado com o tratamento de uma doença hiper-proliferativa com um agente imunoestimulatório, compreendendo a administração um anticorpo anti-08E e uma dose subterapêutica do anticorpo anti-CTLA-4 para um indivíduo. Por exemplo, o método da presente invenção provê um método para reduzir a incidência de colite induzida pelo anticorpo terapêutica imunoestimulatório ou uma diarréia por administração de um esteróide não-absorvível ao paciente. Devido ao fato de qualquer paciente receber um anticorpo terapêutico imunoestimulatório ter o risco de desenvolver colite ou diarréia induzida pelo referido anticorpo, esta população de paciente inteira é apropriada para a terapia de acordo com o método da presente invenção. Embora os esteróides sejam administrados para tratar doença óssea inflamatória (IBD) e prevenir as exacerbações de IBD, eles não foram utilizados para prevenir (diminuição da incidência de) IBD em pacientes que não foram diagnosticados com IBD. Os efeitos colaterais significativos com esteróides, mesmo os esteróides não- absorvíveis, foram desencorajados ao uso profilático. Em configuração adicional, uma combinação de 08E e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueado (ou seja, anticorpos terapêuticos imuno-estimulatórios anti-08E e anti-PD-1 e/ou anti-CTL4- 4) pode ser combinado adicionalmente com o uso de qualquer esteróide não-absorvível. Conforme utilizado aqui, um "esteróide não-absorvível" é um glicocorticóide que exibe um metabolismo que passa pela primeira extensão de modo que, seguindo o metabolismo no fígado, a bio- disponibilidade do esteróide é baixa, ou seja, menor que cerca de 2 0%. Em uma configuração desta invenção, o esteróide não-absorvível é budesonide. 0 Budesonide é um glicocorticoesteróide de ação local, que é metabolizado extensivamente, primeiramente pelo fígado, seguido pela administração oral. ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca) é um pH- e formulação oral dependente do tempo de budesonide desenvolvido para otimizar a liberação do fármaco para o íleo e através do colo. O ENTOCORT EC® foi aprovado nos Estados Unidos para o tratamento da doença de Crohn média a moderada, que envolvem o íleo e/ou no cólon ascendente.
A dosagem oral usual de ENTOCORT EC® para o tratamento da doença de Crohn é de 6 a 9 mg/dia. O ENTOCORT EC® é liberado nos intestinos antes de ser absorvido e retido na mucosa das tripas. Uma vez que ele passou através do tecido alvo da mucosa das tripas, o ENTOCORT EC® é metabolizado extensivamente pelo sistema P450 do citocromo no fígado para os metabólitos com atividade de glicocorticóide insignificante. Portanto, a bio- disponibilidade é baixa (cerca de 10%) . A baixa bio- disponibilidade de budesonide resulta em uma proporção terapêutica melhorada comparada com outros glicocorticóides com menor passagem extensiva pelo primeiro metabolismo. 0 Budesonide resulta em efeitos colaterais menores, incluindo pouca supressão do hipotalâmico-pituitário,menor quantidade de corticoesteróides agindo sistemicamente. Entretanto, a administração crônica de ENTOCORT EC® pode resultar em efeitos glicocorticóides sistêmicos tais como hipercorticismo e supressão adrenal. Ver, PDR 58th, Ed. 2004; 608-610.
Ainda em configurações adicionais, uma combinação 08E e PD-I e/ou CTLA-4 bloqueado (ou seja, anticorpos terapêuticos imuno-estimulatórios anti-08E e anti-PD-1 e/ou anti-CTLA-4) em conjunto com um esteróide não- absorvível pode ser combinado ainda com um salicilato. Os salicilatos incluem agentes 5-ASA tais como, por exemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & UpJohn); olsalazine (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn); balsalazide (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); e mesalamine (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticais; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).
De acordo com os métodos da presente invenção, um salicilato administrado em combinação com os anticorpos anti-08E e anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-CTLA-4 e esteróides não-absorvíveis pode incluir qualquer sobreposição ou administração seqüencial do salicilato e o esteróide não-absorv£vel para o propósito da diminuição da incidência de colite induzida pelos anticorpos imunoestimulatório. Assim, por exemplo, métodos para reduzir a incidência de colite induzida pelos anticorpos imunoestimulatório de acordo com a presente invenção abrange a administração de um salicilato e uma administração de não-absorvi vel concomitantemente ou seqüencialmente (por exemplo, um salicilato é administrado 6 horas após um esteróide não-absorvivel) ou qualquer combinação do mesmo. Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, um salicilato e um esteróide não-absorvível pode ser administrado por uma mesma rota (por exemplo, ambos são administrados oralmente), ou por rotas diferentes (por exemplo, um salicilato é administrado oralmente e um esteróide não-absorvível é administrado retalmente), que pode diferir daquela rota(s) utilizada(s) para administrar os anticorpos anti- 08E, anti-PD-1 e anti-CTLA-4.
As composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) desta invenção que têm sítios de ligação do complemento, tais como porções de IgGl, -2 ou -3 ou IgM que que liga ao complemento, pode também ser utilizado em presença do complemento. Em uma configuração, o tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo as células alvos com um agente de ligação desta invenção e as células efetoras apropriadas podem ser suplementadas pela adição de complemento ou soro contendo o complemento. Fagocitose das células alvo revestidas com um agente de ligação desta invenção pode ser melhorada pela ligação das proteínas de complemento. Em uma outra configuração, as células alvo revestidas com as composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas biespecíficas e biespecíficas) desta invenção podem também ser lisadas pelo complemento. Em ainda uma outra configuração, as composições desta invenção não ativam o complemento.
As composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) desta invenção também podem ser administradas junto com o complemento. Consequentemente, dentro do escopo da invenção as composições compreendem anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e soro ou complemento. Estas composições são vantajosas de modo que o complemento esteja localizado nas proximidades dos anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou moléculas biespecíficas.
Alternativamente, os anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas desta invenção e o complemento ou o soro podem ser administrados separadamente.
Consequentemente, os pacientes tratados com as composições de anticorpo desta invenção podem ser administrados adicionalmente (antes da, simultaneamente com ou em seguida a administração de um anticorpo humano desta invenção) com um outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que melhora ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos humanos.
Em uma outra configuração, o indivíduo pode ser tratado adicionalmente com um agente que modula, por exemplo, melhora ou inibe, a expressão ou a atividade de Fcy ou dos receptores Fc γ, por exemplo, pelo tratamento do indivíduo com uma citocina. As citocinas preferidas para administração durante o tratamento com a molécula multiespecífica incluindo o fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF), fator estimulante de colônia de granulócito-macrófagos (GM-CSF), interferon-γ (IFN- γ) e fator de necrose tumoral (TNF).
As composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) desta invenção podem também ser utilizadas pelas células alvos expressando FcyR ou 08E, por exemplo, para marcar as referidas células. Para cada uso, o agente de ligação pode estar ligado a uma molécula que pode ser detectada. Assim, esta invenção provê métodos para localizar células ex vivo ou in vivo expressando receptores Fc, tais como FcyR ou 08E. 0 marcador detectável pode ser, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator de enzima.
Em uma configuração particular, esta invenção provê métodos para detectar a presença do antígeno 08E em uma amostra ou medir a quantidade do antígeno 08E, compreendendo contatar a amostra e uma amostra controle, com um anticorpo monoclonal humano ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente ao 08E, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo ou uma porção do mesmo e 08E. A formação de um complexo é então detectada, onde a diferença na formação do complexo, entre a amostra quando comparada com a amostra controle, é indicativa da presença do antígeno 08E na amostra.
