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CN103328481A - 背板胶质乙酰酯酶的抑制剂及其应用方法 - Google Patents

背板胶质乙酰酯酶的抑制剂及其应用方法 Download PDF

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CN103328481A
CN103328481A CN2011800442957A CN201180044295A CN103328481A CN 103328481 A CN103328481 A CN 103328481A CN 2011800442957 A CN2011800442957 A CN 2011800442957A CN 201180044295 A CN201180044295 A CN 201180044295A CN 103328481 A CN103328481 A CN 103328481A
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heteroalkyl
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肯尼斯·格尔顿·卡松
迈克尔·瓦尔特·加德彦
何伟
维多利亚·罗姆巴多
普拉温·帕巴
小詹姆斯·塔弗
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Abstract

本发明公开了用于治疗、管控和防止影响骨的疾病和障碍的化合物。具体化合物是背板胶质乙酰酯酶的强效抑制剂，并具有下式：，其中E、G、Y、Z、R1、R2和R3被定义在本文中。

Description

背板胶质乙酰酯酶的抑制剂及其应用方法
本申请要求2010年9月14日提交的美国临时专利申请no.61/382,526的优先权，所述临时专利申请在此以其全文引为参考。
技术领域
本发明涉及背板胶质乙酰酯酶的小分子抑制剂、包含所述抑制剂的组合物及其应用方法。
背景技术
骨健康取决于骨形成性成骨细胞与骨再吸收性破骨细胞的协调活性。“骨更新反映出这些合成代谢和分解代谢细胞功能之间的平衡，并确保成熟骨骼能够在受损时修复其自身并能通过将矿物质例如钙和磷释放到血液循环中来维持其内分泌功能。”Allen,J.G.等，J.Med. Chem.,53(June10,2010),pp.4332–4353,4332。许多疾病状态改变这种平衡，引起骨质量的增加或降低或骨品质的改变。骨矿物质密度的逐渐损失被称为骨质减少；骨的严重损失被称为骨质疏松症。同上。
目前用于治疗和防止骨质疏松症的护理标准利用二膦酸盐类的口服小分子抗再吸收剂。同上，在4333页。唑来膦酸、雷洛昔芬、钙和维生素D增补剂典型地也用于骨质疏松症治疗。同上。尽管抗再吸收剂能够帮助防止骨损失，但同化剂“能够较大程度增加骨质量，……并且还具有改善骨品质和增加骨强度的能力。”Guo,H.等，J.Med. Chem.,53(February25,2010),pp.1819–1829,1819。在美国，人PTH是FDA批准的唯一同化剂。同上；Allen，在4333页。“由于缺乏用于骨质疏松症治疗的可用同化剂，因此对于开发用于治疗这种疾病的无毒、成本效益高并易于施用的小分子化合物，存在迫切需求。”Guo，在1819页。
“尽管与抗再吸收疗法相比，刺激骨形成的药剂的开发进展较少，但已知有几种途径可促进成骨细胞的功能。”Allen，在4338页。这些途径包括骨形态发生蛋白、转化生长因子β、甲状旁腺激素、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子和无翅型MMTV整合位点（WNT）信号转导。同上。Guo及合作者最近报道了关于这些途径中的第一种的结果。Guo，同上。具体来说，他们报道了某些取代的苯并噻吩和苯并呋喃化合物在小鼠和大鼠中增强骨形态发生蛋白2的表达。所报道的化合物中的两种在体内刺激骨形成和骨小梁连接性的恢复。同上，在1819页。
这些途径中的另一种途径是WNT途径，其与多种发育和再生过程相关。Allen，在4340页。然而，该途径是复杂的，关于它的更多知识以及关于它的组分如何影响骨，尚不清楚。例如，已经提出，其突变与人类中骨质量增加相关的LRP-5，以及典型的WNT信号转导通过其发生的β-连环蛋白，“可能不是经由WNT信号转导直接相连来控制骨质量的。”同上。
最近的基因表达数据分析导致鉴定到WNT信号转导的新靶点。参见例如Torisu,Y.等，Cancer Sci.,99(6):1139-1146,1143(2008)。一个这样的靶点是背板胶质乙酰酯酶，也称为NOTUM和LOC174111。
发明概述
本发明涵盖了下式的化合物及其药学可接受的盐：
Figure BDA00002918764400021
其中：E与G之一是氮，并且E与G中的另一个是氮或CR4；Y与Z之一是CR5，并且Y与Z中的另一个是O或S(O)m，其中m为0、1或2；R1是卤素、-R1A、-OR1A、-S(O)nR1A、–S(O)nOR1A或–S(O)nN(R1A)2，其中n为0、1或2；每个R1A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R2是氢、卤素、-CO2R2A、-C(O)N(R2A)2、-SR2A、-OR2A、-N(R2A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R2A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R3是氢、卤素、氰基、-CO2R3A、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A、-N(R3A)2、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环，或者与R5和它们所连接的原子一起形成任选取代的环状部分；每个R3A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R4是氢、卤素或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R5是氢、卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环，或者与R3和它们所连接的原子一起形成任选取代的环状部分；并且每个R5A是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环。
本发明涵盖了包含本文公开的化合物的药物组合物。
本发明还涵盖了使用本文公开的化合物抑制背板胶质乙酰酯酶（“NOTUM”）的方法，刺激内皮质骨形成的方法，以及治疗、管控和防止与骨损失相关的疾病和障碍例如骨质疏松症的方法。
附图说明
参考附图可以理解本发明的某些方面。
图1提供了NOTUM纯合敲除小鼠（“HOM”）与其野生型同窝幼仔（“WT”）中各种骨部位的皮质厚度之间的差异的图示。
图2提供了在NOTUM纯合和杂合（“HET”）敲除小鼠两者中观察到的与其野生型同窝幼仔相比的皮质骨厚度的增加的图示。
图3提供了从在雄性NOTUM纯合和杂合敲除小鼠及其野生型同窝幼仔的骨上进行的股骨断裂强度和脊柱压缩试验获得的结果的图示。
图4提供了从在雌性NOTUM纯合和杂合敲除小鼠及其野生型同窝幼仔的骨上进行的股骨断裂强度和脊柱压缩试验获得的结果的图示。
图5提供了在用1mg/kg、8mg/kg和24mg/kg的NOTUM抑制剂2-((5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸给药F1雄性杂交（129x C57）小鼠25天后获得的中段股骨干的皮质厚度测量结果的图示。
图6提供了在用2-((5-氯-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸给药Fischer344卵巢切除大鼠5周后获得的中段股骨干的皮质厚度测量结果的图示，其中“假手术对照”是指没有切除卵巢且没有施用化合物的大鼠；“假手术加化合物”是指没有切除卵巢但施用化合物的大鼠；“OVX对照”是指卵巢切除但没有施用化合物的大鼠；“OVX加化合物”是指卵巢切除且施用化合物的大鼠。
图7提供了从与图6相关的同一实验获得的中段胫骨干的皮质厚度测量结果的图示。
图8提供了在用3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的NOTUM抑制剂2-((6-氯-7-环丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸给药F1雄性杂交（129x C57）小鼠25天后获得的中段股骨干的皮质厚度测量结果的图示。
图9提供了在用34mg/kg的NOTUM抑制剂2-((6-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸给药F1雄性杂交（129x C57）小鼠7天和18天后获得的中段股骨干的皮质厚度测量结果的图示。
发明详述
本发明部分基于抑制NOTUM能够影响内皮质骨形成这一发现。本发明的具体方面是基于对缺乏功能性NOTUM基因的小鼠（“敲除小鼠”）的研究，基于抑制NOTUM的化合物的发现，以及基于这样的化合物可以用于在小鼠和大鼠中刺激皮质骨形成这一发现。
定义
除非另有指明，否则术语“烯基”是指具有2至20个（例如2至10个或2至6个）碳原子并包括至少一个碳-碳双键的直链、支链和/或环状烃。代表性的烯基部分包括乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基和3-癸烯基。
除非另有指明，否则术语“烷氧基”是指-O-烷基。烷氧基的实例包括但不限于-OCH3、-OCH2CH3、-O(CH2)2CH3、-O(CH2)3CH3、-O(CH2)4CH3和-O(CH2)5CH3。
除非另有指明，否则术语“烷基”是指直链、支链和/或环状（“环烷基”）烃。非环状烷基部分可以具有1至20个（例如1至10个或1至4个）碳原子；环状烷基部分可以具有3-20个（例如3-10个或3-6个）碳原子。具有1至4个碳原子的烷基部分被称为“低级烷基”。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、异己基、庚基、4,4-二甲基戊基、辛基、2,2,4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。环烷基部分可以是单环或多环的，其实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基和金刚烷基。烷基部分的其他实例具有直链、支链和/或环状部分（例如1-乙基-4-甲基-环己基）。术语“烷基”包括饱和烃以及烯基和炔基部分。
除非另有指明，否则术语“烷基芳基”或“烷基-芳基”是指结合于芳基部分的烷基部分。
除非另有指明，否则术语“烷基杂芳基”或“烷基-杂芳基”是指结合于杂芳基部分的烷基部分。
除非另有指明，否则术语“烷基杂环”或“烷基-杂环”是指结合于杂环部分的烷基部分。
除非另有指明，否则术语“炔基”是指具有2至20个（例如2至20个或2至6个）碳原子并包括至少一个碳-碳叁键的直链、支链或环状烃。代表性的炔基部分包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、5-己炔基、1-庚炔基、2-庚炔基、6-庚炔基、1-辛炔基、2-辛炔基、7-辛炔基、1-壬炔基、2-壬炔基、8-壬炔基、1-癸炔基、2-癸炔基和9-癸炔基。
