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PT1252192E - Melhoramento da semivida de circulação de proteínas de fusão à base de anticorpos - Google Patents

Melhoramento da semivida de circulação de proteínas de fusão à base de anticorpos Download PDF

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PT1252192E
PT1252192E PT01916083T PT01916083T PT1252192E PT 1252192 E PT1252192 E PT 1252192E PT 01916083 T PT01916083 T PT 01916083T PT 01916083 T PT01916083 T PT 01916083T PT 1252192 E PT1252192 E PT 1252192E
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PT
Portugal
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antibody
fusion protein
protein
based fusion
amino acid
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PT01916083T
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Stephen D Gillies
Christa Burger
Kin Ming Lo
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Merck Patent Gmbh
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Description

1
DESCRIÇÃO "MELHORAMENTO DA SEMIVIDA DE CIRCULAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO À BASE DE ANTICORPOS" Área da Invenção A presente invenção relaciona-se, em termos gerais, com proteínas de fusão. Mais especificamente, a presente invenção relaciona-se com métodos para melhorar a semivida de circulação de proteínas de fusão à base de anticorpos.
Antecedentes da Invenção A utilização de anticorpos para tratar doenças humanas está bem estabelecida e tornou-se mais sofisticada com a introdução da engenharia genética. Foram desenvolvidas várias técnicas para melhorar a utilidade de anticorpos. Estas incluem: (1) a produção de anticorpos monoclonais por fusão celular para criar "hibridomas" ou por clonagem molecular das cadeias pesada (H) e leve (L) do anticorpo a partir de células produtoras de anticorpo; (2) a conjugação de outras moléculas com anticorpos para as administrar em sítios preferidos in vivo, e.g., radioisótopos, fármacos tóxicos, toxinas proteicas e citocinas; (3) a manipulação de funções efectoras do anticorpo para intensificar ou atenuar a actividade biológica; (4) A junção de outras proteínas tais como toxinas e citocinas com anticorpos ao nível genético para produzir proteínas de fusão à base de anticorpos; e (5) a junção de um ou mais conjuntos de regiões de combinação de anticorpo ao nível genético para produzir anticorpos bi-específicos. 2
As proteínas podem ser unidas através de manipulação química ou genética utilizando métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Gillies et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:1428-1432 (1992); e Patente U.S. n° 5 650 150.
No entanto, a utilidade de proteínas de fusão à base de anticorpos produzidas de modo recombinante pode ser limitada pela sua rápida eliminação in vivo da circulação. Por exemplo, foi demonstrado que as proteínas de fusão anticorpo-citocina têm uma semivida de circulação in vivo significativamente menor do que a do anticorpo livre. Depois de testar uma diversidade de proteínas de fusão anticorpo-citocina, Gillies et al. relataram que todas as proteínas de fusão avaliadas tinham uma semivida de fase α (fase de distribuição) menor do que 1,5 horas. Na realidade, a maior parte das proteínas de fusão à base de anticorpos tinham sido eliminadas até 10% da concentração do anticorpo livre no soro às duas horas. Ver, Gillies et ai., BIOCONJ. CHEM. 4: 230-235 (1993). Mais recentemente foi demonstrado que as proteínas de fusão à base de anticorpos com uma afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc têm maiores semividas de circulação. Foi também demonstrado que a diminuição da afinidade de ligação para o receptor Fc interferiu com algumas das funções efectoras do anticorpo tal como a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), mas não interferiu com outras funções tal como a fixação de complemento ou a ligação do antigénio. Ver Gillies et al., Câncer Res. 59(9):2159-66 (1999).
Nalguns casos, tal como no tratamento de cancro ou de doenças virais, seria desejável manter as funções efectoras 3 do anticorpo e uma semivida de circulação longa. Por conseguinte, existe uma necessidade na técnica para métodos adicionais de aumentar a semivida de circulação in vivo de proteínas de fusão à base de anticorpos.
Sumário da Invenção
As moléculas de Imunoglobulina G (IgG) interactuam com várias classes de receptores celulares incluindo três classes de receptores Fcy (FcyR) específicos para a classe IgG de anticorpo, nomeadamente FcyRI, FcyRII e FcyRIII. Eles também interactuam com a classe FcRp do receptor de uma maneira dependente do pH com pouca ou nenhuma ligação a pH neutro mas com uma ligação elevada a um pH de 6,0. A semivida no soro de um anticorpo é afectada pela aptidão desse anticorpo para se ligar a um receptor Fc(FcR) e ao receptor de protecção Fc (FcRp). A semivida no soro de proteínas de fusão de imunoglobulina é também afectada, por exemplo, pela aptidão para se ligar a tais receptores (Gillies et al., Câncer Res. 59:2159-66 (1999)). A invenção descreve a observação surpreendente que, nas proteínas de fusão compreendendo uma unidade de imunoglobulina (Ig) e uma unidade não imunoglobulínica (não-Ig), a alteração dos aminoácidos próximos da junção das duas unidades aumenta drasticamente a semivida da proteína de fusão no soro. A observação é surpreendente porque as alterações de aminoácidos afecta superfícies proteicas que são diferentes das superfícies de interacção da região Fc com os receptores Fc e com o receptor de protecção de Fc. Além disso, as alterações de aminoácido da invenção têm o seu efeito até mesmo quando o receptor Fc e 4 receptor de protecção de Fc não são os determinantes principais da semivida da proteína de fusão no soro. Assim, as alterações de aminoácidos da invenção podem ser combinadas com alterações de aminoácidos que afectam a interacção com o receptor Fc e/ou receptor de protecção de Fc para se conseguirem efeitos sinérgicos. A presente invenção proporciona proteínas de fusão contendo uma imunoglobulina cuja semivida no soro está melhorada em consequência de alterações que estão em sítios distintos da superfície de interacção da região Fc com o receptor Fc e receptor de protecção de Fc (FcRp). A presente invenção também proporciona métodos para a produção de proteínas de fusão entre uma unidade de imunoglobulina e uma segunda proteína não imunoglobulínica possuindo uma semivida no soro melhorada.
As alterações na sequência de aminoácidos da proteína de fusão localizam-se, de um modo preferido, na junção da unidade de Ig com a unidade de não-Ig. A região de junção da proteína de fusão contém alterações que, em relação às sequências naturais da cadeia pesada de Ig e da proteína não-Ig, se situam, de um modo preferido, dentro de aproximadamente 10 aminoácidos do ponto de junção. De um modo mais preferido, as alterações de aminoácido provocam um aumento na hidrofobicidade. De um modo ainda mais preferido, as alterações de aminoácido envolvem a alteração da lisina C-terminal da unidade de anticorpo para um aminoácido hidrófobo tal como alanina ou leucina. Numa forma de realização preferida, a proteína de fusão da invenção compreende uma cadeia pesada de Ig localizada, de 5 um modo preferido, N-terminal relativamente a uma segunda proteina não-Ig.
Noutra forma de realização da invenção, a afinidade de ligação das proteínas de fusão para o FcRp está optimizada através da alteração da superfície de interacção da unidade Fc que estabelece contacto com o FcRp. As sequências importantes para a ligação da IgG ao receptor FcRp foram descritas como estando localizadas nos domínios CH2 e CH3. De acordo com a invenção, as alterações da junção de fusão numa proteína de fusão são combinadas com alterações da superfície de interacção dos Fc com o FcRp para produzir um efeito sinérgico. Nalguns casos pode ser útil aumentar a interacção da unidade Fc com o FcRp a pH 6 e também pode ser útil diminuir a interacção da unidade Fc com o FcRp a pH 8. Estas modificações incluem alterações de resíduos necessários para estabelecer contacto com os receptores Fc ou a alteração de outros que afectam o contacto entre outros resíduos de cadeia pesada e o receptor FcRp através de alterações conformacionais induzidas. Assim, numa forma de realização preferida, uma proteína de fusão à base de anticorpo com maior semivida de circulação in vivo é obtida ligando em primeiro lugar as sequências de codificação de uma região constante de Ig e uma segunda proteína não imunoglobulínica, e introduzindo depois uma mutação (tal como um ponto de mutação, uma delecção, uma inserção ou um rearranjo genético) numa região constante da IgG no local ou próxima de um ou mais aminoácidos seleccionados de Ile 253, His 310 e His 435. As proteínas de fusão à base de anticorpos resultantes têm uma semivida de circulação in vivo mais prolongada do que as proteínas de fusão não modificadas. 6
Em certas circunstâncias é útil mutar determinadas funções efectoras da unidade Fc. Por exemplo pode eliminar-se a fixação do complemento. Alternativa ou adicionalmente num outro conjunto de formas de realização o componente Ig da proteína de fusão tem pelo menos uma fracção da região constante de uma IgG que tem uma menor afinidade de ligação para pelo menos um de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII. Por exemplo, pode utilizar-se a cadeia gama4 da IgG no lugar da gamai. A alteração tem a vantagem da cadeia gama4 originar uma semivida no soro mais prolongada, funcionando sinergicamente com uma ou mais mutações na junção de fusão. Em conformidade pode também utilizar-se a IgG2 em vez da IgGl. Numa forma de realização alternativa da invenção, uma proteína de fusão inclui uma região constante de IgGl mutante, por exemplo uma região constante de IgGl com uma ou mais mutações ou delecções de Leu234, Leu235, GIÍ236, GI1237, Asn297 ou Pro33i. Noutra forma de realização da invenção, uma proteína de fusão inclui uma região constante de IgG3 mutante, por exemplo uma região constante de IgG3 com uma ou mais mutações ou delecções de Leu28i, Leu282, G1 1283 , G1 Í284 , Asn344 ou Pro378 . No entanto, para algumas aplicações, pode ser útil conservar a função efectora que acompanha a ligação ao receptor Fc, tal como ADCC.
Numa forma de realização preferida, a segunda unidade não imunoglobulínica da proteína de fusão é uma citocina. 0 termo "citocina" é aqui utilizado para descrever proteínas naturais ou recombinantes, análogos destas e fragmentos destas que induzem uma resposta biológica específica numa célula que tem um receptor para essa citocina. De um modo preferido, as citocinas são proteínas que podem ser 7 produzidas e excretadas por uma célula. As citocinas incluem, de um modo preferido, interleucinas tais como interleucina-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-β, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 e IL-18, factores hematopoiéticos tais como o factor estimulante de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colónias de granulócitos (G-CSF) e eritropoeitina, factores de necrose tumoral (TNF) tal como TNFa, linfocinas tal como linfotoxina, reguladores de processos metabólicos tais como leptina, interferões tais como interferão a, interferão β e interferão γ e quimiocinas. De um modo preferido, a proteína de fusão anticorpo-citocina da presente invenção exibe actividade biológica de citocina.
