PT2049165E

PT2049165E - Selante seco de acção rápida e métodos para uso e fabrico

Info

Publication number: PT2049165E
Application number: PT07813656T
Authority: PT
Inventors: Felix Vega; Woonza M Rhee; Cary J Reich; A Edward Osawa
Original assignee: Baxter Int; Baxter Healthcare Sa
Priority date: 2006-08-02
Filing date: 2007-08-01
Publication date: 2012-05-25
Also published as: ATE547128T1; WO2008016983A2; CL2007002244A1; CN106178085A; CA2659369C; MX2009001224A; AR062178A1; EP3909619B1; TW200824726A; US20080187591A1; JP2013048936A; EP3466454B1; JP2009545405A; CN101594890A; ES2383550T3; US9114172B2; DK2049165T3; CA2659369A1; TWI436793B; JP5301439B2

Description

ΕΡ 2 049 165/PT

DESCRIÇÃO "Selante seco de acção rápida e métodos para uso e fabrico"

ANTECEDENTES DO INVENTO A patente U.S. N° 5,162,430, concedida em 10 de

Novembro de 1992, de Rhee et al, discute conjugados de polímeros sintéticos de colagénio preparados através de ligação covalente de colagénio a polímeros sintéticos hidrofílicos, tais como os vários derivados de polietilenoglicol. A patente U.S. N° 5,324,775, concedida em 28 de Junho de 1994, de Rhee et al., descreve vários polímeros de enxerto biocompatíveis de origem natural, (tais como polissacáridos) covalentemente ligados a polímeros de polietilenoglicol hidrofílicos, não-imunogénicos, sintéticos. A patente U.S. N° 5, 328, 955, concedida em 12 de Julho de 1994, de Rhee et al, descreve várias formas activadas de polietilenoglicol e várias ligações que podem ser utilizadas para produzir conjugado de polímeros de colagénio sintético apresentando uma gama de propriedades físicas e químicas.

Ser. N° 08/403,358, depositada em 14 de Março de 1995, discute uma composição de biomaterial reticulado que é preparada utilizando um agente de reticulação hidrofóbico, ou uma mistura de agentes de reticulação hidrofílicos e hidrofóbicos. Agentes de reticulação hidrofóbicos podem incluir qualquer polímero hidrofóbico que contenha, ou pode ser quimicamente derivatizado para conter, dois ou mais grupos de succinimidilo. A patente U.S. N° 5,580,923, concedida em 3 de Dezembro de 1996, de Yeung et al., discute uma composição útil na prevenção de aderências cirúrgicas que compreende um material substrato e um agente anti-aderência de ligação, em que o material de substrato compreende preferencialmente colagénio e o agente de ligação compreende preferencialmente pelo menos um grupo funcional reactivo em tecido e pelo menos um grupo funcional reactivo ao substrato. 2

ΕΡ 2 049 165/PT A patente U.S. N°. 5, 614,587, concedida em 25 de Março de 1997, de Rhee et al., discute composições bioadesivas compreendendo colagénio reticulado usando um polímero sintético hidrofílico activado multifuncional, bem como métodos de utilização dessas composições para levar a cabo a adesão entre uma primeira superfície e uma segunda superfície, em que pelo menos uma das primeira e segunda superfícies pode ser uma superfície de tecido nativo. A publicação de patente Japonesa N° 07090241 discute uma composição utilizada para a adesão temporária de um material para lentes num suporte, para montar o material sobre um dispositivo de maquinagem, compreendendo uma mistura de polietilenoglicol, com um peso molecular médio na gama de 1000-5000, e poli-N-vinilpirrolidona, com um peso molecular médio na gama de 30.000-200.000.

West e Hubbell, Biomaterials (1995) 16:1153-1156, discutem a prevenção de aderências pós-operatórias, utilizando um hidrogel fotopolimerizável de polietilenoglicol-co-diacrilato de ácido láctico e um hidrogel fisicamente reticulado de polietilenoglicol-co-polipropileno glicol, Poloxamer 407®.

As patentes U.S. N°s. 5,672,336 e 5,196,185 descrevem um penso para feridas que compreende um colagénio fibrilar em micro-partículas com um tamanho de partícula de 0,5-2,0 μιη. Esta composição compreende geralmente uma fase aquosa e pode não formar um hidrogel tal como descrito no presente invento. A patente U.S. N°. 5, 698,213 descreve um hidrogel reticulado de poli-éster alifático útil como dispositivo cirúrgico absorvível e veículo para administração de fármacos. A patente U.S. N°. 5, 674,275 descreve um adesivo hidrogel à base de acrilato ou metacrilato. A patente U.S. N°. 5,306,501 descreve um hidrogel termorreversível à base de polioxialquileno útil como veículo para administração de fármacos.

As patentes U.S. N°s. 4,925,677 e 5,041,292 descrevem um hidrogel que compreende um componente proteico reticulado com um polissacárido ou mucopolissacárido e útil como veículo para administração de fármacos. 3 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ São descritos polímeros biodegradáveis para administração de fármacos injectáveis na patente U.S. N° 5, 384,333 e por Jeong et al. (1997) "Nature", 388:860-862.

Hidrogéis biodegradáveis para a administração de fármacos em libertação controlada são descritos na patente U.S. N° 4,925,677. São descritos sistemas reabsorvíveis de administração de fármacos à base de colagénio nas patentes U.S. N°s 4,347,234 e 4,291,013. São descritas películas biocompatíveis para administração de fármacos à base de aminopolissacarídeo nas patentes U.S. N°s 5,300,494 e 4,946,870. São descritos suportes solúveis em água para administração de taxol na patente U.S. N° 5,648,506. Têm sido utilizados polímeros como suportes de agentes terapêuticos para efectuar uma libertação localizada e controlada (Langer, et al., Rev. Macro. Chem. Phys., C23 (1), 61, 1983; Controlled Drug Delivery, Vol. I e II, Bruck, SD, (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1983; Leong et al., Adv. Drug Delivery Review, 1:199, 1987). Estes sistemas de administração de agentes terapêuticos simulam a infusão e proporcionam o potencial de maior eficácia terapêutica e toxicidade sistémica reduzida.

Outras classes de polímeros sintéticos que têm sido propostos para a administração de fármacos em libertação controlada incluem poliésteres (Pitt, et al., Controlled Release of Bioactive Materials, R. Baker, Ed., Academic Press, New York, 1980) poliamidas; (Sidman et al., Journal of Membrane Science, 7:227, 1979); poliuretanos (Maser, et al., Journal of Polymer Science, Polymer Symposium, 66:259, 1979) poliortoésteres; (Heller, et al., Polymer Engineering Scient, 21:727, 1981) e polianidridos (Leong, et al.,

Biomateriais, 7:364, 1986).

Composições contendo colagénio que tenha sido mecanicamente fragmentado para alterar as suas propriedades físicas encontram-se descritas nas patentes U.S. N°s 5,428,024; 5,352,715; e 5,204,382. Estas patentes em geral dizem respeito a colagénios fibrilares e insolúveis. Encontra-se descrita na patente U.S. N° 4,803,075 uma composição injectável de colagénio. É descrita na patente 4

ΕΡ 2 049 165/PT U.S. N°. 5,516,532 uma composição injectável de osso/cartilagem. Uma matriz de administração à base de colagénio compreendendo partículas secas na gama de dimensões de 5 pm a 850 pm que pode ser suspensa em água e que apresenta uma determinada densidade de carga de superfície é descrita na WO 96/39159. Encontra-se descrita na patente U.S. N° 5,196,185 uma preparação de colagénio com um tamanho de partícula de 1 pm a 50 pm útil como pulverizador de aerossol para formar um curativo. Outras patentes que descrevem composições de colagénio incluem as patentes U.S. Pat. N°s 5,672,336 e 5,356,614. Encontra-se descrito na WO 96/06883 um hidrogel polimérico, não-erodível que podem ser reticulado e injectado através de uma seringa.

Os pedidos pendentes que se seguem, atribuídos ao cessionário do presente pedido, contêm matéria relacionada: U.S. 2008085316, depositado em 31 de Julho de 1997; U.S. 2004214770, depositado em 18 de Junho de 1997; U.S. 2002193448, depositado em 27 de Agosto de 1996; U.S. Ser. N° 08/673,710, depositado em 19 de Junho de 1996; U.S. Ser. No. 60/011,898, depositado em 20 de Fevereiro de 1996; U.S. Ser.

No. 60/006,321, depositado em 7 de Novembro de 1996; U.S. Ser. No. 60/006, 322, depositado em 7 de Novembro de 1996; U.S. Ser. No. 60/006, 324, depositado em 7 de Novembro de 1996; e U.S. Ser. No. 08/481,712, depositado em 7 de Junho de 1995.

Existe uma variedade de materiais adequados para uso como bioadesivos, para aumento de tecido, para a prevenção de aderências cirúrgicas, para revestimento de superfícies de implantes sintéticos, como matrizes para administração de fármacos, para aplicações oftálmicas, e similares. No entanto, em muitos casos, o tempo de endurecimento para estes materiais pode ser aquém do ideal, enquanto para aplicações cirúrgicas e outras aplicações médicas, é muitas vezes preferido um material de actuação rápida. Noutros casos, os materiais actualmente disponíveis podem exibir propriedades de expansibilidade que são indesejáveis para determinadas aplicações cirúrgicas. Deste modo, o que é necessário é um material de actuação rápida, para utilização como, por exemplo, selante de tecido para aplicações hemostáticas e/ou de cicatrização de feridas. Seria 5

ΕΡ 2 049 165/PT igualmente desejável proporcionar materiais que apresentem propriedades de expansibilidade mínimas.

BREVE RESUMO DO INVENTO O presente invento proporciona composições para a realização da hemostasia ou contenção de outro fluido num contexto in vivo, tal como mencionado nas reivindicações. As composições da invenção compreendem primeiro e segundo componentes reticuláveis e pelo menos um componente formador de hidrogel, numa composição adequada para aplicação a um vertebrado para facilitar a contenção de líquidos. As composições incluem materiais de actuação rápida, para utilização como, por exemplo, selante de tecido para aplicações hemostáticas e/ou de cicatrização. As composições apresentam propriedades de expansibilidade mínimas.

Num primeiro aspecto, concretizações do presente invento proporcionam uma composição que inclui um primeiro componente reticulável, um componente reticulável segundo que reticula com o primeiro componente reticulável sob condições favoráveis de reacção, e um componente formador de hidrogel. O primeiro e segundo componentes reticuláveis reticulam-se para formar uma matriz porosa com interstícios, e o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos interstícios. Em alguns aspectos, o pH do componente formador de hidrogel pode influenciar o tempo de reacção para a formação da barreira matriz selante. Por exemplo, em algumas concretizações, uma composição que inclui um componente formador de hidrogel com um pH de 6,75 proporciona um tempo de reacção mais lento do que a composição que inclui um componente formador de hidrogel com um pH de 9,5. O primeiro componente reticulável pode incluir múltiplos grupos nucleofílicos e o segundo componente reticulável pode incluir múltiplos grupos electrofílicos. Em alguns aspectos, o primeiro componente reticulável inclui um óxido de polialquileno multi-nucleofílico tendo m grupos nucleofílicos, e o segundo componente reticulável inclui um 6 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ óxido de polialquileno multi-electrofílico tendo n grupos electrofílicos, onde m e n são, cada um maior ou igual a dois, e em que m+n é maior ou igual a cinco. Em alguns aspectos, n é dois, e m é maior ou igual a três. O óxido de polialquileno multi-nucleofilico pode ser tetrafuncionalmente activado. Em alguns aspectos, m é dois, e n é maior ou igual a três. O óxido de polialquileno multi-electrof ilico pode ser tetrafuncionalmente activado. Em alguns casos, tanto o óxido de polialquileno multi-nucleofilico como o óxido de polialquileno multi-electrof ilico encontram-se tetrafuncionalmente activados. O óxido de polialquileno multi-nucleofilico pode incluir dois ou mais grupos nucleofílicos, por exemplo NH2, -SH, -H, -PH2, e/ou -CO-NH-NH2. Em alguns casos, o óxido de polialquileno multi-nucleofilico inclui dois ou mais grupos amino primários. Em alguns casos, o óxido de polialquileno multi-nucleof ilico inclui dois ou mais grupos tiol. O óxido de polialquileno multi-nucleofilico pode ser polietileno-glicol ou um derivado do mesmo. Em alguns casos, o polietilenoglicol inclui dois ou mais grupos nucleofílicos, os quais podem incluir um grupo amino primário e/ou um grupo tiol. O óxido de polialquileno multi-electrofilico pode incluir dois ou mais grupos electrofílicos tais como C02N (COCH2) 2, -C02H, -CHO, -CHOCH2, -N=C=0, -S02CH=CH2, N (COCH) 2r e/ou -S-S- (C5H4N) . 0 óxido de polialquileno multi- electrof ilico pode incluir dois ou mais grupos succinimidilo. O óxido de polialquileno multi-electrofilico pode incluir dois ou mais grupos maleimidilo. Em alguns casos, o óxido de polialquileno multi-electrofilico pode ser um polietilenoglicol ou um derivado do mesmo.

Em alguns aspectos, a composição inclui um polissacárido ou uma proteína. O polissacárido pode ser um glicosaminoglicano, tal como o ácido hialurónico, quitina, sulfato de condroitina A, sulfato de condroitina B, sulfato de condroitina C, sulfato de queratina, queratosulfato, heparina, ou um derivado dos mesmos. A proteína pode ser colagénio ou um seu derivado. O óxido de polialquileno multi-nucleofilico ou o óxido de polialquileno multi-electrof ilico, ou tanto o óxido de polialquileno multi-nucleofílico como o óxido de polialquileno multi-electrof ilico podem incluir um grupo de ligação. Em alguns 7

ΕΡ 2 049 165/PT casos, o óxido de polialquileno multi-nucleofílico pode ser representado pela fórmula: polímero-Q1-Xm. O óxido de polialquileno multi-electrofílico pode ser representado pela fórmula: polimero-Q2-Yn. X pode ser um grupo electrofílico e Y pode ser um grupo nucleofílico, m e n podem ser cada 2 a 4, m+n pode ser <5, e cada um de Q1 e Q2 pode ser grupos de ligação tais como -0-(CH2)n-/ -S-, -(CH2)n'_, -NH- (CH2) n'-, -O2C-NH- (CH2)n'/ -02C- (CH2)„--, -02C-CR1H, e/ou -OR2-CO-NH. Em alguns casos, n' pode ser de 1 a 10, R1 pode ser -H, -CH3, ou -C2H5, R2 pode ser -CH2- ou -CO-NH-CH2CH2-, e Q1 e Q2 podem ser iguais ou diferentes, ou podem estar ausentes. Em alguns aspectos, Y pode ser-C02N (COCH2) 2 ou -C02N (COCH2) 2 · Em alguns casos, o óxido de polilaquileno multi-nucleofílico ou o óxido de polialquileno multi-electrofílico, ou tanto o óxido de polialquileno multi-nucleofílico como o óxido de polialquileno multi-electrofílico, incluem ainda um grupo biodegradável. O grupo biodegradável pode ser uma lactida, glicólido, ε-caprolactona, poli (cx-hidroxiácido) , poli (aminoácido), ou um poli(anidrido). Em alguns aspectos, o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel biocompatível fragmentado que inclui gelatina e absorve água quando administrado a um local alvo de tecido húmido. O hidrogel pode incluir subunidades com dimensões que variam desde cerca de 0,01 mm a cerca de 5 mm quando completamente hidratadas e uma expansibilidade de equilíbrio variando de cerca de 400% a cerca de 5000%. Em alguns casos, o hidrogel tem um tempo de degradação in vivo inferior a um ano. Em alguns casos, o hidrogel é pelo menos parcialmente hidratado com um meio aquoso e inclui um agente activo, que pode incluir um agente de coagulação, tal como a trombina.

Num outro aspecto, concretizações do presente invento proporcionam um método para a administração de um agente activo a um paciente. O método pode incluir a administração a um local alvo no paciente de uma quantidade de uma composição tal como aqui descrita. Em alguns aspectos, as concretizações incluem um método para a administração de um agente de selagem a um paciente. O método pode incluir a administração a um local alvo com hemorragia de uma quantidade de uma composição tal como aqui descrita, numa quantidade suficiente para inibir a hemorragia. Em alguns 8 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ aspectos, as concretizações incluem um método para a administração de trombina a um paciente. 0 método pode incluir a administração a um local alvo com hemorragia de uma quantidade de uma composição tal como aqui descrita, numa quantidade suficiente para inibir a hemorragia.

Em ainda outro aspecto, concretizações do presente invento englobam uma composição que inclui um óxido de polialquileno multi-nucleófilo, um óxido de polialquileno multi-electrofilico e um componente formador de hidrogel. O óxido de polialquileno multi-nucleofilico pode ainda incluir pelo menos um grupo amino primário e pelo menos um grupo tiol. Sob condições favoráveis de reacção o óxido de polialquileno multi-nucleófilo e o óxido de polialquileno multi-electrofilico são capazes de reticular substancialmente de imediato. As concretizações abrangem composições em que o óxido de polialquileno multi- nucleofilico inclui dois ou mais grupos tiol e o óxido de polialquileno multi-electrofilico inclui dois ou mais grupos electrofilicos tais como um grupo succinimidilo e/ou um grupo maleimidilo. As concretizações englobam também composições em que o óxido de polialquileno multi- nucleofilico inclui dois ou mais grupos nucleofilicos tais como um grupo amino primário e/ou um grupo tiol. O óxido de polialquileno multi-electrofilico pode incluir dois ou mais grupos succinimidilo. Em alguns casos, as concretizações compreendem composições que incluem um primeiro polietilenoglicol com dois ou mais grupos tiol, um segundo polietilenoglicol com dois ou mais grupos succinimidilo ou grupos maleimidilo e um componente formador de hidrogel. A soma dos grupos tiol e dos grupos de succinimidilo ou maleimidilo pode ser pelo menos cinco, e sob condições favoráveis de reacção o primeiro polietilenoglicol e o segundo polietilenoglicol podem ser capazes de reticular substancialmente de imediato. Em alguns casos, o primeiro polietilenoglicol inclui quatro grupos tiol e o segundo polietilenoglicol inclui quatro grupos de succinimidilo. Em alguns casos, a composição inclui uma proteina ou um polissacárido. O polissacárido pode ser um glicosaminoglicano, tal como o ácido hialurónico, quitina, sulfato de condroitina A, sulfato de condroitina B, sulfato de condroitina C, queratina, sulfato queratosulfato, 9 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ heparina, ou um derivado dos mesmos. A proteína pode ser colagénio ou um seu derivado.

Num outro aspecto, as concretizações do presente invento incluem um método para selagem de um tracto de tecido. 0 método pode incluir pelo menos parcialmente, o enchimento de um tracto de tecido com uma composição que inclui um primeiro componente reticulável, um segundo componente reticulável que reticula com o primeiro componente reticulável sob condições favoráveis de reacção, e um componente formador de hidrogel. Os primeiros e segundo componentes reticuláveis podem reticular para formar uma matriz porosa com interstícios, e o componente formador de hidrogel pode ser capaz de ser hidratado para formar um hidrogel que preencha pelo menos alguns dos interstícios. Em alguns casos, o hidrogel inclui subunidades que têm dimensões que variam desde cerca de 0,05 mm a cerca de 5 mm, quando completamente hidratado, que têm um expansibilidade de equilíbrio que varia de cerca de 400% a cerca de 1300%, e que degradam no tracto de tecido após cerca de 1 a cerca de 120 dias. Em alguns casos, o primeiro componente reticulável inclui múltiplos grupos nucleofílicos e o segundo polímero compreende múltiplos grupos electrofílicos.

Em ainda outro aspecto, as concretizações do presente invento incluem um método para inibir a hemorragia num local alvo no corpo de um paciente. O método pode incluir a administração de uma composição no local alvo, numa quantidade suficiente para inibir a hemorragia, em que a composição inclui um primeiro componente reticulável, um segundo componente reticulável que reticula com o primeiro componente reticulável sob condições favoráveis de reacção, e um componente formador de hidrogel. O primeiro e segundo componente reticulável podem reticular para formar uma matriz porosa com interstícios, e o componente formador de hidrogel pode ser capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos interstícios. O hidrogel pode incluir subunidades que têm dimensões que variam desde 0,05 mm a 5 mm, quando completamente hidratado, que possuem uma expansibilidade de equilíbrio que varia de 400% a 1300%, e que degradam no tracto de tecido após 1 a 120 dias. O primeiro componente reticulável pode incluir 10

ΕΡ 2 049 165/PT múltiplos grupos nucleofílicos e o segundo componente reticulável pode incluir múltiplos grupos electrofilicos. Num outro aspecto, as concretizações do presente invento incluem um método para a administração de uma substância bioactiva a um local alvo no corpo de um paciente. O método pode incluir administrar uma composição em combinação com a substância bioactiva no local alvo, em que a composição inclui um primeiro componente reticulável, um segundo componente reticulável que reticula com o primeiro componente reticulável sob condições favoráveis de reacção, e um componente formador de hidrogel. O primeiros e segundo componente reticulável podem reticular para formar uma matriz porosa com interstícios, e p componente formador de hidrogel pode ser capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos interstícios. O hidrogel pode ter subunidades tendo dimensões que variam desde 0,05 mm a 5 mm, quando completamente hidratado, uma expansibilidade de equilíbrio que varia de 400% a 1300%, e pode degradar no tracto de tecido após 1 a 120 dias. Em alguns casos, o primeiro componente reticulável inclui múltiplos grupos nucleofilicos e o segundo componente reticulável inclui múltiplos grupos electrofilicos. A substância bioactiva pode ser um agente hemostático, tal como a trombina.

Num outro aspecto, as concretizações do presente invento incluem um método para a administração de uma composição expansível num local alvo em tecido. O método pode incluir a aplicação da composição no local alvo, em que a composição inclui um primeiro componente reticulável, um segundo componente reticulável que reticula com o primeiro componente reticulável sob condições favoráveis de reacção, e um componente formador de hidrogel. O primeiro e segundo componente reticuláveis podem reticular para formar uma matriz porosa com interstícios, e o componente formador de hidrogel pode ser capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos interstícios. O hidrogel pode incluir subunidades que têm dimensões que variam de 0,05 mm a 5 mm, quando completamente hidratadas, que têm uma expansibilidade de equilíbrio que varia de 400% a 1300%, e que degradam no tracto de tecido após 1 a 120 dias. A composição pode ser menos hidratada em relação à sua 11 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ expansibilidade de equilíbrio aquando da aplicação no local alvo onde expande para um valor de expansibilidade de equilíbrio. Em alguns aspectos, o primeiro componente reticulável inclui múltiplos grupos nucleofílicos e o segundo componente reticulável inclui múltiplos grupos electrofílicos. Em alguns aspectos, o local alvo é tecido que pode ser músculo, pele, tecido epitelial, músculo liso, esquelético ou cardíaco, tecido conjuntivo ou de suporte, tecido nervoso, tecido oftálmico e do órgão sensorial, tecido vascular e cardíaca, órgãos gastrointestinais e tecido, pleura e outros tecidos pulmonares, rim, glândulas endócrinas, órgãos reprodutores masculinos e femininos, tecido adiposo, fígado, pâncreas, linfa, cartilagem, osso, tecido oral e tecido da mucosa, e baço e outros órgãos abdominais. Em alguns aspectos, o local alvo inclui uma região desocupada dentro do tecido seleccionado, tal como uma parcela de tecido, tracto de tecido, espaço intervertebral, ou cavidade corporal. Em alguns casos, o hidrogel apresenta um grau de hidratação na gama de 50% a 95% da hidratação na expansibilidade de equilíbrio. Em alguns casos, o hidrogel inclui um plastificante, tal como polietilenoglicol, sorbitol, ou glicerol. O plastificante pode estar presente de 0,1% em peso a 30% em peso da composição do componente de hidrogel. Em alguns casos, o hidrogel inclui um hidrogel de proteína reticular. A proteína pode incluir gelatina, colagénio solúvel, albumina, hemoglobina, fibrinogéneo, fibrina, caseína, fibronectina, elastina, queratina, laminina, e seus derivados e combinações. Em alguns casos, o hidrogel inclui um polissacárido reticulado. O polissacárido pode incluir glicosaminoglicanos, derivados de amido, derivados de celulose, derivados de hemicelulose, xilano, agarose, alginato e quitosano e combinações dos mesmos. Em alguns casos, o hidrogel inclui um polímero reticulado não biológico. O polímero reticulado não-biológico pode incluir poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilamidas, resinas de polivinilo, poliactida-glicólido e policaprolactones, polioxietilenos, e combinações dos mesmos. Em alguns casos, o hidrogel inclui pelo menos dois componentes seleccionados de entre um grupo que inclui proteínas reticulares, polissacáridos reticulados, e polímeros não biológicos reticulados. O hidrogel pode incluir um polímero de hidrogel 12 ΕΡ 2 049 165/PT e um agente reticulante de hidrogel. 0 polímero de hidrogel e o agente reticulante de hidrogel pode ter sido feitos reagir sob condições que produzem a reticulação de moléculas de polímero de hidrogel. Em alguns casos, o hidrogel inclui um hidrogel molecular reticulado que foi produzido através de reacção de monómeros de hidrogel mono-insaturados ou poli-insaturados sob condições que conduzem à reticulação das moléculas de polímero de hidrogel.

