PT1771474E

PT1771474E - Inibidores de proteína 4 do tipo angiopoietina, combinações e sua utilização

Info

Publication number: PT1771474E
Application number: PT05790352T
Authority: PT
Inventors: Napoleone Ferrara; Hans-Peter Gerber; Xiao Huan Liang
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2004-07-20
Filing date: 2005-07-19
Publication date: 2010-05-03
Also published as: AU2011201436A1; CN102641503A; EP2361931A1; JP2012017331A; CY1109931T1; WO2006014729A3; US7740846B2; EP2361931B1; NZ552956A; JP4947717B2; KR101254815B1; PL1771474T3; JP2008507536A; EP2172482A1; ZA200701183B; ES2339789T3; DK1771474T3; DE602005019167D1; CA2574758A1; RU2007106076A

Description

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DESCRIÇÃO "Inibidores de proteína 4 do tipo angiopoietina, combinações e sua utilização"

CAMPO DO INVENTO

Este invento refere-se na generalidade ao tratamento de doenças humanas e condições patológicas, tais como cancro. 0 invento refere-se a inibidores de proteína 4 do tipo angiopoietina (ANGPTL4), e a combinações de inibidores de ANGPTL4 com outros agentes terapêuticos e a métodos para utilizar estas composições para o diagnóstico e tratamento de doenças ou condições patológicas.

ANTECEDENTES DO INVENTO 0 cancro é uma das principais causas de morte nos Estados Unidos. Têm sido utilizados vários tipos de terapias para tratar cancro. Por exemplo, utilizam-se métodos cirúrgicos para remover tecido canceroso ou necrótico. Utilizam-se como terapias do cancro, a radioterapia, que funciona reduzindo tumores sólidos, e a quimioterapia, que mata células em divisão rápida.

Em 1971, Folkman propôs que a anti-angiogénese pode ser uma estratégia anticancerosa eficaz. Folkman, N. Engl. J. Med 285, 1182-1186 (1971). A angiogénese é o desenvolvimento de nova vasculatura a partir de vasos sanguíneos preexistentes e/ou células estaminais endoteliais em circulação (consultar, e.g., Ferrara e Alitalo, Nature Medicine 5(12) 1359-1364 (1999)). A angiogénese é uma cascata de processos que consiste em 1) degradação da matriz extracelular de uma vénula local após a libertação de protease, 2) proliferação de células endoteliais capilares e 3) migração de túbulos capilares para o estímulo angiogénico. Ferrara et al. Endocrine Rev. 13:18-32 (1992) . 0 crescimento de novos vasos sanguíneos é um pré-requisito durante os processos fisiológicos normais de desenvolvimento embrionário e pós-natal, e.g., embriogénese, cicatrização de ferimentos e menstruação. Consultar, e.g., Folkman e Klagsbrun 2 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Science 235:442-447 (1987). Esta proliferação de novos vasos sanguíneos a partir de capilares preexistentes desempenha adicionalmente um papel chave no desenvolvimento patológico de várias desordens, incluindo, sem lhes estar limitadas, e.g., tumores, retinopatias proliferativas, degenerescência macular relacionada com a idade, psoríase, inflamação, diabetes e artrite reumatóide (AR). Consultar, e.g., Ferrara, Recent Prog. Horm. Res. 55:15-35 (2000), discussão 35-6.

Tendo em consideração a extraordinária importância fisiológica e patológica da angiogénese, tem-se dedicado muito esforço à elucidação dos factores capazes de regular este processo. Foi sugerido que o processo de angiogénese é regulado por um equilíbrio entre moléculas pró-angiogénicas e antiangiogénicas e que está desregulado em várias doenças, especialmente cancro. Consultar, e.g., Carmeliet e Jain Nature 407:249-257 (2000) .

Por exemplo, a angiogénese é dependente de factores excretados, tais como factor de crescimento endotelial vascular A (VEGF, também denominado factor de permeabilidade vascular (VPF)) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF). Consultar, e.g., Ferrara e Davis-Smyth Endocrine Rev. 18:4-25 (1997); e Ferrara J. Mol. Med. 77:527-543 (1999). Além de ser um factor angiogénico em angiogénese e vasculogénese, o VEGF, como factor de crescimento pleiotrópico, apresenta vários efeitos biológicos noutros processos fisiológicos, tais como sobrevivência de células endoteliais, permeabilidade dos vasos e vasodilatação, quimiotaxia de monócitos e influxo de cálcio. Ferrara e Davis-Smyth (1997), supra. Além disso, alguns estudos relataram efeitos mitogénicos de VEGF em alguns tipos de células não endoteliais, tais como células epiteliais de pigmento retinal, células do dueto pancreático e células de Schwann. Consultar, e.g., Guerrin et al. J. Cell Physiol. 164:385-394 (1995); Oberg-Welsh et al. Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132 (1997); e Sondell et al. J. Neurosci. 19:5731-5740 (1999) . em O VEGF pertence a uma família de genes que inclui factor de crescimento de placenta (PIGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e VEGF-E. Estes ligandos ligam-se e coordenam-se com receptores tirosina-quinase expressos em células endoteliais. Por 3 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ exemplo, a família de receptores tirosina-quinase de VEGF inclui Fltl (VEGF-R1) (que liga os ligandos VEGF, VEGF-B e PIGF), Flkl/KDR (VEGF-R2) (que liga VEGF, VEGF-C, VEGF-D e VEGF-E) e Flt 4 (VEGF-R3) (que liga VEGF-C e VEGF-D) . Consultar, e.g., Ferrara et al., Nature Medicine 9(6):669-676 (2003); e Robinson e Stringer, Journal of Cell Science, 114(5):853-65 (2001).

As angiopoietinas são outro grupo de factores de crescimento para o endotélio vascular. Consultar, e.g., Davis et al., Cell, 87:1161-1169 (1996); Suri et al., Cell, 87:1171-1180 (1996); Maisonpierre et al. Science 277:55-60 (1997); e Valenzuela et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 96:1904-1909 (1999) . As angiopoietinas parecem funcionar de uma forma complementar e coordenada com VEGF, em que o VEGF actua no desenvolvimento vascular, enquanto as angiopoietinas actuam mais provavelmente na modulação da remodelação, maturação e estabilização da vasculatura. Consultar, e.g., Holash et al., Oncogene 18:5356-5362 (1999). A angiopoietina 1, a angiopoietina 2, a angiopoietina 3 e a angiopoietina 4 ligam-se a receptores tirosina-quinase Tie2 (também denominados Tek), que são receptores presentes em células endoteliais. Consultar, e.g., Ward e Dumont, Seminars in Cell & Developmental Biology, 13:19-27 (2002). Existe também um receptor órfão Tiel. A angiogénese não depende apenas de factores de crescimento, sendo também influenciada por moléculas de adesão celular (CAM), incluindo integrinas, ligando-se aos seus ligandos presentes dentro da matriz extracelular. Consultar, e.g., Ferrara e Alitalo, Nature Medicine 5(12) 1359-1364 (1999); e Carmeliet, Nature Medicine, 6(3):389-395 (2000). As integrinas facilitam a adesão celular e a migração das proteínas da matriz extracelular presentes nos espaços intercelulares e membranas basais. A família das integrinas das proteínas de adesão celular é composta por, pelo menos, 18 subunidades α e 8 subunidades β que são expressas em pelo menos 22 combinações heterodiméricas αβ. Consultar, e.g., Byzova et al., Mol. Cell., 6(4):851-860 (2000); e Hood e Cheresh, Nature Reviews, 2:91-99 (2002). De entre estas, pelo menos seis das combinações (ανβ3, ανβ5, α5βι, α2βι, ανβι e αιβι) foram implicadas na angiogénese (consultar, e.g., Hynes e 4

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Bader, Thromb. Haemost., 78 (1):83-87 (1997); e Hynes et al.,

Braz. J. Med. Biol. Res., 32(5):501-510 (1999)). A inactivação de vários genes que codificam receptores de adesão específicos ou a administração de anticorpos de bloqueio em modelos animais tem efeitos profundos na resposta angiogénica de células endoteliais. Consultar, e.g., Elicieri e Cheresh, Mol. Med., 4:741-750 (1998) .

Estas moléculas têm sido alvos para terapias contra o cancro. Por exemplo, o reconhecimento de VEGF como um regulador primário da angiogénese em condições patológicas levou a numerosas tentativas para bloquear as actividades do VEGF. Anticorpos inibidores anti-receptores de VEGF, construções de receptores solúveis, estratégias anti-sentido, aptâmeros de ARN contra VEGF e inibidores de tirosina-quinases receptoras (RTK) de VEGF de baixo peso molecular, foram todos propostos para utilização para interferência na sinalização de VEGF. Consultar, e.g., Siemeister et al. Câncer Metastasis Rev. 17:241-248 (1998). Demonstrou-se que os anticorpos neutralizantes anti-VEGF suprimem o crescimento de várias linhas celulares de tumores humanos em ratinhos nus (Kim et al. Nature 362:841-844 (1993); Warren et al. J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstrõm et al. Câncer Res. 56:4032-4039 (1996); e Melnyk et al. Câncer Res. 56:921-924 (1996)) e também inibem a angiogénese intra-ocular em modelos de desordens isquémicas da retina (Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). De facto, um anticorpo anti- VEGF humanizado, o bevacizumab (AVASTIN®, Genentech) foi aprovado pela FDA dos EUA como uma terapia de primeira escolha para cancro colorrectal metastático. Consultar, e.g., Ferrara et al., Nature Reviews Drug Discovery, 3:391-400 (2004).

No entanto, os métodos de tratamento de cancro actuais nem sempre são óptimos. Frequentemente, um único tipo de terapia não consegue suprimir completamente uma condição patológica. Por exemplo, utilizando procedimentos cirúrgicos não é frequentemente possível remover todo o crescimento canceroso. Outros tratamentos de cancro, tais como a quimioterapia, têm numerosos efeitos secundários e/ou a terapia torna-se ineficaz, e.g., porque o cancro desenvolve resistência ao fármaco ou ao tratamento. A inibição de VEGF ou de um receptor VEGR ou do sistema receptor Tie2 por vezes não suprimiu 5

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT completamente o crescimento tumoral. Consultar, e.g., Gerber et al., Câncer Research, 60:6253-6258 (2000); Ferrara et ai·,

Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004); Millauer et al.r Nature 367, 576-579 (1994); Kim et al., Nature 362: 841- 844 (1993); Millauer et al., Câncer Res. 56:1615-1620 (1996);

Goldman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:8795-8800 (1998); Asano et al., Câncer Research, 55:5296-5301 (1995); Warren et al, J. Clin. Invest., 95:1789-1797 (1995); Fong et al., Câncer Res. 59:99-106 (1999); Wedge et al., Câncer Res. 60:970-975 (2000); Wood et al. Câncer Res. 60:2178-2189 (2000); Siemeister et al., Câncer Res. 59:3185-3191 (1999); Lin et al., J. Clin. Invest. 103:159-165 (1999); Lin et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:8829-8834 (1998); e Siemeister et al., Câncer Res. 59, 3185-3191, (1999).

Assim, há uma necessidade urgente de novas terapias mais eficazes para regular os cancros. O invento foca-se nestas e noutras necessidades, tal como será evidente por revisão da seguinte divulgação.

SUMÁRIO DO INVENTO O invento refere-se a inibidores de proteína 4 do tipo angiopoietina (ANGPTL4) e a métodos de utilização de tais inibidores para tratar doenças e condições patológicas, e.g., para bloquear ou reduzir o crescimento tumoral ou o crescimento de células cancerosas, para bloquear ou reduzir as recaídas de crescimento tumoral, etc. O invento proporciona combinações de inibidores de ANGPTL4 e agentes anticancerosos e métodos de utilização destas combinações, para inibir o crescimento tumoral. O invento também proporciona combinações de inibidores de ANGPTL4 e inibidores de angiogénese e métodos de utilização destas combinações, para inibir o crescimento de cancro e/ou desordens que envolvem angiogénese, e.g., desordens neoplásicas (e.g., crescimento tumoral) e não neoplásicas.

Proporcionam-se moduladores de ANGPTL4, e.g., antagonistas ou agonistas de ANGPTL4. Os antagonistas de ANGPTL4 do invento são moléculas que inibem ou reduzem a actividade de ANGPTL4. Um inibidor de ANGPTL4 pode incluir uma substância de baixo peso molecular, um polinucleótido, moléculas anti-sentido, aptâmeros de ARN, ribozimas contra ANGPTL4 ou seus 6 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ polipéptidos receptores, um polipéptido, variantes antagonistas de ANGPTL4, uma proteína isolada, uma proteína recombinante, um anticorpo ou seus conjugados ou suas proteínas de fusão, que inibem uma actividade de ANGPTL4, directa ou indirectamente. Em determinadas concretizações, um antagonista de ANGPTL4 inclui um anticorpo que se liga a ANGPTL4. Em determinadas concretizações do invento, um anticorpo antagonista de ANGPTL4 é um anticorpo que inibe ou reduz a actividade de ANGPTL4 por ligação a uma subsequência ou região específicas da proteína ANGPTL4, e.g., terminal N, domínio em hélice enrolada do terminal N, terminal C, domínio do tipo fibrinogénio do terminal C ou as subsequências de aminoácidos ANGPTL4 (1-183), ANGPTL4 (23-183), ANGPTL4 (1 a cerca de 162), ANGPTL4 (cerca de 162-406), ANGPTL4 (23-406) ou ANGPTL4 (184-406) de ANGPTL4 humana e/ou subsequências de aminoácidos mANGPTL4 (1-183), mANGPTL4 (23-183), mANGPTL4 (1 a cerca de 165), mANGPTL4 (23 a cerca de 165), mANGPTL4 (23-410) ou mANGPTL4 (184-410) de ANGPTL4 murina. Outras subsequências também incluem, sem lhes estar limitadas, e.g., 40-183, 60- 183, 90-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 e 160-406 de hANGPTL4 e, e.g., 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 e 160-410 de mANGPTL4.

Em determinadas concretizações do invento, um antagonista de ANGPTL4 inclui um anticorpo anti-avPs, e.g., um anticorpo antagonista anti-avPs. Em determinadas concretizações, os anticorpos do invento são anticorpos humanizados. Em determinadas concretizações do invento, um antagonista de ANGPTL4 é uma molécula de ARNpi (em inglês SiRNA). Numa concretização, a molécula de ARNpi é uma molécula ANGFTL4-ARNpi, em que a molécula tem como alvo uma sequência de ADN (e.g., GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA, SEQ ID NO:3) de um ácido nucleico que codifica ANGPTL4.

Proporcionam-se métodos para bloquear ou reduzir o crescimento tumoral ou crescimento de uma célula cancerosa. Em determinadas concretizações, os métodos incluem a administração ao tumor ou a células cancerosas de uma quantidade eficaz de um antagonista do tipo angiopoietina 4 (ANGPTL4). Noutra concretização, o antagonista de ANGPTL4 é um anticorpo antagonista anti-avp5. A quantidade eficaz bloqueia ou reduz o crescimento tumoral ou o crescimento da célula 7 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ cancerosa. Também se proporcionam métodos para inibir a migração de células tumorais. Por exemplo, um método inclui a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista de ANGPTL4 às células tumorais, inibindo assim a sua migração. Numa concretização do invento, a administração do antagonista de ANGPTL4 inibe metástases.

Podem combinar-se e/ou administrar-se com um antagonista de ANGPTL4, agentes terapêuticos adicionais, e.g., um ou mais agentes anticancerosos, anticorpos múltiplos para o mesmo antigénio ou para antigénios diferentes, um ou mais agentes antiangiogénicos ou inibidores, medicação para as dores, etc. Também se podem efectuar ou administrar procedimentos terapêuticos adicionais, e.g., procedimentos cirúrgicos, irradiação, etc., ao tumor e/ou células cancerosas nos métodos ou com composições do invento. 0 invento também proporciona composições de combinação, e.g., uma composição que inclui um agente anticanceroso (e.g., agente antiangiogénico, etc.), um antagonista de ANGPTL4 e um transportador (e.g., transportador farmaceuticamente aceitável).

Um agente anticanceroso inclui, sem lhes estar limitados, e.g. agentes anticancerosos conhecidos na especialidade e os que são aqui descritos. Em determinadas concretizações, um agente anticanceroso compreende um ou mais agentes antiangiogénicos, e.g., um antagonista ou inibidor de VEGF, etc. Numa concretização, um antagonista de VEGF compreende um anticorpo anti-VEGF ou seu fragmento activo (e.g., A4.6.1 humanizado, Avastin®, etc.). Em determinadas concretizações, um agente anticanceroso compreende um ou mais agentes quimioterapêuticos.

Proporcionam-se métodos de combinação para bloquear ou reduzir o crescimento tumoral ou o crescimento de uma célula cancerosa. Em determinadas concretizações, os métodos incluem administrar ao tumor ou célula cancerosa uma quantidade eficaz de agente anticanceroso e administrar ao tumor ou à célula cancerosa uma quantidade eficaz de antagonista de ANGPTL4. Alternativa ou adicionalmente, pode administrar-se uma composição de combinação compreendendo uma quantidade eficaz de um agente anticanceroso (e.g., agente antiangiogénico, etc.) e uma quantidade eficaz de um antagonista de ANGPTL4. As 8 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ quantidades eficazes combinadas bloqueiam ou reduzem o crescimento tumoral ou o crescimento de células cancerosas.

Proporcionam-se também métodos de bloqueio ou de redução de recaídas de crescimento tumoral ou de recaída de crescimento de células cancerosas. Em determinadas concretizações do invento, o indivíduo foi sujeito a terapia contra o cancro ou encontra-se concomitantemente a fazer terapia contra o cancro com pelo menos um agente anticanceroso e administra-se ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista de ANGPTL4. A administração da quantidade eficaz de antagonista de ANGPTL4 bloqueia ou reduz a recaída de crescimento tumoral ou a recaída de crescimento de células cancerosas. Em determinadas concretizações, o indivíduo esteve em terapia ou está concomitantemente em terapia com um antagonista de ANGPTL4 e administra-se ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente anticanceroso (e.g., um agente antiangiogénico) , em que a administração da quantidade eficaz do agente anticanceroso bloqueia ou reduz a recaída de crescimento tumoral ou a recaída de crescimento de células cancerosas.

Tipicamente, o tumor ou a célula cancerosa estão num indivíduo. Em determinadas concretizações, o indivíduo esteve em terapia de cancro ou está ou estará concomitantemente em terapia de cancro com pelo menos um agente anticanceroso.

Tipicamente, o indivíduo é um mamífero (e.g., um ser humano). Em determinadas concretizações, os agentes do invento são administrados a um indivíduo. A administração ou as etapas do procedimento podem ser efectuadas por qualquer ordem. Numa concretização, são efectuadas sequencialmente. Noutra concretização, são efectuadas concomitantemente. Alternativa ou adicionalmente, as etapas podem ser efectuadas como uma combinação sequencial e concomitante, por qualquer ordem.

Proporcionam-se também kits de moduladores de ANGPTL4. Em determinadas concretizações, um kit inclui um antagonista de ANGPTL4, um transportador, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis e um recipiente. Numa concretização, um kit inclui uma primeira quantidade de um agente anticanceroso (e.g., um agente antiangiogénico, etc.), uma segunda quantidade de um antagonista de ANGPTL4 e um 9 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ transportador, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis e um recipiente. Noutra concretização, um kit inclui uma quantidade de um agente anticanceroso (e.g., um agente antiangiogénico, etc.) e um transportador, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis numa primeira forma de dosagem unitária; uma quantidade de um antagonista de ANGPTL4 e um transportador, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis numa segunda forma de dosagem unitária; e um recipiente. Podem também incluir-se instruções para a sua utilização.

DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS A figura 1 ilustra uma sequência de ácido nucleico de ANGPTL4 humana (SEQ ID NO. 1). A figura 2 ilustra uma sequência de aminoácidos de ANGPTL4 humana (SEQ ID NO. 2). A figura 3, painel A ilustra ANGPTL4 murina recombinante purificada (23-410) separada por electroforese em gel de SDS- poliacrilamida (SDS-PAGE) (4-20%) na presença de ditiotreitol (DTT) (10 mM) ou na sua ausência. A figura 3, painel B ilustra hANGPTL4 de tipo selvagem (pista 1) e variante (pista 2) separadas num gel de SDS e detectadas por hibridação de "Western", em que a hANGPTL4 variante tem uma substituição R162G e R164E. A figura 4, painéis A, B e C ilustra esquematicamente que ANGPTL4 estimula a proliferação de células tumorais A673 (painel A e B) e células tumorais U87MG (painel B) por transdução de células tumorais com uma construção de expressão de ANGPTL4 e com meio condicionado de células COS (C) transduzido com uma construção de expressão de ANGPTL4 (2) (painel C). No painel B, as células tumorais são transduzidas com (1), que é um controlo de construção de expressão de

AdLacZ, (2), que é a construção de expressão de Ad-ANGPTL4 ou (3), que é a construção Ad-ARNpi ANGPTL4. No painel C, a proliferação das células tumorais A673 é efectuada com meio condicionado de células Hepa (A), HMVEC (B) ou COS (C) transduzidas com (1) uma construção de expressão de LacZ, (2) 10 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ uma construção de expressão de ANGPTL4 ou (3) uma construção de expressão de ANGPTL3. A figura 5 ilustra esquematicamente que mANGPTL4 estimula a proliferação de A673 quando revestem placas de cultura. A figura 6, painéis A e B ilustra esquematicamente várias formas (painel A) de ligação de ANGPTL4 a células tumorais A673 e em várias condições (painel B). A figura 7, painéis A e B ilustra esquematicamente a proliferação de A673 com meio contendo ANGPTL4 quando cultivadas durante 7 dias (painel A) ou 4 dias (painel B) . No painel A (1) é um controlo de construção de expressão de AdLacZ, (2) é uma construção de expressão de Ad-hANGPTL4 e (3) é uma construção de expressão de AdLacZ e rmANGPTL4. No painel B, (1) é sem qualquer adição, (2) é um controlo de tampão, (3) mANGPTL4 (2,5 pg/ml), (4) é hANGPTL4 (2,5 pg/ml), (5) é hIgG-hANGPTL4 (2,5 pg/ml) e (6) hIgG-mANGPTL4 (2,5 pg/ml). A figura 8, painéis A, B e C ilustra esquematicamente que ANGPTL4 promove o crescimento tumoral in vivo (painel A e painel B) e a tendência para escapar ao tratamento antitumoral, e.g., com um anticorpo anti-VEGF (AVASTIN® (Genentech, South San Francisco)), em tumores com administração intratumoral de construções de adenovírus-Angptl4 (painel C) . Os painéis A e C ilustram o tamanho do tumor em cm3 em função dos dias após o implante do tumor. O painel B ilustra o peso de tumor A673 xenoenxertado, 20 dias após o implante. A figura 9 ilustra que ANGPTL4 induz migração celular de células tumorais, A673 e 4T-1, em que (1) é sem adição de soro, (2) é soro fetal de vitelo (FCS) a 10%, (3) é PDGF-BB e (4) ANGPTL4. A figura 10, painéis A e B, ilustra que os anticorpos anti-hANGPTL4 inibem o crescimento de células tumorais, e.g., painel A (células HeLa-S3 e Caki) e painel B (células U87MG, 293 e A693), em que (1) são anticorpos anti-hANGPTL4, (2) é anticorpo de controlo anti-proteina da região critica 1 de 11 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ síndrome de Down (Dscr) e (3) é sem qualquer adição, em que os números por baixo do gráfico de barras indicam a concentração de anticorpo em (yg/ml). A figura 11 ilustra a adesão de células 293-1953 (ανβδ) a uma placa revestida com ANGPTL4 ou vitronectina na concentração indicada em baixo em (pg/ml), em que se utiliza BSA como controlo. A figura 12 ilustra que os anticorpos anti-oç^s e anti-hANGPTL4 eliminam a actividade de adesão celular de ANGPTL4, em que (1) é BSA, (2) é vitronectina e (3) é ANGPTL4.

A figura 13, painéis A, B e C, ilustram a ligação de ANGPTL4 a integrina ανβ5· 0 painel A ilustra a ligação de proteína (mANGPTL4, hANGPTLA-Ntermínai ou hANGPTL4-Cterminai) , utilizando a quantidade indicada, a placas revestidas com ανβ5· 0 painel B ilustra a inibição da ligação de proteína (mANGPTL4, hANGPTL4-Ntermínai ou hANGPTL4-Cterminai) a placas revestidas com ανβδ com anticorpos anti-hANGPTL4. 0 painel C ilustra a ligação de ANGPTL4 e ανβδ, em que (1) é hANGPTL4-Cterminal como revestimento da placa, (2) é hANGPTL4-Cterminal como revestimento da placa e incubada com anti-hANGPTL4, (3) é hANGPTL4-Cterminal como revestimento da placa e incubada com anti-Dscr, (4) é vitronectina como revestimento da placa e (5) é BSA como revestimento da placa, antes de adição de ανβ5· DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

Antes de descrever o invento detalhadamente, deve considerar-se que este invento não está limitado a determinadas composições ou sistemas biológicos específicos, que podem obviamente variar. Também se deve considerar que a terminologia aqui utilizada é apenas com o objectivo de descrever determinadas concretizações e não se pretende que seja limitativa. Tal como utilizadas nesta descrição e reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências no plural salvo se o conteúdo específico determinar obviamente em contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma molécula" inclui opcionalmente uma combinação de duas ou mais tais moléculas e semelhantes. 12 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Salvo definição em contrário, todas as expressões cientificas e técnicas são interpretadas com o significado usualmente utilizado na especialidade à qual se referem. Para os objectivos do invento, definem-se seguidamente as seguintes expressões. A expressão "ANGPTL4" ou "Angptl4" refere-se a polipéptido ou proteina 4 do tipo angiopoietina, conjuntamente com as suas formas de ocorrência natural alélicas, excretadas e processadas. Por exemplo, a ANGPTL4 humana é uma proteina de 406 aminoácidos, enquanto a ANGPTL4 de ratinho é uma proteina de 410 aminoácidos. A expressão "ANGPTL4" é também utilizada para referir fragmentos (e.g., subsequências, formas truncadas, etc.) do polipéptido compreendendo, e.g., fragmento N-terminal, dominio de hélice enrolada, fragmento C-terminal, domínio do tipo fibrinogénio, aminoácidos 1-183, 23-183, 1 a cerca de 162, 23 a cerca de 162, 23-406, 184-406, cerca de 162-406 ou 23-184 da proteína 4 do tipo angiopoietina humana e aminoácidos 1-183, 23-183, 1 a cerca de 165, 23 a cerca de 165, 23-410 ou 184-410 da proteína 4 do tipo angiopoietina murina. Outros fragmentos incluem, sem limitação, e.g., 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60- 406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 e 160-406 de HANGPTL4 e, e.g., 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 e 160-410 de mANGPTL4. A referência a quaisquer tais formas de ANGPTL4 pode ser também identificada no pedido, e.g., por "ANGPTL4 (23— 406)", "ANGPTL4 (184-406)", "ANGPTL4 (23-183)", "mANGPTL4 (23-410)", "mANGPTL4 (184-410)", etc., em que m indica sequência murina. A posição de aminoácidos para um fragmento de ANGPTL4 nativa está numerada tal como indicado na sequência de ANGPTL4 nativa. Por exemplo, a posição de aminoácido 22(Ser) num fragmento de ANGPTL4 é também a posição 22(Ser) em ANGPTL4 humana nativa, e.g., consultar a figura 2. Em geral, o fragmento de ANGPTL4 nativa tem actividade biológica. A expressão "modulador de ANGPTL4" refere-se a uma molécula que pode activar, e.g. um agonista, ANGPTL4 ou a sua expressão, ou que pode inibir, e.g. um antagonista (ou inibidor) a actividade de ANGPTL4 ou a sua expressão. Os agonistas de ANGPTL4 incluem anticorpos e fragmentos activos. Um antagonista de ANGPTL4 refere-se a uma molécula capaz de 13 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ neutralizar, bloquear, inibir, abolir, reduzir ou interferir com as actividades de ANGPTL4, e.g., a proliferação ou crescimento, migração, adesão celulares ou modulação metabólica, e.g., lipido, ou sua expressão incluindo a sua ligação a um receptor de ANGPTL4, e.g., ανβ5· Os antagonistas de ANGPTL4 incluem, e.g., anticorpos anti-ANGPTL4 e seus fragmentos de ligação ao antigénio, moléculas receptoras e derivados que se ligam especificamente a ANGPTL4 sequestrando assim a sua ligação a um ou mais receptores, anticorpos anti-receptores de ANGPTL4 e antagonistas de receptores de ANGPTL4, tais como moléculas pequenas inibidoras do receptor. Outros antagonistas de ANGPTL4 também incluem variantes antagonistas de ANGPTL4, moléculas anti-sentido (e.g., ANGPTL4-ARNpi), aptâmeros de ARN e ribozimas contra ANGPTL4 ou o seu receptor. Em determinadas concretizações, os anticorpos antagonistas de ANGPTL4 são anticorpos que inibem ou reduzem a actividade de ANGPTL4 por ligação a uma subsequência ou uma região especificas de ANGPTL4, e.g., fragmento N-terminal, domínio de hélice enrolada, fragmento C-terminal, domínio tipo fibrinogénio, aminoácidos 1-183, 23-183, 1 a cerca de 162, 23 a cerca de 162, 23-406, 184-406 ou 23-184 da proteína 4 de tipo angiopoietina humana e aminoácidos 1-183, 23-183, 1 a cerca de 165, 23 a cerca de 165, 23-410 ou 184-410 da proteína 4 do tipo angiopoietina murina. Outros fragmentos incluem, sem limitação, e.g., 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 e 160-406 de hANGPTL4 e, e.g., 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 e 160-410 de mANGPTL4. A expressão "anticorpo anti-ANGPTL4" é um anticorpo que se liga a ANGPTL4 com afinidade e especificidade suficientes. O anticorpo anti-ANGPTL4 do invento pode ser utilizado como um agente terapêutico para tomar como alvo e interferir em doenças ou condições em que está envolvida actividade de ANGPTL4. Em geral, um anticorpo anti-ANGPTL4 não se ligará usualmente a outros homólogos de ANGPTL4, e.g., ANGPTL3.

