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PT2956173T - Compostos de tubulisina, métodos de produção e utilização - Google Patents

Compostos de tubulisina, métodos de produção e utilização Download PDF

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Publication number
PT2956173T
PT2956173T PT147067433T PT14706743T PT2956173T PT 2956173 T PT2956173 T PT 2956173T PT 147067433 T PT147067433 T PT 147067433T PT 14706743 T PT14706743 T PT 14706743T PT 2956173 T PT2956173 T PT 2956173T
Authority
PT
Portugal
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compound
unsubstituted
substituted
mmol
alkyl
Prior art date
Application number
PT147067433T
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English (en)
Inventor
Cheng Heng
Cong Qiang
Gangwar Sanjeev
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
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Description

DESCRIÇÃO
COMPOSTOS DE TUBULISINA, MÉTODOS DE PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a compostos estruturalmente semelhantes às tubulisinas, conjugados dos mesmos com um ligando, métodos para produção e utilização de tais compostos e conjugados e composições compreendendo tais compostos e conjugados.
As tubulisinas são citotoxinas originalmente isoladas a partir de culturas da mixobactéria Archangium gephyra ou Angiococcus disciformis, com cada organismo produzindo uma mistura diferente de tubulisinas ÊSasse et al. 2000; Reichenbach et al. 1998Õ. A sua estrutura cristalina e via biossintética foram elucidadas ÊSteinmetz et al. , 2QQ4Õ e os seus genes biossintéticos foram sequenciados ÊHoefle et al. 2006bÕ. Também foi mostrado que a pré-tubulisina, um precursor biossintético das tubulisinas, possui alguma atividade ÊUllrich et al., 20Q9Õ. ÊSão listadas citações completas dos documentos citados no presente documento por primeiro autor ou inventor e ano no final da presente memória descritivaÕ.
As tubulisinas pertencem a um grupo de polipéptidos e depsipéptidos anti mitóticos de ocorrência natural que incluem as fomopsinas, as dolastatinas e as criptoficinas ÊHamel, 2002Õ. Também existem outros agentes anti mitóticos para além de polipéptidos ou depsipéptidos, por exemplo paclitaxel, as maitansinas e as epotilonas. Durante a mitose, os microtúbulos de uma célula reorganizam-se para formar o fuso mitótico, um processo que requer a montagem e desmontagem rápidas das proteínas constituintes dos microtúbulos, cí- e β-tubulinas. Agentes anti mitóticos bloqueiam este processo e evitam que uma célula seja submetida a mitose. Ao nível molecular o mecanismo de EP2956173B1 bloqueio exato pode diferir de um agente anti mitótico para outro. As tubulisinas impedem a montagem das tubulinas em microtúbulos, causando que as células afetadas se acumulem na fase G2ÁM e sejam submetidas a apoptose ÊKhalil et al. 2006Õ. 0 paclitaxel obtém o mesmo resultado final ligando aos microtúbulos e impedindo a sua desmontagem.
As tubulisinas têm uma armação de tetrapeptidilo construída a partir de uma subunidade de aminoãcido proteinogénico e três subunidades de aminoácidos não proteinogénicos conforme mostrado na fórmula ÊAÕ: ácido N-metilpipecolínico ÊMepÕ, isoleucina ÊlleÕ, tubuvalina ÊTuvÕ e tubufenilalanina ÊTup, R' igual a HÕ ou tubutirosina ÊTut, R' igual a OHÕ. Entre as tubulisinas mais conhecidas de ocorrência natural Êdesignadas A, B, etc.Õ, os locais de variações estruturais são nos resíduos R!, R" e R" ' de fórmula ÊAÕ, conforme mostrado no Quadro 1:
EP2956173B1
Adicionalmente, foram identificadas outras tubulisinas de ocorrência natural ÊChai et al. 2010Õ.
Kaur et al. 2006 estudaram as propriedades antiproliferativas da tubulisina A e descobriram que esta era mais potente do que outros agentes anti mitóticos, tais como paclitaxel e vinblastina, e era ativa em ensaios de xenoenxerto contra uma variedade de linhas de células cancerígenas. Além disso, a tubulisina A induziu apoptose em células cancerígenas mas não células normais e mostrou potenciais propriedades anti angiogénicas significativas em ensaios in vitro. As propriedades anti mitóticas de outras tubulisinas também foram avaliadas e, em geral foram constatadas como comparando favoravelmente com as de agentes anti mitóticos de não tubulisina Êveja-se, por exemplo, Balasubramanian et al. 2009; Steinmetz et al. 2004; Wipf et al. 2004Õ. Por estas razões, existe um interesse considerável nas tubulisinas como agentes anti cancro Êveja-se, por exemplo, Domling et al. 2005c,·. Hamel, 20020. Várias publicações descrevem os esforços dirigidos à síntese de tubulisinas, incluindo: Balasubramanian et al. 2009; Domling et al. 2006; Hoefle et al. 2003; Neri et al. 2006; Peltier et al. 2006; Sani et al. 2007; Sasse et al. 2 007; Shankar et al. 2 009; Shibue et al. 2009 e 2010; e
Wipf et al. 2004. Outras publicações descrevem estudos da relação estrutura-atividade ÊSARÕ, através de preparação e avaliação de análogos ou derivados de tubulisina: Balasubramanian et al. 2008 e 2009; Chai et al. 2011;
Domling 2006; Domling et al. 2005a; Ellman et al. 2013; Hoefle et al. 2001 μ 2006a; Pando et al. 2011; Patterson et al. 2007 μ 2008; Richter 2012a, 2012b, e 2012c; Shankar et al. 2013; Shibue et al. 2011; Sreejith et al. 2011; Vlahov et al. 2010a; Wang et al. 2007; Wipf et al. 2007 e 2010; e Zanda et al. 2013. Os estudos de SAR exploraram principalmente as variações estruturais no anel de Mep, resíduos R" e R!! ' da subunidade Tuv, e a cadeia de carbono do anel aromático ou alifãtico da subunidade TupÁTut.
Domling et al. 2005 divulgam conjugados de tubulisinas com uma molécula parceira genericamente descrita como um polímero ou uma biomolécula, mas com exemplos limitados a polietilenoglicol ÊPEGÕ como a molécula parceira. Cheng et al. 2011 também divulgam análogos de tubulisina adaptados para utilização em conjugados. Outros documentos divulgando conjugados de tubulisinas são Boyd et al. 2008 e 2010; Jackson et al. 2013; Vlahov et al. 2008a, 2008b e 2010b; Leamon et al. 2008 e 2010; Reddy et al. 2009; e Low et al. 2010. Leung et al. 2002 divulgam polipéptidos polianiónicos que podem ser conjugados com fármacos Êincluindo tu-bulisinasõ para melhorar a sua bioatividade e solubilidade em água.
Davis et al. 2008 e Schluep et al. 2009 divulgam formulações à base de ciclodextrina nas quais as tubulisinas estão covalentemente ligadas a uma ciclodextrina através de uma fração de ligando de dissulfeto de hidrazida ligada ao grupo carboxilo de TupÁTut. Os documentos EP2292639 e W02001Á069116 divulgam derivados de tubulisina e a sua síntese. A desacetilação da subunidade Tuv Êisto é, R" na fórmula ÊAÕ é hidroxilo em vez de acetiloõ alegadamente leva à perda de atividade biológica ÊDomling et al., 2006Õ. Num estudo de tubulisinas U e V, as quais diferem por a primeira ser acetilada e a última ser desacetilada, a tubulisina V foi relatada como sendo menos potente em cerca de 20OX a 6 0OX, dependendo do ensaio ÊBalasubramanian et al. , 2009Õ. Dado que um grupo acetato é suscetível de hidrólise, a desacetilação na posição R" é uma preocupação, como um centro de potencial centro de instabilidade levando à perda de atividade, para o desenvolvimento de análogos de tubulisina para aplicações farmacêuticas.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Foi descoberto que é possível conferir proteção contra a perda de atividade biológica associada à desacetilação conforme discutido acima ao substituir um acetato na posição R" por um grupo carbamato. Um grupo carbamato conforme descrito no presente documento não causa uma perda significativa de atividade biológica mas ainda assim é mais estável.
Consequentemente, num aspecto, a presente invenção proporciona um composto tendo uma estrutura representada pela fórmula ÊIÕ:
(I) em que: R1 é H, C1-C10 alquilo não substituído ou substituído, C2-Cio alquenilo não substituído ou substituído, C2-Ci0 alquinilo não substituído ou substituído, arilo não substituído ou substituído, heteroarilo nao substituído ou substituído, ÊCH2Õi-2OÊCi-Cio alquiloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi_2OÊC2-Ci0 alqueniloõ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi_ 2OÊC2-Cio alquiniloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi_2OCÊ=OÕÊCi-Cio alquiloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi_2OCÊ-OÕÊC2-C10 alqueniloõ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi_2OCÊ=OÕÊC2-Ci0 alquiniloÕ não substituído ou substituído, CÊ=OÕÊCi-Ci0 alquiloõ não substituído ou substituído, CÊ=OÕÊC2-Ci0 alqueniloÕ não substituído ou substituído, CÊ=OÕÊC2-Ci0 alquiniloÕ não substituído ou substituído, cicloalifático não substituído ou substituído, heterocicloalifático não substituído ou substituído, arilalquilo nâo substituído ou substituído ou alquilarilo não substituído ou substituído; R"" é H, C1-C10 alquilo não substituído ou substituído, C2-Cio alquenilo não substituído ou substituído, C2-Ci0 alquinilo não substituído ou substituído, arilo não substituído ou substituído, heteroarilo nao substituído ou substituído, ÊCH2Õi„2OÊCl-Ci0 alquiloõ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi_2OÊC2-Ci0 alqueniloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi-2OÊC2-Cio alquiniloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi_2OCÊ=OÕÊCi-Cio alquiloõ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi_2OCÊ=OÕÊC2 - Cio alqueniloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi-2OCÊ=OÕÊC2-Ci0 alquiniloÕ não substituído ou substituído, CÊ=OÕÊCi-Ci0 alquiloõ não substituído ou substituído, CÊ=OÕÊC2-Ci0 alqueniloÕ não substituído ou substituído, CÊ=OÕÊC2-C10 alquiniloÕ não substituído ou substituído, cicloalifático nâo substituído ou substituído, heterocicloalifático não substituído ou substituído, arilalquilo não substituído ou substituído ou alquilarilo não substituído
ou substituído; ou em que cada R2d é independentemente H, NH2, NHMe, Cl, F, Me, Et OU CN; R3a são independentemente H, C:L-C5 alquilo, CH2ÊC5-C6 e cicloalquiloÕ, CH2C6H5, C6H5 ou CH2CH2OH; R3b R4 é
em que R4a é H ou C1-C3 alquilo; e Y é H, OH, Cl, F, CN, Me, Et, N02 OU NH2; R5 é H, Ci-C5 alquilo, C2-C5 alquenilo, C2-C5 alquinilo, COÊCi-Cs alquiloõ, COÊC2-C5 alqueniloõ ou COÊC2-C5 alquiniloÕ; W é 0 ou S Êde preferência OÕ; e n é 0, 1 ou 2; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Noutra forma de realização, esta invenção proporciona um conjugado que compreende um composto de acordo com a fórmula ÊIÕ ligado covalentemente a uma fração de direcionamento que liga especificamente ou preferentemente a uma entidade química sobre uma célula alvo, cuja célula alvo é preferentemente uma célula cancerígena. Preferentemente, a fração de direcionamento é um anticorpo - mais preferentemente um anticorpo monoclonal e ainda mais preferentemente um anticorpo monoclonal humano - ou a porção de ligação a antígeno do mesmo e a entidade química é um antigénio associado a tumor. 0 antigénio associado a tumor pode ser um que é exibido sobre a superfície de uma célula cancerígena ou um que é segregado por uma célula cancerígena para o espaço extracelular circundante.
Noutra forma de realização, é proporcionada uma composição de matéria compreendendo um composto desta invenção e uma fração de ligando tendo um grupo funcional reativo, adequado para conjugação a uma fração de direcionamento.
Noutra forma de realização, é proporcionado um composto desta invenção para utilização num método de tratamento de um cancro num indivíduo sofrendo de tal cancro, compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto desta invenção ou um conjugado do mesmo com uma fração de direcionamento Êparticularmente um anticorpoÕ. Noutra forma de realização, é proporcionado um composto da presente invenção ou um conjugado do mesmo com uma fração de direcionamento Êparticularmente um anticorpoÕ para utilização na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro num indivíduo sofrendo de tal cancro. 0 cancro pode ser cancro renal, gástrico, pulmonar ou ovãrico. BREVE DESCRIÇÃO DOÊSÕ DESENHOÊSÕ
As Figuras 1, 2a - 2b e 3 mostram, em combinação, um esquema para a síntese do composto ÊIII-1Õ. A Figura 4 mostra um esquema para a síntese do composto ÊIII-2Õ. A Figura 5 mostra um esquema para a síntese dos compostos ÊI-2Õ e ÊI-3Õ,
As Figuras 6a - 6c mostram, em combinação, um esquema para a síntese dos compostos ÊIII-4Õ e ÊIII-5Õ. A Figura 7 mostra um esquema para a síntese do composto ÊI-1Õ. A Figura 8 mostra um esquema para a síntese do composto EI-40.
As Figuras 9a e 9b mostram, em combinação, um esquema para a síntese do composto ÊIII-6Õ.
As Figuras 10 e 11 mostram esquemas para a síntese de intermediários úteis para a preparação de compostos desta invenção. A Figura 12 mostra esquemas para a síntese de compostos adicionais desta invenção.
As Figuras 13a - 13d mostram a atividade biológica de alguns compostos desta invenção. A Figura 14 mostra a atividade in vitro de um conjugado desta invenção. A Figura 15 mostra a atividade in vivo de um conjugado desta invenção.
As Figuras 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b e 20 mostram dados adicionais in vivo sobre a atividade dos conjugados desta invenção.
As Figuras 21 e 22 mostram esquemas para a síntese de compostos adicionais desta invenção ilustrando variações estruturais no grupo carbamato. A Figura 23 mostra um esquema para a síntese de compostos desta invenção adequados para conjugação através de química "click". A Figura 24 mostra um esquema para a síntese de compostos desta invenção adequados para conjugação através de um grupo amina alifático.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES "Anticorpo" significa anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação a antigénio (isto é, "porção de ligação a antigénio") ou variantes de cadeia simples dos mesmos. Um anticorpo inteiro é uma proteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada compreendendo três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (VL ou Vk) e uma região constante de cadeia leve compreendendo um único domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões de determinação de complementaridade ÊCDRsÕ, interpostas com regiões estruturais ÊFRÕ mais conservadas. Cada VH e VL compreende três CDRs e quatro FRs dispostas do terminal amino para carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As regiões variáveis contêm um domínio de ligação que interatua com um antigénio. As regiões constantes podem mediar a ligação do anticorpo aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune Êpor exemplo, células efetorasÕ e o primeiro componente ÊClqÕ do sistema de complemento clássico. Um anticorpo é referido como "ligando especificamente" a um antigénio X se o anticorpo ligar ao antigénio X com uma KD de 5 x IO'8 M ou menos, mais preferentemente 1 x 10'8 M ou menos, mais preferentemente 6 x 10~9 M ou menos, mais preferentemente 3 x 10~9 M ou menos, ainda mais preferentemente 2 x 10"9 M ou menos. 0 anticorpo pode ser quimérico, humanizado ou, preferentemente, humano. A região constante de cadeia pesada pode ser manipulada para afetar o tipo ou extensão da glicosilação, prolongar a semivida do anticorpo, aumentar ou reduzir interações com células efetoras ou o sistema de complemento ou modular alguma outra propriedade. A manipulação pode ser realizada por meio de substituição, adição ou eliminação de um ou mais aminoácidos ou através de substituição de um domínio por um domínio a partir de outro tipo de imunoglobulina ou uma combinação dos anteriores. "Fragmento de ligação a antigénio" e "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo Êou simplesmente "porção de anticorpo" ou "fragmento de anticorpo"Õ significa um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de ligar especificamente a um antigénio. Foi mostrado que a função de ligação a antigénio de um anticorpo pode ser desempenhada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo, tais como ÊiÕ um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CHi; ÊiiÕ um fragmento FÊab'Õ2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; ÊiiiÕ um fragmento Fab', que é essencialmente um Fab com parte da região de dobradiça Êveja-se, por exemplo, Abbas et al. , Cellular and Molecular Immunology, 6 a Ed., Saunders Elsevier 2007Õ; ÊivÕ um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CHi; ÊvÕ um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, ÊviÕ um fragmento dAb ÊWard et al. , Ê1989Õ Nature 341: 544-546Õ, que consiste num domínio VH; ÊviiÕ uma região de determinação de complementaridade ÊCDRÕ isolada; e ÊviiiÕ um nanocorpo, uma região variável de cadeia pesada contendo um único domínio variável e dois domínios constantes. Os fragmentos de ligação a antigénio preferidos são fragmentos Fab, FÊab'Õ2, Fab', Fv e Fd. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um ligando sintético que permite que sejam formados como uma cadeia de proteína única, na qual as regiões VL e VH são emparelhadas para formar moléculas monovalentes Êconhecido como Fv de cadeia simples ou scFvÕ; veja-se, por exemplo, Bird et al. Ê1988Õ Science 242: 423-426; e Huston et al. Ê1988Õ Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883Õ. Tais anticorpos de cadeia simples também estão abrangidos no termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo.
Um "anticorpo isolado", significa um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigénicas Êpor exemplo, um anticorpo isolado que liga especificamente a um antigénio X é substancialmente isento de anticorpos que ligam especificamente a outros antigénios para além do antigénio XÕ. Um anticorpo isolado que liga especificamente a um antigénio X pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antigénios, tais como moléculas de antigénio X a partir de outras espécies. Em determinadas formas de realização, um anticorpo isolado liga especificamente a um antigénio humano X e não tem reatividade cruzada com outros antigénios para além do antigénio X Ênão humanosõ. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular eÁou produtos químicos. "Anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" significa uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única, que exibe uma especificidade de ligação única e afinidade por um epítopo particular. "Anticorpo humano" significa um anticorpo tendo regiões variaveis nas quais tanto as regiões estruturais como CDR Êe a região constante, se presenteõ são derivadas a partir de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Os anticorpos humanos podem incluir modificações posteriores, incluindo modificações naturais ou sintéticas. Os anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoãcidos não codificados pelas sequências de imunog1obu1inas da linha germinativa humana Êpor exemplo, mutações introduzidas através de mutagénese aleatória ou específica de sítio in vitro ou através de mutação somática in vivoQ. No entanto, "anticorpo humano" não inclui anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas a partir da linha germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um ratinho, foram enxertadas em sequências estruturais humanas. "Anticorpo monoclonal humano" significa um anticorpo que exibe uma única especificidade de ligação, que tem regiões variáveis nas quais tanto as regiões estruturais como CDR são derivadas a partir de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Numa forma de realização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal transgénico não humano, por exemplo, um ratinho transgénico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundido com uma célula imortalizada. ÉAlifãticoÉ significa uma fração hidrocarboneto não aromática de cadeia linear ou ramificada, saturada ou insaturada, tendo o número especificado de átomos de carbono Êpor exemplo, conforme em ÉC3 alifáticoÉ, ÉC1-C5 alifáticoÉ ou ÉCi a C5 alifáticoÉ, as duas últimas frases sendo sinónimas para uma fração alifática tendo de 1 a 5 átomos de carbonoõ ou, onde o número de átomos de carbono não é explicitamente especificado, de 1 a 4 átomos de carbono Ê2 a 4 carbonos no caso de porções alifáticas insaturadasõ. ÉAlquiloÉ significa uma porção alifática saturada, com a mesma convenção para designação do número de átomos de carbono sendo aplicável. A título de ilustração, porções C1-C4 alquilo incluem, mas não estão limitadas a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobutilo, t-butilo, 1-butilo, 2-butilo e semelhantes. ÉAlquilenoÉ significa uma contraparte divalente de um grupo alquilo, tal como CH2CH2, CH2CH2CH2 e CH2CH2CH2CH2. ÉAlqueniloÉ significa uma fração alifática tendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono, com a mesma convenção para designação do número de átomos de carbono sendo aplicável. A título de ilustração, porções C2-C4 alquenilo incluem, mas não estão limitadas a, etenilo ÊviniloÕ, 2-propenilo Êalilo ou prop-2-eniloÕ, cis-1-propenilo, trans-l-propenilo, E- Êou Z~Q 2-butenilo, 3-butenilo, 1,3-but.adienilo Êbut-1,3-dieniloÕ e semelhantes. ÉAlquiniloÉ significa uma porção alifática tendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono, com a mesma convenção para designação do número de átomos de carbono sendo aplicável. A título de ilustração, grupos C2-C4 alquinilo incluem etinilo ÊacetileniloÕ, propargilo Êprop-2-iniloÕ, 1-propinilo, but-2-inilo e semelhantes. ÉCicloalifáticoÉ significa uma porção hidrocarboneto não aromático saturada ou insaturada tendo de 1 a 3 anéis, cada anel tendo de 3 a 8 Êpreferentemente de 3 a 6Õ átomos de carbono. ÉCicloalquiloÉ significa uma fração cicloalif ática na qual cada anel é saturado. ÉCicloalqueniloÉ significa uma fração cicloalifática na qual pelo menos um anel tem pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. ÉCicloalquiniloÉ significa uma fração cicloalif ática na qual pelo menos um anel tem pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. A título de ilustração, frações cicloalifáticas incluem, mas não estão limitadas a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, ciclooctilo e adamantilo. Frações cicloalifáticas preferidas são as de cicloalquilo, especialmente ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo e ciclohexilo. ÉCicloalquilenoÉ significa uma contraparte divalente de um grupo cicloalquilo. ÉHeterocicloalifáticoÉ significa uma fração cicloalifática em que, em pelo menos um anel da mesma, até três Êpreferentemente 1 a 2Õ carbonos foram substituídos por um heteroátomo independentemente selecionado a partir de N, 0 ou S, onde o N e S podem ser opcionalmente oxidados e o N pode ser opcionalmente quaternizado. De forma semelhante, ÉheterocicloalquiloÉ, ÉheterocicloalqueniloÉ e ÉheterocicloalquiniloÉ significam uma fração cicloalquilo, cicloalquenilo ou cicloalquinilo, respetivamente, na qual pelo menos um anel da mesma foi modificado. Frações heterocicloalifáticas exemplares incluem aziridinilo, azetidinilo, 1,3-dioxanilo, oxetanilo, tetrahidrofurilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, tetra-hidrotiopiranil sulfona, morfolinilo, tiomorfolinilo, sulfoxido de tiomorfolinilo, tiomorfolinil sulfona, 1,3~ dioxolani lo, tet rahidro-1,1 - dioxo t i enilo, 1,4 - dioxani lo, tietanilo e semelhantes. ÉHeterocicloalquilenoÉ significa uma contraparte divalente de um grupo heterocicloalquilo. ÉAlcoxiÉ, ÉariloxiÉ, ÊalquiltioÉ e ÉariltioÉ significam -OÊalquiloÕ, -OÊariloÕ, -SÊalquiloÕ e -SÊariloÕ, respetivamente. Exemplos são metoxi, fenoxi, metiltio e feniltio, respetivamente. ÉHalogénioÉ ou ÉhaloÉ significa flúor, cloro, bromo ou iodo. ÉAriloÉ significa uma fração hidrocarboneto tendo um sistema de anel mono-, bi- ou tricíclico em que cada anel tem de 3 a 7 átomos de carbono e pelo menos um anel é aromático. Os anéis no sistema de anel podem ser fundidos entre si Êcomo em naftiloÕ ou ligados entre si Êcomo em bifeniloõ e podem ser fundidos ou ligados a anéis não aromáticos Êcomo em indanilo ou ciclohexilfeniloÕ. A título de ilustração adicional, as frações arilo incluem, mas não estão limitadas a, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, bifenilo, fenantrilo, antracenilo e acenaftilo. ÉArilenoÉ significa uma contraparte divalente de um grupo arilo, por exemplo, 1,2-fenileno, 1,3-fenileno ou 1,4-fenileno. ÉHeteroariloÉ significa uma fração tendo um sistema de anel mono-, bi- ou tricíclico em que cada anel tem de 3 a 7 átomos de carbono e pelo menos um anel é um anel aromático contendo de 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados a partir de N, 0 ou S, onde o N e S podem ser opcionalmente oxidados e o N pode ser opcionalmente quaternizado. Tal pelo menos um anel aromático contendo heteroátomo pode ser fundido a outros tipos de anéis Êcomo em benzofuranilo ou tetrahidroisoquinoliloõ ou diretamente ligado a outros tipos de anéis Êcomo em fenilpiridilo ou 2-ciclopentilpiridiloÕ. A título de ilustração adicional, as frações heteroarilo incluem pirrolilo, furanilo, tiofenilo EtieniloO, imidazolilo, pirazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, t iazolilo, isotiazold.lo, triazolilo, t0t1r3.zoll.XO/ piridilo, N-oxopiridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, cinolinilo, quinozalinilo, naftiridinilo, benzofuranilo, indolilo, benzotiofenilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, fenotiazolilo, benzimidazolilo, benzotriazolilo, dibenzofuranilo, carbazolilo, dibenzotiofenilo, acridinilo e semelhantes. ÉHeteroarilenoÉ significa uma contraparte divalente de um grupo arilo.
