PL193575B1

PL193575B1 - Zastosowanie przeciwciała przeciwko białku pokrewnemu z hormonem przytarczyc (PTHrP)

Info

Publication number: PL193575B1
Application number: PL336797A
Authority: PL
Inventors: Koh Sato; Toshiaki Tunenari; Kimie Ishii
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-05-15
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2007-02-28
Also published as: AU7236998A; KR20010012613A; CN1255858A; DE69837707T2; AU750021B2; EP1004313A4; BR9809629A; US20030138424A1; NO995558D0; DE69837707D1; SK155799A3; WO1998051329A1; NO995558L; TR199902800T2; EP1004313B1; TWI227140B; PL336797A1; EP1004313A1; UA74130C2; AU750021C

Abstract

1. Zastosowanie przeciwcia la przeciwko bia lku pokrewnemu z hormonem przytarczyc (PTHrP) do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia kacheksji indukowanej przez raka. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała przeciwko białku pokrewnemu z hormonem przytarczyc (PTHrP)do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia kacheksji indukowanej przez raka.

Kacheksja spotykana u terminalnych pacjentów z nowotworem jest jednym z powszechnych zespołów paraneoplastycznych choroby nowotworowej i charakteryzuje się układowymi zaburzeniami z anoreksją, utratą ciężaru ciała, anemią, zaburzeniami równowagi elektrolitowej i upośledzoną odpornością, jako głównymi objawami. Rozwój kacheksji u pacjentów nowotworowych prowadzi do śmiertelnych i terminalnych objawów; zaburza jakość życia (QOL) pacjentów, i silnie wpływa na sferę psychologiczną, fizyczną i socjalną pacjentów, ich rodzin i otaczających ludzi.

Ostatnio stwierdzono, że kachektyna, którą uważa się za czynnik przyczynowy kacheksji rakowej, jest identyczna z czynnikiem martwicy nowotworu (TNF). Następnie stwierdzono, że cytokiny (np. interleukina (IL) 1, IL-6, LIF, IFN) również wywierają to samo działanie co kachektyna, tak więc kacheksja jest wywoływana przez złożone działanie licznych czynników.

Wiadomo, że linia komórkowa OCC-1 pochodząca z ludzkiego nowotworu jamy ustnej wytwarza różne rodzaje rozpuszczalnych czynników związanych z kacheksją rakową. U myszy nagich, którym wszczepiono komórki OCC-1, rozwijają się różne zespoły, w tym kacheksja (Kajimura i in., Canc. Chemother. Pharmacol., 1996, 38 suppl., 48-52; Tanaka R. i in., Jpn. J. Clin. Oncology Apr. 1996, 26 (2) : 88-94). Uważa się, że spowodowane jest to tym, że linia komórkowa OCC-1 wszczepiona myszom nagim, wraz ze wzrostem komórek wytwarza różne cytokiny (np. G-CSF, IL-6, LIF, IL-11, PTHrP), które to czynniki działają wspólnie powodując u myszy wspomniane objawy.

Objawy spotykane u myszy nagich, którym wszczepiono linię komórkową OCC-1, wydają się przypominać objawy spotykane u pacjentów w terminalnym stanie raka. Jednakże, nie istniały doniesienia dotyczące leków albo czynników terapeutycznych do leczenia kacheksji.

Celem wynalazku jest dostarczenie czynnika terapeutycznego do leczenia kacheksji, który jako składnik czynny zawiera substancję zdolną do hamowania wiązania między białkiem spokrewnionym z hormonem przytarczyc (PTHrP) i jego receptorem.

Wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała przeciwko białku pokrewnemu z hormonem przytarczyc (PTHrP)do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia kacheksji indukowanej przez raka.

Korzystnie przeciwciało jest fragmentem przeciwciała przeciw PTHrP i/lub jego modyfikowanym fragmentem. Bardziej korzystnie przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem chimerycznym.

Najkorzystniej przeciwciało humanizowane jest przeciwciałem humanizowanym #23-57-137-1.

Korzystnie przeciwciało jest typu monoklonalnego.

Krzystnie przeciwciało (a) jest aktywne w zapobieganiu lub leczeniu kacheksji, i (b) nie hamuje wzrostu komórek nowotworowych OCC-1.

W niniejszym wynalazku, określenie „kacheksja obejmuje stan wywołany przez raka.

W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „receptor PTHrP dotyczy dowolnego receptora, który wiąże się z PTHrP (taki jak opisany w publikacji japońskiego zgłoszenia patentowego nr 6-506598), niezależnie od tego czy receptor PTHrP występuje w narządzie docelowym (np. kości, nerce) czy nie.

W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „substancja zdolna do hamowania wiązania pomiędzy PTHrP i jego receptorem (receptorem PTHrP) oznacza dowolną substancję, która może się wiązać z receptorem PTHrP; taką jak przeciwciało przeciwko PTHrP; dowolną substancję, która może się wiązać z receptorem PTHrP zapobiegając wiązaniu się receptora PTHrP z PTHrP, taką jak antagonista receptora PTHrP (antagonista PTHrP), szczególnie peptyd z zastąpieniem albo delecją przynajmniej jednej reszty aminokwasowej w peptydzie PTHrP albo częściowej sekwencji peptydu PTHrP, albo ich kombinacji.

Przeciwciało przeciwko PTHrP obejmuje dowolny znany rodzaj przeciwciała, taki jak przeciwciało humanizowane, przeciwciało ludzkie (WO 96/33735) albo przeciwciało chimeryczne (publikacja japońskiego zgłoszenia patentowego nr 4-228089) i przeciwciało przykładowo zastosowane w niniejszym wynalazku (przeciwciało #23-57-137-1).

PL 193 575 B1

W publikacji Journal of Bone and Minerał Research, vol 8 no 7, July 1993, str 949-860 opisano stosowanie przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP do leczenia hiperkalcemii towarzyszącej nowotworowi złośliwemu, przy czym wyraźnie zaznaczono, iż przeciwciało to nie wpływa na wzrost nowotworu FA-6.

Przeciwciało może być poliklonalne albo monoklonalne, ale korzystnie jest to przeciwciało monoklonalne. Antagonista PTHrP obejmuje polipeptyd albo związek drobnocząsteczkowy. Antagonista PTHrP obejmuje substancję, która wiąże się z receptorem PTHrP w sposób antagonistyczny, jak polipeptyd o aktywności antagonistycznej, jak opisany w publikacji japońskiego zgłoszenia patentowego nr 7-165790; Peptides (USA) 1995, 16 (6) :1031-1037, Biochemistry (USA) Apr. 281992, 31(16)4026-4033 i japońskiej publikacji zgłoszenia w fazie krajowej nr 5-509098. Polipeptydy te mogą mieć delecję, zastąpienie, addycję albo insercję przynajmniej jednej reszty aminokwasowej, o ile wykazują równoważny poziom aktywności antagonistycznej względem PTHrP, które są również objęte pojęciem antagonistów PTHrP.

1. Przeciwciało przeciwko PTHrP

Przeciwciało przeciwko PTHrP stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem może być dowolnym przeciwciałem, o ile wykazuje efekt terapeutyczny względem kacheksji, niezależnie od źródła, rodzaju (monoklonalne albo poliklonalne) i konfiguracji.

Przeciwciało przeciwko PTHrP można wytworzyć dowolnym znanym sposobem, jako przeciwciało poliklonalne albo monoklonalne. Korzystnie, przeciwciałem przeciwko PTHrP jest przeciwciało monoklonalne pochodzące od ssaka. Przeciwciało monoklonalne od ssaka obejmuje przeciwciała wytworzone przez hybrydoma, jak również wytworzone techniką inżynierii genetycznej w gospodarzu transformowanym rekombinowanym wektorem ekspresyjnym, niosącym gen dla przeciwciała. Przeciwciało stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest przeciwciałem, które może się wiązać z PTHrP zapobiegając wiązaniu się PTHrP z receptorem PTH/PTHrP, blokując w ten sposób przekazywanie sygnału PTHrP i w wyniku hamując aktywność biologiczną PTHrP.

Konkretnym przykładem takiego przeciwciała jest przeciwciało #23-57-137-1, które można wytworzyć przy użyciu klonu hybrydoma #23-57-137-1.

Klon hybrydoma #23-57-137-1 który oznaczono „hybrydoma mysio-mysia #23-57-137-1 zdeponowano na zasadach Traktatu Budapeszteńskiego 15 sierpnia, 1996, w National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency for Industrial Science and Technology, Japonia (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japonia), pod numerem dostępu FERM BP-5631.

2. Hybrydoma wytwarzająca przeciwciało

Hybrydoma wytwarzającą przeciwciało można wytworzyć zasadniczo dowolną znaną techniką. PTHrP stosuje się jako antygen do immunizowania według konwencjonalnych metod immunizacji. Powstałe immunocyty poddaje się fuzji ze znanymi komórkami rodzicielskimi konwencjonalnym sposobem fuzji komórkowej, zaś komórki wytwarzające przeciwciała monoklonalne bada się przesiewowo konwencjonalnymi sposobami badania przesiewowego.

Konkretniej, komórki wytwarzające przeciwciała monoklonalne wytwarza się w następujący sposób.

Po pierwsze, ludzkie PTHrP, które stosuje się jako antygen uczulający do wytwarzania przeciwciał, wytwarza się przez wyrażenie sekwencji genu/aminokwasowej PTHrP ujawnionej w Suva L. J. i in., Science (1987) 237, 893. To znaczy, sekwencję nukleotydową kodującą PTHrP wprowadza się do dowolnego znanego wektora ekspresyjnego, i transformuje się komórkę odpowiedniego gospodarza wektorem ekspresyjnym. Białko PTHrP izoluje się i oczyszcza z komórek transformowanego gospodarza albo z supernatantu hodowlanego komórek transformowanego gospodarza dowolnym sposobem.

Po drugie, oczyszczone białko PTHrP stosuje się jako antygen uczulający. Alternatywnie, jako antygen uczulający można zastosować 34-aminokwasowy peptyd regionu końca N PTHrP, który można syntetyzować chemicznie.

Zakres ssaków, które można immunizować nie jest szczególnie ograniczony. Jednakże, ssaka korzystnie wybiera się biorąc pod uwagę zgodność komórek rodzicielskich zastosowanych do fuzji komórkowej. Na ogół, stosuje się gryzonia (np. mysz, szczura, chomika, królika) albo małpę.

Immunizację ssaka antygenem uczulającym można przeprowadzić według dowolnej znanej metody, przykładowo, przez wstrzyknięcie antygenu uczulającego ssakowi dootrzewnowo albo podskórnie. Konkretniej, antygen uczulający rozcieńcza się i zawiesza w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) albo w normalnym roztworze soli, powstałą zawiesinę miesza się z odpowiednią ilością adiuwantu (np. kompletnego adiuwantu Freunda) otrzymując emulsję. Emulsję wstrzykuje się ssakowi

PL 193 575 B1 kilkakrotnie, w odstępach 4-21 dni. Podczas immunizacji antygen uczulający można przyłączyć do odpowiedniego nośnika.

Po immunizacji, sprawdza się poziom przeciwciał surowiczych. Gdy potwierdzi się, że poziom przeciwciał surowiczych osiągnął żądany poziom, izoluje się immunocyty od ssaka, a następnie poddaje fuzji komórkowej. Korzystnymi immunocytami są splenocyty.

Komórkami rodzicielskimi zastosowanymi do fuzji komórkowej (tj. jako partner fuzji komórkowej z immunocytami) są komórki szpiczaka, pochodzące od ssaka. Komórkami szpiczaka mogą być komórki dowolnej znanej linii, przykładowo P3 (P3x63Ag8.653)(J. Immunol., (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Curr. Topics in Microbiol. Immunol., (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler G. i Milstein C.. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. i in., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. i in., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S.F. i in., J. Immunol. Meth. (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med., (1978) 148, 313-323) albo R210 (Galfre, G. i in., Nature (1979) 277, 131-133).

Fuzję komórkową immunocytów z komórkami szpiczaka przeprowadza się znanymi sposobami, takimi jak sposób Milsteina i in. (Kohler, G. i Milstein C., Meth. Enzymol., (1981) 73, 3-46).

Konkretniej, fuzję komórkową przeprowadza się, przykładowo, w konwencjonalnej hodowlanej pożywce odżywczej w obecności promotora fuzji komórkowej. Promotorem fuzji komórkowej może być glikol polietylenowy (PEG) albo wirus Sendai (japoński wirus hemaglutynujący; HVJ). Jeżeli to konieczne, w celu poprawienia wydajności fuzji, można również dołączyć taki dodatek jak dimetylosulfotlenek.

Stosunek immunocytów do komórek szpiczaka w fuzji komórkowej może być dowolny. Przykładowo, immunocyty stosuje się w ilości 1 do 10-krotnie większej niż komórki szpiczaka. Pożywką hodowlaną stosowaną do fuzji komórkowej jest, przykładowo pożywka RPMI 1640 albo MEM, przydatne do hodowli komórek szpiczaka albo inna pożywka zwykle stosowana do hodowli takich komórek. Jeżeli to konieczne, do pożywki hodowlanej stosuje się dodatek surowicy, takiej jak płodowa surowica cielęca (FCS).

Fuzję komórek przeprowadza się przez dokładne wymieszanie immunocytów z komórkami szpiczaka w podanych ilościach, w pożywce hodowlanej, dodając roztworu PEG (np. średni ciężar cząsteczkowy: około 1000-6000) (który uprzednio podgrzano do około 37°C), zwykle w stężeniu 30-60% (wag./obj.), a następnie wymieszanie powstałego roztworu, co powoduje powstanie komórek fuzyjnych (hybrydoma). Następnie, do roztworu dodaje się odpowiedniej pożywki hodowlanej i odwirowuje się w celu usunięcia nadsączu. Procedurę powtarza się kilkakrotnie w celu usunięcia promotora fuzji komórkowej lub tym podobnych, co byłyby niepożądane do wzrostu hybrydoma w pożywce hodowlanej.

Otrzymane hybrydoma można selekcjonować, przez hodowanie w konwencjonalnej pożywce selekcyjnej, takiej jak pożywka z hipoksantyną-aminopteryną-tymidyną (HAT). Hodowanie hybrydoma w pożywce HAT przeprowadza się przez czas wystarczający do zniszczenia komórek innych niż pożądane hybrydoma (tj. komórek, które nie uległy fuzji), zwykle przez kilka dni do kilku tygodni. Następnie, przeprowadza się konwencjonalną procedurę rozcieńczania granicznego w celu przesiewania i klonowania hybrydoma, które wydzielają żądane przeciwciało.

Alternatywnie, ludzkie przeciwciało o aktywności wiązania wobec PTHrP można wytworzyć przez uczulanie ludzkich limfocytów przy użyciu PTHrP in vitro, a następnie poddawanie uczulonych limfocytów fuzji komórkowej z komórkami ludzkiego szpiczaka, zdolnymi do nieograniczonego wzrostu (japońska publikacja patentowa nr 1-59878). Alternatywnie, ludzkie przeciwciało przeciwko PTHrP można wytworzyć przez wstrzyknięcie PTHrP jako antygenu zwierzęciu transgenicznemu posiadającemu cały repertuar ludzkich genów przeciwciał, otrzymując komórki wydzielające przeciwciała przeciwko PTHrP i unieśmiertelnienie tych komórek, tak że przeciwciało ludzkie jest wytwarzane przez unieśmiertelnione komórki (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 i WO 94/02602).

Hybrydoma wytwarzające przeciwciało monoklonalne można hodować w konwencjonalnej pożywce i przechowywać w ciekłym azocie przez czas dłuższy.

W celu wytwarzania przeciwciała monoklonalnego z hybrydoma, można zastosować sposób obejmujący hodowanie hybrydoma według konwencjonalnego sposobu i zbieranie przeciwciała monoklonalnego z supernatantu komórkowego albo sposób obejmujący wstrzykiwanie hybrydoma ssakowi zgodnemu z hybrydoma, w celu hodowania hybrydoma w organizmie ssaka i zbieranie hybrydoma z wysięku otrzewnowego ssaka. Ta pierwsza metoda jest przydatna do wytwarzania przeciwciał o dużej czystości, zaś druga jest przydatna do wytwarzania przeciwciała w znacznych ilościach.

PL 193 575 B1

3. Przeciwciało rekombinowane

Według wynalazku, można również zastosować przeciwciało monoklonalne typu rekombinacyjnego, które można wytworzyć przez klonowanie genu przeciwciała z hybrydoma, integrowanie genu przeciwciała do odpowiedniego wektora, wprowadzanie wektora do organizmu gospodarza i wytwarzanie przeciwciała w komórce gospodarza według konwencjonalnych technik rekombinacji genetycznej (patrz, przykładowo, Vandamme A.M. i in., Eur. J. Biochem. (1990) 192:767-775).

Konkretniej, mRNA kodujący region zmienny (V) przeciwciała przeciwko PTHrP izoluje się z hybrydoma wytwarzających przeciwciała przeciwko PTHrP. Izolowanie mRNA przeprowadza się przez wyizolowanie całkowitego RNA dowolną znaną metodą taką jak ultrawirowanie z guanidyną (Chirgwin J.M i in., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) albo metodą AGPC (Chomczyński P. i in., Analytical Biochemistry (1987) 162, 156-159), z którego otrzymuje się mRNA przy użyciu zestawu do oczyszczania mRNA (Pharmacia) itp. Można również wykorzystać zestaw do oczyszczania mRNA Quick Prep (Pharmacia).

Następnie, cDNA dla regionu V przeciwciała syntetyzuje się z mRNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy. Syntezę cDNA przeprowadza się przy użyciu zestawu AMV Reverse Trascriptase Firststrand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Corporation) itp. cDNA można również syntetyzować albo amplifikować przez 5'-RACE (Frohman M.A. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky A. i in., Nucleic Acids Res., 17, 2919-2932, 1989) wykorzystując zestaw 5'-Ampli FINDER RACE (CLONTECH Inc.) w kombinacji z metodą PCR itp.

Interesujący fragment DNA izoluje się i oczyszcza z powstałego produktu PCR, a następnie poddaje się ligacji do wektora DNA otrzymując wektor rekombinowany. Rekombinowany wektor wprowadza się do komórki gospodarza, jak E. coli, i selekcjonuje się kolonie zawierające pożądany rekombinowany wektor. Sekwencję nukleotydową pożądanego DNA potwierdza się, przykładowo, metodą zakańczania łańcucha dideoksynukleotydami.

Po otrzymaniu DNA kodującego region V przeciwciała przeciwko PTHrP, DNA poddaje się integracji do wektora ekspresyjnego zawierającego DNA kodujący region stały (C) przeciwciała.

W celu wytwarzania przeciwciała przeciwko PTHrP stosowanego zgodnie z wynalazkiem, gen przeciwciała poddaje się integracji z wektorem ekspresyjnym tak, że gen przeciwciała może być wyrażany pod kontrolą regionu kontrolującego ekspresję (np. wzmacniacza, promotora). Komórkę gospodarza transformuje się wektorem ekspresyjnym w celu wyrażania przeciwciała.

Podczas ekspresji genu przeciwciała, DNA kodujący łańcuch ciężki (H) i DNA kodujący łańcuch lekki (L) przeciwciała można integrować z osobnymi wektorami ekspresyjnymi, a następnie transformować komórkę gospodarza równocześnie obydwoma powstałymi wektorami ekspresyjnymi. Alternatywnie, zarówno DNA kodujący łańcuch H jak i DNA kodujący łańcuch L przeciwciała można integrować łącznie w pojedynczym wektorze ekspresyjnym, a następnie transformować komórkę gospodarza powstałym wektorem ekspresyjnym (WO 94/11523).

W celu wytwarzania przeciwciała rekombinowanego, oprócz wspomnianych komórek gospodarza, można również zastosować zwierzę transgeniczne jako gospodarza. Przykładowo, gen przeciwciała wprowadza się w określone miejsce genu kodującego białko nieodłącznie wydzielane do mleka zwierzęcia (np. β-kazeinę kozią) otrzymując gen fuzyjny. Fragment DNA zawierający gen przeciwciała-gen fuzyjny, wstrzykuje się do zarodka kozy, poczym zarodek wprowadza się do samicy kozy. Samica kozy z wprowadzonym zarodkiem rodzi zwierzę transgeniczne. Interesujące przeciwciało jest wydzielane do mleka transgeniczne j kozy oraz jej potomstwa.

W celu zwiększenia ilości mleka zawierającego przeciwciało, transgenicznej kozie można podawać odpowiedni hormon (Ebert K.M. i in., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

4. Przeciwciało modyfikowane

W celu zmniejszenia heterogeniczności wobec organizmu ludzkiego itp., można zastosować rekombinowane przeciwciało sztucznie modyfikowane, w tym przeciwciało chimeryczne i przeciwciało humanizowane. Te modyfikowane przeciwciała można wytworzyć znanymi sposobami.

Chimeryczne przeciwciało możliwe do zastosowania według wynalazku można wytworzyć przez poddanie ligacji DNA kodującego region V przeciwciała jak wspomniano wyżej, z DNA kodującym region C ludzkiego przeciwciała, integrowanie produktu ligacji z wektorem ekspresyjnym i wprowadzenie powstałego rekombinowanego wektora ekspresyjnego do organizmu gospodarza w celu wytworzenia przeciwciała chimerycznego.

PL 193 575 B1

Przeciwciało humanizowane jest również określane jako „przeciwciało ludzkie o zmienionej postaci, w którym regiony określające komplementarność (CDR) przeciwciała ssaka, który nie jest człowiekiem (np. myszy) przeszczepia się do przeciwciała ludzkiego. Ogólna procedura rekombinacji genetycznej w celu wytwarzania takiego przeciwciała ludzkiego jest również znana (EP 125023;

WO 96/02576).