Em uma outra configuração, esta invenção provê métodos para tratar um distúrbio mediado por 08E em um indivíduo. Ainda em uma outra configuração, os imunoconjugados desta invenção podem ser utilizados para os compostos alvos (por exemplo, agentes terapêuticos, agentes marcadores, citotoxinas, imunosupressantes de radiotoxinas, etc..), para as células que tem receptores de superfície na célula 08E por ligação do referido composto ao anticorpo. Por exemplo, um anticorpo anti-08E pode ser conjugado a um UPT, como descrito nos pedidos de patente americanos Nos.: US 10/160,972; 10/161,233; 10/161,234; 11/134,826; 11/134,685 e o pedido de patente provisório americano No.: 60/720,499 e/ou qualquer um dos compostos de toxinas descritos nas patentes U.S. Nos.: 6,281,354 e 6,548,530; os pedidos de patente Nos.: US 2003/0050331; US 2003/0064984; US 2003/0073852 e US 2004/0087497 ou O pedido internacional publicado WO 2003/022806, os quais são incorporados aqui por referência em sua íntegra. Assim, a invenção também provê métodos para localizar as células ex vivo ou in vivo expressando 08E (por exemplo, com um marcador detectável, tais como, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator de enzima). Alternativamente, os imunoconjugados podem ser utilizados para matar as células que tem os receptores de superfície celular de 08E para localizar as citotoxinas ou radiotoxinas para 08E.
A presente invenção é ilustrada ainda pelos exemplos a seguir que não devem ser interpretados como restritivos. 0 conteúdo de todas as figuras e todas as referências, patentes, e pedidos de patente publicados citados em todo o pedido são aqui expressamente incorporados por referência.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1
Geração de Anticorpos Monoclonais Humanos Contra 08E
Antígeno
As células CHO e HEK-2 93 foram transfectadas com 08E usando métodos de transfecção recombinante padrão e utilizadas como antígeno para imunização. Em adição, o recombinante 08E sozinho foi também utilizado como
antígeno para imunização.
Camundongo Transgênico KM-Mouse® e HuMAb-Mouse®
Anticorpos monoclonais totalmente humanos para 08E foram preparados utilizando as cepas HCo7 e HCol2 do camundongo transgênico HuMab® e a cepa KM de camundongos transcromossômicos transgênicos, cada uma delas expressando os genes de anticorpo humano. Em cada uma dessas cepas de camundongo, o gene de cadeia leve kappa de camundongo endógeno foi homozigoticamente rompido conforme descrito em Chen et al.(1993) EMBO J.12:811-820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi homozigoticamente rompido conforme descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187. Cada uma dessas cepas de camundongo carrega um transgene de cadeia leve kappa humano, o KCo5, conforme descrito em Fishwild et al.(1996) Nature Biotechnology 14:845-851. A cepa HCo7 carrega o trangene de cadeia pesada humano HCo7 como descrito na patente U.P. Nos.: 5,545,806; 5,625,825; e 5,545,807. As cepas HCol2 carregam o transgene de cadeia pesada humana HCol2 como descrito no Exemplo 2 da publicação internacional PCT WO 01/09187. A cepa do camundongo KM® contém o transcromossomo SC2 0 como descrito na publicação internacional PCT WO 02/43478. Imunizações KM e HuMab:
Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para 08E, camundongos HuMAb -MOUSE® e KM-MOUSE® foram imunizados com células CH0-08E transfectadas, células HEK2 93-08E transfectadas e/ou proteína 08E recombinante purificada. Esquemas gerais de imunização para camundongos HuMab® estão descritos em Lonberg, N. et al.(1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 1_4: 845-851 e na publicação PCT WO 98/24884. Os camundongos tinham de 6-16 semanas de vida quando da primeira infusão de antígeno. Uma preparação recombinante purificada (5-50 μg) da proteína 08E foi utilizada para imunizar os camundongos HuMAb™ e camundongos KM™.
Os camundongos transgênicos foram imunizados duas vezes com o antígeno com o antígeno em adjuvante de Freund completo ou intraperitonealmente com adjuvante (IP) , ou subcutaneamente (Sc) , seguido de 3-21 dias IP ou SC (até um total de 11 imunizações) com o antígeno em adjuvante de Freund incompleto. A resposta imune, foi monitorada através de sangramentos retro-orbitais. 0 plasma foi examinado através do teste ELISA (conforme descrito abaixo) e os camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-08E foram usados para as fusões. Os camundongos foram estimulados intravenosamente com o antígeno 3 e 2 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Tipicamente, foram realizadas de 10-35 fusões para cada antígeno. Diversas dúzias de camundongos foram imunizadas para cada antígeno.
Seleção de um HuMab-MOUSE™ ou KM-MOUSE™ Produtor de Anticorpos Anti-08E
Para selecionar camundongos HuMab-Mouse™ ou KM-MOUSE™ produtores de anticorpos que se ligam ao 08E, os soros de camundongos imunizados foram testados através de ELISA como descrito por Fishwild, D. et al.(1996) supra. Resumidamente, placas de microtitulação foram revestidas com 08E recombinante purificado em 1-2 μg/ml em PBS, 50 μl/poços incubados a 40C durante a noite, então bloqueado com 200 μl/poço de soro de galinha a 5% em PBS/Tween (0,05%). Diluições de plasma a partir de camundongos imunizados 08E foram adicionados em cada poço e incubados por 1-2 horas em temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e então incubados com um anticorpo monoclonal policlonal de IgG Fc de cabra anti-humano conjugado com peroxidase de rábano-silvestre (HRP) por 1 hora em temperatura ambiente. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) e analisado por espectrofotômetro em OD 415- 495. Os camundongos que desenvolveram títulos maiores de anticorpos anti-08E foram utilizados para as fusões. As fusões foram realizadas como descrito abaixo e os sobrenadantes de hibridoma foram testados quanto a atividade de anti-08E por ELISA e FACS.
Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos Monoclonais Humanos para 08E:
Os esplenócitos de camundongo, isolados de camundongo KM HuMab-mouse™ e/ou KM-mouse™, foram fundidos com PEG a uma linha celular, com mieloma de camundongo tanto com PEG, baseados em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes foram então examinados quanto à produção dos anticorpos antígeno-específicos. Suspensões de células simples de esplenócitos de camundongos imunizados foram fundidas a um quarto do número de células de mieloma de camundongo não-secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) com 50% de PEG (Sigma). As células foram plaqueadas em aproximadamente lxl05/poço em placa de microtitulação de fundo plano, seguido por cerca de duas semanas de incubação em meio seletivo contendo soro fetal bovino a 10% (Hyclone, Logan, UT) , meio condicionado P388D1 a 18% (ATCC, CRL TIB-63) , 3-5% de Origen (IGEN) em DEMEN (Mediatech, CRL 10013, com alto teor de glicos, L-glutamina e piruvato de sódio), mais 0,055 mM 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina e Ix HAT (Sigma, CRL P-7185) . Após uma a duas semanas, as células cultivadas em meio no qual HAT foi substituído por HT. Os poços individuais foram então examinadas através de FACS ou ELISA (descrito acima) para detectar os anticorpos IgG monoclonais anti-08E humanos.
Os clones positivos foram então examinados para os anticorpos 08E positivos na proteína 08E recombinante por ELISA ou em células expressando 08E, por exemplo, para as células CH0-08E transfectadas, foram examinadas por FACS. Resumidamente, as células expressando 08E foram colhidas quando frescas a partir das garrafas de cultura de tecido e uma suspensão de célula simples foi preparada. As suspensões da célula expressando 08E foram tanto coradas com anticorpo primário diretamente quanto após a fixação com paraformaldeído a 1% em PBS. Aproximadamente, um milhão de células foram re-suspensas em PBS contendo BSA a 0,5% e 50-200 μg/ml do anticorpo primário, e incubadas em gelo durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 0,1% de BSA, 0,01% de NaN3, re- suspensas em 100 μΐ de 1:100 diluída a IgG de cabra anti- humana FITC conjugada (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) e incubadas em gelo por um período de 30 minutos adicional. As células foram novamente lavadas duas vezes, re-suspensas em 0,5 ml de tampão em água e analisado para coloração fluorescente em um citômetro FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA) . Uma vez que o crescimento extensivo de hibridomas ocorreu, o meio foi monitorado usualmente após 10-14 dias. Os hibridomas secretando os anticorpos foram re- plaqueados, examinados novamente e, se ainda positivo para a IgG humana, os anticorpos monoclonais anti-08E foram subclonados pelo menos duas vezes por diluições limitantes. Os sub-clones estáveis foram então cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpos em meio de cultura de tecido para caracterização adicional. Os clones de hibridoma IGll, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 foram selecionados para análise adicional. EXEMPLO 2:
Caracterização Estrutural de Anticorpos Monoclonais Humanos 1G11, 2A7, 2F9, 12E1 e 12D12.