As expressões "VEGF" e "VEGF-A" são utilizadas indistintamente para referir o factor de crescimento de células endoteliais vasculares de 165 aminoácidos e os factores de crescimento de células endoteliais vasculares 14 ΕΡ 1 771 47 4/PT relacionados de 121, 145, 183, 189 e 206 aminoácidos, tal como descrito por Leung et al. Science, 246:1306 (1989), Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991) e Robinson e Stringer, Journal of Cell Science, 144(5):853-865 (2001), conjuntamente com as suas formas alélicas de ocorrência natural e processadas. A expressão "VEGF" também é utilizada para referir fragmentos do polipéptido, e.g., compreendendo os aminoácidos 8 a 109 ou 1 a 109 do factor de crescimento de células endoteliais vasculares humano de 165 aminoácidos. A referência a qualquer de tais formas de VEGF pode ser identificada no presente pedido, e.g., por "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" ou "VEGF165". As posições de aminoácidos para um "fragmento" de VEGF nativo estão numeradas tal como indicado na sequência de VEGF nativo. Por exemplo, a posição de aminoácido 17 (metionina) no fragmento de VEGF nativo é também a posição 17 (metionina) no VEGF nativo. O fragmento de VEGF nativo pode ter afinidade de ligação para com os receptores KDR e/ou Flt-1 comparável com o VEGF nativo.

Um anticorpo "anti-VEGF" é um anticorpo que se liga a VEGF com afinidade e especificidade suficientes. O anticorpo anti-VEGF do invento pode ser utilizado como um agente terapêutico para tomar como alvo e interferir com doenças ou condições em que está envolvida actividade de VEGF. Um anticorpo anti-VEGF não se ligará usualmente a outros homólogos de VEGF, tais como VEGF-B ou VEGF—C, nem a outros factores de crescimento tais como PIGF, PDGF ou bFGF. Consultar, e.g., patentes U.S. 6582959, 6703020; WO 98/45332 WO 96/30046; WO 94/10202; ΕΡ 0666868B1; pedidos de patente US 20030206899, 20030190317, 20030203409 e 20050112126; Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004); e processo de mandatário número P2072R1. O anticorpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV)", também denominado "rhuMAb VEGF" ou "Avastin™", é um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante gerado de acordo com Presta et al. Câncer Res. 57:4593-4599 (1997). Compreende regiões de esqueleto de IgGl humana mutadas e regiões determinantes de complementaridade de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal murino anti-hVEGF A.4.6.1 que bloqueia a ligação de VEGF humano aos seus receptores. Aproximadamente 93% da sequência de aminoácidos de Bevacizumab, incluindo a maior parte das regiões de esqueleto, é derivada de IgGl humana e cerca de 7% da sequência é 15

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT derivada do anticorpo murino A4.6.1. 0 bevacizumab tem uma massa molecular de cerca de 149 000 daltons e é glicosilado. O bevacizumab e outros anticorpos anti-VEGF humanizados são descritos adicionalmente na patente U.S. 6884879 concedida a 26 de Fevereiro de 2005.

Um "antagonista de VEGF" refere-se a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, abolir, reduzir ou interferir com actividades de VEGF incluindo a sua ligação a um ou mais receptores de VEGF. Os antagonistas de VEGF incluem anticorpos anti-VEGF e seus fragmentos de ligação ao antigénio, moléculas receptoras e derivados que se ligam especificamente a VEGF sequestrando assim a sua ligação a um ou mais receptores, anticorpos anti-receptores de VEGF e antagonistas de receptores de VEGF tais como inibidores de molécula pequena das tirosina-quinases VEGFR e proteínas de fusão, e.g., VEGF-Trap (Regeneron), VEGFi2i-gelonina (Peregine). Os antagonistas de VEGF também incluem antagonistas variantes de VEGF, moléculas anti-sentido dirigidas a VEGF, aptâmeros de ARN e ribozimas contra VEGF ou receptores de VEGF.

Um polipéptido de "sequência nativa" compreende um polipéptido com a mesma sequência de aminoácidos que um polipéptido derivado da natureza. Assim, um polipéptido de sequência nativa pode ter a sequência de aminoácidos do polipéptido de ocorrência natural de qualquer mamífero. Este polipéptido de sequência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido por meios recombinantes ou sintéticos. A expressão polipéptido de "sequência nativa" abrange especificamente formas truncadas ou excretadas de ocorrência natural do polipéptido (e.g., uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (e.g., formas de "splicing" alternativo) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipéptido.

Uma "cadeia polipeptídica" é um polipéptido em que cada um dos seus domínios está ligado a outro(s) domínio(s) por ligações peptídicas e não por interacções não covalentes ou ligações dissulfureto.

Uma "variante" polipeptídica significa um polipéptido activo biologicamente com pelo menos cerca de 80% de 16 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ identidade de sequência de aminoácidos com o correspondente polipéptido de sequência nativa. Tais variantes incluem, por exemplo, polipéptidos em que estão adicionados ou removidos um ou mais resíduos de aminoácido (aminoácidos de ocorrência natural e/ou aminoácidos não de ocorrência natural) no terminal N e/ou C do polipéptido. Usualmente, uma variante terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 95% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com o polipéptido de sequência nativa. As variantes também incluem fragmentos polipeptídicos (e.g., subsequências, truncagens, etc.), tipicamente activas biologicamente, da sequência nativa. "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" define-se aqui como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos numa sequência seleccionada, após alinhamento das sequências e introdução de hiatos, caso necessário, para atingir o máximo de percentagem de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequências. O alinhamento para os objectivos de determinar a percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser efectuado de várias formas conhecidas dos peritos na especialidade, por exemplo, utilizando software de computador disponível ao público tal como O software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar os parâmetros adequados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências a comparar. Para os presentes objectivos, contudo, os valores de % de identidade de sequências de aminoácidos são obtidos tal como descrito seguidamente utilizando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi concebido por Genentech, Inc. e foi apresentado com documentação para o utilizador "U.S. Copyright Office", Washington D.C., 20559, onde está registado com o número de registo TXU510087 de "U.S. Copyright" e encontra-se disponível ao público através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para ser 17

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT utilizado num sistema operativo UNIX, e.g., UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Para os presentes objectivos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A relativamente a, com, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B (o que pode ser alternativamente expresso como uma determinada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de aminoácidos relativamente a, com, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma:

100 vezes a fracção X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácidos classificados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento do programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Ter-se-á em consideração que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A com B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B com A. A expressão "variante de ANGPTL4" tal como aqui utilizada refere-se a uma variante tal como descrita anteriormente e/ou uma ANGPTL4 que inclui uma ou mais mutações de aminoácidos na sequência de ANGPTL4 nativa. Opcionalmente, a mutação ou mutações de aminoácidos incluem substituição(ões) de

aminoácido(s). A ANGPTL4 e suas variantes para utilização no invento podem ser preparadas por vários métodos bem conhecidos na especialidade. As variantes de sequência de aminoácidos de ANGPTL4 podem ser preparadas por mutações no ADN de ANGPTL4. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções, inserções ou substituições de resíduos no interior da sequência de aminoácidos de ANGPTL4, e.g., uma sequência de aminoácidos humana codificada pelo ácido nucleico depositado na ATCC com o número de depósito 209284, ou tal como apresentada na figura 2. Pode efectuar-se qualquer combinação de deleção, inserção e substituição para conseguir a construção final com a actividade pretendida. As mutações que serão feitas no ADN 18

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT que codifica a variante não podem colocar a sequência fora do quadro de leitura e, de preferência, não criarão regiões complementares que poderiam produzir uma estrutura de ARNm secundário. EP 75 444A.

As variantes de ANGPTL4 são preparadas opcionalmente por mutagénese dirigida ao local, de nucleótidos no ADN que codifica a ANGPTL4 nativa ou por técnicas de exibição sobre fagos, produzindo assim ADN que codifica a variante, e subsequentemente expressão do ADN em cultura de células recombinantes.

Embora o local para introdução de uma variação na sequência de aminoácidos seja predeterminado, a mutação por si só não tem de ser predeterminada. Por exemplo, para optimizar o desempenho de uma mutação num determinado local, pode efectuar-se mutagénese aleatória no codão ou região alvo e rastreiam-se as variantes de ANGPTL4 expressas relativamente à combinação óptima para a actividade pretendida. As técnicas para fazer mutações de substituição em locais predeterminados em ADN com uma sequência conhecida são bem conhecidas, tais como, por exemplo, a mutagénese específica de local. A preparação das variantes de ANGPTL4 aqui descritas pode ser conseguida com técnicas de exibição sobre fagos, tais como as descritas na publicação PCT WO 00/63380.

Após selecção de tal clone, pode remover-se a região de proteína mutada e colocar-se num vector adequado para produção da proteína, geralmente um vector de expressão do tipo que pode ser utilizado para transformação de um hospedeiro adequado.

As deleções de sequência de aminoácidos estão em geral na gama de cerca de 1 a 30 resíduos, opcionalmente 1 a 10 resíduos, opcionalmente 1 a 5 resíduos ou menos e tipicamente são contíguas.

As inserções na sequência de aminoácidos incluem fusões no terminal amino e/ou carboxilo desde um resíduo até polipéptidos de comprimento essencialmente não limitado, como inserções intra-sequência de resíduos aminoácido únicos ou múltiplos. As inserções intra-sequência (i.e., inserções 19 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ dentro da sequência de ANGPTL4 nativa) podem estar em geral na gama de cerca de 1 a 10 resíduos, opcionalmente 1 a 5, ou opcionalmente 1 a 3. Um exemplo de uma inserção terminal inclui uma fusão de uma sequência de sinal, quer heteróloga, quer homóloga à célula hospedeira, no terminal N, para facilitar a secreção de hospedeiros recombinantes. São variantes de ANGPTL4 adicionais aquelas em que se removeu pelo menos um resíduo de aminoácido na ANGPTL4 nativa e se insere um resíduo diferente no seu lugar. Numa concretização do invento, a variante de ANGPTL4 inclui uma substituição em 162 e/ou 164 de ANGPTL4 ou uma substituição em 169 de mANGPTL4. Tais substituições podem ser efectuadas de acordo com as apresentadas na tabela 1. As variantes de ANGPTL4 podem ser também aminoácidos não naturais, tal como aqui descrito.

Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as semelhanças das propriedades das suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, segunda ed., p. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) não polares: Ala (A), Vai (V), Leu (L) , Ile (I), Pro (P) ,

Phe (F), Trp (W) , Met (M) (2) polares neutros: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gin (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H)

Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base em propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile; (2) neutros hidrófilos: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. 20 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Tabela 1

Resíduo original Exemplos de substituições Substituições preferidas Ala (A) Vai; Leu; Ile Val Arg(R) Lys; Gin; Asn Lys Asn(N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gin (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gin Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg He (I) Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; Ile; Vai; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Vai; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Vai; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Vai (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

Os “resíduos de aminoácidos de ocorrência natural" (i.e. resíduos de aminoácidos codificados pelo código genético) podem ser seleccionados do grupo que consiste em: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gin); ácido glutâmico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); e valina (Vai). Um "resíduo de aminoácido de ocorrência não natural" refere-se a um resíduo, diferente dos resíduos de aminoácido de ocorrência natural listados anteriormente, que é capaz de se ligar covalentemente ao(s) resíduo(s) de aminoácido(s) adjacente(s) numa cadeia polipeptídica. Os exemplos de resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural incluem, e.g., norleucina, ornitina, norvalina, homosserina e outros análogos de resíduos de 21 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ aminoácidos tais como os descritos em Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991) e publicação de pedido de patente US 20030108885 e 20030082575. Sucintamente, estes procedimentos envolvem a activação de um ARNt supressor com um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural seguido por transcrição e tradução in vitro ou in vivo do ARN. Consultar, e.g., publicações de pedidos de patente US 20030108885 e 20030082575; Noren et al. Science 244:182 (1989); e Ellman et al., supra.

Um polipéptido "isolado" é um polipéptido que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações de diagnóstico ou terapêuticas para o polipéptido e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos e não proteináceos. Em determinadas concretizações, o polipéptido será purificado (1) até mais de 95% em peso do polipéptido tal como determinado pelo método de Lowry ou mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna por utilização de um sequenciador de copo rotativo ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando coloração com azul de Coomassie ou com prata. O polipéptido isolado inclui o polipéptido in situ dentro de células recombinantes, dado que não estará presente pelo menos um componente do ambiente natural do polipéptido. No entanto, usualmente o polipéptido isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação. A expressão "anticorpo" é utilizada no seu sentido mais lato e inclui anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo ou intactos), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (e.g., anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos (consultar seguidamente) desde que apresentem a actividade biológica pretendida.

Salvo indicação em contrário, a expressão "anticorpo multivalente" é utilizada ao longo deste fascículo para indicar um anticorpo compreendendo três ou mais locais de 22

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT ligação ao antigénio. 0 anticorpo multivalente é tipicamente modificado por engenharia genética de modo a ter três ou mais locais de ligação ao antigénio e em geral não é um anticorpo IgM ou IgA de sequência nativa.

Os “fragmentos de anticorpo" compreendem apenas uma parte de um anticorpo intacto, em geral incluindo um local de ligação ao antigénio do anticorpo intacto e mantendo assim a capacidade de ligar o antigénio. Os exemplos de fragmentos de anticorpo abrangidos pela presente definição incluem: (i) o fragmento Fab, com domínios VL, CL, VH e CHI; (ii) o fragmento Fab', que é um fragmento Fab com um ou mais resíduos de cisteína no terminal C do domínio CHI; (iii) o fragmento Fd com domínios VH e CHI; (iv) o fragmento Fd' com domínios VH e CHI e um ou mais resíduos de cisteína no terminal C do domínio CHI; (v) o fragmento Fv com os domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (vi) o fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste em um domínio VH; (vii) regiões CDR isoladas; (viii) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente incluindo dois fragmentos Fab' ligados por uma ponte de dissulfureto na região de charneira; (ix) moléculas de anticorpo de cadeia simples (e.g. Fv em cadeia simples; scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); e Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) "diacorpos" com dois locais de ligação ao antigénio, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (consultar, e.g., EP 404 097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "anticorpos lineares" compreendendo um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que conjuntamente com polipéptidos de cadeia leve complementares formam um par de regiões de ligação ao antigénio (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057 1062 (1995); e patente US 5641870). A expressão "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizada refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos com excepção de possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades minoritárias. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra 23 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ um único antigénio. Além disso, contrariamente às preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. 0 adjectivo "monoclonal" não deve ser entendido como requerendo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais que se utilizam de acordo com o invento podem ser preparados pelo método do hibridoma, primeiro descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de ADN recombinante (consultar, e.g., patente U.S. 4816567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpos sobre fagos utilizando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) ou Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) .

Os anticorpos monoclonais incluem aqui especificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou que pertencem a uma determinada classe ou subclasse de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que apresentem a actividade biológica pretendida (patente U.S. 4816567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)).

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (e.g., murinos) são anticorpos quiméricos que contêm a sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na sua maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recebedor) nos quais se substituem resíduos de uma região hipervariável do recebedor por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como de ratinho, rato, coelho ou primata não humano, com a especificidade, afinidade e capacidade pretendidas. Em alguns casos, substituem-se resíduos da região de esqueleto (FR) da imunoglobulina humana por resíduos correspondentes não humanos. Além disso, os anticorpos humanizados podem 24 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ compreender resíduos que não se encontram nem no anticorpo recebedor, nem no anticorpo dador. Estas modificações são efectuadas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as ansas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado compreenderá também opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, consultar Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Um "anticorpo humano" é um anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou foi preparado utilizando qualquer das técnicas para preparar anticorpos humanos, tal como aqui reveladas. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antigénio não humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na especialidade. Numa concretização, o anticorpo humano é seleccionado de uma biblioteca de fagos, em que essa biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et ai., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Os anticorpos humanos também podem ser preparados por introdução de locais de imunoglobulina humana em animais transgénicos, e.g., ratinhos nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram parcial ou completamente inactivados. Após provocação, verifica-se a produção de anticorpo humano, que se assemelha muito à verificada em seres humanos em todos os aspectos, incluindo rearranjo génico, montagem e reportório de anticorpos. Esta abordagem está descrita, por exemplo, nas patentes U.S. 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016 e nas seguintes publicações científicas: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 25 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996);

Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).

Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado através de imortalização de linfócitos B humanos que produzem um anticorpo dirigido contra um antigénio alvo (estes linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou podem ter sido imunizados in vitro) . Consultar, e.g., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R Liss, p. 77 (1985); Boerner et ai., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991); e patente US 5750373. A expressão "variável" refere-se ao facto de determinadas partes dos domínios variáveis terem sequências que diferem extensamente entre anticorpos e serem utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para com o seu antigénio específico. No entanto, a variabilidade não está distribuída uniformemente ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis nos domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. As partes mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas as regiões de esqueleto (FR). Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem, cada um, quatro FR, que adoptam na sua maior parte uma configuração em folha beta, ligados por três regiões hipervariáveis, que formam ansas que ligam, e em alguns casos fazendo parte da estrutura em folha beta. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas muito próximas pelas FR e, juntamente com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigénio de anticorpos (consultar Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos directamente na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas apresentam várias funções efectoras, tal como a participação do anticorpo em citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). A expressão "região hipervariável" quando aqui utilizada refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis por ligação ao antigénio. A região hipervariável 26 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ compreende geralmente resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (e.g. resíduos 2 4-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., Seguences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service,

National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de uma "ansa hipervariável" (e.g. resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) do domínio variável da cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) do domínio variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Os resíduos de "região de esgueleto" ou "FR" são os resíduos do domínio variável que não são resíduos da região hipervariável, tal como aqui definida.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser classificados em diferentes "classes". Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser divididas adicionalmente em "subclasses" (isotipos), e.g., IgGi (incluindo alotipos não A e A), IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, denominados capa (6) e lambda (8), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. A expressão "região Fc" é utilizada para definir a região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que pode ser gerada por digestão de um anticorpo intacto com papaína. A região Fc pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante. Embora as fronteiras da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é usualmente definida como estendendo-se desde um resíduo de aminoácido em cerca da posição Cys226, ou desde cerca da posição Pro230 , até ao terminal carboxilo da região Fc. A região Fc de uma 27 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ imunoglobulina compreende geralmente dois domínios constantes, um domínio CH2 e um domínio CH3 e opcionalmente compreende um domínio CH4.

Aqui, "cadeia da região Fc" significa uma das duas cadeias polipeptídicas de uma região Fc. 0 "domínio CH2" de uma região Fc de IgG humana (também denominado domínio "Cg2") estende-se usualmente desde um resíduo de aminoácido em cerca da posição 231 até um resíduo de aminoácido em cerca da posição 340. O domínio CH2 é único pelo facto de não estar emparelhado em proximidade com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de hidrato de carbono ramificadas ligadas a N estão interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Especulou-se que o hidrato de carbono pode proporcionar um substituto para o emparelhamento domínio-domínio, e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985) . Aqui, o domínio CH2 pode ser um domínio CH2 de sequência nativa ou um domínio CH2 variante. O "domínio CH3" compreende a parte de resíduos do terminal C até um domínio CH2 numa região Fc (i.e. desde um resíduo de aminoácido em cerca da posição 341 até um resíduo de aminoácido em cerca da posição 447 de uma IgG) . Aqui a região CH3 pode ser um domínio CH3 de sequência nativa ou um domínio CH3 variante (e.g. um domínio CH3 com uma "protuberância" introduzida numa das suas cadeias e uma "cavidade" correspondente introduzida na sua outra cadeia; consultar a patente US 5821333. Estes domínios CH3 variantes podem ser utilizados para preparar anticorpos multiespecíficos (e.g. biespecíficos) tal como aqui descrito. A "região de charneira" é geralmente definida como estendendo-se desde cerca de Glu216 ou cerca de Cys226 até cerca de Pro230 de IgGl humana (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)). As regiões de charneira de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgGl colocando o primeiro e o último resíduos de cisteína que formam ligações S-S inter-cadeias pesadas nas mesmas posições. Aqui, a região de charneira pode ser uma região de charneira de sequência nativa ou uma região de charneira variante. As duas 28 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ cadeias polipeptídicas de uma região de charneira variante retêm geralmente pelo menos um resíduo de cisteína por cadeia polipeptídica, de modo gue as duas cadeias polipeptídicas da região de charneira variante possam formar uma ponte de dissulfureto entre as duas cadeias. Aqui, a região de charneira preferida é uma região de charneira humana de sequência nativa, e.g. uma região de charneira de IgGl humana de sequência nativa.

Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma "função efectora" de uma região Fc de sequência nativa. Os exemplos de "funções efectoras" incluem ligação a Clq; citoxicidade dependente do complemento (CDC); ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (e.g. receptor de células B; BCR), etc. Tais funções efectoras requerem geralmente que a região Fc esteja combinada com um domínio de ligação (e.g. um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas utilizando vários ensaios conhecidos na especialidade para avaliar tais funções efectoras do anticorpo.

Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza.

Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude da modificação de pelo menos um aminoácido. Em determinadas concretizações, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparativamente com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipéptido progenitor, e.g. desde cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos e, de preferência, desde cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos numa região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipéptido progenitor. Aqui, a região Fc variante possuirá tipicamente, e.g., pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipéptido progenitor, ou pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com essa, ou pelo menos cerca de 95% ou mais de identidade de sequência com essa. 29 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ "Citoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" e "ADCC" (do inglês "Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity") referem-se a uma reacção mediada por células na qual células citotóxicas não especificas que expressam receptores de Fc (FcR) (e.g. células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado numa célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, as células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a actividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode efectuar-se um ensaio de ADCC in vitro, tal como o descrito na patente US 5500362 ou 5821337. As células efectoras úteis para estes ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a actividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, e.g., num modelo animal tal como divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

As "células efectoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcR e efectuam funções efectoras. Tipicamente, as células expressam pelo menos FcyRIII e efectuam a função efectora de ADCC. Os exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) , células assassinas naturais (NK) , monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; sendo preferidas as PBMC e as células NK. As células efectoras podem ser isoladas de uma sua fonte nativa, e.g. de sangue ou PBMC, tal como aqui descrito.

As expressões "receptor de Fc" e "FcR" são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas de splicing alternativo destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de activação") e FcyRIIB (um 30 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus dominios citoplasmáticos. O receptor de activação FcyRIIA contém um motivo de activação de imunorreceptores à base de tirosina (ITAM) no seu dominio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição de imunorreceptores à base de tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático (revisto em Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Os FcR são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei et al.r Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995) . Outros FcR, incluindo os que venham a ser identificados futuramente, estão aqui abrangidos pela expressão "FcR". A expressão também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol 117:587 (1976); e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994) ) . "Citotoxicidade dependente do complemento" e "CDC"" referem-se à lise de um alvo na presença de complemento. A via de activação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema do complemento (Clq) a uma molécula (e.g. um anticorpo) complexado com um antigénio cognato. Para avaliar a activação do complemento, pode efectuar-se um ensaio de CDC, e.g. tal como descrito em Gazzano-Santoro et al., J.Immunol. Methods 202:163 (1996).

Um anticorpo "amadurecido por afinidade" é um anticorpo que contém uma ou mais alterações numa ou mais das suas CDR que resultam numa melhoria da afinidade do anticorpo para com o antigénio, comparativamente com o anticorpo progenitor que não possui essa(s) alteração(ões) . Os anticorpos amadurecidos por afinidade preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para com o antigénio alvo. Os anticorpos amadurecidos por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos na especialidade. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descrevem o amadurecimento por afinidade por permuta de domínios VH e VL. A mutagénese aleatória de resíduos da CDR e/ou do esqueleto é descrito em: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994- 31 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ 2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Aqui, um "ligante flexível" refere-se a um péptido compreendendo dois ou mais resíduos de aminoácido ligados por ligação(ões) peptídica(s) e que proporcionam maior liberdade rotacional para os dois polipéptidos (tais como as duas regiões Fd) assim ligados. Tal liberdade rotacional permite que cada um de dois ou mais locais de ligação ao antigénio ligados pelo ligante flexível acedam mais eficazmente ao(s) antigénio(s) alvo. Os exemplos de sequências de ligantes peptídicos flexíveis adequados incluem gly-ser, gly-ser-gly-ser, ala-ser e gly-gly-gly-ser.

