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CN113164780A - 抗lap抗体变体及其用途 - Google Patents

抗lap抗体变体及其用途 Download PDF

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CN113164780A
CN113164780A CN201980081592.5A CN201980081592A CN113164780A CN 113164780 A CN113164780 A CN 113164780A CN 201980081592 A CN201980081592 A CN 201980081592A CN 113164780 A CN113164780 A CN 113164780A
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J·M·英格里什
B·S·福克斯
S·科普西亚弗蒂斯
Y·戈梅兹·洛伦特
R·穆雷
P·拉奥
G·斯卡皮恩
K·J·西蒙
周海宏
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Telos Treatment Co
Merck Sharp and Dohme LLC
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Abstract

本文提供了抗LAP抗体(例如，重组人源化、嵌合和人抗LAP抗体)或其抗原结合片段，其具有治疗有益性质，如特异性结合至细胞上的PAP‑TOPβ1，而不结合至胞外基质的LAP‑TGFβ1，以及包含其的组合物。还提供了这些抗体或抗原结合片段在治疗应用(如癌症的治疗)和诊断应用中的用途。

Description

抗LAP抗体变体及其用途
相关申请
本申请要求2018年10月10日提交的美国临时专利申请号62/744,045，2018年10月24日提交的美国临时申请号62/750,065和2018年11月08日提交的美国临时申请号62/757,519的优先权，其每一个的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及抗LAP抗体或其抗原结合片段。本发明的另一个方面涉及包含抗LAP抗体或抗原结合片段的组合物和试剂盒。本发明的另一个方面涉及通过施用抗体或抗原结合片段治疗疾病(例如，癌症)的方法。
背景技术
转化生长因子β1(TGFβ1)以前蛋白复合物形式合成，其中成熟细胞因子被笼罩在LAP(潜在相关肽)中，LAP是TGFβ1的潜在相关肽。LAP-TGFβ1复合物与以下五种目前已知的锚定蛋白之一进行二硫键键合：糖蛋白A主导重复序列(GARP)、含有富含亮氨酸的重复的蛋白33(LRRC33)、潜在转化生长因子β结合蛋白1(LTBP1)、潜在转化生长因子β结合蛋白3(LTBP3)和潜在转化生长因子β结合蛋白4(LTBP4)。这些锚定蛋白将潜在TGFβ1定位在体内的特定部位和特定细胞上。
GARP(也称为富含亮氨酸的重复蛋白32或LRRC32)是一种跨膜蛋白，其将LAP-TGFβ1锚定在淋巴细胞(尤其是调节性T细胞)的表面。GARP还在血小板、B细胞、NK细胞、成纤维细胞、间充质基质细胞、间充质干细胞和内皮细胞上表达，并且还控制LAP-TGFβ1在这些细胞类型上的表达。LRRC33是一种跨膜蛋白，据报道可以将LAP-TGFβ1锚定在髓细胞表面上，尤其是巨噬细胞、树突状细胞和髓系来源的抑制性细胞(MDSC)。LTBP1、LTBP3和LTBP4是将LAP-TGFβ1锚定到胞外基质(ECM)中的分泌分子。
尽管LAP结合剂已在本领域用作鉴定某些细胞群的工具，但对LAP在疾病状态中的相关性知之甚少。
LAP-TGFβ1复合物的位置具有重要的生物学和临床意义，因为一旦在溶液中半衰期短的成熟TGFβ1细胞因子被释放，其就以自分泌或接近旁分泌的方式在局部起作用。因此，锚定蛋白是其中潜在TGFβ1在特定位置上分级，等待有效的成熟细胞因子释放以作用于局部组织的主要机制。
当在不同位置中表达时，LAP-TGFβ1具有不同功能。例如，通过LTBP锚定在细胞外基质中的LAP-TGFβ1对于组织内稳态至关重要。对此，Xu等(Bone Research 2018；6：2)注意到“TGF-β复合物更类似于分子传感器，其通过释放在细胞层面上发挥生理学作用的活性配体，对ECM扰动立即做出反应，从而确保正常的组织内稳态”。
已知LAP-TGFβ1掺入胞外基质的改变会导致人类疾病。例如，在小鼠和人类两者中LTBP-3的缺失都会导致骨骼和牙齿形成方面的类似缺陷。LTBP-3缺陷还与马凡氏综合征中的主动脉扩张相关(Rifkin等，Matrix Biol 2018；71-72：90-99)。据信这些作用是由于局部胞外基质中的TGFβ1的异常直接作用所致(Xu等，Bone Research 2018；6：2)。
与将LAP-TGFβ1定位于胞外基质的锚定蛋白不同的是，由GARP锚定的LAP-TGFβ1对于调节性T细胞(Edwards等，Eur J Immunol2016；46：1480-9)和抑制性B细胞亚群(Wallace等，JCI Insight2018；3：e99863)的免疫抑制功能至关重要。还显示了一些肿瘤表达GARP，使其能够局部表达TGFβ，并直接抑制肿瘤微环境中的免疫系统并支持其自身生长(Metelli等，Journal of Hematology&Oncology2018；11：24)。
锚定于髓细胞的LAP-TGFβ1对于MDSC(Zhang H等，Frontiers in Immunology2017；8：1-15)和M2巨噬细胞(Zhang等，Oncotarget2017；8：99801-15)的免疫抑制功能至关重要。根据一项最新研究，已显示髓细胞使用锚定蛋白LRRC33将潜在TGFβ锚定在细胞表面上(Qin等，Cell 2018；174：1-16)。
癌症疗法的最新进展集中在通过例如激活耗竭的免疫细胞群、接种疫苗和除去免疫抑制性细胞群来利用患者的免疫系统。鉴于对靶向(和诊断)疾病(如癌症)的改进策略的持续需求，需要用于这些目的的新型药剂和方法。
发明内容
本文提供的本发明的一个方面是一种构建体(例如，多核苷酸、表达载体和宿主细胞)、蛋白或肽，其包含本文所述的任何序列，例如在表(如表34)中所见的氨基酸序列。本文提供了结合LAP的抗体和抗原结合片段，所述LAP包含以下指定的结构和功能特征(例如，在表34中的SEQ ID NO：16-197、214、216-240、242-245、248、249和255的氨基酸序列中的任一项)。例如，抗体和抗原结合片段包含本文的表中所述的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO：16-197、214和216-255。在各种实施方式中，LAP包含含有LAP和TGFβ(例如，TGFβ1)的复合物和/或表位。在各种实施方式中，表位是在本文的实施例(例如，实施例19-23)中描述的。
本发明的一个方面提供了分离的单克隆抗体(例如，重组人源化、嵌合和人抗体)，其与此前的抗LAP抗体相比显示出治疗上有利的结合至LAP-TGFβ1(例如，人LAP-TGFβ1)的模式和功能性质。在一个实施方式中，抗LAP抗体选择性结合至细胞(例如，免疫细胞和其他免疫抑制性细胞)上的LAP-TGFβ1，但不结合至胞外基质中的LAP-TGFβ1，因此能够靶向广泛的临床相关细胞类型，同时保留胞外基质中LAP-TGFβ1的天然功能/激活。因为TGFβ以自分泌或近旁分泌的方式起作用，所以与特定细胞群的选择性结合将导致在所指示的细胞群的紧邻处抑制成熟TGFβ的产生。因此，本文所述的抗体提供了以高度选择性的细胞特异性方式抑制TGFβ激活和释放成熟细胞因子的临床获益。在一些实施方式中，抗LPA抗体是具有活性效应功能的同种型，特异性抗LAP抗体与给定细胞群的结合增强将导致ADCC或CDC对该细胞群的耗竭增加。因此，本文公开的抗LAP抗体是理想的用于以单一疗法以及与其他免疫调节剂或治疗剂(例如，免疫检查点抑制剂)组合治疗多种疾病的方法，包括癌症和涉及免疫抑制性细胞的其他疾病。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种抗体(例如，重组人源化、嵌合、结构域或人抗体)或其抗原结合片段，其特异性结合至LAP，其包含：
(a)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：16、26和18的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：19、20和21的氨基酸序列；
(b)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、55和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(c)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、66和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(d)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、55和68的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(e)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、66和68的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(f)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、111和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列；或者
(g)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、120和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列。
在各种实施方式中，所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。
在各种实施方式中，使用所述抗体进行施用步骤(例如，在治疗或诊断受试者的方法中)。在各种实施方式中，所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。在各种实施方式中，所述LAP是人LAP、食蟹猴(cyno)LAP、大鼠LAP和/或小鼠LAP。在各种实施方式中，使用抗原结合片段进行施用步骤(例如，在治疗或诊断受试者的方法中)。
在各种实施方式中，抗体的恒定区是人IgG1恒定区。例如，IgG1恒定区包含本文公开的表(例如，表34)中所示的氨基酸序列。例如，IgG1恒定区包含SEQ ID NO：196、244或245中所示的氨基酸序列。在各种实施方式中，抗体的恒定区是人IgG4恒定区。例如，人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：197中所示的氨基酸序列。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种分离的抗体或抗原结合片段，其特异性结合至人LAP，并且包含重链可变区序列和轻链可变区序列，所述重链可变区序列和所述轻链可变区序列与选自以下的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性：(a)分别为SEQ ID NO：42和52；(b)分别为SEQ ID NO：101和104；(c)分别为SEQ ID NO：98和104；(d)分别为SEQ ID NO：133和154；和(e)分别为SEQ ID NO：218和154。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种分离的抗体或抗原结合片段，其特异性结合至人LAP，并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：218的氨基酸序列，或所述重链可变区包含具有1、2或3个氨基酸置换的SEQ ID NO：218的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：154的氨基酸序列，或所述轻链可变区包含具有1、2或3个氨基酸置换的SEQ ID NO：154的氨基酸序列。在各种实施方式中，至少一个置换位于CDR内。在各种实施方式中，至少一个置换位于框架区内。在各种实施方式中，至少一个置换位于至少一个CDR和至少一个框架区内。在各种实施方式中，所述至少一个置换的任何和/或全部位于和/或存在于一个或多个框架区内。在各种实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。本文提供的本发明的另一个方面是一种分离的抗体或抗原结合片段，其特异性结合至人LAP，并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO：218的氨基酸序列或重链可变区包含具有1-5、5-10、10-15、15-20或20-25个氨基酸置换的SEQ ID NO：218的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：154的氨基酸序列或轻链可变区包含具有1-5、5-10、10-15、15-20或20-25个氨基酸置换的SEQ ID NO：154的氨基酸序列。例如，至少一个置换位于至少一个CDR区中。在各种实施方式中，至少一个置换位于多个CDR内。在各种实施方式中，至少一个置换位于至少一个框架区内。在各种实施方式中，至少一个置换位于至少一个CDR内和至少一个框架区中。在各种实施方式中，所述至少一个置换的任何和/或全部位于和/或存在于一个或多个框架区内。在各种实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。
本文提供的本发明的另一个方面是一种分离的抗体或抗原结合片段，其特异性结合至人LAP，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其包含SEQ ID NO：218的氨基酸序列，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，其包含SEQ ID NO：154的氨基酸序列。在各种实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。
本文提供的本发明的另一个方面是一种分离的抗体或抗原结合片段，其特异性结合至人LAP，其中所述抗体或抗原结合片段包含由SEQ ID NO：218的氨基酸序列组成的重链可变区，其中所述抗体或抗原结合片段包含由SEQ ID NO：154的氨基酸序列组成的轻链可变区。在各种实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。
本文提供的本发明的另一个方面是一种分离的抗体或抗原结合片段，其特异性结合至人LAP，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链，其包含SEQ ID NO：219的氨基酸序列，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链，其包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列。在各种实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。
本文提供的本发明的另一个方面是一种分离的抗体或抗原结合片段，其特异性结合至人LAP，其中所述抗体或抗原结合片段包含由SEQ ID NO：219的氨基酸序列组成的重链，其中所述抗体或抗原结合片段包含由SEQ ID NO：155的氨基酸序列组成的轻链。在各种实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。在本发明的另一个方面中，本文提供了一种分离的抗体或抗原结合片段，其特异性结合至人LAP，并且包含重链序列和轻链序列，所述重链序列和所述轻链序列与选自以下的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性：(a)分别为SEQ ID NO：43和53；(b)分别为SEQ ID NO：45和53；(c)分别为SEQ ID NO：102和105；(d)分别为SEQ ID NO：103和105；(e)分别为SEQ ID NO：99和105；(f)分别为SEQ ID NO：100和105；(g)分别为SEQ ID NO：134和155；(h)分别为SEQ IDNO：135和155；(i)分别为SEQ ID NO：219和155；和(j)分别为SEQ ID NO：220和155。例如，至少一个置换位于至少一个CDR区中。在各种实施方式中，至少一个置换位于多个CDR内。在各种实施方式中，至少一个置换位于至少一个框架区内。在各种实施方式中，至少一个置换位于至少一个CDR内和至少一个框架区中。在各种实施方式中，所述至少一个置换的任何和/或全部位于和/或存在于一个或多个框架区内。在各种实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种分离的抗体或抗原结合片段，其结合至人LAP，并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、120和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列，其中所述抗体还包含人IgG1恒定区。在各种实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种分离的抗体或抗原结合片段，其结合至人LAP，并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其包含分别与氨基酸序列SEQ ID NO：110、120和112具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其包含分别与氨基酸序列SEQ ID NO：113、114和115具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中所述抗体还包含人IgG1恒定区。在各种实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种分离的抗体或抗原结合片段，其结合至人LAP，并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、120和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列，其中所述抗体还包含突变的人IgG4恒定区，其包含SEQ ID NO：197的氨基酸序列。在各种实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。
本发明的一个方面提供了一种本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段(例如，表34中所述的20E6及其人源化形式)，其与一种分离的抗体结合，所述分离的抗体包含含有SEQ ID NO：240的氨基酸序列的免疫球蛋白重链和含有SEQ ID NO：241的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
本发明的一个方面提供了本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段(例如，表34中所述的20E6及其人源化形式)，其与一种分离的抗体结合，所述分离的抗体包含含有SEQ IDNO：246的氨基酸序列的免疫球蛋白重链和含有SEQ ID NO：247的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
本文提供的本发明的另一个方面是一种分离的抗体或抗原结合片段，其与本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至LAP上的相同表位。在另一个方面中，本文提供了一种分离的抗体或抗原结合片段，其与本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至LAP上的相同氨基酸或氨基酸的组。例如，表位(例如，LAP以及包含LAP和TBFβ1的LAP复合物)、抗体或抗原结合片段具有本文(如表25、26、27、28、29和/或30)所述的特征。在一些实施方式中，抗LAP抗体结合至人LAP的特定氨基酸，例如人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的氨基酸31-40、274-280和340-343，例如，如通过至少一种结构分析方法(如晶体学和/或cryo-EM)所评估的。在一些实施方式中，抗LAP抗原结合片段结合至人LAP的特定氨基酸，例如人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的氨基酸31-40、274-280和340-343，例如，如通过至少一种结构分析方法(如晶体学和/或cryo-EM)所评估的。在各种实施方式中，抗体或抗原结合片段结合至所述氨基酸内的一个或多个氨基酸，即人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的氨基酸31-40、274-280和340-343内的一个或多个氨基酸。在一些实施方式中，分离的抗体或抗原结合片段结合至人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的残基31-40、274-280和340-343的一个或多个残基，或者结合至人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的残基31-43、272-283和340-344的一个或多个残基。在一些实施方式中，抗LAP抗体或其抗原结合片段结合至LAP-TGFβ1的一个或多个特定区域，例如，如图34中所示的区域1、区域2、区域3和/或区域4，例如，如通过至少一种结构分析方法(如HDX-MS)所评估的。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合至人LAP(例如，以约11nm的KD，以11nm或更低的KD或者以10nM或更低的KD)在各种实施方式中，抗体或抗原结合片段以60nM或更低、50nM或更低、40nM或更低、30nM或更低、20nM或更低或者10nM或更低的KD结合至LAP(例如，人、食蟹猴、大鼠或小鼠)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合至人LAP(例如，以小于60nM、50nM、40nM、30nM、20nM或10nM的KD)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段以约40-60nM或约50-60nM的KD结合至人LAP。在各种实施方式中，通过Octet结合分析确定KD。在各种实施方式中，通过
Figure BDA0003108510350000071
表面等离子体共振(可互换地称为“BiaCore”和“BIACore”)结合分析确定KD。在各种实施方式中，抗体或抗原结合片段具有本文(例如，表31-32)所述的结合亲和性。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段抑制TGFβ1激活。在各种实施方式中，抗体或抗原结合片段抑制TGFβ的整联蛋白激活和/或从LAP-TGFβ1复合物释放人LAP。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合至人和小鼠LAP两者。在一些实施方式中，在不存在锚定蛋白的情况下，抗体或抗原结合片段结合至人LAP。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合至或被确定为结合至免疫抑制性细胞上与锚定蛋白(例如，GARP、LRRC33)复合的LAP-TGFβ1，但不结合至锚定蛋白或由LAP-TGFβ和锚定蛋白两者的残基组成的表位。免疫抑制性细胞包括例如抑制性T细胞(例如，调节性T细胞、激活的T细胞)、癌症相关的成纤维细胞、M2巨噬细胞、表达LAP-TGFβ1的癌细胞和/或单核髓系来源的抑制性细胞。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段不结合游离TGFβ1或空LAP。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段不结合至胞外基质中的LAP。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段不结合至或被确定为不结合至与LTBP1、LTBP3和/或LTBP4复合的LAP。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合至或被确定为结合至包含K27C和Y75C突变和/或人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的残基82-130的全部或一部分(例如，在所述残基内)的人LAP-TGFβ1，但是不结合至包含Y74T突变的人LAP-TGFβ1。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合至或被确定为结合至GARP阳性免疫抑制性细胞核GARP阴性免疫抑制性细胞两者。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合至或被确定为结合至血小板，但不引起血小板聚集或血小板脱颗粒。
在一些实施方式中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体或其变体。在一些实施方式中，抗体是嵌合、结构域、人源化或人抗体。
在任何上文所述的实施方式中，抗体或起抗原结合片段可以包含任何本文所述的可变轻链和本文所述的轻链恒定结构域(例如，人轻链恒定结构域)。例如，在表34中描述了轻链恒定结构域。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含人κ轻链恒定结构域或其变体。在各种实施方式中，所述变体包含至多1-25个修饰的氨基酸置换(例如，20个置换)。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含人λ轻链恒定结构域或其变体。在各种实施方式中，所述变体包含至多1-25个修饰的氨基酸置换(例如，20个置换)。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含人κ轻链恒定结构域，其包含SEQ ID NO：256的氨基酸序列。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种双特异性抗体，其包含本文所述的抗LAP抗体的对LAP具有特异性的第一结合区，和结合至另一抗原的第二结合区或治疗剂，例如，肿瘤相关抗原、CD4、CD8、CD45、CD56、CD14、CD16、CD19、CD11b、CD25、CD20、CD22、CD30、CD38、CD114、CD23、CD73、CD163、CD206、CD203、CD200R或CD39。在各种实施方式中，第二结合区或治疗剂结合至受体蛋白。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种免疫缀合物，其包含与可检测部分、结合部分、标记部分和/或生物活性部分(例如，双特异性分子和/或双功能分子)连接的本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段。例如，生物活性部分包含受体陷阱构建体。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种核酸(一种或多种核酸)，其包含编码本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列，以及包含其的表达载体，和使用所述表达载体转化的细胞。在另一个方面中，本文提供了一种核酸(一种或多种核酸)，其包含编码本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链的核苷酸序列，以及包含其的表达载体，和使用所述表达载体转化的细胞。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述组合物包含一种或多种另外的治疗剂，如抗癌剂、化学治疗剂、免疫调节剂(例如，免疫刺激剂或免疫抑制剂)、抗炎剂和/或免疫检查点阻断剂(例如，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIGIT抗体和抗TIM3抗体)。例如，PD-1抗体是派姆单抗。
在一个实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段(例如，表34中所述的20E6及其人源化形式)与分离的抗体结合，所述分离的抗体包含含有SEQ ID NO：240的氨基酸序列的免疫球蛋白重链和含有SEQ ID NO：241的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。SEQID NO：240和241对应于派姆单抗的重链序列和轻链序列。
在一个实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段(例如，表34中所述的20E6及其人源化形式)与分离的抗体结合，所述分离的抗体包含含有SEQ ID NO：246的氨基酸序列的免疫球蛋白重链和含有SEQ ID NO：247的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。SEQID NO：246和247对应于派姆单抗的重链序列和轻链序列。
在本发明的另一个方面中，本文提供了试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段和使用说明书。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种制备特异性结合至LAP的抗体的方法，其包括：(a)使用多肽免疫动物，所述多肽包含由28G11识别的人LAP上的表位。(b)从免疫的动物选择与28G11结合相同表位的抗体，和(c)分离从步骤(b)选择的抗体。在一些实施方式中，抗体结合至包含TGFβ1的人LAP复合物。在一些实施方式中，抗体结合至人LAP的残基82-130的全部或部分(例如，在所述残基内)。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种选择性抑制细胞(如抑制性T细胞(例如，抑制性细胞，如抑制性T细胞(例如，调节性T细胞、活化的T细胞)、M2巨噬细胞、表达LAP-TGFβ1的癌细胞、癌症相关成纤维细胞、间充质基质细胞、间充质干细胞和/或单核髓系来源的抑制性细胞)上的TGFβ1激活，但不抑制胞外基质上的TGFβ1激活的方法，其包括向受试者施用本文所述的任何抗LAP抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合物和/或药物组合物。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的任何抗LAP抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合物和/或药物组合物。
在一些实施方式中，癌症的特征在于TGFβ活性异常。在一些实施方式中，癌症与分化簇4(CD4)+调节性T细胞、分化簇8(CD8)+调节性T细胞、调节性B细胞、髓系来源的抑制性细胞、肿瘤相关巨噬细胞、癌症相关成纤维细胞、和/或先天性淋巴细胞的浸润相关。
在一些实施方式中，癌症是乳腺癌、膀胱癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠道癌、胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤或骨髓增生异常综合症。
在上文所述方法的一些实施方式中，施用一种或多种另外的疗法，例如，放射疗法、化学疗法、免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIGIT抗体和抗TIM3抗体)、免疫抑制疗法、免疫刺激疗法、细胞疗法和治疗剂(例如，抗癌剂、化学治疗剂、免疫抑制剂、免疫调节剂和抗炎剂)。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种检测LAP的方法，其包括将样品(例如，生物样品)与本文所述的任何抗LAP抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合物和/或药物组合物接触，并检测复合物。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种诊断与调节性T细胞浸润相关的癌症的方法，其包括使来自罹患所述癌症的患者的生物样品与本文所述的任何抗LAP抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合物和/或药物组合物接触，其中所述抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合物和/或药物组合物的阳性染色表示所述癌症是与调节性T细胞浸润相关的。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种诊断与GARP阴性抑制性细胞相关的癌症的方法，其包括使来自罹患所述癌症的患者的生物样品与本文所述的结合至GARP阴性抑制性细胞的任何抗LAP抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合物和/或药物组合物接触，其中所述抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合物和/或药物组合物的阳性染色和抗GARP抗体的阴性染色表示所述癌症与GARP阴性抑制性细胞相关。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种选择罹患癌症的患者以接受本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合和/或药物组合物的方法，其包括使来自所述患者的生物样品与所述抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合物和/或药物组合物接触，其中所述抗体或抗原结合片段的阳性染色表示所述癌症适合用所述抗体治疗。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种确定罹患癌症的患者对本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段治疗的应答的方法，其包括使来自所述患者的生物样品与所述抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合物和/或药物组合物减少的染色表示所述癌症对使用所述抗体的治疗具有应答。
在本发明的另一个方面中，本文提供了一种制备特异性结合至28G11识别的人LAP上相同表位的抗体的方法，其包括使用包含肽的免疫原免疫动物，其中所述肽包含由28G11识别的表位，从免疫的动物中选择与28G11结合至相同表位的抗体，和获得与28G11结合至相同表位的抗体。在各种实施方式中，人LAP包含含有人LAP和TGFβ1的复合物。
本发明的另一个方面是本文所述的任何抗LAP抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合物和/或药物组合物用于选择性抑制免疫抑制性细胞上的TGFβ1激活而非胞外基质上的TGFβ1激活；治疗癌症；诊断癌症(例如，与调节性T细胞浸润或GARP阴性抑制性细胞相关的癌症)；选择罹患癌症的患者；和确定罹患癌症的患者对使用本文所述的抗LAP抗体治疗的应答的用途。还提供了本文所述的任何抗LAP抗体或抗原结合片段、双特异性分子、免疫缀合物和/或药物组合物用于制备在免疫抑制性细胞上选择性抑制TGFβ1激活而非在胞外基质上的TGFβ1激活和治疗癌症的药物的用途。
附图说明
图1A-1F是显示在未转染的HT1080细胞(HT 1080-无)以及过表达人LAP-TGFβ1(HT1080-huB1)、人LAP-TGFβ2(HT1080-huB2)、人LAP-TGFβ3(HT1080-huB3)和小鼠LAP-TGFβ1(HT1080-muB1)的HT1080细胞上抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1、24E3_hIgG1和2C9_(hyb)的结合的图。[TGFβ2＝转化生长因子β-2；TGFβ3＝转化生长因子β-3]
图2A-2F是显示抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1、24E3_hIgG1和2C9_(hyb)与所示的LAP-TGFβ变体结合的图。黑色柱子对应于结合至过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的所述抗体。灰色柱子对应于未添加抗LAP抗体的阴性对照样品。HT1080-huB1：过表达LAP-TGFβ1的HT1080细胞。HT1080-K27C_Y75C：过表达具有K27C和Y75C突变的LAP-TGFβ1的HT1080细胞(阻止由整联蛋白进行的TGFβ1激活的突变；“封闭”构型)，HT1080-Y74T：过表达具有Y74T突变的LAP-TGFβ1的HT1080细胞(有利于TGFβ1的自发性释放的突变“开放构型”)；HT1080-ch2.3：过表达嵌合LAP-TGFβ1的HT1080细胞，其中人LAP-TGFβ1的外显子2.3(残基131-164)已被替代为来自鸡LAP-TGFβ1(UniProt登录号#H9CX01)的相应残基；HT1080-ch4：过表达嵌合LAP-TGFβ1的HT1080细胞，其中人LAP-TGFβ1的外显子4(残基183-208)已被替代为来自鸡LAP-TGFβ1的外显子4。
图3A-3F是显示抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1、24E3_hIgG1和2C9_(hyb)与所示的LAP-TGFB变体结合的图。黑色柱子对应于结合至过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的所述抗体。灰色柱子对应于未添加抗LAP抗体的阴性对照样品。HT1080-huB1：过表达LAP-TGFβ1的HT1080细胞，HT1080-空LAP：过表达不包含成熟TGFβ1细胞因子的LAP的HT1080细胞，HT1080-ch2.2：过表达嵌合LAP-TGFβ1的HT1080细胞，其中人LAP-TGFβ1的外显子2.2(残基108-130)已被替代为来自鸡LAP-TGFβ1的外显子2.2。
图4是显示抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1、24E3_hIgG1和1D11与成熟TGFβ(即，无LAP的TGFβ)结合的图，如通过ELISA测定所测量的，其中信号的抑制反映与成熟TGFβ的结合。
图5A和图5B是一组显示在表达人LAP-TGFβ1(图5A)和小鼠LAP-TGFβ1(图5B)的P3U1细胞中28G11对TGFβ1激活的影响的图。
图6A-6F是显示在表达人或小鼠LAP-TGFβ1的P3U1细胞中抗体17G8(图6A针对人LAP-TGFβ1和图6B针对小鼠LAP-TGFβ1)、24E3(图6C针对人LAP-TGFβ1和图6D针对小鼠LAP-TGFβ1)、22F9(图6E针对人LAP-TGFβ1)、20E6(图6F针对人LAP-TGFβ1)对TGFβ1激活的影响的图。图6G-6L是显示在表达人或小鼠LAP-TGFβ1的P3U1细胞中28G11_IgG2a(图6G)、20E6_IgG2a(图6H)、22F9_IgG2a(图6I)、24E3_hIgG1(图6J)、17G8_hIgG1(图6K)和20E6_H0.2aL1_hIgG1(图6L)对TGFβ1激活的影响的图。
图7是显示所示的抗LAP抗体结合至由P3U1细胞保存的胞外基质(ECM)的图。检测了三种细胞类型：无LAP-TGFβ的P3U1细胞，表达人LAP-TGFβ1的P3U1细胞和表达小鼠LAP-TGFβ1的P3U1细胞。以2μg/mL的浓度使用抗体。
图8是显示所示的抗LAP抗体(即，抗体28G11、22F9、20E6、17G8和24E3)结合至人血小板的剂量-应答关系的图。
图9A-9E是显示抗LAP抗体28G11_hyb(图9A)、20E6_IgG2a(图9B)、22F9_IgG2a(图9C)、17G8_hIgG1(图9D)和24E3_hIgG1(图9E)对人血小板脱颗粒的影响的图。
图10A和图10B是显示所示的抗LAP抗体与THP-1细胞结合的图。THP细胞结合在图10A中表示为LAP+细胞的百分比(％)，且在图10B中表示为中位荧光强度(MFI)。图10C是显示所示的抗LAP抗体与THP-1细胞结合的图。THP细胞结合表示为LAP+细胞的％。图10D显示了所示的抗LAP抗体与THP-1细胞结合的点图。图10E和图10F是显示所示的抗LAP抗体与U937细胞结合的图。U937细胞结合在图10E中表示为LAP+细胞的％，且在图10F中表示为MFI。图10G显示了所示的抗LAP抗体与U937细胞结合的点图。
图11是显示抗LAP抗体28G11、22F9和20E6与调节性T细胞、CD8细胞、M2巨噬细胞和来自CT26 TIL的M-MDSC结合(以阳性细胞的百分比表示)的图。
图12是显示人源化28G11变体与小鼠28G11亲本抗体竞争结合至过表达人GARP和LAP-TGFβ1的P3U1细胞的能力的图。H0-H2是变体人源化的重链，和L0-L3是变体人源化的轻链。
图13是显示所示的人源化28G11变体与过表达人GARP和LAP-TGFβ1的P3U1细胞结合的图。
图14A-14D是显示通过ELISA测定的所示的人源化28G11变体对TGFβ1激活的抑制的图。
图15A是显示人源化的28G11_H2L3变体回复至人残基的多种回复组合对与过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞结合的影响的图。所检测的各种抗体以HC变体_LC变体形式列出。图15B是显示28G11_H2.1L3和28G11_H2aL3a变体对与过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞结合的影响的图。黑色柱子对应于结合至过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的抗体。灰色柱子对应于结合至不过表达人LAP-TGFβ1的对照HT1080细胞的抗体。
图16是显示所示的人源化22F9变体与过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞结合的图。黑色柱子对应于结合至过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的抗体。灰色柱子对应于结合至不过表达人LAP-TGFβ1的对照HT1080细胞的抗体。
图17A和图17B是所示抗体22F9和变体的体积排阻高效液相色谱(SE-HPLC)的色谱图。
图18A是显示使22F9_H5L0的重链中的小鼠残基回复成相应人残基对于过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的结合的影响的图。图18B是显示除去22F9_H5L0中的潜在脱酰胺化和/或异构化位点的置换对于过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的结合的影响的图。22F9_H5.2L0对应于具有双重N54Q/D102A突变的22F9_H5L0。图18C是显示22F9_H0.1、22F9_H1.1、22F9_H2.1和22F9_H3.1变体与过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞结合的图。黑色柱子对应于结合至过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的抗体。灰色柱子对应于结合至不过表达人LAP-TGFβ1的对照HT1080细胞的抗体。
图19A和图19B是显示所示的人源化20E6变体与人LAP-TGFβ1结合的图。黑色柱子对应于结合至过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的抗体。灰色柱子对应于结合至不过表达人LAP-TGFβ1的对照HT1080细胞的抗体。
图20A是显示20E6的L1轻链的小鼠回复置换对与人LAP-TGFβ1的结合的影响的图。图20B是显示具有降低的免疫原性的20E6_H0重链变体的结合对与人LAP-TGFβ1的结合的影响的图。黑色柱子对应于结合至过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的抗体。灰色柱子对应于结合至不过表达人LAP-TGFβ1的对照HT1080细胞的抗体。
图21A-21C是显示20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体与包含人LAP-TGFβ1、LAP-TGFβ2或LAP-TGFβ3的Fc融合蛋白结合的生物层干涉曲线。
图22A-22D是显示20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体的多个重链和轻链CDR变体与人LAP-TGFβ1结合的图。
图23A和图23B是显示20E6_H0.2aL1_hIgG1的F(ab’)2片段和Fab’片段与过表达GARP和LAP-TGFβ1的P3U1细胞的结合的图。
图24是显示MHG8(GARP特异性小鼠IgG2a)抗体、16F4(抗LAP)抗体和人源化20E6抗体与可溶性LAP-TGFβ1、sGARP-LAP-TGFβ1和ECR3E-LAP-TGFβ1复合物结合的一系列生物层干涉曲线。
图25是如实施例17中所述的用于比较小鼠28G11、16F4和MHG8的结合表位的竞争实验的示意图。
图26A显示了用于建立人源化20E6-Fab/LAP-TGFβ1模型的cryo-EM图的实例。图26B是FSC曲线对分辨率的曲线。图26C是使用Guinier曲线的B因子评估。
图27A是在
Figure BDA0003108510350000141
分辨率下与LAP-TGFβ1复合的人源化20E6抗体的cryo-EM图。图27B显示了在
Figure BDA0003108510350000142
分辨率下PDB条目5jxe的电子密度。
图28A显示了LAP与人源化20E6 Fab的VL和vH之间的相互作用。图28B显示了TGFβ1与Fab的人源化20E6 VL和VH部分之间的相互作用。图28C和图28D显示了LAP-TGFβ1与20E6Fab的20E6 VL部分之间的另外的相互作用。构建体和相互作用以灰度显示。
图29A显示了LAP与28G11人源化Fab的VL和VH之间的相互作用。图29B显示了TGFβ1与Fab的人源化28G11 VL和VH部分之间的相互作用。图29C显示了人源化28G11和人源化20E6中CDR的再定位。图29D显示了人源化28G11中的Q56是与跨越残基V342-K344的TGFβ1环的相互作用的理想位置。图29E显示了在人源化28G11中，Tyr残基由Gly置换，引起与V341的侧链的相互作用丧失。构建体和相互作用以灰度显示。
图30A显示了在cryo-EM中鉴定的2Mab：2TGFβ1复合物(Mab指22F9 Fab)。构建体是：LAP-TGFβ1二聚体；22F9-Fab；22F9-Fc。图30B提供了2D类别的实例。构建体和相互作用以灰度显示。
图31A显示了LAP与22F9 Fab的VL和VH部分之间的相互作用。图31B显示了TGFβ与22F9 VL和VH之间的相互作用。图31C显示了22F9-Fab+LAP-TGFβ1复合物和人源化20E6-Fab+LAP-TGFβ1(Fab)的重叠，以及人源化20E6-Fab和22F9-Fab针对抗原的不同定向。图31D和图31E显示了LAP-TGFβ1与20E6 Fab的部分之间的另外的相互作用。构建体和相互作用以灰度显示。
图32是在人源化20E6抗体结合至人LAP-TGFβ1蛋白后的氘摄取保护的H/D差异曲线。
图33是在抗体结合至人LAP-TGFβ1蛋白后的氘摄取保护的H/D差异曲线。
图34是人LAP-TGFβ1和小鼠LAP-TGF1之间的序列比对。所鉴定的表位均位于在人和小鼠LAP-TGFβ1之间同源的区域中。图中的人LAP-TGFβ1序列对应于SEQ ID NO：257。图中的小鼠LAP-TGFβ1序列对应于SEQ ID NO：7。
图35A和图35B是人LAP-TGFβ1、GARP-LAP-TGFβ1、人源化20E6和复合物的体积排阻色谱图。各样品的洗脱时间与凝胶过滤标准品一致。通过光散射检测器确定所报道的分子量。
图36A-36F是显示在同基因型CT26结直肠癌肿瘤模型中抗LAP抗体28G11和16B4与抗PD-1抗体联用对肿瘤体积影响的一系列图。图中显示的数据为：图36A(仅抗PD-1抗体)、图36B(28G11_IgG2a+抗PD-1抗体)、图36C(IgG2a同种型对照)、图36D(仅抗PD-1抗体)、图36E(仅16B4_IgG2a)和图36F(16B4_IgG2a+抗-PD-1抗体)。抗PD-1抗体是大鼠抗PD-1(克隆RMP1-14)-IgG2a抗体。
图37是显示在同基因型EMT6乳腺癌肿瘤模型中抗LAP抗体28G11与抗PD-1抗体联用对肿瘤体积影响的图。抗PD-1抗体是大鼠抗PD-1(克隆RMP1-14)-IgG2a抗体。使用的统计学检验是双因素ANOVA。
图38是显示在同基因型EMT6乳腺癌肿瘤模型中抗LAP抗体22F9与抗PD-1抗体联用对肿瘤体积影响的图。抗PD-1抗体是大鼠抗PD-1(克隆RMP1-14)-IgG2a抗体。使用的统计学检验是双因素ANOVA。
图39是显示在同基因型EMT6乳腺癌肿瘤模型中抗LAP抗体20E6与抗PD-1抗体联用对肿瘤体积影响的图。抗PD-1抗体是大鼠抗PD-1(克隆RMP1-14)-IgG2a抗体。使用的统计学检验是双因素ANOVA。
图40是显示在4T1乳腺癌肿瘤转移模型中抗LAP抗体28G11_IgG2a和16B4_IgG2a。以及抗TGFβ抗体1D11_IgG1作为单药疗法对肺结节计数影响的图(p＜0.05，除去异常值后进行非配对T检验)。
图41A和图41B是显示在同基因型CT26肿瘤模型中抗LAP抗体28G11_IgG2a与12Gy(图41A)和20Gy(图41B)照射联用对肿瘤体积影响的图。使用的统计学检验是双因素ANOVA。****P＜.0001，***P＝.0004。
图42A-42C是显示在使用或不使用12Gy或20Gy照射的条件下抗LAP抗体28G11_IgG2a对M-MDSC(图42A)、M2巨噬细胞(图42B)和树突状细胞(图42C)中CD73表达影响的图。
图43A-43H是显示在同基因型EMT6小鼠乳腺癌肿瘤模型中抗LAP抗体28G11-mIgG2a和20E6-mIgG2a单用以及与抗PD-1抗体联用对肿瘤体积影响的一系列图。图中显示的数据为：图43A是28G11-mIgG2a有效性的总结图和图43B是20E6-mIgG2a有效性的总结图。还显示了对照抗体(图43C)、抗体20E6-mIgG2a(图43D)、抗体28G11-mIgG2a(图43E)、抗PD-1抗体(图43F)、抗体20E6-mIgG2a和抗PD-1抗体的组合(图43G)以及抗体28G11-mIgG2a和抗PD-1抗体的组合(图43H)的肿瘤体积数据。
图44A-44D是显示抗LAP F(ab’)与人LAP-TGFβ亚型1、2和3结合的一系列Biacore图。
图45A-45D是显示抗LAP F(ab’)与人、食蟹猴、大鼠和小鼠LAP-TGFβ1结合的一系列Biacore图。
图46是显示使用20E6_mIgG2a抗体、同种型对照抗体或抗-αVβ6(10D5)抗体抑制整联蛋白(avb6)激活LAP-TGFb1的图。
具体实施方式
定义
为了容易理解以下详细描述，首先定义某些术语。全文中提供了其他定义。
在分子的活性、水平或表达的背景下，“异常”指所述活性、水平或表达超出该分子的正常活性、水平或表达。在活性、水平或表达的背景下，“正常”指健康、性别和年龄匹配的受试者人群中发现的蛋白活性、水平或表达的范围。可以使用标准统计学指标确定该健康人群的最小规模，例如，从业人员可以考虑该疾病在普通人群中的发病率以及结果中所需的统计确定性水平。优选地，针对生物标志物的活性、水平或表达的正常范围是由受试者人群(例如，至少五个、十个或二十个受试者)确定的，更优选是由至少四十个或八十个受试者群体确定的，甚至更优选是由超过100个受试者确定的。
如本文所用，“潜在相关肽”或“LAP”指人TGFβ1前体肽的氨基末端结构域，并且具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。“LAP-TGFβ1”和“LAP/TGFβ1”在本文中可以互换使用，指人TGFβ1前体肽(其包括TGFβ1细胞因子)，并且包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列(除去信号序列的Uniprot sp|P01137|TGFB1_HUMAN)。
LAP还可以指人TGFβ2前体肽(LAP区：SEQ ID NO：4，LAP-TGFβ2：SEQ ID NO：3)和人TGFβ3前体肽(LAP区：SEQ ID NO：6，LAP-TGFβ2：SEQ ID NO：5)的氨基末端结构域，以及其来自其他物种的对应物(例如，小鼠TGFβ1前体肽(小鼠LAP区：SEQ ID NO：8；小鼠LAP-TGFβ1：SEQ ID NO：7)、小鼠TGFβ2前体肽(小鼠LAP区：SEQ ID NO：10；小鼠LAP-TGFβ2：SEQ ID NO：9)和小鼠TGFβ3前体肽(小鼠LAP区：SEQ ID NO：12；小鼠LAP-TGFβ3：SEQ ID NO：11))以及其他天然存在的等位基因、剪接变体及其加工形式。LAP被合成为与TGFβ的复合物。缺乏成熟TGFβ的LAP被称为“空LAP”。除非另有说明，否则本文所用的“空LAP”指来源于人TGFβ1的N末端结构域的LAP。除了在LAP上的残基以外，本文所述的抗LAP抗体还可以与LAP-TGFβ1复合物中的成熟TGFβ的残基结合。尽管如此，在所有情况下，抗体至少结合复合物的LAP部分中的残基。
如本文所用，“游离TGFβ1”指成熟TGFβ1细胞因子，即未与LAP复合的TGFβ1。
如本文所用，“锚定蛋白”指将LAP-TGFβ锚定到细胞表面或胞外基质的蛋白。示例性锚定蛋白包括GARP、LRRC33、LTBP1、LTBP3和LTBP4。GARP和LRRC33是将LAP-TGFβ锚定到细胞表面上的蛋白，以及LTBP1、LTBP3和LTBP4是将LAP-TGFβ锚定到胞外基质上的蛋白。
如本文所用，术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。在一个实施方式中，“抗体”指包含通过二硫键互相连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。在某些天然存在的抗体中，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。在某些天然存在的抗体中，每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步分成高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。