Onde é indicado que uma fração pode ser substituída, tal como através da utilização das expressões Énão substituído ou substituídoÉ ou Éopcionalmente substituídoÉ, conforme em ÉCi-C5 alquilo não substituído ou substituídoÉ ou Éheteroarilo opcionalmente substituídoÉ, tal fração pode ter um ou mais substituintes independentemente selecionados, preferentemente em número de um a cinco, mais preferentemente em número de um ou dois. Podem ser selecionados substituintes e padrões de substituição por um perito na especialidade considerando a fração à qual o substituinte está fixo, para proporcionar compostos que são quimicamente estáveis e que podem ser sintetizados por meio de técnicas conhecidas na técnica bem como os métodos estabelecidos no presente documento. ÉArilalquiloÉ, (heterocicloalifático)alquiloÉ, Éari1a1queniloÉ, ÉarilalquiniloÉ, ÉbiarilalquiloÉ e semelhantes significam uma fração alquilo, alquenilo ou alquinilo, conforme o caso, substituída por uma porção arilo, heterocicloalifático, biarilo, etc., conforme o caso, com a valência aberta (não satisfeita) na fração alquilo, alquenilo ou alquinilo, por exemplo, conforme em benzilo, fenetilo, N-imidazoiletilo, N-morfolinoetilo e semelhantes. Inversamente, ÉalquilariloÉ, ÉalquenilcicloalquiloÉ e semelhantes significam uma fração arilo, cicloalquilo, etc., conforme o caso, substituída por uma fração alquilo, alquenilo, etc., conforme o caso, por exemplo, conforme em metilfenilo ÊtoliloÕ ou alilciclohexilo. ÉHidroxialquiloÉ, ÉhaloalquiloÉ, ÉalquilariloÉ, ÉcianoariloÉ e semelhantes significam uma fração alquilo, arilo, etc., conforme o caso, substituída por um ou mais dos substituintes identificados Êhidroxilo, halo, etc., conforme o casoõ.
Por exemplo, substituintes permissíveis incluem, mas não estão limitados a, alquilo Êespecialmente metilo ou etiloõ, alquenilo Êespecialmente aliloõ, alquinilo, arilo, heteroarilo, cicloalifático, heterocicloalifático, halo Êespecialmente flúorõ, haloalquilo Êespecialmente trifluorometiloÕ, hidroxilo, hidroxialquilo Êespecialmente hidroxietiloÕ, ciano, nitro, alcoxi, -OÊhidroxialquiloÕ, OÊhaloalquiloÕ Êespecialmente -OCF3Õ, -OÊcicloalquiloÕ, OÊhe t e roc i c 1 oa 1 qu i 1 oO, — OÊariloO, alquiltio, ariltio, =0, =NH, =NÊalquiloÕ, =N0H, =N0ÊalquiloÕ, -CÊ=0ÕÊalquiloÕ, -CÊ=0ÕH, -C02H, -CÊ-0ÕNH0H, -CÊ=0Õ0ÊalquiloÕ, CÊ=0Õ0ÊhidroxialquiloÕ, -CÊ=0ÕNH2, -CÊ=OÕNHÊalquiloÕ, CÊ=OÕNÊalquiloÕ2, -0CÊ=0ÕÊalquiloÕ, 0CÊ=0ÕÊhidroxialquíloÕ, -0CÊ=0Õ0ÊalquiloÕ, 0CÊ=0Õ0ÊhidroxialquiloÕ, -0CÊ=0ÕNH2, -0CÊ=0ÕNHÊalquiloÕ, 0CÊ=0ÕNÊalquiloÕ2, azido, -NH2, -NHÊalquiloÕ, -NÊalquiloÕ2, -NHÊariloÕ, -NHÊhidroxialquiloÕ, -NHCÊ=OÕÊalquiloÕ, NHCÊ=0ÕH, -NHCÊ=0ÕNH2, -NHCÊ=OÕNHÊalquiloÕ, NHCÊ=OÕNÊalquiloÕ2, -NHCÊ=NHÕNH2, -0S02ÊalquiloÕ, -SH, SÊalquiloÕ, -SÊariloÕ, -SÊcicloalquiloÕ, ~SÊ=0Õalquilo, S02ÊalquiloÕ, -S02NH2, -S02NHÊalquiloÕ, -S02NÊalquiloÕ2e semelhantes.
Onde a fração a ser substituída é uma fração alifática, substituintes preferidos são arilo, heteroarilo, cicloalifático, heterocicloalifático, halo, hidroxilo, ciano, nitro, alcoxi, -OÊhidroxialquiloÕ, -OÊhaloalquiloÕ, -OÊcicloalquiloÕ, -OÊheterocicloalquiloÕ, -OÊariloO, alquiltio, ariltio, =0, =NH, =NÊalquiloÕ, =N0H, =N0ÊalquiloÕ, -C02H, -CÊ=0ÕNH0H, -CÊ=0Õ0ÊalquiloÕ, CÊ=OÕOÊhidroxialquiloÕ, -CÊ=OÕNH2, -CÊ=OÕNHÊalquiloÕ, CÊ=OÕNÊalquiloÕ2, -OCÊ=OÕÊalquiloÕ, OCÊ=OÕÊhidroxialquiloÕ, -OCÊ=OÕOÊalquiloÕ, OCÊ=OÕOÊhidroxialquiloÕ, -OCÊ=OÕNH2, -OCÊ=OÕNHÊalquiloÕ, OCÊ=OÕNÊalquiloÕ2, azido, -NH2, -NHÊalquiloÕ, -NÊalquiloÕ2, -NHÊariloÕ, -NHÊhidroxialquiloÕ, -NHCÊ=OÕÊalquiloÕ, NHCÊ=OÕH, -NHCÊ=OÕNH2, -NHCÊ=OÕNHÊalquiloÕ, NHCÊ=OÕNÊalquiloÕ2, -NHCÊ=NHÕNH2, -0S02ÊalquiloÕ, -SH, SÊalquiloÕ, -SÊariloÕ, -SÊ=OÕalquilo, -SÊcicloalquiloÕ, S02ÊalquiloÕ, ~S02NH2í -S02NHÊalquiloÕ e -S02NÊalquiloÕ2. Substituintes mais preferidos são halo, hidroxilo, ciano, nitro, alcoxi, -OÊariloÕ, =0, =N0H, =N0ÊalquiloÕ, 0CÊ=0ÕÊalquiloÕ, ~0CÊ=0Õ0ÊalquiloÕ, ~0CÊ=0ÕNH2, 0CÊ=0ÕNHÊalquiloÕ, -0CÊ=0ÕNÊalquiloÕ2, azido, -NH2, NHÊalquiloÕ, -NÊalquiloÕ2, -NHÊariloÕ, -NHCÊ=OÕÊalquiloÕ, -NHCÊ=0ÕH, -NHCÊ=0ÕNH2, -NHCÊ=OÕNHÊalquiloÕ, NHCÊ=OÕNÊalquiloÕ2 e -NHCÊ=NHÕNH2. Especialmente preferidos são fenilo, ciano, halo, hidroxilo, nitro, Ci-C4alquioxi, 0ÊC2-C4 alquilenoÕOH e 0ÊC2-C4 alquilenoõhalo.
Onde a fração a ser substituída é uma fração cic1oa1ifatico, heterocicloalifatico, arilo ou heteroarilo, substituintes preferidos são alquilo, alquenilo, alquinilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, hidroxialquilo, ciano, nitro, alcoxi, -OÊhidroxialquiloÕ, -OÊhaloalquiloÕ, -OÊariloÕ, OÊcicloalquiloÕ, -OÊheterocicloalquiloÕ, alquiltio, ariltio, -CÊ=0ÕÊalquiloÕ, -CÊ=0ÕH, -C02H, -CÊ=0ÕNH0H, CÊ=0Õ0ÊalquiloÕ, -CÊ=0Õ0ÊhidroxialquiloÕ, -CÊ=0ÕNH2, CÊ^OÕNHÊalquiloÕ, -CÊ=OÕNÊalquiloÕ2, -OCÊ^OÕÊalquiloÕ, 0CÊ=0ÕÊhidroxialquiloÕ, -0CÊ=0Õ0ÊalquiloÕ, 0CÊ=0Õ0ÊhidroxialquiloÕ, -0CÊ=0ÕNH2, -0CÊ=0ÕNHÊalquiloÕ, -0CE=0ÕNÊalquiloÕ2, azido, -NH2, -NHÊalquiloÕ, -NÊalquiloÕ2, -NHÊariloÕ, -NHÊhidroxialquiloÕ, -NHCÊ=0ÕÊalquiloÕ, NHCÊ=0ÕH, -NHCÊ=0ÕNH2, -NHCÊ=OÕNHÊalquiloÕ, NHCÊ=OÕNÊalquiloÕ2, -NHCÊ=NHÕNH2, -0S02ÊalquiloÕ, -SH, SÊalquiloÕ, -SÊariloÕ, -SÊcicloalquiloÕ, -SÊ=0Õalquilo, S02ÊalquiloÕ, -SQ2NH2, -S02NHÊalquiloÕ e -S02NÊalquiloÕ2. Substituintes mais preferidos são alquilo, alquenilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, hidroxialquilo, ciano, nitro, alcoxi, -OÊhidroxialquiloÕ, -CÊ=OÕÊalquiloÕ, -CÊ=OÕH, C02H, -CÊ=OÕNHOH, -CÊ=OÕOÊalquiloÕ, CÊ=OÕOÊhidroxialquiloÕ, -CÊ=OÕNH2, -CÊ=OÕNHÊalquiloÕ, CÊ=OÕNÊalquiloÕ2, -OCÊ=OÕÊalquiloÕ, OCÊ=OÕÊhidroxialquiloÕ, -OCÊ=OÕOÊalquiloÕ, OCÊ=OÕOÊhidroxialquiloÕ, -OCÊ=OÕNH2, -OCÊ=OÕNHÊalquiloÕ, OCÊ=OÕNÊalquiloÕ2, -NH2, -NHÊalquiloÕ, -NÊalquiloÕ2, NHÊariloÕ, -NHCÊ=OÕÊalquiloÕ, -NHCÊ=OÕH, -NHCÊ=OÕNH2, NHCÊ=OÕNHÊalquiloÕ, -NHCÊ=OÕNÊalquiloÕ2 e -NHCÊ=NHÕNH2. Especialmente preferidos são Ci-C4 alquilo, ciano, nitro, halo e Ci.-C4alcoxi,
Onde um intervalo é estabelecido, conforme em "C1-C5 alquilo” ou "5 a 10%", tal intervalo inclui os pontos finais do intervalo, como em CS e C5 no primeiro caso e 5% e 10% no segundo caso. A menos que estereoisómeros específicos sejam especificamente indicados Êpor exemplo, por uma ligação em negrito ou tracejada a um estereocentro relevante numa fórmula estrutural, por representação de uma ligação dupla como tendo a configuração E ou Z numa fórmula estrutural ou mediante utilização de uma nomenclatura designando a estereoquímicaõ, todos os estereoisómeros estão incluídos dentro do âmbito da invenção, como compostos puros bem como misturas dos mesmos. A menos que indicado de outra forma, os enantiómeros, diastereómeros individuais, isómeros geométricos e combinações e misturas dos mesmos estão todos abrangidos pela presente invenção.
Os peritos na especialidade apreciarão que os compostos podem ter formas tautoméricas Êpor exemplo, formas ceto e enolõ, formas racémicas e formas zwiteriónicas, que são equivalentes às ilustradas nas fórmulas estruturais utilizadas no presente documento e que as formulas estruturais abrangem tais formas tautoméricas, racémicas ou zwiteriónicas. ÉB ster farmaceuticamente aceitávelÉ significa um éter que é hidrolisado in vivo Êpor exemplo, no corpo humanoõ para produzir o composto parental ou um sal do mesmo ou tem per se uma atividade semelhante à do composto original. M steres adequados incluem ésteres de Ç-C5 alquilo, C2-C5 alquenilo ou C2-C5 alquinilo, especialmente éster metílico, etílico ou n-propílico. ÉSal farmaceuticamente aceitávelÉ significa um sal de um composto adequado para formulação farmacêutica. Onde um composto tem um ou mais grupos básicos, o sal pode ser um sal de adição de ácido, tal como um sulfato, bromidrato, tartarato, mesilato, maleato, citrato, fosfato, acetato, pamoato ÊembonatoÕ, iodidrato, nitrato, cloridrato, lactato, metilsulfato, fumarato, benzoato, succinato, mesilato, lactobionato, suberato, tosilato e semelhantes.
Onde um composto tem um ou mais grupos ácidos, o sal pode ser um sal, tal como um sal de cálcio, sal de potássio, sal de magnésio, sal de meglumina, sal de amónio, sal de zinco, sal de piperazina, sal de trometamina, sal de lítio, sal de colina, dietilamina, sal de 4-fenilciclo-hexilamina, sal de benzatina, sal de sódio, sal de tetrametilamõnio e semelhantes. Formas cristalinas polimórficas e solvatos estão também abrangidos dentro do âmbito da presente invenção.
COMPOSIÇ® ES
Na fórmula ÊIÕ, repetida abaixo por conveniência,
00 o grupo R1 é, preferentemente, Me, Et, n-Pr, i-Pr ou ! mais preferentemente este último.
Também, na fórmula ÊIÕ, o grupo R2 é preferentemente Ci-C5 alquilo, C1-C5 alquenilo, C1-C5 alquinilo, CH2OCÊ=OÕCi-C5 alquilo, CH2OCÊ=OÕC:1 -C5 alquenilo, CH2OCÊ=OÕCI-C5 alquinilo,
Também, na fórmula ÊIÕ, grupos NÊR3aÕÊR3DÕ preferidos são:
sendo especialmente preferido que um de R3a e R3b seja H e o outro seja Me. Noutras formas de realização preferidas, R3a e R3d são ambos H ou ambos Me, ou um de R3a e R3b é H e o outro é C6H5.
Noutra forma de realização preferida, R3a e R3b são independentemente H, C1-C5 alquilo, CH2ÊC5-C6 cicloalquiloÕ, CH2C6H5 ou CH2CH2OH.
Nas definições de R1 e R2 na fórmula ÊIÕ, onde um grupo é definido como sendo não substituído ou substituído, este é preferentemente não substituído.
Nas fórmulas da presente memória descritiva, uma ligação que atravessa um anel de fenilo entre dois carbonos do anel de fenilo significa que o grupo unido à ligação pode estar localizado em qualquer uma das posições ortor meta ou para do anel de fenilo. A título de ilustração, a fórmula:
representa
A síntese de contrapartes das subunidades Tuv e Tup de tubulisina com vários grupos R2 e R4 é ensinada por Cheng et al. 2011.
Numa forma de realização preferida dos compostos de acordo com a fórmula ÊIÕ, R1 é
3 R2 é Ci-C5 alquilo Êespecialmente Me ou n-PrÕ ou
um de R3a e R30 é H e o outro é Me; R4 é
onde Y é H ou N02 e R4a é H, Me ou Et; R5 é Me; W é 0 e n é 1.
Noutra forma de realização preferida de compostos de acordo com a fórmula ÊIÕ, n é 1, W é 0, Y em R4 é H ou N02 Êpreferentemente HÕ e R2 é
e mais preferentemente
Um composto de acordo com esta forma de realização preferida é representado pela fórmula ÊlaÕ
em que Y é H ou N02; R4a é H, Me ou Et; e Rja e R3D são independentemente H, CSH5, Me ou Et; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Ainda mais preferentemente, o composto tem uma estrutura reoresentada Dela fórmula ÊIa'Õ:
(Ta1) s onde R4a é H, Me ou Et; e R3a e R3d são independentemente H, C6H5, Me ou Et; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Ainda noutra forma de realização preferida, W é 0, Y é NH2, n é 1 e ambos os grupos R2a em R2 são outros para além de NH2. Um composto de acordo com esta forma de realização é representado pela fórmula ÊlbÕ: (Ib)
ϊ onde R4a é H, Me ou Et; R3a e R3b são independentemente H, C6H5, Me e Et; e R6 é C1.-C5 alquilo, CH2OCÊ=OÕCi-C5 alquilo ou ÊCH2Õi-.2C6H5 ; ou um sal f armaceuticamente aceitável do mesmo.
Ainda noutra forma de realização preferida, o composto tem uma estrutura representada pela fórmula ÊIb'Õ:
(ft1) onde R4a é H, Me ou Et Êpreferentemente HÕ e R6 é Me ou n-Pr; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Preferentemente, nas fórmulas ÊlaÕ, ÊIa'Õ e ÊlbÕ, um de R3a e R3b é H e o outro é Me. Noutras formas de realização preferidas, R3a e R3b são ambos H ou ambos Me ou um de R3a e R3b é H e o outro é CSH5. Ainda noutras formas de realização preferidas, R3a e R3b são independentemente H, Me ou Et.
Exemplos específicos de compostos da presente invenção incluem os compostos mostrados imediatamente a seguir, juntamente com os seus sais farmaceuticamente aceitáveis:
Os compostos ÊI-2Õ, ÊI-7Õ, ÊI-8Õ e ÊI-9Õ são preferidos .
CONJUGADOS
Opcionalmente, os compostos da presente invenção podem ser conjugados com uma fração de direcionamento que liga específica ou preferentemente a uma entidade química numa célula cancerígena. Preferentemente, a fração de direcionamento é um anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo e a entidade química é um antigénio associado a tumor. Preferentemente, a conjugação é realizada através de uma ligação química a um grupo funcional na subunidade Tuv ou Tup, tal como um grupo amino.
Noutra forma de realização, é proporcionado um conjugado compreendendo o composto citotõxico de acordo com esta invenção e um ligando representado pela fórmula ÊIIÕ: [DÊXDÕaCÊXzÕb3 mZ ÊIIÕ onde Z ê um ligando; D ê um composto citotóxico de acordo com a presente invenção Êpor exemplo, um composto de acordo com a fórmula ÊIÕ, ÊlaÕ, ÊIa'Õ ou ÊIbÕÕ; e -ÊXDÕaCÊXzÕb- são coletivamente referidos como uma "fração ligando" ou "ligando", dado que ligam Z e D. Dentro do ligando, C é um grupo clivável concebido para ser clivado em ou próximo do local da ação biológica pretendida do composto D; XD e Xz são referidos como frações espaçadoras Êou "espaçadores"Õ dado que separam D e C e C e Z, respetivamente; os subscritos a e b são independentemente 0 ou 1 Êisto é, a presença de XD eÁou Xz é opcionalÕ; e o subscrito m é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Êpreferentemente 1, 2, 3 ou 4Õ. D, XD, C, Xz e Z são descritos mais detalhadamente abaixo no presente documento. 0 ligando Z - por exemplo, um anticorpo - serve uma função de direcionamento. Ao ligar a um tecido ou célula alvo, onde o seu antigénio ou recetor está localizado, o ligando Z direciona o conjugado para esse sítio.
Preferentemente, o tecido ou célula alvo é uma célula ou tecido cancerígeno e o antigénio ou recetor é um antigénio associado a tumor, isto é, um antigénio que é expresso unicamente por células cancerígenas ou é superexpresso por células cancerígenas, em comparação com células não cancerígenas. A clivagem do grupo C no tecido alvo ou célula liberta o composto D para exercer o seu efeito citotóxico localmente. Nalguns casos, o conjugado é internalizado numa célula alvo através de endocitose e ocorre clivagem dentro da célula alvo. Deste modo, é obtida distribuição precisa de composto D no local da ação pretendida, reduzindo a dose necessária. Igualmente, o composto D é normalmente biologicamente inativo Êou significativamente menos ativoõ no seu estado conjugado, deste modo reduzindo a toxicidade indesejada contra o tecido ou células não alvo. Dado que os fármacos anti cancro são frequentemente altamente tóxicos para as células em geral, esta é uma consideração importante.
Conforme refletido pelo subscrito m, cada molécula de ligando Z pode ser conjugada com mais de um composto D, dependendo do número de locais que o ligando Z tenha disponível para conjugação e das condições experimentais empregues. Os peritos na especialidade apreciarão que, embora cada molécula individual do ligando Z seja conjugada a um número inteiro de compostos D, uma preparação do conjugado pode analisar uma razão não inteira de compostos D para ligando Z, refletindo uma média estatística. Esta razão é referida como a razão de substituição ÊSRÕ ou, alternativamente, no caso de conjugados anticorpo-fãrmaco, a razão de fármaco-anticorpo ÊDARÕ.
Ligando Z e Conjugação do Mesmo
Preferentemente, o ligando Z é um anticorpo. Por razões de conveniência e brevidade e não de limitação, a subsequente discussão detalhada no presente documento sobre a conjugação de um ligando Z é escrita no contexto de este ser um anticorpo, mas os peritos 11a especialidade entenderão que outros tipos de ligando Z podem ser conjugados, mutatis mutandis. Por exemplo, conjugados com ácido fólico como ligando podem visar células tendo o recetor de folato sobre as suas superfícies ÊVlahov et al. 2008; Leamon et al. 2008Õ. Pela mesma razão, a discussão detalhada abaixo é escrita principalmente em termos de uma razão 1:1 de anticorpo Z para composto D Êm = 1Õ.