Um "domínio de dimerização" é formado pela associação de pelo menos dois resíduos de aminoácido (geralmente resíduos de cisteína) ou de pelo menos dois péptidos ou polipéptidos (que podem ter a mesma sequência de aminoácidos ou sequências de aminoácidos diferentes). Os péptidos ou polipéptidos podem interactuar entre si através de associação(ões) covalente(s) e/ou não covalente (s) . Aqui, os exemplos de domínios de dimerização incluem uma região Fc; uma região de charneira; um domínio CH3; um domínio CH4; um par CH1-CL; uma "interface" com um "botão" ou "protuberância" concebidos por engenharia genética tal como descrito na patente US 5821333; um "fecho de correr" de leucinas (e.g. um fecho de correr de leucinas jun/fos, consultar Kostelney et al., J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992); ou um fecho de correr de leucinas GCN4 de levedura); um fecho de correr de isoleucinas; um par dimérico receptor (e.g., receptor de interleuquina-8 (IL-8R); e heterodímeros de integrina tais como LFA-1 e GPIIIb/IIIa) ou a(s) sua(s) região(ões) de dimerização; polipéptidos ligandos diméricos (e.g. factor de crescimento de nervos (NGF), neurotrofina-3 (NT-3), interleuquina-8 (IL-8), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), VEGF-C, VEGF-D, membros PDGF e factor neurotrófico derivado de cérebro (BDNF); consultar Arakawa et al. J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994) e Radziejewski et al. Biochem. 32(48):1350 (1993)) ou a(s) sua(s) região(ões) de dimerização; um par de resíduos de cisteína capaz de formar uma ponte de dissulfureto; um par de péptidos ou polipéptidos, cada um dos quais compreendendo pelo menos um resíduo de cisteína (e.g. desde cerca de um, dois, 32 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ três a cerca de dez resíduos de cisteína) de modo a que se possa(m) formar ligação(ões) dissulfureto entre os péptidos ou polipéptidos (doravante "uma charneira sintética"); e domínios variáveis de anticorpo. Aqui, os domínios de dimerização mais preferidos são uma região Fc ou uma região de charneira.

Um "local de ligação ao antigénio funcional" de um anticorpo é um local capaz de se ligar a um antigénio alvo. A afinidade de ligação ao antigénio do local de ligação ao antigénio não é necessariamente tão forte como a do anticorpo progenitor do qual é derivado o local de ligação ao antigénio, mas a capacidade de ligação ao antigénio tem que ser mensurável utilizando qualquer um de vários métodos conhecidos para avaliar a ligação de anticorpos a um antigénio. Além disso, aqui a afinidade de ligação ao antigénio de cada um dos locais de ligação ao antigénio de um anticorpo multivalente não tem que ser quantitativamente a mesma. Aqui, para os anticorpos multiméricos, o número de locais de ligação ao antigénio funcionais pode ser avaliado utilizando análise de ultracentrifugação. De acordo com este método de análise, combinam-se diferentes razões de antigénio alvo para anticorpo multimérico e calcula-se o peso molecular médio dos complexos assumindo números diferentes de locais de ligação funcionais. Estes valores teóricos são comparados com os valores experimentais de facto obtidos de modo a avaliar o número de locais de ligação funcionais.

Um anticorpo com uma "característica biológica" de um determinado anticorpo é um anticorpo que possui uma ou mais das características biológicas desse anticorpo que o distinguem de outros anticorpos que se ligam ao mesmo antigénio.

De modo a rastrear anticorpos que se ligam a um epítopo num antigénio ligado por um anticorpo de interesse, pode efectuar-se um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold-Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). A administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui a administração simultânea (concomitante) e/ou consecutiva por qualquer ordem. 33 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ "Mamífero", para os objectivos de tratamento, refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de quinta e animais de jardim zoológico, desporto ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, ovelhas, porcos, etc. Tipicamente, o mamífero é um ser humano.

Uma "desordem" é qualquer condição que beneficiaria de tratamento com as moléculas do invento. Tal inclui desordens crónicas e agudas ou doenças incluindo as condições patológicas que predispõe o mamífero à desordem em causa. Os exemplos não limitantes de desordens a tratar aqui incluem qualquer forma de tumor, tumores benignos e malignos; tumores vascularizados; hipertrofia; leucemias e malignidades linfóides; desordens neuronais, gliais, astrocitárias, hipotalâmicas e outras desordens glandulares, macrofágicas, epiteliais, estromais e blastocélicas; e desordens inflamatórias; angiogénicas e imunológicas, desordens vasculares que resultam da vascularização e/ou permeabilidade vascular inadequadas, aberrantes, excessivas e/ou patológicas. A expressão "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" referem-se a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar uma doença ou desordem num mamífero. No caso de cancro, a quantidade eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (i.e., desacelerar em alguma extensão ou tipicamente parar) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (i.e., desacelerar em alguma extensão e tipicamente parar) metástases tumorais; inibir, em alguma extensão, o crescimento tumoral; e/ou aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas associados à desordem. Na medida em que o fármaco pode evitar o crescimento e/ou matar células cancerosas existentes, pode ser citostático e/ou citotóxico. Para terapia do cancro, a eficácia in vivo pode ser medida, por exemplo, por avaliação da duração de sobrevivência, tempo até à progressão da doença (TAP), taxas de resposta (TR), duração da resposta e/ou qualidade de vida. "Tratamento" refere-se tanto a tratamento terapêutico, como a medidas profiláticas ou preventivas. Os que necessitam 34 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ de tratamento incluem aqueles que já têm a desordem, bem como aqueles em que a desordem se pretende prevenir.

Aqui, a expressão "actividade biológica" e "biologicamente activo" relativamente a moléculas de ANGPTL4 referem-se à capacidade de uma molécula se ligar especificamente e regular respostas celulares, e.g., proliferação, adesão, migração, modulação de lípidos, etc. As respostas celulares também incluem as mediadas através de um receptor de ANGPTL4, e.g., um receptor integrina ανβ5, incluindo, sem lhes estar limitadas, adesão, migração e/ou proliferação. Neste contexto, a expressão "modular" inclui tanto promoção como inibição. As moléculas do invento também incluem agonistas e antagonistas de um receptor de ANGPTL4, e.g., receptor integrina ανβ5. "Hipertrofia", tal como aqui utilizada, é definida como um aumento da massa de um órgão ou estrutura independente do crescimento natural que não envolve formação de tumor. A hipertrofia de um órgão ou tecido é devida quer a um aumento da massa das células individuais (hipertrofia verdadeira), quer a um aumento do número de células que constituem o tecido (hiperplasia), ou ambos.

As expressões "cancro" e "canceroso" referem-se a, ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Os exemplos de cancro incluem, sem lhes estar limitados, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais específicos de tais cancros incluem cancro do rim ou renal, cancro da mama, cancro do cólon, cancro rectal, cancro colorrectal, cancro do pulmão, incluindo cancro do pulmão de células pequenas, cancro do pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, cancro das células escamosas (e.g. cancro de células escamosas epiteliais), cancro cervical, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro do fígado, cancro da bexiga, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gástrico ou do estômago incluindo cancro gastrointestinal, cancro pancreático, cancro da cabeça e pescoço, glioblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, tecomas, arrenoblastomas, hepatoma, malignidades hematológicas incluindo linfoma não hodgkiniano (NHL), mieloma múltiplo e 35

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT malignidades hematológicas agudas, carcinoma do endométrio ou uterino, endometriose, fibrossarcomas, coriocarcinoma, carcinoma das glândulas salivares, cancro da vulva, cancro da tiróide, carcinomas esofágicos, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma do pénis, carcinoma nasofaringeo, carcinomas da laringe, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas da pele, Schwanoma, oligodendroglioma, neuroblastomas, rabdomiossarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiossarcomas, carcinomas do tracto urinário, carcinomas da tiróide, tumor de Wilm, bem como linfoma de células B (incluindo linfoma não hodgkiniano (NHL) de grau baixo/folicular; NHL linfocítico pequeno (SL); NHL de grau intermédio/folicular; NHL difuso de grau intermédio; NHL imunoblástico de grau elevado; NHL linfoblástico de grau elevado; NHL de células pequenas não clivadas de grau elevado; NHL de doença volumosa; linfoma de células do manto; linfoma relacionado com SIDA; e macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; e desordem linfoproliferativa pós-transplante (DLPT), bem como proliferação vascular anómala associada a facomatoses, edema (tal como o associado a tumores cerebrais), sindrome de Meigs. A expressão “composição antineoplásica" refere-se a uma composição útil no tratamento de cancro compreendendo pelo menos um agente terapeuticamente activo, e.g., "agente anticanceroso". Os exemplos de agentes terapêuticos (agentes anticancerosos) incluem, sem lhes estar limitados, e.g., agentes quimioterapêuticos, agentes inibidores do crescimento, agentes citotóxicos, agentes utilizados em terapia com radiação, agentes antiangiogénicos, agentes apoptóticos, agentes anti-tubulina, toxinas e outros agentes para tratar o cancro, e.g., anticorpo neutralizante anti-VEGF, antagonista de VEGF, anti-HER-2, anti-CD20, um antagonista do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) (e.g., um inibidor de tirosina-quinase), inibidor de HER1/EGFR, erlotinib, um inibidor de COX-2 (e.g., celecoxib), interferões, citoquinas, antagonistas (e.g., anticorpos neutralizante) que se ligam a um ou mais dos receptores de ErbB2, ErbB3, ErbB4 ou VEGF, inibidores para tirosina-quinases receptoras do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e/ou factor de células estaminais (SCF) (e.g., mesilato de imatinib (Gleevec® 36

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Novartis)), TRAIL/Apo2 e outros agentes químicos bioactivos e orgânicos, etc. No invento, incluem-se também as suas combinações. A expressão "agente citotóxico", tal como aqui utilizada, refere-se a uma substância que inibe ou evita a função de células e/ou causa a destruição de células. Pretende-se incluir na expressão isotopos radioactivos (e.g., At, I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapêuticos e toxinas, tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas activas enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes.

Um "agente inibidor do crescimento" quando aqui utilizado refere-se a um composto ou uma composição que inibem o crescimento de uma célula in vitro e/ou in vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento pode ser um agente que reduz significativamente a percentagem de células na fase S. Os exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (num local diferente da fase S), tais como agentes que induzem paragem G1 e paragem em fase M. Os bloqueadores de fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), TAXOL® e inibidores de topo II, tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido e bleomicina. Os agentes que param G1 também extravasam para paragem em fase S, por exemplo, agentes de alquilação de ADN, tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C. Pode encontrar-se informação adicional em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, ed., Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de cancro. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquilsulfonatos tais como bussulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, 37 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetra-hidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®; beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposido; criptoficinas (especialmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de azoto tais como clorambucilo, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimustina; antibióticos tais como antibióticos de enediina (e.g., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama II e caliqueamicina ómega II (consultar, e.g., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de cromoproteina enedina), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo ADRIAMYCIN®, morfolinodoxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina, injecção de lipossomas de doxorrubicina HC1 (DOXIL®) e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tais como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), uma epotilona e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina 38 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenérgico tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reconstituinte de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulinico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; etoglicido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo de polissacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2', 2''-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, e.g., paclitaxel (TAXOL®), formulação em nanopartícuias manipuladas com albumina de paclitaxel (ABRAXANETM) e doxetaxel (TAXOTERE®); clorambucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorrelbina (NAVELBINE®); daunomicina; aminopterina; topoisomerase RFS 2000; retinóides tais como ácido novantrona; edatrexato; ibandronato; inibidor de difluorometilornitina (DMFO); retinóico: sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores; bem como combinações de dois ou mais dos anteriores, tais como CHOP, uma abreviatura para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviatura para o regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINTM) combinada com 5-FU e leucovovina. 39

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Também se incluem nesta definição agentes anti-hormonais que actuam para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormonas que podem promover o crescimento de cancro, e são frequentemente sob a forma de tratamento sistémico ou de corpo inteiro. Estes podem ser as próprias hormonas. Os exemplos incluem anti-estrogénios e moduladores selectivos de receptores de estrogénio (SERM), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno de NOLVADEX®) , raloxifeno (EVISTA®), droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (FARESTON®); anti-progesteronas; reguladores negativos de receptores de estrogénio (ERD); agentes que funcionam suprimindo ou desactivando os ovários, por exemplo, agonistas da hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH) tais como acetato de leuprolida (LUPRON® e ELIGARD®), acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros anti-androgénios tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogénio nas supra-renais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGASE®), exemestano (AROMASIN®), formestano, fadrozole, vorozole (RIVISOR®), letrozole (FEMARA®) e anastrozole (ARIMIDEX®). Além disso, esta definição de agentes quimioterapêuticos inclui bisfosfonatos tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) ou risedronato (ACTONEL®); bem como troxacitabina (um análogo de 1,3-dioxolano nucleósido citosina); oligonucleótidos anti-sentido, em particular os que inibem expressão de genes nas vias de sinalização implicadas em proliferação celular aberrante tal como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras e receptor do factor de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas tais como a vacina THERATOPE®, vacinas de terapia génica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor de topoisomerase 1 (e.g., LURTOTECAN®); rmRH (e.g., ABARELIX®); ditosilato de lapatinib (um inibidor de molécula pequena de tirosina-quinase duplo de ErbB-2 e EGFR também denominado GW572016); inibidores de COX-2 tais como celecoxib (CELEBREX®; 4-(5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-lH-pirazol-l-il)benzenossulfonamida; e sais, ácidos ou 40 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores. A expressão "citoquina" é uma expressão genérica para proteínas libertadas por uma população celular que actuam sobre outra célula como mediadores intercelulares. São exemplos de tais citoquinas as linfoquinas, monoquinas e hormonas polipeptídicas tradicionais. Estão incluídas nas citoquinas as hormonas de crescimento, tais como a hormona de crescimento humana, N-metionil-hormona de crescimento humana e hormona de crescimento bovina; hormona paratiróide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormonas de glicoproteína tais como hormona estimulante do folículo (FSH), hormona estimulante da tiróide (TSH) e hormona luteinizante (LH); factor de crescimento hepático; factor de crescimento de fibroblastos; pró-lactina; lactogénio placentário; factor alfa e factor beta de necrose tumoral; substância inibidora da mulleriana; péptido associado a gonadotropina de ratinho; inibina; activina; factores de crescimento endotelial vascular (e.g., VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E); factor de crescimento derivado de placenta (PIGF); factores de crescimento derivados de plaquetas (PDGF, e.g., PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD); integrina; trombopoietina (TPO); factores de crescimento de nervos tais como NGF-alfa; factor de crescimento de plaquetas; factores de crescimento de transformação (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta; factor I e factor II de crescimento do tipo insulina; eritropoietina (EPO); factores osteoindutores; interferões tais como interferão alfa, beta e gama, factores de estimulação de colónias (CSF) tal como CSF de macrófago (M-CSF); CSF de granulócitos-macrófagos (GM-CSF); e CSF de granulócitos (G-CSF); interleucinas (IL) tais como IL-1, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-β, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-30; secretoglobina/uteroglobina; oncostatina M (OSM); um factor de necrose tumoral tal como TNF alfa ou TNF beta; e outros factores polipeptídicos incluindo LIF e ligando kit (KL) . Tal como aqui utilizada, a expressão citoquina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes activos biologicamente de citoquinas de sequência nativa. 41 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ A expressão "pró-fármaco" tal como utilizada neste pedido refere-se a uma forma precursora ou derivada de uma substância activa farmaceuticamente que é menos citotóxica para células tumorais comparativamente com o fármaco progenitor e é susceptível de ser activada enzimaticamente ou convertida na forma progenitora mais activa. Consultar, e.g., Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, p. 375-382, 615° Meeting Belfast (1986) e Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), p. 247-267, Humana Press (1985). Os pró-fármacos deste invento incluem, sem lhes estar limitados, pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró-fármacos contendo péptido, pró-fármacos modificados com D-aminoácidos, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos contendo beta-lactama, pró-fármacos contendo opcionalmente fenoxiacetamida substituída ou pró-fármacos contendo opcionalmente fenilacetamida substituída, pró-fármacos de 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos de 5-fluorouridina que podem ser convertidos na forma de fármaco livre citotóxica mais activa. Os exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivatizados numa forma de pró-fármaco para utilização neste invento incluem, sem lhes estar limitados, os agentes quimioterapêuticos descritos anteriormente.

Um "factor ou agente angiogénico" é um factor de crescimento que estimula o desenvolvimento de vasos sanguíneos, e.g., promove angiogénese, crescimento de células endoteliais, estabilidade de vasos sanguíneos e/ou vasculogénese, etc. Por exemplo, os factores angiogénicos incluem, sem lhes estar limitados, e.g. VEGF e membros da família VEGF, PIGF, família PDGF, família de factor de crescimento de fibroblastos (FGF), ligandos TIE (angiopoietinas), efrinas, ANGPTL3, ANGPTL4, etc. Incluiriam também factores que aceleram a cicatrização de ferimentos, tais como hormona de crescimento, factor I de crescimento do tipo insulina (IGF-I), VIGF, factor de crescimento epidérmico (EGF), CTGF e membros da sua família e TGF-α e TGF-β. Consultar, e.g., Klagsbrun e D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit e Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara e Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 42 ΕΡ 1 771 4 7 4/PT (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (e.g., a tabela 1 que apresenta uma lista de factores angiogénicos); e Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003).

Um "agente antiangiogénico" ou "inibidor de angiogénese" referem-se a uma substância de baixo peso molecular, um polinucleótido, um polipéptido, uma proteína isolada, uma proteína recombinante, um anticorpo, ou seus conjugados ou proteínas de fusão, que inibem a angiogénese, a vasculogénese ou a permeabilidade vascular indesejáveis, directa ou indirectamente. Por exemplo, um agente antiangiogénico é um anticorpo ou outro antagonista para um agente angiogénico tal como definido anteriormente, e.g., anticorpos para VEGF, anticorpos para receptores de VEGF, moléculas pequenas que bloqueiam a sinalização do receptor de VEGF (e.g., PTK787/ZK2284, SU6668). Os agentes antiangiogénicos incluem também inibidores de angiogénese nativos, e.g., angiostatina, endostatina, etc. Consultar, e.g., Klagsbrun e D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit e Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (e.g., a tabela 3 que apresenta uma lista de terapias antiangiogénicas em melanoma maligno); Ferrara e Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (e.g., a tabela 2 que apresenta uma lista de factores antiangiogénicos); e Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (e.g., a tabela 1 que apresenta uma lista de agentes antiangiogénicos utilizados em ensaios clínicos). A expressão "marcador" quando aqui utilizada refere-se a um composto ou uma composição detectáveis que estão directa ou indirectamente conjugados com o polipéptido. O marcador pode ser ele próprio detectável (e.g., marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável.

Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está usualmente associada na fonte natural do ácido nucleico do polipéptido. Uma molécula de ácido nucleico isolada está sob uma forma diferente da forma ou configuração como se encontra 43

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT na natureza. Assim, as moléculas de ácido nucleico isoladas distinguem-se da molécula de ácido nucleico tal como existe nas células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que expressam usualmente o polipéptido em que, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente daquela que tem nas células naturais. A expressão "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação ligada operativamente num determinado organismo hospedeiro. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores. 0 ácido nucleico está "ligado operativamente" quando está colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou comando de secreção está ligado operativamente a ADN para um polipéptido caso este seja expresso na forma de uma pré-proteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou potenciador está ligado operativamente a uma sequência de codificação se afectar a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está ligado operativamente a uma sequência de codificação, caso esteja posicionado de modo a potenciar a tradução. Em geral, "ligado operativamente" significa que as sequências de ADN que estão ligadas são contíguas e, no caso de um comando de secreção, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os potenciadores não têm de ser contíguos. A ligação é conseguida por ligação em locais de restrição convenientes. Caso não existam tais locais, utilizam-se adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos de acordo com a prática convencional.

Tal como aqui utilizadas, as expressões "célula", "linha celular" e "cultura celular" são utilizadas indiferentemente e todas estas denominações incluem a descendência. Assim, as expressões "produtos de transformação" e "células transformadas" incluem a célula primária em causa e suas culturas derivadas sem considerar o número de transferências. 44 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Também se deve considerar que nem toda a descendência tem de ser precisamente idêntica em conteúdo de ADN, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Encontra-se incluída a descendência mutante que tem a mesma função ou actividade biológica da rastreada nas células transformadas originalmente. Quando se pretendem denominações diferentes, será evidente pelo contexto. ANGPTL4 A proteína 4 do tipo angiopoietina (ANGPTL4) é uma proteína excretada e é um membro da família das angiopoietinas. É também conhecida como proteína relacionada com fibrinogénio/angiopoietina hepática (HFARP) (Kim et al., Biochem. J. 346:603-610 (2000)), PGAR (proteína relacionada com angiopoietina PPARy) (Yoon, et al., Mol. Cell Biol, 20:5343-5349 (2000)), factor de adipose induzido por jejum (FIAF) (Kerten et al., J. Biol. Chem., 275:28488-28493 (2000)); proteína relacionada com angiopoietina (ARP-4); NL2 (consultar patente US 6348350; 6372491; e 6455496); e Ang6. A proteína ANGPTL4 do ser humano é uma proteína de 406 aminoácidos (e.g., patentes US 6348350, 6372491 e 6455496), enquanto a ANGPTL4 de ratinho é uma proteína de 410 aminoácidos (Kim et al., Biochem. J. 346:603-610 (2000)). A proteína de ratinho e a humana partilham cerca de 75% de identidade de sequências ao nível dos aminoácidos. Kim et al., Biochem. J. 346:603-610 (2000). A ANGPTL4 tem um péptido de sinal, três locais potenciais de N-glicosilação e quatro cisteínas que podem estar envolvidas em ligações dissulfureto intramoleculares. Por exemplo, a ANGPTL4 forma estruturas moleculares maiores, e.g., tal como indicado na figura 3, painel A. Consultar também, e.g., Ge et al., J. Biol. Chem., 279(3):2038-2045 (2004); Ge et al., J. Lipid Res. 45:2071-2079 (2004); e Mandard et al., J. of Biol. Chem., 279(33):34411-34420 (2004) . A ANGPTL4 também pode ser processada proteoliticamente. Consultar também, e.g., Ge et al., J. Biol. Chem., 279(3):2038-2045 (2004); e Mandard et al., J. of Biol. Chem., 279(33):34411-34420 (2004). Tal como aqui descrito, as substituições R162G e R164E de ANGPTL4 resultam na variante de ANGPTL4 que corre com um peso molecular num gel de SDS maior 45

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT do que a proteína de tipo selvagem (ou nativa) (consultar a figura 3, painel B).

As regiões conservadas da família das angiopoietinas incluem um domínio com hélice enrolada e um domínio C-terminal do tipo fibrinogénio (FBN) . Consultar, e.g., Kim et al., Biochem. J. 346:603-610 (2000). Foi sugerido que a ANGPTL4 é processada proteoliticamente de uma forma regulada para libertar um domínio C-terminal do tipo fibrinogénio. Consultar, e.g., Ge et al., J. Biol. Chem., 279(3):2038-2045 (2004). Outros membros da família das angiopoietinas incluem angiopoietina 1, angiopoietina 2 e angiopoietina 3/ angiopoietina 4, que se ligam ao receptor Tie2. Consultar, e.g., Davis et al., Cell 87, 1161-1169 (1996); Maisonpierre et al., Science 277, 55-60 (1997); Valenzuela et al, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 96, 1904-1909 (1999); e as patentes US 5521073; 5650490; e 5814464. As angiopoietinas 1 e 4 parecem ser agonistas para o receptor Tie2, enquanto as angiopoietinas 2 e 3 parecem ser um antagonista (e possivelmente um agonista) para o receptor Tie2. Consultar, e.g., Folkman e D'Amore, Cell, 87:1153-1155 (1996); Suri et al., Cell, 87:1171-1180 (1996); Masionpierre et al., Science 277:55-60 (1997); e Ward e Dumont, Seminars in Cell & Developmental Biology, 13:19-27 (2002) .

Outro membro da família, a proteína 3 do tipo angiopoietina (ANGPTL3) é um factor angiogénico que se liga a integrina ανβ3· Consultar, e.g., pedido de patente US 20030215451, publicado a 20 de Novembro de 2003 e Camenisch et al., J. Biol. Chem., 277(19):17281-17290 (2002). A ANGPTL3 não parece ligar-se ao receptor Tie2. Camenish et al., Journal of Biol. Chem. 277(19):17281-17290 (2002). A ANGPTL3 também é um regulador dos níveis plasmáticos de lípidos. Consultar, e.g., Koishi et al., Nat. Genetics 30:151-157 (2002). A ANGPTL4 liga-se a integrina ανβ5. Consultar, e.g., figuras 11, 12 e 13. A integrina ανβ5 é um receptor para proteínas da matriz extracelular incluindo vitronectina e Del-1 (consultar, e.g., Stupack e Cheresh, Journal of Cell Science 115:3729-3738 (2002)). As alfa v-integrinas foram implicadas em progressão tumoral e metástases. Consultar, e.g., Marshall, J F e Hart, I R Semin. Câncer Biol. 7(3): 129- 46 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ 38 (1996). Além disso, foi também demonstrado um papel das alfa v-integrinas durante a angiogénese. Consultar, e.g., Eliceiri, B P e Cheresh, D A Molecular Medicine 4: 741-750 (1998). Por exemplo, demonstrou-se que um anticorpo monoclonal para ανβ5 inibe a angiogénese induzida por VEGF em córnea de coelho e no modelo de membrana corioalantóica de galinha. Consultar, e.g., M.C. Friedlander, et al., Science 270:1500-1502 (1995) . Também se demonstrou que os antagonistas de ανβ5 e ανβ5 inibem a angiogénese induzida por factor de crescimento e por tumor. Consultar, e.g., Eliceiri e Cheresh, Current Opinion in Cell Biology, 13:563-568 (2001). O invento proporciona composições de moduladores, e.g., agonistas ou antagonistas, de proteína 4 do tipo angiopoietina (ANGPTL4) e combinações desses moduladores com outros agentes terapêuticos. Por exemplo, combinações de antagonistas de ANGPTL4 com agentes anticancerosos e métodos para a sua utilização para bloquear ou reduzir o crescimento tumoral ou o crescimento de células cancerosas. O invento também proporciona métodos para bloquear ou reduzir as recaídas de crescimento tumoral ou recaídas de crescimento de células cancerosas com antagonistas de ANGPTL4 e/ou outros agentes anticancerosos. Também se proporcionam composições de antagonistas de ANGPTL4 e combinações de agentes antiangiogénicos e métodos para a sua utilização no bloqueio ou redução da neovascularização em desordens neoplásicas ou não neoplásicas.

Moduladores de ANGPTL4 e suas utilizações.

Os moduladores de ANGPTL4 são moléculas que modulam a actividade de ANGPTL4, e.g., agonistas e antagonistas. A expressão "agonista" é utilizada para referir os análogos peptídicos e não peptídicos de ANGPTL4 e anticorpos que se ligam especificamente a estas moléculas de ANGPTL4, desde que tenham a capacidade de sinalizar através de um receptor de ANGPTL4 nativo (e.g., integrina ανβ5) . A expressão "agonista" é definida no contexto do papel biológico de um receptor de ANGPTL4 (e.g., ανβ5) . Em determinadas concretizações, os agonistas possuem as actividades biológicas de uma ANGPTL4 nativa, tal como definidas anteriormente, tais como promover 47 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ proliferação, migração e/ou adesão de células e/ou modulação de homeostase lipídica. A expressão "antagonista" é utilizada para referir moléculas gue têm a capacidade de inibir a actividade biológica de ANGPTL4 independentemente de terem a capacidade de se ligarem a ANGPTL4 ou ao seu receptor, e.g., ανβ5· Assim, os antagonistas que têm a capacidade de se ligarem a ANGPTL4 ou ao seu receptor incluem anticorpos anti-ANGPTL4 e anti-οίνβδ- Os antagonistas de ANGPTL4 podem ser avaliados, e.g., por inibição da actividade de ANGPTL4, e.g., adesão, migração, proliferação e/ou modulação da actividade de homeostase lipídica de ANGPTL4. Relativamente à actividade do receptor integrina ανβ5, pode determinar-se um modulador de um receptor integrina ανβ5 por métodos conhecidos na especialidade. Por exemplo, pode utilizar-se o método descrito por J.W. Smith et ai. em J. Biol. Chem. 265:12267-12271 (1990).