Em ainda outro aspecto, as concretizações do presente invento englobam um método de formação de uma matriz polimérica sintética tridimensional. O método inclui proporcionar um componente primeiro reticulável contendo m grupos nucleofílicos e um segundo componente reticulável contendo n grupos electrofílicos. Os grupos electrofílicos reagem com os grupos nucleofílicos para formarem entre eles ligações covalentes, m e n são, cada um maior ou igual a dois, e m+n é maior ou igual a cinco. O método inclui igualmente a combinação do primeiro componente reticulável e do segundo componente reticulável, a adição de um componente formador de hidrogel ao primeiro componente reticulável e segundo componente reticulável, e permitindo que o primeiro componente reticulável e o segundo componente reticulável se tornem reticulados um com o outro para formar uma matriz tridimensional. O método pode também incluir o contacto com uma primeira superfície de tecido e uma segunda superfície com o primeiro componente reticulável, o segundo componente reticulável, e o componente formador de hidrogel. Em alguns casos, a segunda superfície é uma superfície de tecido nativo. Em alguns casos, a segunda superfície é uma superfície do tecido não nativo, tal como um implante sintético. O implante sintético pode ser uma córnea de doador, um vaso sanguíneo artificial, uma válvula cardíaca, um órgão artificial, uma prótese de ligação, uma lentícula implantável, um enxerto vascular, um stent, ou uma combinação de stent/enxerto. Em alguns casos, o primeiro componente reticulável, o segundo componente reticulável e o componente formador de hidrogel são cada um aplicado na forma de pó na superfície do primeiro tecido. Em alguns casos, o primeiro componente reticulável, o segundo componente reticulável e o componente formador de hidrogel são aplicados sob a forma de pó numa formulação única 13 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ combinada de mistura de pós na primeira superficie do tecido. A formulação de mistura de pós pode incluir uma proteina e/ou um polissacárido. A primeira superficie de tecido pode ser sobre ou dentro de um tecido duro ou de um tecido mole. A primeira superficie do tecido pode incluir, circundar ou estar adjacente à área cirúrgica. O método pode igualmente incluir o fecho da área cirúrgica. Em alguns casos, a formulação de mistura de pós inclui colagénio. Em alguns casos, a formulação de mistura de pós inclui um agente biologicamente activo. Em alguns aspectos, as concretizações do presente invento englobam uma composição de mistura de pós que inclui um primeiro componente reticulável na forma de pó com múltiplos grupos nucleofilicos, um segundo componente reticulável na forma de pó com múltiplos grupos electrofilicos e um componente formador de hidrogel em forma de pó. Sob condições favoráveis de reacção o primeiro e segundo componentes reticuláveis são capazes de reticulação imediata de forma substancial.

Num aspecto relacionado, o primeiro componente reticulável adicionado ao segundo componente reticulável proporciona uma composição de componentes reticuláveis combinados. O primeiro componente reticulável pode estar presente numa concentração na gama de cerca de 0,5 a cerca de 20 por cento em peso da composição de componentes reticuláveis combinados. Em alguns casos, o segundo componente reticulável pode estar presente numa concentração na gama de cerca de 0,5 a cerca de 2 0 por cento em peso da composição de componentes reticuláveis combinados. A proporção em peso do primeiro componente reticulável em relação ao segundo componente reticulável pode encontrar-se na gama de cerca de 45% a cerca de 55%. De modo similar, a proporção em peso do primeiro componente reticulável em relação ao segundo componente reticulável pode ser cerca de 50%. Em alguns casos, a proporção em peso entre o primeiro e segundo componentes reticuláveis e o componente formador de hidrogel pode encontrar-se na gama de 28% a 42% p/p. De modo similar, a proporção em peso entre o primeiro e o segundo componentes reticuláveis e o componente formador de hidrogel pode encontrar-se na gama de 20% a 30% p/p. Em alguns aspectos, o primeiro componente reticulável pode estar 14 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ presente numa concentração na gama de 0,5 a 2 0 por cento em peso da composição de componentes reticuláveis combinados. De modo similar, o segundo componente reticulável pode estar presente numa concentração na gama de 0,5 a 20 por cento em peso da composição de componentes reticuláveis combinados. A proporção em peso do primeiro componente reticulável em relação ao segundo componente reticulável pode encontrar-se na gama de 45% a 55%. Do mesmo modo, a proporção em peso do primeiro componente reticulável em relação ao segundo componente reticulável pode ser cerca de 50%.

Num outro aspecto, as concretizações do presente invento proporcionam kits de composições de matrizes selantes. Um kit pode incluir, por exemplo, um recipiente e uma composição de mistura de pós dispostos no interior do recipiente. A composição pode incluir um primeiro componente reticulável com múltiplos grupos nucleofilicos e um segundo componente reticulável com múltiplos grupos electrofilicos. O primeiro componente reticulável, o segundo componente reticulável, ou ambos, podem encontra-se sob a forma de pó. O kit pode também incluir um componente formador de hidrogel em forma de pó. Sob condições favoráveis de reacção o primeiro e segundo componentes reticuláveis podem ser capazes de reticulação imediata de modo substancial. Em alguns casos, o recipiente inclui um corpo de seringa e um êmbolo da seringa. Um kit pode igualmente incluir instruções escritas para aplicação da composição de mistura de pós num local alvo em hemorragia de um paciente. Em alguns casos, o pó misturado inclui um agente activo. O agente activo pode incluir trombina. Num outro aspecto, um kit pode incluir uma esponja de colagénio ou outro suporte adequado, e uma composição de mistura de pós fixada na superfície da esponja ou do suporte. A composição pode incluir um primeiro componente reticulável com múltiplos grupos nucleofilicos e um segundo componente reticulável com múltiplos grupos electrofilicos. O primeiro componente reticulável, o segundo componente reticulável, ou ambos, podem encontrar-se sob a forma de pó. O kit pode também incluir um componente formador de hidrogel em forma de pó. Sob condições favoráveis de reacção o primeiro e segundo componentes reticuláveis podem ser capazes de reticulação imediata de modo substancial. 15 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ

Para uma melhor compreensão acerca da natureza e vantagens do presente invento, deverá ser feita referência à descrição detalhada adiante considerada em conjunto com as figuras anexas. A presente invento inclui, mas não se encontra limitado a:

Uma composição compreendendo: um primeiro componente reticulável; um segundo componente reticulável, que reticula com o primeiro componente reticulável sob condições favoráveis de reacção, e um componente formador de hidrogel; em que o primeiro e segundo componente reticulável reticulam para formar uma matriz porosa com interstícios, e em que o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos interstícios. A composição do parágrafo 31, em que o primeiro componente reticulável compreende múltiplos grupos nucleofílicos e o segundo componente reticulável compreende múltiplos grupos electrofílicos. A composição do parágrafo 31, em que o primeiro componente reticulável compreende um óxido de polialquileno multi-nucleofílico com m grupos nucleofílicos, e o segundo componente reticulável compreende um óxido de polialquileno multi-electrofílico com n grupos electrofílicos, em que m e n são cada um superior ou igual a dois, e em que m+n é superior ou igual a cinco. A composição do parágrafo 33, em que n é dois, e em que m é maior ou igual a três. A composição do parágrafo 34, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofílico se encontra tetrafuncionalmente activado. e em que A composição do parágrafo 33, em que m é dois, n é maior ou igual a três. 16

ΕΡ 2 049 165/PT A composição do parágrafo 36, em que 0 óxido de polialquileno multi-electrofilico se encontra tetrafuncionalmente activado. A composição do parágrafo 33, em que tanto 0 óxido de polialquileno multi-nucleofilico como 0 óxido de polialquileno multi-electrofilico se encontram tetrafuncionalmente activados. A composição do parágrafo 33, em que 0 óxido de polialquileno multi-nucleofilico compreende ainda dois ou mais grupos nucleofilicos seleccionados a partir do grupo que consiste em de NH2,-SH, -Η,-PH2, e -CO-NH-NH2. A composição do parágrafo 33, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico compreende ainda dois ou mais grupos amino primários. A composição do parágrafo 33, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico compreende ainda dois ou mais grupos tiol. A composição do parágrafo 33, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico é o polietilenoglicol ou um seu derivado. A composição do parágrafo 42, em que o polietilenoglicol compreende ainda dois ou mais grupos nucleofilicos seleccionados a partir do grupo que consiste em um grupo amino primário e um grupo tiol. A composição do parágrafo 33, em que o óxido de polialquileno multi-electrofilico compreende ainda dois ou mais grupos electrofilicos seleccionados a partir do grupo que consiste em CO2N (COCH2)2, -CO2H, -CHO, -CHOCH2, -N=C=0, -S02CH=CH2, N(COCH)2, e -S-S-(C5H4N) . A composição do parágrafo 33, em que o óxido de polialquileno multi-electrofilico compreende ainda dois ou mais grupos succinimidilo. 17 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ A composição do parágrafo 33, em que o óxido de polialquileno multi-electrofilico compreende ainda dois ou mais grupos maleimidilo. A composição do parágrafo 33, em que o óxido de polialquileno multi-electrofilico é um polietilenoglicol ou um seu derivado. que compreende ainda um que compreende polissacárido ainda um é um A composição do parágrafo 33 polissacárido ou uma proteína. A composição do parágrafo 33 polissacárido, em que o glicosaminoglicano. A composição do parágrafo 4 9, em que o glicosaminoglicano é seleccionado a partir do grupo que consiste em ácido hialurónico, quitina, sulfato de condroitina A, sulfato de condroitina B, sulfato de condroitina C, sulfato de queratina, queratosulfato, heparina, e derivados dos mesmos. A composição do parágrafo 33 que compreende ainda uma proteína, em que a proteína é o colagénio ou um seu derivado. A composição do parágrafo 33, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico ou o óxido de polialquileno multi-electrofilico, ou tanto o óxido de polialquileno multi-nucleofilico como o óxido de polialquileno multi-electrof ilico, compreende(em) ainda um grupo de ligação. A composição do parágrafo 33, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico é dado pela fórmula: polírnero-Q1-Xm e em que o óxido de polialquileno multi- electrof ilico é dado pela fórmula: polímero-Q2-Yn 18

ΕΡ 2 049 165/PT em que X é um grupo electrof í lico e Y é um grupo núcleofílico; em que m e m são cada um 2 a 4/ em que m+n < 5; em que cada um de Q1 e Q2 são grupos de ligação seleccionados a partir do grupo que consiste em -0-(0¾) n'_, -S-, -(CH2)n'", -NH-(CH2)n' ", -S2C-NH- (CH2 ) n'~ r S2C~ (CR 2)n’-r -S2C-CR1H, e -0R2-C0-NH; em que n' = 1 a 10/ em que R1 = -H, -CH3, ou -C2H5; em que R2 = -CH2-, ou -CO-NH-CH2CH2-; e em que Q1 e Q2 podem ser iguais ou diferentes, ou podem estar ausentes. A composição do parágrafo 53, em que Y é dado pela fórmula: -C02N (COCH2) 2. A composição do parágrafo 53, em que Y é dado pela fórmula: -N(COCH)2. A composição do parágrafo 33, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofílico ou o óxido de polialquileno multi-electrofílico ou tanto o óxido de polialquileno multi-nucleofílico como o óxido de polialquileno multi-electrof ílico compreende(em) ainda um grupo biodegradável. A composição do parágrafo 56, em que o grupo biodegradável é seleccionado a partir do grupo que consiste em lactida, glicolido, ε-caprolactona, poli (a-hidroxiácido), poli (aminoácido), e poli(anidrido). A composição do parágrafo 31, em que o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel fragmentado biocompatível que compreende gelatina e que irá absorver água, quando administrado num local alvo de tecido húmido, e em que o hidrogel compreende subunidades com dimensões que variam desde cerca de 0,01 mm a cerca de 5 mm, quando completamente hidratado e que apresenta uma gama 19

ΕΡ 2 049 165/PT de expansibilidade em equilíbrio que varia desde cerca de 400% a cerca de 5000%. A composição do parágrafo 58, em que o hidrogel possui um tempo de degradação in vivo inferior a um ano. A composição de qualquer um dos parágrafos 58 e 59, em que o hidrogel se encontra pelo menos parcialmente hidratado com um meio aquoso que compreende um agente activo. A composição do parágrafo 60, em que o agente activo é um agente de coagulação. A composição do parágrafo 61, em que o agente de coagulação é trombina.

Um método para a administração de um agente activo a um paciente, compreendendo o método a administração num local alvo do paciente de uma quantidade da composição do parágrafo 60.

Um método para a administração de um agente selante a um paciente, compreendendo o método a administração num local alvo em hemorragia de uma quantidade da composição do parágrafo 31 suficiente para inibir a hemorragia.

Um método para a administração de trombina a um paciente, compreendendo o método a administração num local alvo em hemorragia de uma quantidade da composição do parágrafo 62 suficiente para inibir a hemorragia.

Uma composição compreendendo um óxido de polialquileno multi-nucleófilo, um óxido de polialquileno multi-electrofílico, e um componente formador de hidrogel, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico compreende ainda pelo menos um grupo amino primário e pelo menos um grupo tiol, e em que sob condições favoráveis de reacção o óxido de polialquileno multi-nucleófilo e óxido de polialquileno multi-electrofilico são capazes de reticulação imediata de modo substancial.

Uma composição compreendendo um óxido de polialquileno multi-nucleófilo, um óxido de polialquileno multi- 20 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ electrofίlico, e um componente formador de hidrogel, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico compreende ainda dois ou mais grupos tiol e o óxido de polialquileno multi-electrofilico compreende ainda dois ou mais grupos electrofilicos seleccionados a partir dos grupos que consiste em grupos succinimidilo e grupos maleimidilo, e em que sob condições favoráveis de reacção o óxido de polialquileno multi-nucleófilo e óxido de polialquileno multi-electrofilico são capazes de reticulação imediata de modo substancial.

Uma composição compreendendo um óxido de polialquileno multi-nucleófilo, um óxido de polialquileno multi-electrof ilico, e um componente formador de hidrogel formando, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico compreende ainda dois ou mais grupos nucleofilicos seleccionados a partir do grupo que consiste em grupos amino primários e grupos tiol, e o óxido de polialquileno multi-electrof ilico compreende ainda dois ou mais grupos de succinimidilo, e em que sob condições favoráveis de reacção o óxido de polialquileno multi-nucleófilo e óxido de polialquileno multi-electrofilico são capazes de reticulação imediata de modo substancial.

Uma composição compreendendo um primeiro polietilenoglicol compreendendo dois ou mais grupos tiol, um segundo polietilenoglicol compreendendo dois ou mais grupos succinimidilo ou grupos maleimidilo e um componente formador de hidrogel, em que a soma dos grupos tiol e dos grupos succinimidilo ou maleimidilo é de pelo menos cinco, e em que sob condições favoráveis de reacção o primeiro polietilenoglicol e o segundo polietilenoglicol são capazes de reticulação imediata de modo substancial. A composição do parágrafo 69, em que o primeiro polietilenoglicol compreende ainda quatro grupos tiol e o segundo polietilenoglicol compreende ainda quatro grupos succinimidilo. A composição do parágrafo 69 que compreende ainda uma proteina ou um polissacárido. 21

ΕΡ 2 049 165/PT A composição do parágrafo 69 que compreende ainda um polissacárido, em que o polissacárido é um glicosaminoglicano. A composição do parágrafo 72, em que o glicosaminoglicano é seleccionado a partir do grupo que consiste em ácido hialurónico, quitina, sulfato de condroitina A, sulfato de condroitina B, sulfato de condroitina C, sulfato de queratina, queratosulfato, heparina, e derivados dos mesmos. A composição do parágrafo 69 que compreende ainda uma proteína, em que a proteína é o colagénio ou um seu derivado.

Um método para selar um tracto de tecido, compreendendo o método, o enchimento pelo menos parcial dum tracto de tecido com uma composição compreendendo: um primeiro componente reticulável; um segundo componente reticulável, que reticula com o primeiro componente reticulável sob condições favoráveis de reacção, e um componente formador de hidrogel; em que o primeiro e segundo componentes reticuláveis reticulam para formar uma matriz porosa com interstícios, e o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos interstícios, o hidrogel compreendendo subunidades com dimensões que variam de 0,05 mm a 5 mm, quando completamente hidratado, com uma gama de expansibilidade em equilíbrio que varia de 400% a 1300%, e que degrada no tracto de tecido após 1 a 120 dias. O método do parágrafo 75, em que o primeiro componente reticulável compreende múltiplos grupos nucleofílicos e o segundo polímero compreende múltiplos grupos electrofílicos.

Um método para inibir a hemorragia num local alvo no corpo de um paciente, compreendendo o método a administração de uma composição no local alvo, numa quantidade suficiente para inibir a hemorragia, compreendendo a composição: 22

ΕΡ 2 049 165/PT um primeiro componente reticulável; um segundo componente reticulável, que reticula com o primeiro componente reticulável sob condições favoráveis de reacção, e um componente formador de hidrogel; em que o primeiro e segundo componentes reticuláveis reticulam para formar uma matriz porosa com interstícios, e o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos interstícios, compreendendo o hidrogel subunidades com dimensões que variam variando de 0,05 mm a 5 mm, quando completamente hidratado, com uma expansibilidade de equilíbrio que varia de 400% a 1300%, e degradando no tracto de tecido após 1 a 120 dias. O método do parágrafo 77, em que o primeiro componente reticulável compreende múltiplos grupos nucleofílicos e o segundo componente reticulável compreende múltiplos grupos electrofílicos.

Um método para a administração de uma substância bioactiva num local alvo no corpo de um paciente, compreendendo o método a administração de uma composição em combinação com a substância bioactiva no local alvo, compreendendo a composição: um primeiro componente reticulável; um segundo componente reticulável, que reticula com o primeiro componente sob condições favoráveis de reacção favoráveis, e um componente formador de hidrogel; em que o primeiro e segundo componentes reticuláveis reticulam para formar uma matriz porosa com interstícios, e o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos interstícios, compreendendo o hidrogel subunidades com dimensões que variam de 0,05 mm a 5 mm, quando completamente hidratado, com uma expansibilidade de equilíbrio que varia de 400% a 1300%, e degradando no tracto de tecido após 1 a 120 dias. O método do parágrafo 79, em que o primeiro componente reticulável compreende múltiplos grupos nucleofílicos e o 23 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ segundo componente reticulável compreende múltiplos grupos electrofílicos.

Um método tal como no parágrafo 79, em que a substância bioactiva é um agente hemostático.

Um método tal como no parágrafo 79, em que a substância bioactiva é trombina.

Um método para a administração de uma composição expansível num local alvo em tecido, compreendendo o referido método a aplicação da composição no local alvo, compreendendo a composição: um primeiro componente reticulável; um segundo componente reticulável, que reticula com o primeiro componente reticulável sob condições favoráveis de reacção, e um componente formador de hidrogel; em que o primeiro e segundo reticulável componentes reticuláveis reticulam para formar uma matriz porosa com interstícios, e o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos interstícios, compreendendo o hidrogel subunidades com dimensões que variam de 0,05 mm a 5 mm, quando completamente hidratado, com uma expansibilidade de equilíbrio que varia de 400% a 1300%, e degradando no tracto de tecido após 1 a 120 dias, estando a composição hidratada menos do que o valor da sua expansibilidade de equilíbrio aquando da aplicação no local alvo onde expande para um valor de expensibilidade de equilíbrio. O método do parágrafo 83, em que o primeiro componente reticulável compreende múltiplos grupos nucleofílicos e o segundo componente reticulável compreende múltiplos grupos electrofílicos. O método do parágrafo 83, em que o local alvo é em tecido seleccionado de entre o grupo que consiste em músculo, pele, tecido epitelial, tecido conjuntivo ou de suporte, tecido nervoso, tecido oftálmico e tecido de outros órgão sensoriais, tecido vascular e cardíaco, órgãos e 24 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ tecidos gastrointestinais, pleura e outro tecido pulmonar, rim, glândulas endócrinas, órgãos reprodutores masculinos e femininos, tecido adiposo, figado, pâncreas, linfa, cartilagem, osso, tecido oral, e tecido da mucosa, e baço e outros órgãos abdominais. O método do parágrafo 85, em que o local alvo é uma região vazia no interior do tecido seleccionado. O método do parágrafo 86, em que a região vazia é seleccionado a partir do grupo que consiste em regiões desocupadas de tecidos, tractos de tecido, espaços intravertebrais e cavidades corporais. O método do parágrafo 83, em que o hidrogel apresenta um grau de hidratação na gama de 50% a 95% da hidratação na expansibilidade de equilíbrio. O método do parágrafo 83, em que o hidrogel compreende um plastificante. O método do parágrafo 89, em que o plastificante é seleccionado a partir do grupo que consiste em polietilenoglicol, sorbitol e glicerol. O método do parágrafo 89, em que o plastif icante está presente desde 0,1% em peso a 30% em peso da composição do componente hidrogel.

Um método tal como em qualquer um dos parágrafos 75-91, em que o hidrogel compreende um hidrogel de proteína reticulada.

Um método tal como no parágrafo 92, em que a proteína é seleccionada a partir do grupo que consiste em gelatina, colagénio solúvel, albumina, hemoglobina, fibrinogénio, fibrina, caseína, fibronectina, elastina, queratina, laminina, e seus derivados e combinações.

Um método como em qualquer um dos parágrafos 75-91, em que o hidrogel compreende um polissacárido reticulado. 25

ΕΡ 2 049 165/PT

Um método tal como no parágrafo 94, em que o polissacárido é seleccionado a partir do grupo que consiste em glicosaminoglicanos, derivados de amido, derivados de celulose, derivados de hemicelulose, xilano, agarose, alginato e quitosano e combinações dos mesmos.

Um método como em qualquer um dos parágrafos 75-91, em que o hidrogel compreende um polímero reticulado não biológico.

Um método tal como no parágrafo 96, em que o polímero reticulado não biológico é seleccionado a partir do grupo que consiste em poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilamidas, resinas de polivinilo, polilactido-glicolidos policaprolactonas e polioxietilenos e combinações dos mesmos.

Um método como em qualquer um dos parágrafos 75-91, em que o hidrogel compreende pelo menos dois componentes seleccionados de entre o grupo que consiste em proteínas reticuladas, polissacáridos reticulados, e polímeros não biológicos reticulados.

Um método tal como em qualquer um dos parágrafos 75-91, em que o hidrogel compreende um polímero de hidrogel e um agente reticulante de hidrogel, em que o polímero de hidrogel e agente reticulante de hidrogel foram feitos reagir sob condições que proporcionam a reticulação das moléculas de polímero de hidrogel.

Um método tal como em qualquer um dos parágrafos 75-91, em que o hidrogel compreende um polímero de hidrogel molecular reticulado o qual foi produzido através de irradiação do hidrogel sob condições que proporcionam a reticulação das moléculas de polímero de hidrogel.

Um método como em qualquer um dos parágrafos 75-91, em que o hidrogel compreende um hidrogel molecular reticulado o qual foi produzido através de reacção de monómeros mono-saturados e poli-insaturados de hidrogel sob condições que proporcionam a reticulação de moléculas de polímero de hidrogel. 26 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ

Um método de formação de uma matriz polimérica sintética tridimensional que compreende os passos de: proporcionar um primeiro componente reticulável contendo m grupos nucleofilicos e um segundo componente reticulável contendo n grupos electrofilicos, em que os grupos electrofilicos reagem com os grupos nucleofilicos para formar ligações covalentes entre si, em que m e n são, cada um maior ou igual a dois , e em que m+n é maior ou igual a cinco; combinar o primeiro componente reticulável e o segundo componente reticulável; adicionar um componente formador de hidrogel ao primeiro componente reticulável e segundo componente reticulável; permitir que o primeiro componente reticulável e o segundo componente reticulável se reticulem um ao outro para formar uma matriz tridimensional. O método do parágrafo 102, compreendendo ainda fazer contactar uma primeira superfície de tecido e uma segunda superfície com o primeiro componente reticulável, o segundo componente reticulável, e o componente formador de hidrogel. O método do parágrafo 103, em que a segunda superfície é uma superfície do tecido nativo. O método do parágrafo 103, em que a segunda superfície é uma superfície do tecido não nativo. O método do parágrafo 105, em que a superfície de tecido não nativo é um implante sintético. O método do parágrafo 106, em que o implante sintético é seleccionado a partir do grupo que consiste em córnea de doador, um vaso sanguíneo artificial, uma válvula cardíaca, um órgão artificial, uma prótese de ligação, uma lentícula implantável, um enxerto vascular, um stent, e uma combinação stent/ enxerto. O método do parágrafo 102, em que o primeiro componente reticulável, o segundo componente reticulável, e o 27 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ componente formador de hidrogel é cada um aplicado na forma de pó na superfície do primeiro tecido. O método do parágrafo 102, em que o primeiro componente reticulável, o segundo componente reticulável, e o componente formador de hidrogel é cada um aplicado sob a forma de pó numa formulação única combinada de mistura de pós na primeira superfície de tecido O método do parágrafo 109, em que a formulação de mistura de pós compreende ainda uma proteína ou um polissacárido. O método do parágrafo 102, em que a primeira superfície de tecido se encontra sobre ou no interior de um tecido duro ou de um tecido mole. O método do parágrafo 102, em que a primeira superfície de tecido compreende, circunda ou é adjacente a uma área cirúrgico, e em que o método compreende ainda o passo de fecho da área cirúrgica. O método do parágrafo 102, em que a formulação de mistura de pós compreende ainda colagénio. O método do parágrafo 102, em que a formulação de mistura de pós compreende ainda um agente biologicamente activo.

