PT2307435E - Sais de compostos inibidores de vih - Google Patents

Description

ΕΡ2307435Β1

DESCRIÇÃO

SAIS DE COMPOSTOS INIBIDORES DE VIH

Campo da invenção A invenção refere-se de modo geral a sais de compostos com actividade anti-viral, e mais especificamente com propriedades anti-VIH.

Antecedentes da invenção 0 vírus da imunodeficiência humana (VIH) é um retro vírus que pode levar a síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), uma condição em humanos em que o sistema imunitário está enfraquecido, levando a infecções oportunistas com risco de vida. Os inibidores do VIH são úteis para tratar a infecção pelo VIH num mamífero (por exemplo, reduzir e limitar o estabelecimento e progressão da infecção pelo VIH), assim como em ensaios de diagnóstico para o VIH. A utilidade dos inibidores do VIH actualmente comercializados é até certo ponto limitada pela toxicidade, e outros efeitos secundários. Assim, existe uma necessidade de novos agentes terapêuticos do VIH.

Uma formulação farmacêutica de um agente terapêutico, deve entregar o agente terapêutico a um paciente em necessidade do mesmo, de uma forma reproduzível e consistente. Esta consistência de entrega pode ser conseguida, pelo menos em parte, pela incorporação de uma forma em estado sólido, estável, solúvel, do agente terapêutico na composição farmacêutica. Além disso, a síntese da forma em estado 1 ΕΡ2307435Β1 sólido desejada do agente terapêutico, deve ser tecnicamente e economicamente viável, e deve ser adequada para a produção comercial em larga escala. É divulgado N-[(S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il) -4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo em WO 2006/015261 e WO 2006/110157.

Sumário da invenção O N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é um inibidor da transcriptase reversa que bloqueia a replicação do vírus do VIH, in vivo e in vitro, e tem efeitos indesejados limitados quando administrado a seres humanos. A estrutura do N-[ (S) ({ [ (2R, 5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é mostrada na fórmula P:

O N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-i1)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é um sólido de baixo ponto de fusão, amorfo, que é difícil de isolar, purificar, armazenar durante um longo período, e formular como uma composição farmacêutica. O N-[ (S) ({ [ (2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5- 2 ΕΡ2307435Β1 dihidrofurano-2-il]oxi Jmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é também uma base fraca, que é capaz de formar sais com ácidos. Deste modo, num aspecto, a presente invenção proporciona sais estáveis de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo que são fisicamente mais estáveis, e são mais facilmente isolados e formulados, do que a forma de base livre do composto.

Os sais da presente invenção são úteis, por exemplo, para o tratamento de pacientes humanos infectados com o vírus da imunodeficiência humana (estirpes do VIH-1 ou VIH-2) que causa SIDA. Os sais da presente invenção também são úteis, por exemplo, para a preparação de um medicamento para o tratamento do VIH ou um distúrbio associado com o VIH. Os sais da presente invenção também são úteis, por exemplo, para inibir a replicação do vírus do VIH in vitro, e podem então ser utilizados em ensaios biológicos como um composto de controlo para a identificação de outros inibidores da transcriptase reversa, ou para a investigação do mecanismo de acção da transcriptase reversa H1V e a sua inibição.

Assim, num aspecto, a presente invenção proporciona sais de citrato, succinato e malonato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. São divulgados métodos de preparação dos sais anteriores. Em algumas realizações os sais da presente invenção são anidros, ao passo que noutras realizações os sais da presente invenção são pelo menos parcialmente hidratados. Em algumas realizações os sais da presente invenção existem como formas cristalinas. 3 ΕΡ2307435Β1

Assim, a presente invenção compreende sais de citrato, succinato e malonato do composto com fórmula P, bem como hidratos dos mesmos. Os hidratos da invenção podem estar num estado hidratado parcial (por exemplo, hemi-hidrato) ou completo (por exemplo, mono-hidrato). A presente invenção também compreende os sais sujeitos em estados anidros ou essencialmente anidros. Da mesma forma, os sais da invenção e hidratos dos mesmos, compreendem estados amorfos e cristalinos, bem como estados que compreendem ambas as caracteristicas amorfas e cristalinas. Tal como aqui utilizado, "cristalino" significa um material que tem uma estrutura molecular ordenada, de longo alcance. Em contraste, materiais "amorfos" não possuem ordem de longo alcance. Entende-se que os materiais cristalinos são geralmente termodinamicamente mais estáveis do que as formas amorfas da mesma substância. Deste modo, apenas com poucas excepções notáveis, é geralmente preferido usar materiais cristalinos em aplicações farmacêuticas. Uma medida do grau de cristalinidade dos compostos da invenção pode ser vista, por exemplo, na nitidez das bandas de absorção (picos) DSC e XRPD. Quanto mais nitido for o pico, maior o grau de cristalinidade. Por outro lado, quanto mais largo for o pico, menor o grau de cristalinidade.

Como descrito mais detalhadamente no exemplo 12 aqui, em realizações especificas, um sal de citrato de N- [(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é caracterizado por bandas de absorção, obtidas de um padrão de difracção de raios-X em pó, a espaçamentos espectrais-d de 4,48, 3,12 e 6,05 angstroms, um sal de succinato de N-[ (S) ({[(2R,SR)-5-(amino-9H-purina-9-ilo)-4- 4 ΕΡ2307435Β1 fluoro-2,5-dihidrofurano-2- ilo]oxiJmetilo)fenoxifosfinoilo]-L-alaninato de etilo é caracterizado por bandas de absorção, obtidas de um padrão de difracção de raios-X em pó, a espaçamentos espectrais-d de 3,57, 4,80 e 4,99 angstroms, e um sal de malonato de N-[ (S) ({ [ (2R, 5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é caracterizado por bandas de absorção, obtidas de um padrão de difracção de raios-X em pó, a espaçamentos espectrais-d de 4,99, 5,93 e 4,72 angstroms. Noutra realização especifica, a presente invenção proporciona um sal de citrato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo com um ponto de fusão de entre 142 °C a 150 °C. O N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é um pró-fármaco amidato que sofre reacção com, e decomposição em solventes próticos. A taxa da reacção depende do pH e da temperatura. Consequentemente, é um resultado surpreendente e inesperado, a formação de um sal estável entre o pró-fármaco amidato e ácido cítrico, ácido succínico e/ou ácido malónico, que contêm cada um porções nucleofílicas capazes de reagir com o pró-fármaco (por exemplo, reacção com a porção amidato do pró-fármaco).

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas, que incluem cada uma, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um sal da presente invenção, e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas da presente invenção podem 5 ΕΡ2307435Β1 também incluir um agente terapêutico adicional, tal como um agente anti-viral, antibacteriano, antifúngico ou anti-cancerígeno. As composições farmacêuticas da invenção podem estar na forma de formas de dosagem unitárias, tais como comprimidos ou cápsulas. As formas de dosagem unitária, fornecem tipicamente uma dose diária eficaz de um sal da presente invenção a um ser humano em necessidade do mesmo. As doses diárias eficazes dos sais da presente invenção são tipicamente de 1 mg a 100 mg, tal como de 10 mg a 30 mg. São divulgados métodos de preparação dos sais de citrato, succinato e malonato da presente invenção. Assim, por exemplo, é divulgado um processo para a preparação de um sal de citrato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo , em que o processo inclui a etapa de pôr em contacto cerca de um equivalente da base livre de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9-ilo-purina-9-ilo)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-ilo]oxiJmetilo)fenoxifosfinoilo]-L-alaninato de etilo num solvente adequado (por exemplo, acetonitrilo) , com uma forma de cerca de um equivalente a cerca de 1,2 equivalentes de ácido cítrico, a uma temperatura na gama de desde cerca de 55 °C a cerca de 75 °C. É divulgado um processo para a preparação de um sal de succinato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi Jmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo , em que o processo inclui a etapa de pôr em contacto cerca de um equivalente da base livre de N-[(S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi Jmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato 6 ΕΡ2307435Β1 de etilo num solvente adequado (por exemplo, 2-butanona), com desde cerca de um equivalente a cerca de 1,2 equivalentes de ácido succinico, a uma temperatura na gama de desde cerca de 60 °C até cerca de 70 °C, para formar o sal de succinato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo.

Além disso, é divulgado um processo para a preparação de um sal de malonato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo , em que o processo inclui a etapa de pôr em contacto cerca de um equivalente da base livre de N-[ (S) ({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo num solvente adequado (por exemplo, 2-butanona), com cerca de um equivalente a cerca de 1,2 equivalentes de ácido malónico, a uma temperatura na gama de desde cerca de 50 °C até cerca de 70 °C, para formar o sal de malonato de N-[ (S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi Jmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. São divulgados métodos de tratamento ou prevenção profilática de SIDA, em que os métodos incluem a etapa de administração a um ser humano sofrendo de SIDA de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um sal da invenção, ou um hidrato do mesmo. 7 ΕΡ2307435Β1

Breve descrição das figuras A figura 1 mostra um rastreio de calorimetria diferencial de varrimento (DSC) caracteristico para o sal de malonato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. A figura 2 mostra um rastreio de DSC caracteristico para o sal de succinato de N-[(S) ({ [ (2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. A figura 3 mostra um rastreio de DSC caracteristico para o sal de citrato de N-[ (S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. A figura 4 mostra um padrão de difracção de raios-X em pó (XRPD) caracterí stico para o sal de malonato de N-[(S) ({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-ilo)-4-fluoro-3, 5-dihidrofurano-2-ilo]oxi}metilo)fenoxifosfinoilo]-L-alaninato de etilo. A figura 5 mostra um padrão de XRPD característico para o sal de succinato de N-[(S) ({ [ (2R, 5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. A figura 6 mostra um padrão de XRPD característico para o sal de citrato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9- 8 ΕΡ2307435Β1 il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. Descrição detalhada da realização exemplar

Quando os nomes comerciais são aqui utilizados, os requerentes pretendem incluir de forma independente o produto do nome comercial, e o(s) inqrediente(s) farmacêutico(s) activo(s) do produto do nome comercial.

Sais de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo

Num aspecto, a presente invenção proporciona sais de citrato, succinato e malonato de N-[(S) ({[(2R,5R)-5-(6- amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. 0 sal de citrato é mostrado na fórmula I: 1 NHj

0 sal de succinato é mostrado na fórmula II: 9 ΕΡ2307435Β1 Π

Ο sal de malonato é mostrado na fórmula III: m

É descrito aqui no exemplo de referência I um método para a síntese de N-[ (S) ({[(2R,3R)-5-(6-amino-9H-purina-9-ilo)-4-fluoro-2,3-dihidrofurano-2- ilo]oxi}metilo)fenoxifosfinoilo]-L-alaninato de etilo. São aqui descritos nos exemplos 3, 4 e 5, respectivamente, os métodos para produzir os sais de malonato, succinato e citrato de N-[ (S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. Algumas propriedades físicas dos sais anteriores são aqui descritas no exemplo 6, e demonstra por exemplo, que cada um destes sais é fisicamente estável quando armazenado a 40 °C e uma humidade relativa de 75%.