Utilizações terapêuticas A ANGPTL4 está implicada como um alvo de cancro. Quando expressa em algumas células tumorais, a ANGPTL4 causa proliferação de células tumorais, in vitro e in vivo (consultar, e.g., figura 4, figura 5, figura 7 e figura 8, painel A e painel B). Quando a ANGPTL4 é expressa em tumores a tratar com um factor antiangiogénico, e.g., anticorpo anti-VEGF, o tumor pode manter a capacidade de crescer (consultar, e.g., figura 8, painel C). A ANGPTL4 também causa migração de células tumorais (consultar, e.g., figura 9). Também se demonstrou que é regulada positivamente em cancros renais. Consultar, e.g., processo do mandatário número P5032R1; WO 02107941; e Le Jan et ai., American Journal of Pathology, 162(5):1521-1528 (2003). Além disso, a ANGPTL4 é um factor pró-angiogénico (consultar, e.g., S. Le Jan et al., Am. J. Pathol., 162(5):1521-1528 (2003)), que são alvos para terapia do cancro. Tal como o VEGF (Shweiki et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA 92:768-772 (1995), a expressão de ANGPTL4 é aumentada em resposta a hipoxia. Consultar, e.g., Le Jan et al., American Journal of Pathology, 162(5):1521-1528 (2003). A ANGPTL4 liga-se a células tumorais, e.g., células A673, em várias condições (e.g., figura 6, painel A e B) . Tal como 48 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ apresentado na figura 4, painel A e painel B, a ANGPTL4 estimula algum crescimento de células tumorais in vitro quando as células são transduzidas com uma construção de expressão que expressa ANGPTL4. A figura 4, painel C também ilustra que a adição de meio condicionado por células C0S7 transduzidas com ANGPTL4 induz a proliferação de células A673. Consultar também a figura 7, painel A e B. A ANGPTL4 induz proliferação celular de proliferação de A673 quando se revestem placas de cultura com ANGPTL4 (consultar a figura 5) , mas não induz proliferação celular de células epiteliais de rim, células mesangiais renais ou HUVEC. A ANGPTL4 também induz a migração celular de células tumorais. Consultar, e.g., figura 9. A ANGPTL4 é predominantemente expressa em tecido adiposo, placenta, fígado e rim e também é regulada positivamente em ratinhos ob/ob ("knockout" para leptina) e db/db ("knockout" para receptor de leptina). Consultar, e.g., Yoon et al., Mol. Cell. Biol. 20:5343-5349 (2000); Kim et al., Biochem. J., 346:603-610 (2000); Kersten et al., J. Biol. Chem., 275:28488-28493 (2000); e Le Jan et al., American Journal of Pathology 162(5):1521-1528 (2003). Também foi relatado que ANGPTL4 é um modulador de lípidos e inibidor da lipoproteína-lipase. Consultar, e.g., Yu et al.r PNAS USA 102(5):1767-1772 (2005); Yoshida et al., J. Lipid Res. 43:1770-1772 (2002); e Wiesner et al., J. Endocrinology 180:R1-R6 (2004). A expressão de ANGPTL4 é também induzida por PPAR gama e alfa em tecido adiposo e é induzida por jejum. Também modula a proliferação de pré-adipócitos e hepatócitos e/ou migração celular de pré-adipócitos juntamente com modulação dos níveis de triglicéridos e colesterol no soro. Consultar, pedido provisório de patente U.S. 60/589875 e processo de mandatário P2156R1 apresentado concomitantemente e publicado como WO 2006/014678. Os investigadores relataram a existência de ligações entre angiogénese e adipogénese. Consultar, e.g., Sierra-Honigmann et al., "Biological Action of Leptin as an Angiogenic Factor" Science 281:1683-1686; (1998); Rupnick et al., "Adipose tissue mass can be regulated through the vasculature" Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 99(16):10730-10735 (2002); e Fukumura et al., "Paracrine Regulation of Angiogenesis and Adipocyte Differentiation During In Vivo Adipogenesis." Circ. Res. 93:e88-e97 (2003). 49 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Está contemplado que, de acordo com o invento, se possam utilizar moduladores de ANGPTL4 e/ou combinações de moduladores de ANGPTL4 e outros agentes terapêuticos para tratar várias doenças neoplásicas e não neoplásicas. Numa concretização, utilizam-se moduladores de ANGPTL4, e.g., antagonistas de ANGPTL4, na inibição de crescimento de células cancerosas ou de tumores. Por exemplo, tal como se pode verificar na figura 10, painel A e B, os anticorpos policlonais anti-ANGPTL4 inibiram o crescimento de células tumorais de uma forma dependente da dose. A ANGPTL4 pode causar migração de células tumorais (consultar, e.g., figura 9) . Está contemplado que, de acordo com o invento, também se possam utilizar antagonistas de ANGPTL4 para inibir metástases de um tumor. A ANGPTL4 também induz migração de pré-adipócitos. Consultar o pedido provisório de patente U.S. 60/589875 e processo de mandatário P2156R1 apresentado concomitantemente e publicado como WO 2006/014678. Em determinadas concretizações, podem administrar-se um ou mais agentes anticancerosos com antagonistas de ANGPTL4 para inibir o crescimento de células cancerosas ou de tumores. Consultar aqui a secção intitulada Terapias combinadas.

Os exemplos de desordens neoplásicas a tratar incluem, sem lhes estar limitadas, as aqui descritas pelas expressões "cancro" e "cancerosa". As doenças não neoplásicas que são passíveis de tratamento com antagonistas do invento incluem, sem lhes estar limitadas, e.g., hipertrofia indesejável ou aberrante, artrite, artrite reumatóide (AR), psoríase, placas psoriáticas, sarcoidose, aterosclerose, placas ateroscleróticas, edema devido a enfarte do miocárdio, retinopatias diabéticas e outras retinopatias proliferativas incluindo retinopatia de prematuridade, fibroplasia retrolenticular, glaucoma neovascular, degeneração da mácula relacionada com a idade, edema macular diabético, neovascularização da córnea, neovascularização de enxerto da córnea, rejeição de enxerto da córnea, neovascularização da retina/coróide, neovascularização do ângulo (rubeose), doença neovascular ocular, restenose vascular, malformações arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias da tiróide (incluindo doença de Grave), transplante de córnea e de outros tecidos, inflamação crónica, inflamação pulmonar, lesão pulmonar aguda/ARDS, sépsia, 50 ΕΡ 1 771 4 7 4/PT hipertensão pulmonar primária, efusões pulmonares malignas, edema cerebral (e.g., associado a icto agudo/lesão fechada da cabeça/traumatismo), inflamação sinovial, formação de panos na AR, miosite ossificante, formação de osso hipertrópica, osteoartrite (OA) , ascites refractárias, doença dos ovários policisticos, endometriose, doenças de fluidos no terceiro espaço (pancreatite, sindrome de compartimentos, queimaduras, doença intestinais), fibróides uterinos, parto prematuro, inflamação crónica tal como IBD (doença de Crohn e colite ulcerativa), rejeição de aloenxerto renal, doença intestinal inflamatória, sindrome nefrótico, crescimento de massa de tecido indesejável ou aberrante (não canceroso), obesidade, crescimento de massa de tecido adiposo, articulações hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, inibição de crescimento do cabelo, sindrome de Osler-Weber, fibroplasias rentrolenticulares de granuloma piogénico, esclerodermia, tracoma, adesões vasculares, sinovite, dermatite, pré-eclampsia, ascites, efusão pericárdica (tal como a associada a pericardite) e efusão pleural.

Podem utilizar-se moduladores de ANGPTL4, e.g., agonistas ou activadores de ANGPTL4, para tratamentos de desordens patológicas. Podem utilizar-se moduladores de ANGPTL4, e.g., agonistas de ANGPTL4, no tratamento de desordens patológicas em que se pretende angiogénese ou neovascularização e/ou hipertrofia, que incluem, sem lhes estar limitadas, e.g., traumatismo vascular, feridas, lacerações, incisões, queimaduras, úlceras (e.g., úlceras diabéticas, úlceras de pressão, úlceras de hemofilia, úlceras varicosas), crescimento de tecidos, ganho de peso, doença arterial periférica, indução de trabalho de parto, crescimento de cabelo, epidermólise bolhosa, atrofia da retina, fracturas ósseas, fusões ósseas da espinal medula, lágrimas do menisco, etc. Consultar igualmente, pedido provisório de patente U.S. 60/589875 e processo de mandatário P2156R1 apresentado simultaneamente e publicado como WO 2006/014678.

Terapias de combinação

Tal como anteriormente indicado, o invento proporciona terapias combinadas em que se administra um antagonista de ANGPTL4 com outra terapia. Por exemplo, utilizam-se 51 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ antagonistas de ANGPTL4 em combinações com terapêuticas anticancerosas ou em terapêuticas anti-neovascularização para tratar várias condições neoplásicas ou não neoplásicas. Numa concretização, a condição neoplásica ou não neoplásica caracteriza-se por desordem patológica associada com angiogénese aberrante ou indesejada. 0 antagonista de ANGPTL4 pode ser administrado em série ou em combinação com outro agente que é eficaz para esses objectivos, quer na mesma composição quer em composições independentes. Alternativa ou adicionalmente podem administrar-se múltiplos inibidores de ANGPTL4. A administração do antagonista e/ou agentes do invento pode efectuar-se simultaneamente, e.g., como uma única composição ou como duas ou mais composições distintas utilizando a mesma via de administração ou vias de administração diferentes. Alternativa ou adicionalmente, a administração pode efectuar-se sequencialmente segundo qualquer ordem. Em determinadas concretizações, podem existir intervalos entre as administrações de duas ou mais composições que podem ir de minutos a dias, de semanas a meses. Por exemplo, pode administrar-se primeiro o agente anticanceroso seguido do inibidor de ANGPTL4. Contudo, também se considera a administração simultânea ou a administração inicial do antagonista de ANGPTL4.

As quantidades eficazes de agentes terapêuticos administrados em combinação com um antagonista de ANGPTL4 serão decididas pelo médico assistente ou pelo veterinário assistente. A administração da dosagem e o seu ajuste são efectuados para obter o máximo de controlo das doenças a tratar. A dose dependerá adicionalmente de factores tais como o tipo de agente terapêutico a utilizar e o doente específico a tratar. As dosagens adequadas para o agente anticanceroso são aquelas presentemente utilizadas e podem diminuir-se devido à acção combinada (sinergia) do agente anticanceroso e do antagonista de ANGPTL4. Em determinadas concretizações a combinação dos inibidores potência a eficácia de um só inibidor. A expressão "potência" refere-se a uma melhoria da eficácia de um agente terapêutico na sua dose habitual ou aprovada. Consultar igualmente aqui a secção intitulada Composições farmacêuticas. 52 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Tipicamente, os antagonistas de ANGPTL4 e agentes anticancerosos são adequados para a mesma doença ou para doenças semelhantes para bloquear ou reduzir uma desordem patológica tal como crescimento tumoral ou o crescimento de uma célula cancerosa. Numa concretização o agente anticanceroso é um agente antiangiogénico. A terapia antiangiogénica relativamente ao cancro é uma estratégia de tratamento do cancro dirigida para inibir o desenvolvimento de vasos sanguíneos tumorais necessários para proporcionar nutrientes para apoiar o crescimento tumoral. Devido à angiogénese estar envolvida no crescimento do tumor primário e em metástases, o tratamento antiangiogénico proporcionado pelo invento é capaz de inibir o crescimento tumoral neoplásico no local primário assim como evitar metástase de tumores em locais secundários, permitindo assim o ataque dos tumores por outras terapêuticas.

Muitos agentes antiangiogénicos têm sido identificados e são conhecidos na especialidade, incluindo os aqui apresentados, e.g., apresentados em Definições e por, e.g., Carmeliet e Jain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara et al., Nature ReviewsrDrug Discovery, 3:391-400 (2004); e Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003). Consultar igualmente, o pedido de patente US20030055006. Numa concretização, o antagonista de ANGPTL4 utiliza-se em combinação com um anticorpo neutralizante anti-VEGF (ou fragmento) e/ou outro antagonista de VEGF ou um antagonista de receptor de VEGF, incluindo, sem lhes estar limitados, por exemplo, o receptor de VEGF solúvel (e.g., VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, fragmentos de neuropilinas (e.g., NRP1, NRP2)), aptâmeros capazes de bloquear VEGF ou VEGFR, anticorpos neutralizantes anti-VEGFR, inibidores de baixo peso molecular de tirosina-quinases (RTK) VEGFR, estratégias anti-sentido para VEGF, ribozimas contra VEGF ou receptores de VEGF, variantes antagonistas de VEGF; e quaisquer das suas combinações. Alternativa ou adicionalmente, podem co-administrar-se ao doente dois ou mais inibidores de angiogénese. Em determinada concretização, podem administrar-se um ou mais agentes terapêuticos adicionais, e.g., agentes anticancerosos em combinação com um antagonista de ANGPTL4 e um agente antiangiogénico. 53 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Em determinados aspectos do invento, outros agentes terapêuticos úteis para terapia tumoral de combinação com um antagonista do invento incluem outras terapias de cancro, (e.g., cirurgia, tratamentos radiológicos (e.g., envolvendo irradiação ou administração de substâncias radioactivas), quimioterapia, tratamento com agentes anticancerosos aqui apresentados e conhecidos na especialidade ou suas combinações). Alternativa ou adicionalmente, podem co-administrar-se ao doente dois ou mais anticorpos que se ligam ao mesmo ou a dois ou mais antigénios diferentes aqui revelados. Algumas vezes pode ser benéfico também administrar uma ou mais citoquinas ao doente.

Agentes quimioterapêuticos

Em determinados aspectos, o invento proporciona um método para bloquear ou reduzir o crescimento tumoral ou o crescimento de uma célula cancerosa por administração de quantidades eficazes de um antagonista de ANGPTL4 e/ou um ou mais inibidores de angiogénese e um ou mais agentes quimioterapêuticos a um doente que é susceptivel a cancro ou ao qual foi diagnosticado cancro. Podem utilizar-se vários agentes quimioterapêuticos nos métodos de tratamento combinado do invento. Proporciona-se aqui em "Definição" uma listagem de exemplos não limitativos de agentes quimioterapêuticos considerados.

Tal como será evidente para os peritos na especialidade, as doses apropriadas de agentes quimioterapêuticos serão geralmente à volta das já utilizadas em terapias clinicas em que os produtos de quimioterapia são administrados sozinhos ou em combinação com outros produtos de quimioterapia. Ocorrerá provavelmente uma variação de dosagem dependendo da doença a tratar. 0 médico assistente que administra o tratamento será capaz de determinar a dose adequada para o indivíduo em particular.

Recaída de crescimento tumoral 0 invento também proporciona métodos e composições para inibir ou evitar recaída de crescimento tumoral ou recaída de crescimento de células cancerosas. Por exemplo, o painel C da 54 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ figura 8 ilustra esquematicamente a capacidade de um tumor, que está a ser tratado com um anticorpo anti-VEGF (AVASTIN) , escapar ao tratamento (e.g., um tipo de recaída) quando o tumor também expressa ANGPTL4.

Utiliza-se recaída de crescimento tumoral ou recaída de crescimento de células cancerosas para descrever uma condição na qual os doentes em tratamento ou que foram tratados com uma ou mais das terapias actualmente disponíveis (e.g., terapias de cancro, tais como quimioterapias, terapia de radiação, cirurgia, terapia hormonal e/ou terapia/imunoterapia biológica, nomeadamente um regímen terapêutico padrão para o cancro específico) não é clinicamente apropriado para tratar os doentes ou os doentes já não estão a usufruir de qualquer efeito benéfico da terapia de modo que esses doentes necessitam de terapia adicional eficaz. Tal como aqui utilizada, a frase pode também referir-se a um condição do doente "não sensível/refractário", e.g., que descreve doentes que são sensíveis a terapia mas que sofrem contudo de efeitos secundários, desenvolvem resistência, não são sensíveis à terapia, não são sensíveis de forma satisfatória à terapia, etc. Em várias concretizações, o cancro é recaída de crescimento tumoral ou recaída de crescimento de células cancerosas em que o número de células cancerosas não foi significativamente reduzido ou aumentou ou o tamanho do tumor não foi significativamente reduzido ou aumentou ou falha qualquer redução adicional do tamanho ou do número de células cancerosas. Pode determinar-se se as células cancerosas são recaída de crescimento tumoral ou recaída de crescimento de células cancerosas in vivo ou in vitro, por qualquer método conhecido na especialidade para ensaiar a eficácia de tratamento de células cancerosas, utilizando os significados aceites na especialidade em tal contexto para "recaída" ou "refractário" ou "não sensível". 0 invento proporciona métodos para bloquear ou reduzir a recaída de crescimento tumoral ou a recaída de crescimento de células cancerosas num indivíduo por administração de um ou mais antagonistas de ANGPTL4 do invento para bloquear ou reduzir a recaída de crescimento tumoral ou recaída de crescimento de células cancerosas no indivíduo. Em determinadas concretizações, pode administrar-se o antagonista 55 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ de ANGPTL4 subsequentemente à terapia do cancro. Em determinadas concretizações, administra-se o ANGPTL4 simultaneamente com a terapia do cancro. Alternativa ou adicionalmente, a terapia com antagonista de ANGPTL4 alterna com outra terapia de cancro, o que pode ser efectuado por qualquer ordem. 0 invento também abrange métodos para administrar um ou mais anticorpos inibidores de ANGPTL4 para evitar o desencadeamento ou a recorrência de cancro em doentes predispostos a cancro. De um modo geral, o indivíduo esteve, ou está, a ser submetido simultaneamente a terapia de cancro.

Numa concretização a terapia de cancro é o tratamento com um agente antiangiogénico. 0 agente antiangiogénico inclui os que são conhecidos na arte e os que se encontram aqui nas Definições. Numa concretização, o agente antiangiogénico é um anticorpo neutralizante anti-VEGF ou fragmento (e.g., A4.6.1 humanizado, AVASTIN® (Genentech, South San Francisco, CA) , Y0317, M4, G6, B20, 2C3, etc.) . Consultar, e.g., as patentes U.S. 6582959, 6884879, 6703020; WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202; ΕΡ 0666868B1; os pedidos de patente US 20030206899, 20030190317, 20030203409 e 20050112126; Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004); e processo de mandatário n.° PR2072-4. Podem administrar-se agentes adicionais em combinação com antagonistas de ANGPTL4 para bloquear ou reduzir a recaída de crescimento tumoral ou a recaída de crescimento de células cancerosas, e.g., consultar secção aqui intitulada Terapias de combinação.

Numa concretização, administram-se antagonistas de ANGPTL4 do invento ou outros produtos terapêuticos que reduzem a expressão de ANGPTL4 para reverter a resistência ou a sensibilidade reduzida de células cancerosas a determinados agentes biológicos, hormonais, de radiação e quimioterapêuticos tornando assim a sensibilizar as células cancerosas a um ou mais desses agentes, que podem então ser administrados (ou continuar a ser administrados) para tratar ou gerir o cancro, incluindo evitar metástases.

Anticorpos

Os anticorpos do invento incluem anticorpos anti-ANGPTL4 e anticorpos anti-fragmentos de ANGPTL4, anticorpos que são agentes antiangiogénicos ou inibidores de angiogénese, 56 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ anticorpos que são agentes anticancerosos, anticorpos para um receptor de ANGPTL4, e.g., anticorpo anti-avp5 ou outros anticorpos aqui descritos. Exemplos de anticorpos incluem, e.g., anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, fragmentos, multiespecíficos, heteroconjugados, multivalentes, efectores de funções, etc.

Anticorpos policlonais

Os anticorpos do invento podem incluir anticorpos policlonais. 0 perito na especialidade conhece métodos para preparar anticorpos policlonais. Por exemplo, desenvolvem-se em animais anticorpos policlonais contra um anticorpo do invento através de uma ou várias injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante com uma proteína que é imunogénica na espécie a imunizar, e.g., hemocianina de lapa Fissurella, albumina sérica, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster maleimidobenzoílico de sulfosuccinimida (conjugação através de resíduos de cisterna), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR, em que R e R1 são grupos alquilo diferentes.

Imunizam-se animais contra uma molécula do invento, conjugados imunogénicos ou derivados por combinação, e.g., de 100 pg ou 5 pg da proteína ou do conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injecção intradérmica da solução em múltiplos locais. Um mês mais tarde os animais recebem reforços com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injecção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 dias mais tarde sangram-se os animais e ensaia-se o soro quanto ao título de anticorpo. Os animais recebem reforços até estabilização do título. Tipicamente, o animal recebe reforço com um conjugado do mesmo antigénio mas que é conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Podem também produzir-se conjugados em cultura de células recombinantes na forma de fusões de proteína. Igualmente, utilizam-se de forma adequada agentes de agregação tais como alúmen para aumentar a resposta imunitária. 57 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Anticorpos monoclonais

Podem produzir-se anticorpos monoclonais contra um antigénio aqui descrito utilizando o método do hibridoma, primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem produzir-se por métodos de ADN recombinante (patente U.S. 4816567).

No método do hibridoma imuniza-se um ratinho ou outro animal hospedeiro adequado, tal como um hamster ou macaco macaque, tal como anteriormente descrito para eliciar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, podem imunizar-se linfócitos in vitro. Fundem-se então os linfócitos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado tal como polietilenoglicol para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, p. 59 103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma assim preparadas são inoculadas e cultivadas num meio de cultura adequado que contém tipicamente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência de células de mieloma progenitoras não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma progenitoras estiverem isentas da enzima hipoxantinaguanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT) , substâncias que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As células de mieloma típicas são aquelas que se fundem eficazmente, mantêm a produção estável de anticorpo em níveis elevados pelas células produtoras de anticorpo seleccionadas e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. Entre estas, as linhas celulares de mieloma preferidas são as linhas de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis em Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, E.U.A. e as células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, E.U.A. Também foram descritas linhas celulares de mieloma humano e de 58 ΕΡ 1 771 4 7 4/PT heteromieloma ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et ai., Monoclonal Antibody Production Tehniques and Applications, p. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)).

Ensaia-se o meio de cultura no qual crescem células de hibridoma quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra, e.g., ANGPTL4, ανβδ ou uma molécula de angiogénese. Pode determinar-se a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma por imunoprecipitação ou por ensaio de ligação in vitro tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Estas técnicas e ensaios são conhecidos na especialidade. Pode determinar-se a afinidade de ligação do anticorpo monoclonal, por exemplo, pela análise de Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Após identificação das células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou actividade pretendidas, podem subclonar-se os clones por procedimentos de diluição limitante e cultivar-se por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, p.59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura adequados para este objectivo incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, podem crescer-se as células de hibridoma in vivo como tumores ascíticos num animal.

Os anticorpos monoclonais excretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, do fluido ascítico ou do soro por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas tais como, por exemplo, cromatografia em proteína A-Sepharose, hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Podem também produzir-se os anticorpos monoclonais por métodos de ADN recombinante tal como os descritos na patente U.S. 4816567. Isola-se facilmente ADN que codifica os anticorpos monoclonais e sequencia-se utilizando procedimentos convencionais (e.g., utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de ligar especificamente genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como uma fonte desse ADN. Após isolamento, 59 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ pode colocar-se ο ADN em vectores de expressão que são então transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de simio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produziriam de outro modo proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A produção recombinante de anticorpos será descrita seguidamente em maior detalhe.

Noutra concretização, podem isolar-se anticorpos ou fragmentos de anticorpos a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos geradas por utilização das técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628-(1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (gama de nM) por permuta aleatória de cadeias ("chain shuffling") (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), assim como por infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)).

Assim, essas técnicas são alternativas viáveis às técnicas do hibridoma de anticorpo monoclonal tradicionais para isolamento de anticorpos monoclonais. O ADN também pode ser modificado, por exemplo, por substituição pela sequência de codificação dos domínios constantes das cadeias pesada e leve humanos no lugar das sequências murinas homólogas (patente U.S. 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad Sei. USA, 81:6851 (1984)) ou por ligação covalente da sequência de codificação de imunoglobulina a toda ou a parte da sequência de codificação de um polipéptido que não imunoglobulina.

Tipicamente substituem-se os domínios constantes de um anticorpo ou os domínios variáveis de um local de combinação com o antigénio de um anticorpo, por estes polipéptidos que não imunoglobulina, para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um local de combinação com o antigénio com especificidade para um antigénio e outro local de 60 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ combinação com ο antigénio com especificidade para um antigénio diferente.

Anticorpos humanizados e humanos

Os anticorpos do invento podem compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido nele introduzidos provenientes de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são muitas vezes referidos como resíduos "de importação" que são tipicamente retirados de um domínio variável "de importação". A humanização pode ser essencialmente efectuada seguido o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986);

Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), por substituição das sequências de um anticorpo humano pela(s) sequência(s) de CDR correspondente(s) de roedor. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (patente U.S. 4816567) em que substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, para utilizar na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método denominado "melhor ajuste", rastreia-se a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor contra a biblioteca completa de sequências de domínios variáveis humanos conhecidos. Aceita-se então a sequência humana mais próxima da sequência de roedor como o esqueleto (FR) humano para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método utiliza um esqueleto específico derivado de uma sequência consensual de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. Pode utilizar-se o mesmo esqueleto para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)) . 61 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ É além disso importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de afinidade elevada para com o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objectivo, de acordo com um método típico, preparam-se anticorpos humanizados por um processo de análise das sequências progenitoras e vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências progenitora e humanizada. Estão usualmente disponíveis modelos tridimensionais de imunoglobulinas e são familiares aos peritos na especialidade. Encontram-se disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata ligar o seu antigénio. Deste modo, podem-se seleccionar e combinar resíduos FR das sequências recebedora e de importação de modo a se obter a característica pretendida do anticorpo, tal como afinidade aumentada para com o(s) antigénio (s) alvo. De um modo geral, os resíduos de CDR estão directamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antigénio.

Alternativamente, é agora possível produzir animais transgénicos (e.g., ratinhos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, descreveu-se que a deleção homozigótica do gene da região de charneira (JH) da cadeia pesada do anticorpo em ratinhos mutantes quiméricos e de linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência da matriz do gene de imunoglobulina de linha germinal humana nestes ratinhos mutantes de linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos após provocação com antigénio. Consultar, e.g., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); e Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Podem também derivar-se anticorpos humanos a partir de bibliotecas de exibição em fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 62

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT (1991); Marks et al., J. Mol, Biol., 222:581-597 (1991);

Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)).