Uma composição de mistura de pós compreendendo: um primeiro componente reticulável compreendendo múltiplos grupos nucleofílicos, o primeiro componente reticulável na forma de pó; um segundo componente reticulável compreendendo múltiplos grupos electrofílicos, o segundo componente reticulável na forma de pó, e um componente formador de hidrogel em forma de pó; em que sob condições favoráveis de reacção o primeiro e segundo componentes reticuláveis são capazes de reticular substancialmente de imediato. A composição de mistura de pós do parágrafo 115, em que o primeiro componente reticulável adicionado ao segundo 28 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ componente reticulável proporciona uma composição combinada de componentes reticuláveis, e o primeiro componente reticulável primeiro encontra-se presente numa concentração na gama de 0,5 a 20 por cento em peso da composição combinada de componentes reticuláveis. A composição de mistura de pós do parágrafo 115, em que o primeiro componente reticulável adicionado ao segundo componente reticulável proporciona uma composição combinada de componentes reticuláveis, e o segundo componente reticulável primeiro encontra-se presente numa concentração na gama de 0,5 a 20 por cento em peso da composição combinada de componentes reticuláveis. A composição de mistura de pós do parágrafo 115, em que a proporção em peso do primeiro componente reticulável em relação ao segundo componente reticulável se encontra na gama de 45% a 55%. A composição de mistura de pós do parágrafo 115, em que a proporção em peso do primeiro componente reticulável em relação ao segundo componente reticulável é de cerca de 50%. A composição de mistura de pós do parágrafo 115, em que a proporção em peso entre o primeiro e segundo componente reticuláveis e o componente formador de hidrogel se encontra na gama de 28% a 42% p/p. A composição de mistura de pós do parágrafo 115, em que a proporção em peso entre o primeiro e o segundo componentes reticuláveis e o componente formador de hidrogel se encontra na gama de 20% a 30% p/w. A composição de mistura de pós do parágrafo 121, em que o primeiro componente reticulável adicionado ao segundo componente reticulável proporciona uma composição combinada de componentes reticuláveis, e o primeiro componente reticulável se encontra presente numa concentração na gama de 0,5 a 20 por cento em peso da composição combinada de componentes reticuláveis. A composição de mistura de pós do parágrafo 121, em que o primeiro componente reticulável adicionado ao segundo 29 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ componente reticulável proporciona uma composição combinada de componentes reticuláveis, e o segundo componente reticulável encontra-se presente numa concentração na gama de 0,5 a 20 por cento em peso da composição combinada de componentes reticuláveis. A composição de mistura de pós do parágrafo 121, em que a proporção em peso do primeiro componente reticulável em relação ao segundo componente reticulável se encontra na gama de 45% a 55%. A composição de mistura de pós do parágrafo 121, em que a proporção em peso do primeiro componente reticulável em relação ao segundo componente reticulável é de cerca de 50%.

Um kit compreendendo: um recipiente; e uma composição de mistura de pós depositada no interior do recipiente, compreendendo a composição: um primeiro componente reticulável compreendendo múltiplos grupos nucleofilicos, o primeiro componente reticulável na forma de pó; um segundo componente reticulável compreendendo múltiplos grupos electrofilicos, o segundo componente reticulável na forma de pó, e um componente formador de hidrogel em forma de pó; em que sob condições favoráveis de reacção o primeiro e segundo componentes reticuláveis são capazes de reticular substancialmente de imediato. O kit do parágrafo 12 6, em que o recipiente compreende um corpo de seringa e um êmbolo da seringa. O kit do parágrafo 126, compreendendo ainda instruções escritas para aplicar a composição de mistura de pós num local alvo em hemorragia num paciente. O kit do parágrafo 126, em que a mistura de pós compreende ainda um agente activo. em que o agente activo O kit do parágrafo 129, compreende trombina. 30 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ

Um kit compreendendo: uma esponja de colagénio, e uma composição de mistura de pós fixada com uma superficie da esponja, compreendendo a composição de mistura de pós: um primeiro componente reticulável compreendendo múltiplos grupos nucleofilicos, o primeiro componente reticulável na forma de pó; um segundo componente reticulável compreendendo múltiplos grupos electrofilicos, o segundo componente reticulável na forma de pó, e um componente formador de hidrogel em forma de pó; em que sob condições favoráveis de reacção o primeiro e segundo componentes reticuláveis são capazes de reticular substancialmente de imediato.

Uma composição para o fabrico de um medicamento compreendendo: um primeiro componente reticulável; um segundo componente reticulável, que reticula com o primeiro componente reticulável sob condições favoráveis de reacção, e um componente formador de hidrogel; em que o primeiro e segundo componente reticuláveis se reticulam para formar uma matriz porosa com intersticios, e em que o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos intersticios. A composição do parágrafo 132, em que o primeiro componente reticulável compreende múltiplos grupos nucleofilicos e o segundo componente reticulável compreende múltiplos grupos electrofilicos. A composição do parágrafo 133, em que o primeiro componente reticulável compreende um óxido de polialquileno multi-nucleofilico com m grupos nucleofilicos, e o segundo componente reticulável compreende um óxido de polialquileno multi-electrofilico com n grupos electrofilicos, em que m e n são cada um maior ou igual a dois, e em que m+n é maior ou igual a cinco. 31 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ A composição do parágrafo 134, em que n é dois, e em que m é maior ou igual a três. A composição do parágrafo 135, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico é tetrafuncionalmente activado. A composição do parágrafo 134, em que m é dois, e em que n é maior ou igual a três. A composição do parágrafo 137, em que o óxido de polialquileno multi-electrofilico é tetrafuncionalmente activado. em que tanto o óxido de como o óxido de são tetrafuncionalmente A composição do parágrafo 134, polialquileno multi-nucleofilico polialquileno multi-electrofilico activados. A composição do parágrafo 134, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico compreende ainda dois ou mais grupos nucleofilicos seleccionados a partir do grupo que consiste em NH2, -SH, -H, -PH2, e -CO-NH-NH2. A composição do parágrafo 134, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico compreende ainda dois ou mais grupos amino primários.

Uma composição compreendendo: uma esponja de colagénio compreendendo fibras de colagénio nativas, e uma composição de mistura de pós fixada com uma superfície da esponja, compreendendo a composição de mistura de pós: um primeiro componente reticulável compreendendo múltiplos grupos nucleofilicos, o primeiro componente reticulável na forma de pó e compreendendo cerca de 10% da mistura de pós; um segundo componente reticulável compreendendo múltiplos grupos electrofilicos, o segundo componente reticulável na forma de pó e compreendendo cerca de 10% da mistura de pós; e 32

ΕΡ 2 049 165/PT um componente formador de hidrogel em forma de pó, compreendendo cerca de 80% da mistura de pós; em que sob condições favoráveis de reacção o primeiro e segundo componentes reticuláveis são capazes de reticular substancialmente de imediato para formar uma matriz porosa com interstícios, e o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos interstícios.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 ilustra um primeiro componente reticulável de acordo com algumas concretizações do presente invento A FIG. 2 ilustra um segundo componente reticulável de acordo com algumas concretizações do presente invento. A FIG. 3 representa a formação de uma composição de matriz reticulada a partir de um polímero hidrofílico de acordo com algumas concretizações do presente invento. A FIG. 4 representa a formação de uma composição de matriz reticulada a partir de um polímero hidrofóbico de acordo com algumas concretizações do presente invento. A FIG. 5 ilustra uma subunidade do componente formador de hidrogel de acordo com algumas concretizações do presente invento. A FIG. 6 ilustra a correlação entre a percentagem de expansão e a percentagem de sólidos de um gel polimérico reticulado fragmentado útil como um componente formador de hidrogel numa composição selante de acordo com algumas concretizações do presente invento.

As Figs. 7A-E ilustram a aplicação de uma composição de matriz selante para tratar um punção da artéria esplénica de acordo com concretizações do presente invento.

As Figs. 8A-E ilustram a aplicação de uma composição de matriz selante para tratar uma ressecção hepática de acordo com concretizações do presente invento. 33 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ A FIG. 9 ilustra ο processamento e embalagem de uma composição de matriz selante de acordo com concretizações do presente invento. A FIG. 10 ilustra o processamento e embalagem de uma composição de matriz selante de acordo com concretizações do presente invento. A FIG. 11 ilustra o efeito da concentração de PEG na resistência do gel, de acordo com concretizações do presente invento. A FIG. 12 ilustra o efeito da concentração de PEG na razão de expansão, de acordo com concretizações do presente invento. A FIG. 13 ilustra o efeito da concentração de PEG na razão de expansão, de acordo com concretizações do presente invento. A FIG. 14 ilustra o efeito da concentração de PEG na razão de expansão, de acordo com concretizações do presente invento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

De acordo com algumas concretizações, o presente invento proporciona composições de matrizes selantes secas para a realização da hemostasia ou contenção de outro fluido num contexto in vivo, selando uma ruptura ou defeito no tecido. As composições de algumas concretizações do invento compreendem primeiro e segundo componentes reticuláveis e pelo menos um componente formador de hidrogel, numa composição seca adequada para aplicação num tecido de um vertebrado para facilitar a contenção de liquidos. O primeiro e segundo componentes nas composições do presente invento reagem sob condições in-vivo para formar uma matriz reticulada, enquanto o componente formador de hidrogel absorve rapidamente o fluido biológico que emana através da ruptura de tecido, além de reforçar a barreira física da matriz selante resultante formada à medida que o primeiro e 34 ΕΡ 2 049 165/PT segundo componentes reticulam. Tal como descrito no presente pedido, "composições de matriz selante" pode dizer respeito a composições do invento, antes da aplicação no local de tecido in vivo, e "barreira de matriz selante" pode dizer respeito à barreira matriz resultante após as composições do invento contactarem com fluidos biológicos e o primeiro e segundo componentes reticularem para formar uma matriz reticulada porosa contendo o hidrogel. As composições de matriz selante podem ser produzidas numa variedade de formatos, incluindo pós, pastas, pastilhas e similares. Concretizações de pasta incluem amostras em pó de composições de matriz selante que tenham sido aquecidas ou cozidas para formar um corpo agregado. Concretizações de pastilhas incluem amostras em pó de composições de matriz selante que foram colocadas sobre uma esponja, tal como uma esponja de colagénio ou outro suporte, que é então cozida para criar um pó solidificado que é fundido com a esponja ou suporte.

Apesar do presente invento pode ser utilizado para conter fluidos biológicos diferentes de sangue (por exemplo, linfa, ou fluido espinal), a matriz de selante formada pelas composições de algumas concretizações do presente invento podem também ser denominadas como "matriz hemostática", dado que este é um uso principal aqui descrito.

Além de proporcionar hemostasia rápida e uma barreira com elevada aderência aos tecidos circundantes, a matriz de selante de algumas das concretizações do presente invento possuem várias vantagens em relação aos materiais anteriormente descritos utilizados para atingir a hemostase. Em primeiro lugar, a matriz de selante de algumas concretizações do presente invento pode ser utilizada sob condições em que a ruptura do tecido é bastante húmida (por exemplo, hemorragias arteriais com gotejamento rápido ou esguicho, tais como traumatismo abrasivo ou de corte de um órgão interno). Em comparação, muitas das composições actualmente comercializadas para hemostasia requerem um local relativamente seco para a aderência adequada da composição e manutenção da hemostase. Por exemplo, em alguns casos, podem ser colocadas determinadas misturas de PEG numa área com hemorragia rápida, no entanto, é provável que as 35

ΕΡ 2 049 165/PT mesmas saiam com lavagem. De modo similar, em alguns casos, determinadas composições de gelatina poderiam hidratas numa área em hemorragia rápida, no entanto, é provável que as mesmas teriam dificuldade em permanecer na área. Vantajosamente, determinou-se que as preparações que incluem um primeiro componente reticulável, um segundo componente reticulável, e um componente formador de hidrogel pode proporcionar um material que, em condições favoráveis de reacção permanece imobilizado, mesmo com hemorragia substancial para formar um material mecanicamente estável tipo coágulo para estancar a hemorragia. Em segundo lugar, a matriz de selante de algumas concretizações do presente invento funciona por selagem fisica da ruptura do tecido, sem depender de qualquer capacidade endógena de coagulação do vertebrado. Deste modo, a matriz selante pode ser utilizada em vertebrados com baixa concentração de fibrinogénio no sangue, ou mesmo com substitutos do sangue que não contenham fibrinogénio. Por exemplo, quando o primeiro e segundo componentes reticuláveis são combinados com um componente formador de hidrogel e aplicados a uma superfície em hemorragia, pode ocorrer uma interacção sinérgica entre os componentes reticuláveis e o componente formador de hidrogel. De acordo com algumas concretizações, o primeiro e segundo componentes reticuláveis podem, na presença do componente formador de hidrogel, reagir e reticular no local alvo em hemorragia para formar uma estrutura relativamente rígida. De um modo similar, o componente formador de hidrogel pode preencher a estrutura relativamente rigida e mediar a formação de um selante fisico.

De acordo com algumas concretizações do presente invento, as composições de matriz selante pode ser preparado misturando um primeiro componente reticulável com um segundo componente reticulável e um componente formador de hidrogel sob condições nas quais o primeiro e segundo componentes reticuláveis não reticulam (isto é, falta de humidade, pH adequado, temperatura, etc.). Em contacto com o fluido biológico, ou em outras condições favoráveis de reacção, os primeiro e segundo componentes reticuláveis reticulam-se para formar uma matriz porosa com interstícios, e o componente formador de hidrogel é hidratado para formar um 36 ΕΡ 2 049 165/PT enchimento de hidrogel, em pelo menos alguns dos interstícios. Opcionalmente, os componentes reticuláveis também podem reticular com o componente formador de hidrogel e/ou tecidos circundantes. I. Componentes Reticuláveis de Matriz Selante

Frequentemente, o primeiro componente reticulável contém dois ou mais grupos nucleofílicos e o segundo componente reticulável contém dois ou mais grupos electrofílicos capazes se ligarem de modo covalente com os grupos nucleofílicos do primeiro componente reticulável. O primeiro e segundo componentes podem reticular-se para formar uma matriz porosa. Exemplos de primeiro e segundo componentes e matrizes porosas encontram-se descritos nas Patentes U.S. N°s. 5,874,500/ 6,166,130; 6,312,725; 6,328,229 e 6,458,889. O primeiro e segundo componentes são tipicamente seleccionados para não serem imunogénicos, e, como tal, podem não necessitar de um "teste cutâneo" antes de iniciar o tratamento. Além disso, estes componentes e o componente formador de hidrogel podem ser seleccionados para resistir à clivagem enzimática através das metaloproteinases de matriz (por exemplo, colagenase) para proporcionar uma maior persistência de longo prazo in vivo em relação às composições de colagénio actualmente disponíveis.

Alternativamente, o primeiro e segundo componentes e os componentes formadores de hidrogel podem ser seleccionados para serem eliminados ou reabsorvidos durante a cicatrização das feridas, de modo a evitar a formação de tecido fibroso em torno da matriz selante in vivo.

Numa concretização, o primeiro componente pode ser um polímero sintético contendo múltiplos grupos nucleofílicos (representados adiante como "X"), que pode reagir com um segundo componente polímero sintético contendo múltiplos grupos electrofílicos (representados adiante como "Y"), resultando numa rede polimérica ligada de modo covalente, tal como se segue: polírnero-Xm + polímero-Yn — polímero-Z-polímero 37

ΕΡ 2 049 165/PT em que m > 2, m > 2 e m+n > 5; X = -NH2, -SH, -OH, -PH2, -CO-NH-NH2, etc, e pode ser igual ou diferente; Y = -C02N (COCH2) 2, -C02H, -CHO, -CHOCH2, -N=C=0, S02 CH=CH2, -N (COCH) 2) r -S-S-(C5H4N) , etc, e pode ser igual ou diferente, e Z = grupo funcional resultante da união de um grupo nucleofilico (X) e um grupo electrofilico (Y).

Tal como acima referido, X e Y podem ser iguais ou diferentes, ou seja, o primeiro componente pode ter dois grupos nucleofilicos diferentes e/ou o segundo componente pode ter dois grupos electrofilicos diferentes. Um exemplo de um primeiro componente polimérico ou primeiro componente reticulável é ilustrado na FIG. 1. Um exemplo de um segundo componente polimérico ou segundo componente reticulável é ilustrado na FIG. 2. A estrutura-base do primeiro e segundo componentes poliméricos pode ser um óxido de alquileno, particularmente, óxido de etileno, óxido de propileno e suas misturas. Exemplos de óxidos de alquileno difuncionais podem ser representados por:

X-polímero-X Y-polímero-Y em que X e Y são tal como anteriormente definidos, e o termo "polímero" representa - (CH2CH20) n- ou - (CH (CH3) CH20) n-ou - (0Η20Η20)η-(CH(CH3)CH20)n-. O grupo funcional X ou Y é comummente acoplado à estrutura-base do polímero por um grupo de ligação (representado adiante como "Q"), muitos dos quais são conhecidos ou possíveis. Embora os componentes do invento possuam dois ou mais grupos funcionais, os exemplos adiante por uma questão de simplicidade mostram apenas um grupo funcional e a reticulação resultante. Existem muitas 38

ΕΡ 2 049 165/PT maneiras para preparar os vários polímeros funcionalizados, algumas das quais estão abaixo listadas: polimero-Q1-X + polimero-Q2-Y ->· polimero-Q1-Z-Q2-Polimero em que Q = estrutura completa = -0- (CH2)n- polímero-O-(CH2) n-X (ou Y) -S- (CH2)n- polímero-S-(CH2) n-X (ou Y) -NH- (CH2)n- polímero-NH-(CH2) n-X (ou Y) -02C-NH- (CH2)n- polímero-0 02C-NH-(CH2) n-X (ou Y) -02C- (CH2)n- polímero-02C- (CH2) -X (ou Y) -o2c-cr1h- polímero-02C-CRH-X (ou Y) O 1 w NJ 1 o 0 1 2 1 polímero-OR-CO-NH-X (ou Y) em que n = 1-10, em cada caso; R1= H, CH3, C2H5, ... CpH2p+i; R2= ch2, co-nh-ch2ch2. Q1 e Q2 podem ser iguais ou diferentes.

Por exemplo, quando Q2 = OCH2CH2 (não existe Qi neste caso); Y = -C02N (COCH2) 2; e X = -NH2, -SH, ou -OH, as reacções resultantes e os grupos Z seriam como se segue: polímero-NH2 OCH2CH2CO-polímero + polimero-0CH2CH2C02-N (COCH2) 2 (amida) -NH- polímero-SH OCH2CH2CO-polímero + polimero-0CH2CH2C02-N (COCH2) 2 (tioéster) -S- polímero-OH OCH2CH2CO-polimero + polímero-0CH2CH2C02-N (COCH2) 2 (éster) -0-

Um grupo adicional, abaixo representado como "D", pode ser inserido entre o polímero e o grupo de ligação para aumentar a degradação da composição de polímero reticulado 39

ΕΡ 2 049 165/PT in vivo, por exemplo, para uso em aplicações de administração de fármacos: polímero-D-Q-X + polímero-D-Q-Y -► polímero-D-Q-Z-Q-D-polimero-

Alguns grupos "D" biodegradáveis úteis incluem lactido, glicolido, ε-caprolactona, poli(α-hidroxiácido), poli (aminoácidos), poli (anidrido), e vários di- ou tripéptidos. A. Primeiro e Segundo Componentes com Estrutura-base Polimérica

Tal como referido anteriormente, de modo a preparar as composições do presente invento, é útil proporcionar um primeiro componente polimérico contendo dois ou mais grupos nucleofilicos, tais como grupos amino primários ou grupos tiol, e um segundo componente polimérico contendo dois ou mais grupos electrofilicos capazes de se ligaram de modo covalente com os grupos nucleofilicos do primeiro componente polimérico. O primeiro e segundo componentes poliméricos podem ser sintéticos.

Tal como utilizado com respeito ao primeiro e segundo componentes poliméricos, o termo "polímero" refere-se inter alia a polialquilos; di-, tri-, oligo-, e poliamino ácidos, e tri-, oligo-, ou polissacáridos.

Tal como utilizado com respeito ao primeiro e segundo componentes poliméricos, o termo "polímero sintético" engloba polímeros que não são de ocorrência natural e que são produzidos através de síntese química. Como tal, as proteínas que ocorrem naturalmente, tais como colagénio e polissacáridos que ocorrem naturalmente, tais como ácido hialurónico podem ser excluídos. Estão incluídos colagénio sintético, e ácido hialurónico sintético e seus derivados. Polímeros sintéticos contendo grupos nucleofilicos ou electrofilicos abrangem "polímeros sintéticos multifuncionalmente activados". O termo multifuncionalmente activado" (ou, simplesmente, "activado") pode referir-se a polímeros sintéticos que estão, ou foram quimicamente modificados para possuir, dois ou mais grupos 40

ΕΡ 2 049 165/PT nucleofίlicos ou electrofílicos que são capazes de reagir entre si (ou seja, os grupos nucleofilicos reagem com os grupos electrofilicos) para formar ligações covalentes. Tipos de polímeros sintéticos multifuncionalmente activados incluem difuncionalmente activados, tetrafuncionalmente activados, e polímeros ramificados em estrela.

Os polímeros sintéticos multifuncionalmente activados para utilização no presente invento contêm geralmente pelo menos dois, ou pelo menos três, grupos funcionais, a fim de formar uma rede tridimensional reticulada com polímeros sintéticos contendo múltiplos grupos nucleofilicos (ou seja, "polímeros multi-nucleofilicos"). Ou seja, são tipicamente pelo menos difuncionalmente activados, ou trifuncionalmente ou tetrafuncionalmente activados. Se o primeiro polímero sintético é um polímero sintético difuncionalmente activado, o segundo polímero sintético contém, tipicamente, três ou mais grupos funcionais, a fim de obter uma rede tridimensional reticulada. Tanto o primeiro como o segundo componente polimérico pode conter pelo menos três grupos funcionais. B. Primeiro Componente Polimérico

Os polímeros dos primeiros componentes contendo múltiplos grupos nucleofilicos são aqui igualmente referidos genericamente como " polímeros multi-nucleofilicos". Para utilização no presente invento, os polímeros multi-nucleof ilicos contêm geralmente pelo menos dois, ou pelo menos três, grupos nucleofilicos. Se for usado um polímero sintético contendo com apenas dois grupos nucleofilicos, será frequentemente utilizado um polímero sintético contendo três ou mais grupos electrofilicos de forma a obter uma rede tridimensional reticulada.

Os polímeros multi-nucleofilicos para utilização nas composições e métodos do presente invento incluem polímeros sintéticos que contêm, ou que tenham sido modificados para conter, múltiplos grupos nucleofilicos tais como grupos amino primários e grupos tiol. Tais polímeros multi-nucleof ilicos podem incluir: (i) polipéptidos sintéticos que tenham sido sintetizados de forma a conter dois ou mais 41 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ grupos amino primários ou grupos tiol, e (ii) polietilenoglicóis que tenham sido modificados para conter dois ou mais grupos amino primários ou grupos tiol. Em geral, a reacção de um grupo tiol com um grupo electrofilico tende a ocorrer mais lentamente do que a reacção de um grupo amino primário com um grupo electrofilico.

Os polipéptidos multi-nucleofílicos podem ser polipéptidos sintéticos que tenham sido sintetizados para incorporar aminoácidos contendo grupos amino primários (tais como lisina) e/ou aminoácidos contendo grupos tiol (tais como cisterna). Por exemplo, o primeiro componente polimérico pode ser uma dilisina, trilisina, tetralisina, pentalisina, ou uma dicisteina, tricisteina, tetracisteina, pentacisteina, ou oligopéptidos ou polipéptidos que compreendem duas ou mais lisinas ou cisternas e outros aminoácidos (por exemplo, glicina, alanina), de preferência aminoácidos não hidrofóbicos. É frequentemente utilizado poli (lisina), um polimero produzido sinteticamente a partir do aminoácido lisina (145 PM) . Foram preparadas poli (lisina)s foram preparadas tendo de 6 a cerca de 4.000 grupos amino primários, correspondendo a pesos moleculares de cerca de 870 a cerca de 580.000. Poli (lisina) s de pesos moleculares variáveis encontram-se comercialmente disponíveis a partir de Península Laboratories, Inc. (Belmont, Calif.). O polietileno-glicol pode ser quimicamente modificado de modo a conter vários grupos amino primários ou tiol de acordo com métodos estabelecidos, por exemplo, no Capítulo 22 de Poly(ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, ed, Plenum Press, NY (1992.). Polietilenoglicóis que tenham modificados para conter dois ou mais grupos amino primários são aqui referidos como "PEGs multi-amino". Polietilenoglicóis que tenham sido modificados para conter dois ou mais grupos tiol são aqui referidos como "PEGs multi-tiol". Tal como aqui utilizado, o termo "polietilenoglicol (óis)" inclui polietilenoglicol(óis) modificado (s) e ou derivatizado (s) .

Encontram-se comercialmente disponíveis várias formas de PEG multi-amino a partir de Shearwater Polymers (Huntsville, 42

ΕΡ 2 049 165/PT

Alabama) e a partir de Texaco Chemical Company (Houston, Texas), sob a denominação "Jeffamine". PEGs multi-amino úteis no presente invento incluem diaminas (série "D") e triaminas (série "T") Jeffamine da Texaco, que contêm dois e três grupos amino primários por molécula, respectivamente.

