CN106596979B - 一种用于帕金森综合症检测的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种用于帕金森综合症检测的试剂盒及其检测方法。该试剂盒包含能特异性检测帕金森综合症的适配子。提供的适配体具有较好的结合能力，比现有技术的试剂盒具有更好的检测准确性。
Description
技术领域
本发明涉及疾病检测领域，具体地涉及一种用于帕金森综合症检测的试剂盒及其检测方法。
背景技术
帕金森病(PD)又名震颤麻痹，是最常见的神经退行性疾病之一。流行病学显示，患病率为15～328/10万人口，＞65岁人群约1％；发病率为10～21/10万人口/年。PD病因及发病机制尚未明确，可能与社会因素、药物因素、患者因素等有关。PD病理改变为：中脑黑质致密部、蓝斑神经元色素脱失，黑质色素变淡及出现路易小体。PD神经生化改变为：中脑黑质致密部、蓝斑神经元脱失致上述部位及其神经末梢处多巴胺(DA)减少，(DA减少≥70％时产生PD临床表现)，而黑质纹状体系统中与DA功能拮抗的乙酰胆碱(ACH)作用相对亢进，DA与ACH平衡失调。
迄今为止，pd的病因仍不清楚。目前的研究倾向于与年龄老化、遗传易感性和环境毒素的接触等综合因素有关。
1)年龄老化：
2)环境因素：流行病学调查结果发现，帕金森病的患病率存在地区差异，所以人们怀疑环境中可能存在一些有毒的物质，损伤了大脑的神经元。
3)家族遗传性：医学家们在长期的实践中发现帕金森病似乎有家族聚集的倾向，有帕金森病患者的家族其亲属的发病率较正常人群高一些。
4)遗传易感性：尽管帕金森病的发生与老化和环境毒素有关，但是并非所有老年人或暴露与于同一环境的人，甚至同样吸食大量mptp的人都会出现帕金森病。虽然帕金森病患者也有家族集聚现象，但至今也没有在散发的帕金森病患者中找到明确的致病基因，说明帕金森病的病因是多因素的。
综上所述，任何单一的因素均不能完满的解释pd的病因。多数研究者倾向于帕金森病的病因是上述各因素共同作用的结果。即中年以后，对环境毒素易感的个体，在接触到毒素后，因其解毒功能障碍，出现亚临床的黑质损害，随着年龄的增长而加重，多巴胺能神经元渐进性不断死亡变性，最终失代偿出现帕金森病的临床症状。
目前，关于帕金森病早期诊断的生物化学标志物研究设及免疫学、炎症反应、氧化应激反应、细胞调亡等多个领域，其中W突触共核蛋白(a-Syn)最具研究前景。组织病理学研究显示，帕金森病患者黑质纹状体突触共核蛋白异常聚集、沉积及功能失调，而且突触共核蛋白是路易小体的主要成分，因此若在脑脊液、外周血或唾液等体液中检测到突触共核蛋蛋白，则判断受试者患有帕金森症。但是W蛋白为疾病标志物的检测方法缺乏特异性和灵敏性。
血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)是分泌蛋白的血管生成素家族的成员。血管生成素家族的保守区域包括螺旋区和C末端纤维蛋白原(FBN)样结构域。见例如，Kim et al.，Biochem.J.346＝603-610(2000)。该家族的其他成员包括血管生成素I，血管生成素2和血管生成素3。血管生成素1，血管生成素2和血管生成素3/血管生成素4结合Tie2受体。见例如，Davis et al.,Ce 1187,1161-1169(1996)；Maisonpierre et al.,Science277,55-60(1997)；Valenzuela et al,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96,1904-1909(1999)；和美国专利5，521，073；5,650，490；和，5，814，464。血管生成素I和4是Tie2受体的激动剂，而血管生成素2和3是Tie受体的拮抗剂(以及可能的激动剂)。见例如,Folkman&D’Amore,Cell,87:1153-1155(1996)；Suri et al.，Cell,87:1171-1180(1996)；Masionpierre etal.,Science277:55-60(1997)；和，Ward&Dumont,Seminars in Cell&DevelopmentalBiology,13:19-27(2002)。Tie2受体属于内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶家族，其也包括Tiel孤儿受体。该家族另一成员血管生成素-样3蛋白结合整合素ανβ3.见例如，US专利申请20030215451和Camenisch et al.,J.Biol.Chem.,277(19):17281-17290(2002)。
ANGPTL4也已知为其他术语。例如，ANGPTL4也已知为肝纤维蛋白原/血管生成素-相关蛋白(HFARP)(Kim et al.,Biochem.J.346＝603-610(2000)),PPAR Y血管生成素相关蛋白(PGAR)(Yoon,et al.，Mol.Cell Biol.,20:5343-5349(2000))，以及禁食诱导的月旨肪因子(fasting induced adiposefactor)(FIAF)(Kerten et al.,J.Biol.Chem.,275:28488-28493(2000))。
ANGPTL4的体外和体内研究以及定性为治疗剂和/或治疗提供了有价值的鉴定和发现，所述治疗剂和/或治疗可用于预防，缓解或矫正与ANGPTL4活性和/或表达相关的疾病或功能不良。例如，组织培养研究和遗传改造的小鼠已被证实是与人疾病相关的生物过程的功能性深入研究的无价的工具，所述疾病包括免疫学，癌症疾病，神经生物学，心血管生物学疾病，肥胖以及其他疾病。需要发现并理解ANGPTL4的许多生物学功能。