Preferentemente, o ligando Z é um anticorpo contra um antigénio associado a tumor, permitindo que um conjugado compreendendo um tal ligando Z vise seletivamente células cancerígenas. Exemplos de tais antigénios incluem: mesotelina, antigénio de membrana específico de próstata ÊPS-MAÕ, CD19, CD22, CD30, CD7Q, B7H4 Êtambém conhecido como 08EÕ, proteína tirosina quinase 7 ÊPTK7Õ, glipicano-3, RG1, CTLA-4 e CD44. 0 anticorpo pode ser animal Êpor exemplo, de ratinhoÕ, quimérico humanizado ou, preferentemente, humano. 0 anticorpo é preferentemente monoclonal, especialmente um anticorpo monoclonal humano. A preparação de anticorpos monoclonais humanos contra alguns dos antigénios mencionados anteriormente é descrita em Korman et al., documento US 2009Á0074660 Al ÊB7H4Õ; Rao-Naik et al. , documento 8.097.703 B2 ÊCD19Õ; King et al., documento US 2010Á0143368 Al ÊCD22Õ; Keler et al., documento US 7.387.776 B2 Ê20G8Õ ÊCD30Õ; Terrett et al., documento US 8.124.738 B2 ÊCD70Õ; Korman et al. , documento US 6.984.720 BI Ê2Q06Õ ÊCTLA-4Õ; Korman et al. , documento US 8.008.449 B2 Ê2011Õ ÊPD-1Õ; Huang et al., documento US 2009Á0297438 Al e Cardarelli et al. , documento US 7.875.278 B2 ÊPSMAÕ; Terrett et al. , documento US 2G10ÁG034826 AI ÊPTK7Õ; Ter-rett et al. , documento US 2010Á0209432 ÊA1Õ Êglipicana-3Õ; Harkins et al., documento US 7.335.748 B2Ê200SÕ ÊRG1Õ; Terrett et al. , documento US 8.268.970 B2 Ê2012Õ ÊmesotelinaÕ; e Xu et al., documento US 2010Á0092484 Al ÊCD44Õ. O ligando Z pode também ser um fragmento de anticorpo ou mimético de anticorpo, tal como um aficorpo, um anticorpo de domínio ÊdAbÕ, um nanocorpo, um unicorpo, um DARPin, uma anticalina, um versacorpo, uma duocalina, uma lipocalina ou um avímero.
Qualquer um de vários grupos reativos diferentes no ligando Z pode ser um local de conjugação, incluindo grupos ε-amino em resíduos de lisina, frações hidrato de carbono pendentes, grupos ácido carboxílico, grupos dissulfeto e grupos tiol. Cada tipo de grupo reativo representa uma compensação, tendo algumas vantagens e algumas desvantagens. Para comentários sobre grupos reativos de anticorpos adequados para conjugação, veja-se, por exemplo, Garnett, Adv. Drug Delivery Rev. 53 Ê2001Õ, 171-216 e Dubowchik e Walquer, Pharmacology & Therapeutics 83 Ê1999Õ, 67-123.
Numa forma de realização, o ligando Z é conjugado através de um grupo ε-amino da lisina. A maioria dos anticorpos têm múltiplos grupos ε-amino da lisina expostos, os quais podem ser conjugados por meio de ligações de amida, ureia, tioureia ou carbamato utilizando métodos conhecidos na técnica, incluindo modificação com um agente heterobifuncional Êconforme adicionalmente descrito abaixo no presente documentoÕ. No entanto, é difícil controlar quais e quantos grupos ε-amino reagem, levando a variabilidade potencial de lote para lote em preparações de conjugado. Igualmente, a conjugação pode provocar neutralização de um grupo ε-amino protonado importante para manter a conformação nativa do anticorpo ou pode ocorrer numa lisina próxima ou no sítio de ligação a antigénio, nenhum sendo uma ocorrência desejável.
Noutra forma de realização, o ligando Z pode ser conjugado por meio de uma cadeia lateral de hidrato de carbono, dado que muitos anticorpos são glicosilados. A cadeia lateral de hidrato de carbono pode ser oxidada com periodato para gerar grupos aldeído que, por sua vez, podem ser reagidos com aminas para formar um grupo imina, tal como numa semicarbazona, oximo ou hidrazona. Se desejado, o grupo imina pode ser convertido num grupo amina mais estável por meio de redução com cianoborohidreto de sódio. Para divulgações adicionais sobre a conjugação através de cadeias laterais de hidrato de carbono veja-se, por exemplo, Rodwell et al. , Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 83, 2632-2636 Ê1986Õ, cuja descrição é incorporada no presente documento por referência. Tal como com os grupos ε-amino de lisina, existem preocupações relativamente à reprodutibilidade da localização doÊsÕ sítioÊsÕ de conjugação e estequiometria.
Ainda noutra forma de realização, o ligando Z pode ser conjugado através de um grupo ácido carboxílico. Numa forma de realização, um grupo ácido carboxílico terminal é funcionalizado para gerar uma carbohidrazida, que é então reagida com uma fração de conjugação portando aldeído. Veja-se Fisch et al., Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 147-153 .
Ainda noutra forma de realização, o anticorpo Z pode ser conjugado através de um grupo dissulfeto unindo um resíduo de cisteína no anticorpo Z e um átomo de enxofre sobre a outra porção do conjugado. Alguns anticorpos carecem de grupos tiol livres ÊsulfidriloÕ mas têm grupos dissulfeto, por exemplo na região de dobradiça. Em tal caso, os grupos tiol livres podem ser gerados por meio de redução de grupos dissulfeto nativos. Os grupos tiol assim gerados podem então ser utilizados para conjugação. Veja- se, por exemplo, Packard et al. , Biochemistry 1986, 25, 3548-3552; King et al., Cancer Res. 54, 6176-6185 Ê1994Õ; e Doronina et al. , Nature Bíotechnol. 21Ê7Õ, 778-784 Ê20Q3Õ. Novamente, existem preocupações em relação à localização do sítio de conjugação e estequiometria e possível rutura da conformação nativa do anticorpo.
Uma série de métodos são conhecidos por introduzir grupos tiol livres em anticorpos sem romper ligações dissulfeto nativas, cujos métodos podem ser praticados com um ligando Z da presente invenção. Dependendo do método empregue, pode ser possível a introdução de um número previsível de sulfidrilos livres em locais predeterminados. Numa abordagem, são preparados anticorpos mutados nos quais um resíduo de cisteína é substituído por outro aminoácido. Veja-se, por exemplo, Eigenbrot et al., documento US 7.521.541 B2 Ê20Q9Õ; Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507; Urnovitz et al. , documento US 4.6 98.420 Ê1987Õ; Stimmel et al., J. Biol. Chem., 275 Ê39Õ, 30445-30450 Ê2000Õ; Bam et al., documento US 7.311.902 B2 Ê2007Õ; Kuan et al., J. Biol. Chem., 269 Ê10Õ, 7610-7618 Ê1994Õ; Poon et al. , J. Biol. Chem., 270 Ê15Õ, 8571-8577 Ê1995Õ. Noutra abordagem, uma cisteína extra é adicionada ao C-término. Veja-se, por exemplo, Cumber et al. , J. Immunol., 149, 120-126 Ê1992Õ; King et al, Cancer Res., 54, 6176-6185 Ê1994Õ; Li et al. , Bioconjugate Chem., 13, 985-995 Ê2002Õ; Yang et al. , Protein Engineering, 16, 761-770 Ê2QQ3Õ; e Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 Ê2004Õ. Um método preferido para introdução de cisternas livres é ensinado por Liu et al. , Documento WO 2009Ã026274 Al, no qual uma sequência de aminoãcidos portando cisteína é adicionada ao terminal C da cadeia pesada de um anticorpo. Este método introduz um número conhecido de resíduos de cisteína Êum por cada cadeia pesadaõ numa localização conhecida a partir do sítio de ligação a antigénio.
Ainda noutra forma de realização, grupos ε-amino da lisina podem ser modificados com reagentes heterobifuncionais, tais como 2-iminotiolano ou N-succinimidil-3-Ê2-piridilditioÕ-propionato ÊSPDPÕ, a conversão de um grupo ε-amino num grupo tiol ou dissulfeto - a criação de um substituto de cisteína, por assim dizer. No entanto, este método sofre das mesmas limitações de localização de conjugação e estequiometria associadas aos grupos ε-amino adequados.
Ainda noutra forma de realização preferida, o ligando Z é conjugado através do produto de adição nucleofílica de um grupo tiol com um grupo aceitador. Uma fração aceitadora preferida é um grupo maleimida, cuja reação com um grupo tiol do anticorpo é genericamente ilustrada abaixo. 0 grupo tiol pode ser um nativo, ou um introduzido conforme descrito acima.
0 ligando Z também pode ser conjugado através de um grupo funcional adaptado para utilização com química "click", conforme discutido abaixo no presente documento.
Ligando - (XD) aC (Xz) b-
Conforme notado acima, a porção ligando de um conjugado da presente invenção compreende até três elementos: um grupo C clivãvel e espaçadores Xz e XD opcionais.
0 grupo C clivãvel é um grupo clivãvel sob condições fisiológicas, preferentemente selecionado de modo a ser relativamente estável, enquanto o conjugado é em geral de circulação no plasma sanguíneo, mas é prontamente clivado após o conjugado atingir o seu local de ação pretendido, isto é, próximo de, em, ou no interior da célula alvo. Preferentemente, o conjugado é internalizado através de endocitose por uma célula alvo após ligação do anticorpo Z a um antigénio exibido sobre a superfície da célula alvo. Subsequentemente, a clivagem do grupo C ocorre num corpo vesicular da célula alvo Êum endossoma precoce, um endossoma tardio ou, especialmente, um lisossomaõ.
Numa forma de realização, o grupo C é um grupo sensível ao pH. 0 pH do plasma sanguíneo é ligeiramente acima do neutro, enquanto o pH dentro de um lisossoma é ácido, cerca de 5. Assim, um grupo C cuja clivagem é catalisada por ácido clivará a uma taxa de várias ordens de magnitude mais rápida do que no interior de um lisossoma no plasma sanguíneo. Exemplos de grupos sensíveis a ácidos adequados incluem amidas de cis-aconitilo e hidrazonas, conforme descrito em Shen et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102, 1048-1054 Ê1981Õ e Yang et al, , Proc. Natl Acad. Sei (USA), 85, 1189-1193 E19880,
Noutra forma de realização, o grupo C é um dissulfeto. Os dissulfetos podem ser clivados por um mecanismo de permuta de tiol-dissulfeto, a uma taxa dependente da concentração ambiente de tiol. Dado que a concentração intracelular de glutationa e outros tióis é mais elevada do que as suas concentrações no soro, a taxa de clivagem de um dissulfeto será maior intracelularmente. Além disso, a taxa de permuta de tiol-dissulfeto pode ser modulada por meio de ajuste das características estéricas e eletrónicas do dissulfeto Êpor exemplo, um dissulfeto de alquilarilo contra um dissulfeto de alquil-alquilo; substituição no anel de arilo, etc.Õ, permitindo a conceção de ligações dissulfeto que potenciaram a estabilidade no soro ou uma taxa de clivagem particular. Para descrições adicionais em relação a grupos de clivagem de dissulfeto em conjugados, veja-se, por exemplo, Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 Ê1988Õ; Santi et al. , documento US 7.541.530 B2 Ê2QQ9Õ; Ng et al., documento US 6.989.452 B2 Ê2006Õ; Ng et al., documento WO 2002Á096910 Al; Boyd et al., documento US 7.691.962 B2; e Sufi et al., documento US 2010Á0145036 Al.
Um grupo C preferido compreende uma ligação peptídica que é clivada, preferentemente por uma protease no local de ação pretendido em vez de por uma protease no soro. Tipicamente, o grupo C compreende de 1 a 20 aminoácidos, preferentemente de 1 a 6 aminoácidos, mais preferentemente 1 a 3 aminoácidos. OÊsÕ aminoácidoÊsÕ podeÊmÕ ser a-aminoácidos naturais eÁou não naturais. Aminoácidos naturais são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos derivados a partir dos mesmos, por exemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, citrulina e 0-fosfoserina. 0 termo aminoácido também inclui análogos e miméticos de aminoácidos. Análogos são compostos tendo a mesma estrutura geral H2NÊRÕCHC02H de um aminoácido natural, exceto que o grupo R não é um encontrado entre os aminoácidos naturais. Exemplos de análogos incluem homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina e metil sulfónio de metionina. Um mimético de aminoácido é um composto que tem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um a-aminoácido, mas funciona de uma maneira semelhante. 0 termo "aminoácido não natural" destina-se a representar a forma estereoquímica "D", os aminoácidos naturais sendo da forma "L".
Preferentemente, o grupo C contém uma sequência de aminoácidos que é uma sequência de reconhecimento de clivagem para uma protease. São conhecidas várias sequências de reconhecimento de clivagem na técnica. Veja-se, por exemplo, Matayoshi et al. Science 247: 954 Ê1990Õ; Dunn et al, Meth. Enzymol. 241: 2 54 Ê19 94Õ; Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 Ê1994Õ; Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 Ê1994Õ; Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 Ê1994Õ; Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 Ê1994Õ; e Bouvier et al. Meth. Enzymol.248: 614 Ê1995Õ.
Para conjugados que não se destinam a ser internalizados por uma célula, um grupo C pode ser eleito de modo a ser clivado por uma protease presente na matriz extracelular na proximidade do tecido alvo, por exemplo, uma protease libertada por células em morte próximas ou uma protease associada a um tumor. Exemplos de proteases extracelulares associadas a tumores são metaloproteases da matriz ÊMMPÕ, thimet oligopeptidase ÊTOPÕ e CD10.
Para conjugados que são concebidos para serem internaiizados por uma célula, o grupo C compreende preferentemente uma sequência de aminoácidos selecionada para clivagem por uma protease endossómica ou lisossómica, especialmente a última. Exemplos não limitantes de tais proteases incluem catepsinas B, C, D, H, L e S, especialmente catepsina B. A catepsina B cliva preferentemente péptidos numa sequência -AA^AA1- onde ΆΆ1 é um ácido fortemente básico ou aminoácido de ligação forte a hidrogénio Êtal como lisina, arginina ou citrulinaÕ e AA2 é um aminoácido hidrofóbico Êpor exemplo, fenilalanina, valina, alanina, leucina ou isoleucinaõ, por exemplo, Val-Cit Êonde Cit denota citrulinaÕ ou Val-Lys. ÊNo presente documento, as sequências de aminoácidos são escritas na direção N para C, conforme em H2N-AA2“AA1“C02H, a menos que o contexto indique claramente o contrário.Õ Para informação adicional em relação a grupos catepsina cliváveis, veja-se Dubowchik et al. , Biorg. Pled. Chem. Lett. 8, 3341-3346 Ê1998Õ; Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 3347-3352 Ê1998Õ; e Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13, 855-869 Ê2002Õ. Outra enzima que pode ser utilizada para clivar ligandos de peptidilo é legumaína, uma protease de cisteína lisossómica que cliva preferentemente Ala-Ala-Asn.
Numa forma de realização, o grupo C é um péptido compreendendo a sequência de aminoácido -AA2-AA1- em que AA1 e lisina, arginina ou citrulina e AA e fenilalanina, valina, alanina, leucina ou isoleucina. Noutra forma de realização, C consiste numa sequência de um a cinco aminoácidos, selecionada a partir do grupo consistindo em Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Vai-
Leu-Lys, Cit-Cit, Val~Lys, Ala~Ala~Asn, Lys, Cit, Ser e Glu . A conceção e preparação de grupos C cliváveis consistindo num único aminoãcido é descrita em Chen et al. , documento US 2010Á0113476 Al. 0 grupo C também pode ser fotoclivável, por exemplo um éter nitrobenzílico que é clivado após exposição à luz. 0 grupo C pode ser ligado diretamente ao anticorpo Z ou ao composto D; isto é, os espaçadores Xz e XD, conforme o caso, podem estar ausentes. Por exemplo, se o grupo C é um dissulfeto, um dos dois enxofres pode ser um resíduo de cisteína ou o seu substituto no anticorpo Z. Ou, o grupo C pode ser uma hidrazona ligada a um aldeído na cadeia lateral de hidrato de carbono do anticorpo. Ou, o grupo C pode ser uma ligação peptídica formada com um grupo ε-amino da lisina do anticorpo Z. Numa forma de realização preferida, o composto D é diretamente ligado ao grupo C através de uma ligação peptidilo a um grupo carboxilo ou amina no composto D.
Quando presente, o espaçador Xz proporciona uma separação espacial entre o grupo C e o anticorpo Z, de modo que o primeiro não interfira estericamente com a ligação a antigénio pelo último ou o último interfira estericamente com a clivagem do primeiro. Além disso, o espaçador Xz pode ser utilizado para conferir propriedades de solubilidade aumentada ou agregação reduzida aos conjugados. Um espaçador Xz pode compreender um ou mais segmentos modulares, os quais podem ser montados em qualquer número de combinações. Exemplos de segmentos adequados para um espaçador Xz são:
e combinações dos mesmos, onde o subscrito q é 0 ou 1 e o subscrito r é 1 a 24, preferentemente 2 a 4, Estes segmentos podem ser combinados, conforme mostrado abaixo:
0 espaçador XD, se presente, permite a separação espacial entre o grupo C e o composto D, de modo que o último não interfira estérica ou eletronicamente com a clivagem do primeiro. 0 espaçador XD pode também servir para introduzir massa molecular e funcionalidade química adicionais a um conjugado. Em geral, a massa e a funcionalidade adicionais afetarão a semivida no soro e outras propriedades do conjugado. Consequentemente, através da escolha judiciosa de grupos espaçadores, a semivida no soro de um conjugado pode ser modulada. 0 espaçador XD também pode ser montado a partir de segmentos modulares, conforme descrito acima no contexto do espaçador Xz.
Os espaçadores Xz eÁou XJ, onde presentes, proporcionam preferentemente, uma separação linear de 4 a 25 átomos, mais preferentemente de 4 a 20 átomos entre Z e C ou D e C, respetivamente.
Quer o espaçador Xz ou XD, ou ambos, podem compreender uma fração de autoimolação. Uma fração de autoimolação é uma fração que Ê1Õ é ligada ao grupo C e qualquer anticorpo Z ou citotoxina D e Ê2Õ tem uma estrutura tal que a clivagem do grupo C inicia uma sequência de reação resultando em desprendimento da fração de autoimolação do anticorpo Z ou citotoxina D, conforme o caso. Por outras palavras, a reação num local distal do anticorpo Z ou citotoxina D Êclivagem a partir do grupo CÕ causa que a ligação Xz-Z ou Xd-D se rompa também. A presença de uma fração de autoimolação é desejável no caso do espaçador XD porque se, após clivagem do conjugado, o espaçador XD ou uma fração do mesmo se mantiver ligado à citotoxina D, a atividade biológica da última pode ser prejudicada. A utilização de uma fração de autoimolação é especialmente desejável quando o grupo C clivável é um polipéptido.
Frações de autoimolação exemplares Êiõ - ÊvÕ ligadas a um grupo hidroxilo ou amino numa molécula parceira D são mostradas abaixo:
A fração de autoimolação é a estrutura entre as linhas tracejadas a e b, com características estruturais adjacentes mostradas para proporcionar contexto. As frações de autoimolação Êiõ e ÊvÕ estão ligadas a um composto D-NH2 Êisto é, o composto D é conjugado através de um grupo aminoÕ, enquanto as frações de autoimolação ÊiiÕ, ÊiiiÕ e
EivÕ estão ligadas a um composto D-OH Êisto é, o composto D é conjugado através de um grupo hidroxilo ou carboxiloõ. A clivagem da ligação de amida na linha tracejada b liberta o azoto a partir da amida como um azoto de amina, iniciando uma sequência de reação que resulta na clivagem da ligação na linha tracejada e uma consequente libertação de D-OH ou D-NH2, conforme o caso. Para divulgações adicionais em relação às frações de autoimolação, veja-se Cari et al., documento WO 81Á01145 Ê1981Õ; Dubowchik et al,,
Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 Ê1999Õ; Firestone et al. , documento US 6.214.345 BI Ê2001Õ; Toki et al. , J. Org. Chem. 67, 1866-1872 Ê2Q02Õ; Doronina et al., Nature
Biotechnology 21 Ê7Õ, 778-784 Ê2003Õ (erratum, página 941Õ; Boyd et al. , documento US 7.691.962 B2; Boyd et al. , documento US 2008Á0279868 Al; Sufi et al. , documento WO 2008Á083312 A2; Feng, documento US 7.375.078 B2; e Senter et al., documento US 2003Á0096743 Al.
Noutra forma de realização, uma fração de direcionamento de anticorpo e o composto citotõxico D são ligados por um ligando não clivãvel. A degradação do anticorpo eventualmente reduz o ligando a uma pequena fração anexada que não interfere com a atividade biológica do composto citotóxico D.
Composições de Composto D - Ligando
Os conjugados da presente invenção são preferentemente preparados primeiro ao unir um composto D e ligando ÊXJÕacÊXzÕb Êonde XD, C, Xz, a e b são conforme definido para a fórmula ÊIIÕÕ para formar uma composição de fármaco-ligando representada pela fórmula ÊIIIÕ: D - ÊXDÕaCÊXzÕb - R31 ÊIIIÕ onde R3i é um grupo funcional adequado para reagir com um grupo funcional no anticorpo Z para formar o conjugado. Exemplos de grupos R31 adequados incluem amino, azida, ciclooctino, i onde R32 é Cl, Br, F, mesilato ou tosilato e R33 é Cl, Br, I, F, OH, -O-N-succinimidilo, -0-Ê4-nitrofeniloõ, -0-pentafluorofenilo ou -0-tetrafluorofenilo. 0 deserta química geralmente utilizável para a preparação de frações D-ÊXDÕaCÊXZÕb-R31 adequadas em Ng et al. , documento US 7.087.600 B2 Ê2006Õ; Ng et al. , documento US 6.989.452 B2 Ê2006Õ; Ng et al., documento US 7.129.261 B2 Ê2006Õ; Ng et al. , documento WO 02Á096910 Al; Boyd et al. , documento US 7.691.962 B2; Chen et al., documento US 7.517.903 B2 Ê2Q09Õ; Gangwar et al., documento US 7.714.016 B2 Ê2010Õ; Boyd et al., documento US 2008Á0279868 Al; Gangwar et al., documento US 7.847.105 B2 Ê2010Õ; Gangwar et al.. documento US 7.968.586 B2 Ê2011Õ; Sufi et al. , documento US 2010Á0145036 Al; e Chen et al. , documento US 2010Á0113476 Al .
Preferentemente, um grupo funcional reativo RJi é -NH2, -OH, -C02H, -SH, maleimido, ciclooctino, azido Ê-N3Õ, hidroxilamino Ê-0NH2Õ ou N-hidroxisuccinimida. Grupos funcionais R31 especialmente preferidos são selecionados a partir do grupo consistindo em:
Um grupo -OH pode ser esterificado com um grupo carboxi no anticorpo, por exemplo, sobre uma cadeia lateral de ácido aspártico ou glutâmico.
Um grupo -C02H pode ser esterificado com um grupo -OH ou amidado com um grupo amino Êpor exemplo, numa cadeia lateral de lisinaÕ no anticorpo.
Um grupo N-hidroxissuccinimida é funcionalmente um grupo carboxilo ativado e pode ser convenientemente amidado por meio de reação com um grupo amino Êpor exemplo, a partir da lisinaÕ.
Um grupo maleimida pode ser conjugado com um grupo -SH sobre o anticorpo Êpor exemplo, a partir de cisteína ou a partir de modificação química do anticorpo para introduzir uma funcionalidade sulfidriloõ, numa reação de adição de Michael.
Um grupo -SH é particularmente útil para conjugação onde o anticorpo foi modificado para introduzir um grupo maleimida no mesmo numa reação de adição de Michael que é a "imagem especular" da descrita acima. Os anticorpos podem ser modificados para terem grupos maleimida com 4-ÊmaleimidometilÕ-ciclo-hexanocarboxilato de N-succinimidilo ÊSMCCÕ ou a sua variante sulfonada sulfo-SMCC, ambos os reagentes estando disponíveis da Sigma-Aldrich.
Azida e ciclooctino são grupos funcionais complementares que podem afetar a conjugação através da denominada química "click" isenta de cobre, na qual a azida é adicionada através da ligação de alquino do ciclooctino para formar um anel de 1,2,3-triazol. Veja-se, por exemplo, Agard et al. , J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571-6584. A azida pode ser o grupo funcional reativo R3i na fórmula ÊIIIÕ e o ciclooctino pode estar localizado na fração de ligação ao anticorpo ou antigénio, ou vice-versa. Pode ser proporcionado um grupo ciclooctino através de um reagente DIBO Êdisponível da InvitrogenÁMolecular Probes, Eugene, OregonÕ.