Os sais de citrato, succinato e malonato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato 10 ΕΡ2307435Β1 de etilo são úteis por exemplo, para inibir a replicação do VIH in vitro e in vivo. A este respeito, como aqui se explica mais detalhadamente no exemplo de referência 8, o N-[ (S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-ilo)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-3-ilo]oxi}metilo)fenoxifosfinoilo]-L-alaninato de etilo é um pró-fármaco que é metabolizado no corpo humano para dar um composto parente, que por sua vez é fosforilado no interior do corpo, para produzir o metabolito activo que inibe a replicação do VIH. 0 exemplo de referência 8 aqui, mostra que o N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo provoca uma maior acumulação do metabolito activo em glóbulos brancos, que são as células que abrigam o virus VIH, do que o faz o composto parente. Além disso, o exemplo de referência 9 aqui, apresenta dados in vitro mostrando que o N—[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi Jmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é um fármaco anti-VIH mais potente do que o composto parente, tal como avaliado num ensaio in vitro. Adicionalmente, o exemplo 10 aqui, fornece dados mostrando que um comprimido que contém o sal de citrato de N-[(S)({[(2R,4R)-5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-ilo)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-ilo]oxi}metilo)fenoxifosfinoilo]-L-alaninato de etilo, fornece este fármaco para a corrente sanguínea de cães Beagle com farmacocinéticas semelhantes a uma preparação liquida do fármaco administrado por via oral. Assim, o sal de citrato de N-[(S) ({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é uma composição fisicamente e quimicamente estável de matéria, que pode ser administrado por via oral a um sujeito vivo, 11 ΕΡ2307435Β1 para proporcionar uma quantidade terapeuticamente eficaz de N-[ (S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo , que é um aqente anti-VIH mais eficaz do que o composto parente.

Composição farmacêutica

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas, também referidas como formulações farmacêuticas, que incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais sais da invenção, e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Embora seja possível que os sais da invenção sejam administrados sozinhos, é geralmente preferível administrá-los como composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas da invenção são formuladas com veículos e excipientes convencionais, que são seleccionados de acordo com a prática comum. 0(s) transportador(es) deve(m) ser "aceitável(eis)" no sentido de ser(em) compatível(eis) com os outros ingredientes da formulação, e fisiologicamente inócuo(s) para o seu receptor. Os comprimidos contêm tais componentes como excipientes, agentes de deslizamento, agentes de enchimento, ligantes e semelhantes. As formulações aquosas são preparadas de forma estéril, e quando se destinam à entrega por outro meio, que não a administração oral, são geralmente isotónicas. Todas as formulações contêm opcionalmente excipientes, tais como os descritos no Manual de excipientes farmacêuticos (R. C. Rowe et al., Pharmaceutical Press, 5a ed., 2006). Os excipientes incluem ácido ascórbico e outros antioxidantes, 12 ΕΡ2307435Β1 agentes quelantes tais como EDTA, hidratos de carbono tais como dextrina, hidroxialquilcelulose, hidroxialquilmetilecelulose, ácido esteárico e semelhantes. 0 pH das formulações varia entre cerca de 3 a cerca de 11, mas é normalmente de cerca de 7 a 10.

As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária (por exemplo, um comprimido), e podem ser preparadas por qualquer dos métodos bem conhecidos na tecnologia da farmácia. As técnicas e formulações são geralmente encontradas em Ciências farmacêuticas Remington (Mack Publishing Co., Easton, PA). Tais métodos incluem a etapa de colocar em associação o ingrediente activo com o transportador, que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas por colocar em associação, uniformemente e intimamente, o ingrediente activo com transportadores líquidos ou transportadores sólidos finamente divididos ou ambos, e em seguida, se necessário, moldar o produto.

As formulações farmacêuticas contendo o ingrediente activo, podem estar em qualquer forma adequada para o método de administração pretendido. Por exemplo quando utilizadas para uso oral, podem ser preparados comprimidos, pastilhas, rebuçados, suspensões aquosas ou de óleo, pós dispersáveis ou grânulos, emulsões, cápsulas duras ou moles, xaropes ou elixires. As composições destinadas a utilização oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na tecnologia para o fabrico de composições farmacêuticas, e tais composições podem conter um ou mais agentes, incluindo agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes corantes e agentes conservantes, a fim de proporcionar uma 13 ΕΡ2307435Β1 preparação de sabor agradável. São aceitáveis os comprimidos que contêm o ingrediente activo em mistura com excipientes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, que são adequados para fabricação de comprimidos. Estes excipientes podem ser por exemplo, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio ou de sódio, lactose, monohidrato de lactose, croscarmelose de sódio, povidona, fosfato de cálcio ou de sódio, agentes de granulação e de desintegração, tais como amido de milho ou ácido alginico, agentes aglutinantes, tais como celulose, celulose microcristalina, amido, gelatina ou acácia, e agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Os comprimidos podem não ser revestidos, ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas incluindo a microencapsulação, para retardar a desintegração e absorção no tracto gastrointestinal, e assim proporcionar uma acção prolongada durante um período mais longo. Por exemplo, pode ser empregue um material retardador tal como monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo, sozinho ou com uma cera.

As formulações para utilização oral podem também ser apresentadas como cápsulas de gelatina dura, em que o ingrediente activo é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo fosfato de cálcio ou caulino, ou como cápsulas de gelatina mole, em que o ingrediente activo é misturado com água ou com um meio oleoso, tal como óleo de amendoim, parafina líquida ou azeite.

As suspensões aquosas de sais da invenção contêm os materiais activos em mistura com excipientes adequados para o fabrico de suspensões aquosas. Tais excipientes podem 14 ΕΡ2307435Β1 incluir um agente de suspensão, tal como carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, metilcelulose de hidroxipropilo, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto e goma de acácia, e agentes dispersantes ou humidificantes, tais como um fosfatideo de ocorrência natural (por exemplo, lecitina), um produto de condensação de um óxido de alquileno com um ácido gordo (por exemplo, estearato de polioxietileno), um produto de condensação de óxido de etileno com um álcool alifático de cadeia longa (por exemplo, heptadecaetilenooxicetanol) , um produto de condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de um ácido gordo e um anidrido de hexitol (por exemplo, monooleato de polioxietileno sorbitano). A suspensão aquosa pode também conter um ou mais conservantes, tais como etilo ou p-hidroxibenzoato de n-propilo, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes aromatizantes e um ou mais agentes edulcorantes, tais como sacarose ou sacarina.

As suspensões oleosas podem ser formuladas suspendendo o ingrediente activo num óleo vegetal, tal como óleo de amendoim, azeite, óleo de sésamo ou óleo de coco, ou num óleo mineral tal como parafina liquida. As suspensões orais podem conter um agente espessante, tal como cera de abelhas, parafina dura ou álcool cetilico. Podem ser adicionados agentes edulcorantes, tais como os estabelecidos anteriormente, e agentes aromatizantes, para proporcionar uma preparação oral de sabor agradável. Estas composições podem ser conservadas pela adição de um antioxidante, tal como ácido ascórbico. 15 ΕΡ2307435Β1

Os pós dispersáveis e grânulos da invenção adequados para a preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água, proporcionam o ingrediente activo em mistura com um agente dispersante ou humidificante, um agente de suspensão, e um ou mais conservantes. Agentes dispersantes ou humidificantes e agentes de suspensão adequados são exemplificados por aqueles divulgados anteriormente. Podem também estar presentes excipientes adicionais, por exemplo agentes edulcorantes, aromatizantes e corantes.

As composições farmacêuticas da invenção podem também estar sob a forma de emulsões óleo em água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, tal como azeite ou óleo de amendoim, um óleo mineral, tal como parafina liquida, ou uma mistura destes. Agentes emulsionantes adequados incluem gomas de ocorrência natural, tais como goma de acácia e goma de tragacanto, fosfatideos de ocorrência natural, tais como lecitina de soja, ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos gordos e anidridos de hexitol, tais como monooleato de sorbitano, e produtos de condensação destes ésteres parciais com óxido de etileno, tais como monooleato de polioxietileno sorbitano. A emulsão pode também conter agentes edulcorantes e aromatizantes. Os xaropes e elixires podem ser formulados com agentes edulcorantes, tais como glicerol, sorbitol ou sacarose. Tais formulações podem também conter um agente demulcente, um conservante, um aromatizante ou um corante.

As composições farmacêuticas da invenção podem estar na forma de uma preparação injectável estéril, tal como uma suspensão injectável estéril aquosa ou oleaginosa. Esta suspensão pode ser formulada de acordo com a tecnologia 16 ΕΡ2307435Β1 conhecida, utilizando aqueles agentes dispersantes ou humidificantes e agentes de suspensão adequados que foram mencionados anteriormente. A preparação injectável estéril pode também ser uma solução ou suspensão injectável estéril, num diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável, tal como uma solução em 1,3-butano-diol, ou preparada como um pó liofilizado. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues estão a água, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. Além disso, os óleos estéreis fixos podem ser convencionalmente utilizados como um meio solvente ou de suspensão. Para este fim, qualquer óleo fixo brando pode ser empregue incluindo mono- ou diglicéridos sintéticos. Além disso, podem do mesmo modo ser utilizados na preparação de injectáveis, ácidos gordos tais como ácido oleico. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com o material transportador para produzir uma forma de dosagem única, irá variar dependendo por exemplo, do modo particular de administração. Por exemplo, uma formulação de libertação temporal destinada à administração oral a humanos, pode conter aproximadamente 1 a 1000 mg de material activo composto com uma quantidade apropriada e conveniente de material transportador, que pode variar de cerca de 5% a cerca de 95% da composição total (peso: peso).

As formulações adequadas para administração no olho incluem gotas oculares, em que o ingrediente activo é dissolvido ou suspenso num veiculo adequado, especialmente um solvente aquoso para o ingrediente activo. 17 ΕΡ2307435Β1

As formulações adequadas para administração tópica na boca incluem rebuçados, compreendendo o ingrediente activo numa base aromatizada, tal como sacarose e acácia ou tragacanto, pastilhas compreendendo o ingrediente activo numa base inerte tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia, e elixires compreendendo o ingrediente activo num transportador líquido adequado.

As formulações para administração rectal podem ser apresentadas como um supositório, com uma base adequada compreendendo por exemplo manteiga de cacau ou um salicilato.

As formulações adequadas para administração intrapulmonar ou nasal têm um tamanho de partícula por exemplo na gama de 0,1 a 500 micra (incluindo tamanhos de partículas numa gama entre 0,1 e 500, micra em incrementos de micra tais como 0,5, 1, 30 micra, 35 micra, etc.), que são administradas por inalação rápida através da passagem nasal ou por inalação através da boca, de modo a atingir os sacos alveolares. As formulações adequadas incluem soluções aquosas ou oleosas do ingrediente activo. As formulações adequadas para administração em aerossol ou pó seco podem ser preparadas de acordo com métodos convencionais, e podem ser fornecidas com outros agentes terapêuticos, tais como compostos outrora utilizados no tratamento ou profilaxia de condições associadas com a actividade do VIH.

As formulações adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, gel, pastéis, espumas ou formulações para pulverização, contendo 18 ΕΡ2307435Β1 para além do ingrediente activo, tais transportadores como os conhecidos na tecnologia como sendo apropriados.

As formulações adeguadas para administração parentérica incluem soluções para injecção estéreis aguosas e não aguosas, gue podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos, que tornam as formulações isotónicas com o sangue do receptor pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas, que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes.

As formulações são apresentadas em recipientes de dose unitária ou multi-dose, por exemplo ampolas e frascos dimensionados, e podem ser armazenadas numa condição congelada-seca (liofilizada), requerendo apenas a adição do transportador liquido estéril, por exemplo água para injecção, imediatamente antes da utilização. As soluções e suspensões injectáveis extemporâneas são preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo previamente descrito. As formulações de dosagem unitária preferidas, são aquelas que contêm uma dose diária ou unidade de sub-dose diária ou uma fracção apropriada da mesma, do ingrediente activo. Assim por exemplo, uma dose diária de um sal da presente invenção pode ser fornecida num único comprimido, ou em vários comprimidos (por exemplo, dois ou três comprimidos).