Poliaminas, tais como etilenodiamina (H2N-CH2CH2-NH2) , tetrametilenodiamina (H2N-(CH2) 4-NH2) , pentametilenodiamina, (cadaverina) (H2N-(CH2) 5-NH2) , hexametilenodiamina (H2N- (CH2) 6-NH2) , bis (2-hidroxietil) amina (HN-(CH2CH2OH) 2) , bis (2) aminoetil)amina (HN-(CH2CH2NH2)2) , e tris(2-aminoetil)amina (N-(CH2CH2NH2) 3) podem igualmente ser usadas como primeiro componente polimérico sintético contendo múltiplos grupos nucleofilicos. C. Segundo Componente Polimérico

Polímeros do segundo componente contendo múltiplos grupos electrofilicos são também aqui referidos como "polímeros multi-electrofilicos". Para utilização no presente invento, os polímeros multi-electrofilicos geralmente contêm pelo menos dois, ou pelo menos três, grupos electrofilicos, a fim de formar uma rede tridimensional reticulada com polímeros multi-nucleofilicos.

Os polímeros multi-electrofilicos para utilização nas composições do invento podem ser polímeros que contêm dois ou mais grupos succinimidilo capazes de formar ligações covalentes com grupos nucleofilicos de outras moléculas. Os grupos succinimidilo são altamente reactivos com materiais contendo grupos amino primário (-NH2) , tais como PEG multi-amino, poli(lisina), ou colagénio. Os grupos succinimidilo são ligeiramente menos reactivos com materiais contendo grupos tiol (-SH), tais como PEG multi-tiol ou polipéptidos sintéticos contendo múltiplos resíduos de cisteína.

Tal como aqui utilizado, o termo "contendo dois ou mais grupos succinimidilo" significa que abrange polímeros que se encontram comercialmente disponíveis contendo dois ou mais grupos succinimidilo, bem como aqueles que são quimicamente derivatizados para conter dois ou mais grupos succinimidilo. Tal como aqui utilizado, o termo "grupo succinimidilo" 43

ΕΡ 2 049 165/PT pretende incluir grupos sulfosuccinimidilo e outras variações tais do grupo "genérico" succinimidilo. A presença do fragmento sulfito de sódio no grupo sulfosuccinimidilo serve para aumentar a solubilidade do polimero. D. Polímeros Hidrofílicos para Uso como Estruturas-Bases de Primeiro ou Segundo Componente

Podem ser usados polímeros hidrófilos e, em particular, diversos polietilenoglicóis, nas estruturas-base do primeiro e segundo componente polimérico de acordo com algumas concretizações do presente invento. Tal como aqui utilizado, o termo "PEG" engloba polímeros possuindo a estrutura de repetição (OCH2CH2)n.

Uma estrutura para uma forma tetrafuncionalmente activada de PEG encontra-se representada na FIG. 3, dado ser um produto da reacção generalizado obtido por reacção de um PEG tetrafuncionalmente activado com um PEG multi-amino. Tal como representado na figura, o grupo succinimidilo é uma estrutura em anel de cinco membros representada como-N (COCH2)2. Na FIG. 3, o símbolo ΛΛΛ representa uma ligação aberta.

Concretizações incluem a reacção de glutarato de succinimidilo de PEG tetrafuncionalmente activado, aqui referido como SG-PEG, com PEG multi-amino, e o produto da reacção assim obtido. Outra forma activada de PEG é referida como propionato de succinimidilo de PEG (SE-PEG). Concretizações incluem SE-PEG tetrafuncionalmente activado e o produto da reacção obtido por reacção com PEG multi-amino. Em algumas concretizações, existem três grupos CH2 que se repetem em ambos os lados do PEG. Outras concretizações abrangem um conjugado que compreende uma ligação "éter" que é menos sujeita a hidrólise. Isto é distinto do conjugado representado na FIG. 3, em que é proporcionada uma ligação éster. A ligação éster encontra-se sujeita a hidrólise em condições fisiológicas. Outros formas funcionalmente activadas de polietilenoglicol são contempladas por concretizações do presente invento, tal como o são os conjugados formados por reacção de PEGs tetrafuncionalmente activados com um PEG multi-amino. Em algumas concretizações, 44 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ um conjugado inclui tanto uma ligação éter como uma ligação amida. Estas ligações são estáveis sob condições fisiológicas.

Outra forma de PEG funcionalmente activada é referida como succinamida de succinimidilo de PEG (SSA-PEG). Concretizações incluem a forma tetrafuncionalmente activada deste composto e do produto da reacção obtido por reacção com PEG multi-amino. Estes compostos e compostos relacionados podem também ser utilizados em composições de acordo com concretizações do invento. Concretizações também englobam um conjugado que inclui uma ligação "amida" a qual, tal como a ligação éter anteriormente descrita, é menos sujeita a hidrólise e é, portanto, mais estável do que uma ligação éster. Ainda outra forma activada de PEG é proporcionada num composto concretização referido como carbonato de succinimidilo de PEG de (SC-PEG). Concretizações incluem SC-PEG tetrafuncionalmente activado e o conjugado formado por reacção com PEG multi-amino.

Tal como anteriormente discutido, os derivados de polietilenoglicol activados para uso em concretizações do invento podem conter grupos succinimidilo como grupo reactivo. Contudo, podem ser ligados grupos de activação diferentes em zonas ao longo do comprimento da molécula de PEG. Por exemplo, o PEG pode ser derivatizado para formar o aldeido propion PEG (A-PEG) funcionalmente activado. As concretizações englobam a forma tetrafuncionalmente activada, bem como o conjugado formado pela reacção de A-PEG com PEG multi-amino. A ligação pode ser referida como uma ligação -(CH2)m“NH-, em que m = 1-10.

Ainda outra forma de polietilenoglicol activado é éter de glicidilo de PEG (E-PEG) funcionalmente activado. Concretizações englobam o composto tetrafuncionalmente activado, bem como o conjugado formado por reacção do mesmo com PEG multi-amino. Outro derivado activado de polietilenoglicol é PEG-isocianato (I-PEG) funcionalmente activado. As concretizações incluem o conjugado formado por reacção do mesmo com PEG multi-amino. Outro derivado activado de polietileno-glicol é PEG-vinilsulfona (V-PEG) funcionalmente activado. As concretizações incluem o conjugado formado por reacção do mesmo com PEG multi-amino. 45 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ

Polietilenoglicóis multifuncionalmente activados para uso em composições e outras concretizações do presente invento podem incluir polietilenoglicóis contendo grupos succinimidilo, tais como SG-PEG e SE-PEG, os quais podem estar nas formas trifuncionalmente ou tetrafuncionalmente activadas. Muitas das formas activadas de polietilenoglicol anteriormente descritas estão agora disponíveis comercialmente a partir de Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama, e pela Union Carbide, South Charleston, W.Va. E. Derivatização do Primeiro e Segundo Componentes Poliméricos para Conter Grupos Funcionais

Determinados polímeros, tal como os poliácidos, podem ser derivatizados de modo a conter dois ou mais grupos funcionais, tais como grupos succinimidilo. Poliácidos para uso no presente invento incluem, sem limitação, ácido tricarboxílico à base de trimetilolpropano, ácido tetracarboxílico à base de di(trimetilolpropano), ácido heptanodióico, ácido octanodióico (ácido subérico), e ácido hexadecanodióico (ácido tapsico). Muitos destes poliácidos estão comercialmente disponíveis a partir de DuPont Chemical Company.

De acordo com um método geral, os poliácidos podem ser quimicamente derivatizados para conter dois ou mais grupos succinimidilo através de reacção com uma quantidade molar apropriada de N-hidroxissuccinimida (NHS), na presença de N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC).

Os poliálcoois, tais como trimetilolpropano e di(trimetilolpropano) podem ser convertidos na forma de ácido carboxílico usando vários métodos, sendo posteriormente derivatizados através de reacção com NHS, na presença de DCC para produzir polímeros trifuncionalmente e tetrafuncionalmente activados, respectivamente, tal como descrito no pedido U.S. Ser. N°. 08/403, 358. Poliácidos, tais como ácido heptanodióico (HOOC-(CH2) 2-COOH) , ácido octanodióico (HOOC-(CH2) 2-COOH) e ácido hexadecanodióico (HOOC-(CH2) 14-COOH) são derivatizados através de adição de grupos succinimidilo para produzir polímeros difuncionalmente activados.

ΕΡ 2 049 165/PT 4 β

As poliaminas, tais como etilenodiamina (H2N-CH2CH2-NH2) , tetrametilenodiamina (H2N-(CH2) 4-NH2) , pentametilenediamina (cadaverina) (H2N- (CH2) 5-NH2) , hexametilenodiamina (H2N- (CH2) 6-NH2) , bis (2-hidroxietil) amina (HN- (CH2CH2OH) 2) , bis (2-aminoetil)amina (HN-(CH2CH2NH2)2) , e tris(2-aminoetil)amina (N- (CH2CH2NH2) 3) , podem ser quimicamente derivatizadas em poliácidos, os quais podem posteriormente ser derivatizados para conter dois ou mais grupos succinimidilo através de reacção com as quantidades molares apropriadas de N-hidroxissuccinimida, na presença de DCC, tal como descrito no pedido U.S. Ser. N° 08/403,358. Muitas destas poliaminas estão comercialmente disponíveis a partir de DuPont Chemical Company.

Em algumas concretizações, um primeiro componente reticulável (por exemplo, PEG multi-amino) encontra-se presente numa concentração na gama de 0,5 a 20 por cento em peso da composição total de componente reticulável, e um segundo componente reticulável encontra-se presente numa concentração na gama de 0,5 a 20 por cento em peso da composição total de componente reticulável. Por exemplo, uma composição de componente reticulável final com um peso total de 1 grama (1000 miligramas) pode conter entre cerca de 5 a cerca de 200 miligramas do primeiro componente reticulável (PEG multi-amino, por exemplo), e entre 5-200 miligramas do segundo componente reticulável.

Em algumas concretizações, a proporção em peso do primeiro componente reticulável em relação ao segundo componente reticulável encontra-se na gama de 20% a 80%. Em concretizações relacionadas, esta proporção encontra-se na gama de 45% a 55%. Em alguns casos, a proporção é de cerca de 50%. A proporção em peso é determinada com base num teste de resistência do gel. O primeiro componente reticulável e o segundo componente reticulável podem ter o mesmo peso molecular. II. Componentes Formadores de Hidrogel para Utilização na Composição de Matriz Selante

Os componentes formadores de hidrogel para utilização de acordo com o presente invento podem incluir géis e hidrogéis 47 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ reticulados moleculares biocompatíveis e reabsorvíveis tal como discutido em Patentes U.S. N°s. 4,640,834; 5,209,776; 5,292,362; 5,714,370; 6,063,061; e 6,066,325. Os materiais fabricados pelas técnicas descritas nestas patentes encontram-se comercialmente disponíveis sob a marca registada FLOSEAL a partir do Healthcare Baxter Corporation, num kit para mistura com solução de trombina para utilização como agente hemostático. Em alternativa, podem ser utilizados quaisquer polímeros reticulados hidratáveis como componentes formadores de hidrogel no invento. Por exemplo, alginatos, agaroses, gelatinas (por exemplo, SURGIFOAMmr em pó) , ou podem ser utilizados outros polímeros reticulados sintéticos, de hidratos de carbono, ou à base de proteínas hidratáveis. As principais características dos componentes formadores de hidrogel úteis são a biocompatibilidade, absorção rápida e retenção de fluido. Deste modo, apesar da poliacrilamida poder ser utilizada como um componente formador de hidrogel na invenção, seria menos preferido devido à sua fraca biocompatibilidade em muitas aplicações internas. Muitas vezes, os polímeros reticulados hidratáveis para utilização como componente formador de hidrogel têm um tamanho de partícula de 70 a 300 microns, e um pH de 6,8 a 9,5. Os componentes formadores de hidrogel podem proporcionar estabilidade mecânica ao primeiro e segundo componentes reticuláveis, particularmente quando uma matriz selante é sujeito a forças, pressões ou diluições.

Em algumas concretizações, a proporção em peso entre o primeiro e segundo componentes reticuláveis e o componente formador de hidrogel, encontra-se na gama de 28% a 42% p/p. Em alguns casos, a composição pode conter uma concentração de primeiro e segundo componentes reticuláveis combinados que é de 5% a 75% da massa total da composição, e uma concentração de componente formador de hidrogel que é de 95% a 25% da massa total da composição. De um modo semelhante, a composição pode conter uma concentração de primeiro e segundo componentes reticuláveis combinados que é de 5% a 40% da massa total da composição, e uma concentração de componente formador de hidrogel que é de 95% a 60% da massa total da composição. Do mesmo modo, a composição pode conter uma concentração de primeiro e segundo componentes reticuláveis combinados que é 10% a 30% da massa total da 48 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ composição, e uma concentração de componente formador de hidrogel que é de 90% a 70% da massa total da composição.

Por exemplo, a composição pode conter cerca de 20% de primeiro e segundo componentes reticuláveis combinados, e cerca de 80% de componente formador de hidrogel. Em algumas concretizações, a composição de primeiro e segundo componentes reticuláveis combinados pode ter uma proporção de peso fixa de 50:50%, e a razão de p/p da composição de primeiro e segundo componentes reticuláveis combinados em relação ao componente formador de hidrogel pode encontrar-se na gama de 20% a 30%. A razão de p/p da composição de primeiro e segundo componentes reticuláveis combinados em relação ao componente formador de hidrogel pode ser seleccionada com base num teste de de resistência/aderência de gel. O componente formador de hidrogel pode actuar como absorvente para proporcionar uma superfície semi-seca para o primeiro e segundo componentes reticuláveis polimerizarem.

As concretizações do presente invento englobam kits de composição de matriz selante secos que incluem componentes reticuláveis e componentes formadores de hidrogel em quantidades de acordo com estas proporções.

De acordo com algumas concretizações, o termo "biocompatível" diz respeito a materiais que atendem aos critérios da norma #ISO 10993-1 promulgada pela Organização Internacional de Normalização (NAMSA, Northwood, Ohio). De acordo com algumas concretizações, o termo "reabsorvível" refere-se a composições que degradam ou solubilizam, quando colocadas directamente num local alvo no corpo de um paciente (e não protegido dentro de um dispositivo de implante tal como um implante da mama), durante um periodo de tempo de inferior a um ano, usualmente de 1 a 120 dias. Os protocolos para medição da reabsorção e degradação são conhecidos. De acordo com algumas concretizações, o termo "reticulado molecular" diz respeito a materiais que incluem moléculas de polímero (ou seja, cadeias individuais) que estão ligadas por pontes constituídas quer por um elemento, um grupo, ou um composto, em que os átomos da estrutura-base das moléculas de polímero são unidos por ligações químicas primárias. A reticulação pode ser realizada de uma variedade de modos, tal como será adiante descrito em maior detalhe. 49 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ

De acordo com algumas concretizações, o termo "hidrogel" abrange composições que incluem um colóide aquoso de fase única em que um polímero biológico ou não biológico, tal como adiante definido em maior detalhe, absorve a água ou um tampão aquoso. Um hidrogel pode compreender múltiplas sub-redes, em que cada sub-rede é um hidrogel reticulado molecular tendo dimensões que dependem do grau de hidratação e estão dentro das gamas estabelecidas acima. Muitas vezes, os hidrogéis terão pouca ou nenhuma água livre, ou seja, a água não pode ser removida a partir do hidrogel através de filtração simples. "Percentagem de expansão" pode ser definido como o peso seco subtraído do peso húmido, dividido pelo peso em seco e multiplicado por 100, onde o peso húmido é medido após um agente molhante ter sido removido, tão completamente quanto possível a partir do exterior do material, por exemplo, através de filtração, e em que o peso seco é medido após a exposição a uma temperatura elevada durante um tempo suficiente para evaporar o agente molhante, por exemplo, 2 horas a 120°C. "Expansibilidade de Equilíbrio" pode ser definida como a percentagem de expansão no estado de equilíbrio após o material polimérico reticulado hidratável ter sido imerso num agente molhante, durante um período de tempo suficiente para o teor de água se tornar constante, tipicamente 18 a 24 horas. "Local alvo" é normalmente o local em que a composição de matriz selante deve ser administrada, usualmente uma ruptura ou defeito no tecido. Frequentemente, o local alvo será a localização de interesse no tecido, mas em alguns casos, a composição da matriz selante pode ser administrada ou dispensada num local perto do local de interesse, por exemplo, quando o material expande in situ para cobrir o local de interesse.

Os polímeros reticulados hidratáveis para uso como componentes formadores de hidrogel em pelo menos algumas concretizações do presente invento, pode ser formados a partir de polímeros biológicos e não biológicos. Polímeros 50 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ biológicos adequados incluem proteínas, tais como gelatina, colagénio solúvel, albumina, hemoglobina, caseína, fibrinogénio, fibrina, fibronectina, elastina, queratina, laminina, e seus derivados e suas combinações. O colagénio fibrilar não-solúvel é similarmente adequado. Exemplos de formulações de gelatina encontram-se abaixo indicados. Outros polímeros biológicos adequados incluem polissacáridos, tais como os glicosaminoglicanos (por exemplo, ácido hialurónico e sulfato de condroitina), derivados de amido, xilano, derivados de celulose, derivados de hemicelulose, agarose, alginato, quitosano e seus derivados e suas combinações. Polímeros não biológicos adequados podem ser seleccionados para ser degradáveis por um de dois mecanismos, ou seja, (1) quebra da estrutura-base polimérica ou (2) degradação das cadeias laterais que resultam em solubilidade aquosa. Exemplos de polímeros não biológicos incluem materiais sintéticos, tais como poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilamidas, resinas de polivinilo, polilactido-glicolidos, policaprolactonas e polioxietilenos, e seus derivados e suas combinações.

As moléculas de polímero reticulado hidratável para utilização como componentes formadores de hidrogel podem ser reticulados de qualquer modo adequada para formar um hidrogel aquoso. Por exemplo, essas moléculas poliméricas podem ser reticuladas utilizando agentes de reticulação bi-ou poli-funcionais que se ligam de modo covalente a duas ou mais cadeias moleculares de polímero. Exemplos de agentes de reticulação bifuncionais incluem aldeídos, epóxidos, succinimidas, carbodiimidas, maleimidas, azidas, carbonatos, isocianatos, divinil sulfona, álcoois, aminas, imidatos, anidridos, halogenetos, silanos, diazoacetato e aziridinas e similares. Alternativamente, a reticulação pode ser alcançada usando oxidantes e outros agentes, tais como periodatos, os quais activam as cadeias laterais ou fragmentos no polímero de modo a que estes possam reagir com outras cadeias laterais ou fragmentos para formar as ligações de reticulação. Um método adicional de reticulação compreende expor os polímeros à radiação, tal como radiação gama, para activar a cadeia lateral do polímero de modo a permitir reacções de reticulação. São igualmente adequados os métodos de reticulação desidrotérmico. A reticulação 51 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ desidrotérmica de gelatina pode ser alcançada mantendo-a a uma temperatura elevada, tipicamente 120°C, durante um periodo de pelo menos 8 horas. Aumentar a extensão da reticulação, tal como manifestado pelo declinio da percentagem de expansão no equilíbrio, pode ser conseguido através de elevação da temperatura de retenção, prolongamento da duração do tempo de retenção, ou uma combinação de ambos. Operar sob pressão reduzida pode acelerar a reacção de reticulação. Os métodos preferidos para a reticulação de moléculas de gelatina são adiante descritos.

Os hidrogéis podem incluir um plastificante para aumentar a maleabilidade, flexibilidade, e a taxa de degradação do hidrogel. O plastificante pode ser um álcool, tal como polietilenoglicol, sorbitol ou glicerol.

Frequentemente, o plastificante será polietilenoglicol com um peso molecular variando entre 200 e 1000 D, ou com um peso molecular de cerca de 400D. Os plastificantes podem estar presentes no hidrogel desde 0,1% em peso a 30% em peso, de preferência de 1% em peso a 5% em peso da composição de polímero. Os plastificantes podem ser particularmente benéficos para uso com hidrogéis possuindo um alto teor em sólidos, tipicamente acima de 10% em peso da composição (sem plastificante).

Exemplos de métodos para a produção gelatinas reticulares moleculares são como se segue. A gelatina é obtida e colocada num tampão aquoso para formar um gel não-reticulado, tendo tipicamente um teor de sólidos de 1% a 70% em peso, ou de 3% a 10% em peso. A gelatina é reticulada, tipicamente através de exposição glutaraldeído (por exemplo 0,01% a 0,05% p/p, de um dia para o outro a 0°C a 15°C em tampão aquoso), periodato de sódio (por exemplo 0,05M, mantido de 0°C a 8°C durante 48 horas) ou l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida ("EDC") (por exemplo, de 0,5% a 1,5% p/p, de um dia para o outro à temperatura ambiente), ou por exposição a cerca de 0,3 a 3 megarads de radiação gama ou de feixe de electrões. Em alternativa, as partículas de gelatina podem ser suspensas num álcool, tal como álcool metílico ou álcool etílico, a um teor de sólidos de 1% a 70% em peso, ou 3% a 10% em peso, e reticuladas por 52

ΕΡ 2 049 165/PT exposição agente de reticulação, tipicamente glutaraldeido (por exemplo, de 0,01% a 0,1% p/p, até ao dia seguinte à temperatura ambiente) . No caso dos aldeidos, o pH é tipicamente mantido desde cerca de 6 a cerca de 11, ou de 7 a 10. Quando se reticula com glutaraldeido, as reticulações são formadas através de bases de Schiff que podem ser estabilizadas por subsequente redução, por exemplo, através de tratamento com boro-hidreto de sódio. Após reticulação, os grânulos resultantes podem ser lavados em água e, opcionalmente, enxaguados num álcool, secos e ressupendidos até um grau desejado de hidratação num meio aquoso com tampão e pH pretendidos. Os hidrogéis resultantes podem posteriormente ser carregados nos aplicadores do presente invento, conforme descrito em maior detalhe a seguir. Em alternativa, os hidrogéis podem ser mecanicamente fragmentados antes ou depois da reticulação, também tal como adiante descrito em maior detalhe.

Exemplos de métodos para a produção de composições de gelatina reticulada molecular com percentagens de expansão na gama de 400% a 1300%, ou de 600% a 950%, são tal como se segue. A gelatina é obtida e colocada num tampão aquoso (tipicamente a um pH de 6 a 17, ou a um pH entre 7 e 10) contendo um agente de reticulação em solução (frequentemente glutaraldeido, tipicamente a uma concentração de 0,01% a 0,1% p/p) para formar um gel, tendo tipicamente um teor de sólidos de 1% a 70%, em peso, usualmente de 3% a 10% em peso. O gel é bem misturado e mantido de um dia para o outro de 0o a 15°C à medida que a reticulação ocorre. É posteriormente lavado três vezes com água desionizada, duas vezes com um álcool (de preferência álcool metilico, álcool etílico, ou álcool isopropílico) e deixado a secar à temperatura ambiente. Opcionalmente, o gel pode ser tratado com borohidreto de sódio para estabilizar ainda mais a reticulação. Em alguns casos, o componente formador de hidrogel pode incluir uma gelatina com, por exemplo, um grande número de resíduos glicina (por exemplo 1 em 3 dispostos em cada terceiro resíduo), resíduos de prolina e resíduos de 4-hidroxiprolina. Um exemplo de subunidade gelatina é apresentado na FIG. 5. Concretizações da gelatina incluem moléculas possuindo uma composição em aminoácidos de: glicina 21%, prolina 12%, hidroxiprolina 12%, ácido 53

ΕΡ 2 049 165/PT glutâmico 10%, alanina 9%, arginina, 8%, ácido aspártico 6%, lisina 4%, serina 4%, leucina 3%, valina, 2%, fenilalanina, 2%, treonina, 2%, isoleucina 1%, hidroxilisina 1%, metionina e histidina <1% e tirosina <0,5%. A FIG.6 ilustra a correlação entre a percentagem de expansão e a percentagem de sólidos de uma concretização de um gel polimérico reticulado fragmentado útil como componente formador de hidrogel numa composição selante.

Os hidrogéis reticulados moleculares são de preferência mecanicamente fragmentados num processo descontinuo antes do uso como componente formador de hidrogel. O objectivo principal deste passo de ruptura mecânica é o de criar múltiplas subunidades de hidrogel possuindo um tamanho que aumenta a capacidade para encher e acondicionar o espaço ao qual ele está adicionado. Sem ruptura mecânica, os hidrogéis reticulados moleculares terão dificuldade em adaptar-se e preencher os espaços alvo de forma irregular que estão a ser tratados. Ao fragmentar o hidrogel em sub-unidades menores, tais espaços podem ser preenchidos muito mais eficientemente, mantendo a integridade mecânica e persistência do hidrogel reticulado. A reticulação molecular das cadeias poliméricas do hidrogel pode ser realizada antes ou após a sua fragmentação mecânica. Os hidrogéis podem ser mecanicamente fragmentados em operações descontinuas, tal como mistura, desde que a composição de hidrogel seja dividida em sub-unidades com um tamanho na gama anteriormente estabelecida de 0,01 mm a 5,0 mm. Outros processos descontínuos de fragmentação mecânica incluem bombeamento através de um homogeneizador ou misturador ou através de uma bomba que comprime, estica ou corta o hidrogel para um nível que excede o limite de elasticidade de fragmentação do hidrogel. Em alguns casos, a extrusão da composição polimérica faz com que o hidrogel seja convertido de uma rede substancialmente contínua, ou seja, uma rede que abarca as dimensões da massa original do hidrogel, num conjunto de sub-redes ou sub-unidades com dimensões nas gamas acima estabelecidas.