Podem ser utilizadas técnicas para introdução de aminoácidos não naturais em anticorpos, com o aminoácido não natural proporcionando uma funcionalidade para conjugação com o grupo funcional reativo. Por exemplo, o aminoácido não natural p-acetilfenilalanina pode ser incorporado a um anticorpo ou outro polipéptido, conforme ensinado em Tian et al., documento WO 2008Á03Q612 A2 Ê2008Õ. 0 grupo cetona em p-acetilfenilalanina pode ser um local de conjugação através da formação de um oximo com um grupo funcional reativo hidroxilamina. Alternativamente, o aminoácido não natural p-azidofenilalanina pode ser incorporado num anticorpo para proporcionar um grupo funcional azida para conjugação através de química "click". Os aminoácidos não naturais podem também ser incorporados num anticorpo ou outro polipéptido utilizando métodos isentos de células, conforme ensinado em Goerke et al., documento US 2Q10ÁQQ93Q24 Al Ê201QÕ e Goerke et al. , Biotechnol. Bioeng. 2009, 102 Ê2Õ, 400-416.
Pode ser utilizado um grupo amina ÊNH2Õ para conjugação com a enzima transglutaminase, conforme ensinado em Jeger et ai., Angev/. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995 -9997 . A conjugação também pode ser realizada utilizando a enzima Sortase A, conforme ensinado em Levari et ai., PLoS One 2011, 6Ê4Õ, el8342; Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1-10; Ploegh et ai., documento WO 2010Á087994 A2 Ê2010Õ; e Mao et ai., documento WO 2005Á051976 A2 Ê2Q05ÕÕ. 0 motivo de reconhecimento de Sortase A Êtipicamente LPXTG, onde X é qualquer aminoácido naturalÕ pode estar localizado no ligando Z e o motivo aceitador nucleofílico Êtipicamente GGGÕ pode ser o grupo R31 na fórmula ÊIIIÕ, ou vice-versa. 0 grupo D nas fórmulas [DÊXDÕaCÊXzÕb] mZ e D-ÊXDÕaCÊXzÕb-R31 tem preferentemente uma estrutura de acordo com a fórmula ÊD-aÕ
(D-a) ou a fórmula ÊD-bÕ
(D-b) em que Y ê H ou N02; R4a é H, Me ou Et; R3a e R3b são independentemente H, Me ou Et; e R6 é C:L-C5 alquilo, CH2OCÊ=OÕCi-C5 alquilo ou ÊCH2Õi-2C6H5 .
Exemplos de tais grupos D incluem:
s
em que R7 é H, Me ou Et.
Exemplos de composições de acordo com a formula D-ÊXDÕaCÊXzÕb - R31 incluem aquelas mostradas imediatamente a seguir; juntamente com os seus sais farmaceuticamente aceitáveis:
Um composto de fármaco-ligando preferido tem uma estrutura representada pela fórmula ÊlII-aÕ:
onde: R3a e são independentemente H, Me ou Et; R3b
Rfa é Me, Et ou n-Pr; AAa e cada AAb são selecionados independentemente a partir do grupo consistindo em alanina, β-alanina, ácido γ-aminobutírico, arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido γ-carboxiglutâmico, citrulina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, norleucina, norvalina, ornitina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e vaiina; p é 1, 2, 3 ou 4; q é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Êpreferentemente 2, 3, ou 4Õ; r é 1, 2, 3, 4 ou 5; s é 0 ou 1; e R31 é selecionado a partir do grupo consistindo em:
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Na fórmula ÊlII-aÕ, -AAa- [AAD] p- representa um polipéptido cujo comprimento é determinado pelo valor de p Êpor exemplo, dipéptido se p é 1, tetrapéptido se p é 3, etc.Õ. AAa está no terminal carboxi do polipéptido e o seu grupo carboxilo forma uma ligação peptídica ÊamidaÕ com o azoto da anilina do fármaco. Por outro lado, o último AAb está no terminal amino do polipéptido e o seu grupo alfa-amino forma uma ligação peptídica com
se s ê 1 e com:
se s é 0.
Um composto de fármaco-ligando mais preferido tem uma estrutura representada pela fórmula ÊlII-bÕ:
onde:
Rfa é Me ou n-Pr; q é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Êpreferentemente 2, 3 ou 4Õ; r é 1, 2, 3 , 4 ou 5; s é 0 ou 1; e R31 é selecionado do grupo consistindo em:
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Preparação de Conjugados 0 seguinte é um procedimento ilustrativo, com base na introdução de grupos tiol livres no anticorpo através da reação de grupos e-amino da lisina com 2-iminotiolano, seguido por reação com uma fração fármaco-ligando contendo maleimida conforme descrito acima. Inicialmente, o anticorpo é submetido a permuta de tampão para tampão de fosfato a 0,1 M ÊpH 8,0Õ contendo NaCl a 50 mM e ácido dietileno triamina pentaacético ÊDTPAÕ a 2 mM e concentrado para 5 a 10 mgÁml. É obtida tiolação mediante adição de 2-iminotiolano ao anticorpo. A quantidade de 2-iminotiolano a ser adicionada pode ser determinada através de uma experiência preliminar e varia de anticorpo para anticorpo. Na experiência preliminar, é adicionada uma titulação de quantidades crescentes de 2-iminotiolano ao anticorpo e, após incubação com o anticorpo durante 1 h à TA Êtemperatura ambiente, cerca de 25°CÕ, o anticorpo é dessalinizado em tampão HEPES a 50 mM, pH 6,0, utilizando uma coluna G-2 5 SEPHADEX™ e o número de grupos tiol introduzidos determinado rapidamente por meio de reação com ditiodipiridina ÊDTDPÕ. A reação de grupos tiol com DTDP resulta na libertação de tiopiridina, a qual pode ser monitorizada por meio de espectroscopia a 324 nm. São tipicamente utilizadas amostras a uma concentração de proteína de 0,5 a 1,0 mgÁml. A absorvãncia a 280 nm pode ser utilizada para determinar com precisão a concentração de proteínas nas amostras, e então uma alíquota de cada amostra Ê0,9 mlõ é incubada com 0,1 ml de DTDP Êsolução-mãe a 5 mM em etanolÕ durante 10 min à TA, As amostras em branco de tampão por si só mais DTDP também são incubadas juntamente. Após 10 min, a absorvãncia a 324 nm é medida e o número de grupos tiol é quantificado utilizando um coeficiente de extinção para tiopiridina de 19.800 M"1.
Tipicamente é desejável um nível de tiolação de cerca de três grupos tiol por anticorpo. Por exemplo, com alguns anticorpos isto pode ser obtido mediante adição de um excesso molar de 15 vezes de 2-iminotiolano seguido por incubação à temperatura ambiente durante 1 h. 0 anticorpo é então incubado com 2-iminotiolano na razão molar desejada e então dessalinizado em tampão de conjugação Êtampão HEPES a 50 mM com pH 6,0 contendo glicina a 5 mM e DTPA a 2 mMÕ. 0 material tiolado é mantido sobre gelo enquanto o número de tióis introduzidos é quantificado, conforme descrito acima.
Após verificação do número de tióis introduzido, a fração fármaco-ligando é adicionada num excesso molar de 3 vezes por tiol. A reação de conjugação é deixada prosseguir em tampão de conjugação também contendo uma concentração final de sulfóxido de dimetilo ÊDMSOÕ a 5% ou um solvente alternativo semelhante. Comummente a solução de fármaco-ligando é dissolvida em DMSO a 100%. A solução é adicionada diretamente ao anticorpo tiolado, o qual tem DMSO suficiente adicionado para levar a concentração final a 10%, ou pré-diluída em tampão de conjugação contendo uma concentração final de DMSO a 10%, seguido pela adição de um volume igual de anticorpo tiolado. A mistura de reação de conjugação é incubada à temperatura ambiente durante 2 h com agitação. Após incubação, a mistura de reação de conjugação é centrifugada e filtrada através de um filtro de 0,2 pm. Pode ser obtida purificação do conjugado por meio de cromatografia utilizando uma série de métodos. Num método, o conjugado é purificado utilizando cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna Sephacryl S200™ previamente equilibrada com tampão HEPES a 50 mM, pH 7,2 contendo glicina a 5 mM e NaCl a 150 mM. É realizada cromatograf ia numa taxa de fluxo linear de 28 cmÁh. As frações contendo o conjugado são recolhidas, combinadas e concentradas. Num método alternativo, pode ser obtida purificação por meio de cromatografia de permuta iónica. As condições variam de anticorpo para anticorpo e devem ser otimizadas em cada caso. Por exemplo, a mistura de reação do conjugado de anticorpo-fármaco é aplicada a uma coluna SP-Sepharose™ pré-equilibrada em HEPES a 50 mM, pH 5,5 contendo glicina a 5 mM. 0 conjugado de anticorpo é eluído utilizando um gradiente de NaCl a 0-1 M em tampão de equilíbrio num pH de 5,5. As frações relevantes contendo o conjugado são agrupadas e submetidas a dialise contra tampão de formulação (HEPES a 50 mM, pH de 7,2, contendo glicina a 5 mM e NaCl a 100 mM).
Os peritos na especialidade entenderão que as condições e método descritos acima são exemplares e não limitativos e que outras abordagens para conjugação são conhecidas na técnica e podem ser utilizadas na presente invenção.
Um conjugado preparado através do procedimento descrito acima é representado pela fórmula (II-l) . É um conjugado do composto (III-l) e o anticorpo anti mesotelina 6A4 (Terrett et ai., 2012):
Os peritos na especialidade apreciarão que tal preparado de conjugado pode ter frações com diferentes razões de substituição, tipicamente na intervalo de 1 a 5, e que tal preparado pode ser representado pela fórmula ÊII-1'0:
onde R6 é Me ou n-Pr e Ab é um anticorpo. 0 anticorpo é preferentemente, um anticorpo anti-CD7G, um anticorpo anti mesotelina ou um anticorpo anti glipicano-3.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um composto da presente invenção, ou um conjugado do mesmo, formulado em conjunto com um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Esta pode opcionalmente conter um ou mais ingredientes farmaceuticamente ativos adicionais, tais como um anticorpo ou outro fármaco. As composições farmacêuticas podem ser administradas numa terapêutica de combinação com outro agente terapêutico, especialmente outro agente anti cancro. A composição farmacêutica pode compreender um ou mais excipientes. Os excipientes que podem ser utilizados incluem veículos, agentes tensioativos, agentes espessantes ou emulsificantes, aglutinantes sólidos, auxiliares de dispersão ou suspensão, solubilizantes, corantes, agentes aromatizantes, revestimentos, agentes desintegrantes, lubrificantes, edulcorantes, conservantes, agentes isotónicos e combinações dos mesmos. A seleção e utilização de excipientes adequados são ensinadas em Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed. ÊLippincott Williams μ Wilkins 2003.
Preferentemente, uma composição farmacêutica é adequada para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentêrica, espinal ou epidérmica Êpor exemplo, através de injeção ou infusãoõ. Dependendo da via de administração, o composto ativo pode ser revestido com um material para protege-lo contra a ação de ácidos e outras condições naturais que o podem inativar, A frase "administração parentêrica" significa modos de administração para além da administração entérica e tópica, habitualmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intra-espinal, injeção e infusão peridural e intrasternal. Alternativamente, a composição farmacêutica pode ser administrada através de uma via não parentêrica, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.
As composições farmacêuticas podem estar na forma de soluções ou dispersões aquosas estéreis. Podem também ser formuladas numa microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para atingir uma concentração elevada de fármaco. As composições também podem ser proporcionadas na forma de liofilizados para reconstituição com água antes da administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material portador para produzir uma forma farmacêutica única variará dependendo do indivíduo a ser tratado e do modo particular de administração e será geralmente a quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, em cem por cento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, preferentemente entre cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, mais preferentemente de cerca de 1 por cento a cerca de 3 0 por cento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar uma resposta terapêutica. Por exemplo, pode ser administrado um único bolus, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas em forma farmacêutica unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. "Forma farmacêutica unitária" refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir a resposta terapêutica desejada em associação com o protador farmacêutico necessário. A dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 rngÁkg, e mais habitualmente, 0,01 a 5 rngÁkg de peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 rngÁkg de peso corporal, 1 rngÁkg de peso corporal, 3 rngÁkg de peso corporal, 5 rngÁkg de peso corporal ou 10 rngÁkg de peso corporal ou no intervalo de la 10 rngÁkg. Exemplos de regimes de tratamento são administração uma vez por semana, uma vez cada duas semanas, uma vez cada três semanas, uma vez cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez cada 3 meses ou uma vez cada três ou seis meses. Os regimes de dosagem preferidos incluem 1 mgÁkg de peso corporal ou 3 mgÁkg de peso corporal através de administração por via intravenosa utilizando um dos seguintes esquemas de dosagem: ÊiÕ cada quatro semanas durante seis dosagens, posteriormente cada três meses; ÊiiÕ de três em três semanas; ÊiiiÕ 3 mgÁkg de peso corporal uma vez, seguido por 1 mgÁkg de peso corporal de três em três semanas. Nalguns métodos, a dosagem é ajustada para obter uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1 a 1000 ngÁml e, nalguns métodos, cerca de 25 a 300 mgÁml.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um composto da invenção resulta preferentemente numa diminuição na gravidade dos sintomas da doença, um aumento da frequência e duração dos períodos livres de sintomas da doença, ou uma prevenção de insuficiência ou incapacidade devida à doença. Por exemplo, para o tratamento de pacientes portadores de tumores, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" inibe preferentemente o crescimento do tumor em pelo menos cerca de 20%, mais preferentemente em pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferentemente em pelo menos cerca de 60% e, ainda mais preferentemente em pelo menos cerca de 80% em relação a indivíduos não tratados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor ou de outra forma melhorar os sintomas num indivíduo que é tipicamente um ser humano mas pode ser outro mamífero. A composição farmacêutica pode ser uma formulação com libertação controlada ou prolongada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biocompatíveis biodegradáveis, tais como acetato de vinilo de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Veja-se, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.
As composições terapêuticas podem ser administradas através de dispositivos médicos, tais como Ê1Õ dispositivos de injeção hipodérmica sem agulha Êpor exemplo, documentos U. S 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; e 4.596.556Õ; Ê2Õ bombas de microinfusão Êdocumento US 4.487.603Õ; Ê3Õ dispositivos transdérmicos Êdocumento US 4.486.194Õ; Ê4Õ aparelhos de infusão Êdocumentos US 4.447.233 e 4.447.224Õ; e Ê5Õ dispositivos osmóticos Êdocumentos US 4.439.196 e 4.475.I960.
Em determinadas formas de realização, a composição farmacêutica pode ser formulada para garantir uma distribuição adequada in vivo, Por exemplo, para garantir que os compostos terapêuticos da invenção atravessam a barreira hematoencefálica, podem ser formulados em lipossomas, que podem adicionalmente compreender frações de direcionamento para melhorar o transporte seletivo para células ou órgãos específicos. Veja-se, por exemplo, os documentos US 4.522.811; 5.374.548; 5.416.016; e 5.399.331; V. V. Ranade Ê1989Õ J. Clin. Pharmacol. 29: 685; Umezawa et al., Ê1988Õ Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038; Bloeman et al. Ê1995Õ FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. Ê1995Õ Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180; Briscoe et al. Ê1995Õ Am. J. Physiol. 1233: 134; Schreier et al. Ê1994Õ J. Biol. Chem. 269: 9090; Keinanen e Laukkanen Ê1994Õ FEES Lett. 346: 123; e Killion e Fidler Ê1994Õ Lmmunometods 4: 273.
UTILIZAÇ0 ES
Os compostos da presente invenção ou os seus conjugados podem ser utilizados para o tratamento de doenças tais como, mas não limitadas a, doenças hiperproliferativas, incluindo: cancros da cabeça e pescoço que incluem tumores da cabeça, pescoço, cavidade nasal, seios paranasais, nasofaringe, cavidade oral, orofaringe, laringe, hipofaringe, glândulas salivares e paragangliomas; cancros do fígado e vias biliares, em particular carcinoma hepatocelular; cancros intestinais, particularmente cancro colorretal; cancro de ovário; cancro do pulmão de células pequenas e células não pequenas ÊNS-CLC e SCLCÕ; sarcomas por cancro de mama, tais como fibrossarcoma, histiocitoma fibroso maligno, rabdomiossarcoma embrionário, leiomiossarcoma, neurofibrossarcoma, osteossarcoma, sarcoma sinovial, lipossarcoma e sarcoma de partes moles alveolar; leucemias, tais como leucemia promielocítica aguda ÊAPLÕ, leucemia mieloide aguda ÊAMLÕ, leucemia linfoblástica aguda ÊALLÕ e leucemia mieloide crónica ÊCMLÕ; neoplasmas do sistema nervoso central, particularmente cancro cerebral; mieloma múltiplo ÊMMÕ, linfomas, tais como linfoma de Hodgkin, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma folicular, linfoma do tecido linfoide associado à mucosa, linfoma das células do manto, linfoma da linha de células B grandes, linfoma de Burkitt e linfoma de células T de células anaplásicas grande. Clinicamente, a prática dos métodos e utilização das composições descritas no presente documento resultará numa redução do tamanho ou número do crescimento canceroso eAou uma redução dos sintomas associados Êonde aplicávelõ. Patologicamente, a prática do método e utilização das composições descritas no presente documento produzirá uma resposta patologicamente relevante, tal como: inibição da proliferação de células cancerígenas, redução do tamanho do cancro ou tumor, prevenção de metástases adicionais e inibição da angiogénese tumoral. 0 método de tratamento de tais doenças compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma combinação da invenção a um indivíduo. 0 método pode ser repetido conforme necessário. Especialmente, o cancro pode ser cancro renal, pulmonar, gástrico ou ovãrico.
Os compostos da presente invenção ou os seus conjugados podem ser administrados em combinação com outros agentes terapêuticos, incluindo anticorpos, agentes de alquilação, inibidores de angiogénese, antimetabolitos, agentes de clivagem de ADN, agentes de reticulação de ADN, intercaladores de ADN, ligandos do sulco menor de ADN, enodiinos, proteínas de choque térmico 90, inibidores de histona desacetilase, imunomoduladores, estabilizantes de microtúbulos, análogos de nucleósidos Êpurina ou pirimidinaõ, inibidores de exportação nuclear, inibidores de proteassoma, inibidores de topoisomerase ÊI ou IIÕ, inibidores de tirosina quinase e inibidores de serinaÁtreonina quinase. Agentes terapêuticos específicos incluem adalimumab, ansamitocina P3, auristatina, bendamustina, bevacizumab, bicalutamida, bleomicina, bortezomib, bussulfano, calistatina A, camptotecina, capecitabina, carboplatina, carmustina, cetuximab, cisplatina, cladribina, citarabina, criptoficinas, dacarbazina, dasatinib, daunorubicina, docetaxel, doxorrubicina, duocarmicina, dinemicina A, epotilonas, etopósido, floxuridina, fludarabina, 5-fluorouracilo, gefitinib, gencitabina, ipilimumab, hidroxiureia, imatinib, infliximab, interferões, interleucinas, β-lapachona, lenalidomida, irinotecano, maitansina, mecloretamina, melfalano, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitomicina C, nilotinib, oxaliplatina, paclitaxel, procarbazina, suberoil anilida de ácido hidroxâmico ÊSAHAÕ, 6-tioguanidina, tiotepa, tenipósido, topotecano, trastuzumab, tricostatina A, vinblastina, vincristina e vindesina.
EXEMPLOS A prática da presente invenção pode ser adicionalmente compreendida por meio de referência aos exemplos a seguir. Exemplo 1 - Composto (III-l)
Este exemplo divulga a síntese de composto ÊIII-1Õ, o esquema correspondente sendo mostrado nas Figuras 1, 2a e 2b e 3 combinadas.
Composto 2. Uma mistura de composto 1 Ê6 g, 16,6 mmol; preparado de acordo com Peltier et al. 2006Õ e paraformaldeído Ê9,94 g, 331 mmolÕ em tolueno Ê150 mlõ foi aquecida num frasco selado a 70°C durante 24 h. Cromatografia em camada fina ÊTLCÕ mostrou que a reação estava completa. A mistura de reação foi filtrada através de meio de filtro CELITE™ e o bolo de filtro foi totalmente lavado com tolueno. Após evaporação do solvente, o produto em bruto foi purificado por meio de cromatograf ia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de acetato de etilo a 0 a 70% ÊEtOAcÕ em diclorometano ÊDCMÕ para proporcionar 4,76 g de composto 2 como um óleo amarelo claro. MS: ÊIEI Õ mÁz 3 7 5,2 ÊM0 1Õ.
Composto 3.Õ Foi adicionado ácido clorídrico Ê4,0 M em 1,4-dioxano, 12,24ml, 50,8 mmolÕ gota a gota a uma solução de composto 2 Ê4,76 g, 12,7 mmolÕ em acetonitrilo Ê62 mlõ e metanol Ê6,8mlÕ, na presença de resina de cianoborohidreto ligado a suporte ÊMP-BH3CNÕ Ê4,85 g, 12,7 mmolÕ. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente ÊTAÕ durante 3 h. LCMS mostrou que a reação tinha terminado. A resina foi filtrada e lavada com uma mistura de acetonitrilo-metanol. Após evaporação do solvente, o produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de metanol a 0 a 10% em DCM contendo NH40H a 1% para proporcionar o composto em bruto 3.
As frações de produto foram concentradas, diluídas com EtOAc e lavadas uma vez com NaHC03 saturado aq. para remover os sais de amónio em excesso. A fração aquosa foi novamente extraída uma vez com EtOAc. As fases orgânicas combinadas foram secas e concentradas para proporcionar 2,82 g de composto 3 como um sólido espumoso. MS: Ê0 Õ mÁz 273,2 ÊM0 1Õ.
Composto 4. Foi adicionada N-benzil-N-ciclo-hexilcarbodiimida ligada a polímero ÊAldrich, 4,5 g, 5,21 mmolÕ a uma solução de composto 3 Ê1,42 g, 5,21 mmolÕ, t-butanol Ê0,72 g, 5,32 mmolÕ e isoleucina Boc-protegida 3a Ê1,27 g, 5,47 mmolÕ em DCM Ê48 mlõ a 0°C. A mistura de reação foi agitada à TA durante a noite. A resina foi filtrada e lavada com DCM. 0 filtrado foi concentrado, diluído com EtOAc e lavado uma vez com NaHC03 saturado aq. A solução aquosa foi extraída duas vezes com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas e concentradas. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de metanol a 0-10% em DCM contendo NH40H a 1% para proporcionar frações contendo produto intermediário 3b.
As frações contendo produto foram combinadas, concentradas, diluídas com EtOAc e lavadas com NaHC03 saturado aq. para remover os sais de amónio em excesso. A fração aquosa foi novamente extraída uma vez com EtOAc. As fases orgânicas combinadas foram secas e concentradas para proporcionar o produto intermediário 3b como um sólido branco. 0 produto intermediário 3b em tolueno Ê50 mlõ foi aquecido até 90°C num recipiente selado durante a noite, com agitação. LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0-100% em hexanos para proporcionar 1,3 g de composto 4 como um sólido amarelo claro. MS: Ê+Õ m/z 486,3 ÊM+1Õ.
Composto 5. Ácido trifluoroacético ÊTFA, 26 mlõ foi adicionado a uma mistura de composto 4 em DCM Ê26 mlõ. Após agitação à TA durante 30 min, LCMS mostrou que a reação estava completa. A solução foi concentrada, diluída com EtOAC e lavada uma vez com NaHC03 saturado aq. A solução aquosa foi novamente extraída duas vezes com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas e concentradas para proporcionar 1,03 g de composto 5 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 386,3 ÊM™1Õ.