Podem também produzir-se anticorpos humanos utilizando várias técnicas conhecidas na especialidade, incluindo bibliotecas de exibição em fagos (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). De acordo com esta técnica, genes do domínio V de anticorpo são clonados em enquadramento num gene de proteína do revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso tal como M13 ou fd e são exibidos sob a forma de fragmentos funcionais de anticorpo na superfície de uma partícula fágica. Devido à partícula filamentosa conter uma cópia de ADN em cadeia simples do genoma do fago, as selecções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo resultam também em selecção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades. Assim, o fago mimetiza algumas das propriedades da célula B. Pode efectuar-se a exibição em fagos em vários formatos revistos em, e.g., Johnson, K S. e Chiswell, D J., Cur Opin in Struct Biol 3:564-571 (1993). Podem utilizar-se várias fontes de segmentos de gene V para exibição em fagos. Por exemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram uma matriz diversificada de anticorpos anti-oxazolona de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados dos baços de ratinhos imunizados. Pode construir-se um repertório de genes V de dadores humanos não imunizados e podem isolar-se anticorpos para uma matriz variada de antigénios (incluindo auto-antigénios), e.g., seguindo essencialmente as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Consultar, igualmente, patentes U.S. 5565332 e 5573905. Estão também disponíveis as técnicas de Cole et al. e Boerner et al. para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)). Podem também gerar-se anticorpos humanos por células B activadas in vitro (consultar patentes U.S. 5567610 e 5229275).

Fragmentos de anticorpo

Fragmentos de anticorpos estão também incluídos no invento. Têm-se desenvolvido várias técnicas para a produção 63 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos eram derivados por digestão proteolitica de anticorpos intactos (consultar, e.g., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e

Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Contudo, esses fragmentos podem agora ser produzidos directamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, podem isolar-se os fragmentos de anticorpo a partir das bibliotecas fágicas de anticorpos anteriormente discutidas. Alternativamente, podem recuperar-se fragmentos Fab'-SH directamente a partir de E. coli e acoplar-se guimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et ai., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, podem isolar-se fragmentos F(abf)2 directamente da cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão óbvias para o perito na especialidade. Noutras concretizações, o anticorpo de eleição é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Consultar WO 93/16185; patente U.S. 5571894; e patente U.S. 5587458. Fv e sFv são as únicas espécies com locais de combinação intactos gue estão isentos de regiões constantes; assim, são adeguadas para reduzir a ligação não especifica durante a utilização in vivo. Podem construir-se proteínas de fusão de sFv para proporcionar a fusão de uma proteína efectora com os terminais amino ou carboxilo de um sFv. Consultar Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. 0 fragmento de anticorpo pode também ser um “anticorpo linear", e.g., tal como descrito na patente U.S. 5641870 por exemplo. Estes fragmentos de anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

Anticorpos multiespecíficos (e.g., biespecíficos)

Os anticorpos do invento também incluem, e.g., anticorpos multiespecíficos, que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes. Apesar destas moléculas ligarem normalmente apenas dois antigénios (i.e. anticorpos biespecíficos, BsAb), abrangem-se nesta expressão quando aqui utilizada, anticorpos com especificidades adicionais tais como anticorpos triespecíficos. Exemplos de BsAb incluem os que têm um braço dirigido contra um antigénio de célula tumoral e o outro braço dirigido contra uma molécula desencadeadora citotóxica tal como um anti-FcYRI/anti-CD15, anti-pl85HER2/FcYRIII (CD16), anti-CD3/anti-célula B maligna (1D10), 64 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ anti-CD3/anti-pl85HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de célula renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-carcinoma do cólon), anti-CD3/anti-análogo de hormona estimuladora de melanócitos, anti-receptor de EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMAl, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-molécula de adesão celular neural (NCAM)/anti-CD3, anti-proteína de ligação de folato (FBP)/anti-CD3, anti-antigénio associado a pan-carcinoma (AMOC-31)/anti-CD3; BsAb com um braço que se liga especificamente a um antigénio tumoral e um braço que se liga a uma toxina tal como anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadeia A de ricina, anti-interferão-α(IFN-a)/anti-idiotipo de hibridoma, anti-CEA e alcaloide de vinca; BsAb para converter pró-fármacos activados por enzimas tais como anti-CD30/anti-fosfatase alcalina (que catalisa conversão do pró-fármaco fosfato de mitomicina em álcool de mitomicina); BsAb que podem ser utilizados como agentes fibrinoliticos tais como antifibrina/anti-activador do plasminogénio tecidular (tPA), anti-fibrina/anti-activador do plasminogénio do tipo uroquinase (uPA); BsAb para que complexos imunitários tenham como alvos receptores da superfície celular tais como anti-lipoproteína de baixa densidade (LDL)/anti-receptor de Fc (e.g. FcyRI, FcyRII ou FcyRIII); BsAb para utilização em terapia de doenças infecciosas tais como anti-CD3/anti-vírus herpes simplex (HSV), anti-receptor de células T:complexo CD3/anti-influenza, anti-FcYR/anti-VIH; BsAb para detecção de tumor in vitro ou in vivo tais como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA e anti-DPTA, anti-pl85HER2/anti-hapteno; BsAb como adjuvantes de vacinas; e BsAb como ferramentas de diagnóstico tais como anti-IgG de coelho/anti-ferritina, anti-peroxidase de rábano (HRP)/anti-hormona, anti-somatostatina/anti-substância P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-p-galactosidase. Exemplos de anticorpos triespecíficos incluem anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti- CD3/anti-CD5/anti-CD37 e anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Podem preparar-se anticorpos biespecíficos na forma de anticorpos completos ou de fragmentos de anticorpos (e.g. anticorpos biespecíficos F(ab')2>.

Conhecem-se na especialidade métodos para produzir anticorpos biespecíficos. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos completos baseia-se na co-expressão de dois 65

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina em que as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Devido à distribuição aleatória das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes das quais apenas uma tem a estrutura biespecifica correcta. A purificação da molécula correcta, que se efectua habitualmente por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante complicada e os rendimentos de produto são reduzidos. Revelam-se procedimentos semelhantes em WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) .

De acordo com uma abordagem diferente, fundem-se os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação pretendidas (locais de combinação anticorpo-antigénio) com sequências do domínio constante de imunoglobulina. A fusão é preferentemente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo pelo menos parte das regiões de charneira, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para ligação da cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Inserem-se ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e caso pretendido, a cadeia leve de imunoglobulina, em vectores de expressão separados e co-transfectam-se num organismo hospedeiro adequado. Tal proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções relativas dos três fragmentos polipeptídicos em concretizações nas quais a utilização de proporções díspares das três cadeias polipeptídicas nas construções proporciona os rendimentos óptimos. É contudo possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias polipeptídicas num vector de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as razões não têm qualquer significado especial.

Numa concretização desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda 66 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação entre o composto biespecifico pretendido e combinações de cadeia de imunoglobulina não pretendidas, dado que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecifica proporciona um modo fácil de separação. Esta abordagem é revelada em WO 94/04690. Para detalhes adicionais sobre a geração de anticorpos biespecificos consultar, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acordo com outra abordagem descrita em W096/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, substituem-se uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo por cadeias laterais maiores (e.g. tirosina ou triptofano). Criam-se “cavidades" de compensação com tamanho idêntico ou semelhante ao da(s) cadeia(s) lateral(ais) grande(s) na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição das cadeias laterais de aminoácido grandes por outras mais pequenas (e.g. alanina ou treonina). Tal proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento de heterodímero relativamente a produtos finais não pretendidos tal como homodímeros.

Descreveram-se também na literatura técnicas para gerar anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpo. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos biespecificos utilizando ligação química. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) descreve um procedimento em que se clivam proteoliticamente anticorpos intactos para gerar fragmentos F(ab')2· Reduzem-se estes fragmentos na presença do agente complexante de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e evitar formação de dissulfureto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido ao Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo 67 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas. 0 progresso recente facilitou a recuperação directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' foi independentemente excretado de E. coli e submetido a acoplamento químico directo in vitro para formar o anticorpo biespecífico. 0 anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que sobre-expressam o receptor de VEGF e a células T humanas normais, assim como de desencadear actividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.

Também se descreveram várias técnicas para preparar e isolar fragmentos de anticorpo biespecífico directamente a partir da cultura de células recombinantes. Por exemplo, produziram-se anticorpos biespecíficos utilizando fechos de correr de leucinas. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Ligaram-se os péptidos de fechos de correr de leucinas das proteínas Fos e Jun às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão génica. Reduziram-se os homodímeros de anticorpo na região de charneira para formar monómeros e seguidamente reoxidaram-se para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia dos "diacorpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpo biespecífico. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Assim, forçam-se os domínios VH e VL de um fragmento a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento formando assim dois locais de ligação ao antigénio. Descreveu-se também outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpo biespecífico pela utilização de dímeros de Fv em cadeia 68 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ simples (sFv). Consultar Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Estão contemplados anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Anticorpos heteroconjugados

Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou “heteroconjugados", que são anticorpos do invento. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina e o outro a biotina. Tais anticorpos têm sido propostos, por exemplo, para direccionar células do sistema imunitário para células não desejadas (patente US 4676980) e para o tratamento de infecção por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Podem produzir-se anticorpos heteroconjugados utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. São bem conhecidos na especialidade agentes de reticulação adequados e são revelados na patente US 4676980 conjuntamente com várias técnicas de reticulação.

Anticorpos multivalentes

Os anticorpos do invento incluem um anticorpo multivalente. Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais depressa do que um anticorpo bivalente por um célula que expressa um antigénio ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos do invento podem ser anticorpos multivalentes (que são de uma classe diferente de IgM) com três ou mais locais de ligação ao antigénio (e.g. anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidos por expressão recombinante de ácido nucleico que codifica as cadeias polipeptídicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um dominio de dimerização e três ou mais locais de ligação ao antigénio. O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região de charneira. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais domínios de ligação ao antigénio em posição amino-terminal relativamente à região Fc. O anticorpo multivalente aqui preferido compreende (ou consiste em) três a cerca de oito, mas preferentemente quatro, locais de ligação ao antigénio. O anticorpo multivalente compreende 69 ΕΡ 1 771 4 7 4/PT pelo menos uma cadeia polipeptídica (e preferentemente duas cadeias polipeptidicas) , em que a(s) cadeia(s) polipeptidica(s) compreendem dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) podem compreender VD1-(XI) n-VD2-(X2) n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, XI e X2 representam um aminoácido ou polipéptido e n é 0 ou 1. Por exemplo, a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) podem compreender: VH-CHl-ligante flexível-VH-CHl-cadeia da região Fc; ou VH-CHl-VH-CHl-cadeia da região Fc. Aqui, o anticorpo multivalente compreende adicionalmente, de preferência, pelo menos dois (e de preferência quatro) polipéptidos do domínio variável de cadeia leve. Aqui, o anticorpo multivalente pode compreender, por exemplo, desde cerca de dois a cerca de oito polipéptidos de domínio variável de cadeia leve. Os polipéptidos de domínio variável de cadeia leve aqui abrangidos compreendem um domínio variável de cadeia leve e opcionalmente compreendem adicionalmente um domínio CL.

Manipulação da função efectora

Pode pretender-se modificar o anticorpo do invento relativamente à função efectora de modo a melhorar a eficácia do anticorpo no tratamento do cancro, por exemplo. Por exemplo, podem introduzir-se um ou mais resíduos de cisteína na região Fc permitindo assim a formação de ligações dissulfureto intercadeia nesta região. 0 anticorpo homodimérico assim gerado pode apresentar capacidade de internalização melhorada e/ou assassínio de células mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) melhoradas. Consultar Caron et al., J. Exp Med 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Podem também preparar-se anticorpos homodiméricos com actividade antitumoral melhorada utilizando agentes de reticulação heterobifuncionais tal como descrito em Wolff et al. Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode manipular-se um anticorpo que tem regiões Fc duplas e pode assim apresentar capacidades aumentadas de lise do complemento e ADCC. Consultar Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para aumentar a semivida sérica do anticorpo pode incorporar-se no anticorpo (especialmente num fragmento de anticorpo) , um epítopo de recuperação de 70 ΕΡ 1 771 4 7 4/PT ligação ao receptor tal como descrito na patente U.S. 5739277, por exemplo. Tal como aqui utilizada, a expressão "epítopo de recuperação de ligação ao receptor" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula IgG (e.g., IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável por aumentar a semivida sérica in vivo da molécula de IgG.

Imunoconjugados O invento também se refere a imunoconjugados compreendendo o anticorpo aqui descrito conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, uma toxina (e.g, uma toxina enzimaticamente activa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou seus fragmentos) ou um isótopo radioactivo (i.e., um radioconjugado). Estão disponíveis vários radionuclídeos para a produção de anticorpos radioconjugados. Os exemplos incluem, sem lhes estar limitados, e.g., 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 196Re.

Descreveram-se anteriormente agentes quimioterapêuticos úteis na geração de tais imunoconjugados. Por exemplo, pode conjugar-se BCNU, estreptozoicina, vincristina, 5-fluorouracilo, a família de agentes conhecidos colectivamente por complexo LL-E33288 descritos nas patentes U.S. 5053394, 5770710, esperamicinas (patente U.S. 5877296), etc. (consultar aqui igualmente a definição de agentes quimioterapêuticos) aos anticorpos antÍ-ANGPTL4, anti-alfa Vbeta5 ou antiangiogénicos ou aos seus fragmentos.

Para destruição selectiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioactivo. Estão disponíveis vários isótopos radioactivos para a produção de anticorpos radioconjugados anti-ANGPTL4 ou antiangiogénicos ou de seus fragmentos. Os exemplos incluem, sem lhes estar limitados, e.g., 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb, ιηΙη, isótopos radioactivos de Lu, etc. Quando se utiliza o conjugado para diagnóstico este pode compreender um átomo radioactivo para estudos de cintigrafia, por exemplo 99mTc ou 123I ou um marcador de spin para imagem de ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecida como imagem de ressonância magnética, MRI), tal como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, azoto-15, oxigénio-17, gadolínio, manganês ou ferro. 71 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Os marcadores radioactivos ou outros podem ser incorporados no conjugado por métodos conhecidos. Por exemplo, o péptido pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 em vez de hidrogénio. Podem ligar-se marcadores tais como 99mTc ou I, Re, Re e In através de um resíduo de cisterna do péptido. Pode ligar-se ítrio-90 através de um resíduo de lisina. Pode utilizar-se o método IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 para incorporar iodo-123. Consultar, e.g., Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press 1989) que descreve detalhadamente outros métodos.

As toxinas activas enzimaticamente e seus fragmentos que podem ser utilizadas incluem cadeia A de difteria, fragmentos activos não ligantes de toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, neomicina e os tricotecenos. Consultar, e.g., WO 93/21232 publicado a 28 de Outubro de 1993.

Preparam-se conjugados de um anticorpo e agente citotóxico utilizando uma variedade de agentes de acoplamento bifuncional de proteínas tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclo-hexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como dimetiladipimidato HC1), ésteres activos (tal como dissuccinimidilsuberato), aldeídos (tal como glutaraldeído) , compostos bis-azido (tal como bis(p-azidobenzoí1)-hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (tal como bis-(p-diazóniobenzoí1)etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, pode preparar-se uma imunotoxina de ricina tal como descrito em Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). O ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietileno- 72 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ triaminopenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um exemplo de agente de quelação para conjugação de radionucleótidos ao anticorpo. Consultar WO 94/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável" que facilita a libertação do fármaco citotóxico na célula. Podem utilizar-se, por exemplo, um ligante lábil em ácido, um ligante sensivel a peptidase, um ligante fotolábil, um ligante dimetilo ou um ligante contendo dissulfureto (Chari et al., Câncer Research 52:127-131 (1992); patente U.S. 5208020).

Alternativamente, pode produzir-se uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo anti-ANGPTL4, anti-avPs ou anti-angiogénese e o agente citotóxico, e.g., por técnicas recombinantes ou de síntese de péptidos. O comprimento de ADN pode compreender regiões respectivas que codificam as duas partes do conjugado adjacentes entre si ou separadas por uma região que codifica um péptido ligante que não destrói as propriedades pretendidas do conjugado.

Em determinadas concretizações o anticorpo está conjugado com um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização em dirigir previamente ao alvo de tumor em que o conjugado

anticorpo-receptor é administrado ao doente, seguido de remoção de conjugado não ligado da circulação utilizando um agente de depuração seguido de administração de um "ligando" (e.g. avidina) que está conjugado a um agente citotóxico (e.g. um radionucleótido). Em determinadas concretizações forma-se um imunoconjugado entre um anticorpo e um composto com actividade nucleolítica (e.g., uma ribonuclease ou uma ADN endonuclease tal como uma desoxirribonuclease; ADNase).

Maitansina e maitansinóides O invento proporciona um anticorpo do invento, que está conjugado com uma ou mais moléculas maitansinóides. Os maitansinóides são inibidores mitóticos que actuam por inibição da polimerização de tubulina. A maitansina foi inicialmente isolada de Maytenus serrata, um arbusto do leste africano (patente U.S. 3896111). Subsequentemente; verificou-se que determinados micróbios também produziam maitansinóides tais como maitansinol e ésteres de C-3 maitansinol (patente U.S. 4151042). Revelam-se maitansinol sintético e seus derivados e análogos em, por exemplo, 73 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ patentes U.S. 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663; e 4371533.

Conjuga-se anticorpo antÍ-ANGPTL4, anti-oç^s ou anti- angiogénese com uma molécula maitansinóide sem diminuir significativamente a actividade biológica quer do anticorpo quer da molécula maitansinóide. Em média 3-4 moléculas maitansinóides conjugadas por molécula de anticorpo mostraram eficácia no aumento de citotoxicidade de células alvo sem afectar negativamente a função ou solubilidade do anticorpo, apesar de ser expectável que apenas uma molécula de toxina/anticorpo aumente a citotoxicidade relativamente à utilização de anticorpo nu. Os maitansinóides são bem conhecidos na especialidade e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados de fontes naturais. Revelam-se maitansinóides adequados em, por exemplo, patente U.S. 5208020 e noutras publicações de patentes e de não patentes aqui anteriormente referidas. Numa concretização, os maitansinóides são maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou noutras posições da molécula de maitansinol, tal como vários ésteres de maitansinol.

Conhecem-se na especialidade muitos grupos de ligação para produzir conjugados anticorpo-maitansinol incluindo, por exemplo, os revelados na patente U.S. 5208020 ou na patente EP 0425235 BI e Chari et al., Câncer Research 52:127-131 (1992). Os grupos de ligação incluem grupos dissulfureto, grupos tioéter, grupos lábeis aos ácidos, grupos fotolábeis, grupos lábeis com peptidase ou grupos lábeis com esterase tal como revelado nas patentes anteriormente identificadas, preferindo-se os grupos dissulfureto e tioéter.

Podem produzir-se conjugados do anticorpo e maitansinóide utilizando vários agentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como dimetiladipimidato HC1), ésteres activos (tal como dissuccinimidilsuberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido (tal 74 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ como bis (p-azidobenzoí1)-hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (tal como bis-(p-diazóniobenzoí1)etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Os agentes de acoplamento típicos incluem propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP) (Carlsson et al., Biochem J. 173:723-737 [1978]) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar uma ligação dissulfureto. 0 ligante pode ligar-se à molécula maitansinóide em várias posições dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, pode formar-se uma ligação éster por reacção de um grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamento convencionais. A reacção pode ocorrer na posição C-3 que têm um grupo hidroxilo, na posição C-14 modificada com hidroximetilo, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxilo e na posição C-20 com um grupo hidroxilo. A ligação forma-se na posição C-3 do maitansinol ou de um análogo de maitansinol.

Caliqueamicina

Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo do invento conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos de caliqueamicina é capaz de produzir quebras no ADN em cadeia dupla a concentrações sub-picomolar. Para a preparação de conjugados da família caliqueamicina, consultar as patentes U.S. 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (todas de American Cyanamid Company). Os análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, sem lhes estar limitados, γ/, oç1, α3Σ, N-acetil-γι1, PSAG e θΣχ (Hinman et al., Câncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Câncer Research 58:2925-2928 (1998) e as patentes U.S. anteriormente mencionadas de American Cyanamid). Outro fármaco antitumoral com o qual se pode conjugar o anticorpo é QFA que é um antifolato. Tanto a caliqueamicina como o QFA têm locais de acção intracelulares e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Assim, a absorção celular destes agentes através de endocitose mediada por anticorpo aumenta grandemente os seus efeitos citotóxicos. 75 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Outras modificações de anticorpo

Abrangem-se aqui outras modificações do anticorpo. Por exemplo, pode ligar-se o anticorpo a um de entre vários polímeros não proteináceos, e.g., polietilenoglicol, polipropilenoglicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol. 0 anticorpo pode também ser aprisionado em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato) , respectivamente) em sistemas coloidais de entrega de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas ou em macroemulsões. Revelam-se tais técnicas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A., ed., (1980).

Lipossomas e nanopartículas

Os polipéptidos do invento podem ser formulados em lipossomas. Por exemplo, os anticorpos do invento podem ser formulados como imunolipossomas. Preparam-se lipossomas contendo o anticorpo por métodos conhecidos na especialidade, tal como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad Sei. USA, 77:4030 (1980); e patentes U.S. 4485045 e 4544545. Revelam-se lipossomas com tempo de circulação aumentado na patente U.S. 5013556. De um modo geral, a formulação e utilização de lipossomas é conhecida dos peritos na especialidade:

Podem gerar-se lipossomas especialmente úteis pelo método de evaporação de fase inversa com uma composição lipídica compreendendo fosfaditileolina, colesterol e fosfaditiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Extrudem-se os lipossomas através de filtros com porosidade definida para proporcionar lipossomas com o diâmetro pretendido. Podem conjugar-se fragmentos Fab' do anticorpo do invento com os lipossomas tal como descrito em Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) através de uma reacção de permuta de dissulfureto. Inclui-se opcionalmente no lipossoma um agente quimioterapêutico (tal como doxorrubicina). 76 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Consultar Gabizon et al. J. National Câncer Inst. 81(19)1484 (1989) .

Outras utilizações

Os anticorpos do invento têm várias utilizações. Por exemplo, podem utilizar-se anticorpos anti-ANGPTL4 em ensaios de diagnóstico para ANGPTL4, e.g., detectar a sua expressão em células, tecidos específicos ou em soro para detecção de cancro (e.g., na detecção de cancro renal), etc. Numa concretização, utilizam-se anticorpos ANGPTL4 para seleccionar a população de doentes para tratamento com os métodos aqui proporcionados, e.g., para doentes com expressão de ANGPTL4, níveis de ANGPTL4 elevados ou cancros sensíveis aos níveis de ANGPTL4. Podem utilizar-se várias técnicas de ensaios de diagnóstico conhecidas na especialidade, tal como ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche directos ou indirectos e ensaios de imunoprecipitação conduzidos em fase heterogénea ou homogénea (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) p. 147-158). Os anticorpos utilizados nos ensaios de diagnóstico podem ser marcados com uma parte detectável. A parte detectável deve ser capaz de produzir, directa ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a parte detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P; 35S ou 125I, um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano. Pode utilizar-se qualquer método conhecido na especialidade para conjugar o anticorpo com uma parte detectável incluindo os métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (19 74); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); e Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).

Os anticorpos anti-ANGPTL4 são também úteis para a purificação por afinidade de ANGPTL4 ou de fragmentos de ANGPTL4 a partir de culturas de células recombinantes ou de fontes naturais. Neste processo, imobilizam-se os anticorpos contra ANGPTL4 num suporte adequado, tal como uma resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. O anticorpo imobilizado é então posto em contacto com uma amostra contendo o ANGPTL4 a purificar e 77 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ seguidamente lava-se ο suporte com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material da amostra com excepção de ANGPTL4, que está ligado ao anticorpo imobilizado. Finalmente, lava-se o suporte com outro solvente adequado que libertará o ANGPTL4 do anticorpo:

Modificações covalentes de polipéptidos do invento

Incluem-se no âmbito deste invento modificações covalentes de um polipéptido do invento, e.g., um fragmento de antagonista polipéptido, uma molécula de fusão (e.g., uma molécula de imunofusão), um anticorpo do invento. Pode produzir-se por síntese química ou por clivagem química ou enzimática do polipéptido, se aplicável. Introduzem-se na molécula outros tipos de modificações covalentes do polipéptido por reacção de resíduos de aminoácido alvo do polipéptido com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou com os resíduos N-terminal ou C-terminal ou por incorporação de um aminoácido modificado ou aminoácido não natural na cadeia polipeptídica nascente, e.g., Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991); Noren et al. Science 244:182 (1989); e publicações de pedidos de patente US 20030108885 e 20030082575.

Mais habitualmente fazem-se reagir os resíduos cisteinilo com um haloacetato (e aminas correspondentes) tal como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para proporcionar derivados carboximetilo ou carboxiamidometilo. Os resíduos de cisteinilo são também derivatizados por reacção com bromotri-fluoroacetona, ácido a-bromo-β-(5-imidozoí1)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridildissulfureto, 2-piridildissulfureto de metilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazole.

Derivatizam-se os resíduos histidilo por reacção com dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidilo. O brometo de para-bromofenacilo é também útil; a reacção efectua-se tipicamente em cacodilato de sódio 0,1 M a pH 6,0. 78 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Fazem-se reagir os resíduos lisinilo e amino-terminal com ácido succínico e outros anidridos ácidos carboxílicos. A derivatização com estes agentes tem o efeito de inverter a carga dos resíduos lisinilo. Outros reagentes adequados para derivatização de resíduos contendo α-amino incluem imidoésteres tal como metilpicolinimidato, fosfato piridoxal, piridoxal, cloroboro-hidreto, ácido trinitrobenzenossulfónico, 0- metilisoureia, 2,4-pentanodiona e reacção com glioxilato catalisada por transaminase.

Modificam-se os resíduos arginilo por reacção com um ou vários reagentes convencionais, entre os quais fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona e ninidrina. A derivatização de resíduos de arginina necessita que a reacção seja efectuada em condições alcalinas devido ao pKa elevado do grupo funcional de guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina assim como com o grupo épsilon-amino de arginina.

Pode efectuar-se a modificação específica de resíduos tirosilo, com especial interesse na introdução de marcadores espectrais em resíduos tirosilo por reacção com compostos aromáticos de diazónio ou tetranitrometano. Mais habitualmente, utilizam-se N-acetilimidizole e tetranitrometano para formar espécies O-acetiltirosilo e derivados 3-nitro, respectivamente. Os resíduos tirosilo são iodados utilizando 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para utilização em radioimunoensaio.

Modificam-se selectivamente grupos laterais carboxilo (aspartilo ou glutamilo) por reacção com carbodiimidas (R-N=C=N-R/), em que R e R' são grupos alquilo diferentes, tal como l-ciclo-hexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida ou 1- etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Além disso, convertem-se resíduos aspartilo e glutamilo a resíduos asparaginilo e glutaminilo por reacção com iões amónio.

Os resíduos glutaminilo e asparaginilo são frequentemente desamidados aos correspondentes resíduos glutamilo e asparagilo, respectivamente. Estes resíduos são desamidados sob condições neutras ou básicas. A forma desamidada destes resíduos encontra-se no âmbito deste invento. 79 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos serilo ou treonilo, metilação de grupos α-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, p. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxilo C-terminal.

