PT2616471E - Inibidores da notum pectinacetilesterase e métodos para a sua utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"INIBIDORES DA NOTUM PECTINACETILESTERASE E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO"

1. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a pequenas moléculas inibidoras da Notum Pectinacetilesterase, composições que as compreendem, e métodos para a sua utilização.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A saúde óssea depende das atividades coordenadas dos osteoblastos formadores de osso e dos osteoclastos reabsorvedores de osso. "A renovação óssea reflete um equilíbrio entre estas funções celulares anabólicas e catabólicas, e assegura que o esqueleto maduro possa tanto autorregenerar-se quando danificado, como manter a sua função endócrina por libertação de minerais, tais como cálcio e fósforo, para a circulação." Allen, J.G. et al. , J. Med. Chem. , 53 (10 de junho, 2010), pp. 4332 - 4353, 4332. Muitos estados de doença alteram este equilíbrio, resultando numa massa óssea aumentada ou diminuída, ou em alterações na qualidade do osso. A perda gradual da densidade mineral do osso é conhecida como osteopenia; a perda grave de osso é conhecida como osteoporose. Id. O atual padrão de cuidados para o tratamento e prevenção da osteoporose utiliza a classe dos bisfosfonatos orais de pequenas moléculas antirreabsorção. Id. a 4333. O ácido zoledrónico, raloxifeno, cálcio, e suplementos de vitamina D são também tipicamente utilizados no tratamento da osteoporose. Id. Embora os agentes antirreabsorção possam ajudar a prevenir a perda óssea, os agentes anabólicos "são capazes de aumentar a massa óssea num maior grau... e apresentam também a capacidade para melhorar a qualidade do osso e aumentar a sua resistência." Guo, H., et al., J. Med. Chem., 53 (25 de fevereiro de 2010), pp. 1819 - 1829, 1819.

Nos Estados Unidos, a PTH humana é o único agente anabólico aprovado pela FDA. Id.; Allen a 4333. "Devido à escassez de agentes anabólicos para o tratamento da osteoporose, há uma necessidade urgente de desenvolver compostos de pequenas moléculas para tratar esta doença, que não sejam tóxicos, apresentem uma boa relação custo-benefleio, e sejam fáceis de administrar." Guo, a 1819. "Embora o desenvolvimento de agentes farmacológicos que estimulem a formação óssea esteja menos avançada do que as terapias de antirreabsorção, são conhecidas várias vias que facilitam a função do osteoblasto." Allen a 4338. Estas vias incluem proteínas morfogénicas do osso, o fator de transformação de crescimento, a hormona paratiroide, o fator de crescimento tipo insulina, o fator de crescimento de fibroblastos, e a sinalização do local de integração MMTV tipo wingless (WNT). Id. Guo e colaboradores publicaram recentemente resultados sobre a primeira destas vias. Guo, supra. Em particular, referiram que certos compostos substituídos com benzotiofeno e benzofurano melhoram a expressão da proteína morfogénica 2 do osso em murganhos e ratos. Foi reportado que dois dos compostos estimulam a formação óssea e o restabelecimento da conectividade trabecular in vivo. Id. a 1819.

Outra destas vias é a via WNT, que está implicada numa variedade de processos de desenvolvimento e regeneração. Allen a 4340. No entanto, esta via é complexa, está pouco clarificada e não se sabe como os seus componentes afetam o osso. Por exemplo, foi sugerido que o LRP-5, cujas mutações estão associadas com o aumento da massa óssea em humanos, e a -catenina, através da qual ocorre a sinalização canónica da WNT, "podem não estar associados diretamente via sinalização WNT ao controlo de massa óssea." Id.

Uma análise recente de dados de expressão de genes levou à identificação de novos alvos de sinalização WNT. Ver, e.g., Torisu, Y., et ai., Cancer Sei., 99(6): 1139-1146, 1143 (2008) . Um destes alvos é a Notum Pectinacetilesterase, também conhecida como NOTUM e LOC174111.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção abrange compostos da fórmula:

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: X é ORib ou N (Rib) 2; cada Rib é independentemente hidrogénio ou opcionalmente substituídos alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo; R2 é hidrogénio, halo, -CO2R2A, -C (O) N (R2a) 2, -SR2A, -OR2A, —N (R2a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R2A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituído; R3 é hidrogénio, halo, ciano, -CO2R3A, -C (O) N (R3a) 2, -SR3A, -OR3A, -N(R3a)2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R3A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R5 é hidrogénio, halo, -CO2R5A, -C (O) N (Rsa) 2, SR5A, -OR5A, —N (R5a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada Rsa é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; e n é 1 ou 2; em que "opcionalmente substituído" significa opcionalmente substituído com um ou mais entre alcoxi, alquilo, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino), arilo, ácido carboxílico, ciano, halo, haloalquilo, heterociclo, ou hidroxilo. A invenção também abrange compostos da fórmula:

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: X é ORib ou N (Rib) 2; cada Rib é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R2 é hidrogénio, halo, -CO2R2A, -C (0) N (R2a) 2, SR2A, -OR2A, —N (R2a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R2A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R3 é hidrogénio, halo, ciano, -CO2R3A, -C (0) N (R3a) 2, -SR3A, -OR3A, -N(R3a)2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R3A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R4 é hidrogénio, halo, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R5 é hidrogénio, halo, -CO2R5A, -C (0) N (R5a) 2, -SRsa, -ORsa, -N(R5a)2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada Rsa é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; e n é 1 ou 2; em que "opcionalmente substituído" significa opcionalmente substituído com um ou mais entre alcoxi, alquilo, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino), arilo, ácido carboxílico, ciano, halo, haloalquilo, heterociclo, ou hidroxilo.

Esta invenção abrange composições farmacêuticas compreendendo os compostos aqui revelados. A invenção também abrange compostos de:

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização como um medicamento para o tratamento ou gestão de uma doença ou distúrbio caracterizados por perda óssea, em que: X é ORib ou N (Rib) 2; cada Rib é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R2 é hidrogénio, halo, -CO2R2A, -C (0) N (R2a) 2, SR2A, -OR2A, —N (R2a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R2A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R3 é hidrogénio, halo, ciano, -CO2R3A, -C (0) N (R3a) 2, -SR3A, -OR3A, -N(R3a)2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R3A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R5 é hidrogénio, halo, -CO2R5A, -C (0) N (Rsa) 2, SR5A, -OR5A, —N (Rsa) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; e cada Rsa é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; em que "opcionalmente substituído" significa opcionalmente substituído com um ou mais entre alcoxi, alquilo, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino), arilo, ácido carboxílico, ciano, halo, haloalquilo, heterociclo, ou hidroxilo.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Certos aspetos da invenção podem ser compreendidos por referência às respetivas figuras. A Figura 1 é uma representação gráfica das diferenças entre as espessuras corticais de vários sítios do osso em murganhos inativados para Notum homozigótico ("HOM") e as dos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem ("WT"). A Figura 2 é uma representação gráfica de um aumento nas espessuras do osso cortical observado em murganhos inativados para NOTUM homozigótico e heterozigótico ("HET") em comparação com a dos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem. A Figura 3 é uma representação gráfica dos resultados obtidos dos testes de resistência do fémur a fratura e de compressão medular efetuados nos ossos de murganhos machos inativados para NOTUM homozigótico e heterozigótico e dos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem. A Figura 4 é uma representação gráfica de resultados obtidos a partir de testes de resistência do fémur a fratura e compressão medular efetuados nos ossos de murganhos fêmea inativados para NOTUM homozigótico e heterozigótico e seus companheiros de ninhada do tipo selvagem A Figura 5 é uma representação gráfica de medições da espessura cortical no eixo médio do fémur obtidas após 25 dias de administração a murganhos F1 machos híbridos (129 x C57) de doses de 1 mg/kg, 8 mg/kg, e 24 mg/kg do inibidor da Notum, o ácido 2-((5,6-dimetiltieno[2,3-d]pirimidin-4-il)tio)acético. A Figura 6 é uma representação gráfica de medições da espessura cortical no eixo médio do fémur obtidas após cinco semanas de administração a ratos Fischer 344 ovariectomizados de ácido 2-( (5-cloro-6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-il)tio)acético, em que "CONTROLO DE SIMULAÇÃO" se refere a ratos que não foram ovariectomizados e aos quais não foi administrado composto; "SIMULAÇÃO MAIS COMPOSTO" refere-se a ratos que não foram ovariectomizados mas aos quais foi administrado composto; "CONTROLO DE OVX" refere-se a ratos que foram ovariectomizados mas aos quais não foi administrado composto; e "OVX MAIS COMPOSTO" refere-se a ratos que foram ovariectomizados e aos quais foi administrado composto. A Figura 7 é uma representação gráfica de medições da espessura cortical do eixo médio da tibia obtidas do mesmo teste associado com a Figura 6. A Figura 8 é uma representação gráfica de medições da espessura cortical no eixo médio do fémur obtidas após 25 dias de administração a murganhos F1 machos híbridos (129 x C57) de doses de 3 mg/kg, 10 mg/kg, e 30 mg/kg do inibidor da Notum, o ácido 2 - ( (6-cloro-7-ciclopropiltieno[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)acético. A Figura 9 é uma representação gráfica de medições da espessura cortical no eixo médio do fémur obtidas após sete e 18 dias de administração a murganhos F1 machos híbridos (129xC57) de uma dose de 34 mg/kg do inibidor da Notum, o ácido 2-((6-cloro-7-metiltieno[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)-acético

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada, em parte, na constatação de que a inibição da Notum pode afetar a formação do osso endocortical. Certos aspetos da invenção são baseados em estudos de murganhos sem um gene Notum funcional ("murganho inativado"), na descoberta de compostos que inibem a NOTUM, e na constatação de que estes compostos podem ser utilizados para estimular a formação de osso cortical em murganhos e ratos. 5.1. Definições

Salvo indicação em contrário, o termo "alcenilo" significa um hidrocarboneto de cadeia linear, ramificada e/ou cíclica com 2 a 20 (por exemplo, 2 a 10 ou 2 a 6) átomos de carbono, e com pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. As unidades representativas de alcenilo incluem vinilo, alilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-l-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 1- heptenilo, 2-heptenilo, 3-heptenilo, 1-octenilo, 2-octenilo, 3-octenilo, 1-nonenilo, 2-nonenilo, 3-nonenilo, 1-decenilo, 2-decenilo e 3-decenilo.

Salvo indicação em contrário, o termo "alcoxi" significa um grupo -O-alquilo. Exemplos de grupos alcoxi incluem, sem lhes estar limitados, -OCH3, -OCH2CH3, -0(CH2)2CH3, -0(CH2)3CH3, -0(CH2)4CH3, e -0(CH2)5CH3.