Composto 6. DCC Ê0,664 g, 3,22 mmolÕ foi adicionado a uma mistura de composto 5 Êl,03 g, 2,68 mmolÕ, ácido ÊJ2Õ-1-metilpiperidina-2-carboxílico 5a Ê0,4 g, 2,81 mmol; preparado de acordo com Peltier et al. 2006Õ e t-butanol Ê0,369 g, 2,73 mmolÕ em DCM a 0°C. A mistura de reação foi deixada aquecer até à TA e agitada à TA durante a noite. 0 sólido foi filtrado e o filtrado foi concentrado. 0 resíduo foi dissolvido em EtOAc e lavado uma vez com NaHC03 saturado aq. A solução aquosa foi novamente extraída duas vezes com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas e concentradas. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de metanol a 0-20% em DCM para proporcionar 1,23 g de composto 6 como um sólido amarelo claro. MS: Ê™Õ mÁz 511,4 ÊM™1Õ.
Composto 7. Uma mistura de J^N-di-isopropiletilamina ÊDIEA, também referida como DIPEA, 0,972 ml, 5,58 mmolÕ, carbonato de bisÊ4-nitrofeniloÕ ÊBNPC, 1,698 g, 5,58 mmolÕ e composto 6 Ê0,57 g, 1,116 mmolÕ em N,N-dimetilformamida ÊDMF, 10 mlõ foi agitada à TA durante a noite. LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash em gel de sílica com um gradiente de metanol a 0 a 20% em DCM para proporcionar 0,68 g de composto 7 como um óleo amarelo. MS: Ê™Õ mÁz 676,4 ÊM™1Õ.
Composto 8. Foi adicionada metilamina em metanol Ê2,0 M, 0,089 ml, 0,178 mmolÕ ao composto 7 Ê0,1 g, 0,148 mmolÕ em metanol Ê1 mlõ. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, LCMS mostrou que a reação estava completa. 0 solvente foi evaporado para proporcionar 0,084 g de composto 8. MS: Ê™Õ mÁz 568,4 ÊM™1Õ.
Composto 9. Foi adicionado hidróxido de lítio Ê7,09 mg, 0,296 mmolõ em água Ê0,5 mlõ a uma solução de composto 8 Ê0,084 g, 0,148 mmolõ em 1,4-dioxano Ê0,5 mlõ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 2 h, LCMS mostrou que a reação estava completa. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de metanol a 0-30% em DCM para proporcionar 0,075 g de composto 9 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 554,4 ÊM™1Õ.
Composto 10. Foi adicionada trietilamina Êll,73 ml, 84 mmolõ a uma mistura de di-t-butildicarbonato ÊB0C20, 10,57 ml, 46,0 mmolõ e cloridrato de 2-amino-3-Ê4-nitrofenilõpropanoato de ÊSÕ-metilo 9a Ê10 g, 38,4 mmolõ em acetonitrilo Ê300 mlõ a 0°C. A mistura de reação foi deixada aquecer até à TA e agitada à TA durante a noite. LCMS mostrou que a reação tinha terminado. A mistura de reação foi concentrada e o produto foi novamente dissolvido em 200 ml de éter dietílico. 0 sólido foi filtrado e o filtrado foi concentrado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0 a 50% em hexanos para proporcionar 11,3 g de um intermediário protegido com Boc como um sólido branco.
Foi adicionado catalisador de PdÁC Ê10% em peso, 0,85 g, 7,99 mmolõ a uma solução do intermediário protegido com Boc Ê15 g, 46,2mmolÕ em MeOH Ê200 mlõ. A mistura de reação foi agitada sob uma atmosfera de hidrogénio durante a noite. 0 catalisador de PdÁC foi filtrado e o filtrado foi concentrado para proporcionar 13,6 g de composto 10 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 195,2 ÊM™l-BocÕ.
Composto 11. Piridina Ê5,77 ml, 71,3 mmolõ foi adicionada a uma solução de cloroformato de benzilo Ê10,18 ml, 71,3 mmolõ e composto 10 Ê17,5 g, 59,5 mmolõ em DCM Ê185 mlõ a 0°C. A mistura de reação foi deixada aquecer até à TA e foi agitada à TA durante a noite. A reação foi extinta por meio da adição de NaHC03 saturado aq. e lavada com salmoura. A camada orgânica foi seca, filtrada e concentrada. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0-50% em hexanos para proporcionar 22,6 g de composto 11 como um óleo incolor. MS: Ê™Õ mÁz 329,2 ÊM™1-BocÕ.
Composto 12. Foi adicionado hidreto de di-isobutilalumínio ÊDIBAL-HÕ em hexanos Ê1M, 26,5 ml, 26,5 mmolÕ a uma solução de composto 11 Ê5,17 g, 12,07 mmolÕ em D CM Ê39 mlõ a -78°C. A mistura de reação foi agitada a -78°C durante 2 h. Foram adicionados ácido acético Ê24 mlõ e tolueno Ê36 mlõ a -78°C. A mistura de reação foi aquecida até à TA. Foi adicionado ácido tartárico Ê10% aq., 69 mlõ à mistura de reação. A solução aquosa foi extraída com uma mistura de hexanos e EtOAc ÊvÁv 1:1Õ. As camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas e concentradas. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatograf ia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0-50% em hexanos para proporcionar 3,12 g de composto 12 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 299,2 ÊM™l-BocÕ.
Composto 13. DibutilÊÊÊtrifluorometilõsulfonilõoxiõborano ÊBu2B0Tf, 1M em DCM, 8,61 ml, 8,61 mmolÕ e DIEA Êl,637 ml, 9,40mmolÕ foram adicionados a uma solução de ÊSÕ-4-isopropil-3-propioniloxazolidin-2-ona 12a Ê1,450 g, 7,83 mmolÕ em DCM Ê7,8 mlõ a 0°C. A mistura de reação foi agitada a 0 °C durante 45 min. Foi adicionada uma solução de composto 12 Ê3,12 g, 7,83 mmolÕ em DCM Ê7,8 mlõ à mistura de reação a -78°C. A mistura de reação foi deixada aquecer até à TA durante a noite. Foi adicionado tampão de fosfato de sódio ÊpH de 7,29 mlõ. A solução aquosa foi extraída com DCM. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas, filtradas e concentradas. 0 resíduo foi novamente dissolvido em metanol Ê130 mlõ e arrefecido até 0°C. Foi adicionado H202 aquoso Ê30%, 39,7 mlõ à mistura de reação a 0°C. A mistura de reação foi agitada a 0 °C durante 4 h. Foi adicionada água Ê39 mlõ. Um pouco do solvente ÊMeOHÕ foi evaporado. A solução aquosa foi extraída com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução de NaHC03 a 5% e salmoura, secas, filtradas e concentradas. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0-50% em hexanos para proporcionar 4,23 g de composto 13 como um óleo incolor. MS: Ê+Õ m/z 484,3 ÊM+l-BocÕ.
Composto 14. Foi adicionado diÊlH- imidazol -1-ilÕmetanotiona Êl,5 g, 8,42 mmolÕ a uma solução de composto 13 Ê2,46 g, 4,21 mmolÕ em THF Ê20 mlõ. A mistura de reação foi submetida a refluxo durante a noite. LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado. 0 produto bruto foi purificado por meio de cromatograf ia rápida em gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0-50% em hexanos para proporcionar 1,25 g de composto 14 como um sólido branco. MS: Ê+Õ m/z 694,3 ÊM+1Õ.
Composto 15. Foi adicionado ÊEQ -2,2'-Êdiazeno-1,2 -diilÕbisÊ2-metilpropanonitriloÕ ÊAIBN, 0,016 g, 0,095 mmolÕ a uma solução de composto 14 Êl,78 g, 2,57 mmolÕ e tributilestanano ÊBu3SnH, 1,380 ml, 5,13 mmolÕ. A mistura de reação foi submetida a refluxo durante 30 min Êtemperatura do banho de óleo a 142 °CÕ. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0-33% em hexanos para proporcionar 0,84 g de composto 15 como um óleo amarelo claro. MS: Ê+Õ m/z 468,3 ÊM+l-BocÕ.
Composto 16. Foi adicionado LiOH Ê0,071 g, 2,96 mmolÕ em água Ê3,7 mlõ a uma solução de composto 15 Ê0,84 g, 1,480 mmolÕ em tetrahidrofurano ÊTHF, 11,4 mlõ, seguido pela adição de H202 a 30% aq. Ê0,271 ml, 8,88 mmolõ a 0°C. Após a mistura de reação ser agitada a 0 °C durante 4 h, foram adicionados 2 0 ml de Na2S03 a 1,33 M aq. para dissipar a reação. Foi adicionado ácido clorídrico Ê1 MÕ para ajustar o pH para 2-3. A solução aquosa resultante foi extraída com DCM. As camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas e concentradas. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0-75% em hexanos para proporcionar 0,53 g de composto 16 como um óleo incolor. MS: Ê™Õ mÁz 357,3 ÊM™l-BocÕ.
Composto 17. Foi adicionado ácido clorídrico concentrado Ê4 gotasÕ a uma solução de 2,2-dimetoxipropano Ê3,53 ml, 28,7 mmolõ e composto 16 Ê0,53 g, 1,161 mmolõ em metanol Ê17,7 mlõ. A mistura de reação foi agitada à TA durante a noite. LCMS mostrou que a reação tinha terminado. LCMS também mostrou a formação de um pouco de subproduto 16a desprotegido. 0 solvente foi evaporado.
Foi adicionada trietilamina Ê2,2 eq., 0,36 mlõ a uma solução do resíduo acima e B0C20 Êl,2 eq., 3 04,3 mgõ em acetonitrilo à TA para proteger novamente o subproduto 16a. A mistura de reação foi agitada à TA durante 2 h. LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado. Foi adicionada água Ê7 mlõ e a solução aquosa foi extraída com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas e concentradas. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0-50% em hexanos para proporcionar 0,3 g de composto 17 como um óleo incolor. MS: Ê™Õ mÁz 371,3 ÊM™l-BocÕ.
Composto 18. Uma mistura de composto 17 Ê0,223 g, 0,4 74mmolÕ e PdÁC a 10% em peso Ê2 0 mg, 0,4 74 mmolõ em metanol Ê6 mlõ foi agitada sob H2 durante a noite. 0 catalisador de PdÁC foi filtrado e o filtrado concentrado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de silica com um gradiente de EtOAc a 0-50% em hexanos para proporcionar 0,112 g de composto 18 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 237,2 ÊM™1-BocÕ.
Composto 19. Uma mistura de composto 18 Ê0,204 g, 0,606 mmolõ, cloridrato de N-Etil-N’ - Ê3-dimetilaminopropilÕ carbodiimida ÊEDC, 0,174 g, 0,910 mmolõ e citrulina protegida com Fmoc 18a Ê0,361 g, 0,910 mmolõ em DMF Ê!2,4 mlõ foi agitada à TA durante a noite. Foi adicionada solução saturada de NH4C1 Ê20 mlõ para dissipar a reação. A solução aquosa foi extraída com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas e concentradas. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash em gel de sílica com um gradiente de MeOH a 0-30% em DCM para proporcionar 0,25 g de composto 19 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 716,4 ÊM™1Õ.
Composto 20. Foi adicionada piperidina Ê0,5 ml, 5,06 mmolõ a uma solução de composto 19 Ê0,25 g, 0,349 mmolõ em DMF Ê5 mlõ. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, o solvente foi evaporado para proporcionar o intermediário desprotegido com Fmoc como um resíduo.
Foi adicionado DIEA a uma solução de ácido ÊSÕ-2-ÊÊÊÊ9H-fluoren-9 -ilÕmetoxiÕcarbonilÕaminoÕ-3-metilbutanoico 19a Ê0,142 g, 0,418 mmolõ e hexafluorofosfato de Ν,Ν,Ν',Ν’-tetrametil-0-Ê7-azabenzot.riazol-l-ilÕurónio ÊHATU, 0,146 g, 0,3 83 mmolõ em DMF Ê2 mlõ, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 5 min, o resíduo acima em DMF Ê1 mlõ e DIEA foi adicionado à mistura de reação, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 15 min, foram adicionados 20 ml de água contendo 8 ml de TFA a 0,1% aquoso. A solução aquosa foi extraída com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas e concentradas. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia rápida eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de MeOH a 0-20% em DCM para proporcionar 0,24 g de composto 20 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 815,4 ÊM™1Õ.
Composto 21. Foi adicionada piperidina Ê0,3 mlõ a uma solução de composto 20 em DMF Ê3 mlõ. A mistura de reação foi agitada à TA durante 1 h. LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado.
Foi adicionado hidróxido de lítio Ê0,028 g, 1,176 mmolÕ em água Ê2 mlõ a uma solução do resíduo acima em THF Ê4 mlõ. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 4 h, aq. Foi adicionado HC1 Ê0,1NÕ para acidificar a mistura de reação ÊpH 2-3Õ. O solvente foi parcialmente evaporado e liofilizado para proporcionar o composto 21 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 579,4 ÊM™1Õ.
Composto 22. Foi adicionado DIEA a uma mistura de N-hidroxisuccinimida éster de ácido ε-maleimidocaproico 21a ÊTokyo Chemical Industry, 64,7 mg, 0,210 mmolÕ e composto 21 Ê81 mg, 0,14mmolÕ em DMF Ê3 mlõ, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 2h, foram adicionados 10 ml de uma mistura a 1:1 ÊvÁvÕ de acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%. 0 produto 22 foi purificado por meio de cromatograf ia de líquido de alto desempenho preparativa ÊHPLCÕ. MS: Ê™Õ mÁz 772,5 ÊM™1Õ.
Composto 23. Foi adicionado ácido 2,2,2-trifluoroacético Ê0,7 ml, 0,013 mmolÕ a uma mistura de composto 22 Ê30 mg, 0,039 mmolÕ em DCM Ê1 mlõ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado, proporcionando o composto 23, MS: Ê™Õ mÁz 672,4 ÊM™1Õ.
Composto (III-l). Foi adicionado DIEA a uma solução de composto 9 Ê23,66 mg, 0,043 mmolÕ e HATH Êi4,77 mg, 0,039 mmolÕ em DMF Ê1 mlõ. 0 pH da mistura de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, foram adicionados composto 23 Ê26,l mg, 0,039 mmolÕ em DMF Ê1 mlõ e DIEA. 0 pH da solução de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, LCMS mostrou que a reação estava completa. A reação foi extinta por meio da adição de 10ml de uma mistura a 1:1 ÊvÁvÕ de água contendo TF A. a 0,1% e acetonitrilo. O produto composto (III-1) foi purificado por meio de HPLC prep. MS: Ê™Õ mÁz 1207,7 ÊM™10.
Podem ser utilizados compostos tal como (III-l), tendo um grupo maleimido, para preparar conjugados por meio de reação com um grupo sulfidrilo sobre um anticorpo ou outro ligando. 0 grupo sulfidrilo pode ser um de um resíduo de cisterna ou um obtido por meio de derivatização de um resíduo de lisina com 2-iminotiolano.
Exemplo 2 - Composto (III-2)
Este exemplo divulga a síntese de composto ÊIII-2Õ, o esquema correspondente sendo mostrado na Figura 4.
Composto 24. Foi adicionada N-Etil-N-isopropilpropan-2-amina Ê0,556 ml, 3,19 mmolõ a uma solução de cloridrato de éster terc-butílico de glicina 23a Ê0,209 g, 1,596 mmolõ, Fmoc-ãcido aminoxiacético 23b Ê0,5g, 1,596 mmolõ e HATU Ê0,607 g, 1,596 mmolõ em DMF Ê5 mlÕ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 1 h, foi adicionado TFA aq. a 0,1% Ê20 mlÕ. A solução aquosa foi extraída com EtOAc e as camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas e concentradas. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0-70% em hexanos para proporcionar 0,4 5 g de composto 24 como um óleo incolor. MS: Ê™Õ mÁz 449,2 ÊM™23Õ.
Composto 25. Foi adicionado TFA Ê3 ml, 1,437 mmolõ a uma solução de composto 24 Ê0,45 g, 1,055 mmolõ em DCM Ê0,5 mlÕ à TA. A mistura de reação foi agitada à TA durante a noite. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia rápida eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de MeOH a 0-30% em DCM para proporcionar 0,39 g de composto 25 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 371,1 ÊM™1Õ.
Composto 26. Foi adicionado N, Ν' - metanodiilidenodiciclohexanamina ÊDCC, 0,261 g, 1,267 rnrnolÕ a uma solução de composto 25 e l-hidroxipirrolidina-2,5-diona Ê0,14 6 g, 1,267 rnrnolÕ em DCM Ê6mlÕ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante a noite, o sólido foi filtrado. 0 filtrado foi então concentrado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0-100% em hexanos para proporcionar 0,4 3 g de composto 26 como um óleo incolor.
Composto 27. Foi adicionado Dl EA a uma solução de composto 21 Ê50 mg, 0,086 rnrnolÕ e composto 26 Ê60,6 mg, 0,130 rnrnolÕ em DMF à TA, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 4 h, a reação foi extinta por meio da adição de 10 ml de uma mistura a 1:1 de TFA aq. a 0,1% e acetonitrilo. Purificação por meio de HPLC preparativa proporcionou 55 mg de composto 27 como um sólido branco, MS: Ê™Õ mÁz 931,4 ÊM™1Õ.
Composto 28. Foi adicionado TFA Ê1 ml, 0,059 rnrnolÕ a uma solução de composto 27 Ê55 mg, 0,059 rnrnolÕ em DCM Ê2 mlõ à TA. A mistura de reação foi agitada à TA durante 10 min. 0 solvente foi evaporado.
Foi adicionado DIEA a uma solução de composto 9 Ê32,7mg, 0,059 rnrnolÕ e HATU Ê22,47 mg, 0,059 rnrnolÕ em DMF Ê1 mlõ. 0 pH da mistura de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, foram adicionados DMF Ê2 mlõ e DIEA. 0 pH da solução de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, LCMS mostrou que a reação estava completa. A reação foi extinta por meio da adição de 20 ml de uma mistura a 1:1 ÊvÁvÕ de água contendo TFA a 0,1% e acetonitrilo. Purificação por meio de HPLC preparativa proporcionou 70 mg de composto 28 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 684,1 ÊMÁ2™1Õ,
Composto (III-2). Foi adicionada piperidina a uma solução de composto 28 Ê7 0 mg, 0,051 mmolõ em DMF Ê4 mlõ. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 2 0 min, foi adicionada uma mistura a 1:1 de acetonitrilo e TFA aq. a 0,1% Ê40 mlõ. Purificação por HPLC preparativa proporcionou 46 mg de composto (III-2) como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 1144,6 ÊM™1Õ.
Podem ser utilizados compostos tal como (111-2}, tendo um grupo hidroxilamina, para formar conjugados com um anticorpo ou outro ligando tendo uma funcionalidade aldeído ou cetona, por exemplo, através de incorporação do aminoãcido não natural 4-acetilfenilalanina.
Exemplo 3 - Compostos (1-2) e (1-3) A síntese de compostos ÊI-2Õ e ÊI-3Õ é mostrada esquematicamente na Figura 5.
Composto (1-3) . Foi adicionado Dl EA a uma solução de composto 9 Ê10 mg, 0,018 mmolõ e HATU Ê6,87 mg, 0,018 mmolõ em DMF Ê0,3 mlõ, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, foram adicionados composto 2 9 Êpreparado de acordo com Cheng et al. 2 011, Exemplo 17; 4,56 mg, 0,018 mmolõ em DMF Ê0,5 mlõ e DIEA, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, a reação foi dissipada por meio da adição de 4 ml de uma mistura a 1:1 de acetonitrilo e TFA aq. a 0,1%. Purificação por meio de HPLC preparativa proporcionou 12 mg de composto (1-3) ÊI-2Õ como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 788,4 ÊM™1Õ.
Composto (1-2). Uma mistura de composto (1-3) Ê12 mg, 0,015 mmolõ e PdÁC a 10% em peso Ê4 mg, 0,015 mmolõ em metanol Ê0,5 mlõ foi agitada sob uma atmosfera de H2 durante a noite. 0 catalisador foi filtrado e o filtrado concentrado. Purificação por meio de HPLC preparativa proporcionou 8,1 mg de composto (1-2) como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 758,4 ÊM™1Õ. 0 Composto (1-1) pode ser preparado analogamente substituindo o composto 29 pelo composto tendo estereoquímica mista na posição alfa-metilo ÊCheng et ai. 2Q11Õ.
Exemplo 4 - Composto (III-4)
As Figuras 6a a 6c em combinação mostram esquematicamente a síntese de composto ÊIII-4Õ.
Composto 32. Foi dissolvido Composto 30 ÊAldrich, 3,5g, 13,9 mmolÕ em 50 ml de DCM. A esta solução foi adicionado periodinano de Dess-Martin Êli,8 g, 27,9 mmolÕ a 5°C. Após 1 0 min, a mistura foi aquecida até à TA. Após mais uma hora, a reação foi extinta com NaHC03 saturado aq. e NaS203 saturado aq. Após extração com éter, o extrato de éter foi lavado com NaHC03 aq. e então salmoura e seco e evaporado até um óleo viscoso. 0 óleo foi dissolvido em 50 ml de DCM, ao qual foi adicionado o composto 31 comercialmente disponível Ê5,05 g, 13,93 mmolÕ. Após 10 min, a mistura de reação foi captada em EtOAc, lavada com NaHC03 aq. e então salmoura e seca, filtrada e o solvente evaporado. Após cromatografia em coluna ÊEtOAc: hexano, gradiente de 0 a 20%Õ o composto 32 Ê2,3 g, 6,90 mmol, rendimento de 49,5%Õ foi obtido como um sólido branco. Teve um espetro de NMR consistente com a literatura ÊWipf et al. 2Q04aÕ.
Composto 33. Foi adicionado ácido clorídrico Ê7,80 ml, 31,2 mmol, 4M em dioxanoÕ a 5 °C a uma solução em DCM de composto 32 Ê5,2 g, 15,60 mmolÕ. Após a reação de desproteção estar completa, a mistura de reação foi evaporada e foi obtido composto 33 Ê4,21 g, 15,60 mmol, rendimento de 100%, cloridratoÕ como um sólido branco, que é utilizado na seguinte etapa sem purificação adicional.
Composto 35. A uma solução de composto 34 Êpreparada por Sani et al. 2007, 4,00 g, 11,6 mmolÕ em 20 ml de DMF a 5 °C foram adicionados HATU Ê4,61 g, 12,12 mmolÕ e DIPEA Ê6 ml, 34,4 mmolÕ. Após 10 min, foi adicionado composto 33 Ê2,71 g, 11,60 mmolÕ. Após mais meia hora, a mistura foi captada em EtOAc, que foi lavado com ácido cítrico aq. a 10%, NaHC03 saturado aq. e salmoura. Após secagem e filtração, a fase orgânica foi evaporada para proporcionar o composto 35 Ê6,49 g, 11,60 mmol, rendimento de 100%, [M™Na] , calculado 582,3, encontrado 582,30 como um óleo, que foi utilizado na seguinte etapa sem purificação adicional.
Composto 36. Foi adicionado NaBH4 Ê4,66 g, 123 mmolÕ, em porções, a 100 ml de uma solução em metanol de composto 35 Ê6,49 g, 11,6 mmolÕ e NiS04ÊH20Õ6 Ê6,48 g, 24,66 mmolÕ a 5°C. ÊCuidado: foi gerado hidrogénioÕ. Após 30 min, foi adicionado NaHC03 saturado aq., seguido por EtOAc. Após filtração através de CELITES , a fase orgânica foi eparada da fase aquosa, lavada com salmoura, seca, filtrada e evaporada para proporcionar o composto 36 Ê5,6 g, 9,97mmol, rendimento de 81%, [M™1]", calculado 562,3, encontrado 562,40, que foi utilizado na seguinte etapa sem purificação adicional
Composto 37. Foi dissolvido Composto 36 Ê5,6 g, 9,97 mmolÕ em 30 ml de piridina a 5°C. Foi adicionado anidrido acético Ê4 g, 3 9,2 mmolÕ a esta solução. Após 10 min, a mistura foi aquecida até à TA. Após cerca de uma hora, a mistura de reação foi concentrada. 0 resíduo resultante foi captado em EtOAC e a fase orgânica foi lavada com ácido cítrico aq. a 10%, MaHC03 saturado aq. e salmoura, sequencialmente. A fase orgânica foi seca, filtrada e concentrada para proporcionar o composto 37 Ê5,8 g, 9,61 mmol, rendimento de 100%, [M™1]", calculado 604,3, encontrado 604,40, que foi utilizado na seguinte etapa sem purificação adicional.