Deve ser entendido que para além dos ingredientes particularmente mencionados anteriormente, as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais na tecnologia, tendo em conta o tipo de formulação em 19 ΕΡ2307435Β1 questão, por exemplo aquelas que são adequadas para administração oral podem incluir agentes aromatizantes.

As formulações farmacêuticas que estão também dentro do âmbito da invenção proporcionam uma libertação controlada do ingrediente activo, para permitir uma dosagem menos frequente ou para melhorar o perfil farmacocinético ou de toxicidade do ingrediente activo. Por conseguinte, a invenção também proporciona composições farmacêuticas compreendendo um ou mais sais da invenção, formuladas para libertação prolongada ou controlada.

Uma dose eficaz de um sal da presente invenção, depende por exemplo, do facto de o sal estar a ser utilizado profilacticamente (tipicamente é necessária uma dose mais baixa em relação ao uso terapêutico do mesmo sal) , do método de entrega e da formulação farmacêutica, e será determinada pelo médico, utilizando estudos de escalonamento de dose convencionais. Uma dose eficaz pode-se esperar que seja entre cerca de 0,0001 mg/kg de peso corporal por dia, a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia. Tipicamente, de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia. Mais tipicamente, de cerca de 0,01 a cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dia. Mais tipicamente, de cerca de 0,05 a cerca de 0,5 mg/kg de peso corporal por dia. Por exemplo, a dose diária para um humano adulto de aproximadamente 70 kg de peso corporal estará tipicamente na gama de 1 mg a 1000 mg, de preferência entre 5 mg e 500 mg, podendo assumir a forma de doses únicas ou múltiplas. A titulo de exemplo, a dose de um sal da presente invenção numa formulação de dose unitária a ser administrada uma vez por dia, pode ser de 1 mg a 100 mg, 20 ΕΡ2307435Β1 tal como de 30 mg a 60 mg, tal como uma dose diária de 30 mg ou uma dose diária de 60 mg.

Terapia combinada

Cada um dos sais de citrato, succinato e malonato de N-[ (S) ({ [(3R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-ilo)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-ilo]oxi}metilo)fenoxifosfinoilo]-L-alaninato de etilo podem ser utilizados em combinação com outros agentes terapêuticos para o tratamento ou profilaxia de SIDA, e/ou uma ou mais de outras doenças presentes num sujeito humano que sofra de SIDA (por exemplo, infecções bacterianas e/ou fúngicas, outras infecções virais, como a hepatite B ou hepatite C, ou cancros tais como o sarcoma de Kaposi). 0(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(ais) pode(m) ser co-formulado(s) com um ou mais sais da invenção (por exemplo, co-formulado(s) num comprimido).

Exemplos de tais agentes terapêuticos adicionais incluem agentes que são eficazes para o tratamento ou profilaxia de infecções virais, parasitárias ou bacterianas, ou condições associadas, ou para o tratamento de tumores ou condições relacionadas, incluem 3'-azido-3'-deoxitimidina (zidovudina, AZT), 2'-deoxi-3'-tiacitidina (3TC), 2',3'- dideoxi-2',3'-didehidroadenosina (D4A), 2',3'-dideoxi- 2',3'-didehidrotimidina (D4T), carbovir (carbocíclico 2',3'-dideoxi-2',3'-didehidroguanosina), 3'-azido-2,3'- didcoxiuridina, 5-fluorotimidina, (E)-5-(2-bromovinilo)-2'-deoxiuridina (BVDU), 2-clorodeoxiadenosina, 2- deoxicoformicina, 5-fluorouracilo, 5-fluorouridina, 5- fluoro-2'-deoxiuridina, 5-trifluorometilo-2'-deoxiuridina, 6-azauridina, 5-ácido fluoroarótico, metotrexato, 21 ΕΡ2307435Β1 triacetiluridina, 1-(2'-deoxi-2'-fluoro-l-p-arabinosilo)-5-iodocitidina (FIAC), tetrahidro-imidazo (4,5, 1-jk)-(1,4)-benzodiazepina-3 (lH)-tiona (TIBO), GMP 2'-norcíclico, 6-metoxipurina arabinosido (ara-M), 6-metoxipurina arabinosido 2'-O-valerato, citosina arabinosido (ara-C) , 2', 3' dideoxinucleosídeos tais como 2',3'-dideoxicitidina (ddC), 2',3'-dideoxiadenosina (ddA) e 2',3'-dideoxiinosina (ddl), nucleosídeos aciclicos, tais como, aciclovir, penciclovir, famciclovir, ganciclovir, HPMPC, PMEA, PMEG, PMPA, PMPDAP, FPMPA, HPMPA, HPMPDAP, (2R,5R)-9-tetrahidro-5-(fofonometoxi)-2-furaniladenina, (2R,5R)-l-tetrahidro-5-(fosfonometoxi)-2-furaniltimina, outros anti-virais, incluindo ribavirina (adenina arabinosido), 2-tio-6-azauridina, tubercidina, ácido aurintricarboxilico, 3-deazaneoplanocin, neoplanocin, rimantidina, adamantina, e foscarnete (fosfonoformato trissódico), agentes antibacterianos, incluindo fluoroquinolonas bactericidas (ciprofloxacina, pefloxacina e semelhantes), antibióticos aminoglicosidicos bactericidas (estreptomicina, gentamicina, amicacina e semelhantes), inibidores de β-lactamase (cefalosporinas, penicilinas e semelhantes), outros antibacterianos, incluindo tetraciclina, isoniazida, rifampicina, cefoperazona, claitromicina e azitimmicina, agentes antiparasita ou anti-fúngicos incluem pentamidina (1,5-bis (4'-aminofenoxi) pentano), 9-deazainosina, sulfametoxazol, sulfadiazina, quinapiramina, quinina, fluconazol, cetoconazol, itraconazol, anfotericina B, 5-fluarocitosina, clotrimazol, hexadccilfosfocolina e nistatina, inibidores de excreção renal tais como probenecida, inibidores de transporte de nucleosídeos, tais como dipiridamol, dilazep e nitrobenziltioinosina, imunomoduladores tais como FK506, ciclosporina A, timosina 22 ΕΡ2307435Β1 α-l, citocinas, incluindo TNF e TGF-β, interferões, incluindo IFN-α , IFN-β e IFN-γ, interleucinas incluindo várias interleucinas, factores estimulantes de colónias de macrófagos/granulócitos, incluindo GM-CSF, G-CSF, M-CSF, antagonistas de citocinas, incluindo anticorpos anti-TNF, anticorpos anti-interleucina, receptores de interleucina solúveis, inibidores da proteína quinase C e semelhantes.

Exemplos de agentes terapêuticos activos ou ingredientes adequados que podem ser combinados com os sais da invenção, e que têm actividade contra o VIH, incluem: 1) inibidores da protease do VIH, por exemplo, amprenavir, atazanavir, fosamprenavir, indinavir, lopinavir, ritonavir, lopinavir -r ritonavir, nelfinavir, saquinavir, tipranavir, brecanavir, darunavir, TMC-126, TMC-114, mozenavir (DMP-450), JE-2147 (AGI7 7 6), AGI 8 3 9, DG35, L-756423, RO0334649, KNI-272, DPC-681, DPC-684, e GW640385X, DG17.PPL-100, 2) um inibidor não nucleosídeo do VIH da transcriptase reversa, por exemplo, capravirina, emivirina, deloviridina, efavirenz, nevirapina, (+) calanólido A, etravirina, GW5634, DPC-083, DPC-961, DPC-963, MIV-150 e TMC-120, TMC-278 (rilpivirina), efavirenz, BILR 355 BS, VRX 840773, UK-453.061, RDEA806, 3) um inibidor nucleosídeo do VIH da transcriptase reversa, por exemplo, zidovudina, emtricitabina, didanosina, estavudina, zalcitabina, lamivudina, abacavir, amdoxovir, elvucitabina, alovudina, MIV-210, racivir (-FTC), D-d4FC, emtricitabina fosfazida, fozivudina tidoxil, fosalvudina tidoxil, apricitibina (AVX754) , amdoxovir, KP-1461, abacavir + lamivudina, abacavir + lamivudina + zidovudina, zidovudina + lamivudina, 4) um inibidor nucleotídeo do VIH da transcriptase reversa, por exemplo, tenofovir, fumarato de tenofovir disoproxilo + emtricitabina, fumarato de 23 ΕΡ2307435Β1 tenofovir disoproxilo + emtricitabina + efavirenz, e adefovir, 5) um inibidor de integrase do VIH, por exemplo, curcumina, derivados de curcumina, ácido chicórico, derivados do ácido chicórico, ácido 3,5-dicafeoilquinico, derivados do ácido 3,5-dicafeoilquinico, ácido aurintricarboxilico, derivados do ácido aurintricarboxilico, ácido cafeico fenetilo éster, derivados do ácido cafeico fenetilo éster, tirfostin, derivados de tifostin, quercetina, derivados de quercetina, S-1360, zintevir (AR-177), L-870812, e L-870810, MK-0518 (raltegravir), BMS-707035, MK-2048, BA-011, BMS-538158, GSK364735C, 6) um inibidor de gp41, por exemplo, enfuvirtida, sifuvirtida, FB006M, TRI-1144, SPC3, DES6, Locus gp41, CovX, e REP 9, 7) um inibidor de CXCR4, por exemplo, AMD-070, 8) um inibidor de entrada, por exemplo, SP01A, TNX-355, 9) um inibidor da gpl20, por exemplo, BMS-488043 e BlockAide/CR, 10) um inibidor de G6PD e oxidase-NADH, por exemplo, imunitin, 10) um inibidor de CCR5, por exemplo, aplaviroc, vicriviroc, INCB9471, PRO-140, INCB15050, PF-232798, CCR5mAb004, e maraviroc, 11) um interferão, por exemplo, rIFN-alfa 2b peguilado, rIFN-alfa 2a peguilado, rIFN-alfa 2b, IFN alfa-2b XL, rIFN-alfa 2a, IFN alfa consenso, infergen, rebif, locteron, AV1-005, PEG-infergen, IFN-beta peguilado, interferão alfa oral, ferão, reaferão, intermax alfa, r-IFN-beta, infergen e actimune, IFN-omega com DUROS, e albuferão, 12) análogos de ribavirina, por exemplo, rebetol, copegus, levovirin, VX-497, e viramidina (taribavirin), 13) inibidores de NS5a, por exemplo, A-831 e A-689, 14) inibidores da polimerase NS5b, por exemplo, NM-283, valopicitabina, R1626, PSI-6130 (R1656), HIV-796, BILB 1941, MK-0608, NM-107, R7128, VCH-759, PF-868554, GSK625433, e XTL-2125, 15) inibidores da 24 ΕΡ2307435Β1 protease NS3, por exemplo, SCH-503034 (SCH-7), VX-950 (Telaprevir), ITMN-191, e BILN-2065, 16) inibidores de

alfa-glucosidase 1, por exemplo, MX-3253 (celgosivir) e UT-231B, 17) hepatoprotectores, por exemplo, IDN-6556, ME 3738, MitoQ, e LB-84451, 18) inibidores não nucleosideos do VIH, por exemplo, derivados de benzimidazol, derivados de benzo-1,2,4-tiadiazina, e derivados de fenilalanina, 19) outros fármacos para o tratamento do VIH, por exemplo, zadaxin, nitazoxanida (alinea), BIVN-401 (virostat), DEBIO-025, VGX-410C, EMZ-702, AVI 4065, bavituximab, oglufanida, PYN-17, KPE02003002, actilon (CPG-10101), KRN-7000, civacir, GI-5005, ANA-975 (isatoribina), XTL-6865, ANA 971, NOV-205, tarvacin, EHC-18, e NIM811, 19) potenciadores farmacocinéticos, por exemplo, BAS-100 e SPI452, 20) inibidores de RNAse H, por exemplo, ODN-93 e ODN-112, 21) outros agentes anti-VIH, por exemplo, VGV-1, PA-457 (bevirimat), ampligen, HRG214, citolin, polimun, VGX-410, KD247, AMZ 0026, CYT 99007, A-221 HIV, BAY 50-4798, MDX010 (iplimumab), PBS119, ALG889 e PA-1050040.