Estes exemplos descrevem a análise de cinco seqüências (5) aos anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente ao 08E. As seqüências de cDNA codificando as regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos monoclonais IGll, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 foram obtidas dos hibridomas IGll, 2A7, 2F9, 12E1 e 13D12 respectivamente, utilizando-se as técnicas PCR padrão e foram seqüenciadas utilizando técnicas de seqüenciamento de DNA padrão.
As seqüências de nucleotídeos e de aminoácido da região variável de cadeia pesada de IGll são mostradas na Figura 1A e na SEQ ID NO: 41 e 1, respectivamente. As seqüências de nucleotídeo e de aminoácido da região variável de cadeia leve de IGll são mostradas na Figura 1B e em SEQ ID NO: 46 e 6, respectivamente. A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada IGll com as conhecidas seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 1G11 utiliza um segmento Vh de linha germinal humana Vh 4-34 mostrada na figura 6. Análise adicional da seqüência IGll VH usando o sistema Kabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3, conforme mostrado nas Figuras IA e 6, e nas SEQ ID NOs: 11, 16, e 21, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve IG11 com as conhecidas seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve IG11 utiliza um segmento VL da linha germinal humana Vk A27. O alinhamento da seqüência IG11 VL com a seqüência Vk A27 de linha germinal é mostrado na Figura 9. Análise adicional da seqüência VL de IG11 utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras IB e 9, e nas SEQ ID NOs: 26, 31 e 36, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 2A7 são mostradas na Figura 2A e na SEQ ID No.:42 e 2, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 2A7 são mostradas na Figura 2B e na SEQ ID NO: 47 e 7, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 2A7 com as conhecidas seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 2A7 utiliza um segmento Vh da linha germinal humana Vh 3-53 de um segmento JH da linha germinal humana 4-11, e um segmento Jh da linha germinal humana JH 6b. O alinhamento da seqüência 2A7 Vh com a seqüência Vh 3-53 de linha germinal é mostrado na Figura 7. Análise adicional da seqüência Vh 2A7 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 2A e 7, e as SEQ ID NOs: 12, 17, e 22, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 2A7 com as conhecidas seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve 2A7 utiliza um segmento Vl da linha germinal humana Vk A27. 0 alinhamento da seqüência Vl 2A7 com a seqüência de linha germinal Vk A27 é mostrado na Figura 9. Outra análise da seqüência Vl 2A7 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 2B e 9 e nas SEQ ID NOs: 27, 32 e 37, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia pesada de 2F9 são mostradas na Figura 3A e nas SEQ ID NO.:43 e 3, respectivamente. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia leve de 2F9 são mostradas na Figura 3B e SEQ ID NO: 48 e 8, respectivamente. A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 2F9 com as conhecidas seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 2F9 utiliza um segmento Vh da linha germinal humana Vh 3-53 e um segmento JH da linha germinal humana JH 6b. 0 alinhamento da seqüência VH 2F9 com a seqüência Vh 3-53 de linha germinal é mostrado na Figura 7. Outra análise da seqüência Vh 2F9 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostrado nas Figuras 3A e 7, e nas SEQ ID NOs: 13, 18 e 23, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 2F9 com as conhecidas seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve 2F9 utiliza um segmento Vl de linha germinal humana Vk A27. 0 alinhamento da seqüência Vl 2F9 com a seqüência de linha germinal Vk A27 é mostrado na Figura 9. Outra análise da seqüência Vl 2F9 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 3B e 9, e nas SEQ ID NOs: 28, 33 e 38, respectivamente. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia pesada de 12E1 são mostradas na Figura 4A e nas SEQ ID NOs: 44 e 4, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia leve de 12E1 são mostradas na Figura 4B e nas SEQ ID NOs: 49 e 9, respectivamente. A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 12E1 com as conhecidas seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 12E1 utiliza um segmento Vh de linha germinal humana Vh 3-9, um segmento D da linha germinal humana 3-10, e um segmento Jh de linha germinal humana JH 6b. O alinhamento da seqüência Vh 12E1 com a seqüência da linha germinal Vh 3-9 é mostrado na Figura 8. Outra 15 análise da seqüência Vh 12E1 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CDR3 nas Figuras 3A e 8, e nas SEQ ID NOs: 14, 19, e 24, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 12E1 com as conhecidas seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve 12E1 utiliza um segmento Vl de linha germinal humana Vk L6 e um segmento Jk de linha germinal humana JK 1. O alinhamento da seqüência VL 12E1 com a seqüência Vk L6 de linha germinal é mostrado na Figura 10. Outra análise da seqüência Vl 12E1 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 3B e 10, e nas SEQ ID NOs: 29, 34 e 39, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 13D12, são mostradas na Figura 5A e nas SEQ ID NOs: 45 e 5, respectivamente. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da região variável de cadeia leve de 13D12, são mostradas na Figura 5B e nas SEQ ID NOs: 50 e 10, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 13D12 com as conhecidas seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 13D12 utiliza um segmento Vh de linha germinal humana Vh 4-34. 0 alinhamento da seqüência Vh 13D12 com a seqüência Vh 4-34 de linha germinal é mostrado na Figura 6. Outra análise da seqüência Vh 13D12 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia pesada CDRl7 CDR2 e CDR 3 conforme mostram as Figuras 5A e 6, e as SEQ ID NOs: 15, 20 e 25, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 13D12 com as conhecidas seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve 13D12 utiliza um segmento Vl de linha germinal humana Vk A27. 0 alinhamento da seqüência Vl 13D12 com a seqüência Vk A27 da linha germinal é mostrado na Figura 9. Outra análise da seqüência Vl 13D12 utilizando o sistema Kabat de determinação de região CDR levou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 conforme mostram as Figuras 5B e 9, e nas SEQ ID NOs: 30, 35 e 40, respectivamente.
EXEMPLO 3: Caracterização de Especificidade de Ligação dos Anticorpos Monoclonais Humanos Anti-08E
Este exemplo descreve uma comparação dos anticorpos anti- 08E na ligação ao 08E imunopuri ficado realizada pelo ELISA padrão para examinar a especificidade de ligação para o O8E.
O 08E marcado com myc e com His recombinante foi revestido em uma placa durante a noite, então testado para a ligação contra os anticorpos monoclonais humanos anti -08E 2A7, 12E1 e 12D12. Os procedimentos de ELISA padrão foram realizados. Os anticorpos monoclonais anti- O8E humanos foram adicionados em uma concentração de 1 μg/ml e com titulações de 1:2 em diluições seriais. 0 anticorpo policlonal IgG anti-humano de cabra (cadeia- específica Fc ou Kappa) conjugado com peroxidase de rábano silvestre ("horseradish peroxidase") (HRP) foi utilizado como anticorpo secundário.
A Ig-B74H recombinante foi purificada a partir do sobrenadantes das células 2 93T transfectadas com um constructo B7H4-Ig por cromatografia usando a proteína A. Uma placa de ELISA foi revestida com os anticorpos humanos seguido pela adição da proteína purificada e então a detecção com o anti-soro de coelho anti-B7H4. Ver, A FIGURA IlA. A proteína Penta-B7H4 com uma tag C-9 foi purificada a partir do sobrenadante das células 293T transfectadas com um constructo de Penta-B7H4-C9 por cromatografia usando uma coluna 2A7 de afinidade. Uma placa de ELISA foi revestida com Fc anti-camundongo, seguido pelo anti-C9 monoclonal (0,6 mg/ml), então titulada a Penta-B7h4 como indicado, então os anticorpos humanos em 1 μg/ml. O Fc anti-camundongo revestido seguido pelo M-anti-C9 (0,6 μg/ml), então titulada com Penta-08E como indicado, então HuMAbs@ lmg/ml. Ver, a figura 11B.