除非另有指明，否则术语“芳基”是指由碳和氢原子构成的芳香环或者芳香族或部分芳香族的环系统。芳基部分可以包含结合或稠合在一起的多个环。芳基部分的实例包括但不限于蒽基、薁基、联苯基、芴基、茚满、茚基、萘基、菲基、苯基和1,2,3,4-四氢-萘。
除非另有指明，否则术语“芳基烷基”或“芳基-烷基”是指结合于烷基部分的芳基部分。
除非另有指明，否则术语“卤素”和“卤”涵盖氟、氯、溴和碘。
除非另有指明，否则术语“杂烷基”是指其中至少一个碳原子已被杂原子（例如N、O或S）代替的烷基部分（直链、支链或环状）。
除非另有指明，否则术语“杂烷基芳基”或“杂烷基-芳基”是指结合于烷基部分的杂烷基部分。
除非另有指明，否则术语“杂烷基杂环”或“杂烷基-杂环”是指结合于杂环部分的杂烷基部分。
除非另有指明，否则术语“杂芳基”是指其中至少一个碳原子已被杂原子（例如N、O或S）代替的芳基部分。其实例包括但不限于吖啶基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并喹唑啉基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、呋喃基、咪唑基、吲哚基、异噻唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、酞嗪基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、四唑基、噻唑基和三嗪基。
除非另有指明，否则术语“杂芳基烷基”或“杂芳基-烷基”是指结合于烷基部分的杂芳基部分。
除非另有指明，否则术语“杂环”是指由碳、氢和至少一个杂原子（例如N、O或S）构成的芳香族、部分芳香族或非芳香族的单环或多环的环或环系统。杂环可以包括稠合或结合在一起的多个（即两个以上）环。杂环包括杂芳基。其实例包括但不限于苯并[1,3]二氧杂环戊烯基、2,3-二氢-苯并[1,4]二氧杂环己烯基、噌啉基、呋喃基、乙内酰脲基、吗啉基、氧杂环丁基、环氧乙烷基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基和戊内酰胺基。
除非另有指明，否则术语“杂环基-烷基”或“杂环-烷基”是指结合于烷基部分的杂环部分。
除非另有指明，否则术语“杂环烷基”是指非芳香族杂环。
除非另有指明，否则术语“杂环烷基烷基”或“杂环烷基-烷基”是指结合于烷基部分的杂环烷基部分。
除非另有指明，否则术语“管控”涵盖在已经患有特定疾病或障碍的患者中防止所述疾病或障碍的复发，和/或延长患有所述疾病或障碍的患者处于缓解状态的时间。该术语涵盖调节所述疾病或障碍的阈值、发展和/或持续时间，或改变患者对所述疾病或障碍作出响应的方式。
除非另有指明，否则术语“药学可接受的盐”是指从药学可接受的无毒性酸或碱制备的盐，所述酸或碱包括无机酸和无机碱以及有机酸和有机碱。适合的药学可接受的碱加成盐包括但不限于由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属盐，或由赖氨酸、N,N’-二苯甲基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺（N-甲基葡萄糖胺）和普鲁卡因制成的有机盐。适合的无毒性酸包括但不限于无机酸和有机酸，例如乙酸、藻酸、邻氨基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯磺酸、甲酸、延胡索酸、呋喃甲酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、硫酸、酒石酸和对甲苯磺酸。具体的无毒性酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和甲磺酸。因此，具体的盐的实例包括盐酸盐和甲磺酸盐。其他药学可接受的盐在本领域中是公知的。参见例如《雷氏药学》（Remington’s Pharmaceutical Sciences）第18版（Mack Publishing,Easton PA:1990）和《雷明顿：药学科学和实践》（Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy）第19版（Mack Publishing,Easton PA:1995）。
除非另有指明，否则术语“防止”意指在患者开始患上特定疾病或障碍之前发生的抑制或减轻所述疾病或障碍的严重性的行动。换句话说，该术语涵盖了预防。
除非另有指明，否则化合物的“预防有效量”是足以防止疾病或病症或与所述疾病或病症相关的一种或多种症状或者防止其复发的量。化合物的“预防有效量”是指单独或与其他药剂组合能够在防止疾病中提供预防益处的治疗剂的量。术语“预防有效量”可以涵盖改善总体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。
除非另有指明，否则术语“取代的”在用于描述化学结构或部分时，是指所述结构或部分中一个或多个氢原子被化学部分或官能团取代的衍生物，所述化学部分或官能团例如但不限于醇、醛、烷氧基、烷酰氧基、烷氧基羰基、烯基、烷基（例如甲基、乙基、丙基、环丙基、叔丁基）、炔基、烷基羰基氧基（-OC(O)烷基）、酰胺（例如-C(O)NH-烷基-、-烷基NHC(O)烷基）、脒基（例如-C(NH)NH-烷基-、-C(NR)NH2）、胺（伯胺、仲胺和叔胺例如烷基氨基、芳基氨基、芳基烷基氨基）、芳酰基、芳基、芳氧基、偶氮、羧酰胺基（例如-NHC(O)O-烷基-、–OC(O)NH-烷基）、氨甲酰基（例如CONH2、CONH-烷基、CONH-芳基、CONH-芳基烷基）、羰基、羧基、羧酸、羧酸酐、羧酰氯、氰基、酯、环氧化物、醚（例如甲氧基、乙氧基）、胍基、卤素、卤代烷基（例如-CCl3、-CF3、-C(CF3)3）、杂烷基、半缩醛、亚胺（伯亚胺和仲亚胺）、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酮、腈、硝基、氧代、磷酸二酯、硫化物、磺酰胺基（例如SO2NH2）、砜、磺酰基（包括烷基磺酰基、芳基磺酰基和芳基烷基磺酰基）、亚砜、硫醇（例如氢硫基、硫醚）和脲（例如-NHCONH-烷基-）。具体的取代基是烷氧基、烷基、氨基（包括烷基氨基、二烷基氨基）、芳基、羧酸、氰基、卤素、卤代烷基、杂环和羟基。
除非另有指明，否则化合物的“治疗有效量”是足以在疾病或病症的治疗或管控中提供治疗益处或者使与所述疾病或病症相关的一种或多种症状延迟或最小化的量。化合物的“治疗有效量”是指单独或与其他疗法组合能够在疾病或病症的治疗或管控中提供治疗益处的治疗剂的量。术语“治疗有效量”可以涵盖改善总体疗法、减轻或避免疾病或病症的症状或病因或者增强另一种治疗剂的治疗功效的量。
除非另有指明，否则术语“治疗”意指当患者患有特定疾病或障碍时发生的减轻所述疾病或障碍的严重性或者延迟或减缓所述疾病或障碍的进展的行动。
除非另有指明，否则术语“包括”具有与“包括但不限于”相同的含义。类似地，术语“例如”具有与术语“例如但不限于”相同的含义。
除非另有指明，否则紧接在一系列名词之前的一个或多个形容词应该被解释为适用于每个名词。例如，词组“任选取代的烷基、芳基或杂芳基”具有与“任选取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基”相同的含义。
应该指出，形成较大化合物的一部分的化学部分在本文中可以使用当它作为单个分子存在时通常赋予它的名称或通常赋予它的基团的名称来描述它。例如，当术语“吡啶”和“吡啶基”被用于描述与其他化学部分连接的部分时，它们被赋予相同的含义。因此，两个词组“XOH，其中X是吡啶基”和“XOH，其中X是吡啶”被赋予相同的含义，并涵盖了化合物吡啶-2-醇、吡啶-3-醇和吡啶-4-醇。
还应该指出，如果结构或一部分结构的立体化学没有用例如粗线或虚线标明时，所述结构或一部分结构应该被解释为涵盖了它的所有立体异构体。此外，图中示出的具有未满足的化合价的任何原子被假定为连接有足够的氢原子以满足化合价。此外，如果化合价允许，用平行于一条虚线的一条实线绘出的化学键涵盖了单键和双键两者（例如芳香族键）。
化合物
本发明涵盖了下式的化合物及其药学可接受的盐：
Figure BDA00002918764400101
其中：E与G之一是氮，并且E与G中的另一个是氮或CR4；Y与Z之一是CR5，并且Y与Z中的另一个是O或S(O)m，其中m为0、1或2；R1是卤素、-R1A、-OR1A、-S(O)nR1A、–S(O)nOR1A或–S(O)nN(R1A)2，其中n为0、1或2；每个R1A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R2是氢、卤素、-CO2R2A、-C(O)N(R2A)2、-SR2A、-OR2A、-N(R2A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R2A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R3是氢、卤素、氰基、-CO2R3A、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A、-N(R3A)2、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环，或者与R5和它们所连接的原子一起形成任选取代的环状部分；每个R3A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R4是氢、卤素或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R5是氢、卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环，或者与R3和它们所连接的原子一起形成任选取代的环状部分；并且每个R5A是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环。应该指出，在Y、R3所连接的碳和Z之间绘出的内键是虚线的。
在某些化合物中，E和G两者都是氮。
在某些化合物中，Z是S。
在某些化合物中，Y是S。
在某些化合物中，R1是-R1A或-S(O)nR1A。在某些化合物中，R1A是取代的烷基。在具体化合物中，R1A任选被一个或多个氰基、卤素、羟基、-N(R1B)2、-S(O)pR1B、–S(O)pOR1B、-S(O)pN(R1B)2、–C(O)OR1B、-C(O)N(R1B)2或-C(O)N(R1B)S(O)pR1B取代；其中每个R1B独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且p是0、1或2。在某些化合物中，R1B任选被一个或多个烷氧基、烷基、氨基（包括烷基氨基、二烷基氨基）、芳基、羧酸、氰基、卤素、卤代烷基、杂环或羟基取代。
在某些化合物中，R1A是取代的烷基。在某些化合物中，R1A被–C(O)OR1B取代。在其他化合物中，R1A被-C(O)N(R1B)2取代。在具体化合物中，R1B是氢或低级烷基。
在某些化合物中，R2是氢、卤素或低级烷基。在具体化合物中，R2是氢。
在某些化合物中，R3是氰基、卤素、羟基或任选取代的烷基。
在某些化合物中，R4是氢。
在某些化合物中，R5是氰基、卤素、羟基或任选取代的烷基。
某些化合物具有下式：
其他化合物具有下式：
Figure BDA00002918764400122
某些化合物具有下式：
Figure BDA00002918764400123