Konkretnie, sekwencję DNA, do której włączono sekwencję CDR mysiego przeciwciała, poddaje się ligacji w regionie zrębowym (FR) i syntetyzuje metodą PCR stosując kilka oligonukleotydów jako startery, które są zaprojektowane w taki sposób, że zawierają region nakładający się na regiony końcowe CDR i FR. Powstały DNA poddaje się ligacji z DNA kodującym region C przeciwciała ludzkiego, zaś produkt ligacji poddaje się integracji z wektorem ekspresyjnym. Powstały rekombinowany wektor ekspresyjny wprowadza się do organizmu gospodarza tworząc przeciwciało humanizowane (EP 239044, WO 96/02576).

FR poddane ligacji z CDR selekcjonuje się w taki sposób, że CDR dają zadowalające miejsce wiązania antygenu. Jeżeli to konieczne, aminokwas(y) w FR regionu V przeciwciała można zastąpić tak, że CDR humanizowanego przeciwciała mogą tworzyć odpowiednie miejsce wiązania antygenu (Sato K. i in., Cancer Res. (1993) 53:851-856).

Region C przeciwciała chimerycznego albo humanizowanego może być dowolnym regionem C przeciwciała ludzkiego, takim jak: Cy1, Cy2, Cy3 albo Cy4 dla łańcucha H oraz Ck albo Ολ dla łańcucha L. Region C przeciwciała ludzkiego można modyfikować w celu polepszenia stabilności przeciwciała albo zapewnienia stabilnego wytwarzania przeciwciała.

Przeciwciało chimeryczne jest zbudowane z regionów V pochodzących z przeciwciała ssaka, który nie jest człowiekiem i regionów C pochodzących z przeciwciała ludzkiego. Przeciwciało humanizowane jest zbudowane z CDR pochodzących z przeciwciała ssaka, który nie jest człowiekiem i regionów FR i C ludzkiego przeciwciała. Przeciwciało humanizowane jest szczególnie przydatne jako składnik czynny środka terapeutycznego wytwarzanego zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, ponieważ zmniejszona jest antygenowość przeciwciała wobec organizmu ludzkiego.

Konkretnym przykładem przeciwciała humanizowanego zastosowanego według wynalazku jest humanizowane przeciwciało #23-57-137-1, w którym CDR pochodzą z mysiego przeciwciała #23-57-137-1, zaś łańcuch L jest zbudowany z CDR połączonych przez wolne FR(Fr1, FR2 i FR3) pochodzące z ludzkiego przeciwciała HSU 03868 (GenBank, Deftos M i in., Scand. J. Immunol., 39:95-103, 1994), a FR4 pochodzi z ludzkiego przeciwciała S25755 (NBRF-PDB); zaś łańcuch H jest zbudowany z CDR połączonych z FR pochodzącymi z ludzkiego przeciwciała S31679 (NBRF-PDB, Cousinier A.M. i in., Eur. J. Immunol., 23, 110-118, 1993), w których część reszt aminokwasowych w FR zastąpiono tak, że humanizowane przeciwciało może wykazywać aktywność wiązania antygenu.

Szczepy E. coli zawierające plazmidy z DNA kodującym, odpowiednio, łańcuch H i łańcuch L humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 oznaczono E. coli JM109 (hMBC1HcDNA/pUC19) (dla łańcucha H) i E. coli JM109 (hMBC1Lqλ/pUC19) dla łańcucha L).

Szczepy te zdeponowano na zasadach Traktatu Budapeszteńskiego 15 sierpnia, 1996, w National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency for Industrial Science and Technology, Japonia (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japonia), pod numerami dostępu FERM BP-5629 dla E. coli JM109 (hMBC1HcDNA/pUC19) i FERM BP-5630 dla E. coli JM109 (hMBC1Lqλ/pUC19).

5. Odmiany przeciwciał

Przeciwciało stosowane zgodnie z wynalazkiem może być jego dowolnym fragmentem albo modyfikowanym produktem fragmentu, o ile może wiązać się z PTHrP i hamować aktywność PTHrP. Przykładowo, fragmenty przeciwciała obejmują Fab, F(ab')2 Fv albo jednołańcuchowy Fv (scFv) obejmujący Fv łańcucha H albo Fv łańcucha L połączone ze sobą odpowiednim łącznikiem. Konkretnie, takie fragmenty przeciwciał można wytworzyć przez cięcie przeciwciała na fragmenty enzymem (np. papainą, pepsyną) albo przez konstruowanie genu kodującego fragment przeciwciała i wprowadzanie genu do wektora ekspresyjnego i wprowadzanie powstałego rekombinowanego wektora ekspresyjnego do odpowiedniej komórki gospodarza, wyrażającej fragment przeciwciała (patrz, np. Co M. S. i in., J. Immunol., (1994), 152, 2968-2976; Better M. i Horvitz A. H., Meth. in Enzymol. (1989) 178:476-496, Academic Press, Inc.; Plueckthun A. i Skerra A., Meth. in Enzymol. (1989) 178:476-496, Academic Press, Inc.; Lamoyi E., Meth. in Enzymol. (1989) 121:652-663, Academic Press, Inc.; Rousseaux J. i in., Meth. in Enzymol. (1989) 121:652-663, Academic Press, Inc.; oraz Bird R.E. i in., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

PL 193 575 B1 scFv można wytworzyć przez poddanie ligacji regionu V łańcucha H z regionem V łańcucha L przez łącznik, korzystnie łącznik peptydowy (Huston, J. S. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85,

5879-5883). Region V łańcucha H i region V łańcucha L w scFv może pochodzić z dowolnego opisanego tu przeciwciała. Łącznik peptydowy, który łączy regiony V, może być dowolnym łącznikiem peptydowym, przykładowo, obejmującym 12-19 reszt aminokwasowych.

DNA kodujący scFv można wytworzyć przez amplifikowanie osobno DNA kodującego region V łańcucha H i DNA kodującego region V łańcucha L przeciwciała stosując jako matrycę fragment DNA kodujący cały region łańcucha H albo jego część, która obejmuje region V i fragment DNA kodujący cały region łańcucha L albo jego część, która obejmuje region V, oraz pary starterów, które określają końce fragmentów DNA, a następnie amplifikowanie DNA kodującego łącznik peptydowy jako matrycę i parę starterów, które określają zakończenia fragmentu DNA tak, że każde zakończenie łącznika peptydowego poddaje się ligacji, odpowiednio, z regionem V łańcucha H i regionem V łańcucha L.

Po wytworzeniu DNA kodującego scFv, można wytworzyć konwencjonalnymi sposobami wektor ekspresyjny niosący DNA i gospodarza transformowanego wektorem ekspresyjnym. scFv można wytworzyć z transformowanego gospodarza stosując dowolny konwencjonalny sposób.

Fragmenty przeciwciał zastosowane według wynalazku można wytworzyć przez izolowanie genów dla fragmentów i wyrażanie genów w odpowiednim gospodarzu, jak to opisano wyżej. Te fragmenty przeciwciał są również objęte stosowanym w niniejszym opisie określeniem „przeciwciało.

Jako modyfikowaną postać powyżej wspomnianych przeciwciał można zastosować, przykładowo przeciwciało przeciwko PTHrP sprzęgnięte z dowolną cząsteczką (np. glikolem polietylenowym). Takie modyfikowane przeciwciała są również objęte terminem „przeciwciało. Modyfikowane przeciwciała można wytworzyć przez modyfikowanie chemiczne przeciwciał. Techniki chemicznej modyfikacji przydatne dla tych celów są znane w stanie techniki.

6. Ekspresja i wytwarzanie rekombinowanego przeciwciała albo modyfikowanego przeciwciała

Gen przeciwciała skonstruowany w opisany wyżej sposób można wytworzyć i wyrazić znanymi sposobami. Do ekspresji w komórkach ssaka łączy się funkcjonalnie konwencjonalny promotor, wyrażany gen przeciwciała i sygnał poli(A) (położony poniżej końca 3' genu przeciwciała). Przykładowo, jako przydatny układ promotor/wzmacniacz można zastosować układ bezpośredniego wczesnego promotora/wzmacniacza ludzkiego wirusa cytomegalii.

Do ekspresji przeciwciała, którego zastosowanie jest przedmiotem niniejszego wynalazku można również zastosować inne układy promotor/wzmacniacz, przykładowo, pochodzące od wirusów (np. retrowirusów, wirusa polioma, adenowirusów i małpiego wirusa 40 (SV40)) oraz pochodzące od komórek ssaków (np. ludzki czynnik wydłużania 1α (HEF1a)).

Gdy stosuje się układ promotor/wzmacniacz SV40, ekspresję genu można przeprowadzić sposobem według Mulligan i in. (Nature (1979) 277, 108). Gdy stosuje się układ promotor/wzmacniacz HEF1a, ekspresję genu można przeprowadzić sposobem Mizushima i in. (Nucl. Acids Res. (1990) 18, 5322).

Do ekspresji w E. coli można połączyć funkcjonalnie konwencjonalny przydatny promotor, sekwencję sygnałową do wydzielania interesującego przeciwciała oraz gen przeciwciała. Jako promotor można zastosować promotor lacZ albo promotor araB. Gdy stosuje się promotor lacZ, ekspresję genu przeprowadza się sposobem według Ward i in. (Nature (1998) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), podczas gdy stosuje się promotor araB, ekspresję genu można przeprowadzić sposobem według Better i in. (Science (1988) 240, 1041-1043).

Odnośnie sekwencji sygnałowej do wydzielania przeciwciała, to gdy interesujące przeciwciało ma być wydzielane do przestrzeni periplazmatycznej E. coli, można zastosować sekwencję sygnałową pe1B (Lei i in., J. Bacteriol. (1987) 169;4379). Przeciwciało wydzielane do przestrzeni periplazmatycznej izoluje się, a następnie fałduje tak, że przybiera odpowiednią konfigurację.

Można zastosować początek replikacji pochodzący z wirusów (np. SV40, wirusa polioma, adenowirusów, bydlęcego wirusa brodawczaków (BPV)) albo podobny. W celu zwiększenia liczby kopii genu w układzie komórki gospodarza, wektor ekspresyjny może dalej zawierać selekcyjny gen znacznikowy, taki jak gen fosfotransferazy aminoglikozydowej (APH), gen kinazy tymidynowej (TK), gen fosforybozylotransferazy ksantyno-guanidynowej E. coli (Ecogpt) i gen reduktazy dihydrofolianowej (dhfr).

W celu wytwarzania przeciwciała stosowanego zgodnie z niniejszym wynalazkiem, można zastosować dowolny układ ekspresyjny, w tym układy komórek prokariotycznych i eukariotycznych. Komórki eukariotyczne obejmują ustalone zwierzęce linie komórkowe (np. ssaków, owadów, pleśni i grzybów, drożdży). Komórki prokariotyczne obejmują komórki bakteryjne, takie jak komórki E. coli.

PL 193 575 B1

Korzystnie, przeciwciało stosowane zgodnie z wynalazkiem jest wyrażane w komórkach ssaków, takich jak komórki CHO, COS, szpiczaka, BHK, Vero i HeLa.

Następnie, transformowane komórki gospodarza hoduje się in vitro w celu wytworzenia interesującego przeciwciała. Hodowanie komórek gospodarza przeprowadza się dowolną znaną metodą. Pożywką hodowlaną może być pożywka DMEM, MEM, RPMI 1640 albo IMDM. Pożywka hodowlana może zawierać dodatek surowicy, takiej jak płodowa surowica cielęca (FCS).

7. Izolowanie i oczyszczanie przeciwciała

Przeciwciało, wyrażone i wytworzone jak to opisano powyżej, można izolować z komórek albo organizmu zwierzęcego gospodarza i oczyszczać do jednorodności. Izolowanie i oczyszczanie przeciwciała stosowanego według wynalazku można przeprowadzić na kolumnie powinowactwa. Przykłady kolumny białka A obejmują Hyper D, POROS i Sepharose F. F. (Pharmacia). Do izolowania i oczyszczania przeciwciała można również zastosować inne konwencjonalnie stosowane sposoby; tak więc sposób nie jest szczególnie ograniczony. Przykładowo, do izolowania i oczyszczania interesującego przeciwciała można zastosować różne chromatografie przy użyciu kolumn obejmujących wspomniane wyżej kolumny powinowactwa, filtrację, ultrafiltrację, wysalanie i dializę pojedynczo lub w kombinacji (Antibodies: A Laboratory Manual, wyd. Harlow E. i Lane D., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

8. Określanie aktywności przeciwciała

Określenie aktywności wiązania antygenu (Antibodies: A Laboratory Manual, wyd. Harlow E. i Lane D., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) albo aktywności hamującej wobec liganda receptora (Harada A. i in., Int. Immunol., (1993) 5, 681-690) przeciwciała stosowanego według wynalazku można przeprowadzić dowolnym sposobem.

Sposób określania aktywności wiązania antygenu przeciwciała przeciwko PTHrP stosowanego według wynalazku może obejmować, przykładowo, ELISA (enzymatyczny test immunosorpcyjny), EIA (test immunoenzymatyczny), RIA (test immunoradiologiczny) albo technikę przeciwciał fluorescencyjnych. Przykładowo, gdy stosuje się test immunoenzymatyczny, próbkę roztworu zawierającego przeciwciało przeciwko PTHrP (np. supernatant hodowlany komórek wytwarzających przeciwciało przeciwko PTHrP albo samo przeciwciało przeciwko PTHrP w postaci oczyszczonej) dodaje się do płytki, którą uprzednio pokryto PTHrP (1-34). Dalej, do płytki dodaje się wtórne przeciwciało znakowane enzymem (np. fosfatazą alkaliczną). Płytkę inkubuje się i płucze. Następnie do płytki dodaje się substrat enzymu (np. kwas p-nitrofenylofosforowy) i mierzy się absorbancję roztworu w płytce w celu oceny aktywności przeciwciała w wiązaniu antygenu.

W celu potwierdzenia aktywności przeciwciała stosowanego zgodnie z wynalazkiem, określa się aktywność neutralizującą przeciwciała (np. przeciwciała przeciwko PTHrP).

9. Drogi podania i preparaty farmaceutyczne

Środek terapeutyczny wytwarzany zgodnie z zastosowaniem może być użyty do leczenia albo łagodzenia kacheksji wywołanej nowotworem. Przykłady takiej kacheksji opisano w J. UroI. (USA) marzec 1995, 153 (3 Pt 1) str. 854-857; Langenbecks Arch. Chir. Supl. II Verh. Dtsch. Ges. Chir. (Niemcy) 1900, str. 261-265; Oncology (Szwajcaria) 1990, 47 (1) 87-91; Int. J. Pancreatol. (USA) sierpień-listopad 1990, 7 (1-3) str. 141-150; J. Natl. Canc. Inst. (USA) 19, 1990, 82(24), 1922-1926.

Przykłady kacheksji innej niż wywołana nowotworem obejmują opisane w JPEN J. Parenteral Enteral Nutr. (USA) listopad-grudzień 1990, 14(6), 605-609; Chest (USA) listopad 1990, 98 (5), 1091-1094; Bone Marrow Transplant. (Anglia) lipiec 1990 6(1) 53-57.

Środek terapeutyczny obejmujący przeciwciało przeciwko PTHrP jako składnik czynny, można podawać doustnie albo pozajelitowo, ale korzystnie pozajelitowe. Środek terapeutyczny może być w dowolnej postaci dawkowania, takiej jak środek przezpłucny (np. środek podawany z pomocą urządzenia takiego jak nebulizer), środek nosowo-żołądkowy, środek przezskórny (np. maść, krem) albo iniekcja.

Przykłady iniekcji obejmują iniekcję dożylną (np. kroplówka), iniekcję domięśniową, iniekcję dootrzewnową oraz iniekcję podskórną do podawania ogólnoustrojowego albo miejscowego. Droga podania może być wybrana zależnie od wieku pacjenta i stanu. Skuteczna dawka pojedyncza może być wybrana z zakresu od 0,001 do 1,000 mg na kg ciężaru ciała. Alternatywnie, dawka dla pacjenta może być wybrana z zakresu od 0,01 do 100000 mg/organizm. Jednakże, dawka czynnika terapeutycznego obejmującego przeciwciało przeciwko PTHrP nie jest szczególnie ograniczona do wyżej określonego zakresu.

PL 193 575 B1

Środek terapeutyczny można podawać pacjentowi w dowolnym stanie, w tym przed albo po rozwinięciu się kacheksji. Alternatywnie, środek terapeutyczny można podawać w stanie, gdy przewiduje się utratę wagi u pacjenta.

Środek terapeutyczny obejmujący przeciwciało przeciwko PTHrP można formułować dowolnym konwencjonalnym sposobem (Remington's Pharmaceutical Science, wyd. ostatnie, Mack Publishing Company, Easton, USA). Preparat może jeszcze obejmować dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i dodatki.

Przykłady takich nośników i dodatków obejmują wodę, dopuszczalne farmaceutycznie rozpuszczalniki, kolagen, poli(alkohol winylowy), poliwinylopirolidon, polimer karboksywinylowy, sól sodowa karboksymetylocelulozy, poliakrylan sodu, arginian sodu, dekstran rozpuszczalny w wodzie, sól sodowa karboksymetyloskrobi, pektyna, metyloceluloza, etyloceluloza, guma ksantanowa, guma arabska, kazeina, agar, glikol polietylenowy, diglicerol, glicerol, glikol propylenowy, wazelina, parafina, alkohol stearylowy, kwas stearynowy, albumina surowicy ludzkiej (HSA), mannitol, sorbitol, laktoza i surfaktanty dopuszczalne jako dodatki farmaceutyczne.

W praktycznym zastosowaniu, dodatek wybiera się odpowiednio z powyższej grupy pojedynczo albo w kombinacji, zależnie od zastosowanej postaci dawkowania, ale nie ograniczając się do niej. Przykładowo, postać do iniekcji wytwarza się przez rozpuszczenie przeciwciała przeciwko PTHrP w postaci oczyszczonej w rozpuszczalniku (np. normalny roztwór soli, bufor, roztwór glukozy), a następnie dalsze dodanie środków zapobiegających adsorpcji (np. Tween 80, Tween 20, żelatyna, albumina surowicy ludzkiej).

Środek terapeutyczny może być również w umożliwiającej odtworzenie, liofilizowanej postaci, którą się rozpuszcza przed zastosowaniem. Do wytworzenia postaci liofilizowanej, można włączyć zaróbkę, taką jak alkohol cukrowy (np. mannitol, glukoza) i cukier.

Krótki opis rysunków

Figura 1 stanowi ilustrację graficzną leczniczego wpływu przeciwciała przeciwko PTHrP na kacheksję.

Figura 2 stanowi ilustrację graficzną leczniczego wpływu przeciwciała przeciwko PTHrP na kacheksję.

Figura 3 stanowi ilustrację graficzną leczniczego wpływu przeciwciała przeciwko PTHrP na kacheksję.

Figura 4 stanowi ilustrację graficzną leczniczego wpływu przeciwciała przeciwko PTHrP na kacheksję.

Figura 5 stanowi ilustrację graficzną wyników pomiaru aktywności wiązania antygenu.

Figura 6 stanowi ilustrację graficzną wyników pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała.

Figura 7 stanowi ilustrację graficzną wyników pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała.

Figura 8 stanowi ilustrację graficzną wyników pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała.

Figura 9 stanowi ilustrację graficzną wyników pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała.

Figura 10 stanowi ilustrację graficzną wyników pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała.

Figura 11 stanowi ilustrację graficzną wyników pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała.

Figura 12 stanowi ilustrację graficzną wyników pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała.

Figura 13 stanowi ilustrację graficzną neutralizującego działania przeciwciała humanizowanego.

Figura 14 stanowi ilustrację graficzną neutralizującego działania przeciwciała humanizowanego.

Figura 15 stanowi ilustrację graficzną neutralizującego działania przeciwciała humanizowanego.

Fig. 16 stanowi ilustrację graficzną leczniczego wpływu humanizowanego przeciwciała na kacheksję.

Figura 17 stanowi ilustrację graficzną leczniczego wpływu humanizowanego przeciwciała na kacheksję.

Figura 18 stanowi ilustrację graficzną leczniczego wpływu humanizowanego przeciwciała na kacheksję.

PL 193 575 B1

Figura 19 stanowi ilustrację graficzną leczniczego wpływu humanizowanego przeciwciała na kacheksję.

Poniżej wynalazek opisany zostanie bardziej szczegółowo w odniesieniu do poniższych przykładów referencyjnych i przykładów, które nie ograniczają zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1. Test farmakologiczny wykorzystujący zwierzęcy model kacheksji

Wykorzystując zwierzęcy model kacheksji (ludzki nowotwór implantowany myszom nagim) badano wpływ leczniczy na kacheksję mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP.

Jako zwierzęcy model kaheksji wykorzystano myszy nagie, którym implantowano ludzki nowotwór jamy ustnej OCC-1 [uzyskany z Central Institute of Experimental Animals]. Wiadomo, że myszy nagie, którym implantowano ludzki nowotwór jamy ustnej OCC-1, wykazują podwyższony poziom wapnia przy wzroście objętości guza i rozwijają objawy kacheksji, takie jak utrata wagi i osłabienie perystaltyki. W tym badaniu oceniano złagodzenie objawów kacheksji wywołanej przez ludzki nowotwór jamy ustnej OCC-1 przez mysie przeciwciało monoklonalne w odniesieniu do poziomu wapnia, masy ciała i wpływu na przedłużenie czasu przeżycia.