Os anticorpos monoclonais humanos anti-08E, 2A7, 12E1 e 13D12 ligados com alta especificidade ao 08E. EXEMPLO 4:
Caracterização da ligação de anticorpo anti-08E ao 08E expresso na superfície das linhas de célula de carcinoma de câncer de mama.
Este exemplo descreve o teste dos anticorpos anti-08E quanto a ligação às células CH0-08E (a/k/a, B7H4, B7S e B7x) transfectantes e células de carcinoma de células mamárias expressando 08E em sua superfície celular por citometria de fluxo.
A linha de célula CHO transf ectada com 08E bem como a linha de célula de carcinoma de célula mamária SKBR3 (ATCC Número de Acesso No. HTB-3 0) foram testadas quanto a ligação dos anticorpos. A ligação dos anticorpos monoclonais anti-08E humano HuMAb 2A7 foi avaliada através da incubação de IxlO5 células com o 2A7 em uma concentração inicial de 1 μg/ml. As células foram lavadas e a ligação foi detectada com uma IgG Ab anti-humana marcada com FITC. A análise de citometria de fluxo foi realizada usando um citômetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA) . Os resultados são mostrados na Figura 12 e 13.
Estes dados demonstram que o anti-08e HuMAbs liga-se ao 08E expressando as células CHO e a uma linha de célula de carcinoma de célula mamária.
EXEMPLO 5:
Análise de Scatchard da afinidade de ligação dos anticorpos monoclonais anti-08E.
Este exemplo descreve o teste dos anticorpos monoclonais humanos IGll, 2F9, 2 A7, 12E1 e os anticorpos monoclonais 13D12 quanto ã ligação com a linha de célula HEK transfectada com 08E utilizando uma análise de Scatchard. As células HEK foram transfectadas com a extensão completa de 08E usando técnica padrão e crescimento em meio RPMI contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) .
(Figura 12 apresenta a análise FACS destas células HEK- 08E com o anticorpo monoclonal anti-08e humano 2A7) . As células foram tripsinizadas e lavadas uma vez em Tris com base no tampão de ligação (24 mM de Tris, pH 7,2; 137mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 2 mM de glicose, 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 0,1% de BSA) e as células foram ajustadas a 2xl06 células/ml em um tampão de ligação. Placas Millipore (MAFB N0B) foram revestidas com 1% de leite em pó sem gordura em água e armazenadas a 4 o durante a noite. As placas foram lavadas três vezes com 0,2 ml de tampão de ligação. Cinqüenta microlitros de tampão sozinho foram adicionados ao máximo de poços de ligação (total de ligação). Vinte e cinco microlitros de tampão sozinho foram adicionados ao máximo de poços de ligação (total de ligação). Uma concentração variável do anticorpo anti-08E-1125 foi adicionado em todos os poços em um volume de 25 μΐ. (Em alguns casos anticorpos marcados FITC foram utilizados para a titulação, uma vez que material não-marcado não estava disponível, a ligação pode ser comprometida nestes exemplos). Concentrações variadas de anticorpos não-marcados de 100 vezes o excesso foram adicionadas em um volume de 25 μl aos poços controle e 25 μl de células CHO transfectadas com O8E (2 X10^6 células/ml) em um tampão de ligação foram adicionados em todos os poços. As placas forma incubadas durante 2 horas a 200 RPM em um agitador a 4°C. Em uma finalização da incubação as placas Millipore foram lavadas três vezes com 0,2 ml de tampão de lavagem frio (24 mM Tris; pH 7,2; 500mM de NaCl; 2,7mM de KCl; 2 mM de glicose; ImM de CaCl2; ImM de MgCl2; 0,1% de BSA). Os filtros forma removidos e contados em um contador gama. A avaliação do equilíbrio de ligação foi realizada usando um parâmetro de ligação em um sítio único com um Software Prism (San Diego, CA).
Os dados foram analisados por regressão não-linear em uma resposta de dose sigmoidal (PRIZM™) e o resultado no cálculo de um EC50, que foi utilizado para a classificação dos anticorpos como ilustrado na Tabela 2. Os valores EC50 calculados nestes experimentos são medidas qualitativas da afinidade do anticorpo e ao representa a afinidade absoluta para O8E.
TABELA 2
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*Valores de Fundo e de Topo ajustados como constantes para compensar uma curva incompleta.
Exemplo 6:
Internalização dos anticorpos monoclonais anti-O8E. Este exemplo demonstra o teste dos HuMAbs anti-O8E quanto à capacidade para internalizar dentro das células de carcinoma mamário CHO expressando O8E usando um ensaio de internalização Hum-Zap. Os testes dos ensaios Hum-Zap para internalização de um anticorpo humano primário através da ligação de um segundo anticorpo com afinidade para o conjugado de IgG humano a uma toxina saporina. A linha de célula SKBR3 de carcinoma de células mamárias expressando 08E foi semeada em l,25xl04 células/poço em 100μΙ por poço durante a noite. Os anticorpos HuMAb anti- 08E IGll, 2F9, 2A7, 12E1 ou 13D12 foram adicionados aos poços em uma concentração de 10 pM. Um anticorpo controle isotipo que é não-específico para 08E foi utilizado como um controle negativo. 0 Hum-Zap (Advanced Targetin Systems, San Diego, CA, IT-22-25) foi adicionado em uma concentração de 11 nM e as placas foram deixadas em incubação durante 72 horas. As placas foram então pulsadas com 1,0 μ(Γί de 3H-timidina durante 24 horas, colhidas e lidas em um contador Top Count Scintillation (Packard Instruments, Meriden, CT) . Os resultados estão demonstrados abaixo na Tabela 3. E nas figuras 14-15. Os anticorpos anti-08E IGll, 2F9, 2A7, 12E1 e 13D12 demonstraram uma concentração de anticorpo dependente da diminuição da incorporação de 3H-timidina nas células de câncer de carcinoma mamário SLBR3 expressando 08E.
Estes dados demonstram que os anticorpos anti-08E IGll, 2F9, 2A7, 12E1 ou 13D12 internalizam dentro da linha de célula de câncer de carcinoma mamário.
TABELA 3
<table>table see original document page 151</column></row><table>
A classificação para a eficiência de internalização foi avaliada sobre os três experimentos em SKBR3 e dois experimentos em CH0-08E. A classificação de internalização, com EC50s para a ligação com CH0-08E, estão apresentadas nas tabelas 4 e 5. Os Resultados demonstraram que a eficiência da internalização não está diretamente relacionada com a afinidade de ligação, que sugere que a internalização é dependente do epítopo.
TABELA 4
Eficiência da internalização classificada pela internalização na linha de célula de carcinoma mamário SBKR3.
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TABELA 5
Eficiência da internalização classificada pela internalização na linha de célula CH0-08E.
<table>table see original document page 152</column></row><table>
A atividade de internalização dos conjugados de saporina em CH0-08E foi medida com uma dose de resposta através de uma faixa de ~ 500 pM a 1 pM usando anticorpos monoclonais humanos 2A7, 2F9 e IGll. Como ilustrado na figura 14, a internalização foi muito eficiente com EC50s em uma faixa de pM baixa. A linha de célula parental CHO e Hu IgG-SAP foram utilizadas como controle negativo e não demonstraram um histórico de toxicidade significante ou uma internalização não-específica. Os conjugados anti- 08E diretos para SAP foram utilizados com as células SKBR3. A porcentagem de internalização (versus controle) como uma função da dose de Ig-SAP é apresentada na figura 15. Exemplo 7: Avaliação da morte celular de um anticorpo anti-08E toxina-conjugado nas linhas de célula de carcinoma de célula mamária.
Este exemplo descreve o teste de anticorpos monoclonais anti-08E conjugados à toxina quanto a capacidade de matar as linhas de célula de carcinoma de células mamárias 08E+ em um ensaio de proliferação celular.
