CN105209484A - 温敏性骨生长组合物 - Google Patents

Abstract

一种非侵入式可注射组合物，其含有水介质中的I型胶原、成骨生长因子(OSF)如骨形态发生蛋白以及可逆性温敏性的生物可降解聚合物(如泊洛沙姆407)。所述制剂可以非侵入式地施用，例如通过注射施用，从而避免了目前市售的许多骨诱生产品的局限性。可注射的成骨制剂在所需的部位有效诱导骨形成。可注射的悬液可以伴随生物可吸收的骨矿质复合物(例如羟基磷灰石、磷酸三钙)和/或糖胺聚糖(例如透明质酸、硫酸肝素)一起使用，以成型为油灰(putty)和/成板为骨移植替代植入物，从而在骨折愈合和脊柱融合术过程中诱导新骨形成。

Description

温敏性骨生长组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求申请日为2013年3月14日的美国专利申请序列号No.61/783,803的优先权，其在此通过提述并入。

技术领域

本发明涉及促进骨生长的组合物，更具体为用于诱导新骨形成的骨移植替代物(BGS)。

发明背景

当前BGS制剂的外科应用(例如用于骨折修复术或脊柱融合术)可以是侵入式的、耗时且繁冗的，这是由于已经开发用于递送成骨生长因子的递送系统的设计和结构所造成的。

发明概述

我们开发了一种非侵入式的可注射的组合物，其含有水介质中的I型胶原、成骨生长因子(OSF)以及可逆性温敏性的生物可降解聚合物。该制剂可以非侵入式地施用，例如通过注射施用，从而避免了目前市售的许多骨诱生产品的局限性。如已通过例如异位成骨的标准大鼠模型来确定的，所述可注射的成骨制剂有效诱导骨形成。所述温敏性的生物可降解的聚合物控制组合物的流变学特性，以便使其能在室温注射，并且随着其温度升至体温(37℃)，其在递送位点形成含有OSF的生物可相容的凝胶，从而将所述组合物(尤其是OSF)定位在其有用的部位。在所述组合物中使用骨胶原粉，提供了适于OSF的递送基质并提供了促进成骨的生物环境。这种可注射组合物使得能以低OSF浓度进行新骨形成。

在所述组合物的优选实施方案中，OSF是骨形态发生蛋白(BMP)，如BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7(OP-1)。可以使用BMP-2或BMP-4或BMP-6或BMP-7(OP-1)的同源二聚体，同样可以使用所选的BMP的异源二聚体，如BMP-2/7异源二聚体。还可以使用所选的BMP的组合。这些蛋白可以是人蛋白，并且它们可以通过重组方式产生；它们可以低于3.5mg/每克温敏性胶原骨架的浓度存在。组合物还可以包含矿物质如磷酸三钙或羟基磷灰石。组合物还可以包含填充剂或粘度增补剂如透明质酸化合物，尤其是分子量>500Da的透明质酸化合物。所述透明质酸化合物可以是交联的，例如交联的透明质酸，以促进植入部位处骨模(mold)或骨板(slab)的形成。可以包含糖胺聚糖如硫酸软骨素或壳聚糖。

同样在优选的实施方案中，在室温或以下，所述组合物粘度适于从注射器进行注射，例如当组合物从针头尺寸为20G-l.5"的5cc注射器递送时，其展示出≤30牛顿的注射器挤压力。所述组合物可以是可塑的油灰(putty)。所述组合物含有按重量计50％-80％的液体。如通过粒度筛所确定的，胶原的平均粒径为70-425μm。所述组合物成分溶解/悬浮于缓冲溶液或无菌水中。组合物可以包含放射性造影剂，并且所述组合物不需要包含透明质酸化合物。

所述组合物可用于治疗需要诱导骨生长的患者，所述治疗是通过在希望骨生长的部位(例如骨折部位，或对于正在经受或已经受过脊柱融合术程序的患者而言是其脊柱融合部位)注射该组合物。

定义：

术语“透明质酸化合物”包括糖胺聚糖(例如来自活生物来源例如鸟类或细菌来源的天然HA，或合成的HA)，以及透明质酸盐和上述的衍生物，包括聚合胶、交联胶和衍生的透明质酸。

成骨生长因子(OGF)意为影响天然骨形成过程的化合物，如生长与分化因子(GDF)、成骨蛋白(OP)、诱导成骨因子(OIF)。该术语包括骨形态发生蛋白(BMP)如BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7(OP-1)。通常这些因子是为人所熟知的且市售的。

泊洛沙姆可以是非离子三嵌段共聚物，其由两侧的两条聚氧乙烯(聚(氧化乙烯))亲水链和中心的聚氧丙烯(聚(氧化丙烯))疏水链组成。一般参见US3,740,421。泊洛沙姆包括产品Synperonics(CrodaInc.,EdisonNJ)，具体是泊洛沙姆407；普郎尼克(BASFCorporation,FlorhamPark,NJ)；和Kolliphor(BASFCorporation,Tarrytown,NY)，聚乙氧基蓖麻油和血管内阻塞胶(occlusiongel)，其包含20％(盐水中的重量百分比)的纯化的泊洛沙姆407。泊洛沙姆是一个生物可相容性的、水溶性的、具有可逆性温敏性特性(即随着温度升高，其粘度升高)的聚合物的家族。具体而言，所用的泊洛沙姆是无毒性、生物可相容的、水溶性的，且其粘度随着温度在使用范围内升高而降低。在室温，所述组合物是可注射的，但是有粘性的。在加热至体温时，其经历了温度诱导的相变，而其化学组成未发生实际变化(未固化)，从而形成聚合的栓或板。

本发明的一个或多个实施方案的详情在下文的附图和说明书中示出。本发明的其他特征、目的和优点可从说明书和附图以及权利要求书中明显地看出。

附图简述

图1显示了新骨形成的组织学分数：评估了加载于20％普朗尼克F-127中的BBC上的BMP-2诱导骨形成的能力，其与加载于PBS中的BBC上的BMP-2(阳性对照)进行对比；BBC：牛骨胶原。

图2A显示了新骨形成的组织学分数：透明质酸和普朗尼克F-127伴随BBC作为添加的骨架对于BMP-2诱导骨形成的能力的效果。

图2B显示了皮下植入物中新骨形成的组织学分数。评估了作为骨架的多种市售的透明质酸以及BBC/普朗尼克酸：每个点代表一个个体动物，而水平短线代表组中位分数。任意组之间的新骨/软骨形成的组平均分数无显著差异(P>0.05)。

图3显示了皮下植入物中新骨形成的组织学分数：评估了放射性造影剂(Isov)与BBC/22.％普朗尼克酸的组合)：每个点代表一个个体动物，而水平短线代表组中位分数。标注：+P<0.01，与第1组对照(22.5％PL+0μgBMP-2)相比；##P<0.001，与第1组对照相比；^P<0.05，与DGE组相比；PL＝普朗尼克。

图4显示了皮下植入物中新骨形成的组织学分数：评估了珊瑚-羟基磷灰石骨架与BBC/普朗尼克酸IBMP的组合。每个圆圈代表一个个体动物而水平短线是组中位数。标注：+P<0.0l且#P<0.001，与25BBC+0μgBMP+P对照(第1组)对比；PL＝普朗尼克。