其中X是OR1A或N(R1A)2；每个R1B独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R2是氢或任选取代的烷基；每个R2A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R3是卤素、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A、-N(R3A)2、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R3A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R5是卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R5A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且n是0、1或2。
在该式的具体化合物中，n是1或2。在某些化合物中，n是0。
在某些化合物中，X是N(R1A)2。
本发明的一个实施方案涵盖了下式的化合物及其药学可接受的盐：
Figure BDA00002918764400131
其中：R1B是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R2是氢或任选取代的烷基；每个R2A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R3是卤素、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A、-N(R3A)2、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R3A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R5是卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且每个R5A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环。
具体化合物是这样的化合物：当R2是氢、R3是甲基并且R5是氯时，R1B不是乙基；以及当R3是甲基时，R5不是甲基或任选取代的苯基。在某些化合物中，R3不是低级烷基（例如甲基）。在某些化合物中，R5不是低级烷基（例如甲基）。
在某些化合物中，R1B是氢或任选取代的烷基（例如低级烷基）或芳基。在具体化合物中，R1B是氢或烷基。
在某些化合物中，R3是烷基或卤素（例如氯）。
在某些化合物中，R5是烷基（例如低级烷基）或卤素。
本发明的一个实施方案涵盖了下式的化合物及其药学可接受的盐：
Figure BDA00002918764400141
其中：R1B是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R2是氢、卤素、-CO2R2A、-C(O)N(R2A)2、-SR2A、-OR2A或-N(R2A)2，或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R2A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R3是氢、卤素、氰基、-CO2R3A、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A、-N(R3A)2、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R3A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R5是氢、卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R5A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且n是1或2。
在该式的某些化合物中，R1B是氢或任选取代的烷基（例如低级烷基）或芳基。在具体化合物中，R1B是氢或烷基。
在某些化合物中，R2是氢或任选取代的烷基。
在某些化合物中，R3是烷基或卤素（例如氯）。在某些化合物中，R3不是低级烷基（例如甲基）。
在某些化合物中，R5是烷基（例如低级烷基）或卤素。在某些化合物中，R5不是低级烷基（例如甲基）。
本发明的某些化合物具有下式：
Figure BDA00002918764400151
其中X是OR1A或N(R1A)2；每个R1B独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R2是氢或任选取代的烷基；每个R2A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R3是卤素、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A、-N(R3A)2、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R3A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R5是卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R5A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且n是0、1或2。
在该式的具体化合物中，n是1或2。在某些化合物中，n是0。
在某些化合物中，X是N(R1A)2。
本发明的一个实施方案涵盖了下式的化合物及其药学可接受的盐：
Figure BDA00002918764400152
其中：R1B是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R2是氢或任选取代的烷基；每个R2A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R3是卤素、-CO2R3A、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A或-N(R3A)2、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R3A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R5是卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且每个R5A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环。
在该式的某些化合物中，R2是氢或任选取代的烷基。
在某些化合物中，R1B是氢或任选取代的烷基（例如低级烷基）或芳基。在具体化合物中，R1B是氢或烷基。
在某些化合物中，R3是烷基或卤素（例如氯）。在某些化合物中，R3不是低级烷基（例如甲基）。
在某些化合物中，R5是烷基（例如低级烷基）或卤素。在某些化合物中，R5不是低级烷基（例如甲基）。
本发明的一个实施方案涵盖了下式的化合物及其药学可接受的盐：
Figure BDA00002918764400161
其中：R1B是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R2是氢、卤素、-CO2R2A、-C(O)N(R2A)2、-SR2A、-OR2A或-N(R2A)2，或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R2A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R3是氢、卤素、氰基、-CO2R3A、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A、-N(R3A)2、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R3A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R4是氢、卤素或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R5是氢、卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R5A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且n是1或2。
在该式的某些化合物中，R1B是氢或任选取代的烷基（例如低级烷基）或芳基。在具体化合物中，R1B是氢或烷基。
在某些化合物中，R2是氢或任选取代的烷基。
在某些化合物中，R3是烷基或卤素（例如氯）。在某些化合物中，R3不是低级烷基（例如甲基）。
在某些化合物中，R5是烷基（例如低级烷基）或卤素。在某些化合物中，R5不是低级烷基（例如甲基）。
本发明的一个实施方案涵盖了下式的化合物及其药学可接受的盐：
Figure BDA00002918764400171
其中：每个R1A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R2是氢或任选取代的烷基；每个R2A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R3是卤素、-CO2R3A、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A或-N(R3A)2、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R3A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R5是卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R5A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且n是0、1或2。
具体化合物是这样的化合物：当R2是氢时，R3和R5两者不都是苯基；当R1A是取代的嘧啶、R2是氢并且R3是取代的苯基时，R5不是甲基；当R2是氢时，R3和R5两者不都是甲基；并且当R1A是取代的苯基、R2是氢并且R3是取代的苯基时，R5不是氢。
在某些化合物中，R1A是取代的烷基。在具体化合物中，R1A被一个或多个氰基、卤素、羟基、-N(R1B)2、-S(O)pR1B、–S(O)pOR1B、-S(O)pN(R1B)2、-C(O)OR1B、-C(O)N(R1B)2或-C(O)N(R1B)S(O)pR1B取代；其中每个R1B独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且p是0、1或2。
在某些化合物中，R1B任选被一个或多个烷氧基、烷基、氨基（包括烷基氨基、二烷基氨基）、芳基、羧酸、氰基、卤素、杂环或羟基取代。在具体化合物中，R1B是氢或任选取代的烷基（例如低级烷基）或芳基。在某些化合物中，R1B是氢或烷基。
在某些化合物中，R2是氢或任选取代的烷基。
在某些化合物中，R3是烷基或卤素。
在某些化合物中，R5是烷基或卤素。
本发明的一个实施方案涵盖了下式的化合物及其药学可接受的盐：
Figure BDA00002918764400181