抗体通常以高亲和性特异性结合其同源抗原，这反映在解离常数(KD)为10-5至10-11M或更低上。通常认为任何大于约10-4M的KD表示非特异性结合。如本文所用，“特异性结合”至抗原的抗体指以高亲和性结合抗原和基本上相同的抗原，这意味着具有10-7M或更低，优选地10-8M或更低，甚至更优选地5x 10-9M或更低和最优选地在10-8M和10-10M之间或更低的KD，但不以高亲和性结合至无关抗原的抗体。
如本文所用，短语抗体的“抗原结合部分”指保持与抗原(例如，人和/或小鼠LAP)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已发现抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。抗体结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可以任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但其可以使用重组方法通过合成的接头连接，所述合成的接头能够使其可以制成单一蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等，(1988)Science242：423-426；和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此类单链抗体也旨在包括在术语抗体的“抗原结合部分”范围内。使用本领域技术人员公知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。可以通过重组DNA技术活完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来生产抗原结合部分。
在本发明范围内的抗体片段还包括F(ab’)2片段，其可以通过例如胃蛋白酶对IgG的酶促切割生产。Fab片段可以通过例如使用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab’)2来生产。Fab片段是通过二硫桥连接至VH-CH1链的VL-CL链。F(ab’)2片段是两个Fab片段，其又由两个二硫桥附接。F(ab’)2分子的Fab部分包括Fc区中位于二硫桥之间的部分。
术语“受体人框架”指包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以与天然存在的人免疫球蛋白框架或人共有框架具有相同的氨基酸序列，或者其与野生型天然存在的人免疫球蛋白框架或人共有框架相比具有氨基酸序列改变。在一些实施方式中，氨基酸改变的数量是10、9、8、7、6、5、4、3或2或1。在一些实施方式中，VL受体人框架序列与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列是相同的。
“多特异性抗体”是识别两种或更多种不同抗原或表位的抗体(例如，双特异性抗体、三特异性抗体)。
如本文所用，术语“结合蛋白”还指特异性结合至至少一个靶抗原的非天然存在的(或重组的)蛋白。
“双特异性”或“双功能性抗体”是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。可以通过多种方法生产双特异性抗体，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见，例如，Songsivilai&Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。双功能性抗体包括例如异二聚体抗体缀合物(例如，每一个具有不同特异性的两个抗体或抗体片段结合在一起)、抗体/细胞表面结合分子缀合物(例如，与非抗体分子(如受体)缀合的抗体)和杂合抗体(例如，具有针对两个不同抗原的结合位点的抗体)。
术语“重组抗体”指通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体，如(a)从针对免疫球蛋白基因(例如，人免疫球蛋白基因)转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)分离的抗体或由此制备的杂交瘤，(b)从转化为表达抗体的宿主细胞中(例如，从转染瘤)重分离的抗体，(c)使用噬菌体展示，从重组组合抗体文库(例如，含有人抗体序列)中分离的抗体，和(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列(例如，人免疫球蛋白基因)剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体可以具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在某些实施方式中，然而，此类重组人抗体可以进行体外诱变，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是来源于人种系VH和VL序列并与之相关的序列，但可能不天然存在于体内的人抗体种系库中。
“人”抗体指具有可变区的抗体，所述可变区中的框架区和CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。还包含来源于人种系免疫球蛋白序列的抗体，其包含相对于野生型种系免疫球蛋白序列改变种系免疫球蛋白序列的正常体细胞超突变。
“人源化”抗体指其中非人抗体的CDR结构域外的一些、大部分或全部氨基酸由来源于人免疫球蛋白的相应氨基酸替换的抗体。在抗体人源化形式的一个实施方式中，CDR结构域外的一些、大部分或所有氨基酸由来源于人免疫球蛋白的氨基酸替换，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或全部氨基酸不变。氨基酸的任何添加、缺失、插入、置换或修饰是允许的，只要其不消除抗体结合至特定抗原的能力即可。“人源化”抗体保留类似于原始抗体的抗原特异性。
“嵌合抗体”指其中可变区来源于一个或多个物种且恒定区来源于另一物种的抗体，如其中可变区来源于小鼠抗体和恒定区来源于人抗体。参见美国专利号4,816,567；和Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad Sci.USA 81：6851-6855。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，群体中的单个抗体基本上相似并且结合一个或多个相同表位(例如，抗体表现出单一的结合特异性和亲和性)，但在单克隆抗体生产期间可能产生的可能的变体除外，此类变体通常以少量存在。
“单克隆”表示已经从基本上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不需要通过任何特定方法来生产抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指针对特定表位表现出单一结合特异性和亲和性的抗体，或者针对特定表位其中所有抗体表现出单一结合特异性和亲和性的抗体组合物。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等，(1975)Nature 256：495描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制备。还可以使用Clackson等，(1991)Nature 352：624-628和Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。
此类免疫球蛋白的抗原结合片段(包括scFv)也包含在如本文所用的术语“单克隆抗体”中。单克隆抗体是高特异性，直接针对单一抗原位点的。此外，与通常包含针对抗原上不同表位的不同抗体的常规(多克隆)抗体的制备不同的是，每种单克隆抗体均针对单一表位。可以使用任何本领域公认的技术和本文所述的那些，诸如，例如，杂交瘤方法、转基因动物、重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)，或者使用在例如美国专利号7,388,088和PCT公开号WO 00/31246中描述的技术使用噬菌体抗体文库制备单克隆抗体。单克隆抗体包括嵌合抗体、人抗体和人源化抗体，并且可以是天然存在的或重组生产的。
“结构域抗体”是仅包含重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同抗原。
“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的(见下文)。
如本文所用，术语“单链Fv”或“scFv”抗体指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在通常情况下，Fv多肽还包含多肽接头。关于sFv的综述，参见Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，vol.113，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，New York，pp.269-315。
本文中的单克隆抗体还包括骆驼化单域抗体。参见，例如，Muyldermans等，(2001)Trends Biochem.Sci.26：230；Reichmann等，(1999)J.Immunol.Methods 231：25；WO 94/04678；WO 94/25591；美国专利号6,005,079，其全部内容通过引用并入本文。一个实施方式中，本发明提供了包含两个VH结构域的单域抗体，这两个VH结构域具有修饰，以使得形成单域抗体。
如本文所用，术语“双体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在相同多肽链中(VH-VL或VL-VH)连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用非常短以使得同一链上的两个结构域之间不同配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448中对双体进行了更加详细的描述。关于工程化抗体变体的综述通常参见Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。
本发明的抗体还包括具有修饰的(或阻断的)Fc区以提供改变的效应功能的抗体。参见，例如，美国专利号5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702；Presta(2006)Adv.Drug Delivery Rev.58：640-656。此类修饰可以用于增强或抑制免疫系统的各种反应，其在诊断和治疗中可能具有有益作用。Fc区的改变包括氨基酸变化，如置换、缺失和插入，糖基化或去糖基化，以及添加多个Fc。Fc的变化可以用于改变治疗性抗体中的抗体的半衰期，且更长的半衰期将导致更不频繁的给药，以及随之而来的增加的便利性和降低的原料用量。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731 at 734-35。
术语“全人抗体”指仅包含人免疫球蛋白序列抗体。如果在小鼠中、在小鼠细胞中或在来源于小鼠细胞的杂交瘤中生产，则全人抗体可以含有小鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。
如本文所用，术语“高变区”(有时称为“可变区”)指负责抗原结合的抗体的残基。高变区包含来自在轻链可变结构域中的“互补决定区”或“CDR”(例如，残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)以及在重链可变结构域中的残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)；Kabat等，(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.)的氨基酸残基和/或来自“高变环”(即，在轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L 2)和91-96(L3)和在重链可变结构域中的26-32(L1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)的那些残基。
如本文所用，术语“框架”或“FR”残基指本文定义的高变区残基如CDR残基以外的那些可变结构域残基。上面的残基编号与Kabat编号系统有关，不一定与随附的序列表中的序列编号详细对应。还可以使用其他编号系统定义抗体中的氨基酸残基，如Chothia、增强的Chothia、IMGT、Kabat/Chothia复合系统、Honegger(AHo)、Contact或任何其他常规的抗体编号流程。
如本文所用，“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。如本文所用，“同种型”指由抗体的重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD和IgE抗体)。
“效应功能”指抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用，或由此产生的生化事件。示例性“效应功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应功能，如ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，以及细胞表面受体下调(例如，B细胞受体；BCR)。此类效应功能通常需要将Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合。
“Fc区”、“Fc结构域”或“Fc”指抗体重链的C末端区域。因此，Fc区包含除了第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)以外的抗体恒定区。
术语“表位”或“抗原决定簇”指在抗原(例如，人LAP-TGFβ1)上免疫球蛋白或抗体特异性与之结合的位点。表位既可以由连续氨基酸(通常是线形表位)形成，也可以由蛋白的三级折叠并置的不连续氨基酸(通常为构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常但不总是在暴露于变性溶剂中时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常在独特空间构型中包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸。
术语“表位作图”指鉴定涉及抗体-抗原识别的抗原上的分子决定簇的过程。用于确定给定抗体结合哪些表位的方法是本领域中熟知的，并且包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测定来自例如LAP-TGFβ1的重叠或连续的肽与给定抗体(例如，抗LAP抗体)的反应性；x射线晶体学；抗原突变分析、二维核磁共振；酵母展示；以及氢/氘交换-质谱法(HDX-MS)(参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996))。亦参见Champe等，(1995)J.Biol.Chem.270：1388-1394。
对于两种或更多种抗体，术语“结合至相同表位”指抗体结合至相同区段或氨基酸残基的相同区段，如通过给定方法所测定的。用于确定抗体是否与本文所述的抗体结合至“LAP-TGFβ1上的相同表位”的技术包括例如表位作图法，如抗原：抗体复合物的x射线分析，其提供了表位的原子分辨率，和HDX-MS。其他方法可监测抗体与抗原片段(例如，蛋白水解片段)或抗原突变变异的结合，其中由于抗原序列中氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失通常被视为表位组分的指示，如丙氨酸扫描诱变(Cunningham&Wells(1985)Science 244：1081)、突变体靶序列变体的酵母展示或嵌合体分析(例如，在实施例2和3中所描述的)。此外，还可以使用用于表位作图的计算组合法。这些方法依赖于目标抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和性分离特定短肽的能力。具有相同VH和VL或者相同CDR1、2和3序列的抗体预期结合至相同表位。
“与另一抗体竞争与靶点的结合”的抗体指(部分或完全)抑制其他抗体与靶点的结合的抗体。两种抗体是否彼此竞争结合至靶点，即一种抗体是否抑制另一抗体与靶点的结合及其抑制程度可以使用公知的结合竞争实验(例如，
Figure BDA0003108510350000231
表面等离子体共振(SPR)分析)来确定。在某些实施方式中，抗体竞争并抑制另一抗体与靶点的结合至少50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争的水平可以是不同的，这取决于哪种抗体是“阻断抗体”(即，当与抗原结合时阻断与所述抗原发生另一种免疫反应的抗体)。竞争测定可以如例如Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harb.Protoc.2006；doi：10.1101/pdb.prot4277或Ed Harlow和David Lane编辑的“Using Antibodies”中的第11章，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA 1999中所描述的来进行。竞争性抗体与相同表位、重叠表位或相邻表位结合(例如，通过空间位阻证明)。如果抗体彼此双向阻断至少50％，则两种抗体“交叉竞争”，即与在竞争实验中一种抗体或另一种抗体是否首先与抗原接触无关。
用于确定两种抗体是否竞争或交叉竞争结合的竞争性结合测定包括针对结合至表达LAP-TGFβ1的细胞的竞争，例如，通过流式细胞术测量。其他方法包括：表面等离子体共振(SPR)(例如，
Figure BDA0003108510350000232
)、固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli等，Methods in Enzymology 9：242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等，J.Immunol.137：3614(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow和Lane，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等，Mαl.Immunol.25(1)：7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等，Virology 176：546(1990))；和直接标记RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.32：77(1990))。
如本文所用，术语“特异的结合”、“选择的结合”、“选择性结合”和“特异性结合”指抗体结合至预定抗原上的表位。通常，抗体(i)当通过例如使用预定抗原作为分析物并使用抗体作为配体的表面等离子体共振(SPR)，或抗体与抗原阳性细胞的结合的Scatchard分析测定时，以约小于10-7M(如约小于10-8M、10-9M或10-10M或者甚至更低)的平衡解离常数(KD)结合，以及(ii)以比其结合至除预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的亲和性大至少两倍的亲和性结合至预定抗原。通常将大于约10-4M的任何KD视为指示非特异性结合。
如本文所用，术语“kassoc”或“ka”指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所用，术语“kdis”或“kd”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”旨在指解离常数，其获自kd与ka的比率(即，kd/ka)，且以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以使用本领域众所周知的方法来确定。用于确定抗体的KD的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统，如
Figure BDA0003108510350000241
系统或流式细胞术和Scatchard分析，或生物层干涉法。
在使用抗体的体外或体内测定的背景下，术语“EC50”指诱导最大应答的50％的应答，即最大应答与基线之间的一半的抗体浓度。
如本文所用，术语“交叉反应”指本文所述的抗体结合至来自不同物种的LAP-TGFβ1的能力。例如，本文所述的结合人LAP-TGFβ1的抗体还可以结合其他物种的LAP-TGFβ1(例如，小鼠LAP-TGFβ1、大鼠LAP-TGFβ1或食蟹猴LAP-TGFβ1)。可以通过在结合测定(例如，SPR、ELISA、生物层干涉法)中检测与纯化抗原的特定反应性或与生理学上表达LAP-TGFβ1的细胞(例如，过表达LAP-TGFβ1的HT1080细胞)的结合或其他功能性相互作用来测量交叉反应性。用于测定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如，通过生物层干涉法或流式细胞术技术。
如本文所用，术语“连接”指两个或更多个分子的结合。连接可以是共价的或非共价的。连接还可以是遗传的(即，重组融合)。此类连接可以使用诸如化学缀合和重组蛋白生产的广泛的多种本领域公认的技术来实现。
如本文所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。
如本文中涉及编码抗体或抗体片段(例如，VH、VL、CDR3)的核酸所用，术语“分离的核酸分子”旨在指一种核酸分子，其中核苷酸序列基本上不含其他基因组核苷酸序列，例如，编码结合除LAP以外的抗原的抗体的核酸分子，其中其他序列可以天然地位于人基因组DNA的核酸侧翼。
如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入其的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制原点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，可以将其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。在本文中将此类载体称为“重组表达载体”(或简称为，“表达载体”)。在通常情况下，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，还包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其具有相同的功能。
还提供了本文所示序列的“保守性序列修饰”，即，不消除由核苷酸序列编码的抗体或含有氨基酸序列的抗体与抗原结合的氨基酸序列修饰。此类保守性序列修饰包括保守性核苷酸和氨基酸置换，以及核苷酸和氨基酸添加和缺失。例如，可以通过本领域公知的标准技术(如位点定向诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本文表(例如，表34)中的序列中。保守性氨基酸置换包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。在本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选将抗LAP抗体中预测的非必需氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的另一氨基酸残基。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法是本领域众所周知的(参见，例如，Brummell等，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等，Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417(1997))。或者，在另一个实施方式中，可以沿全部或部分抗LAP抗体编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以筛选所得修饰的抗LAP抗体的结合活性。
对于核酸，术语“基本上同源性”表示当最佳比对和比较时，两个核酸或其指定序列在至少约80％的核苷酸中，通常至少约80％至85％、85％至90％或90％至95％和更优选至少约98％至99.5％的核苷酸相同，其中具有适当的核苷酸插入或缺失。或者，当区段将在选择性杂交条件下与链的互补序列杂交时，存在基本上同源性。对于多肽，术语“基本上同源性”表示当最佳比对和比较时，两个多肽或其指定序列在至少约80％的氨基酸中，通常至少约80％至85％、85％至90％、90％至95％和更优选至少约98％至99.5％的氨基酸相同，其中具有适当的氨基酸插入或缺失。
两个序列之间的同一性百分比是所述序列共享的相同位置数量的函数(即，同源性％＝相同位置数/位置总数x 100)，同时考虑了需要引入以实现两条序列的最佳比对的空位数量和每个空位的长度。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成，如在以下非限制性实例中所述的。可以使用GCG软件包(可在http://www.gcg.com获得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵，以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。还可以使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法(其已并入ALIGN程序(2.0版)中)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12和空位罚分4确定两个核苷酸或两个氨基酸序列之间的同一性百分比。此外，可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法(其已并入GCG软件包(可在http://www.gcg.com获得)的GAP程序中)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
本文所述的核酸和蛋白序列可以进一步用作“查询序列”，以对公共数据库进行检索，例如，鉴定相关序列。可以使用Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行此类检索。可以用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸检索，以获得与本文所述核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白检索，以获得与本文所述蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschu1等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指包含不天然存在于细胞中的核酸的细胞，并且可以是其中已引入重组表达载体的细胞。应当理解的是，此类术语不仅旨在指特定个体细胞，而且旨在指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，术语“抑制”指生物活性的任何统计学显著的降低，包括活性的部分和完全阻断。例如，“抑制”可以指生物活性统计学显著降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
如本文所用，“TGFβ1激活”指从由LAP和TGFβ1组成的潜在复合物释放成熟细胞因子TGFβ1。存在很多已知可诱导TGFβ1激活的机制(参见Robertson IB，RifkinDB.Unchaining the beast；insights from structural and evolutionary studies onTGFβ1 secretion，sequestration，and activation.Cytokine Growth Factor Rev.2013Aug；24(4)：355-72)。可以使用特定ELISA或类似检测方法或通过使用表达TGFβ受体的报告细胞系来检测成熟细胞因子。
例如，如本文所用，术语“抑制TGFβ1激活”包括TGFβ1激活的任何可测量的降低，例如，与对照物(例如，对照抗体)相比TGFβ1激活抑制至少约10％，例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约99％或约100％。抑制可以特异性针对TGFβ1激活的单一机制，或者可以对TGFβ1激活的所有机制普遍适用。如本文所用，术语“抑制TGFβ1激活”包括抑制至少一种激活机制。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指本文所述的治疗性或预防性措施。“治疗”方法使用向患有肿瘤或癌症的受试者或者易于患有此类疾病或病症的受试者施用本文所述的抗LAP抗体(例如，抗人LAP抗体)，以预防、治愈、延迟、减轻其严重程度或延缓所述疾病或病症或复发性疾病或病症的一种或多种症状，或者以延长受试者的存活时间使其超过在不存在此类治疗的情况下预期的存活时间。
“免疫疗法”指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法治疗罹患疾病或具有感染或经历疾病复发风险的受试者。
“免疫刺激疗法”或“免疫刺激性疗法”指导致受试者的免疫应答增加(诱导或增强)的疗法，例如，以治疗癌症。
如本文所用，“免疫细胞”指称为白血细胞的血细胞子集，其包括单核细胞，如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和粒细胞。
如本文所用，“免疫抑制性细胞”指有助于或促进免疫抑制性肿瘤微环境的细胞。肿瘤微环境中存在免疫抑制性细胞群可增加肿瘤对免疫应答的抗性，导致肿瘤保护、肿瘤逃逸和/或肿瘤转移。除非以某种方式对抗，否则这些免疫抑制性细胞能够降低免疫介导的抗癌治疗的有效性。示例性免疫抑制性细胞包括癌症相关成纤维细胞、髓系来源的抑制性细胞、调节性T细胞(Treg)、表达LAP的肿瘤细胞和免疫抑制性巨噬细胞。这些细胞类型可以由本领域技术人员使用例如鉴定Treg(例如，CD4、FoxP3、CD127和CD25)、巨噬细胞(例如，CSF-IR、CD203、CD206、CD163、IL-10和TGFβ)、癌症相关成纤维细胞(例如，α平滑肌肌动蛋白、成纤维细胞激活蛋白、腱生蛋白-C、骨膜蛋白、NG2、波形蛋白、结蛋白、PDGFRα和β、FSP-1、ASPN和STC1)和髓系来源的抑制性细胞(例如，CD11b、CD33、CD14或CD15，以及低水平HLADR)的标志物的流式细胞术鉴定。应当理解的是，免疫抑制性细胞在抑制其他疾病状态中的免疫系统方面也可能是重要的。
如本文所用，“抑制性T细胞”指有助于或促进免疫抑制性微环境的T细胞。示例性抑制性T细胞包括CD4+调节性T细胞和CD8+调节性T细胞。此类细胞可以由本领域技术人员使用例如用于鉴定诸如FoxP3、LAP或Helios的标志物的流式细胞术鉴定。
如本文所用，“调节性T细胞”或“Treg”指通常抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖的免疫抑制性细胞。Treg通常表达生物标志物CD4、FOXP3和CD25且被认为是来源于与幼稚CD4细胞相同谱系。
“T效应”(“Teff”)细胞指具有细胞溶解活性的T细胞(例如，CD4+和CD8+T细胞)，以及T辅助(Th)细胞，其分泌炎性细胞因子并激活和引导其他免疫细胞，但不包括调节性T细胞(Treg细胞)。
如本文所用，“施用”指使用本领域技术人员公知的各种方法和递送系统的任何一种，将分子(例如，结合LAP的抗体或抗原结合片段)或者包含治疗剂(例如，抗LAP抗体或抗原结合片段)的组合物以物理方式引入受试者。用于本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、腹腔内、肌内、皮下、脊椎或其他胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“胃肠外施用”指除肠和局部施用以外的施用模式，通常通过注射进行，并且包括但不限于，静脉内、腹腔内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。或者，本文所述的抗体可以通过非胃肠外途径施用，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。施用亦可以例如进行一次、多次和/或经过一个或多个延长的周期。
如本文所用，“癌症”指特征为异常细胞在体内不受控生长的广泛的一组疾病。不受调控的细胞分裂可引起恶性肿瘤或细胞的形成，所述肿瘤或细胞侵袭相邻组织并且可以通过淋巴系统或血流转移至身体的远端部分。
如本文所用，“自身免疫性疾病”描述使受试者的身体产生针对受试者的自身身体组分的功能障碍性免疫应答和副作用的疾病状态或综合征。
如本文所用，“纤维化”指由细胞外基质的异常沉积或伴有细胞外基质的异常沉积的病症或疾病状态(即，在正常器官和组织中不形成纤维化组织)。纤维化的特征在于受累组织中细胞外基质过度沉积，其通常引起破坏该组织的正常架构且引起严重的器官功能障碍。尽管各种器官中的纤维化病况具有不同病因学，但是纤维化通常由多种刺激(如慢性感染、局部缺血、过敏性和自身免疫性反应、化学损伤或放射损伤)诱导的慢性持续性炎症引起(来自Biernacka，2011Growth Factors.2011Oct；29(5)：196-202.doi：10.3109/08977194.2011.595714.Epub 2011Jul11)。纤维化可以影响心脏、肝脏、肾脏、肺脏和皮肤，并且也是很多癌症的重要特征。如本文所用，“细胞疗法”指涉及施用活细胞(例如，CAR T细胞和NK细胞)的治疗方法。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指对受试者进行的任何类型的介入或方法，或向受试者施用活性剂(例如，抗LAP抗体或抗原结合片段)，其目的在于逆转、缓解、改善、抑制或减缓或预防症状、并发症、病况或与疾病相关的生化标志的进展、发展、严重程度或复发。治疗可以是治疗患有疾病的个体或未患有疾病的个体(例如，用于预防)。
如本文所用，“辅助”或“组合”施用(共同施用)包括以相同或不同剂型同时施用药剂和/或化合物，或者单独施用化合物(例如，顺序施用)。例如，至少一种药剂包含抗LAP抗体或抗原结合片段。因此，可在单一制剂中同时施用第一抗体或抗原结合片段(例如，抗LAP抗体或抗原结合片段)以及第二、第三或更多的抗体或抗原结合片段。或者，第一和第二(或更多的)抗体或抗原结合片段可经配制以用于单独施用和同时或顺序施用。
如本文所用，“联合”疗法指以协同方式施用两种或更多种治疗剂，且包括但不限于伴随给药。特别地，联合疗法包括共同施用(例如，施用共同制剂物或同时施用单独的治疗组合物)以及连续或顺序施用，条件是在施用一种治疗剂时以某种方式调节另一种治疗剂的施用。例如，一种治疗剂可以仅在已施用不同治疗剂之后施用并使其在指定时间段内起作用。(参见，例如，Kohrt等，(2011)Blood 117：2423)。例如，可以首先施用抗LAP抗体，接着(例如，紧接着)施用第二抗体(例如，抗PD-1抗体)或抗原结合片段，或者反之亦然。在一个实施方式中，在施用第二抗体或抗原结合片段之前施用抗LAP抗体或抗原结合片段。在另一个实施方式中，与第二抗体或抗原结合片段间隔例如几分钟(例如，在约30分钟内)或至少一小时施用抗LAP抗体或抗原结合片段。此类伴随或顺序施用优选地引起两种抗体或抗原结合片段同时存在于所治疗的患者中。
将术语“有效剂量”或“有效用量”定义为足以达成或至少部分达成所需作用的量。药物(例如，抗LAP抗体或抗原结合片段)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当单独或与另一种治疗剂组合使用时，促进疾病消退(由疾病症状的最严重程度的降低、无疾病症状时段的出现率以及持续时间的增加或预防由疾病病痛引起的损伤或功能障碍证明)的药物或治疗剂的任何量。药物或治疗剂的治疗有效量或剂量包括“预防有效量”或“预防有效剂量”，其为当单独或与另一种治疗剂组合向具有产生疾病或罹患疾病复发的风险的受试者施用时，抑制所述疾病的发展或复发的药物或治疗剂的任何量。治疗剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力可使用本领域技术人员公知的各种方法(如在临床试验期间在人类受试者中，在预测在人体内的有效性的动物模型系统中，或通过在体外测定中测定药剂的活性)来评价。
根据本文中所提供的方法中任一者的有效量的单独的抗LAP抗体或抗原结合片段或抗LAP抗体或抗原结合片段与另一种化合物或药剂(例如，免疫检查点阻断剂，如抗PD-1抗体)的组合物的施用可产生至少一种治疗作用，包括例如降低肿瘤生长或尺寸，降低随着时间的推移而呈现的癌症标志(例如，转移性病灶)的数量、完全缓解、部分缓解或病情稳定。例如，治疗方法产生比在不施用抗LAP抗体或抗原结合片段的情况下所实现或比在施用组合抗体中的任一者的情况下所实现更好的类似临床获益率(CBR＝完全缓解(CR)+部分缓解(PR)+病情稳定(SD)持续≥6个月)，例如，临床获益率的改善为约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
作为实例，对于肿瘤的治疗，与未经治疗的受试者相比，药物或治疗(例如，抗LAP抗体或抗原结合片段)的治疗有效量或剂量抑制肿瘤细胞生长达至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少超过70％、至少约80％或至少约90％。在一些实施方式中，药物或治疗剂的治疗有效量或剂量完全抑制细胞生长或肿瘤生长，即，抑制细胞生长或肿瘤生长达100％。可使用本文所述的测定评价化合物或治疗剂(包括抗体)抑制肿瘤生长的能力。或者，可通过检查组合物抑制细胞生长的能力来评价包含化合物或治疗剂的组合物的该性质；此类抑制可通过由本领域技术人员公知的测定在体外测量这种抑制。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本文所述的方法和组合物可以用于治疗患有癌症的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、猫、犬、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
术语“样品”指从患者或受试者获得的组织、体液或细胞(或前述中任何一者的一部分)。通常，将从患者取出组织或细胞，但也涵盖体内诊断。在实体瘤的情况下，组织样品可以获自以手术方式取出的肿瘤并且通过常规技术制备用于检测。在淋巴瘤和白血病的情况下，可获得并适当地制备淋巴细胞、白血病细胞或淋巴组织(例如，来自血液的白血病细胞)。其他样品，包括尿液、泪液、血清、血浆、脑脊液、粪便、痰、细胞提取物等也可用于特定癌症。
如本文所用，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括性或开放式的，且不排除其他未列出的要素或方法步骤。如本文所用，“由......组成”排除所主张要素中未规定的任何要素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由......组成”不排除不会实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。在本文的每个实例中，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任何一个都可以任选地被其他两个术语中的任何一个代替，从而描述了本主题范围的替代方面。本文说明性地描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素，一个或多个限制的情况下适宜地实践。
如本文所用，除非上下文以其他方式明确规定，否则单数形式的“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。除非另外陈述，否则“或”或“和”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括/包含(including)”以及其他形式，如“包括/包含(include、includes和included)”的使用不具有限制性。
如本文所用，当指代可测量的值(如量、时距等)时，术语“约”涵盖了距离指定值最多土10％的变化。除非另有说明，否则本文中使用的表示成分数量、性质(如分子量、反应条件等)的所有数字应理解为由术语“约”修饰。
如本文所用，“和/或”应视为两种指定特征或组分中的每一者在存在或不存在另一者的情况下的特定公开。因此，如在诸如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”包括“A和B”、“A或B”、仅“A”和仅“B”。类似地，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”包括以下中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；仅A；仅B；和仅C。
如本文所用，术语“ug”或“uM”分别与“μg”和“μM”互换使用。
在以下小节中将进一步详细描述本文所述的各个方面。
I.抗LAP抗体
在一个方面中，本文提供了一种分离的抗LAP抗体(即，结合指LAP的抗体)或其抗原结合片段。
在一个方面中，本文提供了一种分离的抗LAP抗体(例如，重组人源化、嵌合或人抗体)或其抗原结合片段，其包含：
(a)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：16、26和18的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：19、20和21的氨基酸序列；
(b)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：16、27和18的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：19、20和21的氨基酸序列；
(c)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：16、28和18的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：19、20和21的氨基酸序列；
(d)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：16、29和18的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：19、20和21的氨基酸序列；
(e)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：16、30和18的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：19、20和21的氨基酸序列；
(f)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、55和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(g)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、64和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(h)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、65和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(i)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、66和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(j)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、67和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(k)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、55和68的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(1)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、55和69的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(m)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、55和70的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(n)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、66和68的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列；
(o)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、111和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列；
(p)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、120和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列；
(q)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、121和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列；
(r)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、122和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列；
(s)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、123和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列；
(t)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、124和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列；
(u)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、125和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列；
(v)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、126和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列；
(w)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：162、163和164的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：165、166和167的氨基酸序列；
(x)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：162、172和164的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：165、166和167的氨基酸序列；
(y)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：162、173和164的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：165、166和167的氨基酸序列；
(z)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：162、174和164的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：165、166和167的氨基酸序列；
(aa)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：162、174和164的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：165、166和167的氨基酸序列；
(ab)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：162、176和164的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：165、166和167的氨基酸序列；
(ac)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：162、177和164的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：165、166和167的氨基酸序列；
(ad)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：162、178和164的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：165、166和167的氨基酸序列；
(ae)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：179、180和181的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：182、183和184的氨基酸序列；或
(af)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：179、189和181的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：182、183和184的氨基酸序列；
(ag)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：179、190和181的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：182、183和184的氨基酸序列；
(ah)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：179、191和181的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：182、183和184的氨基酸序列；
(ai)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：179、192和181的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：182、183和184的氨基酸序列；
(aj)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：179、193和181的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：182、183和184的氨基酸序列；
(ak)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：179、194和181的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：182、183和184的氨基酸序列；
(al)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：179、195和181的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：182、183和184的氨基酸序列；
(am)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：225、226和227的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：228、229和230的氨基酸序列；
(an)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：225、226和227的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：228、229和230的氨基酸序列；
(ao)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：225、232和227的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：228、229和230的氨基酸序列；或者
(ap)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：225、233和227的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：228、229和230的氨基酸序列。
在一些实施方式中，抗LAP抗体(例如，重组人源化、嵌合或人抗体)或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：16、17和18的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：19、20和21的氨基酸序列，除了其中所述重链可变区(对应于SEQ ID NO：17的位置7)的位置56是N以外的氨基酸(例如，Q、S、H、L、D)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、S、H、L、D)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体(例如，重组人源化、嵌合或人抗体)或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、55和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列，除了其中所述重链可变区的位置54(对应于SEQ IDNO：55的位置5)是N以外的氨基酸(例如，Q、A、H、S)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、A、H、S)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体(例如，重组人源化、嵌合或人抗体)或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、55和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列，除了其中所述重链可变区的位置102(对应于SEQID NO：56的位置4)是D以外的氨基酸(例如，A、E、G)或者被D以外的氨基酸残基(例如，A、E、G)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体(例如，重组人源化、嵌合或人抗体)或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：54、55和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：57、58和59的氨基酸序列，除了其中所述重链可变区的位置54(对应于SEQ IDNO：55的位置5)是N以外的氨基酸(例如，Q、A、H、S)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、A、H、S)置换以外，以及其中所述重链可变区的位置102(对应于SEQ ID NO：56的位置4)是D以外的氨基酸(例如，A、E、G)或者被D以外的氨基酸残基(例如，A、E、G)置换。