Compostos 38a e 38b. Foi dissolvido composto 37 Ê0,8 g, 1,3 mmolÕ em 5 ml de metanol a -78°C. A esta solução foi adicionado NaOMe Ê331 ml, 1,33 mmol, 4M em MeOHÕ. A mistura foi deixada aquecer até à TA durante 1 hora. A mistura foi captada em EtOAc, lavada com ácido cítrico aq. a 10%, solução de NaHC03 saturado aq. e salmoura. A fase orgânica separada foi seca, filtrada e evaporada para proporcionar uma mistura de ésteres etílico e metilico Êcompostos 38a e 38b, respetivamenteõ. A mistura de ésteres não foi separada durante as seguintes etapas até ambos serem hidrolisados ao ácido carboxílico na última etapa.
Compostos 40a e 40b. A mistura de compostos 38a e 38b da reação acima foi dissolvida em 20 ml de DCM. A esta solução foram adicionados carbonocloridato de 4-nitrofenilo 39 Ê524 mg, 2,6mmolÕ e piridina Ê210 μΐ, 2,6 mmolÕ a 5°C. A temperatura foi deixada aumentar até à temperatura ambiente após lhe foi adicionada metilamina Êl,950ml, 3,9 mmol, 2M em THFÕ. Após 10 min, o solvente foi evaporado e o resíduo foi passado através de uma coluna de cromatografia para proporcionar uma mistura de compostos 40a e 40b Êésteres etílico e metilico, respetivamente; 420 mg, razão de 40a/40b de 3:1 a partir de HPLC, rendimento de cerca de 53% para duas etapas, [M+l]+: calculado 603,3, encontrado 603,4 para 40a; calculado 589,3, encontrado 589,4 para 40bÕ.
Compostos 41a e 41b. A mistura de compostos 40a e 49b Ê420 mg, cerca de 0,68 mmolÕ foi dissolvida em 3 ml de DCM, à qual foi adicionado HC1 Ê4,8 mmol, 1,2 ml, 4N em dioxanoõ. Após 1 h a 5°C, o solvente foi evaporado e a mistura de compostos 41a Êéster etílicoÕ e 41b Êéster metílicoõ, razão de cerca de 3:1, foi utilizada na seguinte etapa sem purificação adicional.
Compostos 43a e 43b. Uma mistura de compostos 41a e 41b Ê400 mg, «0,72 mmolÕ, composto 42 Êcomercialmente disponível da Anichem, 170 mg, 0,721 mmolÕ e ácido acético Ê0,041 ml, 0,721mmolÕ foram misturados em DCM a 5 °C. Foi adicionado Triacetoxiborohidreto de sódio Ê306 mg, 1,44 mmolÕ. A mistura foi captada em EtOAc após 30 min. Após ser lavada com K2C03 aq. a 7% e salmoura, a fase orgânica foi seca, filtrada e evaporada para proporcionar um resíduo. Após purificação através de cromatografia em coluna ÊMeOH: DCM, gradiente de 0-7%Õ, foram obtidos os compostos 43a Êéster etílicoÕ e 43b Êéster metílicoÕ Ê310 mg, aproximadamente 0,42 mmol, rendimento de aproximadamente 58,3%, razão de 43a:43b de cerca de 3:1, [M™1] , calculado 738,4, encontrado 738 para 43a; calculado 724,4, encontrado 724 para 43bÕ.
Compostos 45a e 45b. Uma mistura de compostos 43a e 43b Ê310 mg, aproximadamente 0,42 mmolÕ foi dissolvida em 5 ml de DCM à TA. A esta solução foram adicionados 2,6-di-terc-butilpiridina Ê161 mg, 0,840 mmolÕ e a 2 ml de uma solução em DCM de composto 44 Êpreparado por Peltier et al. 2006, 73,8 mg, 0,420 mmolÕ. Após meia hora, Et3N Ê58,6 μΐ, 0,420 mmolÕ foi adicionado. A mistura foi então captada em EtOAc, que foi lavado com ácido cítrico aq. a 10%, solução de NaHC03 saturado aq. e salmoura. A fase orgânica foi seca, filtrada e evaporada até um resíduo. Após purificação através de por cromatografia em coluna, foram obtidos os compostos 45a e 45b Ê294 mg, aproximadamente 0,334 mmol, rendimento de 80%, razão de 45a:45b de 3:1, [M™1] ”, calculado 877,5, encontrado 877 para 45a; calculado 863,5 encontrado 863 para 45bÕ como um óleo viscoso.
Compostos 46a e 46b. Uma mistura de compostos 45a e 45b Ê100 mg, aproximadamente 0,114 mmolÕ foi adicionada a uma suspensão de Pd/C Ê6 5 mg, 10%Õ em 2 0 ml MeOH. Foi adicionado HC1 Ê28,5 μΐ, 0,114 mmol, 4M em dioxanoÕ. 0 frasco foi evacuado e novamente preenchido com H2/ este processo sendo repetido três vezes. Após 2 h, a suspensão foi filtrada e o solvente foi evaporado para proporcionar um resíduo. Foram adicionados uma suspensão de composto 5a Ê19,5 9 mg, 0,137 mmolÕ em 500 ml de DMF, HATU Ê43,4 mg, 0,114 mmolÕ e DIPEA Ê4 9,8 μΐ, 0,2 85 mmolÕ a 5 °C. Após a suspensão se tornar homogénea, o resíduo acima foi adicionado como uma solução em DMF Ê1 mlÕ. Foi adicionado mais DIPEA para ajustar o pH a cerca de 12. Após 10 min, a mistura foi captada em EtOAc, que foi lavado com ácido cítrico aq. a 10%, NaHC03 saturado aq. e salmoura. A fase orgânica separada foi seca, filtrada e evaporada. O resíduo resultante foi passado através de uma coluna cromatográfica para proporcionar uma mistura de compostos 46a e 46b Êésteres etílico e metílico, respetivamente, 80 mg, cerca de 0,082 mmol, rendimento de 71,9%, razão de 46a:46b de 3:1, [Μ™1] , calculado 976,5, encontrado 976,5 para 46a; calculado 962,5, encontrado 962,5 para 46bÕ.
Compostos 47a e 47b. Foi adicionado HC1 Ê256 μΐ, 1,024 mmol, 4M em dioxanoÕ a 2 ml de uma solução em MeOH de compostos 46a e 46b Ê200 mg, 0,205 mmolÕ a 5 °C. Após 1 h, a solução foi evaporada e seca sob vácuo elevado durante a noite para proporcionar um óleo viscoso. Este óleo viscoso, citrulina protegida com Fmoc 18a Ê81 mg, 0,205 mmolÕ e DIPEA Ê179 μΐ, 1,024 mmolÕ foram dissolvidos em 2 ml de DMF à TA. Foi adicionado anidrido de ácido propilfosfõnico ÊT3P, 178 μΐ, 0,410 mmol, 2,3 M em EtOAcÕ. Após Ih, a mistura de reação foi captada em EtOAc, que foi lavada com solução de NaHC03 saturado aq. e salmoura. Após separação, secagem e evaporação, o resíduo resultante foi passado através de uma coluna cromatográfica ÊMeOH: DCM, gradiente de 0-10%Õ para proporcionar uma mistura de compostos 47a e 47b Êésteres etílico e metílico, respetivamente, 150 mg, aproximadamente 0,119 mmol, rendimento de cerca de 58,3%, razão de 47a :47b de 3:1, [M™1] , calculado 1255,6, encontrado 1255,6 para 47a; calculado 1241,6, encontrado 1241,6 para 47bÕ.
Composto 49. Uma mistura de compostos 47a e 47b Ê200mg, cerca de 0,165 mmolÕ foi dissolvida em 5 ml de DMF Êcom 5% piperidinaõ à temperatura ambiente. A solução foi evaporada até à secura após 30 min. 0 resíduo resultante foi misturado com éster de N-hidroxisuccinimida de valina protegido com Boc 48 Ê61,9 mg, 0,198mmolÕ, 5 ml de DMF e DIPEA Ê87 μΐ, 0,496 mmolÕ. Após deixar que a reação prosseguisse durante a noite, a mistura de reação foi evaporada até à secura. A mistura resultante foi dissolvida em 5 ml de uma mistura de MeOH, THF e água Ê1:1:1Õ. Foi adicionado NaOH e o pH da solução final era de 14. Após deixar que a reação prosseguisse durante a noite à TA, a mistura foi acidificada com HC1 a um pH de 3 e evaporada sob alto vácuo. 0 sólido obtido foi tratado com TFA e a mistura foi evaporada após 10 min, proporcionando composto 49 Ê80 mg, 0,072 mmol, rendimento de 43,8%, [M™1]", calculado 1104,6, encontrado 1104,60 após purificação através de HPLC preparativa.
Composto (III-4). Composto 49 Ê80 mg, 0,072 mmolÕ, composto 21a comercialmente disponível ÊAldrich, 26,6 mg, 0,087 mmolÕ e DIPEA Ê38,0 μΐ, 0,217 mmolÕ foram dissolvidos em 2 ml de DMF. Após deixar que a reação prosseguisse durante a noite, a mistura foi evaporada e o resíduo foi purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar um isómero principal Ê15 mg, rendimento de 16%, 1Á2 [M™2]2 ", calculado 649,3, encontrado 649,50 e um isómero menor Ê3,7 mg, rendimento de 4%, 1Á2[M™2]2 , calculado 649,3, encontrado 649,5ÕÕ. 0 isómero principal foi tentativamente designado como (III-4), tendo a estereoquímica da tubulisina natural na posição alfa-metilo da subunidade Tup e o isómero menor foi designado como composto (III-5), tendo a estereoquímica invertida.
Exemplo 5 - Compostos (1-5), (1-6) e (1-7)
Uma pequena fração do óleo viscoso descrito acima do tratamento dos compostos 46a e 46b com HC1 não foi acoplada ao composto 18a, mas foi em vez disso dissolvida numa mistura de THF, MeOH e água Ê1:1:1Õ. 0 pH da mistura de reação foi ajustado a 14. Após deixar que a reação prosseguisse durante a noite, metade da mistura de reação foi evaporada e purificada por meio de cromatografia preparativa para proporcionar os compostos (1-5) Ê1 m; M™1, 876,60, (1-6) Ê1 mg; M™1, 862,50 e (1-7) Ê! mg; M™1, 848,5Õ.
Exemplo 6 - Composto (1-1) É mostrado um esquema para a síntese de composto (I-l) na Figura 7.
Composto 51. Foi adicionado HC1 Ê6 N, 0,2 mlõ a uma solução de composto 50 ÊCheng et al. 2011; 50 mg, 0,198 mmolõ e 2,2-dimetoxipropano ÊQ,244 ml, 1,982 mmolõ em MeOH Ê1 mlõ. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante a noite, o solvente foi evaporado para proporcionar 52,8 mg de composto 51. MS: Ê™Õ mÁz 267,2 ÊM™1Õ.
Composto 52. Uma mistura de composto 51 Ê52,8 mg, 0,198 mmolõ e paládio sobre carbono Ê10% em peso, 8 mgõ em MeOH Ê1 mlõ foi agitada sob uma atmosfera de H2 durante a noite. 0 catalisador foi então filtrado e o solvente evaporado para proporcionar 46,9 mg de composto 52, MS: Ê™Õ mÁz 237,3 ÊM™1Õ.
Composto (1-1). Uma mistura de pentafluorofenol Ê2,493mg, 0,014 mmolõ, 1,3-diciclo-hexilcarbodiimida Ê2,049 mg, 9,93 prnolõ e composto 9 Ê5 mg, 9,03 pmolÕ em DCM ÊQ,5 mlõ foi agitada à TA durante a noite. 0 solvente foi então evaporado. A uma solução do resíduo resultante Ê6,50 mg, 9,03 μηιοΙΟ e composto 52 Ê4,27 mg, 18,06 pmolÕ em DMF Ê0,2 mlõ foi adicionado DIEA Ê1 gotaõ. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, a reação foi extinta por meio da adição de uma mistura a 1:1 de acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1% Ê4 mlõ. Purificação por meio de HPLC preparativa proporcionou 2,5 mg de composto (I-l) como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 772,5 ÊM™1Õ.
Exemplo 6 - Composto (1-4) A Figura 8 mostra um esquema para a síntese do composto (1-4).
Foi adicionado DIEA a uma solução de composto 9 Ê1Q,69 mg, 0,019 mmolõ e HATU Ê7,34 mg, 0,019 mmolõ em DMF Ê0,3 mlõ, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, foram adicionados composto 53 Ξ4 mg, 0,019 mmol; preparado de acordo com Sani et al. 2007Õ em DMF Ê0,5 mlõ e DI-EA, ajustando o pH para 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, a reação foi extinta por meio da adição de uma mistura a 1:1 de acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1% Ê4 mlõ. Purificação por meio de HPLC preparativa proporcionou 12,5 mg de composto (1-4) como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 743,4 ÊM™1Õ.
Exemplo 7 - Tiocarbamatos
Podem ser produzidos compostos de acordo com a fórmula ÊIÕ nos quais W é S Êisto é, tiocarbamatosÕ por meio de tratamento de um precursor adequado tal como composto 6 ÊFigura 1Õ, com hidreto de sódio e então um tioisocianato, conforme ilustrado abaixo:
Exemplo 8 - Composto (III-6) É mostrado um esquema para a síntese do composto 56 nas Figuras 9a e 9b.
Composto 56. Foi adicionada 1,3-
Diciclohexilcarbodiimida ÊDCC, 0,160 g, 0,778 mmolÕ a uma solução de l-amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de terc-butilo 54 ÊQuanta Biosciences, 0,25 g, 0,778 mmolÕ e ácido 2-ÊÊÊÊÊ9H-fluoren-9 -ilõmetoxiõcarbonilõ aminoÕ oxiõacético 55 ÊChem-Impex, 0,244 g, 0,778 mmolÕ em DCM Ê5mlÕ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante a noite, o precipitado foi filtrado. 0 filtrado foi então concentrado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de metanol a 0-10% em DCM para proporcionar 0,3 0 g de composto 56 como um óleo incolor. MS: Ê™Õ mÁz 617,4 ÊM™1Õ.
Composto 57. Uma solução de composto 56 ÊG,303 g, 0,491 mmolõ em TFA Ê2 ml, 0,662 mmolÕ foi agitada à TA durante 2 h. Após a solução ser concentrada, o resíduo foi lavado com hexanos para proporcionar 0,28 g de composto 57, MS: Ê™Õ mÁz 561,3 ÊM™1Õ.
Composto 58. Foi adicionado DCC Ê0,199 g, 0,963 mmolõ a uma solução de composto 57 Ê0,27 g, 0,482 mmolõ e 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona Êtambém conhecida como N-hidroxissuccinimida ou NHS, 0,111 g, 0,963 mmolõ em DCM Ê5 mlõ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante a noite, o solido foi filtrado. 0 filtrado foi então concentrado. O produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de acetato de etilo a 0-100% em hexanos para proporcionar 0,12 g de composto 58 como um óleo incolor. MS: Ê™Õ mÁz 658,3 ÊM™1Õ.
Composto 59. Foi adicionado DIEA Ê2 gotasõ a uma solução de composto 58 Ê0,12 g, 0,182 mmolõ e composto 21 Ê0,!06 g, 0,182mmolÕ em DMF Ê2 mlõ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante Ih, a reação foi extinta por meio da adição de uma mistura de acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC prep para proporcionar 0,12 g de composto 59 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 1121,6 ÊM™1Õ.
Composto 60. TFA Ê0,5 mlõ foi adicionado a uma solução de composto 59 Ê20 mg, 0,018 mmolõ em DCM Ê1 mlõ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, a solução foi concentrada para proporcionar 18,2 mg de composto 60, MS: Ê™Õ mÁz 1021,6 ÊM™1Õ.
Composto 61. Foi adicionado DIEA a uma solução de composto 9 Ê9,87 mg, 0,018 mmolõ e HATU Ê6,78 mg, 0,018 mmolõ em DMF Ê0,4 mlõ. 0 pH da mistura de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, foi adicionado composto 60 Ê18,2 mg, 0,018 mmolõ em DMF Ê1 mlõ e DIEA. 0 pH da mistura de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, a reação foi extinta por meio da adição de 10 ml de uma mistura a 1:1 ÊvÁvÕ de água contendo TFA a 0,1% e acetonitrilo. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC prep para proporcionar 2 5 mg de composto 61 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 779,0 ÊMÁ2™1Õ.
Composto (III-6) . Foi adicionada uma gota de piperidina a uma solução de composto 61 Ê25 mg, 0,016 mrnolÕ em DMF Ê1 mlõ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante Ih, a reação foi extinta por meio da adição de uma mistura de acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC prep para proporcionar 20 mg de composto (III-6) como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 668,0 ÊMÁ2™1Õ. 0 Composto ÊIII-6Õ tem um grupo hidroxilamina, que pode ser utilizado para conjugação por meio de formação de oximo, por exemplo, com o grupo cetona de um resíduo de p-acetilfenialanina que foi introduzido numa proteína, conforme discutido acima.
Um conjugado de composto (III-6) e um anticorpo anti mesotelina modificado para conter um resíduo de p-acetilfenilalanina exibiu uma EC50 de 0,14 contra células de cancro gástrico N87 utilizando um ensaio de incorporação de 3H timidina.
Numa forma de realização, esta invenção proporciona um conjugado do composto (III-6) e um anticorpo anti mesotelina modificado para conter um grupo cetona. Preferentemente, a modificação é por meio da incorporação de um resíduo de p-acetilfenilalanina na cadeia polipeptídica do anticorpo. Também preferentemente, o anticorpo assim modificado é 6A4.
Exemplo 9 - Composto intermediário 69 A Figura 10 mostra um esquema para a síntese de composto 69, que pode ser utilizado como um intermediário para a síntese de compostos desta invenção.
Composto 63. Foi adicionado Composto 62 ÊChem-Impex, 5 g, 23,8 mmolõ a uma solução de S0C12 Ê3,4 7 ml, 4 7,6 mmolõ em 20ml de MeOH a 5°C. Após permitir que a reação prosseguisse durante a noite, a mistura de reação foi aquecida durante meia hora a 45°C. Os materiais voláteis foram evaporados e o resíduo foi dissolvido em 20 ml de DCM. Foi adicionado Boc20 Ê7,8 g, 35,7 mmolõ. Foi utilizado Et3N para ajustar o pH da solução a 9 Êtestado com papel de pH húmidoõ. Após algumas horas a mistura de reação foi captada em EtOAc. A solução de EtOAc foi lavada com solução de ácido cítrico a 10%, solução de NaHC03 sat. aq. e salmoura. A fase orgânica foi seca, separada e evaporada. 0 resíduo final a partir da evaporação da fase orgânica seca foi passado através de uma coluna para proporcionar o composto 63 Ê5 g, rendimento de 65%, [M™l-Boc] , calculado 225,1, encontrado 225,20.
Composto 65. A 20 ml de uma solução em DCM de composto 63 Ê2 g, 6,2 mmolõ foi adicionado DIBAL-H Ê12,4 ml, 12,4 mmol, 1M em DCMÕ a -78°C. Após meia hora, foi utilizado MeOH para extinguir a reação. Foi utilizado HC1 para ajustar o pH da solução a cerca de 2. A mistura foi captada em EtOAc, que foi lavado com ácido cítrico a 10%, salmoura, seco, separado e evaporado. 0 resíduo foi dissolvido em 30 ml de DCM. Foi adicionado Composto 64 Ê2,4 g, 6,2 mmol, documento US 4.894.386Õ a 0°C. A mistura foi evaporada após lh à TA, o resíduo foi passado através de uma coluna para proporcionar composto 65 Ê2 g, rendimento de 79%, [M™1-Boc] ”, calculado 3 07,2, encontrado 307,10.
Composto 66. Composto 65 Ê600 mg, 1,48 mmolõ foi dissolvido em 75 ml de EtOAc à TA. A solução foi transferida para um balão preenchido com N2 e Pd/C Ê600 mg, 10%Õ, 0 balão foi evacuado e novamente preenchido com H2; o ciclo foi repetido três vezes. Após lha solução foi filtrada e evaporada para proporcionar composto 66 Ê560 mg, rendimento de 100%, [M™1]', calculado 379,3, encontrado 3 7 9,30 como uma mistura de epímeros. A mistura não foi separada até mais tarde.
Composto 67. Composto 66 Ê1,30 g, 3,43 mmolÕ, citrulina protegida com Fmoc 18a Ê1,6 g, 4,12 mmolÕ e 2-etoxi-l-etoxicarbonil-1,2-di-hidroquinolina ÊEEDQ, 1,06 g, 4,3 mmolÕ foram dissolvidos numa mistura de DCM e MeOH Ê22 ml, 10:1Õ. Após permitir que a reação prosseguisse durante a noite, a mistura foi evaporada e o resíduo foi passado através de uma coluna ÊMeOH:DCM, gradiente de 0-5%Õ para proporcionar composto 67 Ê[M™1]", 7calculado 758,4, encontrado 758,40 como uma mistura de epímeros Ê«4:1 a partir de análise por HPLCÕ. Foi utilizado na seguinte etapa sem purificação adicional.
Composto 68a. A mistura de composto 67 da reação acima foi dissolvida em 10 ml de DMF Êcom piperidina a 5%Õ à TA. Após 3 0 min, a mistura foi evaporada e seca com uma bomba de alto vácuo durante a noite. 0 resíduo foi misturado com composto 48 Ê1,5 g, 3,45mmolÕ em 5 ml de DMF. Foi utilizado Et3N para ajustar o pH da solução a 12. Após Ih a mistura de reação foi captada em EtOAc, que foi lavado com ácido cítrico a 10%, solução de NaHC03 sat. aq. e salmoura. A fase orgânica foi seca, filtrada e evaporada até à secura. 0 resíduo foi desprotegido com piperidina a 5% em DMF da mesma maneira que a desproteção do composto 67. Foram misturados a amina obtida nesta etapa e composto 21a Ê1 g, 3,27 mmolÕ em 10 ml de DMF. Foi utilizado Et3N para ajustar o pH da solução a 12 à TA. Após permitir que a reação prosseguisse durante a noite, a mistura foi captada em EtOAc, que foi lavado com ácido cítrico a 10%, NaHC03 sat. aq. e salmoura. A fase orgânica foi seca, filtrada e evaporada para proporcionar um resíduo. 0 resíduo foi passado através de uma coluna de sílica vulgar para proporcionar uma mistura de compostos 68a e 68b Êlg, rendimento de 35% a partir do composto 66, [M+l]+, calculado 828,5, encontrado 828,50. Após separação sobre uma coluna de HPLC preparativa, foram obtidos 600 mg do epímero principal Êestrutura designada tentativamente como composto 68a, com composto 68b designado como o epímero menorõ.
Composto 69. 0 Composto 68a Ê600 mg, 0,72 mmolÕ foi dissolvido em 5 ml de uma mistura de DCM e TFA Ê1:1Õ. Após 2 h, a mistura de reação foi evaporada para proporcionar composto 69 Êrendimento quantitativo, [Μ™1], calculado 672,4, encontrado 672,40.
Exemplo 10 - Composto intermediário 75 A Figura 11 mostra um esquema para a síntese do composto intermediário 75, que pode ser utilizado para a síntese de compostos da presente invenção.