Salvo indicação em contrário, o termo "alquilo" significa um hidrocarboneto de cadeia linear, ramificada e/ou cíclica. As unidades alquilo não cíclicas podem ter de 1 a 20 ('por exemplo, 1 a 10 ou 1 a 4) átomos de carbono; as unidades alquilo cíclicas podem ter de 3 a 20 fpor exemplo, 3 a 10 ou 3 a 6) átomos de carbono. As unidades alquilo de 1 a 4 carbonos são referidas como "alquilo inferior." Exemplos de grupos alquilo incluem, sem lhes estar limitados, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, iso-hexilo, heptilo, 4,4-dimetilpentilo, octilo, 2,2,4-trimetilpentilo, nonilo, decilo, undecilo e dodecilo. As unidades cicloalquilo podem ser monocíclicas ou multicíclicas, e os exemplos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, e adamantilo. Outros exemplos de unidades alquilo têm porções lineares, ramificadas e/ou cíclicas (por exemplo, l-etil-4-metilciclo-hexilo). O termo "alquilo" inclui hidrocarbonetos saturados assim como unidades alcenilo e alcinilo.

Salvo indicação em contrário, o termo "alquilarilo" ou "alquil-arilo" significa uma unidade alquilo ligada a uma unidade arilo.

Salvo indicação em contrário, o termo "alquilheteroarilo" ou "alquil-heteroarilo" significa uma unidade alquilo ligada a uma unidade heteroarilo.

Salvo indicação em contrário, o termo "alquilheterociclo" ou "alquil-heterociclo" significa uma unidade alquilo ligada a uma unidade heterociclo.

Salvo indicação em contrário, o termo "alcinilo" significa hidrocarboneto de cadeia linear, ramificada ou cíclica com 2 a 20 (por exemplo, 2 a 20 ou 2 a 6) átomos de carbono, e com pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. As unidades alcinilo representativas incluem acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-l-butinilo, 4-pentinilo, 1-hexinilo, 2-hexinilo, 5-hexinilo, 1-heptinilo, 2-heptinilo, 6-heptinilo, 1-octinilo, 2-octinilo, 7-octinilo, 1-noninilo, 2-noninilo, 8-noninilo, 1-decinilo, 2-decinilo e 9-decinilo.

Salvo indicação em contrário, o termo "arilo" significa um anel aromático ou um sistema de anel aromático ou parcialmente aromático composto por átomos de carbono e hidrogénio. Uma unidade arilo pode compreender múltiplos anéis ligados ou fundidos. Exemplos de unidades arilo incluem, sem lhes estar limitados, antracenilo, azulenilo, bifenilo, fluorenilo, indano, indenilo, naftilo, fenantrenilo, fenilo, e 1,2,3,4-tetra-hidro-naftaleno.

Salvo indicação em contrário, o termo "arilalquilo" ou "aril-alquil" significa uma unidade arilo ligada a uma unidade alquilo.

Salvo indicação em contrário, os termos "halogénio" e "halo" incluem flúor, cloro, bromo, e iodo.

Salvo indicação em contrário, o termo "heteroalquilo" refere-se a uma unidade alquilo (linear, ramificada ou cíclica) na qual pelo menos um dos seus átomos de carbono foi substituído com um heteroátomo (por exemplo, N, O, ou S).

Salvo indicação em contrário, o termo "heteroalquilarilo" ou "heteroalquil-arilo" refere-se a uma unidade heteroalquilo ligada a uma unidade alquilo.

Salvo indicação em contrário, o termo "heteroalquilheterociclo" ou "heteroalquil-heterociclo" refere-se a uma unidade heteroalquilo ligada a uma unidade heteroarilo.

Salvo indicação em contrário, o termo "heteroarilo" significa uma unidade arilo em que pelo menos um dos seus átomos de carbono foi substituído com um heteroátomo (por exemplo, N, 0 ou S). Exemplos incluem, sem lhes estar limitados, acridinilo, benzimidazolilo, benzofuranilo, benzoisotiazolilo, benzoisoxazolilo, benzoquinazolinilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, furilo, imidazolilo, indolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, oxazolilo, ftalazinilo, pirazinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridilo, pirimidinilo, pirimidilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, tetrazolilo, tiazolilo, e triazinilo.

Salvo indicação em contrário, o termo "heteroarilalquilo" ou "heteroaril-alquilo" significa uma unidade heteroarilo ligada a uma unidade alquilo.

Salvo indicação em contrário, o termo "heterociclo" refere-se a um anel aromático, parcialmente aromático ou não aromático monocíclico ou policíclico ou sistema de anel constituído por carbono, hidrogénio e pelo menos um heteroátomo (por exemplo, N, 0 ou S) . Um heterociclo pode compreender múltiplos (i.e., dois ou mais) anéis fundidos ou ligados em conjunto. Os heterociclos incluem heteroarilos. Exemplos incluem, sem lhes estar limitados, benzo[l,3]dioxolilo, 2,3-di-hidro-benzo[1,4]dioxinilo, cinolinilo, furanilo, hidantoinilo, morfolinilo, oxetanilo, oxiranilo, piperazinilo, piperidinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, tetra-hidrofuranilo, tetra-hidropiranilo, tetra-hidropiridinilo, tetra-hidropirimidinilo, tetra-hidrotiofenilo, tetra-hidrotiopiranilo e valerolactamilo.

Salvo indicação em contrário, o termo "heterocicloalquilo" ou "heterociclo-alquilo" refere-se a uma unidade heteroarilo ligada a uma unidade alquilo.

Salvo indicação em contrário, o termo "heterocicloalquilo" refere-se a um heterociclo não aromático.

Salvo indicação em contrário, o termo "heterocicloalquilalquilo" ou "heterocicloalquilo-alquilo" refere-se a uma unidade heterocicloalquilo ligada a uma unidade alquilo.

Salvo indicação em contrário, os termos "gerir", "gerindo" e "gestão" engloba a prevenção da recorrência da doença ou distúrbio especificados num doente que já sofreu da doença ou distúrbio, e/ou o prolongamento do tempo em que um doente que sofreu da doença ou distúrbio permanece em remissão. Os termos englobam a modulação do limiar, o desenvolvimento e/ou a duração da doença ou distúrbio, ou a alteração da forma como um doente responde à doença ou distúrbio.

Salvo indicação em contrário, o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se aos sais preparados a partir de ácidos ou bases não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo ácidos e bases inorgânicos e ácidos e bases orgânicos. Os sais de adição com bases adequados farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem lhes estar limitados, sais metálicos preparados a partir de alumínio, cálcio, lítio, magnésio, potássio, sódio e zinco, ou sais orgânicos preparados a partir de lisina, N,N' - dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, meglumina (N-metilglucamina) e procaína. Os ácidos não tóxicos adequados incluem, sem lhes estar limitados, ácidos inorgânicos e orgânicos tais como ácido acético, algínico, antranílico, benzenossulfónico, benzóico, camforsulfónico, cítrico, etenossulfónico, fórmico, fumárico, furóico, galacturónico, glucónico, glucurónico, glutâmico, glicólico, bromídrico, clorídrico, isotiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanossulfónico, múcico, nítrico, pamóico, pantoténico, fenilacético, fosfórico, propiónico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanílico, sulfúrico, tartárico, e ácido p-toluenossulfónico. Os ácidos não tóxicos específicos incluem os ácidos clorídrico, bromídrico, fosfórico, sulfúrico, e metanossulfónico. Exemplos de sais específicos incluem assim sais cloridrato e mesilato. Outros sais são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Mack Publishing, Easton PA: 1990) e Remington: The Science and Practice of

Pharmacy, 19a ed. (Mack Publishing, Easton PA: 1995) .

Salvo indicação em contrário, os termos "prevenir", "prevenindo" e "prevenção" contemplam uma ação que ocorre antes de um doente começar a sofrer da doença ou distúrbio especificados, que inibe ou reduz a gravidade da doença ou distúrbio. Por outras palavras, os termos englobam profilaxia.

Salvo indicação em contrário, uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um composto é uma quantidade suficiente para prevenir uma doença ou estado, ou um ou mais sintomas associados com a doença ou estado, ou prevenir a sua recorrência. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um composto significa uma quantidade de agente terapêutico, isolado ou em combinação com outros agentes, que proporciona um benefício profilático na prevenção da doença. O termo "quantidade profilaticamente eficaz" pode englobar uma quantidade que melhora a profilaxia geral ou melhora a eficácia profilática de outro agente profilático.

Salvo indicação em contrário, o termo "substituído", quando utilizado para descrever uma estrutura ou unidade química, refere-se a um derivado dessa estrutura ou unidade em que um ou mais dos seus átomos de hidrogénio foram substituídos com uma unidade química ou um grupo funcional tal como, mas sem lhes estar limitado, álcool, aldeído, alcoxi, alcanoíloxilo, alcoxicarbonilo, alcenilo, alquilo (por exemplo, metilo, etilo, propilo, ciclopropilo, t-butilo), alcinilo, alquilcarboniloxilo (-OC(O)alquilo), amida (e. g. -C (O)NH-alquil-, -alquilNHC(O)alquilo) , amidinilo (por exemplo, -C(NH)NH-alquil-, -C(NR)NH2), amina (primária, secundária e terciária tal como alquilamino, arilamino, arilalquilamino), aroílo, arilo, ariloxilo, azo, carbamoílo (por exemplo, -NHC(0)O-alquil-,-OC(0)NH-alquilo), carbamilo (por exemplo, CONH2, CONH-alquilo, CONH-arilo, CONH-arilalquilo), carbonilo, carboxilo, ácido carboxílico, anidrido de ácido carboxílico, cloreto de ácido carboxílico cloreto, ciano, éster, epóxido, éter (por exemplo, metoxilo, etoxilo), guanidino, halo, haloalquilo (por exemplo, -CCI3, -CF3, -C(CF3)3), heteroalquilo, hemiacetal, imina (primária e secundária), isocianato, isotiocianato, cetona, nitrilo, nitro, oxo, fosfodiéster, persulfureto, sulfonamida (por exemplo, SO2NH2) , sulfona, sulfonilo (incluindo alquilsulfonilo, arilsulfonilo e arilalquilsulfonilo), sulfóxido, tiol (por exemplo, sulfidrilo, tioéter) e ureia (por exemplo, -NHCONH-alquil-). Específicos substituintes são alcoxi, alquilo, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino) , arilo, ácido carboxílico, ciano, halo, haloalquilo, heterociclo, e hidroxilo.

Salvo indicação em contrário, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um composto é uma quantidade suficiente para proporcionar um benefício terapêutico no tratamento ou gestão de uma doença ou estado, ou para retardar ou minimizar um ou mais sintomas associados com a doença ou estado. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um composto significa uma quantidade de agente terapêutico, isolado ou em combinação com outras terapias, que proporciona um benefício terapêutico no tratamento ou gestão da doença ou estado. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" pode englobar uma quantidade que melhora a terapia geral, reduz ou evita os sintomas ou causas de uma doença ou estado, ou intensifica a eficácia terapêutica de outro agente terapêutico.