Outro tipo de modificação covalente envolve acoplamento químico ou enzimático de glicósidos a um polipéptido do invento. Estes procedimentos são vantajosos na medida em que não necessitam produção do polipéptido numa célula hospedeira que tenha capacidades de glicosilação para glicosilação ligada a N ou ligada a 0. Dependendo do modo de acoplamento utilizado, pode(m) ligar-se o(s) açúcar(es) a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo livres, (c) grupos sulfidrilo livres tal como os de cisteína, (d) grupos hidroxilo livres tal como os de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos tal como os de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina. Descrevem-se estes métodos em W0 87/05330 publicada a 11 de Setembro de 1987 e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., p. 259-306 (1981) .

Pode obter-se química ou enzimaticamente a remoção de quaisquer partes de hidrato de carbono presentes num polipéptido do invento. A desglicosilação química necessita de exposição do polipéptido ao composto ácido trifluorometanossulfónico ou a um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos os açúcares com excepção do açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina) deixando o polipéptido intacto. Descreve-se desglicosilação química em Hakimuddin, et al. Arch Biochem. Biophys. 259:52 (1987) e em Edge et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981). Pode obter-se clivagem enzimática de partes de hidrato de carbono, e.g., em anticorpos pela utilização de uma variedade de endoglicosidases e exoglicosidases tal como descrito por Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138:350 (1987). 80 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Outro tipo de modificação covalente de um polipéptido do invento compreende ligar o polipéptido a um de entre vários polímeros não proteináceos, e.g., polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos no modo estabelecido nas patentes U.S. 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 ou 4179337.

Vectores, células hospedeiras e métodos recombinantes

Os polipéptidos do invento podem ser produzidos de forma recombinante utilizando técnicas e materiais facilmente obteníveis.

Para produção recombinante de um polipéptido do invento, e.g., um ANGPTL4 ou um anticorpo anti-ANGPTL4, um anticorpo anti-OG-Ps ou anticorpo anti-angiogénese, e.g., anticorpo anti-VEGF, isola-se o ácido nucleico que o codifica e insere-se num vector replicável para clonagem adicional (amplificação do ADN) ou para expressão. O ADN que codifica o polipéptido do invento é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais. Por exemplo, isola-se e sequencia-se um ADN que codifica um anticorpo monoclonal, e.g., utilizando sondas de oligonucleótido que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo. Estão disponíveis muitos vectores. As componentes do vector incluem geralmente, sem lhes estar limitadas, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição.

Componente sequência de sinal

Podem produzir-se polipéptidos do invento de forma recombinante não apenas directamente mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que é tipicamente uma sequência de sinal ou outro polipéptido com um local de clivagem específico no N-terminal da proteína ou polipéptido maduros. A sequência de sinal heteróloga tipicamente seleccionada é aquela que é reconhecida e processada (i.e., clivada por uma peptidase de sinalização) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam a sequência de sinal do 81 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ polipéptido nativo substitui-se a sequência de sinal por uma sequência de sinal procariótica seleccionada, por exemplo, de um grupo de comandos de fosfatase alcalina, de penicilinase, de Ipp ou de enterotoxina II estável ao calor. Para secreção por levedura pode substituir-se a sequência de sinal nativa por, e.g., o comando de invertase de levedura, um comando de factor (incluindo comandos do factor α de Saccharomyces e

Kluyveromyces) ou comando de fosfatase ácida, o comando de glucoamilase de C. albicans ou o sinal descrito em WO 90/13646. Na expressão de células de mamífero estão disponíveis sequências de sinal assim como comandos de secreção virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex. O ADN para essa região precursora é ligado em enquadramento de leitura ao ADN que codifica o polipéptido do invento.

Componente origem de replicação

Tanto o vector de expressão como o de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite ao vector replicar em uma ou mais células hospedeiras seleccionadas. De um modo geral, em vectores de clonagem esta sequência é aquela que permite ao vector replicar independentemente do ADN cromossómico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autónoma. Tais sequências são bem conhecidas para várias bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação de um plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é adequada para levedura e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para clonagem de vectores em células de mamífero. De um modo geral, a componente origem de replicação não é necessária para vectores de expressão de mamíferos (pode ser tipicamente utilizada a origem de SV40 apenas porque contém o promotor precoce).

Componente gene de selecção

Os vectores de expressão e clonagem podem conter um gene de selecção também denominado um marcador de selecção. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) 82 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos, e.g., o gene que codifica D-alanina-racemase para bacilos.

Um exemplo de um esquema de selecção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a um fármaco e assim sobrevivem ao regime de selecção. Exemplos desta selecção dominante utilizam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para absorver o ácido nucleico do anticorpo tal como DHFR, timidina-quinase, metalotioneína I e II, tipicamente genes de metalotioneína de primatas, adenosina-desaminase, ornitina-descarboxilase, etc.

Por exemplo, as células transformadas com o gene seleccionável DHFR são primeiro identificadas por cultura de todos os produtos de transformação num meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando se utiliza DHFR de tipo selvagem é a linha celular de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em actividade de DHFR.

Alternativamente, podem seleccionar-se células hospedeiras (nomeadamente hospedeiros de tipo selvagem que contêm DHFR endógena) transformadas ou co-transformadas com sequências de ADN que codificam um polipéptido do invento, proteína DHFR de tipo selvagem e outro marcador seleccionável tal como aminoglicósido-3'-fosfotransferase (APH) por crescimento celular em meio contendo um agente de selecção para o marcador seleccionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, e.g., canamicina, neomicina ou G418. Consultar patente U.S. 4965199.

Um gene de selecção adequado para utilização em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura Yrp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). 0 gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC 44076 83 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ ou ΡΕΡ4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). A presença da lesão trpl I no genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um ambiente eficaz para detectar transformação por crescimento na ausência de triptofano. De igual modo, estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20622 ou 38626) são complementadas por plasmídeos conhecidos apresentando o gene Leu2.

Adicionalmente, podem utilizar-se vectores derivados do plasmideo circular de 1,6 pm pKDl para transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, relatou-se um sistema de expressão para produção em grande escala de quimosina de vitelo recombinante para K. lactis Van den Berg, Biol/Technology, 8:135 (1990). Também se revelaram vectores de expressão multi-cópias estáveis para secreção de albumina sérica humana recombinante madura por estirpes industriais de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

Componente promotor

Os vectores de expressão e clonagem contêm habitualmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está ligado operativamente a um ácido nucleico que codifica um polipéptido do invento. Os promotores adequados para utilização com hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, os sistemas promotores de β-lactamase e de lactose, fosfatase alcalina, um sistema promotor do triptofano (trp) e promotores híbridos tais como o promotor tac. São contudo adequados outros promotores bacterianos conhecidos. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos conterão igualmente uma sequência Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operativamente ao ADN que codifica o polipéptido do invento. São conhecidas sequências promotoras para eucariotas. Virtualmente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do local onde se inicia a transcrição. Outra sequência presente a 70 a 80 bases a montante do início de transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT em que N pode ser qualquer nucleótido. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos encontra-se uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli A à extremidade 3' da 84 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ sequência de codificação. Todas estas sequências são adequadamente inseridas em vectores de expressão eucarióticos.

Exemplos de sequências de promoção adequadas para utilização com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato-quinase ou outras enzimas glicolíticas, tal como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase.

Outros indutíveis controlada promotoras fosfatase metabolismo promotores de levedura, que são promotores apresentando a vantagem adicional de transcrição por condições de crescimento, são as regiões para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, ácida, enzimas de degradação associadas ao do azoto, metalotioneina, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis por utilização de maltose e galactose. Descrevem-se adicionalmente vectores e promotores adequados para utilização em expressão de levedura em EP 73657. Utilizam-se vantajosamente também potenciadores de levedura com promotores de levedura. A transcrição de polipéptidos do invento a partir de vectores em células hospedeiras de mamifero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir de genomas de virus tais como vírus do polioma, vírus da varíola aviária, adenovírus (tal como adenovírus 2), virus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e tipicamente vírus símio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, e.g., o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas celulares do hospedeiro.

Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos na forma de um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem de replicação virai de SV40. O promotor precoce imediato de citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindIII E. Revela-se um sistema para expressar ADN em 85

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT hospedeiros mamíferos utilizando o vírus do papiloma bovino como vector na patente U.S. 4419446. Descreve-se uma modificação deste sistema na patente U.S. 4601978. Consultar igualmente Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre expressão de ADNc de β-interferão humano em células de ratinho sob o controlo de um promotor de timidina-quinase do vírus herpes simplex. Alternativamente, pode utilizar-se como promotor a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous.

Componente elemento potenciador A transcrição de um ADN que codifica um polipéptido deste invento por eucariotas superiores é muitas vezes aumentada por inserção de uma sequência potenciadora no vector. São agora conhecidas muitas sequências potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, utilizar-se-á um potenciador de um vírus de célula eucariótica. Os exemplos incluem o potenciador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o potenciador do promotor precoce de citomegalovírus, o potenciador de polioma no lado tardio da origem de replicação e potenciadores de adenovírus. Consultar igualmente Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para activação de promotores eucarióticos. O potenciador pode ser submetido a splicing para o vector na posição a 5' ou 3' da sequência que codifica o polipéptido mas localiza-se tipicamente no local a 5' do promotor.

Componente terminação de transcrição

Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (leveduras, fungos, insectos, plantas; animais, humanos ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão sequências necessárias para a terminação de transcrição e para estabilizar o ARNm. Tais sequências estão habitualmente disponíveis das regiões não traduzidas a 5' e ocasionalmente a 3', de ADN ou ADNc eucarióticos ou virais. Essas regiões contêm segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados na parte não traduzida do ARNm que codifica o polipéptido do invento. Uma componente terminação de transcrição útil é a região de 86 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ poliadenilaçao da hormona de crescimento bovino. Consultar WO 94/11026 e o vector de expressão ai revelado.

Selecção e transformação de células hospedeiras

Aqui, são células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de ADN que codifica os polipéptidos do invento nos vectores, as células procariotas, de levedura ou eucariotas superiores anteriormente descritas. Os procariotas adequados para este objectivo incluem eubactérias tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcesans e Shigella, assim como bacilos tais como B. subtilis e B. licheni forrais {e.g., B. licheniformis 41P revelado em DD 266710 publicado a 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa e Streptomyces. Tipicamente, o hospedeiro de clonagem E. coli é E. coli 294 (ATCC 31446) apesar de serem adequadas outras estirpes tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537) e E. coli W3110 (ATCC 27325). Estes exemplos são ilustrativos e não limitativos.

Além de procariotas, os micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vectores que codificam o polipéptido do invento. A Saccharomyces cerevisiae ou levedura de padeiro comum é o mais habitualmente utilizado dos microrganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. Contudo, vários outros géneros, espécies e estirpes estão habitualmente disponíveis e são aqui úteis, tal como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces tal como, e.g., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans e K. marxianus; Yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tais como, e.g., hospedeiros de Neurospora, Penicilliuin, Tolypocladium e Aspergillus tal como A. nidulans e A. niger. 87 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Derivam-se células hospedeiras adequadas para a expressão de polipéptidos glicosilados do invento a partir de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e de insecto. Identificaram-se várias estirpes e variantes de baculovirus correspondentes a células hospedeiras de insecto permissivas de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca do vinagre) e Bombyx mori. Estão disponíveis ao público várias estirpes virais para transfecção, e.g., a variante L-l de

Autographa californica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV e podem utilizar-se tais vírus como os vírus aqui de acordo com o invento nomeadamente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Podem também utilizar-se como hospedeiros culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco.

Contudo, o interesse tem sido maior em células de vertebrado e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecidos) tem-se tornado procedimento de rotina. Exemplos de linhas celulares de mamífero hospedeiras úteis são a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen ViroL 36:59 (1977); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather,

Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato-búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e linha de hepatoma humano (Hep G2).

Transformam-se células hospedeiras com os vectores de expressão ou clonagem anteriormente mencionados para produção de polipéptido do invento e cultivam-se em meio nutriente

88 ΕΡ 1 771 4 7 4/PT convencional promotores, amplificação pretendidas. modificado como adequado para indução de selecção de produtos de transformação ou dos genes que codificam as sequências

Cultura de células hospedeiras

As células hospedeiras utilizadas para produzir polipéptidos do invento podem ser cultivadas em vários meios. São adequados para cultivar as células hospedeiras os meios disponíveis comercialmente tais como FIO de Ham (Sigma), meio mínimo essencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e meio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma). Além disso, podem utilizar-se como meios de cultura para as células hospedeiras quaisquer dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), patente U.S. 4767704; 4657866; 4927762; 4560655; ou 5122469.; WO 90/03430; WO 87/00195; ou patente U.S. Re. 30985. Quaisquer destes meios podem ser suplementados como necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleótidos (tal como adenosina e timidina), antibióticos (tais como fármaco 47 GENTAMYCIN™), elementos vestigiários (definidos como compostos inorgânicos habitualmente presentes a concentrações finais na gama micromolar) e glucose ou uma fonte de energia equivalente. Podem também incluir-se quaisquer outros suplementos necessários a concentrações apropriadas que seriam conhecidas pelos peritos na especialidade. As condições da cultura, tal como temperatura, pH e semelhantes, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e será evidente para o perito na especialidade.

Purificação de polipéptidos

Quando se utilizam técnicas recombinantes pode produzir-se um polipéptido do invento, e.g., ANGPTL4, anticorpos do invento, e.g., anticorpo anti-ANGPTL4, anticorpo anti-o^s ou anticorpo de moléculas anti-angiogénese, intracelularmente no espaço periplasmático ou directamente excretados para o meio. Podem recuperar-se polipéptidos do invento a partir do meio de cultura ou de lisados de células hospedeiras. Se estiverem 89

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT ligados à membrana podem ser libertados das membranas utilizando uma solução de detergente apropriado (e.g. Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. As células utilizadas na expressão de um polipéptido do invento podem ser quebradas por vários meios físicos ou químicos tais como ciclos de congelamento-descongelamento, ultra-sons, ruptura mecânica ou agentes de lise de células.

Pode pretender-se purificar um polipéptido do invento de proteínas ou polipéptidos de células recombinantes. Os seguintes procedimentos são exemplos de procedimentos de purificação adequados: fraccionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação com etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™, cromatografia numa resina de permuta aniónica ou catiónica (tal como uma coluna de poli(ácido aspártico), DEAE, etc.); cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A-Sepharose para remover contaminantes tais como IgG; e colunas de quelação de metais para ligar formas de polipéptidos do invento marcadas com epítopos. Podem utilizar-se vários métodos de purificação de proteínas e tais métodos são conhecidos na especialidade e descritos por exemplo em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990);

Scopes, Protein Purification: Principies and Practice,

Springer-Verlag, New York (1982). A(s) etapa(s) de purificação seleccionada(s) dependerão, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do polipéptido do invento específico produzido.

Por exemplo, uma composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, sendo a cromatografia de afinidade a técnica de purificação típica. A adequação de proteína A como um ligando de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiam nas cadeias pesadas γΐ, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Recomenda-se proteína G para todos os isotipos de ratinho e para y3 humano (Guss et al., EMBO J. 90

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT 5:1507-1575 (1986)). A matriz à qual se liga o ligando de afinidade é na maioria das vezes agarose mas estão disponíveis outras matrizes. As matrizes mecanicamente estáveis tal como vidro de porosidade controlada ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem caudais mais rápidos e tempos de processamento mais curtos relativamente aos obtidos com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Estão também disponíveis outras técnicas para purificação de proteína, e.g., as indicadas anteriormente, dependendo do anticorpo a recuperar. Consultar igualmente, Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) que descreve um procedimento para isolar anticorpos que são excretados para o espaço periplasmático de E. coli.

Composições farmacêuticas

Preparam-se para armazenamento formulações terapêuticas de polipéptidos do invento, moléculas do invento e suas combinações e descrevem-se aqui utilizações de acordo com o invento, por mistura de um ou mais polipéptidos com o grau de pureza pretendido com transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. [1980]), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os recebedores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrina; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra iões formadores de sal tal como sódio; 91

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT complexos metálicos (e.g. complexos Zn-proteína); e/ou tensioactivos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG).

Podem também aprisionar-se os ingredientes activos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas coloidais de entrega de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Revelam-se tais técnicas em Remington's Pharmaceutical Science 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

As formulações a utilizar para administração in vivo têm que ser estéreis. Tal consegue-se facilmente por filtração através de membranas de filtração estéreis.

Podem preparar-se preparações de libertação prolongada. Exemplos adequados de preparações de libertação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo um polipéptido do invento, cujas matrizes estão na forma de artigos enformados, e.g. filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2- hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinílico)), polilactidas (patente U.S. 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etileno e acetato de vinilo não degradáveis, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tal como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitem a libertação de moléculas ao longo de 100 dias, determinados hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos permanecem no corpo durante um período de tempo longo, estes podem desnaturar ou agregar em resultado da exposição a humidade a 37°C resultando em perda de actividade biológica e possíveis alterações de imunogenicidade. Podem planear-se estratégias racionais para estabilização dependendo do 92

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT mecanismo envolvido. Por exemplo, caso se verifique que o mecanismo de agregação é a formação de ligações S-S intermoleculares através de permuta de tiodissulfureto, pode obter-se estabilização por modificação de resíduos sulfidrilo, liofilização a partir de soluções ácidas, controlo do teor em humidade, utilização de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matrizes poliméricas específicas. Consultar igualmente, e.g., patente US 6699501, que descreve cápsulas com cobertura polielectrolítica.

Está adicionalmente contemplado que se possa introduzir um agente do invento (ANGPTL4, agonista de ANGPTL4 ou antagonista de ANGPTL4) num indivíduo por terapia génica. A terapia génica refere-se a terapia efectuada pela administração de um ácido nucleico a um indivíduo. Em aplicações de terapia génica, introduzem-se genes em células de modo a obter síntese in vivo de um produto génico terapeuticamente eficaz, por exemplo para substituição de um gene defeituoso. A "terapia génica" inclui terapia génica convencional em que se obtém um efeito duradouro com um único tratamento e a administração de produtos terapêuticos de agentes génicos, o que envolve administração única ou repetida de um ADN ou ARNm terapeuticamente eficaz. Podem utilizar-se ARN anti-sentido e ADN anti-sentido como agentes terapêuticos para bloquear a expressão de determinados genes in vivo. Consultar, e.g. Ad-ANGPTL4-ARNpi aqui descrito. Já se tinha demonstrado que se podem importar oligonucleótidos anti-sentido curtos para células onde actuam como inibidores apesar das suas concentrações intracelulares reduzidas provocadas pela sua absorção restrita pela membrana celular. (Zamecnik et al.,

Proc. Natl. Acad Sei. USA 83:4143-4146 (1986)). Podem modificar-se os oligonucleótidos para aumentar a sua absorção, e.g. por substituição dos seus grupos fosfodiéster carregados negativamente por grupos não carregados. Para revisões gerais dos métodos de terapia génica, consultar, por exemplo, Goldspiel et al. clinicai Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu e Wu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol.

Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993); Morgan e Anderson Ann Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); e May TIBTECH 11:155-215 (1993). Descreve-se métodos comummente conhecidos na especialidade de tecnologia de ADN recombinante e que se podem utilizar em Ausubel et al. ed. 93 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; e Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY. Há várias técnicas disponíveis para introduzir ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo do ácido nucleico a ser transferido para células cultivadas in vitro ou in vivo para as células do hospedeiro pretendido. As técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamífero in vitro incluem a utilização de lipossomas, electroporação, micro-injecção, fusão celular, DEAE-dextrano, o método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. As técnicas de transferência génica in vivo presentemente preferidas incluem transfecção com vectores virais (tipicamente retrovirais) e transfecção mediada por proteína de envelope viral-lipossoma (Dzau et ai., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). Por exemplo, as técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo incluem transfecção com vectores virais (tal como adenovírus, vírus herpes simplex I, lentivírus, retrovírus ou vírus adeno-associados) e sistemas baseados em lípidos (lípidos úteis para transferência do gene mediada por lípido são DOTMA, DOPE e DC-Chol, por exemplo). Podem encontrar-se exemplos de utilização de vectores virais em terapia génica em Clowes et ai. J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al. Blood 83:1467-1473 (1994) ; Salmons e Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993) ; Grossman e Wilson Curr. Opin. in. Genetics and Devei 3:110-114 (1993); Bout et ai. Human-Gene-Therapy 5:3=10 (1994) , Rosenfeld, et al. Science 252:431-434 (1991);

Rosenfeld et al. Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al. J. Clin Invest. 91:225-234 (1993); e Walsh et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993).

Nalgumas situações pretende-se proporcionar a fonte de ácido nucleico com um agente que tem como alvo as células alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína de superfície de membrana celular ou a célula alvo, um ligando para um receptor da célula alvo, etc. Quando se utilizam lipossomas, podem utilizar-se proteínas que se ligam a uma proteína de superfície de membrana celular associada a endocitose para dirigir ao alvo e/ou para facilitar absorção, e.g. proteínas de cápside ou seus fragmentos trópicos para um 94 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ tipo celular específico, anticorpos para proteínas que sofrem endocitose em ciclização, proteínas que têm como objectivo localização intracelular e melhoram a semivida intracelular. Descreve-se a técnica de endocitose mediada por receptor, por exemplo, em Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); e Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 3410-3414 (1990). Para uma revisão de protocolos de marcação génica e de terapia génica, consultar Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992) .

Dosagem e administração

Administram-se as moléculas do invento a um doente humano de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa como um bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, pelas vias de administração intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica, inalação e/ou subcutânea.

Em determinadas concretizações, o tratamento do invento envolve a administração combinada de um antagonista de ANGPTL4 e de um ou mais agentes anticancerosos, e.g., agentes antiangiogénicos. Numa concretização, estão presentes agentes anticancerosos adicionais, e.g., um ou mais agentes antiangiogénicos diferentes, um ou mais agentes quimioterapêuticos, etc. O invento também abrange administração de inibidores múltiplos, e.g., anticorpos múltiplos contra o mesmo antigénio ou anticorpos múltiplos para diferentes moléculas activas em cancro. Numa concretização, administra-se uma mistura de diferentes agentes quimioterapêuticos com o antagonista de ANGPTL4 e/ou um ou mais agentes antiangiogénicos. A administração combinada inclui co-administração utilizando formulações independentes ou uma formulação farmacêutica única e/ou administração consecutiva por qualquer ordem. Por exemplo, um antagonista de ANGPTL4 pode preceder, seguir, ou alternar com a administração dos agentes anticancerosos ou ser administrado simultaneamente com estes. Numa concretização, ocorre um período de tempo em que ambos (ou todos) os agentes activos exercem simultaneamente as suas actividades biológicas. 95 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Para prevenção ou tratamento de doença, a dosagem de antagonista de ANGPTL4 apropriada dependerá do tipo de doença a tratar tal como definido anteriormente, da gravidade e decurso da doença, se o inibidor é administrado com objectivos preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, da história clinica do doente e da resposta ao inibidor e da opinião do médico assistente. O inibidor é adequadamente administrado ao doente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Num regime de terapia de combinação, administram-se as composições do invento numa quantidade terapeuticamente eficaz ou numa quantidade sinérgica terapeuticamente. Tal como aqui utilizada, uma quantidade terapeuticamente eficaz é tal que a administração de uma composição do invento e/ou co-administração de antagonista de ANGPTL4 e um ou mais outros agentes terapêuticos, resulta na redução ou inibição da doença ou condição alvo. 0 efeito da administração de uma combinação de agentes pode ser aditivo. Numa concretização, o resultado da administração é um efeito sinergético. Uma quantidade sinergética terapeuticamente é a quantidade de antagonista de ANGPTL4 e um ou mais outros agentes terapêuticos, e.g., um inibidor de angiogénese, necessários para reduzir ou eliminar de forma sinérgica ou significativa condições ou sintomas associados com uma doença especifica.

Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 50 mg/kg (e.g. 0,1-20 mg/kg) de antagonista de ANGPTL4 ou inibidor de angiogénese é uma dosagem candidata inicial para administração ao doente, quer seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, quer seja por infusão continua. Uma dosagem diária típica pode variar desde cerca de 1 pg/kg a cerca de 100 mg/kg ou mais dependendo dos factores anteriormente mencionados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, mantém-se o tratamento até à ocorrência pretendida de uma supressão de sintomas de doença. Podem contudo ser úteis outros regimes de dosagem. Tipicamente, o médico administrará uma ou mais moléculas do invento até se atingir uma dosagem que proporcione o efeito biológico pretendido. A progressão da terapia do invento é facilmente monitorizada por técnicas e ensaios convencionais. 96

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT

Por exemplo, podem utilizar-se calendários de preparação e dosagem para inibidores de angiogénese, e.g., anticorpos anti-VEGF tal como AVASTIN® (Genentech) , de acordo com as instruções do fabricante ou determinam-se empiricamente pelo perito na especialidade. Noutro exemplo, podem utilizar-se calendários de preparação e dosagem para tais agentes quimioterapêuticos de acordo com as instruções do fabricante ou tal como determinado empiricamente pelo perito na especialidade. Descrevem-se também calendários de preparação e dosagem para quimioterapia em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

Eficácia do tratamento

Pode medir-se a eficácia do tratamento do invento por vários pontos terminais habitualmente utilizados na avaliação de desordens neoplásicas ou não neoplásicas. Por exemplo, os tratamentos de cancro podem ser avaliados por, e.g., sem lhes estar limitados, regressão de tumor, diminuição de peso ou tamanho de tumor, tempo decorrido até progressão, duração da sobrevivência, sobrevivência sem progressão, taxa de resposta global, duração da resposta e qualidade de vida. Devido aos agentes antiangiogénicos aqui descritos terem como alvo a vasculatura do tumor e não necessariamente as próprias células neoplásicas, estes representam uma classe única de fármacos anticancerosos e consequentemente podem necessitar de medidas e definições únicas de respostas clinicas a fármacos. Por exemplo, a diminuição do tumor até mais de 50% numa análise bidimensional é o limiar padrão para reconhecimento de resposta. Contudo, os inibidores do invento podem provocar inibição de alastramento metastático sem diminuição do tumor primário ou podem simplesmente exercer um efeito de impedir a propagação do tumor. Assim, podem utilizar-se abordagens para determinar a eficácia da terapia, incluindo por exemplo medição de marcadores de angiogénese plasmáticos ou urinários e medição de resposta através de imagem radiológica.

Numa concretização, o invento pode ser utilizado para aumentar a duração de sobrevivência de um doente humano susceptivel a uma desordem neoplásica ou não neoplásica ou ao qual foi diagnosticada tal doença, e.g., cancro. A duração da sobrevivência define-se como o intervalo de tempo desde a primeira administração do fármaco até à morte. Num aspecto, 97 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ administra-se um antagonista de ANGPTL4 do invento ao doente humano em combinação com um ou mais agentes anticancerosos aumentado assim efectivamente a duração da sobrevivência do doente comparativamente com um único tipo de terapia sozinha, e.g., aumenta cerca de 5% ou aumenta cerca de 10% ou aumenta cerca de 20% ou aumenta cerca de 30% ou aumenta cerca de 40% ou aumenta cerca de 50% ou mais, comparativamente com um único tipo de terapia.

Noutra concretização, o invento proporciona métodos para aumentar sobrevivência sem progressão de um doente humano susceptivel a uma desordem neoplásica ou não neoplásica ou ao qual foi diagnosticada tal doença, e.g., cancro. A duração até à progressão da doença define-se como o intervalo de tempo desde a administração do fármaco até à progressão da doença. Numa concretização, o tratamento de combinação do invento utilizando antagonista de ANGPTL4 e um ou mais agentes anticancerosos aumenta significativamente a sobrevivência sem progressão em pelo menos cerca de 2 meses, pelo menos cerca de 4 meses, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 8 meses, um ano ou mais, comparativamente com um tratamento anticanceroso com uma só terapia.