Novamente a titulo de exemplo, a lista que se segue divulga os anti-virais VIH exemplares, com os seus correspondentes números de patentes US, que podem ser combinados com os sais da presente invenção.

Anti-virais VIH exemplares e números de patentes

Ziagen (sulfato de abacavir, US 5.034.394)

Epzicom (sulfato de abacavir/lamivudina, US 5.034.394) Hepsera (dipivoxilo de adefovir, US 4.724.233) Agenerase (amprenavir, US 5.646.180)

Reyataz (sulfato de atazanavir, US 5.849.911) 25 ΕΡ2307435Β1

Rescriptor (mesilato de delavirdina, US 5.563.142) Hivid (dideoxicitidina, zalcitabina, US 5.028.595) Videx (dideoxiinosina, didanosina, US 4.861.759) Sustiva (efavirenz, US 5.519.021)

Emtriva (emtricitabina, US 6.642.245)

Lexiva (cálcio fosamprenavir, US 6.436.989) Virudin, Triapten, Foscavir (sódio foscarnet, US 6.476.009)

Crixivan (sulfato de indinavir, US 5.413.999) Epivir (lamivudina, US 5.047.407)

Combivir (lamivudina/zidovudina, US 4.724.232) Aluviran (lopinavir)

Kaletra (lopinavir/ritonavir, US 5.541.206) Viracept (mesilato de nelfinavir, US 5.484.926) Viramune (nevirapina, US 5.366.972)

Norvir (ritonavir, US 5.541.206)

Invirase, Fortovase (mesilato de saquinavir, US 5.196.438)

Zerit (estavudina, US 4.978.655)

Truvada (fumarato de tenofovir disoproxilo/emtricitabina, US 5.210.085)

Aptivus (tipranavir)

Retrovir (zidovudina, azidotimidina, US 4.724.232) Métodos de inibição do VIH São divulgados métodos de tratamento do sindrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) , em que cada um dos métodos inclui a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um sal da invenção, ou um hidrato de um sal da invenção, a um ser humano sofrendo de SIDA. O tratamento de SIDA inclui a melhoria de pelo menos 26 ΕΡ2307435Β1 um sintoma de SIDA, e/ou retardar ou evitar a progressão da doença. Tipicamente, a quantidade terapeuticamente eficaz do sal é administrada a um ser humano, sob a forma de uma composição farmacêutica, tal como descrito no titulo "Composições farmacêuticas". Tipicamente, a composição farmacêutica é administrada por via oral, por exemplo sob a forma de um comprimido. Exemplos de doses diárias terapeuticamente eficazes de um ou mais sais da invenção, ou hidratos dos mesmos, são de 1 mg a 100 mg, tal como de 10 mg a 30 mg. Os sais da invenção podem ser administrados diariamente, por exemplo sob a forma de um ou mais comprimidos, que incluem uma quantidade de sal que fornece uma quantidade eficaz, tal como 10 mg ou 30 mg ou 60 mg, da base livre, quando o sal se dissocia num meio aquoso, dentro do corpo humano.

Vias de administração

Um ou mais sais da invenção são para serem administrados por qualquer via adequada à condição a ser tratada. As vias adequadas incluem oral, rectal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal e parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e epidural), e semelhantes. Será apreciado que a via preferida pode variar com, por exemplo, a condição do destinatário. Uma vantagem dos sais da presente invenção é que são biodisponiveis por via oral e podem ser administrados oralmente.

Exemplos e realizações exemplares: 27 ΕΡ2307435Β1

Exemplo de referência 1. Síntese de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. ΕΡ2307435Β1 .0.

(2) 2-deoxi-2-fluoro-3,5-di-O-benzoilo-a-D-arabinofuranosilbrometo (2) 0 composto (2) foi sintetizado de acordo com os esquemas de síntese apresentados em Tann et al., JOC, 1985, vol. 50, p. 3644 e Howell et al., JOC, 1988, vol. 53, p. 85. A uma solução ou 1,3,5-tri-0-benzoilo-2-deoxi-2-fluoro-a-D-arabinofuranose (1) (120 g, 258 mmol), comercialmente disponível de Davos ou produtos químicos CMS, em CH2C12 (1 L), adicionou-se 33% de HBr/ácido acético (80 ml). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 h, arrefecida com água gelada, e neutralizada lentamente durante 1-2 h com NaHC03 (150 g/1,5 L de solução). A fase de CH2C12 foi separada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, e lavado com NaHC03 até não estar presente ácido. A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada, e concentrada sob pressão reduzida para dar o produto 2 como um óleo amarelo (~ 115 g). 28 ΕΡ2307435Β1 Cf

2-deoxi-2-fluoro-3,5-di-0-benzoilo^-D-arabinofuranosilo-9H-6-cloropurina (3) 0 composto (3) foi sintetizado de acordo com os esquemas de síntese descritos em Ma et al., J. Med. Chem., 1997, vol. 40, p. 2750, Marquez et al., J. Med. Chem., 1990, vol. 33, p. 978, Hildebrand et al., J. Org. Chem., 1992, vol. 57, p. 1808 e Kazimierczuk et al., JACS, 1984, vol. 106, p. 6379. A uma suspensão de NaH (14 g, 60%) em acetonitrilo (900 ml), foi adicionada 6-cloropurina (52,6 g) em 3 porções. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 h. Foi adicionada gota a gota uma solução de 2 (258 mmol) em acetonitrilo (300 ml) . A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 16 h. A reacção foi extinta com ácido acético (3,5 ml), filtrada, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi repartido entre CH2CI2 e água. A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e concentrada. O resíduo foi tratado com CH2C12, e em seguida EtOH (total ~ 1:2) para precipitar o produto desejado 3 como um sólido amarelado (83 g, 65% a partir de 1). 29 ΕΡ2307435Β1 ΕΡ2307435Β1

ΟΜ© W ho^v°vn

\_íUF

HO m 2-deoxi-2-fluoro-p-D-arabinofuranesilo-6-metoxiadenina (4) A uma suspensão de 3 (83 g, 167 mmol) em metanol (1 L) a 0 °C, foi adicionado NaOMe (25% em peso, 76 ml) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h, e depois foi extinta com ácido acético (~ 11 m, pH = 7) . A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi repartido entre hexano e água (aproximadamente 500 ml de hexano e 300 ml de água) . A camada aquosa foi separada, e a camada orgânica foi misturada com água mais uma vez (aproximadamente 300 ml) . As fracções de água foram combinadas e concentradas sob pressão reduzida para ~ 100 ml. O produto 4 precipitou e foi recolhido por filtração (42 g, 88%). GMe

l-deoxi-2-fluoro-5-carboxi-3-D-arabinofuranosilo-6-metoxiadenina (5) O composto (5) foi sintetizado de acordo com os esquemas de síntese divulgados em Moss et al., J. Chem. Soc., 1963, p. 1149. 30 ΕΡ2307435Β1

Uma mistura de Pt/C (10%, 15 g (20-30% equiv. mol) como uma pasta de água) e NaHC03 (1,5 g, 17,94 mmol) em H20 (500 ml) foi agitada a 65 °C sob H2 durante 0,5 h. A mistura de reacção foi então deixada a arrefecer, colocada sob vácuo, e lavada com N2 diversas vezes para remover completamente todo o H2. Foi então adicionado o composto 4 (5,1 g, 17,94 mmol) à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi agitada a 65 °C sob 02 (balão) , até a reacção estar completa por LC-MS (tipicamente 24-72h). A mistura foi arrefecida até à temperatura ambiente e filtrada. O Pt/C foi lavado extensivamente com H20. Os filtrados combinados foram concentrados até ~ 30 ml, e acidificados (pH 4) pela adição de HC1 (4 N) a 0 °C. Precipitou um sólido preto, que foi recolhido por filtração. O produto bruto foi dissolvido numa quantidade mínima de metanol, e filtrado através de uma almofada de sílica gel (eluição com metanol). O filtrado foi concentrado e cristalizado a partir de água para dar o composto 5 (2,5 g) como um sólido esbranquiçado. OMe

(2'R, 3'S, 4'R, 5'R)-6-metoxi-9-[tetrahidro 4-iodo-3- fluoro-5-(dietoxifosfinilo)-metoxi-2-furanilo] purina (6) O composto (6) foi sintetizado de acordo com os esquemas de síntese divulqados em Zemlicka et al., J. Amer. Chem. Soc., 1972, vol. 94, p. 3213. 31 ΕΡ2307435Β1

Foram adicionados a uma solução de 5 (22 g, 73,77 mmol) em DMF (400 ml), DMF dineopentilo acetal (150 ml, 538 mmol) e ácido metanosulfónico (9,5 ml, 146,6 mmol). A mistura de reacção foi agitada a 80-93 °C (temperatura interna) durante 30 min, depois arrefecida até à temperatura ambiente, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi repartido entre acetato de etilo e água. A fase orgânica foi separada e lavada com NaHC03, seguida de salmoura, seca sobre MgS04, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo e fosfonato de dietilo (hidroximetilo) (33 ml, 225

mmol) foram dissolvidos em CH2C12 (250 ml) e arrefecidos até - O o O Foi adicionada gota a gota uma solução de monobrometo de iodo (30,5 g, 1,1 mol) em CH2C12 (100 ml). A mistura foi agitada a -20 até -5 °C durante 6 h. A reacção foi então extinta com NaHC03 e Na2S203. A fase orgânica foi separada, e a fase aquosa foi extraída com CH2C12. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas sobre MgS04, filtradas, e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia de sílica gel para dar o produto 6 (6 g, 15,3%).

Procedimento alternativo para a preparação de 6

Uma solução de 5 (2,0 g, 6,7 mmol) em THF (45 ml) foi tratada com fosfina de trifenilo (2,3 g, 8,7 mmol) sob N2. Foi adicionado lentamente azodicarboxilato de diisopropilo (1,8 g, 8,7 mmol) . A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, e depois concentrada sob pressão reduzida até seca. O resíduo foi dissolvido em CH2C12 (20 ml) , e em seguida tratado com fosfonato de dietilo (hidroximetilo) (4,5 g, 27 mmol). A mistura foi arrefecida até -60 °C, e em seguida foi adicionada uma 32 ΕΡ2307435Β1 solução fria de monobrometo de iodo (2 g, 9, 6 mmol) em CH2CI2 (10 ml) . A mistura de reacção foi aquecida até -10 °C, e depois mantida a -10 °C durante 1 h. A mistura de reacção foi diluída com CH2C12, lavada com NaHC03 aquoso saturado, e em seguida com tiosulfato de sódio aquoso. A fase orgânica foi separada, seca sobre MgS04, e concentrada sob pressão reduzida até seca. A mistura de reacção foi purificada por cromatografia em sílica gel (eluindo com 25% de acetato de etilo em CH2C12, em seguida mudando para 3% de metanol em CH3C12) para dar o produto 6 (0,9 g, 33%).