在一些实施方式中，抗LAP抗体(例如，重组人源化、嵌合或人抗体)或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：110、111和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：113、114和115的氨基酸序列，除了其中所述重链可变区的位置54(对应于SEQ ID NO：111的位置5)是N以外的氨基酸(例如，Q、G、A、S、H、L、D)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、G、A、S、H、L、D)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体(例如，重组人源化、嵌合或人抗体)或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：162、163和164的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：165、166和167的氨基酸序列，除了其中所述重链可变区的位置56(对应于SEQ ID NO：163的位置7)是N以外的氨基酸(例如，Q、G、A、S、H、L、D)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、G、A、S、H、L、D)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体(例如，重组人源化、嵌合或人抗体)或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：179、180和181的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：182、183和184的氨基酸序列，除了其中所述重链可变区的位置55(对应于SEQ ID NO：180的位置6)是N以外的氨基酸(例如，Q、G、A、S、H、L、D)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、G、A、S、H、L、D)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体(例如，重组人源化、嵌合或人抗体)或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：225、226和227的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO：228、229和230的氨基酸序列，除了其中所述重链可变区的位置55(对应于SEQ ID NO：226的位置5)是D以外的氨基酸(例如，G、A、E)或者被D以外的氨基酸残基(例如，G、A、E)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上(a)-(ap)子部分中任何一个的重链CDR序列，以及恒定区，例如，人IgG恒定区(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体)。在一些实施方式中，恒定区是包含SEQ ID NO：196中所示的氨基酸序列的人IgG1恒定区。在一些实施方式中，恒定区是包含SEQ ID NO：197中所示的氨基酸序列的变体人IgG4恒定区。在一些实施方式中，包含以上(a)-(ap)子部分中任何一个的重链CDR序列的重链可变区可以连接至恒定结构域以形成重链(例如，全长重链)。类似地，包含以上(a)-(ap)子部分中任何一个的轻链CDR序列的轻链可变区可以连接至恒定区以形成轻链(例如，全长轻链)。全长重链(C末端赖氨酸(K)除外，或C末端甘氨酸和赖氨酸(GK)可能不存在或被除去除外)和全长轻链组合以形成全长抗体。
在另一个方面中，本文提供了一种分离的抗LAP抗体，其包含：
(a)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：42和52；
(b)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：40和52；
(c)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：35和46；
(d)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：35和50；
(e)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：101和104；
(f)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：98和104；
(g)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：92和104；
(h)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：92和106；
(i)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：95和104；
(j)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：77和104；
(k)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：82和104；
(1)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：87和104；
(m)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：133和154；
(n)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：130和154；
(o)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：127和154；
(p)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：144和154；
(q)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：146和154；
(r)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：148和154；
(s)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：150和154；或者
(t)重链可变区序列和轻链可变区序列，其分别包含SEQ ID NO：218和154。
在一些实施方式中，抗LAP抗体具有其中除去潜在责任位点(例如，去酰胺化位点和/或异构化位点)的可变区序列。
因此，在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上(a)-(d)子部分中任何一个的重链可变区序列和轻链可变区序列，除了其中所述重链可变区的位置56是N以外的氨基酸(例如，Q、S、H、L、D)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、S、H、L、D)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上(e)-(1)子部分中任何一个的重链可变区序列和轻链可变区序列，除了其中所述重链可变区的位置54是N以外的氨基酸(例如，Q、A、H、S)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、A、H、S)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上(e)-(1)子部分中任何一个的重链可变区序列和轻链可变区序列，除了其中所述重链可变区的位置102是D以外的氨基酸(例如，A、E、G)或者被D以外的氨基酸残基(例如，A、E、G)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上(e)-(1)子部分中任何一个的重链可变区序列和轻链可变区序列，除了其中所述重链可变区的位置54是N以外的氨基酸(例如，Q、A、H、S)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、A、H、S)置换以外，并且其中所述重链可变区的位置102是D以外的氨基酸(例如，A、E、G)或者被D以外的氨基酸残基(例如，A、E、G)置换。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上(m)-(t)子部分中任何一个的重链可变区序列和轻链可变区序列，除了其中所述重链可变区的位置54是N以外的氨基酸(例如，Q、G、A、S、H、L、D)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、G、A、S、H、L、D)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含重链和/或轻链可变区序列，其与以上任一个子部分(a)-(t)的重链和/或轻链可变区具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方式中，以上任一子部分(a)-(t)的重链和/或轻链可变区序列具有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸取代(例如，保守性氨基酸取代)。在一些实施方式中，抗LAP抗体不具有分别与SEQ ID NO：22和23；分别与60和61；分别与116和117；分别与168和169；或者分别与185和186具有同一性的重链可变区序列和轻链可变区序列。可以使用本文中(例如，在实施例中)所述的测定法和动物模型检测这些抗LAP抗体的临床上有利的各种性质(例如，结合至LAP-TGFβ1、抑制TGFβ1激活、结合至各种细胞(例如，免疫细胞)群、在体内抑制肿瘤生长)。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上任一个子部分(a)-(t)的重链可变区序列以及恒定区，例如，人IgG恒定区(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体)。在一些实施方式中，恒定区是包含SEQ ID NO：196中所示的氨基酸序列的人IgG1恒定区。在一些实施方式中，恒定区是包含SEQ ID NO：197中所示的氨基酸序列的变体人IgG4恒定区。在一些实施方式中，包含以上(a)-(t)子部分中任何一个的重链可变区序列可以连接至恒定结构域以形成重链(例如，全长重链)。类似地，包含以上(a)-(t)子部分中任何一个的轻链可变区可以连接至恒定区以形成轻链(例如，全长轻链)。全长重链(C末端赖氨酸(K)除外，或C末端甘氨酸和赖氨酸(GK)可能不存在或被除去除外)和全长轻链组合以形成全长抗体。
因此，在一些实施方式中，本文提供了抗LAP抗体，其包含(a)重链CDR1-3序列，其分别包含SEQ ID NO：225、231和227，和轻链CDR1-3序列，其分别包含SEQ ID NO：228、229和230，(b)重链CDR1-3序列，其分别包含SEQ ID NO：225、232和227，和轻链CDR1-3序列，其分别包含SEQ ID NO：228、229和230，或者(c)重链CDR1-3序列，其分别包含SEQ ID NO∶225、233和227，和轻链CDR1-3序列，其分别包含SEQ ID NO：228、229和230。
在一些实施方式中，本文提供了抗体，其包含分别包含(a)SEQ ID NO：234和224，(b)SEQ ID NO：235和224或者(c)SEQ ID NO：236和224的重链可变区序列和轻链可变区序列。
在一些实施方式中，本文提供了抗LAP抗体，其包含分别包含(a)SEQ ID NO：237和222，(b)SEQ ID NO：238和222或者(c)SEQ ID NO：239和222的重链序列和轻链序列。
在另一个方面中，本文提供了分离的抗LAP抗体，其包含：
(a)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：43和53；
(b)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO∶45和53；
(c)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：41和53；
(d)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：36和47；
(e)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：37和47；
(f)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：36和51；
(g)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：37和51；
(h)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：102和105；
(i)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：103和105；
(j)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：99和105；
(k)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：100和105；
(1)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：93和105；
(m)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：94和105；
(n)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：93和107；
(o)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：94和107；
(p)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：96和105；
(q)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：97和105；
(r)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：78和105；
(s)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：79和105；
(t)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：83和105；
(u)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO∶84和105；
(v)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO∶88和105；
(w)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：89和105；
(x)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：134和155；
(y)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：135和155；
(z)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：131和155；
(aa)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：132和155；
(ab)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：128和155；
(ac)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：129和155；
(ad)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：145和155；
(ae)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：147和155；
(af)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：149和155；
(ag)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：151和155；
(ah)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：219和155；或者
(ai)重链序列和轻链序列，其分别包含SEQ ID NO：220和155。
在一些实施方式中，全长重链缺乏C末端赖氨酸残基(其可能不存在或被除去)。
在一些实施方式中，抗LAP抗体具有其中除去潜在责任位点(例如，去酰胺化位点和/或异构化位点)的重链序列和轻链序列。
因此，在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上任一个子部分(a)-(g)的重链序列和轻链序列，除了所述重链的位置56是N以外的氨基酸(例如，Q、S、H、L、D)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、S、H、L、D)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上任一个子部分(h)-(w)的重链序列和轻链序列，除了所述重链的位置54是N以外的氨基酸(例如，Q、A、H、S)或者被N、H或S以外的氨基酸残基(例如，Q、A、H、S)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上任一个子部分(h)-(w)的重链序列和轻链序列，除了所述重链的位置102是D以外的氨基酸(例如，A、E、G)或者被D以外的氨基酸残基(例如，A、E、G)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上任一个子部分(h)-(w)的重链序列和轻链序列，除了所述重链的位置54是N以外的氨基酸(例如，Q、A、H、S)或者被N、H或S以外的氨基酸残基(例如，Q、A、H、S)置换以及所述重链可变区的位置102是D以外的氨基酸(例如，A、E、G)或者被D以外的氨基酸残基(例如，A、E、G)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含以上任一个子部分(x)-(ai)的重链序列和轻链序列，除了所述重链的位置54是N以外的氨基酸(例如，Q、G、A、S、H、L、D)或者被N以外的氨基酸残基(例如，Q、G、A、S、H、L、D)置换以外。
在一些实施方式中，抗LAP抗体包含重链和/或轻链序列，其与以上任一个子部分(a)-(ai)的重链和/或轻链序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％同一性。在一些实施方式中，以上任一子部分(a)-(ai)的重链和/或轻链序列具有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸取代(例如，保守性氨基酸取代)。在一些实施方式中，抗LAP抗体不具有分别与SEQ ID NO：24和25；62和63；或者118和119具有同一性的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。可以使用本文中(例如，在实施例中)所述的测定法和动物模型检测这些抗LAP抗体的临床上有利的各种性质(例如，结合至LAP-TGFβ1、抑制TGFβ1激活、结合至各种细胞(例如，免疫细胞)群、在体内抑制肿瘤生长)。
在一些实施方式中，包含分别为SEQ ID NO：110、120和113的VHCDR1-3序列和分别为SEQ ID NO：113、114和115的VLCDR1-3序列的抗LAP抗体或抗原结合片段在CDR或可变区中具有一个或多个氨基酸取代。例如，在一些实施方式中，在六个重链和轻链CDR(总共)或两个重链和轻链可变区(总共)中不超过3个氨基酸(即，1、2或3个氨基酸)被取代。
在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段相对于GYTFTSYWMH(SEQ ID NO：110)包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换(例如，保守性氨基酸置换)的VHCDR1。
在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段相对于RIDPQSGGIK(SEQ ID NO：120)包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换(例如，保守性氨基酸置换)的VHCDR2。在一些实施方式中，VHCDR2包含序列：RX1X2X3X4X5X6X7X8X9，其中X1-X9可以是任何氨基酸。在一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：120的氨基酸序列在X1-X9中仅1个位置被置换。
在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段相对于WDYGGYFDV(SEQ ID NO：112)包含具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸置换(例如，保守性氨基酸置换)的VHCDR3。在一些实施方式中，VHCDR3包含序列：WX1YGGYFX2X3(SEQ ID NO：242)，其中X1-X3可以是任何氨基酸。在一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：112的氨基酸序列在X1-X3中仅1个位置被置换。
在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段相对于RASQDITNYL(SEQ ID NO：113)包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸置换(例如，保守性氨基酸置换)的VLCDR1。在一些实施方式中，VLCDR1可以包含序列：RX1X2X3DIX4X5YX6X7，其中X1-X7是任何氨基酸。在一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：113的氨基酸序列在X1-X7中仅1个位置被置换。
在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段相对于YTSRLHS(SEQ ID NO：114)包含具有1、2、3、4、5、6或7个氨基酸置换(例如，保守性氨基酸置换)的VLCDR2。在一些实施方式中，VLCDR2包含序列：YX1X2RX3X4X5，其中X1-X5是任何氨基酸。在一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：114的氨基酸序列在X1-X5中仅1个位置被置换。
在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段相对于QQGDTLPWT(SEQ ID NO：115)包含具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸置换(例如，保守性氨基酸置换)的VLCDR3。在一些实施方式中，VLCDR3可以包含序列：QQGDX1LPWT(SEQ ID NO：243)，其中X1是任何氨基酸。
在下文中更详细地描述了本文提供的抗LAP抗体或抗原结合片段的功能性特征。
在一些实施方式中，在不存在锚定蛋白的情况下，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至LAP-TGFβ1(例如，人LAP-TGFβ1)。例如，在不包括锚定蛋白的测定中，本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段结合指重组人LAP-TGFβ1。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段以100nM或更低，如90nM或更低、80nM或更低、70nM或更低、60nM或更低、50nM或更低，如40nM或更低、30nM或更低、20nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、3nM或更低、1nM或更低、0.9nM或更低、0.8nM或更低、0.7nM或更低、0.6nM或更低、0.5nM或更低、0.4nM或更低、0.3nM或更低、0.2nM或更低、0.1nM或更低、10nM至0.1nM、5nM至0.1nM、3nM至0.1nM、1nM至0.1nM、0.8nM至0.1nM、0.5nM至0.1nM、10nM至0.5nM、10nM至0.8nM、10nM至1nM、1nM至0.5nM或者1nM至0.8nM的KD结合至LAP-TGFβ1(例如，可溶的LAP-TGFβ1)，如通过例如生物层干涉法(例如，如实施例1中所述的)所评估的，或如通过Octet或BIACore所确定的。在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段以本文实施例中的KD结合至LAP-TGFβ1(例如，人、食蟹猴和大鼠)。在各种实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至人LAP-TGFβ1、大鼠LAP-TGFβ1、食蟹猴LAP-TGFβ1和/或小鼠LAP-TGFβ1。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至与免疫抑制性细胞上的锚定蛋白复合的LAP-TGFβ1，但不结合至锚定蛋白。在一些实施方式中，锚定蛋白是GARP或LRRC33。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段选择性抑制免疫抑制性细胞上的TGFβ1激活，但不抑制胞外基质上的TGFβ1激活。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段不结合至与LTBP1、LTBP3和/或LTBP4复合的LAP。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段不结合至LAP-TGFβ2(例如，人LAP-TGFβ2)和LAP-TGFβ3(例如，人LAP-TGFβ3)，如通过例如使用过表达TGFβ2或TGFβ3的细胞的流式细胞术，或使用重组LAP-TGFβ2或LAP-TGFβ3的生物层干涉法所评估的。例如，在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段以不显著高于在对照抗体(例如，同种型对照)情况下发现的信号或在不存在抗LAP抗体的情况下(例如，如在实施例2中所述的)发现的信号的信号或亲和性结合至LAP-TGFβ2或LAP-TGFβ3。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段抑制TGFβ1激活，如通过例如在过表达LAP-TGFβ1的P3U1细胞培养物中对游离TGFβ1的ELISA检测所评估的。在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段抑制(或测定为抑制)TGFβ1激活达到约50％或更高，例如约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多或者约90％或更多，如通过ELISA(例如，在过表达LAP-TGFβ1的P3U1细胞培养物中对游离TGFβ1的ELISA检测(如，在实施例4中所述的))所评估的。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至小鼠和人LAP-TGFβ1，如通过例如激活的免疫细胞群的流式细胞术所评估的。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段不结合至游离TGFβ1(即，无LAP的TGFβ1)，如通过例如ELISA所评估的。在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段不结合至空LAP(例如，未与TGFβ1复合的LAP)，如通过例如生物层干涉法所评估的。例如，在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段以不显著高于在对照抗体(例如，同种型对照)的情况下发现的信号或在不存在抗LAP抗体的情况下发现的信号(例如，如在实施例2中所述的)的信号或亲和性结合至游离TGFβ1或空。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至包含K27C和Y75C突变的人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：12)。在另一个实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段不结合至(或测定为不结合至)包含Y74T突变的人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：13)。在另一个实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至(或测定为结合至)包含Y27C和Y75C突变的人LAP-TGFβ1，但不结合至包含Y74T突变的LAP-TGFβ1。
在一些实施方式中，抗LAP抗体结合至人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的残基82-130的全部或一部分。
在一些实施方式中，抗LAP抗体在人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的残基82-130内结合。在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段结合至人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)上的一个或多个区域，其包含或由氨基酸31-40、274-280和340-343组成。在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段结合至人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的氨基酸31-40、274-280和340-343。在一些实施方式中，表位是通过cryo-EM确定的。
在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段结合至人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)上的一个或多个区域，其包含或由氨基酸31-38、278-281和342-344组成。在一些实施方式中，抗LAP抗体结合至人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的氨基酸31-38、278-281和342-344。在一些实施方式中，表位是通过cryo-EM确定的。在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段结合至人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)上的一个或多个区域，其包含或由氨基酸35-43、272-275、280-283和340(SEQ ID NO：1)组成。在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段结合至人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的氨基酸35-43、272-275、280-283和340。在一些实施方式中，表位是通过cryo-EM确定的。
如上文所讨论的，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至细胞上的LAP-TGFβ1，如免疫细胞，例如，免疫抑制性细胞。免疫抑制性细胞包括但不限于抑制性T细胞(例如，调节性T细胞、激活的T细胞、抑制性CD8+T细胞)、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、树突状细胞、调节性B细胞、粒细胞性MDSC和/或单核细胞性MDSC，如例如通过流式细胞术评估的。在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至免疫细胞以外的细胞，如肿瘤细胞、成纤维细胞(包括癌症相关成纤维细胞)、间充质基质细胞、间充质干细胞、造血干细胞、无髓鞘雪旺细胞、成肌纤维细胞、内皮细胞、血小板、巨核细胞、周细胞和/或肝星状细胞。在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至免疫细胞(例如，免疫抑制性细胞)和非免疫细胞上的LAP-TGFβ1。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至GARP阳性细胞(例如，GARP阳性免疫抑制性细胞)上的LAP-TGFβ1。在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至(或测定为结合至)GARP阴性细胞(例如，GARP阴性免疫抑制性细胞)上的LAP-TGFβ1。在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至GARP阳性和GARP阴性细胞上的LAP-TGFβ1，如例如通过流式细胞术所评估的。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段降低CD73的内源性表达。在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段抑制由治疗(例如，放射)引起的CD73表达增加。可以使用本领域公知的标准方法(例如，如在实施例16中所述的)确定CD73的表达。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段以1000ng/ml或更低、500ng/ml或更低、200ng/ml或更低、150ng/ml或更低、100ng/ml或更低、50ng/ml或更低、25ng/ml或更低、10ng/ml或更低、5ng/ml或更低、2ng/ml或更低、1ng/ml至200ng/ml，1ng/ml至150ng/ml、1ng/ml至100ng/ml、1ng/ml至50ng/ml、1ng/ml至25ng/ml、1ng/ml至10ng/ml或1ng/ml至5ng/ml的EC50结合至细胞上表达的LAP-TGFβ1(例如，在例如P3U1细胞上表达的人或小鼠LAP-TGFβ1)，如通过流式细胞术所测量的(例如，在实施例2中所述的)。
还可以通过流式细胞术使用定量免疫荧光来定义抗LAP抗体或抗原结合片段与LAP-TGFβ1的结合，其允许对每个细胞结合的抗体分子的数量进行定量。因此，在一些实施方式中，结合至亦表达GARP的细胞的抗LAP抗体的数量可以等于结合至该细胞的抗GARP抗体的数量，或者可以是结合至所述细胞的抗GARP抗体的数量的至少80％、至少50％、至少20％、至少10％、至少5％、至少1％或至少0.1％。在一些实施方式中，可以使用检测大部分LAP分子的群中的抗LAP抗体，使用定量免疫荧光来定量以每个细胞计的表达的LAP-TGFβ1分子的数量；此类抗体的实例包括2F8、2C9、16B4和抗LAP单克隆抗体#27232(R&DSystems)。在一些实施方式中，结合至细胞的抗LAP抗体的数量可以等于所述细胞上LAP分子的数量，或者可以是在该细胞上表达的LAP分子的数量的至少80％、至少50％、至少20％、至少10％、至少5％、至少1％或至少0.1％。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段与对照物(例如，对照抗体)相比抑制TGFβ1激活达例如，10％或更多，例如，20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多或95％或更多，如通过ELISA所测量的(例如，如在实施例4中所述的)。
优选地，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段以高亲和性，例如以10-7M或更低、10-8M或更低、10-9M或更低、10-10M或更低、10-11M或更低、10-12M或更低、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M或10-9M至10-7M的KD结合至可溶性LAP-TGFβ1，如通过生物层干涉法所测量的(例如，如在实施例1中所述的)。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段不结合至胞外基质中的LAP-TGFβ1。例如，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段不结合至胞外基质中的LAP-TGFβ1，如通过ELISA测量的，其中抗体或抗原结合片段结合的O.D.信号不显著高于在不存在本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段的情况下发现的信号或在对照抗体(例如，同种型对照)情况下发现的信号(例如，如在实施例5中所述的)。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段不抑制在ECM中的TGFβ激活，如通过例如在组合ECM中的LAP-TGFβ1来源(例如，如在实施例5中所述的)与MMP-2、MMP-9、血小板反应蛋白或表达αVβ6或αVβ8整联蛋白的细胞的测定中的游离TGFβ1的ELISA检测所评估。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至血小板上的LAP-TGFβ1。例如，在一些实施方式中，可以通过流式细胞术，通过抗LAP抗体的结合(例如，以比在同种型对照抗体情况下所发现更高的程度显示信号)来检测至少5％、至少10％、至少20％或至少50％的血小板(例如，如在实施例6中所述的)。在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至血小板，但不引起血小板聚集或血小板脱颗粒。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至免疫细胞，例如，抑制性T细胞(例如，调节性T细胞)、M2巨噬细胞、单核细胞性MDSC、CD11b阳性细胞和/或树突状细胞。例如，在一些实施方式中，可以通过流式细胞术，通过抗LAP抗体的结合(例如，以比在同种型对照抗体的情况下所发现更高的程度显示信号)来检测至少0.5％、至少1％、至少2％、至少5％、至少7％、至少10％、至少20％或至少50％的这些细胞类型(例如，如在实施例7中所述的)。在一些实施方式中，如果本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段的结合比同种型对照高≥2标准差，则认为其结合至这些细胞类型。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段结合至GARP阴性白细胞。例如，在一些实施方式中，可以通过流式细胞术测量，通过抗LAP抗体的结合(例如，以比在同种型对照抗体的情况下所发现更高的程度显示信号)来检测至少0.5％、至少1％、至少2％、至少5％、至少7％、至少10％、至少20％或至少50％的GARP阴性白细胞(例如，如在实施例7中所述的)。
显示出上文所述的功能性性质中的一种或多种(例如，生物化学、免疫化学、细胞、生理学或其他生物活性)的抗体或抗原结合片段，如使用本领域公知的和本文所述的方法所确定的，将被理解为与在不存在抗体的情况下(例如，或当存在具有无关特异性的对照抗体时)所发现相比的特定活性的统计学显著差异相关。优选地，抗LAP抗体诱导所测量的参数的增加可实现所测量的参数的至少10％，更优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(即，2倍)、3倍、5倍或10倍的统计学显著性增加。而相反的是，抗LAP抗体诱导所测量的参数(例如，TGFβ1激活)的降低可实现至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的统计学显著性降低。
本文还提供了与本文中所述的任何抗LAP抗体结合至人LAP-TGFβ1上的相同表位的抗LAP抗体。这些抗体具有与本文中所述的任何抗LAP抗体交叉竞争结合至人LAP-TGFβ1的能力。在一些实施方式中，抗LAP抗体结合人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO：1)的残基82-130内的一个或多个氨基酸。
本文中所公开的抗体包括所有已知的抗体形式以及具有抗体样性质的其他蛋白骨架。例如，抗体可以是人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、免疫缀合物、嵌合抗体或具有抗体样性质的蛋白支架，如纤连蛋白或锚定蛋白重复。
在一些实施方式中，抗体是双特异性抗体，其包含第一结合区和第二结合区，其中所述第一结合区包含本文所述的抗LAP抗体的结合特异性(例如，抗原结合区)，和不结合至LAP的第二结合区。在一些实施方式中，第二结合区结合至在血小板上不表达的蛋白。
抗体还可以是Fab、F(ab’)2、scFv、AFFIBODY、avimer、纳米抗体、单链抗体或结构域抗体。抗体也可以具有任何同种型，包括以下同种型中的任一者：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。全长抗体可以使用标准重组DNA技术和核酸由VH和VL序列制备，所述核酸编码与可变区序列可操作地连接的所需恒定区序列。
在某些实施方式中，本文所述的抗体可以具有效应功能，或者可以具有降低的或不具有效应功能。在某些实施方式中，抗LAP抗体包含效应子减少的或大部分效应子减少的Fc，例如，IgG2或IgG4。在通常情况下，本文所述的可变区可连接至包含一种或多种修饰的Fc，通常以改变抗体的一种或多种功能性性质，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗体依赖性细胞毒性。此外，本文所述的抗体可以经化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分附接至抗体)或经修饰以改变其糖基化，以改变抗体的一种或多种功能性性质。在下文中进一步详细描述了这些实施方式中的每一个。在Fc区中的残基编号是Kabat的EU索引下的编号。
在一些实施方式中，Fc区是变体Fc区，例如，与亲本Fc序列(例如，未经修饰的Fc多肽，其接着被修饰以产生变体)相比经修饰(例如，通过氨基酸置换、缺失和/或插入)的Fc序列，以提供所需结构特征和/或生物活性。例如，可在Fc区中进行修饰以产生满足以下条件的Fc变体：(a)具有增加或降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(b)增加或降低的补体介导的细胞毒性(CDC)，(c)具有增加或降低的针对C1q的亲和性和/或(d)与亲本Fc相比具有增加或降低的针对Fc受体的亲和性。此类Fc区变体将通常在Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。认为将氨基酸修饰组合是特别理想的。例如，变体Fc区可以在其中包括例如本文中鉴定的特定Fc区位置的两个、三个、四个、五个等置换。
变体Fc区还可以包含其中涉及二硫键形成的氨基酸被除去或被其他氨基酸置换的序列变化。此类除去可以避免与用于产生本文中所述的抗体的宿主细胞中存在的其他含有半胱氨酸的蛋白的反应。即使当除去半胱氨酸残基时，单链Fc结构域仍可形成非共价地保持在一起的二聚Fc结构域。在其他实施方式中，可以对Fc区进行修饰以使其与所选择的宿主细胞更相容。例如，可以除去典型天然Fc区的N末端附近的PA序列，所述序列可以由E.coli中的消化酶(如脯氨酸亚氨基肽酶)识别。在其他实施方式中，可以除去Fc结构域内的一个或多个糖基化位点。通常糖基化的残基(例如，天冬酰胺)可以赋予细胞溶解应答。可以将此类残基缺失或使用未糖基化的残基(例如，丙氨酸)取代。在其他实施方式中，可以从Fc区除去涉及与补体相互作用的位点，如C1q结合位点。例如，可以缺失或取代人IgG1的EKK序列。在某些实施方式中，可以除去影响结合至Fc受体的位点，优选除清道夫受体结合位点以外的位点。在其他实施方式中，可以对Fc区进行修饰以除去ADCC位点。ADCC位点是本领域公知的；关于IgG1中的ADCC位点，参见，例如，Molec.Immunol.29(5)：633-9(1992)。例如，在PCT公开号WO 97/34631和WO96/32478中公开了变体Fc结构域的特定实例。
在一个实施方式中，对Fc的铰链区进行修饰，以使得在铰链区中半胱氨酸残基的数量被改变，例如，增加或减少。在Bodmer等的美国专利号5,677,425中进一步描述了这种方法。更具体地，将一种或多种氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，以是的抗体对葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合减弱。在Ward等的美国专利号6,165,745中进一步描述了这种方法。
在另外其他实施方式中，通过使用不同氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基改变Fc区，以改变抗体的一种或多种效应功能。例如，可以使用不同氨基酸残基替代选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸，以使得抗体针对效应配体具有改变的亲和性，但保持亲本抗体的抗原结合能力。亲和性改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。在Winter等的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述了这种方法。在另一个实例中，选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸可以被不同氨基酸残基替代，以使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在Idusogie等的美国专利号6,194,551中进一步详细描述了这种方法。在另一个实例中，在氨基酸位置231和239中的一个或多个氨基酸残基被改变，从而改变抗体固定补体的能力。在Bodmer等的PCT公开号WO 94/29351中进一步详细描述了这种方法。
在又一个实例中，可以对Fc区进行修饰以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或以增加针对Fcγ受体的亲和性，通过在下述位置的一个或多个氨基酸的修饰：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。示例性置换包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。示例性变体包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F/324T。用于增强FcvR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于置换298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I和396L。在Stroh1，2009，Current Opinion in Biotechnology20：685-691中综述了这些和其他修饰。
对于增加结合至Fcγ受体的Fc修饰包括在Fc区的下述氨基酸位置的任何一个或多个的氨基酸修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中在Fc区中的残基的编号是如Kabat(PCT专利公开号WO00/42072)中的EU索引的编号。
可以对Fc进行的其他Fc修饰是降低或消除结合至FcγR和/或补体蛋白的那些，从而降低或消除Fc介导的效应功能，如ADCC、ADCP和CDC。示例性修饰包括但不限于在位置234、235、236、237、267、269、325和328的置换、插入和缺失，其中根据EU索引进行编号。示例性置换包括但不限于234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L和328R，其中根据EU索引进行编号。Fc变体可以包含236R/328R。用于降低FcγR与补体相互作用的其他修饰包括置换297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P和234V，以及位置297处的糖基化通过突变或酶促方式除去或通过在不使蛋白糖基化的生物体(如细菌)中产生来除去。在Strohl，2009，Current Opinion in Biotechnology20：685-691中综述了这些和其他修饰。任选地，Fc区可以在本领域技术人员公知的其他和/或替代性位置处包含非天然存在的氨基酸残基(参见，例如，美国专利号5,624,821；6,277,375；6,737,056；6,194,551；7,317,091；8,101,720；PCT专利公开号WO00/42072；WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO05/070963；WO 05/040217，WO 05/092925和WO 06/020114)。
还可以使用增强对抑制性受体FcγRIIb的亲和性的Fc变体。此类变体可以提供具有与FcγRIIb+细胞(包括例如B细胞和单核细胞)相关的免疫调节活性的Fc融合蛋白。在一个实施方式中，与一种或多种活化受体相比，Fc变体提供选择性增强的对FcγRIIb的亲和性。用于改变与FcγRIIb的结合的修饰包括一个或多个在选自以下的位置的修饰：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332，根据EU索引。用于增强FcyRIIb亲和性的示例性置换包括但不限于234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。示例性置换包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。用于增强结合至FcγRIIb的其他Fc变体包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E和267E/328F。
在某些实施方式中，抗体被修饰以增加其生物半衰期。各种方法均是可能的。例如，这可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和性来进行。例如，可以使下述残基的一个或多个突变：252、254、256、433、435、436，如在美国专利号6,277,375中所述的。特定示例性置换包括下述中的一个或多个：T252L、T254S和/或T256F。或者，为增加生活半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体以含有清道夫受体结合表位，其来自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环，如在Presta等的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述的。增加结合至FcRn和/或改善药代动力学性质的其他示例性变体包括在位置259、308、428和434的置换，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。增加Fc结合至FcRn的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等，2004，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216，Hinton等，2006Journal of Immunology 176：346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、31 1A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等，Journal of Biological Chemistry，2001，276(9)：6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等，Journal of Immunology，2002，169：5171-5180，Dall′Acqua等，2006，Journal of Biological Chemistry281：23514-23524)。在Yeung等，2010，J Immunol，182：7663-7671中描述了用于调节FcRn结合的其他修饰。在某些实施方式中，可以使用具有特定生物学特征的杂交IgG同种型。例如，可以通过用两个同种型不同的位置上的IgG3氨基酸取代CH2和/或CH3区域中的IgG1位置来构建IgG1/IgG3杂合变体。因此，可以构建包含一个或多个置换的杂合变体IgG抗体，例如，274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R和436F。在本文所述的其他实施方式中，可以通过用两个同种型不同的位置上的IgG1氨基酸取代CH2和/或CH3区域中的IgG2位置来构建IgG1/IgG2杂合变体。因此，可以构建包含一个或多个置换的杂合变体IgG抗体，例如，一个或多个下述氨基酸置换：233E、234L、235L、-236G(指在位置236处的甘氨酸的插入)和327A。