Ludzki nowotwór jamy ustnej OCC-1 pasażowano in vivo wykorzystując myszy nagie BALB/cnu/nu (Japan CLEA Co., Inc.). W celu oceny efektu farmakologicznego nabywano 6-tygodniowe samce myszy nagich BALB/c-nu/nu i aklimatyzowano przez tydzień do wieku 7-tygodni, które to myszy dostarczano w celu zastosowania w badaniu.

W modelu kacheksji myszy przygotowywano i dzielono na grupy w następujący sposób. Pasażowany ludzki nowotwór jamy ustnej OCC-1 usuwano z myszy nagich i następnie delikatnie cięto na sześciany o wielkości 3 mm³. Uzyskane sześciany nowotworowe implantowano podskórnie w region boczny każdej myszy, jeden kawałek na mysz. Dziesięć dni po wszczepieniu, po potwierdzeniu, że objętość guza każdej myszy stała się wystarczająco duża, myszy dzielono na grupy, w których poziomy wapnia, masy ciała i objętości guza każdej myszy w poszczególnych grupach były porównywalne, co dostarczono w celu wykorzystania jako zwierzęcy model kacheksji.

Badanie wpływu leczniczego na kacheksję przeprowadzono w sposób następujący.

(1) Obserwacja czasu przeżycia

W badaniu wpływu na przedłużenie czasu przeżycia podawano przez tydzień mysie przeciwciało monoklonalne myszom w grupie badanej i obserwowano czas przeżycia każdej myszy. Pojedynczą dawkę istniejącego czynnika do leczenia hiperkalcemii (soli disodowej pamidronianu; Aredia) podawano przez żyłę ogonową myszom innej grupy badanej w dawce 15 mg/kg. Jako kontrolę w tym badaniu myszom z grupy kontrolnej podawano, dwa razy w tygodniu, przez żyłę ogonową sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) w dawce 0,2 ml/mysz. Wyniki pokazano na fig. 1.

(2) Obserwacja poziomu wapnia we krwi

Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko PTHrP podawano badanej grupie myszy będących modelem kacheksji dwukrotnie w dwudniowych przedziałach czasu przez żyłę ogonową w dawce 10 ąg, albo 100 ąg na mysz na każde podanie. Pojedynczą dawkę istniejącego czynnika do leczenia hiperkalcemii (soli disodowej pamidronianu; Aredia) podawano myszom innej grupy badanej przez żyłę ogonową w dawce 15 mg/kg. Jako kontrolę w tym badaniu podawano sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) myszom grupy kontrolnej przez żyłę ogonową dwukrotnie w odstępach dwudniowych w dawce 0,2 ml/mysz na każde podanie.

(3) Określenie poziomu wapnia we krwi

Pierwszego i czwartego dnia po podaniu myszy przeciwciała monoklonalnego, w celu oceny skuteczności farmakologicznej przeciwciała, we krwi każdej myszy określano poziom wapnia. Poziom wapnia we krwi określano jako poziom zjonizowanego wapnia w pełnej krwi przez pobranie krwi od każdej myszy przez oczodół stosując pipetę do badania hematokrytu i podając krew do 643 Automatic Ca/pH Analyzer (CIBA-CORNING). Każdego dnia aż do czwartego dnia po podaniu przeciwciała badano masę ciała myszy. Wyniki pokazano na figurach 2 i 3.

(4) Określenie objętości guza

Objętość guza określano cztery dni po podaniu przeciwciała przez pomiar najdłużej osi (a mm) i najkrótszej osi (b mm) guza i podstawienie obu zmierzonych wartości do wzoru Galanta [ab²/2]. Wyniki pokazano na fig.4.

Wyniki te w sposób oczywisty wskazują, że chociaż myszy, którym podawano przeciwciało w dawce 10 ąg wykazują poziomy wapnia równoważne do poziomów u tych myszy, które otrzymywały pamidronian, to obserwowano zahamowanie utraty masy ciała u myszy, którym podawano przeciwciało, i utrata wagi nie była tak znacząca jak u myszy, którym podawano pamidronian. Myszy, którym

PL 193 575 B1 podawano przeciwciało w dawce 100 mg, były w wyższym stopniu zabezpieczone przed wzrostem poziomu wapnia i utratą wagi w porównaniu z myszami, którym podawano pamidronian i myszami kontrolnymi. U myszy, którym podawano przeciwciało neutralizujące PTHrP w dawce 100 m9 dwa razy w tygodniu, obserwowano znaczące wydłużenie czasu przeżycia w porównaniu z myszami, którym podawano pamidronian i myszami kontrolnymi (p=0,0003: test Log Rank).

W wyniku tego stwierdzono, że monoklonalne przeciwciało neutralizujące przeciwko PTHrP wykazuje doskonałe efekty, takie jak zahamowanie utraty wagi i wydłużenie czasu przeżycia, których nie wykazują istniejące czynniki do leczenia hiperkalcemii. Wyniki te wykazują, że przeciwciało zastosowane w tym badaniu jest przydatnym czynnikiem terapeutycznym do leczenia kacheksji związanej z chorobą nowotworową.

P r z y k ł a d 2. Test farmakologiczny wykorzystujący model zwierzęcy hiperkalcemii i kacheksji

Wykorzystując zwierzęcy model kacheksji (ludzki nowotwór implantowany myszom nagim) badano wpływ terapeutyczny na kacheksję humanizowanego przeciwciała wersji „q przeciwko PTHrP.

Jako zwierzęcy model kacheksji wykorzystano myszy nagie, którym implantowano ludzki nowotwór jamy ustnej OCC-1 [uzyskany z Central Institute of Experimental Animals]. Wiadomo, że myszy nagie, którym implantowano ludzki nowotwór jamy ustnej OCC-1, wykazują podwyższony poziom wapnia przy wzroście objętości guza i rozwijają objawy kacheksji, takie jak utrata wagi i osłabienie poruszania się. W tym badaniu, oceniano złagodzenie objawów kacheksji wywołanej przez ludzki nowotwór jamy ustnej OCC-1 przez wersję „q humanizowanego przeciwciała w odniesieniu do poziomu wapnia, masy ciała i wpływu na przedłużenie czasu przeżycia.

Podkulturę nowotworu jamy ustnej OCC-1 przygotowywano in vivo wykorzystując myszy nagie BALB/c-nu/nu (Japan CLEA Co., Inc.). W celu oceny efektu farmakologicznego nabywano 6-tygodniowe samce myszy nagich BALB/c-nu/nu i aklimatyzowano przez tydzień do wieku 7-tygodni, po czym dostarczano je w celu zastosowania w badaniu.

W modelu kacheksji myszy przygotowywano i dzielono na grupy w następujący sposób. Pasażowany ludzki nowotwór jamy ustnej OCC-1 usuwano z myszy nagich i następnie delikatnie cięto na sześciany o wielkości 3 mm³. Uzyskane sześciany implantowano podskórnie w region boczny każdej myszy, jeden sześcian na mysz. Dziesięć dni po wszczepieniu, po potwierdzeniu, że objętość guza tych myszy stała się wystarczająco duża, myszy dzielono na grupy, w których poziomy wapnia, masy ciała i objętości guza każdej myszy w poszczególnych grupach były uśredniane, i myszy dostarczono w celu wykorzystania jako zwierzęcy model kacheksji.

(1) Obserwacja czasu przeżycia

W badaniu wpływu na przedłużenie czasu przeżycia myszom w grupie badanej podawano przez tydzień wersję „q przeciwciała humanizowanego i obserwowano czas przeżycia każdej myszy. Jako kontrolę w tym badaniu dwa razy w tygodniu podawano myszom z grupy kontrolnej przez żyłę ogonową sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) w dawce 0,1 ml/mysz.

Wyniki pokazano na fig.16.

(2) Obserwacja poziomu wapnia we krwi

Wersję „q humanizowanego przeciwciała podawano badanej grupie myszy będących modelem kacheksji dwukrotnie w dwudniowych przedziałach czasu przez żyłę ogonową w dawce 10 m9, albo 100 mg na mysz na każde podanie. Jako kontrolę w tym badaniu dwukrotnie w odstępach dwudniowych podawano myszom grupy kontrolnej przez żyłę ogonową sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) w dawce 0,1 ml/mysz na każde podanie.

(3) Określenie poziomu wapnia we krwi

Pierwszego i czwartego dnia po podaniu myszom wersji „q przeciwciała humanizowanego, w celu oceny skuteczności farmakologicznej przeciwciała, określano poziom wapnia we krwi każdej myszy. Poziom wapnia we krwi określano jako poziom zjonizowanego wapnia w pełnej krwi przez pobranie krwi od każdej myszy przez oczodół stosując pipetę do badania hematokrytu i podając krew do 643 Automatic Ca/pH Analyzer (CIBA-CORNING). Masę ciała każdej myszy uzyskiwano przez codzienne ważenie aż do czwartego dnia po podaniu przeciwciała. Wyniki pokazano na fig. 17 i 18.

(4) Określenie objętości guza

Objętość guza określano cztery dni po podaniu przeciwciała przez pomiar najdłużej osi (a mm) i najkrótszej osi (b mm) guza i podstawienie obu zmierzonych wartości do wzoru Galanta [ab²/2]. Wyniki pokazano na fig.19.

PL 193 575 B1

Wyniki te w sposób oczywisty wskazują, że myszy, którym podawano wersję „q przeciwciała w dawce 10 ąg albo 100 ąg są zabezpieczone przed wzrostem poziomu wapnia we krwi i utratą wagi, jak również utrata wagi nie jest tak wyraźna jak u myszy kontrolnych. U myszy, którym podawano wersję „q humanizowanego przeciwciała w dawce 100 ąg dwa razy w tygodniu obserwowano znaczące wydłużenie czasu przeżycia w porównaniu z myszami kontrolnymi (p=0,1008: test Log Rank). Skuteczność wersji „q humanizowanego przeciwciała na model zwierzęcy kacheksji związanej z nowotworem była podobna do skuteczności badanego powyżej mysiego przeciwciała monoklonalnego. Wyniki te wykazują, że przeciwciało zastosowane w tym badaniu jest przydatnym czynnikiem terapeutycznym do leczenia kacheksji związanej z chorobą nowotworową.

Przykład referencyjny 1

Wytwarzanie hybrydoma produkujących mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko PTHrP (1-34)

Hybrydoma zdolne do wytwarzania przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP (1-34) (Id Sek. Nr :75), #23-57-154 i #23-57-137-1, wytworzono zgodnie ze sposobem opisanym przez Kanji Sato (Sato K. i in., J. Bone Miner. Res. 8:849-860, 1993).

Jako immunogen zastosowano PTHrP (1-34) (Peninsula), z którym sprzęgnięto tyroglobulinę jako białko nośnikowe przy użyciu karbodiimidu (Dojinn). PTHrP (1-34) sprzęgnięty z tyroglobuliną dializowano w celu otrzymania roztworu o zawartości białka równej 2 ąg/ml. Uzyskany roztwór zmieszano z adiuwantem Freund'a (Difco) w stosunku 1:1 otrzymując emulsję. W celu immunizowania myszy, emulsję wstrzyknięto 16 samicom myszy BALB/c podskórnie w grzbiet lub dootrzewnowo w ilości równej 100 ąg/mysz na iniekcję. Wstrzyknięcie powtórzono 11 razy. Kompletny adiuwant Freund'a zastosowano do pierwszej immunizacji, zaś do kolejnych immunizacji stosowano niekompletny adiuwant Freund'a.

U każdej z immunizowanych myszy badano miano przeciwciał w surowicy w następujący sposób:

Od każdej z myszy pobierano krew z żyły ogonowej i wydzielano z krwi surowicę odpornościową. Surowicę rozcieńczano buforem RIA, mieszano z PTHrP (1-34) znakowanym ¹²⁵I i poddano oznaczeniu aktywności wiązania. Myszom, u których stwierdzono zadowalające, wysokie miano przeciwciał wstrzyknięto dootrzewnowo PTHrP (1-34) bez białka nośnikowego w dawce 50 ąg/mysz w celu końcowej immunizacji.

Trzy dni po końcowej immunizacji myszy zabito i usunięto ich śledziony. Następnie, splenocyty poddano fuzji z linią komórkową szpiczaka P3x63Ag8U.1 zgodnie ze znaną konwencjonalną metodą, stosując 50% glikol polietylenowy 4000. Wytworzonymi w ten sposób fuzjami komórkowymi zaszczepiono 85 studzienek płytki 96-studzienkowej w ilości 2x10⁴/studzienkę. Badanie przesiewowe hybrydoma przeprowadzono stosując pożywkę HAT w następujący sposób.

Badanie przesiewowe przeprowadzono przez określenie obecności przeciwciał rozpoznających PTHrP w supernatancie hodowli ze studzienek, w których obserwowano wzrost komórek w pożywce HAT metodą RIA na podłożu stałym. Ze studzienek, w których stwierdzono zdolność wiążącą przeciwciał przeciwko PTHrP zebrano hybrydoma. Otrzymane w ten sposób hybrydoma zawieszono w pożywce RPMI 1640 zawierającej 15% FCS z dodatkiem OPI (Sigma), a następnie ujednolicono przez rozcieńczanie graniczne, otrzymując w ten sposób dwa rodzaje klonów hybrydoma, #23-57-154 i #23-57-137-1 wykazujących silną zdolność wiązania PTHrP (1-34).

Klon hybrydoma #23-57-154, oznaczono „hybrydoma mysio-mysia #23-57-154 i zdeponowano na zasadach Traktatu Budapeszteńskiego 15 sierpnia, 1996, w National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency for Industrial Science and Technology, Japonia (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japonia), pod numerem dostępu FERM BP-5631.

Przykład referencyjny 2

Klonowanie DNA kodującego region V mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP (1-34)

Klonowanie DNA kodującego region V mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP (1-34) #23-57-137-1, przeprowadzono w następujący sposób.

(1) Preparowanie mRNA mRNA wytworzono z hybrydoma #23-57-137-1 stosując Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech).Komórki hybrydoma #23-57-137-1 homogenizowano z buforem ekstrakcyjnym i izolowano i oczyszczano z nich mRNA stosując oligo(dT)- Cellulose Spun Column, według instrukcji producenta zestawu. Z uzyskanego roztworu wytrącano etanolem osad mRNA. Osad mRNA rozpuszczono w buforze elucyjnym.

PL 193 575 B1 (2) Wytwarzanie i amplifikacja cDNA genu kodującego region V mysiego łańcucha H.

(i) Klonowanie cDNA dla regionu V łańcucha H przeciwciała #23-57-137-1

Gen kodujący region V łańcucha H mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP klonowano metodą 5'-RACE (Frohman M.A. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998-9002; Belavsky A. i in., NucI. Acids Res. 17:2919-2932, 1989). Sposób ten przeprowadzono stosując zestaw 5'-Ampli FINDER RACE (Clonetech) według instrukcji producenta załączonych do zestawu.

W tym sposobie, starterem stosowanym do syntezy cDNA był starter MHC2 (Id. Sekw. nr 1), który jest zdolny do hybrydyzacji z regionem C mysiego łańcucha H. Około 2 μg mRNA otrzymanego wyżej, który był matrycą dla syntezy cDNA, zmieszano z 10 pmolami startera MHC2. Uzyskaną mieszaninę poddano reakcji z odwrotną transkryptazą w 52°C przez 30 minut tworząc cDNA, który był komplementarny z mRNA.

Uzyskany roztwór reakcyjny zmieszano z 6N NaOH w celu hydrolizy pozostałego mRNA (w 65°C przez 30 minut), a następnie poddano wytrącaniu etanolem w celu wyizolowania i oczyszczenia osadów cDNA. Oczyszczony w ten sposób cDNA poddano ligacji z Ampli FINDER Anchor (Id. Sekw. nr 42) na końcu 5', przez poddanie reakcji z ligazą RNA T4 w 37°C przez 6 godzin i dodatkowo w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Jako startery do amplifikacji cDNA metodą PCR, zastosowano starter kotwiczący (Id. Sekw. nr 2) i starter MHC-G1 (Id. Sekw. nr 3) (Jones S.T. i in. , Biotechnology 9:88, 1991).

Roztwór PCR, który pokryto 50 μ I oleju mineralnego zawierał w 50 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCh, 2,5 jednostki TaKaRa Taq (Takara Shuzo Co., Ltd), 10 pmoli startera kotwiczącego i 1 μ l mieszaniny reakcyjnej cDNA, który zligowano ze starterem MHC-G1 i starter Ampli FINDER Anchor. Przeprowadzono 30 cykli PCR stosując urządzenie Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) i cykl temperaturowy po 45 sekund w 94°C, 45 sekund w 60°C i 2 minuty w 72°C.

(ii) Klonowanie cDNA dla regionu V łańcucha L przeciwciała #23-57-137-1

Gen kodujący region V łańcucha L mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP klonowano metodą 5'RACE (Frohman M. A. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998-9002; Belyavsky A. i in., NucI. Acids Res. 17:2919-2932, 1989). Sposób ten przeprowadzono stosując zestaw 5'-Ampli FINDER RACE (Clonetech) według instrukcji producenta załączonych do zestawu. W tym sposobie, starterem stosowanym do syntezy cDNA był starter oligo-dT) Około 2 μg mRNA otrzymanego jak wyżej, który był matrycą do syntezy cDNA, zmieszano ze starterem oligo-dT. Uzyskaną mieszaninę poddano reakcji z odwrotną transkryptazą w 52°C przez 30 minut tworząc cDNA, który był komplementarny z mRNA. Uzyskany roztwór reakcyjny zmieszano z 6N NaOH w celu hydrolizy pozostałego mRNA (w 65°C przez 30 minut), a następnie wytrącano etanolem osad cDNA. Wyizolowany w ten sposób cDNA poddano ligacji z Ampli FINDER Anchor na końcu 5', przez poddanie reakcji z ligazą RNA T4 w 37°C przez 6 godzin i dodatkowo w temperaturze pokojowej przez 16 godzin.

Jako starter do amplifikacji cDNA metodą PCR, zastosowano starter MLC (Id. Sekw. nr 4) zaprojektowany w oparciu o zakonserwowaną sekwencję regionu C łańcucha L w formie λ, a następnie syntetyzowany na urządzeniu 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI). Roztwór PCR, który pokryto 50 μl oleju mineralnego zawierał w 100 μ l 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCb, 2,5 jednostki AmpliTaq (Perkin-Elmer), 50 pmoli startera kotwiczącego (Id. Sekw. nr 2) i 1 μl mieszaniny reakcyjnej cDNA, który zligowano ze starterem MLC (Id. Sekw. nr 4) i starter Ampli FINDER Anchor. Przeprowadzono 35 cykli PCR stosując urządzenie Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) cykl temperaturowy po 45 sekund w 94°C, 45 sekund w 60°C i minuty w 72°C.

(3) Oczyszczanie i fragmentacja produktów PCR

Każdy z amplifikowanych w metodzie PCR fragmentów DNA opisanych wyżej oddzielono stosując elektroforezę na 3% żelu agarozowym NuSieve GTG (FMC Bio. Products). Dla każdego z regionów V łańcucha H i regionu V łańcucha L, pobrano wycinek żelu zawierający fragment DNA wielkości około 550 bp. Każdy z otrzymanych wycinków żelu poddano oczyszczeniu DNA stosując zestaw GENECLEAN II (Bio101) według instrukcji producenta. Oczyszczony DNA wytrącano z roztworu etanolem, a następnie rozpuszczano w 20 μl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA. 1 μl wytworzonego w ten sposób roztworu DNA trawiono enzymem restrykcyjnym XmaI (New England Biolabs) w 37°C przez 1 godzinę i dodatkowo enzymem EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd) w 37°C przez 1 godzinę. Mieszaninę trawienną poddano ekstrakcji fenolem i chloroformem, a następnie poddano wytrącaniu etanolem w celu zebrania DNA.

PL 193 575 B1

W ten sposób otrzymano dwa fragmenty DNA zawierające odpowiednio gen kodujący mysi region V łańcucha H i gen kodujący mysi region V łańcucha L, z których oba miały sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI na końcu 5' i sekwencję rozpoznawaną przez Xmal na końcu 3'.

Każdy z fragmentów DNA EcoRI-Xmal zawierający, odpowiednio, gen kodujący mysi region V łańcucha H i gen kodujący region V łańcucha L zligowano z wektorem pUC19, który trawiono EcoRI i XmaI w 16°C przez godzinę stosując zestaw do ligacji DNA ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd) według instrukcji producenta. Mieszaninę ligacyjną (10 μ Ι) dodano do 100 μ Ι roztworu zawierającego kompetentne komórki E. coli JM 109 (Nippon Gene Co., Ltd). Mieszaninę komórek pozostawiono przez 15 minut na lodzie, w 42°C przez 1 minutę, a następnie przez 1 minutę na lodzie. Uzyskaną mieszaninę komórkową zmieszano z 300 μl pożywki SOC (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) i następnie inkubowano w 37°C przez 30 minut. Uzyskaną zawiesinę komórek wysiano na pożywce LB albo 2xYT z agarem (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) z dodatkiem 100 albo 50 μg/ml ampicyliny, 0,1 mM IPTG i 20 μg/ml X-gal i inkubowano w 37°C przez noc. W ten sposób wytworzono transformanty E. coli.

Transformanty hodowano przez noc w 2 ml pożywki LB albo 2xYT z dodatkiem 100 albo 50 μg/ml ampicyliny w 37°C. Frakcję komórek wprowadzono do Plasmid Extracter PI-100@ (Kurabo Industries Ltd.) albo do zestawu QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Otrzymany w ten sposób plazmidowy DNA sekwencjonowano.