Salvo indicação em contrário, os termos "tratar" "tratando" e "tratamento" contemplam uma ação que ocorre enquanto um doente sofre da doença ou distúrbio especificados, que reduz a gravidade da doença ou distúrbio, ou retarda ou abranda a progressão da doença ou distúrbio.

Salvo indicação em contrário, o termo "incluem" tem o mesmo significado de "incluem, sem lhes estar limitados," e o termo "inclui" tem o mesmo significado de "inclui, sem lhes estar limitado". Do mesmo modo, o termo "tal como" tem o mesmo significado que o termo "tal como, sem lhes estar limitado".

Salvo indicação em contrário, um ou mais adjetivos imediatamente anteriores a uma série de substantivos devem ser entendidos como sendo aplicados a cada um dos substantivos. Por exemplo, a frase "alquilo, arilo, ou heteroarilo opcionalmente substituídos" tem o mesmo significado de "alquilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído, ou heteroarilo opcionalmente substituído".

Note-se que uma unidade química que faz parte de um composto maior pode ser aqui descrita utilizando o nome que lhe é normalmente atribuído como molécula única, ou o nome que é normalmente atribuído ao seu radical. Por exemplo, os termos "piridina" e "piridilo" têm o mesmo significado quando são utilizados para descrever uma unidade ligada a outras unidades químicas. Deste modo, as duas frases "XOH, em que X é piridilo" e "XOH, em que X é piridina" têm o mesmo significado e incluem os compostos piridin-2-ol, piridin-3-ol, e piridin-4-ol.

Note-se também que se a estereoquímica de uma estrutura ou porção de uma estrutura não está indicada com, por exemplo, linhas a negrito ou a ponteado, a estrutura ou a porção da estrutura devem ser interpretadas como incluindo todos os seus estereoisómeros. Além disso, assume-se que qualquer átomo apresentado num desenho com valências não satisfeitas está ligado a suficientes átomos de hidrogénio para satisfazer essas valências. Adicionalmente, as ligações químicas representadas com uma linha a cheio em paralelo com uma linha a ponteado englobam ligações simples e duplas (por exemplo, aromáticas), se as valências assim o permitirem. 5.2. Compostos

Esta invenção abrange os compostos:

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: X é ORib ou N (Rib) 2; cada Rib é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R2 é hidrogénio, halo, -CO2R2A, -C (0) N (R2a) 2, SR2A, -OR2A, —N (R2a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R2A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R3 é hidrogénio, halo, ciano, -CO2R3A, -C (0) N (R3a) 2, -SR3A, -OR3A, -N(R3a)2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R3A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R5 é hidrogénio, halo, -CO2R5A, -C (0) N (Rsa) 2, SR5A, -OR5A, —N (Rsa) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada Rsa é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; e n é 1 ou 2; em que "opcionalmente substituído" significa opcionalmente substituído com um ou mais entre alcoxi, alquilo, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino), arilo, ácido carboxílico, ciano, halo, haloalquilo, heterociclo, ou hidroxilo. A invenção também abrange compostos da fórmula:

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: X é ORib ou N (Rib) 2; cada Rib é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R2 é hidrogénio, halo, -CO2R2A, -C (0) N (R2a) 2, SR2A, -OR2A, —N (R2a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R2A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R3 é hidrogénio, halo, ciano, - CO2R3A, -C (0) N (R3a) 2, -SR3A, -OR3A, -N(R3a)2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R3A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R4 é hidrogénio, halo, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R5 é hidrogénio, halo, -CO2R5A, -C (0) N (R5a) 2, -SRsa, -ORsa, -N(R5a)2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada Rsa é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; e n é 1 ou 2; em que "opcionalmente substituído" significa opcionalmente substituído com um ou mais entre alcoxi, alquilo, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino), arilo, ácido carboxílico, ciano, halo, haloalquilo, heterociclo, ou hidroxilo.

Em alguns compostos, R2 é hidrogénio, halo, ou alquilo inferior. Em determinados compostos, R2 é hidrogénio.

Em alguns, R3 é ciano, halo, hidroxilo, ou alquilo opcionalmente substituído.

Em alguns, R4 é hidrogénio.

Em alguns, Rs é ciano, halo, hidroxilo, ou alquilo opcionalmente substituído.

Em certos compostos desta fórmula formula, X é ORib.

Em alguns, Rib é hidrogénio ou alquilo ou arilo opcionalmente substituídos.

Em alguns, R2 é hidrogénio ou alquilo opcionalmente substituído.

Em alguns, R3 é alquilo ou halo.

Em alguns, R3 é cloro.

Em alguns, R5 é alquilo ou halo.

Em alguns, R5 é alquilo C1-4.

Uma forma de realização particular é uma em que o composto não é 2-((6,7-difenilfuro[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)-1-morfolinoetanona. Uma forma de realização é uma em que ambos R3 e R5 não são fenilo.

Certos compostos têm uma CI50 inferior a cerca de 0,1, 0,05, ou 0,025 μΜ como determinado pelo ensaio de ligação aqui descrito. Certos compostos têm uma CE50 inferior a cerca de 5, 2,5, ou 1 μΜ como determinado pelo ensaio repórter aqui descrito.

Os compostos da invenção (i.e., compostos aqui revelados) podem ser preparados por métodos aqui revelados assim como por métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a patente U.S. n2 6 579 882 de Stewart et al. ; a patente EP n2 0447891 de Wiesenfeldt et al. 5.3. Métodos de Tratamento

Esta invenção refere-se a um método de estimulação da formação de osso endocortical num doente, que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um composto da invenção a um doente com necessidade deste. Também se refere a um método para aumentar a espessura do osso cortical, que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um composto da invenção a um doente com necessidade deste.

Esta invenção refere-se a um método de tratamento, gestão, ou prevenção de uma doença ou distúrbio associados com perda óssea, que compreende a administração de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um composto da invenção a um doente com necessidade deste. Exemplos de doenças e distúrbios incluem osteoporose (por exemplo, osteoporose pós-menopausa, osteoporose induzida por esteroides ou glucocorticoides), osteopenia e doença de Paget.

Também relacionado com a invenção é um método de tratamento, gestão, ou prevenção de fraturas ósseas, que compreende a administração de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um composto da invenção a um doente com necessidade deste. Fraturas ósseas especificas são as associadas com doença metastásica do osso, ou seja, cancro que metastizou para o osso. Exemplos de cancros que podem metastasizar para o osso incluem cancro da próstata, mama, pulmão, tiroide, e rim.

Esta invenção também se refere a um método de tratamento, gestão, ou prevenção de perda óssea associada com, ou causada por, uma doença ou distúrbio, que compreende a administração de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um composto da invenção a um doente com necessidade deste. Exemplos de doenças e distúrbios incluem doença celíaca, Doença de Crohn, síndrome de Cushing, hiperparatiroidismo, doença inflamatória dos intestinos e colite ulcerativa.

Exemplos de doentes que podem beneficiar dos métodos desta invenção incluem homens e mulheres com 55 anos ou mais, mulheres pós-menopausa, e doentes que sofrem de insuficiência renal.

Os compostos da invenção podem ser administrados em combinação (por exemplo, em simultâneo ou em alturas diferentes) com outros fármacos úteis para o tratamento, gestão, ou prevenção de doenças ou estados que afetam o osso. Exemplos incluem: moduladores do recetor do androgénio; bisfosfonatos; calcitonina; antagonistas do recetor sensor de cálcio; inibidores da catepsina K; estrogénio e moduladores do recetor de estrogénio; ligantes, anticorpos e antagonistas do recetor da integrina; hormona paratiroide (PTH) e seus análogos e miméticos; e Vitamina D e análogos sintéticos da Vitamina D.

Exemplos de moduladores do recetor de androgénio incluem finasterida e outros inibidores da 5 -redutase, nilutamida, flutamida, bicalutamida, liarozol e acetato de abiraterona.

Exemplos de bisfosfonatos incluem alendronato, cimadronato, clodronato, etidronato, ibandronato, incadronato, minodronato, neridronato, olpadronato, pamidronato, piridronato, risedronato, tiludronato, e zolendronato, e seus sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis.

Exemplos de inibidores da catepsina K incluem VEL-0230, AAE581 (balicatibe), MV061194, SB-462795 (relacatibe), MK-0822 (odanacatibe) e MK-1256.

Exemplos de estrogénio e moduladores do recetor de estrogénio incluem estrogénios de ocorrência natural (por exemplo, 7-estradiol, estrona, e estriol), estrogénios conjugados (por exemplo, estrogénios equinos conjugados), contracetivos orais, estrogénios sulfatados, progestogénio, estradiol, droloxifeno, raloxifeno, lasofoxifeno, TSE-424, tamoxifeno, idoxifeno, LY353381, LY117081, toremifeno, fulvestrant, 4-[7-(2,2-dimetil-l-oxopropoxi-4-metil-2-[4-[2- (1-piperidinil)etoxi]fenil]-2H-l-benzopiran-3-il]-fenil-2,2-dimetilpropanoato, 4,4' -di-hidroxibenzofenona-2,4- dinitrofenil-hidrazona e SH646.

Exemplos de ligantes, anticorpos e antagonistas do recetor de integrina incluem vitaxina (MEDI-522), cilengitida e L-000845704. 5.4. Formulações Farmacêuticas

Esta invenção abrange composições farmacêuticas constituídas por um ou mais compostos da invenção, e opcionalmente um ou mais de outros fármacos, tal como os descritos atrás.