Numa forma de realização preferida alternativa, a segunda unidade não imunoglobulínica da proteína de fusão é uma proteína de ligação ao ligando com actividade biológica. Estas proteínas de ligação ao ligando podem, por exemplo, (1) bloquear as interacções receptor-ligando na superfície celular; ou (2) neutralizar a actividade biológica de uma molécula (e.g., uma citocina) na fase fluida do sangue evitando, desse modo, que atinja o seu alvo celular. De um modo preferido, as proteínas de ligação ao ligando incluem CD4, CTLA-4, receptores do TNF ou receptores de interleucina tais como os receptores de IL-1 e IL-4. De um modo preferido, a proteína de fusão anticorpo-receptor da presente invenção exibe a actividade biológica da proteína de ligação ao ligando.
Ainda noutra forma de realização preferida alternativa, a segunda unidade não imunoglobulínica da 8 proteína de fusão é uma toxina proteica. De um modo preferido, a proteína de fusão anticorpo-toxina da presente invenção exibe a actividade tóxica da toxina proteica.
Ainda noutras formas de realização preferidas, a segunda unidade não imunoglobulínica da proteína de fusão é uma hormona, neurotrofina, regulador do peso corporal, proteína sérica, factor de coagulação, protease; componente da matriz extracelular, factor angiogénico, factor antiangiogénico ou outra proteína segregada ou domínio segregado. Por exemplo, CD26, receptor de IgE, receptor de IgA polimérica, receptores de outros anticorpos, Factor VIII, Factor IX, Factor X, TrkA, PSA, PSMA, Ligando de Flt-3, endostatina, angiostatina e domínios destas proteínas.
Ainda noutras formas de realização, a segunda unidade não imunoglobulínica é uma proteína não humana ou não mamífera. Por exemplo, são preferidos, o HIV gp 120, HIV Tat, proteínas da superfície de outros vírus tais como adenovírus e RSV, outros componentes de HIV, proteínas da superfície de parasitas tais como antigénios maláricos e proteínas da superfície de bactérias. Estas proteínas não humanas podem ser utilizadas, por exemplo, como antigénios ou porque elas têm actividades úteis. Por exemplo, a segunda unidade não imunoglobulínica pode ser a estreptocinase, estafilocinase, urocinase, activador tecidular de plasminogénio ou outras proteínas com actividades enzimáticas úteis.
De acordo com a invenção, a unidade não imunoglobulínica pode ser uma fracção de uma proteína. De um modo preferido, a unidade de proteína não-Ig é uma 9 fracção proteica que retém consideravelmente as propriedades funcionais e/ou estruturais de uma proteína intacta. Numa forma de realização preferida, a unidade de proteína não-Ig é uma fracção funcional ou estrutural de uma proteína aqui descrita.
Numa forma de realização preferida, a proteína de fusão à base de anticorpo compreende uma região variável específica para um antigénio alvo bem como uma região constante, qualquer uma das quais está ligada através de uma ligação peptídica a uma segunda proteína não imunoglobulínica. A região constante pode ser a região constante normalmente associada à região variável, ou uma outra diferente, e.g., e regiões variável e constante de espécies diferentes. A cadeia pesada pode incluir qualquer combinação de um ou mais domínios CHI, CH2 ou CH3. De um modo preferido, a cadeia pesada inclui os domínios CHI, CH2 e CH3, e de um modo mais preferido, apenas os domínios CH2 e CH3. Numa forma de realização, a proteína de fusão à base de anticorpo compreende uma região Fv com regiões variáveis de cadeia pesada e leve fundidas. Estão também incluídos no termo “proteína de fusão" as construções com um domínio de ligação compreendendo regiões estruturais e regiões variáveis (i.e., regiões determinantes de complementaridade) de espécies diferentes, tais como são descritas em Winter, et al., Patente da Grã-Bretanha n° 2 188 638. As proteínas de fusão à base de anticorpos compreendendo uma região variável exibem, de um modo preferido, especificidade de ligação ao antigénio. Ainda noutra forma de realização preferida, a proteína de fusão à base de anticorpo compreende ainda uma cadeia leve. A invenção proporciona assim proteínas de fusão nas quais as 10 actividade e especificidade de ligação ao antigénio de um anticorpo são combinadas com a actividade biológica potente de uma segunda proteína não imunoglobulínica, tal como uma citocina. A proteína de fusão da presente invenção pode ser utilizada para administrar selectivamente a segunda proteína não imunoglobulínica a uma célula alvo in vivo de acordo com o que a segunda proteína não imunoglobulínica pode exercer um efeito biológico localizado.
Numa forma de realização preferida alternativa, a proteína de fusão à base de anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada ligada através de uma ligação peptídica a uma segunda proteína não imunoglobulínica, mas não compreende uma região variável de cadeia pesada. Deste modo, a invenção proporciona ainda proteínas de fusão que retêm a actividade biológica potente da segunda proteína não imunoglobulínica, mas que carecem das actividade e especificidade da ligação ao antigénio de um anticorpo.
Em formas de realização preferidas, a proteína de fusão contém duas cadeias quiméricas compreendendo pelo menos uma fracção de uma cadeia pesada e uma segunda proteína não-Ig ligada através de uma ligação dissulfureto.
Em formas de realização preferidas, as proteínas de fusão da invenção são úteis para tratar o cancro, infecções virais, distúrbios imunes e para intensificar o crescimento (incluindo a proliferação) de tipos celulares específicos. A invenção tem também como objectivo construções de ADN que codifiquem as proteínas de fusão acima descritas e 11 linhas celulares, e.g., mielomas, transfectados com estas construções.
Estes e outros objectos, conjuntamente com as vantagens e características da invenção aqui descritas, tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição, desenhos e reivindicações que se seguem.
Descrição Abreviada das Figuras A Figura 1 mostra o comportamento farmacocinético da proteína de fusão KS-IL-2 e de várias proteínas de fusão mutantes contendo substituições da unidade lisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo ou outras alterações descritas nos Exemplos. Os níveis de anticorpo ou proteína de fusão foram medidos por um ELISA que analisa a IL-2 (Figura IA) ou o Fc humano (Figura 1B). A Figura 2 mostra as propriedades farmacocinéticas de proteínas de fusão KS-IL-2 portadoras da cadeia gamai ou gama4 com a lisina original ou com a mutação de lisina para alanina na extremidade C da cadeia pesada do anticorpo. Os níveis de anticorpo ou proteína de fusão foram medidos por um ELISA que analisa a unidade de IL-2. A Figura 3 mostra as propriedades farmacocinéticas de fusões de um anticorpo humano com o Factor de Necrose Tumoral alfa (TNFalfa) . Os níveis da proteína de fusão foram medidos por um ELISA que analisa a região Fc humana. São mostrados os níveis de uma proteína de fusão anticorpo-TNFalfa intacta (losangos pretos) e os níveis de uma proteína de fusão em tudo idêntica na qual foi eliminada a 12 lisina C-terminal da unidade de anticorpo (quadrados cinzentos). A Figura 4 mostra a ligação de proteínas de fusão anticorpo-IL-2 às membranas de células J774 fixadas, as quais são ricas em receptores da classe FcyR. São mostradas a ligação de uma proteína de fusão KS-IL-12 não mutante (losangos pretos) e de uma proteína de fusão KS-IL-12 portadora de uma mutação da Lisina C-terminal da cadeia pesada para Alanina (quadrados cinzentos). A Figura 5 mostra o efeito do tratamento de ratinhos Balb/C portadores de tumores subcutâneos derivados de células de carcinoma do cólon CT26 que foram manipuladas para expressar o EpCAM humano, o antigénio para o KS, com a proteína de fusão anticorpo-citocina.
Descrição Pormenorizada da Invenção A presente invenção proporciona proteínas de fusão de anticorpo com uma ou mais mutações na junção entre as unidades de Ig e não-Ig as quais aumentam as semividas de circulação das proteínas de fusão. As proteínas de fusão mutantes da invenção têm a propriedade vantajosa de terem a sua semivida no soro melhorada sem afectar a interacção da unidade de anticorpo com qualquer um dos dois receptores determinantes da farmacocinética no organismo conhecidos: o receptor Fc e o FcRp.
Duma maneira geral, uma proteína de fusão à base de anticorpo da invenção compreende uma fracção de uma proteína de imunoglobulina (Ig) ligada a uma proteína não imunoglobulínica (não-Ig), de tal modo que a sequência de 13 aminoácidos da região que atravessa a junção entre as proteínas de Ig e não-Ig tem pelo menos uma mutação quando comparada com as sequências de aminoácidos naturais das proteínas de Ig e não-Ig.
Numa forma de realização, pelo menos uma mutação está na região C-terminal da parte de Ig. Noutra forma de realização, pelo menos uma mutação está na região N-terminal da proteína não-Ig. Noutra forma de realização, a proteína de fusão contém pelo menos uma mutação na região C-terminal da parte de Ig e pelo menos uma mutação na região N-terminal da proteína não-Ig. Uma mutação pode ser uma mutação pontual, uma inserção, uma delecção ou um rearranjo genético. Nas formas de realização preferidas a mutação aumenta a hidrofobicidade da região de junção. Por exemplo, a mutação substitui um aminoácido com carga ou ionizável por um aminoácido sem carga ou hidrófobo (e.g., uma Lis, Arg ou outro resíduo ionizável é substituído por uma Ala, Leu, Gli, Trp ou outro resíduo sem carga ou hidrófobo).
Numa forma de realização opcional é inserido um péptido espaçador ou de ligação entre as proteínas de Ig e não-Ig. 0 péptido espaçador ou de ligação é, de um modo preferido, não carregado, de um modo mais preferido não polar e/ou hidrófobo. 0 comprimento dum péptido espaçador ou de ligação é de um modo preferido entre 1 e cerca de 100 aminoácidos, de um modo mais preferido entre 1 e cerca de 50 aminoácidos ou entre 1 e cerca de 25 aminoácidos, e de um modo ainda mais preferido entre 1 e cerca de 15 aminoácidos. Numa outra forma de realização da invenção, as unidades de Ig e não-Ig da proteína de fusão estão ligadas 14 via um péptido espaçador ou de ligação, e existe pelo menos uma mutação em qualquer uma ou em ambas as unidades de Ig e não-Ig. Numa forma de realização alternativa da invenção, as unidades de Ig e não-Ig estão separadas por um espaçador sintético, por exemplo um espaçador PNA, que é de um modo preferido não carregado, de um modo mais preferido não polar e/ou hidrófobo.