(4) Sekwencjonowanie genu kodującego region V mysiego przeciwciała

Sekwencję nukleotydową cDNA kodującego region niesiony przez plazmid określono przy użyciu urządzenia DNA Sequencer 373A (ABI; Perkin Elmer) stosując Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer). Tę sekwencję DNA określono przez potwierdzenie sekwencji zasad w obu kierunkach stosując startery M13 Primer M4 (Takara Shuzo Co., Ltd) (Id. Sekw. nr 5) i M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd) (Id. Sekw. nr 6).

Plazmid, zawierający gen kodujący region V mysiego łańcucha H pochodzący z hybrydoma #23-57-137-1 oznaczono „MBC1H04 a plazmid zawierający gen kodujący region V mysiego łańcucha L pochodzący z hybrydoma #23-57-137-1 oznaczono„MBC1L24. Sekwencje nukleotydowe (i odpowiednie sekwencje aminokwasowe) DNA kodującego region V łańcucha H i DNA kodującego region V łańcucha L mysiego przeciwciała #23-57-137-1 (odpowiednio niesione przez MBC1H04 i MBC1H24) pokazano, odpowiednio, na Id. Sekw. nr 57 i 65. Oba polipeptydy dla fragmentu regionu V łańcucha H i fragmentu regionu V łańcucha L rozpoczynały się od 58 nukleotydu (kodującego glutaminę) w sekwencjach DNA pokazanych jako Id. Sekw. nr 57 i 65. Sekwencje aminokwasowe polipeptydów dla regionu V łańcucha H i regionu V łańcucha L pokazano, odpowiednio, jako Id. Sekw. nr 46 i 45.

Szczep E. coli zawierający plazmid MBC1H04 i szczep E. coli zawierający plazmid MBC1L24 oznaczono, odpowiednio, jako „Escherichia coli JM109 (MBC1H04) i „Escherichia coli JM109 (MBC1L24). Te szczepy E. coli zdeponowano zgodnie z zasadami Traktatu Budapeszteńskiego 15 sierpnia, 1996, w National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency for Industrial Science and Technology, Japonia (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japonia), pod numerem dostępu, odpowiednio, FERM BP-5628 dla Escherichia coli JM109 (MBC1H04) i FERM BP-5627 dla Escherichia coli JM109 (MBC1L24).

(5) Określanie CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego #23-57-137-1 przeciwko ludzkiemu PTHrP.

Ogólne struktury regionu V łańcucha H oraz regionu V łańcucha L są do siebie podobne. Oznacza to, że obie struktury mają cztery regiony zrębowe (FR) połączone trzema regionami hiperzmiennymi (tj. regionami determinującymi dopasowanie (CDR)). Sekwencje aminokwasowe regionów zrębowych są stosunkowo dobrze zakonserwowane, podczas gdy sekwencje aminokwasowe regionów CDR wykazują niezwykle silną zmienność (Kabat E.A. i in., Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1983).

Na podstawie powyższych faktów, CDR określono przez poszukiwanie homologii sekwencji aminokwasowych regionu V mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP przez odniesienie do bazy danych sekwencji aminokwasowych przeciwciał, ustanowionej przez Kabat'a i in. Zatem CDR regionów V określono jak przedstawiono w tabeli 1.

Sekwencje aminokwasowe CDR 1-3 w regionie V łańcucha L pokazano, odpowiednio, w Id. Sekw. nr 59-61, zaś sekwencje aminokwasowe CDR 1-3 regionu V łańcucha H pokazano, odpowiednio, w Id. Sekw. nr 62-64.

PL 193 575 B1

T a b e l a 1

region V	Id. Sekw. nr	CDR1	CDR2	CDR3
region V łańcucha H	57	31-35	50-66	99-107
region V łańcucha L	65	23-34	50-60	93-105

Przykład referencyjny 3

Konstruowanie przeciwciała chimerycznego (1) Konstruowanie łańcucha H przeciwciała chimerycznego (2) Konstruowanie regionu V łańcucha H

Klonowany cDNA kodujący region V mysiego łańcucha H zmodyfikowano metodą PCR w celu połączenia go z wektorem ekspresyjnym niosącym genomowy DNA dla regionu Cy1 ludzkiego łańcucha H. Starter stosowany „poniżej, MBC1-S1 (Id. Sekw. nr 7) zaprojektowano w taki sposób, że mógł on hybrydyzować z sekwencją DNA kodującą region końca 5' sekwencji liderowej regionu V i posiadał obie sekwencje zgodności Kozak'a (Kozak M. i in., J. Mol. Biol. 196:947-950, 1987) i sekwencję rozpoznawania Hindlll. Starter „powyżej, MBC1-a (Id. Sekw. nr 8) zaprojektowano w taki sposób, żeby hybrydyzował z DNA kodującym region 3' regionu J i miał obie sekwencje donorowe składania i sekwencję rozpoznawaną przez BamHI.

Reakcję PCR przeprowadzono stosując TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd) i dołączony bufor. Roztwór PCR (50 μΙ) obejmował 0,07 ąg plazmidu MBC1H04 jako matrycę DNA, 50 pmoli MBC1-a i 50 pmoli MBC1-S1, jako startery, 2,5 jednostki TaKaRa Ex Taq i 0,25 ąm dNTP w buforze, który pokryto 50 ąl oleju mineralnego. Przeprowadzono 30 cykli PCR w następujących warunkach: 1 minuta w 94°C, 1 minuta w 55°C i 2 minuty w 72°C. Fragmenty DNA amplifikowane metodą PCR rozdzielono stosując elektroforezę na 3% żelu agarozowym NuSieve GTG Agarose (FMC Bio. Products).

Następnie, wycinek żelu agarozowego zawierającego fragment DNA wielkości 437 bp wycięto i oczyszczono fragment DNA stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta załączonych do zestawu. Oczyszczony DNA zebrano przez wytracanie etanolem i rozpuszczono w 20 μ l roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mol EDTA. 1 μ l uzyskanego roztworu DNA trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i HindIII (Takara Shuzo Co., Ltd) w 37°C przez 1 godzinę. Mieszaninę trawienną ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie wytrącano etanolem w celu zebrania DNA.

Otrzymany fragment DNA HindIII-BamHI, który zawierał gen kodujący region V mysiego łańcucha H, klonowano do wektora pUC19, który trawiono HindIII i BamHI. Otrzymany plazmid sekwencjonowano na urządzeniu DNA Sequencer 373A (Perkin Elmer) z użyciem startera M13 Primer M4 i M13 Primer RV oraz zestawu Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer). Plazmid zawierający DNA o prawidłowej sekwencji zasad kodujących region V mysiego łańcucha H pochodzącego z hybrydoma #23-57-137-1 i posiadający sekwencję rozpoznawaną przez HindIII i sekwencję Kozak'a w regionie 5' i sekwencję rozpoznawaną przez BamHl na końcu 3', oznaczono „MBC1H/pUC19.

(ii) Konstruowanie regionu V łańcucha H stosowanego do wytwarzania mysio-ludzkiego cDNA chimerycznego łańcucha H typu cDNA

DNA kodujący region V mysiego łańcucha H skonstruowanego w opisany wyżej sposób zmodyfikowano metodą PCR w celu połączenia go z cDNA regionu Cy1 ludzkiego łańcucha H. Starter wsteczny MBC1HVR2 (Id. Sekw. nr 9) zastosowany do regionu V łańcucha H tak zaprojektowano, że powoduje zastąpienie drugiego aminokwasu (tj. asparaginy) sekwencji kodującej początkową część sekwencji liderowej regionu V łańcucha H glicyną i zawiera sekwencję zgodności Kozak'a (Kozak M. i in., J. Mol. Biol. 196:947-950, 1987) i sekwencje rozpoznawane przez HindllI i EcoRI. Starter „naprzód MBC1HVR2 (Id. Sekw. nr 10) zastosowany dla regionu V łańcucha H tak zaprojektowano, aby hybrydyzował z sekwencją DNA kodującą region 3' regionu J, kodując region 5' regionu C i zawierając sekwencje rozpoznawane przez Apal i Smal.

Reakcję PCR przeprowadzono stosując TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co.,Ltd.) i dołączony bufor. Roztwór PCR zawierał w 50 μ l 0,6 ąg plazmidu MBC1H/pUC19 jako matrycy DNA, 50 pmoli MBC1HVS2 i 50 pmoli MBC1HVR2 jako starterów, 2,5 U TaKaRa Ex Taq i 0,25 tnM dNTP w buforze, co pokryto warstwą 50 ąl oleju mineralnego. Przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 55°C i 1 minutę w 72°C. Amplifikowane fragmenty DNA w reakcji

PL 193 575 B1

PCR rozdzielono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stosując 1% Sea Kem GTG Agarose (FMC

Bio. Products). Następnie, fragment żelu zawierający fragment DNA wielkości 456 bp wycięto i oczyszczono fragment DNA stosując GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta. Oczyszczone fragmenty DNA wytrącano etanolem i rozpuszczono w 20 μΙ roztworu zawierającego 10 mM

Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

μg uzyskanego roztworu DNA trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Smal (Takara Shuzo Co., Ltd) w 37°C przez 1 godzinę. Mieszaninę trawienną ekstrahowano fenolem i chloroformem i wytrącano etanolem w celu odzyskania DNA. Otrzymane fragmenty DNA EcoRI-SmaI, które zawierały DNA kodujący region V mysiego łańcucha H klonowano do wektora pUC19, który był trawiony EcoRI i SmaI. Otrzymany plazmid sekwencjonowano na urządzeniu DNA Sequencer 373A (Perkin Elmer) stosując startery M13 Primer M4 i M13 Primer RV oraz zestaw Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer). Otrzymano plazmid, który zawierał gen kodujący region V mysiego łańcucha H pochodzącego z hybrydoma #23-57-137-1 o prawidłowej sekwencji zasad i posiada sekwencje rozpoznawane przez EcoRI i HindlII oraz sekwencję Kozak'a na końcu 5' oraz sekwencję rozpoznawaną przez ApaI i SmaI na końcu 3' i oznaczonego jako „MBC1Hv/pUC19.

(iii) Konstruowanie wektora ekspresyjnego dla łańcucha H przeciwciała chimerycznego cDNA zawierający region Cy1 łańcucha H ludzkiego przeciwciała wytworzono w następujący sposób.

mRNA wytworzono z komórek CHO, do których wprowadzono wektor ekspresyjny DHFR-AE-RVh-PM-1-f (patrz WO 92/19759) kodujący genomowe DNA regionu V łańcucha H humanizowanego przeciwciała PM1 oraz regionu C łańcucha H ludzkiego przeciwciała IgG1 (N. Takahashi i in., Cell 29, 671-679, 1982) oraz wektor ekspresyjny RV1-PM1a (patrz WO 92/19759) kodujący genomowe DNA regionu V łańcucha L humanizowanego przeciwciała PM1 oraz region C łańcucha L typu κ przeciwciała ludzkiego. Stosując otrzymany w ten sposób mRNA, klonowano cDNA zawierający region V łańcucha H humanizowanego przeciwciała PM1 oraz region Cy1 regionu C przeciwciała ludzkiego przy użyciu RT-PCR, a następnie klonowano do plazmidu pUC19 w miejscu HindIII-BamHI. Po zsekwencjonowaniu otrzymano plazmid, który miał prawidłową sekwencję nukleotydową i oznaczono go jako „pRVh-PM1f-cDNA.

Wektor ekspresyjny DHFR-AE-RVh-PM-1-f, który posiadał delecję miejsca Hindlll pomiędzy promotorem SV40 i genem DHFR oraz miejsce EcoRI pomiędzy promotorem EF-1a i regionem V łańcucha H przeciwciała humanizowanego PM1 wytworzono w celu skonstruowania wektora ekspresyjnego dla cDNA zawierającego gen regionu V łańcucha H humanizowanego przeciwciała PM1 oraz gen regionu Cy1 regionu C przeciwciała ludzkiego.

Otrzymany plazmid pRVh-PM1f-cDNA trawiono BamHI, stępiano fragmentem Klenowa, i dalej trawiono Hindlll w celu otrzymania fragmentu Hindlll-BamHI z tępymi końcami. Ten fragment HindlII-BamHI z tępymi końcami poddano ligacjij z wektorem ekspresyjnym DHFR-AE-RVh-PM1-f, który trawiono HindlII i BamHI we wspomnianych powyżej miejscach Hindlll i EcoRI. Tak skonstruowano wektor ekspresyjny RVh-PM1f-cDNA zawierający cDNA kodujący region V łańcucha H humanizowanego przeciwciała PM1 i Cy1 regionu C przeciwciała ludzkiego.

Wektor ekspresyjny RVh-PM1f-cDNA zawierający cDNA kodujące region V łańcucha H przeciwciała PM1 i Cy1 regionu C przeciwciała ludzkiego trawiono Apal i BamHI i pobrano fragment DNA zawierający region C łańcucha H. Uzyskany fragment DNA wprowadzono do plazmidu MBC1Hv/pUC19, który trawiono Apal i BamHI. Wytworzony w ten sposób plazmid oznaczono „MBC1HcDNA/pUC19. Plazmid ten zawierał cDNA kodujące region V łańcucha H przeciwciała mysiego i Cy1 regionu C przeciwciała ludzkiego i posiada sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI i HindIII na końcu 5' i sekwencję rozpoznawaną przez BamHI na końcu 3'.

Plazmid MBC1HcDNA/pUC19 trawiono EcoRI i BamHI w celu otrzymania fragmentu DNA obejmującego sekwencję nukleotydową kodującą łańcuch H przeciwciała chimerycznego. Uzyskany fragment DNA wprowadzono do wektora ekspresyjnego pCOS1, który trawiono EcoRI i BamHI. Otrzymano wektor ekspresyjny dla przeciwciała chimerycznego i oznaczono go „MBC1HcDNA/pCOS1. Następnie, skonstruowano wektor ekspresyjny pCOS1 stosując HEF-PMh-gy1 (patrz, WO 92/19759) przez usunięcie z niego genów przeciwciała przy użyciu EcoRI i Smal, a następnie poddanie ligacji z Adaptorem EcoRI-Notl-BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd).

W celu wytworzenia plazmidu do ekspresji w komórkach CHO, plazmid MBC1HcDNA/pUC19 trawiono EcoRI i BamHI w celu otrzymania fragmentu DNA kodującego gen łańcucha H przeciwciała chimerycznego. Fragment DNA następnie wprowadzono do plazmidu ekspresyjnego pCHO1, który

PL 193 575 B1 trawiono EcoRI i BamHI w celu uzyskania plazmidu ekspresyjnego dla przeciwciała chimerycznego, który oznaczono „MBC1HcDNA/pCHO1. Wektor ekspresyjny pCHO1 skonstruowano stosując DHFR-AE-rvH-PM1-f (patrz WP92/19759) przez usunięcie z niego genu przeciwciała przy użyciu trawienia

EcoRI i Smal, a następnie ligację do Adaptora EcoRI-NotI-BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd).

(2) Konstruowanie regionu C ludzkiego łańcucha L (i) Wytwarzanie wektora do klonowania

W celu skonstruowania wektora pUC19 zawierającego region C ludzkiego łańcucha L, wytworzono wektor pUC19 z usuniętym miejscem HindIII. 2 ąg wektora pUC19 trawiono 20 μ l roztworu reakcyjnego zawierającego 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCL, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd) w 37°C przez 1 godzinę. Otrzymaną mieszaninę trawienną ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie poddano wytrącaniu etanolem w celu zebrania żądanego DNA.

Zebrany DNA poddano reakcji w 50 μ l roztworu reakcyjnego zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCh, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 0,5 mM dNTP i 6 U fragmentu Klenowa (Gibco BRL) w temperaturze pokojowej przez 20 minut i uzyskano DNA z tępymi końcami. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie poddano wytrącaniu etanolem w celu zebrania żądanego wektorowego DNA.

Wektorowy DNA poddano reakcji w 10 ąl roztworu reakcyjnego zawierającegoo 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCh, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% (obj/obj) glikol polietylenowy 8000 i 0,5 U ligazy DNA T4 (Gibco BRL) w 16°C przez 2 godziny w celu samoligacji wektorowego DNA. 5 ąl roztworu reakcyjnego dodano do 100 μl roztworu zawierającego kompetentne komórki E. coli JM 109 (Nippon Gene Co., Ltd). Uzyskany roztwór pozostawiono przez 30 minut na lodzie, w 42°C przez 1 minutę i następnie przez 1 minutę znów na lodzie. Roztwór reakcyjny zmieszano z 500 ąl pożywki SOC i inkubowano w 37°C przez 1 godzinę. Wytworzony roztwór wysiano na pożywce 2xYT z agarem z dodatkiem 50 ąg/ml ampicyliny, którą stosowano z X-gal i IPTG na powierzchni (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al Cold Spring Harbbor Laboratory Press 1989) i następnie hodowano przez noc w temperaturze 37°C w celu uzyskania transformanta. Transformanty hodowano przez noc w pożywce 2xYT (20 ml) z dodatkiem 50 ąg/ml ampicyliny w 37°C. Z frakcji komórkowej pożywki hodowlanej izolowano i oczyszczano plazmidowy DNA stosując zestaw Plasmid Mini Kit (QIAGEN) zgodnie z instrukcjami zawartymi w zestawie. Oczyszczony plazmid trawiono Hindlll. Plazmid, co do którego stwierdzono, że posiada miejsce HindllI określa się jako „pUC19 AHindlN (ii) Konstruowanie DNA kodującego region C łańcucha łańcucha L typu λ

Wiadomo było, że region C łańcucha L typu λ obejmuje przynajmniej cztery izotypy Mcg⁺Ke⁺Oz, McgKeOz', ^Mc^gKe^Oz+ ⁱ IMc^Ke+Oz (^Dariavacti ^P. ⁱ in., ^Proc. IMati. Acad. ^ScL ^{USA 84}:⁹⁰⁷⁴-^{9078, 1987}). Przeprowadzono poszukiwanie regionów C ludzkiego łańcucha L typu λ ludzkiego przeciwciała homologicznego do regionu C mysiego łańcucha L typu X #23-57-137-1 opierając się na bazie danych EMBL. W rezultacie, stwierdzono, że izotyp Mcg⁺Ke⁺Oz regionu C łańcucha L typu λ ludzkiego przeciwciała (Nr dostępu Χ57819 (Dariavach P. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9074-9078, 1987) wykazał najwyższą homologię z regionem C łańcucha L typu λ mysiego #23-57-137-1 i wykazywał 64,4% homologię w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej i 73,4% homologii w odniesieniu do sekwencji DNA.

Następnie, przeprowadzono konstruowanie DNA kodującego region C łańcucha L typu λ ludzkiego przeciwciała metodą PCR. Wszystkie startery syntetyzowano stosując urządzenie 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI). Syntetyzowano następujące startery HLAMB1 (Id. Sekw. nr 11) i HLAMB3 (Id. Sekw. nr 13) o sensownej sekwencji DNA oraz HLAMB2 (Id. Sekw. nr 12) i HLAMB4 (Id. Sekw. nr 14) o antysensownej sekwencji DNA, przy czym każdy ze starterów zawierał sekwencję komplementarną o długości 20-23 bp na obu końcach.

Zewnętrzne startery HLAMBS (Id. Sekw. nr 15) i HLAMBR (Id. Sekw. nr 16) miały sekwencje homologiczne odpowiednio, ze starterami HLAMB1 i HLAMB4. HLAMBS zawierał sekwencje rozpoznawane przez, EcoRI, Hindlll i Blnl a HLAMBR zawierał sekwencję rozpoznawalną przez EcoRI. W pierwszej reakcji PCR przeprowadzono reakcję HLAMB1-HLAMB2 i HLAMB3-HLAMB4. Po zakończeniu reakcji, oba uzyskane w PCR produkty zmieszano w równych ilościach i połączono w kolejnej reakcji PCR. Do roztworu reakcyjnego dodano zewnętrzne startery HLAMBS i HLAMBR. Mieszaninę reakcyjną poddano trzeciej reakcji PCR w celu amplifikacji DNA pełnej długości.

Każdą reakcję PCR przeprowadzono stosując TaKaRa Ex Tag (Takara Shuzo Co.,Ltd) według instrukcji producenta. W pierwszej reakcji PCR zastosowano 100 ą l roztworu reakcjyjnego zawierającego 5 pmoli HLAMB1, 0,5 pmoli HLAMB2 i 5 U TaKaRa Ex Tag (Takara Shuzo Co.,Ltd), który npo18

PL 193 575 B1 kryto warstwą 50 μ Ι oleju mineralnego i przeprowadzono 5 cykli PCR stosując program obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C.

W drugiej reakcji PCR, zastosowano mieszaninę 50 μΙ każdego z roztworów reakcyjnych, na które nawarstwiono 50 μΙ oleju mineralnego i przeprowadzono trzy cykle reakcji PCR stosując program obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C.

W trzeciej reakcji PCR zastosowano roztwór reakcyjny, do którego dodano 50 pmoli każdego ze starterów zewnętrznych HLAMBS i HLAMBR i przeprowadzono 30 cykli PCR stosując program obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C.

Otrzymany w trzeciej reakcji PCR fragment DNA poddano elektroforezie przy użyciu 3% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (NuSieve GTG, FMC), zebrano i oczyszczono z żelu stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta.

Otrzymany w ten sposób fragment DNA trawiono 20 μ l roztworu reakcyjnego zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCfe, 1 mM DTT, 100 mM NaCl i 8 U EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd) w 37°C przez 1 godzinę. Roztwór trawienny ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie wytrącano DNA etanolem. DNA zebrano i rozpuszczono w 8 μl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA).