因此寻找一种有效的能够在早期即可诊断帕金森症发生的基因标志物是亟待解决的问题。
发明内容
在本发明的一个方面，提供了血管生成素样蛋白4其特异性抗体的用途，被用于制备检测帕金森综合症的诊断试剂或试剂盒。
本发明另外提供一种鉴定血管生成素样蛋白4与帕金森综合症之间关系的方法。
本发明另外提供一种血管生成素样蛋白4的适配子，所述适配子的序列分别如SEQID NO：1-18所示。
本发明首先采用筛选方法对帕金森综合症进行了检测，实验结果表明血管生成素样蛋白4在帕金森综合症出现明显上调表达。
另外，本发明对血管生成素样蛋白4在帕金森综合征病人血液中的表达进行了定量检测。研究证实血管生成素样蛋白4可以作为帕金森综合征的诊断标志物，同时也可以作为防治帕金森综合征的药物。
有益效果:本发明通过大量实验研究筛选，实验结果表明血管生成素样蛋白4在帕金森综合症出现明显上调表达，可作为帕金森综合征疾病临床诊断标志物。并且本发明研究结果表明通过检测血管生成素样蛋白4的表达可为帕金森综合征预防诊断或治疗方案。
附图说明
图1是患者血液和健康对照组血液中ANGPTL4的浓度的统计分析图。★指P<0.05。
图2是ROC曲线显示蛋白诊断帕金森综合症的特异性和灵敏度。
图3适配子筛选流程图
图4大鼠血浆中作为孵育时间的函数的全-长适体剩余百分数的对数-线性图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
通过前期基因组数据的批量比对，通过50例正常人和40例患者的蛋白表达数据分析，申请人发现ANGPTL4蛋白在帕金森患者中是超量表达的。
通过定量PCR的方法检测所有患者和正常人群血液中mRNA和蛋白的表达水平，通过测定结果如下表1所示：
| mRNA(相对表达量) | 蛋白浓度(ng/mL) | |
| 患者 | 1.7 | 110.2 |
| 正常人群 | 1 | 40.5 |
上述结果表明，ANGPTL4在帕金森综合症患者的血液中高水平表达，提示ANGPTL4的表达与帕金森患者的病程密切相关。
实施例2血清中ANGPTL4浓度与疾病关联
采用抗ANGPTL4的单克隆抗体ABB(所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO：19所示，所述抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：20所示)，通过ELISA方法(双抗体夹心法)检测了100例帕金森综合征患者和40例健康对照组血清中ANGPTL4的浓度。结果表明，在患者血清中ANGPTL4的浓度为110.4±15.3ng/ml(平均数±SD)；健康对照组血清中ANGPTL4的浓度为40.6±10.2ng/ml(平均数±SD)；患者血清中ANFPRL4浓度明显高于对照组血清(P＜0.05)，参见图1。
另外，根据图2ROC曲线设定了ANGPTL4的cut-off值为10.25ng/ml，其敏感性和特异性均大于90％，阳性率为92.5％(37/40)。统计分析结果显示，血液中ANGPTL4浓度与帕金森患者密切相关，中和上述实验研究，可以得出结论，分泌性ANGPTL4在帕金森患者中高分泌，可以作为帕金森综合症和正常人群区分的一个特别好的标志物。
实施例3ANGPTL4蛋白适配子的筛选
取ANGPTL4重组蛋白10mg，按照适配子筛选方法，SELEX技术，筛选适配子：
预先设计并合成随机单链寡核苷酸文库，
TTCGACAGTATGAAGCTCGG-N35-GGCACTGAAGTGACTAGACT
(1)单链DNA文库，寡核苷酸中间为35个长度的随机序列，5’端和3’端各设计一段固定序列用于PCR扩增；另外，5’端还有T7RNA聚合酶的转录启动子。
(2)在适宜条件下，将单链寡核苷酸库和靶分子进行孵育，其中能与靶物质特异性结合的寡核苷酸便形成DNA-靶分子复合物，在最初几个循环中只有少数的序列与靶物质结合。
(3)将未结合与特异性结合的寡核苷酸分离开来，分离方法为凝胶阻滞法；
(4)通过亲和层析，使结合的寡核苷酸与靶物质解离。
(5)将分离得到的寡核苷酸经过严格的洗涤，洗脱，PCR扩增产生次级文库，用于下一轮筛选。
通过14轮的筛选后，目标序列通过克隆，测序，共得到18个序列，分别如SEQ IDNO：1-18所示(筛选示意图见图3)。
用平衡渗透法结合HPLC，测定适配体序列的解离常数Kd值，结果如下：
| 适配子名称 | 解离常数(nM) |
| ANGPTL4-1 | 47.6 |
| ANGPTL4-2 | 86.5 |
| ANGPTL4-3 | 89.6 |
| ANGPTL4-4 | 70.5 |
| ANGPTL4-5 | 90.9 |
| ANGPTL4-6 | 100.1 |
| ANGPTL4-7 | 98.4 |
| ANGPTL4-8 | 97.6 |
| ANGPTL4-9 | 87.6 |
| ANGPTL4-10 | 76.8 |
| ANGPTL4-11 | 102.3 |
| ANGPTL4-12 | 77.6 |
| ANGPTL4-13 | 88.7 |
| ANGPTL4-14 | 478.5 |
| ANGPTL4-15 | 104.7 |
| ANGPTL4-16 | 456.5 |
| ANGPTL4-17 | 97.4 |
| ANGPTL4-18 | 356.4 |
从上表可以看出，新提供的适配体的解离常数都非常低，尤其是ANGPTL4-1，具有更好的亲和力。
特异性检测
取ANGPTL4-1～18这18个适配子分别与人血白蛋白、IgG、和ANGPTL4蛋白进行结合检测，通过分析发现，这18个适配子也只与ANGPTL4蛋白结合，不与其它蛋白结合。说明本发明的适配子就有很好的特异性。
实施例4适配子试剂盒临床样本检测