De acordo com a invenção, uma cadeia de imunoglobulina (Ig) é uma proteina de imunoglobulina ou uma fracção de uma proteína de imunoglobulina que inclui um domínio variável ou um domínio constante. Uma cadeia de Ig é, de um modo preferido, uma fracção de uma cadeia pesada de imunoglobulina, por exemplo, uma região variável de imunoglobulina capaz de ligar um tipo celular pré-seleccionado. Numa forma de realização preferida, a cadeia de Ig inclui uma região variável específica para um antigénio alvo bem como uma região constante. A região constante pode ser a região constante normalmente associada à região variável, ou uma outra diferente, e.g., regiões variáveis e constantes de espécies diferentes. Numa forma de realização mais preferida, uma cadeia de Ig inclui uma cadeia pesada. A cadeia pesada pode incluir qualquer combinação de um ou mais domínios CHI, CH2 ou CH3. De um modo preferido, a cadeia pesada inclui os domínios CHI, CH2 e CH3, e de um modo mais preferido apenas os domínios CH2 e CH3. Numa forma de realização, a fracção da imunoglobulina inclui uma região Fv com regiões variáveis das cadeias pesada e leve fundidas.
De acordo com a invenção, uma proteína não imunoglobulínica inclui uma proteína natural que não seja 15 uma imunoglobulina, ou uma proteína sintética ou recombinante que não seja uma imunoglobulina, ou um fragmento de qualquer uma das anteriores. Numa forma de realização preferida, a proteína não imunoglobulínica inclui um domínio funcional tal como um domínio de ligação ao ligando, um domínio enzimático, um domínio regulador ou um domínio que interage com um ou mais factores celulares. Numa forma de realização alternativa, um domínio não imunoglobulínico compreende um domínio estrutural ou um determinante antigénico.
Numa forma de realização preferida, a cadeia Ig está unida à proteína não-Ig via uma fusão de genes. De um modo preferido, a fusão de genes é sintética ou recombinante, e é gerada utilizando técnicas correntes de síntese química ou biologia molecular. Tipicamente, uma mutação é introduzida como parte da construção de fusão de genes. Alternativamente, uma mutação pode ser introduzida subsequentemente, utilizando métodos conhecidos de mutagénese (por exemplo expondo a construção de fusão de genes à irradiação, ou mutagénese química ou biológica).
De acordo com a invenção, uma região de junção é a região da proteína de fusão adjacente ao ponto de junção entre as unidades de Ig e não-Ig da proteína de fusão. Numa forma de realização preferida, a região de junção inclui a parte C-terminal da unidade de Ig e a parte N-terminal da unidade de não-Ig. Numa forma de realização, a região de junção inclui também um péptido espaçador ou de ligação inserido no ponto de junção das unidades de Ig e não-Ig. 16
De acordo com formas de realização preferidas da invenção, uma mutação na unidade de Ig está na parte C-terminal da unidade de Ig, de um modo preferido em cerca de 100 resíduos, de um modo mais preferido em cerca de 50 resíduos ou cerca de 25 resíduos, e de um modo ainda mais preferido em cerca de 10 resíduos da extremidade C da unidade de Ig.
De acordo com formas de realização preferidas da invenção, uma mutação na unidade não-Ig está na parte N-terminal da unidade não-Ig, de um modo preferido em cerca de 100 resíduos, de um modo mais preferido em cerca de 50 resíduos ou cerca de 25 resíduos, e de um modo ainda mais preferido em cerca de 10 resíduos da extremidade N da unidade não-Ig.
Em formas de realização preferidas da invenção, uma mutação está na região C-terminal da unidade de Ig, mas a mutação não está na parte da proteína de Ig que interage com o receptor Fc (FcR) ou FcRp.
Uma proteína de fusão de anticorpo com uma mutação de acordo com a invenção tem uma maior semivida de circulação in vivo quando comparada com a semivida de circulação de uma proteína de fusão de anticorpo correspondente sem a mutação. A semivida de circulação de uma proteína de fusão de anticorpo pode ser medida analisando o teor da proteína de fusão no soro em função do tempo. A evidência experimental indica que os efeitos das mutações preferidas da invenção não são dependentes das interacções com o FcR ou FcRp. Primeiro, as mutações 17 preferidas que aumentam a semivida de circulação de uma proteína de fusão não afectam regiões do anticorpo que, na estrutura tridimensional, façam parte da superfície de interacção que se liga ao FcR ou ao FcRp. Segundo, as mutações preferidas da invenção podem provocar um melhoramento da semivida no soro até mesmo quando a interacção com o FcR é eliminada através da utilização de uma IgG-cadeia gama4 e a interacção com o FcRp é eliminada realizando o estudo farmacocinético num ratinho mutante de beta2-microglobulina que seja deficiente em FcRp. Terceiro, as mutações preferidas da invenção não afectam significativamente a ligação das proteínas de fusão de Ig aos FcR nas células J774.
As análises de mutagénese dirigida indicam que a superfície do Fc que interage com o receptor Fc está próxima da região de articulação do domínio CH2. A região Fc da superfície de interacção do FcR está muito afastada, em três dimensões, da extremidade C do Fc. Análises semelhantes indicam que o FcRp interage com os resíduos de aminoácido localizados na interface entre os domínios CH2 e CH3. 0 FcRp liga o seu ligando com uma eficiência muito maior a pH ácido (pH 6,0), do que a pH neutro ou ligeiramente básico (pH 7,4). Isto é coerente com o papel do FcRp na protecção de moléculas possuindo Fc tais como anticorpos após a sua assimilação celular nos endossomas. Estes compartimentos celulares tornam-se ácidos após fusão com os lisossomas e os seus constituintes proteicos são degradados por proteases ácidas. A fixação ao FcRp ligado à membrana durante este processo evita a degradação do 18 anticorpo e permite reciclá-lo para o exterior da célula (de novo para a circulação) ou através de uma camada celular (um processo chamado transcitose) . Este último processo permite que a IgG passe através da mucosa intestinal neonatal após a ingestão de leite no ambiente ácido do intestino. A estrutura do complexo Fc/FcRp indica que o FcRp se liga ao lado da região Fc, com contactos em ambos os domínios CH2 e CH3 e que a região de contacto não está particularmente próxima da extremidade C da região Fc. Deste modo não se espera que a alteração da região exactamente C-terminal do Fc altere a interacção com o FcRp. Não se pretendendo ficar limitado por qualquer teoria particular, julga-se que as mutações na região da junção de fusão que aumentam a semivida de circulação de uma proteína de fusão de acordo com a invenção reduzam também a degradação da proteína de fusão num ensaio de degradação por protease, como se ilustra no Exemplo 15. Julga-se ainda que a digestão pela protease pode contribuir para o desaparecimento de proteínas intactas do organismo, incluindo as proteínas de fusão. Deste modo, a resistência às proteases pode contribuir directamente para melhorar a farmacocinética de proteínas. Julga-se também que a digestão de proteínas não desnaturadas pela protease envolve o acesso de uma protease a uma sequência exposta na conformação correcta, bem como o reconhecimento de uma sequência de aminoácidos específica. Assim, as mutações na junção de fusão que afectam a conformação geral de uma proteína e, consequentemente, afectam a acessibilidade das 19 proteases aos seus sítios de clivagem podem contribuir para a resistência à protease e para farmacocinéticas melhoradas. Além disso, as mutações que alteram sequências de reconhecimento pela protease específicas podem contribuir para a resistência à protease e para farmacocinéticas melhoradas.
Uma caracteristica das mutações da invenção é que elas podem ser combinadas com outras mutações ou substituições na unidade de anticorpo para modular sinergicamente a semivida no soro ou outras propriedades da unidade de Ig. Por exemplo, uma ou mais mutações da invenção que aumentam a semivida de circulação de uma proteína de fusão à base de anticorpo podem ser combinadas com uma ou mais mutações que afectam a interacção entre a proteína de fusão de anticorpo e o FcR ou FcRp.
Além disso, as mutações da invenção podem ser utilizadas com uma grande diversidade de unidades anticorpo e com uma grande diversidade de parceiros de fusão de tipo não-Ig. As imunoglobulinas incluam IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Os parceiros de fusão de tipo não-Ig incluem citocinas, outras proteínas segregadas, enzimas ou fragmentos solúveis de receptores transmembranares, tais como domínios de ligação ao ligando.
De acordo com a invenção, uma proteína de fusão à base de anticorpo com uma maior semivida de circulação in vivo pode ser ainda melhorada modificando a própria parte Fc. Estes podem ser resíduos que incluem ou estão adjacentes à Ile 253, His 310 ou His 435 ou outros resíduos que podem gerar os ambientes iónicos destes resíduos quando a 20 proteína está enrolada na sua estrutura tridimensional. As proteínas resultantes podem ser avaliadas em termos de ligação óptima a pH 6 e a pH 7,4-8, seleccionando-se aquelas com níveis elevados de ligação a pH 6 e ligação baixa a pH 8 para serem utilizadas in vivo. Estas mutações podem ser utilmente combinadas com as mutações de junção da invenção.
Os métodos e composições da invenção são úteis quando co-administrados com inibidores da angiogénese tais como os descritos na PCT/US99/08335 (WO 99/52562) ou com inibidores das prostaglandinas tais como os descritos na PCT/US99/08376 (WO 99/53958). Os métodos e composições da invenção também podem ser utilizados em complexos de citocina e proteína múltiplos tais como os descritos na PCT/US00/21715. Os métodos e composições da invenção também são úteis em combinação com outras mutações descritas na PCT/US99/03966 (WO 99/43713) que aumentam a semivida de circulação de uma proteína de fusão. Métodos não restritivos para sintetizar formas de realização úteis da invenção, bem como ensaios úteis para avaliar as actividades farmacocinéticas, tanto in vitro como em modelos animais pré-clínicos in vivo, são descritos mais à frente nos Exemplos. A construção genética preferida que codifica uma cadeia quimérica inclui, na orientação 5' para 3', um segmento de ADN que codifica pelo menos uma fracção de uma imunoglobulina e ADN que codifica uma segunda proteína não imunoglobulínica. Uma construção genética preferida alternativa inclui, na orientação 5' para 3', um segmento de ADN que codifica uma segunda proteína não imunoglobulínica e ADN que codifica pelo menos 21 uma fracção de uma imunoglobulina. 0 gene fundido é montado ou inserido num vector de expressão para transfecção das células receptoras apropriadas onde ele é expressado. A invenção também proporciona métodos para identificar mutações que aumentam a semivida de circulação de uma proteína de fusão à base de anticorpo. Os métodos compreendem introduzir uma ou mais mutações numa região que atravessa a junção entre a unidade de Ig e a unidade não-Ig de uma proteína de fusão à base de anticorpo. A semivida de circulação da proteína de fusão mutante é avaliada, de um modo preferido, monitorizando o seu teor in vivo no soro em função do tempo.
Numa forma de realização da invenção, uma mutação que aumenta a semivida de circulação de uma proteína de fusão à base de anticorpo é uma mutação que reduz a degradação da proteína de fusão num ensaio de degradação pela protease, como se discute no Exemplo 15. A mutação é, de um modo preferido, uma mutação na região que atravessa a junção entre a unidade de Ig e a unidade não-Ig da proteína de fusão (por exemplo, uma mutação na região de junção discutida abaixo). Alternativamente, a mutação pode ser qualquer mutação na proteína de fusão que reduza a degradação pela protease e aumente a semivida de circulação da proteína de fusão, como se descreve no Exemplo 16. Em conformidade, a invenção proporciona métodos para rastrear mutações em proteínas em geral e, de um modo preferido, numa proteína de fusão de Ig-citocina, para identificar mutações que aumentam a semivida de circulação da proteína de fusão. 22 A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não restritivos. Os números de resíduos de aminoácidos aqui utilizados referem-se à sequência de aminoácidos IgGl. 0 técnico médio na matéria compreenderá que mutações correspondentes em proteínas de fusão que envolvem outras proteínas de Ig são úteis para aumentar as suas semividas de circulação.