Composto 71. Foram misturados Composto 70 ÊCheng et al. 2011, 25 mg, 0,044 mmolÕ, N,Ν'-diisopropilcarbodiimida ÊDIC, 0,014 ml, 0,088 mmolÕ, 4-ÊdimetilaminoÕpiridina ÊDMAP, 10,78 mg, 0,088 mmolÕ e MeOH ÊQ,036 ml, 0,882 mmolÕ à TA. Após uma hora, a mistura de reação foi evaporada e passada através de uma coluna para proporcionar composto 71 Ê10 mg, rendimento de 39%, M™1, 581,40.
Composto 72. Foi dissolvido Composto 71 Ê122 mg, 0,210 mmol, de outro lote sintéticoÕ em MeOH Ê2 mlõ a 5°C. Foi adicionado NaOMe Ê0,441ml, 0,221 mmolÕ. Após 0,5 h, a mistura foi neutralizada com HC1 Ê4M em dioxanoÕ e evaporada para proporcionar composto 72 Êm™l, 539,40, que foi utilizado na seguinte etapa sem purificação adicional.
Composto 73. Foi dissolvido Composto 72 Ê6 0 mg, 0,111 mmolÕ em DCM Êl,5 mlõ a 5°C, Piridina Ê0,045 ml, 0,5 57 mmolÕ. Foi adicionado 4-carbonocloridrato de nitrofenilo 72a Ê67,3 mg, 0,334 mmol, AldrichÕ em 0,5 ml de DCM lentamente. Após permitir que a reação prosseguisse durante a noite, a mistura foi evaporada e purificada por meio de cromatografia em coluna para proporcionar composto 73 Ê42mg, 0,060 mmol, rendimento de 53,6%Õ Êm™l, 704,40.
Composto 74. Foi dissolvido Composto 73 Ê42 mg, 0,060 mmolÕ em DCM Ê1 mlõ a 5°C. Foi adicionada metilamina Êl,853 mg, 0,0 60 mmolõ. Após 0,5 h, a mistura foi evaporada e o resíduo foi passado através de uma coluna cromatográfica ÊMeOH:DCM, gradiente de 0-15%, produto eluindo a 7-10%Õ para proporcionar composto 74 Ê35mg, 0,059 mmol, rendimento de 98%Õ Êm™l, 596,40.
Composto 75. Foi dissolvido Composto 74 Ê93 mg, 0,156 mmolõ em THF Ê1 mlõ a 5°C. Foi adicionado LiOH Ê7,47 mg, 0,94 mmolõ em 0,34 ml de água. Após a reação ter terminado, a mistura de reação foi neutralizada com HC1 Ê4M em dioxanoõ e seca sob vácuo elevado para proporcionar composto 75 Êm!Ml, 582,30, que foi utilizado na seguinte etapa sem purificação adicional.
Exemplo 11 - Compostos fill-7; e (III-8) A Figura 12 mostra os esquemas para a síntese dos compostos ÊIII-7Õ e ÊIII-8Õ.
Composto (III-7). Foi ativado Composto 75 Êll mg, 0,019 mmolõ em DMF Ê0,5 mlõ com HATU Ê6,83 mg, 0,018 mmolõ e DlEA Ê14,86 μΐ, 0,085 mmolõ. Foi então adicionado
Composto 69 Ê15,24 mg, 0,023 mmolõ. Após 10 min, a mistura de reação foi captada em DMSO e purificada por meio de cromatografia preparativa para proporcionar composto {III- 7) Ê12 mg, 9,71 pmol, rendimento de 51,4%Õ Êm™l, 1235,70.
Composto (III-8). Foi ativado Composto 75 Ê10 mg, 0,017 mmolõ em DMF Ê0,5 mlõ com HATU Ê6,21 mg, 0,016 mmolõ e DIEA Ê0,014 ml, 0,077 mmolõ. Foi então adicionado
Composto 23 Ê13,86 mg, 0,021 mmolõ. Após 10 min, a mistura de reação foi captada em DMSO e purificada por meio de cromatografia preparativa para proporcionar composto (III- 8) Ê13 mg, 10,52 pmol, rendimento de 61,2%Õ Êm™l, 1235,70. Exemplo 12 - Compostos (1-8) e (1-9)
Em princípio, os compostos (1-8) e (1-9) podem ser obtidos por meio de tratamento dos compostos (III-7) e (III-8), respetivamente, com a protease catepsina B, para a qual o dipéptido Val-Cit é um motivo de substrato. 0 Composto (III-7}, com o seu grupo orto-amino, pode ser submetido a mais impedimento estérico contra clivagem.
Exemplo 13 - Atividade Biológica de Compostos
As Figuras 13a e 13b mostram a atividade biológica dos compostos (1-4) e (1-2) da presente invenção contra células de cancro de pulmão H226 e células de cancro renal 786-0, respetivamente, utilizando um ensaio de luminescência de ATP. Como controlos, foram utilizados doxorrubicina e o análogo de tubulisina Composto A, que contém um grupo acetato em vez de um grupo carbamato na subunidade Tuv. 0 Composto A pode ser preparado de acordo com os ensinamentos de Cheng et al. 2011.
Contra células H226, os valores de EC50 foram: doxorrubicina, 115,4 nM; Composto A, 2,4 nM; e composto ÊI-4Õ, 12,1 nM. Contra células 786-0, os valores de EC50 foram: doxorrubicina, 68,9 nM; Composto A, 1,2 nM e composto ÊI-4Õ, 7,1 nM.
As Figuras 13c e 13d apresentam o tipo semelhante de dados para os compostos (1-5), (1-6) e (1-7). Os compostos comparativos foram doxorrubicina e tubulisina D. Os valores de EC50 contra células H226 foram: doxorrubicina, 115,4 nM; tubulisina D, 0,05 nM; composto ÊI-5Õ, 19,5 nM; composto ÊI-6Õ, 9,9 nM; e composto ÊI-7Õ, 15,4 nM. Contra células 786-0, os valores de EC5o foram: doxorrubicina, 68,9 nM; tubulisina D, 0,02 nM; composto ÊI-5Õ, 22,9 nM; composto ÊI-6Õ, 22,8 nM; e composto ÊI-7Õ, 12,5 nM.
Foram obtidas linhas de células tumorais da American Type Culture Collection ÊATCCÕ, PO Box 1549, Manassas, VA 20108, EUA, e cultivadas de acordo com as instruções da ATCC. As células foram cultivadas a 1,0 x 1Q3 célulasÁpoço em placas com 96 poços durante 3 horas para os ensaios de ATP. Foram adicionadas diluições em série 1:3 dos compostos aos poços. As placas foram deixadas incubar durante 24 a 72 h. Os níveis de ATP nas placas de ATP foram medidos . , , ® , utilizando o kit CELLTITER-GLO Luminescent. Cell Viability seguindo o manual do fabricante e lidos num luminómetro GLOMAX® 20Á20 Êambos da Promega, Madison, WI, EUAÕ. Os valores de EC50 - a concentração à qual um agente inibe ou reduz a proliferação celular em 50% - foram determinadas utilizando o software Prism™, versão 4.0 ÊGraphPad Software, La Jolla, CA, EUAÕ.
Exemplo 14 - Atividade in vitro de um conjugado A Figura 14 mostra a atividade in vitro do conjugado ÊII-1Õ, contra células de cancro gástrico N87 ÊAmerican Type Culture Collection ÊATCCÕ, P.0. Box 1549, Manassas, VA 20108, EUAÕ.
As células foram cultivadas a 1,0 x 104 célulasÁpoço em placas com 96 poços durante 3 horas para os ensaios de 3H timidina, respetivamente. Foram adicionadas diluições em série Ê1:3Õ de conjugado ÊII-1Õ aos poços. As placas foram deixadas incubar durante 120 horas. As placas receberam um pulso com 1,0 mCi de 3H-timidina por poço durante as últimas 24 h do período total de incubação, recolhidas e lidas num Top Count ÊPackard Instruments, Meriden, CTÕ, 0 valor de EC50 - a concentração à qual um agente inibe ou reduz a proliferação celular em 50% da inibição máxima -foi determinada utilizando o software Prism™, versão 4.0 ÊGraphPad Software, La Jolla, CA, EUAÕ como sendo de 0,2 nM.
Uma comparação dos valores de EC50 a partir das Figuras 13a-13d e Figura 14 ilustra dois pontos. 0 primeiro é a melhoria da potência associada à distribuição visada de uma citotoxina através de um conjugado e posteriormente o mecanismo de internalização ativo desencadeado pela ligação do componente de anticorpo do conjugado ao seu antigénio ÊSchrama et al. , 2006Õ. Em segundo lugar, as toxinas não conjugadas são compostos relativamente polares e, na ausência de um mecanismo de internalização ativo, têm dificuldade de difusão através de uma membrana celular, consequentemente resultando em maiores valores de EC50 Êmenor potênciaÕ medidos.
Exemplo 15 - Atividade in vivo de um conjugado
Neste exemplo, a atividade in vivo do conjugado ÊII-1Õ foi comparada contra a do Conjugado B ÊCheng et al. 2011Õ, que é estruturalmente idêntico ao conjugado ÊII-1Õ, exceto por ter um acetato na subunidade Tuv, em vez de um carbamato:
Cinco milhões de células de cancro ovárico 0VCAR3, ressuspensas em 0,1 ml de solução salina tamponada com fosfato Ê!!PBS'!Õ mais 0,1 ml de matrigel, foram implantadas subcutaneamente na região do flanco de ratinhos SCID. As medições do tumor começaram 28 dias depois, e os ratinhos foram divididos aleatoriamente em grupos de 7 ratinhos cada um com tamanhos médios do tumor de 60 mm3 estimados através de LWHÁ2 de tumores. 29 dias após a implantação do tumor, os ratinhos foram doseados por via intraperitoneal isoladamente com compostos de teste. A Figura 15 mostra que, contra xenoenxertos de 0VCAR3, o conjugado ÊII-1Õ suprimiu o crescimento tumoral mais eficazmente do que o conjugado B. A diferença é especialmente notável após 20 dias.
As Figuras 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b e 20 apresentam dados de eficácia in vivo adicionais para os conjugados desta invenção, gerados conforme o protocolo descrito acima, mutatis mutandis. A J?B ÒL CTU3T íâ jL S câ mostra os dados para volume tumoral de 0V-CAR3 Êcancro ováricoÕ contra o tempo para uma série de conjugados de composto ÊIII-1Õ com anticorpo anti-CD70 1F4 ou um anticorpo anti mesotelina 6A4. A legenda proporciona, por ordem, a DAR Êpor exemplo, "2,7"Õ e a dosagem em pmolÁkg Êpor exemplo, "0,1"Õ. Em cada caso, o modo de administração foi intraperitoneal, numa única dose ÊSDÕ, exceto para o ultimo conjunto de dados ÊfÕ, para o qual o conjugado foi administrado Q7Dx3. A Figura 16b mostra a variação de peso corporal para a mesma experiência. A preparação e caracterização do anticorpo monoclonal humano 6A4 são descritas em Terrett et al. 2012, cuja descrição é incorporada no presente documento por referência. As sequências de VH CDR1, CDR2 e CDR3 e VK CDR1, CDR2 e CDR3 para o anticorpo 6A4 são proporcionadas nas SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respetivamente. As sequências de região variável VH e VK do anticorpo 6A4 são proporcionadas nas SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8, respetivamente.
A preparação e caracterização do anticorpo monoclonal humano 1F4 são descritas em Coccia et al. 2010, cuja descrição é incorporada no presente documento por referência. As sequências de VH CDR1, CDR2 e C-DR3 e VK CDR1, CDR2 e CDR3 para o anticorpo 1F4 são proporcionadas nas SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:1Q, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO :14, respetivamente. As sequências de região variável VH e VK do anticorpo 1F4 são proporcionadas nas SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respetivamente.
As Figuras 17a e 17b apresentam os resultados para uma experiência semelhante, mas com conjugados de composto ÊIII-8Õ e um anticorpo anti mesotelina 6A4. Em cada caso, foi administrada uma única dose por via intraperitoneal. A eficácia de um conjugado de composto ÊIII-1Õ e um anticorpo anti mesotelina 6A4 contra tumores H226 Êcancro de pulmãoõ é apresentada nas Figuras 18a e 18b, com DAR e informação de dosagem encontradas novamente nas legendas. Em cada caso, o conjugado foi administrado por via intraperitoneal numa única dose.
As Figuras 19a e 19b apresentam os dados de H226 para um conjugado de composto ÊIII-8Õ e um anticorpo anti mesotelina 6A4. No primeiro conjunto de dados, Ê«Õ a administração foi uma única dose, enquanto para os dois últimos conjuntos de dados ÊYe ♦Õ o regime de administração foi Q7Dx3. A Figura 20 mostra os dados de eficácia para os conjugados de composto ÊIII-1Õ com um anticorpo anti mesotelina 6A4 ou anticorpo anti-CD70 1F4 contra tumores de cancro gástrico N87.
Os anticorpos, especialmente quando utilizados em conjugados, podem ter uma região constante natural ou uma modificada ÊmanipuladaÕ, concebida para reduzir ou eliminar funções efetoras tais como ADCC. Exemplos de tais regiões constantes de anticorpo modificadas são proporcionados pelos polipéptidos das SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26. A SEQ ID NO:25 é uma região constante do isótipo IgG4 modificada com determinadas substituições de aminoácidos. A SEQ ID NO:26 é uma região constante de IgGlÁIgG4 híbrida. Tanto na SEQ ID NO:25 como na SEQ ID NO:26, a presença da lisina C-terminal é opcional.
Exemplo 16 - Estudos de Estabilidade
Neste exemplo, foi comparada a estabilidade no soro de ratinho de Conjugado ÊII-1Õ e Conjugado B, com os seus respetivos grupos carbamato e acetato. 0 conjugado foi injetado em ratinhos numa dose de 0,1 mmolÁkg. No caso do conjugado ÊII-1Õ, a concentração de administração foi de 3,4 mgÁml e o conjugado tinha uma razão de substituição ÊSRÕ de 4,2. No caso do conjugado B, a concentração de administração foi de 1,2 mgÁml e a SR foi de 2,3. Foram tomados aproximadamente 100 ul de soro a partir de cada um dos três animais em cada ponto de tempo para análise.
Foram reunidas amostras de soro de diferentes animais, proporcionando 200 a 300 ul em cada ponto de tempo. 0 volume agrupado foi centrifugado para remover os sólidos e o sobrenadante foi utilizado para análise. 0 conjugado foi isolado a partir do soro através de captura de imunoafinidade utilizando um anticorpo monoclonal anti-idiotípico acoplado a microesferas de SEPHAROSE™. Após captura, o conjugado foi eluído através de exposição a baixo pH, seguido por neutralização com base de Tris. A citotoxina presente no conjugado foi libertada mediante adição de catepsina B ativada para clivar o ligando peptídico Cit-Val. Foi realizada digestão com catepsina B a 37 °C durante 3 h, seguido pela adição de 1 volume de metanol frio. A citotoxina extraída com solvente foi analisada através de LC-MS utilizando um MS ESI-TOF em linha com um UPLC com cromatografia de fase reversa ÊAcquity HSS T3 2,1 x 50 mmõ.
Para o conjugado ÊII-1Õ, a presença do composto de hidroxilo a partir da hidrólise do grupo carbamato não foi detetada em nenhum momento, através de pontos de tempo até 240 horas. Somente foi detetado o composto de carbamato.
Inversamente, para o conjugado B, o produto de hidrólise foi detetável após 6 horas e cerca de 50 por cento de hidrólise ocoreu em 72 h. 0 Quadro 2 abaixo mostra as quantidades relativas dos compostos de etilo e hidroxilo com base em intensidades do espetro de massa para os respetivos iões duplamente carregados ÊM[H2™] 372,2 Da e 351,2 DaÕ:
Estes resultados mostram que embora a substituição do grupo acetato na subunidade Tuv leve a um composto muito mais estável, contudo, este ainda retém atividade biológica substancial.
Exemplo 17 - Compostos 72a, 72b e 72c
Este exemplo divulga a preparação e propriedades de compostos da presente invenção tendo variações estruturais no grupo carbamato. É feita referência à Figura 21 para o esquema sintético.
Composto 70a. Foi adicionada amónia em MeOH Ê2M, 0,089 ml, 0,178mmolÕ ao composto 7 Ê0,i g, 0,148 mmolÕ em MeOH Ê2 mlõ. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de MeOH a 0-15% em DCM para proporcionar 55 mg de composto 7 0a como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 554,3 ÊM™1Õ.
Composto 71a. Foi adicionado LiOH Ê4,41 mg, 0,184 mmolÕ em água Ê0,5mlÕ a uma solução de composto 70a Ê51 mg, 0,092 mmolÕ em THF Ê1 mlõ à TA, Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 2 h, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de MeOH a 0-30% em DCM para proporcionar 47 mg de composto 71a como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 540,3 ÊM™1Õ.
Composto 72a. Foi adicionado DIEA Ê6,45 μΐ, 0,037 mmolÕ a uma solução de composto 71a Ê20 mg, 0,037 mmolÕ e HATU Ê14,Q9mg, 0,037 mmolÕ em DMF Ê0,5 mlõ. 0 pH da mistura de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, foi adicionado composto 23 Ê24,9 mg, 0,037 mmolÕ em DMF Ê1 mlõ e DIEA Ê6,45 μΐ, 0,037 mmolÕ. 0 pH da solução de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante outros 20 min, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. A reação foi extinta por meio da adição de 10 ml de uma mistura a 1:1 ÊvÁvÕ de água contendo TFA a 0,1% e acetonitrilo contendo TFA a 0,1%. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar 35,2 mg de composto 72a como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 1193,6 ÊM™1Õ. 0 Composto 72a é também referido acima no presente documento como composto ÊIII-9Õ.
Um conjugado de composto 72a e anticorpo anti-CD70 1F4 teve uma EC50 de 0,19 nM contra células de cancro renal 786-0. Um conjugado de composto 72a e um anticorpo anti mesotelina 6A4 tiveram uma EC50 de 0,16 nM contra células de cancro gástrico N87. Em ambos os casos, foi utilizado um ensaio de incorporação de 3H-timidina.
Composto 70b. Uma solução de composto 7 Ê0,1 g, 0,148mmolÕ e anilina Ê0,041 ml, 0,444 mmolÕ em DMF Ê!,8 mlÕ foi aquecida a 50°C durante a noite. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de MeOH a 0-15% em DCM para proporcionar 58 mg de composto 5 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 630,4 ÊM™1Õ.
Composto 71b. Foi adicionado LiOH Ê4,03 mg, 0,168 mmolÕ em água Ê0,5mlÕ a uma solução de composto 70b Ê53 mg, 0,084mmolÕ em THF Ê1 mlÕ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 2 h, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de MeOH a 0-30% em DCM para proporcionar 4 3 mg de composto 71b como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 616,3 ÊM™1Õ.
Composto 72b. Foi adicionado DIEA Ê5,66 μΐ, 0,032 mmolÕ a uma solução de composto 71b Ê20 mg, 0,032 mmolÕ e HATU Ê12,35mg, 0,032 mmolÕ em DMF Ê0,5 mlÕ, 0 pH da mistura de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, foi adicionado composto 23 Ê21,82 mg, 0,032 mmolÕ em DMF Ê1 mlÕ e DIEA Ê5,66 μΐ, 0,032 mmolÕ. 0 pH da solução de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante outros 20 min, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. A reação foi extinta por meio da adição de 10 ml de uma mistura a 1:1 ÊvÁvÕ de água contendo TFA a 0,1% e acetonitrilo contendo TFA a 0,1%. O produto em bruto foi purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar 35 mg de composto 72b como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 1269,7 ÊM™1Õ. O Composto 72b é também referido no presente documento acima como composto ÊIII-10Õ.
Um conjugado de composto 72b e anticorpo anti-CD70 1F4 teve uma ECS0 de 0,58 nM contra células de cancro renal 786-0. Um conjugado de composto 72b e um anticorpo anti mesotelina 6A4 teve uma EC50 de 0,47 contra células de cancro gástrico N87. Em ambos os casos, foi utilizado um ensaio de incorporação de 3H timidina.
Composto 70c. Foi adicionada dimetilamina em DMF Ê1 ml, 0,148 mmolÕ gota a gota a uma solução de composto 7 Ê0,1 g, 0,148mmolÕ em DMF Ê1 mlÕ à TA, até a reação terminar. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de MeOH a 0-15% em DCM para proporcionar 56 mg de composto 7 0c como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 582,3 ÊM™1Õ.
Composto 71c. Foi adicionado LiOH Ê8,23 mg, 0,344 mmolÕ em água Ê0,5mlÕ a uma solução de composto 70c Ê0,1 g, 0,172mmolÕ em THF Ê1 mlÕ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 2 h, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de MeOH a 0-30% em DCM para proporcionar 50,8 mg de composto 71c como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 568,3 ÊM™1Õ,
Composto 72c. Foi adicionado Dl EA Ê6,14 μΐ, 0,03 5 mmolÕ a uma solução de composto 71c Ê20 mg, 0,035 mmolÕ e HATU Ê13,39mg, 0,035 mmolÕ em DMF ÊG,5 mlÕ. 0 pH da mistura de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, foram adicionados composto 23 Ê23,67 mg, 0,035 mmolÕ em DMF Ê1 mlÕ e DlEA Ê6,14 μΐ, 0,035 mmolÕ. 0 pH da solução de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante mais 20 min, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. A reação foi extinta por meio da adição de 10 ml de uma mistura a 1:1 ÊvÁvÕ de água contendo TFA a 0,1% e acetonitrilo contendo TFA a 0,1%. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar 23,8 mg de composto 72c como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 1221,6 ÊM™1Õ. 0 Composto 72c é também referido acima no presente documento como composto ÊIII-11Õ.
Um conjugado de composto 72c e anticorpo anti-CD70 1F4 teve uma EC50 de 0,32 nM contra células de cancro renal 786-O. Um conjugado de composto 72c e anticorpo anti mesotelina 6A4 teve uma ECSo de 0,34 nM contra células de cancro gástrico N87. Em ambos os casos, foi utilizado um ensaio de incorporação de 3H timidina.
Exemplo 18 - Compostos 75a, 75b e 75c
Este exemplo divulga a preparação dos análogos de tubulisina do exemplo anterior, mas sem as frações de ligando unidas. É feita referência à Figura 22 para o esquema sintético.
Composto 73. Foi adicionado LiOH Ê0,071 g, 2,97 mmolÕ em água Ê5 mlõ a uma solução de composto 18 Ê0,25 g, 0,743 mmolÕ em THF Ê5 mlõ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 2 h, o solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de MeOH a 0-20% em DCM para proporcionar 0,22 g de composto 73 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 223,3 ÊM™l-BocÕ,
Composto 74. Uma mistura de composto 73 Ê0,2 g, 0,620mmolÕ e HC1 a 4N em 1,4-dioxano Ê4 ml, 0,620 mmolÕ foi agitada à TA durante 1 h. 0 solvente foi evaporado. 0 sólido branco do composto 74 foi lavado com hexanos duas vezes. MS: Ê™Õ mÁz 223,3 ÊM™1Õ.
Composto 75a. Foi adicionado DIEA Ê3,23 μΐ, 0,019 mmolÕ a uma solução de composto 71a Ê10 mg, 0,019 mmolÕ e HATU Ê7,05mg, 0,019 mmolõ em DMF Ê0,5 mlõ, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, foram adicionados DlEA Ê3,23 μΐ, 0,019 mmolõ e composto 74 Ê5,35 mg, 0,024 mmolõ em DMF Ê0,5 mlõ, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 1 h, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. A reação foi extinta por meio da adição de 10ml de uma mistura a 1:1 ÊvÁvÕ de acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar 6,0 mg de composto 75a como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 744,4 ÊM™1Õ. 0 Composto 75a é também referido acima no presente documento como composto ÊI-1QÕ. 0 Composto 75a teve uma EC50 de 75,8 nM contra células de cancro gástrico N87, utilizando um ensaio de luminescência de ATP.