图4A显示了皮下植入物中新骨形成的组织学分数。对比了临床使用来源于牛跟腱(BovineAchillesTendon)的胶原(Heliostat-InFuse,Medtronic)与BBC/普朗尼克酸骨架，伴随多种量的BMP-2。每个点代表一个个体动物，而水平短线代表组中位分数。标注：BBC＝牛骨胶原/普朗尼克酸盐，～P<0.05，对比0μg的两组；A^P<0.01，对比0μg的两组；#P<0.001，对比0μg的两组；+P<0.01，对比H-5.4μg组；++P<0.001，对比H-5.4μg组；*P<0.05，对比H-5.4μg组。

图5显示了病理学分数。每个圆圈代表一个个体动物，而水平短线代表新骨/软骨生成的组中位分数。接受含有>1μgBMP-2植入物的(第2-12组)任意组之间组中位分数无显著差异。标注：+P<0.001，与第1组对比；*P<0.01，与第1组对比；#P<0.05，与第1组对比。

图6显示了BBC的份额(lots)和骨架尺寸对样品中每克蛋白的碱性磷酸酶活性的影响。

图7显示了不同比例的HA和普朗尼克F-127对每克蛋白的碱性磷酸酶活性的影响。

图8显示了BBC的份额和骨架尺寸对样品中钙浓度的影响。

图9显示了不同的HA/普朗尼克F-127浓度对样品中钙浓度的影响。

图10显示了不同的胶原骨架对大鼠异位模型中BMP-2的成骨诱导潜力的影响(22.5％普朗尼克F-127作为载体)。

图11显示了载体对大鼠异位模型中BMP-2的成骨诱导潜力的影响(BBC,70-425um作为骨架)。

图12显示了新骨/软骨形成的病理学分数。每个点代表一个个体动物，而水平短线代表组中位分数。任意组之间的新骨/软骨形成分数的组中位分数无显著差异(P>0.05)。

图13显示了HA市售产品植入物在28天后的钙浓度。

图14显示了在大鼠异位模型中作为BMP-2骨架的新批次(批号#17075-43)的BBC的成骨诱导潜力，与现有批次(批号#11848-79)的BBC进行对比。

图15显示了对载体缓冲液、谷氨酸盐和PBS与对照相比对于大鼠异位模型中BMP-2的成骨诱导潜力的评估。

图16对比了两种新载体，2.5％HA和20％普朗尼克F-127/2.5％HA，与20％普朗尼克F-127。

图17显示了不同载体对rhBMP-2诱导骨形成的能力的影响。

图18对比了两种大鼠异位模型：不同载体中皮下(SQ)对比肌内(IM)移植。

图19是病理学分数的散点图。每个点代表一个个体动物，而水平短线代表组中位分数。标注：+P<0.01，对比第1组对照(22.5％PL+0μgrhBMP-2)；#P<0.001，对比第1组对照；^P<0.05，对比DGE组；PL＝普朗尼克。

图20显示了不同载体对钙浓度的影响。

图21显示了植入物中新骨/软骨的病理学分数。每个点代表一个个体动物，而水平短线代表组中位分数。符号显示了相对于对照的第1组的统计学差异。给予了>3μgrhBMP-2的任意处理组之间无显著差异(P>0.05)。标注：^P<0.05，对比第1组；+P<0.01，对比第1组；#P<0.001，对比第1组。

图22显示了RBC和BBC对钙浓度的影响。

图23显示了载体中不同的BBC粒径、骨架尺寸和造影剂对钙浓度的影响。

图24是皮下植入物中骨/软骨生成的病理学分数的散点图。。每个点代表一个个体动物，而水平短线代表组中位分数。标注：+(P<0.05)，对比BMP-4，3μg)；#(P<0.05，对比BMP-4，0.3μg)；*(p<0.01，对比BMP-4，3μg)；^(P<0.001，对比BMP-4，3μg和0.3μg)；a(P<0.05，对比BMP-4，1μg)；b(P<0.01，对比BMP-4，0.3μg)；PL＝22.5％普朗尼克；sqi＝皮下注射。

发明详述

总体而言，如下的方案阐述了可注射的成骨组合物的形成。OGF、I型胶原和聚合物组分仅供说明之用，并且本领域技术人员会理解，用于临床用途的组分会选自那些已经被批准用于人临床用途的组分。

成骨溶液制备：

将无菌的、可溶的且颗粒状的牛骨来源的I型胶原置于0.01NHCl中的30-40％乙醇(水中的v/v)中，并无菌地向其添加溶于0.01NHCl中的或谷氨酸盐缓冲液(pH4.8)中的BMP溶液，涡旋振荡x3，于4℃温育1小时，然后进行冻干。添加至浓缩物(concentrations)中的BMP的量范围为1-100μg至25-200mg的胶原。随后将冻干的胶原/BMP基质(～25mg)置于150μl的20-40％普朗尼克聚合物(v/v)在PBS(pH7.4)中的溶液中，并在室温(RT)充分混合用于注射。在一些实例中，将胶原-BMP-普朗尼克混合物与填充剂(例如透明质酸、骨矿质或其组合)合并。或者，可以将BMP-骨胶原-普朗尼克聚合物、矿质和糖胺聚糖与放射性造影剂的混合物在无菌环境中冻干，并可以在使用前在操作套件处将其悬于水或缓冲溶液中。

骨诱生测定：

可注射成骨制剂的骨诱导活性可以通过在啮齿动物的皮下部位移植或通过经皮注射入啮齿动物的腹膜(abdominalfascia)或骨骼肌袋(pouches)来进行评估。在注射后第12-21天，收取植入物，并通过生化分析法(碱性磷酸酶和钙含量)和如(Sampath.T.K.和Reddi,A.H.1981)中所述的组织学来测定其骨形成活性。

OGF：

OGF，例如天然的或重组的人BMP，如BMP-2或BMP-7(OP-1)或BMP-4或BMP-6，或混合物，可从商业来源获得。

胶原基质：

I型胶原可以从多个商业来源获得。下文实施例使用的牛骨I型胶原按照(Sampath.T.K.和Reddi,A.H.1981)所述制备。在临床使用中，I型胶原应当是可以用于治疗人的那种。

通过使用标准程序从3-6个月龄的奶牛制备牛去矿质骨干骨基质，DBM(70-420μm)。然后在4℃用6M胍HCl处理牛DBM数小时(16-24小时)，然后用水洗涤，在酸性环境中加热1小时然后在冻干之前用水洗并用酒精处理。通过在使用前以3.5megaRADγ射线处理，将去矿质的、不可溶的、胍-HCL提取的且经酸处理的牛骨I型胶原进行灭菌，然后用含自由基清除剂无菌水洗涤处理并进行冻干。

透明质酸(HA)产品

通过在Framingham,MA的Genzyme设备中发酵兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)从而纯化细菌来源的HA(平均分子量3,000,000)。在Ridgefield,NJ的Genzyme设备中从鸡冠生产HylanA(平均分子量6,000,000)。