—、临床标本收集。
收集就诊于华西医院的诊断明确的帕金森综合征患者(40人)以及参加健康体检的正常健康人(50人)的外周静脉血非抗凝标本，自然凝固后常规离心分离血清备测。
二.试剂盒的制备
诊断试剂盒，其特征在于试剂盒由下列独立包装的组分组成:(1)SEQ ID NO：1-18的核酸适配子溶液；(2)聚丙烯酰胺凝胶母液；(3)过硫酸铵；(4)四甲基二乙胺(TEMED)；(5)50％甘油溶液I；(6)50％甘油溶液II；(7)1.25M氯化钠溶液；(8)GelRed染料溶液；(9)阳性对照血清；(10)阴性对照血清；所述的50％甘油溶液I用蒸馏水配制而成，50％甘油溶液II用结合缓冲液配制而成。
三、结果分析
通过标准曲线建立，判定相应的血液中的ANGPTL4蛋白浓度，当阳性阈值取130ng/mL时，有39例样本评定为帕金森患者，其中39例经过核查，均为患者，说明准确性更加高。说明准确性更加高。显示出良好的诊断效果。
降解性检测
适配子在大鼠血浆中的代谢稳定性
适配子在大鼠血浆中测试以评估其稳定性，动力速率，和降解途径。使用5’末端-放射标记(32P)适体与95％血浆(柠檬酸盐)在37℃孵育100小时。在选择时间点，取出等量的包括适体的血浆，液氮中快速冷冻，储存于-80℃。使用液-液(苯酚-氯仿)抽提，随后凝胶电泳(10％变性聚丙烯酰氨测序凝胶)和高分辨率放射自显影测定和分析血浆中的适体和其代谢产物。图4显示了大鼠血浆中作为孵育时间的函数的全-长适体剩余百分数的对数-线性图。两个物种中的降解特性都充分显示为单相的，这充分说明，本发明提供的适配子具有较好的血浆稳定性，可以用于长期的血浆检测需要。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
〈110〉申冬昌
〈120〉一种用于帕金森综合症检测的试剂盒及其检测方法
〈160〉20
〈210〉1
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-1
TTCGACAGTATGAAGCTCGGCCCCCAATTCAACTTAAAATACACCCTAATTCTTAGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉2
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-2
TTCGACAGTATGAAGCTCGGTATAAAAATCCAACCCCTACACTACATCACACTCCGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉3
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-3
TTCGACAGTATGAAGCTCGGTATCTTACCTATACTTACCTAATACTTAACATTATGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉4
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-4
TTCGACAGTATGAAGCTCGGTTTAACACAATAATTAAATAACAACTCTATACAATGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉5
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-5
TTCGACAGTATGAAGCTCGGCAACCTTACCTTCCAAACATCCCCCTATACCTTCCGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉6
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-6
TTCGACAGTATGAAGCTCGGCATCTCCCCATCCCTAATAACTACTTTTACCACTTGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉7
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-7
TTCGACAGTATGAAGCTCGGCCTCTTAAACAATCCTATATACTACCTCTACAAATGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉8
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-8
TTCGACAGTATGAAGCTCGGCAACCAATCTTCCTTTTACTAATACATTTTACTCCGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉9
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-9
TTCGACAGTATGAAGCTCGGCTCTCTCTATATCATTCCTCCTTTAATCAAAACCAGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉10
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-10
TTCGACAGTATGAAGCTCGGCAATATTTATAATATACTTCTAATCTTTCCCAACCGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉11