其中：每个R1A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R2是氢或任选取代的烷基；每个R2A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R3是卤素、-CO2R3A、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A或-N(R3A)2、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R3A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；R5是卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；每个R5A独立地是氢、任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且n是0、1或2。
在具体实施方案中，化合物不是2-((6,7-二苯基呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)-1-吗啉乙酮。在一个实施方案中，R3和R5两者不都是苯基。
在某些化合物中，R1A是取代的烷基。在具体化合物中，R1A被一个或多个氰基、卤素、羟基、-N(R1B)2、-S(O)pR1B、–S(O)pOR1B、-S(O)pN(R1B)2、-C(O)OR1B、-C(O)N(R1B)2或-C(O)N(R1B)S(O)pR1B取代；其中每个R1B独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且p是0、1或2。
在某些化合物中，R1B任选被一个或多个烷氧基、烷基、氨基（包括烷基氨基、二烷基氨基）、芳基、羧酸、氰基、卤素、杂环或羟基取代。在具体化合物中，R1B是氢或任选取代的烷基（例如低级烷基）或芳基。在某些化合物中，R1B是氢或烷基。
在某些化合物中，R2是氢或任选取代的烷基。
在某些化合物中，R3是烷基或卤素。
在某些化合物中，R5是烷基或卤素。
当通过本文描述的结合测定法测定时，具体化合物具有低于约0.1、0.05或0.025μM的IC50。当通过本文描述的报告物测定法测定时，具体化合物具有低于约5、2.5或1μM的EC50。
本发明的化合物（即本文公开的化合物）可以通过本文公开的方法以及通过本领域已知的方法来制备。参见例如Stewart等的美国专利no.6,579,882，Wiesenfeldt等的欧洲专利no.0447891。
治疗方法
本发明涵盖了在患者中刺激内皮质骨形成的方法，所述方法包括向需要的患者施用有效量的本发明化合物。本发明还涵盖了增加皮质骨厚度的方法，所述方法包括向需要的患者施用有效量的本发明化合物。
本发明涵盖了治疗、管控或防止与骨损失相关的疾病或障碍的方法，所述方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的本发明化合物。疾病和障碍的实例包括骨质疏松症（例如绝经后骨质疏松症、类固醇或糖皮质激素诱导的骨质疏松症）、骨质减少和佩吉特病。
本发明还涵盖了治疗、管控或防止骨折的方法，所述方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的本发明化合物。具体的骨折与转移性骨病即已转移到骨的癌症相关。能够转移到骨的癌症的实例包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌和肾癌。
本发明还涵盖了治疗、管控或防止与疾病或障碍相关或由其引起的骨损失的方法，所述方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的本发明化合物。疾病和障碍的实例包括乳糜泻、克罗恩病、库欣综合征、甲状旁腺功能亢进、炎性肠病和溃疡性结肠炎。
可以从本发明的方法获益的患者的实例包括年龄在55岁以上的男性和女性、绝经后女性以及患有肾功能不全的患者。
可以将本发明的化合物与已知可用于治疗、管控或防止影响骨的疾病或病症的其他药物组合（例如在同一时间或不同的时间）施用。所述其他药物的实例包括：雄激素受体调节剂，二膦酸盐类，降钙素，钙敏感受体拮抗剂，组织蛋白酶K抑制剂，雌激素和雌激素受体调节剂，整合素的结合物、抗体和受体拮抗剂，甲状旁腺激素（PTH）及其类似物和模拟物，以及维生素D和合成的维生素D类似物。
雄激素受体调节剂的实例包括非那雄胺和其他5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他胺、比卡鲁胺、利阿唑和乙酸阿比特龙。
二膦酸盐类的实例包括阿仑膦酸盐、英卡膦酸盐、氯膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、因卡膦酸盐、米诺膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、帕米膦酸盐、吡利膦酸盐、利塞膦酸盐、替鲁膦酸盐和唑来膦酸盐及其药学可接受的盐和酯。
组织蛋白酶K抑制剂的实例包括VEL-0230、AAE581（巴利卡替）、MV061194、SB-462795（瑞拉卡替）、MK-0822（odanacatib）和MK-1256。
雌激素和雌激素受体调节剂的实例包括天然存在的雌激素（例如7-雌二醇、雌酮和雌三醇）、结合的雌激素（例如结合的马雌激素）、口服避孕药、硫酸酯化的雌激素、孕激素、雌二酮、屈洛昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、TSE-424、他莫昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-(2,2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基丙酸酯、4,4'-二羟基二苯甲酮-2,4-二硝基苯腙和SH646。
整合素的结合物、抗体和受体拮抗剂的实例包括vitaxin（MEDI-522）、西仑吉肽和L-000845704。
药物制剂
本发明涵盖了包含一种或多种本发明的化合物以及任选的一种或多种其他药物例如上述药物的药物组合物。
某些药物组合物是适合于口服、粘膜（例如鼻、舌下、阴道、颊或直肠）、肠胃外（例如皮下、静脉内、推注、肌内或动脉内）或经皮施用于患者的单剂量剂型。剂型的实例包括但不限于：片剂；囊片；胶囊，例如软质弹性明胶胶囊；扁囊剂；锭剂；菱锭；分散剂；栓剂；软膏；泥罨剂（泥敷剂）；糊剂；粉剂；敷料；乳膏剂；硬膏剂；溶液；贴片；气雾剂（例如鼻喷雾剂或吸入剂）；凝胶；适合于口服或粘膜施用于患者的液体剂型，包括混悬剂（例如水性或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂）、溶液和酏剂；适合于肠胃外施用于患者的液体剂型；以及无菌固体（例如结晶或无定形固体），所述无菌固体可以被重构以提供适合于肠胃外施用于患者的液体剂型。
制剂应该适合于施用方式。例如，口服施用需要肠溶包衣来保护本发明的化合物免于在胃肠道内降解。类似地，制剂可以含有促进活性成分递送至作用部位的成分。例如，可以以脂质体制剂来施用化合物，以便保护它们免受降解酶的影响、促进在循环系统中运输、并实现跨过细胞膜向细胞内部位的递送。
剂型的组成、形状和类型随着其用途而变。例如，在疾病的急性治疗中使用的剂型可以含有比在相同疾病的慢性治疗中使用的剂型所包含的量大的一种或多种活性成分。类似地，肠胃外剂型可以含有比用于治疗相同疾病的口服剂型所包含的量少的一种或多种活性成分。本发明所涵盖的特定剂型彼此不同的这些方面以及其他方面对于本领域技术人员来说是显而易见的。参见例如《雷氏药学》（Remington’sPharmaceutical Sciences）第18版（Mack Publishing,Easton PA:1990）。
优选口服施用本发明的药物组合物。适合于口服施用的离散剂型包括片剂（例如咀嚼片）、囊片、胶囊和液体（例如调味糖浆）。这样的剂型含有预定量的活性成分，并可以通过本领域技术人员公知的药学方法来制备。参见例如《雷氏药学》（Remington’s PharmaceuticalSciences）第18版（Mack Publishing,Easton PA:1990）。
按照常规的制药调配技术将活性成分与至少一种赋形剂合并成紧密的混合物，由此制备典型的口服剂型。取决于施用所需要的制剂形式，赋形剂可以采取广泛的各种形式。
由于易于施用，片剂和胶囊代表了最有利的口服单位剂型。如果需要，可以通过标准的水性或非水性技术对片剂进行包衣。这样的剂型可以通过常规的药学方法来制备。一般来说，通过将活性成分与液体载体、细分的固体载体或两者均匀且紧密地混合，然后如果需要，将产品成形为所需的外观，来制备药物组合物和剂型。在固体剂型中可以掺入崩解剂以促进快速溶解。也可以掺入润滑剂以促进剂型（例如片剂）的制造。
实施例
敲除小鼠
使用来自于突变型鼠类ES细胞克隆OMNIBANK保藏库（OMNIBANK collection of mutated murine ES cell clones）的相应的突变型胚胎干（ES）细胞克隆来产生对人类NOTUM基因的鼠类直系同源物中的遗传工程突变而言纯合的小鼠（总体参见美国专利no.6,080,576）。简单来说，将在鼠类NOTUM基因座中含有诱变病毒插入片段的ES细胞克隆微注射到胚囊中，并将所述胚囊又植入到假孕雌性宿主中并怀到足月。随后将得到的嵌合后代与C57black6雌性小鼠杂交，并对后代的被敲除的NOTUM等位基因的种系传递进行检查。随后将对突变的NOTUM等位基因而言杂合的动物进行育种，以约1：2：1的比例产生对突变的NOTUM等位基因而言纯合的后代、对突变的NOTUM等位基因而言杂合的后代或野生型后代。
将对NOTUM基因破坏而言纯合的小鼠（-/-）与对NOTUM基因破坏而言杂合的小鼠（+/-）和野生型同窝幼仔（+/+）相结合进行研究。在该分析期间，使用被设计用于评估哺乳动物对象中主要器官系统的功能的整套医学诊断程序，对小鼠进行医学诊断检查。通过以所描述的数量并结合杂合（+/-）和野生型（+/+）同窝幼仔对纯合（-/-）“敲除”小鼠进行研究，获得了更可靠且可重复的数据。
如图1中所示，具有纯合的NOTUM基因破坏的雄性小鼠（“纯合小鼠”）与它们的野生型同窝幼仔相比，在16周龄时在各种骨部位处表现出更大的皮质厚度（对于两个组来说，小鼠数量N=10）。通过microCT（Scanco μCT40）测量到的这些差异是：中段股骨干处为28%（p<0.001）；中段肱骨干处为19%（p<0.001）；中段胫骨干处为17%（p<0.001）；胫骨-腓骨接合处为11%（p<0.001）。如图2中所示，在16周龄时，对NOTUM突变而言杂合的小鼠（“杂合小鼠”）的中段股骨干的皮质骨厚度也大于它们的野生型同窝幼仔：雄性杂合小鼠（N=50）与它们的野生型同窝幼仔（N=23）相比表现出6%（p=0.007）的增加；雌性杂合小鼠（N=57）与它们的野生型同窝幼仔（N=22）相比表现出9%（p<0.001）的增加。
在NOTUM动物中观察到的骨形成重新分布的实际表现被反映在图3和4中，所述图显示了使用标准的4点弯曲试验进行的股骨断裂强度测试（由SkeleTech即现在的Ricerca Biosciences执行）的结果。如图3中所示，该图提供了对16周龄雄性小鼠获得的结果，杂合小鼠（N=20）与它们的野生型同窝幼仔（N=23）相比表现出股骨断裂强度提高5%（p=0.54），而纯合小鼠（N=17）表现出提高28%（p<0.001）。另一方面，与野生型对照相比，NOTUM纯合和杂合小鼠两者的脊柱压缩试验均没有显示出最大脊柱压缩载荷的显著降低。对16周龄的雌性小鼠获得了类似结果。如图4中所示，杂合小鼠（N=20）与它们的野生型同窝幼仔（N=21）相比，表现出股骨断裂强度提高12%（p=0.04），而纯合小鼠（N=18）表现出提高28%（p<0.001）。这些以及其他数据的分析揭示出皮质厚度与股骨断裂强度之间的强烈相关性。