Consequentemente, os ensinamentos aqui apresentados são aplicáveis a outras moléculas de Ig tal como IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD ou IgE.
Exemplos
Exemplo 1. Construção de genes de anticorpo-IL-2 com substituições do codão de Lis na junção de fusão A sequência de aminoácidos na junção da proteína de fusão anticorpo-IL-2 é SerProGliLis-AlaProTre (SEQ ID N°: 1), na qual a SerProGliLis (SEQ ID No. 2) é a extremidade carboxilo normal da cadeia pesada do anticorpo, e AlaProTre é a sequência N-terminal da IL-2 madura. Para determinar o efeito das alterações na região da junção de fusão na farmacocinética da proteína de fusão, efectuou-se substituições ou a delecção do resíduo por mutagénese, como se descreve a seguir. 0 vector de expressão para imunocitocinas foi descrito em Gillies et al., (1998) J. Imunol. 160:6195-6203. No gene gama-1 humano que codifica a cadeia pesada, destruiu-se o sítio de restrição Xmal localizado 280 bp a montante do codão de paragem da tradução através da introdução de uma mutação silenciosa (TCC para TCA). Introduziu-se uma outra mutação silenciosa (TCT para TCC) para o codão de Ser três 23 resíduos a montante da lisina C-terminal da cadeia pesada para gerar a sequência TCC CCG GGT AAA (SEQ ID No. 3), a qual contém um novo sítio Xmal [Lo et al., (1998) Protein Engineering 11:495-500]. O ADNc da IL-2 foi construído por síntese química e ele contém um novo e único sítio de restrição PvuII [Gillies et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. 89:1428-1432]. Ambos os sítios Xmal e PvuII são únicos no vector de expressão e eles facilitaram a mutagénese do codão de lisina que se situa na junção do ADN do CH3 e da IL-2 . A substituição ou delecção deste codão de Lis foi conseguida substituindo o fragmento Xmal-PvuII no vector de expressão de imunocitocina por uma cadeia dupla de oligonucleótidos que codifica a mutação desejada. Neste caso as regiões variáveis das cadeias pesada e leve eram provenientes do anticorpo KS humanizado, o qual reconhecia um antigénio humano designado EpCAM (molécula de adesão celular epitelial). As sequências das cadeias duplas de oligonucleótidos utilizadas na presente invenção são listadas abaixo, nas quais os codãos a negrito codificam as mutações desejadas e as sequências a itálico, CCCGG e CAG são a extremidade coesiva do sítio Xmal e a extremidade romba do sítio PvuII, respectivamente. Utilizou-se a cadeia dupla de oligonucleótidos com extremidades 5'-hidroxilo na ligação ao vector de expressão digerido com Xmal-PvuII. A utilização de oligonucleótidos com extremidades 5'-hidroxilo eliminou a autoligação à cadeia dupla de oligonucleótido. 1.) Substituição de Lis por Ala 24 5' CCG GGT GCA GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG 3' (SEQ ID N°: 4)
3' CA CGT CGT GGA TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGT GTC 5' (SEQ ID N°: 5) 2.) Substituição de Lis por Arg 5' CCG GGT AGG GCG CCA ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG 3' (SEQ ID N°: 6) 3' CA TTC CGC GGT TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGT GTC 5' (SEQ ID N°: 7)
Introduziu-se também um sítio de restrição NarI (GGCGCC) por mutação silenciosa para facilitar o rastreio de clones recombinantes. 3. ) Delecção de Lis 5' CCG GGT GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG 3' (SEQ ID N°: 8) 3' CA CGT GGA TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGT GTC 5' (SEQ ID N°: 9) 4. ) Substituição de Lis por Gli 5' CCG GGT GGG GCC CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG 3' (SEQ ID N°: 10) 3' CA CCC CGG GGA TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGT GTC 5' (SEQ ID N°: 11) 25
Introduziu-se também um sítio de restrição Apal (GGGCCC) por mutação silenciosa para facilitar o rastreio de clones recombinantes. 5. ) Substituição de Lis por Leu 5' CCG GGT CTG GCG CCA ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG 3' (SEQ ID N°: 12) 3 ' CA GAC CGC GGT TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGT GTC 5' (SEQ ID N°: 13)
Introduziu-se também um sítio de restrição NarI (GGCGCC) por mutação silenciosa para facilitar o rastreio de clones recombinantes. 6. ) Substituição de Lis por AlaAlaAla 5' CCG GGT GCA GCA GCT GCC CCA ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG 3' (SEQ ID N° : 14) 3 ' CA CGT CGT CGA CGG GGT TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGT GTC 5' (SEQ ID N°: 15) 7. ) Substituição de Lis por Cis 5' CCG GGT TGC GCA CCA ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG 3' (SEQ ID N° : 16) 3 ' CA ACG CGT GGT TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGT GTC 5' (SEQ ID N°: 17)
Introduziu-se também um sítio de restrição FspI (TGCGCA) por mutação silenciosa para facilitar o rastreio de clones recombinantes. 26 8. ) Substituição de Lis por Asp 5' CCG GGT GAC GCA CCA ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG 3' (SEQ ID N°: 18) 3 ' CA CTG CGT GGT TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGT GTC 5' (SEQ ID N°: 19)
As construções genéticas recombinantes que contêm as várias substituições ou delecções do codão de Lis foram confirmadas por sequenciação de ADN.
Exemplo 2. Construção de genes de anticorpo-IL-2 que codificam resíduos adicionais de aminoácidos na junção de fusão É comum na técnica separar domínios de proteínas de fusão com grupos de ligação flexíveis que contêm resíduos de aminoácidos tais como glicina e serina. Estudou-se a importância do espaçamento entre o CH3 e a IL-2 nas experiências de mutagénese que se seguem. Inseriu-se cadeias duplas de oligonucleótidos de extremidades rombas que codificam um número diferente de resíduos de aminoácidos no sítio de restrição da endonuclease Smal (o mesmo sítio de reconhecimento que o Xmal mencionado acima) do vector de expressão huKS-IL-2 por ligação; e confirmou-se a orientação correcta da inserção por sequenciação de ADN. Como se discutiu acima, utilizou-se cadeias duplas de oligonucleótidos com extremidades 5'-hidroxilo para eliminar a autoligação. 9. ) Substituição de Lis por Cis com a inserção de uma cadeia de ligação 27
Inseriu-se o seguinte grupo de ligaçao (cadeia dupla de oligonucleótido) no sitio de restrição de endonuclease
Smal do vector de expressão huKS-IL-2 por ligação. A sequência GCATGC codifica um sítio de restrição Sphl, o qual facilita o rastreio de recombinantes que contêm a inserção de ligaçao. 5' G GCA TGC GG 3 3' C CGT ACG CC 5
Depois da inserção do grupo de ligação no sitio Smal (CCCGGG), a sequência na junção de fusão ficou C CCG GCA TGC GGG GGT AAA (SEQ ID N°: 20) (sequência de ligação sublinhada)
Pro Ala Cis Gli Gli Lis (SEQ ID N°: 21)
Assim, o grupo de ligação coloca um resíduo de Cis na posição original do resíduo de Lis, para uma possível formação de uma ligação de dissulfureto entre cadeias. O resíduo original de Lis foi empurrado por 3 resíduos de aminoácidos (AlaCisGli). 10.) Uma cadeia de ligação que codifica 6 resíduos de aminoácidos
Inseriu-se o seguinte grupo de ligação (cadeia dupla de oligonucleótido) no sítio de restrição de endonuclease Smal do vector de expressão huKS-IL-2 por ligação. A sequência GGATCC codifica um sítio de restrição BamHI, o 28 qual facilita o rastreio de recombinantes que contêm a inserção de ligação. 5' G GGT TCA GGA TCC GGA GG 3 ' (SEQ ID N° : 22) 3' C CCA AGT CCT AGG CCT CC 5 ' (SEQ ID N° : 23) Depois da inserção do grupo de ligação no sítio Smal, a sequência na junção de fusão ficou
ProGliSerGliSerGliGliGliLis (SEQ ID N°: 24), onde se sublinhou os seis resíduos de aminoácidos inseridos. 11.) Um grupo de ligação que codifica 11 resíduos de aminoácidos
Inseriu-se o seguinte grupo de ligação (cadeia dupla de oligonucleótido) no sítio de restrição de endonuclease Smal do vector de expressão huKS-IL-2 por ligação. A sequência GGATCC codifica um sítio de restrição BamHI, o qual facilita o rastreio de recombinantes que contêm a inserção de ligação.
5' G GGT TCA GGC TCT GGA TCA GGG TCC GGA TCC GG 3' (SEQ ID N°: 25)
3' C CCA AGT CCG AGA CCT AGT CCC AGG CCT AGG CC 5' (SEQ ID N°: 26)
Depois da inserção do grupo de ligação no sítio Smal, a sequência na junção de fusão ficou
ProGliSerGliSerGliSerGliSerGliSerGliGliLis (SEQ ID N°: 27), onde se sublinhou os onze resíduos de aminoácidos inseridos. 29
Exemplo 3. Construção de genes de anticorpo-IL-2 com substituições do codão de Pro na junção de fusão A prolina na sequência ProGliLis na extremidade carboxilo do CH3 é mutada para Ala, Leu ou Gli, e outros aminoácidos. Isto é conseguido substituindo um fragmento de Sapl-Smal com 25 pares de bases do vector de expressão KS-IL-2 por uma cadeia dupla de oligonucleótidos que codifica a alteração desejada. Cada uma das cadeias duplas de oligonucleótidos seguintes tem uma extremidade coesiva SapI (projecção de 3 bases) e uma extremidade romba (para ligar à extremidade Smal do fragmento de restrição). As substituições no codão de Pro estão assinaladas a negrito. Estas substituições não têm qualquer efeito significativo na farmacocinética da proteína de fusão, indicando que as propriedades estruturais do resíduo de Pro não têm qualquer efeito significativo na farmacocinética da proteína de fusão 3' (SEQ ID N°: 28) 5' (SEQ ID N°: 29) 3 ' (SEQ ID N°: 30) 5' (SEQ ID N°: 31) 3 ' (SEQ ID N°: 32) 5' (SEQ ID N°: 33)
12.) Substituição de Pro por Ala 5' CG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC GC
3' TC TTC TCG GAG AGG GAC AGG CG
13.) Substituição de Pro por Leu 5' CG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC CT
3' TC TTC TCG GAG AGG GAC AGG GA
14.) Substituição de Pro por Gli 5' CG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC GG
3' TC TTC TCG GAG AGG GAC AGG CC 30
Exemplo 4. Construção de ADN hu!4.18-(Lis para Ala)-IL-2
Para demonstrar que o efeito da substituição de Lis por Ala na farmacocinética da proteína de fusão anticorpo-IL-2 não se limitava ao anticorpo huKS, nós escolhemos um anticorpo diferente, 14.18 humanizado (hul4.18), que reconhecia GD2, um gangliósido expressado em excesso da superfície de muitas células de tumores humanos. O vector de expressão para o hul4.18-(Lis para Ala)-IL-2 foi construído como se descreveu acima.