Ainda noutra concretização, o tratamento do invento aumenta significativamente a taxa de resposta num grupo de doentes humanos susceptíveis a cancro ou aos quais foi diagnosticado cancro que são tratadas com vários produtos terapêuticos. Define-se taxa de resposta como a percentagem de doentes tratados que reagiram ao tratamento. Numa concretização do invento, o tratamento de combinação do invento utilizando antagonista de ANGPTL4 e um ou mais agentes anticancerosos aumenta significativamente a taxa de resposta no grupo de doentes tratados comparativamente com o grupo tratado com um único tipo de terapia de cancro (e.g., apenas quimioterapia) tendo o referido aumento um valor de p de Qui quadrado, e.g., inferior a 0,010 ou inferior a 0,005 ou inferior a 0,001.

Num aspecto, o invento proporciona métodos para aumentar a duração da resposta num doente humano ou num grupo de doentes humanos susceptíveis a cancro ou aos quais foi diagnosticado cancro. Define-se a duração da resposta como o intervalo de 98 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ tempo desde a resposta inicial até à progressão da doença. Em determinadas concretizações do invento, num tratamento de combinação do invento utilizando antagonista de ANGPTL4 e um ou mais agentes anticancerosos, pode obter-se um aumento estatisticamente significativo de, e.g., pelo menos 2 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 6 meses de duração de resposta.

Artigos de fabrico

Noutra concretização do invento, proporciona-se um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o tratamento das desordens anteriormente descritas. 0 artigo de fabrico compreende um recipiente, uma etiqueta e um folheto inserido na embalagem. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de matérias tais como vidro ou plástico. 0 recipiente contém uma composição que é eficaz para o tratamento da doença e pode ter um ponto de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de infecção hipodérmica). Pelo menos um agente activo na composição é um modulador de ANGPTL4. A etiqueta nos recipientes ou associada a estes indica que a composição é utilizada para tratar a doença em causa. 0 artigo de fabrico pode compreender adicionalmente um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável tal como solução salina tamponada de fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir adicionalmente outros materiais pretendidos de um ponto de vista comercial ou do utilizador, incluindo agentes activos adicionais, outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Depósito de materiais

Depositaram-se os seguintes materiais em American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209, EUA (ATCC):

Material N.0 de depósito ATCC Data do depósito ANGPTL4 (NL2-ADN 22780-1078) 209284 18/9/97 Linha celular de hibridoma que produz o anticorpo A4.6.1 ATCC HB-10709 29/3/91 99 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ Ο depósito foi efectuado ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patente e seus Regulamentos (Tratado de Budapeste). Tal assegura a manutenção de uma cultura viável do depósito durante 30 anos a partir da data do depósito. O depósito será tornado disponível pela ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre Genentech, Inc. e ATCC, que assegura disponibilidade permanente e ilimitada ao público da descendência da cultura do depósito por concessão da patente U.S. pertinente ou tornar disponível ao público qualquer pedido de patente U.S. ou estrangeiro, aquele que surgir primeiro e assegura a disponibilidade da descendência aquele que o U.S. Commissioner of Patents and Trademarks determinar como tendo esse direito de acordo com 35 USC § 122 e em conformidade com as respectivas regras do Commissioner (incluindo 37 CFR § 1.14 com particular referência a 886 OG 638). 0 cessionário do presente pedido concordou que se a cultura de materiais em depósito morrer ou for perdida ou destruída quando cultivada sob condições adequadas, os materiais serão imediatamente substituídos por outros iguais após notificação. A disponibilidade do material depositado não deve ser considerada como uma autorização para levar o invento à prática em contravenção dos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis de patentes.

EXEMPLOS

Entende-se que os depósitos, exemplos e concretizações aqui descritos têm objectivos meramente ilustrativos e que, tendo as mesmas em conta, serão sugeridas várias modificações aos peritos na especialidade e podem estar incluídas no âmbito das reivindicações anexas. Os reagentes disponíveis comercialmente e referidos nos exemplos são utilizados de acordo com as instruções do fabricante salvo indicação em contrário. 100 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

EXEMPLO 1: ANGPTL4 ESTIMULA A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS TUMORAIS E MIGRAÇÃO CELULAR

Geração de vectores adenovirais e transdução: As construções adenovirais foram construídas por clonagem da inserção de ADNc Notl-Notl no local poliligante dos kits de construção de vectores Ad-easy da Stratagene (LaJolla, CA) , essencialmente como descrito pelo fabricante. Consultar, e.g., Hesser et al. Blood, 104(1):149-158 (2004).

Geração de proteína marcada com um único marcador flag hAngptlí (23-406) (PUR9384), mAngptl4 (184-410) -IgG (PUR938) e mAngptl4(23-410) (PUR9452): Passou-se durante a noite, fluido recolhido da cultura celular sobre resina anti-flag M2 (Sigma#A-2220). Lavou-se a coluna até à linha de base com PBS e seguidamente eluiu-se com citrato de Na 50 mM, pH 3,0. Este volume foi concentrado em Amicon-15 de 10 000 MWO (Millipore #UFC901024) . A etapa final foi diálise para HC1 lmM/H20 Super Q e filtração em 0,2 um. Utilizou-se um gel de SDS-page de tris a 4-20%/glicina (Invitrogen#EC6028box) +/- DTT 10 mM para determinar a pureza. As proteínas correctas foram identificadas por espectrometria de massa ou por sequenciação N-terminal de Edman.

Geração de marcador flag n-terminal de hAngptl4 (184-406) -IgG (PUR 9441) seguido em série por um marcador hu Fc n-terminal: Passou-se, durante a noite, fluido recolhido da cultura celular sobre ProSep A (Amersham #113111835). Lavou-se a coluna até à linha de base com PBS. Seguidamente efectuou-se uma etapa de lavagem com quatro volumes de coluna de TMAC 0,5 M/PBS, pH 7,5, seguida por uma lavagem com PBS até à linha de base. A etapa de eluição foi com um choque de citrato de Na 50 mM pH 3,0. Este volume foi concentrado em Amicon-15 de 10 000 MWCO (Millipore #UFC901024). A etapa final foi diálise para HC1 1 mM/H20 Super Q e filtração em 0,2 um. Utilizou-se um SDS-page de tris a 4-20%/glicina (Invitrogen#EC6028box) +/-DTT 10 mM para determinar a pureza. As proteínas correctas foram identificadas por espectrometria de massa ou por sequenciação N-terminal de Edman. As proteínas recombinantes também podem ser preparadas utilizando técnicas padrão conhecidas na especialidade. 101 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Geração de Ad-ANGPTL4-ARNpi: Geraram-se 4 moléculas de ANGPTL4-ARNpi (Qiagen) potenciais com base na sequência completa de hANGPTL4. Seleccionou-se um ANGPTL4-ARNpi com base na capacidade do ARNpi inibir a expressão de hANGPTL4. Tinha como alvo a seguinte sequência de ADN GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA (SEQ ID NO:3) de ANGPTL4, e.g., r(GGCCAAGCCUGCCCGAAGAUU) (SEQ ID NO:4) e/ou r(UCUUCGGGCAGGCUUGGCCAC) (SEQ ID NO:5). Clonou-se o ARNpi num vector de transferência CMVpShuttle-Hl.1 com um promotor de ARN, e.g., promotor Hl (GenScript). Clonou-se então a cassete de expressão de ARNpi para gerar uma construção AdhANGPTL4-ARNpi adenoviral. Por exemplo, construiram-se construções adenovirais por clonagem da inserção de ADNc NotI-Notl no local poliligante dos kits de vector de construção de vectores Ad-easy de Stratagene (LaJolla, CA), essencialmente como descrito pelo fabricante. Consultar, e.g., Hesser et al., Blood, 104(1):149-158 (2004).

Verificou-se a expressão de ANGPTL4 por análise "Western blooting" utilizando um anticorpo anti-FLAG. Seleccionou-se um clone com expressão forte e amplificaram-se os títulos de acordo com as instruções dos fabricantes. As preparações virais foram purificadas por centrifugação com CsCl e ensaiaram-se quanto a produtos de inversão por PCR. Determinaram-se os títulos virais por experiências de lise celular em 96 poços de acordo com as instruções dos fabricantes. Estes vectores, juntamente com pShuttleCMV-lacZ fornecido, foram recombinados em bactérias BJ5183 electrocompetentes com o vector AdEasy contendo o genoma Ad5 com deleção das regiões EI e E3. Prepararam-se soluções de reserva virais primárias por transfecção transitória de plasmídeos AdEasy recombinados em células hospedeiras HEK293. As soluções de reserva de adenovírus foram amplificadas adicionalmente em células HEK293 e purificadas utilizando o método de purificação em gradiente de CsCl, tal como descrito pelo fabricante. Os títulos de trabalho de adenovírus foram obtidos por ensaio de Elisa.

Geração de mANGPTL4: Transfectaram-se transitoriamente células 293 com uma construção que continha um ácido nucleico que codifica mANGPTL4 completo (1-410). Purificou-se mANGPTL4 a partir do sobrenadante e utilizou-se para experiências. 102 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Proliferação de células tumorais in vitro: A ANGPTL4 estimulou a proliferação de células tumorais de rabdomiossarcoma A673 humano (HTB 1598) in vitro. Consultar a figura 4, painel A. Geraram-se construções de adenovirus de Ad-Angptl4, Ad-LacZ, Ad-Angptll3 tal como descrito anteriormente (Hesser et al., Blood, 104 (1):149-158 (2004)).

Transduziram-se células A673 com uma construção compreendendo a construção adenovírus-ANGPTL4 (Ad-Angptl4), a construção adenovírus-LacZ (Ad-LacZ) como um controlo ou a construção adenovírus-ANGPTL3 (Ad-Angptl3) à multiplicidade de infecção (MOI) de 100. Após 3 dias de cultura de células A6 73 em DMEM com teor elevado de glicose e FCS a 5%, contaram-se as células. Tal como indicado na figura 4, painel A, Ad-Angptl4 estimulou a proliferação de células tumorais. Verificou-se um aumento superior a cerca de 2 vezes do número de células em células tratadas com Ad-Angptl4 comparativamente com o controlo Ad-LacZ. Ad-Angptl4 também estimulou a proliferação de células MCF7 (adenocarcinoma de mama humano) cerca de 3 vezes, das células TK10 (linha de cancro de células renais) cerca de 2 vezes e de células A549 (carcinoma de pulmão humano) cerca de 1,5 vezes comparativamente com o controlo. Ad-Angptl4 também estimulou a proliferação de células U87MG; consultar figura 4, painel B, em que se transduziram células (A673, U87MG, 4T-1 ou Caki) com uma construção compreendendo a construção de adenovírus-ANGPTL4 (Ad-Angptl4 (2)), a construção de adenovírus-LacZ (Ad-LacZ (1)) como um controlo ou a construção de adenovirus ANGPTL4-ARNpi (3) à multiplicidade de infecção (MOI) de 500. Após 2-3 dias de cultura das células em DMEM de glicose elevada com FCS a 5%, contaram-se as células. O meio condicionado de células COS transduzidas com ANGPTL4 também induziu proliferação de células A673. Consultar a figura 4, painel C. Adicionou-se a células A673 meio condicionado (sobrenadante) de hepatócitos (Hepa) (A), células endoteliais microvasculares humanas (HMEC) (B) ou COS7 (C) que estavam transduzidas com construções de adenovirus (Ad-Angptl4-(2), Ad-LacZ (1) ou Ad Angptl3 (4) . Após 4 dias de cultura das células A673 em DMEM de glicose elevada com FCS a 5%, contaram-se as células. Tal como indicado na figura 4, painel C, o sobrenadante de células COS + Ad-Angptl4 estimulou a proliferação de células tumorais comparativamente com os 103 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ controlos e outros sobrenadantes de outros tipos de células que foram utilizados, e.g., células Hepa e células HMVEC.

Actividade Angptl4 quando em revestimento de placas de cultura: A proliferação de células A673 por Angptl4 foi também analisada revestindo placas de cultura com proteína. As placas foram revestidas com Angptl4 murino, LZ-hANgptl4, fibronectina, NL4 como uma proteína de controlo, IgG-hAngptl4 (184-406), mAngptl3, hAngptl3, mAngptl4 (23-410), Lz-hAngptl4 (184-406), Fc-hAngptl4 (184-406) ou BSA, a várias concentrações, e.g., sem revestimento, 0,3 pg/ml, 3,0 pg/ml ou 30 pg/ml. Revestiram-se placas de fundo plano de 96 poços (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca) durante a noite a 4°C. Recolheram-se as células tumorais A673 humanas e diluíram-se para 105 células/ml em meio HG-DMEM contendo FCS a 5%. Adicionaram-se suspensões de células (104 células/poço) em 200 μΐ aos poços revestidos e incubaram-se as placas a 37°C durante intervalos de tempo seleccionados. Removeram-se as células não aderentes por lavagens com PBS e mediu-se a ligação de células utilizando violeta de cristal ou o método PNAG de Landegren. Consultar Landegren, U. (1984) J. Immunol. Methods 67:379-388. Os resultados são expressos como as médias dos valores de D055o ou DO405 de poços em triplicado, respectivamente.

De modo semelhante, recolheram-se células endoteliais de veia umbilical primária humana (HUVEC), células epiteliais (epi) e mesangiais (mesa) isoladas de cordões umbilicais humanos ou rins humanos (Cambrex) e ensaiaram-se utilizando condições idênticas. Para o ensaio de proliferação, utilizou-se o meio fornecido para cada tipo de célula pelo fabricante (Cambrex). ANGPTL4 não pareceu induzir proliferação de células epiteliais de rim, células mesangiais renais ou células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC), mas induziu proliferação de A673 (figura 5).

Análise FACS de ligação de ANGPTL4 a células A673: Analisou-se a ligação de ANGPTL4 a células A673 humanas por análise FACS. Plaquearam-se células A673 em placas de cultura de 10 cm a 500 000 a 1 x 106 células/poço de amostra. As células foram divididas no dia anterior a FACS. As células foram lavadas uma vez com PBS e seguidamente adicionou-se 104 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ 10 ml de EDTA 20 mM em PBS e incubou-se durante 10 a 20 minutos. Após 20 minutos, rasparam-se as células da placa. Adicionou-se 10 ml de FCS a 5% em PBS e transferiram-se as células para um tubo Falcon de 50 ml. As células foram centrifugadas a 1,8K rpm durante 5 minutos a 4°C. Removeu-se o sobrenadante e ressuspenderam-se as células em 1 ml de FCS a 5% em PBS. Distribuiu-se 100 μΐ de suspensão celular para tubos de FACS de 5 ml contendo 1 yg de proteína e incubou-se durante 30 minutos ou mais em gelo. Utilizaram-se as seguintes proteínas: mAngptl4 (23-410), PUR 9452, 0,428 mg/ml (2 μΐ/amostra); hAngptl4 (23-406), PUR 9384, +/- 90 yg/ml (10 μΐ/amostra); hAngptl4 (184-406)-IgG, PUR 9441, 1,5 mg/ml (1 μΐ/amostra); e controlo FLAG-BAP (Sigma) 0,1 mg/ml (2 μΐ/amostra). Após incubação, encheram-se os tubos com 5 ml de FCS a 5% em PBS em gelo. Centrifugaram-se as células durante 5 minutos a 2K rpm. Removeu-se o sobrenadante. Adicionou-se anticorpo anti-FLAG-FTTC (Sigma) (2 μΐ de anticorpo (solução mãe a 100 yg/ml) e incubou-se em gelo durante 5 minutos ou mais. A concentração final de anticorpo foi de 1 yg/ml. Adicionou-se 5 ml de FCS a 5% em PBS e centrifugaram-se as células durante 5 minutos a 1,8K rpm a 4°C. Removeu-se o sobrenadante e ressuspenderam-se as células em 0,25 ml de PBS com FCS a 5% em gelo. Pode também estar presente azida de sódio a 0,05% para evitar endocitose de receptor. Pode adicionar-se 1 μΐ de solução mãe de iodeto de propídio (PI) diluída a 1:50 por amostra. As células foram então sujeitas a FACS. Várias formas de ANGPTL4, tanto ANGPTL4 humana como bovina, ligam-se a células A673 (figura 6, painel A) em várias condições (figura 6, painel B), normoxia, hipoxia (O2 a 0%, durante 24 horas ou PMA (200 nM durante 24 horas). Para as experiências de hipoxia, incubaram-se células durante 24 horas a 37°C num incubador com CO2 a 5%, N2 a 95% durante 24 horas. Alternativamente, activaram-se as células na presença de forboLeste (PMA) 200 nM num incubador a 37°C, C02 a 5% e condições de normoxia.

Meio condicionado de células que expressam ANGPTL4: Analisou-se a proliferação de células A673 quando se utilizou meio condicionado de células que expressam Angptl4 ou por adição de Angptl4 recombinante. Adicionou-se a células A673 500 μΐ de meio condicionado (sobrenadante) de COS7 que foram transduzidas com construções de adenovírus (Ad-Angptl4 (2), 105 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Ad-LacZ (1) ou Ad-LacZ + rmAngptl4 (23-410) (3) (5 pg/ml)).

Após a cultura das células durante 7 dias (figura 7, painel A) em meio DMEM de glicose elevada contendo FCS a 5%, contaram-se as células. Analisou-se também a proliferação de A673 por adição de Angptl4 recombinante ao meio com FCS a 5% e cultura das células durante 4 dias. Não se efectuou qualquer adição (1) ou adicionou-se um tampão de controlo (2), mAngptl4 (23-410) (2,5 pg/ml) (3), hAngptl4 (23-406) (2,5 pg/ml) (4), hlgG- hAngptl4 (184-406) (2,5 pg/ml) (5) ou hIgG-mAngptl4 (184-410) (2,5 pg/ml) (6) ao meio, à concentração indicada. Após se cultivarem as células durante 4 dias (figura 7, painel B) em meio DMEM de glicose elevada contendo FCS a 5%, contaram-se as células. A proliferação de células A673 por meio condicionado de células que expressam ANGPTL4 ou com proteína recombinante adicionada ao meio pode ser dependente da densidade celular. Consultar a figura 7, painel A (proliferação celular quando cultivadas durante 7 dias nas condições referidas) e painel B (proliferação celular quando cultivadas durante 4 dias nas condições referidas).

Angptl4 induz migração celular: Analisamos a capacidade de Angptl4 para induzir a migração celular de células tumorais 4T-1 murino. A motilidade celular foi medida tal como descrito (consultar, e.g., Camenisch, et al., J. BioL Chem, 277(19):17281-17290 (2002)) utilizando inserções de cultura de tecidos multi-poços HTS com porosidade de 3 pm (Becton Dickinson, NJ). Diluiu-se hANGPTL4 (1-406) em 50/50/BSA a 0,1% a 5, 1 e 0,2 pg/ml. Como um controlo positivo, incubaram-se as membranas com meio contendo soro de vitelo fetal (FCS) a 10% ou PDGF-BB humano recombinante (R&D Systems) a 0,1 pg/ml). Utilizou-se 50/50/BSA a 0,1% como um controlo negativo. Lavaram-se as células tumorais 4T1 de ratinho três vezes com PBS, recolheram-se e suspenderam-se a cerca de 105 células/ml em 50/50/BSA a 0,1%. Ensaiaram-se as seguintes preparações celulares, em que mANGPTL4 é indicada como NL2. 4T-1 50/50/BSA a 0,1% NL2 5 ug +FBS a 10% NL2 0,5 ug +FBS a 10% NL2 0,2 ug 50/50/BSA a 0,1% PDGF-BB 0,1 ug 106

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT

As preparações foram adicionadas à câmara inferior e as preparações foram incubadas a 37°C durante 19 horas.

Adicionou-se a suspensão celular (250 μΐ) à câmara superior e deixaram-se as células migrar durante a noite a 37°C num incubador humidificado com CO2 a 5%. Após incubação, aspirou-se o meio das câmaras superior e inferior e as células que tinham migrado para a face inferior da membrana foram fixadas com metanol (400 μΐ de MeOH durante 30 minutos a 4°C, remover MeOH e secar com ar durante 40 minutos) e coradas com iodeto de YO-PRO-1 (Molecular Probes, OR) (400 μΐ de iodeto de YO-PRO-1 a 10 pm (1:100 de uma solução-mãe 1 mM) ) . Quantificam-se os resultados da migração em termos do número médio de células/campo microscópico a uma ampliação de 20 vezes utilizando o utilitário Openlab (Improvision, MA).

Noutra experiência, verificou-se que Angptl4 induzia migração de células A673 conjuntamente com migração de células tumorais 4T-1. Diluiu-se mANGPTL4 em 50/50/BSA a 0,1% a 6, 1,5 e 0,375 pg/ml. Como controlo positivo, incubaram-se membranas com soro fetal de vitelo (FCS) a 10% contendo meio ou PDGF-BB humano recombinante (R&D Systems) a 0,1 pg/ml. Utilizou-se 50/50/BSA a 0,1% como controlo negativo. Recolheram-se células 4T-1 e A673 e ressuspenderam-se em 50/50/BSA a 0,1% (2xl05) células/ml). Ensaiaram-se as seguintes preparações celulares, em que mANGPTL4 é indicado como NL2. 4T-1 A6 73 50/50/BSA a 0,1% NL2 6 pg 50/50/BSA a 0,1% NL2 6 pg +10%FBS NL2 1,5 pg +10%FBS NL2 1,5 pg +10%FBS NL2 0,375 pg +10%FBS NL2 0,375 pg 50/50/BSA a 0,1% PDGF-BB 0,1 pg 50/50/BSA a 0,1% NL2 0,375 pg

Adicionaram-se as preparações à câmara inferior em 750 μΐ e incubaram-se as preparações a 37°C durante 19 horas.

Adicionou-se a suspensão celular (250 μΐ) (5xl04) à câmara superior e deixaram-se as células migrar durante 7 horas a 37°C num incubador humidificado com CO2 a 5%. Após incubação, aspirou-se o meio das câmaras superior e inferior e as células que tinham migrado para a face inferior da membrana foram 107 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ fixadas com metanol (400 μΐ de MeOH durante 30 minutos a 4°C, remover MeOH e secar com ar durante 40 minutos) e coradas com iodeto de YO-PRO-1 (Molecular Probes, OR) (400 μΐ de iodeto de YO-PRO-1 a 10 μιη (1:100 de uma solução-mãe 1 mM) ) . Quantificam-se os resultados da migração em termos do número médio de células/campo microscópico a uma ampliação de 20 vezes utilizando o utilitário Openlab (Improvision, MA). Consultar a figura 9, em que (1) é sem adição de soro, (2) é soro fetal de vitelo (FCS) a 10%, (3) é PDGF-BB e (4) é ANGPTL4. Utilizando ANGPTL4 e FCS a 10%, as células A673 e 4T-1 migraram. Assim, podem utilizar-se antagonistas de Angptl4 para inibir metástase, e.g., sem limitação teórica, evitando migração de células tumorais. ANGPTL4 aumenta o tamanho do tumor in vivo: Cultivaram-se células A673 de rabdomiossarcoma humano (HTB 1598) tal como anteriormente descrito (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); e Gerber et al., Câncer Research, 60:6253-6258 (2000)). Injectaram-se s.c. 5 x 106 células A673 em 0,1 ml de Matrigel na região do flanco dorsal de ratinho nus bege (Harlan Sprague Dawley) para estabelecer xenoenxertos. Injectou-se uma construção de adenovirus com 1 x 108 unidades formadoras de placas (PFU) , intratumoral (II), q7d aos dias 1, 7 e 14. Administraram-se as injecções directamente na massa de tumor, lateralmente e por baixo desta, utilizando uma agulha de calibre 28 e uma seringa de tuberculina de 0,5 ml. As construções de adenovirus foram uma construção de adenovírus-ANGPTL4 (Ad-Angptl4), uma construção de adenovírus-LacZ (Ad-LacZ) como controlo ou uma construção de adenovírus-ANGPTL3 (Ad-Angptl3). Determinou-se o tamanho do tumor em diferentes dias após implante do tumor. Efectuaram-se medições do tamanho do tumor dia sim, dia não, e calculou-se o volume do tumor utilizando as fórmulas do volume de elipsóides n/6 x L x W x H, em que L= comprimento, W= largura e H= altura; Tomayko & Reynolds, Câncer Chemother. Pharmacol, 24:148-154 (1989)). Tal como se pode observar na figura 8, o tamanho (painel A) e peso (painel B) do tumor aumentaram estatisticamente (P<0,0001) em ratinhos injectados com células A673 e com uma construção adenovírus-ANGPTL4 (Ad-Angptl4) comparativamente com as construções Ad-LacZ ou Ad-Angptl3. 108 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ EXEMPLO 2: TENDÊNCIA DOS TUMORES TRATADOS COM ANGPTL4

ESCAPAREM A TRATAMENTO ANTI-VEGF ANGPTL4 estimulou a proliferação de células tumorais em tumores tratados com um agente antiangiogénico, e.g., anti-VEGF (tal como AVASTIN® (Genentech, South San Francisco). Consultar figura 8, painel C. Cultivaram-se células A673 de rabdomiossarcoma humano (HTB 1598) tal como anteriormente descrito (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); e, Gerber et al., Câncer Research, 60:6253-6258 (2000)). Injectaram-se s.c. 5 x 106 células A673 em 0,1 ml de Matrigel na região do flanco dorsal de ratinho nus bege (Harlan Sprague Dawley) para estabelecer xenoenxertos. Injectou-se uma construção de adenovirus com 1 x 108 unidades formadoras de placas (PFU), intratumoral (IT), q7d aos dias 1,7,14,21 e 28. As construções de adenovirus foram de construção de adenovírus-ANGPTL4 (Ad-Angptl4), uma construção de adenovírus-LacZ (Ad-LacZ) como controlo ou uma construção de adenovírus-ANGPTL3 (Ad-Angptl3). Trataram-se também os ratinhos com Avastin® (Genentech) a uma dose de 5 mg/kg, ip, duas vezes por semana. Administraram-se as injecções directamente na massa de tumor, lateralmente e por baixo desta utilizando uma agulha de calibre 28 e uma seringa de tuberculina de 0,5 ml.

Efectuaram-se medidas de tamanho do tumor dia sim, dia não, e calculou-se o volume do tumor utilizando as fórmulas de volume de elipsóide n/6 x L x W x H, em que L= comprimento, W= largura e H= altura; Tomayko & Reynolds, Câncer Chemother. Pharmacol, 24:148-154 (1989)). Tal como se pode observar na figura 8, painel C, o tamanho do tumor aumentou em ratinhos injectados com uma construção adenovírus-ANGPTL4 (Ad-Angptl4) apesar de estarem a ser tratados com AVASTIN®, comparativamente com ratinhos injectados com células contendo uma construção Ad-LacZ ou Ad-Angptl3 em combinação com tratamento com AVASTIN®.