Certas composições farmacêuticas são formas farmacêuticas unitárias individuais adequadas para administração oral, via mucosa (por exemplo, nasal, sublingual, vaginal, bocal, ou retal), parentérica (por exemplo, subcutânea, intravenosa, injeção de bólus, intramuscular, ou intra-arterial), ou transdérmica a um doente. Exemplos de formas farmacêuticas incluem, sem lhes estar limitados: comprimidos; drageias; cápsulas, tais como cápsulas de gelatina elástica mole; hóstias; trociscos; rebuçados; dispersões; supositórios; unguentos; cataplasmas (emplastros); pastas; pós; curativos; cremes; gesso; soluções; pensos; aerossóis (por exemplo, pulverizadores nasais ou inaladores); géis; formas farmacêuticas líquidas adequadas para administração oral ou via mucosa a um doente, incluindo suspensões (por exemplo, suspensões líquidas aquosas ou não aquosas, emulsões óleo-em-água, ou emulsões líquidas água-em-óleo), soluções, e elixires; formas farmacêuticas líquidas adequadas para administração parentérica a um doente; e sólidos esterilizados (por exemplo, sólidos cristalinos ou amorfos) que podem ser reconstituídos para proporcionar formas farmacêuticas líquidas adequadas para administração parentérica a um doente. A formulação deve seguir o modo de administração. Por exemplo, a administração oral requere revestimentos entéricos para proteger os compostos desta invenção contra a degradação no trato gastrointestinal. Do mesmo modo, uma formulação pode conter ingredientes que facilitem a distribuição do(s) princípio (s) ativo(s) no local de ação. Por exemplo, os compostos podem ser administrados em formulações lipossómicas a fim de os proteger contra enzimas degradadoras, facilitar o transporte no sistema circulatório e efetuar a entrega através das membranas celulares para os locais intracelulares. A composição, forma, e tipo de forma farmacêutica varia de acordo com a sua utilização. Por exemplo, uma forma farmacêutica utilizada no tratamento agudo de uma doença pode conter um ou mais princípios ativos em quantidades maiores do que uma forma farmacêutica utilizada no tratamento crónico da mesma doença. Do mesmo modo, uma forma farmacêutica parentérica pode conter um ou mais princípios ativos em quantidades mais pequenas do que uma forma farmacêutica oral utilizada para tratar a mesma doença. Esta e outras maneiras pelas quais as formas farmacêuticas específicas abrangidas por esta invenção variam entre si serão óbvias para os peritos na especialidade. Ver, por exemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Mack Publishing, Easton PA: 1990) .

As composições farmacêuticas desta invenção são de preferência administradas oralmente. As formas farmacêuticas discretas adequadas para administração oral incluem comprimidos (por exemplo, comprimidos mastigáveis), drageias, cápsulas e líquidos (por exemplo, xaropes aromatizados). Estas formas farmacêuticas contêm quantidades predeterminadas de princípios ativos e podem ser preparadas por métodos de farmácia bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Ver, por exemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Mack Publishing, Easton PA: 1990) .

As formas farmacêuticas orais típicas são preparadas por combinação do(s) princípio(s) ativo(s) numa mistura íntima com pelo menos um excipiente de acordo com técnicas convencionais de composição farmacêutica. Os excipientes podem adquirir uma ampla variedade de formas dependendo da forma de preparação desejada para administração.

Em virtude da sua facilidade de administração, os comprimidos e cápsulas representam as formas farmacêuticas unitária orais mais vantajosas. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos por técnicas convencionais aquosas ou não aquosas. Estas formas farmacêuticas podem ser preparadas por métodos convencionais de farmácia. Em geral, as composições farmacêuticas e as formas farmacêuticas são preparadas por mistura uniforme e íntima dos princípios ativos com veículos líquidos, veículos sólidos finamente divididos, ou ambos, e a seguir, se necessário, por moldagem do produto na apresentação desejada. Desintegradores podem ser incorporados nas formas farmacêuticas sólidas para facilitar a dissolução rápida. Lubrificantes podem igualmente ser incorporados para facilitar a preparação das formas farmacêuticas (por exemplo, comprimidos).

6. EXEMPLOS 6.1. Murganho Inativado

Murganhos homozigóticos para uma mutação geneticamente manipulada no ortólogo murino do gene Notum humano foram produzidos utilizando os correspondentes clones de células estaminais embrionárias (ES) mutadas da coleção OMNIBANK de clones de células ES mutadas de murino (ver, em geral, a Patente U.S. n.2 6 080 576). Resumidamente, clones de células ES contendo uma inserção mutagénica viral no locus NOTUM murino foram microinjetados em blastocistos, os quais por sua vez foram implantados numa fêmea pseudográvida hospedeira, que foi levada até ao termo. A descendência quimérica resultante foi subsequentemente criada para 6 murganhos fêmea C57 pretos e a descendência foi verificada quanto à transmissão da linha germinal do alelo NOTUM eliminado. Os animais heterozigdticos para o alelo NOTUM mutado foram subsequentemente criados para produzir descendência que era homozigótica para o alelo NOTUM mutado, heterozigótica para o alelo NOTUM mutado, ou descendência do tipo selvagem numa proporção aproximada de 1:2:1.

Murganhos homozigóticos (-/-) para a disrupção do gene NOTUM foram estudados em conjunto com murganhos heterozigóticos ( + /-) para a disrupção do gene NOTUM e com companheiros de ninhada do tipo selvagem (+/+). Durante esta análise, os murganhos foram sujeitos a um tratamento médico com um conjunto integrado de procedimentos de diagnóstico médico concebido para avaliar a função dos principais sistemas de órgãos num indivíduo mamífero. Ao estudar os murganhos "inativados" homozigóticos (-/-) nos números descritos e em conjunto com os companheiros de ninhada heterozigóticos (+/-) e do tipo selvagem (+/+), foram obtidos dados mais fiáveis e reproduzíveis.

Como apresentado na Figura 1, os murganhos macho com disrupção homozigótica do gene NOTUM ("horns") exibiram espessuras corticais em vários locais do osso que eram maiores do que as dos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem às 16 semanas de idade (número de murganhos N = 10 para ambos os grupos) . Estas diferenças, que foram medidas por microCT (Scanco mCT40), eram: 28% (p < 0,001) no eixo médio do fémur; 19% (p < 0,001) no eixo médio do úmero; 17% (p < 0,001) no eixo médio da tíbia; e 11% (p < 0,001) na junção tíbia-fíbula. Como se pode ver na Figura 2, às 16 semanas de idade, a espessura do osso cortical do eixo médio do fémur de murganhos heterozigóticos para a mutação da Notum ("hets") era também superior às dos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem: os machos hets (N = 50) exibiram um aumento de 6% (p = 0,007) em comparação com os seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (N = 23); e as fêmeas hets (N = 57) exibiram um aumento de 9% (p < 0,001) em comparação com o dos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (N = 22).

As manifestações práticas da redistribuição observada na formação de osso em animais NOTUM estão refletidas nas Figuras 3 e 4, em que são apresentados os resultados dos testes da resistência do fémur à fratura (efetuados por SkeleTech, agora Ricerca Biosciences) obtidos por meio de um teste de flexão convencional de 4 pontos. Como se pode ver na Figura 3, a qual apresenta os resultados obtidos para murganhos machos às 16 semanas de idade, os hets (N = 20) exibiram um aumento de 5% (p = 0,54) na resistência do fémur à fratura em comparação com os seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (N = 23) , enquanto os horns (N = 17) exibiram um aumento de 28% (p < 0,001). Por outro lado, os testes de compressão medular dos horns e hets Notum não mostraram uma redução significativa nas cargas máximas de compressão medular em comparação com os controlos do tipo selvagem. Foram obtidos resultados semelhantes para murganhos fêmea de 16 semanas de idade. Como se pode ver na Figura 4, os hets (N = 20) exibiram um aumento de 12% (p = 0,04) na resistência do fémur à fratura em comparação com os seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (N = 21), enquanto os horns (N = 18) exibiram um aumento de 28% (p < 0,001) . A análise destes e outros dados revelou uma forte correlação entre a espessura cortical e a resistência do fémur a fratura. 6.2. Ensaio Repórter

Os valores de CE50 dos compostos foram determinados por este ensaio, que utilizou meio condicionado preparado como se segue. Um plasmídeo contendo notum pectinacetiltransferase humana no vetor pcDNA3.1(+) foi transfetado para células HEK293 e clones foram selecionados por crescimento na presença de 400 pg/mL de G418. O clone contendo a expressão mais elevada de notum pectinacetiltransferase humana no meio condicionado foi mantido para todos os futuros ensaios de atividade. Células L para sobre-expressão e secreção de Wnt3a para o meio condicionado foram adquiridas de ATCC.

O protocolo de ensaio foi como se segue. Aproximadamente 5 milhões de células CellSensor®LEF/TCF-bla Freestile™ 293F foram cultivadas até perto da confluência em placas de 15 cm. 0 meio de crescimento celular consistia em DMEM com 10% de FBS Dialisado, 5 pg/ml de Blasticidina (Invitrogen, R2IO-OI), NEAA 0,1 mM, HEPES 25 mM e lxGPS. As células foram então tripsinizadas, primeiro por lavagem com PBS, seguido da adição de 5 mL de tripsina e incubação das placas à temperatura ambiente, durante dois minutos. Um total de 10 mL de meio de ensaio (Opti-MEM, com 0,5% de FBS dialisado, NEAA 0,1 mM, piruvato de sódio 1 mM, HEPES 10 mM, lxGPS) foi então adicionado por placa de 15 cm. As células foram contadas e suspensas a 0,75 milhões de células por mL. As células foram semeadas em placas Biocoat de 384 poços (Fisher, Catalogue #356663) , a uma densidade de 15 000 células por 20 pL por poço. Após incubação das células a 37°C durante 3 horas, adicionou-se 10 pL de LiCl 30 mM em meio de ensaio por poço, seguido de incubação a 37°C durante mais 3 horas. Entretanto, os compostos foram dispensados acusticamente para placas Greiner de 384 poços (catálogo #781076) utilizando um ECHO, seguido pela adição de 10 pL por poço de meio condicionado com Wnt3a e 10 pL por poço de meio condicionado com notum pectinacetilesterase. A seguir, transferiu-se 10 pL da mistura Wnt3a/notum pentinacetiltransferase das placas Greiner para cada poço das placas de 384 poços contendo as células CellSensor. Após incubação das células durante a noite a 37°C, as reações foram desenvolvidas pela adição de 5 pL de lxCCF4 (Invitrogen, número de catálogo K1085) a cada poço, cobrindo toda a placa de 384 poços e abanando-a suavemente no escuro à temperatura ambiente, durante 3 horas. As placas foram então lidas num leitor de placas Envision, a um comprimento de onda de excitação de 400 nm e aos comprimentos de onda de emissão de 460 nm e 535 nm. 6.3. Ensaio de Ligação

Os valores de CI50 dos compostos foram determinados por este ensaio, que utilizou octanoíloxipireno-1,3,6-trisulfonato trissódico (OPTS), um substrato enzimático solúvel em água para ensaios fluorimétricos de esterases e lipases. O plasmídeo contendo notum pectinacetiltransferase humana no vetor pcDNA3.1(+) foi transfetado para células HEK293 e clones foram selecionados por crescimento na presença de 400 pg/mL de G418. Meio condicionado destas células foi utilizado para o ensaio.