Exemplo 5. Construção de ADN de huKS-(sem Lis)-TNFa
Para demonstrar que o efeito do resíduo de Lis na farmacocinética da proteína de fusão anticorpo-IL-2 se aplicava a outras citocinas, nós escolhemos uma citocina diferente, TNFa. A sequência completa de ADNc do TNFa foi publicada por Nedwin et al. em Nucleic Acids Res. (1985) 13:6361-6373, e a expressão de um anticorpo-TNFa também foi descrita por Gillies et al. em Bioconjugate Chem. (1993) 4:230-235. A junção de fusão do anticorpo-TNFa tem a sequência SerProGliLis-ValArgSerSerSer (SEQ ID N°: 34), em que Vai é o resíduo N-terminal do TNFa maduro. Para comparar com a huKS-TNFa, construiu-se o ADN que codifica a huKS-(sem Lis)-TNFa por um método de PCR de sobreposição [Daugherty et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:2471-2476] com iniciadores mutagénicos que codificam a delecção do resíduo de Lis. Assim, o vector de expressão resultante para a huKS-(sem Lis)-TNFa codifica a sequência peptídica SerProGli-ValArgSerSerSer (SEQ ID N° : 35) na junção de fusão. Modificações adicionais desta proteína de fusão de 31 acordo com a nova invenção podem incluir a eliminação do resíduo de Arg na sequência amino-terminal do TNF para reduzir ainda mais a carga total da região de junção.
Exemplo 6. Construção de ADN de huKS-(EU) - (Lis para Ala)-IL-2
Todas as proteínas de fusão anticorpo-citocina mencionadas nos exemplos acima basearam-se num determinado alotipo da IgGl humana representado pela cadeia de mieloma H, KOL. Para demonstrar que o efeito da substituição de Lis por Ala na farmacocinética da proteína de fusão anticorpo-IL-2 não se limitava à KOL, nós escolhemos um alotipo diferente de IgGl representado pela cadeia de mieloma H, EU. 0 alotipo EU difere do alotipo KOL em três resíduos de aminoácidos nas regiões constantes. 0 alotipo EU contém Lis-229 na extremidade do CHI, e Asp-356 e Leu-358 no início do CH3. 0 alotipo KOL contém Arg-229, Glu-356 e Met-358 nas posições correspondentes. 0 ADN que codifica o alotipo EU foi obtido por mutagénese do ADN de KOL utilizando o método de PCR de sobreposição. 0 ADN de EU resultante foi depois utilizado para substituir o fragmento correspondente de ADN de KOL para gerar o vector de expressão para produzir huKS-(EU)-(Lis para Ala)-IL-2.
Exemplo 7. Transfecção de células e expressão de proteínas
Para transfecções transitórias, introduziu-se o plasmídeo em células renais de cria de Hamster (BHK) por lipofecção utilizando Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) segundo o protocolo do fornecedor. 32
Para se obter clones transfectados de modo estável, introduziu-se ADN de plasmideo nas células de mieloma NS/0 de ratinho por electroporação. Multiplicou-se as células NS/0 em meio de Eagle modificado por Dulbecco fortificado com 10% de soro fetal bovino, 2 mM de glutamina e penicilina/estreptomicina. Lavou-se cerca de 5xl06 células uma vez com PBS e ressuspendeu-se em 0,5 ml de PBS. Incubou-se em seguida 10 μg de ADN de plasmideo linearizado com as células numa cuveta Gene Pulser (0,4 cm de distância entre eléctrodos, BioRad) em gelo durante 10 min. A electroporação foi realizada utilizando um Gene Pulser (BioRad, Hercules, Calif.) com os parâmetros a 0,25 V e 500 μΕ. Deixou-se que as células recuperassem durante 10 min. em gelo, após o que elas foram ressuspendidas em meio de crescimento e depois aplicadas em duas placas de 96 poços. Seleccionou-se clones transfectados de modo estável por crescimento na presença de 100 nM de metotrexato (MTX), o qual foi introduzido dois dias após transfecção. As células foram alimentadas de 3 em 3 dias mais duas ou três vezes, tendo surgido clones resistentes ao MTX em 2 até 3 semanas. Analisou-se os sobrenadantes dos clones por ELISA anti-Fc para identificar grandes produtores. Os clones de produção elevada foram isolados e propagados em meio de crescimento contendo MTX 100 nM.
Para caracterização em rotina por electroforese em gel, capturou-se proteínas de fusão anticorpo-citocina no meio condicionado em Sepharose de Proteína A (Repligen, Cambridge, Mass.) e eluiu-se em seguida por ebulição no tampão de amostra de proteína com ou sem 2-mercaptoetanol. Após electrof orese num gel de SDS, as bandas de proteína 33 foram visualizadas por revelação com Coomassie. A cadeia pesada do anticorpo-IL-2 e a cadeia leve tinham MM aparentes de cerca de 67 e 28 kD respectivamente, em SDS-PAGE.
Para purificação, as proteínas de fusão ligadas à Sepharose de Proteína A foram eluídas num tampão de fosfato de sódio (NalhPCh 100 mM, pH 3, e NaCl 150 mM) . O eluato foi depois imediatamente neutralizado com NaOH 0,1N.
Exemplo 8. Procedimentos de ELISA
Utilizou-se ELISA para determinar as concentrações de produtos proteicos nos sobrenadantes de amostras de clones resistentes ao MTX e de outras amostras testes. O ELISA anti-huFc consiste de um passo de captura utilizando anticorpo de cabra anti-IgG humana (contra as cadeias pesada e leve) e um passo de detecção utilizando o fragmento conjugado com peroxidase de rábano-silvestre F(ab')2 do anticorpo de cabra anti-IgG humana, específico para o fragmento Fc. Por conseguinte, o ELISA anti-huFc mede a IgG humana, quer como um anticorpo por si só ou como uma proteína de fusão com citocina. Para determinar a concentração da proteína de fusão anticorpo-IL-2 intacta, utilizou-se um ELISA de detecção de IL-2. Este consiste do mesmo passo de captura utilizando anticorpo de cabra anti-IgG humana (contra as cadeias pesada e leve), mas o passo de detecção utiliza um anticorpo de detecção dirigido contra a IL-2. Nalgumas experiências, utilizou-se EPCAM em vez de um anticorpo de captura para detectar proteínas de fusão KS-IL-2, uma vez que o anticorpo KS reconhece o EPCAM. Nalgumas experiências, utilizou-se um estojo 34 comercial de detecção ELISA para a IL-2 humana (R&D Systems). Os vários procedimentos ELISA envolvendo anticorpos de detecção de IL-2 deram todos resultados semelhantes . Nc > entanto, como se pode concluir a partir da comparação das Figura IA e Figura 1B, existe uma perda progressiva de material imunorreactivo à IL-2 relativamente ao material imunorreactivo Fc humano nos últimos pontos da farmacocinética ao longo do tempo. Este efeito é mais pronunciado para proteínas de fusão que têm as piores propriedades farmacocinéticas. 0 ELISA anti-huFc é descrito em pormenor abaixo. A. Placas com revestimento.
Revestiu-se as placas de ELISA com anticorpo de cabra anti-IgG humana AffiniPure (H+L) (Jackson Imuno Research Laboratories, West Grove, Pa.) a 5 μρ/πΛ em PBS e com 100 μΕ/ροςο em placas de 96 poços (Nunc-Imuno plate Maxisorp). Cobriu-se as placas revestidas e incubou-se a 4 °C dum dia para o outro. Lavou-se então as placas 4 vezes com 0,05% de Tween (Tween 20) em PBS e bloqueou-se com 1% de BSA/1% de soro de cabra em PBS, 200 μΕ/ροςο. Após incubação com o tampão de bloqueio a 37 °C durante 2 h, lavou-se as placas 4 vezes com Tween a 0,05% em PBS e secou-se com toalhas de papel. B. Incubação com amostras de ensaio e anticorpo secundário
Diluiu-se as amostras de ensaio até às concentrações apropriadas em tampão de amostra, o qual contém 1% de BSA/1% de soro de cabra/0,05% de Tween em PBS. Preparou-se uma curva de calibração com um anticorpo quimérico (com um Fc humano) de concentração conhecida. Para preparar uma 35 curva de calibração, efectuou-se diluições em série no tampão da amostra para dar uma curva de calibração na gama de 125 ng/mL até 3,9 ng/mL. Adicionou-se as amostras e os padrões diluídos à placa, 100 μL/poço, e incubou-se a placa a 37 °C durante 2 h. Após incubação, lavou-se a placa 8 vezes com 0,05% de Tween em PBS. A cada poço adicionou-se em seguida 100 μΐϋ do anticorpo secundário, o fragmento de anticorpo de cabra anti-IgG humana AffiniPure F(ab')2 conjugado com peroxidase de rábano-silvestre, específico para o fragmento Fc (Jackson Imuno Research) , diluído a cerca de 1:120.000 no tampão de amostra. A diluição exacta do anticorpo secundário tem de ser determinado para cada lote da anti-IgG humana conjugada com HRP. Após incubação a 37 °C durante 2 h, lavou-se a placa 8 vezes com Tween a 0,05% em PBS. C. Desenvolvimento
Adicionou-se a solução de substrato à placa a 100 μΐ,/poço. Preparou-se a solução de substrato dissolvendo 30 mg de OPD (dicloridrato de o-fenilenodiamina, 1 comprimido) em 15 mL de ácido cítrico 0,025 M/tampão de Na2HPC>4 0,05 M, pH 5, o qual continha 0,03% de H202 adicionado de fresco. Deixou-se desenvolver a cor durante 30 min. à temperatura ambiente no escuro. O tempo de desenvolvimento pode variar dependendo da variabilidade de lote para lote das placas revestidas, do anticorpo secundário, etc. Observar o desenvolvimento da cor na curva de calibração para determinar o momento de paragem da reacção. Parou-se a reacção através da adição de H2SO4 4N, 100 μΐ,/poço. A placa foi lida num leitor de placas, o qual foi ajustado a 490 e 650 nm e programado para subtrair a OD de fundo a 650 nm da OD a 490 nm. 36
Exemplo 9. Comportamento farmacocinético de proteínas de fusão anticorpo-citocina portadoras de alterações na junção de fusão
As proteínas de fusão foram avaliadas para o seu comportamento farmacocinético após injecção intravenosa em ratinhos Balb/c. Colheu-se sangue de ratinhos por sangramento retro-orbital e conservou-se a 4 °C em tubos de microcentrífuga Eppendorf. Nalguns casos utilizou-se dois métodos ELISA diferentes para medir a quantidade de anticorpo humano e a quantidade da segunda proteína não-Ig fundida que permanece no sangue em vários pontos no tempo. Alternativamente, a presença da unidade não-Ig foi demonstrada através de análise por transferência de Western de pontos no tempo farmacocinéticos.