报告物测定法
使用这种测定法测定化合物的EC50值，所述测定法利用了如下制备的调制培养基。将在pcDNA3.1(+)载体中含有人类背板胶质乙酰转移酶的质粒转染到HEK293细胞中，并通过在400ug/mL G418存在下生长来选择克隆。维持在调制培养基中含有人类背板胶质乙酰转移酶的最高表达的克隆，用于将来的所有活性测定。Wnt3a过表达并将其分泌到调制培养基中的L细胞购自ATCC。
测定流程如下。将约500万个
Figure BDA00002918764400251
LEF/TCF-bla FreeStyleTM293F细胞在15-cm培养板中生长至接近汇合。细胞生长培养基由含有10%透析过的FBS、5μg/ml杀稻瘟菌素（Invitrogen，R210-01）、0.1mMNEAA、25mM HEPES和1×GPS的DMEM构成。然后通过首先用PBS清洗，接着添加5mL胰蛋白酶，并将培养板在室温下温育2分钟，来对细胞进行胰蛋白酶处理。然后在每个15cm培养板中加入总共10mL测定培养基（Opti-MEM，添加0.5%透析过的FBS、0.1mM NEAA、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES、1x GPS）。对细胞进行计数，并以每mL75万个细胞的密度悬浮。将细胞以每个孔每20μL15000个细胞的密度接种到Biocoat384孔板（Fisher，目录号356663）中。将细胞在37℃温育3小时后，向每个孔加入10μL含有30mM LiCl的测定培养基，然后在37℃下继续温育3小时。同时，使用ECHO将化合物声学脉冲到Greiner384孔板（目录号781076）中，随后添加每孔10μL的Wnt3a调制培养基和每孔10μL的背板胶质乙酰酯酶调制培养基。然后将10μL的Wnt3a/背板胶质乙酰转移酶混合物从Greiner板转移至384孔板的含有CellSensor细胞的每个孔中。在将细胞在37℃温育过夜后，通过向每个孔添加5μL1xCCF4（Invitrogen，目录号K1085），盖上整个384孔板，并在暗处在室温下轻摇3小时，对反应进行显色。然后将板在Envision读板器上使用400nm激发波长以及460nm和535nm发射波长进行读数。
结合测定法
使用这种测定法测定化合物的IC50值，所述测定法利用了8-辛酰氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠（OPTS），一种用于酯酶和脂肪酶的荧光测定的水溶性酶底物。将在pcDNA3.1(+)载体中含有人类背板胶质乙酰转移酶的质粒转染到HEK293细胞中，并通过在400ug/mL G418存在下生长来选择克隆。将来自于这些细胞的调制培养基用于该测定法。
使用ECHO将75nL化合物声学分发到干燥的Greiner384孔板（目录号781076）中，然后向这些384孔测定板的每个孔添加10uL50mMTris/HCl（pH6.8）。将含有人类背板胶质乙酰转移酶的调制培养基用测定缓冲液（50mM Tris，pH6.8，5mM CaCl2，0.5mM MgCl2）稀释75倍，并向每个孔添加25μL这种“酶混合物”，然后进行10分钟的预温育。通过添加15μL OPTS底物（Sigma，目录号74875）至终浓度为5μM来起始酶反应，反应时间为室温下10分钟。将所有板在Envision读板器上使用485nm激发波长和535nm发射波长进行读数。
通用合成方法A：3-氯-2-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-4-醇（2）和3-溴-2-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-4-醇（3）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400271
在100mL圆底烧瓶中，取6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-醇1（1g，6.2mmol）置于乙酸（12mL）中并在室温下搅拌。向其加入溴（0.3mL，6.2mmol），并将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后用冰将反应淬灭并搅拌直至冰熔化。然后将产物过滤出来，用水洗涤并干燥，获得作为干燥产物（1g，66%得率）的3-溴-2-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-4-醇2。
在3L圆底烧瓶中，取6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-醇1（50g，310mmol）置于乙酸（525mL）中，并加入NCS（37.5g，372mmol）。将反应物在55℃下加热8小时。然后将反应物冷却至室温，用水淬灭，并用二氯甲烷（2x250mL）提取化合物。将合并的有机层用盐水洗涤，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩，得到作为固体3的3-氯-2-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-4-醇（42.15g，70%得率）。
通用合成方法B：2-(5-氯-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸（6）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400272
4的合成：将3-氯-2-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-4-醇3（40g，2000mmol，1当量）悬浮在POCl3（368mL，4000mmol，20当量）中，并加热至90℃4小时。冷却后，将反应物浓缩，并将残留物冷却至0℃。然后缓慢加入冰冷的水以确保POCl3完全消耗。将黑色溶液用乙酸乙酯提取3次。将合并的有机提取液用饱和NaHCO3水溶液洗涤两次，用盐水洗涤一次，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩，得到浅棕色固体4,5-二氯-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶4（41.6g，93%得率），其在完全干燥后立即使用。
5的合成：将4,5-二氯-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶4（40g，182.2mmol，1当量）悬浮在甲醇（500mL）中并冷却至0℃。缓慢加入2-巯基乙酸甲酯（27mL，191.5mmol，1.05当量），然后缓慢添加TEA（53mL，382.6mmol，2.1当量）。在搅拌90分钟后，将反应物浓缩。取残留物置于乙酸乙酯中，通过硅胶塞过滤以去除盐和一些颜色。将滤液浓缩，并使用硅胶层析法、利用含0-15%乙酸乙酯的己烷进行纯化，得到作为浅白色固体的2-(5-氯-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯5（47.30g，91%得率）。
6的合成：取2-(5-氯-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯5（45g，150mmol，1当量）置于THF（350mL）中，加入1N NaOH水溶液（300mL，300mmol，2当量）并有效搅拌。40分钟后，将反应物浓缩，并取残留物置于水中，冷却至0℃，用1N HCl酸化至低pH。通过真空过滤收集沉淀物，用水洗涤。将其在真空下干燥过夜，得到作为白色固体的纯的2-(5-氯-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸6（40.5g，94%得率）。MS m/z C9H7ClN2O2S2[M+1]+=275和[M+1]+3=277。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm8.66(s,1H),4.05(s,2H),2.54(s,3H)。13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δppm170.04(s),162.55(s,1C),162.48(s,1C),152.55(s,1C),135.03(s,1C),125.03(s,1C),114.36(s,1C),32.17(s,1C),14.05(s,1C)。
通用合成方法C：2-(6-溴-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸（10）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400291
8的合成：取按照通用合成方法B制备的4-氯-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶7（1g，5.4mmol）置于乙酸中，并在室温下搅拌。向该反应混合物加入溴（1当量=275μL，5.4mmol），并将反应混合物搅拌过夜。然后将反应用冰淬灭并搅拌直至冰熔化。然后将产物过滤出来，用水洗涤并干燥，获得作为浅黄色固体的1g6-溴-4-氯-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶8（786mg，55%得率）。
按照通用合成方法B制备化合物9和10。
通用合成方法D：2-(5-环丙基-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯（12）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400292
在100mL圆底烧瓶中装入2-(5-溴-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯11（0.100g，0.3mmol，1当量）、环丙基硼酸（51mg，0.6mmol）和三环己基膦（8.4mg，0.03mmol），并取K3PO4（212mg，1.05mmol）置于甲苯和水的混合物（4mL，1:1）中。将该混合物在室温和N2气氛下搅拌。向该搅拌的溶液加入二乙酸钯（4mg，0.015mmol）。然后将反应混合物在100℃加热8小时。通过加入1N HCl将反应淬灭，并将水性部分用EtOAc提取三次。将合并的有机部分在MgSO4上干燥，过滤并浓缩，得到作为浅黄色固体的2-(5-环丙基-6-甲基噻吩并[2.3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯（40mg，45%得率）12。
通用合成方法E：2-(6-乙基-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯（13）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400301