Prevelle丝(PrevelleSilk)和真皮凝胶提取物(DermalGelExtra,DGE)为真皮填充物(dermalfiler)。它们制备于Ridgefield,NJ的Genzyme设备。

Hylastan是一种粘度补充剂(visco-supplement)，用于治疗由骨关节炎引起的疼痛。其制备于Ridgefield,NJ的Genzyme设备。Restylane是一种真皮填充物，并且购自QMED,瑞典。

透明质酸(HA)的市售产品的特性

	(DGE)	Prevelle丝	Restylane*	Hylastan/
					总HA浓度(mg/mL)	22	5.5	20	10
凝胶/流体比	85/15	98/2	75/25	65/35
					HA凝胶浓度(mg/mL)	18.7	5.4	15.0	10
HA修饰程度(％)	9	23	3	3.5
					％交联的HA	7	12	1.2	2.7
耐稀释性/％膨胀	～15	<25	50
					G’模量(Pa)	1800	230-260	660
平均粒径(微米)	230	350	300
					化学	DVS	DVS	BDDGE	DVS
HA流体MW[kDa]-预灭菌	-	-	-	3MD
					利多卡因	+	+	-	-
体内滞留时间(月)	9	4-6	6-9	～1-2
					G针	30	31	30	18-21
挤压力(1ml/G30)[N]	33	18*	27

泊洛沙姆407聚合物：

泊洛沙姆407/普朗尼克F-127共聚物(氧化乙烯和氧化丙烯嵌段)购自BASF(MountOlive,NJ)。

所述聚合物溶于PBS中得到20-30％wt/体积的聚合物终浓度。在这个浓度，聚合物显示出热可逆特性、在室温的流体状态以及在体温的凝胶状态。通过向100mL的冷PBS添加20g普朗尼克F-127并在4℃搅拌过夜以获良好溶解，从而制备了20％凝胶。接下来将所述溶液用0.22μm过滤器过滤除菌。

组合物特征：

组合物具有粘性和挤压力，这使其能够在注射器中使用。例如，其从5cc注射器用尺寸为20G-l.5"的针以低于30牛顿的挤压力进行递送。

实施例

实施例1.可注射的成骨制剂诱导了软骨内的骨形成，这是通过对来自异位骨形成的大鼠模型样品外植体的碱性磷酸酶活性、钙含量和组织学评估判断出的。骨诱导活性的水平取决于BMP蛋白浓度(图1)。

实施例2.在这些研究中测验了浓度范围为20-30％的泊洛沙姆407。当所有含泊洛沙姆的制剂都诱导骨形成时，观测到其泊洛沙姆407最佳浓度为20-25％，以加速体内的凝胶形成(图2A)。

实施例3.有或无普朗尼克酸的、胶原-BMP基质伴随高分子量透明质酸(Hyal-A或Hyalastin)溶液经皮注射，也诱导了新骨形成(图2B)。

实施例4.由于可注射成骨制剂的临床使用可能需要荧光检查指引至意图递送部位，我们证明向制剂添加放射性造影剂不干扰体内的骨形成。用临床相关浓度的放射性造影剂(例如Isovue-370)对可注射成骨制剂进行补充，并测试异位骨形成大鼠模型。这项研究的结果揭示了放射性造影剂不干扰该骨形成动物模型中的骨诱导(图3)。

实施例5.由于珊瑚来源的羟基磷灰石已经用作骨缝隙填充物(boneavoidfiller)和带有自体骨移植物的膨胀矿物骨架，我们测验了500R(Interporc,CrossInternational)对于新骨形成的效果。结果提示，珊瑚-羟基磷灰石是可与BBC/普朗尼克酸生物相容的，并形成为可塑的油灰以用作骨移植替代物用于脊柱融合术(图4)。

实施例6.InFuse(Medtronic,MN)已经被批准用于体内融合使用于腰椎。Infuse采用12mg的BMP-2，其吸收了来源于牛跟腱瓣的I型胶原，并被拧入钛金属笼的凹槽中，以刺激新骨形成并融合邻近的腰椎段。我们对比了皮下植入物中的InFuse-牛跟腱胶原与BBC/普朗尼克可注射悬液与多种剂量的BMP-2。结果显示，对于给定体积的胶原植入物，BBC/普朗尼克酸悬液采用了比BMP-2低10-50倍以引发相当的新骨形成，如组织学分数所证明的那样(图5)。

实施例7(09-4662)：

本实施例调查了：

·大鼠异位模型中胶原载体批次(lots)的成骨诱导潜力

·胶原/BMP比率以及骨架质量(scaffoldmass)对成骨诱导潜力的影响

·对于大鼠异位模型中成骨诱导的载体/聚合物比率的变化

研究设计：12组(n＝4)4-5周龄的雄性LongEvans大鼠在胸部接受了双边皮下植入物。手术植入物含有不同浓度的HA/普朗尼克F-127(载体)和不同量的BBC(骨架)中的0-10μgBMP-2(信号)。

研究设计的细节在下表1中列出。

在第14天将所有大鼠经CO₂窒息处死，并获取样本用于分析。

表1：研究设计

*Lot#18034-124

**Lot#18034-104

将每个样品分为两块。一半的样品于10％中性缓冲的福尔马林中固定，包埋在甲基丙烯酸甲酯中，以约5微米切片，并用苏木素和伊红(H&E)、vonKossa和甲苯胺蓝染色。组织病理学评估包括对样品中新软骨和骨形成的定量和半定量评定，所述评定是用表2中所示的记分系统来进行的。还对每个样品的新骨/软骨形成的分布模式进行记分(表3)(LucyPhillips,B.V.Sc.,A.C.V.P,病理学部，建新公司)。

表2：新骨/软骨的记分系统

分数	描述
		0	无新骨
1	1-25％的植入物含有新骨或软骨
		2	25-50％的植入物含有新骨或软骨
3	50-75％的植入物含有新骨或软骨
		4	75-100％的植入物含有新骨或软骨

表3：新骨/软骨的分布模式

模式	描述
		A	病灶；新骨围绕空腔中心形成环边
B	病灶；新骨围绕增殖中的间充质细胞形成环边
		C	病灶；新骨在整个植入物中以实心模式延伸
D	多病灶；新骨围绕多个空腔区域形成环边
		E	多病灶；新骨围绕多个增殖中的间充质细胞部位形成环边
F	多病灶；新骨的一些结节在整个植入物中以实心模式延伸

清除另一半样品的附着组织。将样品置于2ml的冰冷的0.15MNaCl/3mMNaHCO₃中，然后用Polytron匀浆器进行匀浆。然后将其离心，把上清倒出并通过RandoxDaytona化学分析仪来分析总蛋白浓度(TP)和碱性磷酸酶活性(ALP)。(MichelleSearles,药理学/毒理学部；建新公司)。

在5ml的20mM磷酸盐缓冲液中将残余物洗涤两次，然后在5ml的0.6NHCL中4℃提取过夜。然后将其离心，倒出上清并进行钙分析。在VarianICP-OES上于396nm发射光处分析样品，所述分析由建新公司分析研发部MartinHanus完成。