Numa concretização actualmente preferida, o polímero reticulado hidratável pode ser inicialmente preparado (por 54

ΕΡ 2 049 165/PT exemplo, através de secagem por pulverização) e/ou ser mecanicamente fragmentado antes de ser reticulado, muitas vezes normalmente antes da hidratação, para formar um hidrogel. O polímero reticulado hidratável pode ser proporcionado sob a forma de sólido seco finamente dividido ou em pó o qual pode ser fragmentado por cominuição adicional para proporcionar partículas com uma dimensão pretendida, sendo normalmente estreitamente confinadas em gama apertada. Pode também ser ainda levada a cabo a selecção de dimensões e os passos de modificação, tal como peneiração, classificação por ciclone, etc, . Para os materiais de gelatina adiante exemplificados, o tamanho de partícula seca encontra-se de preferência no intervalo de 0,01 mm a 1,5 mm, mais preferencialmente de 0,05 mm a 1,0 mm. Um exemplo de distribuição de tamanho de partícula será um em que cerca de 95% em peso das partículas estejam na gama de 0,05 mm a 0,7 mm. Métodos para cominuição do material polimérico de partida incluem homogeneização, trituração, coacervação, moagem, moagem por jacto, e similares. Os materiais poliméricos de partida em pó podem igualmente ser formados através de secagem por pulverização. A distribuição de tamanho de partícula pode ser ainda mais controlada e refinada através de técnicas convencionais tais como peneiração, agregação, nova moagem, e similares. O sólido seco em pó pode ser posteriormente suspenso num tampão aquoso, tal como descrito algures neste documento, e reticulado. Em outros casos, o polímero reticulado hidratável pode ser suspenso num tampão aquoso, reticulado, e posteriormente seco. O polímero reticulado e seco pode posteriormente ser fragmentado, e o material fragmentado ser subsequentemente ressuspendido num tampão aquoso. Em todos os casos, o material resultante compreende um hidrogel reticulado possuindo sub-redes discretas, com as dimensões acima estabelecidas.

Os polímeros reticulados hidratáveis úteis como componentes formadores de hidrogel, após fragmentação mecânica, serão tipicamente reabsorvíveis, ou seja, irão biodegradar-se no corpo do paciente, durante um período inferior a um ano, usualmente de 1 a 120 dias, preferencialmente entre 1 a 90 dias, e mais 55

ΕΡ 2 049 165/PT preferencialmente de 2 a 30 dias após a sua aplicação inicial. São conhecidas as técnicas para medir o intervalo de tempo necessário para a reabsorção. III. Preparação e Uso de Um Grupo de Concretizações das Composições de Matriz Selantes: Combinação de Matriz Porosa e Polímero Reticulado Hidratável

As composições de acordo com o presente invento compreendem um primeiro componente reticulável combinado com um segundo componente reticulável os quais são capazes de reticular para formar uma matriz porosa com interstícios, a qual é combinado com um polímero reticulado hidratável que é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos interstícios. E de assinalar que as composições do presente invento podem ser usadas para uma variedade de aplicações biomédicas, incluindo cada uma das aplicações acima discutidas com referência à alteração de (1) o primeiro e segundo componentes (ou seja a matriz porosa), e (2) o polímero reticulado hidratável. Por exemplo, tais composições podem actuar como um selante mecânico para parar ou inibir hemorragia através da formação de uma barreira física em relação ao sangue. Em conformidade, algumas concretizações do presente invento podem proporcionar resultados sem um efeito "hemostático" directo (por exemplo, efeito bioquímico em cascata de coagulação; envolvendo iniciadores de coagulação). O componente formador de hidrogel pode servir como absorvente (por exemplo, para o sangue e outros fluidos e tecidos). Ao absorver sangue, o componente formador de hidrogel pode garantir que uma concentração mais elevada do primeiros e segundo componentes reticuláveis é mantida na área de tratamento, e pode garantir que é proporcionada uma superfície semi-seca para o primeiro e segundo componentes reticuláveis para reticularem entre si e para os tecidos circundantes. Em algumas concretizações, o primeiro e segundo componentes podem reticular ao mesmo tempo que o componente formador de hidrogel absorve sangue. Esta absorção e reticulação podem ocorrer em segundos, e a barreira matriz selante resultante pode alcançar a máxima força em 30 minutos a uma hora. 56 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ

Geralmente, as composições de matriz selante são "secas", embora algum teor minimo de humidade possa estar presente, por exemplo, no componente formador de hidrogel. Em alguns casos, é possível pré-hidratar parcialmente o polímero reticulável hidratável antes da aplicação, embora possa ser necessário fazê-lo a um pH mais elevado do que o pH fisiológico, ou sob outras condições que evitará que o primeiro e segundo componentes de reticularem antes da aplicação no local alvo. Frequentemente, as composições de matriz selante estarão na forma de pó ou pasta fundida.

As concentrações do primeiro componente e do segundo componente utilizadas para preparar as composições de matriz selante podem variar dependendo de uma série de factores, incluindo os tipos e pesos moleculares dos componentes reticuláveis utilizados em particular e da aplicação de uso final pretendida. Em algumas concretizações, a proporção em peso do primeiro e segundo componentes em relação ao componente formador de hidrogel varia de 10- 50% p/p, 15-45% p/p, 20-42% p/p, 30-40% p/p e 28 a 42% p/p. Em algumas concretizações, os tamanhos de partícula do primeiro e segundo polímeros podem variar desde 50 a 90 microns. Em algumas concretizações, tamanhos de partículas para o polímero reticulado hidratável pode variar de cerca de 250 a cerca de 400 microns.

Em algumas concretizações, o primeiro e segundo componentes podem ser proporcionados sob a forma de partículas secas ou em pó. Nesta forma o primeiro e segundo componentes podem ser misturados em conjunto, e posteriormente podem ser misturados com o componente formador de hidrogel, igualmente na forma de partículas secas ou em pó. Ά mistura dos componentes pode ser obtida por quaisquer meios de mistura mecânicos, tais como mistura com lâmina de moagem. A composição da matriz selante em pó seco resultante pode posteriormente ser acondicionada em vários recipientes, por exemplo, caixas de cartão, envelopes, frascos, e similares. A mistura e enchimento podem ser realizados em condições assépticas, ou a composição da matriz selante pode ser esterilizada após embalagem, por exemplo, através de radiação gama. As 57 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ concretizações de pó seco do invento estão então prontas para utilização. O primeiro e segundo polímeros reticuláveis irão reagir para reticular sob condições fisiológicas (por exemplo, pH do sangue) e de modo que a composição de matriz selante de três componentes da composição pode ser aplicada directamente no local desejado na forma seca para selar um defeito no tecido, desde que esteja presente suficiente fluido corporal hidratante. Deste modo, a composição de matriz selante em pó pode ser simplesmente vertida sobre e para dentro do local alvo com defeito em tecido, e mantida no lugar (por exemplo, com uma compressa de gaze ou luva cirúrgica) até que se forme a barreira de matriz selante. Isto é particularmente útil e conveniente, em situações de trauma (por exemplo, num conjunto de emergência ou em campo de batalha) onde são desejáveis produtos prontos a usar que possam ser utilizados para várias dimensões de defeito em tecido.

Em outras concretizações, o primeiro e segundo componentes e o componente formador de hidrogel podem ser imobilizados sobre um suporte, ou apoio, formando um "bloco de matriz selante". Nestas concretizações, é proporcionado um suporte, tal como uma esponja de colagénio, e, em seguida, a composição da matriz selante é fixada sobre o suporte para uso. Dado que as composições de matriz selantes se ligam facilmente com tecidos, materiais orgânicos e materiais sintéticos, estas concretizações podem ser vantajosas na medida em que podem ser utilizados em suportes mais facilmente manipuláveis para aplicar a composição de matriz selante. Devido ao facto de ser necessária uma quantidade relativamente pequena de composição para criar uma barreira de matriz selante eficaz, pode ser fixada ao suporte um bloco relativamente fino de composição da matriz selante. Por exemplo, nos exemplos apresentados abaixo, apenas 0,5-1,0 g de composição de matriz selante fixada na superfície criaram um bloco de 3 cm x 3 cm com muito boas propriedades hemostáticas. Tal como será entendido pelos peritos nas técnicas cirúrgicas, estas concretizações são desejáveis em situações em que o tamanho do defeito no tecido é antecipado, e quando são pretendidas características de manuseamento melhoradas, em comparação com um pó. Tal como as concretizações em pó seco, as 58 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ concretizações de bloco de matriz selante das composições de matriz selante podem ser aplicadas directamente no defeito do tecido sem mais preparações pressionando o lado da composição de matriz selante do bloco em contacto com o defeito no tecido até os componentes reticuláveis reticularem. O suporte para as concretizações de bloco de matriz selante do invento podem ser em qualquer material biocompativel. Apesar de os suportes de colagénio serem descritas em pormenor, podem ser usados outros materiais para suportes. Por exemplo, pode ser usado outro material de suporte em proteína ou polissacárido que são biocompatíveis. Estes materiais de suporte podem degradar-se a aproximadamente a mesma taxa in vivo que a barreira de matriz selante, ou podem degradar a taxas diferentes em relação à barreira de matriz selante. As esponjas de colagénio e sua preparação são bem conhecidos nas técnicas cirúrgicas, e a preparação e manuseamento de colagénio são descritos detalhadamente abaixo. Da mesma forma, podem ser usadas esponjas preparadas a partir de fibrina. Podem igualmente ser usados materiais à base de hidratos de carbono tais como celulose (para aplicações externas) ou quitosano. Além disso, podem ser usados polímeros sintéticos biocompatíveis e biodegradáveis. Os peritos nas técnicas cirúrgicas irão reconhecer que podem ser utilizadas outras formas de esponjas para suportes nas concretizações de bloco de matriz selante do invento. Por exemplo, podem ser usados uma folha ou película de colagénio ou outros materiais. Além disso, o suporte pode tomar qualquer forma útil, tais como cones, hemisférios, varetas, calços e similares, a fim de proporcionar um bloco que será mais aproximado à forma do defeito no tecido. Por exemplo, um bloco de matriz selante que utiliza uma esponja de colagénio em forma de cone como suporte pode ser útil no tratamento de uma ferida de bala.

Tipicamente, tais suportes irão actuar como componente estrutural ou mecânico. Os suportes podem ter um determinado grau de porosidade, de modo a permitir que sangue ou outros líquidos se infiltrem no suporte e tenham maior contacto com as composições. Tais construções podem ter um factor expansibilidade de l,3x a l,5x e, desse modo, podem ser 59 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ ideias para aplicações cirúrgicas. Por exemplo, as composições em suporte de esponja podem ser utilizadas em neurocirurgia para selagem de dura-máter, onde a expansão excessiva pode colocar pressão indesejada sobre o cérebro. Em geral, os suportes devem ser suficientemente flexiveis para se moldarem a um defeito em tecido típico, e devem possuir boas propriedades de manuseamento, no contexto cirúrgico.

As composições de matriz selante podem ser imobilizadas sobre o suporte através de uma variedade de meios. Em algumas concretizações adiante descritas, é suficiente calor suave para imobilizar composições de matriz selantes em pó contendo primeiro e segundo componentes de PEG com 4 ramificações, e um componente formador de hidrogel de gelatina reticulada. Nestas concretizações, a composição da matriz selante em pó foi colocada sobre uma esponja de colagénio, e aquecida a 60-70°C durante cerca de 1-2 minutos. A matriz de pó seco fundiu ligeiramente com esse calor, fixando-a à superfície da esponja de colagénio. Em alternativa, a composição da matriz selante pode ser fixada ao suporte através de agentes de ligação, ou outros excipientes conhecidos nas técnicas farmacêuticas. Em geral, a técnica utilizada para fixar a composição da matriz selante no suporte irá depender do primeiro e segundo componentes e do componente formador de hidrogel da composição de matriz selante. O método utilizado para fixar a composição de matriz selante sobre o suporte não deverá diminuir de modo apreciável a capacidade do primeiro e segundo componentes para reticular quando expostos a condições fisiológicas, ou a capacidade do componente formador de hidrogel para absorver fluidos biológicos.

Em outras concretizações, a composição de matriz selante pode ser formada numa folha ou película sem um suporte. Tal formação da composição de matriz selante pode ser conseguida utilizando os métodos descritos acima para a fixação de uma composição de matriz selante num suporte nas concretizações de bloco de matriz selante. 60

ΕΡ 2 049 165/PT IV. Adição de Componentes Adicionais na Composição da Matriz Selante

Em concretizações adicionais do presente invento, podem ser adicionados componentes diferentes do primeiro e segundo componentes reticuláveis e componente formador de hidrogel, às composições de matriz selante do presente invento. Em geral, estes componentes adicionais podem ser misturados com o primeiro e segundo componentes e componente formador de hidrogel em forma seca. Os componentes adicionais podem adicionar maior resistência mecânica ou por outro lado melhorar o desempenho das composições de matriz selante do presente invento em aplicações específicas. Por exemplo, dado ser opaco e menos pegajoso do que o colagénio não fibrilar, o colagénio fibrilar pode por vezes ser menos preferido para utilização em composições bioadesivas. No entanto, conforme divulgado na patente U.S. N° 5,614,587, o colagénio fibrilar, ou misturas de colagénio fibrilar e não fibrilar, podem ser preferidos para utilização em composições adesivas destinadas a persistência in vivo de longo prazo. Vários derivados de glicosaminoglicano desacetilados e/ou dessulfatados podem ser incorporados na composição de um modo semelhante ao acima descrito em relação ao colagénio.

As proteínas de origem natural, tal como o colagénio, e derivados de vários polissacáridos de origem natural, tais como os glicosaminoglicanos, podem ser incorporados na barreira de matriz selante quando o primeiro e segundo componentes do invento reagem sob condições fisiológicas para reticular. Quando estes outros componentes contêm também grupos funcionais que irão reagir com os grupos funcionais dos polímeros sintéticos, a sua presença durante a reticulação do primeiro e segundo componentes no local alvo irá resultar na formação de uma matriz reticulada de polímero sintético com polímero de origem natural. Em particular, quando o polímero de origem natural (proteína ou polissacárido) também contiver grupos nucleofílicos tais como grupos amino primários, os grupos electrofílicos do segundo componente reticulável irão reagir com os grupos amino primários destes componentes, bem como os grupos nucleofílicos do primeiro componente reticulável, originando 61 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ que estes outros componentes se tornem parte da barreira de matriz selante.

Em geral, os glicosaminoglicanos são tipicamente quimicamente derivatizados através de desacetilação, dessulfatação, ou ambos, de modo a conter grupos amino primários disponiveis para reacção com os grupos electrofilicos do segundo componente reticulável. Os glicosaminoglicanos que podem ser derivatizados de acordo com qualquer um ou ambos os métodos acima mencionados, incluem os seguintes: ácido hialurónico, sulfato de condroitina A, sulfato de condroitina B (sulfato de dermatano), sulfato de condroitina C, quitina (pode ser derivatizado em quitosano), sulfato de queratano, queratosulfato e heparina. A derivatização dos glicosaminoglicanos por desacetilação e/ou dessulfatação e a ligação covalente dos derivados de glicosaminoglicano resultantes com polímeros sintéticos hidrofílicos é descrita em maior detalhe na comummente atribuída e concedida Patente U.S. N° 5,510,418.

De modo similar, os grupos electrofilicos do segundo componente reticulável podem reagir com grupos amino primários em resíduos lisina ou grupos tiol em resíduos cisteína de determinadas proteínas de origem natural. Proteínas ricas em lisina como o colagénio e seus derivados são especialmente reactivos com grupos electrofilicos de polímeros sintéticos. Tal como aqui utilizado, o termo "colagénio" destina-se a englobar colagénio de qualquer tipo, a partir de qualquer fonte, incluindo, mas não estando limitado a, colagénio extraído a partir de tecido ou produzido de forma recombinante, análogos de colagénio, derivados de colagénio, colágenios modificados, e colágenios desnaturados tal como a gelatina. A ligação covalente do colagénio com polímeros sintéticos hidrófilos encontra-se descrita em detalhe na comummente atribuída e concedida Patente U.S. N° Pat. No. 5,162,430, concedida em 10 de Novembro de 1992, de Rhee et al.

Em geral, o colagénio a partir de qualquer fonte pode ser usado nas composições do invento; por exemplo, o colagénio pode ser extraído e purificado a partir de um 62

ΕΡ 2 049 165/PT humano ou outra fonte de mamífero, tais como cório de bovino ou de suíno e placenta humana, ou pode ser produzido de forma recombinante ou outra. A preparação de colagénio substancialmente não antigénico purificado em solução a partir da pele de bovino é bem conhecida na técnica. A patente U.S. N° 5,428,022, concedida em 27 de Junho de 1995, de Palefsky et al., descreve métodos de extracção e purificação de colagénio a partir da placenta humana. A patente U.S. N° 5,667,839 divulga métodos de produção de colagénio recombinante humano no leite de animais transgénicos, incluindo vacas transgénicas. O termo "colagénio" ou "material de colagénio" tal como aqui utilizado diz respeito a todas as formas de colagénio, incluindo aquelas que tenham sido processadas ou de outra forma modificadas. O colagénio de qualquer tipo, incluindo, mas estando limitado a, tipos I, II, III, IV, ou qualquer combinação dos mesmos, pode ser utilizado nas composições do invento, embora seja frequentemente preferido o do tipo I. Podem ser usados o colagénio com atelopéptido ou com telopéptido, no entanto, quando é usado colagénio de uma fonte xenogénicas, tal como colagénio de bovino, o colagénio atelopéptido é muitas vezes preferido, devido à sua imunogenicidade reduzida em comparação com colagénio contendo telopéptido. O colagénio que não tenha sido previamente reticulado por meio de métodos tais como o calor, a irradiação, ou agentes de reticulação químicos pode ser utilizado nas composições do presente invento, bem como colagénio que tenha sido reticulado anteriormente. Colagénio fibrilar contendo não reticulado contendo atelopéptido encontra-se comercialmente disponível de Collagen Corporation (Paio Alto, Califórnia) em concentrações de colagénio de 35 mg/ml e 65 mg/ml sob as designações comerciais Zyderm® I Collagen e Zyderm II Collagen, respectivamente. Colagénio fibrilar atelopéptido reticulado com glutaraldeído encontra-se comercialmente disponível a partir de Collagen Corporation numa concentração de colagénio de 35 mg/ml sob a designação comercial Zyplast® Collagen. Os colagénios para utilização no presente invento encontram-se geralmente em forma de pó seco liofilizado. 63

ΕΡ 2 049 165/PT

Devido à sua consistência pegajosa, o colagénio não fibrilar é tipicamente usado em composições do invento que são destinadas a utilização como bioadesivos. O termo "colagénio não fibrilar" engloba qualquer material de colagénio modificado ou não modificado que se encontra substancialmente na forma substancialmente a pH 7, tal como indicado através de clareza óptica de uma suspensão aquosa do colagénio. O colagénio, que já se encontra na forma não fibrilar pode ser utilizado nas composições do invento. Tal como aqui utilizado, o termo "colagénio não fibrilar" pretende incluir os tipos de colagénio, que são não fibrilares na forma nativa, bem como colágenios que tenham sido modificados quimicamente de tal modo que se encontram na forma não fibrilar a pH neutro ou aproximado. Tipos de colagénio, que são não fibrilares (ou microfibrilares) na forma nativa incluem os tipos IV, VI e VII.

Colagénios quimicamente modificados que se encontram na forma de não fibrilar a pH neutro incluem colagénio succinilado e colagénio metilado, ambos os quais podem ser preparados de acordo com os métodos descritos na patente U.S. N°. 4,164,559, concedida em 14 de Agosto de 1979, de

Miyata et al., Devido à sua pegajosidade inerente, o colagénio metilado é geralmente usado em composições bioadesivas, conforme divulgado na patente U.S. N° 5,614,587.

Os colagénios para utilização nas composições de matriz selante do presente invento pode estar no inicio em forma fibrilar, posteriormente, serem tornados não fibrilares através da adição de um ou mais agentes de desmontagem de fibra. O agente de desmontagem de fibra encontra-se tipicamente presente numa quantidade suficiente para tornar o colagénio substancialmente não fibrilar a pH 7, tal como descrito anteriormente. Os agentes de desmontagem de fibra para utilização no presente invento incluem, sem limitação, vários álcoois biocompatíveis, aminoácidos, sais inorgânicos, e hidratos de carbono, sendo os álcoois biocompativeis particularmente preferidos. Álcoois biocompativeis preferidos incluem glicerol e propileno 64 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ glicol. Em alguns casos, álcoois não-biocompatíveis, tais como etanol, metanol e isopropanol, podem não ser desejáveis para utilização no primeiro e segundo polímeros do presente invento, devido aos seus efeitos potencialmente prejudiciais sobre o corpo do paciente que os receber. Exemplos de aminoácidos incluem arginina. Exemplos de sais inorgânicos incluem cloreto de sódio e cloreto de potássio. Embora possam ser usados hidratos de carbono, tais como vários açúcares, incluindo a sacarose, ao praticar o presente invento, estes não são tão preferidos como outros tipos de agentes de desmontagem de fibras porque podem ter efeitos citotóxicos in vivo.

Para utilização em adesão a tecido, além da selagem, pode igualmente ser desejável incorporar proteínas tais como fibrina, albumina ou de fibrinogénio na composição de matriz selante para promover a adesão celular. Além disso, a introdução de hidrocolóides tal como carboximetilcelulose pode promover a adesão ao tecido e/ou expansibilidade.

As composições de matriz selante do presente invento podem também compreender um ou mais agentes ou compostos biologicamente activos adicionais. Numa concretização, agentes biologicamente activos, tais como os derivados de taxol podem ser adicionados à composição da matriz selante para impedir a adesão no local do defeito do tecido. Em outras concretizações, podem ser adicionados agentes biologicamente activos tais como antibióticos ou agentes antimicrobianos à matriz selante para utilização, por exemplo, em situações de ferimento induzido por trauma (por exemplo, feridas de faca, ou bala), onde os organismos patogénicos podem ter entrado no local do defeito do tecido, ou ferida. Em outras concretizações, podem ser administrados agentes biologicamente activos, tais como factores de crescimento a partir da composição para uma área de tecido local a fim de facilitar a cicatrização do tecido e de regeneração. Noutras concretizações, podem ser adicionados agentes de coagulação do sangue, tal como a trombina, para melhorar ainda mais a selagem e regeneração de tecidos através da activação da cascata de coagulação. Exemplos de componentes bioactivos incluem, mas não estão limitados a, proteínas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, e 65

ΕΡ 2 049 165/PT moléculas biologicamente activas inorgânicas e orgânicas tais como enzimas, antibióticos, agentes antineoplásicos, agentes bacteriostáticos, agentes anti-formação de aderências (tais como os derivados de taxol), agentes bactericidas, agentes antivirais, agentes hemostáticos, anestésicos locais, agentes anti-inflamatórios, hormonas, agentes antiangiogénicos, anticorpos, neurotransmissores, fármacos psicoactivos, fármacos que afectam os órgãos reprodutivos e oligonucleotideos, tal como oligonucleotideos antisense. O termo "agente biologicamente activo" ou "agente activo" tal como aqui utilizado abrange moléculas orgânicas ou inorgânicas, que exercem efeitos biológicos in vivo. Exemplos de agentes activos incluem, sem limitação, enzimas, antagonistas ou agonistas de receptores, hormonas, factores de crescimento, medula óssea autógena, antibióticos, agentes anti-aderência de formação, agentes antimicrobianos, outros agentes farmacêuticos, e anticorpos. O termo "agente activo" também se destina a englobar combinações ou misturas de dois ou mais agentes activos, tal como definidos acima.

Tais componentes bioactivos estarão tipicamente presentes em concentrações relativamente baixas, tipicamente abaixo de 10% por peso das composições, geralmente abaixo de 5%, em peso, e frequentemente abaixo de 1% em peso. Dois ou mais de tais agentes activos podem ser combinados numa composição única e/ou duas ou mais composições podem ser utilizadas para administrar diferentes componentes activos, em que os referidos componentes podem interagir no local administração. Exemplos de agentes hemostáticos incluem trombinha, fibrinogénio e factores de coagulação. Podem ser adicionados agentes hemostáticos tal como trombina em concentrações que variam, por exemplo, de cerca de 50 a cerca de 10.000 unidades de trombina por ml de hidrogel, ou de cerca de 100 a cerca de 1000 unidades de trombina por ml hidrogel.

As composições de primeiro e segundo polímeros reticulados podem igualmente ser preparadas de modo a conter vários agentes de contraste, tais como iodo ou sulfato de bário, ou flúor, a fim de ajudar a visualização das composições após a administração através de raios-X, ou 19F-RM, respectivamente. 66

ΕΡ 2 049 165/PT

Agentes activos preferidos para utilização nas composições do presente invento incluem factores de crescimento, tais como os factores de crescimento transformantes (TGFs), factores de crescimento de fibroblastos (FGFs), factores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs) , factores de crescimento epidérmico (EGFs), péptidos activados de tecido conjuntivo (CTAPs) , factores osteogénicos, e análogos biologicamente activos, fragmentos e derivados de tais factores de crescimento. Os membros da família supergene do factor de crescimento transformante (TGF), os quais são proteínas reguladoras multifuncionais, são particularmente preferidos. Os membros da família supergénica TGF incluem factores de crescimento de beta transformados (por exemplo, o TGF-βΙ, TGF^2, o TGF-β3) ; proteínas morfogenéticas ósseas (por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP- 4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); factores de ligação à heparina de crescimento (por exemplo, factor de crescimento de fibroblastos (FGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crescimento tipo insulina (IGF)); Inibinas (por exemplo, Inibina A, Inibina B) ; factores de crescimento de diferenciação (por exemplo, GDF-1); e Activinas (por exemplo, Activina A, Activina B, Activina AB).