此外，在人IgG1上针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经定位，并且已描述了具有改善的结合的变体(参见Shields，R.L.等，(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。已证实在位置256、290、298、333、334和339的特异性突变改善与FcγRIII的结合。此外，已证实下述组合突变改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A，已证实其显示出增强的FcγRIIIa结合和ADCC活性(Shields等，2001)。已鉴定出具有显著增加的与FcγRIIIa的结合的其他IgG1变体：包括具有S239D/I332E和S239D/1332E/A330L突变的变体，其显示出针对FcγRIIIa最大增加的亲和性，FcγRIIb结合的降低和在食蟹猴中较强的细胞毒活性(Lazar等，2006)。将三重突变引入诸如阿伦单抗(CD52特异性)、曲妥珠单抗(HER2/neu特异性)、利妥昔单抗(CD20特异性)和西妥昔单抗(EGFR特异性)的抗体中转化为体外ADCC活性极大增强，并且S239D/I332E变体在猴中显示出增强的耗竭B细胞的能力(Lazar等，2006)。此外，已鉴定出在B细胞恶性肿瘤和乳腺癌模型中在表达人FcγRIIIa的转基因小鼠中的含有L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L突变的IgG1突变体，其显示出与FcγRIIIa的结合增强以及伴随增强的ADCC活性(tavenhagen等，2007；Nordstrom等，2011)。可以使用的其他Fc突变体包括：S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L和M428L/N434S。
当使用IgG4恒定结构域时，通常优选地包括置换S228P，其模拟IgG1中的铰链序列并且从而使IgG4分子稳定。
在另外其他实施方式中，抗体的糖基化被修饰。例如，可以制备非糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化，以例如提高抗体对抗原的亲和性。可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成此类碳水化合物修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点处的糖基化。此类非糖基化可以提高抗体对抗原的亲和性。在Co等的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步线性描述了此类方法。通过将N297残基突变为其他残基(例如，N297A)和/或通过突变相邻氨基酸(例如，298)来阻止N297上的恒定区糖基化，从而降低在N297上的糖基化。
另外或或者，可以制备糖基化类型改变的抗体，如岩藻糖基量减少的低岩藻糖基化抗体或二等分GlcNac结构增加的抗体。已证明此类改变的糖基化模式能够增加抗体ADCC的能力。可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现此类碳水化合物的修饰。现有技术中已经描述了具有改变的糖基化机制的细胞，并且可以用作在其中表达本文所述的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，在Hanai等的EP 1,176,195中描述了一种具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，使得此类细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖基化。Presta的PCT公开号WO 03/035835描述中了一种变体CHO细胞系Lec13细胞，其具有降低的使岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力，亦导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(亦参见Shields，R.L.等，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。在Umana等的PCT公开号WO 99/54342中描述了一种工程化以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII))的细胞系，以使得在工程化的细胞系中表达的抗体显示出增加的二分GlcNac结构，其导致抗体的ADCC活性增加(亦参见Umana等，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。
本文中所述抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以对抗体进行聚乙二醇化以例如增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体发生聚乙二醇化，通常使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(如PEG的反应性酯或醛衍生物)在使一个或多个PEG基团附接至抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在包含已用于衍生化其他蛋白的任何一种PEG形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方式中，聚乙二醇化的抗体是去糖基化抗体。用于聚乙二醇化蛋白的方法是本领域公知的，并且可应用于本文所述的抗体中。参见例如，Nishimura等的欧洲专利号EP 0 154 316和Ishikawa等的欧洲专利号EP 0 401 384。
可以通过本领域公知的各种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)确定Fc区与其配体的亲和性和结合性质，包括但不限于平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))，或动力学(例如，BIACORE分析)，以及其他方法，如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和层析(例如，凝胶过滤)。这些和其他方法可以利用所检测组分的一个或多个上的标记和/或使用多种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。对结合亲和性和动力学的详细描述可以参见Paul，W.E.，ed.，Fundamental Immunology，4th Ed.，Lippincott-Raven，Philadelphia(1999)，其聚焦于抗体-免疫原相互作用。
II.与抗LAP抗体结合至相同表位或交叉竞争的抗体
可以使用免疫接种方案产生与本文所公开的抗体结合至相同或相似表位(并且因此也与本文所公开的抗体交叉竞争)的抗LAP抗体。可以针对与人LAP-TGFβ1的高亲和性结合来筛选所得抗体。然后，可以例如在其中在酵母细胞表面上存在LAP-TGFβ1序列变体的酵母展示测定中或通过氢氘交换实验来研究所选择的抗体，以确定抗体结合的确切表位。
还可以使用嵌合构建体(例如，LAP-TGFβ1的鸡-人嵌合体)产生与本文所述的抗LAP抗体结合至相同表位的抗体。由于可以将人和鸡的序列组合以产生正确折叠的LAP-TGFβ1蛋白(如在实施例2中所述的)，因而可以将该方法用于产生针对LAP-TGFβ1上的目标特异性表位的免疫原。通过这种策略，将从鸡LAP-TGFβ1获得大部分序列，其具有在含有所需表位的区域中插入的人LAP-TGFβ1的小片段。可以使用这种策略靶向的LAP-TGFβ1上的示例性表位包括例如LAP-TGFβ1的下臂、LAP-TGFβ1的潜伏套索或包含人LAP-TGFβ1的氨基酸82-130的表位。在实施例3中描述了示例性鸡-人嵌合体构建体。可以将该嵌合蛋白用于免疫鸡以产生单克隆抗体。由于鸡LAP-TGFβ1将被识别为自身，因而免疫应答将集中于人序列上。可以使用本领域公知的标准方法(例如，本文所述的方法)针对各种功能/性质(例如，结合至LAP-TGFβ1、抑制TGFβ1激活、结合至ECM、结合至细胞(如免疫抑制性细胞))检测使用该方法产生的抗体。
可以使用本领域公知的方法确定与抗体结合的表位。如果抗LAP抗体例如满足以下条件，则认为其与参照抗LAP抗体结合至相同表位：与参照抗体接触人LAP-TGFβ1上的一个或多个相同残基；与参照抗体接触人LAP-TGFβ1的至少一个区域内的一个或多个相同残基；与参照抗体接触人LAP-TGFβ1的至少一个区域内的大部分残基；与参照抗体接触人LAP-TGFβ1的各区域内的大部分残基；与参照抗体接触沿人LAP-TGFβ1的整个长度的大部分相同残基；与参照抗体接触人LAP-TGFβ1的所有相同的独特区域；与参照抗体接触人LAP-TGFβ1上的任一区域处的所有相同残基；或与参照抗体接触人LAP-TGFβ1的所有相同区域处的所有相同残基。
用于确定与本文所述的抗LAP抗体结合至“人LAP-TGFβ1上的相同表位”的抗体的技术包括抗原-抗体复合物的晶体x射线分析，其提供了所述抗原的原子分辨率。其他方法监测抗体与抗原片段的结合或抗原的突变变异，其中由于抗原序列内的氨基酸修饰而导致的结合丧失表明表位组分。方法也可以依赖于目标抗体从组合噬菌体展示肽文库或靶蛋白的蛋白酶消化物中亲和分离特定短肽(天然三维形式或变性形式)的能力。然后，将肽视为对应于用于筛选肽文库的抗体表位定义的前导。对于表位作图，亦已开发了已证实可定位构型不连续表位的计算算法。
还可以通过针对结合至一系列跨域人LAP-TGFβ1的重叠肽进行筛选来鉴定表位或包含所述表位的区域。或者，可以将Jespers et al.(1994)Biotechnology 12：899的方法用于指导具有与本文所述的抗LAP抗体相同的表位且因此具有与本文所述的抗LAP抗体类似性质的抗体的选择。使用噬菌体展示，首先，将抗LAP抗体的重链与(例如，人)轻链文库配对，以选择LAP结合抗体，然后将新的轻链与(例如，人)重链文库配对，以选择与本文所述的抗LAP抗体具有相同表位或表位区域的(例如，人)LAP结合抗体。或者，可以通过将编码抗体的重链和轻链的cDNA序列诱变获得本文所述抗体的变体。
还可以采用丙氨酸扫描诱变，如Cunningham&Wells(1989)Science244：1081所描述的，或LAP-TGFβ1中氨基酸残基的一些其他形式的点诱变，来确定抗LAP抗体的功能性表位。
还可以通过评估抗体与包含LAP-TGFβ1片段的肽的结合来确定与特异性抗体结合的表位或表位区域(“表位区域”是包含表位或与表位重叠的区域)。可以合成一系列涵盖LAP-TGFβ1序列的重叠肽，且例如在直接ELISA、竞争性ELISA(其中评估肽阻止抗体与结合至微量滴定板的孔的LAP-TGFβ1结合的能力)中或在芯片上筛选其结合性。此类肽筛选方法可能无法检测一些不连续的功能性表位。
还可以通过基于MS的蛋白足迹法(如HDX-MS和蛋白的快速光化学氧化(FPOP))、结构方法(如X射线晶体结构测定)、分子建模和核磁共振光谱法来鉴定表位。
还可以将单一粒子低温电子显微法(SP-Cryo-EM)用于鉴定抗体结合的表位。SP-Cryo-EM是一种用于大分子结构分析的技术，其使用高强度电子束，在低温下，在生物样本的天然环境中对其进行成像。近年来，SP-cryo-EM已称为晶体学和NMR的补充技术，用于测定适宜用于药物研发应用的近原子水平结构(Renaud等，Nat Rev Drug Discov2018；17：471-92；Scapin等，Cell Chem Biol 2018；25：1318-25；Ceska等，Biochemical SocietyTransactions 2019：p.BST20180267)。除了高分辨率信息以外，SP-Cryo-EM具有允许进入更大和更复杂的生物系统的额外优点，以及表征来自相同样品的多重构型或组成解析状态的可能性，提供对更多大分子的生物相关状态的深入研究。为了进行成像，将小体积的样品(例如，3μl等分试样)应用到网格上并在液态乙烷浴中急骤冷冻。然后，将冷冻网格装载到显微镜中，并收集网格的不同区域的数百至数千个影像。这些图像含有生物大分子(颗粒)的二维投影：使用数学工具和GPU驱动的算法，鉴定、提取粒子并进行分类；在后续步骤中，使用不同类别计算一个或多个3D重构，如果其共存在相同样本中，则对应于不同构型、寡聚或结合状态。然后，可将单个重构精确至高分辨率。
III.核酸分子
本文还提供了编码本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段的核酸分子。核酸可存在于全细胞中、在细胞裂解物中或以部分纯化或基本上纯化的形式存在。本文所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或可以不含内含子序列。在某些实施方式中，核酸是cDNA分子。可以使用标准分子生物学技术获得本文所述的核酸。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备杂交瘤，如下文中进一步描述的)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体轻链和重链的eDNA可以通过标准PCR扩增或eDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库(例如，使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从文库回收编码抗体的核酸。
在一些实施方式中，本文提供了编码本文中所述的抗LAP抗体或抗原结合片段中的任一者的VH和/或VL序列或者重链和/或轻链序列的核酸分子。本文涵盖包含本文所述的核苷酸序列(例如，核酸分子)的宿主细胞。一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，例如，以将可变区基因转化成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白(如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段。如在本上下文中所用的，术语“可操纵地连接”旨在指两个DNA片段连接，以使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框架中。
可以通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的另一分子可操作地连接将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域公知的(参见例如，Kabat，E.A.等，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH公开号91-3242)并且可以通过标准PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。
可以通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可操纵地连接将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域公知的(参见例如，Kabat，E.A.等，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH公开号91-3242)并且可以通过标准PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是K或λ恒定区。
本文还提供了具有保守性置换的核酸分子，所述保守性置换在核酸分子翻译后不改变所得氨基酸序列。
IV.生产方法
可以使用本领域公知的多种技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或其组合。
用于制备本文所述的单克隆抗体的各种方法是本领域可用的。例如，可以使用由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法或其任何改进版本或通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)来制备单克隆抗体。例如，可以使用杂交瘤技术制备单克隆抗体，包括本领域公知以及在例如Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，2nd ed.，1988)；Hammer-ling等，Monoclona1Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述参考文献的全部内容通过引用并入)中教导的那些。用于使用杂交瘤技术生产和筛选特定抗体的方法是本领域中常规且熟知的。在另一个实例中，还可以使用本领域公知的各种噬菌体展示方法产生用于本文所述的方法和组合物中的抗体，如从使用在McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)中所述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离。Clackson等Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离小鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链混排(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为用于重构非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))产生高亲和性(例如，nM范围)人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
可以通过本领域公知的多种方法制备人抗体，包括上文所述的噬菌体展示方法，其使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库。亦参见，美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开号WO 98/46645、WO98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO96/33735和WO 91/10741，其全部内容通过引用并入本文。还可以使用转基因小鼠生产人抗体，所述转基因小鼠表达人免疫球蛋白基因，并且在免疫接种后能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完全的人抗体库。对于用于生产人抗体的这种技术的综述，参见，Lonberg和Huszar，1995，Int.Rev.Immunol.13：65-93。亦可使用噬菌体展示技术(McCafferty等Nature 348：552-553(1990))从来自未经免疫共同的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库体外生产人抗体和抗体片段。还可以通过体外活化的B细胞产生人抗体(参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其全部内容通过引用并入本文)。可以使用称为“指导选择”的技术来产生识别选择的表位的完全人抗体。在这种方法中，所选择的非人单克隆抗体(例如，小鼠抗体)用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等，1994，Bio/technology 12：899-903)。
可以基于小鼠单克隆抗体的序列制备嵌合抗体。可以从目标小鼠杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准分子生物学技术将其改造成含有非小鼠(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了制备嵌合抗体，可以使用本领域公知的方法将小鼠可变区连接至人恒定区(参见例如，Cabilly等的美国专利号4,816,567)。
抗LAP抗体的嵌合形式(例如，小鼠抗LAP抗体的人源化形式)是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体通常是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的CDR或高变区的残基被来自诸如具有所需特异性、亲和性和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的非人物种(供体抗体)的CDR或高变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应非人残基替换。人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中未被发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体性能。在通常情况下，人源化抗体将包含基本上全部至少一个且通常是两个可变结构域，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环且全部或基本上全部FR区域是人类免疫球蛋白共有需要的FR区域。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。对于其他细节，参见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
人源化抗体的框架区和CDR区不必精确对应于亲本序列，例如，供体抗体CDR或共有框架可通过至少一个氨基酸残基的置换、插入和/或缺失来进行进行诱变，以使得该位点处的CDR或框架残基无法刚好对应于供体抗体或共有框架。如本文所用，术语“共有框架”指在共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”指由相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如，Winnaker，From Genes to Clones(Veriagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987))。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的各个位置由该家族中最频繁出现在该位置上的氨基酸占据。若两个氨基酸同样频繁地出现，则共有序列中可包括任一个。如本文所用，“Vernier区”指如Foote和Winter(1992，J.Mol.Biol.224：487-499，其通过引用并入本文)所述的，可调节CDR结构并微调与抗原的配合度的框架残基的子集。Vernier区残基形成在CDR下面且可影响CDR结构和抗体亲和性的层。可用作受体的人免疫球蛋白(Ig)序列是本领域熟知的。
在人框架区中的框架残基可以被来自CDR供体抗体的相应残基置换，以改变，优选地改善抗原结合。这些框架置换是通过本领域熟知的方法鉴定的，例如，通过使CDR与框架残基相互作用建模，以鉴定对于抗原结合而言重要的框架残基，并进行序列比较以鉴定特定位点处的异常框架残基。(参见例如，Queen等，美国专利号5,585,089；Riechmann等，Nature 332：323(1988)，其全部内容通过引用并入本文。)通常可以获得三维免疫球蛋白模型，并且其是本领域技术人员熟悉的。可以使用说明且显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构型结构的计算机程序。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从共有序列和导入序列中选择FR残基并进行组合，从而获得所需的抗体特征，如针对一个或多个靶抗原的增加的亲和性。在通常情况下，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。可以使用本领域公知的多种技术将抗体人源化，其包括但不限于在Jones等，Nature321：522(1986)；Verhoeyen等，Science 239：1534(1988)，Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901(1987)，Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993)，Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，ProteinEngineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS 91：969-973(1994)；PCT公开号WO91/09967、PCT/：US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246、EP592，106；EP 519,596、EP 239,400、美国专利号5,565,332、5,723，323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539；4,816,567中描述的那些，其每一个通过引用整体并入本文。
可以使用本领域公知和在实施例中所述的方法(如本领域公知的蛋白-蛋白结合测定、生物化学筛选测定、免疫测定和基于细胞的测定)，使用上文所述的方法检测所产生的抗LAP抗体的所需功能，如特定结合特异性、结合亲和性、靶细胞群。本发明的一个方面提供了一种分子，其可以用于筛选结合LAP、包含LAP的复合物和/或包含LAP-TGFβ1的复合物的抗体或抗原结合片段。例如，表4中的分子(即，具有SEQ ID NO：1和198-210中任一项的氨基酸序列的分子)用于筛选或确定至少一种结合蛋白的结合。在各种实施方式中，在表4(即，具有SEQ ID NO：1和198-210中任一项的氨基酸序列的分子)和表6(即，具有SEQ IDNO：211-213中任一项的氨基酸序列的分子)中的至少一种分子用于筛选或确定至少一种抗体或抗原结合片段的结合。
示例性测定包括但不限于免疫沉淀或体外结合测定，如放射免疫测定(RIA)、FACS、酶联免疫吸附测定(ELISA)、生物层干涉法(例如，ForteBio测定)和Scatchard分析。
抗体工程化
还包括其中抗LAP抗体或其抗原结合片段是工程改造的抗体以包括对亲本单克隆抗体的可变结构域内的框架残基的修饰(例如，以改善抗体或片段的性质)的实施方式。通常地，产生此类框架修饰以降低抗体或片段的免疫原性。这通常通过以下实现：将亲本(例如，啮齿动物)抗体或片段中的可变结构域中的非CDR残基(即，框架残基)替换为来自待使用抗体的物种的免疫库的类似残基，例如，在人治疗剂的情况下是人残基。将此类抗体或片段称为“人源化”抗体或片段。在一些情况下，需要增加工程化(例如，人源化)抗体的亲和性或改变特异性。一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。更具体地，已经历体细胞突变的抗体或片段可以含有不同于获得抗体的种系序列的框架残基。可以通过将抗体或片段序列与获得抗体或片段的种系序列进行比较鉴定此类残基。另一种方法是在工程化(例如，人源化)抗体的一个或多个位置处恢复成原始亲本(例如，啮齿动物)残基，例如，以恢复可能在替代框架残基的过程中丧失的结合亲和性。(参见，例如，美国专利号5,693,762、美国专利号5,585,089和美国专利号5,530,101。)
在某些实施方式中，对抗LAP抗体及其抗原结合片段进行工程化(例如，人源化)以在框架和/或CDR中包含修饰，以改善其性质。此类工程化的改变可以基于分子建模。可以构建亲本(非人)抗体序列的可变区的分子模型以理解抗体的结构特征并用于鉴定能够与抗原相互作用的抗体上的潜在区域。常规CDR基于免疫球蛋白序列的比对和鉴定可变区。Kabat等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest；Kabat等，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，等5版；NIH公开号91-3242；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等，(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616。Chothia及其同事仔细检查了抗体晶体结构中环的构象，并提出了高变环。Chothia等，(1987)JMol.Biol.196：901-917或Chothia等，(1989)Nature 342：878-883。分类为“CDR”和“高变环”的区域之间存在变化。随后的研究(Raghunathan等，(2012)J.Mol Recog.25，3，103-113)分析了若干抗体-抗原晶体复合物并发现抗体中的抗原结合区未必严格地符合“CDR”残基或“高变”环。非人抗体可变区的分子模型可用于指定可能与抗原结合的区域的选择。实际上，基于模型的潜在抗原结合区不同于常规的“CDR”或“高变”环。可以将诸如MOE(Chemical Computing Group)的商业化的科学软件用于分子建模。可以基于在框架和CDR中与非人序列的最佳匹配来选择人框架。对于VH中的FR4(框架4)，将人种系的VJ区与相应非人区域进行比较。在VL中的FR4(框架4)的情况下，将人种系的J-κ和J-λ区与相应非人区域进行比较。一旦鉴定了适宜的人框架，就将CDR移植到选择的人框架中。在一些情况下，可以在非人(亲本)序列中保留VL-VH界面中的一些残基。还可以将分子模型用于鉴定能够潜在地改变CDR构型并因此改变与抗原的结合的残基。在一些情况下，这些残基作为非人(亲本)序列保留。还可以将分子模型用于鉴定暴露于溶剂的氨基酸，这些氨基酸可能导致不良影响，如糖基化、脱酰胺和氧化。可以在设计阶段早期就引入可开发性过滤器，以消除/最小化这些潜在问题。
框架修饰的另一种类型涉及将框架区内或者甚至在一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变，以除去T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也被称为“去免疫”，并且在美国专利号7,125,689中进一步详细描述。
在特定实施方式中，为了提供最终抗体更大的化学稳定性，以避免脱酰胺或异构化，将含有暴露的侧链的氨基酸改变为另一氨基酸残基可能是理想的。天冬酰胺的脱酰胺作用可能发生在NG、DG、NG、NS、NA、NT、QG或QS序列上，并导致异天冬氨酸残基的产生，该残基将纽结(kink)引入多肽链并降低其稳定性(异天冬氨酸作用)。异构化可以出现在DG、DS、DA或DT序列。在某些实施方式中，本公开内容的抗体不含有脱酰胺或天冬酰胺异构化位点。例如，可以将天冬酰胺(Asn)残基改变为Gln或Ala，以降低在任何Asn-Gly序列(特别是CDR内)形成异天冬酰胺的可能性。
类似问题可能出现在Asp-Gly序列。Reissner和Aswad(2003)Cell.Mol.LifeSci.60：1281。异天冬氨酸的形成可能会使抗体与其靶抗原的结合变弱或完全消除。参见，Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731至734。
在各种实施方式中，将天冬酰胺变成谷氨酰胺(Gln)。改变与天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)残基邻近的氨基酸以降低脱酰胺的可能性也可能是理想的，当小氨基酸在天冬酰胺或谷氨酰胺邻近出现时，脱酰胺以更大速率发生。参见，Bischoff&Kolbe(1994)J.Chromatog.662：261。此外，在CDR中的任何甲硫氨酸残基(通常溶剂暴露的Met)可以改变为Lys、Leu、Ala或Phe或其他氨基酸以降低甲硫氨酸的硫氧化的可能性，硫氧化能够降低抗原结合亲和性并且还有助于在最终抗体制备中的分子异质性。同上。此外，为了阻止或最小化潜在的易裂Asn-Pro肽键，可能需要将CDR中发现的任何Asn-Pro组合改变为Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。随后筛选具有此类置换的抗体，以确保所述置换不会将所述抗体对LAP的亲和性或特异性，或其他所需的生物学活性降至不可接受的水平。针对示例性稳定化CDR变体参见表1A。
表1A：示例性稳定化CDR变体
Figure BDA0003108510350000621
Fc区的抗体工程化
还可以对本文公开的抗体(例如，人源化抗体)及其抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式和抗体28G11及其人源化形式)进行工程化以在Fc区内包含修饰，通常以改变抗体的一种或多种性质，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或效应功能(例如，抗原依赖性细胞毒性)。此外，可以对本文公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式)进行化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分附接至抗体)或修饰以改变其糖基化，再次改变抗体或片段的一种或多种性质。在下文中进一步详细描述了这些实施方式的每一个。在Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引的编号。
本文公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式)还包括具有修饰(或阻断)的Fc区的抗体和片段，以提供改变的效应功能。参见，例如，美国专利号5,624,821；和PCT公开号WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。可以将此类修饰用于增强或抑制免疫系统的各种反应，其在诊断和治疗中可能具有有益作用。Fc区的改变包括氨基酸改变(置换、缺失和插入)、糖基化或去糖基化以及添加多个Fc区。Fc的改变还可能改变在治疗抗体中抗体的半衰期，实现较不频繁的给药以及因此便利性并降低物质的用量。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731，734-35。
在一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式)是在重链恒定区的铰链区对应于位置228的位置处包含丝氨酸至脯氨酸突变(S228P；EU索引)的IgG4同种型抗体或片段。已报道该突变消除铰链区中重链间二硫桥的异质性(Angal等，见上文；位置241基于Kabat编号系统)。
在本发明的一个实施方式中，对CH1的铰链区进行修饰，以使得在交联区中半胱氨酸残基的数量增加或减少。在美国专利号5,677,425中进一步描述了这种方法。改变CH1铰链区中半胱氨酸残基的数量，例如，以促进轻链和重链的组装或者提高或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方式中，本发明抗体或抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式和抗体22F9及其人源化形式)的Fc铰链区被突变以缩短抗体或片段的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域重，以使得抗体或片段对葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言减弱。在美国专利号6,165,745中进一步详细描述了这种方法。
在另一个实施方式中，对本发明抗体或抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式和抗体20E6及其人源化形式)进行修饰以延长其生物半衰期。各种方法都是可能的。例如，可以引入下述突变重的一个或多个：T252L、T254S、T256F，如在美国专利号6,277,375中描述的。或者，为了延长生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体以包含来自IgG的Fc区CH2结构域的两个环的清道夫受体结合表位，如在美国专利号5,869,046和6,121,022中所描述的。
在另外其他实施方式中，通过使用不同氨基酸残基代替至少一个氨基酸残基改变Fc区，以改变抗体或抗原结合片段的一个或多个效应功能。例如，可以使用不同氨基酸残基代替选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸，以使得抗体针对效应配体具有改变的亲和性并保持亲本抗体的抗原结合能力。亲和性改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。在美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述了这种方法。
在另一个实例中，可以使用不同氨基酸残基代替选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸，以使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在美国专利号6,194,551重进一步详细描述了这种方法。
在另一个实例中，在氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基被改变，从而改变抗体固定补体的能力。在PCT公开号WO 94/29351中进一步详细描述了这种方法。
在又一个实例中，通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以降低本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式和抗体20E6及其人源化形式)介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或降低抗体或片段对Fcγ受体的亲和性：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。在PCT公开号WO 00/42072中对这种方法进行了进一步描述。此外，人IgG1上针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已被定位，并且已描述了具有改善的结合的变体(参见，Shields等，(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。
在本发明的一个实施方式中，通过修饰残基243和264对Fc区进行修饰以降低本发明的抗体(例如，抗体20E6及其人源化形式)介导效应功能的能力和/或提高抗炎性质。在一个实施方式中，通过将在位置243和264的残基变成丙氨酸对抗体或片段的Fc区进行修饰。在一个实施方式中，通过修饰残基243、264、267和328对Fc区进行修饰，以降低抗体或片段介导效应功能的能力和/或提高抗炎性质。
改变的效应功能
在一些实施方式中，对抗LAP抗体的Fc区进行修饰以增加或降低抗体或抗原结合片段介导效应功能的能力和/或增加/降低其与Fcγ受体(FcγR)的结合。
据信抗原结合蛋白的恒定区与包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)在内的各种Fc受体(FcR)之间的相互作用介导抗原结合蛋白的效应功能，如ADCC和CDC。Fc受体对于抗体交联也是重要的，抗体交联对于抗肿瘤免疫而言是重要的。
可以以多种方式测量效应功能，包括例如通过FcγRIII与自然杀伤细胞的结合，或通过FcγRI与单核细胞/巨噬细胞的结合，以测量ADCC效应功能。例如，可以在自然杀伤细胞测定中针对ADCC的效应功能对本发明的抗原结合蛋白进行评估。此类测定的实例可以参见Shields等，2001J.Biol.Chem.，Vo1.276，p 6591-6604；Chappel等，1993J.Biol.Chem.，Vol268，p 25124-25131；Lazar等，2006PNAS，103；4005-4010。
已证实在残基Asn297上含有特定突变或改变的糖基化的人IgG1恒定区与Fc受体的结合降低。在其他情况下，也证实了突变增强ADCC和CDC(Lazar等，PNAS 2006，103；4005-4010；Shields等，J Biol Chem2001，276；6591-6604；Nechansky等，Mol Immunol，2007，44；1815-1817)。
在本发明的一个实施方式中，此类突变在选自239、332和330(IgG1)的一个或多个位置中，或者在其他IgG同种型的同等位置中。适宜突变的实例是S239D和I332E和A330L。在一个实施方式中，本文所述本发明的抗原结合蛋白在位置239和332突变，例如S239D和I332E，或者在一个进一步的实施方式中，其在选自239和332和330的三个或更多个位置突变，例如S239D和I332E和A330L。(EU索引编号)。
在本发明的一个替代实施方式中，提供了一种抗体，其包含具有改变的糖基化性质的重链恒定区，以使得抗原结合蛋白具有增强的效应功能。例如，其中所述抗体具有增强的ADCC或增强的CDC或者其中其具有增强的ADCC或CDC效应功能。在PCT公开号WO2003011878和WO2006014679以及欧洲专利号EP1229125中描述了生产具有改变的糖基化性质的抗原结合蛋白的适宜方法学的实例。
在一个进一步的方面中，本发明提供了“非岩藻糖基化”或“去岩藻糖基化”抗体。非岩藻糖基化抗体具有无岩藻糖残基的Fc的复合型N-聚糖的三甘露糖基核心结构。由于FcγRIIIa结合能力增强，因而缺乏来自Fc N-聚糖的核心岩藻糖残基的这些糖基工程化抗体显示出与岩藻糖基化等效物相比更强的ADCC。
本发明还提供了一种用于制备根据本发明的抗体的方法，其包括以下步骤：a)培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含如本文所述的分离的核酸，其中所述重组细胞不包含α-1，6-岩藻糖基转移酶；和b)回收抗原结合蛋白。重组宿主细胞通常可能不含有编码α-1，6-岩藻糖基转移酶的基因(例如，酵母宿主细胞，如毕赤酵母属)或者可能已被基因修饰以使得α-1，6-岩藻糖基转移酶失活。已被基因修饰以使得编码α-1，6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因失活的重组宿主细胞是可获得的。参见，例如，可以从BioWa，Inc.(Princeton，N.J.)获得的POTELLIGENTTM技术系统，其中缺乏FUT8基因的功能性拷贝的CHOK1SV细胞生产与在具有功能性FUT8基因的细胞中生产的相同单克隆抗体相比具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性的单克隆抗体。在美国专利号US7214775和US6946292以及PCT公开号WO0061739和WO0231240中描述了POTELLIGENTTM技术系统的方面。本领域技术人员将知晓其他适合的系统。
将对本领域技术人员显而易见的是，此类修饰不仅可以单独使用，而且可以彼此之间组合使用，以进一步增强或降低效应功能。
具有修饰的糖基化的抗体的制备
在又一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式)包含特定糖基化模式。例如，可以制备去岩藻糖基化或去糖基化抗体或片段(即，分别缺乏岩藻糖或糖基化的抗体)。可以改变抗体或片段的糖基化模式例如以增加抗体或片段对LAP抗原的亲和性或亲合力。可以通过例如改变抗体或片段序列内的一个或多个糖基化位点实现此类修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，导致除去一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除在该位点的糖基化。此类去糖基化可以增加抗体或片段对抗原的亲和性或亲合力。参见，例如，美国专利号5,714,350和6,350,861。
本文公开的抗体和抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式和抗体28G11及其人源化形式)可以进一步包括在低等真核生物宿主细胞中生产的那些，特别是真菌宿主细胞，如酵母和丝状真菌已被基因工程化以生产具有哺乳动物或人样糖基化模式的糖蛋白(参见例如，Choi等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100：5022-5027；Hamilton等，(2003)Science 301：1244-1246；Hamilton等，(2006)Science 313：1441-1443；Nett等，Yeast 28(3)：237-52(2011)；Hamilton等，Curr Opin Biotechnol.Oct；18(5)：387-92(2007))。这些基因修饰的宿主细胞与目前使用的哺乳动物细胞系相比的一个特别的优点是能够控制在细胞中生产的糖蛋白的糖基化性质，以使得可产生其中特定N-聚糖结构占优势的糖蛋白组合物(参见，例如，美国专利号7,029,872和美国专利号7,449,308)。已将这些基因修饰的细胞用于生产主要具有特定N-聚糖结构的抗体(参见，例如，Li等，(2006)Nat.Biotechnol.24：210-215)。
在特定实施方式中，本文公开的抗体和抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式)进一步包括在低等真核宿主细胞中生产的那些，并且包括岩藻糖基化和非岩藻糖基化杂合体和复合N-聚糖，包括二等分和多触角(multiantennary)物质，包括但不限于N-聚糖，如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。
在特定实施方式中，本文中提供的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式)可以包含具有至少一种选自以下的杂交N-聚糖的抗体或片段：GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2；和NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。在特定方面中，杂交N-聚糖是组合物中的主要N-聚糖物质。
在特定实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式和抗体28G11及其人源化形式)包含具有至少一种选自以下的复合N-聚糖的抗体和片段：GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在特定方面中，复合N-聚糖是组合物中的主要N-聚糖物质。在进一步的方面中，复合N-聚糖是特定N-聚糖物质，其占组合物中复合N-聚糖的约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一个实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段包含复合N-聚糖，其中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的复合N-聚糖包含结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其中此类结构是去岩藻糖基化的。可以例如在工程化的毕赤酵母宿主细胞中生产此类结构。
在特定实施方式中，N-聚糖是岩藻糖基化的。在通常情况下，岩藻糖在N-聚糖的还原端与GlcNAc的α1，3-连接中，在N-聚糖的还原端与GlcNAc的α1，6-连接中，在N-聚糖的非还原端与Ga1的α1，2-连接中，在N-聚糖的非还原端与GlcNac的α1，3-连接中或在N-聚糖的非还原端与GlcNac的α1，4-连接中。因此，在上述糖蛋白组合物的特定方面中，糖型呈α1，3-连接或α1，6-连接岩藻糖形式，以产生选自以下的糖型：Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；呈α1，3-连接或α1，4-连接岩藻糖形式，以产生选自以下的糖型：GlcNAc(Fuc)MansGlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或者呈α1，2-连接岩藻糖形式，以产生选自以下的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在进一步的方面中，抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段包含高甘露糖N-聚糖，其包括但不限于Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2或者由Man3GlcNAc2N-聚糖结构组成的N-聚糖。
在上述进一步的方面中，复合N-聚糖还包括岩藻糖基化和非岩藻糖基化二等分和多触角物质。
如本文所用，术语“N-聚糖”和“糖型”可以互换使用，并且指N-连接寡糖，例如，由天冬酰胺-N-乙酰基葡糖胺键连接至多肽的天冬酰胺残基的寡糖。N-连接糖蛋白含有连接至蛋白中的天冬酰胺残基的酰胺氮的N-乙酰基葡糖胺残基。在糖蛋白上发现的主要的糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰基-神经氨酸(NANA))。糖基团的加工在ER内腔中共翻译发生，并在高尔基体中针对N-连接糖蛋白在翻译后继续进行。N-聚糖具有Man3GlcNAc2的常用五碳糖核心(“Man”指甘露糖；“Glc”指葡萄糖；和“NAc”指N-乙酰基；GlcNAc指N-乙酰葡糖胺)。通常，N-聚糖结构以非还原端在左侧且还原端在右侧来呈现。N-聚糖的还原端是附接到蛋白上包含糖基化位点的Asn残基的末端。N-聚糖在包含添加至Man3GlcNAc2(“Man3”)核心结构(其亦称为“三甘露糖核心”、“五碳糖核心”或“寡甘露糖”核心)的周围糖(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分枝(触角)数量方面不同。N-聚糖根据其分支组分(例如，高甘露糖、复合或杂合)分离。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型N-聚糖通常具有至少一个附接至“三甘露糖”核心的1，3甘露糖臂的GlcNAc和至少一个附接至1，6甘露糖臂的GlcNAc。复合N-聚糖还可以具有任选地被唾液酸或衍生物(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”指神经氨酸和“Ac”指乙酰基)修饰的半乳糖(“Gal”)或N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)残基。复合N-聚糖还可以具有包含“二等分”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)的链内置换。复合N-聚糖还可以在“三甘露糖核心”上具有多个触角，通常称为“多触角聚糖”。“杂合”N-聚糖在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂的末端上具有至少一个GlcNAc并在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上具有零个或更多个甘露糖。各种N-聚糖也称为“糖型”。
对于复合N-聚糖，术语“G-2”、“G-1”、“G0”、“G1”、“G2”“A1”和“A2”指下述。“G-2”指可以表征为Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G-1”指可以表征为GlcNAcMan3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G0”指可以表征为GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G1”指可以表征为GalGlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G2”指可以表征为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“A1”指可以表征为NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；以及术语“A2”指可以表征为NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构。除非另有明示，术语“G-2”、“G-1”、“G0”、“G1”、“G2”“A1”和“A2”指不具有连接至N-聚糖的还原端处的GlcNAc残基的岩藻糖的N-聚糖物质。当术语包括“F”时，“F”指示N-聚糖物质在N-聚糖的还原端的GlcNAc残基上含有岩藻糖残基。例如，G0F、G1F、G2F、A1F和A2F均指示N-聚糖还包括在N-聚糖的还原端附接至GlcNAc残基的岩藻糖残基。诸如酵母和丝状真菌的低级真核生物通常不产生可产生岩藻糖的N-聚糖。
对于多触角N-聚糖，术语“多触角N-聚糖”指在甘露糖残基上进一步包含GlcNAc残基，所述甘露糖残基包含在含有N-聚糖的1，6臂和1，3臂的非还原端的每个甘露糖残基上的N-聚糖或GlcNAc残基的1，6臂或1，3臂的非还原端。因此，可以用下式表征多触角N-聚糖：GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2。术语“1-4”指1、2、3或4个残基。对于二等分N-聚糖，术语“二等分N-聚糖”指其中GlcNAc残基在GlcNAc的还原端处连接至甘露糖残基的N-聚糖。可以用式GlcNAc3Man3GlcNAc2表征二等分N-聚糖，其中各甘露糖残基在其非还原端处连接至GlcNAc残基。而相比之下，当以GlcNAc3Man3GlcNAc2表征多触角N-聚糖时，该式指示两个GlcNAc残基在N-聚糖的两个之一的还原端处连接至甘露糖残基，且一个GlcNAc残基在N-聚糖的另一个臂的非还原端处连接至甘露糖残基。
抗体的生理性质
本文公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式)可以在轻链或重链免疫球蛋白可变区中进一步包含一个或多个糖基化位点。此类糖基化位点可引起抗体或片段的免疫原性增加，或归因于抗原结合改变的抗体的pK的变化(Marshall等，(1972)Annu Rev Biochem41：673-702；Gala和Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick等，(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等，(1985)Nature 316：452-7；Mimura等，(2000)Mol Immunol37：697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列的基序处进行。
各抗体或抗原结合片段(例如，20E6或其人源化形式)将具有独特的等电点(pI)，其通常在6至9.5之间的pH值范围内。IgG1抗体的pI通常在7-9.5的pH范围内和IgG4抗体的pI通常在6-8的pH范围内。
各个抗体或抗原结合片段(例如，20E6或其人源化形式)将具有特征性熔化温度，其中更高的熔化温度指示更高的体内总体稳定性(Krishnamurthy R和Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol3：361-71)。在通常情况下，TM1(初始去折叠温度)可以大于60℃、大于65℃或大于70℃。抗体或片段的熔点可以使用差示扫描量热法(Chen等，(2003)PharmRes 20：1952-60；Ghirlando等，(1999)Immunol Lett68：47-52)或圆二色性(Murray等，(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)测量。在一个进一步的实施方式中，选择不会迅速降解的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体20E6及其人源化形式)。可以使用毛细管电泳法(CE)和MALDI-MS(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem67：3626-32)测量抗体或片段的降解。