结果：组织病理学评估

病理学分数的散点图如图5中所示。

含有25或50mg的BBC(批号#18034-124)的样品和含有批号#18034-124(新)或批号#10834-104(旧)的样品中新骨/软骨的程度和分布模式是相当的。

对于含有不同浓度的HA/普朗尼克F-127载体的样品，在新骨产生的程度上没有显著差异；然而，随着HA浓度增加，新骨在围绕含BBC骨架的腔体中心的环边而形成和出血的趋势是显著的。

碱性磷酸酶活性

·对于含3μgBMP-2的植入物，碱性磷酸酶浓度没有差异。

·将BBC骨架从25升至50mg(而BBC/BMP-2比例相同)，不导致更高的碱性磷酸酶浓度。

·在5μgBMP-2处，增加载体中HA的浓度和降低普朗尼克F127的浓度不导致碱性磷酸酶浓度的差异。

·在10μgBMP-2负载处，具有较高HA浓度(6％)的样品具有较高的碱性磷酸酶浓度，但不高于测定中的变化。

钙评估

·对于含有3μgBMP-2的植入物而言，旧批次的BBC(批号#10834-104)与新批次(批号#10834-124)相比有较高的Ca含量的趋势。

·BBC骨架从25升至50mg(而BBC/BMP-2比例相同)，不导致更高的Ca浓度。

·在5μgBMP-2处，增加载体中HA的浓度和降低普朗尼克F-127的浓度不导致Ca浓度的差异。

·含有10μgBMP-2和1.5％F-127/6％HA载体的样品具有比其他测试的制剂高25％的Ca浓度。

结论：

·含有25和50mg的BBC的植入物中和含有批号#10834-124和批号#10834-104骨架的植入物中的新骨/软骨的程度和分布模式、钙和碱性磷酸酶浓度是相当的。

·对于载体中含有不同浓度的HA和普朗尼克F-127的植入物而言，新骨产生的程度上没有差异，然而，随着HA浓度增加，新骨作为围绕含BBC骨架的腔体中心的环边而形成和出血的趋势是显著的。

实施例8(09-3467)：

本实施例调查了：

·软骨粒径的影响

·载体中聚合物浓度对成骨诱导的影响

·载体/聚合物比率的影响

·造影剂的影响

研究设计：12组4-5周龄的雄性LongEvans大鼠在胸部接受了双边皮下植入物。

3个组接受了手术植入物，该手术植入物含有5μgBMP-2(信号)，其与不同比例的造影剂(Isovue-370)/普朗尼克F-127家载于25mg的牛骨胶原(BBC,批号#17075-43，骨架)上作为载体(组1-3)。

8个组接受了含有5μgBMP-2(信号)的手术植入物，其载于PBS中的普朗尼克F-127(载体)中的25mg不同的胶原(骨架)上。本项研究中使用的胶原包括如下各项：

·BBC，批号#17075-43,70-425um

·BBC,批号#17075-128,70-250um

·可溶胶原(MPBiologics)

·发热(febrile)胶原(InstantMCH,Ethicon)

两个组接受了含有5μgBMP-2(信号)的手术植入物，所述BMP-2载于20％普朗尼克F-127/2.5％HA或真皮凝胶提取物(DermalGelExtra；DGE)中的25mg的BBC(批号#17075-43)骨架上。

在第14天将所有大鼠经CO₂窒息处死，并获取样本用于分析。

研究设计详情如下表4中所示。

表4：研究设计

收取植入物，在40％酒精中固定，包埋于甲基丙烯酸甲酯中，以约5微米切片并用苏木素和伊红(H&E)及甲苯胺蓝染色。

组织病理学分析由KuberSampath(Genzyme)进行，并包括用表5中所示记分系统对植入物中新骨产生进行半定量评定。

表5：针对新骨的记分系统

分数	描述
		0	无新骨
1	1-20％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
		2	21-40％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
3	41-60％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
		4	61-80％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
5	81-100％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)

结果：含有发热胶原骨架的植入物在收取之时无法鉴定。因此没有取样(第8组)。

数据在表6和图10和11中呈现。

表6：组织学分数

·对于1μgrhBMP-2剂量而言，含有25mg较小颗粒BBC的植入物显示出比等效剂量的大颗粒BBC组更多新骨产生的趋势。

·对于5μgrhBMP-2剂量而言，具有不同粒径的BBC植入物显示出相当的新骨产生。

·可溶胶原与两个批次的BBC相比都显示出非常贫乏的骨产生。

·向22.5％普朗尼克F-127载体添加20或40％Isovue对成骨诱导潜力没有影响。

·当向普朗尼克F-127添加80％Isovue时，植入物中的新骨/软骨产生趋向于更低。

·当向普朗尼克F-127添加HA时，或当把DGE用作唯一载体时，植入物中的新骨/软骨产生趋向于更低。

结论：

·BBC粒径对BMP-2成骨诱导潜力没有影响。

·可溶胶原具有非常贫乏的新骨产生。

·向22.5％普朗尼克F-127载体添加Isovue对成骨诱导潜力没有影响。

·当向普朗尼克F-127添加HA时，或当把DGE用作唯一载体时，植入物中的新骨/软骨产生更低。

实施例9(09-3468)：

本实施例调查了：

·有或没有聚合物时的BMP剂量响应

·通过重组BMP的成骨诱导

·改变载体

研究设计：13组(n＝4只/组)4-5周龄的雄性LongEvans大鼠在胸部接受了双边皮下植入物。

8个组接受了含有10μgBMP-2(信号)的手术植入物，所述BMP-2载于25mg的牛骨胶原(BBC,批号#17075-43，骨架)上，并与不同的透明质酸(HA)市售产品(载体)配制在一起。

5个组接受了含有3-10μgBMP-2或BMP-4的手术植入物，所述BMP-2或BMP-4载于25mg的含有F-127的BBC上。

在第14天或第28天将所有大鼠经CO₂窒息处死，并获取样本用于分析。

研究设计详情如表7中所示。

表7：研究设计

评估：

在尸检时从每个测试部位收集样品(14或28天)。将每个样品切成两块。一半的样品在10％中性缓冲的福尔马林中固定，包埋于甲基丙烯酸甲酯中，以约5微米切片，并用苏木素和伊红(H&E)、vonKossa和甲苯胺蓝染色。

组织病理学评估包括对样品中新软骨和骨形成的定量和半定量评估，并使用表8中所示的记分系统。还对每个样品的新骨/软骨形成的分布模式进行打分(表9)(建新公司病理学部，LucyPhillips,B.V.Sc.,A.C.V.P)。

表8：用于新骨/软骨的记分系统

分数	描述
		0	无新骨
1	1-25％的植入物含有新骨或软骨
		2	25-50％的植入物含有新骨或软骨
3	50-75％的植入物含有新骨或软骨
		4	75-100％的植入物含有新骨或软骨

表9：新骨/软骨的分布模式

模式	描述
		A	病灶；新骨围绕空腔中心形成环边
B	病灶；新骨围绕增殖中的间充质细胞形成环边
		C	病灶；新骨在整个植入物中以实心模式延伸
D	多病灶；新骨围绕多个空腔区域形成环边
		E	多病灶；新骨围绕多个增殖中的间充质细胞部位形成环边
F	多病灶；新骨的一些结节在整个植入物中以实心模式延伸