Os anticorpos HuMAb anti-08E IG11, 2F9, 2A7, 12E1 ou 13D12 podem ser conjugados a uma toxina via um ligante, tal como um peptidil, hidrazona ou um ligante bissulfeto. Uma linha de célula de câncer de carcinoma de mama, tal como SKBR3, é semeada em cerca de 3xl04 células/poço em 100 μl poços durante 3 horas. Um conjugado toxina- anticorpo anti-08E foi adicionado aos poços em uma concentração inicial de 30 nM e titulada em diluições seriais de 1:3. Um anticorpo controle isotipo que não é específico para O8E foi utilizado como um controle negativo. As placas foram deixadas em incubação durante 69 horas. As placas foram então pulsadas com 1,0 μCi de 3H-timidina durante 24 horas, colhidas e lidas em um Contador de cintilação Top Count (Packard Instruments, Meriden, CT). Os anticorpos anti-08E são esperados demonstrar uma concentração de anticorpo-toxina dependente da diminuição da incorporação de 3H-timidina nas células de câncer de carcinoma de mama expressando 08E. Estes dados demonstram que os anticorpos anti-08E 1G11, 2F9, 2A7, 12E1 e 13D12 são potencialmente citotóxicos para as células de câncer de carcinoma de mama quando conjugados com a toxina.
Exemplo 8:
Avaliação da atividade ADCC do anticorpo anti-08E. Este exemplo descreve o teste dos anticorpos monoclonais anti-O8E quanto à capacidade de matar as linhas de célula 08E+ em presença das células efetoras via anticorpo dependente da citotoxicidade celular (ADCC) em um ensaio de citotoxicidade por fluorescência.
As células efetoras humanas foram preparadas a partir de todo o sangue como a seguir. As células mononucleares do sangue periférico humano foram purificadas a partir de todo sangue heparinizado por separação padrão Ficoll- paque. As células foram re-suspensas em meio RPMI164O, contendo 10% de FBS e 200 U/ml de IL-2 humana e incubadas durante a noite a 37°C. No dia seguinte, as células foram colhidas e lavadas quatro vezes em um meio de cultura e re-suspensas a 2xl07 células/ml. As células alvo 08E+ foram incubadas com o reagente BATDA (Perkin Elmer, Wellesley, MA) em 2,5 μΐ de BATDA por células/ml alvo IxlO6 durante 2 0 minutos a 3 7 °C. As células alvo foram lavadas quatro vezes, agitadas e induzidas a um volume final de 1x10^5 células/ml.
As linhas de célula 08E+ SKBR3, bem como a linha de célula SK0V3 transfectada com 08E foram testadas quanto a especificidade do anticorpo ADCC para os anticorpos monoclonais anti-08E humano usando a análise de emissão de fluorescência Delfia como a seguir. Cada linha de célula alvo (100 μl de células-alvo marcadas) foi incubada com 50 μl de células efetoras e 50 μl do anticorpo. Um alvo para a proporção de efetor de 1:50 foi utilizado durante o experimento. Em todos os estudos, um IgGl isotipo controle humano foi utilizado como um controle negativo. Seguindo uma rotação em pulso de 2000 rpm e uma incubação de uma hora a 37°C, os sobrenadantes foram colhidos, uma rotação rápida novamente e 20 μl do sobrenadante foi transferido para um frasco de fundo plano, ao qual 180 μΐ de uma solução Eu (Perkin Elmer, Wellesley, MA) foram adicionados e lidos em um leitor RubyStar (BMG Labtech) . A % de Iise foi calculada como a seguir: (liberação da amostra - liberação espontânea* 100)/ (liberação máxima - liberação espontânea), onde a liberação espontânea é a fluorescência dos poços que contém apenas as células alvo e a liberação máxima é a fluorescência dos poços contendo as células alvo e tendo sido tratada com 2% de Triton-X. A % da citotoxicidade da lise celular para as linhas de células SKBR3, com os anticorpos anti-08e IGll, 2F9 e 2A7 está apresentada na figura 17; a % da citotoxicidade da Iise celular para a linha de célula transfectada com SK0V3-08E com os anticorpos anti-08E IGll, 2F9 e 2A7 está representada na figura 18; e a % da citotoxicidade celular dependente da concentração na Iise para as células SKBR3 com os anticorpos anti-08e 2F9 e 2A7 estão apresentadas na figura 19. Ambas as linhas de células expressando 08E+ SKBR3 e SK0V3-08E demonstraram uma citotoxicidade mediada pelo anticorpo com os anticorpos HuMAb anti-08E IGll, 2F9 e 2A7. Estes dados demonstram que os anticorpos anti-08E HuMAb mostram uma citotoxicidade específica para as células expressando 08E+.
EXEMPLO 9:
Tratamento de modelo de Xeno-enxertos/xenotransplantes tumorais in vivo usando anticorpos anti-08E citotoxina- conjugados e descobertos.
Este exemplo descreve o tratamento in vivo dos camundongos implantados com tumores de carcinoma de células mamárias com anticorpos anti-08E toxina- conjugados para examinar o efeito in vivo dos anticorpos no crescimento do tumor.
As células SKBR3 ou outras células de carcinoma de célula mamária apropriadas foram expandidas in vitro usando procedimentos de laboratório padrão. Machos de camundongos pelados Ncr atímicos (Taconic, Hudson, NY) com idade entre 6-8 semanas foram implantados subcutaneamente no flanço direito com 7,5 XlO6 células de ACHN ou A-4 98 em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por camundongo. Os camundongos foram pesados e medidos quanto à tridimensionalidade dos tumores usando um calibrador eletrônico duas vezes por semana após o implante. Os volumes dos tumores foram calculados como altura χ largura χ comprimento. Os camundongos com tumores ACHN com tamanho médio de 270 mm3 ou tumor A-4 98 com tamanho médio de 110 mm3 foram introduzidos, aleatoriamente, nos grupos de tratamento. Os camundongos foram dosados intraperitonealmente com um veículo PBSi um anticorpo controle isotipo toxina-conjugado ou um isotipo toxina- conjugado anti-08E HuMAb 2H5 no dia 0 (zero) . Os exemplos dos compostos de toxinas que podem ser conjugados aos anticorpos da invenção atual estão descritos no pedido de patente atual com número MEDX-0034US4. O camundongo que recebeu o anti-08E HuMAb foi testado com três diferentes compostos de toxina. Os camundongos foram monitorados para o crescimento do tumor durante 60 dias após a dosagem. Os camundongos foram eutanizados quando os tumores alcançaram um ponto máximo de tumor (2000 mm3). O conjugado anticorpo anti-08E apropriado à toxina estendida em um tempo médio para se conseguir o volume do ponto máximo do tumor (2 00 0 mm3) e diminuir a progressão do crescimento do tumor. Assim, o tratamento com um conjugado anticorpo-toxina anti-08E teve um efeito inibitório in vivo direto no crescimento do tumor.
EXEMPLO 10:
Imuno-histoquímica com o anti-08E HuMAb 2A7.
Este exemplo descreve que o anti-08E HuMAb 2A7 para reconhecer o 08E através da imuno-histoquímica foi examinada usando ensaios de tecido de camundongo normal (IMGENEX Histo-Array; Imgenex Corp., San Diego, CA) . Para a imuno-histoquímica, 2,000 μm de corações foram utilizados. Após a secagem durante 3 0 minutos, secções foram fixadas com acetona (em temperatura ambiente durante 10 minutos) e secas ao ar durante 5 minutos. As lâminas foram lavadas em PBS e então, pré-incubadas com 10% de soro normal de cabra em PBS durante 20 minutos e, subseqüentemente incubados com 10 μg/ml 2A7 fitocilados em PBS com 10% de soro de cabra normal durante 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas durante 30 minutos com anti-FITC de camundongo (10 μg/πιl DAKO) em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas novamente
com PBS e incubadas com conjugado HRP anti-camundongo de cabra (DAKO) durante 30 minutos a temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas novamente 3x com PBS. A diaminobenzidina (Sigma) foi utilizada como substrato, resultando em uma coloração marrom. Após a lavagem com água destilada, as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina por 1 minuto. Subseqüentemente, as lâminas foram lavadas durante 10 segundos em uma corrida com água destilada e montadas em glicergel (DAKO). Os resultados destes estudos estão apresentados na Tabela 6.