在一个进一步的实施方式中，选择具有最小聚集作用的抗体(例如，抗体20E6及其人源化形式)及其抗原结合片段，聚集作用能够导致不需要的免疫应答的触发和/或改变或不利的药代动力学性质。在通常情况下，聚集度为25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低或者5％或更低的抗体和片段是可接受的。可以通过若干技术测量聚集，包括体积排色谱柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)和光散射。
V.多特异性抗体
本文提供的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)包括至少一个针对如本文所述的LAP-TGFβ1(例如，人LAP-TGFβ1)上特定表位的结合区，以及至少一个其他结合区(例如，癌抗原)。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2抗体)。
用于制备多特异性抗体的方法是本领域熟知的(参见，例如，PCT公开号WO05117973和WO 06091209)。例如，可以基于两条配对的免疫球蛋白重链和轻链的共表达生产全长多特异性抗体，其中这两条链具有不同特异性。还描述了用于从重组细胞培养物中直接制备和分离多特异性抗体片段的各种技术。例如，可以使用亮氨酸拉链生产多特异性抗体。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备多特异性抗体片段的其他策略。
适宜的多特异性分子平台的实例包括但不限于双重靶向(DT)-Ig (GSK/Domantis)、二合一抗体(Genentech)、交联Mab(Karmanos Cancer Center)、Fcab和mAb2(F-Star)、CovX-体(CovX/Pfizer)、双重可变结构域(DVD)-Ig(Abbott)、IgG-样双特异性(ImClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(Medlmmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(BiogenIdee)、TvAb(Roche)、ScFv/Fc融合物、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion，Zymogenetics/BMS)、双亲和性再靶向技术(Fc-DART)(MacroGenics)、双重(ScFv)2-Fab(National Research Center for Antibody Medicine-China)、F(ab)2(Medarex/AMGEN)、双重作用或双Fab(Genentech)、对接和锁定(DNL)(ImmunoMedics)、二价特异性(Biotecnol)、SEED(EMD Serono)、mAb2(F-star)、Fab-Fv(UCB-Celltech)、双特异性T细胞衔接子(BiTE)(Micromet)、串联双体(Tandab)(Affimed)、双亲和性再靶向技术(DART)(MacroGenics)、单链双体(Academic)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics)、COMBODY(EpigenBiotech)、双重靶向纳米抗体(Ablynx)和Fc工程化的IgGl(Xencor)。
在一个特定实施方式中，多特异性抗体包含结合至LAP-TGFβ1衍生的或连接至另一功能性分子(例如，另一肽或蛋白(例如，受体的另一抗体或配体))的第一抗体(或其结合部分)，以产生结合至LAP-TGFβ1和非LAP靶分子的多特异性抗体。抗体可以衍生化或连接至一个以上的其他功能性分子，以产生结合至两个以上不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子。为产生多特异性分子，本文公开的抗体可以在功能上连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价结合或以其他方式)至一个或多个其他结合分子，如另一抗体、抗体片段、肽、受体或结合模拟物，以使得产生多特异性分子。
因此，涵盖包含至少一种针对LAP-TGFβ1(例如，人LAP-TGFβ1)上的特定表位的第一结合特异性和针对第二靶点的第二结合特异性的多特异性分子，例如，双特异性抗体和双功能性抗体。在一些实施方式中，第二靶点是特异性结合至肿瘤相关抗原的第二结合区。肿瘤相关抗原是本领域熟知的。示例性肿瘤相关抗原包括但不限于AFP、ALK、BAGE蛋白、β-连环蛋白、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、caspase-8、CCR5、CD19、CD20、CD30、CDK4、CEA、细胞周期蛋白B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如，GAGE-1、GAGE-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例如，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6和MAGE-12)、MART-1、间皮素、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、STn、存活素、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3。
在一些实施方式中，双特异性抗体的第二结合区特异性结合至CD4、CD8、CD45、CD56、CD14、CD16、CD 19、CD20、CD25、CD38、CD11b、CD22、CD30、CD39、CD114、CD23、CD73、CD163、CD206、CD203、CD200R、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、IDO、TIM-3、LAG-3、TIGIT、PVR、PVRL2、B7H3、B7H4、CSF-1R、VISTA、KIR、OX-40、GITR、4-1BB、CD40、CD40L、CD27/CD70、CD28、ICOS、CD3、CD56、NKG2DA、NKG2DB、NKG2DC、NKG2DD、NKG2DF、NKG2DH、CD94、NKP46、NKP30、CD33、CD73、CD47、LILRB1、CD91、钙网蛋白、CD122、GARP、LRRC33、LAP2、LAP3、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、FAP、钙粘蛋白11和斯钙素1。在一些实施方式中，当结合至靶点(例如，TNF家族成员激动剂、OX40配体、CD137配体、CD137激动剂、STING激动剂、GITR激动剂、ICOS激动剂和CD28激动剂)时，第二结合区具有激动性质。
在一些实施方式中，抗体是包含第一、第二和第三结合区的三特异性抗体，其中所述第一结合区包含本文所述的抗LAP抗体的结合特异性(例如，抗原结合区)，和所述第二和第三结合区结合至两个不同靶点(或相同靶点上的不同表位)，例如，上文所述的靶点。
在一些实施方式中，抗体是双功能性抗体，其包含本文所述的抗LAP抗体和受体分子(即，受体陷阱构建体，如TGFβ超家族配体受体(例如，ActRIIB及其变体)或VEGFR)。
在一个实施方式中，多特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段作为结合特异性，包括例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv。抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，如Fv或单链构建体，如在Ladner等的美国专利号4,946,778中所描述的。
可以使用本领域公知的方法通过缀合组分结合特异性(例如，抗FcR和抗LAP结合特异性)来制备多特异性分子。例如，可以单独产生多特异性分子的每个结合特异性，然后将彼此缀合在一起。当结合特异性是蛋白或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二甲酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)。优选的缀合剂是SATA和磺基-SMCC，其均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时，其可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键缀合。在一个特别优选的实施方式中，在缀合之前，对铰链区进行修饰以含有奇数个巯基残基，优选地一个。
或者，两种结合特异性可以在同一载体中编码，并在同一宿主细胞中表达和组装。这种方法尤其适用于其中多特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab′)2或配体xFab融合蛋白的情况。多特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，也可以是包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。多特异性分子可以包含至少两个单链分子。在例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中描述了用于制备多特异性分子的方法。
可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或western印迹测定来确认多特异性分子与其特异性靶点的结合。这些测定中的每一者通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如，抗体)来检测特定目标蛋白-抗体复合物的存在。例如，可以使用例如识别并特异性结合至抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。或者，可以使用多种其他免疫测定的任何一种来检测复合物。例如，可以对抗体进行放射性标记，并用于放射免疫测定(RIA)。放射性同位素可以通过使用αγ-β计数器或闪烁计数器等手段进行检测，也可以通过放射自显影进行检测。
VI.免疫缀合物
可以通过将抗体与另一治疗剂缀合以形成例如抗体-药物缀合物(ADC)来形成包含本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物。适宜的药剂包括例如细胞毒剂(例如，化学治疗剂)、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)和/或放射性同位素(即，放射性缀合物)。其他适宜药剂包括例如抗代谢物、烷化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂，抗生素和抗有丝分裂剂。在一些实施方式中，具有本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段(例如，缀合至细胞毒剂)且与免疫抑制性细胞(例如，调节性T细胞)结合的ADC可用于从例如肿瘤微环境中耗尽免疫抑制性细胞。
可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α八叠球菌、油酮蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、新霉素和单端孢霉烯。细胞毒素或细胞毒剂的其他实例包括，例如，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽醌二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(此前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素D(此前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
在ADC中，抗体和治疗剂优选地通过可裂解接头，如肽基、二硫键或腙接头缀合。更优选地，接头是肽基接头，如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO：214)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。可以如美国专利号7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开号WO 02/096910；WO 07/038658；WO 07/051081；WO 07/059404；WO 08/083312；和WO 08/103693；美国专利号20060024317；20060004081；和20060247295中所述制备ADC；其公开内容通过引用并入本文。
多种放射性核素可用于生产放射性缀合的抗LAP抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90y和186Re。
还可以将免疫缀合物用于修饰给定生物学应答，并且不应将药物部分解释为限于经典化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白或多肽(例如，淋巴因子、肿瘤坏死因子、IFNγ、生长因子)。
可以使用多种双功能性蛋白偶联剂来制备免疫缀合物，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能性衍生物(如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双叠氮鎓衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。经碳14标记的1-异硫氰酸基苯甲基-3-甲基甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合至抗体的示例性螯合剂(参见，例如，PCT公开号WO94/11026)。
用于将此类治疗部分缀合至抗体的技术是熟知的，参见，例如，Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编著)，第243-56页(AlanR.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery″，Controlled DrugDelivery(2nd Ed.)，Robinson等(编著)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编著)，第475-506页(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编著)，第303-16页(Academic Press 1985)，以及Thorpe等，″The Preparation And Cytotoxic PropertiesOf Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段还用于诊断目的。可以将此类抗体或抗原结合片段缀合至适宜可检测剂以形成免疫缀合物。对于诊断目的，合适的药剂是可检测的标记，包括用于全身成像的放射性同位素，以及用于样品测试的放射性同位素、酶、荧光标记和其他合适的抗体标签。
可检测的标记物可以是当前体外诊断领域中使用的各种类型的任何一种，包括微粒标记、同位素、发色团、荧光标记物、法光标记物、金属标记(例如，对于CyTO，成像质谱细胞计数)、磷光标记物等，以及将给定底物转化为可检测标记物的酶标记，以及在扩增后(如通过聚合酶链式反应)显示的多核苷酸标签。适宜的酶标记包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。例如，标记可以是酶碱性磷酸酶，通过测量在1，2二氧杂环丁烷底物(如金刚烷基甲氧基磷酰氧基苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)3-(4-(甲氧基螺{1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-(5′-氯)三环{3.3.1.13，7}癸}-4-基)磷酸苯基酯(CSPD)，以及CDP和
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或在本领域中熟知的其他发光底物，例如适宜的镧系元素(如铽(III)和铕(III))螯合物转化后的化学发光的存在或形成来检测。检测手段由所选择的标记决定。在标签为颗粒状并以适当水平积累的情况下，可以使用肉眼来识别标记或其反应产物的出现，或使用全部根据标准实践的如分光光度计、发光计、荧光剂等仪器的仪器来实现。
优选地，缀合方法产生基本上(或几乎)非免疫原性连接，例如，肽-(即，酰胺-)、硫键-(位阻)、二硫键-、腙-以及醚连接。这些连接是几乎非免疫原性的并在血清内显示出合理的稳定性(参见，例如，Senter，P.D.，Curr.Opin.Chem.Biol.13(2009)235-244；以及PCT公开号WO2009/059278和WO 95/17886)。
根据该部分和抗体的生物化学性质，可以使用不同缀合策略。在所述部分是天然存在的或50至500个氨基酸之间重组体的情况下，在教科书中有描述蛋白缀合物合成化学的标准程序，本领域技术人员可以容易地遵照(参见例如，Hackenberger，C.P.R.和Schwarzer，D.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.47(2008)10030-10074)。在一个实施方式中，使用使用马来酰亚胺基部分与抗体或该部分内的半胱氨酸残基的反应。在例如使用抗体的Fab或Fab′片段的情况下，这是特别适宜的偶联化学。或者，在一个实施方式中，进行与抗体或部分的C末端的偶联。例如，对蛋白(例如，Fab片段)的C末端修饰可以如所述的进行(Sunbul，M.和Yin，J.，Org.Biomol.Chem.7(2009)3361-3371)。
在通常情况下，位点特异性反应和共价偶联是基于将天然氨基酸转化成具有与所存在的其他官能团的反应性正交的反应性的氨基酸。例如，稀有序列背景下的特定半胱氨酸可以酶促转化为醛(参见Frese，M.A.和Dierks，T.，ChemBioChem.10(2009)425-427)。在给定的序列背景下，还可以通过利用某些酶与天然氨基酸的特定酶反应性来获得所需的氨基酸修饰(参见，例如，Taki，M.等，Prot.Eng.Des.Sel.17(2004)119-126；Gautier，A.等，Chem.Biol.15(2008)128-136；且通过Bordusa，F.，Highlights in Bioorganic Chemistry(2004)389-403使用C-N键的蛋白酶催化形成)。位点特异性反应和共价偶联还可以通过末端氨基酸与合适的修饰剂的选择性反应来实现。N末端半胱氨酸与苯甲腈的反应性(参见Ren，H.等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48(2009)9658-9662)可用于实现位点特异性共价偶联。天然化学连接也可以依赖于C末端半胱氨酸残基(Taylor，E.Vogel；Imperiali，B，Nucleic Acids and Molecular Biology(2009)，22(Protein Engineering)，65-96)。
所述部分还可以是合成的肽或肽模拟物。在化学合成多肽的情况下，可以在此类合成期间引入具有正交化学反应性的氨基酸(参见例如，de Graaf，A.J.等，Bioconjug.Chem.20(2009)1281-1295)。由于多种正交官能团至关重要且可引入合成肽中，因而此类肽与接头的缀合是标准化学。
在一些实施方式中，附接至抗LAP抗体或抗原结合片段的部分选自可检测部分、结合部分、标记部分和生物活性部分。
VII.测定
可以使用本领域公知的多种测定针对所需性质(例如，本文所述的那些)检测本文公开的抗LAP抗体或抗原结合片段。
在一个实施方式中，针对特异性结合至LAP-TGFβ1(例如，人LAP-TGFβ1)检测抗体或抗原结合片段。用于分析各种抗LAP抗体或抗原结合片段的结合亲和性、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域公知的标准测定，例如，使用BiacoreTM2000SPR仪器(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析，或生物层干涉法(例如，ForteBio测定)，如在实施例中所述的。在一些实施方式中，在结合测定中使用的LAP是与TGFβ1复合的。在一些实施方式中，在结合测定中使用的LAP不与TGFβ1复合。在一些实施方式中，在结合测定中使用的LAP与TGFβ1以及GARP或GARP的片段或者LRRC33或LRRC33的片段复合的。在一些实施方式中，在结合测定中使用的LAP是与TGFβ1以及LTBP(例如，LTBP1、LTBP3或LTBP4)或LTBP的片段复合的。
在一个实施方式中，针对与已转染LAP-TGFβ1的细胞结合的能力检测抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，细胞还已经被GARP或LRRC33转染。
在一个实施方式中，针对与已涂覆LAP的小珠表面结合的能力筛选抗体或抗原结合片段。
在一个实施方式中，针对与在表达硫酸肝素糖蛋白(如多配体聚糖-4)的细胞上LAP结合的能力筛选抗体或抗原结合片段。例如，将表达肝素硫酸糖蛋白的细胞与LAP或与LTBP(例如，LTBP1、LTBP3或LTBP4)复合的LAP孵育，并通过流式细胞术筛选抗体的结合。
在一个实施方式中，针对结合或影响TGFβ1的能力对抗体或抗原结合片段进行检测。在一个实施方式中，针对结合或影响TGFβ2的能力对抗体进行检测。在一个实施方式中，针对结合或影响TGFβ3的能力对抗体进行检测。
在另一个实施方式中，针对其对TGFβ激活的作用(例如，抑制、刺激或无作用)对抗体或抗原结合片段进行检测。在一些实施方式中，TGFβ1激活是由整联蛋白的结合介导的，包括但不限于αvβ6、αvβ8、αvβ3或αvβ1。在一些实施方式中，TGFp1激活是由基质金属蛋白酶介导的，包括但不限于，MMP2和MMP9。在一些实施方式中，TGFβ1激活是由血小板反应蛋白介导的。在一些实施方式中，TGFβ1激活是由血清蛋白酶介导的。在一些实施方式中，TGFβ1激活是通过热、通过剪切力、通过pH的变化或通过电离辐射来介导的。在一些实施方式中，TGFβ1激活是由活性氧(ROS)介导的。在激活测定中LAP的来源可以是转染细胞系表面上的LAP，内源性或对特定刺激产生应答表达LAP的细胞群表面上的LAP，结合至胞外基质的LAP，在溶液中的LAP(例如，重组LAP)，其与TGFβ1或不与TGFβ1复合，或者与TGFβ1和锚定蛋白(如GARP、LRRC33、LTBP1、LTBP3或LTBP4)复合。LAP-TGFβ1可以购自R&D Systems或者可以从细胞上清液中分离。例如，可以使用ELISA(例如，如在实施例4中所述)来测定抗体对TGFβ1激活的作用，所述ELISA在不同条件下(例如，具有或不具有抗体)测量活性TGFβ1的水平。还可以使用表达TGFβ受体的报告细胞系以及对成熟TGFβ的应答确定抗体对LAP-TGFβ1激活的作用。
在另一个实施方式中，针对结合胞外基质中LAP的能力检测抗体或抗原结合片段。用于确定是否抗体与胞外基质中的LAP结合的适宜方法包括体外测定，其中在培养板上培养细胞(例如，使用LAP-TGFβ转染的P3U1细胞)以浸没ECM并接着除去，以及针对其结合至培养板表面上剩余的LAP和ECM的能力对标记的抗体进行检测(例如，如在实施例5中所述的)。可以使用成纤维细胞系或已知分泌LAP-TGFβ和胞外基质组分的其他细胞进行类似测定。在一些实施方式中，可通过ELISA测定抗LAP抗体是否结合至或不结合至ECM，其中已使用市售的抗体证实ECM表达潜在TGFβ。
在另一个实施方式中，针对其结合至特定细胞类型的能力对抗体或抗原结合片段进行检测，例如，免疫细胞(例如，免疫抑制性细胞、白细胞)或血小板。可以使用流式细胞术确定抗体或抗原结合片段与某些白细胞群(例如，Treg、巨噬细胞、MDSC、GARP阴性细胞)的结合，例如，如在实施例7中所述的。
还可以使用本领域公知的方法(例如，3H胸腺嘧啶掺入、使用增殖标记物的免疫组织化学、动物癌症模型)针对其抑制细胞增殖或活力(在体内或体外)，如肿瘤细胞，对抗体或抗原结合片段进行检测。
还可以使用本领域熟知的同基因型肿瘤模型，如CT26结直肠肿瘤模型、EMT6乳腺癌模型和4T1乳腺癌肿瘤转移模型，针对其在体内的抗肿瘤活性(例如，作为单药疗法或组合疗法)对抗体或抗原结合片段进行检测。还可以在已知由抗TGFβ抗体抑制的肿瘤异种移植模型(例如，Detroit 562肿瘤异种移植模型)中对抗LAP抗体进行检测。例如在实施例12-16中描述了使用抗LAP抗体用于治疗这些模型的示例性方法。
用于确定是否抗LAP抗体或抗原结合片段显示处某些性质(例如，结合、抑制激活、激活)的示例性标准如表1B中所示。
表1B。
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VIII.组合物
本文还提供了组合物(例如，药物组合物)，其包含本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段，包含其的免疫缀合物，或包含其的双特异性抗体，以及载体(例如，药学上可接受的载体)。此类组合物用于各种治疗性应用中。
在一些实施方式中，本文公开的药物组合物可以包含用于治疗各种疾病(例如，癌症、纤维化、自身免疫性疾病)的其他化合物、药物和/或药剂。此类化合物、药物和/或药剂例如可以包括抗癌剂、化学治疗剂、免疫抑制剂、免疫刺激剂、免疫检查点抑制剂和/或抗炎剂。在下面的章节(即，第IX章；用途和方法)中描述了可以与本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段一起或单独制剂的示例性化合物、药物和药剂。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将活性化合物(即，抗体、免疫缀合物或双特异性分子)包被在一种材料中，以保护所述化合物免受酸和可能使所述化合物失活的其他自然条件的作用。
本文所述的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”指保持母体化合物所需的生物学活性并且不产生任何不良毒理学作用的盐(参见例如，Berge，S.M.等，(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸的盐，如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及来源于无毒有机酸的盐，如脂肪族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等。碱加成盐包括来源于碱土金属(如钠、钾、镁、钙等)，以及来源于无毒有机胺(如N，N′-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的盐。
本文所述的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基羟基茴香醚(BHT)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可以在本文所述的药物组合物中使用的适宜水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)及其适宜的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序(见上文)以及通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包含等张剂，如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延长吸收的药剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现延长可注射药物形式的吸收。
药学上可接受的载体包含无菌水溶液或分散液以及用于临用时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则可考虑将其用于本文所述的药物组合物中。药物组合物可以包含防腐剂或可以不含防腐剂。可以将补充活性化合物加入组合物中。
治疗性组合物通常在生产和储存条件下必需是无菌和稳定的。可以将组合物配制为溶液、微乳、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适宜混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在很多情况下，组合物中将优选地包含等张剂(例如，糖)、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)可以实现可注射组合物的延长吸收。
可以通过将所需量的活性化合物与所需的一种或上述成分的组合掺入适当的溶剂中，然后进行灭菌微滤，来制备无菌注射溶液。通常，分散液是通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备，所述无菌载体包含基本分散介质和本文列举的那些所需的其他成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从其此前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定的施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的组合物的量。在通常情况下，以百分之一百计，此量将在约0.01％至约99％的活性成分，优选地从约0.1％至约70％，最优选地从约1％至约30％范围内的活性成分与药学上可接受的载体的组合。
调整剂量方案以提供最佳所需应答(例如，治疗应答)。例如，可以单次推注施用，随着时间的推移可以分几次施用，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制胃肠外组合物是特别有利的，以易于施用和剂量均匀。如本文所用，剂量单位形式指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有计算以产生所需治疗作用的预定量的活性化合物，以及所需的药物载体。本文所述的单位剂型的规格是通过下述情况指定且直接取决于下述情况：(a)活性化合物的独特特征以及所要获得的特定治疗作用，和(b)混配这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的本领域中的固有限制。
对于施用抗体或抗原结合片段，剂量为宿主体重的约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5或10mg/kg。示例性治疗方案需要每周一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每三个月一次或每三到六个月一次施用。
抗体可以持续释放制剂施用，在这种情况下，需要较少的频率施用。剂量和频率取决于患者体内抗体的半衰期。在通常情况下，人抗体显示出最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内，以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者终生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的时间间隔使用相对高的剂量，直到疾病进展减少或终止，并且优选地直到患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可以向患者施用预防性方案。
可以改变本文所述药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得有效实现对于特定患者、组合物和施用方式的所需治疗应答，而对患者没有毒性的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本文中所述的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康状况和此前的病史以及在医疗领域中熟知的类似因素。
在各种实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段的治疗有效剂量导致疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的出现频率和持续时间增加或者防止由于疾病病痛引起的损伤或功能障碍。在癌症背景下，有效剂量优选地导致生存期延长，和/或防止与癌症相关的身体症状的进一步恶化。治疗有效量可以阻止或延迟癌症发作，如当存在疾病的早期或初始体征时可能是需要的。
可以通过一个或多个施用途径使用本领域公知的方法中的一种或多种施用本文所述的组合物。如本领域技术人员将意识到的是，施用途径和/或方式将根据所需结果而变化。本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹腔内、皮下、脊柱或其他胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“胃肠外施用”指通常通过注射的经肠和局部施用以外的施用方式，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，本文所述的抗体或抗原结合片段可以通过非胃肠外途径施用，如局部、表皮或粘膜途径施用，例如，鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。
活性化合物可以与将保护所述化合物免于快速释放的载体一起制备，如控制释放制剂，包括植入物、透皮贴片和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的很多方法已获得专利或通常是本领域技术人员公知的。参见，例如，Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可以使用本领域公知的医疗装置施用治疗组合物。例如，在一个优选实施方式中，本文所述的治疗性组合物可用无针皮下注射装置施用，如在美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。与本文所述的抗LAP抗体一起使用的熟知植入剂和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了以控制速率分配药物的可植入的微量输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了一种用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了一种以精确宿主速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流量植入式输注设备；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多腔室隔室的渗透性药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其公开了一种渗透性药物递送系统。这些专利通过引用并入本文。很多其他此类植入物、递送系统和模式是本领域技术人员公知的。
在某些实施方式中，可以将本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段制剂以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除很多高亲水性化合物。为确保本文所述的治疗性化合物穿过BBB(如有需要，例如，用于脑癌)，可以使其例如在脂质体中进行制剂。对于生产脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含选择性输送至特异性细胞或器官中的一个或多个部分，因此增强靶向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等，(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等，(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；亦参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
IX.用途和方法
本文所述的抗体、抗体组合物和方法具有多种体外和体内应用。
例如，本文提供了一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段，以使得所述受试者被治疗，例如，以使得癌性肿瘤的生长被抑制或减少和/或实现肿瘤消退和/或长期存活。
在一个实施方式中，本文提供了一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量(例如，治疗有效量)的本文所述的抗LAP抗体(或者双特异性抗体或包含所述抗体的免疫缀合物)。在一些实施方式中，所述受试者被施用了其他治疗剂。在一些实施方式中，所述其他治疗剂选自以下：抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗LAG3抗体或其抗原结合部分、抗VISTA抗体或其抗原结合片段、抗BTLA抗体或其抗原结合片段、抗TIM3抗体或其抗原结合片段、抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、抗HVEM抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗CD137抗体或其抗原结合片段、抗OX40抗体或其抗原结合片段、抗CD28抗体或其抗原结合片段、抗PDL1抗体或其抗原结合片段、抗PDL2抗体或其抗原结合片段、抗GITR抗体或其抗原结合片段、抗ICOS抗体或其抗原结合片段、抗SIRPα抗体或其抗原结合片段、抗ILT2抗体或其抗原结合片段、抗ILT3抗体或其抗原结合片段、抗ILT4抗体或其抗原结合片段、抗ILT5抗体或其抗原结合片段和抗4-1BB抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗PD1抗体或其抗原结合片段是派姆单抗或其抗原结合片段。派姆单抗的重链和轻链序列分别如SEQ ID NO：240和241中所示。在一些实施方式中，所述其他治疗剂是纳武单抗。在各种实施方式中，纳武单抗的重链和轻链序列在包含SEQ ID NO：246和247中所示。
在一些实施方式中，癌症的特征在于TGFβ活性异常。在一些实施方式中，癌症与纤维化相关。在一些实施方式中，癌症与CD4+调节性T细胞的浸润相关。在一些实施方式中，癌症与CD8+调节性T细胞的浸润相关。在一些实施方式中，癌症与调节性B细胞的浸润相关。在一些实施方式中，癌症与髓系来源的抑制性细胞的浸润相关。在一些实施方式中，癌症与肿瘤相关巨噬细胞的浸润相关。在一些实施方式中，癌症与先天性淋巴细胞的浸润相关。在一些实施方式中，癌症与癌症相关成纤维细胞的浸润相关。在一些实施方式中，癌症与上述细胞类型的辐射相关增加相关。
在一些实施方式中，癌症与TGFβ1激活标记增加相关。在一些实施方式中，癌症与EMT或EMT标记相关。在一些实施方式中，癌症与显示EMT或EMT标记和免疫浸润的肿瘤相关。在一些实施方式中，癌症与免疫排除的肿瘤性质相关。在一些实施方式中，癌症与LAP表达增加相关。在一些实施方式中，癌症与GARP表达增加相关。在一些实施方式中，癌症与LRRC33表达增加相关。
使用本文所述的抗LAP抗体可以抑制生长的癌症包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症更特别的实例包括但不限于基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；脑和CNS癌；乳腺癌(例如，雌激素受体阳性乳腺癌HER-2阳性乳腺癌；三阴性乳腺癌)；腹膜癌；宫颈癌；胆管癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠道癌症)；胶质母细胞瘤；肝癌(例如，肝细胞癌；肝肿瘤)；上皮内肿瘤；肾或肾脏癌；喉癌；白血病；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌瘤)；淋巴瘤，包括霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(例如，嘴唇、舌、口部和咽喉)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌瘤；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；畸胎上皮癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；以及其他癌瘤和肉瘤；以及B细胞淋巴瘤(包括低分级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小型非裂解型细胞NHL；巨大肿块NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关的淋巴瘤；和华氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴母细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性髓母细胞性白血病；和移植后淋巴细胞增殖性病症(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤相关的异常血管增殖、水肿(如与脑肿瘤相关)、原始来源的肿瘤和梅格斯氏综合征。
可以使用本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段治疗的其他癌症包括转移性胰腺癌、转移性胰脏腺癌、胃癌、纤维化癌症、胶质瘤、恶性胶质瘤、弥漫性脑桥神经胶质瘤、儿童复发性脑肿瘤肾细胞癌、透明细胞转移性肾细胞癌、转移性去势抗性前列腺癌、IV期前列腺癌、转移性黑色素瘤、恶性黑色素瘤、皮肤复发性黑色素瘤、黑色素瘤脑转移、头颈部恶性黑色素瘤、鳞状细胞非小细胞肺癌、转移性乳腺癌，滤泡性淋巴瘤、晚期B细胞NHL、包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的HL、多发性骨髓瘤、慢性髓性白血病、成人急性髓性白血病缓解期、伴有Inv(16)(p13.1q22)的成人急性髓性白血病、CBFB-MYH11、伴有t(16：16)(p13.1：q22)的成人急性髓性白血病、CBFB-MYH11、伴有t(8：21)(d22：q22)的成人急性髓性白血病、RUNX1-RUNX1T1、伴有t(9：11)(p22：q23)的成人急性髓性白血病、MLLT3-MLL、伴有tO15：17)(q22：q12)的成人急性前髓细胞性白血病、PML-RARA、烷化剂相关的急性髓性白血病、里希特氏综合征、成人胶质母细胞瘤、成人神经胶质肉瘤、复发性胶质母细胞瘤、复发性儿童期横纹肌肉瘤、复发性尤因肉瘤/外周原始神经外胚层肿瘤、复发性神经母细胞瘤、复发性骨肉瘤、结直肠癌、MSI阳性结直肠癌、MSI阴性结直肠癌、鼻咽非角化性癌瘤、复发性鼻咽未分化性癌瘤、宫颈腺癌、宫颈腺鳞癌瘤；宫颈鳞状细胞癌、复发性宫颈癌、肛管鳞状细胞癌、转移性肛管癌瘤、复发性肛管癌瘤、复发性头颈癌、头颈鳞状细胞、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、卵巢癌、结肠癌、晚期GI癌、胃腺癌、胃食管交界处腺癌、骨肿瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤、胸腺癌、尿路上皮癌、默克尔细胞癌、复发性默克尔细胞癌、蕈样真菌病、塞扎里综合征、神经内分泌癌、鼻咽癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、神经胶质瘤、间皮瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓纤维化(MF)、骨髓增生性肿瘤和急性髓性白血病(AML)。
癌症可以是转移性或可以是原发性癌症。癌症可以是去增生性或非去增生性的。癌症可以是复发性癌症。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段用于治疗骨髓增生异常综合征(MDS)。MDS是一类多样的恶性病症，其特征是由于造血功能不良和增生细胞的产生而导致的骨髓衰竭。TGFβ是MDS的主要驱动因素(Geyh等，Haematologica 2018；103：1462-71)并且已提出将抑制TGFβ功能的药剂作为治疗剂(Mies等，Curr Hematol MaligRep2016；11：416-24)。此外，已知MDSC在MDS中失调(Chen等，JCI2013；123：4595-611)并且降低骨髓中的MDSC含量的药剂是潜在治疗剂。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段用于治疗骨髓纤维化，这是另一种骨髓恶性疾病，其中TGFβ1起关键作用(Mascarenhas等，Leukemia&Lymphoma2014；55：450-2)。
在一些实施方式中，癌症是一种或多种检查点抑制剂抗性的。在一些实施方式中，癌症本质上是难治性或耐药性的(例如，对PD-1通路抑制剂、PD-1通路抑制剂或CTLA-4通路抑制剂具有耐药性)。在一些实施方式中，癌症的抗性或难治性状态是获得性的。在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与检查点抑制剂组合使用，以克服癌症对检查点抑制剂的耐药性。在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与检查点抑制剂组合或与诱导间叶细胞表型的药剂(如MAPK通路抑制剂)顺序共同用于治疗具有间叶细胞和/或EMT标记的肿瘤。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段用于增强离体免疫细胞的活力，例如，在过继性NK细胞转移中。因此，在一些实施方式中，将抗LAP抗体与过继转移的NK细胞组合以治疗癌症。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段用于治疗具有MHC丧失或MHC下调的肿瘤，以单药疗法或与NK活化或增强治疗组合的形式。在一些实施方式中，使用本文所述的抗LAP抗体与NK活化或增强治疗的组合治疗检查点抑制剂抗性肿瘤。
本文提供了还提供了用于治疗与循环血小板的数目增加或血小板与淋巴细胞的比率增加相关的癌症的方法，其包含向有需要的受试者施用有效量的特异性结合至LAP的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合至血小板，但不会引起血小板聚集或血小板脱颗粒。
可以在可预测在人类肿瘤中的有效性的动物模型系统中评价化合物抑制癌症的能力。或者，可以通过使用本领域技术人员公知的体外测定法检查化合物的抑制能力来评价组合物的这种性质。治疗性化合物的治疗有效量能够缩小肿瘤尺寸，或者以其他方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的体型、受试者症状的严重程度，以及所选择的特定组合物或给药途径等的因素来确定这样的量。
还涵盖用于检测样品(例如，肿瘤组织活检样品)中是否存在LAP-TGFβ1或测量样品中LAP-TGFβ1的量的方法，其包括将样品(例如，肿瘤组织)和对照样品(例如，相应的健康组织)与特异性结合至LAP-TGFβ1的抗体(例如，单克隆抗体)或抗原结合片段在允许抗体或其部分与LAP-TGFβ1之间形成复合物的条件下接触。然后，检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比的复合物形成差异指示样品中存在LAP-TGFβ1。本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段还可以用于通过免疫亲和性纯化来纯化LAP-TGFβ1。
还涵盖本文所述的抗LAP抗体的诊断性应用。
在一个实施方式中，本文提供了一种诊断与调节性T细胞浸润相关的癌症的方法，其包括使来自罹患癌症的患者的生物样品与本文所述的结合至调节性T细胞的抗LAP抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体的阳性染色指示癌症是与调节性T细胞浸润相关的。
在另一个实施方式中，本文提供了一种诊断与GARP阴性抑制性细胞相关的癌症的方法，其包括使来自罹患癌症的患者的生物样品与本文所述的结合至GARP阴性抑制性细胞的抗LAP抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体的阳性染色和抗GARP抗体的阴性染色指示癌症是与GARP阴性抑制性细胞相关的。
在另一个实施方式中，本文提供了一种选择罹患癌症的患者以用本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段治疗的方法，其包括使来自患者的生物样品与抗体接触，其中抗体的阳性染色指示癌症是可用抗体治疗的。
在另一个实施方式中，本文提供了一种测定罹患癌症的患者对用本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段进行的治疗的应答的方法，其包含使来自患者生物样品与抗体接触，其中抗体的染色减少指示癌症对用抗体进行治疗具有应答。
在另一个实施方式中，本文提供了一种测定患者中的癌症是否已转移的方法，包括(a)鉴定患有癌症的患者，(b)向所述患者施用标记的(例如，放射性标记的)本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段并且确定标记的抗LAP抗体的生物分布，和(c)周期性重复步骤(b)以确定是否标记的抗LAP抗体的生物分布是否已改变，其中在标记的抗LAP抗体的生物分布中的变化指示癌症已转移。
还提供了使用本文所述的抗LAP抗体治疗纤维化的方法。在一个实施方式中，本文提供了一种治疗纤维化的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，纤维化与癌症相关。在一些实施方式中，纤维化与髓系来源的抑制性细胞的水平增加相关(例如，Fernandez等，Eur Respir J2016；48：1171-83)。
能够使用任何本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段治疗的示例性纤维化病症包括但不限于心脏纤维化、肌肉纤维化、皮肤纤维化、肝脏纤维化、软组织(例如，纵隔或腹膜后腔)纤维化、肾脏纤维化、骨髓纤维化、肠纤维化、关节(例如，膝部、肩部或其他关节)纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、心内膜纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性块状纤维化、输卵管纤维化、肾源性全身纤维化，克隆氏病、瘢痕疙瘩、老年心肌梗死、硬皮病/系统性硬化、上皮下纤维化、关节纤维化、粘附性囊炎的一些形式、增生性纤维化、病毒性肝炎引起的纤维化、药物引起的纤维化、射线引起的纤维化以及与癌症相关的纤维化。
本文还提供了在移植之前、期间或之后降低患者中的免疫抑制性细胞的数量的方法，其包括在进行移植之前、在移植期间和/或在移植之后向患者施用有效量的本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段中的任一者。在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段改善移植物的存活。
已在急性肝疾病的模型(对乙酰氨基酚损伤小鼠模型)中证实抑制TGFβ可通过减少老化及增强肝再生来使再生性衰竭恢复(Bird等，Sci Transl Med 2018；10：eaan1230)。因此，本文还提供了一种增加急性器官损伤(例如，急性肝损伤)中的再生性应答的方法，其包括向具有急性器官损伤的受试者施用有效量的本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段。
已证实TGFβ的异常活化可引起发颞下颌关节骨关节炎的发作(Zheng等，Bone Res2018；6：26)。因此，本文还提供了一种治疗颞下颌关节骨关节炎的方法，其包括向患者施用有效量的本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段，以治疗颞下颌关节骨关节炎。
还证实了在HIV-1感染期间，LAP-TGFβ1介导CD4+效应细胞分化成生产性或潜伏性感染的中央记忆T细胞中(Cheung等，J Viol2018；92：e01510-17)。因此，本文还提供了一种治疗具有HIV-1感染的患者(或处于发展成HIV-1感染的风险中的患者)的方法，其包括向患者施用有效量的本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段，以治疗HIV-1感染(例如，抑制CD4+效应细胞分化成生产性和潜伏性感染的中央记忆T细胞)。
已证实子宫内膜异位症患者的腹膜液中的表达TGFβ的巨噬细胞以及抑制性调节性T细胞发生改变(Hanada等，Reprod Biol Endocrinol2018；16：9)，表明靶向在这些细胞上表达的LAP-TGFb1可能有利于治疗所述病症。因此，本文还提供了一种治疗患有子宫内膜异位症的患者的方法，其包括向患者施用有效量的本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段，以治疗子宫内膜异位症。
已证实携带多重耐药性结核分枝杆菌的患者中表达LAP-TGFβ1的-CD4+T细胞和CD14+单核细胞以及巨噬细胞增加(Basile等，Clin Exp Immunol 2016；187：160)，表明靶向在这些细胞上表达的LAP-TGFb1可能有利于治疗感染。因此，本文还提供了一种治疗具有多重耐药性结合分支杆菌的患者的方法，其包括向患者施用有效量的本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段(例如，抑制LAP-TGFβ1激活的抗LAP抗体)，以治疗感染。
在一些实施方式中，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段用于治疗β-地中海贫血，这是一种其中TGFβ超家族成员参与红细胞生成不足的病症(Dussiot等，Nat Med 2014；20：398-407)。
在某些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段可以用作单用疗法，以治疗疾病或病症(例如，癌症)。或者，可以将抗LAP抗体或抗原结合片段与另一种药剂或疗法(例如，抗癌剂、化学治疗剂、免疫抑制剂、免疫刺激剂、免疫检查点抑制剂、抗炎剂或细胞疗法)结合使用，如在下文中更加详细地描述的。
联合疗法
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以用于与本领域公知的用于治疗癌症的多种治疗或药剂(或在多特异性抗体或双功能性伴侣物的背景下)组合使用，如下文所述。
用于与本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段的联合疗法的适宜抗癌剂包括但不限于手术、化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法和放射疗法中使用的药剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微观蛋白剂以及治疗癌症的其他药剂，如抗HER-2抗体(例如，