(2'R,5'R)-6-metoxi-9-[3-fluoro-2,5-dihidro-5-(dietoxifosfinilo)-metoxi-2-furanilo] purina (7) A uma solução do composto 6 (6 g, 11,3 mmol) em ácido acético (2,5 ml) e metanol (50 ml), foi adicionado gota a gota NaClO (10-13%) (50 ml). A mistura de reacção foi então agitada durante 0,5 h e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi tratado com acetato de etilo, e em seguida filtrado para remover os sólidos. O filtrado foi concentrado, e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel para se obter o produto 7 (4 g, 88%). 33 ΕΡ2307435Β1 ΕΡ2307435Β1

<S> sal di-sódico de (2'R,5'R)-9-(fluoro-2,5-dihidro-5-fosfonometoxi-2-furanilo) adenina (8)

Uma solução do composto 7 (2,3 g, 5,7 mmol) em metanol (6 ml) foi misturada com hidróxido de amónio (28-30%) (60 ml). A mistura resultante foi agitada a 120 °C durante 4 h, arrefecida, e depois concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi seco sob vácuo durante 12 h. O resíduo foi dissolvido em DMF (40 ml) , e foi adicionado bromotrimetilsilano (3,5 ml). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 h, e em seguida concentrada sob pressão reduzida. 0 resíduo foi dissolvido em NaHCCq aquoso (2,3 g em 100 ml de água). A solução foi evaporada, e o resíduo foi purificado numa coluna C-18 (40 ym) , eluindo com água. As fracções aquosas foram liofilizadas para dar o sal di-sódico 8 (1,22 g, 57%).

Exemplo de preparação de mono amidato (9) 34 ΕΡ2307435Β1

Foram misturados em piridina anidra (1 ml), sal di -sódico 8 (25 mg, 0,066 mmol), hidrocloreto de éster de (S)-Ala-O- ciclobutilo (24 mg, 2 eq., 0,133 mmol) e fenol (31 mg, 0,333 mmol). Foi adicionada trietilamina (111 μΐ, 0,799 mmol) , e a mistura resultante foi agitada a 60 °C sob azoto. Num frasco separado, foram dissolvidos em piridina anidra (0,5 ml ), 2'-aldritiol (122 mg, 0,466 mmo1) e trifenilfosfina (103 mg, 0,466 mmol), e a solução amarela resultante foi agitada durante 15-20 min. A solução foi então adicionada à solução de 8 numa porção. A mistura combinada foi agitada a 60 °C sob azoto durante 16 h, para dar uma solução amarela clara a castanha clara. A mistura foi então concentrada sob pressão reduzida. O óleo resultante foi dissolvido em CH2C12, e purificado por cromatografia em silica gel (eluindo com um gradiente linear de 0 a 5% de MeOH em CH2C12) para dar um óleo. O óleo resultante foi dissolvido em acetonitrilo e água, e purificado por HPLC preparativa (gradiente linear, 5-95% de acetonitrilo em água). As fracções puras foram combinadas e liofilizadas, para dar mono amidato 9 como um pó branco.

Exemplo de preparação de bis amidato (10) di -sódico (S)-Ala-O-adicionada resultante

Foram misturados em piridina anidra (1 ml), sal 8 (12 mg, 0,032 mmol) e hidrocloreto de éster de n-Pr (32 mg, 6 eq., 0,192 mmol) . Foi trietilamina (53 μΐ, 0,384 mmol), e a mistura 35 ΕΡ2307435Β1 foi agitada a 60 °C sob azoto. Num frasco separado, foram dissolvidos em piridina anidra (0,5 ml), 2'-aldritiol (59 mg, 0,224 mmol) e trifenilfosfina (49 mg, 0,224 mmol), e a solução amarela resultante foi agitada durante 15-20 min. A solução foi então adicionada à solução de 8 numa porção. A mistura combinada foi agitada a 60 °C sob azoto durante 16 h, para dar uma solução amarela clara a castanha clara. A mistura foi então concentrada sob pressão reduzida. 0 óleo resultante foi dissolvido em CH2C12, e purificado por cromatografia em sílica gel (eluindo com um gradiente linear de 0 a 5% de MeOH em CH2C12) para dar um óleo. O óleo resultante foi dissolvido em acetonitrilo e água, e purificado por HPLC preparativa (gradiente linear, 5-95% de acetonitrilo em água). As fracções puras foram combinadas e liofilizadas, para dar bis amidato como um pó branco. ΕΡ2307435Β1 NHj

N

Exemplo de preparação de mono amidato (11) O composto 8 (1,5 g, 4 mmol) foi misturado com sal de éster de HC1 de etilo alanina (1,23 g, 8 mmol) e fenol (1,88 g, 20 mmol) . Foi adicionada piridina anidra (35 ml) , seguida de TEA (6,7 ml, 48 mmol). A mistura foi agitada a 60 °C sob azoto, durante 15-20 min. Foi misturado num frasco separado 2'-aldritiol (7,3 g) com trifenilfosfina (6,2 g) em piridina anidra (5 ml), e a mistura resultante foi agitada 36 ΕΡ2307435Β1 durante 10-15 min para dar uma solução amarela clara límpida. A solução foi então adicionada à mistura anterior, e agitada durante a noite a 60 °C. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida para remover a piridina. O resíduo resultante foi dissolvido em acetato de etilo, e lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (2x) , e depois com uma solução saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e depois concentrada sob pressão reduzida. O óleo resultante foi dissolvido em diclorometano, e carregado numa coluna CombiFlash seca, 40 g, eluindo com um gradiente linear de 0-5% de metanol em diclorometano durante 10 minutos, e em seguida 5% de metanol em diclorometano durante 7-10 minutos. As fracções contendo o produto desejado foram combinadas e concentradas sob pressão reduzida para dar uma espuma. A espuma foi dissolvida em acetonitrilo, e purificada por HPLC preparativa para se obter 11 (0,95 g). 11 (950 mg) foi dissolvido numa peguena guantidade de acetonitrilo, e deixado em repouso à temperatura ambiente durante a noite. 0 sólido foi recolhido por filtração, e lavado com uma pequena quantidade de acetonitrilo. O filtrado foi reduzido sob vácuo, e então carregado numa coluna Chiralpak AS-H equilibrada no tampão A, 2% de etanol em acetonitrilo. 0 isómero A, 12, foi eluído com o tampão A a 10 ml/min durante 17 min. Após o qual foi usado o tampão B, 50% de metanol em acetonitrilo, para eluir o isómero B, 13, separadamente para fora da coluna em 8 min.

Foi removido todo o solvente, e em seguida re-dissolvidos separadamente em acetonitrilo e água. As amostras foram 37 ΕΡ2307435Β1 liofilizadas separadamente (massa-348 mg). 0 isómero 12 é mostrado em seguida

{12)

Exemplo 2. Rastreio de formas de sal de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo

Os ácidos seguintes foram rastreados para determinar se formavam sais cristalinos adequados de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo : ácidos minerais (HX, em que X = halogénio, H3P04) , ácidos orgânicos sulfónicos (RS03H, em que R = Me, Et, Ph, ( + )-cânfora-1O-ácido sulfónico, naftaleno-2-ácido sulfónico, naftaleno-1,5-ácido disulfónico), ácidos mono carboxílicos (RC02H, em que R = H, Me, Et, Ph, trans-PhCH=CH, C12CH, PhCONHCH2) , e ácidos dicarboxilicos (malónico, succínico, fumárico, adípico, oxálico, maleico).

Foram obtidos sólidos com três dos ácidos anteriores quando misturados com N-[ (S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi Jmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo : ácido trifluoroacético, ácido malónico e ácido succínico. 0 ácido trifluoroacético não é considerado como sendo farmaceuticamente aceitável. 38 ΕΡ2307435Β1 Ο Ν-[(S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi Jmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é um pró-fármaco amidato que sofre uma decomposição em solventes próticos, em condições ácidas ou básicas. Por esta razão, os ácidos com porções potencialmente nucleofilicas não foram incluídos na primeira ronda de rastreio. Subsequentemente foram avaliados o ácido cítrico, ácido glicólico, (S)-(+)-ácido láctico, ácido salicílico, (S) -(-)-ácido málico, (S)-( + )-ácido mandélico e (S)-(+)-ácido glutâmico. 0 N- [ (S) ({ [ (2R, 5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo formou inesperadamente um sal cristalino estável com ácido cítrico. Este foi um resultado inesperado, porque o ácido cítrico inclui um grupo hidroxilo que pode actuar como um nucleófilo para a porção de amidato do N-[ (S) ({ [ (2R, 5R)-5- (6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2, 5-dihidrofurano-2-il ]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo , e ser potencialmente submetido a uma reacção com o mesmo, em que se forma uma ligação covalente entre o N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo e o grupo hidroxilo do ácido cítrico, com a expulsão de ou fenol ou éster de alanina etilo.

Exemplo 3. Sintese do sal de malonato de N-[(S)({[(2R,5R) -5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo A forma de base livre de N-[ (S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo foi 39 ΕΡ2307435Β1 dissolvido em 2-butanona morna (15 partes), e foi adicionado ácido malónico (0,26 partes) para formar uma solução com agitação. Foi adicionado heptano (5 partes) à solução, que foi lentamente arrefecida até cerca de 5 °C, recolhida, e lavada com 2-butanona/heptano frio. Foi assim produzido com um rendimento de cerca de 80%, o sal de malonato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo resultante. O espectro de RMN do sal de malonato tinha as seguintes características: 1H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) ppm = 8,27 (s, 1 H), 8,26 (S, 1 H) , 7,32-7,20 (m, 3 H) , 7, 15 (d, , J = 7,8 Hz, 2 H), 6, .78 (m, 1 H) , 5,88 (br. s ♦ t 1 H) , 5, 78 (S, 1 H) , 4,17 (m, 2 H) , 4, 15- 4,07 (m, 3 H) , 3, 85 (dd t J = 8,0, O 00 , 1 H) , 3, 38 (s, 2 N) , 1,31 (d, J = 7, . 0 Hz, 3 H) , 1,23 (t, J = 7, , 0 Hz, 3H) 31P RMN (162 MHz, clorof órmio-d) ppm = 20, 64 (s) 19F RMN (376 MHz, acetonitrilo-d3) ppm = -135,19 (s)

Exemplo 4. Síntese do sal de succinato de N-[(S)({[(2R,5R)— 5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. A forma de base livre de N-[(S) ({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo foi dissolvido em 2-butanona morna (15 partes), e foi adicionado ácido succínico (0,28 partes) para formar uma solução com agitação. A solução foi lentamente arrefecida até cerca de 5 °C, recolhida, e lavada com 2-butanona fria, produzindo assim o sal de succinato de N-[(S)({[(2R,5R)-5- 40 ΕΡ2307435Β1 (6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo com um rendimento de 80%. O espectro de RMN do sal de succinato tinha as seguintes caracteristicas: RMN (400 MHz, acetonitrilo-d3) ppm = 8,26 (s, 1 H) , 8,15 (s, 1 H) , 7,29 (dd, J = 7,6, 7,6 Hz, 2 H), 7,16 (d, J= 7,6 Hz, 1 H) , 7,12 (d , J = 8,0 Hz, 2 H) , 6,78 (m, 1 H) , 6,17 (br s, 1 H) , 5,89 (m, 2 H) , 4,12-3,95 (multipletos sobrepostos, 6 H) , 2,53 (s, 4 H) , 1,34 (d, J = 6,8, 3 H) , 1,18 (t, J = 7,2, 3 H) . 31p rmn (162 MHz, acetonitrilo-d3) ppm = 21,60 (s) 19F RMN (376 MHz, acetonitrilo-d3) ppm = -135,19 (s)