TABELA 6
Imuno-reatividade de 08E em Ensaios de tecidos normais de camundongos
<table>table see original document page 157</column></row><table> <table>table see original document page 158</column></row><table>
Estes dados e dados correspondentes coletados para os anticorpos anti-08E IGll e 2F9, demonstraram que a imuno- reatividade forte para intensa (3+, 4+) estava presente nas células do tipo entero-endócrina no cólon e no intestino delgado, bem como no fluido do lúmen da vesícula seminal; imuno-reatividade de fraca a moderada de 08E (1 + , 2 + ) foi revelada em neurônios do cérebro, em rede de fibra nervosa sem mielina e fibras do cérebro e pontes, na massa branca do cerebelo, nas células da cripta epitelial do intestino delgado e em um pequeno número das células linfóides grandes no baço; imuno- reatividade fraca de 08E (1+) foi demonstrada no epitélio da superfície do cólon, células de Purkinje no cerebelo e epitélio Acinar da glândula salivar e do pâncreas; imuno- reatividade de equivocada a fraca de 08E demonstrou no epitélio transitório da bexiga, trato urinário, espermotócito primário dos testículos e nervo plexo no estômago; e todos os outros órgãos apresentam coloração de negativa a equivocada, que inclui pele, fígado, coração, pulmão, timo, rim, útero, ovário, epidídimo, língua e músculo esquelético.
EXEMPLO 11:
Produção de HuMAb defucosilado.
Este exemplo demonstra a produção de HuMAb anti-08E que perdeu os resíduos de fucosil.
Os anticorpos com reduzida quantidade de resíduos de fucosil demonstraram aumentar a capacidade ADCC dos anticorpos. A linha de célula CHO Ms704-F, que perde o gene fucosiltransferase FUT 8 (Biowa, Inc., Princeton, NJ) foi eletroporada com um vetor que expressa as cadeias pesada e leve de um anti-08E HuMAb. Os clones fármaco- resistentes foram selecionados pelo crescimento no meio Ex-Cell 325-PF CHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS) com 6 mM de L-glutamina e 500 μg/ml de G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os clones foram classificados quanto a expressão de IgG pelo ensaio ELISA padrão. Dois clones separados foram produzidos, B8A6 e B8C11, que teve faixas de produção variando de 1,0 a 3,8 picogramas de célula por dia.
EXEMPLO 12:
Avaliação da atividade ADCC do anticorpo anti-08E defucosilado.
Este exemplo descreve o teste de um anticorpo monoclonal anti-08E não-defucosilado e defucosilado quanto a capacidade para matar as células 08E+ em presença das células efetoras via anticorpo dependente da citotoxicidade celular (ADCC) em um ensaio de citotoxicidade por fluorescência.
O anticorpo monoclonal anti-08E humano foi defucosilado como descrito acima. As células efetoras humanas foram preparadas a partir de todo o sangue como a seguir. As células mononucleares do sangue periférico humano foram purificadas por heparinização de todo o sangue por separação Ficoll-paque padrão. As células foram re- suspensas em meio RPMI1640 contendo 10% de FBS (meio de cultura) e 200 U/ml de IL-2 humano e incubado durante a noite a 37°C. 0 dia seguinte, as células foram colhidas e lavadas uma vez em meio de cultura e re-suspensas em 2xl07 células/ml. As células alvo 08E+ foram incubadas com o reagente BATDA (Perkin Elmer, Wellesley, MA) em 2,5 μl de BATDA por IxlO6 de células alvo/mL no meio de cultura suplementado com 2,5mM de probenecida (meio de ensaio) durante 2 0 minutos a 37°C. As células alvo foram lavadas quatro vezes em PBS com 2 0 mM de HEPES e 2,5 mM de probenecida, agitadas e induzidas a um volume final de 1x105 células/ml em meio de ensaio.
As linhas de célula 08E+ ARH-77 (leucemia Iinfoblástica de célula B humana; ATCC número de acesso CRL-1621) foram testados para o anticorpo específico ADCC ao anticorpo monoclonal anti-08E humano defucosilado e não- defucosilado usando a análise de emissão de fluorescência Delfia como a seguir. As linhas de célula alvo ARH77 (100 μl de células alvo-marcada) foi incubada com 50 μl de células efetoras e 50 μΐ tanto do IGll ou do anticorpo IGll defucosilado. Um alvo para a proporção efetora de 1:100 foi utilizado durante os experimentos. Um controle isotipo IgGl humano foi utilizado como um controle negativo. Seguindo uma rotação em pulso de 2100 rpm e uma é usado. O catalisador de metal nobre pode ser suportado no silicato de titânio. Alternativamente, pode ser suportado em um veículo diferente de silicato de titânio, tal como um oxido, como sílica, alumina, titânia, zircônia, nióbia ou simi- lares, ácido de nióbio, ácido de zircônio, ácido de tungstênio, ácido de titânio, carbono, ou uma mistura deles. Quando o catalisador de metal nobre é supor- tado em um veículo diferente de silicato de titânio, o veículo suportando o cata- lisador de metal nobre pode ser misturado com o silicato de titânio, de modo a usar-se a mistura como um catalisador. Entre os veículos diferentes de silicato de titânio da presente invenção, o preferido é carbono.
Como um processo para suportar o catalisador de metal nobre em um veículo, por exemplo, ilustra-se um processo no qual uma solução coloidal de metal nobre, obtida por dispersão das partículas de metal nobre usando um agente dispersante, tal como ácido cítrico, poli (álcool vinílico), polivinilpirrolidona, hexametafosfato de sódio, ou similares, é suportada em um veículo por impregnação ou similares, seguida por calcinação sob uma atmosfera de gás inerte.
Alternativamente, o catalisador de metal nobre pode ser prepa- rado por suporte de um composto de metal nobre, como uma fonte de metal nobre, um sal de nitrato de um metal nobre, tal como nitrato de paládio, um sal de sulfato, tal como sulfato de paládio diidratado, um halogeneto de um metal nobre, tal como cloreto de paládio, um sal de ácido carboxílico de ace- tato de paládio, ou um complexo de amina, tal como de tetramina - cloreto de paládio diidratado ou similares em um veículo, por impregnação ou simi- lares, seguida por redução com um agente redutor. Também, o catalisador de metal nobre pode ser preparado por obtenção de um hidróxido de um metal nobre, usando um álcali, tal como hidróxido de sódio, seguida por re- dução em uma fase líquida ou uma fase gasosa com um agente redutor.
Os exemplos do agente redutor, a ser usado no caso de redução em uma fase líquida, incluem hidrogênio, hidrazina monoidratada, formaldeí- do, boridreto de sódio, e similares. Um álcali pode ser adicionado no caso do uso de hidrazina monoidratada ou formaldeído.
Hidrogênio pode ser usado como um agente redutor para a re- de anticorpo secundário anti-humano de cabra com PE (Jackson ImmunoResearch Lab) em diluições de 1:100 em gelo durante 30 minutos. As células foram assim imediatamente visualizadas quanto à morfologia e intensidade imuno-fluorescente sob um microscópio fluorescente (Nikon) em 0 minuto ou foram incubadas a 37°C por várias vezes. A imagem da morfologia celular e a intensidade da imuno-fluorescência das células coradas foram observadas em diferentes períodos de tempo como indicado nas figuras abaixo. A fluorescência foi observada apenas nas células coradas com os anticorpos anti-08E HuMAb. Nenhuma fluorescência foi detectada com o anticorpo IgG1 controle. Os resultados similares foram também obtidos com os anticorpos anti-08E HuMAB conjugados diretamente com FITC nos ensaios.