Foi utilizado um ECHO para dispensar acusticamente 75 nL de compostos para placas Greiner secas de 384 poços (catálogo #81076), seguido pela adição de 10 pL de 50 mM de Tris/HCl (pH 6,8) a cada poço destas placas de ensaio de 384 poços. O meio condicionado contendo notum pectinacetiltransferase humana foi diluído 75x com tampão de ensaio (Tris 50 mM, pH 6,8, CaCÍ2 5 mM, MgCÍ2 0,5 mM) , e adicionou-se 25 pg desta "Mistura Enzimática" a cada poço, seguido por uma pré-incubação de 10 minutos. As reações enzimáticas foram iniciadas por adição de 15 pi de substrato OPTS (Sigma, catálogo # 74875) até uma concentração final de 5 mM, e os tempos de reação foram de 10 minutos à temperatura ambiente. Todas as placas foram lidas num leitor de placas Envision, a um comprimento de onda de excitação de 485 nm e a um comprimento de onda de emissão de 535 nm. 6.4. Método Geral de Síntese A: Preparação de 3-cloro-2-metiltieno [2,3-Jb] piridina-4-ol (2); 3-bromo-2- metiltieno[2,3-b]piridina-4-ol (3)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

Num balão de fundo redondo de 100 mL, 6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-ol 1 (lg, 6,2 mmole) foi combinado com ácido acético (12 mL) e agitado à temperatura ambiente. Acrescentou-se bromo (0,3 mL, 6,2 mmole) e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A reação foi então interrompida com gelo e agitou-se até o gelo fundir. O produto foi então removido por filtração, lavado com água e seco, obtendo-se (1 g, 66% de rendimento) 3-bromo-2-metiltieno[2,3-b]piridino-4-ol 2 como um produto seco.

Num balão de fundo redondo de 3 L, combinou-se 6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-ol 1 (50 g, 310 mmole) com ácido acético (525 mL), acrescentou-se NCS (37,5 g, 372 mmole) e aqueceu-se a 55°C durante 8 horas. A mistura reacional foi então arrefecida até à temperatura ambiente, extinguida com água e o composto foi extraído com cloreto de metileno (2 x 250 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina e secas com MgSCh, filtradas e concentradas, produzindo 3-cloro-2-metiltieno[2,3-b]piridino-4-ol na forma de um sólido 3 (42,15 g, 70% de rendimento). 6.5. Método Geral de Síntese B: Preparação de ácido 2-(5-cloro-6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acético (6)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico dado a seguir:

Síntese de 4: Suspendeu-se 3-cloro-2-metiltieno[2,3-b]piridino-4-ol 3 (40 g, 2000 mmole, 1 eq.) em POCI3 (368 mL, 4000 mmole, 20 eq.) e aqueceu-se a 90°C durante 4 horas. Após arrefecimento, a reação foi concentrada e o resíduo arrefecido para 0°C. Foi então adicionada água arrefecida em gelo, lentamente, para assegurar o consumo completo de POCI3. A solução negra foi extraída três vezes com acetato de etilo. Os extratos orgânicos combinados foram lavados duas vezes com NaHC03 saturado aquoso, uma vez com salmoura, secos com MgS04, filtrados e concentrados, produzindo o sólido castanho claro 4,5-dicloro-6-metiltieno[2,3-d]pirimidina 4 (41,6 g, 93% de rendimento), que foi imediatamente utilizado após secagem completa. Síntese de 5: Suspendeu-se 4,5-dicloro-6-metiltieno[2,3-djpirimidina 4 (40 g, 182,2 mmole, 1 eq.) em metanol (500 mL) e arrefeceu-se até 0°C. Acrescentou-se 2-mercaptoacetato de metilo (27 mL, 191,5 mmole, 1,05 eq.) lentamente, seguido pela adição lenta de TEA (53 mL, 382, 6 mmole, 2,1 eq.) . Após agitação durante 90 minutos, a reação foi concentrada. O resíduo foi combinado com acetato de etilo e filtrado através de um rolhão de gel de sílica para remover sais e alguma cor. O filtrado foi concentrado e purificado utilizando cromatografia em gel de sílica com 0-15% de acetato de etilo em hexanos, produzindo 2-(5-cloro-6-metiltieno [2,3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de metilo 5 (47,30 g, 91% de rendimento) na forma de um sólido branco. Síntese de 6: Adicionou-se 2-(5-cloro-6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de metilo 5 (45 g, 150 mmole, 1 eq.) a THF (350 mL) e acrescentou-se NaOH 1 N aquoso (300 mL, 300 mmole, 2 eq.) sob agitação eficiente. Após 40 minutos, a mistura reacional foi concentrada e o resíduo foi recuperado em água, arrefeceu-se até 0°C e acidificou-se para um pH baixo com HC1 IN. O precipitado foi recolhido por filtração a vácuo e lavado com água. Secagem sob vácuo durante a noite produziu o ácido 2-(5-cloro-6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acético 6 (40,5 g, 94% de rendimento), puro, na forma de um sólido branco. MS m/z C9H7CIN2O2S2 [M+l]+ = 275 e [M+l]+3 = 277. RMN (400 MHz, METANOL-d4) ppm 8,66 (s, 1 H) , 4.05 (s, 2 H) , 2.54 (s, 3 H) . 13C RMN (101 MHz, DMSO-d6) ppm 170, 04 (s), 162,55 (s, 1C), 162,48 (s, 1C), 152,55 (s, 1C), 135,03 (s, 1C), 125,03 (s, 1C), 114,36 (s, 1C), 32,17 (s, 1C), 14,05 (s, 1C). 6.6. Método Geral de Síntese C: Preparação de ácido 2—(6— bromo-5-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acético (10)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

Síntese de 8: Adicionou-se 4-cloro-5-metiltieno[2,3- djpirimidina 7 (lg, 5,4 mmole), preparada de acordo com o Método Geral de Síntese B, a ácido acético e agitou-se à temperatura ambiente. A esta mistura reacional, acrescentou-se bromo (1 eq = 275 pL, 5,4 mmole) e agitou-se durante a noite. Extinguiu-se a reação com gelo e agitou-se até o gelo fundir. O produto foi removido por filtração, lavado com água e seco, obtendo-se 1 g de 6-bromo-4-cloro-5-metiltieno[2,3-djpirimidina 8 (786 mg, 55% de rendimento) na forma de um sólido amarelo pálido.

Os compostos 9 e 10 foram preparados de acordo com o Método Geral de Síntese B. 6.7. Método Geral de Síntese D: Preparação de 2- (5- ciclopropil-6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acetato_de metilo (12)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

A um balão de fundo redondo de 100 mL, adicionou-se 2-(5-bromo-6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de metilo 11 (0,100 g, 0,3 mmole, 1 eq) , ácido ciclopropilborónico (51 mg, 0,6 mmole) e triciclo-hexilfosfina (8,4 mg, 0,03 mmole) e K3PO4 (212 mg, 1,05 mmole) foram combinados com mistura de tolueno e água (4 mL, 1:1) . Esta mistura foi agitada à temperatura ambiente sob atmosfera de N2. À solução agitada, adicionou-se acetato de paládio (4 mg, 0,015 mmole). A mistura reacional foi em seguida aquecida a 100°C durante 8 h. A reação foi interrompida pela adição de HC1 1 N e a porção aquosa foi extraída três vezes com EtOAc. As porções orgânicas combinadas foram secas com MgSCb, filtradas e concentradas, obtendo-se 2-(5-ciclopropil-6-metiltieno[2.3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de metilo (40 mg, 45% de rendimento) 12 na forma de um sólido amarelo claro. 6.8. Método Geral de Síntese E: Preparação de 2-(6-etil-5-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de metilo (13)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

Num balão de fundo redondo de 100 mL com 2-(6-bromo-5-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de metilo 9 (50 mg, 0,15 mmole), preparado de acordo com o Método Geral de Síntese C, e dietilzinco (1,1 M em tolueno, 204 pL, 0,23 mmole), Pd(dba)3 (4 mg, 0,0075 mmole), e 2-diciclo-hexilfosfino-2' ,6' -isopropoxidifenilo (13 mg, 0,03 mmole) foram combinados com DMF seco (2,5 mL) num recipiente de microondas e aqueceu-se sob irradiação micro-ondas a 160°C, durante 10 minutos. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, filtrou-se através de celite e concentrou-se. Isto foi combinado com EtOAc e lavado com água. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca com sulfato de magnésio e concentrada, obtendo-se 2-(6-etil-5-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de metilo 13 (17 mg, 40% de rendimento). 6.9. Método Geral de Síntese F: Preparação de ácido 2—(5— (dimetilamino)-6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acético (14)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

2-(5-Bromo-6-metiltieno[2.3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de metilo 11 (100 mg, 0,3 mmole), preparado pelo Método Geral de Síntese C, foi combinado com 1 mL (excesso, como solvente) de dimetilamina a 40% em água. Uma quantidade catalítica de óxido de cobre foi então adicionada e a reação foi aquecida sob irradiação de microondas a 140°C durante 15 min. A mistura reacional foi depois purificada por HPLC preparativa (acetato de amónio aquoso/acetonitrilo) . Foi isolado 14 na forma de um sólido branco (60 mg, 71% de rendimento). 6.10. Método Geral de Síntese G: Preparação de 2-(5,6- dimetiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)-N-(2- metoxietil)acetamida (17)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

Ácido 2 - (5,6-dimetiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acético 15 (0,050 g, 0,2 mmole, 1 eq), que pode ser obtido comercialmente ou preparado pelo Método Geral de Síntese B, foi combinado com DMF (2,2 mL). A esta mistura, foram adicionados 2-metoxietanamina 16 (0,019 g, 0,24 mmole, 1,2 eq) , HATU (0, 076 g, 0,2 mmole, 1 eq) e N,N- diisopropiletilamina (0,08 mL, 0,44 mmole, 2,2 eq) e a mistura reacional foi agitada durante 8 h à temperatura ambiente. Acrescentou-se água para extinguir a reação e a fase aquosa foi extraída três vezes com EtOAc. As fases orgânicas combinadas foram secas com MgSCb, filtradas e concentradas. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa utilizando condições neutrais produzindo 2-(5,6-dimetiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)-N-(2-metoxietil)acetamida 17 (56 mg, 90% de rendimento) na forma de um sólido branco. 6.11. Método Geral de Síntese H: Preparação de 2-(5,6- dimetiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de isopropilo (19)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

0 composto 15 (100 mg, 0,4 mmole), que pode ser obtido comercialmente ou preparado pelo Método Geral de Síntese B, foi dissolvido em DCM seco, adicionou-se cloreto de tionilo (56 uL, 0,8 mmole) e agitou-se à temperatura ambiente durante 1 hora. A seguir, acrescentou-se propano-2-ol 18 em excesso e agitou-se à temperatura ambiente durante mais 1 hora. A mistura reacional foi então concentrada e purificada por HPLC preparativa de fase neutra (acetato de amónio aquoso/acetonitrilo), obtendo-se 19 na forma de um sólido (100 mg, 85% de rendimento). 6.12. Método Geral de Síntese I: Preparação de ácido 2-(5-cloro-6-isopropiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acético (24)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