清除另一半样品的附着组织。将样品置于2ml的冰冷的0.15MNaCl/3mMNaHCO₃中，然后用Polytron匀浆器进行匀浆。然后将其离心，把上清倒出。

在5ml的20mM磷酸盐缓冲液中将残基洗涤两次，然后在5ml的0.6NHCL中4℃提取过夜。然后将其离心，倒出上清并进行钙分析。在VarianICP-OES上于396nm发射光处分析样品(建新公司分析研发部，MartinHanus)。

结果：

在第14天尸检时，所有含有BMP-4的植入物(第11&12组)都无法鉴定并因此未取样。

在第28天尸检时，所有含有22.5％普朗尼克F-127的植入物(第10组)都无法鉴定并因此未取样。

组织病理学评估

在14天和28天针对HA产品的病理学分数的散点图如图12中所示。

·无论使用什么HA载体(P>0.05)，在14天和28天，所有组的植入物中新骨/软骨的形成都具有相当的中位分数。

·任何组中都没有一致的新骨/软骨的分布模式。

钙评价

含有DGE和Prevelle丝的植入物具有与Hylastan和Restylane相比较高的％Ca浓度的趋势。

结论：

·在14天，具有BMP-4的植入物无法鉴定

·在28天，具有22.5％普朗尼克F-127的植入物被完全再吸收

·在14或28天，不论使用什么HA载体，含有rhBMP-2、BBC和HA市售产品的植入物都具有相当的新骨/软骨形成

·在28天，不论使用什么HA载体，含有加载了rhBMP-2和HA市售产品的骨架的植入物具有相当的Ca浓度

实施例10(08-3212)：

本实施例调查了：

·大鼠异位模型中胶原载体批次的成骨诱导潜力

·载体中聚合物浓度对成骨诱导的影响

·载体/聚合物比率的影响

研究设计：在这项研究中使用了16组雄性6周龄LongEvans大鼠。测试品在胸部通过手术双边植入至皮下袋中。

·2个组接受了含有1.5或5μgBMP-2(信号)的植入物，所述BMP-2载于谷氨酸盐缓冲液(载体)中的150μl20％普朗尼克F-127中的25mg的BBC(批号#17075-43，骨架)上(第1&2组)。

·4个组接受了含有0-5μgBMP-2(信号)的植入物，所述BMP-2载于PBS(载体)中的150μl20％普朗尼克F-127中的25mg的BBC(批号#17075-43，骨架)上(第3-6组)。

·2个组接受了含有1.5或5μgBMP-2(信号)的植入物，所述BMP-2载于谷氨酸盐缓冲液(载体)中的150μl20％普朗尼克F-127+2.5％HA中的25mg的BBC(批号#17075-43，骨架)上(第7&8组)。

·4个组接受了含有0-5μgBMP-2(信号)的植入物，所述BMP-2载于40μlPBS(阳性对照)中的25mg的BBC(批号#17075-43，骨架)上(第9-12组)。

·3个组接受了含有0-5μgBMP-2(信号)的植入物，所述BMP-2载于PBS(载体)中的150μl20％普朗尼克F-127中的25mg的BBC(批号#11848-79，骨架)上(第13-15组)。

·1个组接受了含有1.5μgBMP-2(信号)的植入物，所述BMP-2载于谷氨酸盐缓冲液(载体)中的150μl2.5％HA中的25mg的BBC(批号#17075-43，骨架)上(第16组)。

在植入后第14天将所有大鼠经CO₂窒息处死，并获取植入物。

研究设计详情如下表10中所示。

表10：研究设计

*BBC,批号#17075-43

**BBC,批号#11848-79

评估：

收取植入物，在40％酒精中固定，包埋于甲基丙烯酸甲酯中，以约5微米切片并用苏木素和伊红(H&E)及甲苯胺蓝染色。

组织病理学分析由KuberSampath(Genzyme)进行，并包括用表2中所示记分系统对植入物中新骨产生进行半定量评定。

表11：新骨产生的记分系统

分数	描述
		0	无新骨
1	1-20％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
		2	21-40％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
3	41-60％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
		4	61-80％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
5	81-100％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)

结果：

数据如表12和图14、15和16中所示。

表12：组织学分数表

*BBC,批号#17075-43

**BBC,批号#11848-79

对于5μgrhBMP-2剂量，含有两种BBC批次的植入物显示出相当的成骨诱导潜力。对于1.5μgrhBMP-2剂量，新批次的BBC(批号#17075-43)显示出更大的成骨诱导潜力。

对于所有rhBMP-2剂量，两种缓冲液显示出相当的成骨诱导潜力。含有2.5％HA和20％普朗尼克F-127/2.5％HA的植入物，具有可变的组织学分数并且比20％普朗尼克F-127组中小。

结论：

·测试的两个批次的BBC在5μgBMP-2剂量处具有相当的成骨诱导潜力。

·20％普朗尼克F-127/2.5％HA和2.5％HA具有比20％普朗尼克F-127更低的成骨诱导密度。

·两种缓冲液，谷氨酸盐缓冲液和PBS显示出了相当的成骨诱导潜力。

实施例11(09-2764)：

研究目标：

·为了评估不同浓度的OGF载体。

研究设计

12组4-5周龄的雄性LongEvans大鼠在胸部接受了双边皮下植入物。手术植入物体积维持恒定在250μl并使用5μg剂量的BMP-2(信号)。在存在或不存在BBC的情况下测试载体。在移植后第14天将所有大鼠经CO₂窒息处死，并收取植入物。

研究设计详情如下表13中所示。

表13：研究设计

组#	骨架	BMP-2剂量[μg]	植入物载体	#动作/组
					1	BBC	5	谷氨酸盐缓冲液	5
2	-	5	2.5％HA	4
					3	BBC	5	2.5％HA	6
4	-	5	5％HA	3
					5	BBC	5	5％HA	3
6	BBC	5	2.5％Hylan-A	3
					7	-	5	2.5％Hylan-A	3
8	BBC	5	5％Hylan-A	3
					9	-	5	30％普朗尼克F-127	3
10	BBC	5	30％普朗尼克F-127	3
					11	-	5	20％普朗尼克F-127	3
12	BBC	5	20％普朗尼克F-127	3

评估：

收取植入物，在40％酒精中固定，包埋于甲基丙烯酸甲酯中，以约5微米切片并用苏木素和伊红(H&E)及甲苯胺蓝染色。

组织病理学分析由KuberSampath(Genzyme)进行，并包括用表14中所示记分系统对植入物中新骨产生进行半定量评定。

图14：新骨产生的记分系统

分数	描述
		0	无新骨
1	1-20％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
		2	21-40％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
3	41-60％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
		4	61-80％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
5	81-100％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)