Os dados da imagem demonstraram a aparência da fluorescência na membrana da superfície celular com todos os três anticorpos anti-08E HuMAb em 0 minuto. Em 3 0 minutos de incubação, a intensidade da fluorescência na membrana diminuiu significativamente enquanto a coloração aumentou dentro das células. Em um período de tempo de 120 minutos, a fluorescência na membrana não foi aparente, mas ao contrário, parecer estar presente nos compartimentos intracelulares. Os dados demonstram que os anticorpos anti-08E HuMAb podem ser internalizados especificamente sob ligação às células de tumores endógenos expressando 08E.
EXEMPLO 14:
Eficácia dos anticorpos anti-08E em tumores HEK-B7H4 em camundongos SCID.
Neste exemplo, os camundongos SCID implantados com tumores HEK-B7H4 são tratados in vivo com anticorpos anti-08E desnudos para examinar o efeito in vivo dos anticorpos em crescimento de tumores.
Camundongos com várias imunodeficiências combinadas (SCID), que perderam os linfócitos BeT funcionais foram utilizados no estudo do crescimento do tumor. As células da linha celular de tumor HEK transfectadas com B7H4 foram implantados subcutaneamente em 5 milhões célula/camundongo em matrigel (50% v/v). Cada camundongo recebeu um inóculo de 0,2 ml de células no dia 0 (zero). O camundongo foi checado quanto ao crescimento do tumor iniciando no dia 10 e monitorado duas vezes por semana quanto ao crescimento do tumor por aproximadamente 6 semanas. Quando os tumores alcançados a cerca de 130 mm3, o camundongo foi classificado quanto ao volume de tumor dentro de 3 grupos. Os camundongos pelados foram tratados tanto com 10 mg/kg do anticorpo anti-08E 2A7, um anticorpo isotipo controle ou formulação tampão como um controle negativo. Os animais foram dosados pela injeção intraperitoneal a cada 5 dias durante 5 injeções. Usando um calibre eletrônico, os tumores foram medidos tridimensionalmente (altura x largura x comprimento) e volume de tumor foi calculado. Os camundongos foram eutanizados quando os tumores alcançaram um volume de 1500 mm3 ou demonstraram uma perda maior que 15%. Os resultados estão demonstrados na figura 20. O crescimento do tumor foi inibido pelo tratamento com o anticorpo anti-08E 2A7. O meio de inibição do crescimento do tumor para o grupo tratado com 2A7 foi de 63% no dia 34. Os tumores resumiram o crescimento após a dosagem ter sido interrompida. Estes resultados mostram que os anticorpos anti-08E são eficazes no tratamento de tumores que expressão in vivo 08E.
EXEMPLO 15:
Imuno-histoquímica usando um anticorpo anti-08E. A capacidade do anti-B7H4 HuMAb 2A7 para reconhecer B7H4 por imuno-histoquímica foi examinada usando a biópsia clínica de câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de mama, e câncer de cabeça e pescoço.
Para a imuno-histoquímica, 5 μm de secções congeladas foram utilizadas (Ardais, Inc., USA). Após a secagem durante 30 minutos, secções foram fixadas com acetona (em temperatura ambiente durante 10 minutos) e secas ao ar durante 5 minutos. As lâminas foram lavadas em PBS e então, pré-incubadas com 10% de soro normal de cabra em PBS durante 2 0 minutos e, subseqüentemente incubadas com 10 μg/ml do anticorpo fitocilados em PBS com 10% de soro de cabra normal durante 3 0 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas durante 30 minutos com anti-FITC de camundongo (10 μg/ml DAKO) em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas novamente com PBS e incubadas com conjugado HRP anti-camundongo de cabra (DAKO) durante 30 minutos a temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas novamente 3x com PBS. A diaminobenzidina (Sigma) foi utilizada como substrato, resultando em uma coloração marrom. Após a lavagem com água destilada, as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina por 1 minuto. Subseqüentemente, as lâminas foram lavadas durante 10 segundos em uma corrida com água destilada e montada em glicergel (DAKO). A imuno-histoquímica da biópsia clínica corada revelou coloração positiva no câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, e amostras de câncer de cabeça e de pescoço.
EXEMPLO 16:
RT-PCR quantitativo em tecidos normais e de câncer Várias amostras de tecido normais e com câncer foram classificadas para a expressão de 08E mRNA usando transcriptase reversa quantitativa PCR (RT-PCR). A expressão de mRNA é indicativa da expressão da proteína 08E.
Para o RT-PCR quantitativo, os primers 08E a seguir foram utilizados: B7-H4,3: AGGATGGAATCCTGAGCTGCACTT; B7-H4,4: TCCGACAGCTCATCTTTGCCTTCT como provido por Operon (Huntsville, AL) . As condições de reação padrão foram utilizados (5 μΐ de cDNA padrão em 1 ng/ml, 0,1 μl do primer a jusante em 40 μΜ, 0,1 μΐ do primer a montante em 40 μΜ, 6μl de 2X SYBR verde, mistura de PC (Applied Biosystems #4367659), e 0,8 μΐ de água). 0 cDNA foi amplificado durante 40 ciclos usando condições de PCR padrão em um ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Os resultados de RT-PCR quantitativo estão mostrados na Tabela 7 abaixo. As amostras com contagem indeterminada representam os valores que estão abaixo de um limiar de fluorescência. Os tumores de câncer de mama, ovário e cabeça e pescoço demonstraram expressar 08E, com níveis elevados de expressão, demonstram em algumas amostras de cânceres de ovário e câncer de cabeça e de pescoço relativas aos tecidos normais.
TABELA 7
RT-PCR quantitativo da expressão em tecidos de cânceres e tecidos normais.
<table>table see original document page 165</column></row><table> <table>table see original document page 166</column></row><table>
A presente invenção não está limitada ao escopo das configurações específicas descrito aqui. Ao contrário, várias modificações desta invenção em adição àquelas descritas se tornarão aparentes aos técnicos no assunto a partir da descrição antecedente e acompanhando as figuras. Pretende-se que as referidas modificações estejam dentro do escopo de proteção das reivindicações anexas.
Patentes, pedidos de patente, publicações, descrição de produtos e os protocolos são citados durante este pedido, as descrições das quais são incorporadas aqui por referência em sua íntegra para todos os propósitos. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Medarex, Inc.
<120> "ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO OU UMA PORÇÃO LIGANTE AO ANTfGENO DO MESMO, COMPOSIÇÃO, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-08E E MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENÇA DEFINIDA PELO CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS EXPRESSANDO 08E".