Composto 75b. Foi adicionado DIEA Ê2,83 μΐ, 0,016 mmolõ a uma solução de composto 71b Ê10 mg, 0,016 mmolõ e HATH Ê6,17 mg, 0,016 mmolõ em DMF Ê0,5 mlõ, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, foram adicionados DIEA Ê2,83 μΐ, 0,016 mmolõ e composto 74 Ê4,69 mg, 0,021 mmolõ em DMF ÊQ,5 mlõ, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 1 h, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. A reação foi extinta por meio da adição de 10 ml de uma mistura a 1:1 ÊvÁvÕ de acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar 7,6 mg de composto 75b como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 820,4 ÊM™1Õ. 0 Composto 75b é também dito acima no presente documento como composto EI-110. 0 Composto 75b teve uma ECSo de 0,39 nM contra células de cancro gástrico N87, utilizando um ensaio de luminescência de ATP,
Composto 75c. Foi adicionado DIEA Ê3,07 μΐ, 0,018 mmolõ a uma solução de composto 71c Ê10 mg, 0,018 mmolõ e HATH Ê6,70 mg, 0,018 mmolõ em DMF Ê0,5 mlõ, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, foram adicionados DIEA Ê3,07 μΐ, 0,018 mmolõ e composto 74 Ê5,09 mg, 0,023 mmolõ em DMF ÊQ,5 mlõ, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 1 h, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. A reação foi extinta por meio da adição de 10 ml de uma mistura a 1:1 ÊvÁvÕ de acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar 7,6 mg de composto 75c como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 772,5 ÊM™!Õ. 0 Composto 75c é também dito acima no presente documento como composto ÊI-12Õ. 0 Composto 75c teve uma EC50 de 5,4 nM contra células de cancro gástrico N87, utilizando um ensaio de luminescência de ATP.
Exemplo 19 - Composto 80
Este exemplo descreve a síntese de um composto 80 adequado para conjugação por meio de química "click", tendo um grupo ciclooctino que pode reagir com um grupo azida numa molécula parceira. 0 esquema sintético correspondente é mostrado na Figura 23.
Composto 77. DCC Ê22,40 mg, 0,109 mmolõ foi adicionado a uma solução de DBCQ-PEG4-13 eido 76 Ê50 mg, 0,090 mrnol, adquirido da Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZÕ e N-hidroxissuccinimida ÊNHS, 20,83 mg, 0,181 mmolõ em DCM Ê1 mlõ à TA. A mistura de reação foi agitada à TA durante a noite. 0 sólido foi filtrado e o filtrado concentrado para proporcionar composto 77, MS: Ê™Õ mÁz 650,3 ÊM™1Õ.
Composto 78. Foi adicionado DIEA a uma solução de composto 77 Ê58,8 mg, 0,091 mmolõ e composto 21 Ê57,6 mg, 0,100 mmolõ em DMF Ê1 mlõ à TA, ajustando o pH a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 1 h, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar 20 mg de composto 78 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 1113,6 ÊM™1Õ.
Composto 79. Foi adicionado TFA Ê0,5 ml, 6,53 mmolÕ a uma mistura de composto 78 Ê17,2 mg, 0,015 mmolÕ em DCM Ê1 mlõ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 1 h, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado para proporcionar composto 79, MS: Ê™Õ mÁz 1013,5 ÊM™1Õ.
Composto 80. Foi adicionado DIEA Ê2,96 μΐ, 0,017 mmolÕ a uma solução de composto 9 Ê8,55 mg, 0,015 mmolÕ e HATH Ê5,87 mg, 0,015 mmolÕ em DMF Ê0,4 mlõ. 0 pH da mistura de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, foram adicionados composto 79 Ê15,65 mg, 0,015 mmolÕ em DMF Ê1 mlõ e DIEA Ê2,96 μΐ, 0,017 mmolÕ. 0 pH da mistura de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante outros 20 min, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi novamente dissolvido em 1 ml de DMSO e purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar composto 80 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 775,0 ÊMÁ2™1Õ. 0 Composto 80 é também referido acima no presente documento como composto ÊIII-12Õ.
Um conjugado do composto 80 e sete variantes de anticorpo anti glipicano 3 4A6 modificados para ter um grupo azida em vários locais exibiram ECS0s de 1,4, 0,17, 0,13, 0,22, 0,14, 0,064 e 0,25 nM contra células de cancro gástrico N87, utilizando um ensaio de incorporação de ‘Ή timidina. A preparação e caracterização de anticorpo 4A6 são descritas em Terrette et al. 2010, cuja descrição é incorporada no presente documento por referência. As sequências de VH CDR1, CDR2 e CDR3 e VK CDR1, CDR2 e CDR3 para o anticorpo 4A6 são proporcionadas nas SEQ ID NO: 17, SEQ ID MO: 18, SEQ ID N0:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO :22, respetivamente. As sequências de região variável VH e VK são proporcionadas nas SEQ ID NO :23 e SEQ ID NO :24, respetivamente.
Numa forma de realização, esta invenção proporciona um conjugado de composto 80 e um polipéptido, preferentemente um anticorpo, modificado para incluir um grupo azida. Exemplo 20 - Composto 88
Este exemplo divulga a síntese de composto 88, que tem uma funcionalidade alquilamina primária que pode ser utilizada para conjugação. É feita referência ao esquema sintético da Figura 24.
Composto 82. Uma mistura de l-amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de terc-butilo 54 Ê0,285 g, 0,888 mmol, adquirido da VWR; veja-se também o Exemplo 8Õ e 6-ÊÊÊÊ9H-fluoren-9 -ilõmetoxiõcarbonilõaminoõhexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo 81 Ê0,4 g, 0,888 mmol, adquirido da Chem-ImpexÕ em DMF Ê3 mlõ foi agitada à TA durante 2 h. 0 solvente foi evaporado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de MeOH a 0-10% em DCM para proporcionar 0,4 g de composto 82 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mAz 657,4 ÊM™1Õ.
Composto 83. Uma mistura de composto 82 Ê0,258 g, 0,3 93mmolÕ em TFA Ê2 ml, 0,3 93 mmolÕ foi agitada à TA durante 1 h. 0 solvente foi evaporado. 0 Composto 83 Êsólido brancoõ foi lavado duas vezes com hexanos e utilizado na seguinte etapa de reação sem purificação adicional.
Composto 84. DCC Ê0,162 g, 0,786 mmolÕ foi adicionado a uma mistura de composto 83 Ê0,236 g, 0,393 mmolÕ e NHS Ê0,G90 g, 0,786 mmolÕ em DCM Ê5 mlõ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante a noite, o sólido foi filtrado e o filtrado concentrado. 0 produto em bruto foi purificado por meio de cromatografia flash eluindo a partir de gel de sílica com um gradiente de EtOAc a 0-100% em hexanos para proporcionar 0,195 g de composto 84 como um óleo incolor. MS: Ê™Õ mÁz 698,3 ÊM™1Õ.
Composto 85. Foi adicionado DIEA a uma solução de composto 21 Ê0,162 g, 0,279 mmolÕ e composto 84 Ê0,195 g, 0,279 mmolÕ em DMF Êl,5 mlõ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 1 h, a reação foi extinta por meio da adição de 6 ml de uma mistura a 1:1 de acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar 0,292 g de composto 85 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 1161,6 ÊM™1Õ.
Composto 86. Foi adicionado TFA Ê0,5 mlõ a uma mistura de composto 85 Ê22,l mg, 0,019 mmolÕ em DCM Ê1 mlõ à TA. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 20 min, o solvente foi evaporado para proporcionar composto 86, MS: Ê™Õ mÁz 1061,6 ÊM™1Õ.
Composto 87. Foi adicionado DIEA a uma solução de composto 9 Ê10,53 mg, 0,019 mmolÕ e HATU Ê7,23 mg, 0,019 mmolÕ em DMF Ê0,4 mlõ. 0 pH da mistura de reação foi ajustado a 8-9, Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, foram adicionados composto 86 Ê20,19 mg, 0,019 mmolÕ em DMF Ê1 mlõ e DIEA. 0 pH da solução de reação foi ajustado a 8-9. Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 10 min, LCMS mostrou que a reação tinha terminado. A reação foi extinta por meio da adição de 10 ml de uma mistura a 1:1 ÊvÁvÕ de água ÊTFA a 0,1%Õ e acetonitrilo. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar 27,3 mg de composto 87 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 799,1 ÊMÁ2™1Õ.
Composto 88. Foi adicionada piperidina a uma solução de composto 87 Ê27,3mg, 0,017 mmolÕ em DMF Ê2 mlõ à TA, ajustando o pH a 9-10, Após a mistura de reação ser agitada à TA durante 1 h, a reação foi extinta por meio da adição de 6 ml de uma mistura a 1:1 de acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%. 0 produto em bruto foi purificado por meio de HPLC preparativa para proporcionar 22,5 mg de composto 88 como um sólido branco. MS: Ê™Õ mÁz 688,1 ÊMA2™1Õ. 0 Composto 88 ê também referido acima no presente documento como composto ÊIII-13Õ.
Numa forma de realização, é proporcionado um conjugado no qual o composto 88 é conjugado a um polipéptido, que é preferentemente um anticorpo, por meio de formação de amida entre a alqui lamina primária do composto 88 e um grupo carboxilo num resíduo de cadeia lateral de um aminoácido -preferentemente ácido glutâmico - no polipéptido. A presente invenção também proporciona um método de produção de um tal conjugado compreendendo a combinação do composto 88 e do polipéptido na presença da enzima transglutaminase. REFERÊNCIAS
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LISTA DE SEQUÊNCIAS É incorporada no presente documento por referência na sua totalidade uma Lista de Sequências denominada "SEQT_12026WOPCT.txt" compreendendo as SEQ ID NO: la SEQ ID NO: 26, que incluem as sequências de ácido nucleico eÁou aminoãcidos divulgadas no presente documento. A Lista de
Sequências foi depositada em anexo em formato de texto ASCII através de EFS-Web, e consequentemente constitui tanto a forma legível em papel como legível em computador da mesma. A Listagem de Sequências foi criada pela primeira vez utilizando Patentln 3.5 a 4 de Janeiro de 2014 e tem aproximadamente 15 KB de tamanho. 0 seguinte Quadro 3 resume as descrições das seguências descritas no presente pedido.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Bristol-Myers Squibb Company
< 12 0 > COMPOSTOS DE TUBULISINA, MÉTODOS DE PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO
<13 0 > 12026-WO-PCT <150> US 61Ã764825 <151> 14-02-2013 <16 0 > 2 6 <170> Patentln versão 3.5
<210> 1 <211>5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 lie Tyr Gly Met His 1 5
<210>2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>2
Val Leu Trp Tyr Asp Gly Ser His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly
<210>3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
Asp Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Leu Asp Tyr 15 10
<210>4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<21G>5 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5
<210>6 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Gin Gin Ara Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5
<210>7 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>7
Gin Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly lie Thr Phe Arg lie Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val Leu Trp Tyr Asp Gly Ser His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Leu Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210>8 < 211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Glw lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 IQ 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 35
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105
<210>9 <211>5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>9 lie Tyr Ala Met Ser 1 5
<210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Ala He Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val Arg 1 5 10 15
Gly
<210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11
Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr 15 10
<210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 12
Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<210> 13 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 14 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr 1 5
< 210 > 15 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser
65 70 75 SO
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105
< 210 > 17 <211>5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17
Ser Tyr Trp lie Ala 1 5
<210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 lie He Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 15 10 15
Gly
< 210 > 19 <211>8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19
Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 20 <211> 12
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20
Ang Ala Val Gin Sen val Sen Sen Sen Tyn Leu Ala 15 10
<210>21 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21
Gly Ala Sen Sen Ang Ala Thn 1 5
<210> 22 <211>8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22
Gin Gin Tyn Gly Sen Sen Pno Thn 1 5
<210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <4QG> 23
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val lys Lys Pro Gly Gin 1 5 10 15
Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Sex Gly Tyr Sex Phe Thx Sex Tyr 20 25 30
Trp lie Ala Trp Val Axg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly lie lie Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Arg Ser lie Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Vai Gin Ser Vai Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 S0
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 * 105
<210> 25 <211> 327 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Região Constante de Anticorpo Modificado <400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110
Glu Ala Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125
Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140
Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205
Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325
<210> 26 <211> 330 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Região Constante de Anticorpo Modificado <400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr lie Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 95
Arg Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Asp Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175
Glu Gin Phe Asn Ser rhr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Gly Leu Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arq Trp Gin Glu Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 330
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • EP 2292639 A [0009] • WO 2001069116 A [0009] • US 20090074660 AI, Korman [0064] • US 8097703 B2, Rao-Naik [0064] • US 20100143368 AI, King [0064] • US 7387776 B2, Keler [0064] • US 8124738 B2, Terrett [0064] • US 6984720 BI, Korman [0064] • US 8008449 B2, Korman [0064] • US 20090297438 AI, Huang [0064] • US 7875278 B2, Cardarelli [0064] • US 20100034826 AI, Terrett [0064] • US 20100209432 AI, Terrett [0064] [0292] • US 7335748 B2, Harkins [0064] • US 8268970 B2, Terrett [0064] [0292] • US 20100092484 AI, Xu [0064] • US 7521541 B2, Eigenbrot [0071] • US 4698420 A, Urnovitz [0071] • US 7311902 B2, Bam [0071] • WO 2009026274 AI, Liu [0071] • US 4631190 A, Shen [0077] • US 5144011 A, Shen [0077] • US 7541530 B2, Santi [0078] • US 6989452 B2, Ng [0078] [0094] • WO 2002096910 AI, Ng [0078] • US 7691962 B2, Boyd [0078] [0092] [0094] [0292] • US 20100145036 AI, Sufi [0078] [0094] • US 20100113476 A1, Chen [0084] [0094] • WO 8101145 A, Carl [0092] • US 6214345 B1, Firestone [0092] • US 20080279868 A1, Boyd [0092] [0094] [0292] • WO 2008083312 A2, Sufi [0092] • US 7375078 B2, Feng [0092] • US 20030096743 A1, Senter [0092] • US 7087600 B2, Ng [0094] • US 7129261 B2, Ng [0094] • WO 02096910 Al, Ng [0094] • US 7517903 B2, Chen [0094] • US 7714016 B2, Gangwar [0094] • US 7847105 B2, Gangwar [0094] • US 7968586 B2, Gangwar [0094] • WO 2008030612 A2, Tian [0102] • US 20100093024 Al, Goerke [0102] • WO 2010087994 A2, Ploegh [0104] • WO 2005051976 A2, Mao [0104] • US 5399163 A [0127] • US 5383851 A [0127] • US 5312335 A [0127] • US 5064413 A [0127] • US 4941880 A [0127] • US 4790824 A [0127] • US 4596556 A [0127] • US 4487603 A [0127] • US 4486194 A [0127] • US 4447233 A [0127] • US 4447224 A [0127] • US 4439196 A [0127] • US 4475196 A [0127] • US 4522811 A [0128] • US 5374548 A [0128] • US 5416016 A [0128] • US 5399331 A [0128] • US 4894386 A [0214] • WO 9721712 A, Abe [0292] • US 20110245295 A1, Chai [0292] • US 20110027274 A1, Cheng [0292] • US 20100150950 A, Coccia [0292] • US 20080176958 A1, Davis [0292] • DE 102004030227 A1, Domling [0292] • US 20050239713 A1, Domling [0292] • US 20050249740 A1, Domling [0292] • US 8476451 B2, Ellman [0292] • DE 10008089 A1, Hoefle [0292] • US 20060128754 A1, Hoefle [0292] • US 20060217360 A1, Hoefle [0292] • US 20130224228 A1, Jackson [0292] • US 20100323973 A1, Leamon [0292] • US 20020169125 A1, Leung [0292] • US 20100324008 A1, Low [0292] • WO 9813375 A1, Reichenbach [0292] • US 20120129779 A1, Richter [0292] • US 20120252738 A1, Richter [0292] • US 20120252739 A1, Richter [0292] • US 20080248052 A1, Vlahov [0292] • US 20100240701 A1, Vlahov [0292] • US 20100048490 A1, Vlahov [0292] • US 20100047841 A1, Wipf [0292] • US 8580820 B2, Zanda [0292] • US 61764825 B [0295]
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Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Um composto tendo uma estrutura representada pela fórmula ÊIÕ
(I) em que: R1 é H, C1-C10 alquilo não substituído ou substituído, C2-C;[ o alquenilo não substituído ou substituído, C2-Ci0 alquinilo não substituído ou substituído, arilo não substituído ou substituído, heteroarilo não substituído ou substituído, ÊCH2Õi-2OÊCi-C;lo alquiloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi-2OÊC2-Cio alqueniloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi_2OÊC2-Cio alquiniloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õ1_2OCÊ=OÕÊC1-C10 alquiloÕ, ÊCH2Õi_ 2OCÊ=OÕÊC2-Cio alqueniloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi_2OCÊ=OÕÊC2 - Cio alquiniloÕ não substituído ou substituído, CÊ=OÕÊCi-Cio alquiloÕ não substituído ou substituído, CÊ=OÕÊC2-C;L0 alqueniloÕ não substituído ou substituído, CÊ=OÕÊC2-Cio alquiniloÕ não substituído ou substituído, cicloalifático não substituído ou substituído, heterocicloalifãtico não substituído ou substituído, arilalquilo não substituído ou substituído ou alquilarilo não substituído ou substituído; R2 é H, C1-C10 alquilo não substituído ou substituído, C2-C10 alquenilo não substituído ou substituído, C2-Ci0 alquinilo não substituído ou substituído, arilo não substituído ou substituído, heteroarilo não substituído ou substituído, ÊCH2Õi-2OÊCi-Cio alquiloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi-2OÊC2-C10 alqueniloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi-2OÊC2-C10 alquiniloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi-2OCÊ=OÕÊCi-C10 alquiloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi-2OCÊ=OÕÊC2-Cio alqueniloÕ não substituído ou substituído, ÊCH2Õi„ 2OCÊ=OÕÊC2”Cio alquiniloÕ não substituído ou substituído, CÊ=OÕêCi.-C].o alquiloÕ não substituído ou substituído, CÊ=OÕÊC2-C10 alqueniloÕ não substituído ou substituído, CÊ=OÕÊC2-Cio alquiniloÕ não substituído ou substituído, cicloalifático não substituído ou substituído, heterocicloalifático não substituído ou substituído, arilalquilo não substituído ou substituído ou alquilarilo não substituído ou substituído:
. s em que cada R2a é independentemente H, NH2, NHMe, Cl, F, Me, Et ou CN; R3a e R3b são independentemente H, Ci-C5 alquilo, CH2EC5-C5 cicloalquiloÕ, CH2C6H5, C5H5 ou CH2CH2OH; R4 é ou
em que R4a é H ou Ci-C3 alquilo; e Y é H, OH, Cl, F, CN, Me, Et, N02 ou NH2 ; R5 é H, C1-C5 alquilo, C2-C5 alquenilo, C2-C5 alquinilo, COÊC1-C5 alquiloÕ, COÊC2-C5 alqueniloÕ ou COÊC2-C5 alquiniloO; W é 0 ou S; e n é Ο, 1 ou 2; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Um composto de acordo com a reivindicação 1, tendo uma estrutura representada pela fórmula ÊlaÕ
(Ia) s em que Y é H ou N02; R4a é H, Me ou Et; e R3a e R3b são independentemente H, Me ou Et.
3. Um composto de acordo com a reivindicação 1, tendo uma estrutura representada pela fórmula ÊlbÕ:
(íh) onde R4a é H, Me ou Et; R3a e R3b são independentemente H, Me e Et; e R6 é C]-C5 alquilo, CH2OCÊ=OÕC:L-C5 alquilo ou ÊCHsCh-sCsHs .
4. Um composto de acordo com a reivindicação 3, tendo uma estrutura representada pela fórmula ÊIb'Õ:
(Ib‘) onde R4a é H, Me, ou Et e R6 é Me ou n-Pr.
5. Um conjugado compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 1 ligado covalentemente a uma fração de direcionamento que liga especificamente ou preferentemente a um antigénio associado a tumor.
6. Um conjugado de acordo com a reivindicação 5, tendo uma estrutura representada pela fórmula ÊII-1'Õ:
onde Rs é Me ou n-Pr e Ab é um anticorpo que é preferentemente um anticorpo anti-CD70, anti mesotelina ou anti glipicano 3.
7. Um conjugado de acordo com a reivindicação 5, tendo uma estrutura representada pela fórmula ÊIIÕ [DÊXDÕaCÊXzÕb] mZ ÊIIÕ em que Z é uma fração de direcionamento que é, preferentemente, um anticorpo; XD é uma primeira fração espaçadora; Xz é uma segunda fração espaçadora; C é um grupo clivãvel; os subscritos a e b são independentemente 0 ou 1; o subscrito m é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; e D é de acordo com a fórmula ÊD-aÕ (D-a) ou a fórmula ÊD-bÕ:
(D-b) em que Y é H ou N02; R4a é H, Me ou Et; R3a e R3C são independentemente H, Me ou Et; e R6 é Ci-C5 alquilo, CH2OCÊ=OÕCi-C5 alquilo ou ÊCH2Õi_2C6H5 ; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
8. Um composto de fármaco-ligando tendo uma estrutura de acordo com a formula ÊIIIÕ D - ÊXDÕaCÊXzÕb - R31 ÊIIIÕ em que R3i é um grupo funcional reativo; XD é uma primeira fração espaçadora; Xz é uma segunda fração espaçadora; C é um grupo clivável; os subscritos a e b são independentemente 0 ou 1; o subscrito mél, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; e D é de acordo com a fórmula ÊD-aÕ (D-a) ou a fórmula ÊD-bÕ
(D-b) em que Y é H ou N02; R4a é H, Me ou Et; e R3a e R30 são independentemente H, Me ou Et; e Rs é C;L-C5 alquilo, CH2OCÊ=OÕCi-C5 alquilo ou ÊCH2Õi-2C6H5; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
9. Um composto de fármaco-ligando de acordo com a reivindicação 8, tendo uma estrutura representada pela fórmula ÊlII-aÕ:
onde R3a e R3b são independentemente H, Me ou Et; R6 é Me, Et ou n-Pr; AAa e cada ΆΑ° são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em alanina, β-alanina, ácido γ-aminobutírico, arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido γ-carboxiglutâmico, citrulina, cisterna, ácido glutãmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, norleucina, norvalina, orni t ina, f enilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; p é 1, 2, 3 ou 4; qél, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; r é 1, 2, 3, 4 ou 5; s é 0 ou 1; e R31 é selecionado a partir do grupo consistindo em
10. Um composto de fármaco-ligando de acordo com a reivindicação 8, tendo uma estrutura representada pela fórmula ÊlII-bÕ:
onde R6 é Me ou n-Pr; qél, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 OU 10; r é 1, 2, 3, 4 ou 5; s é 0 ou 1; e R3i é selecionado a partir do grupo consistindo em
11. Um composto conforme definido na reivindicação 1 com uma fração de direcionamento, para utilização no tratamento de um cancro num indivíduo sofrendo de tal cancro.
12. 0 composto para a utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o composto é conjugado com uma fração de direcionamento que é um anticorpo que liga a um antigénio que é superexpresso ou unicamente expresso pelo cancro.
13. 0 composto para a utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o cancro é selecionado a partir do grupo consistindo em cancro renal, pulmonar, gástrico, e ovãrico.
14. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 1, ou um conjugado do mesmo com uma fração de direcionamento, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, em que o composto de acordo com a reivindicação 1 ê conjugado com uma fração de direcionamento que é um anticorpo.
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