结果：

不含BBC的样品(第2、4、7、9和11组)和不含载体的样品(第1组)在收取组织时无法鉴定，因此这些组未收集到样品。

病理学分数如表15和图17中所示。

表15：组织学分数表

结论：

·BBC的存在对于载入了rhBMP-2的植入物诱导骨形成的能力是至关重要的。

·仅含20％普朗尼克作为载体的制剂以一致的方式诱导良好的骨形成

实施例12(08-2973)：

研究目标：

·比较两种大鼠异位模型：皮下(SQ)对比肌内(IM)移植

·评估不同浓度的OGF载体

研究设计：

12组(n＝3/组)4-5周龄的雄性LongEvans大鼠接受了双边植入物。在这之中，6个组在胸部中接受了双边皮下植入物(第1-6组)而6个组接受了背部的肌内植入物(第7-12组)。两组手术植入物(对照)含有125μl的谷氨酸盐缓冲液中的伴随25mgBBC(骨架)的5μgBMP-2(信号)。10种手术植入物含有150μl的不同载体中的伴随25mgBBC(骨架)的5μgBMP-2(信号)。在移植后第14天将所有大鼠经CO₂窒息处死，并收取植入物。

研究设计详情如下表16中所示。

表16：研究设计

评估：

收取植入物，在40％酒精中固定，包埋于甲基丙烯酸甲酯中，以约5微米切片并用苏木素和伊红(H&E)及甲苯胺蓝染色。

组织病理学分析由KuberSampath(Genzyme)进行，并包括用表17中所示记分系统对植入物中新骨产生进行半定量评定。

表17：新骨产生的记分系统

分数	描述
		0	无新骨
1	1-20％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
		2	21-40％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
3	41-60％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
		4	61-80％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)
5	81-100％的植入物区域含有新骨(不含BBC占据的区域)

结果：

数据如表18和图18所示。

表18：组织学分数表

·两个模型的新骨产生的分数之间没有差异。

·具有不同普朗尼克F-127浓度的制剂显示出相似的组织学分数并且与对照是相似的。

·用2.5％HA和HylanA的植入物与对照相比具有较低的组织学分数。

结论：

·植入到皮下和肌内植入部位中的制剂对所有载体显示出相当的成骨诱导分数。

·所有普朗尼克载体都诱导与阳性对照相似水平的骨形成，而两种HA载体诱导比阳性对照更少的骨形成。

实施例13(09-4064)：

研究目标：

·造影剂的效果

·评价聚合物浓度

·评价载体OGF比率

·评价多种载体

研究设计：

10组(n＝4/组)4-5周龄的雄性LongEvans大鼠在胸部中接受了双边皮下植入物。手术植入物具有150μl的体积并含有0或10μgBMP-2(信号)、25mg的牛骨胶原(BBC,批号#17075-183,骨架)和不同类型的载体。

研究设计详情如表19中所示。在第14天将所有大鼠经CO₂窒息处死，并获取样本用于分析。

表19：研究设计

组#	骨架	BMP-2剂量[μg]	载体
				1	BBC	0	PBS中的22.5％普朗尼克F-127(阴性对照)
2	BBC	10	PBS中的22.5％普朗尼克F-127(阳性对照)
				3	BBC	10	80％Isovue 370中的22.5％普朗尼克
4	BBC	10	20％Isovue 370中的22.5％普朗尼克
				5	BBC	10	PBS中的30％普朗尼克F-127
6	BBC	10	5％HA Mw 3MDa/40％普朗尼克F-127
				7	BBC	10	2.5％HA Mw 3MDa/20％普朗尼克F-127
8	BBC	10	真皮凝胶提取物(DGE)
				9	BBC	10	PREVEL丝
10	BBC	10	DGE/22.5％普朗尼克F-127

评估：

在尸检之时从每个测试部位收集样品。

将每个样品且为两块。一半的样品于10％福尔马林中固定，包埋在石蜡中，以约5微米切片，并用苏木素和伊红(H&E)染色。

组织病理学评估包括对样品中新软骨和骨形成的定量和半定量评估，所述评估使用表20中所示的记分系统。还根据表21对每个样品的新骨/软骨形成的分布模式进行记分(建新公司病理学部，LucyPhillips,B.V.Sc.,A.C.V.P)。

表20：新骨/软骨产生的记分系统

分数	描述
		0	无新骨
1	1-25％的植入物含有新骨或软骨
		2	25-50％的植入物含有新骨或软骨
3	50-75％的植入物含有新骨或软骨

4	75-100％的植入物含有新骨或软骨

表21：新骨/软骨产生的分布模式

模式	描述
		A	病灶；新骨围绕空腔中心形成环边(rim)
B	病灶；新骨围绕增殖中的间充质细胞形成环边
		C	病灶；新骨在整个植入物中以实心模式延伸
D	多病灶；新骨围绕多个空腔区域形成环边
		E	多病灶；新骨围绕多个增殖中的间充质细胞部位形成环边
F	多病灶；新骨的一些结节在整个植入物中以实心模式延伸

清除另一半样品的附着组织。将样品置于2ml的冰冷的0.15MNaCl/3mMNaHCO₃中，然后用Polytron匀浆器进行匀浆。然后将其离心，把上清倒出。

在5ml的20mM磷酸盐缓冲液中将残基洗涤两次，然后在5ml的0.6NHCL中4℃提取过夜。然后将其离心，倒出上清并进行钙分析。在VarianICP-OES上于396nm发射光处分析样品(建新公司分析研发部，MartinHanus)。

结果：

组织病理学评估

病理学分数的散点图如图19中所示。

·将普朗尼克F-127浓度增加至30％对中位新骨/软骨分数没有影响(P>0.05)。

·添加20％或80％Isovue–370至22.5％普朗尼克F-127载体对中位新骨/软骨分数没有影响(P>0.05)。

·添加2.5％或5％HA至普朗尼克F-127趋向于较低的中位新骨/软骨分数，尽管其并无统计学显著性(P>0.05)。

·单独DGE或添加至普朗尼克F-127趋向于较低的中位新骨/软骨分数，尽管其并无统计学显著性(P>0.05)。

·Prevelle丝趋向于较低的中位新骨/软骨分数，尽管其并无统计学显著性(P>0.05)。

·含有普朗尼克F-127、普朗尼克F-127+Isovue370或普朗尼克F-127+HA的组，倾向于具有贯穿整个植入物的“实心的(solid)”骨分布或是具有混合模式，所述混合模式中存在实心区域(模式C)和围绕增殖的间充质细胞的中心病灶的环边形成区域(模式B)二者。

·含有DGE或Prevelle丝的组倾向于形成围绕中心腔体区域的新骨的环边，所述中心腔体区域含有BBC骨架和DGE/Prevelle丝材料(模式D&E)。

钙评价

·载体中增加的HA/F-127浓度不导致Ca浓度的任何差异。

·添加20％或80％Isovue至22.5％普朗尼克F-127对Ca浓度没有影响。

·含有普朗尼克F-127的植入物(第2-7和10组)具有比没有普朗尼克F-127的植入物更高的钙浓度(第8&9组)。

结论：

·含有植入物的普朗尼克F-127趋向于具有主要为实心的新骨/软骨分布模式，然而DGE或Prevelle丝植入物经常具有环绕中心腔体区域形成的新骨环边，所述中心腔体区域含有骨架和载体。