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)、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼
Figure BDA0003108510350000882
)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如，GLEEVEC(甲磺酸伊马替尼))、COX-抑制剂(例如、塞来昔布)、干扰素、细胞因子、结合至下述靶点的一种或多种的拮抗剂(例如，中和抗体)：PD1、PDL1、PDL2(例如，派姆单抗；纳武单抗；MK-3475；AMP-224；MPDL3280A；MEDI0680；MSB0010718C；和/或MEDI4736)；CTLA4(例如，曲美单抗(PFIZER)和伊匹单抗)；LAG3(例如，BMS-986016)；CD 103；TIM-3和/或其他TIM家族成员；CEACAM-1和/或其他CEACAM家族成员，ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFRβ、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2、PARP抑制剂(例如，AZD-2281、Lynparza Olaparib、RubracaRucaparib；(Zejula)尼拉帕尼)、DNA损伤修复抑制剂(例如，ATMi、ATRi、DNAPKi)和其他生物活性和有机化学药剂。还特别地涵盖其组合用于本文所述的方法中。
用于与本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段的联合疗法的适宜化学治疗剂包括但不限于烷化剂，如塞替派和
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环磷酰胺；替莫唑胺；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，如苯唑多巴、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；多聚乙酰(特别是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓虫素；海洋抑素；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔毒素；多卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑素；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆固醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；生素类，诸如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ11和加利车霉素ω11(参见例如，Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐类，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素类、放线菌素、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉比辛、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、
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多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类，诸如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；氨苯吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱类，诸如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；
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多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌烯类(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；噻替哌；类紫杉醇，例如
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(紫杉醇；Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、
Figure BDA0003108510350000902
(不含克列莫佛、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(AmericanPharmaceutical Partners，Schaumberg，111.)和
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多西他塞(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；
Figure BDA0003108510350000904
吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINE，长春瑞滨；能灭瘤；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，诸如视黄酸；卡培他滨；考布他丁；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(TYKERB)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR的抑制剂(例如，厄洛替尼
Figure BDA0003108510350000905
)和减少细胞增殖的VEGF-A以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
亦适于与本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段组合使用的是靶向表观遗传调节剂的药物，如HDAC抑制剂、溴结构域抑制剂和E3连接酶(例如，cereblon)抑制剂(例如，来那度胺、泊利度胺和沙利度胺)。
用于与本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段的联合疗法的适宜抗炎剂包括但不限于阿司匹林和其他水杨酸盐、Cox-2抑制剂(例如，罗非昔布和塞来昔布)、NSAID(如布洛芬、非诺洛芬、萘普生、舒林酸、双氯芬酸、吡罗昔康、酮洛芬、二氟尼柳、萘丁美酮、依托度酸、奥沙普嗪和吲哚美辛)、抗IL6R抗体、抗IL8抗体、抗IL15抗体、抗IL15R抗体、抗CD4抗体、抗CD11a抗体(例如，依法利珠单抗)、抗α-4/β-1整联蛋白(VLA4)抗体(例如，那他珠单抗)、用于治疗炎性疾病的CTLA4-Ig、泼尼松龙、泼尼松、改善病情的抗风湿药物(DMARD)，如甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、嘧啶合成抑制剂(例如，来氟特米)、IL-1受体阻断剂(例如，阿那白滞素)、TNF-α阻断剂(例如，依那西普、英夫利西单抗和阿达木单抗)等。
适宜的免疫调节剂(例如，免疫刺激剂和免疫抑制剂)包括但不限于环孢菌素、硫唑嘌呤、霉酚酸、霉酚酸酯、皮质类固醇，如泼尼松、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺胺吡啶、抗疟疾药、布雷喹纳、来氟米特、咪唑立宾、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽、胸腺素-α、结合至IL-2受体的p75的抗体、结合至MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a或CD58的抗体，或结合至其配体可溶性IL-15R、IL-10、B7分子(B7-1、B7-2、其变体及其片段)、ICOS、OX40的抗体，阴性T细胞调节剂的抑制剂(如针对CTLA4的抗体)等。
其他免疫抑制剂包括，例如，抗TNF剂，如依那西普、阿达木单抗和英夫利西单抗，以及类固醇。特定天然和合成类固醇的实例包括，例如：醛固酮、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯泼尼醇、可的松、可的伐唑、脱氧皮质酮、地松奈德、去羟米松、地塞米松、二氟皮质酮、氟氯洛龙、氟米松、氟尼缩松、氟轻松、醋酸氟轻松、福可定丁酯、氟可的松、氟可松龙、氟米龙、氟氢缩松、氟替卡松、哈西奈德、氢化可的松、甲氧米松、甲泼尼龙、甲基泼尼松龙，对甲米松，泼尼松龙，泼尼松，替考克醇和曲安西龙。
用于与本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段的联合疗法的适宜免疫刺激剂包括，例如，能够刺激抗原呈递细胞(APC)的化合物，如树突状细胞(DC)和巨噬细胞。例如，适宜的免疫刺激剂能够刺激APC，这样APC成熟过程加速、APC增殖增加和/或共刺激分子(例如，CD80、CD86、ICAM-1、MHC分子和CCR7)和促炎性细胞因子(例如，IL-1β、IL-6、IL-12、IL-15和IFN-γ)的募集或释放上调。适宜免疫刺激剂还能够增加T细胞增殖。此类免疫刺激剂包括但不限于CD40配体；FLT3配体；细胞因子，如IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-2；集落刺激因子，如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)和GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)；抗CTLA-4抗体、抗PD1抗体、抗41BB抗体或抗OX-40抗体；LPS(内毒素)；ssRNA；dsRNA；卡介苗(BCG)；盐酸左旋咪唑；和静脉内免疫球蛋白。在一个实施方式中，免疫刺激剂可以是Toll样受体(TLR)激动剂。例如，免疫刺激剂可以是TLR3激动剂，如双链肌苷：胞嘧啶多核苷酸(Poly I：C，例如，可从Hemispherx Bipharma，PA，US作为AmpligenTM获得，或来自Oncovir的Poly IC：LC)或Poly A：U；TLR4激动剂，如单磷酰基脂质A(MPL)或RC-529(例如从GSK，UK获得)；TLR5激动剂，如鞭毛蛋白；TLR7或TLR8激动剂，如咪唑并喹啉TLR7或TLR8激动剂，例如咪喹莫德(例如，AldaraTM)或雷西莫德以及相关咪唑并喹啉药剂(例如，可从3M Corporation获得)；或者TLR9激动剂，如具有未甲基化的CpG基序的脱氧核苷酸(“CpG”，例如，可从ColeyPharmaceutical获得)。在另一个实施方式中，免疫刺激分子是STING激动剂。此类免疫刺激剂可以与本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段同时、分别或顺序施用。
适宜的免疫检查点阻断剂包括但不限于结合至PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、CTLA4、TIGIT、ICOS、OX40、PVR、PVRIG、VISTA和TIM3的药剂(例如，抗体)。结合至PD-1、PD-L1和PD-L2的抗体的非限制性实例包括派姆单抗；纳武单抗；MK-3475；MPDL32；MED10680；MEDI4736；AMP-224；和MSB0010718C。
在一些实施方式中，抗LAP抗体或抗原结合片段与靶向刺激性或抑制性分子的药剂一起施用，所述分子是免疫球蛋白超家族(IgSF)成员。例如，本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可与靶向IgSF家族成员的药剂一起向受试者施用以提高免疫应答。例如，抗LAP抗体或抗原结合片段可以与靶向膜结合配体的B7家族(其包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)和B7-H6)的成员或特异性结合至B7家族成员的共刺激性或共抑制性受体的药剂一起施用。
抗LAP抗体或抗原结合片段还可以与靶向分子(配体或受体)的TNF和TNFR家族的成员(如CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDA1、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY和NGFR)的药剂一起施用(参见，例如，Tansey(2009)Drug Discovery Today00：1)。
可以通过本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段与一种或多种下述药剂的组合刺激T细胞应答：
(1)抑制T细胞激活的蛋白的拮抗剂(抑制剂或阻断剂)(例如，免疫检查点抑制剂)，如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2和LAG-3，如上文所述，以及以下蛋白中的任一者：TIM-3、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素1、TIGIT、CD113、CD155、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1和TIM-4；和/或
(2)刺激T细胞激活的蛋白激动剂，如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、GITR、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H。
调节上述蛋白且可与本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段组合用于治疗癌症的示例性药剂包括：YervoyTM(伊匹单抗)或曲美单抗(针对CTLA-4)、加利昔单抗(针对B7.1)、BMS-936558(针对PD-1)、MK-3475(针对PD-1)、AMP224(针对B7DC)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A(针对B7-H1)、MEDI-570(针对ICOS)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3)、IMP321(针对LAG-3)、BMS-663513(针对CD137)、PF-05082566(针对CD137)、CDX-1127(针对CD27)、抗OX40(Providence Health Services)、huMAbOX40L(针对OX40L)、阿塞西普(针对TACI)、CP-870893(针对CD40)、卢卡单抗(针对CD40)、达西珠单抗(针对CD40)、莫罗单抗-CD3(针对CD3)、伊匹单抗(针对CTLA-4)。
可以与抗LAP抗体或抗原结合片段组合用于治疗癌症的其他分子包括在NK细胞上抑制性受体的拮抗剂或NK细胞上活化受体的激动剂。例如，抗LAP抗体或抗原结合片段可以与KIR的拮抗剂(例如，lirilumab)组合。
T细胞激活亦由可溶性细胞因子调控，并且抗LAP抗体与抑制T细胞激活的细胞因子的拮抗剂或刺激T细胞激活的细胞因子的激动剂一起向例如患有癌症的受试者施用。
在某些实施方式中，可以将抗LAP抗体或抗原结合片段与以下组合使用：(i)抑制T细胞激活的IgSF家族或B7家族或TNF家族的蛋白的拮抗剂(或抑制剂或阻断剂)，或抑制T细胞激活的细胞因子(例如，IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF；“免疫抑制性细胞因子”)的拮抗剂，和/或(ii)IgSF家族、B7家族或TNF家族或刺激T细胞激活的细胞因子的刺激性受体的激动剂，以用于刺激免疫应答，例如，用于治疗增殖性疾病，如癌症。
其他用于联合疗法的药剂包括抑制或耗竭巨噬细胞或单核细胞的药剂，包括但不限于CSF-1R拮抗剂，如CSF-1R拮抗剂抗体，包括RG7155(参见PCT公开号WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、WO13/87699、WO13/119716和WO13/132044)或FPA-008(参见PCT公开号WO11/140249；WO13169264；和WO14/036357)。
可以与抗LAP抗体或抗原结合片段联用的其他药剂包括增强肿瘤抗原呈递的药剂，例如，树突状细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸和咪喹莫德，或增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如，蒽环类抗生素)。
可以与抗LAP抗体联用的另一种疗法是抑制代谢酶(如吲哚胺双加氧酶(IDO)、色氨酸-2，3-双加氧酶、双加氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合酶)的疗法。
另一类可与抗LAP抗体一起使用的药剂包括抑制腺苷形成或抑制腺苷A2A受体的药剂，例如，抗CD73抗体、抗CD39抗体和腺苷A2A/A2b抑制剂。
可以与抗LAP抗体或抗原结合片段组合用于治疗癌症的其他疗法包括逆转/阻止T细胞失能或耗竭的疗法，以及引起肿瘤位点的先天性免疫激活和/或炎症的疗法。
抗LAP抗体或抗原结合片段可以与靶向免疫途径的多个元件的组合方法组合，如以下中的一种或多种：增强肿瘤抗原呈递的疗法(例如，树突状细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫德)；抑制负向免疫调控的疗法，例如，通过抑制CTLA-4和/或PD1/PD-L1/PD-L2途径和/或耗竭或阻断调节性T细胞或其他免疫抑制细胞；刺激正向免疫调控的疗法，例如，使用刺激CD-137和/或GITR途径和/或刺激T细胞效应功能的激动剂；全身性增加抗肿瘤T细胞的出现频率的疗法；使用CD25的拮抗剂(例如，达克珠单抗)或通过离体抗CD25小珠耗竭或抑制调节性T细胞的疗法；影响肿瘤中的抑制性髓细胞的功能的疗法；增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如，蒽环类抗生素)；使用过继性T细胞或NK细胞转移进行的细胞疗法，包括经基因修饰的细胞，例如，经嵌合抗原受体修饰的细胞(CAR-T疗法)；抑制代谢酶，如吲哚胺双加氧酶(IDO)、双加氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合酶的疗法；逆转/阻止T细胞失能或耗竭的疗法；触发肿瘤部位的先天性免疫激活和/或炎症的疗法；施用免疫刺激性细胞因子；或阻断免疫抑制性或免疫抑止性细胞因子。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与促炎性细胞因子(例如，IL-12和IL-2)组合。可以对这些细胞因子进行修饰以增强半衰期和肿瘤靶向。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与免疫细胞接合子(如NK细胞接合子或T细胞接合子)组合。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与吲哚胺双加氧酶(IDO)抑制剂、色氨酸-2，3-双加氧酶(TDO)抑制剂和双重IDO/TDO抑制剂组合。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与犬尿碱抑制剂组合。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与CD47和/或SIRPa阻断疗法组合。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与JAK抑制剂和JAK途径抑制剂(例如，STAT3抑制剂)组合，例如，用于治疗骨髓纤维化和骨髓增生性肿瘤。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与DNA损伤修复抑制剂组合。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与红细胞生成素和刺激造血的药物组合物。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与血管生成抑制剂组合。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段可以与抗病毒药(如神经氨酸酶抑制剂)组合。
可以将双特异性抗体与至少一种其他抗癌剂(例如，射线、化学治疗剂、生物制剂、疫苗)组合使用以抑制肿瘤生长，所述双特异性抗体具有第一结合区，其具有本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段的特异性，以及第二结合区，其结合至免疫检查点阻断剂(例如，PD-1、PD-L1)。
可以将本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段与一种或多种免疫刺激性抗体(如抗PD-1拮抗剂抗体、抗PD-L1拮抗剂抗体、拮抗剂抗CTLA-4抗体、拮抗性抗TIM3抗体和/或抗LAG3拮抗剂抗体)组合，以使得刺激受试者中的免疫应答，例如以抑制肿瘤生长。
示例性抗PD-1抗体包括在WO2012/145493中描述的纳武单抗、派姆单抗(也称为MK-3475、兰博单抗)；在WO 2012/145493中描述的AMP-514，以及在WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2011/066389，、WO 2011/161699、WO 2012/145493、美国专利号7,635,757和8,217,149以及美国专利公开号2009/0317368中描述的PD-1抗体和其他PD-1抗体。
示例性抗PD-L1抗体包括MEDI4736(也称为抗B7-H1)、MPDL3280A(也称为RG7446)、MSB0010718C(WO2013/79174)、rHigM12B7，以及在WO2013/173223、WO2011/066389、WO2012/145493、美国专利号7,635,757和8,217,149和美国专利公开号2009/145493中公开的任何抗PD-L1抗体。
示例性抗CTLA-4抗体包括YervoyTM(伊匹单抗)、曲美单抗(此前为替卡单抗，CP-675，206)，或者在下述公开文献中的任一者中描述的抗CTLA-4抗体：WO 98/42752；WO 00/37504；美国专利号6,207,156；Hurwitz等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17)：10067-10071；Camacho等，(2004)J.Clin.Oncology 22(145)：摘要第2505号(抗体CP-675206)；和Mokyr等，(1998)Cancer Res.58：5301-5304。
示例性抗LAG3抗体包括在美国专利公开号2011/007023，以及PCT公开号WO08/132601和WO09/44273中描述的IMP731和IMP-321，以及在美国专利公开号US2011/0150892，以及国际专利公开号WO10/19570和WO2014/008218中描述的抗体。
抗LAP抗体或抗原结合片段还可以与以下组合：免疫肿瘤学药剂，如CD137(4-1BB)激动剂(例如，激动性CD137抗体，如urelumab或PF-05082566(参见PCT公开号WO12/32433))；GITR激动剂(例如，激动性抗GITR抗体)、CD40激动剂(例如，激动性CD40抗体)；CD40拮抗剂(例如，拮抗性CD40抗体，如卢卡单抗(HCD122)、达西珠单抗(SGN-40)、CP-870，893或Chi Lob 7/4)；CD27激动剂(例如，激动性CD27抗体，如varlilumab(CDX-1127))、MGA271(针对B7H3)(WO11/109400)；KIR拮抗剂(例如，lirilumab)；IDO拮抗剂(例如，INCB-024360(WO2006/122150、WO07/75598、WO08/36653、WO08/36642)、吲哚莫德、NLG-919(WO09/73620、WO09/1156652、WO11/56652、WO12/142237)或F001287)；Toll样受体激动剂(例如，TLR2/4激动剂(例如，卡介苗)；TLR7激动剂(例如，希托洛或咪喹莫德)；TLR7/8激动剂(例如，雷西莫德)；或TLR9激动剂(例如，CpG7909))；和TGF-β抑制剂(例如，GC1008、LY2157299、TEW7197或IMC-TR1)。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段还可以与免疫原性药剂组合，如癌性细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞以及使用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(He等，(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原肽，如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(在下文中进一步讨论)。
本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段还可以与抗赘生性抗体组合，如
Figure BDA0003108510350000961
(利妥昔单抗)、
Figure BDA0003108510350000962
(曲妥珠单抗)、
Figure BDA0003108510350000963
(托西莫单抗)、
Figure BDA0003108510350000964
(替伊莫单抗)、
Figure BDA0003108510350000965
(阿伦单抗)、
Figure BDA0003108510350000966
(依帕珠单抗)、
Figure BDA0003108510350000967
(贝伐单抗)和
Figure BDA0003108510350000968
(厄洛替尼)等。
若干实验性治疗方案涉及离体抗原特异性T细胞的离体激活和扩增以及将这些细胞过继转移到受体中，以产生针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg&Riddell，见上文)。预期在存在本文中所述的抗LAP抗体的条件下，在存在或不存在其他免疫刺激疗法(例如，免疫检查点阻断剂)的条件下的离体激活可以提高过继转移的T细胞的出现频率和活性。
抗LAP抗体或抗原结合片段还可以与标准护理治疗，或另一种治疗，如射线、手术或化疗一起施用。抗LAP抗体或抗原结合片段可以与疫苗接种方案组合。已设计了很多用于针对肿瘤的疫苗接种的实验策略(参见Rosenberg，S.，2000，Development of CancerVaccines，ASCO Educational Book Spring：60-62；Logothetis，C.，2000，ASCOEducational Book Spring：300-302；Khayat，D.2000，ASCO Educational Book Spring：414-428；Foon，K.2000，ASCO Educational Book Spring：730-738；亦参见Restifo，N.和Sznol，M.，Cancer Vaccines，Ch.61，pp.3023-3043，DeVita等(编著)，1997，Cancer：Principles and Practice of Oncology，第五版)。在这些策略中的一个中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已证实这些细胞疫苗在肿瘤细胞经转导以表达GM-CSF时最有效。已证实GM-CSF是用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的高效激活剂(Dranoff等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90：3539-43)。
树突状细胞(DC)是可用于引发抗原特异性应答的高效抗原呈递细胞。DC可离体产生并加载有各种蛋白和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等，(1998)Nature Medicine4：328-332)。DC还可以通过基因方法转导以亦表达这些肿瘤抗原。DC还已直接融合至肿瘤细胞以用于免疫接种的目的(Kugler等，(2000)Nature Medicine 6：332-336)。作为疫苗接种的方法，DC免疫接种可与本文所述的抗LAP抗体或抗原结合片段有效地组合以活化更高效的抗肿瘤应答。
在一些实施方式中，本文中讨论的治疗性抗体的组合可以作为单一组合物在药学上可接受的载体中同时施用，或者作为单独的组合物与每种抗体在药学上可接受的载体中同时施用。在另一个实施方式中，可以顺序施用治疗性抗体的组合。
X.试剂盒
还提供了试剂盒，其包含本文公开的抗LAP抗体或抗原结合片段、多特异性分子或免疫缀合物，其任选地包含在单一药瓶或容器中，以及包含例如治疗或诊断疾病(例如，癌症)的使用说明书。试剂盒可以包含标签，其指示试剂盒内容物的预期用途。术语标签包括随试剂盒提供或随试剂盒一起提供的任何书写、营销材料或记录的材料。此类试剂盒可以包含在单位剂型(如在单剂量药瓶或单剂量预装载注射器)中的抗体、多特异性分子或免疫缀合物。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为进一步的限制。在本申请中引用的所有图和所有参考文献、Genbank序列、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
实施例
除非另有明示，否则根据生产厂商的说明书使用以下实施例中提及的市售试剂。除非另外说明，否则本发明使用重组DNA技术的标准程序，诸如上文以及以下教科书中所述的程序：Sambrook等，见上文；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.，1989)；Innis等，PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，Inc.：N.Y.，1990)；Harlw等，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press：Cold SpringHarbor，1988)；Gait，Oligonucleotide Synthesis(IRL Press：Oxford，1984)；Freshney，Animal Cell Culture，1987；Coligan等，Current Protocols in Immunology，1991。
以下实施例描述了抗LAP抗体28G11、22F9、20E6(也称为26E10)、17G8和24E3的表征，所述抗体是通过用小鼠TGFβ1对TGFβ1基因敲除小鼠进行免疫而产生，如在Oida等(PLoSOne 2010；5(11)：e15523)中所描述。在表34中提供了抗LAP抗体28G11、22F9、20E6、17G8和24E3的CDR序列、可变区序列和全长重链和轻链序列。这些抗体是以具有mIgG2a恒定区的小鼠抗体形式、具有人IgG恒定区的嵌合形式和/或人源化形式制备。
为产生具有mIgG2a恒定区的抗体，各抗体的可变区序列与小鼠IgG2a恒定区融合。使用重叠延伸PCR，使小鼠VH结构域与小鼠IgG2a恒定区的密码子优化基因(UniProt登录号#P01863)融合。使用重叠延伸PCR，使小鼠VL结构域与小鼠κ恒定区的密码子优化基因(UniProt登录号#P01837)融合。将完整的重链和轻链序列分别TOPO-TA克隆到pcDNA3.4中以在ExpiCHO细胞中表达。
为产生嵌合形式的抗体，将小鼠亲本克隆的可变区序列与人IgG1恒定区序列融合。使用重叠延伸PCR，将小鼠VH结构域与人IgG1恒定结构域的密码子优化基因(UniProt登录号#P01857)融合。使用重叠延伸PCR，将小鼠VL结构域与人κ恒定区的密码子优化基因(UniProt登录号#P01834)融合。将完整的重链和轻链序列分别TOPO-TA克隆到pcDNA3.4中以在ExpiCHO细胞中表达。
在实施例8-11中描述了抗体人源化的细节。
抗体的名称将遵循表2中描述的格式。
表2。
Figure BDA0003108510350000981
实施例1：抗LAP抗体与人和小鼠(murine)LAP-TGFβ1的结合
本实施例描述了使用生物层干涉法确定的抗LAP抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1和20E6_hIgG1结合至人和小鼠LAP-TGFβ1的能力。
使用EZ-Link SulfoNHS-LC-生物素(ThermoFisher)对嵌合抗体进行生物素化。在结合缓冲液(10mM磷酸钠、150mM氯化钠、1％(w/v)牛血清白蛋白、0.05％(w/v)叠氮钠，pH7.4)中平衡链霉亲和素官能化的尖端(tip)。将尖端浸没在结合缓冲液中的10μg/mL的生物素化、嵌合抗LAP的溶液中15秒以使用抗体加载尖端。然后，在结合缓冲液中洗涤加载抗体的尖端，并置于含有0-24nM的LAP-TGFβ(含有人IgG1 Fc结构域融合至人LAP-TGFβ1的融合蛋白或者具有C末端多聚组氨酸纯化标签的小鼠LAP-TGFβ1)的溶液中。使得抗原与抗体结合5分钟(结合期)，然后将尖端移至结合缓冲液中(解离期)。将结合期和解离期拟合至1∶1结合模型以测定结合速率常数。
如表3中所示，28G11_hIgG1、22F9_hIgG1和20E6_hIgG1以亚纳摩尔亲和力结合至人和小鼠LAP-TGFβ1两者。这些数据表明在存在锚定蛋白的情况下抗体结合至人和小鼠LAP-TGFβ1。
表3。
Figure BDA0003108510350000991
实施例2：抗LAP抗体与LAP-TGFβ亚型和LAP-TGFβ变体的结合
该实施例描述了抗LAP抗体与LAP-TGFβ亚型和LAP-TGFβ变体的结合。除了抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1和20E6_hIgG1以外，在该实验中还检测了抗LAP抗体17G8_hIgG1、24E3_hIgG1和2C9_(hyb)。简言之，在96孔板中培养4x 105个以下细胞中的每一种：(a)HT1080细胞，(b)过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞，(c)过表达人LAP-TGFβ2的HT1080细胞，(d)过表达人LAP-TGFβ3的HT1080细胞，(e)过表达小鼠LAP-TGFβ1的HT1080细胞，(f)P3U1细胞，(g)过表达LAP-TGFβ1和GARP的P3U1细胞，和(h)过表达LAP-TGFβ1和LRRC33的P3U1细胞。将板在1,500rpm下离心5min，除去液体，并将细胞重悬在200μL FACS缓冲液中。将板再次离心，将稀释的一抗加入每孔中，并将板在冰上孵育20分钟，随后离心。将细胞重悬在200μLFACS缓冲液中，再次离心，并重悬在50μL稀释的二抗(Alexa647-抗人IgG或APC-抗小鼠IgG)中。将板在冰上避光孵育20分钟，用200μL FACS缓冲液洗涤两次，并在Attune NXT仪器上读取来自每个孔的细胞(在200μL FACS缓冲液中)。
如图1A-1F中所示，所有检测的抗体结合至过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞系，但不结合至对照HT1080细胞或者过表达人LAP-TGFβ2或LAP-TGFβ3的细胞。所检测的抗体结合至P3U1-hTGFβ1细胞，并且当人GARP或LRRC33共表达时结合增强。抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1，而非2C9_(hyb)，结合至过表达小鼠LAP-TGFβ1的HT1080细胞。这些结果表明，抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1特异性结合至TGFβ的LAP-TGFβ1亚型。
检测了抗LAP抗体结合以下的能力：阻止由整联蛋白进行的TGFβ1激活(“封闭”构型)或促进释放(“开放”构型)的TGFβ1变体、含有来自鸡TGFβ1的残基的嵌合TGFβ1序列、和仅含有LAP的TGFβ1变体(即，不含有成熟细胞因子的人TGFβ1变体)。
简言之，在96孔板中培养4x 105个以下细胞中的每一种：(a)HT1080细胞，(b)过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞，(c)过表达具有K27C和Y75C突变的LAP-TGFβ1的HT1080细胞，(d)过表达具有Y74T突变的LAP-TGFβ1的HT1080细胞，(e)过表达嵌合LAP-TGFβ1的HT1080细胞，嵌合LAP-TGFβ1的人LAP-TGFβ1的外显子2.3(残基131-164)已被来自鸡LAP-TGFβ1(UniProt登录号#H9CX01)的相应残基代替，(f)过表达嵌合LAP-TGFβ1的HT1080细胞，嵌合LAP-TGFβ1的人LAP-TGFβ1的外显子4(残基183-208)已被来自鸡LAP-TGFβ1的外显子4代替，(g)过表达嵌合LAP-TGFβ1的HT1080细胞，嵌合LAP-TGFβ1的人LAP-TGFβ1的外显子2.2(残基108-130)已被来自鸡LAP-TGFβ1的外显子2.2代替，和(h)过表达仅含有LAP的变体(即“空LAP”)的HT1080细胞。以上文针对亚型特异性结合实验所描述的相同方式对细胞进行流式细胞术。
如图2A-2F中所示，尽管所检测的抗LAP抗体均不结合至未转导的HT1080细胞，但是所有检测的抗体均结合至过表达野生型人LAP-TGFβ1的HT1080细胞。抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1结合至K27C/Y75C(“封闭”)LAP-TGFβ1变体，但不结合至Y74T(“开放”)LAP-TGFβ1变体。而相反的是，抗体2C9_(hyb)结合至K27C/Y75C和Y74T LAP-TGFβ1变体两者。抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1，而非2C9_(hyb)，结合至含有鸡外显子#2.3和#4的嵌合LAP-TGFβ1。此外，如图3A-3F中所示，尽管所有检测的抗体均结合至过表达野生型人LAP-TGFB1的HT1080细胞，但是抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1不结合至仅含LAP的变体或含鸡外显子#2.2的嵌合LAP-TGFβ1。
为了确定抗LAP抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1是否结合至游离人TGFβ1(即，缺乏LAP的成熟TGFβ1)，评价了抗体抑制抗TGFβ ELISA的能力。简言之，将成熟TGFβ1(1000pg)与10μg/mL的所示抗LAP抗体在冰上孵育10分钟，将同种型抗体作为阴性对照或者将市售的抗TGFβ抗体作为阳性对照。例如，1D11抗体可从多个销售商购得，例如，Bio x Cell Inc.(West Lebanon，NH)。根据生产厂商的说明书，在TGFβ1 ELISA(R&D Systems)中测定上清液，以测量游离TGFβ1。如图4中所示，抗TGFβ抗体1D11结合至成熟TGFβ并抑制ELISA，但使用28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1未见抑制。这些数据表明，28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1抗体不结合至缺乏LAP的成熟TGFβ1。应注意图示(Figure)和图(Fig.)在本申请中可以互换使用。
总而言之，这些结果表明，抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1共享相关表位。检测的所有抗LAP抗体结合至过表达野生型人LAP-TGFβ1的HT1080细胞(HT1080-hβ1)，但是不结合至未转导的HT1080细胞。抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1不结合至仅含有LAP的构建体或含有鸡外显子#2.2的嵌合体。抗体2C9_(hyb)结合至仅含有LAP的构建体，但不结合至外显子#2.2嵌合体。该数据汇总表明，抗体28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1仅结合至含有成熟细胞因子的LAP，这得到了图4中所示结果的支持。然而，具有鸡外显子#6和#7的嵌合体(其包含成熟细胞因子)由28G11_hIgG1结合(数据未显示)，初步表明28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1不直接结合成熟细胞因子，而是对由存在或不存在成熟细胞因子诱导的LAP区域中的构型变化具有敏感性。而相比之下，2C9结合至LAP的所有变体，包括“开放”和“封闭”构型变体，以及在存在或不存在成熟细胞介导的情况下的LAP。
通过使用流式细胞术评估细胞表面嵌合的人/鸡LAP-TGFβ1分子的结合来定位28G11的结合表位。基于以下假设使用这些结合数据确定表位：
1.抗LAP抗体将不结合至鸡LAP-TGFβ序列。
2.在细胞表面上正确地表达和展示了人/鸡嵌合体。
3.如果抗LAP抗体确实结合至嵌合体，则该外显子中的残基均不是表位的一部分。
4.如果抗LAP抗体未结合至嵌合体，则该外显子中的至少一个残基是表位的一部分，或者该外显子中存在鸡序列会引起破坏表位的LAP-TGFβ的另一部分的构型变化。
通过使用同源鸡LAP-TGFβ1序列代替人LAP-TGFβ1中的单个外显子来制备嵌合LAP-TGFβ1分子(表4)。人和鸡LAP-TGFβ1共享约50％序列同一性。所检测的LAP-TGFβ1序列的氨基酸序列如表34中所示。
表4：用于表位定位的LAP-TGFβ1序列
Figure BDA0003108510350001011
Figure BDA0003108510350001021
将这些构建体亚克隆至慢病毒并转导至HT1080细胞。通过表达绿色荧光蛋白(GFP)报告基因来确认成功基因整合。使用针对来自成熟细胞因子(残基250-361)结构域的肽(Abcam目录号#ab179695)产生的家兔单克隆抗体(Rmab)，28G11_(hyb)and 2C9_(hyb)，通过流式细胞术评价LAP-TGFβ1的表达。简言之，在96孔板中培养4x 105个以下细胞中的每一种：(a)HT1080细胞，(b)过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞，(c)过表达鸡LAP-TGFβ1的HT1080细胞，和(d)过表达人/鸡嵌合体#1-#7的HT1080细胞。将板在1,500rpm下离心5min，除去液体，并将细胞重悬在200μL FACS缓冲液中。将板再次离心，将稀释的一抗加入各孔中，将板在冰上孵育30分钟，随后离心。将细胞重悬在200μL FACS缓冲液中，再次离心，并在50μL稀释的二抗(APC-抗小鼠IgG)中重悬。将板在冰上避光孵育20分钟，使用200μL FACS缓冲液洗涤两次，并在Attune NXT仪器上读取来自每个孔的细胞(在200μL FACS缓冲液中)。如果＞10％的细胞为GFP+/APC+且GFP与别藻蓝蛋白(APC)信号之间存在明显相关性，则认为抗体结合(表5)。
表5：通过流式细胞术的GFP+/APC+细胞％
HT1080变体 Rmab 28G11(hyb) 2C9(hyb)
空 0.7％ 0.0％ 0.0％
huB1 68.9％ 98.3％ 72.4％
chB1 0.5％ 0.3％ 1.1％
嵌合体#1 7.5％ 0.2％ 7.6％
嵌合体#1.2 78.3％ 84.1％ 81.8％
嵌合体#1.3 65.2％ 83.0％ 82.6％
嵌合体#2 1.5％ 0.2％ 4.1％
嵌合体#2.1 79.1％ 3.5％ 5.6％
嵌合体#2.2 47.2％ 0.5％ 0.2％
嵌合体#2.3 ND 94.7％ 0.3％
嵌合体#3 46.3％ 32.2％ 34.0％
嵌合体#4 56.2％ 76.2％ 2.8％
嵌合体#5 11.9％ 41.7％ 4.0％
嵌合体#6 76.7％ 84.9％ 87.6％
嵌合体#7 0.6％ 44.4％ 63.9％
所有三种抗体均结合至过表达人LAP-TGFβ的阳性对照HT1080细胞系。使用阴性对照细胞株(HT1080-空)未观察到结合。抗体均不结合鸡LAP-TGFβ1，表明人和鸡同源物之间的序列差异足以破坏由这些抗体识别的表位。嵌合体#1和#2均未被任何抗体识别，表明这些构建体未有效表达。为检测这种假设，将更小部分的鸡序列插入人序列的外显子#1或#2中(嵌合体#1.2、1.3、2.1、2.2和2.3)。具有这些更小替代的构建体被Rmab抗体所识别，表明其在HT1080细胞中稳定表达。嵌合体#7未由Rmab抗体结合，但是被28G11_(hyb)和2C9_(hyb)两者所识别，表明该构建体在细胞表面上表达，且针对Rmab的表位可能位于蛋白的该区域中。
28G11_(hyb)抗体结合至嵌合体#1.2、1.3、2.3、3、4、5、6和7，表明这些区域与该抗体的表位无关。相比之下，嵌合体#2.1和#2.2未由28G11(hyb)结合，表明这种抗体在序列VLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAE(SEQ ID NO：215)内结合至人LAP-TGFβ1。
在嵌合体#2.1、2.2、2.3、4和5中存在鸡残基破坏2C9_(hyb)结合。这表明，这表明该抗体与不连续的表位结合，该不连续的表位引入了在序列中存在一定距离但在抗原的三维结构中相邻的这些插入序列中每个序列的一部分。
实施例3：结合至LAP-TGFβ1上的目标特异性表位的抗体的产生
如在实施例2中所述，具有人和鸡序列的组合的构建体能够折叠成正确结构。因此，可产生能够用作免疫原的其他嵌合体以靶向LAP-TGFβ1上的特定目标表位。这些构建体将是实施例2中所述的构建体的反转型。也就是说，将从鸡LAP-TGFβ1获得大部分序列，将人LAP-TGFβ1的小区段插入到含有所需表位的区域中。可以使用此策略靶向的LAP-TGFβ1上的示例性表位包括例如包含人LAP-TGFβ1的氨基酸82-130的表位、LAP-TGFβ1的下臂或LAP-TGFβ1的潜在环。该嵌合蛋白可用于使鸡免疫以产生单克隆抗体。由于鸡LAP-TGFβ1将被识别为自身，因而免疫应答将集中在人序列。可以用于免疫鸡的示例性鸡-人嵌合体如表6中所示。在表34中提供了这些嵌合体的序列。可以使用本文所述的方法检测以这种方法产生的抗LAP抗体的各种功能(例如，与人LAP-TGFβ1结合、抑制LAP-TGFβ1激活、与免疫细胞结合)。
表6：用于免疫接种的鸡-人嵌合体
Figure BDA0003108510350001041
Figure BDA0003108510350001051
实施例4：抗LAP抗体对TGFβ1激活的作用
本实施例描述了抗LAP抗体28G11_hIgG1、28G11_mIgG2a、17G8_hIgG1、24E3_hIgG1、22F9_hIgG1、22F9_mIgG2a、20E6_hIgG1和20E6_mIgG2a抗体对TGFβ1激活的作用。
简言之，将表达人LAP-TGFβ1的P3U1细胞或表达小鼠LAP-TGFβ1的P3U1细胞在圆底组织培养板中的无血清高级DMEM中培养过夜，并且次日用抗LAP抗体(以20ug/ml的高浓度起始的2倍连续稀释物)处理24小时。通过利用市售人TGFβ1 ELISA试剂盒(R&D Systems)，根据生产厂商的说明书，在细胞培养物的上清液中检测具有活性的TGFβ1。
图5A和图5B显示28G11_hIgG1抑制表达人LAP-TGFβ1(IC50＝1.4ug/ml)和小鼠LAP-TGFβ(IC50＝1ug/ml)的P3U1细胞中的TGFβ1激活。
与图5中使用28G11的实验相同，所检测的抗体在表达人LAP-TGFβ1的P3U1细胞中抑制TGFβ1激活。数据如下图中所示；显示了针对以下的IC50值：抗体17G8(图6A，针对人TGFβ1(IC50＝1.5ug/ml)和图6B，针对小鼠TGFβ1(IC50＝0.59ug/ml))，抗体24E3(图6C，针对人TGFβ1(IC50＝2.6ug/ml)和图6D，针对小鼠TGFβ1(IC50＝0.76ug/ml))，抗体22F9(图6E，针对人TGFβ1(IC50＝1.8ug/ml))和抗体20E6(图6F，针对人TGFβ1(IC50＝1.08ug/ml))。
进行其他实验以进一步证实抗体在表达人LAP-TGFβ1的P3U1细胞或表达小鼠LAP-TGFβ1的P3U1细胞中抑制激活。数据如下图中所示；显示了针对以下的IC50值：抗体28G11_mIgG2a(图6G：针对人TGFβ1的IC50＝1.6ug/ml和针对小鼠的TGFβ1为0.8ug/ml)，抗体20E6_mIgG2a(图6H：针对人TGFβ1的IC50＝1.4ug/ml和针对小鼠的TGFβ1为1.0ug/ml)，抗体22F9_mIgG2a(图6I：针对人TGFβ1的IC50＝1.8ug/ml和针对小鼠的TGFβ1为1.0ug/ml)，抗体24E3_hIgG1(图6J：针对人的TGFβ1 IC50＝2.5ug/ml和针对小鼠的TGFβ1为1.1ug/m)，抗体17G8_hIgG1(图6K：针对人TGFβ1的IC50＝1.0/ml和针对小鼠的TGFβ1为1.4ug/ml)，抗体20E6_H0.2aL1(图6L：针对人TGFβ1的IC50＝1.3ug/ml和针对小鼠的TGFβ1为1.7ug/ml)。
与上述结果一致，在使用基于P3U1细胞的测定的一项单独的实验中，28G11_hIgG1、22F9_hIgG1和20E6_hIgG1均有效抑制人TGFβ1激活(表7)。
表7。
Figure BDA0003108510350001061
因此，在本实施例中所述的多项实验表明，本文所述的抗LAP抗体对TGFβ1激活具有抑制作用。
实施例5：抗LAP抗体与胞外基质的结合
本实施例描述了28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、2C9_mIgG2a、16B4_mIgG2a、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1抗体结合ECM中的LAP-TGFβ1的能力。
简言之，为评价结合至ECM的抗体，在圆底组织培养板中将P3U1细胞孵育48小时。然后，除去细胞，在板表面上留下ECM。对以下三个不同组进行比较：(a)表达人LAP-TGFβ1的P3U1细胞，(b)表达小鼠LAP-TGFβ1的P3U1细胞，和(c)无LAP-TGFβ1的P3U1细胞(空细胞)。然后，使用生物素化的抗LAP抗体测定抗体与LAP-TGFβ1/ECM的结合，随后与链霉亲和素辣根过氧化物酶(HRP)和3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物一起孵育。
如图7中所示，28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1抗体未结合至LAP-TGFβ1/ECM。而相比之下，抗LAP抗体16B4显示出与LAP-TGFβ1/ECM中的小鼠LAP-TGFβ1的强结合，和抗LAP抗体2C9显示出与LAP-TGFβ1/ECM中的人LAP-TGFβ1的强结合。该结果表明，尽管28G11_hIgG1、22F9_hIgG1、20E6_hIgG1、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1与表达小鼠或人LAP-TGFβ1的细胞强结合，但是其不结合至ECM中的小鼠或人LAP-TGFβ1。
实施例6：抗LAP抗体与血小板的结合
本实施例描述了抗LAP抗体与血小板的结合及其对血小板脱颗粒的作用。
简言之，通过流式细胞术进行直接血小板结合测定。将稀释的全人血与所示浓度的直接缀合的抗LAP抗体(28G11_(hyb)、20E6_mIgG2a、22F9_mIgG2a、17G8_hIgG1和24E3_hIgG1)一起孵育15分钟。然后，将反应物与市售的针对CD61的直接缀合的抗体(BioLegend)一起孵育15分钟，并通过流式细胞术进行分析。数据表示CD61阳性血小板的抗LAP平均荧光强度。如图8中所示，抗LAP抗体28G11、20E6、22F9、17G8和24E3以剂量反应性方式结合至血小板。
针对血小板脱颗粒对这些抗LAP抗体进行进一步检测。简言之，将稀释的全人血与所示浓度的抗LAP抗体或作为阳性对照的二磷酸腺苷(ADP)一起孵育15分钟。然后，将反应物与检测全血小板的针对CD61的和检测脱颗粒的血小板的针对CD62P(BioLegend)的直接缀合的抗体一起再孵育15分钟。通过流式细胞术对样品进行分析，以确定CD62P+血小板的百分比。
如图9A-9E中所示，所检测的抗体(即，28G11、20E6、22F9、17G8和24E3)即使在检测的最高剂量下也均不会诱导显著的血小板脱颗粒。
实施例7：抗LAP抗体与免疫细胞的差异结合
本实施例描述了抗LAP抗体与不同类型免疫细胞的结合。
检测抗LAP抗体结合至THP-1细胞(来源于急性单核细胞性白血病患者的细胞系，已报道其表达LRRC33)的能力。将THP-1细胞与FACS缓冲液和人Fc嵌段一起孵育，随后与不同浓度的Alexa 647缀合的28G11_(hyb)、22F9_mIgG2a、20E6_mIgG2a、17G8_hIgG1、24E3_hIgG1、2C9_mIgG2a或mIgG2a同种型对照一起孵育。通过流式细胞术对细胞进行分析，并以阳性THP-1细胞的百分比或抗LAP结合的中位荧光强度(MFI)作图。如图10A和图10B中所示，抗体22F9、17G8、24E3、20E6和2C9显示出与THP-1细胞的强结合。未发现抗LAP抗体28G11的高于背景的结合。在另一项实验中，使用上文所述的方法，比较了20E6mIgG2a和7H4 hyb与THP-1细胞的结合。如图10C中所示，并且与图10A和图10B一致，20E6显示出与THP-1细胞的强结合，而7H4未显示出结合。在一项单独的实验中，将THP-1细胞与FACS缓冲液和人Fc嵌段一起孵育，然后与5ug/ml的Alexa 647缀合的28G11_(hyb)、22F9_mIgG2a、20E6_mIgG2a、2C9_mIgG2a或IgG2a同种型对照一起孵育。通过流式细胞术对细胞进行分析并以单细胞形式门控。代表性的点图如图10D中所示；在这些图中，抗体为5ug/ml。
针对其结合至U937细胞的能力对抗LAP抗体进行检测，U937细胞是来源于患有组织细胞淋巴瘤的患者的髓细胞系。将U937细胞与FACS缓冲液和人Fc嵌段一起孵育，然后与不同浓度的Alexa 647缀合的28G11_hyb、22F9_mIgG2a或20E6_mIgG2a一起孵育。在一项单独的实验中，将U937细胞与FACS缓冲液和人Fc嵌段一起孵育，然后与10ug/mlAlexa 647缀合的28G11_hyb、22F9_mIgG2a、20E6_mIgG2a或mIgG2a同种型对照一起孵育(图10E和图10F)。代表性的点图如图10G中所示；在这些图中，抗体为10ug/ml。通过MFI以及结合的剂量应答，证实抗LAP抗体28G11、22F9和20E6类似地结合至U937细胞。
这些数据表明，抗LAP抗体28G11、22F9和20E6显示与一种LAP+髓细胞系相当的结合，但与另一种LAP+髓细胞系的结合显著不同。进行以下实验以确定是否可在未转化的细胞群中观察到相同的差异结合。