Exemplo 5. Síntese do sal de citrato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. A forma de base livre de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H- purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo (cerca de 30 g) foi dissolvido em acetonitrilo quente (16 partes), e foi adicionado ácido cítrico (0,38 partes) com agitação. A solução resultante foi lentamente arrefecida até cerca de 5 °C, recolhida, e lavada com acetonitrilo frio, e seca, produzindo assim o sal de citrato de N—[(S)({[(2R,5R)—5—(6— amino-9H-purina-9-ilo)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-3-ilo]oxiJmetilo)fenoxifosfinoilo]-L-alaninato de etilo com um rendimento de cerca de 84%. O espectro de RMN do sal de citrato tinha as seguintes caracteristicas: 3H RMN (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8,20 (s, 2 41 ΕΡ2307435Β1 H), 7,45 (2 H, br s), 7,29 (dd J = 7, 6, 7,6 Hz . 2 H) , 7,13 (dd, J = 7,2 Hz, J = 7,2 Hz 1 H) , 7 ,12 (dd, J = 8,0 Hz, J = 8,0 Hz 2 H) , 6,86 (d, J = 3,4 Hz, 1 H) , 6,14 (s r 1 H) , 5, 97 (d, J = 3,6 Hz, 1 H) , 5,78 (dd, J = 12,2, 10, 4 Hz, 1 H) , 4,05 (m, 1 H) , 4,02 (m, 2 H) , 3, 98 (m, 1 H) , 3, 89 (m, 1 H) , 2,76 (d, J = 15,6 Hz . 2 H) , 2, 66 (d, J = 15, 6 Hz, 2 H) , 1,16 (d, J = 7,2 Hz, I H). 31P RMN ( 162 MHz, DMSO-d6) ppm = 22, 29 (s) 19F RMN ( 376 MHz, acetonitrilo- -d3) ppm = -133 , 88 (s) HRMS: m/z: 507,1561, calculado para C2iH24FN506P: 507,1557. Anal. calculado para C2iH24FN506P : C: 46,42, H: 4,62, N: 12,03, P: 4,43, F: 2,72, encontrado: C: 45,83, H: 4,74, N: 11,81, P: 4,45, F: 2,80.

Exemplo 6. Propriedades físico-químicas dos sais de N-[ (S) ({ [ (2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2, 5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo.

Foram preparados lotes representativos dos sais de malonato, succinato e citrato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. Foram determinados os pontos de fusão destes sais, e servem como uma medida aproximada da estabilidade, com um ponto de fusão mais elevado indicando um nível mais elevado de estabilidade. Como mostrado na tabela 1, o sal de citrato teve o ponto de fusão mais elevado. Além disso, é apresentado na tabela 1 o calor de fusão (AHfUSão) de cada um dos três sais. O sal de citrato teve o maior calor de fusão, indicando um grau mais elevado de cristalinidade de estado sólido do que os outros dois sais. 42 ΕΡ2307435Β1

Tabela 1. Temperaturas de fusão e calor de fusão de sais de succinato, malonato e citrato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo

Sal Peso molecular Δη(fUSão) j/çf Tf (°C) Sal de succinato 624,52 58,85 138,06 Sal de malonato 610,49 66, 10 120,13 Sal de citrato 698,56 127,59 149,76 A forma de base livre de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é amorfa, higroscópica e quimicamente instável, quando armazenada em condições abertas a 40 °C e 75% de humidade relativa (HR) . Como mostrado na tabela 2, os sais de succinato, malonato e citrato correspondentes, não foram higroscópicos à temperatura ambiente quando expostos a uma humidade relativa de 92% durante vários dias.

Tabela 2. Higroscopicidade de estado sólido das formas de sal de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi Jmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo à temperatura ambiente

Sal Tempo (dias) 20-25 °C/92% HR Sal de succinato 0 0,01 13 0,010 Sal de malonato 0 0,02 13 0,12 Sal de citrato 0 0,01 25 0,02 43 ΕΡ2307435Β1

As estabilidades químicas de estado sólido das bases livres dos sais de succinato, malonato e citrato de N-[(S) ({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi Jmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo foram avaliadas em condições abertas a 40 °C e 75% de humidade relativa. Como mostrado na tabela 3, o sal de citrato mostrou uma estabilidade química superior em comparação com os sais de succinato e de malonato.

Tabela 3. Estabilidade de estado sólido da forma de base livre de N-[ (S) ({ [ (2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi Jmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo , e os sais de succinato, citrato e malonato correspondentes, a 40 °C/75% humidade relativa em condições abertas

Forma Tempo Base livre (%) Outras (dias) impurezas (%) Base livre 0 99, 01 0, 99 7 82, 95 17, 05 14 66, 89 33, 11 22 55, 90 44, 10 Sal de 0 98, 95 1, 05 succinato 9 95, 15 4, 85 16 92,47 7,53 22 90,43 9, 57 30 85, 92 14, 08 Sal de malonato 0 97,82 2,18 9 94,66 5,34 16 92, 97 7,03 30 93,48 6,52 30 85, 84 14,16 Sal de citrato 0 98,00 2,00 44 ΕΡ2307435Β1

Forma Tempo (dias) Base livre (%) Outras impurezas (%) 4 97,27 2,73 12 97,20 2,80 17 95, 86 4,14 27 94,59 5, 41

Exemplo 7. Composição de comprimidos fornecendo o equivalente a 10 mg e 30 mg de base livre de N- [(S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il ]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo 0 sal de citrato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo foi formulado em comprimidos de 10 mg e 30 mg, utilizando o processo de compactação por rolos. Foram misturados primeiro o ingrediente activo, lactose anidra, celulose microcristalina e croscarmelose de sódio, a mistura foi então lubrificada com um terço da quantidade total de estearato de magnésio, em seguida compactada por rolos, seguida por moagem. Os grânulos resultantes foram lubrificados com a quantidade restante de estearato de magnésio, e prensados em comprimidos. A tabela 4 mostra a composição dos comprimidos que incluem o sal de citrato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo , e que fornecem ou 10 mg ou 30 mg da forma de base livre do 45 ΕΡ2307435Β1 composto, quando o sal de citrato se dissocia num meio aquoso.

Tabela 4

Componentes % p/p Fórmula de unidade de comprimido (mg/unidade) Referência do compêndio Função 10 mg 30 mg Sal de citrato 13, 794 13, 79a,h 41, 37a'c HSE Ingrediente activo Lactose anidrad 66,00 66, 00 198,00 NF Diluente/enchimento Celulose microcristalina 15,21 15,21 45, 63 NF Ligante/enchimento Croscarmelose de sódio 3, 50 3, 50 10,50 NF Desintegrante Estearato de magnésio 1, 50 1, 50 4, 50 NF Lubrificante Total 100,00 100,00 300,00 a Equivalente a 10% 2/2 da forma de base livre do composto. O peso real da substância do fármaco será ajustado para levar em conta a pureza da substância do fármaco. b Equivalente a 10 mg da forma de base livre do composto, c Equivalente a 30 mg da forma de base livre do composto. d A quantidade ajustada da substância do fármaco será subtraída da quantidade de lactose anidra. c A abreviatura NF significa formulário nacional, e a abreviatura HSE significa casa de referência do compêndio, que é o padrão interno utilizado na Gilead Sciences.

Exemplo de referência 8. Comparação da carga de metabolito activo de linfócito após administração de N-[(S)({[(2R,5R)— 5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo (pró-fármaco) ou composto parente a linfócitos. 0 N-[(S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo é um pró-fármaco que é hidrolisado no corpo humano para produzir um produto de hidrólise, que é daqui em 46 ΕΡ2307435Β1 diante referido como "o composto parente". 0 composto parente é fosforilado no corpo humano para produzir um produto fosforilado biologicamente activo (daqui em diante "o metabolito activo"), que inibe a actividade da enzima transcriptase reversa.

Para caracterizar o metabolismo intracelular do pró-fármaco e do composto parente, foram tratadas células de linfócitos ou com 1 μΜ de pró-fármaco ou com 100 μΜ de composto parente, durante 2, 6 e 24 horas. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas das camadas leucocitárias ("buffy coats") de humanos (Banco sanguíneo de Stanford, Paio Alto, CA) , utilizando centrifugação em Ficoll Paque Plus (GE Healthcare, Piscataway, NJ) de acordo com o procedimento do fabricante. As PBMCs isoladas de 3 a 4 doadores independentes foram mantidas em meio RPMI-1640 com 20% de soro fetal bovino e antibióticos (estado de repouso), ou foram activadas na presença de interleucina 2 (20 unidades/ml, Roche Biochemicals, Indianapolis, IN) e fitohemaglutinina PHA-P (1 pg/ml, Sigma) durante 3 a 4 dias antes do início das experiências.

As células T humanas transformadas CCRF-CEM foram obtidas da Colecção Americana de Culturas Tipo (Manassas, VA) , e cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% FBS e antibióticos. Foi recolhida uma alíquota de células (2-3 x 106 células) em cada ponto de tempo, contadas, sedimentadas por centrifugação, ressuspendidas em 0,5 ml dos meios de tratamento original, e plaqueadas sobre 0,5 ml de óleo de Nyosil M25. As amostras foram centrifugadas numa microcentrífuga durante 20 segundos à velocidade máxima (aproximadamente 800 x g) . A camada superior do meio foi 47 ΕΡ2307435Β1 removida, e a camada de óleo foi lavada duas vezes com 0,8 ml de tampão fosfato salino. O tampão de lavagem e a camada de óleo foram cuidadosamente removidos, o sedimento de células foi ressuspendido em 0,5 ml de metanol a 70%, e incubadas durante a noite a -70 °C para facilitar a lise celular. Os Usados de células foram centrifugados, os sobrenadantes recolhidos, secos por vácuo, e ressuspendidos em 10 μΐ de acetato de tetrabutilo de amónio contendo o difosfato de [5-(6-amino-purina-9-ilo)-2,5-dihidro-furano-2-iloximetilo]-ácido fosfónico (o análogo não fluorado do metabolito activo) como um padrão interno.

Foi utilizada cromatografia liquida de alto desempenho de iões de emparelhamento transitório, acoplada a espectrometria de massa de electropulverização de iões positivos paralelos (LC/MS/MS), para quantificar os nucleotideos intracelulares. Os métodos foram adaptados dos descritos para o nucleotideo análogo fosfonato aciclico, adefovir, seus metabolitos fosforilados e nucleotideos naturais (Vela, J. E. et al. Simultaneous quantitation of the nucleotide analog adefovir, its phosphorylated anabolites and 2’-deoxyadenosine triphosphate by ion-pairing LC/MS/MS. Journal of Chromatography B Anal. Technol. Biomed. Life Sei., vol. 848, 2007, p. 335-343). Foram geradas curvas padrão e amostras de controlo de qualidade para todos os analitos, utilizando extractos de células não tratadas. Sete curvas padrão de ponto geralmente variando de 0,03 a 20 pmol/milhão de células, e com linearidade em excesso de r2 igual a 0,99 para todos os analitos. Os limites inferiores de quantificação para todos os analitos variaram de 0,05 a 0,1 pmol/milhão de células. Foram analisadas amostras de controlo de qualidade de baixa 48 ΕΡ2307435Β1 e alta concentração (tipicamente 0,2 e 10 pmol/milhão de células, respectivamente) para cada analito, no início e no fim de cada ensaio analítico, para assegurar a exactidão e precisão dentro de 20%. O composto parente foi incubado a uma concentração 100 vezes mais elevada (100 μΜ) do que o pró-fármaco (1 μΜ) , para facilitar a análise exacta da muito menor acumulação intracelular de metabolitos, observada após incubação de linfócitos com o composto parente. Como mostrado na tabela 5, o pró-fármaco induziu 76, 290 e 140 vezes o aumento dos níveis de metabolito activo em relação ao composto parente, após incubação com CEM-CCRF, PBMCs quiescentes e PBMCs activadas, respectivamente. Os níveis de metabolitos activos foram normalizados com base na concentração extracelular, após incubações com 1 μΜ de pró-fármaco ou com 100 μΜ de composto parente.