Sintese de 21: Pirimidona 20 (10 g, 51,4 mmole, 1 eq.), que pode ser obtida comercialmente ou preparada pelo Método Geral de Síntese D, foi suspensa em POCI3 (95 mL, 1028 mmole, 20 eq.) e aqueceu-se a 90°C durante 4 horas. Após arrefecimento, a mistura reacional foi concentrada e o resíduo foi arrefecido até 0°C. Água arrefecida em gelo foi então adicionada lentamente para assegurar o consumo completo de POCI3. A solução negra foi extraída três vezes com acetato de etilo. Os extratos orgânicos combinados foram lavados duas vezes com NaHC03 saturado aquoso, uma vez com salmoura, secos com MgS04, filtrados e concentrados, obtendo-se um sólido castanho claro 4-cloro-6-isopropiltieno[2,3-d]pirimidina 21 i (10,16 g, 93% de rendimento), que foi imediatamente utilizado após secagem completa. Síntese de 22: 4-Cloro-6-isopropiltieno[2,3-d]pirimidina sólida 21 (9,2 g, 43,2 mmole, 1 eq.) foi combinada com ácido acético (75 mL) e NCS (8,65 g, 86,5 mmole, 2 eq.) foi acrescentado. A mistura reacional foi aquecida a 55°C durante 6 horas. A reação foi arrefecida e interrompida com água e o composto foi extraído com cloreto de metileno (2 x 50 mL) . As fases orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina e secas com MgSCh, filtradas e concentradas, produzindo 4,5-dicloro-6-isopropiltieno[2,3-d]pirimidina na forma de um sólido 22 (6,2 g, 58% de rendimento). Síntese de 23: Suspendeu-se 4,5-dicloro-6-isopropiltieno[2,3-d]pirimidina 22 (11,6 g, 47 mmole, 1 eq.) em metanol (125 mL) e arrefeceu-se até 0°C. Acrescentou-se 2-mercaptoacetato de metilo (6,86 mL, 49,35 mmole, 1,05 eq.) lentamente, seguido pela adição lenta de TEA (13,7 mL, 98,7 mmole, 2,1 eq.) . Após agitação durante 90 minutos, a mistura reacional foi concentrada. O resíduo foi combinado com acetato de etilo e filtrado através de um rolhão de gel de sílica para remover sais e alguma cor. O filtrado foi concentrado e purificado utilizando cromatografia em gel de sílica com 0-15% de acetato de etilo em hexanos, produzindo 2-(5-cloro-6-isopropiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de metilo 23 (13,6 g, 92% de rendimento) na forma de um sólido branco. Síntese de 24: O composto 23 (5,0 g, 15,8 mmole, 1 eq.) foi combinado com THF (50 mL) e NaOH IN aquoso (32 mL, 32 mmole, 2 eq.), foi adicionado sob agitação eficiente. Após 40 minutos, a mistura reacional foi concentrada e o resíduo com tomado em água, arrefecido a 0°C e acidificado para um pH baixo com HC1 1 N. O precipitado foi recolhido por filtração a vácuo e lavado com água. Secagem sob vácuo durante a noite produziu ácido 2-(5-cloro-6-isopropiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acético 24 puro na forma de um sólido branco (4,5 g, 94% de rendimento) . MS m/ z C11H11CIN2O2S2 [M+l]+ = 303 e [M+1J+3 = 305. ΤΗ RMN (400 MHz, DMSO-d6) ppm 12,83 (s, 1 H) , 8,81 (s, 1 H), 4,12 (s, 2 H), 3,52 - 3,76 (m, 1 H), 1,32 (d, J=7,03 Hz, 6 H) . 13C RMN (101 MHz, DMSO-de) ppm 170,0 (s, 1C), 162,8 (s, 1C), 162,2 (s, 1C), 152,6 (s, 1C), 146,9 (s, 1C), 125,1 (s, 1C), 112,3 (s, 1C), 32,2 (s, 1C), 28,6 (s, 1C), 23,4 (s, 1C), 23,1 (s, 1C). 6.13. Método Geral de Síntese J: Preparação de ácido 2-(6-cloro-7-ciclopropiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acético (31)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

Síntese de 26: Num balão de fundo redondo de 500 mL com 7-bromo-4-metoxitieno[3,2-d]pirimidina 25 (4 g, 16,32 mmole, 1 eq) e ácido ciclopropilborónico (2,81 g, 32,6 mmole, 2 eq) e carbonato de potássio (6,76 g, 49 mmole, 3 eg) e o catalisador, PdCl2(Ph3P)2 (575 mg, 0,816 mmole, 0,05 eq) foram tomados numa mistura de tolueno (60 mL) e H2O (16 mL). Purgou-se a mistura reacional fortemente com N2, durante cinco minutos, e aqueceu-se a mistura reacional a 100°C durante 6 horas. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura reacional foi filtrada e dividida em fases. A fase aquosa foi lavada com tolueno e os solventes orgânicos combinados foram concentrados. O material bruto foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica, utilizando os solventes EtOAc e heptano (10-30%), obtendo-se 7-ciclopropil-4-metoxitieno[3,2-d]pirimidina 26 na forma de um sólido amarelo claro (3 g, 90% de rendimento). O composto 27 foi sintetizado utilizando o Método Geral de Síntese A. Síntese de 28: Tomou-se 6-cloro-7-ciclopropil-4-

metoxitieno[3,2-d]pirimidina (2 g, 8,25 mmole) em HC1 12N (6 mL, 72,5 mmole) e aqueceu-se a mistura reacional a 70°C durante 40 minutos. Após arrefecimento até a temperatura ambiente, adicionou-se água (15 mL) a esta suspensão castanha pálida e misturou-se de forma apropriada. O precipitado foi removido por filtração e lavado com água e heptanos. Secagem durante a noite a 40°C produziu um sólido amarelo claro (1,6 g, 90% de rendimento) O composto 29 foi sintetizado pelo Método Geral de Síntese B. O composto 30 foi sintetizado pelo Método Geral de Síntese B. MS m/z C11H9CIN2O2S2 [M+l]+ = 301 e [M+l]+3 = 303. Ή RMN (400 MHz, DMSO-de) ppm 8,92 (s, 1 H) , 4,22 (s, 2 H) , 2,10 - 2,20 (m, 1 H) , 1,45 - 1,52 (m, 2 H) , 0, 96 - 1, 06 (m, 2 H) . 13C RMN (101 MHz, DMSO-d6) ppm 169,6 (s, 2C) , 161,4 (s, 1C), 156,2 (s, 1C), 154,1 (s, 2C) , 134,4 (s, 1C), 125,9 (s, 1C), 31,9 (s, 1C), 10,2 (s, 1C), 6,3 (s, 2C) . 6.14. Método Geral de Síntese K: Preparação de ácido 2-(7-ciclopropil-6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acético (35)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

0 composto 26 foi sintetizado pelo Método Geral de Síntese J. Síntese de 31: A N, N-diisopropiletilamina (14 mL, 80 mmole) em THF (60 mL) adicionou-se n-BuLi (37,5 mL, 1,6 M, 60 mmole) gota a gota a -60°C. Após 15 minutos de agitação à mesma temperatura, o composto 31 (4,14 g, 20 mmole) foi adicionado numa porção e deixou-se aquecer até -45°C em 45 minutos. A seguir, resfriou-se novamente para -60°C, adicionou-se Mel (5 mL, 80 mmole) lentamente, gota a gota, e agitou-se durante 2 h sob aquecimento da mistura reacional até à temperatura ambiente. Após 2 h, adicionou-se mistura de

salmoura e água (100 mL) e a camada de THF foi separada. A fase aquosa foi extraída com diclorometano e os solventes orgânicos combinados foram lavados de novo com solução salina e passados através de MgSCb. O produto bruto foi purificado por cromatografia em gel de sílica, utilizando mistura de acetato de etilo/hexanos (10% - 30 %), obtendo-se (2,64 g, 60% de rendimento) o composto 32.

Os compostos 32-35 foram sintetizado pelo Método Geral de Síntese B. MS m/z C12H12N2O2S2 [M+l]+ = 281. ΧΗ RMN (400 MHz, DMSO-de) ppm 12,86 (s.lg., 1 H) , 8,85 (s, 1 H) , 4,20 (s, 2 H) , 2,65 (s, 3 H) , 1,99 (tt, J= 8, 63, 5,43 Hz, 1 H) , 1,23 -1,30 (m, 2 H) , 0, 88 - 0, 97 (m, 2 H) . 6.15. Método Geral de Síntese L: Preparação de ácido 4-(carboximetiltio)-7-metiltieno[3,2-d]pirimidine-6-carboxílico (40)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo especifico descrito a seguir:

O composto 36 pode ser obtido comercialmente disponível. O composto 37 foi sintetizado pelo Método Geral de Síntese B. Síntese de 38: A uma solução agitada de tiofeno 37 (368 mg, 2 mmole, 1,0 eq.) em THF anidro (5 mL) , a -30°C, foi adicionada uma solução de LDA (2,2 mmole, 1,1 eq) em THF (preparada de fresco por mistura de 0,34 mL de diisopropilamina e 0,96 mL de nBuLi 2,5 M, a -30°C, em 5 mL de THF). A mistura reacional passou de transparente para amarela. Após 20 minutos, cloroformato de etilo (0,28 mL, 3 mmole, 1,5 eq) foi adicionado gota a gota. A reação foi interrompida com água, após aquecimento até à temperatura ambiente, num banho frio. A mistura foi diluída com 10 mL de acetato de etilo, extraída com acetato de etilo (10 mL x 2 vezes) . A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura, seca com Na2SC>4 e concentrada. A mistura bruta foi então absorvida em gel de sílica e purificada por cromatografia flash (eluída com DCM a 10%/EA), obtendo-se o éster 38 na forma de um sólido branco (127 mg, 25% de rendimento).

Os compostos 39 e 40 foram sintetizados pelo Método Geral de Síntese B. 6.16. Método Geral de Síntese M: Preparação de ácido 2-(6-ciano-7-mstiltisno[3,2-d]pirimidin-4-iltio)acético (44) s ácido_2- (6-carbamoíl-7-metiltieno [3,2-d] pirimidin-4- iltio)acético (46)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelos exemplos específicos descrito a seguir:

Sintese de 41: A uma solução de 37 (368 mg, 2 mmole, 1,0 eq.), preparado pelo Método Geral de Síntese B, em THF anidro (5 mL) e a -30°C, foi adicionada uma solução de LDA (2,2 mmole, 1,1 eq) em THF (preparada de fresco por mistura de 0,34 mL de diisopropilamina e 0,96 mL de nBuLi 2,5 M a -30°C em 5 mL de THF). A mistura reacional passou de translúcida a amarela. Após 20 min, foi adicionado iodo (609 mg, 2,4 mmole, 1,2 eq) gota a gota. A reação foi interrompida com água após ter sido aquecida até à temperatura ambiente, num banho frio.