Os factores de crescimento podem ser isolados a partir de fontes nativas ou naturais, tal como a partir de células de mamíferos, ou podem ser preparados sinteticamente, tal como através de técnicas de ADN recombinante ou por vários processos químicos. Além disso, os análogos, fragmentos ou derivados destes factores podem ser usados, desde que os mesmos apresentem, pelo menos, alguma da actividade biológica da molécula nativa. Por exemplo, os análogos podem ser preparados através da expressão de genes alterados por mutagénese específica do local ou outras técnicas de engenharia genética.

Os agentes biologicamente activos podem ser incorporados na composição da matriz selante através de mistura. Numa concretização, os agentes activos podem ser misturados com composições de matriz selante em pó em forma seca ou 67 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ liofilizada. Numa outra concretização, esta mistura pode ser fixada sobre um suporte sólido, como colagénio, tal como descrito anteriormente para as composições de matriz selantes. Noutras concretizações, os agentes podem ser incorporados nas composições de matriz selante, tal como descrito anteriormente, através da ligação desses agentes com os grupos funcionais do primeiro ou segundo componentes poliméricos sintéticos. Processos para ligar de modo covalente agentes biologicamente activos, tais como factores de crescimento que utilizam polietilenoglicóis funcionalmente activados encontram-se descritos na comummente atribuída patente U.S. N°. 5,162,430, concedida em 10 de Novembro de 1992, de Rhee et al. Tais composições incluem de preferência ligações que podem ser facilmente biodegradadas, por exemplo, como resultado da degradação enzimática, resultando na libertação do agente activo no tecido alvo, onde irá exercer o seu efeito terapêutico pretendido.

Um método simples para a incorporação de agentes biologicamente activos que contenham grupos nucleofílicos na composição de polímero reticulado envolve a mistura do agente activo com o primeiro componente, segundo componente, e componente formador de hidrogel antes da administração em estado seco. Após a aplicação da composição de matriz selante no defeito do tecido e contacto com o fluido biológico, o agente biologicamente activo irá reagir com o segundo componente e será reticulado na matriz reticulada porosa do primeiro e segundo componentes, à medida que componente formador de hidrogel absorve o fluido biológico. Este procedimento resultará em ligação covalente do agente activo com a porção matriz do componente polimérico reticulado da barreira matriz selante que é formada, produzindo uma composição de libertação sustentada altamente eficaz. O tipo e quantidade de agente activo utilizado dependerá, entre outros factores, do local particular e doença a ser tratada e da actividade biológica e farmacocinética do agente activo seleccionado. 68 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ V. Uso de Composições de Matriz Selante como Bioadesivos

As composições de matriz selante do presente invento são geralmente adesivas e ligam-se fortemente a tecidos, dado gue os grupos electrofilicos do segundo componente reticulável reagem com os grupos nucleofilicos de colagénio no tecido do local alvo. Algumas composições de matriz porosa do invento podem apresentar uma pegajosidade invulgarmente elevada. Assim, além de serem usadas como matriz barreira para a hemostase, as composições de matriz selante do presente invento são úteis como bioadesivos para se ligarem a tecidos molhados ou húmidos em condições fisiológicas. Tal como aqui utilizados, os termos "bioadesivos", "adesivo biológico" e "adesivo cirúrgico" podem ser utilizados indiferentemente para abranger composições biocompativeis capazes de efectuar a fixação temporária ou permanente entre as superfícies de dois tecidos nativos, ou entre uma superfície de tecido nativo e uma superfície do tecido não nativo ou uma superfície de um implante sintético.

Num método geral para efectuar a ligação de uma primeira superfície a uma segunda superfície, a composição de matriz selante (por exemplo, em forma de pó seco ou folha) é aplicada a uma primeira superfície. A primeira superfície é posteriormente feita contactar com a segunda superfície, de preferência de imediato, para efectuar a adesão entre as duas superfícies. Pelo menos uma da primeira e segunda superfícies é de preferência uma superfície do tecido nativo. Quando um componente formador de hidrogel mecanicamente estável é usado na composição, tal como a gelatina reticulada utilizada nos exemplos, a matriz porosa resultante apresenta uma maior resistência mecânica em oposição a uma composição contendo somente o primeiro e segundo componentes reticuláveis. Deste modo, a força da adesão entre as duas superfícies de tecido é igualmente aumentada, dado que o bloco de matriz porosa entre os tecidos terá menos probabilidade de se separar internamente sob tensões mecânicas fisiológicas.

As duas superfícies podem ser mantidas juntas manualmente, ou utilizando outros meios adequados, enquanto 69

ΕΡ 2 049 165/PT a reacção de reticulação avança para a sua conclusão. A reticulação encontra-se normalmente completa ao fim de 5 a 60 minutos após a aplicação da composição da matriz selante. No entanto, o tempo necessário para ocorrer reticulação completa é dependente de um determinado número de factores, incluindo os tipos e pesos moleculares do primeiro e segundo componentes reticuláveis e, mais particularmente, das concentrações eficazes dos dois componentes no local alvo (ou seja, concentrações mais elevadas resultam em tempos mais rápidos de reticulação).

Pelo menos uma de entre a primeira e segunda superficies é de preferência uma superfície do tecido nativo. Tal como aqui utilizado, o termo "tecido nativo" abrange tecidos biológicos que são nativos em relação ao corpo do paciente específico a ser tratado. Tal como aqui utilizado, o termo "tecido nativo" abrange os tecidos biológicos que foram elevados ou removidos de uma parte do corpo de um paciente para implantação numa outra parte do corpo do mesmo paciente (tal como auto-enxertos ósseos, auto-enxertos de aba de pele, etc) . Por exemplo, as composições de algumas concretizações do invento podem ser usadas para aderir um pedaço de pele de uma parte do corpo de um paciente para outra parte do corpo, como no caso de uma vítima com queimaduras. A outra superfície pode ser uma superfície do tecido nativo, uma superfície do tecido não nativo, ou uma superfície de um implante sintético. Tal como aqui utilizado, o termo "tecido não nativo" engloba tecidos biológicos que foram removidos do corpo de um paciente doador (que pode ser da mesma espécie ou de uma espécies diferente em relação ao paciente receptor) para implantação no corpo de um paciente receptor (por exemplo, transplante de tecido e órgãos). Por exemplo, as composições poliméricas reticuladas do presente invento podem ser usadas para fixar uma válvula cardíaca xenoenxerto no coração de um paciente e selar em torno da válvula cardíaca para evitar fugas.

Tal como aqui utilizado, o termo "implante sintético" abrange qualquer material biocompatível destinado a implantação no corpo de um paciente não abrangido pelas 70

ΕΡ 2 049 165/PT definições anteriores em relação a tecido nativo e tecido não nativo. Os implantes sintéticos incluem, por exemplo, vasos sanguíneos artificiais, válvulas cardíacas, órgãos artificiais, próteses ósseas, lenticulas implantáveis, enxertos vasculares, stents, e combinações stent/enxerto, etc VI. Utilização das Composições de Matriz Selante para Evitar Adesões

Outro uso das composições selantes do invento é o de revestimento de tecidos a fim de impedir a formação de aderências após cirurgia ou lesão de tecidos ou órgãos internos. Num método geral para revestir tecidos para evitar a formação de aderências após a cirurgia, o de primeiro e segundo polímeros sintéticos são misturados com o polimero reticulado hidratável ou pré-misturados, posteriormente é aplicada um bloco fino da mistura reaccional aos tecidos que compreendem, rodear, e/ou colocar adjacentemente ao local cirúrgico antes de ter ocorrido reticulação substancial entre os grupos nucleofilicos no primeiro polimero sintético e os grupos electrofilicos do segundo polimero sintético. A aplicação da mistura reaccional no local de tecido pode ser através de extrusão, aspersão, escovagem, pulverização (tal como anteriormente descrito) para as composições em pó, por colocação de uma película ou folha fina da composição de matriz selante no tecido, ou por quaisquer outros meios convenientes.

Após a aplicação da mistura reaccional no local cirúrgico, deixa-se a reticulação continuar in situ antes do fecho da incisão cirúrgica. Depois de a reticulação ter atingido o equilíbrio, os tecidos que são colocados em contacto com os tecidos revestidos não irão aderir aos tecidos revestidos. A partir deste ponto no tempo, o local cirúrgico pode ser fechado através de meios convencionais (suturas, etc.)

Em geral, as composições que atingem reticulação completa dentro de um período de tempo relativamente curto (ou seja, 5-15 minutos após a mistura do primeiro polímero sintético e do segundo polímero sintético) podem ser 71

ΕΡ 2 049 165/PT preferidas para uso na prevenção de aderências cirúrgicas, de modo que o local cirúrgico possa ser fechado relativamente cedo após a conclusão do procedimento cirúrgico. Além disso, é preferível que um polímero reticulado hidratável com uma resistência mecânica relativamente elevada seja utilizado nas composições, tal como a gelatina reticulada utilizada nos exemplos, para aumentar a estabilidade mecânica do revestimento.

Os exemplos seguintes descrevem a produção e caracterização de um primeiro componente reticulável com um segundo componente reticulável e um componente formador de hidrogel para formar composições de matriz de selante, e são apresentados, de modo a proporcionar aos peritos na técnica uma descrição e divulgação completas de como produzir as concretizações preferidas dos conjugados, composições e dispositivos e não se destinam a limitar o âmbito daquilo que os inventores consideram como o seu invento. Têm sido feitos esforços para garantir a exactidão relativamente aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, peso molecular, etc), mas devem ser tidas em conta alguns erros experimentais e desvios. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, peso molecular é o peso médio do peso molecular, a temperatura é em graus centígrados, e a pressão é a atmosférica ou próxima. VII. Exemplos

Exemplo 1: Composições de Primeiro e Segundo Componentes para uso em Matriz Selante: Preparação de Composições de PEG Multi-amino Reticuladas

Foram preparados as seguintes soluções de reserva de vários PEGs di-amino: Dez (10) gramas de Jeffamine ED-2001 (obtido de Texaco Chemical Company, Houston, Texas) foram dissolvidos em 9 ml de água. Dez (10) gramas de Jeffamine ED-4000 (também obtido de Texaco Chemical Company) foram dissolvidos em 9 ml de água. 0,1 gramas de PEG di-amino (PM 3400, obtido de Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama) foram dissolvidos em 300 μΐ de água. Cada uma das três soluções de PEG di-amino acima preparadas foi misturada com soluções aquosas de SC-PEG trifuncionalmente activado (TSC- 72 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ PEG, ΡΜ 5000, também obtido de Shearwater Polymers) como estabelecido na Tabela 1, abaixo. TABELA 1

Preparação de Composições de Polímero reticulado PEG di-amino TSC-PEG + solvente aquoso 50 μΐ 0 mg + 50 μΐ de água 50 μΐ 10 mg + 50 μΐ de PBS 50 μΐ 10 mg + 100 μΐ de PBS 250 μΐ 50 mg + 500 μΐ de PBS

As soluções de PEG di-amino e TSC-PEG foram misturadas usando uma mistura seringa-a-seringa. Cada um dos materiais foi extrudido a partir da seringa e deixou-se em repouso durante 1 hora a 37 °C. Cada um dos materiais formou um gel. Em geral, os géis tornaram-se mais suaves com o aumento do teor de água; os géis contendo a menor quantidade de solvente aquoso (água ou PBS) eram mais sólidos.

Exemplo 2: Composições de Primeiro e Segundo Componentes para uso em Matrix Selante: Preparação de Composições de Poli(lisina) Reticuladas

Dez (10) miligramas de bromidrato de poli-L-lisina (PM 8.000, obtido a partir de Peninsula Laboratories, Belmont,

Calif.) em 0,1 ml de tampão fosfato (0,2 M pH= 6,6) foram misturadas com 10 mg de SE-PEG tetrafuncionalmente activado (PM 10.000, obtido de Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama) em 0,1 ml de PBS. A composição formou um gel macio quase imediatamente.

Exemplo 3: Composições de Primeiro e Segundo Componentes para utilização em Matriz Selante: Efeito do pH sobre a

Formação de Gel de Formulações de PEG tetra-amino/ Tetra SE-PEG Géis compreendendo várias concentrações de PEG tetra-amino e tetra SE-PEG a pH 6, 7, e 8 foram preparadas em placas de petri. Após a mistura do PEG tetra-amino e tetra SE-PEG, as placas foram inclinadas repetidamente; o tempo de gelificação foi considerado como sendo o ponto em que a 73 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ formulação deixou de fluir. O efeito do pH no tempo de gelificação das várias formulações PEG tetra-amino/tetra SE-PEG à temperatura ambiente é apresentado na Tabela 2, abaixo. TABELA 2

Efeito do pH sobre a Formação de Formulações de gel de PEG tetra- amino/Tetra SE-PEG Cone. PEG tetra-amino (mg/ml) Cone. Tetra SE-PEG (mg/ml) pH Tempo de gelificação 20 20 6 > 90,0 min 20 20 7 20,0 min 20 20 8 1,4 min 50 50 6 24,0 min 50 50 7 3,5 min 50 50 8 10,0 seg 100 100 6 9,0 min 100 100 7 47,0 seg 100 100 8 10,0 seg 200 200 6 2,0 min 200 200 7 9,0 seg 200 200 8 5,0 seg O tempo necessário para a formação de gel diminuiu com o aumento do pH e com o aumento das concentrações de PEG tetra-amino e tetra SE-PEG.

Exemplo 4: Avaliação de Materiais para os Componentes Formadores de Hidrogel e Métodos de Reticulação e Medição de Percentagem de Expansão

Deixaram-se partículas de gelatina a expandir em um tampão aquoso (por exemplo, fosfato de sódio 0, M, pH 9,2) contendo um agente reticulante (por exemplo, glutaraldeído 0,005 a 0,5% em peso). A mistura reaccional foi mantida refrigerada de um dia para o outro e foi posteriormente lavada três vezes com água desionizada, duas vezes com álcool etílico, e deixou-se secar à temperatura ambiente. A gelatina reticulada seca, foi ressuspensa num tampão aquoso com baixa concentração de sólidos (2-3%) à temperatura 74 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ ambiente durante um período fixo de tempo. 0 tampão encontrava-se em substancial excesso da concentração necessária para a expansibilidade de equilíbrio, e estavam presentes duas fases (uma fase de hidrogel e um tampão) . A suspensão contendo hidrogel húmido foi posteriormente filtrada aplicando vácuo sobre uma membrana filtrante com 0,8 pm de corte nominal (Millipore, Bedford, MA). Após a remoção do tampão em excesso, o peso combinado do hidrogel húmido retido e da membrana filtrante húmida foi registado. O hidrogel e a membrana foram posteriormente secos a cerca de 120°C durante pelo menos duas horas, e o peso combinado do resíduo de hidrogel seco e membrana filtrante seca foi registado. Foram também realizadas várias medições de amostras membranas filtrantes húmidas sem resíduo de hidrogel e membrana filtrante seca sem hidrogel, e foram utilizadas para deduzir o peso líquido de hidrogel húmido e hidrogel seco. A "Percentagem de Expansão" foi posteriormente calculada tal como segue:

Percentagem de expansão = 100x[(peso húmido do hidrogel -peso seco do hidrogel)/peso seco do hidrogel]

Foram realizadas medições de expansão pelo menos em triplicado e calculada a média para uma dada amostra de gelatina. O valor de percentagem de expansão para amostras ressuspensas em tampão durante 18 a 24 horas antes da medição do peso húmido foi definida como "expansibilidade de equilíbrio."

Os materiais de gelatina reticulados resultantes apresentaram valores de expansibilidade de equilíbrio na gama de 400% a 1300%. O grau de expansibilidade de equilíbrio dependia do método e da extensão de reticulação.

Exemplo 5: Componentes Formadores de Hidrogel para Uso na Matriz Selante: Produto Polimérico Reticulado Hidratável Fragmentado Composto por Gelatina Reticulado Usando EDC

Gelatina (Atlantic Gelatin, General Foods Corp., Woburn, Mass.) foi deixada a dissolver em água destilada com 1 a 10% de sólidos (p/p) (mais preferencialmente a 8%) a 70°C. Foi posteriormente adicionado l-etil-3-(3-dimetilamino- 75

ΕΡ 2 049 165/PT propil)carbodiimida (EDC) (Sigma, St. Louis, Mo.) de 0,2% a 3,5% (ou 0,2% a 0,3%). O hidrogel resultante formado durante a agitação foi deixado à temperatura ambiente durante uma hora. O hidrogel foi seco utilizando um sistema de liofilização Freezone 12 (Labconco, Mo.) e finamente moido utilizando um Waring Blender modelo No. 31BC91 (VWR, Willard, Ohio). A composição polimérica seca foi posteriormente carregada em seringas e equilibrada com tampão. A expansibilidade de equilíbrio foi determinada como sendo pelo menos 1000%. Os resultados são apresentados na Tabela 3. TABELA 3

Gelatina (mg) EDC Expansão (%) 500 (8%) 13,5 mg (0,25%) 1080 500 (8%) 13,5 mg (0,25%) 1126 100 (7,4%) 0,945 mg (0,35%) 1620 100 (7,4%) 9,45 mg (3,5%) 1777

Exemplo 6: Componentes Formadores de Hidrogel para Uso na Matriz Selante: Produto Polimérico Reticulado Hidratável Fragmentado Composto por Gelatina e Ácido Poli(L)Glutâmico, Reticulado Usando EDC

Gelatina (Atlantic Gelatin, General Foods Corp., Woburn, Mass.) foi deixada a dissolver em água destilada com 1 a 10% de sólidos (p/p) (mais preferencialmente de 6% a 8%) a 70°C. Foram posteriormente adicionados 0 a 10% (p/p) (mais preferencialmente 2-5%) de ácido Poli(L)glutâmico (PLGA) (Sigma, St. Louis, Mo.) e l-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) (Sigma, St. Louis, Mo.) de 0,2% a 3,5% (ou 0,2% a 0,4%) . O hidrogel resultante formado durante a agitação foi deixado à temperatura ambiente durante uma hora. Deixou-se o hidrogel expandir em solução salina em excesso durante um período fixo de tempo (por exemplo 20h) . O hidrogel foi posteriormente filtrado aplicando vácuo numa membrana filtrante (Millipore, Bedford, Mass.) A expansibilidade de equilíbrio foi determinada como sendo pelo menos 1500%. Os resultados são apresentados na Tabela 4. 76

ΕΡ 2 049 165/PT TABELA 4

Gelatina (mg) PLGA (mg) EDC Expansão (%) 375 (6%) 125 (2%) 13,5 mg (0,25%) 1510 375 (6%) 125 (2%) 13,5 mg (0,25%) 1596 250 (4%) 250 (4%) 13,5 mg (0,25%) 2535 250 (4%) 250 (4%) 13,5 mg (0,25%) 2591 250 (4%) 250 (4%) 13,5 mg (0,25%) 2548 250 (4%) 250 (4%) 13,5 mg (0,25%) 2526 200 (3,2%) 300 (4,8%) 13,5 mg (0,25%) 2747 200 (3,2%) 300 (4,8%) 13,5 mg (0,25%) 2677 200 (3,2%) 300 (4,8%) 13,5 mg (0,25%) 2669 150 (2,4%) 350 (5,6%) 13,5 mg (0,25%) 3258 150 (2,4%) 350 (5,6%) 13,5 mg (0,25%) 3434 150 (2,4%) 350 (5,6%) 13,5 mg (0,25%) 3275 75 (5,5%) 25 (1,9%) 0, 945 mg (0,35%) 2437 50 (3,7%) 50 (3,7%) 0, 945 mg (0,35%) 2616 25 (1,9%) 75 (5,5%) 0, 945 mg (0,35%) 5383 75 (5,5%) 25 (1,9%) 9, 45 mg (3,5%) 1976 50 (3,7%) 50 (3,7%) 9,45 mg (3,5%) 2925 25 (1,9%) 75 (5,5%) 9, 45 mg (3,5%) 4798

Exemplo 7: Componentes Formadores de Hidrogel para Uso em Matriz Selante: Produção de um Hidrogel Polimérico

Reticulado Hidratável Gragmentado Cório de bovino (Spears Co. PA) foi agitado em solução aquosa de hidróxido de sódio (Spectrum Chemical Co., CA) (0,1 M a 1,5 M, ou 0,4 a 1,2 M) por um periodo de uma a 18 horas (ou uma a quatro horas) a uma temperatura de 2°C a 30°C (preferencialmente 22°C a 30°C). A suspensão de cório foi então neutralizada utilizando um ácido inorgânico tal como ácido clorídrico, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico (Spectrum Chemical Co., CA.) e a fase líquida neutralizada foi posteriormente separada do cório insolúvel através de filtração através de um peneiro. O cório foi posteriormente lavado com água apirogénica e um álcool tal como o álcool isopropílico (Spectrum Chemical Co., CA.). Após três a doze 77

ΕΡ 2 049 165/PT lavagens, o cório foi suspendido em água apirogénica e a suspensão aquosa de cório pode ser, em seguida, aquecida de 50°C a 90°C, de preferência 60°C a 80°C para gelatinizar termicamente o cório. Durante o ciclo de gelatinização, o pH da suspensão aquosa de cório foi ajustada e controlado de pH 3 a pH 11, ou pH 7 a pH 9. Além disso, o cório insolúvel na suspensão pode ser fragmentado através de agitação e/ou homogeneização. A fragmentação pode ocorrer antes ou após o ciclo de gelatinização térmica. A gelatinização térmica foi realizada durante uma a seis horas. Após a gelatinização, a suspensão foi clarificada através de filtração. A suspensão de gelatina foi desidratada por secagem com ar de 15°C a 40°C, preferencialmente de 20°C a 35° C. A gelatina seca, em que seca implica um teor de humidade inferior a 20% em peso, foi, posteriormente fragmentada através de moagem.

Gelatina seca foi adicionada a uma solução aquosa arrefecida (5°C a 15°C) de glutaraldeido (Amresco Inc., OH.) de 0,0025% a 0,075% em peso e com um pH entre 7 e 10. A concentração de gelatina nesta solução encontrava-se entre 1% e 10% em peso. O glutaraldeido reticula os grânulos de gelatina ao longo de um periodo de uma a 18 horas após o que a gelatina foi separada da fase aquosa por filtração ou sedimentação. As partículas de gelatina foram posteriormente adicionadas a uma solução aquosa contendo 0,00833% a 0,0667% em peso de borohidreto de sódio (Spectrum Chemical Co., CA.) com a concentração de gelatina encontrando-se de novo entre 1% e 10% em peso e sendo o pH entre 7 e 12, ou entre 7 a 9. Após uma a seis horas, a gelatina reticulada foi separada da fase aquosa por filtração ou sedimentação. A gelatina pode posteriormente ser ressuspensa em água apirogénica, com a concentração de gelatina entre 1% e 10% em peso, para remoção de agentes de reticulação e redução residuais, seguido por separação da fase aquosa por filtração ou sedimentação. A recolha final da gelatina reticulada foi efectuada num filtro de rede ou peneiro e foi efectuada uma lavagem final à gelatina com água apirogénica. A gelatina reticulada húmida foi posteriormente colocada numa câmara de secagem com 15°C a 40°C. A gelatina reticulada seca (ou seja, gelatina reticulada com um teor de humidade inferior a 20% em peso) foi removida da câmara de secagem e foi posteriormente moída usando um moinho de moagem mecânica 78 ΕΡ 2 049 165/PT para produzir um pó com uma distribuição de tamanho de partícula típico de 0,020 mm a 2,000 mm.

Exemplo 8: Pó Selante Hemostático Seco de Acção Rápida

Foi preparado um pó selante hemostático seco de acção rápida combinando um primeiro componente reticulável, um segundo componente reticulável e um componente formador de hidrogel. O primeiro polímero reticulável (PEG-A) era um pó de PEG-succinimidilo, o segundo polímero reticulável (PEG-B) era um pó de PEG-tiol, e o componente formador de hidrogel era um pó de gelatina reticulada.

Exemplo 9: Bloco de Selante Seco de Acção Rápida

Foi preparado um bloco de selante seco de acção rápida combinando um primeiro componente reticulável, um segundo componente reticulável e um componente formador de hidrogel. A composição resultante, uma composição de matriz selante em pó, foi colocada sobre uma esponja de colagénio liofilizado, e aquecida a 60-70°C durante cerca de 1-2 minutos. A matriz de pó seco fundiu ligeiramente com esse calor, fixando-a à superfície da esponja de colagénio, formando desse modo um bloco de matriz selante. Em alternativa, a composição da matriz selante pode ser fixada no suporte usando agentes de ligação ou outros excipientes conhecidos nas técnicas farmacêuticas. Em geral, a técnica utilizada para fixar a composição de matriz selante no suporte pode depender do primeiro e segundo componentes e do componente formador de hidrogel da composição de matriz selante. Concretizações de bloco de matriz selante selante do presente invento proporcionam um formato conveniente, através da qual as composições de matriz selante podem ser manuseadas e administradas num local cirúrgico através de uma esponja ou outros meios de suporte adequados.