Tabela 5

Concentração de dose normalizada de metabolito activo ((pmol/milhão)/1 μΜ concentração média) CEM-CCRF PBMC quiescente PBMC activada Composto parente 0,087 ± 0,014 0,012 ± 0,004 0,045 ± 0,004 Pró-fármaco 6,57 ± 1,00 3,52 ± 0,96 6, 45 ± 1,64 Os valores representam o desvio padrao da ± média de três experiências independentes realizadas em duplicado 49 ΕΡ2307435Β1

Exemplo de referência 9. Comparação da actividade anti-VIH do pró-fármaco e do composto parente.

Os termos "pró-fármaco" e "composto parente" têm os significados descritos no exemplo 8.

As células MT-2 foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com antibióticos e 10% de soro fetal bovino (FBS) . As células MT-2 foram infectadas com VIH-1 IIIB a uma multiplicidade de infecção (moi) de 0,01, e adicionadas a placas de 96 poços com diluições em série dos compostos testados a uma densidade de 20.000 células/poço. Após uma incubação de 5 dias, o efeito citopático induzido pelo vírus foi determinado utilizando um ensaio de viabilidade celular CellTiter-GloTM (Promega, Madison, WI), e expresso como uma percentagem do sinal de amostras com a replicação do vírus completamente suprimida após a subtracção do sinal do controlo não tratado. A concentração de cada fármaco que inibiu o efeito citopático induzido pelo vírus em 50% (EC50) foi determinada por regressão não linear. A actividade contra os mutantes resistentes NRTI foi determinada em paralelo com o vírus controlo de tipo selvagem, e a oportunidade de vezes na EC50 foi calculada.

As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram isoladas das camadas leucocitárias ("buffy coats") de doadores, utilizando centrifugação em Ficoll Paque Plus, e activadas durante 4-5 dias em meio RPMI-1640 com 20% de FBS, antibióticos, interleucina-2 (20 unidades/ml) e fitohemaglutinina PHA-P (1 pg/ml). As PBMC activadas foram infectadas com VIH-1 BaL durante 3 horas, lavadas, plaqueadas em placas de 96 poços (250.000 células/poço) e 50 ΕΡ2307435Β1 incubadas com diluições em série de compostos testados durante 5 dias, ponto no qual os sobrenadantes das células foram recolhidos e foi determinada a produção de virus usando ELISA VIH-1 p24 (Beckman Coulter, Miami, FL) . Foi determinada por análise de regressão a concentração de cada fármaco inibindo a produção de antigénio p24 em 50% (EC50). O efeito da adição de pró-porções na actividade anti-VIH foi avaliada em MT-2 e PBMC estimuladas infectadas com VIH-1. Como mostrado na tabela 6, o pró-fármaco foi 71 e 2.300 vezes mais potente do que o composto parente em MT-2 e PBMC activadas, respectivamente.

Tabela 6. Actividade anti-VIH-1 do pró-fármaco e do composto parente numa linha de células derivadas de linfóides e células linfóides primárias. EC50 (μΜ) MT-2 PBMC Composto parente 10,6 ± 2,4 8,5 ± 7,7 Pró-fármaco 0,15 ± 0,04 0,003 ± 0,0001 Os valores representam o desvio padrão da ± média de pelo menos duas experiências dependentes realizadas em triplicado.

Exemplo 10. Biodisponibilidade oral do sal de citrato de N-[(S) ({[(2R, 5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo após administração na forma de comprimido a cães Beagle 51 ΕΡ2307435Β1 0 grupo com dosagem consistiu de 3 cães Beagle machos não-ingénuos. Os animais foram mantidos em jejum durante a noite antes da administração da dose, e até 4 h após a administração. Foi administrado aos cães um único comprimido contendo 41,38 mg do sal de citrato do pró-fármaco (proporcionando 30 mg do pró-fármaco por comprimido). O comprimido consistia de 13,79% do sal de citrato do pró-fármaco, 66% de lactose anidra, 15,21% de celulose microcristalina, 3,5% de croscamelose de sódio e I, 5% de estearato de magnésio, numa base de peso por peso. As amostras de plasma foram obtidas antes da administração (0 h) e a 0, 083, 0,25, 0,50, 1,0, 2, 0, 4,0, 8,0, 12, 24 h. As amostras de sangue foram recolhidas em tubos Vacutainer™ contendo EDTA-K3. As amostras de sangue foram centrifugadas a 4 °C para separar o plasma. Uma aliguota de 100 μΐ de cada amostra de plasma foi primeiro diluída com 300 μΐ de 80% de acetonitrilo/água, contendo 200 nM do padrão interno. Após a centrifugação do precipitado de proteína, foi removido e usado para análise 100 μΐ do sobrenadante. Foram preparadas curvas padrão e amostras de controlo de qualidade em plasma de cão de animais não doseados com o pró-fármaco. As amostras foram analisadas por uma cromatografia líquida parcialmente validada acoplada com o método de espectrometria de massa de quadrupolo triplo. A administração do sal de citrato do pró-fármaco como um comprimido, resultou na rápida absorção do pró-fármaco e do composto parente derivado do pró-fármaco. Tal como resumido na tabela 7, a exposição do plasma ao pró-fármaco e composto parente foi observada após a administração. A biodisponibilidade oral do pró-fármaco intacto foi de II, 4%. Estes resultados não foram significativamente 52 ΕΡ2307435Β1 diferentes dos observados após a administração oral do pró-fármaco numa formulação de solução, o que ilustra a eficácia dos comprimidos contendo o sal de citrato do pró-fármaco para entregar o pró-fármaco e os seus metabolitos na circulação sistémica.

Tabela 7. Parâmetros farmacocinéticos do plasma médio para o pró-fármaco e o composto parente, após administração oral de uma formulação de comprimido do sal de citrato do pró-fármaco a uma dose média de 3,05 mg/kg equivalentes (média, n = 3)

Valor Parâmetro Pró-fármaco Composto parente Tmax (h) 0,58 2,33 Cmax (ΠΜ) 1.560 959 AUCo-4 (nM· h) 587 7.600 AUCo-8 (nM· h) 608 9.630 11/2 (h) 0,289 11,7 o, tti a. *5 r 11,4 Não determinado a Calculado com base num plasma médio AUC0-i de 818 nM*h observado após uma infusão de 30 minutos por via intravenosa de 0,5 mg/kg de GS-9131 a cães Beagle.

Exemplo 11. Calorimetria diferencial exploratória (DSC) dos sais de citrato, malonato e succinato de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. A calorimetria diferencial exploratória mede com precisão, temperaturas e fluxo de calor associados com transições térmicas num material. Os traços de DSC dos sais da invenção de N-[(S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4- 53 ΕΡ2307435Β1 fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo foram gerados utilizando um instrumento TA (New Castle, DE) DSC 2010 com uma taxa de varrimento de 5 °C min-1. A figura 1 mostra o traço DSC caracteristico para o sal de malonato de N-[ (S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2- il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. O termograma de DSC revelou um único endotérmico correspondendo ao ponto de fusão (120,43 °C, AHf = 73,72 J/g) , seguido por um único exotérmico correspondendo à decomposição do sal de malonato. A figura 2 mostra o traço DSC caracteristico para o sal de succinato de N-[ (S) ({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. O termograma de DSC do sal succinato de GS-9131 revelou um único endotérmico correspondendo ao ponto de fusão (137,44 °C, AHf = 66,18 J/g), seguido por um único exotérmico correspondendo à decomposição do sal. A figura 3 mostra o traço DSC caracteristico para o sal de citrato de N-[(S) ({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi}metil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo. O termograma de DSC do sal de citrato revelou um único endotérmico correspondendo ao ponto de fusão (149,41 °C, AHf = 85, 72 J/g), seguido por um único exotérmico correspondendo à decomposição do sal de citrato. O sal de citrato tem um calor de fusão significativamente maior do que os sais de malonato e succinato, indicando um maior grau de cristalinidade de estado sólido. 54 ΕΡ2307435Β1

Exemplo 12. Análise de difracção de raios-X (XRD) dos sais de citrato, malonato e succinato de N-[ (S) ({ [(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxiJmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo.

Os padrões de difracção de raios-X em pó (XRPD) dos sais da invenção de N-[(S)({[(2R,5R)-5-(6-amino-9H-purina-9-il)-4-fluoro-2,5-dihidrofurano-2-il]oxi Jmetil)fenoxifosfinoil]-L-alaninato de etilo foram gerados utilizando dois métodos. No primeiro método, foi utilizado um instrumento Shimadzu XRD 6000 com os seguintes atributos: tubo de Cu de raios-X, 2,2 KW, NF (foco normal), grafite curvada por monocromador, goniómetro vertical, raio de 185 mm, fendas de divergência: 0,5 °, 1,0 °, 0,05 mm, fendas soller: 0,05 °, 1 °, 2 °, fendas de recepção: 0,15 mm, 0,3 mm, detector de cintilação (Nal) HV 500-1200.

No segundo método, foi utilizado um instrumento Shimadzu XRD 6000 com os seguintes atributos: tubo de Cu de raios-X alvo, 35 kv, corrente 40 ma: varrimento contínuo, monocromador, fenda de divergência, 1 °, fenda soller 1 °, fenda de recepção 0,3 mm. Dados de XRPD para os sais de malonato e succinato foram obtidos utilizando o método 1. Dados de XRPD para o sal de citrato foram obtidos usando o método 2.

Entende-se que os desvios experimentais podem alterar um pouco a informação da banda (pico) de absorção de XRPD. Assim, os números apresentados nesta patente resultantes de padrões de XRPD dos sais da invenção, serão os mesmos ou essencialmente os mesmos, que os números que vão ocorrer mediante a repetição dos testes. "Essencialmente o mesmo" 55 ΕΡ2307435Β1 neste contexto, significa que a posição típica do pico e a variabilidade da intensidade são tidas em conta (como normalmente seriam para qualquer técnica analítica) . Por exemplo, um perito na tecnologia irá apreciar que as posições dos picos irão mostrar uma variabilidade entre aparelhos. Por exemplo, as posições dos picos 2-teta desviam-se tipicamente em tanto como 0,1 graus. Além disso, um perito na tecnologia apreciará que as intensidades relativas dos picos também mostrarão variabilidade devido ao grau de cristalinidade, orientação preferencial, superfície da amostra preparada, e outros factores conhecidos na tecnologia. Assim, as intensidades relativas dos picos devem ser só tomadas como uma medida qualitativa. A figura 4 mostra o padrão XRPD característico para o sal de malonato. Os picos principais e característicos que definem esta forma cristalina do sal de malonato são mostrados nas tabelas 8A e 8B.

Tabela 8A

Picos PXRD do sal de malonato Picos mais 2 Teta d (A) FWHM Int fortes (graus) (graus) integrado 1 17,76 4,9912 0,3190 16049 2 14, 92 5,9342 0,3023 14513 3 18, 80 4,7163 0,6572 21597 56 ΕΡ2307435Β1

Tabela 8B " Processo de dados básicos

Nome do grupo:

Nome do dado: 34984 B

Nome do ficheiro: 349848. PKP.