0,8 μg plazmidu pUC19 AHindlll trawiono EcoRI w taki sam sposób jak opisany wyżej. Roztwór trawienny ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie wytrącano etanolem otrzymując pUC19 AHindlll. Strawiony plazmid poddano reakcji w 50 μl roztworu reakcyjnego zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1 mM MgCh i fosfatazę alkaliczną (E. coli C75, Takara Shuzo Co., Ltd) w 37°C przez 30 minut, w celu defosforylacji plazmidu (tj. traktowanie BAP). Roztwór reakcyjny poddano ekstrakcji fenolem i chloroformem i zbierano DNA przez wytrącanie etanolem. Następnie otrzymany DNA rozpuszczono w 10 μ I roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA).

μ l plazmidu pUC10 AHindlll traktowanego BAP zmieszano z 4 μ l DNA otrzymanego w opisanych wyżej reakcjach PCR poddając je ze sobą ligacji z użyciem zestawu do ligacji DNA ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd). Uzyskany plazmid wprowadzono do kompetentnych komórek E. coli, JM109, otrzymując transformanty. Transformanty hodowano przez noc w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 μg/ml ampicyliny. Z frakcji komórek wyizolowano plazmid stosując zestaw QLAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

Otrzymany plazmid poddano sekwencjonowaniu w odniesieniu do klonowanej części DNA.

W celu określenia sekwencji DNA zastosowano urządzenie 373A DNA Sequencer (ABI) i startery „M13 Primer M4 i „M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd). W wyniku stwierdzono, że klonowany DNA ma delecję wielkości 12 bp. Plazmid oznaczono jako „cXA/pUC19. Następnie, w celu wytworzenia części delecyjnej, wytworzono startery HCLMS (Id. Sekw. nr 17) i HCLMR (Id. Sekw. nr 18) i rekonstruowano prawidłowy DNA stosując te startery w metodzie PCR.

Przeprowadzono pierwszą reakcję PCR z użyciem plazmidu CXA/pUC19, zawierającego DNA z delecją jako matrycy, a następnie z użyciem zestawów starterów HLAMBS i HCLMS albo starterów HCLMS i HLAMB4. Każdy z produktów reakcji PCR oddzielnie oczyszczono. W drugiej reakcji PCR produkty PCR połączono ze sobą.

W trzeciej reakcji PCR do produktu drugiej reakcji PCR dodano zewnętrzne startery HLAMBS i HLAMB4 i amplifikowano w celu uzyskania DNA pełnej długości.

W pierwszej reakcji PCR 100 μ l roztworu reakcyjnego zawierającego 0,1 μg cXA/pUC19 jako matrycę, zastosowano po 50 pmoli każdego ze starterów HLAMBS i HCLMR albo 50 pmoli każdego ze starterów HCLMS i HLAMB4 oraz 5 U TaKaRa Ex Tag (Takara Shuzo Co., Ltd), na co nawarstwiono 50 μ l oleju mineralnego i przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C.

Produkty PCR z pierwszej reakcji, HLAMBS-HCLMR (236 bp) i HCLMS-HLAMB4 (147 bp) poddano elektroforezie stosując 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia w celu wyizolowania fragmentu DNA. Fragmenty DNA zebrano i oczyszczono z żelu stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101). W drugiej reakcji PCR, zastosowano 20 μl roztworu reakcyjnego zawierającego 40 ng oczyszczonego fragmentu DNA i 1 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd), nawarstwiono 25 μl oleju mineralnego i przeprowadzono 5 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C.

W trzeciej reakcji PCR, zastosowano 100 μ l roztworu reakcyjnego zawierającego 2 μl roztworu reakcyjnego otrzymanego w drugiej reakcji PCR, 50 pmoli każdego z zewnętrznych starterów HLAMBS i HLAMB4 i 5 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd), nawarstwiono 50 μl oleju mineralnego i przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę

PL 193 575 B1 w 60°C i 1 minutę w 72°C, otrzymując fragment DNA długości 357 bp (trzeci produkt PCR). Fragment

DNA poddano elektroforezie stosując 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia w celu wyizolowania fragmentu DNA. Fragment DNA zebrano i oczyszczono z żelu stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101).

0,1 ąg fragmentu DNA trawiono EcoRI, a następnie klonowano do plazmidu pUC19AHindlII, który traktowano BAP. Powstały plazmid wprowadzono do kompetentnych komórek E. coli JM109 otrzymując transformanty. Tak wytworzone transformanty hodowano przez noc w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 ąg/ml ampicyliny. Z frakcji komórkowej oczyszczano plazmid stosując zestaw QIAgen Spin Plasmid Kit (QUIAGEN).

Oczyszczony plazmid sekwencjonowano przy użyciu urządzenia DNA Sequencer 373A (ABI; Perkin Elmer) stosując startery M13 Primer M4 (Takara Shuzo Co., Ltd) i M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd). Plazmid zawierający prawidłową sekwencję DNA bez delecji oznaczono „CX/pUC19.

(iii) Konstruowanie DNA kodującego region C ludzkiego łańcuch L, typu κ

Fragment DNA kodujący region C łańcucha L typu κ klonowano z plazmidu HEF-PM1k-gk (WO 92/19759) metodą PCR. Starter do przodu HKAPS (Id. Sekw. nr 19) zaprojektowano w taki sposób, że zawierał sekwencje rozpoznawane przez EcoRI, HindIII i BlnI, zaś starter wsteczny HKAPA (Id. Sekw. nr 20) zaprojektowano w taki sposób, że zawierał sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI, przy czym oba syntetyzowano na urządzeniu 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI).

Reakcję PCR przeprowadzono stosując 100 ąl roztworu reakcyjnego zawierającego 0,1 ąg plazmidu HEF-PM1k-gk jako matrycę, 50 pmoli każdego ze starterów HKAPS i HKAPA oraz 5 U TaKaRa Ex Taq, na co nawarstwiono 50 ąl oleju mineralnego. Przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C i otrzymano produkt PCR o wielkości 360 bp. Fragmenty DNA izolowano i oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stosując 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia i oczyszczono fragment DNA stosując GENECLEAN II (BIO101).

Następnie otrzymany fragment DNA trawiono EcoRI i klonowano do plazmidu pUC19 AHindlll, który traktowano BAP. Otrzymany plazmid wprowadzono do kompetentnych komórek E. coli, JM109 w celu uzyskania transformantów, które hodowano przez noc w pożywce 2xYT z dodatkiem 50 ąg/ml ampicyliny. Z frakcji komórkowej oczyszczano plazmid stosując zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

Otrzymany w ten sposób plazmidowy DNA sekwencjonowano z użyciem startera M13 Primer M4 i M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd) przy użyciu urządzenia 373A DNA Sequencer (ABI). Plazmid o potwierdzonej prawidłowej sekwencji zasad oznaczono „CK/pUC19.

(3) Konstruowanie wektora ekspresyjnego łańcucha L chimerycznego przeciwciała

Konstruowano wektor ekspresyjny dla łańcucha L chimerycznego przeciwciała #23-57-137-1. DNA kodujący region V łańcucha L #23-57-137-1 poddano ligacji w miejscach Hindlll i BlnI występujących tuż przed regionem C ludzkiego przeciwciała, każdego z plazmidów CX,/pUC19 i Cr/pUC19 otrzymując w ten sposób wektory pUC19 zawierające DNA kodujący region V łańcucha L chimerycznego przeciwciała #23-57-137-1 albo region C łańcucha L typu λ albo region C łańcucha L typu κ odpowiednio. Każdy z otrzymanych wektorów trawiono EcoRI w celu oddzielenia genu łańcucha L chimerycznego przeciwciała i klonowano DNA do wektora ekspresyjnego HEF.

Fragment DNA kodujący region V łańcucha L przeciwciała #23-57-137-1 klonowano z plazmidu MBC1L24 metodą PCR. Startery stosowane w PCR indywidualnie syntetyzowano stosując 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI). Starter wsteczny MBCCHL1 (Id. Sekw. nr 21) zaprojektowano tak, że zawierał sekwencję rozpoznawaną przez Hindlll i sekwencję zgodności Kozak'a (Kozak M. i in., J. Mol. Biol. 196:947-950, 1987) zaś starter do przodu MBCCHL3 (Id. Sekw. nr 22) zaprojektowano tak, że zawierał sekwencje rozpoznawane przez Bglll i EcoRI.

Przeprowadzono reakcję PCR stosując 100 ąl roztworu reakcyjnego obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,2 mM dNTP 1,5 mM MgCh, 0,1 ąg MBC1L24, 50 pmoli każdego ze starterów MBCCHL1 i MBCCHL3 i 1 ąl jednostki AmpliTaq (Perkin-Elmer), na co nawarstwiono 50 ąl oleju mineralnego. Przeprowadzono 30 cykli PCR stosując cykl temperaturowy po 45 sekund w 94°C, 45 sekund w 60°C i 2 minuty w 72°C.

Produkt PCR wielkości 444 bp poddano elektroforezie stosując 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia i zebrano i oczyszczono fragment DNA stosując GENECLEAN II (BIO101). Oczyszczony fragment DNA rozpuszczono w 20 ąl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

PL 193 575 B1 μΙ produktu PGR trawiono w 20 μΙ roztworu reakcyjnego zawierającego 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 8 U Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd) i 8 U EcoRI w 37°C przez godzinę. Roztwór trawienny ekstrahowano fenolem/chloroformem, a następnie interesujący DNA zbierano przez wytrącanie etanolem. DNA rozpuszczono w 8 μ l roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA).

W taki sam sposób 1 μg plazmidu pUC19 trawiono HindIII i EcoRI i poddano ekstrakcji fenol/chloroform a następnie wytrącaniu etanolem. Otrzymany plazmid traktowano BAP fosfatazą alkaliczną, E. coli C75; Takara Shuzo Co., Ltd). Uzyskany roztwór reakcyjny ekstrahowano fenolem i chloroformem a DNA zbierano przez wytrącanie etanolem. DNA rozpuszczono w 10 μl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

μ l plazmidu pUC19 traktowanego BAP zmieszano z 4 μl otrzymanego powyżej produktu PCR w celu ligacji przy użyciu zestawu do ligacji DNA ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd). Otrzymany plazmid wprowadzono, w sposób opisany powyżej, do kompetentnych komórek E. coli JM109 otrzymując transformanty. Tak wytworzone transformanty hodowano przez noc w 37°C w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 μg/ml ampicyliny. Z frakcji komórkowej oczyszczano plazmid stosując zestaw QIAgen Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Po określeniu sekwencji nukleotydowej plazmidu o potwierdzonej prawidłowej sekwencji nukleotydowej oznaczono „CHL/pUC19. 1 μg każdego z plazmidów CX/pUC19 i Cr/pUC19 trawiono w 20 μl roztworu reakcyjnego obejmującego 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U HindllI (Takara Shuzo Co., Ltd) i 2 U BlnI (Takara Shuzo Co., Ltd) w 37°C przez godzinę. Roztwór trawienny ekstrahowano fenolem i chloroformem, a DNA zbierano przez wytrącanie etanolem. DNA traktowano BAP w 37°C prze 30 minut. Roztwór reakcyjny ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie wytrącano etanolem. Produkt rozpuszczono w 10 μl roztworu obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

μ l plazmidu CHL/pUC19, który zawierał DNA kodujący region V łańcucha L przeciwciała #23-57-137-1 trawiono Hindlll i BlnI w opisany wyżej sposób dla uzyskania fragmentu DNA wielkości 409 bp, który poddano elektroforezie stosując 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia i zebrano i oczyszczono z żelu stosując zestaw GENECLEAN II. Fragment DNA rozpuszczono w 10 μ l roztworu obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

μ l DNA dla regionu V łańcucha L klonowano do 1 μ l traktowanych BAP plazmidów CX/pUC19 albo cr/pUC19 i wprowadzano do kompetentnych komórek E. coli, JM109, otrzymując transformanty. Transformanty hodowano przez noc w 3 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 μg/ml ampicyliny. Z komórek oczyszczono plazmid stosując zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Otrzymane w ten sposób plazmidy oznaczono „MBC1L(X)/pUC19 albo „MBC1L(K)/pUC19.

Każdy z plazmidów MBC1L(X)/pUC19 i MBC1L (K)/pUC19 trawiono EcoRI i poddawano elektroforezie przy użyciu 3% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (NuSieve GTG, FMC), zebrano i oczyszczono DNA wielkości 743 bp z żelu stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta, po czy rozpuszczono w 10 μl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

2,7 μg wektora ekspresyjnego, plazmidu HEF-PM1k-gk trawiono EcoRI i ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie wytrącano etanolem otrzymując DNA. Fragment DNA traktowano BAP a następnie poddano elektroforezie przy użyciu 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia i oczyszczono z żelu fragment DNA wielkości 6561 bp stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101). Oczyszczony fragment DNA rozpuszczono w 10 μ l roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

μl wektora HEF traktowanego BAP zmieszano z 3 μl fragmentu EcoRI plazmidu MBCL(X)/pUC19 albo MBC1L(X)/pUC19 w celu ich ligacji. Produkt ligacji wprowadzono do kompetentnych komórek E. coli, JM109, otrzymując transformanty. Transformanty hodowano przez noc w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 μg/ml ampicyliny. Z frakcji komórkowej oczyszczono plazmid stosując zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)

Plazmidowy DNA trawiono w 20 μ l roztworu zawierającego 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U HindIII (Takara Shuzo Co., Ltd) i 2 U PvuI (Takara Shuzo Co., Ltd) w 37°C przez godzinę. W tej reakcji trawienia założono, że jeżeli fragment DNA zostanie wprowadzony do wektora w prawidłowej orientacji, to otrzyma się fragment 5104/2195 bp, podczas gdyby fragment DNA wprowadzono do wektora w odwrotnej orientacji, to da to fragment wielkości 4387/2926 bp. Plazmidy, u których potwierdzono, że fragment został wprowadzony w prawidłowej orientacji oznaczono „MBC1LX)/neodla plazmidu MBC1L(K)/pUC19 i „MBC1L(K)/neo dla plazmidu MBC1L(K)/pUC19.

PL 193 575 B1 (4) Transfekcja komórek COS-7

Wytworzone jak wyżej plazmidy ekspresyjne poddano przejściowej ekspresji przy użyciu komórek COS-7, w celu oszacowania przeciwciał chimerycznych pod względem aktywności wiązania i neutralizacji przeciwko antygenowi.

Przejściową ekspresję przeciwciała chimerycznego osiągnięto przez połączenie plazmidów MBC1 HcDNA/pCOSI i MBC1L(X)/neo albo plazmidów MBC1HcDNA/pCOS1 i MBC1L(r)/neo przy użyciu urządzenia Gene Pulser (BioRad) w celu kotransfekowania każdej z kombinacji plazmidów do komórek COS-7. To znaczy, do 0,8 ml zawiesiny komórek, w której komórki COS-7 zawieszono w PBS(-) w gęstości 1x10⁷ komórek/ml, dodano 10 μg każdego z plazmidowych DNA. Powstały roztwór poddano pulsowi przy napięciu 1500 V i pojemności 2 μ F powodując elektroporację. Po 10 minutach okresu regeneracji w temperaturze pokojowej elektroporowane komórki zawieszono w pożywce DMEM (GIBCO) zawierającej 2% surowicę płodową cielęcą Ultra Low IgG (Gibco), a następnie hodowano stosując 10 cm szalki w inkubatorze CO2. Po hodowli przez 72 godziny, supernatant hodowlany zebrano i odwirowano w celu usunięcia resztek komórkowych i dostarczono jako próbkę do testu ELISA.

W tej procedurze, oczyszczanie przeciwciał chimerycznych z supernatantu hodowlanego komórek COS-7 przeprowadzono przy użyciu zestawu Affigel Protein A MAPSII(Bio Rad) według instrukcji producenta.

(5) ELISA (i) Określenie stężenia przeciwciał

Płytkę ELISA do oznaczania stężenia przeciwciał przygotowano w następujący sposób. Każdą studzienkę 96-studzienkowej płytki do ELISA (Maxisorp, NUNC) pokryto 100 μ l buforu pokrywającego (0,1 M NaHCO3, 0,02 NaN₃) uzupełnionego 1 μg/ml koziego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG (TAGO), a następnie blokowano 200 μl buforu do rozcieńczania (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃, 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA); pH 7,2). Do każdej studzienki dodano seryjne rozcieńczenia supernatantu hodowlanego komórek COS-7, w którym ulegały ekspresji przeciwciała chimeryczne albo oczyszczone przeciwciała chimeryczne w seryjnych rozcieńczeniach. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez godzinę i płukaniu PBS-Tween 20, do każdej ze studzienek dodano 100 μl roztworu koziego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną (TAGO). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez godzinę i płukaniu PBSTween 20, do każdej ze studzienek dodano 1 mg/ml roztworu substratu („Sigma 104, kwas p-nitrofenylofosforowy, Sigma). Mierzono absorbancję roztworu przy długości fali równej 405 nm stosując Microplate Reader (Bio Rad). Jako standard stosowano oczyszczane Hu IgG1X (The Binding Site) (ii) Określanie zdolności wiązania antygenu

Płytkę ELISA do oznaczania wiązania przeciwciał przygotowano w następujący sposób. Każdą studzienkę płytki 96-studzienkowej pokryto 100 μ l buforu pokrywającego uzupełnionego 1 μg/ml ludzkiego PTHrP (1-34) (Peptide Research Institute), a następnie zablokowano 200 μ l buforu do rozcieńczania. Do każdej ze studzienek dodano każdego z seryjnych rozcieńczeń supernatantu hodowlanego komórek COS-7, w których wyrażano przeciwciała chimeryczne albo oczyszczone przeciwciała chimerycznej stopniowym rozcieńczeniu. Po inkubacji w temperaturze pokojowej i płukaniu PBS-Tween 20, do każdej ze studzienek dodano 100 μl roztworu koziego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną (TAGO). Po inkubacji w temperaturze pokojowej i płukaniu PBSTween 20 do każdej ze studzienek dodano 1 mg/ml roztworu substratu („Sigma 104, kwas p-nitrofenylofosforowy, Sigma). Mierzono absorbancję roztworu przy długości fali równej 405 nm stosując Microplate Reader (Bio Rad).

W wyniku stwierdzono, że przeciwciało chimeryczne ma zdolność wiązania ludzkiego PTHrP (1-34) jak również ma prawidłową strukturę klonowanego regionu V przeciwciała mysiego (fig. 5). Stwierdzono również, że nie występują różnice w zdolności wiązania PTHrP (1-34) pomiędzy przeciwciałem chimerycznym, w którym region C łańcucha L ma łańcuch λ, a takim, który posiada łańcuch κ regionu C łańcucha L. Stąd, skonstruowano region C łańcucha L przeciwciała humanizowanego łańcucha λ, łańcucha L przeciwciała.

(6) Ustalenie linii komórkowej CHO zdolnej do stabilnego wytwarzania przeciwciał chimerycznych

W celu ustalenia linii komórkowej stabilnie wytwarzającej przeciwciała chimeryczne, opisany wyżej plazmid ekspresyjny wprowadzono do komórek CHO (DXB11).

PL 193 575 B1

Ustalenie linii komórkowej stabilnie wytwarzającej przeciwciała chimeryczne przeprowadzono przy użyciu kombinacji plazmidów ekspresyjnych komórek CHO, MBC1HcDNA/pCHO1 i MBC1L(X)/neo albo plazmidów ekspresyjnych dla komórek CHO, MBCIHcDNA/pCHO1 i MBC1L(K)/neo. Komórkę CHO kotransfekowano plazmidami metodą elektroporacji stosując Gene Pulser (Bio Rad). Każdy z wektorów ekspresyjnych cięto enzymem restrykcyjnym PvuI w celu otrzymania liniowego DNA. Powstały DNA ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie strącano etanolem. Wytworzony w ten sposób plazmidowy DNA poddano elektroporacj i 10 μg każdego z plazmidowych DNA dodano do 0,8 ml zawiesiny komórek zawierającej komórki CHO w PBS(-) w gęstości 1 x 10⁷ komórek/ml. Powstałą mieszaninę poddano pulsowi o napięciu 1500 V i pojemności 25 pF. Po dziesięciu minutach okresu regeneracji w temperaturze pokojowej komórki zawieszono w pożywce MEM-α (Gibco) zawierającej 10% surowicy płodowej cielęcej (Gibco). Powstałą zawiesinę hodowano w trzech płytkach 96-studzienkowych (Falcon) w inkubatorze CO2. Następnego dnia po rozpoczęciu hodowli, pożywkę zastąpiono pożywką wybiórczą (pożywka MEM z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (Gibco) i 500 pg/ml genetycyny (siarczan G418, Gibco) bez rybonukleozydów albo deoksyrybonukleotydów. Z pożywki hodowlanej wybrano komórki, do których wprowadzono gen przeciwciała. Po zastąpieniu pożywki selektywnej świeżą pożywką, po dwóch tygodniach hodowli komórki obserwowano pod mikroskopem. Gdy zaobserwowano wzrost korzystnych komórek komórki badano na ilość wytwarzanych przeciwciał w teście ELISA. Wśród komórek zebrano wybiórczo te, które wytwarzały większe ilości przeciwciał.

Skalowanie w górę hodowli stabilnych transformantow zdolnych do wytwarzania przeciwciał przeprowadzono w butelkach obrotowych stosując pożywkę MEM z dodatkiem pożywki MEM z dodatkiem 2% płodowej surowicy cielęcej Ultra Low IgGl bez rybonukleozydów i dezoksyrybonukleozydów 3 i 4 dnia hodowli, zebrano supernatant hodowlany a następnie filtrowano stosując 0,2 pm filtr (Millipore) w celu usunięcia resztek komórkowych.