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-11
TTCGACAGTATGAAGCTCGGTCATAATCTTAAATCCAAAATTACCCCATCTATCCGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉12
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-12
TTCGACAGTATGAAGCTCGGCTCTAACACTTTCCCCCCCTCATCACATCCCACACGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉13
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-13
TTCGACAGTATGAAGCTCGGTACACTTACATTACCACAATCTCATTTTATACCATGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉14
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-14
TTCGACAGTATGAAGCTCGGCTATTCCCCCTCCCTTCCTCTACTAATCAAACTCTGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉15
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-15
TTCGACAGTATGAAGCTCGGTAAACAATCATTATTTTTCTATAATTCTATTATATGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉16
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-16
TTCGACAGTATGAAGCTCGGCACAATACATTAACACTCCACTAACTCAAATCTACGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉17
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-17
TTCGACAGTATGAAGCTCGGTATCTTCTATCATTTAACCTTTCCTCCCAACACACGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉18
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ANGPTL4-18
TTCGACAGTATGAAGCTCGGTTCTTCCTCCATACCTATACCTCTATCTCACTTTCGGCACTGAAGTGACTAGACT
〈210〉19
〈211〉138
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉ABB
MetGlyTrpSerTrpIlePheLeuPheLeuSerGluThrAlaGlyValLeuSerGluValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuMetLysProGlyAlaSerValLysMetSerCysArgThrSerGlyTyrThrThrPheThrAspTyrSerIleHisTrpValLysGlnSerHisGlyLysArgLeuGluTrpIleGlyTyrIleAsnProTyrAsnGlyAspThrTyrCysAspGlnAsnPheLysGlyLysAlaThrLeuThrPheAsnLysAlaSerSerThrAlaTyrMetGluIleProArgLeuThrSerAspAspSerAlaValTyrTyrCysThrArgTrpLysThrIleGlnAlaProPheAlaTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerAla
〈210〉20
〈211〉129
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉ABB
MetAspMetArgAlaProAlaGlnPheLeuGlyIleLeuLeuLeuTrpPheProGlyAlaArgCysGluIleGlnMetThrGlnSerProSerSerMetSerAlaSerLeuGlyAspArgIleThrIleThrCysGlnAlaThrGlnAspIleValLysAsnLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysProProSerPheLeuIleHisTyrAlaThrGluLeuAlaGluGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlySerAspTyrSerLeuThrIleSerAsnLeuGluSerGluAspPheAlaAspTyrTyrCysLeuGlnSerTyrAspPheProTyrThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleAsn
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