在装有按照通用合成方法C制备的2-(6-溴-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯9（50mg，0.15mmol）和二乙基锌（1.1M，在甲苯中，204μL，0.23mmol）的100mL圆底烧瓶中，取Pd(dba)3（4mg，0.0075mmol）和2-二环己基膦-2’,6’-异丙氧基二苯基（13mg，0.03mmol）置于在微波容器中的无水DMF（2.5mL）中，并在微波辐射下在160℃加热10分钟。在将其冷却至室温后，将其通过硅藻土过滤并浓缩。将其置于EtOAc中并用水洗涤。将有机层用盐水洗涤，在硫酸镁上干燥并浓缩，得到2-(6-乙基-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯13（17mg，40%得率）。
通用合成方法F：2-(5-(二甲基氨基)-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸（14）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400311
取使用通用合成方法C制备的2-(5-溴-6-甲基噻吩并[2.3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯11（100mg，0.3mmol）置于1mL（过量，作为溶剂）含有40%二甲胺的水中。然后加入催化量的氧化铜，并将反应物在微波辐射下在140℃加热15min。停止反应，然后通过制备型HPLC（乙酸铵水溶液/乙腈）进行纯化。分离到作为白色固体的14（60mg，71%得率）。
通用合成方法G：2-(5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)-N-(2-甲氧基乙基)乙酰胺（17）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
取可商购并且也可以使用通用合成方法B制备的2-(5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸15（0.050g，0.2mmol，1当量）置于DMF（2.2mL）中。向该混合物加入2-甲氧基乙胺16（0.019g，0.24mmol，1.2当量）、HATU（0.076g，0.2mmol，1当量）和N,N-二异丙基乙胺（0.08mL，0.44mmol，2.2当量），并将反应混合物在室温下搅拌8小时。加入水进行淬灭，并将水性部分用EtOAc提取三次。将合并的有机层在MgSO4上干燥，过滤并浓缩。使用中性条件，通过制备型HPLC对残留物进行纯化，得到作为浅白色固体的2-(5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)-N-(2-甲氧基乙基)乙酰胺17（56mg，90%得率）。
通用合成方法H：2-(5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸异丙酯（19）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400321
将可商购并且也可以使用通用合成方法B制备的化合物15（100mg，0.4mmol）溶解在无水DCM中，添加氯化亚砜（56uL，0.8mmol）并在室温下搅拌1小时。然后加入过量2-丙醇18，并在室温下继续搅拌1小时。然后将反应混合物浓缩，使用中性相制备型HPLC（乙酸铵水溶液/乙腈）进行纯化，得到作为固体的19（100mg，85%得率）。
通用合成方法I：2-(5-氯-6-异丙基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸（24）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400322
21的合成：将可商购并且也可以通过通用合成方法D制备的嘧啶酮20（10g，51.4mmol，1当量）悬浮在POCl3（95mL，1028mmol，20当量）中，并加热至90℃4小时。在冷却后，将反应物浓缩，并将残留物冷却至0℃。然后缓慢加入冰冷的水以确保POCl3完全消耗。将黑色溶液用乙酸乙酯提取3次。将合并的有机提取液用饱和NaHCO3水溶液洗涤两次，用盐水洗涤一次，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩，得到浅棕色固体4-氯-6-异丙基噻吩并[2,3-d]嘧啶21（10.16g，93%得率），其在完全干燥后立即使用。
22的合成：取固体4-氯-6-异丙基噻吩并[2,3-d]嘧啶21（9.2g，43.2mmol，1当量）置于乙酸（75mL）中，并添加NCS（8.65g，86.5mmol，2当量）。将反应物在55℃加热6小时。将反应物冷却，用水淬灭，并用二氯甲烷（2x50mL）提取化合物。将合并的有机层用盐水洗涤，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩，得到作为固体的4,5-二氯-6-异丙基噻吩并[2,3-d]嘧啶22（6.2g，58%得率）。
23的合成：将4,5-二氯-6-异丙基噻吩并[2,3-d]嘧啶22（11.6g，47mmol，1当量）悬浮在甲醇（125mL）中并冷却至0℃。缓慢加入2-巯基乙酸甲酯（6.86mL，49.35mmol，1.05当量），然后缓慢添加TEA（13.7mL，98.7mmol，2.1当量）。在搅拌90分钟后，将反应物浓缩。取残留物置于乙酸乙酯中，通过硅胶塞过滤以去除盐和一些颜色。将滤液浓缩，并使用硅胶层析法、利用含0-15%乙酸乙酯的己烷进行纯化，得到作为浅白色固体的2-(5-氯-6-异丙基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯23（13.6g，92%得率）。
24的合成：取化合物23（5.0g，15.8mmol，1当量）置于THF（50mL）中，加入1N NaOH水溶液（32mL，32mmol，2当量）并有效搅拌。40分钟后，将反应物浓缩，并取残留物置于水中，冷却至0℃，用1N HCl酸化至低pH。通过真空过滤收集沉淀物，用水洗涤。将其在真空下干燥过夜，得到作为白色固体的纯的2-(5-氯-6-异丙基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸24（40.5g，94%得率）。MS m/zC11H11ClN2O2S2[M+1]+=303和[M+1]+3=305。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm12.83(s,1H),8.81(s,1H),4.12(s,2H),3.52-3.76(m,1H),1.32(d,J=7.03Hz,6H)。13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δppm170.0(s,1C),162.8(s,1C),162.2(s,1C),152.6(s,1C),146.9(s,1C),125.1(s,1C),112.3(s,1C),32.2(s,1C),28.6(s,1C),23.4(s,1C),23.1(s,1C)。
通用合成方法J：2-(6-氯-7-环丙基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸（31）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400341
26的合成：在500mL圆底烧瓶中，取7-溴-4-甲氧基噻吩并[3,2-d]嘧啶25（4g，16.32mmol，1当量）和环丙基硼酸（2.81g，32.6mmol，2当量）和碳酸钾（6.76g，49mmol，3当量）以及催化剂PdCl2(Ph3P)2（575mg，0.816mmol，0.05当量）置于甲苯（60mL）和H2O（16mL）的混合物中。用N2强烈吹扫反应混合物5分钟，并将反应混合物在100℃下加热6小时。在将其冷却至室温后，将反应混合物过滤并将两层分开。将水性层用甲苯洗涤，并将合并的有机溶剂浓缩。使用硅胶柱层析法，使用EtOAc和庚烷（10–30%）溶剂对粗材料进行纯化，得到作为浅黄色固体的7-环丙基-4-甲氧基噻吩并[3,2-d]嘧啶26（3g，90%得率）。
使用通用合成方法A来合成化合物27。
28的合成：取6-氯-7-环丙基-4-甲氧基噻吩并[3,2-d]嘧啶（2g，8.25mmol）置于12N HCl（6mL，72.5mmol）中，并将反应混合物在70℃加热40分钟。在将其冷却至室温后，向该浅棕色浆液加入水（15mL）并适当混合。将沉淀物过滤出来，将其用水和庚烷洗涤。在将其在40℃干燥过夜后，得到浅黄色固体（1.6g，90%得率）。
使用通用合成方法B来合成化合物29。使用通用合成方法B来合成化合物30。MS m/z C11H9ClN2O2S2[M+1]+=301和[M+1]+3=303。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm8.92(s,1H),4.22(s,2H),2.10-2.20(m,1H),1.45-1.52(m,2H),0.96-1.06(m,2H)。13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δppm169.6(s,2C),161.4(s,1C),156.2(s,1C),154.1(s,2C),134.4(s,1C),125.9(s,1C),31.9(s,1C),10.2(s,1C),6.3(s,2C)。
通用合成方法K：2-(7-环丙基-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸（35）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400351
使用通用合成方法J来合成化合物26。
31的合成：在-60℃下，向含N,N-二异丙基乙胺（14mL，80mmol）的THF（60mL）逐滴加入n-BuLi（37.5mL，1.6M，60mmol）。在相同温度下搅拌15分钟后，将化合物31（4.14g，20mmol）作为一个部分加入，并使其在45分钟内升温至–45℃。然后将其冷却回到-60℃，通过缓慢逐滴加入MeI（5mL，80mmol）进行淬灭，将反应混合物升温至室温并搅拌2小时。在2小时后，将其用盐水和水（100mL）的混合物淬灭，并分离THF层。将水性层用二氯甲烷提取，并将合并的有机溶剂再次用盐水洗涤，并将其通过MgSO4。使用硅胶层析法、使用乙酸乙酯/己烷混合物（10%-30%）对粗产物进行纯化，得到化合物32（2.64g，60%得率）。
使用通用合成方法B来合成化合物32-35。MS m/z C12H12N2O2S2[M+1]+=281。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm12.86(br.s.,1H),8.85(s,1H),4.20(s,2H),2.65(s,3H),1.99(tt,J=8.63,5.43Hz,1H),1.23-1.30(m,2H),0.88-0.97(m,2H)。
通用合成方法L：4-(羧甲基硫代)-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-羧酸（40）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
化合物36是可商购的。使用通用合成方法B来合成化合物37。