Oczyszczanie przeciwciał chimerycznych z supernatanu hodowli komórek CHO przeprowadzono przy użyciu kolumny POROS Protein A Column (PerSeptive Biosystems) na ConSep LC100 (Millipore) według instrukcji producenta. Oczyszczone przeciwciała chimeryczne dostarczono jako próbki do określenia aktywności neutralizującej oraz do badania skuteczności leczniczej na hiperkalcemicznym modelu zwierzęcym. Stężenie i aktywność wiązania oczyszczonych przeciwciał chimerycznych przeciwko antygenowi określono tym samym układem ELISA.

Przykład Referencyjny 4

Konstruowanie przeciwciał ludzkich (1) Konstruowanie łańcucha H przeciwciała humanizowanego (i) Konstruowanie regionu V łańcucha H przeciwciała humanizowanego

Łańcuch H przeciwciała humanizowanego #23-57-137-1 wytworzono techniką przeszczepiania CDR przy użyciu PCR. Do wytwarzania łańcucha H humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 (wersja „a) o FR pochodzących z ludzkiego przeciwciała S31679 (NMRF-PDB; Cuisinier A.M. i in., Eur. J. Immunol. 23:110-118, 1993), zastosowano następujące sześć rodzajów starterów PCR: startery przeszczepiania CDR: MBC1HGP1 (Id. Sekw. nr 23) i MBC1HGP3 (Id. Sekw. nr 24 (zawierające sekwencję sensowną DNA) i MBC1HGP2 (Id. Sekw. nr 25) i MBC1HGP4 (Id. Sekw. nr 26) (zawierające sekwencję antysensowną DNA), wszystkie z nich obejmowały sekwencję komplementarną o długości 15-21 bp na ich obu końcach, i startery zewnętrzne: MBC1HVS1 (Id. Sekw. nr 27) i MBC1HVR1 (Id. Sekw. nr 28), mające homologię ze starterami przeszczepiania CDR, odpowiednio, MBC1HGP1 i MBC1HGP4.

Startery przeszczepiania CDR MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 i MBC1HGP4 wyizolowano stosując zdenaturowany mocznikiem żel poliakryloamidowy (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) i ekstrahowano z frakcji żelu metodą „crush and soak (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) w następujący sposób.

nmol każdego ze starterów przeszczepiania CDR rozdzielono na 6% denaturowanym żelu poliakryloamidowym w celu otrzymania fragmentów DNA. Z powstałych fragmentów DNA jeden o żądanej długości zidentyfikowano przez naświetlenie UV na płytce z żelem krzemionkowym, a następnie zebrano metodą „crush and soak. Uzyskany DNA rozpuszczono w 20 pl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA. Reakcję PCR przeprowadzono stosując TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.). Roztwór reakcyjny (100 pl) zastosowany w reakcji PCR obejmował 1 p l każdego ze

PL 193 575 B1 wspomnianych starterów przeszczepiania CDR MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 i MBC1HGP4,

0,25 mM dNTP i 2,5 U TaKaRa Ex Tag w buforze. Przeprowadzono pięć cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 55°C i 1 minutę w 72°C. Do produktu reakcji dodano zewnętrzne startery MBC1HVS1 i MCB1HVR1 po 50 pmoli. Stosując tę mieszaninę reakcyjną przeprowadzono dodatkowe 30 cykli reakcji PCR stosując ten sam cykl temperaturowy.

Amplifikowany w ten sposób fragment DNA wyizolowano przez elektroforezę na żelu agarozowym z użyciem 4% agarozy NuSieve GTG (FMC Bio. Products).

Fragment agarozy zawierający fragment DNA wielkości 421 bp wycięto i oczyszczono fragment DNA stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta. Oczyszczony w ten sposób fragment DNA wytrącano etanolem i rozpuszczano w 20 μΙ roztworu obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA. Mieszaninę reakcyjną zastosowano do klonowania fragmentu DNA do plazmidu pUC19, który przygotowano przez trawienie BamHI i HindIII, a następnie określano sekwencję zasad uzyskanego plazmidu. Plazmid o prawidłowej sekwencji oznaczono „hMGCHv/pUC19.

(ii) Konstruowanie regionu V łańcucha H cDNA humanizowanego łańcucha H

W celu ligacji cDNA regionu C Cy1 humanizowanego łańcucha H, DNA regionu V łańcucha H skonstruowany w powyższym etapie modyfikowano metodą PGR. W tym sposobie zaprojektowano wsteczny starter MBC1HVS2 w taki sposób, aby hybrydyzował z sekwencją kodującą region 5' sekwencji liderowej regionu V i posiadał sekwencję Kozak'a (Kozak i in., J. Mol. Biol. 196:947-950, 1987) i sekwencje rozpoznawane przez HindIII i EcoRI. Starter do przodu MBC1HVR2 zaprojektowano w taki sposób, żeby hybrydyzował z obiema sekwencjami DNA kodującymi region 3' regionu J oraz sekwencję DNA kodującą region 5' regionu C i niósł sekwencje rozpoznawane przez Apal i Smal.

Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu TaKaRa Ex Tag (Takara Shuzo) i dołączonego buforu. Roztwór reakcyjny zastosowany do reakcji PCR zawierał 0,4 μg hMBCHv/pUC19 jako matrycę DNA, 50 pmoli każdego z MBC1HVS2 i MBC1HVR2 jako startery, 2,5 U TaKaRa Ex Taq i 0,25 mM dNTP w buforze. Przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 55°C i 1 minutę w 72°C. Amplifikowane fragmenty w reakcji PCR rozdzielono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stosując 3% agarozę NuSieve (FMC Bio. Products).

Następnie, fragment żelu zawierający fragment DNA wielkości 456 bp wycięto i oczyszczono fragment DNA stosując GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta. Oczyszczone fragmenty DNA wytrącano etanolem i rozpuszczono w 20 μl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA. Mieszaninę reakcyjną PCR zastosowano do klonowania fragmentu DNA do plazmidu pUC19, który przygotowano przez trawienie plazmidu EcoRI i Smal; następnie określano sekwencję DNA powstałego plazmidu. Plazmidowy DNA, który zawiera DNA kodujący region V łańcucha H pochodzący z hybrydoma #23-57-137-1 i zawiera sekwencje rozpoznawane przez EcoRI i HindIII oraz sekwencję Kozak'a na końcu 5' i sekwencje rozpoznawane przez Apal i SmaI na końcu 3' oznaczono „hMBC1Hv/pUC19.

(2) Konstruowanie wektora ekspresyjnego łańcucha H przeciwciała humanizowanego

Plazmid RVh-PM1f-cDNA zawierający sekwencję cDNA łańcucha H przeciwciała hPM1 trawiono ApaI i BamHI w celu otrzymania fragmentu DNA zawierającego sekwencję zasad regionu C łańcucha H. Fragment DNA wprowadzono do plazmidu hMBC1Hv/pUC19, który preparowano przez trawienie plazmidu Apal i BamHI. Otrzymany w ten sposób plazmid oznaczono „hMBC1HcDNA/pUC19. Plazmid ten zawierał DNA kodujący region V łańcucha H humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 oraz DNA kodujący region Cy1 regionu C łańcucha H i miał sekwencje rozpoznawalne przez EcoRI i HindIII w regionie 5' i sekwencje rozpoznawalne przez BamHI w regionie 3'. Sekwencja nukleotydowa oraz odpowiadająca sekwencja aminokwasowa wersji „a humanizowanego łańcucha H w plazmidzie hMBC1HcDNA/pUC19 pokazano odpowiednio w Id. Sekw. nr 58 i Id. Sekw. nr 56.

Plazmid hMBC1HcDNA/pUC19 trawiono EcoRI i BamHI otrzymując fragment DNA zawierający sekwencję zasad kodującą łańcuch H. Fragment DNA wprowadzono do plazmidu ekspresyjnego pCOS1, który trawiono EcoRI i BamHI. Otrzymany w ten sposób plazmid ekspresyjny dla przeciwciała humanizowanego oznaczono „hMBC1HcDNA/pCOS1.

W celu wytworzenia plazmidu do ekspresji w komórkach CHO, plazmid hMBC1HcDNA/pUC19 trawiono EcoRI i BamHI otrzymując fragment DNA zawierający DNA kodujący łańcuch H. Fragment DNA wprowadzono do plazmidu ekspresyjnego pCHO1, który trawiono EcoRI i BamHI.

PL 193 575 B1

Otrzymany w ten sposób plazmid ekspresyjny dla przeciwciała humanizowanego oznaczono „hMBC1HcDNA/pCHO1.

(3) Konstruowanie hybrydowego regionu V łańcucha L (i) Wytworzenie przeciwciała hybrydowego FR1,2/FR3,4

Skonstruowano DNA dla FR hybrydowego łańcucha L, mający zarówno FR z humanizowanego przeciwciała jak i FR z mysiego (chimerycznego) przeciwciała i badano każdy region pod kątem jego przydatności do humanizacji. W tym etapie, wytworzono hybrydowe przeciwciało zawierające FR1 i FR2 pochodzące z przeciwciała ludzkiego i FR3 i FR4 pochodzące z przeciwciała mysiego, przez wykorzystanie miejsca restrykcyjnego AflIII obecnego w CDR2.

ąg każdego z plazmidów MBC1L(X)/neo i hMBC1L(X)neo trawiono w 100 μΙ roztworu reakcyjnego zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCh, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% BSA i 10 U AflII (Takara Shuzo) w 37°C przez 1 godzinę. Roztwór reakcyjny poddano elektroforezie na 2% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia i zebrano fragmenty DNA o wielkości 6282 bp (określone jako „c1) i 1022 bp (określane jako „c2) z plazmidu MBC1L (λ) oraz fragmenty DNA o wielkości 6282 bp (określone jakoh1) i 1022 bp (określone jako „h2) z plazmidu hMBC1(X)/neo. Te fragmenty DNA zebrano i oczyszczono z żelu stosując GENECLEAN II.

ąg każdego z fragmentów c1 i h1 poddano traktowaniu BAP. Fragment DNA ekstrahowano fenolem i chloroformem, zebrano przez wytrącanie etanolem, rozpuszczono w 10 ąl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

ąl traktowanych BAP c1 i h1 fragmentów DNA zmieszano z 4 ąl fragmentów DNA h2 i c2, w celu ligacji (w 4°C przez noc). Każdy z produktów ligacji wprowadzono do kompetentnych komórek E. coli JM109 otrzymując transformanty. Transformanty hodowano w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 ąg/ml ampicyliny. Z frakcji komórkowej oczyszczono plazmid stosując zestaw QIAprep Spis Plasmid Kit (QIAGEN).

Oczyszczony plazmid trawiono w 20 ą l roztworu reakcyjnego zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCh, 1 mM DTT, i albo 2 U ApaLI (Takara Shuzo Co., Ltd.) albo 8 U BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) i HindIII (Takara Shuzo Co., Ltd.) przez 1 godzinę w 37°C. Jeżeli cl-h2 zligowano prawidłowo to w reakcji trawienia uzyskano fragmenty wielkości 5560/1246/498 bp (dzięki trawieniu ApaLl, oraz fragmenty 7134/269 bp (dzięki trawieniu BamHI/HindIII). Opierając się na tym założeniu identyfikowano żądane plazmidy.

Wektor ekspresyjny kodujący hybrydowy łańcuch L przeciwciała ludzko FR1,2/mysiego FR3,4 oznaczono „h/mMBC1L(X)/neo. Z drugiej strony, można było nie otrzymać klonu h1-c1. Stąd, przeprowadzono rekombinację wektora pUC, a uzyskany rekombinant wklonowano do wektora HEF. Jako matrycę DNA zastosowano plazmid hMBC1LaX/pUC19, który zawierał DNA kodujący region V łańcucha H humanizowanego przeciwciała nie zawierający zastąpień aminokwasowych i plazmid hMBC1LdX/pUC19, który zawierał DNA kodujący region V łańcucha L przeciwciała humanizowanego obejmującego zastąpienia aminokwasowe w pozycji 91 w FR3 (tj. aminokwas nr 87 według definicji Kabata), tyrozyny przez izoleucynę.

ą l każdego z plazmidów MBC1L(X)/pUC19, hMBC1LaX/pUC19 i hMBC1LdX,/pUC19 trawiono w 30 ą l roztworu reakcyjnego zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCh, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% (wag.obj) BSA, 16 U HindIII i 4 U AflII w 37°C przez godzinę. Roztwór reakcyjny poddano elektroforezie przy użyciu 2% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia. Fragment DNA wielkości 215 z plazmidu MBC1L(X)/pUC19 (określany jako „c2) albo fragment DNA wielkości 3218 bp z każdego z plazmidów hMBC1LaX/pUC19 i hMBC1LdX/pUC19MBC (określany tu jako ha1' i hd1'). Te fragmenty DNA zbierano i oczyszczano stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101).

Każdy z fragmentów ha1' i hd1' poddano ligacji z fragmentem c2' i wprowadzono do kompetentnych komórek E. coli JM109 otrzymując transformanty. Transformanty hodowano w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 ąg/ml ampicyliny. Z frakcji komórkowej oczyszczono plazmid stosując zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Powstałe plazmidowe DNA zawierające fragment ha1' oznaczono „m/hMBC1LaX/pUC19 i „m/hMBC1LdX/pUC19 dla fragmentu hd1'.

Każdy z tych plazmidów „m/hMBC1LaX/pUC19 i „m/hMBC1LdX/pUC19 trawiono EcoRI. Fragment DNA wielkości 743 bp poddano elektroforezie przy użyciu 2% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia, a następnie zebrano i oczyszczono z żelu przy użyciu zestawu GENECLEAN II. Uzyskany fragment DNA rozpuszczono w 20 ą l roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

PL 193 575 B1 μΙ fragmentu DNA zmieszano z 1 μΙ wyżej wspomnianego traktowanego BAP wektora HEF w celu ligacji. Produkt ligacji wprowadzono do kompetentnych komórek E. coli JM109 otrzymując transformanty. Transformanty hodowano w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 μg/ml ampicyliny.

Z frakcji komórkowej oczyszczono plazmid stosując zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

Każdy z oczyszczonych plazmidowych DNA trawiono w 20 μl roztworu reakcyjnego zawierającego 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCfe, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U HindIII (Takara Shuzo Co., Ltd.) i 2 U PvuI (Takara Shuzo Co., Ltd.) w 37°C przez godzinę. Na tym etapie, plazmidowy DNA identyfikowano w oparciu o oczekiwanie, że jeżeli fragment DNA został wprowadzony do plazmidu w prawidłowej orientacji, to trawienie powinno dawać fragmenty 5104/2195 bp, podczas gdy fragment DNA jest wprowadzony do plazmidu w odwrotnej orientacji, trawienie da fragmenty 4378/2926 bp. Otrzymane plazmidy były wektorami ekspresyjnymi kodującymi łańcuch L przeciwciała hybrydowego mysio FR1,FR2/ludzkiego FR 3,4, które oznaczono odpowiednio jako wektory ekspresyjne „m/hMBC1LX/neo i „m/hMBC1LdX/neo.

(ii) Wytwarzanie przeciwciał hybrydowych FR1/FR2

Przeciwciało hybrydowe FR1/FR2 wytwarzano w taki sam sposób jak opisany wyżej przy użyciu miejsca restrykcyjnego SnaBI obecnego w CDR1.

μg każdego z plazmidów MBC1L(X)/neo i h/mMBC1L(X)/neo trawiono oddzielnie w 20 μ l roztworu reakcyjnego zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM MgCh, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% BSA i 6U SnaBI (Takara Shuzo Co., Ltd) w 37°C przez 1 godzinę. Produkt reakcji dalej trawiono w 50 μl roztworu reakcyjnego zawierającego 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 0,01%(wag.obj.) BSA i 6 U PvuI w 37°C przez godzinę.

Uzyskane roztwory reakcyjne poddano elektroforezie przy użyciu 1,5% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia, a następnie zebrano i oczyszczono fragmenty DNA wielkości 4955 bp (m1) i 2349 bp (m2) przy użyciu zestawu GENECLEAN II (BIO101). Fragmenty DNA otrzymane z plazmidu MBC1L(X)/neo oznaczono „m1 (4955 bp) i „m2 (2349 bp), zaś fragmenty DNA otrzymane z plazmidu h/mMBC1L(X)/neo oznaczono „hm1 (4955 bp) i „hm2 (2349 bp).

Każdy z fragmentów DNA rozpuszczono w 40 μl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

μl każdego z fragmentów m1 i hm1 poddano ligacji z 4 μl każdego z fragmentów hm2 i m2 odpowiednio, a następnie wprowadzono do kompetentnych komórek E. coli, JM109 otrzymując transformanty. Transformanty hodowano w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 μg/ml ampicyliny. Z frakcji komórkowej oczyszczono plazmid stosując zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

Plazmidowy DNA trawiono w 20 μl roztworu reakcyjnego zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCh, 1 mM DTT i 8U ApaI (Takara Shuzo Co., Ltd.) albo 2 U ApaLI (Takara Shuzo Co., Ltd.) w 37°C przez godzinę.

Jeżeli plazmidy zligowano prawidłowo to w wyniku trawienia ApaI uzyskano fragment 7304 bp lub fragmenty 5560/1246/498 bp w trawieniu ApaL1 dla m1-hm2 i uzyskano fragmenty 6538/766 bp (w trawieniu ApaI) lub fragmenty 3535/2025/1246/498 bp (w trawieniu ApaLI) dla hm1-m2. Opierając się na tym założeniu zidentyfikowano plazmidy. Otrzymano wektor ekspresyjny kodujący łańcuch L przeciwciała hybrydowego ludzko FRl/mysiego FR2,3,4 oznaczono „hmmMBC1L(X)/neo, i wektor ekspresyjny kodujący łańcuch L przeciwciała hybrydowego mysio FR1/ludzkiego FR2/mysiego FR3,4 oznaczono „mhmMBC1L(X)/neo.

(4) Konstruowanie łańcucha L przeciwciała humanizowanego

Łańcuch L humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 wytworzono przez przeszczepienie CDR metodą PCR. Tzn. wytworzono łańcuch L humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 (wersja „a), które zawierało FR1, FR2 i FR3 pochodzące z przeciwciała ludzkiego HSU03868 (Gen-Bank, Deftos M. i in., Scand. J. Immunol. 39:95-103, 1994) i FR4 pochodzący z ludzkiego przeciwciała S25755 (NBRF-PDB) przy użyciu sześciu rodzajów starterów:

Były to następujące startery: startery przeszczepiania CDR, MBC1LGP1 (Id. Sekw. nr 29) i MBC1LGP3 (Id. Sekw. nr 30), oba o sekwencji DNA sensownej, startery przeszczepiania CDR MBC1LGP2 (Id. Sekw. nr 31) i MBC1LGP4 (Id. Sekw. nr 32), oba o sekwencji DNA antysensownej, przy czym wszystkie startery przeszczepiania CDR miały sekwencję komplementarną długości 15-21 bp na obu końcach; startery zewnętrzne MBC1LVS1 (Id. Sekw. nr 33) i MBC1LVR1 (Id. Sekw. nr 34) o homologii ze starterami przeszczepiania CDR, odpowiednio, MBC1LGP1 i MBC1LGP4.

PL 193 575 B1

Startery przeszczepiania CDR MBC1LGP1, MBC1LGP3, MBC1LGP2 i MBC1LGP4 wyizolowano stosując zdenaturowany mocznikiem żel poliakryloamidowy (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) i ekstrahowano z frakcji żelu metodą „crusk-and-soak (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Sambrook i in., Cold Spring Harbor

Laboratory Press, 1989).

nmol każdego ze starterów przeszczepiania CDR wyizolowano 6% denaturowanym żelem poliakryloamidowym w celu otrzymania fragmentu DNA. Z powstałych fragmentów DNA zidentyfikowano przez naświetlenie UV fragmenty o żądanej wielkości na płytce z żelem krzemionkowym, a następnie zebrano metodą „crusk-and-soak. Zebrany fragment DNA rozpuszczono w 20 μΙ roztworu obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

Reakcję PCR przeprowadzono stosując TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.). Roztwór reakcyjny (100 μ Ι) zastosowany w reakcji PCR zawierał 1 μ Ι każdego ze wspomnianych starterów przeszczepiania CDR MBC1LGP1, MBC1LGP3, MBC1LGP2 i MBC1LGP4, 0,25 mM dNTP i 2,5 U TaKaRa Ex Taq w buforze. Przeprowadzono pięć cykli reakcji PCR w warunkach 1 minuta w 94°C, 1 minuta w 55°C i 1 minuta w 72°C. Do produktu reakcji dodano zewnętrzne startery MBC1LVS1 i MCB1LVR1 po 50 pmoli. Stosując tę mieszaninę reakcyjną przeprowadzono dodatkowe 30 cykli reakcji PCR stosując te same warunki. Amplifikowany w ten sposób fragment DNA wyizolowano przez elektroforezę na żelu agarozowym z użyciem 3% agarozy NuSieve GTG (FMC Bio. Products).