Diluiu-se a mistura reacional com 10 mL de acetato de etilo e extraiu-se com acetato de etilo (10 mL x 2) . A fase orgânica combinada foi lavada com solução salina, seca com Na2SC>4 e concentrada. A mistura bruta foi então absorvida em gel de silica e purificada por cromatografia flash (eluida com Hexano a 10%/Acetato de etilo), obtendo-se o composto 41 na forma de um sólido branco (407 mg, 65% de rendimento).

Os compostos 42 e 43 foram sintetizados pelo Método Geral de Síntese B. Síntese de 44: Ao composto 43 (70 mg, 0,19 mmole, 1 eq.) em DMF (1 mL) foi adicionado Pd(PPh3)4 (44 mg, 0,038 mmole, 0,2 eq.) e Zn (CN) 2 (30 mg, 0,25 mmole, 1,1 eq) . O frasco foi

desgaseificado com N2 durante 5 minutos antes de ser tapado. A mistura reacional foi então aquecida sob irradiação de microondas a 100°C durante 1,5 horas. Todo o solvente foi removido e o resíduo foi purificado por cromatografia preparativa de camada fina, obtendo-se um sólido branco (28 mg, 42% de rendimento) . MS m/z C10H7N3O2S2 [M+l]+ = 266, 0; 1H RMN (400 MHz, DMSO-de) ppm 9,09 (s, 1 H) , 4,12 (s. lg., 2 H) 2, 60(s,3H) . Síntese de 46: O composto 45 (40 mg, 0,142 mmole, 1 eq.), preparado pelo Método Geral de Síntese M, foi adicionado a 1 mL de MeOH. A esta solução, adicionou-se NaOH IN (2,1 mL) . A mistura resultante foi então agitada à temperatura ambiente antes de ser neutralizada por adição de HC1 1 N. A mistura reacional foi purificada por HPLC preparativa, obtendo-se o composto 46 na forma de um sólido branco (12 mg, 29% de rendimento) . MS m/z C10H9N3O3S2 [M+l]+ = 284,0, observado 224. Ή RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) ppm 8,83 (s, 1 H) 6,06 - 6,36 (m, 2 H) 4,20 (s, 2 H) 2,77 (s, 3 H). 6.17. Método Geral de Síntese N: Preparação de ácido 2-(3-cloro-2-metiltieno[3,2-c]piridin-4-iltio)acético (50)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

0 composto 47 está comercialmente disponível. 0 composto 48 foi sintetizado pelo Método Geral A. Os compostos 49 e 50 foram sintetizados pelo Método Geral B. 6.18. Método Geral de Síntese O: Preparação de ácido 2-(5,6-dimetilfuro[2,3-d]piridin-4-iltio)acético (55)

Esta abordagem geral à síntese de compostos abrangidos pela invenção é ilustrada pelo exemplo específico descrito a seguir:

Síntese de 52: Num balão e fundo redondo de 50 mL, 2-amino-4,5-dimetilfuran-3-carbonitrilo 51 (1 g, 7,4 mmole) foi combinado com ácido fórmico (15 mL) como solvente. Esta mistura foi aquecida à temperatura de refluxo durante 6 horas. A mistura reacional foi arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada sob bomba de vácuo. Depois, adicionou-se diclorometano lavado com H2O. A seguir, o produto bruto foi passado através de Na2SC>4 e concentrado, obtendo-se dimetilfuropirimidinol bruto 52 como um produto bruto, que foi diretamente utilizado no passo seguinte. Síntese de 53: Suspendeu-se 5,6-dimetilfuro[2,3-d] pirimidin-4-ol 52 (700 mg, 4,3 mmole, 1 eq.) em POCI3 (10 mL, 100 mmole, 23 eq.) e aqueceu-se a 90°C durante 3 horas. Após arrefecimento, a mistura reacional foi concentrada e o resíduo arrefecido até 0°C. Foi então adicionada água arrefecida em gelo lentamente para assegurar o consumo completo de POCI3. A solução negra foi extraída três vezes com acetato de etilo. Os extratos orgânicos combinados foram lavados duas vezes com NaHC03 saturado aquoso, uma vez com salmoura, secos sobre MgS04, filtrados e concentrados, produzindo o sólido castanho claro 4-cloro-5,6-dimetilfuro[2,3-d]pirimidina 53 (350 mg, 55% de rendimento), que foi imediatamente utilizada após secagem completa. Síntese de 54: Suspendeu-se 4-cloro-5,6-dimetilfuro[2,3-d]pirimidina 53 (350 mg, 1,91 mmole, 1 eq.) em metanol (10 mL) e arrefeceu-se até 0°C. Adicionou-se 2-mercaptoacetato de metilo (0,13 mL, 2,0 mmole, 1,05 eq.) lentamente, seguido pela adição lenta de TEA (0,39 mL, 3,84 mmole, 2,1 eq.) . Após agitação durante 90 minutos, a mistura reacional foi concentrada. O resíduo foi tomado em acetato de etilo e filtrou-se através de um rolhão de gel de sílica para remover sais e alguma cor. O filtrado foi concentrado e purificado utilizando cromatografia em gel de sílica com 0-15% de acetato de etilo em hexanos, obtendo-se 2-(5,6-dimetilfuro[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de metilo 54 (420 mg, 90% de rendimento) na forma de um sólido. Síntese de 55: Adicionou-se 2-(5,6-dimetilfuro[2,3-d]pirimidin-4-iltio)acetato de metilo 54 (400 mg, 1,58 mmole, 1 eq.) a THF (10 mL) e acrescentou-se NaOH aquoso 1 N (3,2 mL, 3,2 mmole, 2 eq.), sob agitação eficiente. Após 40 minutos, a mistura reacional foi concentrada, combinou-se o resíduo com água, arrefeceu-se até 0°C e acidificou-se para um pH baixo com HC1 1 N. O precipitado foi recolhido por filtração a vácuo e lavado com água. A secagem sob vácuo durante a noite produziu ácido 2-(5,6-dimetilfuro[2,3-d]pirimidin-4-iltio) acetático puro 55 (353 mg, 94% de rendimento) na forma de um sólido. 6.19. Método Geral de Síntese P: Preparação de ácido 2-(7-ciclopropil-6-(trifluorometil)tieno[3,2-d]pirimidin-4- il)tio)acético (60):

Os compostos 26, 56, 57, 58 e 60 foram sintetizados pelo Método Geral de Síntese J.

Sintese de 59: Num balão de fundo redondo de 100 mL com Ru(fen)3Cl2 (14 mg, 0,01 equiv) e K2HPO4 (930 mg, 3 equiv) , a mistura reacional foi desgaseifiçada alternando evacuação a vácuo e enchimento com azoto (x3) antes de se adicionar MeCN (20 mL, 0,125 M) e 2-(7-ciclopropiltieno[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)acetato de etilo 58 (500 mg, 1 equiv) com uma seringa. A solução resultante foi desgaseifiçada alternando evacuação a vácuo e enchimento com azoto (x3) a -78°C, deixando a solução aquecer até à temperatura ambiente sob azoto entre cada iteração. Cloreto de triflilo (0,4 mL, 2 equiv) foi adicionado com uma seringa e o frasco foi selado com parafilme e colocado aproximadamente a 2 cm de uma lâmpada fluorescente compacta de 25 W. Após 48 horas, a reação foi interrompida com água (2 mL) e extraiu-se com CH2CI2 (x2), e as camadas orgânicas combinadas foram secas com MgSCb e concentradas sob vácuo. 0 material bruto foi então purificado por HPLC prep sob condições neutras, obtendo-se 2-(7-ciclopropil-6-(trifluorometil)tieno[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)acetato de metilo 59 (62 mg) com 10% de rendimento. 6.20. Compostos Representativos

Numerosos compostos foram preparados e testados quanto à sua atividade em um ou mais dos ensaios aqui descritos. Alguns destes compostos são listados a seguir na Tabela 1, em que a coluna "Prep" indica o método geral de síntese utilizado para fazer o composto referido. A coluna "Método de HPLC & Tempo (min)" refere-se às seguintes condições de HPLC: A: Sunfire C18 5u 4,6 x 50 mm, 10% a 90% B, tempo de gradiente = 2 min, caudal =3,5 mL/min, comprimento de onda = 220 e 254 nm, solvente A = acetato de amónio aquoso 10 mM, solvente B = acetonitrilo. B: Sunfire C18 5u 4,6 x 50 mm, 10% a 90% B, tempo de gradiente = 2 min, caudal =3,5 mL/min, comprimento de onda = 254 e 280 nm, solvente A = água purificada, solvente B = 95% metanol/5% água com ácido trifluoroacético 0,1% (v/v). A coluna "CI50" apresenta as CI50 dos compostos conforme determinadas pelo ensaio de ligação aqui descrito, em que: **** significa um valor inferior ou igual a 0,025 μΜ; *** significa um valor inferior ou igual a 0,05 μΜ; ** significa um valor inferior ou igual a 0,1 μΜ; * significa um valor inferior ou igual a 0,25 μΜ; e -- significa que a CI50 não foi determinada. A coluna "CE50" apresenta as CE50 dos compostos conforme determinadas pelo ensaio repórter aqui descrito, em que: **** significa um valor inferior ou igual a 1 μΜ; *** significa um valor inferior ou igual a 5 μΜ; ** significa um valor inferior ou igual a 10 μΜ; * significa um valor inferior ou igual a 15 μΜ; e -- significa que a CE50 não foi determinada.

6.21. Farmacologia do ácido 2-((5,6-dimetiltieno[2,3-d]pirimidin-4-il)tio)acético

Num primeiro estudo, o efeito in vivo do ácido 2-((5,6-dimetiltieno[2,3-d]pirimidin-4-il)tio)acético foi determinado por tratamento de murganhos F1 machos híbridos (129xC57) durante 25 dias com o composto, começando às 10,7 semanas de idade. O composto foi administrado na alimentação dos animais. Quatro grupos de murganhos foram utilizados: controlo (N = 12) ; 25 mg/kg composto (N = 9); 83 mg/kg composto (N = 9); e um grupo adicional em que LÍ2CO3 foi administrado nos alimentos (0,1%) (N = 9). A espessura cortical do eixo médio do fémur foi medida utilizando um Scanco mCT40. Em comparação com o grupo de controlo, um aumento na espessura do osso cortical foi observado para ambas as doses de composto: 9% (p = 0,04) a 25 mg/kg; e 8% (p = 0,07) a 83 mg/kg. Para o grupo LÍ2CO3, um decréscimo na espessura do osso cortical de 2% (p = 0,90) foi observado.