Exemplo 10: Pó Selante para Tratar Punção da Artéria Esplénica

As Figs. E-7A-E ilustram a aplicação de uma composição de matriz selante para tratar uma punção da artéria esplénica de acordo com concretizações do presente invento. 79

ΕΡ 2 049 165/PT Ο porco foi heparinizado a aproximadamente 3x a linha de base. Tal como representado na FIG. 7A, foi induzida cirurgicamente uma punção da artéria esplénica num porco com uma agulha 18g 700 . Na sequência da punção, foi observada hemorragia excessiva 705 a partir da artéria 710. Tal como representado nas Figs. 7B e 7C, aproximadamente 700 mg de uma composição em pó de matriz selante 720 foram aplicados no local da punção através de uma seringa 730, e suavemente comprimido ou colocado em contacto com o local durante dois minutos utilizando um dedo enluvado 740. O pó selante formou um coágulo 750 tendo-se observado que o mesmo parou a hemorragia de modo adequado. O local foi irrigado aos 5 minutos após a aplicação com um dispositivo de irrigação 7 60, conforme ilustrado na FIG. 7D, e o excesso de composição em pó foi arrastado por lavagem. Quando o coágulo foi agarrado com uma pinça, pareceu aderir bastante bem ao tecido e apresentava boa integridade. Tal como representado na Fig. 7E, O coágulo 750 foi removido aos 44 minutos após a aplicação, arrancando com uma pinça 770, e foi observada a retoma de hemorragia 715.

Exemplo 11: Pó Selante Para Tratar Ressecção Hepática

As Figs. 8A-E ilustram a aplicação de uma composição de matriz selante para tratar uma ressecção hepática de acordo com concretizações do presente invento. Um porco foi heparinizado a aproximadamente 3x a linha de base. Tal como representado na FIG. 8A, a ponta 800, ou borda, do lobo médio do figado 805 foi ressecada no porco usando tesouras 810. Após a ressecção, foi observada hemorragia excessiva 815 a partir do local. Tal como representado na FIG. 8B, aproximadamente 6 ml (2 g) de uma matriz de composição selante 820 foram aplicados no local, e mantidos no lugar com a ponta de uma seringa 825 durante 2 minutos. Tal como representado na FIG. 8C, pode ser usado um dedo enluvado para comprimir ou segurar o pó em contacto com a lesão. O pó selante formou um coágulo 835 tendo-se observado que o mesmo parou a hemorragia de modo adequado. O local foi irrigado aos 8 minutos após a aplicação com um dispositivo de irrigação 840, conforme ilustrado na FIG. 8D. Quando o coágulo foi agarrado com uma pinça, pareceu aderir bastante bem ao tecido e apresentava boa integridade. O coágulo 835 80

ΕΡ 2 049 165/PT foi removido aos 28 minutos após a aplicação, arrancando-o com pinças 845, e foi observada a retoma de hemorragia 850.

Exemplo 12: Pó Selante Para Tratar Lesão Esplénica

Foi induzida cirurgicamente num porco uma lesão esplénica com um perfurador de tecido para biópsia de 6 milímetros, e o núcleo do tecido foi removido tesouras. O porco foi heparinizado a aproximadamente 2,5x a linha de base. Após a perfuração do tecido, foi observada hemorragia excessiva a partir do baço. Aproximadamente 700 mg (2 ml) de um pó de composição de matriz selante foram aplicados à punção utilizando a extremidade de uma seringa de 12 ml. Não foi utilizada compressão para manter o material no seu lugar. O pó selante formou um coágulo tendo-se observado que o mesmo parou a hemorragia de modo adequado. O local foi irrigado aos 4 minutos após a aplicação. Quando o coágulo foi agarrado com uma pinça, pareceu aderir bastante bem ao tecido e apresentava boa integridade. O coágulo foi removido aos 25 minutos após a aplicação, por arranque, e foi observada a retoma de hemorragia.

Exemplo 13: Teste de Stress Mecânico A barreira de matriz selante foi preparada fazendo reagir 0, 60 a 0,65 g de um pó de composição de matriz selante com 1 ml de plasma porcino num molde de plástico. Deixou- se a mistura a curar à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Ambas as extremidades de um bloco de gel 3x1x0,3 cm de foram tapados com cola de cianoacrilato para criar espaços de aperto para puxar à parte (lxl cm) . As extremidades da fita foram presas com apertos pré-montados. Foi usado um aparelho de teste Chatillon TCD2000 para aplicar um teste de tensão normal na forma rectangular de gel até fracturar, para determinar a resistência à tracção. A resistência máxima, (N) e deflexão na carga máxima (mm) foram medidas estendendo o gel até ruptura. A área superficial efectiva do gel era de 1x0,3 cm, e o comprimento original eficaz do gel era de 1 cm. A resistência a tracção do gel selante foi de aproximadamente 15,3 N/cm2. Foi realizado um teste semelhante numa composição de gel incluindo um primeiro componente reticulável e um 81

ΕΡ 2 049 165/PT segundo componente reticulável, na ausência de um componente formador de hidrogel, e a resistência à tracção observada foi de cerca de 5,1 N/cm2.

Exemplo 14: Teste de Resistência à Descarnação

Em algumas concretizações, uma mistura de pós inclui primeiro e segundo componentes reticuláveis e um componente formador de hidrogel, e é auto-polimerizável dado que dissolve num liquido fisiológico tal como o sangue ou outro fluido corporal. O material pode aderir firmemente a um tecido ou outro local de aplicação através de ligação covalente. A resistência mecânica da aderência ao tecido pode ser examinada usando uma mandrilhadora mecânica para puxar uma matriz selante a partir de um tecido tal como a pele. Neste exemplo, foram realizados vários ensaios de tracção após a formação de barreiras de matriz de selante tal como se segue. Foram preparados uma série de pós de três componentes contendo um primeiro componente reticulável (pentaeritritol poli(etileno glicol) éter tetra-succinimidil glutarato) e um segundo componente reticulável (pentaeritritol poli(etileno glicol) éter tetra-tiol), e uma gelatina reticulada (FloSealMR) , misturando os componentes reticuláveis e a gelatina reticulada em três concentrações diferentes (10%, 20% e 30% do componente reticulável). 0,40 g a 0,45 g do pó dos três componentes foi adicionado a cerca de 0,6 ml de plasma de porcino num molde plástico 3x1x0,3 cm disposto no topo de uma amostra de pele de galinha, e deixou-se curar à temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. Formou-se uma barreira de matriz selante e aderiu firmemente à pele. A barreira de matriz selante formada foi colada a uma placa que foi fixada a um aparelho de teste TCD200 Chatillon. O pico de força máxima (N) foi medido à medida que pele era puxada da barreira de matriz selante. Foi observado um aumento na força de adesão que se correlacionava de modo linear com o aumento na concentração da mistura de PEG (primeiro e segundo componentes reticuláveis) . Os resultados são tal como apresentados na Tabela 4A. 82 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ

Tabela 4A Cone. de mistura de PEG Pele Velocidade, mm/min Tempo de Cura, min Lado de puxar, cm Força N 10% galinha 12,7 80 1 2,00 10% galinha 12,7 80 1 2,10 10% galinha 12,7 80 1 1,70 Média 1,93 Desv. Padrão 0,21 20% galinha 12,7 60 1 3,24 20% galinha 12,7 60 1 2,13 20% galinha 12,7 60 1 3, 41 20% galinha 12,7 70 1 2,10 Média 2,72 Desv.Padrão 0, 71 30% galinha 12,7 70 1 3, 86 30% galinha 12,7 70 1 7,86 30% galinha 12,7 80 1 1,53 30% galinha 12,7 80 1 2,65 30% galinha 12,7 80 1 2,59 30% galinha 12,7 80 1 3, 83 30% galinha 12,7 105 1 3, 32 30% galinha 12,7 107 1 3, 00 Média 3,58 Desv.Padrão 1,89

Exemplo 15: Preparação de Colágenio fibrilar para Suporte em Esponja de Bloco Fundido

Foi preparada uma primeira amostra de colagénio fibrilar tal como se segue. 40g de NaOH foram dissolvidos em 450 cc de H2O a uma temperatura de 25°C. Foram adicionados à solução de NaOH aproximadamente 50 g de fatias de cório de bovino. O 83 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ cório foi agitado durante 80 minutos. A solução de NaOH foi decantada e o cório foi lavado com H20. O cório foi dissolvido em HC1 2M para acertar o pH na gama de 2,3 a 2,4. Continuou-se a agitar durante 18 horas. 1250 ml de colagénio espesso em solução (CIS) foram titulados a pH 7,25 com NaOH 1M a 18°C. Formou-se fibra de colagénio ao longo de um período de 10 horas, e filtrou-se. 240 ml foram precipitados a pH 7,4, e reticulados com 33 μΐ de solução de glutaraldeído a 25% (GA) a 8°C durante 23 horas. O colagénio fibrilar foi liofilizado utilizando um liofilizador Virtis usando um ciclo normalizado.

Uma segunda amostra de colagénio fibrilar foi preparada tal como se segue. Colagénio fibrilar foi reticulado usando 240g de solução viscosa (por exemplo, CIS) . A solução foi diluída através da adição de 60 cc de H20. O pH foi elevado para 9,2 por adição de cerca de 1,8 cc de NaOH 2M. A temperatura da solução foi ajustada para 8°C, e foram adicionados 33 μΐ de GA 25%. A solução foi agitada durante 23 horas, e obteve-se cerca de 54 g de fibras precipitadas. O colagénio fibrilar foi liofilizado utilizando um liofilizador Virtis por um ciclo normalizado.

Exemplo 16: Des-Tamponização do Componente Formador de Hidrogel

Em algumas concretizações, pode ser desejável remover o sal fosfato de um componente formador de hidrogel, tal como o FloSealMR, de modo que o pH do componente formador de hidrogel possa ser facilmente influenciado pelo líquido circundante. A reticulação in-situ dos componentes formadores de hidrogel podem ajudar um composto de matriz selante aderir a tecido após a aplicação. Em alguns casos, a aderência pode ser mais eficaz a determinados valores de pH. Por exemplo, alguns materiais à base de gelatina podem passar por aderência mais facilmente a valores de pH inferiores a 6 ou 7. FloSealMR foi lavada com H20 numa proporção de 1:50, e o pH da suspensão foi ajustado ou acidificado com HC1 0,01M ou NaOH 0,01M a um pH entre 2 e 7. A pasta de gelatina húmida foi filtrada e seca numa estufa de ar forçado a 32°C durante 12 a 20 horas e foi levemente moída com almofariz e pilão. Pó de gelatina seca foi 84 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ adicionado a uma solução de PEG misturado para reticulação in situ. A pasta foi misturada durante 30 segundos e imediatamente aplicada à superfície do papel de pesagem totalmente saturado com 25 mM de tampão fosfato a pH 7,4. Os tempos de polimerização foram registados, e os resultados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5 Amostra pH de FloSeal1® pH de tampão para PEG (A/B) Tempo de Gelificação (minutos) 1 7,6 6 3 2 7,6 6 5 3 6 6 30 4 6,5 6 20 5 4,0 6 90

Exemplo 17: Preparação de Pasta de PEG

Numa concretização, 0,8 g de PEG-succinimida em pó e 0,8 g de PEG-tiol em pó foram cuidadosamente misturados por agitação, e colocados num balão de fundo redondo de 100 ml o qual tinha sido completamente cheio com N2. O pó misturado foi fundido num banho de óleo a 40°C-50°C com agitação manual suave durante 30 minutos, e deixou-se arrefecer. Foi removida uma película sólida do frasco com uma espátula. Numa outra concretização, um pó de mistura de PEG-succinimida e PEG-tiol foi dissolvido numa solução ácida de colagénio (por exemplo, 0,3%) ou gelatina (por exemplo, 2%), e liofilizada. Crê-se que o colagénio fibrilar ou gelatina podem ajudar a desprender a matriz e melhorar o manuseamento da pasta de PEG.

Numa composição comparativa, 1,2 g de fibra de colagénio foram dissolvidos em 100 cc de HCl pH 2, aqueceu-se a 35°C em banho de água durante 1 a 2 horas e diluiu-se com HCl pH 2 para obter um produto CIS 0,3%. 0,2 g de PEG-succinimida e 0,2 g de PEG-tiol foram dissolvidos em 2 cc do CIS 0,3%. A mistura resultante foi vertida para uma bandeja, e liofilizou-se durante um ciclo de 22 horas para produzir uma pasta de PEG. Em ainda outra concretização, 2g de gelatina foram dissolvidos em 100 cc de HCl pH 2 em banho de água a 85 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ 35°C. 4g de uma mistura em pó de dois componentes PEG foi dissolvida em 2 cc de solução de gelatina e foi liofilizada para proporcionar uma pasta de PEG.

Numa concretização relacionada, foram preparadas pastas de PEG por liofilização de soluções mistas de PEG-SG, PEG-SH, e colagénio, a pH 2,0. Os estudos em animais foram realizados em cápsulas de figado raspado num modelo de porcino heparinizado. Foram adicionadas duas gotas de tampão fosfato 0,2 M (pH 9,0) à superfície do figado, o qual sangrava lentamente. Foi colocado um pedaço de pasta sobre o local, sem qualquer compressão. Aos 5 e 10 minutos, foi testada a adesão de cada um das pastas de PEG no local. Observou-se que a actividade de PEG-SG não foi reduzida durante o processo de preparação, e que as pastas de PEG aderiram ao tecido do figado raspado através de ligação covalente. A composição e desempenho in vivo das amostras testadas encontram-se resumidos na Tabela 6.

Tabela 6 Amostra Cone. de PEG-GS (%, p/v) Cone . de PEG-SH (%, p/v) Cone. de gelatina (%, p/v) Cone. de CIS (%, p/v) %massa de colagénio PEG após liofilização Desempenho in vivo (aderência) 1 20 20 2 0 1,0% Excelente 2 20 20 0 0,29 1,5% Excelente 3 20 20 0 0, 52 2,6% Bom

Exemplo 18: Material de Pasta de PEG Pulverizado 400 mg de CoSealMR pré-misturado, 1 g ed FloSealMR (por exemplo, pH 7,1 a 9,5; diâmetro de particula de 70 a 400 μιη) , e 2 a 3 cc de H2O foram combinados numa pasta mista, e liofilizou-se durante um ciclo de 22 horas para formar uma pasta. Tal como representado na FIG. 9, a pasta 900 foi posteriormente quebrada 910, esmagada, e fragmentada em pó 920 pó, e colocada numa seringa 930 (por exemplo, uma seringa de 5 cc ou 10 cc) . A ponta 940 do corpo de seringa foi removida com uma lâmina, a mistura em pó 920 foi aplicada num local com lesão 950, e a actividade selante foi observada in situ. Exemplos de resultados são discutidos nos Exemplos 10-12. Numa outra concretização, foi preparada 86 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ pasta a partir de uma suspensão de três componentes, conforme descrito no Tabela 7.

Tabela 7 Amostra PEG de dois componentes pré-misturados FloSeal1'® H20 PEG % 1 360 mg 500 mg 2,3 cc 42% 2 200 mg 500 mg 1,2 cc 48%

Os resultados do teste dos exemplos de formulações de acordo com algumas concretizações revelaram as seguintes características apresentadas na Tabela 8.

Tabela 8 Amostra pH de FloSealMR Peso de (proporção) FloSealMR Peso de PEG misto Diâmetro de Partícula de FloSealMR 1 9,2 5g 2,5 g 294 mM 2 7,7 5g 2,5 g 308 mM

Exemplo 19: Preparação de Blocos Fundidas de Composição de Matriz Selante

Foram preparados blocos de PEG com pré-misturas de CoSealMR fundido. Três componentes em pó foram preparadas misturando FloSeal1®1 em pó de diferentes valores de pH e CoSealMR pré-misturado (por exemplo, ambos os componentes de PEG sob a forma de pó) de acordo com várias proporções de peso. Foram utilizadas esponjas de colagénio liofilizado como cama de suporte de reserva para suportar a mistura derretida de três componentes. Numa concretização, conforme representado na FIG. 10, 0,5 a 1 g de composição de matriz selante 1000 foram colocados no topo de uma secção de 3x3cm2 de esponja 1010. A esponja e a matriz selante foram cozidas numa estufa a 60-70°C durante 1 a 2 minutos, e deixou-se arrefecer num exsicador para minimizar ou evitar o contacto com o ar. Foi observado gue o pó de matriz selante formou uma pelicula grossa ligou-se à esponja para formar um bloco fundido 1020. Em concretizações relacionadas, foram preparadas várias esponjas, tendo cada uma dimensões de 3x3x0,3cm3. Algumas esponjas foram revestidas com uma mistura de três componentes do primeiro e segundo componentes 87 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ reticuláveis e componente formador de hidrogel. Algumas esponjas foram revestidas apenas com uma mistura de dois componentes do primeiro e segundo componentes reticuláveis. Todos os blocos fundidos foram testados in situ num local da lesão do figado. Os resultados são mostrados na Tabela 9.

Tabela 9 Amostra de esponja de pasta fundida Formulações de três componentes Desempenho in vivo pH de FloSeal^ Peso de FloSeal1'® (g) Peso de CoSealMR (g) Peso de três componentes suportados em esponja (g) Fluxo de hemorragia 1 9 0, 5 0,2 0,4 Selagem mínima ou nenhuma 2 8 0, 5 0,2 0,4 Selagem mínima ou nenhuma 3 8 0, 5 0,2 0,4 Selagem mínima ou nenhuma 4 n/a 0 0, 5 0,4 Selagem mínima ou nenhuma 5 n/a 0 0,5 0,4 Selagem mínima ou nenhuma 6 9 1 0,4 00 o selagem

Em concretizações relacionadas, foram preparadas várias composições em pó. Algumas composições incluíam uma mistura de três componentes do primeiro e segundo componentes reticuláveis e componente formador de hidrogel. Algumas composições incluíram somente uma mistura de dois componentes de primeiro e segundo componentes reticuláveis. Todas as composições foram testadas in situ num local da lesão do fígado. Os resultados são apresentados na Tabela 10. 88

ΕΡ 2 049 165/PT

Tabela 10 Amostra Formulações de três componentes Desempenho in vi vo pH de FloSealMR Peso de FloSealMR (g) Peso de CoSealMR (g) Peso de três componentes aplicados à lesão (g) Fluxo de hemorragia 1 9 0,5 0,2 0,4 a 0,5 Selagem mínima ou nenhuma 2 8 0,5 0,2 0,4 a 0,5 Selagem mínima ou nenhuma 3 9 0,5 0,2 0,4 a 0,5 Selagem mínima ou nenhuma 4 N/a 0 0,5 0,4 a 0,5 Selagem mínima ou nenhuma 5 n/a 0,01 lisina 0,5 0,4 a 0,5 Selagem mínima ou nenhuma

Exemplo 20: Efeito da radiação γ no Desempenho In Vivo

Foram preparadas composições de matriz selante em pó e composições de matriz selante em suporte de esponja e algumas foram γ-irradiadas para determinar os efeitos dos raios γ no desempenho in vivo. Não foram observados efeitos, tal como mostrado na Tabela 11.

Tabela 11 Exemplo de esponj a Formulações de três componentes Desempenho in vivo pH de FloSeal™ Peso de FloSeal1'® (g) Peso de CoSeal'® (g) Peso de três componentes suportados em esponja (g) Fluxo de hemorragia 1 9 0, 5 0,2 0,7 selagem 2 8 0, 5 0,2 0,7 selagem 3 (γ) 9 0, 5 0,2 0,7 selagem 4 (γ) 8 0,5 0,2 0,7 selagem 5 9 0,5 0,2 0,7 selagem 6 8 0,5 0,2 0, 65 selagem 7 8 0,5 0,2 0, 6 selagem 89

ΕΡ 2 049 165/PT

Tabela 11 Exemplo de esponj a Formulações de três componentes Desempenho in vivo pH de FloSealMR Peso de FloSealMR (g) Peso de CoSealMR (g) Peso de três componentes suportados em esponja (g) Fluxo de hemorragia Amostra de pó Formulações de três componentes Desempenho in vivo pH de FloSeal™ Peso de FloSealMR (g) Peso de CoSeal1® (g) Peso de três componentes aplicados à lesão (g) Sangramento fluxo 1 9 0,5 0,2 0, 5 selagem 2 8 0,5 0,2 0,5 selagem 3 (γ) 9 0,5 0,2 0, 5 selagem 4 (Y) 8 0,5 0,2 0, 5 selagem

Exemplo 21: Efeito do pH no Desempenho Jn Vivo

Foram realizados estudos in vivo para avaliar o efeito dos valores de pH de um componente formador de hidrogel, e o efeito dos métodos de aplicação manual, na reticulação in situ. Foram comparados um FlosealMR de pH 6,75 numa primeira composição selante e um FlosealMR de pH 9,5 numa segunda composição selante. Em alguns casos, a composição da matriz selante foi manualmente mantida em contacto com a lesão, e em outros casos, a composição de matriz selante foi aplicada ou colocada sobre a lesão sem fixação. A composição com FlosealMR de pH 6,75 proporcionou tempos de reacção aproximadamente 10 a 30 segundos mais lentos do que a composição com FlosealMR de pH 9,5. Exemplos de resultados do estudo são apresentados na Tabela 12. Crê-se que o pH de um componente formador de hidrogel pode desempenhar um papel nas fases iniciais de uma reacção de reticulação. O pH de um componente formador de hidrogel pode afectar a velocidade de formação de gel num ambiente húmido (por exemplo, quando a hemorragia já está a ocorrer). Em alguns casos, se a reticulação não ocorrer de forma suficientemente rápida, a composição selante pode ser impelida para fora do local da lesão. 90

ΕΡ 2 049 165/PT

Tabela 12 Amostra de pó Formulações de três componentes Desempenho in vivo pH de FloSeal™ Peso de FloSealMR (g) Peso de CoSealMR (g) Peso de três componentes aplicados à lesão (g) Fluxo de Hemorragia Local de aplicação/método P 7 0, 5 0,2 0, 5 sem selagem quadrado de fígado (c/s retenção) P 9 0, 5 0,2 0, 5 selagem quadrado de fígado (c/s retenção) P 7 0, 5 0,2 0, 5 selagem quadrado de fígado (c/s retenção) P 9 0, 5 0,2 0, 5 selagem quadrado de fígado (c/s retenção) P 7 0, 5 0,2 0, 5 selagem veia esplénica (c/s retenção) P 9 0, 5 0,2 0, 5 selagem veia esplénica (c/s retenção)

Exemplo 22: O uso de SURGIFOAM1® como Componente Formador de Hidrogel

Misturas de COH102 em pó (penta-eritritol tetraquis-[1-(1'-oxo-5'succinilpentato)-2-poli(oxietileno)glicol]éter), COH206 em pó (penta-eritritol tetraquis[mercaptoetil-poli(oxietileno)glicol]éter), e Pó de Gelatina Absorvível SURGIFOAMmr (Ethicon, Somerville, NJ) foram misturados em proporções de 1:1:2, 1:1:4 e 1:1:8 em peso e introduzidas em seringas de 5 mL modificadas. As misturas resultantes eram pós que fluíam livremente substancialmente secos. Para cada composição, foram aplicados dois gramas com compressão suave a uma lesão cirurgicamente criada (aproximadamente com 1 cm x 1 cm x 0,3 cm de profundidade) no fígado de um porco. Para cada uma das composições, a compressão foi removida após um minuto. 0 COH102 e COH206 em cada composição reagiram entre si no ambiente húmido da lesão, criando um hidrogel reticulado que incorporou o pó de SURGIFOAMmr e selou fisicamente o local da lesão. Não se observou qualquer hemorragia a partir de qualquer um dos sítios tratados com as composições. Após irrigação das lesões tratadas com solução salina 5 minutos após a aplicação, não se observou ressangramento. 0 exame aos locais tratados duas horas mais tarde, também não assinalou qualquer hemorragia. 91 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ

Exemplo 23: Desempenho Jn vivo da Composição de Matriz Selante com Agente de Coagulação

Foi preparado um pó de composição de matriz selante, contendo FloSeal1®1 e CoSealMR (pré-misturados) numa proporção em peso de 4:1. Em algumas concretizações, esta proporção proporciona um grau de reticulação eficaz para atingir os níveis pretendidos de polimerização química e aderência da composição ao tecido. Foi adicionado pó de trombina ao pó da composição de matriz selante em várias concentrações. A mistura resultante foi testada num estudo em animais que envolveu a medição níveis de hemorragia em quadrados de fígado e a comparação da eficiência hemostática da mistura resultante com composições de matriz selante que não continham trombina.

Os materiais a testar incluíram 0,1 g de penta-eritritol tetraquis[mercaptoetilpoli(oxietileno)]éter, 0,1 g de pentaeritritol tetraquis[1-1'-oxo-5'-succinimidil- pentanoato)-2-poli(oxoetileno)glicol]éter, 0,8 g de partículas de gelatina reticulada (FloSeal1®1) , e várias concentrações (5K, 2,5k, l,25k, e 0,625 k u/g) de trombina.