Fragment agarozy zawierający fragment DNA wielkości 421 bp wycięto i oczyszczono fragment DNA stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną zastosowano do klonowania fragmentu DNA do plazmidu pUC19, który przygotowano przez trawienie BamHI i HindIII, a następnie określano sekwencję zasad plazmidu. Wytworzony plazmid oznaczono jako „hMBCL/pUC19. Jednakże, w plazmidzie tym stwierdzono, że aminokwas w pozycji 104 (aminokwas numer 96 według Kabata) CDR4 został zastąpiony przez argininę. W celu skorygowania tego aminokwasu do tyrozyny, zaprojektowano starter MBC1LGP10R (Id. Sekw. nr 35). Następnie, przeprowadzono reakcję PCR przy użyciu TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) z buforem. Roztwór reakcyjny (100 μ) zastosowany do reakcji PCR zawierał 0,6 μg plazmidu hMBCL/pUC19 jako matrycę DNA, 50 pmoli każdego ze starterów MBC1LVS1 i MBC1LGP10R, 2,5 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) i 0,25 mM dNTP w buforze, na co nawarstwiono 50 μl oleju mineralnego. Przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl temperaturowy obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 55°C i 1 minutę w 72°C. Amplifikowany w ten sposób fragment DNA wyizolowano przez elektroforezę na 3% żelu agarozowym NuSieve GTG (FMC Bio. Products).

Odcinek żelu zawierający fragment DNA długości 421 bp wycięto i fragment DNA oczyszczono przy użyciu zestawu Geneclean II według instrukcji producenta. Mieszaninę reakcyjną do PCR zastosowano do klonowania fragmentu DNA do plazmidu pUC19, który trawiono stosując BamHI i HindIII.

Sekwencję DNA plazmidu określano stosując M13 Primer M4 i M13 Primer RV. W wyniku, potwierdzono, że plazmid ma prawidłową sekwencję. Następnie plazmid trawiono HindII i BlnI, i wyizolowano fragment DNA wielkości 416 bp przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym. Fragment DNA oczyszczono stosując zestaw GenecleanII (BIO101) według instrukcji producenta, a następnie wprowadzono do plazmidu CX/pUC, który trawiono HindlII i BlnI. Powstały plazmid oznaczono „hMBC1LaX/pUC19. Plazmid ten trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA kodującego humanizowany łańcuch L. Fragment DNA wprowadzono do plazmidu pCOS1, w taki sposób, że kodon początkowy humanizowanego łańcucha L położony był poniżej promotora EF1a.

Otrzymany plazmid oznaczono „hMBC1LaX/pCOS1. Sekwencja DNA (w tym odpowiadająca mu sekwencja aminokwasowa) wersji „a humanizowanego łańcucha L pokazana jest na Id. Sekw. nr 66. Sekwencja aminokwasowa wersji „a pokazana jest na Id. Sekw. nr 47.

Humanizowany łańcuch-L wersji „b przygotowano przy użyciu technik mutagenezy metodą PCR. Wersję „b zaprojektowano w taki sposób, że zastępowała aminokwas w pozycji 43, glicynę (aminokwas nr 43 według definicji Kabata) proliną i aminokwas w pozycji 49, lizynę (aminokwas nr 49 według definicji Kabata) kwasem asparaginowym. Reakcję PCR przeprowadzono z użyciem plazmidu hMBC1LaX/pUC19 jako matrycy i startera mutagenicznego MBC1LGP5R (Id. Sekw. nr 36) oraz startera MBC1LVS1. Fragment DNA trawiono BamHI i HindIII, po czym trawiony fragment klonowano w miejsce BamHI-HindlII pUC19. Po sekwencjonowaniu, plazmidowy DNA trawiono HindIII i AflII, zaś powstały fragment poddano ligacji z plazmidem hMBC1LaX/pUC19, który trawiono HindIII i Aflll.

PL 193 575 B1

Otrzymany plazmid oznaczono „hMBC1LbX/pUC19. Ten plazmidowy DNA trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA obejmującego DNA kodujący humanizowany łańcuch L. Fragment

DNA wprowadzono do plazmidu pCOS1 w taki sposób, że kodon początkowy dla humanizowanego łańcucha L położony był poniżej promotora EF1 α. Otrzymany w ten sposób plazmid oznaczono „hMBC1Lb7pCOS1.

Humanizowany łańcuch w wersji „c wytworzono przy użyciu techniki mutagenicznego wprowadzania metodą PCR. Wersję „c zaprojektowano w taki sposób, że zastępowała aminokwas w pozycji 84, serynę (aminokwas nr 80 według definicji Kabata) proliną. Reakcję PCR przeprowadzono z użyciem plazmidu hMBC1LaX/pUC19 jako matrycy i startera mutagenicznego MBC1LGP6S (Id. Sekw. nr 37) oraz startera M13 Primer RV. Otrzymany fragment DNA trawiono BamHI i HindIII, po czym trawiony fragment klonowano w miejsce BamHI-HindIII pUC19.

Po sekwencjonowaniu, plazmidowy DNA otrzymano przez trawienie BstPI i Aor51HI, a otrzymany fragment DNA wligowano do plazmidu hMBc1LaX/pUC19, który trawiono BstPI i Aor51H1. Otrzymany plazmid oznaczono „hMBC1Lc7pUC19. Ten plazmidowy DNA trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA obejmującego DNA kodujący humanizowany łańcuch L. Fragment DNA wprowadzono do plazmidu pCOS1 w miejscu EcoRI w taki sposób, że kodon początkowy dla humanizowanego łańcucha L położony był poniżej promotora EF1 α. Otrzymany w ten sposób plazmid oznaczono „hMBC1LcX/pCOS1.

Wytworzono również wersje „d, „e i „f humanizowanego łańcucha L stosując technikę wprowadzania mutagenicznego metodą PCR. Każdą z wersji „d, „e i „f zaprojektowano w taki sposób aby zastępowała aminokwas w pozycji 91, tyrozynę (aminokwas nr 87 według definicji Kabata) izoleucyną w wersji, odpowiednio, „a, „b i „c. Dla każdej wersji „d, „e i „f przeprowadzono reakcję PCR z użyciem plazmidu hMBC1LaX/pUC19 (dla wersji d), hMBC1LbX/pCOS1 (dla wersji e) i hMBC1LcX/pCOS1 (dla wersji f) jako matrycy i startera mutagenicznego MBC1LGP11R (Id. Sekw. nr 38) oraz startera M-S1 (Id. Sekw. nr 44). Następnie otrzymany fragment DNA trawiono BamHI i HindIII i subklonowano do pU19, który trawiono BamHI i HindIII. Po sekwencjonowaniu fragment DNA trawiono BamHI i HindIII, po czym trawiony fragment klonowano w miejsce BamHI-HindIII C7pUC19. Otrzymane w ten sposób plazmidy oznaczono, odpowiednio, „hMBC1LdX/pUC19(dla wersji d, „hMBC1LeX/pUC19(dla wersji e) i „hMBC1LfX/pUC19 (dla wersji f). Każdy z plazmidów trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA kodującego humanizowany łańcuch L.

Fragment DNA wprowadzono w miejsce EcoRI plazmidu pCOS1 w taki sposób, że kodon początkowy dla humanizowanego łańcucha L położony był poniżej promotora EF1 α. Otrzymane w ten sposób plazmidy oznaczono, odpowiednio, „hMBC1LdX/pCOS1, „hMBC1LeX/pCOS1 i „hMBC1LfX/pCOS1.

Wytworzono również wersje „g i „h humanizowanego łańcucha stosując technikę wprowadzania mutagenicznego metodą PCR. Każdą z wersji „g i „h zaprojektowano w taki sposób, aby zastępowała aminokwas w pozycji 36, histydynę (aminokwas nr 36 według definicji Kabata) tyrozyną w wersji, odpowiednio, „a i „d. Reakcję PCR przeprowadzono z użyciem plazmidu hMBC1LaX/pUC19 jako matrycy i startera mutagenicznego MBC1LGP9R (Id. Sekw. nr 39) oraz startera M13 Primer RV. Przeprowadzono dodatkową reakcję PCR stosując M13Primer M4 jako starter i plazmid hMBC1LaX/pUC19 jako matrycę. Otrzymany fragment DNA trawiono HindIII i BlnI a następnie klonowano do plazmidu CX/pUC19, który trawiono BamHI i HindIII Używając tego plazmidu jako matrycy przeprowadzono reakcję PCR z użyciem starterów MBC1LGP13R (Id. Sekw. nr 40) i MBC1LVS1. Otrzymany fragment PCR trawiono ApaI i HindIII i wprowadzono do plazmidów hMBC1LaX/pUC19 i hMBC1LdX/pUC19, które trawiono ApaI i HindIII.

Określono sekwencję DNA otrzymanych plazmidów. Plazmidy o potwierdzonej sekwencji oznaczono, odpowiednio, „hMBC1LgX/pUC19 (dla wersji „g) i „hMBC1LhX/pUC19 (dla wersji h). Każdy z tych plazmidów trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA kodującego humanizowany łańcuch L. Fragment DNA wprowadzono w miejsce EcoRI plazmidu pCOS1 w taki sposób, że kodon początkowy dla humanizowanego łańcucha L położony był poniżej promotora EF1 α. Otrzymane w ten sposób plazmidy oznaczono, odpowiednio, „hMBC1 LgX/pCOS1 (dla wersji „g) i „hMBC1LhX/pCOS1 (dla wersjih).

Wytworzono również wersje „i, „j, „k, „l, „m, „n i „o humanizowanego łańcucha L stosując technikę wprowadzania mutagenicznego metodą PCR. Przeprowadzono reakcję PCR z użyciem plazmidu hMBC1LaX/pUC19 jako matrycy i startera mutagenicznego MBC1LGP14S (Id. Sekw. nr 41) oraz startera V1RV(X) (Id. Sekw. nr 43). Powstały fragment trawiono ApaI i BlnI i klonowano do plazmidu hMBC1LgX/pUC19, który trawiono ApaI i BlanI. Określono sekwencję DNA otrzymanych pla28

PL 193 575 B1 zmidów i selekcjonowano klony, do których wprowadzono mutację. Otrzymane plazmidy oznaczono, odpowiednio, „hMBC1LxX/pUC19 (x = i, j, k, l, m, n albo o). Każdy z tych plazmidów trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA kodującego humanizowany łańcuch L. Fragment DNA wprowadzono w miejsce EcoRI plazmidu pCOS1 w taki sposób, że kodon początkowy dla humanizowanego łańcucha L położony był poniżej promotora EF1a. Otrzymane w ten sposób plazmidy oznaczono „hMBC1LxX/pCOS1(x = i, j, k, l, m, n albo o). Sekwencje DNA (w tym odpowiadające sekwencje aminokwasowe) wersji „j, „l, „m i „o pokazano na, odpowiednio, Id. Sekw. nr 67, 68, 69 i 70. Sekwencje aminokwasowe tych wersji pokazano, odpowiednio, na Id. Sekw. nr 48, 49, 50 i 51.

Wersję „p, „q, „r, „s i „t humanizowanego łańcucha L zaprojektowano tak, że są zmodyfikowaną postacią wersji, odpowiednio, „i, „j, „m, „l i „o, w których aminokwas w pozycji 87, tyrozynę, zastąpiono izoleucyną. Wersje te wytworzono przez zastosowanie miejsca restrykcyjnego Aor51MI w FR3 w celu zastąpienia wersji „h wersjami „i, „j, „m, „l i „o, w następujący sposób. Z plazmidu ekspresyjnego hMBC1LxX/pCOS1(x = i, j, m, l albo o) usunięto fragment restrykcyjny Aor51HI (514 bp) zawierający CDR3, część FR3 i cały FR4. Pozostałą część plazmidu ekspresyjnego poddano ligacji z fragmentem restrykcyjnym Aor51HI (514 bp) zawierającym CDR3, część FR3 i cały FR4 w taki sposób, że aminokwas w pozycji 91, tyrozynę (aminokwas 87 w numeracji Kabata) zastąpiono izoleucyną. Oznaczono sekwencje powstałych plazmidów i wyselekcjonowano klony każdej z wersji „i, „j, „m, „l i „o, w których aminokwas 91, tyrozynę(aminokwas 87 w numeracji Kabata) zastąpiono izoleucyną. Zmodyfikowane wersje odpowiadające wersjom „i, j, „m, „l i „o oznaczono, odpowiednio, „p, „q, „s, „r i „t, zaś plazmidy dla tych wersji oznaczono, odpowiednio „hMBC1LxX/pCOS1 (x = p, q, s, r albo t). Sekwencje DNA (w tym odpowiadające im sekwencje aminokwasowe) wersji „q, „r, „s i „t, pokazano, odpowiednio, jako Id. Sekw. nr 71, 72, 73 i 74. Sekwencje aminokwasowe tych wersji pokazano jako, odpowiednio, Id. Sekw. nr 52, 53, 54 i 55.

Plazmid hMBC1LqX/pCOS1 trawiono HindIII i EcoRI, a następnie klonowano do plazmidu pUC19 przez trawienie plazmidu HindIII i EcoRI. Otrzymany w ten sposób plazmid oznaczono „hMBC1LqX/pUC19.

Pozycje zastąpionych aminokwasów w każdej z wersji lumanizowanego łańcucha L pokazano w tabeli 2 poniżej.

Pozycje zastąpionych aminokwasów w liście sekwencji (numeracja aminokwasów według definicji Kabata)

Wersja	36	43	45	47	49	80	87
1	2	3	4	5	6	7	8
a
b		P			D
c						P
d							I
e		P			D		I
f						P	I
g	Y
h	Y					l
i	Y		K
j	Y		K		D
k	Y		K	V
l	Y		K	V	D
m	Y				D
n	Y			V

PL 193 575 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7	8
o	Y			V	D
P	Y		K				I
q	Y		K		D		I
r	Y				D		I
s	Y		K	V	D		I
t	Y			V	D		I

W powyższej tabeli 2 wielkie litery oznaczają następujące aminokwasy: Y: tyrozyna; P: prolina; K: lizyna; V: walina; D: kwas asparaginowy i I: izoleucyna.

Szczep E. coli zawierający plazmid hMBC1HcDNA/pUC19 i szczep E. coli zawierający plazmid hMBC1LqX/pUC19 oznaczono „Escherichia coli JM109 (hMBC1HcDNA/pUC19) i „Escherichia coli JM109 (hMBC1LqX/pUC19) i zdeponowano na zasadach Traktatu Budapeszteńskiego 15 sierpnia, 1996, w National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency for Industrial Science and Technology, Japonia (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia), pod numerem dostępu FERM BP-5629 dla Escherichia coli JM109 (hMBC1HcDNA/pUC19) i FERM BP-5630 dla Escherichia coli JM109 (hMBC1LqX/pUC19) .

(5) Transfekcja do komórek COS-7

W celu określenia aktywności wiązania antygenu i aktywności neutralizacyjnej przeciwciała hybrydowego i humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 opisane wyżej plazmidy ekspresyjne poddawano przemijającej ekspresji w komórkach COS-7. W celu przemijającej ekspresji łańcucha L przeciwciała hybrydowego, każdą z poniższych kombinacji plazmidów ko-transfekowano do komórek COS-7 przez elektroporację stosując urządzenie Gene Pulser (Bio Rad):

hMBC1 HcDNA/pCOS1 i h/mMBC1 L(X)/neo; hMBC1 HcDNA/pCOS1 i m/hMBC1 LaX/neo; hMBC1 HcDNA/pCOS1 i m/hMBC1 LdX,/neo; hMBC1 LaX/neo; hMBC1 HcDNA/pCOS1 i hmmMBC1L(X)/neo; i hMBC1HcDNA/pCOS1 i mhmMBC1(X)/neo. W tym celu, do 0,8 ml zawiesiny komórek, w której komórki COS-7 zawieszono w PBS(-) w gęstości 1x10⁷ komórek/ml, dodano 10 μg każdej z kombinacji plazmidowych DNA. Powstały roztwór poddano pulsowi przy napięciu 1500 V i pojemności 25 μ F powodując elektroporację. Po 10 minutach regeneracji w temperaturze pokojowej komórki zawieszono w pożywce DMEM zawierającej 2% surowicę płodową cielęcą Ultra Low IgG (Gibco), a następnie hodowano stosując 10 cm szalki w inkubatorze CO2. Po hodowli przez 72 godziny, supernatant hodowlany zebrano i odwirowano w celu usunięcia resztek komórkowych i dostarczono jako próbkę do testu ELISA.

W celu przemijającej ekspresji humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1, kombinację plazmidów hMBCIHcDNA/pCOS1 albo hMBC1LxX/pCOS1 (x = a - t) transfekowano do komórek COS-7 stosując urządzenie Gene Pulser (Bio Rad) w taki sam sposób jak opisany wyżej dla przeciwciała hybrydowego. Otrzymany supernatant hodowlany dostarczono jako próbkę do testu ELISA.

Oczyszczanie przeciwciał chimerycznych z nadsączu hodowlanego komórek COS-7 przeprowadzono przy użyciu zestawu Affigel Protein A MAPSII(Bio Rad) według instrukcji producenta.

(6) ELISA (i) Określenie stężenia przeciwciał

Płytkę ELISA do oznaczania stężenia przeciwciał przygotowano w następujący sposób. Studzienki płytki 96-studzienkowej do ELISA (Maxisorp, NUNC) pokryto 100 μ l roztworu zawierającego kozie przeciwciało przeciwko ludzkim IgG (TAGO) przygotowanym w buforze do pokrywania (0,1 M NaHCO3, 0,02 NaN₃) w stężeniu 1 μg/ml, a następnie blokowano 200 μl buforu do rozcieńczania (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCh, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN3, 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA); pH 7,2). Do każdej ze studzienek dodano stopniowe rozcieńczenia supernatantu hodowlanego komórek COS-7, w którym ulegały ekspresji przeciwciała hybrydowe i humanizowane albo oczyszczone przeciwciała hybrydowe i humanizowane. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez godzinę i płukaniu PBS-Tween 20, do każdej ze studzienek dodano 100 μl roztworu koziego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną (TAGO). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez godzinę i płukaniu PBS-Tween 20, do każdej ze studzienek dodano 1 mg/ml roztworu substratu („Sigma 104, kwas p-nitrofenylofosforowy, Sigma). W każdej studzience mierzono absor30

PL 193 575 B1 bancję roztworu przy długości fali równej 405 nm stosując Microplate Reader (Bio Rad). Jako standard stosowano oczyszczane Hu IgG1X (The Binding Site).

(ii) Określanie zdolności wiązania antygenu

Płytkę ELISA do oznaczania wiązania przeciwciał przygotowano w następujący sposób. Każdą ze studzienek płytki 96-studzienkowej (Maxisorp, NUNC) pokryto 100 ąl roztworu obejmującego ludzki PTHrP (1-34) (Peptide Research Institute) przygotowanego w buforze pokrywającym o stężeniu 1 ąg/ml, a następnie zablokowano 200 ą l buforu do rozcieńczania. Do każdej ze studzienek dodano stopniowe rozcieńczenia supernatantu hodowlanego komorek COS-7, w których wyrażano przeciwciała hybrydowe i humanizowane albo oczyszczone przeciwciała hybrydowe (chimeryczne) i humanizowane. Po inkubacji w temperaturze pokojowej i płukaniu PBS-Tween 20, do każdej ze studzienek dodano 100 ąl roztworu koziego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną (TAGO). Po inkubacji w temperaturze pokojowej i płukaniu PBS-Tween 20 do każdej ze studzienek dodano 1 mg/ml roztworu substratu („Sigma 104, kwas p-nitrofenylofosforowy, Sigma). Mierzono absorbancję roztworu przy długości fali równej 405 nm stosując Microplate Reader (Bio Rad).

(7) Potwierdzenie aktywności (i) Badanie humanizowanego łańcucha H

Stwierdzono, że przeciwciało obejmujące wersję „a humanizowanego łańcucha H i chimeryczny łańcuch L wykazuje ten sam poziom aktywności wiązania PTHrP co przeciwciało chimeryczne (patrz, fig. 6). Wynik ten sugeruje, że humanizacja regionu V łańcucha H została osiągnięta satysfakcjonująco dzięki wersji „a. Stąd, wersję „a humanizowanego łańcucha H dostarczono jako łańcuch H przeciwciała humanizowanego w następującym doświadczeniu.

(ii) Aktywność przeciwciała hybrydowego (ii-a) Przeciwciało hybrydowe FR1,2/FR3,4

Gdy łańcuchem L był h/mMBC1Ld(X), przeciwciało nie wykazywało aktywności wiązania antygenu. Jednakże, gdy łańcuchem L przeciwciała hybrydowego był m/hMBC1LaX, albo m/hMBC1LdX, przeciwciało wykazywało ten sam poziom aktywności wiązania antygenu co przeciwciało chimeryczne #23-57-137-1 (fig. 7). Wyniki te wskazują, że nie ma problemu odnośnie FR3 i FR4 ale istnieje(ą) reszta(y) aminokwasowa(e), którą(e) należy zastąpić w FR1 i FR2 przy wytwarzaniu humanizowanego przeciwciała.

(ii-b) Przeciwciało hybrydowe FR1/FR2

Gdy łańcuchem L przeciwciała był mhmMBC1L(X), przeciwciało nie wykazywało aktywności wiązania antygenu. Jednakże, gdy łańcuchem L przeciwciała hybrydowego był hmmMBC1L (λ), przeciwciało wykazywało ten sam poziom aktywności wiązania antygenu co przeciwciało chimeryczne #23-57-137-1 (fig. 8). Wyniki te sugerują, że nie ma problemu odnośnie FR1, ale istnieje reszta (reszty) aminokwasowe, które należy zastąpić w FR2 przy wytwarzaniu przeciwciała humanizowanego.

(iii) Aktywność przeciwciała humanizowanego

Przeciwciało humanizowane, w którym jako łańcuch L zastosowano wersje od „a do „t badano na aktywność wiązania antygenu. W wyniku stwierdzono, że przeciwciała humanizowane z łańcuchami L wersji „j, „l, „m, „o, „q, „r, „s i „t wykazywały ten sam poziom aktywności wiązania PTHrP co przeciwciało chimeryczne (fig. od 9 do 12) (8) Ustalenie transformowanej linii komórkowej CHO zdolnej do stabilnej produkcji przeciwciała

W celu ustalenia linii komórkowej zdolnej do stabilnego wytwarzania humanizowanych przeciwciał, każdy opisany wyżej plazmid ekspresyjny wprowadzono do komórek CHO (DXB11).