针对其结合至从携带CT26肿瘤的小鼠中分离的免疫细胞的能力，对抗LAP抗体进行检测。简言之，将1x106个CT26细胞注射至6只雄性Ba1b/C小鼠的肋腹区域中。当平均肿瘤体积达到约80mm3时，使用10mg/kg的IgG2a或IgG1同种型对照抗体对小鼠进行治疗(这是实验的最初部分，其中用治疗性抗体治疗小鼠，并且旨在将这些动物作为对照)。在3天后再次对小鼠进行治疗，并在首次注射后7天进行收集。在GentlMACS解离器中解离肿瘤组织，并用胶原酶Iv/DNase1消化，通过70-μm细胞过滤器过滤并计数。通过穿过70-μm细胞过滤器解离脾组织并计数。使用以下流程，通过流式细胞术对细胞进行分析：活细胞上的门控→单细胞上的门控→CD45+细胞上的门控→CD41-群上的门控→适当免疫细胞子集上的门控，如下所示：
·CD4 T细胞-CD45+、CD3+、CD4+
·调节性T细胞-CD45+、CD3+、CD4+、Foxp3+
·CD8 T细胞-CD45+、CD3+、CD8+
·CD11b-CD45+、CD11b+
·M2巨噬细胞-CD45+、CD11b+、F4/80+、CD206+
·树突状细胞-CD45+、F4/80-、CD11c+
·M-MDSC-CD45+、CD11b+、F4/80-、Ly6G-、Ly6C高
·G-MDSC-CD45+、CD11b+、F4/80-、Ly6G+
·M1巨噬细胞-CD45+、CD11b+、F4/80+、MHC II高、CD206-
·NK细胞-CD45+、CD49b+
使用Alexa 647-标记的28G11-IgG2a、22F9-IgG2a和20E6-IgG2a分析抗LAP抗体的结合。数据总结见表8和图11。三种抗LAP抗体28G11、22F9和20E6对肿瘤组织中的临床相关免疫细胞子集显示出显著不同的结合性质。最值得注意的是，与28G11相比，22F9和20E6结合至更高百分比的调节性T细胞、M2巨噬细胞和M-MDSC。这些数据表明，尽管这三种抗体在其结合和功能性性质方面均具有相似性(参见实施例1、2和4-6)，但是抗体在其与已知在免疫抑制性肿瘤微环境中重要的细胞群的结合方面显示出显著差异。例如，与28G11相比，22F9和20E6两者结合更高百分比的调节性T细胞、M2巨噬细胞和M-MDSC。这支持在调节肿瘤中的这些重要的免疫抑制性细胞群方面，22F9和20E6相比于28G11的优越性。此外，22F9和20E6的结合差异支持在给定肿瘤中可能优先使用一种或另一种抗体，取决于浸润白细胞群的组成，。
表8：在肿瘤中与免疫细胞的结合(表示为6只单独的小鼠的阳性％±SEM)
Figure BDA0003108510350001081
Figure BDA0003108510350001091
通过流式细胞术与肿瘤组织平行分析来自相同小鼠的脾细胞。如表9中所示，与来自那些相同小鼠的肿瘤的免疫细胞(表8)相比，抗体28G11、22F9和20E6结合更低百分比的荷瘤小鼠的脾脏中的免疫细胞。这些数据表明，所有三种抗体的肿瘤选择性。观察到了抗体之间的一些差异，其中22F9显示出在脾脏中的最强结合。这支持20E6在偏好肿瘤环境中的最大选择性的背景下的优越性。
表9：在脾细胞中与免疫细胞的结合(表示为6只单独的小鼠的阳性％±SEM)
免疫细胞类型 28G11 22F9 20E6
CD4 1.6±0.05 2.9±0.06 1.7±0.06
调节性T细胞 4.0±0.4 6.1±0.5 3.6±0.3
CD8 0.9±0.02 1.9±0.1 0.9±0.05
CD11b 4.0±0.5 17.2±1.1 4.2±0.2
M2巨噬细胞 1.8±0.6 11.3±1.7 2.6±0.5
树突状细胞 4.9±0.5 21.5±1.1 6.3±0.5
M-MDSC 8.2±0.6 21.7±2.2 4.9±0.3
G-MDSC 1.6±0.4 8.0±0.4 2.1±0.2
M1巨噬细胞 1.0±0.3 11.7±1.3 1.7±0.4
NK细胞 3.0±0.2 13.4±1.2 4.5±0.2
还考察了抗体28G11、22F9、20E6、17G8、24E3和2F8结合至人巨噬细胞子集的能力。简言之，从StemExpress获得CD14+细胞，其中其通过磁性阴性选择从供体的全血分离。将细胞在具有以下添加物的Immunocult巨噬细胞培养基(StemCell tech)+M-CSF(50ng/ml)中培养6天以使细胞转变成特异性巨噬细胞亚型(M1巨噬细胞：50ng/mlh-IFN-γ+10ng/mlLPS；M2a巨噬细胞：10ng/ml h-IL4；M2b巨噬细胞：固化的IgG+100ng/ml LPS；M2c巨噬细胞：10ng/ml IL10+20ng/mlTGFβ)。使用CD14和Alexa 647-标记的LAP抗体28G11_mIgG2a、22F9_mIgG2a、20E6_mIgG2a、17G8_hIgG1、24E3_hIgG1、2F8_(hyb)、mIgG2a同种型对照或hIgG1同种型对照对细胞染色。在分析之前，以活的、单细胞对细胞进行门控。
如表10中所示，抗LAP抗体对分离的人巨噬细胞子集显示出显著不同的结合模式。值得注意的是，与28G11或20E6相比，22F9结合显著更高的百分比的所有巨噬细胞亚群。与28G11相比，20E6结合更高百分比的M1巨噬细胞。
表10：与来自健康供体的免疫细胞的结合(以阳性％表示)
Figure BDA0003108510350001101
在一项独立的实验中，还评估了抗LAP抗体与激活的人CD4+T细胞群的结合。根据由生产厂商(StemCell Tech)提供的说明书，使用磁性阴性选择，从PBMC中分离CD4+细胞。使用Dynabeads(Thermo)：细胞1∶1的比率激活细胞，并在高级RPMI+10％FBS+30U/m1人IL2中培养48小时。使用活/死染料对细胞染色，然后针对LAP表达用CD4、CD25和28G11-IgG2a、22F9-IgG2a、20E6-IgG2a、17G8-hIgG1、24E3-hIgG1、2F8_(hyb)、IgG1同种型对照或IgG2a同种型对照染色。根据生产厂商的建议(Ebiosciences)固定和透化细胞，以用于Foxp3染色，并针对Foxp3进行染色。在分析之前，以活的、单细胞、CD4+和CD25+形式对细胞进行门控。与其他所检测的抗LAP抗体相比，发现22F9结合更高百分比的已激活的CD4+细胞。
与特异性细胞群的结合增加，预期与直接临床获益相关。本文所描述的抗体抑制TGFβ激活和成熟细胞因子的释放。由于TGFβ以自分泌或近旁分泌方式产生作用，与特异性细胞群选择性结合将会在紧邻所示的细胞群的位置处抑制产生成熟TGFβ。因此，例如，当预期抗LAP抗体20E6与调节性T细胞的结合性比抗体28G11提高时，将会在那些相同调节性T细胞的表面处造成选择性降低的TGFβ水平。鉴于TGFβ是调节性T细胞的主要驱动因素，预期这会在肿瘤微环境中造成调节性T细胞的数量降低，以及20E6比28G11提高的临床有效性。在第二个实例中，当预期抗LAP抗体22F9与巨噬细胞子集的结合性比抗体28G11提高时，将会在那些相同巨噬细胞的表面处造成选择性降低的TGFβ水平。鉴于TGFβ是依赖细胞接触的巨噬细胞抑制效应T细胞功能的主要机制，因此预期这会导致巨噬细胞介导的抑制作用降低，以及在肿瘤微环境中效应T细胞功能增强，并且20E6的临床有效性优于28G11。
在一些实施方式中，抗LAP抗体是具有活性效应功能的同种型，并增强特异性抗LAP抗体与特定细胞群的结合性将会导致被ADCC或CDC耗竭的细胞群增加。因此，例如，当预期抗LAP抗体20E6与调节性T细胞的结合性比抗体28G11提高时，将会造成在肿瘤微环境中ADCC或CDC介导的那些调节性T细胞的耗竭增加，以及20E6比28G11提高的临床有效性。在第二个实例中，当预期抗LAP抗体22F9与巨噬细胞子集的结合性比抗体28G11提高时，将会造成在肿瘤微环境中ADCC或CDC介导的那些巨噬细胞子集的耗竭增加，以及22F9比28G11提高的临床有效性。
在该实施例中存在的数据证明，可在小鼠和人系统中以及在原代细胞群和转化细胞系中证明本文所述的抗LAP抗体以不同方式结合至免疫细胞亚群的发现结果。
实施例8：人源化抗LAP抗体的产生
本实施例描述了抗LAP抗体28G11、22F9和20E6的人源化。
使用Modeller(使用多个结构模板以组装结构模型的程序)构建28G11、22F9和26E10(也称为20E6)可变区的模型。选择PDB码3dv6作为28G11重链(与28G11 VH结构域具有86％序列同一性)的模板，并选择2zjs作为28G11轻链(与28G11 VL结构域具有97％序列同一性)的模板。选择PDB码1a6v作为22F9重链(与22F9 V区具有89％序列同一性)的模板，并选择PDB码2xqy作为轻链22F9轻链(与22F9 V区具有94％序列同一性)的模板。选择PDB码1a6v作为26E10(20E6)重链(与26E10(20E6)V区具有93％序列同一性)的模板，并选择PDB码1jv5作为26E10(20E6)轻链(与26E10V区具有96％同一性)的模板。组装可变区的结构模板，并用Modeller优化。
为选择轻链和重链的抗体受体框架序列，使用抗体序列数据库和查询工具鉴别在典型(canonical)、界面和Vernier区残基方面与小鼠28G11、22F9和26E10(20E6)序列具有最高相似性；相同长度的CDR(如有可能)(除CDR-H3以外)；以及最小所需数量的回复突变(即，人受体与成熟小鼠抗体相比的框架残基类型的变化)的适合的模板。还考虑了在FR4框架区中填充有人共有残基的人种系序列。
根据上述分析，将28G11的CDR序列移植到IGHV3-72*01(H0)和IGKV1-27*01(L0)种系上。对于22F9的人源化，将22F9的CDR序列移植到IGHV1-46*01(H0)和IGKV1-39*01(L0)种系上。对于人源化20E6，将20E6的CDR序列移植到人IGHV1-2*05(H0)和IGKV1-33*01(LO)种系上。基于同源性模型的分析来引入对这些人源化抗体的重链和/或轻链中的小鼠序列的回复置换。还引入置换(如以下实施例中所讨论的)以除去潜在脱酰胺化和异构化位点。检测这些候选物中的每一个的各种功能，包括与过表达LAP-TGFβ1的细胞的结合，如以下实施例中所描述的。
实施例9：人源化28G11候选物和除去责任(liability)位点的28G11变体的表征
在该实施例中，考察了各种人源化28G11候选物的特征，以鉴定保持亲本抗体的功能(例如，与TGFβ1的结合)的人源化抗体。还考察了除去脱酰胺化/异构化位点的28G11变体。表11总结了在该实施例中使用的各种人源化28G11构建体(重链和轻链序列)。在表34中提供了这些构建体的序列。
表11：示例性28G11抗体和抗原结合片段
Figure BDA0003108510350001121
在第一项实验中，在流式细胞术测定中，通过与生物素-28G11竞争来检测各种人源化28G11候选物与人LAP-TGFβ1的结合的保持情况。
以40,000个细胞/孔的密度将过表达人GARP和LAP-TGFβ1的P3U1细胞接种在圆底96孔板中。使用FACS缓冲液(含25mM HEPES、2mMEDTA、2％牛血清白蛋白的Hank平衡盐溶液)洗涤细胞。将50μL 1：200稀释的TruStain小鼠FcX(BioLegend)加入各孔中，随后加入50μL100ng/μL的人源化28G11构建体(H0L0、H0L1、H0L2、H0L3、H1L0、H1L1、H1L2、H1L3、H2L0、H2L1、H2L2、H2L3)。见表34。使抗体结合10分钟。向各孔中添加50μL 6.2ng/μL的生物素化的小鼠杂交瘤28G11_(hyb)。使生物素化的抗体结合10分钟，然后用FACS缓冲液洗涤细胞两次。将细胞用别藻蓝蛋白-链霉亲和素(BioLegend)标记15分钟，使用FACS缓冲液洗涤两次，并通过流式细胞术进行分析。
如图12中所示，所有具有H0、H1或L0的构建体未能阻断生物素-28G11与人LAP-TGFβ1的结合，表明这些人源化框架未能使CDR环具有用于紧密LAP-TGFβ1结合的正确结构。28G11_H2L1、28G11_H2L2和28G11_H2L3与亲本小鼠抗体竞争。对这些构建体进行生物素化以确证特异性结合。
接下来，检测了人源化28G11变体与过表达人GARP和LAP-TGFβ1的P3U1细胞的直接结合。简言之，如上文所述，接种、洗涤和使用FcX处理过表达人GARP和LAP-TGFβ1的P3U1细胞。将细胞与10μg/mL生物素化的28G11_H0L3、28G11_H2L0、28G11_H2L1、28G11_H2L2或28G11_H2L3一起在4℃下孵育20分钟。洗涤细胞，用APC-链霉亲和素染色，再次洗涤并如上所述通过流式细胞术进行分析。与竞争实验一致，28G11_H0L3和28G11_H2L0不结合，但28G11_H2L1、28G11_H2L2和28G11_H2L3显示出与人LAP-TGFβ1的强效结合(图13)。
在基于ELISA的测定中检测了28G11_H2L1、28G11_H2L2和28G11_H2L3(其在上文所述的研究中所检测的人源化28G11变体中显示最强效结合)抑制TGFβ1激活的能力。简言之，在圆底组织培养板中的无血清高级培养基中，将表达人TGFβ的P3U1细胞培养过夜，并且在次日使用人源化28G11变体(以20ug/ml起始的2倍连续稀释物)处理24小时。通过利用市售的人TGFβ1 ELISA试剂盒(R&D Systems)，根据生产厂商的说明书，在细胞培养物的上清液中检测具有活性的TGFβ1。如图14A-14D中所示，28G11_(hyb)、28G11_H2L1和28G11_H2L3，而非28G11_H2L2，抑制TGFβ1激活。
基于上文所述的研究，使用28G11_H2L3观察到了最佳结合。如下文所示，H2重链和L3轻链两者均包含6个由人框架回复突变为小鼠残基的位置(回复突变残基以小写字母和下划线表示)。
Figure BDA0003108510350001131
Figure BDA0003108510350001141
使用28G11_H2L3作为添加个体回复置换的基础，以测定哪些回复突变位置容许人残基。图15A和图15B显示了回复至人残基的逆转的各种组合对过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的结合的作用。例如，HC_N73D+LC_Y71F的组合消除结合，并且HC_T30S+LC_V44P的组合具有降低的结合。LC_L19V构建体表达较弱。由图15A中的数据得出以下结论：重链上可容许L48V、Q75K、S76N和L109V置换(产生序列28G11_H2a)和轻链上可容许T43v和F87Y(产生序列28G11_L3a)。检测28G11_H2aL3a与过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的结合。参见表12和表34。如图15B中所示，该构建体与含有亲本小鼠28G11抗体的原始可变区结构域的小鼠-人类嵌合体结合。
在CDR2区中含有“NG”二肽的28G11_H2L3序列可经历脱酰胺化反应，以在天冬酰胺残基的位置处产生天冬酰胺或异天冬酰胺。为防止此情况发生，将N56Q置换引入序列(28G11_H2.1L3)。与原始序列相比，这种抗体与HT1080-huB1细胞的结合略好(图15B)。
实施例10：人源化22F9候选物以及责任位点移除的22F9变体的表征
在该实施例中，考察了各种人源化22F9候选物的特征，以鉴定保持亲本抗体的功能(例如，与TGFβ1的结合)的人源化抗体。还考察了除去脱酰胺化/异构化位点的22F9变体。表12总结了在该实施例中使用的各种22F9变体。在表34中提供了这些构建体的序列。
表12：示例性22F9抗体和抗原结合片段
Figure BDA0003108510350001142
Figure BDA0003108510350001151
首先，通过流式细胞术检测了22F9_H0L0、H1L0、H2L0、H3L0、H4L0、H5L0、H0L1、H1L1、H2L1、H3L1、H4L1、H5L1、H0L2、H1L2、H2L2、H3L3、H4L2和H5L2与过表达人TGFβ1的HT1080细胞的结合的能力。以40,000个细胞/孔的密度将过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞接种在圆底96孔板中。使用FACS缓冲液(含25mM HEPES、2mMEDTA、2％胎牛血清的Hank平衡盐溶液)洗涤细胞。将50μL 1∶200稀释的TruStain人FcX(BioLegend)加入各孔中，然后加入50μL 100ng/μL的人源化22F9构建体。使抗体结合20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次。将细胞用Alexa647-抗人IgG(Jackson Immunoresearch)标记15分钟，使用FACS缓冲液洗涤两次，并通过流式细胞术进行分析。如图16中所示，22F9_H2L0、H3L0、H4L0、H5L0、H2L1、H3L1、H4L1、H5L1和H4L2显示出相对于对照HT1080细胞和22F9_H0L0的一些结合。使用含有H5重链序列的抗体观察到了最强结合。
还通过生物层干涉法(Octet)检测了候选物子集与人TGFβ1的结合。将链霉亲和素涂覆的尖端在结合缓冲液(10mM磷酸钠、150nM氯化钠、1％牛血清白蛋白、0.05％叠氮钠)中平衡60秒。然后，将尖端浸渍在含10μg/mL生物素化的抗体的结合缓冲液中。在15秒之后，将尖端在结合缓冲液中洗涤60秒，然后浸渍在0-24nM Fc-人LAP中。测量分析物的结合5分钟。将尖端转移至单独的结合缓冲液中，并测量分析物的解离5分钟。将结合和解离数据拟合至1∶1结合模型。如表13中所示，在所检测的候选物中，22F9_H5L0显示最高的结合信号变化，和22F9_H4L0显示最强亲和性。
表13：22F9抗体和抗原结合片段的结合数据
抗体 k<sub>on</sub>(x10<sup>5</sup>M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>off</sub>(x10<sup>-3</sup>s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(nM) 加载(nm) 结合(nm)
22F9_hIgG1 4.50 1.68 3.74 1.13 0.27
22F9_H3L0 7.78 2.14 2.75 0.99 0.023
22F9_H4L0 8.10 1.32 1.63 0.90 0.057
22F9_H4L2 5.98 1.37 2.30 1.17 0.07
22F9_H5L0 5.10 1.7 3.35 1.22 0.13
22F9_H5L1 5.19 1.22 2.34 1.29 0.08
22F9_H5L2 6.29 2.46 3.91 1.25 0.06
在另一项实验中，将体积排阻色谱法(SEC)用于评估候选物的聚集。将每种蛋白在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中稀释至1mg/mL。将SepaxSEC-300柱用10mM磷酸钠、150mM氯化钠、0.05％(v/v)叠氮化钠，pH 7.4平衡。将10μL 1mg/mL的抗体注射至色谱柱。通过在280nm处的吸光度检测洗脱的蛋白。通过针对一组凝胶-过滤分子量标准品(Bio-Rad)比较IgG单峰的保留时间来鉴定IgG单峰。结果如表14中所示。
表14：22F9的层析数据
Figure BDA0003108510350001161
Figure BDA0003108510350001171
大部分检测的候选物显示出极少聚集，如高单体百分比(＞99％)所反映的。具有低于预期Octet结合信号的候选物也具有较小SEC峰。22F9_H4L0的显著更小的总峰面积提示聚集体太大而不能进入色谱柱，而所有22F9_H5构建体表现良好。图17A显示了22F9_hIgG1、22F9_H0L0和22F9_H4L0的体积排阻高效液相色谱(SE-HPLC)的结果，且图17B显示了22F9_H5L0、H5L1和H5L2的结果。
通过借助于单位点置换使小鼠残基回复成相应人残基来进一步表征H5L0候选物(其序列提供在下文中)，以测定其必需的小鼠残基。进行其他置换以除去潜在脱酰胺化位点(N54S、N54H、N54A、N54Q)和异构化位点(D102E、D102A、D102G)。
Figure BDA0003108510350001172
如图18A中所示，所有使小鼠框架残基回复成人的单位点置换均实质上降低与LAP-TGFβ1的结合。如图18B中所示，N54Q和D102A置换保持在这些位置处的所有置换的大部分结合活性，且双重N54Q/D102A变体(22F9_H5.2)具有在这些测定中的所有所检测的抗体的最强结合信号。亦参见表12和表34。
因为单一变体不会引起小鼠残基数量的任何降低，因而使用替代性策略进行各组中的氨基酸置换。如上文所述，针对与过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞的结合来分析这些构建体，即标记的22F9_H0.1、22F9_H1.1、22F9_H2.1和22F9_H3.1。如图18C中所示，22F9_H0.1变体不结合人LAP-TGFβ1，而22F9_H1.1、22F9_H2.1和22F9_H3.1变体结合人LAP-TGFβ1。
实施例11：人源化20E6候选物以及责任位点移除的20E6变体的表征
在该实施例中，考察了各种人源化20E6候选物的特征，以鉴定保持亲本抗体的功能(例如，与TGFβ1的结合)的人源化抗体。还考察了除去脱酰胺化/异构化位点的20E6变体。表15总结了在该实施例中使用的各种20E6变体。在表34中提供了这些构建体的序列。值得注意的是，L1包含3个小鼠回复置换，即P44V(其位于VH/VL界面处，且可潜在地影响结构域配对和稳定性)、F71Y(典型残基，其可潜在地影响CDRL2的结构)和Y87F(其位于VH/VL界面处，且可潜在地影响结构域配对和稳定性)。
表15：示例性20E6抗体和抗原结合片段
Figure BDA0003108510350001181
Figure BDA0003108510350001191
首先，通过流式细胞术检测了人源化20E6与过表达人TGFβ1的HT1080细胞结合的能力。以40,000个细胞/孔的密度将过表达人LAP-TGFβ1的HT1080细胞接种在圆底96孔板中。使用FACS缓冲液(含25mM HEPES、2mM EDTA、2％胎牛血清的Hank平衡盐溶液)洗涤细胞。将某一体积(50μL)1∶200稀释的TruStain人FcX(BioLegend)加入各孔中，然后加入50μL100ng/μL的人源化20E6抗体构建体。使抗体结合20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次。将细胞用Alexa647-抗人IgG(Jackson Immunoresearch)标记15分钟，使用FACS缓冲液洗涤两次，并通过流式细胞术进行分析。如图19A和图19B所示，与对照HT1080细胞相比包含L1轻链的候选物显示出更大的与HT1080-huβ1细胞的结合。
还通过生物层干涉法(Octet)检测了人源化20E6候选物与人LAP-TGFβ1的结合。如表16中所示，20E6_H(0-4)L1具有相当的结合动力学，与流式细胞术结果一致。
表16：20E6的Octet结合数据
抗体 k<sub>on</sub>(x10<sup>5</sup>M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>off</sub>(x10<sup>-3</sup>s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(nM)
20E6_hIgG1 0.98 9.97 1.02
20E6_H0L1 1.59 8.14 0.51
20E6_H1L1 1.41 6.77 0.48
20E6_H2L1 1.57 7.47 0.48
20E6_H3L1 1.48 7.02 0.47
20E6_H4L1 1.56 7.29 0.47
如上文所讨论的，L1轻链具有3个小鼠回复置换，即，P44V、F71Y和Y87F。为确定所有三个这样的小鼠回复置换是否是与LAP-TGFβ1的结合所必需的，将每个置换分别引入L0轻链并与20E6_H0L1进行比较。如图20A中所示，所有三个小鼠回复置换均是与过表达LAP-TGFβ1的HT1080细胞的结合所必需的。
用于产生20E6_H0序列的CDR移植使用重链CDR2的延伸定义，其导致在20E6_H0中引入另外的小鼠残基。为降低免疫原性风险，用重链CDR2的传统(Kabat)定义制备20E6_H0的变体。该构建体20E6_H0.1以及20E6_H0结合至人LAP-TGFβ1，表明无需这些小鼠残基(图20B)。
实施例12：抗LAP抗体与人LAP-TGFβ1、2和3的结合
本实施例描述了使用生物层干涉法检测人源化20E6(20E6_H0.2aL1_IgG1)抗体结合至人LAP-TGFβ亚型1、2和3的特异性，所述抗体分别具有SEQ ID NO：219和155的重链和轻链序列。
使用EZ-Link SulfoNHS-LC-生物素(ThermoFisher)将20E6_H0.2aL1_IgG1抗体生物素化。将链霉亲和素-官能化的尖端在结合缓冲液(10mM磷酸钠、150mM氯化钠、1％(w/v)牛血清白蛋白、0.05％(w/v)叠氮钠，pH 7.4)中平衡，并在10μg/mL的生物素化的抗LAP在结合缓冲液中的溶液中浸渍30秒，以将抗体加载至尖端。然后，在结合缓冲液中洗涤加载抗体的尖端，并置于含有0-24nM融合蛋白的溶液中，所述融合蛋白具有与人LAP-TGFβ1、人LAP-TGFβ2或人LAP-TGFβ3融合的人IgG1 Fc结构域。使抗原结合至抗体保持5分钟(结合期)，然后将尖端移至结合缓冲液中(解离期)。将结合期和解离期拟合至2∶1异源配体结合模型，以确定结合速率常数。如图21A和表17中所示，20E6_H0.2aL1_IgG1以亚纳摩尔亲和性结合至人LAP-TGFβ1，但不结合至人LAP-TGFβ2(图21B)或LAP-TGFβ3(图21C)。这些数据表明，20E6_H0.2aL1_IgG1抗体特异性结合至人LAP-TGFβ1，且不结合至LAP-TGFβ2和LAP-TGFβ3。
表17：抗LAP抗体20E6_H0.2aL1_IgG1与人LAP-TGFβ1、2和3的结合
Figure BDA0003108510350001201
实施例13：抗LAP抗体与小鼠、大鼠、食蟹猴和人LAP-TGFβ1的结合
本实施例描述了使用生物层干涉法检测20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体和20E6_H0.2aL1_hIgG4mut抗体(其分别具有SEQ ID NO：220和155的重链和轻链序列)结合至来自若干物种的LAP-TGFβ1的物种特异性。
使用实施例12中所述的方法，通过生物层干涉法考察20E6_H0.2aL1_IgG1抗体和20E6_H0.2aL1_hIgG4mut抗体与多个物种的LAP-TGFβ1的结合，除了将加载抗体的尖端置于含有0-24nM具有融合至小鼠、大鼠、食蟹猴或人LAP-TGFβ1的人IgG1 Fc结构域的融合蛋白的溶液中以外。分别如表18和表19中所示，20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体和20E6_H0.2aL1_hIgG4mut抗体以纳摩尔亲和性结合至来自所检测的所有物种的LAP-TGFβ1。
表18：20E6_H0.2aL1_IgG1抗体与各物种LAP-TGFβ1的结合数据
Figure BDA0003108510350001202
Figure BDA0003108510350001211
表19：20E6_H0.2aL1_hIgG4mut抗体与各物种LAP-TGFβ1的结合数据
Figure BDA0003108510350001212
实施例14：人源化20E6中CDR的丙氨酸扫描诱变
本实施例描述了使用生物层干涉法测定的人LAP-TGFβ1与各种20E6_H0.2aL1_IgG1抗体的结合。
在抗体的重链和轻链CDR中进行共计49个单一丙氨酸置换以鉴定对人LAP-TGFβ1结合而言重要的残基。此外，用甘氨酸置换轻链中的残基A25。在24孔板上以及在不含DNA的孔(阴性对照)和使用野生型抗体的DNA转染的孔(阳性对照)中，将这些变体的质粒DNA转染至1mL培养物中的ExpiCHO细胞中。通过与蛋白A官能化的尖端的结合来测定各孔中的IgG浓度。将尖端浸渍在含有来自各培养物的上清液的孔中。通过针对在ExpiCHO培养基中稀释的纯化的20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体的标准曲线的信号变化率，比较各孔的信号变化率来测定IgG浓度。CHO上清液在培养基中稀释至0.6μg/mL。将链霉亲和素-官能化的尖端在结合缓冲液(10mM磷酸钠、150mM氯化钠、1％(w/v)牛血清白蛋白、0.05％(w/v)叠氮钠，pH 7.4)中平衡，然后在5μg/mL的生物素化的人LAP-TGFβ1在结合缓冲液中的溶液中浸渍60秒，以用抗原加载尖端。然后，在结合缓冲液中洗涤加载抗原的尖端，并置于稀释的CHO上清液中。使抗原结合至抗体5分钟(结合期)，然后将尖端移至结合缓冲液中(解离期)。将结合和解离期拟合至1∶1结合模型，以确定结合速率常数。
如图22A-22D和表20中所示，重链中的位置50、99、101、102、103、104、105以及轻链中的位置24、28、29、32、50、53、89、90、91、92、94、95、96和97处的丙氨酸置换对结合亲和性具有中度至重度影响，表明这些残基参与与人LAP-TGFβ1的结合。
实施例15：抗LAP抗体与人LAP-TGFβ1的单价结合与二价结合的比较
该实施例比较了20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体与人LAP-TGFβ1的单价结合和二价结合。
用FragIT试剂盒(Genovis)，根据生产厂商的说明书，产生20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体的F(ab′)2片段。然后，用10mM 2-巯基乙胺-HCl(2-MEA)处理F(ab′)2，以产生Fab′片段。为检测与过表达人LAP-TGFβ1的细胞的结合，在96孔板中培养4x 105个以下细胞中的每一种：(a)P3U1细胞和(b)过表达人GARP和人LAP-TGFβ1的P3U1细胞。以1,500rpm将板离心5min，除去液体并在200μL FACS缓冲液中重悬细胞。再次将板离心，将稀释的一抗加入每个孔中，将板在冰上孵育20分钟，随后离心。在200μL FACS缓冲液中重悬细胞，再次离心，并在50μL稀释的二抗(Alexa647-抗人IgG)中重悬。将板在冰上避光孵育20分钟，使用200μL FACS缓冲液洗涤两次，并在Attune NXT仪器上读取来自每个孔的细胞(在200μL FACS缓冲液中)。如图23A和图23B中所示，所有三种构建体均结合过表达GARP和LAP-TGFβ1的P3U1细胞。
实施例16：在存在锚定蛋白的情况下抗LAP抗体与人LAP-TGFβ1的结合
本实施例描述了检测在存在锚定蛋白的情况下20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体与人LAP-TGFβ1的结合。
将LAP-TGFβ通过LTBP锚定至胞外基质，并通过GARP或LRRC33锚定至免疫抑制性细胞的表面。制备人LTBP1和GARP的可溶形式，以评估锚定蛋白对抗LAP抗体结合的影响。ECR3E片段(在Annes等JCB2004；165：723中所述)由人LTBP1的第三富含半胱氨酸的结构域组成，翼侧为EGFR样结构域。该构建体含有共价连接至LAP-TGFβ(形成可溶性复合物)所需的所有元件。通过共表达人LAP-TGFβ1和包含人GARP的胞外域以及跨膜肽酶α的跨膜和胞质结构域的嵌合体来制备可溶性GARP-LAP-TGFβ复合物(在Fridrich等，PLoS ONE.2016；11(4)：e0153290中所述)。
将链霉亲和素-官能化的尖端在结合缓冲液(10mM磷酸钠、150mM氯化钠、1％(w/v)牛血清白蛋白、0.05％(w/v)叠氮钠，pH 7.4)中平衡，并且在5μg/mL的生物素化抗体(即20E6_H0.2aL1_hIgG1、小鼠16F或MHG8，在Lienart等，Science 2018；362：952-956中描述的GARP特异性小鼠IgG2a)在结合缓冲液中的溶液中浸渍30秒，以用抗体加载尖端。然后，在结合缓冲液中洗涤加载抗体的尖端，并置于含有0-24nM融合蛋白的溶液中，所述融合蛋白含有融合至人LAP-TGFβ1、可溶性GARP-LAP-TGFβ1复合物或可溶性ECR3E-LAP-TGFβ1复合物的人IgG1Fc结构域。使抗原结合至抗体5分钟(结合期)，然后将尖端移至结合缓冲液中(解离期)。通过1∶1结合模型良好拟合16F4和MHG8的结合和解离数据。针对20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体，将结合和解离期拟合至2∶1异源配体结合模型，以确定结合速率常数。
如图24和表21中所示，20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体以纳摩尔亲和性结合至游离LAP-TGFβ1和可溶性GARP-LAP-TGFβ1复合物，但不结合至ECR3E-LAP-TGFβ1复合物。如所预期的，抗GARP抗体(MHG8)结合至GARP-LAP-TGFβ1复合物，但不结合至游离LAP-TGFβ1或ECR3E-LAP-TGFβ1复合物。16F4紧密结合所有三种构建体。
Figure BDA0003108510350001241
表21：20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体与游离LAP-TGFβ1复合物、可溶性GARP-LAP-TGFβ1复合物和ECR3E-LAP-TGFβ1复合物的结合亲和性
Figure BDA0003108510350001251
实施例17：人源化20E6与其他抗LAP抗体之间针对结合至可溶性人GARP-LAP-TGFβ1复合物的竞争
小鼠28G11、16F4和MHG8抗体与由人GARP和人LAP-TGFβ1(sGARP-LAP-TGFβ1)的胞外域组成的可溶性复合物紧密结合。观察到20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体也紧密结合至该复合物。如图25中所示，进行竞争实验以比较这四种抗体的结合表位。
将链霉亲和素-官能化的尖端在结合缓冲液(10mM磷酸钠、150mM氯化钠、1％(w/v)牛血清白蛋白、0.05％(w/v)叠氮钠，pH 7.4)中平衡，然后在5μg/mL的生物素化的抗体(即，20E6_H0.2aL1_hIgG1抗体、小鼠16F4抗体、小鼠28G11抗体或MHG8抗体)在结合缓冲液中的溶液中浸渍30秒，以用抗体加载尖端。然后，将加载抗体的尖端在结合缓冲液中洗涤，并置于含有24nM sGARP-LAP-TGFβ1的复合物的溶液中。使抗原结合至抗体5分钟(结合期)，然后尖端移入仅含结合缓冲液或含24nM未经修饰的抗体的孔中。在孵育5分钟后，通过信号变化评价第二、未经修饰的抗体的结合。
如表22中所示，预期所有四种抗体均阻断相同抗体的结合。20E6_H0.2aL1_hIgG1(h12_hIgG1)抗体与28G11抗体，但不与16F4抗体或MHG8抗体竞争结合。
表22：抗LAP抗体与可溶性人GARP-LAP-TGFβ1复合物的竞争结合数据
MHG8 16F4 h12_hIgG1 28G11
MHG8 0.00 0.30 0.25 0.28
16F4 0.46 0.00 0.43 0.43
h12_hIgG1 0.07 0.08 0.00 0.00
28G11 0.29 0.20 -0.01 0.00
实施例18：优化的7H4变体抗体
本实施例描述了抗体7H4的优化(例如，除去重链中的潜在责任位点)。具体地，7H4的重链中的位置55(其位于CDR2中)是潜在异构化位点。为除去该潜在责任位点，将在位置55的天冬氨酸突变为天冬氨酸以外的氨基酸，例如，甘氨酸、丙氨酸或谷氨酸，如在表23中所描述的。在表34中提供了序列。
可以使用本文所描述的方法检测这些7H4变体抗体的各种功能(例如，与人LAP-TGFβ1结合、抑制TGFβ1激活、与免疫细胞结合)。
表23：7H4抗体序列和抗原结合片段的多重变体
Figure BDA0003108510350001261
实施例19：与LAP-TGFβ1复合的人源化20E6的Cryo-EM结构
本实施例描述了通过单一粒子低温电子显微法(SP-Cryo-EM)鉴定与人源化20E6结合的LAP-TGFβ1上的表位，以及人源化20E6的互补位。
样品和栅格(grid)制备。如实施例11中所述产生人源化20E6 mAb(20E6_H0.2aL1_hIgG1)和Fab。如实施例16中所述产生人生物素化的LAP-TGFβ1-Fc和GARP-LAP-TGFβ1。人LAP-TGFβ1购自R&D，并在含有50％甘油的磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(10mM磷酸钠、150mM氯化钠、pH 7.4)中提供。用不同浓度、比率和孵育时间的不同蛋白制备若干不同样品。将下述五种样品用于产生最终重构：
1)样品A：将20微升(也称为μl或ul)LAP-TGFβ1-Fc(10.3微摩(μM或uM)在PBS(10mM磷酸钠、150mM氯化钠、pH 7.4)中)与4ul人源化20E6(26μM在PBS中)混合，以得到4.25μMLAP-TGFβ1-Fc和4.3μM人源化20E6-Mab(1Mab每二聚体比率)的最终溶液；将混合物放置在冰上45min，并接着用于制备栅格。
2)样品B：样品A的1∶5稀释物：4μl样品A+16μl HEPES缓冲盐水(HBS；20mM Hepes、150mM NaCl、pH 7.0)。
3)样品C：将8μlLAP-TGFβ1-Fc(10.3μM在PBS)与8μl人源化20E6(8.6μM在PBS中)混合，以得到2.34μM LAP-TGFβ1-Fc和4.7μM人源化20E6-Fab的最终溶液；将混合物在冰上放置30min，然后使用HBS进行1∶1稀释。
4)样品D：将含LAP-TGFβ1的具有50％甘油的PBS缓冲液交换至不含甘油的缓冲液(即，PBS)中，与人源化20E6-Mab以2份二聚体：1份Mab的比率复合，然后浓缩至30μM(用于HDX研究)。对于cryo-EM研究，将样品用PBS稀释10倍。
5)样品E：将1.2μl GARP-LAP-TGFβ1(19.3μM在PBS中)与1.3μl人源化20E6-Fab(8.6μM在PBS中)和2.6μl HBS缓冲液混合以得到4.4μM GARP-LAP-TGFβ1和2.2μM人源化20E6-Fab的最终溶液(每2份GARP-LAP-TGFβ1的二聚体1份Fab)。将混合物在冰上放置30-60min并用HBS缓冲液进行1∶10稀释。
使用标准程序，使用Vitrobot Mark 4(ThermoFisher)制备栅格(C-flat碳/金，300目，1.3/1.2)：栅格使用Pelco easyGlow单元(Ted Pella，Inc.)在工厂推荐用于血浆清理的值进行辉光放电(0.39mbar，较低水平15mA，保持10″，辉光30″)。Vitrobot设置为：隔室湿度在90-100％之间；隔室温度为4℃；点渍时间为3sec；等待时间为0sec；点渍力为0。将三(3)μl样品应用到栅格上，点渍并接着放置在液态乙烷浴中；然后，将冷冻栅格转移至液氮(LN2)中，并保持在LN2温度下以用于所有后续步骤(裁剪、转移至显微镜盒，并收集数据)。
数据收集和结构确定。用配有Gatan K3直接电子检测器的ThermoFisher TitanKrios G3收集所有数据集。使用Gatan Latitude软件进行数据收集。收集五个数据集(每个所制备的样品一个)。表24总结了用于数据收集的显微镜和相机参数，以及各样品所收集的影片的总数。整个数据收集(针对五个样品)跨越两周。
表24：20E6人源化抗体和Fab的Cryo-EM细节
Figure BDA0003108510350001271
Figure BDA0003108510350001281
数据处理和定位重构。用Cryosparc V2(Structura Biotechnology Inc.，Toronto，Canada；Punjani等，Nature Methods 2017；14：290-6；Brubaker等，IEEE TransPattern Anal Mach Intell 2017；39：706-18)进行整个数据处理和定位重构。单独进行各数据集的处理管线的初始阶段(影片比对、CTF评估、粒子挑选和2D等级确定)。在三个阶段中将来自单独数据集的经清洗的粒子合并在一起。
1)合并来自前三个数据集(样品A-C)的粒子并共同处理，氮最佳定位仅为在
Figure BDA0003108510350001283
处。
2)使用来自样品D的粒子，有可能产生3.8Ang定位。然后，使用来自样品D的模板进行样品A-C的新粒子挑选。然后，对所选择的粒子进行一轮2D分类并与来自样品D的最佳粒子合并在一起，共计533，297个粒子。在一轮2D分类之后，使用最佳等级(436，918个粒子)进行均质优化工作。对所得定位进行一轮不均匀优化(NU-优化)，其产生分辨率
Figure BDA0003108510350001284
的定位。
3)将来自样品E的～1.2M个颗粒的集合与来自2的最后一个(最佳)集合合并。在2轮2D分类之后，使用最佳2D等级(864，958个粒子)计算具有
Figure BDA0003108510350001285
的标称分辨率的定位(在NU优化之后)。
然后，对864，958个粒子再进行2轮2D分类，以产生含有802，256个粒子的集合以及在
Figure BDA0003108510350001286
处的不均匀(NU)优化定位。在整个过程中，使用所得定位的目测检查(密度改善、密度连续性、不具有(或减少)优选定向伪像)来决定后续步骤。最后一个定位明确指出以下事实：尽管存在两个Fab/LAP-TGFβ1二聚体，但一个比另一个明显更好定义(图26A)，且因此应用粒子差分和局部优化程序。所得最终定位的标称分辨率为
Figure BDA0003108510350001282
将该定位用于构建和优化最终模型。图26B和图26C显示了最终定位的FSC曲线和Guinier曲线。
模型构建和优化。使用COOT(Emsley等，Acta Crystallogr D-BiologicalCrystallography2010；66：486-501)和PHENIX(Afonine等，Acta Crystallogr D StructBiol 2018；746：531-44)进行所有模型构建和优化。从PDB条目3RJR获得LAP-TGFβ1坐标，并从使用MOE 2019.0101(Chemical Computing Group ULC)产生的同源模型获得Fab坐标。使用COOT将LAP/TGFβ1和Fab模型最初安置在定位中作为刚性体，并使用密度重建一些环并分配正确序列。进行PHENIX真实空间优化模块以优化模型几何结构。表25总结了模型优化和统计：
表25：人源化20E6 Fab和LAP-TGFβ1的cryo-EM的模型优化和统计
Figure BDA0003108510350001291
最终模型含有LAP-TGFβ1二聚体的两条链(A链和B链，各自含有残基1-61+70-208+216-241+250-361；抗原编号假设不存在信号肽，即，Leu 1＝在完整序列中的Leu 30)；人源化20E6-Fab的两条链(重链(VH)，残基1-221和轻链(VL)，残基2-214)。在一个糖基化位点(Asn A53)将一个糖部分(NAG)模型化；对于所有其他可能的糖基化位置(A107、A147、B53、B107和B147)，密度不足以保证糖添加。
结构分析。确定具有人源化20E6-Fab的复合物中的LAP-TGFβ1二聚体的结构为
Figure BDA0003108510350001292
分辨率。cryo-EM定位的质量使得抗原和Fab的侧链的分配是明确的。在抗原-抗体界面处，定位的质量与在类似分辨率下计算的x射线衍生的电子密度定位类似(图27A：在
Figure BDA0003108510350001304
分辨率下的cryo-EM定位；图27B：在
Figure BDA0003108510350001305
分辨率下的蛋白数据库(PDB)条目5jxe的电子密度)。
由于cryo-EM定位的固有特征(Cardone G等，J Struct Biol.2013；184：226-236)，在LAP-TGFβ1：Fab界面与分子的其余部分之间存在明确梯度。存在第二、对称结合的Fab的降低水平密度，其可对接至最终定位中(图26A)。
在图28A和图28B中显示了包含相互作用界面的人源化20E6-Fab互补位和LAP-TGFβ1表位残基，并总结在表26中。界面由范德华力(vander Waal)和静电相互作用组成，且对应于约
Figure BDA0003108510350001306
的内埋表面，如通过蛋白界面、表面和组件(PISA)计算的(Krissinel等，JMol Biol2007；372：774-97)。表位是由来自A链的残基A31-P40(LAP残基)和来自B链的Y340-R343和R274-K280(TGFβ1残基)形成。与人源化20E6-Fab的相互作用需要LAP和TGFβ1残基的事实解释了抗体为何对LAP-TGFβ1复合物的封闭形成具有特异性且不结合至空LAP或成熟TGFβ1。互补位是由轻链(VL)残基T30、Y32、Y49-Y50、R53、G91-L94、W96和重链(VH)残基W33、R50、I58-K59、W99和Y101-G103形成。由cryo-EM分析确定的表位与实施例22中所述的氢氘交换质谱(HDX-MS)分析一致。互补位与在实施例14中描述的丙氨酸扫描实验鉴定的残基一致。亦参见图28C-D。
表26：LAP-TGFβ1和人源化20E6-Fab*的表位和互补位
VH TGFβ1 VL
R274 T30
G278 T30
W279 Y50，Y50
K280 D92
Y101 V341
Y101，W33 G342
VH LAP VL
A31 Y49，R53
Y104，Y104 S32 Y49，Y50
G102 P33 Y32
P34 Y32
G102，W99， S35 G91，Y32
Q36 D92
G37 L94，D92
R50，K59，W33 E38 L94，W96
*表示来自人源化20E6-Fab VH或VL的与LAP-TGFβ1残基相互作用的残基。氢键相互作用以粗体表示(相互作用截止值设定为
Figure BDA0003108510350001303
氢键相互作用截止值设定为
Figure BDA0003108510350001301
Figure BDA0003108510350001302
实施例20：与LAP-TGFβ1复合的人源化28G11的Cryo-EM结构
通过cryo-EM确定与人LAP-TGFβ1复合的人源化28G11 Fab的结构，以鉴定与抗体结合的LAP-TGFβ1上的表位，和人源化28G11-Fab的互补位。
样品和栅格制备。如实施例9和实施例16中所述产生人源化28G11mAb(28G11_H2bL3a_hIgG1，其分别具有SEQ ID NO：43和53的重链可变区序列和轻链可变区序列)，并在PBS缓冲液(10mM磷酸钠、150mM氯化钠、pH 7.4)中提供。通过混合2.0μl GARP-LAP-TGFβ1(38.7μM)、0.5μl人源化28G11(77.3μM)和17.5μl HBS缓冲液(20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.0)达到以下最终浓度来制备用于cryo-EM实验的样品：GARP-LAP-TGFβ1为3.87μM和人源化28G11为1.95μM。在制备栅格之前，用HBS以1∶1进一步稀释样品。使用含有GARP(而非单独的LAP-TGFβ1)的复合物破坏在从人源化28G11：LAP-TGFβ1的样品收集的数据中观察到的优选定向问题。
使用标准程序，使用Vitrobot Mark 4(ThermoFisher)制备栅格(C-flat碳/金，300目，1.3/1.2)。栅格使用Pelco easyGlow单元(Ted Pella，Inc.)在工厂推荐用于血浆清理的值进行辉光放电(0.39mbar，较低水平15mA，保持10″，辉光30″)。Vitrobot设置为隔室湿度在90-100％之间；隔室温度为4℃；点渍时间为3sec；等待时间为0sec；点渍力为0。将三(3)μl样品应用到栅格上，点渍并接着放置在液态乙烷浴中；然后，将冷冻栅格转移至液氮(LN2)中，并保持在LN2温度下以用于所有后续步骤(裁剪、转移至显微镜盒，并收集数据)。
数据收集和结构确定。用配有ThermoFisher Falcon 3直接电子检测器的ThermoFisher 300KeV Titan Krios G3收集所有数据集。使用ThermoFisher EPU软件进行数据收集。在75,000x的标称放大倍数下收集4267个影片；散焦范围设定在-1.4与-2.0μm之间。检测器像素尺寸为
Figure BDA0003108510350001312
和剂量为
Figure BDA0003108510350001311
数据处理和定位重构。用Cryosparc V2进行整个数据处理和定位重构。初始粒子挑选鉴定2.9M个粒子。在两次2D分类工作之后，使用约620K个粒子计算初始定位(标称分辨率为3.81 Ang)。再使用两次2D分类进一步清理粒子堆，并使用所得粒子集合(505，582个粒子)产生定位，其在NU优化之后具有3.48Ang的标称分辨率。然后，使用局部(遮蔽)优化改良表位-互补位界面处的分辨率。局部优化的结果(在粒子差分之后)为3.38Ang定位，其中界面处的细节得到显著改善。使用此定位构建模型。
模型构建和优化。使用COOT进行所有模型构建和优化。使用LAP-TGFβ1与人源化20E6 Fab之间的复合物作为初始模型；使用COOT将LAP-TGFβ1和人源化28G11-Fab最初安置在定位中作为刚性体，并使用密度重建一些环并分配正确序列。进行PHENIX真实空间优化模块以优化模型几何结构。表27总结了模型优化和统计：
表27：人源化28G11-Fab和LAP-TGFβ1的模型优化和统计
Figure BDA0003108510350001321
最终模型含有LAP-TGFβ1二聚体的两条链(A链和B链，各自含有残基1-61+70-208+216-241+250-361；抗原编号假设不存在信号肽，即，Leu 1＝在完整序列中的Leu 30)和人源化28G11-Fab的一个分子(重链(VH)，残基1-221和轻链(VL)，残基2-214)。在一个糖基化位点(Asn A53)将一个糖部分(NAG)模型化；对于所有其他可能的糖基化位置(Asn A107、Asn A147、Asn B53、Asn B107和Asn B147)，密度不足以保证糖添加。
结构分析。确定与人源化28G11-Fab复合的LAP-TGFβ1二聚体的结构为
Figure BDA0003108510350001322
分辨率。cryo-EM定位的质量使得抗原和Fab的侧链的分配是明确的。
在图29A和图29B中显示了包含相互作用界面的人源化28G11-Fab互补位和LAP-TGFβ1表位残基，并总结在表28中。亦参见图29C-E。界面由范德华力(van der Waal)和静电相互作用组成，且对应于约
Figure BDA0003108510350001332
的内埋表面，如通过PISA计算的。表位是由来自A链的残基A31-E38(LAP残基)和来自B链的G342-K344和G278-W281(TGFβ1残基)形成。与h20E6-Fab的相互作用需要LAP和TGFβ1残基的事实解释了抗体为何对LAP-TGFβ1复合物的封闭形成具有特异性且不结合至空LAP或成熟TGFβ1。互补位是由轻链(VL)残基Y32、Y49-Y50、R53和G91-L94和重链(VH)残基W33、F50-N53、Q56和Y101-Y106形成。
表28：LAP-TGFβ1和28G11-Fab*的表位和互补位
Figure BDA0003108510350001331
*表示来自28G11-Fab VH或VL的与LAP-TGFβ1残基相互作用的残基。氢键相互作用以粗体表示(相互作用截止值设定为
Figure BDA0003108510350001334
氢键相互作用截止值设定为
Figure BDA0003108510350001333
)。
实施例21：与LAP-TGFβ1复合的小鼠22F9的Cryo-EM结构
通过SP-Cryo-EM确定与人LAP-TGFβ1复合的小鼠22F9-Fab(在实施例中称为22F9)的结构，以鉴定与抗体结合的LAP-TGFβ1上的表位，和22F9-Fab的互补位。
样品和栅格制备。在本实验中使用的小鼠22F9 mAb为22F9_N54Q_D102A_mIgG2a，其分别具有SEQ ID NO：248和249的重链可变区序列和轻链可变区序列。人LAP-TGFβ1购自R&D，并在含由50％甘油的PBS缓冲液(10mM磷酸钠、150mM氯化钠、pH 7.4)中提供。按照如下所示制备样品：将含LAP-TGFβ1的具有50％甘油的PBS缓冲液交换至不含甘油的缓冲液(即，PBS)中，并与22F9-Mab以1份二聚体：1份Mab比率复合，然后用PBS稀释10倍。
使用标准程序，使用Vitrobot Mark 4(ThermoFisher)制备栅格(C-flat碳/金，300目，1.3/1.2)：栅格使用Pelco easyGlow单元(Ted Pella，Inc.)在工厂推荐用于血浆清理的值进行辉光放电(0.39mbar，较低水平15mA，保持10″，辉光30″)。Vitrobot设置为是隔室湿度在90-100％之间；隔室温度为4℃；点渍时间为3sec；等待时间为0sec；点渍力为0。将三(3)μl样品应用到栅格上，点渍并接着放置在液态乙烷浴中；然后，将冷冻栅格转移至液氮(LN2)中，并保持在LN2温度下以用于所有后续步骤(裁剪、转移至显微镜盒，并收集数据)。
数据收集和结构确定。用配有Gatan K3直接电子检测器的ThermoFisher 300KeVTitan Krios G3收集所有数据集。使用GatanLatitude软件进行数据收集。在81，000x的标称放大倍数下收集3741个影片；散焦范围设定在-0.8与-1.8μm之间。检测器像素尺寸为
Figure BDA0003108510350001343
和剂量为
Figure BDA0003108510350001342
数据处理和定位重构。用Cryosparc V2进行整个数据处理和定位重构。初始粒子挑选鉴定2.9M个粒子。进行若干2D分类工作以清理粒子堆并移除离群值。最终，在均质优化工作中使用522,208个粒子，其产生3.68Ang定位。非均质优化产生3.43Ang定位，其用于构建模型。2D等级明确证实存在2Mab：2TGFβ1复合物，确认由SEC-MAL实验提出的化学计量(图30A和图30B)。
模型构建和优化。使用COOT和PHENIX进行所有模型构建和优化(Afonine等，ActaCrystallogr D Struct Biol 2018；746：531-44)。使用LAP/TGFβ1与人源化20E6之间的复合物作为初始模型；使用COOT将LAP-TGFβ1和人源化20E6-Fab最初安置在定位中作为刚性体，并使用密度重建一些环并分配正确序列。进行PHENIX真实空间优化模块以优化模型几何结构。表29总结了模型优化和统计：
表29：人源化22F9-Fab和LAP-TGFβ1的模型优化和统计
Figure BDA0003108510350001341
Figure BDA0003108510350001351
最终模型含有LAP-TGFβ1二聚体的两条链(A链和B链，各自含有残基1-61+70-208+216-241+250-361；抗原编号假设不存在信号肽，即，Leu 1＝在完整序列中的Leu 30)；22F9-Fab的两条链(重链(VH)，残基1-221和轻链(VL)，残基2-214)。在糖基化位点(Asn A53和AsnB5)将一个糖部分(NAG)模型化；对于所有其他可能的糖基化位置(A107、A147、B107和B147)，密度不足以保证糖添加。
结构分析。确定与22F9-Fab复合的LAP-TGFβ1二聚体的结构为
Figure BDA0003108510350001353
Figure BDA0003108510350001354
分辨率。cryo-EM定位的质量使得抗原和Fab的侧链的分配是明确的。
在图31A和图31B中显示了包含相互作用界面的22F9-Fab互补位和LAP-TGFβ1表位残基，并总结在表30中.