EXEMPLO 3: OS ANTICORPOS QUE SE LIGAM A ANGPTL4 INIBEM CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS

Ensaiou-se a capacidade de anticorpos anti-ANGPTL4 inibirem uma actividade biológica de ANGPTL4, e.g., proliferação de células tumorais. Plaquearam-se lxlO4 células 109 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ tumorais (e.g., HeLa-S3, Caki, U87MG, 293, A673, HM7 e Caiu 6)/poço em placas de 12 poços em meio com FCS a 10%. Incubaram-se as células durante a noite a 37°C num incubador humidificado com CO2 a 5%. Mudou-se o meio para FCS a 5% (excepto para células Caiu 6 que foram para FCS a 10%) e adicionou-se aos poços anticorpo anti-hANGPTL4 ou anti-Dscr a 1, 2,5, 5 ou 10 yg/ml ou não se adicionou qualquer anticorpo.

Colocaram-se as placas a 37°C num incubador humidificado com CO2 a 5%. Contaram-se as células aos dias 2 ou 3 após adição de anticorpo anti-hANGPTL4. 0 anticorpo anti-ANGPTL4 inibiu crescimento de células HeLa-S3, Caki U87MG, 293, A673 e Caiu 6, mas não de células HM7. Consultar figura 10, painéis A e B. EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS QUE SE LIGAM A ANGPTL4

Conhecem-se na especialidade e descrevem-se aqui técnicas para produzir anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais. Os antigénios (ou imunogénios) que podem ser utilizados incluem proteína do invento purificada, fragmentos de proteína, proteínas de fusão contendo tal proteína e células que expressam proteína recombinante e/ou fragmentos de proteína recombinante à superfície celular. A selecção do antigénio pode ser efectuada pelo perito na especialidade sem experimentação desnecessária.

Imunizam-se ratinhos, tal como Balb/c, com o antigénio emulsionado em adjuvante completo de Freund e injectado subcutânea ou intraperitonealmente numa quantidade de 1-100 microgramas. Alternativamente, emulsiona-se o antigénio em adjuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, Mont.) e injecta-se na planta das patas traseiras do animal. Reforçam-se então os ratinhos imunizados 10 a 12 dias mais tarde com antigénio adicional emulsionado no adjuvante seleccionado. Seguidamente a tal, durante várias semanas, pode igualmente reforçar-se os ratinhos com injecções de imunização adicionais. Podem obter-se periodicamente amostras de soro dos ratinhos por sangramento retro-orbital para ensaiar em ensaios de ELISA para detectar os anticorpos.

Após detecção de um título de anticorpo adequado podem injectar-se os animais "positivos" para anticorpos com uma 110 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ injecção intravenosa final de determinado ligando. Três a quatro dias mais tarde sacrificam-se os ratinhos e recolhem-se células de baço. Fundem-se então as células de baço (utilizando polietilenoglicol a 35%) com uma linha celular de mieloma murino seleccionada tal como P3X63AgU.l, disponível de ATCC, n.° CRL 1597. As fusões geram células de hibridoma que podem ser então plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços contendo meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir proliferação de células não fundidas, híbridos de mieloma e híbridos de células de baço.

As células de hibridoma serão rastreadas num ELISA para reactividade contra o antigénio. A determinação de células de hibridoma "positivas" que excretam aqui os anticorpos monoclonais pretendidos contra ANGPTL4 está bem abrangida pela perícia na especialidade.

Podem injectar-se intraperitonealmente as células de hibridoma positivas em ratinhos singénicos Balb/c para produzir ascites contendo os anticorpos monoclonais anti-ANGPTL4. Alternativamente, podem crescer-se as células de hibridoma em frascos de cultura de tecidos ou em frascos com rotação. Pode obter-se purificação dos anticorpos monoclonais produzidos nas ascites utilizando precipitação com sulfato de amónio seguido por cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente, pode utilizar-se cromatografia de afinidade baseada em ligação de anticorpo a proteína A ou proteína G.

Por exemplo, geraram-se anticorpos policlonais de coelho por imunização de coelho com 500 pg de proteína ANGPTL4 (23 — 406) humana recombinante gerada em E. coli nos dias 1, 40 e 70. Recolheu-se soro aos dias 80 e 120 após imunização e purificaram-se anticorpos com colunas de proteína A-Sephadex.

EXEMPLO 5: ANTICORPOS BLOQUEADORES OU NEUTRALIZANTES

Podem identificar-se anticorpos contra os antigénios aqui descritos através de várias técnicas conhecidas na arte, e.g., um ELISA. Por exemplo, podem revestir-se placas com o polipéptido de interesse, e.g., ANGPTL4 ou um seu fragmento e incubar-se com anticorpos gerados contra esse polipéptido, e.g., ANGPTL4 (consultar, e.g., descrição nas patentes 111 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ U.S. 6348350, 6372491 e 6455496). Pode detectar-se anticorpo ligado por vários métodos.

Podem identificar-se anticorpos antagonistas (e.g., bloqueadores ou neutralizantes) por ensaios de competição e/ou ensaios de actividade. Por exemplo, a expressão de ANGPTL4 estimula proliferação, migração, adesão ou ligação a ανβδ de células tumorais. Pode demonstrar-se a determinação de um anticorpo bloqueador ou neutralizante a ANGPTL4 pela capacidade do anticorpo bloquear proliferação de células tumorais (consultar, e.g., figura 10, painéis A e B) , migração, adesão (consultar, e.g., figura 12) ou ligação a Οίνβδ (USBiological, 37K, Swampscott, Massachusetts) (consultar, e.g., figura 13, painéis B e C) da célula tumoral. Por exemplo, podem plaquear-se células A673 de rabdomiossarcoma e incubar-se com sobrenadante de células COS7 transduzidas com Ad-hAngptl4 conjuntamente com um anticorpo anti-ANGPTL4 ou um anticorpo de controlo ou PBS. Após vários dias podem tratar-se com tripsina e contar-se as células. Identificam-se anticorpos que reduzem os números de células como anticorpos bloqueadores ou neutralizantes. Também se demonstrou que ANGPTL4 induzia migração de células tumorais e era um factor pró-angiogénico. Consultar, e.g., Le Jan et al., American Journal of Pathology, 164(5): 1521-1528 (2003). Podem assim identificar-se anticorpos bloqueadores ou neutralizantes de ANGPTL4 utilizando os anticorpos em combinação com ANGPTL4 em ensaios de migração de células tumorais e/ou ensaios de angiogénese, e.g., ensaio CAM.

Podem também identificar-se anticorpos bloqueadores ou neutralizantes contra ANGPTL4 que se podem utilizar no bloqueio ou redução de crescimento tumoral ou bloqueio ou redução de crescimento de células cancerosas, utilizando células tumorais em cultura tal como anteriormente descrito e/ou em estudos de ratinhos bege/nus. Por exemplo, podem injectar-se ratinhos nus com células tumorais. A vários pontos temporais após se ter estabelecido o crescimento do tumor, podem injectar-se os ratinhos intraperitonealmente uma ou duas vezes por semana com várias doses do anticorpo bloqueador ou neutralizante de ANGPTL4, um controlo de anticorpo ou PBS. Podem medir-se semanalmente o tamanho do tumor e na conclusão do estudo o tumor pode ser excisado e pesado. Identificam-se 112 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ anticorpos bloqueadores ou neutralizantes ANGPTL4 que bloqueiam ou reduzem crescimento tumoral nos ratinhos.

Podem identificar-se combinações de anticorpos ANGPTL4 e agente antiangiogénico para bloquear ou reduzir crescimento tumoral ou bloquear ou reduzir crescimento de células cancerosas por utilização de células tumorais em cultura como anteriormente descrito e/ou estudos com ratinhos bege/nus. Tal como anteriormente indicado podem injectar-se ratinhos nus com células tumorais. A vários pontos temporais após se ter estabelecido o crescimento do tumor, podem injectar-se os ratinhos intraperitonealmente uma ou duas vezes por semana com várias doses da combinação de um antagonista de ANGPTL4 e um agente anticanceroso, e.g., agente antiangiogénico, tal como um anticorpo anti-VEGF ou um antagonista de ANGPTL4 ou um agente anticanceroso ou controlo de anticorpo ou PBS. Podem medir-se semanalmente o tamanho do tumor e na conclusão do estudo o tumor pode ser pode excisado e pesado. Identificam-se terapias de combinação de antagonistas de ANGPTL4 e agentes anticancerosos que bloqueiam ou reduzem crescimento tumoral nos ratinhos ou que aumentam o bloqueio ou redução de crescimento tumoral comparativamente com um controlo ou por um único agente isolado. EXEMPLO 6: VARIANTE DE ANGPTL4

Produziu-se uma ANGPTL4 variante utilizando um kit de mutagénese padrão (e.g., QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia)) seguindo o protocolo do fabricante. Efectuaram-se duas substituições de aminoácidos na sequência de ANGPTL4 humana (consultar, e.g., figura 2). As substituições foram na posição 162 e 164 (R162G e R164E) resultando numa permuta de RKR para GKE. Isolou-se proteína ANGPTL4 (plasmídeo L280, aa 1-406) ou ANGPTL4 variante a partir do sobrenadante de células COS-7 com infecção transitória. Para purificação carregou-se o sobrenadante numa coluna de níquel. Detectou-se proteína por transferência de "Western" com um anticorpo anti-FLAG-HRP. Consultar, figura 3, painel B. Quando se efectuaram as substituições e se comparou o ANGPTL4 variante com a proteína 113

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT ANGPTL4 nativa ou de tipo selvagem, verificou-se que o ANGPTL4 variante apresentava um peso molecular mais elevado do que o ANGPTL4 nativo por transferência de "Western". A substituição de RKR para GKE na posição 162 e 164 da proteína nativa evitou degradação proteolítica de ANGPTL4. EXEMPLO 7: ANGPTL4 LIGA-SE A INTEGRINA ανβ5

As angiopoietinas são factores excretados que regulam a angiogénese por ligação ao receptor tirosina-quinase Tie2, específico de células endoteliais, através do seu domínio do tipo fibrinogénio (FBN). Verificou-se que o domínio com hélice enrolada na família de ligandos excretados é necessário para oligomerização de ligante (consultar, e.g., Procopio et al., J. Chem., 274:30196-201 (1999)).

De modo semelhante às angiopoietinas, ANGPTL3 e ANGPTL4 são glicoproteínas excretadas, cada uma das quais consistindo em um péptido de sinal no terminal N, seguido por um domínio de hélice enrolada e um domínio do tipo FBN no terminal C. Determinou-se que ANGPTL3 se liga a ανβ3 através do domínio do tipo FBN. Determinamos que ANGPTL4 se liga a avPs· Ensaiou-se a linha celular 293-1953 que é transfectada estavelmente com integrina ανβ5 para a sua capacidade de ligar ou aderir a placas revestidas com ANGPTL4. As células foram recolhidas e diluídas a 105 células/ml em meio isento de soro contendo PBS, BSA a 1%, CaCl2 1 mM e MgCl2 1 mM. As células foram pré-incubadas com ou sem anticorpos anti-integrina 3νβ5 (MAB 1961 (Chemicon, Temecula, CA) ) ou péptidos durante 15 minutos a 37°C. Revestiram-se placas de microtitulação de fundo liso de 96 poços Nunc Maxisorp com mANGPTL4 recombinante, BSA ou vitronectina (1 pg, 3 pg, 10 pg ou 30 pg/ml) durante a noite a 40C e bloquearam-se com 200 pl de BSA a 3% em solução salina tamponada de fosfato (PBS), pH 7,4, durante 1,5 horas a 37°C. Adicionaram-se suspensões celulares (5xl04 células/100 pl/poço (5xl05/ml) ) às placas revestidas e incubaram-se as placas a 37°C durante 5,5 horas. Removeram-se as células não aderentes com lavagens com PBS e mediu-se a ligação das células por adição de 200 pl de corante CyQuant GD (Molecular Probes (Invitrogen detection Technologies (Carlsbad, Califórnia)) (1:400)/tampão de lise celular e incubaram-se durante 2-5 minutos. Mediu-se a fluorescência da amostra utilizando 114

ΕΡ 1 771 4 7 4/PT máximos de excitação a 480 nm e de emissão a 520 nm. Também se pode utilizar o método PNAG de Lanndegren (consultar, e.g., Landegren, J. Immunol. Methods, 67:379-388 (1984)). As células que expressam ανβδ apresentam aderência a ANGPTL4 e vitronectina (USBiological, Swampscott, Massachusetts), um controlo positivo, comparativamente com BSA, um controlo negativo. Consultar a figura 11.

Para determinar se a integrina ανβ5 foi suficiente para mediar adesão celular de ANGPTL4, ensaiaram-se anticorpos de bloqueio para a sua capacidade de inibir a adesão no ensaio de adesão celular. Adicionaram-se anticorpos de bloqueio funcionais (anticorpo anti-o^s (MAB1961 (Chemicon, Temecula, CA) ) ou anticorpos anti-hANGPTL4) a células 293-1953 antes de incubação com os poços revestidos com proteína (BSA (1), vitronectina (2) ou ANGPTL4 (3)). Consultar a figura 12. Os anticorpos anti-o^s e anti-ANGPTL4 anticorpos eliminaram a actividade de adesão celular de ANGPTL4.

Efectuaram-se experiências adicionais para confirmar se ANGPTL4 se liga a ανβ5. Ef ectuaram-se experiências de ELISA para detectar se mANGPTL4, IgG-hANGPTLA-Nterminal (1-183) e/ou IgG-hANGPTL4-Cterminal (184-406) se ligam a placas revestidas com θίνβδ (USBiological, 37K, Swampscott. Massachusetts) .

Incubou-se diluente de integrina ανβδ (1 pg/ml de tampão de revestimento (carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6)) e 100 μΐ/poço de tampão de revestimento durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (PBS, pH 7,4, Tween-20 a 0,05%) e adicionou-se 100 μΐ/poço de tampão de bloqueio (PBS, pH 7,4, BSA a 0,5%) durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. Prepararam-se várias quantidades (0; 0,070 pg; 0,22 pg; 0,66 pg; 2 pg; ou 6 pg) de amostras, mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-Nterminal (1-183) e/ou IgG-hANGPTL4-Cterminal (184-406) em tampão de amostra (BSA a 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,4, Tween-20 a 0,05%, MnCl2 1 mM, CaCl2 50 pM, MgCl2 50 pM, NaCl 100 mM) e incubaram-se durante 30 minutos. Adicionaram-se as amostras às placas (100 pl/poço nas quantidades incubadas anteriormente) e incubaram-se durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave. Lavaram-se as placas com tampão e adicionou-se 100 pl/poço de anti-Flag-peroxidase de rábano (HRP) (100 ng/ml) (Jackson, #109-036-098) em tampão de ensaio (PBS, pH 7,4, BSA a 0,5%, Tween 20 a 115 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ 0,05%) e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. Lavaram-se as placas. Adicionou-se 100 μΐ/poço de tetrametilbenzidina (TMB) (Moss, Inc.) e incubou-se nas placas até se ter desenvolvido uma boa cor à temperatura ambiente. Adicionou-se 100 μΐ/poço de solução de paragem (H3PO4 1 M) para parar a reacção. Leram-se as placas a 630 nm. mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-Nterminal e IgG-hANGPTL4-C-terminal ligaram-se a placas revestidas com ανβδ, embora IgG-hANGPTL4-C-terminal se tenha ligado ligeiramente mais às placas. Consultar a figura 13, painel A.

Os anticorpos antÍ-ANGPTL4 inibem a ligação de ANGPTL4 a placas revestidas com ανβ5. Efectuaram-se experiências de ELISA. Incubou-se 100 μΐ/poço de diluente de integrina ανβ5 a 1 pg/ml de tampão de revestimento (carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6)) com tampão de revestimento durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (PBS, pH 7,4, Tween-20 a 0,05%) e adicionou-se 100 μΐ/poço de tampão de bloqueio (PBS, pH 7,4, BSA a 0,5%) durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. Incubaram-se amostras de 0,6 pg a 6,0 pg de mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-Nterminal (1-183) e/ou IgG-hANGPTT4-Cterminal (183-406), em tampão de amostra (BSA a 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,4, Tween 20 a 0,05%, MnCl2 1 mM, CaCl2 50 μΜ, MgCl2 50 μΜ, NaCl 100 mM) com anticorpos anti-ANGPTL4 (1,5 pg) ou anti-Dscr (1,5 pg) durante 30 minutos.

Após incubação, incubou-se 100 μΐ/poço de amostra +/anticorpo com as placas durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave. As placas foram lavadas com tampão e adicionou-se 100 μΐ/poço anti-Flag-HRP (100 ng/ml) em tampão de ensaio (PBS, pH 7,4, BSA a 0,5%, Tween 20 a 0,05%) e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. As placas foram lavadas e adicionou-se 100 μΐ/poço de TMB e incubaram-se as placas até se ter desenvolvido uma boa cor à temperatura ambiente. Adicionou-se 100 μΐ/poço de solução de paragem (H3P04 1 M) para parar a reacção. Leram-se as placas a 630 nm. Os anticorpos anti-ANGPTL4 reduziram a quantidade de ligação de mANGPTL4, IgG-hANGPTL4-Nterminal e IgG-hANGPTL4-Cterminal às placas revestidas com ανβδ comparativamente com anticorpo anti-Dscr, anticorpo monoclonal 5G7 ou meio. Consultar a figura 13, painel B. 116 ΕΡ 1 771 474/ΡΤ

Noutra experiência, demonstrou-se a ligação de ANGPTL4 e integrina ανβ5 por ELISA. Nesta experiência, adicionou-se 80 μΐ/poço de HANGPTL4-C terminal, vitronectina ou BSA (5 pg/ml) às placas em tampão de revestimento (carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6) e incubou-se durante a noite a 4°C. Lavaram-se as placas (tampão de lavagem: PBS, pH 7,4, Tween-20 a 0,05%) e adicionou-se 100 μΐ/poço de tampão de bloqueio (PBS, pH 7,4, BSA a 0,5%) em qualquer dos meios, anticorpos anti-hANGPTL4 (15 pg/100 μΐ) ou anticorpos anti-Dscr (15 pg/100 pg) e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. Lavaram-se as placas e adicionou-se 100 pl de ανβδ (3-9 pg/ml) e incubou-se durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave. As placas foram lavadas e adicionou-se 1 pg/ml (1:1000) de anticorpo anti-oç^s (Chemicon) (5 pg/100 pl) em tampão de ensaio (PBS, pH 7,4, BSA a 0,5%, Tween 20 a 0,05%) e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. Após incubação, as placas foram lavadas e adicionou-se 100 pl/poço de peroxidase de rábano (HRP) anti-ratinho (1:5000) em tampão de ensaio. As placas foram lavadas e adicionou-se 100 pl/poço de tetrametilbenzidina (TMB) e incubou-se à temperatura ambiente até se obter um bom desenvolvimento de cor. Parou-se a reacção com 100 pl/poço de H3P04 1 M e leram-se as placas a 630 nm. ανβδ liga-se a placas revestidas com ANGPTL4 (pista 1) e vitronectina (pista 4). A ligação é bloqueada com anticorpos anti-ANGPTL4 (pista 2) mas não quando se utiliza anticorpo anti-Dscr de controlo (pista 3) ou quando se revestem as placas com proteína de controlo (pista 5). Consultar a figura 13, painel C.

Assim, estas observações demonstram que ANGPTL4 recombinante se liga especificamente a integrina ανβ5·

Considera-se que a especificação é suficiente para permitir que um especialista leve o invento à prática. Deve considerar-se que os exemplos e concretizações aqui descritos são para objectivos meramente ilustrativos. O invento não deve ser limitado no seu âmbito pela construção depositada, dado que a concretização depositada é meramente um exemplo de determinados aspectos do invento e quaisquer construções funcionalmente equivalentes estão abrangidas pelo âmbito do invento. O presente depósito de material não constitui uma 117 ΕΡ 1 771 4 7 4/PT admissão que a descrição escrita é desadequada para permitir a prática de qualquer aspecto do invento, incluindo o melhor de tal, nem deve ser interpretado como limitando o âmbito das reivindicações às ilustrações especificas que represente. De facto, tornar-se-ão para os especialistas várias modificações além das aqui apresentadas e descritas na descrição anterior e que estão no âmbito das reivindicações em anexo.

Lisboa, 2010-04-26

Claims

ΕΡ 1 771 474/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Antagonista de proteína 4 do tipo angiopoietina (ANGPTL4), para utilização num método de bloqueio ou redução de crescimento tumoral ou de crescimento de uma célula cancerosa num indivíduo, em que o referido método compreende: a) administrar ao tumor ou à célula cancerosa uma quantidade eficaz de um agente anticanceroso; e b) administrar ao tumor ou à célula cancerosa uma quantidade eficaz do antagonista de ANGPTL4, em que as quantidades eficazes combinadas bloqueiam ou reduzem o crescimento tumoral ou o crescimento da célula cancerosa.
2. Antagonista de ANGPTL4, para utilização num método para bloquear ou reduzir o crescimento tumoral ou o crescimento de uma célula cancerosa num indivíduo, em que o referido método compreende: administrar ao indivíduo uma composição de combinação compreendendo uma quantidade eficaz de agente antiangiogénico e uma quantidade eficaz de um antagonista de proteína 4 do tipo angiopoietina (ANGPTL4), em que as quantidades eficazes combinadas bloqueiam ou reduzem o crescimento tumoral ou o crescimento da célula cancerosa.
3. Antagonista de ANGPTL4, para utilização num método para bloquear ou reduzir recaídas de crescimento tumoral ou uma recaída de crescimento de células cancerosas num indivíduo, compreendendo o método: administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do antagonista de ANGPTL4, em que o indivíduo esteve ou está concomitantemente em terapia de cancro com um agente anticanceroso e em que administração da quantidade eficaz do antagonista de ANGPTL4 bloqueia ou reduz a recaída de crescimento tumoral ou recaída de crescimento de células cancerosas.
4. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 3, em que o agente anticanceroso é um ou mais agentes quimioterapêuticos. ΕΡ 1 771 474/ΡΤ 2/5
5. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1 ou da reivindicação 3, em que o agente anticanceroso compreende um agente antiangiogénico.
6. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1 ou da reivindicação 3, em que o agente anticanceroso compreende um agente antiangiogénico e em que o agente antiangiogénico é um antagonista de VEGF ou um inibidor anti-VEGF, respectivamente.
7. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 6, em que o antagonista de VEGF ou um inibidor anti-VEGF é um anticorpo anti-VEGF.
8. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 7, em que o anticorpo anti-VEGF é A4.6.1 humanizado.
9. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1 ou da reivindicação 3, em que o antagonista de ANGPTL4 é um anticorpo antÍ-ANGPTL4.
10. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1, em que o antagonista de ANGPTL4 é um anticorpo anti-ANGPTL4 e em que o anticorpo anti-ANGPTL4 se liga a ANGPTL4 (184-406).
11 . Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1 ou da reivindicação 3, em que o antagonista de ANGPTL4 é um anticorpo anti-o^s
· 12 . Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 7, 9 ou 11, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado.
13 . Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1 ou da reivindicação 3, em que o antagonista de ANGPTL4 compreende uma molécula de ARNpi.
14. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 13, em que a molécula de ARNpi é uma molécula de ANGPTL4-ARNpi.
15. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 14, em que a molécula de ANGPTL4-ARNpi tem como alvo uma sequência de ADN de um ácido nucleico que codifica ANGPTL4, em que a sequência ΕΡ 1 771 474/ΡΤ 3/5 de ADN compreende pelo menos GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA (SEQ ID NO:3).
16. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1, em que o método compreende adicionalmente administrar ao tumor ou à célula cancerosa um terceiro agente anticanceroso.
17. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 16, em que o terceiro agente anticanceroso é um agente quimioterapêutico.
18. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 16, em que o terceiro agente anticanceroso é outro inibidor de angiogénese.
19. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1, em que as etapas de administração (a) e (b) são efectuadas sequencialmente.
20. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1, em que as etapas de administração (a) e (b) são efectuadas concomitantemente.
21. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1, em que as etapas de administração (a) e (b) são efectuadas tanto sequencial como concomitantemente.
22. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1, em que as etapas de administração são efectuadas por qualquer ordem.
23. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1, em que o indivíduo é um ser humano.
24. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 1, em que o indivíduo tem recaída de crescimento tumoral ou recaída de crescimento de células cancerosas.
25. Antagonista de ANGPTL4 da reivindicação 2 ou da reivindicação 3, em que o método compreende adicionalmente administrar um agente adicional, em que o agente adicional é um agente anticanceroso.
26. Antagonista de ANGPTL4, para utilização num método para bloquear ou reduzir o crescimento tumoral ou o ΕΡ 1 771 4 7 4/PT 4/5 crescimento de uma célula cancerosa, compreendendo o método a administração ao tumor ou à célula cancerosa de uma quantidade eficaz de antagonista de proteína 4 do tipo angiopoietina (ANGPTL4) , em que o antagonista de ANGPTL4 é um anticorpo que se liga a ANGPTL4 (184-406) e em que a quantidade eficaz bloqueia ou reduz o crescimento tumoral ou o crescimento das células cancerosas.
27. Utilização de um antagonista de ANGPTL4 no fabrico de um medicamento para utilização no tratamento de cancro, em que o antagonista de ANGPTL4 e o tratamento são tal como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.
28. Método para bloquear ou reduzir o crescimento de uma célula cancerosa, não efectuado no corpo humano ou animal, em que o referido método compreende: a) administrar à célula cancerosa uma quantidade eficaz de um agente anticanceroso; e b) administrar à célula cancerosa uma quantidade eficaz de um antagonista de proteína 4 do tipo angiopoietina (ANGPTL4), em que as quantidades eficazes combinadas bloqueiam ou reduzem o crescimento da célula cancerosa.
29. Método da reivindicação 28, em que o agente anticanceroso é tal como definido em qualquer uma das reivindicações 5-8 e 12.
30. Método da reivindicação 28, em que o antagonista de ANGPTL4 é tal como definido em qualquer uma das reivindicações 9-15.
31. Método da reivindicação 28, que compreende adicionalmente administrar um terceiro agente anticanceroso tal como definido em qualquer uma das reivindicações 16-18.
32. Método da reivindicação 28, em que as etapas de administração são efectuadas tal como definido em qualquer uma das reivindicações 19-22.
33. Método para bloquear ou reduzir o crescimento de uma célula cancerosa, compreendendo o método a administração à ΕΡ 1 771 474/ΡΤ 5/5 célula cancerosa de uma quantidade eficaz de um antagonista de proteína 4 do tipo angiopoiet ina (ANGPTL4), em que o antagonista de ANGPTL4 é um anticorpo que se liga a ANGPTL4 (184-406) e em que a quantidade eficaz bloqueia ou reduz o crescimento da célula cancerosa, em que o referido método não é efectuado no corpo humano ou animal.
34. Composição compreendendo um anticorpo que se liga a ANGPTL4 (184-406) e um antagonista de VEGF.
35. Composição compreendendo uma molécula de ANGPTL4-ARNpi, em que a molécula de ANGPTL4-ARNpi tem como alvo uma sequência de ADN de um ácido nucleico que codifica ANGPTL4, em que a sequência de ADN compreende pelo menos GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA (SEQ ID NO:3).
36. Kit compreendendo uma primeira quantidade de um agente antiangiogénico, uma segunda quantidade de um antagonista de proteína 4 do tipo angiopoietina (ANGPTL4) e um transportador, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis, e um recipiente.
37. Kit compreendendo uma quantidade de um agente antiangiogénico e um transportador, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis numa primeira forma de dosagem unitária; uma quantidade de um antagonista de proteína 4 de tipo angiopoietina (ANGPTL4) e um transportador, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis numa segunda forma de dosagem unitária; e um recipiente. Lisboa, 2010-04-26