Num segundo estudo, o efeito in vivo do ácido 2-((5,6-dimetiltieno[2,3-d]pirimidin-4-il)tio)acético foi determinado por tratamento de murganhos F1 machos híbridos (129xC57) durante 25 dias com o composto, começando uma vez mais às 10,7 semanas de idade. O composto foi administrado nos alimentos dos animais. Quatro grupos de murganhos foram utilizados: controlo (N = 12) ; 1 mg/kg de composto (N = 9) ; 8 mg/kg de composto (N = 9); e 24 mg/kg de composto (N = 9). Como se pode ver na Figura 5, os murganhos tratados com 8 mg/kg exibiram um aumento de 4% (p = 0,19) na espessura do eixo médio do fémur cortical, e os murganhos tratados com 24 mg/kg exibiram urn aumento de 6% (p = 0,05) . 6.22. Farmacologia de ácido 2-((5-cloro-6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-il)tio)acético

A farmacologia do ácido 2-( (5-cloro-6-metiltieno[2,3-d]pirimidin-4-il)tio)acético foi estudada em ratos ovariectomizados Fischer 344. Os ratos foram submetidos a ovariectomias ou cirurgias de simulação às 43 ou 46 semanas de idade, e o tratamento com o composto começou às 37 ou 40 semanas depois, às 83 semanas de idade.

Quatro grupos de tratamento foram utilizados: cirurgia de simulação com alimentação de controlo (N = 14); cirurgia de simulação com composto (N = 12); cirurgia OVX com alimentação de controlo (N = 14); e cirurgia OVX com composto (N = 12). O composto foi administrado por incorporação nos alimentos dos ratos: 0,46 gramas de composto por kg de dieta. A dose alvo foi de 30 mg/kg. A administração ocorreu durante cinco semanas. A massa e arquitetura óssea foram determinadas por microCT, utilizando um Scanco mCT40. Como apresentado na

Figura 6, o tratamento aumentou a espessura do osso cortical do eixo médio do fémur em ambos os grupos, de simulação e OVX: 3% nos ratos intactos e 5% nos ratos ovariectomizados. A diferença entre as espessuras do osso cortical do controlo de simulação e do controlo de OVX foi de -13%. Os valores ANOVA de dois fatores foram: p < 0,001 para a cirurgia OVX; p = 0,05 para o tratamento; e p = 0,65 para a interação.

Como se pode ver na Figura 7, o tratamento também aumentou a espessura cortical do eixo médio da tibia em ambos os grupos, de simulação e OVX: 2% nos ratos intactos e 5% nos ratos ovariectomizados. Os valores de ANOVA de dois fatores foram: p = 0,79 para a cirurgia OVX; p = 0,05 para o tratamento; e p = 0,52 para a interação. 6.23. Farmacologia_do_ácido_2- ( (5-cloro-6- isopropiltieno[2,3-d]pirimidin-4-il)tio)acético

O efeito in vivo do ácido 2-((5-cloro-6- isopropiltieno[2,3-d]pirimidin-4-il)tio)acético foi determinado por tratamento de murganhos F1 machos híbridos (129xC57) durante 25 dias com o composto, começando às 8,7 semanas de idade. O composto foi administrado duas vezes ao dia por gavagem oral (veículo = 0,1% de Tween 80 em água). Quatro grupos de murganhos foram utilizados: controlo (N = 13) ; 5 mg/kg de composto (N = 13); 10 mg/kg de composto (N = 13); 15 mg/kg de composto (N = 13). A espessura cortical do eixo médio do fémur foi medida por microCT (Scanco mCT40). Em comparação com o grupo de controlo, foi observado um aumento na espessura do osso cortical em todas as doses: 6% (p = 0,002) a 5 mg/kg; 5% (p = 0,007) a 10 mg/kg; e 6% (p = 0,001) a 15 mg/kg. 6.24. Farmacologia_do_ácido_2- ( (6-cloro-7- ciclopropiltieno[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)acético

0 efeito in vivo do ácido 2-((6-cloro-7-ciclopropiltieno[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)acético foi determinado por tratamento de murganhos F1 machos híbridos (129xC57) durante 25 dias com o composto, começando às 8,7 semanas de idade. 0 composto foi administrado por gavagem oral diária (veículo = 0,1% de Tween 80 em água) . Quatro grupos de murganhos foram utilizados: controlo (N = 13); 3 mg/kg de composto (N = 13); 10 mg/kg de composto (N = 13); 30 mg/kg de composto (N = 13). A espessura cortical do eixo médio do fémur foi medida por microCT (Scanco mCT40) . Como se pode ver na Figura 8, um aumento na espessura do osso cortical foi observado para todas as doses em comparação com os controlo: 7% (p = 0,003) a 3 mg/kg; 10% (p < ,001) a 10 mg/kg; e 13% (p < 0,001) a 30 mg/kg. 6.25. Farmacologia do ácido 2-((6-cloro-7-metiltieno[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)acético

Numa primeira experiência, o efeito in vivo do ácido 2-((6-cloro-7-metiltieno[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)acético foi determinado por tratamento de murganhos F1 machos híbridos (129xC57) durante 25 dias com o composto, começando às 54 semanas de idade. 0 composto foi administrado por gavagem oral diária (veículo = 0,1% de Tween 80 em água) . Três grupos de murganhos foram utilizados: controlo (N = 10); 10 mg/kg de composto (N = 10) ; e 100 mg/kg de composto (N = 10) . Um aumento na espessura do osso cortical do eixo médio do fémur, medido por microCT (Scanco mCT40), foi observado em ambas as doses em comparação com o controlo: 6% (p = 0,06) a 10 mg/kg; e 7% (p=0,03) a 100 mg/kg. Neste teste, como foi geralmente o caso, os valores da espessura cortical do eixo médio do fémur foram obtidos para o fémur direito de cada murganho. Neste teste, os resultados para o grupo de dose de 10 mg/kg incluem uma medição do fémur esquerdo para um dos murganhos cujas medições do fémur direito eram anormais.

Numa segunda experiência, o efeito in vivo do ácido 2-((6-cloro-7-metiltieno[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)acético foi determinado por tratamento de murganhos F1 machos híbridos (129xC57) durante sete e 18 dias com o composto, começando às 8,1 semanas de idade. 0 composto foi administrado na dieta dos animais. Três grupos de murganhos foram utilizados: controlo (N = 9) ; 34 mg/kg de composto durante sete dias (N = 9); e 34 mg/kg de composto durante 18 dias (N = 9). Como se pode ver na Figura 9, um aumento na espessura do osso cortical do eixo médio do fémur foi observado para ambos os grupos de tratamento em comparação com o controlo: 6% (p = 0,13) após sete dias de tratamento; e 10% (p <0,01) após 18 dias de tratamento.

Lisboa, 2015-03-30

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto da fórmula:

   ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: X é ORib ou N (Rib) 2; cada Rib é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R2 é hidrogénio, halo, -CO2R2A, -C (0) N (R2a) 2, -SR2A, -OR2A, —N (R2a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R2A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R3 é hidrogénio, halo, ciano, -CO2R3A, -C (0) N (R3a) 2, -SR3a, -OR3A, —N (R3a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R3A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R5 é hidrogénio, halo, -CO2R5A, -C (0) N (R5a) 2, -SRsa, -OR5A, —N (Rsa) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R.5a é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; e n é 1 ou 2; em que "opcionalmente substituído" significa opcionalmente substituído com um ou mais entre alcoxi, alquilo, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino), arilo, ácido carboxílico, ciano, halo, haloalquilo, heterociclo, ou hidroxilo.
2. 2. Composto da fórmula:

   ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: X é ORib ou N (Rib) 2; cada Rib é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R2 é hidrogénio, halo, -CO2R2A, -C (0) N (R2a) 2, —SR2A, -OR2A, —N (R2a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R2A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R3 é hidrogénio, halo, ciano, -CO2R3A, -C (0) N (R3a) 2, -SR3A, -OR3A, —N (R3a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R.3a é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R4 é hidrogénio, halo, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R5 é hidrogénio, halo, -CO2R5A, -C (0) N (R5a) 2, -SRsa, -OR5A, —N (Rõa) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R5A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; e n é 1 ou 2; em que "opcionalmente substituído" significa opcionalmente substituído com um ou mais entre alcoxi, alquilo, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino), arilo, ácido carboxílico, ciano, halo, haloalquilo, heterociclo, ou hidroxilo.
3. 3. Composto da reivindicação 1 ou 2, em que X é ORib.
4. 4. Composto de qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que Rib é hidrogénio ou alquilo ou arilo opcionalmente substituídos.
5. 5. Composto da reivindicação 4, em que Rib é hidrogénio ou alquilo.
6. 6. Composto de qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que R2 é hidrogénio ou alquilo opcionalmente substituído.
7. 7. Composto de qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que R3 é alquilo ou halo.
8. 8. Composto da reivindicação 7, em que R3 é cloro.
9. 9. Composto de qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que Rs é alquilo ou halo.
10. 10. Composto da reivindicação 9, em que Rs é alquilo Ci-4.
11. 11. Composto ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, composto esse que é o ácido 2-((5,6-dimetiltieno[2,3-d]pirimidin-4-il)tio)acético, o ácido 2-( (5-cloro-6- isopropiltieno[2,3-d]pirimidin-4-il)tio)acético, o ácido 2-( (6-cloro-7-ciclopropiltieno[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)acético, ou o ácido 2-((6-cloro-7-metiltieno[3,2-d]pirimidin-4-il)tio)acético.
12. 12. Composição farmacêutica que compreende um composto de qualquer das reivindicações de 1 a 11 e um excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
13. 13. Composto de qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 para utilização como um medicamento para o tratamento ou gestão de uma doença ou distúrbio caracterizados por perda óssea.
14. 14. Composto da fórmula:

    ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização como um medicamento para o tratamento ou gestão de uma doença ou distúrbio caracterizados por perda óssea, em que: X é ORib ou N (Rib) 2; cada Rib é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R2 é hidrogénio, halo, -CO2R2A, -C (O) N (R2a) 2, —SR2A, -OR2A, —N (R2a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R.2a é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R3 é hidrogénio, halo, ciano, -CO2R3A, -C (0) N (R3a) 2, -SR3a, -OR3A, —N (R3a) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; cada R3A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; R5 é hidrogénio, halo, -CO2R5A, -C (0) N (R5a) 2, -SRsa, -OR5A, —N (Rsa) 2, ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; e cada R5A é independentemente hidrogénio ou alquilo, arilo, heteroalquilo, ou heterociclo opcionalmente substituídos; em que "opcionalmente substituído" significa opcionalmente substituído com um ou mais entre alcoxi, alquilo, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino), arilo, ácido carboxílico, ciano, halo, haloalquilo, heterociclo, ou hidroxilo. Lisboa, 2015-03-30