Utilizando as técnicas descritas nos exemplos precedentes, injectou-se as proteínas mutantes de fusão KS(gamai)-IL-2 em ratinhos e determinou-se o efeito na semivida no soro. Alguns dos resultados são apresentados na Figura 1 e na Figura 2. Além disso, examinou-se o efeito da delecção da lisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo numa fusão IgG(gamai)-IL-2 na qual o anticorpo tinha uma especificidade de ligação diferente. As propriedades farmacocinéticas de uma 14.18(Lis-^Ala)-IL-2 foram superiores à 14.18-IL-2 numa medida que era semelhante ao melhoramento da KS(Lis-^Ala)-IL-2 relativamente à KS-IL-2.
Para fusões anticorpo-IL-2, a classificação do efeito das mutações que afectam a lisina C-terminal da cadeia 37 pesada nas propriedades farmacocinéticas foi (do melhor para o pior):
Lis-^Leu~Lis-^Ala~Lis->Ala3>Lis-^ (delecção) >Lis-^Asp-Lis “^Gli>Lis“^ (sem alteração) ~Lis^Cis>Lis“^Arg.
As propriedades farmacocinéticas da KS (Lis->delecção) -TNFalfa foram significativamente melhoradas relativamente à KS-TNFalfa (Figura 3). 0 perfil farmacocinético da proteina de fusão KS-TNFalfa foi invulgar pelo facto de, guando foram medidos os niveis de anticorpo humano por ELISA de Fc, existir uma queda acentuada do nível de proteína detectada nos primeiros 30 minutos, seguida de um aumento lento no nível de material reactivo para a Fc humana. Este efeito foi extremamente reprodutível.
Quando se analisou amostras de farmacocinética por transferência de Western, constatou-se que o material de reacção cruzada com o Fc humano estava na forma de anticorpo intacto; a unidade TNF tinha sido quebrada e perdida. No entanto, a análise semelhante da proteína de fusão KS-TNFalfa portadora de uma delecção da lisina exterminai indicou que esta proteína tinha sobrevivido essencialmente numa forma intacta, com o TNF ainda presente.
Além disso, expressou-se uma proteína de fusão KS-TNFalfa em que foram eliminados os oito primeiros aminoácidos do TNFalfa maduro. As propriedades farmacocinéticas da proteína de fusão KS-TNFalfa modificado foram superiores às proteínas correspondentes possuindo a sequência completa do TNF maduro. Isto é provavelmente devido à eliminação do resíduo de Arg carregado na posição 38 +2 do TNF maduro o que aumenta a hidrofobicidade da região da junção. A alteração da região constante das cadeias pesadas de KS (Lis Ala)-IL-2 e da KS-IL-2 de KOL para EU não teve qualquer efeito nas propriedades farmacocinéticas de qualquer uma das proteínas.
No seu conjunto, estes resultados indicam que a mutação na junção originou um melhoramento significativo das propriedades farmacocinéticas de proteínas de fusão de Ig. 0 efeito foi observado com vários anticorpos e várias proteínas não-Igs fundidas com uma unidade de Ig.
Exemplo 10. Combinação de mutações na junção de fusão com uma alteração no tipo de Ig de gamai para gama4 conduz a um melhoramento sinérqico da semivida no soro que é independente da função FcRp A região Fc gama4 humana liga-se de modo deficiente aos receptores Fc. Consequentemente, as proteínas de fusão que compreendem uma região Fc gama4 têm, duma maneira geral, propriedades farmacocinéticas superiores relativamente às proteínas de fusão com a cadeia gamai. Para avaliar se as mutações na junção afectam as farmacocinéticas através de um efeito de interacção com um receptor Fc, uma interacção com o FcRp ou ambos, examinou-se as propriedades farmacocinéticas de proteínas de fusão contendo gamai e gama4 com ou sem mutações na junção em ratinhos que eram normais ou deficientes em FcRp. Os resultados destas experiências farmacocinéticas são mostrados na Figura 2. 39 A Figura 2 mostra o comportamento farmacocinético de uma proteína de fusão KS(gamai)-IL-2, uma proteína de fusão KS(gamai)-IL-2, uma proteína de fusão KS(gamai)(Lis-para-Ala)-IL-2 e uma proteína de fusão KS(gama4)(Lis-para-Ala)-IL-2. Examinou-se ratinhos normais e ratinhos mutantes deficientes em microglobulina beta2.
Estes dados indicam que, num ratinho normal, as farmacocinéticas de uma proteína de fusão anticorpo de IgG-gamal-IL-2 foram melhoradas pela introdução de uma mutação Lis-para-Ala na extremidade C da unidade de anticorpo. De modo semelhante, as farmacocinéticas de uma proteína de fusão anticorpo de IgG-gama4-IL-2 foram melhoradas pela introdução de uma mutação Lis-para-Ala na extremidade C da unidade de anticorpo. Estes dados indicam que uma mutação na junção pode melhorar as propriedades farmacocinéticas de uma proteína de fusão que já possui farmacocinéticas melhoradas em resultado de uma redução na ligação ao receptor Fc. A Figura 2 também mostra as propriedades farmacocinéticas das mesmas proteínas quando injectadas num ratinho mutante que carece da proteína microglobulina beta2, a qual é uma subunidade essencial do FcRp (Junghans e Anderson, Proc. Nat Acad. Sei. (1996) 93:5512-5516). Deste modo, estes ratinhos mutantes são deficientes na actividade do FcRp. Consequentemente, o catabolismo de anticorpos é cerca de 10 vezes mais rápido nestes ratinhos mutantes do que nos ratinhos normais. 40
Os dados da Figura 2 indicam que o anticorpo KS (gamai), uma proteína de fusão KS (gamai)-IL-2, uma proteína de fusão KS (gama4)-IL-2, uma proteína de fusão KS (gamai)(Lis-para-Ala)-IL-2 e uma proteína de fusão KS (gama4)(Lis-para-Ala)-IL-2 são todos catabolisados mais rapidamente em ratinhos mutantes microglobulina beta2 do que em ratinhos normais. No entanto, a ordem relativa das semividas no soro é a mesma para estas proteínas em ambas as estirpes de ratinhos: o anticorpo não fundido tem as melhores farmacocinéticas, seguido da proteína de fusão KS(gama4)(Lis-para-Ala)-IL-2, da proteína de fusão KS(gamai) (Lis-para-Ala)-IL-2, da proteína de fusão KS(gama4)-IL-2, tendo a proteína de fusão KS(gamai)-IL-2 as piores propriedades farmacocinéticas. Se uma mutação na junção tivesse o seu efeito exclusivamente através da modificação da interacção de uma proteína de fusão com o FcRp, então na ausência da função FcRp, a mutação na junção não deveria ter qualquer efeito nas farmacocinéticas.
Exemplo 11. Mutação da região de junção num anticorpo intacto não tem qualquer efeito na semivida no soro
Manipula-se uma mutação num gene que codifica a cadeia pesada do anticorpo KS intacto, não fundido para alterar a lisina C-terminal para uma alanina. As formas normal e mutante do KS são expressadas e purificadas pelos métodos descritos acima e as propriedades farmacocinéticas são comparadas. Os comportamentos farmacocinéticos dos anticorpos normais e mutantes são indistinguíveis.
Exemplo 12. Ligação ao receptor Fc pelas proteínas de fusão à base de anticorpo com ou sem mutações na junção de fusão 41
Utilizando um procedimento corrente, examinou-se a ligação das KS-IL-2 e KS(K-A)-IL-2 aos receptores Fc. Não foi encontrado qualquer efeito da mutação. As proteínas de fusão foram expressadas e purificadas como se descreveu acima, e foram avaliadas para a sua aptidão para se ligarem a células J774 fixadas, que expressam o receptor Fc. Os resultados são mostrados na Figura 4.
Exemplo 13. Tratamento do carcinoma do cólon num mamífero com uma proteína de fusão anticorpo-citocina que contém uma mutação na junção
Para testar se uma proteína de fusão citocina-anticorpo com uma mutação na junção seria vantajosa no tratamento do carcinoma do cólon num mamífero realizou-se as seguintes experiências. CT26 é uma linha de células de carcinoma do cólon provenientes de ratinhos Balb/C. Através de técnicas de manipulação genética correntes, esta linha de células foi manipulada para expressar a molécula de adesão da célula epitelial humana (EpCAM), que é o antigénio reconhecido pelo anticorpo KS; estas células são designadas células CT26/EpCAM (Gillies et al. Journal of Imunology (1998) 160:6195-6203).
Inoculou-se subcutaneamente ratinhos Balb/C com 2xl06 células CT26/EpCAM. Quando os tumores atingiram um volume de cerca de 50-200 milímetros cúbicos, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em três grupos de 7 ratinhos para prosseguir o estudo. Começando no dia 0, tratou-se ratinhos portadores de tumor com PBS, cerca de 10 micrograma de KS-IL2 com uma cadeia pesada de IgGl (KS- 42 IL2gamal) ou cerca de 10 micrograma de KS-IL2 com uma cadeia pesada de IgGl e a mutação de Lis para Ala descrita nos exemplos anteriores (KS-IL2gamal [Lis para Ala]). Os ratinhos foram injectados intravenosamente uma vez por dia durante cinco dias. As dimensões do tumor foram medidas com um compasso de espessuras.
Os resultados de uma dessas experiências são mostrados na Figura 5. Nesta experiência, KS-IL2gamal originou uma diminuição significativa no volume de muitos, mão não de todos os tumores. Em seis dos sete animais tratados com KS-IL2gamal, os tumores eram ainda mensuráveis ao 21° dia. No entanto, nos animais tratados com KS-IL2gamal(Lis para Ala), os tumores retraíram de tal modo que ao 21° dia eles não eram mensuráveis em todos os sete animais, e pelo 16° dia apenas dois dos sete ratinhos tinham tumores mensuráveis. Na Figura 5, os losangos pretos indicam os volumes médios dos tumores em ratinhos que foram injectados com PBS como controlos nos dias 0, 1, 2, 3 e 4. Os círculos a cheio indicam os volumes médios dos tumores em ratinhos tratados com 10 micrograma de KS-IL2 gamai. Efectuou-se injecções intravenosas. O eixo dos x indica o número de dias decorridos após a primeira injecção; o eixo dos y indica o volume médio dos tumoOres em milímetros cúbicos.