Nome da amostra: Lote # 2587-168-17

Comentário: Sais USP <941> μ mais pico 3 picos d (A) 1/11 FMHM Intensidade Int forte n° 2 Teta (graus) (contagens) integrado n° (graus) (contagens) 1 13 17,7561 4,99119 100 0,31900 947 16049 2 12 14,3168 5,53423 92 0,30230 867 24513 3 15 18,8000 4,71634 80 0,65720 758 21597 μ Lista de 2 Teta d (A) I/Il FWHM Intensidade Int dados dos (graus) (graus) (contagens) integrado picos: (contagens) pico n° 1 4,7340 18,65124 1 0,16140 9 69 2 5,9215 14,91331 11 0,26490 100 1723 3 7,0000 12,61783 3 0,20660 29 563 4 7,6504 11,69922 25 0,44910 279 6489 5 9,1500 9,65724 8 0,42000 76 1779 6 10,5600 8,37073 4 0,18660 34 468 7 11,0208 8,02175 34 0,29110 323 4468 8 11,1600 7,92200 30 0,56800 287 7708 9 12,6400 6,99756 16 0,35600 147 2545 10 12,8400 6,88901 20 0,27840 191 2234 11 14,5200 6,09549 9 0,16800 87 1282 12 14,9168 5,93423 92 0,30230 867 14513 13 17,7561 4,99119 100 0,31900 947 16049 14 18,3000 4,84405 73 0,40260 692 12656 15 18,8000 4,71634 80 0,65720 758 21597 16 19,2077 4,61714 41 0,36220 387 6608 11 19,5800 4,53018 63 0,34720 593 11731 18 20,0200 4,43159 14 0,15560 130 1783 19 20,7824 4,27071 24 0,54170 223 6510 20 22,0122 4,03499 26 0,47750 250 6040 57 ΕΡ2307435Β1 21 22,4800 3,95190 22 0,45260 211 4333 22 23,3273 3,81023 18 0,29470 171 2718 23 24,1490 3,68242 24 0,51800 232 6302 24 25,3900 3,50653 44 0,43120 413 14100 25 25,8930 3,43822 44 0,27980 419 5539 26 26,2380 3,39378 24 0,79670 227 8510 27 26,8200 3,32144 40 0,61720 383 13675 μ Lista de 2 Teta d (A) I/Il FWHM Intensidade Int dados dos (graus) (graus) (contagens) integrado picos: (contagens) pico n° 28 27,3087 3,26310 14 0,49680 130 3097 29 27,7600 3,21107 18 0,42180 175 4241 30 28,8185 3,08501 27 0,54570 258 5924 31 29,3200 3,04367 11 0,30660 104 2021 32 30,3600 2,94173 13 0,65340 119 4194 33 31,1400 2,86980 17 0,56000 159 4356 34 32,0000 2,79461 3 0,14140 25 165 35 32,8233 2,72637 10 0,39330 95 1976 36 33,8725 2,64428 7 0,55500 64 1859 A figura 5 mo de succinato. definem esta stra o padrão Os picos pr fonte cristã XRPD caracteristico para o incipais e caracteristicos lina do sal de succinato sal que são mostrados nas tabelas 9A e 9B.

Tabela 9A

Picos PXRD do sal de succinato Picos mais 2 Teta d (A) FWHM Int fortes (graus) (graus) integrado 1 24, 91 3,5716 1,1300 409,91 2 18,46 4,8024 3,7340 166,39 3 17,76 4,9901 3,4162 9106 58 ΕΡ2307435Β1

Tabela 9B

Processo de dados básicos

Nome do grupo: Nome do dado: 34984A Nome do ficheiro: 34364A. PKR. Nome da amostra: Lote # 2587-166-27 Comentário: Sais USP <941> 3 picos mais fortes # n° pico 2 Teta d (A) I/II FWHM Intensidade Int n° (graus) (graus) (contagens) integrado (contagens) 1 10 24,9100 3,57161 100 1,13000 590 40991 2 7 18,4600 9,80243 81 0,73400 480 16639 3 6 17,7600 4,99010 79 0,41620 464 9106 # Lista de 2 Teta d (A) I/II FWHM Intensidade Int dados dos (graus) (graus) (contagens) integrado picos (contagens) pico n° 1 6, 0033 14,71029 7 0,64670 43 1492 2 9, 4308 9,37032 12 1,24830 69 4432 3 11,7717 7,51169 33 1,08060 195 11923 4 14,7400 6,00500 10 0,60000 60 4288 5 16,0720 5,51020 9 0,55380 56 1470 6 17,7600 4,99010 79 0,41620 464 9106 7 18,4600 4,80243 62 0,73400 480 16639 8 20,4772 2,33367 57 0,87020 337 13869 9 21,4293 4,14323 43 0,40730 252 4832 10 24,9100 3,57161 100 1,13000 590 40991 11 26,1400 3,40628 36 2,92000 212 21498 12 27,9400 1,19079 15 1,47000 66 8157 13 29,7800 2,99769 9 0,31340 53 779 14 30,9200 2,88972 7 1,28000 40 3619 15 33,2233 2,69446 9 1,09670 49 2527 A figura 6 mostra o padrão XRPD caracteristico para o sal de citrato . Os picos principais e caracteristico s que 59 ΕΡ2307435Β1 definem esta forma mostrados nas tabelas cristalina 10A e 10B. do sal de citrato são

Tabela 10A

Picos PXRD do sal de citrato Picos mais 2 Teta d (A) FWHM Int fortes (graus) (graus) integrado 1 19, 81 4,4784 0,2635 14837 2 28, 63 3,1155 0,3312 13074 3 14, 64 6,0465 0,2473 10572

Tabela 10B " Processo de dados básicos do grupo: do dado: 25614A

Nome Nome

Nome do ficheiro: 35614A

PKR

Nome da amostra: Lote # Comentário: # 3 picos mais fortes 2782-78-32 USP <941> n° pico 2 Teta d (A) I/It n° (graus) 1 21 19,7858 4,48352 100 2 3U 23,9400 3,72944 55 3 35 26,5965 3,34884 51 # Lista de 2 Teta d (A) I/It dados dos (graus) picos pico n° 1 6,7400 13,10398 3 2 6,9496 12,70922 6 3 8,2200 10,74765 6 FWHM Intensidade Int (graus) (contagens) integrado (contagens) 0,26810 1443 20538 0,33400 793 14567 0,31810 734 11131 FWHM Intensidade Int (graus) (contagens) integrado (contagens) 0,16360 47 456 0,21930 87 864 0,23320 81 1414 60 8,4436 10,46352 18 0,22630 253 9, 0566 9,75662 6 0,22460 89 11,0600 7,95341 4 0, 18000 62 11,2871 7,83306 16 0,23720 238 11,8800 7,44345 4 0,19560 52 12,0508 7,33833 8 0,25030 11,4 13,1691 6,71758 16 0,22170 229 13,9959 6,32255 29 0,23910 358 146151 6,05604 33 0,26400 470 15,4624 5,72604 25 0,30010 356 15,8200 5,59740 3 0,18800 49 16,9600 5,22364 26 0,27100 277 17,3474 5,10185 46 0,26120 668 18,0000 4,92411 19 0,19920 271 18,2200 4,86514 31 0,20420 465 18,7154 4,73746 4 0,21420 51 19,2200 4,61421 10 0,19200 146 19,7858 4,46252 100 0,26810 1443 20,0800 4,41849 38 0,19360 546 20,9315 4,32233 32 0,32250 455 21,1200 4,20320 8 0,25500 114 21,4000 4,14883 16 0,26760 235 21,6913 4,05682 10 0,26260 141 22,8001 3,89713 13 0,30110 161 23,2200 3,82760 3 0,19760 50 23,3691 3,60351 6 0,16040 83 2 Teta d (A) I/It FWHM Intensidade (graus) (graus) (contagens) 23,8400 3,72944 55 0,33400 793 24,1000 3,67776 26 0,12300 390 25,0296 3,55482 8 0,32290 119 25,6031 3,47648 7 0,22090 102 26,2800 3,36845 26 0,30180 379 26,5965 3,34884 51 0,31810 734 27,4848 3,24259 6 0,20170 63 28,1600 3,16636 4 0,09340 58 28,5989 3,11875 46 0,33280 668 29,0464 3,07151 9 0,23960 127 29,5600 3,01950 20 0,48340 290 29,8800 2,98789 16 0,14600 235 30,4400 2,93419 3 0,09340 44 30,7800 2090254 11 0,10020 255 31,0600 2,67703 16 0,19060 233 31,3400 2,85195 4 0,18000 55 31,5800 2,83082 4 0,12960 54 31,8602 2,80656 12 0,36550 172 32,2200 2,77603 4 0,095880 55 23,0800 2,70580 2 0,09060 50 33,2668 2,69103 5 0,12920 65 33,5521 2,66571 7 0,36840 108 24,3755 2,60673 6 0,15550 63 de Setembro de 2012

Claims (10)

1. ΕΡ2307435Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Um sal de citrato com a fórmula I ou um hidrato do mesmo:

   2. 0 sal ou hidrato da reivindicação 1, caracterizado por ser cristalino. 3. 0 sal da reivindicação 2, caracterizado por bandas de absorção a espaçamentos espectrais-d, obtidas de um padrão de difracção de raios-X em pó, das mesmas ou essencialmente das mesmas que 4,48, 3,12 e 6,05 angstroms.
2. 4. O sal da reivindicação 2, caracterizado por bandas de absorção de ângulo de difracção 2-teta, obtidas de um padrão de difracção de raios-X em pó, das mesmas ou essencialmente das mesmas que 19,81, 28,63 e 14,64 graus. 5. 0 hidrato da reivindicação 2, caracterizado por ser parcialmente ou totalmente hidratado.
3. 6. O sal da reivindicação 2, caracterizado por ser anidro ou essencialmente anidro.
4. 7. Um sal de succinato com a fórmula II ou um hidrato do mesmo: 1 00 ΕΡ2307435Β1

   8. 0 sal ou hidrato da reivindicação 7, caracterizado por ser cristalino. 9. 0 sal da reivindicação 8, caracterizado por bandas de absorção a espaçamentos espectrais-d, obtidas de um padrão de difracção de raios-X em pó, das mesmas ou essencialmente das mesmas que 3,57, 4,80 e 4,99 angstroms. 10. 0 sal da reivindicação 8, caracterizado por bandas de absorção de ângulo de difracção 2-teta, obtidas de um padrão de difracção de raios-X em pó, das mesmas ou essencialmente das mesmas que 24,91, 18,46 e 17,76 graus.
5. 11. Um sal de malonato com a fórmula III ou um hidrato do mesmo:
6. 12. O sal ou hidrato da reivindicação 11, caracterizado por ser cristalino. 2 ΕΡ2307435Β1 13. 0 sal da reivindicação 12, caracterizado por bandas de absorção a espaçamentos espectrais-d, obtidas de um padrão de difracção de raios-X em pó, das mesmas ou essencialmente das mesmas que 4,99, 5,93 e 4,72 angstroms. 14. 0 sal da reivindicação 12, caracterizado por bandas de absorção de ângulo de difracção 2-teta, obtidas de um padrão de difracção de raios-X em pó, das mesmas ou essencialmente das mesmas que 17,76, 14,92 e 18,80 graus.
7. 15. Uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do sal ou hidrato de qualquer uma das reivindicações 1-14, e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
8. 16. A composição farmacêutica da reivindicação 15, compreendendo ainda um agente terapêutico adicional.
9. 17. A composição farmacêutica da reivindicação 16, em que o agente terapêutico adicional tem actividade contra o VIH.
10. 18. Um sal ou hidrato de qualquer uma das reivindicações 1-14, para utilização no tratamento ou prevenção profilática de uma infecção pelo VIH. Lisboa, 12 de Setembro de 2012 3