38的合成：在-30℃下，向搅拌的含噻吩37（368mg，2mmol，1.0当量）的无水THF（5mL）的溶液加入LDA在THF中的溶液（2.2mmol，1.1当量）（通过在-30℃下将0.34mL二异丙胺与0.96mL2.5MnBuLi混合在5mL THF中来新鲜制备）。反应物从透明变为黄色。20分钟后，逐滴加入氯甲酸乙酯（0.28mL，3mmol，1.5当量）。在将反应在冷水浴中加温至室温后，将其用水淬灭。将混合物用10mL乙酸乙酯稀释，用乙酸乙酯提取（10mL x2次）。将合并的有机层用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩。然后将粗品混合物吸附在硅胶上，并通过快速层析法进行纯化（用10%DCM/EA洗脱），得到作为白色固体的酯38（127mg，25%得率）。
使用通用合成方法B来合成化合物39和40。
通用合成方法M：2-(6-氰基-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸（44）和2-(6-氨甲酰基-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸（46）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400371
41的合成：在-30℃下，向使用通用合成方法B制备的37（368mg，2mmol，1.0当量）在无水THF（5mL）中的溶液，加入LDA（2.2mmol，1.1当量）在THF中的溶液（通过在-30℃下将0.34mL二异丙胺与0.96mL2.5M nBuLi混合在5mL THF中来新鲜制备）。反应物从透明变为黄色。20分钟后，逐滴加入碘（609mg，2.4mmol，1.2当量）。在将反应在冷水浴中加温至室温后，将其用水淬灭。将反应物用10mL乙酸乙酯稀释，用乙酸乙酯提取（10mL x2次）。将合并的有机层用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩。然后将粗品混合物吸附在硅胶上，并通过快速层析法进行纯化（用10%己烷/乙酸乙酯洗脱），得到作为白色固体的化合物41（407mg，65%得率）。
使用通用合成方法B来合成化合物42和43。
44的合成：向含化合物43（70mg，0.19mmol，1当量）的DMF（1mL）加入Pd(PPh3)4（44mg，0.038mmol，0.2当量）和Zn(CN)2（30mg，0.25mmol，1.1当量）。将小瓶用N2驱气5分钟，然后将其盖上盖子。然后在微波辐射下将反应物在100℃加热1.5小时。去除所有溶剂，通过制备型薄层层析法对残留物进行纯化，得到白色固体（28mg，42%得率）。MS m/z C10H7N3O2S2[M+1]+=266.0；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.09(s,1H),4.12(br.s.,2H)2.60(s,3H)。
46的合成：取使用通用合成方法M制备的化合物45（40mg，0.142mmol，1当量）置于1mL MeOH中。向该溶液加入1N NaOH（2.1mL）。然后将得到的混合物在室温下搅拌，然后加入1N HCl将其中和。通过制备型HPLC对反应物进行纯化，得到作为白色固体的化合物46（12mg，29%得率）。MS m/z C10H9N3O3S2[M+1]+=284.0，观察值为224。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm8.83(s,1H)6.06-6.36(m,2H)4.20(s,2H)2.77(s,3H)。
通用合成方法N：2-(3-氯-2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4-基硫代)乙酸（50）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400391
化合物47是可商购的。使用通用方法A来合成化合物48。使用通用方法B来合成化合物49和50。
通用合成方法O：2-(5,6-二甲基呋喃并[2,3-d]吡啶-4-基硫代)乙酸（55）的制备
这种合成本发明所涵盖的化合物的通用方法，通过下面描述的具体实施例进行说明：
Figure BDA00002918764400392
52的合成：在50mL圆底烧瓶中，取2-氨基-4,5-二甲基呋喃-3-甲腈51（1g,7.4mmol）置于作为溶剂的甲酸（15mL）中。将该混合物加热至回流温度6小时。将反应物冷却至室温，并在真空泵下浓缩。然后将其置于二氯甲烷中，用H2O洗涤。然后将粗产物通过Na2SO4并浓缩，获得作为粗产物的粗品二甲基呋喃并嘧啶醇52，将其直接用于下一步骤中。
53的合成：将5,6-二甲基呋喃并[2,3-d]嘧啶-4-醇52（700mg，4.3mmol，1当量）悬浮在POCl3（10mL，100mmol，23当量）中，并加热至90℃3小时。冷却后，将反应物浓缩，并将残留物冷却至0℃。然后缓慢加入冰冷的水以确保POCl3完全消耗。将黑色溶液用乙酸乙酯提取3次。将合并的有机提取液用饱和NaHCO3水溶液洗涤两次，用盐水洗涤一次，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩，得到浅棕色固体4-氯-5,6-二甲基呋喃并[2,3-d]嘧啶53（350mg，55%得率），其在完全干燥后立即使用。
54的合成：将4-氯-5,6-二甲基呋喃并[2,3-d]嘧啶53（350mg，1.91mmol，1当量）悬浮在甲醇（10mL）中并冷却至0℃。缓慢加入2-巯基乙酸甲酯（0.13mL，2.0mmol，1.05当量），然后缓慢添加TEA（0.39mL，3.84mmol，2.1当量）。在搅拌90分钟后，将反应物浓缩。取残留物置于乙酸乙酯中，并通过硅胶塞过滤以去除盐和一些颜色。将滤液浓缩，并使用硅胶层析法、利用含0-15%乙酸乙酯的己烷进行纯化，得到作为固体的2-(5,6-二甲基呋喃并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯54（420mg，90%得率）。
55的合成：取2-(5,6-二甲基呋喃并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸甲酯54（400mg，1.58mmol，1当量）置于THF（10mL）中，加入1N NaOH水溶液（3.2mL，3.2mmol，2当量）并有效搅拌。40分钟后，将反应物浓缩，并取残留物置于水中，冷却至0℃，用1N HCl酸化至低pH。通过真空过滤收集沉淀物，用水洗涤。将其在真空下干燥过夜，得到作为固体的纯的2-(5,6-二甲基呋喃并[2,3-d]嘧啶-4-基硫代)乙酸55（353mg，94%得率）。
通用合成方法P：2-(7-环丙基-6-(三氟甲基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸（60）的制备：
Figure BDA00002918764400411
使用通用合成方法J来合成化合物26、56、57、58和60。
59的合成：在100mL圆底烧瓶中装入Ru(phen)3Cl2（14mg，0.01当量）和K2HPO4（930mg，3当量），并通过交替的抽真空和氮气回填（×3）对反应混合物进行脱气，然后通过注射器加入MeCN（20mL，0.125M）和2-(7-环丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸乙酯58（500mg，1当量）。在-78℃下，通过交替的抽真空和氮气回填（×3）对得到的溶液进行脱气，在每次重复之间允许溶液在氮气下加温至室温。通过注射器加入三氟甲磺酰氯（0.4mL，2当量），将小瓶用石蜡膜密封，并置于距25W小型荧光灯泡约2cm处。48小时后，将反应用水（2mL）淬灭，并用CH2Cl2提取（×2），将合并的有机层在MgSO4上干燥并在真空中浓缩。然后使用中性条件通过制备型HPLC对粗品材料进行纯化，以10%的得率得到2-(7-环丙基-6-(三氟甲基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸甲酯59（62mg）。
代表性化合物
制备了大量化合物，并在本文描述的一种或多种测定法中测试了它们的活性。这些化合物中的一些被列在下面的表1中，其中“制备”列指明了用于制备所述化合物的通用合成方法。“HPLC方法和时间（min）”列是指下面的HPLC条件：
A：Sunfire C185u4.6x50mm，0%至90%B，梯度时间=2min，流速=3.5mL/min，波长=220和254nm，溶剂A=10mM乙酸铵水溶液，溶剂B=乙腈。
B：Sunfire C185u4.6x50mm，10%至90%B，梯度时间=2min，流速=3.5mL/min，波长=254和280nm，溶剂A=纯水，溶剂B=95%甲醇/5%水和0.1%三氟乙酸（v/v）。
“IC50”列提供了使用本文描述的结合测定法测定到的化合物的IC50，其中：****表示小于或等于0.025μM的值；***表示小于或等于0.05μM的值；**表示小于或等于0.1μM的值；*表示小于或等于0.25μM的值；--表示未测定IC50。“EC50”列提供了使用本文描述的报告物测定法测定到的化合物的EC50，其中：****表示小于或等于1μM的值；***表示小于或等于5μM的值；**表示小于或等于10μM的值；*表示小于或等于15μM的值；--表示未测定EC50。
表1
Figure BDA00002918764400421
Figure BDA00002918764400431
Figure BDA00002918764400441
Figure BDA00002918764400451
Figure BDA00002918764400461
Figure BDA00002918764400471
Figure BDA00002918764400481
Figure BDA00002918764400491
2-((5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸的药理学
在第一项研究中，通过在10.7周龄时开始用2-((5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸对F1雄性杂交（129x C57）小鼠进行25天处理，确定了所述化合物的体内效应。在动物的饮食中施用该化合物。使用了四组小鼠：对照（N=12）；25mg/kg的化合物（N=9）；83mg/kg的化合物（N=9）；以及在饮食中施用Li2CO3（0.1%）的另一组（N=9）。
使用Scanco μCT40测量中段股骨干的皮质厚度。与对照组相比，在两种化合物剂量下都观察到皮质骨厚度的增加：25mg/kg组中9%（p=0.04）；83mg/kg组中8%（p=0.07）。对于Li2CO3组来说，观察到皮质骨厚度降低2%（p=0.90）。
在第二项研究中，通过仍是在10.7周龄时开始用2-((5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸对F1雄性杂交（129x C57）小鼠进行25天处理，确定了所述化合物的体内效应。在动物的饮食中施用该化合物。使用了四组小鼠：对照（N=12）；1mg/kg的化合物（N=9）；8mg/kg的化合物（N=9）；以及24mg/kg的化合物（N=9）。如图5中所示，用8mg/kg处理的小鼠表现出中段股骨干的皮质厚度增加4%（p=0.19），用24mg/kg处理的小鼠表现出增加6%（p=0.05）。
2-((5-氯-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸的药理学
Figure BDA00002918764400511