Exemplo 14. Inibição de metástases num mamífero tratado com uma proteína de fusão anticorpo-citocina que contém uma mutação na junção
Para avaliar se uma proteína de fusão anticorpo-citocina poderia inibir o crescimento metastático de células tumorais, realizou-se as seguintes experiências. O 43
Carcinoma Pulmonar de Lewis (LLC) é uma linha de células de carcinoma pulmonar proveniente de ratinhos C57/B16. Utilizando técnicas de manipulação genética correntes, esta linha de células foi manipulada para expressar a molécula de adesão das células epiteliais humanas (EpCAM), a qual é o antigénio reconhecido pelo anticorpo KS; estas células são designadas células LLC/EpCAM.
Injectou-se ratinhos C57/B16 por via intravenosa com lxlO6 células LLC/EpCAM. Após cinco dias, distribuiu-se os ratinhos aleatoriamente em três grupos de 6 ratinhos e tratou-se com PBS, com cerca de 20 micrograma de KS-IL2 ou com cerca de 20 micrograma de KS-Ala-IL2 (KS-IL2 com uma alteração de Lis para Ala na extremidade C da unidade de Ig) . As metástases foram quantificadas no dia 24. Como se indica no quadro abaixo, o grupo tratado com PBS tinha um grande número de metástases nos pulmões. Os animais tratados com KS-yl-IL2 tinham um número significativamente reduzido de metástases. No entanto, os animais tratados com KS-yl-ala-IL2 tinham ainda menos metástases do que os animais tratados com KS-yl-IL2 e num animal não foi detectada nenhuma metástase. Grupo de Tratamento Número de Metástases Peso do Pulmão (g) PBS >250, >250, >250, 0,92 + /- • 0,14 >250, >250, >250 KS-yl-IL2 62, 37, 18, 17, 11, 9 0,27 +/- 0,04 KS-yl-ala-IL2 4, 4, 3, 3, 1, 0 0,25 + /- 0, 02 Em conjunto, os Exemplos 13 e 14 ilustram que as proteínas de fusão anticorpo-citocina podem inibir 0 estabelecimento de metástases bem como o crescimento de 44 células tumorais no sítio primário. Além disso, os resultados indicam que as proteínas de fusão anticorpo-citocina podem inibir doenças resultantes de uma variedade de tipos diferentes de tumores, tais como cancro do cólon e cancro do pulmão. Além disso, as proteínas de fusão anticorpo-citocina com pelo menos uma alteração de aminoácido na região do grupo de ligação de acordo com a invenção são mais eficazes em inibir as metástases e o crescimento de tumores do que as proteínas de fusão anticorpo-citocina sem nenhuma alteração de aminoácido na região do grupo de ligação.
Exemplo 15. Análise da resistência às proteases de proteínas de fusão à base de anticorpo com mutações na junção
Para avaliar se as proteínas de fusão anticorpo-citocina com mutações na junção eram mais ou menos sensíveis à digestão por proteases, tratou-se KS-IL2 e KS-Ala-IL2 purificadas com várias proteases durante períodos de tempo distintos e analisou-se os produtos resultantes por SDS-PAGE.
Numa experiência, tratou-se 4 micrograma de KS-IL2 e KS-Ala-IL2 com 0,1 mU ou 0,4 mU de Catepsina D (Enzyme Systems, Livermore, Calif.) durante cerca de 16 horas a 37 graus C e analisou-se por SDS-PAGE. Utilizou-se condições de tampão de acordo com as instruções do fabricante. Quando a KS-IL2 foi tratada com 0,4 mU de Catepsina D, cerca de 50% da cadeia pesada da KS-IL2 foi convertida em várias formas de baixo peso molecular. O produto de digestão dominante tinha uma massa molecular ligeiramente menor do 45 que a da cadeia pesada da KS-IL2, mas muito maior do que a da cadeia pesada do KS. Este resultado indica que a maior parte da degradação pela Catepsina D não estava a ocorrer na junção da cadeia pesada-IL2.
Em contrapartida, quando a KS-Ala-IL2 foi incubada com 0,4 mU de Catepsina D nas mesmas condições, a extensão da degradação pela Catepsina D foi muito inferior e a banda com a massa molecular do produto de degradação principal da KS-IL2 era praticamente indetectável.
Numa segunda experiência, tratou-se 4 micrograma de KS-IL2 e KS-Ala-IL2 com 25 mU ou 50 mU de Catepsina L (Enzyme Systems, Livermore, Calif.) durante cerca de 16 horas a 37 graus C e analisou-se por SDS-PAGE. Utilizou-se as condições tampão de acordo com as instruções do fabricante. Quando a KS-IL2 foi tratada com 50 mU de Catepsina L, quase toda a cadeia pesada da KS-IL2 foi convertida em várias formas de baixo peso molecular. O produto de digestão dominante tinha uma massa molecular quase igual à da cadeia pesada do KS. Este resultado indica que muita da degradação pela Catepsina L estava a ocorrer próxima ou na junção cadeia pesada-IL2.
Em contrapartida, quando a KS-Ala-IL2 foi incubada com 50 mU de Catepsina L nas mesmas condições, a extensão de degradação pela Catepsina L foi muito menor e a banda com a massa molecular do produto de degradação principal da KS-IL2 continuava a ser a espécie de maior massa molecular observada. 46
Numa terceira experiência, tratou-se 4 micrograma de KS-IL2 e KS-Ala-IL2 com 0,04 mU, 0, mU ou 0,2 mU de plasmina (Sigma, St. Louis, Minn.) durante cerca de 16 horas a 37 graus C e analisou-se por SDS-PAGE. Utilizou-se as condições tampão de acordo com as instruções do fabricante. Quando a KS-IL2 foi tratada com 0,04 mU de plasmina, cerca de 34 da cadeia pesada da KS-IL2 foi convertida numa forma de massa molecular menor com uma massa molecular aparente cerca de 30 aminoácidos superior à da cadeia pesada do KS. Quando a KS-IL2 foi tratada com 0,2 mU de plasmina, praticamente toda a cadeia pesada da KS-IL2 foi convertida numa forma de massa molecular menor com uma massa molecular aparente cerca de 30 aminoácidos maior do que a cadeia pesada do KS. Estes resultados indicam que a degradação da KS-IL2 pela plasmina estava a ocorrer próxima mas não na junção cadeia pesada-IL2.
Em contrapartida, quando a KS-Ala-IL2 foi incubada com 0, 04 mU de plasmina nas mesmas condições, a extensão da degradação pela plasmina foi quase não detectável. Quando a KS-Ala-IL2 foi incubada com 0,2 mU de plasmina, detectou-se algum produto não degradado. Além disso, quando a KS-Ala-IL2 foi degradada com plasmina, acumulou-se numa quantidade significativa uma espécie com um tamanho molecular cerca de 90 aminoácidos maior do que a cadeia pesada da KS-IL2; nas digestões da KS-IL2 pela plasmina, esta espécie +90 foi provavelmente degradada rapidamente até às espécies +30 de menor massa molecular, pelo que não se terá acumulado. Não obstante, a mutação Lis-para-Ala originou uma estabilização significativa da KS-IL2 intacta na presença de plasmina. Em quaisquer dos casos, a cadeia leve do anticorpo não foi degradada nas condições utilizadas. 47
Em conjunto, estes resultados indicam que a mutação Lis-para-Ala originou uma resistência generalizada à degradação pelas proteases, até mesmo nas degradações que não ocorrem no sitio da mutação. Sem se pretender ficar preso a qualquer teoria particular, a mutação de Lis-para-Ala pode fazer com que a unidade IL-2 do KS fique mais resistente às proteases. As proteases podem desempenhar uma função importante nas propriedades farmacocinéticas das proteínas de fusão à base de anticorpo. Por exemplo, quando as proteínas de fusão à base de anticorpo são captadas por células portadoras de receptores Fc e transportadas para os endossomas precoces, pode suceder que a unidade de anticorpo seja resistente às condições proteolíticas utilizadas mas que a unidade parceira de fusão seja mais sensível resultando numa digestão parcial ou completa da proteínas de fusão à base de anticorpo.
Exemplo 16. Utilização da digestão por proteases para avaliar mutações em proteínas de fusão à base de anticorpo
Este exemplo proporciona um método geral para melhorar as propriedades farmacocinéticas de uma proteína. Avalia-se as propriedades farmacocinéticas de uma proteína bem como a sua sensibilidade às proteases. Gera-se proteínas variantes e avalia-se para a existência de uma maior resistência à proteólise. As variantes com maior resistência à proteólise são depois avaliadas em termos das suas propriedades farmacocinéticas. Constata-se que a proporção de proteínas resistentes à proteólise com propriedades farmacocinéticas melhoradas é maior para a população de proteínas variantes como um todo. Algumas proteínas variantes com propriedades 48 farmacocinéticas melhoradas têm uma ou mais substituições de aminoácidos que não provocam uma alteração profunda na estrutura da proteína que pode ser inferida por inspecção da sequência de codificação, tal como a introdução de um sítio de glicosilação ligado a N.
As proteínas variantes são geradas, por exemplo, por mutagénese de uma construção de expressão e isolamento de clones que expressam proteínas variantes individuais. Utiliza-se qualquer uma de uma diversidade de técnicas de mutagénese, incluindo mutagénese dirigida, mutagénese aleatória, mutagénese por PCR e técnicas de mutagénese que originam sequências híbridas de genes relacionados. É útil utilizar proteases intracelulares, tais como proteases endossómicas, nestes ensaios. Sem se pretender ficar limitado a qualquer teoria particular, julga-se que as farmacocinéticas de determinadas proteínas, em particular das proteínas que não são eliminadas por filtração renal, seja determinada pela proteólise que ocorre após endocitose. É também útil utilizar proteases extracelulares, tais como tripsina, quimiotripsina, plasmina, outra protease de digestão, outras proteases do soro tais como factores de coagulação e proteases tecidulares específicas. Por exemplo, utiliza-se proteases específicas para tumores para avaliar as proteínas variantes e identificar aquelas variantes que têm propriedades farmacocinéticas e estabilidade melhoradas dentro do microambiente do tumor. Noutro exemplo, as proteínas que se destinam a serem administradas por via oral são avaliadas para a sua 49 resistência a enzimas presentes no aparelho gastrointestinal, tais como tripsina e quimiotripsina. Constata-se que as proteínas variantes com resistência melhorada às enzimas gastro-intestinais possuem propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como uma maior AUC (Área Sob a Curva).