Num ensaio de mistura, os quatro componentes da mistura resultante foram misturados num misturador de tambor rotativo. Num ensaio de reconstituição, quatro ml de solução de trombina (1250 u/ml) foram misturados com 0,8 g de FloSeal e, posteriormente liofilizou-se durante 22 horas. Posteriormente a mistura seca foi misturada com CoSealMR em pó usando um misturador de tambor rotativo. Sem estar ligado a qualquer teoria em particular, crê-se que a formulação de trombina reconstituída contém moléculas de trombina que penetraram no interior da matriz de FloSealMR de modo que a trombina pode permanecer na barreira de matriz selante aumentando a eficácia hemostática. Num ensaio de bloco, foi preparado um bloco aplicando a mistura de quatro componentes resultante (composição de matriz selante mais trombina) no topo de uma esponja Gelfoam, funde-se a mistura, e deixando arrefecer e solidificar. A temperatura da estufa foi fixada em cerca de 60°C até cerca de 65°C durante cerca de um minuto.

Num teste in vivo, foi heparinizado um animal para activar o tempo de coagulação de modo a ser 3-5 vezes 92 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ superior em relação à linha de base. As formulações foram examinadas no espaço de hemorragia de um quadrado de figado (1 cm x 1 cm x 0,2 cm) que foi cirurgicamente produzido de um figado de porcino. A lesão foi imediatamente irrigada após a leitura dos 5 minutos para remover o excesso de pó. As áreas com lesões tratadas foram classificadas aos 1, 5, 10 e 30 minutos. Os materiais foram polimerizados mediante o contacto com o sangue e posteriormente aderiram firmemente à lesão. A barreira de matriz selante selou mecanicamente as áreas hemorrágicas actuando como um selante mecânico ligando-se aos tecidos. Num teste in vitro, a trombina foi aquecida a cerca de 60°C durante 5 minutos e verificou-se estar totalmente activa. Num bloco preparado de Gelfoam, verificou-se que tinha-se perdido a actividade da trombina.

Os resultados de uma avaliação aguda in-vivo são proporcionados na Tabela 13. As hemorragias das lesões foram classificadas entre "0" sem hemorragia, a "4" hemorragia grave. Com base nas classificações de hemorragia aqui observadas, todas as amostras avaliadas não apresentaram hemorragia. Não se observou qualquer vantagem significativa na adição de trombina na composição de matriz selante. O uso de trombina não demonstrou quaisquer benefícios na hemostasia primária, embora possa aumentar a hemostasia secundária/formação de coágulos e cicatrização de feridas.

Tabela 13 N. 0 de Lote Composição Matriz Selante Trombina (unidade/g) misturada ou reconstituída 1' 5' o \—1 20' 1 sem trombina 0 0 0 0 2 com trombina 625, misturada 0 0 0 0 3 com trombina 2500, misturada 0 0 0 0 4 com trombina 5000, misturada 0 0 0 0 5 com trombina 1250, misturada 0 0 0 0 1 sem trombina 0 0 0 0 0 5 com trombina 1250, misturada abortou 5 com trombina 1250, misturada 0 0 0 0 4 com trombina 5000, misturada 0 0 0 0 4 com trombina 5000, misturada 0 0 0 0 93

ΕΡ 2 049 165/PT

Tabela 13 N. ° de Lote Composição Matriz Selante Trombina (unidade/g) misturada ou reconstituída 1' 5' 10' o Cd 1 sem trombina 0 0 0 0 0 6 com trombina 625, reconstituída 0 0 0 0 7 com trombina 2500, reconstituída abortou 7 com trombina 2500, reconstituída 0 0 0 0 7 com trombina 2500, reconstituída 0 0 0 0 8 sem trombina (esponja) 0 0 0 0 0 9 com trombina (esponja) 2500, misturada 0 0 0 0

Exemplo 24: Efeito da Concentração de PEG na Resistência do Gel O efeito da concentração de PEG na resistência do gel é apresentado na Tabela 14 e FIG. 11, de acordo com uma concretização do presente invento. Foram realizados ensaios de tracção após a formação do gel. Os géis foram preparados permitindo a reacção de três componentes em pó (por exemplo, a composição de matriz selante que inclui primeiro e segundo componentes reticuláveis e um componente formador de hidrogel) em moldes de plástico (3x lx 0,3 cm). Foi adicionado plasma de porcino (1 ml, Baxter número do animal S-264) a uma composição de matriz selante em pó (0,60 - 0,65 g) para iniciar a formação de gel, posteriormente deixou-se a curar à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Ambas as extremidades do gel foram tapadas com fita adesiva usando cola de cianoacrilato para criar os espaços de aperto para a separação por puxão (lxl cm). A partir do ensaio de tracção, foram medidos a resistência máxima (N) e deflexão na carga máxima (cm) para estender o gel até à ruptura. A área de superfície eficaz é de lx 0,3 cm. O comprimento original eficaz do gel é de 1,0 cm. Aplicando uma tensão normal à forma rectangular de gel até que se rompa através de um aparelho de teste Chatillon TCD200 foi o factor de determinação da resistência à tracção. Os resultados do teste demonstraram que uma concentração mais elevada de polímero pode aumentar a resistência do gel na composição de matriz selante. 94 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ

Tabela 14 Número da amostra Material testado Área efectiva, cm quadrado Velocidade mm/min Tempo de cura min Resistência N F/0,3cm2 F/0, 1 cm2 334-25-1 10% PEG 1 x 0,3 12,7 60 2,69 8, 97 334-25-2 10% PEG 1 x 0,3 12,7 60 2,12 7,07 334-25-3 10% PEG 1 x 0,3 12,7 60 2,11 7,03 Média 2,31 7,69 DESVIO PADRÃO 0,33 1,11 334-25-4 20% PEG 1 x 0,3 12,7 55 3, 80 12,67 334-25-5 20% PEG 1 x 0,3 12,7 60 3, 93 13, 10 334-25-6 20% PEG 1 x 0,3 12,7 55 3,47 11,57 334-25-7 20% PEG 1 x 0,3 12,7 60 2,33 7,76 Média 3,38 11,28 DESVIO PADRÃO 0,73 2,43 316-80-1 30%, PEG 1 x 0,3 12,7 70 4,04 13, 46 316-80-2 30%, PEG 1 x 0,3 12,7 60 4,55 15,17 316-80-3 30%, PEG 1 x 0,3 12,7 60 5,12 17,06 316-80-4 30%, PEG 1 x 0,3 12,7 60 4,68 15, 60 316-80-5 30%, PEG 1 x 0,3 12,7 55 4,49 14,97 316-80-6 30%, PEG 1 x 0,3 12,7 60 4,52 15, 07 Média 4,57 15,68 DESVIO PADRÃO 0,35 0, 97

Exemplo 25: Efeito da Concentração de PEG na Razão de expansão 0 efeito da concentração de PEG na razão de expansão é apresentado nas Figs. 12, 13, E 14, De acordo com uma concretização do presente invento. Foram realizados estudos de expansão para a caracterização de géis de composição de matriz selante. Quando em contacto com um ambiente aquoso, o polímero hidrofílico expande para formar um hidrogel. Uma 95

ΕΡ 2 049 165/PT vez formado o gel, as moléculas de água difundem-se livremente através de uma rede mais larga formada por partículas de FloSeal^ expandido. Após a adição de mais água, os contactos de COH102-COH206 são quebrados e as moléculas individuais do polímero dossolvem-se em água. Os géis de composição de matriz selante foram preparados através de mistura de CoSealMR e FloSeal”11 em quatro concentrações diferentes (5%, 10%, 20% e 30% p/p) de polímero e através de reacções com a mesma quantidade de plasma de porcino (1,7 ml/g pós) . O gel foi curado durante 30 minutos e depois deixou-se expandir em solução salina à temperatura ambiente. Periodicamente, o tampão foi drenado e foi determinado o peso do gel remanescente. A mudança no peso de gel foi monitorada. A razão de expansão, Q, foi calculada a partir da seguinte equação:

Q=W*/W em que W* é o peso húmido e W é o peso original. A razão de expansão aumentou com o aumento da concentração de polímero. Sem estar ligado por qualquer teoria particular, o declínio aparente da razão de expansão pode ser interpretado como uma perda de material de gel, uma vez que o gel sofre erosão lenta. O final da experiência é classificada como o tempo quando o gel se desintegra em vários pedaços pequenos ou se torna tão viscoso e fraco que é impossível de decantar o tampão livre a partir do gel. A água continua a penetrar para o núcleo e, finalmente, o gel é convertido numa solução viscosa de PEG e partículas de gelatina. Demorou cerca de 2-3 semanas para todos os materiais se desintegrassem (FIG. 14) . Aparentemente a percentagem de CoSeal^ numa composição de matriz selante em pó pode ter um impacto profundo sobre a estabilidade de um gel de composição de matriz selante. A taxa de dissolução do gel de composição de matriz selante varia conforme o grau de reticulação dos polímeros. Os resultados demonstraram que uma elevada concentração de CoSealMR pode provocar uma estabilidade mais forte do gel e também pode causar mais expansão. É de esperar que a persistência relativa de um tal gel in vitro seja semelhante à in vivo. 96

ΕΡ 2 049 165/PT

Os exemplos anteriores providenciam ampla ilustração que as composições de acordo com o presente invento podem ser selantes eficazes. As composições podem polimerizar in situ com o liquido fisiológico ou sangue, e podem selar ou aderir ao tecido muito firmemente.

Apesar de o invento acima mencionado ter sido descrito com algum detalhe a titulo de ilustração e exemplos, para efeitos de clareza de entendimento, será óbvio que determinadas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do âmbito das reivindicações anexadas. Todas as patentes, publicações, artigos, livros e outros materiais de referência aqui discutidos são incorporadas por referência para todos os fins.

Exemplo 26: Avaliação das Propriedades Hemostáticos em Modelos Animal de Determinadas Formulações

Formulação N° 334-77

Um grama de PEG-se em pó (Penta-eritritol tetraquis[mercaptoetilpoli-oxietileno]éter, PM 10.000), lg de PEG-B em pó (Penta-eritritol tetraquis[1-1'-oxo-5'-succinimidilpentanoato-2-poli-oxoeotileneglicole]éter, PM 10.000), e 8 g de FloSealMR foram colocados num frasco de mistura (volume de 50 ml) e carregados no Tumbler Inversina Mixer para mistura. Mistura de três componentes foram misturadas durante 10 minutos até estarem completamente combinados. Seis seringas (volume de 5 ml) foram cheias com cerca de 1,5 g da mistura.

Formulação N° 334-77-1

Uma amostra de 1,5 g da Formulação N° 334-77 foi montada sobre um pedaço de Gelfoam (3x4 cm2, Compressed Gelfoam, fabricado por Upjohn, NDC 0009-0353-01). O Gelfoam coberto com a amostra foi cozido numa estufa de vácuo a 60-65°C durante 1 min até que a amostra começou a fundir. Deixou-se o material arrefecer e solidificar. Dois pedaços da pasta resultante sobre o Gelfoam foram colocados dentro de uma bolsa inserida com dessecante e selada. 97 ΕΡ 2 049 165/ΡΤ

Formulação Ν° 334-77-4

Uma amostra da Formulação N ° 334-77 foi colocada sobre um pedaço de esponja de colagénio e cozida. As esponjas foram preparadas por leve reticulação de fibras de colagénio com solução de glutaraldeido (5k ppm) e por liofilização de solução de colagénio (1,0%) usando Virtis Genesis Freeze Dryers. Um bloco de colagénio (3x4 cm2) foi cuidadosamente colocado em camadas com uma amostra de 1,5 g da Formulação N° 334-77, posteriormente aqueceu-se numa estufa de vácuo a 60-65° C durante 1 min até que a amostra começar a fundir. Posteriormente deixou-se o material arrefecer e solidificar. Cada bloco de colagénio resultante foi colocado numa bolsa inserida com dessecante e selada. Métodos:

Procedimentos cirúrgicos:

Animais (coelhos NZW, fêmea, aproximadamente 3 kg de peso) foram anestesiados e receberam heparinização intravenosa a uma dose de 4.000 IU/kg 30 minutos antes da ressecção parcial do figado.

Modelo de Ressecção Hepática:

Foi realizada uma laparotomia mediana e o lóbulo esquerdo do figado foi exposto e clampeado. Parte do lóbulo esquerdo do figado lateral foi ressecada. O gotejamento foi controlado por aplicação do item teste. O tempo de aplicação e prazo foi padronizado para não exceder 300 segundos. O grampo hemostático foi removido cinco minutos mais tarde, quando era esperado que se atingisse a hemostasia primária.

Modelo de Abrasão Hepática:

Foi realizada uma laparotomia mediana e o lóbulo esquerdo do figado foi exposto. Uma lesão superficial circular com um diâmetro de 2 centímetros e uma profundidade de 2 milímetros foi friccionada na superfície do lóbulo do fígado. Isto foi conseguido usando uma máquina de perfuração

com um acessório de disco de moagem (moinho de furo PROXXON 98

ΕΡ 2 049 165/PT FBS 230/E; tamanho de grão P40, velocidade de rotação 5.000/min). A hemorragia resultante de pequeno vaso ou capilar ou gotejamento assim gerado foi tratada com uma das formulações.

Após permitir um período de observação de 15 minutos, o lóbulo esquerdo do fígado foi devolvido à sua posição original na cavidade abdominal. Se for atingida a hemostasia, o abdómen será fechado e o omento ressecado (Synthofil® 2/0) . A incisão no músculo e pele será suturada separadamente usando Synthofil® 2/0 como suturas interrompidas de um modo com dois níveis.

Após 24 horas, os animais foram sacrificados em anestesia através de uma sobredosagem de Pentobarbital Natrium (aprox. 320 mg iv/animal) . Após a eutanásia foi realizada uma autópsia. O abdómen foi inspeccionado visualmente em relação à presença de sangue e/ou coágulos de sangue resultantes de ressangramento. Caso estivessem presentes, o sangue e/ou coágulos de sangue eram lavados usando esfregaços cirúrgicos previamente pesados, e o peso era determinado. Se não era atingida a hemostasia, os animais eram sacrificados com uma sobredosagem de Pentobarbital Natrium (aprox. 320 mg iv/animal) e apenas serão avaliados os parâmetros primários.

Resultados: O presente estudo teve como objetivo avaliar as propriedades hemostáticas de formulações 334-77, #334-77-1 e #334-77-4). Foram usados dois modelos de hemostasia muito exigentes: (1) a ressecção do fígado e (2) o modelo de superfície do fígado em coelhos altamente heparinizados.

Após aplicação da formulação #334-77 em pó sobre a ferida em hemorragia, verificou-se ser útil pressionar a formulação sobre a superfície da ferida para se obter hemostasia. Foi difícil de alcançar esta pressão com uma luva cirúrgica de látex seca, uma vez que o pó tinha mais aderência à luva do à ferida. Contudo, a aplicação de pressão com uma luva molhada foi mais fácil. A formulação formou uma membrana estreita após entrar em contato com a 99

ΕΡ 2 049 165/PT humidade do sangue. Após a aplicação conduziu à hemostasia em muitos casos, mesmo nos modelos exigentes utilizados neste exemplo. Se a hemostase não era completamente atingida após a primeira aplicação, e havia um sangramento com gotejamento debaixo do camada formada, era dificil parar a hemorragia de modo adequado simplesmente pela aplicação de mais formulação #334-77. Pode ser dificil restringir a aplicação da formulação apenas no local onde é necessário parar a hemorragia uma vez que formulação em pó pode cair para dentro da cavidade abdominal e aderir à cavidade abdominal se não se tomarem os cuidados suficientes. Deste modo, a aplicação adequada da formulação #334-77 é útil.

Por outro lado, a formulação #344-77-4 pode ser facilmente aplicada numa camada de espessura constante ao longo de uma grande área de tecido e com uma pressão suficiente, a fim de obter hemostasia. A formulação #344-77-4, com suporte de bloco de colagénio nativo, manteve-se aderente ao lóbulo do figado após a aplicação e funcionou como um hemostático e cola, colando o bloco sobre a ferida e a cápsula do figado. Tal suporte biodegradável pode adicionar mais eficácia para o componente em pó para a hemostasia. O suporte biodegradável pode igualmente conferir flexibilidade à formulação, o que permite que a formulação possa dobrar sobre as bordas de uma ressecção durante a aplicação. Foram tratados dois animais com esta formulação, uma no modelo de superfície e uma no modelo de ressecção. Foi obtida hemostasia aguda em ambos os modelos. Só o animal tratado no modelo de superfície sobreviveu sem hemorragias pós-operatórias em 24 h. O velo de colagénio estava ainda no local de aplicação após 24 h. O animal tratado no modelo de ressecção sangrou durante a noite até a morte e o velo estava separado. Uma diferença entre as duas experiências foi a de que na primeira o velo foi pressionado no estado seco sobre a ferida e no segundo foi usado pressão com uma compressa de gaze húmida. Os resultados são apresentados na Tabela 15. 100

ΕΡ 2 049 165/PT

Animal Experiência QUADRO 15 1 la Modelo de ressecção hepática: (#334-77-1) Lóbulo esquerdo hepático. Aplicação sem aperto. Durante a aplicação o bloco de Gelfoam estava quebradiço e rígido e não podia ser dobrado em estado seco em torno das bordas da ressecção. Foi pressionado 2 min com uma compressa de gaze humedecida (NaC10,9%) sobre a superfície de ressecção e da cápsula do fígado intacto em torno da ressecção. 0 pó aderiu firmemente à superfície da ferida, mas não em relação ao suporte de Gelfoam. 0 pó não aderente foi lavado com NaCl 0,9%. A hemorragia foi cessada com excepção de um ponto na extremidade da ressecção onde foi observado gotejamento. lb Modelo de superfície: (#334-77-1) Lóbulo esquerdo mediano hepático. Aplicação sem aperto. A formulação #334-77-1 foi pressionada 2 min com uma compressa de gaze humedecida (NaC10,9%) sobre a superfície da ferida. 0 suporte de Gelfoam foi removido. A formulação foi aderindo à ferida. A hemorragia foi interrompida. 2 2a Modelo de ressecção hepática: (#334-77) Lóbulo lateral esquerdo hepático. A Formulação #334-77 foi aplicada na superfície da hemorragia e foi pressionada com a luva de látex seco. 0 pó aderiu mais fortemente à luva do que em relação à superfície da ferida. A camada de formulação foi removida com a luva. 2b Modelo de ressecção hepática: (#334-77) 0 mesmo lóbulo lateral esquerdo mesmo que em 2a. #334-77 foi aplicado com a luva molhada e pressionado 10 s na superfície da ferida. Não se verificou aderência do pó na luva. Formou-se uma camada sobre a superfície da ferida. Observou-se hemorragia com gotejamento debaixo do pó. 2c Modelo de ressecção hepática (# 334-77) Lóbulo esquerdo mediano hepático, aplicação com aperto. Foi aplicada a formulação #334-77 sobre a superfície ensanguentada e pressionada sobre a superfície com uma folha de metal. 0 grampo foi libertado após 5 min. Ligeira hemorragia gotejando na borda da ressecção. Tentou-se parar esta hemorragia através da aplicação mais formulação. A hemorragia não pode ser cessada completamente. A camada de pó foi removida. A camada formou uma membrana estreita, mas somente com pouca aderência à superfície da ferida. 101

ΕΡ 2 049 165/PT

Animal Experiência QUADRO 15 2d Modelo de ressecção hepática: (# WR334-77) 0 mesmo lóbulo hepático que em 2c, mas foi feito um novo corte a fim de promover a hemorragia. Aplicação após o clampeamento do lóbulo hepático. A formulação foi pressionada 2 min com o bisturi sobre a ferida. A hemorragia não pode ser interrompida. 3 3a Modelo de superfície: # WR334-77 + bloco de colagénio equino. Pó de #344-77 pó foi espalhado numa camada fina de um bloco de colagénio equino. Foram puncionadas furos no bloco de colagénio com uma agulha de injecção a partir do lado com a camada de formulação. Alguma da formulação foi pressionada para dentro dos furos. A camada de formulação era mais fina do que nas variantes da formulação. 0 velo foi aplicado seco, sem aperto do lóbulo hepático. 0 velo foi pressionado com a luva durante 2 min. Não se observou hemorragia. 0 bloco foi removido. Observou-se boa adesão à cápsula do fígado e menor adesão à superfície da ferida. 3b Modelo de superfície: Formulação-Colágenio-Bloco (# 334-77-4) Mesma ferida que em 3a. 0 bloco foi aplicado em estado seco, e pressionado durante 2 min sobre a superfície da ferida. 0 bloco foi mais flexível (dobrável) em comparação com o velo com o suporte de Gelfoam. Isto foi favorável para a facilidade de aplicação. A formulação não se soltou do bloco de colagénio. A totalidade da formulação-bloco de colagénio foi aderindo à ferida e cápsula do fígado. Não se observou hemorragia). 0 bloco de colagénio foi humedecido com NaCl a 0,9% e o coelho foi fechado. 0 animal sobreviveu 24 h sendo posteriormente sacrificado. No exame post mortem o velo estava no local e não ocorreu hemorragia durante 24 h.

Lisboa, 2012-05-16

Claims

ΕΡ 2 049 165/PT 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Composição sólida seca de matriz selante compreendendo: um primeiro componente reticulável; um segundo componente reticulável, que se reticula com o primeiro componente reticulável sob condições favoráveis de reacção, e um componente formador de hidrogel; em que a concentração do primeiro e segundo componentes reticuláveis combinados é de 5 a 75% da massa total da composição e a concentração do componente formador de hidrogel é de 25% a 95% da massa total da composição, e em que sob condições favoráveis de reacção o primeiro e segundo componentes reticuláveis reticulam para formar uma matriz porosa com intersticios, e em que o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para preencher pelo menos alguns dos intersticios.
2. Composição da reivindicação 1, em que o primeiro componente reticulável compreende um óxido de polialquileno multi-nucleofilico com m grupos nucleofilicos, e o segundo componente reticulável compreende um óxido de polialquileno multi-electrofilico com n grupos electrofilicos, em que m e n são cada um maior ou igual a dois, e em que m+n é maior ou igual a cinco.
3. Composição da reivindicação 2, em que o óxido de polialquileno multi-nucleofilico ou o óxido de polialquileno multi-electrofilico ou ambos são polietileno-glicol ou um seu derivado.
4. Composição da reivindicação 1, em que o componente formador de hidrogel compreende gelatina e irá absorver água, quando administrado num local alvo de tecido húmido e é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel biocompativel fragmentado, hidrogel esse que compreende subunidades com ΕΡ 2 049 165/ΡΤ 2/4 dimensões que vão desde 0,01 mm até 5 mm quando completamente hidratado e possuem uma expansibilidade de equilíbrio que varia de 400% a 5000%.
5. Composição da reivindicação 1, em que o primeiro componente reticulável compreende múltiplos grupos nucleofilicos e se encontra em forma de pó, em que o segundo componente reticulável compreende múltiplos grupos electrof ilicos e se encontra em forma de pó, em que o componente formador de hidrogel se encontra na forma de pó, e em que sob condições favoráveis de reacção o primeiro e segundo componentes reticuláveis são capazes de reticularem substancialmente de imediato.
6. Composição da reivindicação 1, em que o primeiro componente reticulável adicionado ao segundo componente reticulável proporciona uma composição combinada de componentes reticuláveis, e o primeiro componente reticulável ou o segundo componente reticulável está presente numa concentração na gama de 0,5 a 20 por cento em peso da composição combinada de componentes reticuláveis.
7. Composição da reivindicação 1, em que a proporção em peso do primeiro componente reticulável em relação ao segundo componente reticulável se encontra na gama de 45% a 55%.
8. Composição da reivindicação 1, em que a proporção em peso entre o primeiro e o segundo componentes reticuláveis e o componente formador de hidrogel se encontra na gama de 10% a 30% p/p.
9. Composição da reivindicação 1 que compreende ainda um polissacárido ou uma proteína.
10. Composição da reivindicação 1 que compreende ainda um polissacárido, em que o polissacárido é seleccionado a partir do grupo que consiste em ácido hialurónico, quitina, sulfato de condroitina A, sulfato de condroitina B, sulfato de condroitina C, sulfato de queratina, queratosulfato, heparina, e derivados dos mesmos. ΕΡ 2 049 165/ΡΤ 3/4
11. Composição da reivindicação 1 que compreende ainda uma proteina, em que a proteina é o colaqénio ou um seu derivado.
12. Composição da reivindicação 1, em que o primeiro componente reticulável, o sequndo componente reticulável, e o componente formador de hidroqel se encontram em forma de mistura de pós que é fixada com uma superficie de uma esponja de colagénio compreendendo fibras de colagénio nativo.
13. Composição da reivindicação 1, em que a composição compreende ainda um agente activo.
14. Composição da reivindicação 13, em que o agente activo compreende trombina.
15. Kit para proporcionar hemostasia ou contenção de outro fluido num contexto in vivo compreendendo: um recipiente; e uma composição de mistura de pós disposta dentro do recipiente, compreendendo a composição: um primeiro componente reticulável compreendendo múltiplos grupos nucleofilicos, o primeiro componente reticulável na forma de pó; um segundo componente reticulável compreendendo múltiplos grupos electrofilicos, o segundo componente reticulável na forma de pó, e um componente formador de hidrogel na forma de pó; em que a concentração de combinados do primeiro e segundo componentes reticuláveis combinados é de 5 a 75% da massa total da composição e a concentração do componente formador de hidrogel é de 25% a 95% da massa total da composição, e em que sob condições favoráveis de reacção o primeiros e segundo componentes reticuláveis são capazes de reticular substancialmente de imediato, para formar uma matriz porosa ΕΡ 2 049 165/PT 4/4 com interstícios, e em que o componente formador de hidrogel é capaz de ser hidratado para formar um hidrogel para encher pelo menos alguns dos interstícios. Lisboa, 2012-05-16