<130> 04280/1203606-US1
<160> 55
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Phe Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Arg 65 70 75 80
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Ser Ser Trp Ser Asn Trp Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Thr Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 116 <212 > PRT <213 > Homo sapiens <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Val Ser Arg Asn 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Gly Ser Gly Arg Thr Asp Cys Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser
115 <210> 4
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Lys Ala Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Ser Asp Phe Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ala Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Lys Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Leu Arg Tyr Phe Glu Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110
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<211> 108
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Glu Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
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<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
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85 90 95
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<210> 8
<211> 109
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<4 0 0 >
8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro b Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 103 <212 > PRT <213 > Homo sapiens <400> 9 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Thr Phe Gly Gln 85 90 95 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 <210> 10 <211> 108 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala 50 55 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 85 Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100
Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 60
Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
90 95
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<210> 11
<211> 5
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
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Asp Tyr Phe Trp Thr 1 5
<210> 12
<211> 6
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
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<211> 5
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
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<211> 5
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
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<212 > PRT
<213> Homo sapiens
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<211> 16
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<4 0 0 > 16
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<210> 17
<211> 16
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
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<211> 16
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<4 0 0 > 18
Val Ile Tyr Gly Ser Gly Arg Thr Asp Cys Ala Asp Ser Val Lys Gly 15 10 15
<210 > 19
<211> 17
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<4 0 0 > 19 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 16
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400 > 20
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<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Leu Ser Ser Trp Ser Asn Trp Ala Phe Glu Tyr 1 5 10
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<211> 7
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
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<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
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<211> 16
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
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<211> 14
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
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<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
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<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<210> 28
<211> 12 <212 > PRT <213> Homo sapiens
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<211> 11
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<4 0 0 > 29
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10
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<211> 12
< 212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10
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<211> 7
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
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<212 > PRT
<213> Homo sapiens
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<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5
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<211> 7
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr 1 5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212 > PRT
<213> Homo sapiens
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Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Tyr Thr 1 5 10
<210 > 39 <211> 5 <212 > PRT
<210> 40
<211> 9
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr 1 5
<210> 41
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt gattacttct ggacctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg gcctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaaccac caactacaac 18 0
ccgtccctca agagtcgagt caccatttca gcagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aggctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actcagcagc 3 00
tggtcgaact gggcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<400> 39
Gln Gln 1
Arg Arg Thr 5 <210> 42
<211> 345
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt gactccgtga agggccgagt caccatctcc caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctatggacg tctggggcca agggaccacg
ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 agcaactaca tgaactgggt ccgccaggct 120 atttatggca gtggtagaac atattacgca 180 agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240 gccgtgtatt actgtgcgag agatacctac 300 gtcaccgtct cctct 345
<210> 43
<211> 348
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
gaggtgcagt tggtggagtc tggaggaggc tcctgtgcag cctctgggtt catcgtcagt ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt gactccgtga agggccgatt caccatctcc caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc
ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 agaaactaca tgaactgggt ccgccaggct 12 0 atttatggca gtggtaggac agactgcgca 18 0 agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240 gccgtgtatt actgtgcgag agatggggac 3 00 acggtcaccg tctcctca 348
<210> 44
<211> 378
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcctgtgtag cctctggatt cacctttgat ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt gcggactctg tgaagggccg attcaccatc ctgcaaatga açagtctgag agctgaggac tatggttcgg ggagttctga cttctactac acggtcgccg tctcctca
ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 attagttgga atagtggtag cataggctat 180 tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 acggccttgt attactgtac aaaagccctc 300 tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 3 60
378
<210> 45
<211> 366
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
caggtgcagc tacagcagtg
acctgcgctg tctatggtgg
ccagggaagg ggctggagtg
gggcgcagga ctgttgaagc gtccttcagt ggttactact gattgggaaa atcaatcata
cttcggagac cctgtccctc 60 ggagctggat ccgccagccc 12 0 gcggaagtac caactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aaactaaact ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agaattacga 300
tattttgaaa actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 46
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
gaaattgtgt tgacgcagtt tccaggcacc
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc
cctggccagg ctcccagggt cctcatctat
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag
gaagggacca aggtggagat caaa
ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
agcacctact tagcctggta ccagcagaaa 120
ggtgcatcca gaagggccac tggcatccca 180
gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cagtatggta gctcaccgct cactttcggc 300
324
<210> 47
<211> 327
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 47
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag
ggccagggga ccaagctgga gatcaaa
ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cagtatggta gctcacccat gtacactttt 300
327
<210> 48
<211> 327
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag
ggccagggga ccaagctgga gatcaaa
ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cagtatggta gctcacctct gtacactttt 300
327 <210> 49
<211> 309
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc ggccaggctc ccaggctcct catctatgat aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag gaaatcaaa
ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 cgtaggacgt tcggccaagg gaccaaggtg 300
309
<210> 50
<211> 324
<212 > DNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag
caagggacca aggtggaaat caaa
ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cagtatggta gctcacctcg gacgttcggc 3 00
324
<210> 51
<211> 97
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg <210> 52
<211> 97
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 53
<211> 124
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Asp 30 Asp Tyr Ala Met His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ser Gly 50 Ile Ser Trp Asn Ser 55 Gly Ser Ile Gly Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Leu Tyr Tyr 95 Cys Ala Lys Asp Tyr 100 Gly Ser Gly Ser Tyr 105 Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 110 Met Asp Val Trp Gly 115 Gln Gly Thr Thr Val 120 Thr Val Ser Ser <210> 54
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 SO 95
<210> 55
<211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Thr Phe 85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (44)

1. Anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de: (a) ligar-se ao 08E humano com um Kd de IxlO"7 M ou menos; e (b) ligar-se a uma linha de célula tumoral de carcinoma de célula mamária.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo de extensão completa de um isótopo IgGl ou IgG4.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia simples.
4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado anticorpo ligar-se a 08E humano com um Kd de 5,5 χ IO"9 M ou menos.
5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado anticorpo ligar-se ao 08E humano com um Kd de 3 χ IO"9 M ou menos.
6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado anticorpo ligar-se ao 08E humano com um Kd de 2 χ IO"9 M ou menos.
7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o referido anticorpo ser internalizado.
8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a linha de célula tumoral do carcinoma de célula mamária ser selecionada a partir do grupo consistindo da linha de célula SKBR3.
9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o referido anticorpo perder os resíduos de fucose.
10. Anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de o anticorpo fazer competição cruzada para ligar-se a 08E com um anticorpo de referência, sendo que o anticorpo de referência: (a) liga-se ao 08E humano com um Kd de 1 χ IO"7 M ou menos; e (b) liga-se a linha de célula tumoral do carcinoma de célula mamária.
11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o anticorpo de referência compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 1; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO:6.
12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o anticorpo de referência compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 2; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO:7.
13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o anticorpo de referência compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 3; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO:8.
14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, caracteri zado pelo fato de o anticorpo de referência compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 4; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO:9.
15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o anticorpo de referência compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 5; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO:10 .
16. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia pesada que é produto de ou derivada de um gene Vh 4-34 humano, um gene Vh 3-53 humano ou o gene Vh 3-9 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E.
17. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia leve que é produto de ou derivada de um gene Vk Al7 humano ou de um gene Vk Ll6 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E.
18. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.NO:11; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.NO:16; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.N0:21; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ.ID.NO:26; (e) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ.ID.NO:31; e (f) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ.ID.NO:3 6.
19. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.NO:12; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.NO:17; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ.ID.NO:22; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ.ID.NO:27; (e) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ.ID.NO:32; e (f) uma CDR1 de região variável de reivindicacao 1, compreendendo a SEQ.ID.NO:37.
20. Anticorpo, de acordo com a reivindicacao 1, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:13; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO: 18; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO: 23; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:28; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:33; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:38.
21. Anticorpo, de acordo com caracterizado pelo fato de compreender (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:14; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:19; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:24; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:29; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:34; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:39.
22. Anticorpo, de acordo com a caracterizado pelo fato de compreender (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:15; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:2 0; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ.ID.NO:2 5; (d) uma CDRl de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:30; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:35; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ.ID.NO:40.
23. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 1; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 6, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E.
24. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 2; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 7, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E.
25. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 3; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 8, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E.
26. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 4; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 9, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E.
27. Anticorpo monoclonal isolado ou porção ligante ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 5; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 10, sendo que o anticorpo liga-se especificamente ao 08E.
28. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo ou a porção ligante ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
29. Imunoconjugado, caracteri zado pelo fato de compreender o anticorpo ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, ligado a um agente terapêutico.
30. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o imunoconjugado, conforme definido na reivindicação 2 9 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
31. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de o agente terapêutico ser uma citotoxina.
32. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o imunoconjugado, conforme definido na reivindicação 31 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
33. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de o agente terapêutico ser um isótopo radioativo.
34. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o imunoconjugado, conforme definido na reivindicação 33 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
35. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de codificar o anticorpo ou a porção ligante ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1.
36. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender a molécula de ácido nucléico conforme definida na reivindicação 35.
37. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender o vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 36.
38. Método para preparar um anticorpo anti-08E, caracterizado pelo fato de compreender a expressão do anticorpo na célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 37, e o isolamento do anticorpo a partir da célula hospedeira.
39. Método para tratar ou prevenir uma doença, definida pelo crescimento de células tumorais expressando 08E, caracterizado pelo fato de compreender administrar a um indivíduo o anticorpo ou a porção ligante ao antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1 em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir a doença.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de a doença ser câncer.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de o câncer ser um carcinoma de célula mamária.
42. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de o câncer ser um câncer de ovário.
43. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de o câncer ser câncer de rim.
44. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de o câncer ser câncer de cabeça e de pescoço.
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