·当添加HA或DGE至普朗尼克F-127时，或当DGE或Prevelle丝用作唯一载体时，植入物中的新骨/软骨产生趋向于较低。

·添加20％或80％Isovue至22.5％普朗尼克F-127载体对成骨诱导潜力没有影响。

·含有普朗尼克F-127的植入物(第2-7和10组)具有比没有普朗尼克F-127的植入物更高的钙浓度(第8&9组)。

实施例14(09-4063)：

研究目标：

1.评估多种胶原

2.造影剂的效果

3.评估软骨粒径

4.评估软骨质量(mass)的效果

5.使用真皮凝胶提取物(DGE)评估大鼠异位模型中的OGF

6.评估多种载体

研究设计：

12组(n＝4/组)4-5周龄的雄性LongEvans大鼠在胸部接受了双边皮下植入物。

·10个组接受了含有0-10μgBMP-2(信号)、150μlPBS中的22.5％F-127(载体)和不同量和类型的骨胶原(骨架)的植入物。

·1组接受了含有3μgBMP-2(信号)、150μl22.5％Pluronic/80％Isovue370(载体)和25mgBBC(骨架)的植入物。

·1组接受了含有150μlDGE(载体)中的50μgBMP-2(信号)的植入物。

研究设计详情如下表22中所示。

在第14天将所有大鼠经CO₂窒息处死，并获取样本用于分析。

表22：研究设计

组#	骨架	BMP-2剂量[μg]	载体
				1	BBC 70-425um 25mg	0	22.5％普朗尼克F-127
2	BBC 70-425um 25mg	3	22.5％普朗尼克F-127
				3	BBC 70-425um 25mg	10	22.5％普朗尼克F-127
4	BBC 70-425um 25mg	3	22.5％普朗尼克/80％Isovue 370
				5	BBC 70-250um 10mg	3	22.5％普朗尼克F-127
6	BBC 70-250um 10mg	10	22.5％普朗尼克F-127
				7	BBC 70-250um 25mg	3	22.5％普朗尼克F-127
8	BBC 70-250um 25mg	10	22.5％普朗尼克F-127
				9	BBC 70-250um 25mg	0	22.5％普朗尼克F-127
10	RBC 70-425um 25mg	3	22.5％普朗尼克F-127
				11	RBC 70-425um 25mg	10	22.5％普朗尼克F-127
12	-	50	DGE

评估：

将每个样品切成两块。一半的样品于40％酒精中固定，包埋在甲基丙烯酸甲酯中，以约5微米切片，并用苏木素和伊红(H&E)染色。

组织病理学评估包括对样品中新软骨和骨形成的定量和半定量评估，所述评估使用表23中所示的记分系统。还对每个样品的新骨/软骨形成的分布模式进行了评分(图24)(建新公司病理学部，LucyPhillips,B.V.Sc.,A.C.V.P)。

表23：新骨/软骨产生的记分系统

分数	描述
		0	无新骨
1	1-25％的植入物含有新骨或软骨
		2	25-50％的植入物含有新骨或软骨
3	50-75％的植入物含有新骨或软骨
		4	75-100％的植入物含有新骨或软骨

表24：新骨/软骨产生的分布模式

模式	描述
		A	病灶；新骨围绕空腔中心形成环边
B	病灶；新骨围绕增殖中的间充质细胞形成环边
		C	病灶；新骨在整个植入物中以实心模式延伸
D	多病灶；新骨围绕多个空腔区域形成环边
		E	多病灶；新骨围绕多个增殖中的间充质细胞部位形成环边
F	多病灶；新骨的一些结节在整个植入物中以实心模式延伸

清除另一半样品的附着组织。将样品置于2ml的冰冷的0.15MNaCl/3mMNaHCO₃中，然后用Polytron匀浆器进行匀浆。然后将其离心，把上清倒出。

在5ml的20mM磷酸盐缓冲液中将残余物洗涤两次，然后在5ml的0.6NHCL中4℃提取过夜。然后将其离心，倒出上清并进行钙分析。在VarianICP-OES上于396nm发射光处分析样品。(建新公司分析研发部，MartinHanus)。

结果：

组织病理学评估

病理学分数的散点图如图21中所示。

评估的任意处理组的中位骨产生分数之间没有显著性差异；然而如下的趋势是明显的：

·对于10μgrhBMP-2剂量而言，含有25mg的较小颗粒BBC的植入物(第8组)显示出相对于等效剂量较大颗粒BBC组(第3组，P>0.05)和10mg较小颗粒BBC组(第6组，P>0.05)更大的新骨生产的趋势。

·对于含有25mgBBC+3μgrhBMP-2+22.5％普朗尼克F-127的植入物而言，添加Isovue造影剂对新骨的产生没有显著影响(P>0.05第4组对比第2组)。

·兔骨胶原植入物是评价新骨产生的鲁棒性较差(lestrobost)的模型，正如3和10μg组(第10和第11组)达不到相比于0μg对照的统计学显著性(第9组)。

·注意到兔骨胶原片段经常比70<420mm牛骨片段更大，并且这可能已经影响了每个植入物新骨产生的量。

·含有25mg的BBC的植入物具有与含有10mg的BBC的植入物相当的中位骨产生分数(第7&8组对比第5&6组)。

·虽然在这项研究中，没有骨架的DGE植入物含最高剂量rhBMP-2，但新骨产生分数是可变的。另外，这个组中新骨的分布模式也比其他组更加可变。

钙评估

在本项研究使用的BMP-2的两个剂量处，BBC植入物(第2和第3组)和RBC植入物(第10和第11组)显示出相当的Ca浓度。然而，存在的趋势是含有BBC的植入物的Ca浓度相对于RBC更高。

任何评估的处理组的Ca浓度之间没有差异。

结论：

·在本项研究中使用的BMP-2的两个剂量处，BBC和RBC植入物显示出相当的中位骨产生分数和Ca浓度。在含有BBC和RBC的组中，新骨分布趋向于是病灶至多病灶实心模式。

·载体22.5％普朗尼克中的80％造影剂不影响新骨产生或Ca浓度。

·改变骨架质量不影响新骨产生或Ca浓度。

·含有较小颗粒BBC的植入物显示出相对于等效剂量的较大颗粒BBC组更大的新骨产生趋势。

·DGE组(其不含骨架)新骨产生分数是低且可变的。

实施例15(09-3469)：

研究目标：

·比较两种骨生长因子的成骨潜力：rhBMP-2和rhBMP-4。

·评估多种载体。

·评估手术方法(移植对比注射)对大鼠异位模型中rhBMP-2的成骨潜力的效果。

研究设计：

12组4-5周龄的雄性LongEvans大鼠在胸部接受了双边皮下植入物。手术植入物含有150μlPBS中的22.5％普朗尼克F-127、PBS中的2.5％HA/22.5％普朗尼克F-127或DGE(载体)中的0-3μgBMP-2(信号)和25mg的牛骨胶原(BBC,批号#17075-114,骨架)。