界面由范德华力(van der Waal)和静电相互作用组成，且对应于约
Figure BDA0003108510350001355
的内埋表面，如通过PISA计算的。表位是由来自A链的残基S35-P43(LAP残基)和来自B链的D272-K275、K280-H283和Y340(TGFβ1残基)形成。
22F9互补位是由轻链(VL)残基Y36、Y53、L58-S60和R98-Y100和重链(VH)残基S31-W33、H52和Y98-D106形成。见图31C-E。
表30：LAP-TGFβ1和22F9-Fab*的表位和互补位
Figure BDA0003108510350001352
Figure BDA0003108510350001361
*表示来自22F9-Fab VH或VL的与LAP-TGFβ1残基相互作用的残基。氢键相互作用以粗体表示(相互作用截止值设定为
Figure BDA0003108510350001362
氢键相互作用截止值设定为
Figure BDA0003108510350001363
)。
实施例22：通过氢氘交换质谱法分析人源化20E6抗体
通过氢氘交换质谱(HDX-MS)确定人源化抗LAP抗体20E6_H0.2_hIgG4mut(在本实施例中称为“人源化20E6”)与人LAP-TGFβ1之间的接触面积。HDX-MS测量氘与氢交换至蛋白的酰胺主链。影响交换率的一个因素是氢对溶剂的暴露。当抗体结合时，抗原中交换程度的比较可鉴定其中结合抗体的蛋白区域。
材料
·人LAP-TGFβ1蛋白购自R&D Systems，并且由N末端249个aa的潜在相关肽(LAP)和C末端112个aa的成熟TGFβ1蛋白组成。将蛋白在10mM磷酸钠、150nM氯化钠，pH 7.4中进行缓冲液交换并浓缩至40μM。
·如实施例11中所述，产生人源化抗LAP-TGFβ1抗体(20E6_H0.2_hIgG4mut)。将抗体从7.1mg/mL至5.8mg/mL，等效于40μM。
液相色谱-质谱
使用Waters Synapt G2Si四级杆时间飞行(TOF)质谱。为了进行肽鉴定和氘标记样品的测量，将质谱仪设置为仅在TOF模式下采集一个全扫描MS数据(低能量)和一个MS(e)数据(高能量)。将扫描时间设定为0.4秒。匀变陷阱碰撞能量为15至45伏。
对于样品消化和装载，液相色谱系统是用于分析型色谱柱梯度和辅助泵的WatersnanoAcquity二元泵。对于样品消化和装载，所使用的缓冲液是100％水和0.1％甲酸，流速为100μL/分钟。对于分析梯度，缓冲液为缓冲液A(含0.1％甲酸的水)和缓冲液B(含0.1％甲酸的乙腈)。
梯度为在9分钟以内以40μL/分钟从5％B至35％B，接着在一分钟内均变至85％B，洗涤85％B一分钟，以及在5％B下再平衡一分钟。然后，通过在5％和95％B之间循环梯度来洗涤色谱柱，进行4次，其中在各步骤下一分钟，随后在5％B下最终平衡一分钟。捕获柱为Waters Vanguard BEH C18 1.7μm Guard柱，和分析柱为Waters BEH C18，1.7μm1x50mm柱。
通过由Leaptec H/D-X PAL系统以及用于柱冷却的Waters HDX腔室组成的WatersHDX单元进行氘标记的样本操作。标记样品托盘设定为10℃的温度，淬灭托盘设定为1.5℃，且捕获器和分析柱腔室设定为1.5℃。来自NovaBioassays的经固化的XIII型蛋白酶/胃蛋白酶柱(w/w，1∶1)在酶柱腔室中保持在20℃下。
氘标记
将人LAP-TGFβ1与人源化20E6混合达到以下浓度：人LAP-TGFβ1为20μM和人源化20E6为10μM。通过在10mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH 7.4中孵育人LAP-TGFβ1来制备未结合的对照物。将抗体结合样品和未结合对照在室温下孵育一小时，随后开始标记实验。
为了氘标记样品，将6μL样品与54μL的含10mM磷酸钠、150mM氯化钠的氧化氘pD7.4混合。标记时间点为0、10、60、600、6000和14，400秒。在每个时间点之后，向50μL冷淬灭缓冲液(含500mM三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的磷酸盐缓冲液，pH 2.5)中添加50μL标记混合物。在混合一次之后，接着将90μL注射至柱冷却腔室中，其中样品通过XIII型蛋白酶/胃蛋白酶柱，并将所得肽装载至捕获柱上。在4分钟之后，阀门切换使XIII蛋白酶/胃蛋白酶柱不在一条线上。然后将捕集阱与分析柱和分析梯度在线切换，并开始质谱仪数据采集。每个时间点一式两份。
数据分析
液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)数据一式四份地采集未标记的结合和未结合样品，并用ProteinLynx Global Server 3.0(Waters Corporation)进行数据库搜索，以验证蛋白的成功消化并生成来自双酶消化的肽列表。使用的蛋白数据库是人LAP-TGFβ1与随机化的人LAP-TGFβ1序列相结合，以减少错误识别。
通过DynamX(3.0.0版，Waters Corporation)处理来自氘标记实验的质谱(MS)数据。对于每个肽，手动检验由软件选择的质量、保留时间和电荷状态。
结果
在H/D差异曲线中显示了由人源化20E6保护的人LAP-TGFβ1肽(图32)。
实施例23：通过HDX-MS进行的小鼠28G11、22F9、20E6和2F8抗体的表位作图
如下文所述，通过HDX-MS确定了小鼠抗LAP-TGFβ1抗体28G11、22F9、20E6和2F8与人LAP-TGFβ1之间的接触面积。
方法
所使用的材料如下所示：
·人LAP-TGFβ1蛋白购自R&D Systems，并且由N末端249个aa的潜在相关肽(LAP)和C末端112个aa的成熟TGFβ1蛋白组成。将蛋白在10mM磷酸钠、150nM氯化钠，pH 7.4中进行缓冲液交换并浓缩至40μM。
·将小鼠28G11_mIgG2a、小鼠22F9_mIgG2a和小鼠20E6_mIgG2a稀释至40μM。28G11(hyb)、22F9(hyb)和20E6(hyb)的重链可变区序列和轻链可变区序列(提供在表34中)与购自BioLegend的mIgG2a恒定小鼠2F8(IgG1)融合，并从0.5mg/mL浓缩至40μM。
以实施例22中所述的方法进行液相色谱-质谱分析，不同之处在于，在用氘标记的样品处理中，将样品托盘的温度设定为25℃而不是10℃。如在实施例22中所述进行氘代标记，不同之处在于，将人LAP-TGFb1与抗体混合至human LAP-TGFβ1的终浓度为20μM和抗体的终浓度为20μM。如实施例22中所述进行数据分析。
结果
在图33中所示的H/D差异曲线中显示了由抗体保护的人LAP-TGFβ1肽。28G11、22F9和20E6的结合表位覆盖了LAP-TGFβ1蛋白的四个区域：氨基酸残基14-25(RKRIEAIRGQIL，区域1；SEQ ID NO：250)、30-39(LASPPSQGEV，区域2；SEQ ID NO：251)、278-286(GWKWIHEPK，区域3；SEQ ID NO：252)和340-346(YVGRKPK，区域4；SEQ ID NO：253)。区域1和区域2在LAP结构域中，和区域3和区域4在成熟TGFβ1结构域中。
在抗体之间检测到氘交换保护程度的差异。例如，在将20E6与28G11和22F9进行比较时，20E6在区域1处没有显示氘交换保护，而28G11和22F9在抗体结合后具有可检测的变化(分别约为1.3和1.9Da)。在区域2和区域3中也观察到氘交换的轻微差异。特别地，在区域2中，针对20E6检测到6Da的差异，但针对28G11的差异仅为4Da。在区域3中，针对20E6检测到4Da的差异，但是针对28G11仅检测到2Da的差异。值得注意的是，在cryo-EM结构中未观察到通过HDX检测到的区域1的相互作用，这表明区域1的氘交换保护不是由于直接的抗体：抗原结合，而是由于这些抗体与LAP-TGFβ1之间的结合相互作用稍有不同，导致了局部溶液动力学的变化。总之，HDX数据与cryo-EM结构一致。
观察到抗体2F8与残基205-255的结合(氨基酸VDINGFTTGRRGDLATIHGMN；SEQ IDNO：254)。
小鼠和人LAP-TGFβ1的氨基酸序列是89％同一性的。已鉴定的表位均在同源区中(图34)。
实施例24：通过体积排阻层析法和多角度光散射获得的与人源化20E6抗体复合的人LAP-TGFβ1或GARP-LAP-TGFβ1的结合化学计量
通过体积排阻色谱和多角度光散射(SEC-MALS)测定与20E6_H0.2_hIgG4mut复合的人LAP-TGFp1或GARP-LAP-TGFβ1的结合化学计量。由于尺寸不同，SEC色谱图上单独的人LAP-TGFβ1、单独的20E6_H0.2_hIgG4mut和复合物在不同时间洗脱。MALS检测器有助于确定每个检测到的峰的分子量。基于单个蛋白和蛋白复合物的分子量，可以确定结合化学计量。
材料
·人LAP-TGFβ1蛋白购自R&D Systems，并且由N末端249个aa的潜在相关肽(LAP)和C末端112个aa的成熟TGFβ1蛋白组成。将蛋白在10mM磷酸钠、150nM氯化钠，pH 7.4中进行缓冲液交换并浓缩至40μM。
·如实施例16中所述，产生了人GARP-LAP-TGFβ1。
·如实施例11中所述，产生了抗人LAP-TGFβ1抗体(20E6_H0.2_hIgG4mut)。将抗体从7.1mg/mL稀释到5.8mg/mL，等效于40μM。
体积排阻色谱-多角度光散射
使用连接至光电二极管阵列检测器和Wyatt光散射检测器的Agilent1200HPLC进行体积排阻色谱。在等度梯度下，使用10mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH 7.4缓冲液以0.2mL/min的流速运行Superdex 200增加型5/150GL色谱柱。
将LAP-TGFβ1与抗体20E6_H0.2_hIgG4mut混合至人LAP-TGFβ1终浓度5μM和抗体20E6_H0.2_hIgG4mut终浓度2.5μM。使用包含凝胶过滤标准品和牛血清白蛋白标准品的SEC-MALS系统分析了30μL单独的5μM人LAP/TGFβ1、单独的5μM 20E6_H0.2_hIgG4mut和LAP-TGFβ1：20E6复合物。还分析了下述样品：30μL 7.5μM单独的人LAP-TGFβ1、7.5μM单独的抗体20E6_H0.2_hIgG4mut和GARP-LAP-TGFβ1：20E6_H0.2_hIgG4mut复合物。
数据分析
所有色谱图均使用ChemStation(A.01.08.108版，Agilent Technologies)在280nM UV吸光度下绘制。使用ASTRA(6.1.2.84版，Wyatt Technologies)分析光散射数据。所有峰均在半峰高处在整个宽度上积分。
结果
针对LAP-TGFβ1：20E6_H0.2_hIgG4mut复合物和GARP-LAP-TGFβ1复合物的SEC-MALS分别如图35A和图35B中所示。基于每种蛋白和蛋白复合物的分子量，LAP-TGFβ1复合物的结合化学剂量为2∶2摩尔比，即，LAP-TGFβ1二聚体的两个拷贝结合至20E6_H0.2_hIgG4mut抗体的两个拷贝；GARP-LAP-TGFβ1复合物的结合化学剂量为2∶1摩尔比率。在存在GARP的情况下，在LAP-TGFβ1二聚体中仅一个结合位点能够与抗体相互作用。
实施例25：在CT26同基因型模型中抗LAP抗体的有效性
本实施例描述了在CT26结直肠癌模型(同基因型癌症模型)中抗LAP抗体与抗PD-1抗体联用的有效性。在该实验中，使用了抗LAP抗体的变体，其中抗体的Fc部分是IgG2a同种型，而非在亲本杂交瘤中发现的同种型。
简言之，将6-8周龄Balb/c小鼠皮下植入3x 105个CT26结直肠癌细胞。使肿瘤生长直至平均尺寸为48mm2，此时将荷瘤动物随机分成每组10只动物的组。
在第0、3、6、9和12天，腹腔内给予一组动物3mg/kg大鼠抗PD-1克隆RMP1-14-IgG2a或者10mg/kg抗PD-1与抗体28G11-IgG2a的组合。还向各组动物给予同种型对照抗体(大鼠IgG2a和/或小鼠IgG2a，未显示)。
在第0、3、6、9和12天，腹腔内给予另一组动物3mg/kg大鼠抗PD-1克隆RMP1-14-IgG2a、10mg/kg抗体16B4-IgG2a或者10mg/kg抗PD-1与抗体16B4-IgG2a的组合。还向各组动物给予同种型对照抗体(大鼠IgG2a和/或小鼠IgG2a，未显示)。
每天评估生存率，并使用公式V＝W2xL/2每周用卡尺测量3次肿瘤体积。给药后对动物进行跟踪53天。
如图36A和图36B中所示，用抗体28G11对该同基因型模型进行治疗，导致完全缓解率比单独的抗PD-1高5倍。而相比之下，如图36C-36F中所示，使用抗体16B4对动物的治疗对肿瘤生长没有作用。事实上，用16B4和抗PD-1的组合治疗动物会导致单独使用抗PD-1抗体的应答率降低。这些数据确定了两种抗LAP抗体28G11和16B4在小鼠肿瘤模型中具有不同的功能特性。这些数据确定了两种抗LAP抗体28G11和16B4在小鼠肿瘤模型中具有不同的功能特性。
实施例26：在EMT6同基因型模型中抗LAP抗体的有效性
本实施例描述了在另一种癌症的同基因型模型(即，EMT6乳腺癌肿瘤模型)中抗LAP抗体与抗PD-1抗体联用的有效性。
简言之，将3x 105个EMT6乳腺癌细胞皮下植入6-8周龄Balb/c小鼠的右后肋腹部。使肿瘤生长直至平均尺寸为75mm2，此时将荷瘤动物随机分成10组每组10只动物，并且根据下述在第0、3、6、9、12、15、18和21天腹腔内给药：
表31：用于EMT6同基因型模型的抗体和给药信息
Figure BDA0003108510350001411
每天评估生存率，并使用公式V＝W2xL/2每周用卡尺测量3次肿瘤体积。给药后对动物进行跟踪28天。将数据绘制为平均肿瘤体积+/-SEM。
如图37中所示，相对于单独的同种型对照抗体或单独的抗PD-1，单独使用抗体28G11或与抗PD-1联合使用对动物的治疗导致肿瘤生长的统计学显著减少。类似地，使用抗体22F9(图38)和20E6(图39)对动物进行治疗，单独使用或与抗PD-1联用，导致与单独的同种型对照抗体或抗PD-1相比，其在肿瘤生长方面的统计学意义显著降低。这些数据表明，28G11、22F9和20E6在EMT6小鼠模型中与抗PD-1抗体联合均具有活性。
实施例27：在4T1乳腺癌肿瘤转移模型中抗LAP抗体的有效性
本实施例描述了在肿瘤转移模型(即，4T1乳腺癌肿瘤转移模型)中抗LAP抗体作为单药疗法的有效性。
简言之，将1x 105个4T1乳腺癌细胞植入6-8周龄Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫。植入后一天，将动物随机分成每组7只动物。给予动物小鼠IgG1同种型对照抗体、小鼠-IgG2a对照抗体、抗TGFβ克隆1D11-IgG1以及抗LAP抗体28G11和16B4。在第0、3、6、9和12天，腹腔内给予所有动物10mg/kg。在给药后第29天，处死动物并且计数转移的肺肿瘤结节。数据以平均肺结节计数±SEM的形式绘制。
如图40中所示，与同种型对照抗体治疗的动物相比，用抗TGFβ抗体1D11和28G11而不是16B4进行的动物治疗具有统计学上显著的转移性肺结节减少(p＜0.05，离群值消除后的非配对T检验)。这些数据表明，在小鼠肿瘤转移模型中，两种抗LAP抗体28G11和16B4具有不同的功能性作用。28G11具有与抗TGFβ抗体1D11相当的有效性的发现与28G11的作用是一致的，这归因于对TGFβ途径的影响。
实施例28：在与射线组合的CT26同基因型模型中抗LAP抗体的有效性
本实施例描述了在同基因型CT26肿瘤模型中抗LAP抗体与射线组合的有效性。
简言之，将1x 106个CT26结直肠癌细胞植入6-8周龄的Balb/c小鼠。植入后8天，当平均肿瘤体积为300mm2时，将动物随机分成6组，每组16只动物(第0天)。在第0天开始，给予动物小鼠IgG2a同种型对照抗体(第1组)、抗LAP抗体28G11-IgG2a(第2组)、12Gy放射疗法和小鼠IgG2a同种型对照抗体(第3组)、20Gy放射疗法和小鼠IgG2a同种型对照抗体(第4组)、12Gy放射疗法和抗LAP抗体28G11-IgG2a(第5组)或20Gy放射疗法和抗LAP抗体28G11-IgG2a(第6组)。所有抗体均以10mg/kg腹腔内给予。第1组和第2组在第0、3和6天共计接受3剂抗体，并且由于肿瘤负荷较大，在第7天处死那些动物。第3-6组在第0、3、6、9和12天共计接受5剂抗体。在第7天还处死来自第3-6组的三只随机动物，其余动物则跟踪到第19天。在其中动物接受放射疗法的所有情况下，仅在第0天给予一次射线。每天评估生存率，并使用公式V＝W2xL/2每周用卡尺测量3次肿瘤体积。数据以存活动物的平均肿瘤体积+/-SEM表示。
如在图41A和41B中所示，单独使用12或20Gy射线治疗导致肿瘤生长延迟。与单独放射治疗相比，以12Gy放射剂量共同施用28G11导致肿瘤生长的统计学显著减少(****P＜.0001，***P＝.0004，2因素ANOVA)。以20Gy的放射剂量共同施用28G11也导致相对于单独的放射治疗减少，并且该作用在统计学上也很显著。
实施例29：抗LAP抗体对CD73表达的影响
在该实施例中，考察了在肿瘤微环境中抗LAP抗体对CD73表达的影响。CD73是一种细胞表面酶，可将单磷酸腺苷(AMP)加工成腺苷，这是一种在肿瘤微环境中具有已知免疫抑制作用的分子。
使CT26肿瘤在Balb/c小鼠中生长至300mm2(指定为第0天)，并且在第0、3和6天以10mg/kg给予抗体28G11。在第0天，用单剂量的靶向射线(12Gy或20Gy)处理小鼠。在放射后第7天通过流式细胞术考察单核性髓系来源的抑制性细胞(mMDSC)、M2巨噬细胞和树突状细胞上的CD73表达。分组如下：
第1组：同种型对照，无射线(n＝5)
第2组：28G11，无射线(n＝5)
第3组：同种型对照，12Gy射线(N＝3)
第4组：同种型对照，20Gy射线(N＝3)
第5组：28G11，12Gy射线(N＝2)
第6组：28G11，20Gy射线(N＝3)
如图42A-42C中所示，在这两个剂量(12Gy和20Gy)下射线诱导mMSDC、M2巨噬细胞和树突状细胞上的CD73表达。通过使用28G11治疗使得在CD73表达中的这种增加衰减。此外，28G11将未经放射治疗小鼠的mMDSC中的CD73表达降低至基线水平以下(图42A)。这些结果表明，抗LAP抗体治疗降低了抑制性细胞群体的数量和免疫抑制能力，这反映在CD73阳性mMDSC、M2巨噬细胞和树突状细胞比例降低。
实施例30：抗LAP抗体的生物分布
在该实施例中考察了在具有肿瘤的小鼠中抗LAP抗体的生物分布。
简言之，使用1x 106个CT26细胞接种3只Balb/C小鼠，并且使得肿瘤生长直至其达到平均肿瘤体积150mm3。以10mg/kg单次注射给予动物28G11_hIgG1。注射后三天，处死动物并收集血液。用PBS灌注小鼠，并收集心脏、肝脏、肾脏、骨骼、结肠、肺和脾组织。将组织置于10％中性福尔马林缓冲液中，于4℃储存过夜，然后转移至80％乙醇中。将组织样品切片，并用抗人IgG1染色，以鉴定在动物中28G11的定位。在大多数组织中观察到的染色很少，而在肿瘤组织中观察到的染色最强。
实施例31：在癌症动物模型中20E6和28G11单用以及与抗PD-1联用的有效性
本实施例描述了在EMT6小鼠乳腺癌肿瘤模型中检测20E6和28G11抗体单用以及与抗PD-1联用的有效性。所使用的抗体列举如下：
o小鼠x[LAP-TGFb1_H]mAb(28G11_VH_N56Q)mIgG2a/κ(CX)：28G11_mIgG2a
o小鼠x[LAP-TGFb1_H]mAb(20E6_Q1E_N54Q)IgG2a/κ(CX)：20E6_mIgG2a
o小鼠x[HEXON_Ad]mAb(TC31.27F11.C2)IgG2a/κ(CC)：同种型对照抗体
简言之，将6-8周龄Balb/c小鼠皮下植入0.3x 106个EMT6小鼠乳腺癌细胞。当肿瘤生长到平均尺寸为约85mm3时，将动物分为6个治疗组，每组10只动物，然后开始治疗。所有动物均腹腔内给药。抗体20E6和28G11以10mg/kg每周两次，而抗PD1每5天给予5mg/kg。载剂对照组由以5mg/kg给药的小鼠IgG1同种型对照和以10mg/kg给药的小鼠IgG2a同种型对照组成。每周测量肿瘤2-3天，并且使用下述公式计算肿瘤体积：V＝(肿瘤宽度)2x(肿瘤长度)/2。观察到与用同种型对照抗体治疗的对象相比，仅用抗体20E6和抗体28G11治疗对象导致显著的肿瘤生长抑制。此外，抗体20E6或抗体28G11与抗PD-1抗体的联合治疗可产生6个完全缓解，其中动物没有任何残留肿瘤。参见图43A-43H。观察到所有治疗均耐受良好，且未引起任何体重减轻。
实施例32：抗LAP F(ab’)与人LAP-TGFβ亚型1、2和3的结合
为避免在亲和性测量中亲合力的干扰，本实施例分析了20E6 F(ab’)结合蛋白与人LAP-TGFβ的结合动力学。本实施例描述了使用表面等离子体共振测量的人源化20E6 F(ab’)结合蛋白结合至人LAP-TGFβ亚型1、2和3的亚型特异性。
根据试剂盒的方案(GE Healthcare，目录号BR100839)，在使用1xHBS-EP+(Teknova，目录号H8022)的Biacore T200仪器上，固化一系列S CM3传感器芯片(GEHealthcare，目录号BR100534)和抗人Fc捕获抗体。在25℃下，在具有0.1mR/mL BSA的1xHBS-EP+(JacksonImmunoresearch，目录号001-000-162)中进行人LAP-TGFβ亚型1、2和3与人源化20E6 F(ab’)之间的动力学结合相互作用。将约50-65RU人LAP-TGFβ-Fc亚型捕获至抗人Fc表面，随后注射以1：3系列稀释的人源化20E6 F(ab’)，从3000nM至1.37nM并包括0nMF(ab’)。通过从参照(仅捕获表面)流动细胞的信号减去0nM F(ab’)注射来双重参照结合数据。通过以1∶1结合模型拟合数据来测定结合速率常数(GE Healthcare Biacore T200评价软件2.0)。
图示和表32中所示，当捕获至抗人Fc捕获传感器芯片时，由于IgG1以及由LAP-TGFβ1分子呈现的二价表位的二价性质，人源化20E6 IgG1抗体显示出非1∶1结合性质。参见图44A。还观察到单价人源化20E6 F(ab’)以纳摩尔亲和性结合至人LAP-TGFβ1(图44B)，但在人LAP-TGFβ2(图44C)或LAP-TGFβ3(图44D)的情况下未观察到显著信号增加。这些数据表明，人源化20E6 F(ab’)特异性结合至人LAP-TGFβ1。
表32：人源化20E6 F(ab’)结合至人TGFβ亚型的结合参数
Figure BDA0003108510350001451
实施例33：抗LAP F(ab’)与人、食蟹猴、大鼠和小鼠LAP-TGFβ1的结合
本实施例描述了使用表面等离子体共振测量的人源化20E6 F(ab’)结合蛋白结合至来自若干物种的LAP-TGFβ1。
根据试剂盒的方案(GE Healthcare，目录号BR100839)，在使用1xHBS-EP+(Teknova，目录号H8022)的Biacore T200仪器上，固化一系列S CM3传感器芯片(GEHealthcare，目录号BR100534)和抗人Fc捕获抗体。在25℃下，在具有0.1mg/mL BSA的1xHBS-EP+(Jackson Immunoresearch，目录号001-000-162)中进行人、食蟹猴、大鼠和小鼠LAP-TGFβ1与人源化20E6 F(ab’)之间的动力学结合相互作用。将约60-95RU人、食蟹猴、大鼠和小鼠LAP-TGFβ-Fc捕获至抗人Fc表面，随后注射以1∶3系列稀释的人源化20E6 F(ab’)，从3000nM至1.37nM，且包括0nM F(ab’)。通过从参照(仅捕获表面)流动细胞的信号减去0nMF(ab’)注射来双重参照结合数据。通过以1∶1结合模型拟合数据来测定结合速率常数(GEHealthcare Biacore T200评价软件2.0)。
图示和表33中所示，人源化20E6 F(ab’)以纳摩尔亲和性结合至人LAP-TGFβ1(图45A)、食蟹猴LAP-TGFβ1(图45B)、大鼠LAP-TGFβ1(图45C)和小鼠LAP-TGFβ1(图45D)。
表33：人源化20E6 F(ab’)结合至来自多个物种的LAP-TGFβ1的结合参数
Figure BDA0003108510350001452
实施例34：LAP-TGFb1的整联蛋白(avb6)激活的抑制
该实施例使用LAP抗体20E6_mIgG2a考察LAP-TGFb1对整联蛋白(avb6)激活的抑制。在37C下，将重组人aVβ6整联蛋白(R&D Systems；目录号#3817-AV)在不含血清的RPMI中以2ug/ml包被在96孔平底组织培养板中2小时。用20E6_mIgG2a、同种型对照物或抗αVβ6(10D5；可从Millipore Sigma购得)的3倍连续稀释物(30ug/ml高)处理各孔。在处理之后，立即向板中依次添加表达人LAP-TGFβ1的P3U1细胞(5x 104个/孔)和HEK-B1ue TGFβ(2X 104个/孔)细胞(HEK-Blue TGFβ细胞含有SMAD结合元件反应性SEAP报告子，其在生物活性TGFβ结合至受体时导致分泌SEAP)。然后，将板在37℃下孵育过夜，并且在第二天，收集125μL上清液并包被于96孔v底板中，并在500G下再旋转5分钟以除去细胞。利用Great EscAPe化学发光试剂盒2.0(Takara Bio；目录号#631736)，根据生产厂商的方案，检测上清液(25μL)中所分泌的碱性磷酸酶(SEAP)的水平。数据表明，与同种型对照和抗αVβ6(10D5)抗体相比，20E6_mIgG2a有效抑制LAP-TGFb1的整联蛋白avb6激活(图46)。
表34：序列总结表
Figure BDA0003108510350001461
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在该表和前面的表中，除非另有说明，否则应当理解，带下划线表示在结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)中的CDR。值得注意的是，可以通过本文所述的任何方法和系统(例如，Chothia、Kabat和IMGT)定义和鉴定CDR。
等效方案：
仅通过不超过常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文公开的具体实施方式的很多等效方案。通过下述权利要求旨在涵盖此类等效方案。
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Claims (54)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至LAP，其包含：
(a)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:110、120和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:113、114和115的氨基酸序列；
(b)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:110、111和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:113、114和115的氨基酸序列；
(c)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:16、26和18的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列；
(d)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:54、55和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:57、58和59的氨基酸序列；
(e)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:54、66和56的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:57、58和59的氨基酸序列；
(f)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:54、55和68的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:57、58和59的氨基酸序列；或者
(g)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:54、66和68的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:57、58和59的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区序列和轻链可变区序列，所述重链可变区序列和所述轻链可变区序列与选自以下的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％同一性：(a)分别为SEQ ID NO:218和154；(b)分别为SEQ IDNO:133和154；(c)分别为SEQ ID NO:42和52；(d)分别为SEQ ID NO:101和104；和(e)分别为SEQ ID NO:98和104。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列，或包含具有1-5、5-10、10-15、15-20或20-25个氨基酸置换的SEQ ID NO:218的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列，或包含具有1-5、5-10、10-15、15-20或20-25个氨基酸置换的SEQ ID NO:154的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下的重链可变区序列和轻链可变区序列：(a)分别为SEQ ID NO:218和154；(b)分别为SEQ ID NO:133和154，(c)分别为SEQ ID NO:42和52；(d)分别为SEQ ID NO:101和104；和(e)分别为SEQ ID NO:98和104。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链序列和轻链序列，所述重链序列和所述轻链序列与选自以下的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％同一性：(a)分别为SEQ ID NO:219和155；(b)分别为SEQ ID NO:220和155；(c)分别为SEQ IDNO:134和155；(d)分别为SEQ ID NO:135和155；(e)分别为SEQ ID NO:43和53；(f)分别为SEQ ID NO:45和53；(g)分别为SEQ ID NO:102和105；(h)分别为SEQ ID NO:103和105；(i)分别为SEQ ID NO:99和105；和(j)分别为SEQ ID NO:100和105。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下的重链序列和轻链序列：(a)分别为SEQ ID NO:219和155；(b)分别为SEQ ID NO:220和155；(c)分别为SEQ IDNO:134和155；(d)分别为SEQ ID NO:135和155；(e)分别为SEQ ID NO:43和53；(f)分别为SEQ ID NO:45和53；(g)分别为SEQ ID NO:102和105；(h)分别为SEQ ID NO:103和105；(i)分别为SEQ ID NO:99和105；和(j)分别为SEQ ID NO:100和105。
7.根据前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合至人LAP、食蟹猴LAP、大鼠LAP和/或小鼠LAP。
8.根据前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体抑制TGFβ1激活。
9.根据前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体以60nM或更低、50nM或更低、40nM或更低、30nM或更低、20nM或更低或者10nM或更低的KD结合至人LAP。
10.根据前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体在不存在锚定蛋白的情况下结合至人LAP。
11.根据前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合至免疫抑制性细胞。
12.根据前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合至免疫抑制性细胞上与锚定蛋白复合的LAP，但不结合至所述锚定蛋白或由LAP和所述锚定蛋白两者的残基组成的表位。
13.根据权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述锚定蛋白是GARP或LRRC33。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述免疫抑制性细胞是调节性T细胞、M2巨噬细胞、表达LAP的癌细胞和/或髓系来源的抑制性细胞。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合至GARP阳性免疫抑制性细胞和GARP阴性免疫抑制性细胞两者。
16.根据前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不结合至胞外基质上的LAP。
17.根据前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不结合至与LTBP1、LTBP3和/或LTBP4复合的LAP。
18.根据前述任一项权利要求所述的抗体，其中所述抗体包含IgG恒定区或其变体。
19.根据前述任一项权利要求所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
20.一种分离的抗体，其与权利要求1-19中任一项所述的抗体结合至LAP上的相同表位。
21.根据前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合至LAP的表位。
22.根据前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不结合至包含Y74T突变的人LAP或者结合至包含K27C和Y75C突变的人LAP。
23.一种分离的抗体，其结合至人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO:1)的残基31-40、274-280和340-343的一个或多个残基，或者结合至人LAP-TGFβ1(SEQ ID NO:1)的残基31-43、272-283和340-344的一个或多个残基。
24.一种分离的抗体，其结合至人LAP，并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:110、120和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:113、114和115的氨基酸序列，其中所述抗体还包含人IgG1恒定区。
25.一种分离的抗体，其结合至人LAP，并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:110、120和112的氨基酸序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区，其分别包含SEQ ID NO:113、114和115的氨基酸序列，其中所述抗体还包含突变的人IgG4恒定区，其包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:218和154的氨基酸序列。
27.一种双特异性分子，其包含连接至具有第二结合区的分子的前述任一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段。
28.根据权利要求27所述的双特异性分子，其中所述第二结合区结合至肿瘤相关抗原。
29.根据权利要求27所述的双特异性分子，其中所述第二结合区结合至CD4、CD8、CD45、CD56、CD14、CD16、CD19、CD11b、CD25、CD20、CD22、CD30、CD38、CD114、CD23、CD73、CD163、CD206、CD203、CD200R或CD39。
30.一种缀合物，其包含权利要求1-26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段连接至可检测部分、结合部分、标记部分或生物活性部分。
31.一种核酸，其包含编码权利要求1-26中任一项所述的抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链可变区的核苷酸序列。
32.一种表达载体，其包含权利要求31所述的核酸。
33.一种细胞，其用权利要求32所述的表达载体转化。
34.一种药物组合物，其包含权利要求1-30中任一项所述的抗体或抗原结合片段、双特异性分子或免疫缀合物，和药学上可接受的载体。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其还包含一种或多种另外的治疗剂。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述一种或多种另外的治疗剂选自以下：抗癌剂、化学治疗剂、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗炎剂和免疫检查点抑制剂。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述免疫检查点阻断剂选自以下：抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIGIT抗体和抗TIM3抗体。
38.一种试剂盒，其包含权利要求1-30中任一项所述的抗体或抗原结合片段、双特异性分子或免疫缀合物，和使用说明书。
39.一种制备抗LAP抗体的方法，其包括在权利要求33所述的细胞中表达所述抗体或抗原结合片段和从所述细胞中分离所述抗体或抗原结合片段。
40.一种在表达LAP的细胞上选择性抑制TGFβ1激活但在胞外基质上不抑制TGFβ1激活的方法，其包括向受试者施用权利要求1-26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，权利要求27-29中任一项所述的双特异性分子，权利要求30所述的免疫缀合物或者权利要求34-37中任一项所述的药物组合物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述细胞是免疫抑制性细胞。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述免疫抑制性细胞选自以下：抑制性T细胞、M2巨噬细胞、表达LAP-TGFβ1的癌细胞和单核髓系来源的抑制性细胞。
43.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-30中任一项所述的抗体或抗原结合片段、双特异性分子或免疫缀合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症的特征在于TGFβ活性异常。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中所述癌症与CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性B细胞、髓系来源的抑制性细胞、肿瘤相关巨噬细胞、癌症相关成纤维细胞、和/或先天性淋巴细胞的浸润相关。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述癌症选自以下：乳腺癌、膀胱癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠道癌、胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和骨髓增生异常综合症。
47.根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其还包括施用一种或多种另外的疗法。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述一种或多种另外的疗法选自放射疗法、化学疗法、免疫检查点抑制剂、免疫抑制疗法、免疫刺激疗法、细胞疗法和治疗剂。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIGIT抗体、或抗TIM3抗体。
50.一种检测样品中是否存在LAP的方法，其包括在允许抗体和LAP之间形成复合物的条件下，使所述样品与权利要求1-26中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触，和检测复合物的形成。
51.一种诊断与调节性T细胞浸润相关的癌症的方法，其包括使来自罹患所述癌症的患者的生物样品与权利要求1-26中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体的阳性染色表示所述癌症是与调节性T细胞浸润相关的。
52.一种诊断与GARP阴性抑制性细胞相关的癌症的方法，其包括使来自罹患所述癌症的患者的生物样品与权利要求1-26中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体的阳性染色和抗GARP抗体的阴性染色表示所述癌症与GARP阴性抑制性细胞相关。
53.一种选择罹患癌症的患者以接受权利要求1-26中任一项所述的抗体治疗的方法，其包括使来自所述患者的生物样品与所述抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体的阳性染色表示所述癌症适合用所述抗体治疗。
54.一种确定罹患癌症的患者对权利要求1-26中任一项所述的抗体治疗的应答的方法，其包括使来自所述患者的生物样品与所述抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体减少的染色表示所述癌症对使用所述抗体的治疗具有应答。
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