Por exemplo, uma construção de expressão que codifica uma proteína de fusão que contém parte ou todo o anticorpo sofreu mutação. Gera-se clones, expressa-se as proteínas correspondentes e avalia-se as proteínas, quer individualmente quer em pequenos grupos, para a sensibilidade relativa às proteases. As proteínas de fusão à base de anticorpo variantes com resistência melhorada às proteases são depois avaliadas em termos das suas propriedades farmacocinéticas, e um número significativo das variantes das proteínas de fusão à base de anticorpo resistentes às proteases possuem propriedades farmacocinéticas melhoradas. Os ácidos nucleicos que codificam as variantes das proteínas de fusão melhoradas são sequenciados e constata-se que algumas variantes melhoradas contêm mutações em sítios que não a junção da proteína de fusão que origina o fenotipo com resistência melhorada à proteólise e com farmacocinética melhorada. 50
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Lexigen Pharmaceuticals Corp. <120> Melhoramento da Semivida de Circulação de Proteínas de Fusão à Base de Anticorpos <13 0> LEX-011PC <150> US 60/181. 768 <151> 2000-02-11 <160> 35 <17 0> Patentln vers ao 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Art ificial <220> <223> sequência da junção <400> 1
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<210> 2 <211> 4 <212> PRT 51 <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência C-terminal da Ig <400> 2
Ser Ptq Oiy Lys 1
<210> 3 <211> 12 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 3 ieeccggyta aa 12
<210> 4 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 4 cegggígcag esectactíc sagítctaca aagaaaacac ag 42 <210> 5 <211> 38
<212> ADN 52 <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 5 ctgtgttttc ffigtagaac ttgaagíagg tgctgcac
<210> 6 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 6 ccgggtaggg egeeaaetíc aagKdaca aaga&aaea.c ag <210> 7 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 7 ctgtglttc tftgtagaac ttgaagttgg cgccttac 38 <210> 8 <211> 39
<212> ADN 53 <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 8 ©cgggtgcac clacíteaag ttetacaaag aaaacacag 39
<210> 9 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 9 ctgsgítrtc tigtagase ttgaagtagg igcac 35
<210> 10 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 10 ccgggtgggg cccctacttc aagttctaca aagaaaacac ag 42
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<210> 14 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 55 <223> Sequência sintética <400> 14 ccggglgcâg csgeígeccc âactâcsagt tetacaaaga aaâcac-âg 48 <210> 15 <211> 44 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 15 cígtgttttc tttgtagaac ítg&agttgg ggcag&gct gcac 44 <210> 16 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 16 ccgggttgcg cacosact& aagttetaea aagaaaacac sg 4 <210> 17 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 56 <223> Sequência sintética <4 Ο 0> 17 ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagttgg tgcgcaac 38
<210> 18 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 18 ccgggigacg caccaacttc aagttctaca aagaaaacac ag 42
<210> 19 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 19
<210> 20 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 38 57 <223> Sequência sintética <220> <221> CDS <222> (2)..(19) <400> 20 c eeg gca tge ggg ggí aaa 18 Pro Aía Cys Gly Gly Lys 1 5
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<210> 22 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 22 gggttcagga tccggagg 18 <210> 23 <211> 18
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Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Lya i s io <210> 28 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 28 25 cgcagaagag ccíctccctg tccgc 60 60 <210> 29 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 29 gcggacaggg agaggctctt et 22 <210> 30 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 30 cgcagaagag cetctccctg tccct 25 <210> 31 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 31 22 agggacaggg agaggctctt ct 61
<210> 32 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Sequência sintética <400> 32 cgcagaagag cctctccctg tccgg 25 <210> 33 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência sintética <400> 33 ccggacaggg agaggctctt ct 22 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de junção Ig-TNF <400> 34
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<210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de fusão Ig-(Lis eliminada)-TNF <400> 35
Ser Pro Gly Vai Ârg Ser Ser Ser 1 5
Lisboa, 15 de Novembro de 2006

Claims (27)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão à base de anticorpo alterada, a qual tem uma semivida de circulação in vivo mais prolongada do que uma proteína de fusão à base de anticorpo correspondente sem a referida alteração, compreendendo uma cadeia pesada de imunoglobulina (Ig) ou uma parte desta com um domínio CH2 e CH3, ligado na sua extremidade C à extremidade N de uma proteína não-Ig segregada, ou uma parte desta que retenha as propriedades funcionais da proteína não-Ig intacta, em que a referida alteração inclui um ponto de mutação, uma inserção, uma delecção ou um rearranjo genético no resíduo de aminoácido C-terminal da cadeia de Ig.
2. Proteína de fusão à base de anticorpo da reivindicação 1, em que a alteração de aminoácido aumenta a hidrofobicidade da referida proteína de fusão à base de anticorpo.
3. Proteína de fusão à base de anticorpo da reivindicação 1, em que a referida alteração de aminoácido inclui uma mutação pontual, inserção ou rearranjo genético de resíduos de aminoácidos sem carga. Proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 3, em que o resíduo de aminoácido C-terminal da cadeia de Ig está substituído por Ala, Leu, Gli e Trp.
4. 2
5. Proteína de fusão à base de anticorpo da reivindicação 4, em que o referido resíduo de aminoácido C-terminal está substituído por Ala.
6. Proteína de fusão à base de anticorpo da reivindicação 4, em que o referido resíduo de aminoácido C-terminal da cadeia de Ig está substituído por Ala-Ala-Ala.
7. Proteína de fusão à base de anticorpo da reivindicação 1 ou 2, em que o referido resíduo de aminoácido C-terminal da cadeia de Ig está eliminado.
8. Proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 7, em que o péptido espaçador ou de ligação, com 1 e 15 resíduos de aminoácidos, está inserido entre a cadeia de Ig e a unidade não-Ig.
9. Proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 8 compreendendo outra mutação na região de 10 resíduos de aminoácidos da extremidade C da unidade de Ig substituindo resíduos de aminoácidos ionizáveis na referida região por resíduos sem carga ou hidrófobos.
10. Proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 8 compreendendo outra mutação na região de 10 resíduos de aminoácidos da extremidade N da unidade de proteína não-Ig substituindo resíduos de aminoácidos ionizáveis na referida região por resíduos sem carga ou hidrófobos. 3
11. Proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 8 compreendendo outra mutação na região de 10 resíduos de aminoácidos da extremidade C da unidade de Ig e na região de 10 resíduos de aminoácidos da extremidade N da unidade de proteína não-Ig, substituindo resíduos de aminoácidos ionizáveis por resíduos sem carga ou hidrófobos.
12. Proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 11 em que a referida cadeia de Ig compreende pelo menos o domínio CH2 de uma IgG2 ou uma região constante de IgG4.
13. Proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 11, em que a referida cadeia de Ig compreende pelo menos uma fracção de uma região constante de IgGl possuindo uma mutação ou uma delecção em um ou mais aminoácidos seleccionados do grupo constituído por Leu234, Leu235, G1Í236, G1Í237, Asn297 e Pro331.
14. Proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 11, em que a referida cadeia de Ig compreende pelo menos uma fracção de uma região constante de IgG3 possuindo uma mutação ou uma delecção em um ou mais aminoácidos seleccionados do grupo constituído por Leu281, Leu282, G1Í283, Gli2g4, Asn344 e Pro378.
15. Proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 11, em que a referida cadeia 4 de Ig tem afinidade de ligaçao para um receptor de protecção de imunoglobulina.
16. Proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 11, em que a referida cadeia de Ig tem uma afinidade de ligação consideravelmente diminuída para um receptor Fc seleccionado do grupo constituído por FcyRI, FcyRII e FcyRIII.
17. Proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 16, em que a referida proteína não-Ig é seleccionada do grupo constituído por uma citocina, uma proteína de ligação ao ligando e uma toxina proteica.
18. Proteína de fusão à base de anticorpo da reivindicação 17, em que a referida citocina é seleccionada do grupo constituído por um factor de necrose tumoral, uma interleucina e uma linfocina.
19. Proteína de fusão à base de anticorpo da reivindicação 18, em que o referido factor de necrose tumoral é o factor de necrose tumoral alfa.
20. Proteína de fusão à base de anticorpo da reivindicação 18, em que a referida interleucina é a interleucina-2.
21. Proteína de fusão à base de anticorpo da reivindicação 18, em que a referida linfocina é uma linfotoxina ou um factor estimulante de colónias. 5
22. Proteína de fusão à base de anticorpo da reivindicação 21, em que o referido factor estimulante de colónias é um factor estimulante de colónias de granulócitos e macrófagos.
23. Proteína de fusão à base de anticorpo da reivindicação 17, em que a referida proteína de ligação ao ligando é seleccionada do grupo constituído por CD4, CTLA-4, receptor de TNF e um receptor de interleucina.
24. Método para aumentar a semivida de circulação de uma proteína de fusão à base de anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de imunoglobulina (Ig), ou uma fracção desta com um domínio CH2 e CH3, ligado na sua extremidade C à extremidade N de uma proteína não-Ig segregada, ou uma fracção desta que conserve as propriedades funcionais da proteína intacta, em que o método compreende alterar o resíduo C-terminal da cadeia de Ig por mutação pontual, inserção, delecção ou rearranjo genético, em que a referida alteração leva a um aumento da hidrofobicidade da referida proteína de fusão.
25. Método da reivindicação 24 compreendendo ainda alterar resíduos de aminoácidos por mutação pontual, inserção, delecção ou rearranjo genético na região que atravessa a junção entre a unidade de Ig e a unidade não-Ig desde 10 resíduos de aminoácidos da extremidade C da cadeia de Ig até 10 resíduos de aminoácidos da extremidade N da unidade não-Ig; em que a referida alteração leva a um aumento da hidrofobicidade da referida proteína de fusão. 6
26. Método para identificar uma mutação que aumenta a semivida de circulação de uma proteína de fusão à base de anticorpo que compreende uma cadeia pesada de imunoqlobulina (Ig), ou uma fracção desta com um domínio CH2 e CH3, ligado na sua extremidade C à extremidade N de uma proteína não-Ig segregada, ou uma fracção desta que conserve as propriedades funcionais da proteína intacta, em que o método compreende os passos de: a) introduzir uma ou mais mutações na região que atravessa a junção entre a unidade de Ig « 2 a unidade de proteína nao-Ig desde 10 resíduos de aminoácidos da extremidade C da proteína de Ig até 10 resíduos de aminoácidos da extremidade N da unidade de proteína não-Ig, de qualquer maneira com pelo menos uma mutação do resíduo de aminoácido na extremidade C da cadeia de Ig, onde as referidas mutações levam a um aumento da hidrofobicidade da proteína de fusão; b) comparar as semividas no soro da proteína de fusão à base de anticorpo com e sem uma mutação: e c) seleccionar uma mutação que aumente a semivida no soro da proteína de fusão à base de anticorpo.
27. Utilização de uma proteína de fusão à base de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 17 até 23 para fabricar um medicamento para o tratamento de doenças relacionadas com tumores. 7 7 28 . 27, em que as incluem as Utilização de acordo com a reivindicação doenças relacionadas com tumores metástases. Lisboa, 15 de Novembro de 2006
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