3组4-5周龄的雄性LongEvans大鼠在胸部接受了双边皮下植入物。手术植入物含150μlPBS中的22.5％普朗尼克F-127中的0.3-3μgBMP-4(信号)和25mg的BBC(骨架)。

对2组4-5周龄的雄性LongEvans大鼠用14G或20G针进行皮下注射。手术植入物含150μlPBS中的22.5％普朗尼克F-127中的3μgBMP-2(信号)和25mg的BBC(骨架)。

在第14天将所有大鼠经CO₂窒息处死，并获取样本用于分析。

研究设计的细节在下表25中列出。

表25：研究设计

组#	骨架	信号	载体	递送	#动物/组
						1	BBC	BMP-2,3.0μg	22.5％普朗尼克F-127	植入物	4
2	BBC	BMP-2,1.0μg	22.5％普朗尼克F-127	植入物	4
						3	BBC	BMP-2,0.3μg	22.5％普朗尼克F-127	植入物	4
4	BBC	BMP-2,0.0μg	22.5％普朗尼克F-127	植入物	4
						5	BBC	BMP-4,3.0μg	22.5％普朗尼克F-127	植入物	4
6	BBC	BMP-4,1.0μg	22.5％普朗尼克F-127	植入物	4
						7	BBC	BMP-4,0.3μg	22.5％普朗尼克F-127	植入物	4
8	BBC	BMP-2,3.0μg	DGE	植入物	4
						9	BBC	BMP-2,1.0μg	DGE	植入物	4
10	BBC	BMP-2,3.0μg	2.5％HA/22.5％普朗尼克F-127	植入物	4
						11	BBC	BMP-2,3.0μg	22.5％普朗尼克F-127	注射	4
12	BBC	BMP-2,3.0μg	22.5％普朗尼克F-127	注射	6

评估：

在尸检时从每个测试部位收集样品。

将植入物在10％中性缓冲的福尔马林中固定。将组织脱钙，常规处理，包埋于石蜡中，以约5微米切片，并用苏木素和伊红(H&E)和甲苯胺蓝染色，用于光学显微评估。

组织病理学评估包括对样品中新软骨和骨形成的定量和半定量评估，并使用表26中所示的记分系统。还对每个样品的新骨/软骨形成的分布模式进行打分(表27)。(建新公司病理学部，LucyPhillips,B.V.Sc.,A.C.V.P)。

表26：新骨/软骨的记分系统

分数	描述
		0	无新骨
1	1-25％的植入物含有新骨或软骨
		2	25-50％的植入物含有新骨或软骨
3	50-75％的植入物含有新骨或软骨
		4	75-100％的植入物含有新骨或软骨

表27：新骨/软骨的分布模式

模式	描述
		A	病灶；新骨围绕空腔中心形成环边
B	病灶；新骨围绕增殖中的间充质细胞形成环边
		C	病灶；新骨在整个植入物中以实心模式延伸
D	多病灶；新骨围绕多个空腔区域形成环边
		E	多病灶；新骨围绕多个增殖中的间充质细胞部位形成环边
F	多病灶；新骨的一些结节在整个植入物中以实心模式延伸

结果：

组织病理学评估

病理学分数的散点图如图24中所示。

·加载了0-3μg的rhBMP-2的手术植入物内的新骨和软骨生产中有剂量响应性的增加。

·加载了rhBMP-4的骨架内的骨产生最小，无论剂量如何。

·含有用普朗尼克或HA/普朗尼克递送的3μgrhBMP-2的手术植入物骨/软骨产生的中位分数是最高的。

·含有DGE的植入物具有稍微较低的中位分数，并经常导致围绕腔体中心的骨生产的环边，所述腔体中心含有DGE和BBC骨架。

·通过手术移植递送的rhBMP-2的骨/软骨产生的中位分数与皮下注射相比趋于稍微较高。

·此外，手术移植提供了主要为弥散的新骨分布，而皮下注射导致了可变的分布模式(弥散，或围绕腔体的或多孔中心的新骨的环边的形成)。

结论：

·含有0-3μg的rhBMP-2的植入物的组织学分数中有响应性增长，所述rhBMP-2载于含普朗尼克F-127的BBC上。

·载有rhBMP-4的骨架内的骨产生最小，无论剂量如何。

·具有3μgrhBMP-2和普朗尼克F-127或HA/普朗尼克F-127的骨架与具有DGE的那些相比具有产生更多骨/软骨的非统计学趋势。

·含有普朗尼克F-127或HA/普朗尼克F-127的植入物在整个植入物中具有弥散的骨分布，然而DGE具有围绕腔体中心的新骨的环边。

·存在一种非统计学趋势，即手术移植比皮下注射具有稍微较多的骨/软骨产生。此外，皮下注射导致可变的分布模式。

已经描述了本发明的多种实施方案。然而应当理解，可以在没有脱离本发明的精神和范围的情况下进行多种修改。

Claims (24)

1.一种可注射的组合物，其包含水介质中的成骨生长因子(OSF)、可逆性温敏性的生物可降解聚合物和I型胶原。

2.权利要求1的组合物，其中所述OSF是骨形态发生蛋白(BMP)。

3.权利要求2的组合物，其中所述BMP是BMP-2或BMP-4或BMP-6或BMP-7(OP-1)的同源二聚体或BMP-2/7异源二聚体或所选BMP的组合。

4.权利要求1的组合物，其中所述BMP以低于3.5mg/每克胶原-泊洛沙姆骨架的浓度存在。

5.权利要求1的组合物，其还包含矿物质。

6.权利要求5的组合物，其中所述矿物质是磷酸三钙或合成的或天然的羟基磷灰石。

7.权利要求1的组合物，其还包含透明质酸化合物。

8.权利要求7的组合物，其中所述透明质酸化合物的分子量>500Da。

9.权利要求1或7的组合物，其中所述透明质酸化合物是交联的透明质酸。

10.权利要求1的组合物，其中所述组合物在室温的粘度适于从注射器进行注射。

11.权利要求10的组合物，其中所述组合物展现出≤30牛顿的注射器挤压力。

12.权利要求1的组合物，其中所述组合物含有按重量计50％至80％的液体。

13.权利要求1的组合物，其中所述胶原的平均粒径为70-425μm。

14.权利要求1的组合物，其中所述组合物是可塑的油灰(malleableputty)。

15.权利要求1的组合物，其中所述水介质是缓冲溶液，其中溶解和/或悬浮有PSF、I型胶原和聚合物。

16.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含放射性造影剂。

17.权利要求1的组合物，其中所述组合物为冻干的混合物。

18.权利要求1的组合物，其包含糖胺聚糖。

19.权利要求18的化合物，其中所述糖胺聚糖是硫酸软骨素或壳聚糖。

20.一种治疗对其有需要的患者的方法，包括在需要骨生长的部位注射权利要求1的组合物。

21.权利要求20的方法，其中所述部位是患者已经受过脊柱融合术的部位。

22.权利要求20的方法，其中所述部位是骨折部位。

23.一种制造用于治疗脊柱融合术或骨折部位的药物的方法，所述药物包含权利要求1的组合物。

24.一种用于实现骨生长的药物，所述药物包含权利要求1的组合物。