在Fischer344卵巢切除大鼠中研究2-((5-氯-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸的药理学。大鼠在43或46周龄时经历卵巢切除术或假手术，并在37或40周后，在83周龄时开始用化合物进行处理。
使用了4个处理组：给予对照饮食的假手术组（N=14）；给予化合物的假手术组（N=12）；给予对照饮食的OVX手术组（N=14）和给予化合物的OVX手术组（N=12）。化合物通过掺入到大鼠的饮食中来进行给药：每kg饮食0.46克化合物。目标剂量是30mg/kg。给药进行5周。
使用Scanco μCT40，通过microCT来测定骨质量和结构。如图6中所示，在假手术和OVX两组中，处理增加了中段股骨干的皮质骨厚度：在完整大鼠中增加3%，在卵巢切除大鼠中增加5%。假手术对照组和OVX对照组的皮质骨厚度之间的差异是-13%。双因子ANOVA值为：对于OVX手术来说，p<0.001；对于处理来说，p=0.05；对于相互作用来说，p=0.65。
如图7中所示，在假手术和OVX两组中，处理也增加了中段胫骨干的皮质厚度：在完整大鼠中增加2%，在卵巢切除大鼠中增加5%。双因子ANOVA值为：对于OVX手术来说，p=0.79；对于处理来说，p=0.05；对于相互作用来说，p=0.52。
2-((5-氯-6-异丙基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸的药理学
Figure BDA00002918764400521
通过在8.7周龄时开始用2-((5-氯-6-异丙基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸对F1雄性杂交（129x C57）小鼠进行25天处理，确定了所述化合物的体内效应。每日两次通过经口强喂法施用该化合物（介质=含有0.1%Tween80的水）。使用4组小鼠：对照（N=13）；5mg/kg的化合物（N=13）；10mg/kg的化合物（N=13）；15mg/kg的化合物（N=13）。
通过microCT（Scanco μCT40）测量中段股骨干的皮质厚度。与对照组相比，在所有剂量下都观察到皮质骨厚度的增加：5mg/kg组中增加6%（p=0.002）；10mg/kg组中增加5%（p=0.007）；15mg/kg组中增加6%（p=0.001）。
2-((6-氯-7-环丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸的药理学
Figure BDA00002918764400522
通过在8.7周龄时开始用2-((6-氯-7-环丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸对F1雄性杂交（129x C57）小鼠进行25天处理，确定了所述化合物的体内效应。每日通过经口强喂法施用该化合物（介质=含有0.1%Tween80的水）。使用4组小鼠：对照（N=13）；3mg/kg的化合物（N=13）；10mg/kg的化合物（N=13）；30mg/kg的化合物（N=13）。
通过microCT（Scanco μCT40）测量中段股骨干的皮质厚度。如图8中所示，与对照相比，在所有剂量下都观察到皮质骨厚度的增加：3mg/kg组中增加7%（p=0.003）；10mg/kg组中增加10%（p<0.001）；30mg/kg组中增加13%（p<0.001）。
2-((6-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸的药理学
Figure BDA00002918764400531
在第一项实验中，通过在54周龄时开始用2-((6-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸对F1雄性杂交（129x C57）小鼠进行25天处理，确定了所述化合物的体内效应。每日通过经口强喂法施用该化合物（介质=含有0.1%Tween80的水）。使用3组小鼠：对照（N=10）；10mg/kg的化合物（N=10）；100mg/kg的化合物（N=10）。与对照相比，在两种剂量下都观察到了通过microCT（Scanco μCT40）测量到的中段股骨干的皮质骨厚度增加：10mg/kg组中增加6%（p=0.06）；100mg/kg组中增加7%（p=0.03）。在本实验中，正如通常情况下那样，使用每只小鼠的右股骨获得中段股骨干的皮质厚度数据。在本实验中，10mg/kg剂量组的结果包括了右股骨测量结果异常的一只小鼠的左股骨测量结果。
在第二项实验中，通过在8.1周龄时开始用2-((6-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸对F1雄性杂交（129x C57）小鼠进行7天和18天处理，确定了所述化合物的体内效应。在动物的饮食中施用该化合物。使用3组小鼠：对照（N=9）；34mg/kg的化合物7天（N=9）；34mg/kg的化合物18天（N=9）。如图9中所示，与对照相比，在两个处理组中都观察到了中段股骨干的皮质骨厚度增加：处理7天后增加6%（p=0.13）；处理18天后增加10%（p<0.01）。
上面引用的所有参考文献（例如专利和专利申请）在此以其全文引为参考。

Claims (15)

1.下式的化合物或其药学可接受的盐：
Figure FDA00002918764300011
其中：
X是OR1B或N(R1B)2；
每个R1B独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
R2是氢、卤素、-CO2R2A、-C(O)N(R2A)2、-SR2A、-OR2A、-N(R2A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
每个R2A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
R3是氢、卤素、氰基、-CO2R3A、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A、-N(R3A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
每个R3A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
R5是氢、卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
每个R5A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且
n是1或2；
其中“任选取代的”是指任选被一个或多个烷氧基、烷基、氨基（包括烷基氨基、二烷基氨基）、芳基、羧酸、氰基、卤素、卤代烷基、杂环或羟基取代。
2.下式的化合物或其药学可接受的盐：
Figure FDA00002918764300012
其中：
X是OR1B或N(R1B)2；
每个R1B独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
R2是氢、卤素、-CO2R2A、-C(O)N(R2A)2、-SR2A、-OR2A、-N(R2A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
每个R2A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
R3是氢、卤素、氰基、-CO2R3A、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A、-N(R3A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
每个R3A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
R4是氢、卤素或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
R5是氢、卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
每个R5A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且
n是0、1或2；
其中“任选取代的”是指任选被一个或多个烷氧基、烷基、氨基（包括烷基氨基、二烷基氨基）、芳基、羧酸、氰基、卤素、卤代烷基、杂环或羟基取代。
3.权利要求2的化合物，其中n是0；
4.权利要求1或2的化合物，其中X是OR1B。
5.权利要求1-4任一项的化合物，其中R1B是氢或任选取代的烷基或芳基。
6.权利要求5的化合物，其中R1B是氢或烷基。
7.权利要求1-4任一项的化合物，其中R2是氢或任选取代的烷基。
8.权利要求1-4任一项的化合物，其中R3是烷基或卤素。
9.权利要求8的化合物，其中R3是氯。
10.权利要求1-4任一项的化合物，其中R5是烷基或卤素。
11.权利要求10的化合物，其中R5是C1-4烷基。
12.化合物或其药学可接受的盐，所述化合物是2-((5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸、2-((5-氯-6-异丙基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸、2-((6-氯-7-环丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸或2-((6-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)硫代)乙酸。
13.药物组合物，其包含权利要求1-12任一项的化合物和药学可接受的赋形剂或稀释剂。
14.权利要求1-12任一项的化合物在制造用于治疗或管控以骨损失为特征的疾病或障碍的药物中的应用。
15.下式的化合物或其药学可接受的盐在制造用于治疗或管控以骨损失为特征的疾病或障碍的药物中的应用：
Figure FDA00002918764300031
其中：
X是OR1B或N(R1B)2；
每个R1B独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
R2是氢、卤素、-CO2R2A、-C(O)N(R2A)2、-SR2A、-OR2A、-N(R2A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
每个R2A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
R3是氢、卤素、氰基、-CO2R3A、-C(O)N(R3A)2、-SR3A、-OR3A、-N(R3A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
每个R3A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
R5是氢、卤素、-CO2R5A、-C(O)N(R5A)2、-SR5A、-OR5A、-N(R5A)2或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；并且
每个R5A独立地是氢或任选取代的烷基、芳基、杂烷基或杂环；
其中“任选取代的”是指任选被一个或多个烷氧基、烷基、氨基（包括烷基氨基、二烷基氨基）、芳基、羧酸、氰基、卤素、卤代烷基、杂环或羟基取代。
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