Ustalenie linii komórkowej zdolnej do stabilnego wytwarzania humanizowanego przeciwciała przeprowadzono przy użyciu każdej z następujących kombinacji plazmidów jako wektorów ekspresyjnych dla komórek CHO: hMBC1HcDNA/pCHO1 i hMBC1 LmX/pCOS1; hMBC1HcDNA/pCHO1 i hMBC1LqX/pCOS1; i hMBC1HcDNA/pCHO1 i hMBC1LrX/pCOS1. Te kombinacje plazmidów kotransfekowano pojedynczo do komórek CHO metodą elektroporacji stosując Gene Pulser (Bio Rad). Każdy z wektorów ekspresyjnych cięto enzymem restrykcyjnym PvuI w celu otrzymania liniowego DNA. Powstały DNA zbierano przez ekstrakcję fenolem i chloroformem, a następnie wytrącano etanolem. Wytworzone w ten sposób plazmidy ekspresyjne poddano elektroporacji. 10 ąg każdego z plazmidowych DNA dodano do 0,8 ml zawiesiny komórek zawierającej komórki CHO w PBS(-) w gęstości 1x10⁷ komórek/ml.

Powstałą mieszaninę poddano pulsowi o napięciu 1500 V i pojemności 25 μ F. Po dziesięciu minutach w temperaturze pokojowej komórki zawieszono w pożywce MEM-α (Gibco) z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (Gibco). Powstałą zawiesinę hodowano w płytkach 96-studzienkowych

PL 193 575 B1 (Falcon) w inkubatorze CO2. Następnego dnia po rozpoczęciu hodowli, pożywkę zastąpiono pożywką wybiórczą (pożywka MEM z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (Gibco) i 500 ng/ml genetycyny (siarczan G418, Gibco) bez rybonukleozydów albo dezoksyrybonukleozydow. Z pożywki hodowlanej wybierano komórki, do których wprowadzono gen przeciwciała. Pożywkę hodowlaną zastąpiono świeżą. Po dwóch tygodniach po zastąpieniu pożywki komórki obserwowano pod mikroskopem. Gdy zaobserwowano wzrost korzystnych komórek komórki badano na ilość wytwarzanych przeciwciał w teście ELISA. Wśród komórek zebrano wybiórczo te, które wytwarzały większe ilości przeciwciał.

Skalowanie w górę hodowli linii komórkowych stabilnie produkujących przeciwciała przeprowadzono w butelkach obrotowych stosując pożywkę MEM bez rybonukleozydów i deoksyrybonukleotydów z dodatkiem 2% płodowej surowicy cielęcej Ultra Low IgGl. Każdego trzeciego i czwartego dnia hodowli, zbierano supernatant hodowlany i filtrowano stosując 0,2 ąm filtr (Millipore) w celu usunięcia resztek komórkowych. Następnie, przeprowadzono oczyszczanie przeciwciał humanizowanych z supernatantu hodowli komórek CHO przy użyciu kolumny Poros Protein A Column (PerSeptive Biosystems) na ConSep LC100 (Millipore) według instrukcji producenta. Humanizowane przeciwciała dostarczono jako próbki do określenia aktywności neutralizującej oraz do badania działania farmakologicznego nahiperkalcemicznym modelu zwierzęcym. Stężenie i aktywność wiązania oczyszczonych przeciwciał humanizowanych przeciwko antygenowi określono tym samym układem ELISA.

Przykład Referencyjny 5

Określanie aktywności neutralizującej

Określenie aktywności neutralizującej przeciwciała mysiego, przeciwciała chimerycznego i przeciwciała humanizowanego przeprowadzono przy użyciu komórek linii szpiczaka szczurzego ROS17/2.8-5. Komórki ROS17/2.8-5 hodowano w pożywce Ham'a F-12 (Gibco) z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (Gibco) w inkubatorze CO2. Każdą ze studzienek płytki 96-studzienkowej zaszczepiono komórkami ROS17/2.8-5 w gęstości 10⁴ komórek/100 ąl/studzienkę i hodowano przez 1 dzień. Po zakończeniu hodowli poożywkę hodowlaną zastąpiono pożywką Ham'a F-12 (Gibco) z dodatkiem 4 mM hydrokortyzonu i 10% surowicy płodowej cielęcej. Po hodowaniu przez 3 do 4 dni, komórki płukano 260 μ l pożywki Ham'a F-12 (Gibco), a następnie dodano 80 μ l pożywki Ham'a F-12 z dodatkiem 1 mM izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX, Sigma), 10% surowicy płodowej cielęcej i 10 mM HEPES. Powstałą mieszaninę inkubowano w 37°C przez 30 minut.

Przeciwciało mysie, przeciwciało chimeryczne i przeciwciało humanizowane badane na aktywność neutralizującą uprzednio rozcieńczono w następujących grupach: [10 ąg/ml, 3,3 ąg/ml, 1,1 ąg/ml i 0,37 ąg/ml], [10 ąg/ml, 2 ąg/ml, 0,5 ąg/ml i 0,01 ąg/ml] oraz [10 ąg/ml, 5 ąg/ml, 1,25 ąg/ml, 0,63 ąg/ml i 0,31 pg/ml]. Każdą z rozcieńczonych próbek przeciwciała zmieszano z równoważną objętością 4 ng/ml PTHrP (1-34). 80 ą l powstałego roztworu dodano do każdej ze studzienek. Stężenie końcowe każdego z przeciwciał stało się czwartą częścią stężenia powyższego przeciwciała, zaś stężenie PTHrP (1-34) wyniosło 1 ng/ml.Po 10 minutowym traktowaniu w temperaturze pokojowej, usunięto supernatant hodowlany, zaś pozostałość płukano PBS trzykrotnie. Następnie z komórek ekstrahowano cAMP przy użyciu 10 ąl 0,3% HCL-95% etanolu, i odparowano przy użyciu urządzenia „water jet aspirator w celu usunięcia HCL-etanolu. Pozostałość rozpuszczono w 120 ąl buforu EIA dołączonego do zestawu cAMP EIA (Cayman Chemical's) w celu ekstrahowania cAMP. Poziom cAMP oznaczano przy użyciu zestawu cAMP EIA Kit (Cayman Chemicals) według instrukcji producenta. Stwierdzono, że wśród przeciwciał humanizowanych wykazujących ten sam poziom aktywności wiązania antygenu co przeciwciało chimeryczne, te, które posiadają wersje łańcucha L „q, „r, „s i „t w których tyrozynę w pozycji 91 zastąpiono izoleucyną, wykazywały aktywność neutralizującą najbliższą z aktywnością przeciwciała chimerycznego, a zwłaszcza te o wersji łańcucha L „q wykazywały najsilniejszą aktywność neutralizującą (fig. 13 do 15).

Przydatność przemysłowa

Jak opisano powyżej, w nawiązaniu do niniejszego wynalazku, dostarczono czynnika terapeutycznego do leczenia kacheksji obejmującego jako substancję aktywną substancję zdolną do hamowania wiązania pomiędzy PTHrP i receptorem.

W testach skuteczności farmakologicznej wykorzystujących zwierzęcy model kacheksji taka substancja zapobiega utracie wagi i przedłuża czas przeżycia w porównaniu z kontrolą. Tak więc, substancja jest przydatna do leczenia kacheksji.

PL 193 575 B1

LISTA SEKWENCJI (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:

AAATAGCCCT TGACCAGGCA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2:

CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA

PL 193 575 Β1 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3:

GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

{A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4:

GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5:

GTTTTCCCAG TCACGAC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

PL 193 575 B1 (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA/' (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6:

CAGGAAACAG CTATGAC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C> NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7:

GTCTAAGCTT CCACCATGAA ACTTCGGGCT C (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8:

TGTTGGATCC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

PL 193 575 Β1 (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9:

GTCTGAATTC AAGCTTCCAC CATGGGGTTT GGGCTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) .OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10:

TTTCCCGGGC CCTTGGTGGA GGCTGAGGAG ACGGTGACCA G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 109 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 11:

GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACGGTC ACCCTGTTCC CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 110 par zasad

PL 193 575 B1 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 12:

GGTTTGGTGG TCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC

ACAGCTCCOG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TCGCCTTCTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 98 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 13:

GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCCAAACAG AGCAACAACA AGTACGGGGC CAGCAGCTAC

CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 106 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 193 575 Β1 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (Xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 14:

TGTTGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT

CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 43 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 15:

GTCTGAATTA AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC (2). INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEFCWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 16:

TGTTGAATTC TTACTATGAA

PL 193 575 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (ci) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 17:

CAACAAGTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 18:

GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (ci) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SERW. NR: 19:

GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC

PL193 575 Β1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 20:

TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 21:

GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 48 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 22:

PL 193 575 Β1

TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:23:

(i') CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 128 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 23:

GTCTAAGCrr CCACCATGGG GTTTGGGCTG AGCTGGGTn TCCTCGTTGC TCTTTTAAGA GGTGTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGGTGGAG TCTGGGGGAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG

TCCCTGAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 125 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 24:

ACCATTACTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGATTCACC

ATCTCCAGAG ACAATTCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAGAGCTGAG

GACAC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:25:

PL 193 575 Β1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 132 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 25:

CTACCACCAC TACTAATGGT TGCCACCCAC TCCAGCCCCT TGCCTGGAGC CTGGCGGACC

CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC

CTCCCAGGCT GG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 110 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 26:

TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC

ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:27:

PL 193 575 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 27:

GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 28:

TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 133 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 29:

ACAAAGCTTC CACCATGGCC TCGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG

GTTCTTTCTC CCAGCTTGTG CTGACTCAAT CGCCCTCTGC CTCTGCCTCC CTGGGAGCCT

CGGTCAAGCT CAC

PL 193 575 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 30:

AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGGTGATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT

CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TGAGGATGAG GCTGACTA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 128 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 31:

CTGTGGCTTC CATCTTGCTT AAGTTTCATC AAGTACCGAG GGCCCTTCTC TGGCTGCTGC

TGATGCCATT CAATGGTGTA CGTACTGTGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGCTTGACC

GAGGCTCC

PL 193 575 Β1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 114 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 32:

CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A)	DŁUGOŚĆ: 17 par zasad
(B)	TYP: kwas nukleinowy
(C)	NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D)	TOPOLOGIA: liniowa
RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

(A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 33:

ACAAAGCTTC CACCATG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

PL193 575 Β1 (A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:34:

CTTGGATCCG GGCTGACCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 75 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: 1iniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 35:

CTTGGATCCG GCCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA

TTGTTCCTTA ATTGT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:36:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 43 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA

PL 193 575 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 36:

AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGCTTCT CTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 37:

ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:38:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 111 par zasad {B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 38:

CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA

TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATCCT C (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:39:

(i) CHARAKTERYSTYKĄ SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

PL 193 575 Β1 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 39:

CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:40:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:40:

CGAGGGCCCT TCTCTGGCTG CTGCTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:41:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:41:

GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:42:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad

PL 193 575 B1 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: poj edyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:42:

CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:43:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A)	DŁUGOŚĆ:	18 par zasad
(B)	TYP: kwas	nukleinowy
(C)	NICIOWOŚĆ	: pojedyncza
(D)	TOPOLOGIA	: liniowa
RODZAJ CZĄSTECZKI:	inny kwas nukleinowy

(A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 43:

GGCTTGGAGC TCCTCAGA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:44:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 44:

GACAGTGGTT CAAAGTTTTT

PL 193 575 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 45:

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys

Tyr V^1 Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg

PL 193 575 Β1

65

70

75

Tyr

Leu

Ser

Ile

Ser

Asn

Ile

Gin

Pro

Glu

Asp

Glu

Ala

Met

Tyr

80

85

90

Ile

Cys

Gly

Val

Gly

Asp

Thr

Ile

Lys

Glu

Gin

Phe

Val

Tyr

Val

95

100

105

Phe

Gly

Thr

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

Gin

Pro

110

115

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:46 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 46:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly

10 15

Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu

40 45

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr

55 60

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

PL 193 575 Β1

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

Thr Ala Met Phe Tyr Cys

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

110

			70					75
Gln	Met	Ser	Ser	Leu	Lys	Ser	Glu	Asp
			85					90
Ala	Arg	Gln	Thr	Thr	Met	Thr	Tyr	Phe
			100					105
Thr	Leu	Val	Thr	Val	Ser	Ala
			115

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:47:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 116 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 47:

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg

40 45

Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

PL 193 575 Β1

70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

110 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:48 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 48:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys

40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

PL 193 575 Β1

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser

Tyr Cys Gly Val Gly Asp

Phe Gly Gly Gly Thr Lys

110

			70					75
Leu	Gln	Ser	Glu	Asp	Glu	Ala	Asp	Tyr
			85					90
Thr	Ile	Lys	Glu	Gln	Phe	Val	Tyr	Val
			100					105
Leu	Thr	Val	Leu	Gly	Gln	Pro
			115

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:49:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 49:

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys

40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

PL 193 575 B1

70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val

100 105 ^Phe Gly ^Gl^y Gl^y Thr ^Lys ^Leu Thr ^Val ^Leu ^Gl^y Gln Pro

110 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:50 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 50:

Gln

Leu

Val

Leu

Th·

Gln

Ser

Pro

Ser

Ala

Ser

Ala

Ser

Leu

Gly

1

5

10

15

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Thr

Cys

Thr

Leu

Ser

Gln

His

Ser

Thr

20

25

30

Tyr

Thr

He

Glu

Trp

Tyr

Gln

Pro

Glu

Lys

Gly

Pro

Arg

35

40

45

Tyr

Leu

Met

Asp

Leu

Lys

Gln

Asp

Gly

Ser

His

Ser

Thr

Gly

Asp

50

55

60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

PL 193 575 B1

70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr ^Val ^Leu ^Gly ^Gln Pro

110 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:51:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (ci) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 51:

Gln Leu Val Leu Tr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lls Leu Thr Cys Thr Llu Ser Ser Gln His Ser Thr

25 30

Tyr Tr Ile Glu Trp Tyr ^Gln Wn Gln ft-o Glu ^Lys Wy Pro Arg

40 45

Tyr Val Met Asp Llu Lys Gln Asp Wy Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Aap AAg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

PL 193 575 Β1

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:52 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 52:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys

40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

PL 193 575 Β1 .

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

110

		70					75
Gin	Ser	Glu	Asp	Glu	Ala	Asp	Tyr
		85					90
Ile	Lys	Glu	Gin	Phe	Val	Tyr	Val
		100					105
Thr	Val	Leu	Gly	Gin	Pro
		115

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:53:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 53:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg

40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

PL 193 575 B1

70 75

Tyr

Leu

Thir

Ile

Ser

Leu

Gin

Ser

Glu

Asp

Glu

Ala

Asp

Tyr

80

85

90

He

Cys

Gly

Yal

Gly

Asp

Thr

Ile

Lys

Glu

Gin

Phe

Val

Tyr

Val

95

100

105

Phe

Gly

^Thr

Lys

Leu

Thr

Val

^Leu

Gly

Gin

Pro

110 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:54 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 54:

Gin Leu

Vvl

Leu

•Ππ-

Gin

^Ser

Pro

Ser

Ala

Ser^-

Ala

Ser

Leu

Gly

1

5

10

15

Ala Ser

Val

Lys

Leu

Tlu'

Cys

Thr

Leu

Ser

Gin

His

Ser

Thr

20

25

30

Tyr Thr

Ile

Glu

Trp

Tyr

Gin

Pro

Glu

Lys

Gly

Pro

^Lys

35

40

45

Tyr Val

Met

Asp

Leu

Lys

Gin

Asp

Gly

Ser

His

Ser

Thr

Gly

Asp

50

55

60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

PL 193 575 B1

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

He Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Th]- Val Leu Gly Gin Pro

110 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:55:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 55:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

55 30

Tyr Thr He ^Glu Tr^p Tyr (lin Gin ^Gln Rro ^Glu Lys dy Rro Arg

40 55

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 00 ^Gly He Rro As^p Arg Rie Ser ^Gly Ser Ser Ser Gly Ala ^Glu Arg

PL 193 575 B1

70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 00

He Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Th- Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

110 118 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:56 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 56:

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly

10 15

A-g Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

40 45

Glu Trp ^Val Ala ^Thr He ^Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr

55 60 ^Pro Asp Ser ^Val ^Lys Gly Ar^{g Ph}e Thr He Ser Arg As^p Asn Ser

PL 193 575 Β1

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gin

Thr

Met

Thr

Tyr

Phe

95

100

105

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:57:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 57:

ATG

AAC TTC

GGG

CTC

AGC

TTG

ATT

TTC

CTT

GCC

CTC

ATT

TTA

AAA

Met

Asn Phe

Gly

Leu

Ser

Leu

He

Phe

Leu

Ala

Leu

Ile

Leu

Lys

-15

-10

-5

GGT

GTC CAG

TGT

GAG

GTG

CAA

CTG

GTG

GAG

TCT

GGG

GGA

GAC

TTA

Gly

Val Gin

Cys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Asp

Leu

1

5

10

GTG

AAG CCT

GGA

GGG

TCC

CTG

AAA

CTC

TCC

TGT

GCA

GCC

TCT

GGA

Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

PL 193 575 B1

15

22

25

TTC

ACT

TTC

ATT

AAC

TTA

GAA

ATC

TCT

TCC

ATT

CGC

CAG

AAT

CCC

180

Phr

Tr

Pht

Ser

TTr

Wy

Met

Ser*

Trp

Ile

Alg

Gln

Thr

Pro

30

33

40

Ad

KAT

CTT

Ad

TCT

gtc;

(AA

ACC

ATT

AGT

(AAT

CCT

AAA

225

AS^p

Lys

Arg

Leu

Hu

Tp

Val

Ala

Thr

Ur

Ser

Gljr

Wy

Ser

45

55

TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270

Tyr Thr Tyr Tyir Pro Aap Ser Val Lys Aly Arg Phe Tr Ile Ser

65 70

AAA TAC AAT TCC AAA Ad AAC CTA TAC CTT CAA ATC ACTC AAA CCG 315

Arg Asp Asn da Lyp Aap TTr Leu Tyr Leu Tin Mer Ser Ser Lru

80 85

TCT AAA AAC ACA GTC AAT ΊΤΓ TAC TAT ACA AGA CAG ACT AAT 56^0

Lyp Ser Alu Asp Thr da Met Phe Tyr Cys da AA-g Gln Tr Thr

95 100

ATA ACT TAC 'TTT ACT Td TCA· GTC CAA AAA ACT CTG GTC ACT GAT ‘105

Met Tr Tyr Phr da Ttt Τρ Gly Aln Aly Thr Leu Val Thr Val

105 110 115

TCC ACA 411

Ser Ala (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 50 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 58:

PL 193 575 Β1

ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG GTT HC CTC CTT GCT CTT TTA AGA 45

Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg

-15 -10 -5

GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG 90

Gly Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val

5 10

GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135

Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro

35 40

GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser

50 55

TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270

Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

65 70

AGA GAC AAT TOC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG 315

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu

80 85

AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT 360

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr ⁹⁰ 95 100

ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTC GTC ACC GTC 405

Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val

105 lio ns

TCC TCA 411

Ser Ser

PL 193 575 Β1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:59:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 59:

Lys Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:60:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 60:

Ser Ala Ser Asn Tyr Thr (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:61:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 61:

Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:62:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 193 575 B1 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 62:

Pro Tyr Trp Met Gin (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:63:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 63:

Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr

Ser Gin Lys Phe Lys Gly (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:64:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 64:

Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp

Tyr

PL 193 575 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:65 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A)	DŁUGOŚĆ: 411 par zasad
(B)	TYP: kwas nukleinowy
(C)	NICIOWOŚĆ: podwójna
(D)	TOPOLOGIA: liniowa
RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA

(ii) (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 65:

ATG GCC TCTlACT CCT CTC TTC TTC TTC CTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Tit> Ttc Pro Leu Phe Phe Phe Phe; Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

Ggt tct CTC TCC CMCTT GGT CTC ATA CAG TCA T(A TCA (TAC TCT 90

Gly Ser Ph(? Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser

5 10

CTC TCC CTGGGA ACCTCA GGA ATT (CTC AAC TTG AAC CTC AG^ AGT 135

Phr Ser Leu Gly Ala Ser ACa Lys Leu Thr Ccy TTr Leu Ser Ser

PL 193 575 B1

CAG

CAC

AGT

ACG

TAC

ACC

ATT

GAA

TO

TAT

CAG

CAA

CAG

CCA

CTC

180

Gln

His

Ser

Thr

Tyr

Thr

Ile

Glu

Trp

Tyr

Gln

Wn

Pro

Lru

30

35

40

AAG

CCT

AAG

TAT

GTG

ATG

GAT

CTT

AAG

CAA

GAT

GGA

AGC

CAC

225

Lys

Pro

Lys

Tyr

Val

Met

Asp

Lru

Lys

Gln

Asp

Gly

Ser

His

45

50

55

AGC

ACA

GGT

GAT

GGG

ATT

CCT

GAT

CGC

TTC

TCT

GGA

TCC

AGC

TCT

270

Ser

Thr

Gly

Asp

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phr

Ser

Gly

Ser

60

65

70

GGT

GCT

GAT

CGC

TAC

CCT

AGG

AAT

TCC

AAC

ATC

CAG

CCA

GM

GAT

315

Gly

Ala

Asp

Arg

Tyr

Leu

Ser

Ile

S^r·

Asn

Ue

Wn

Pro

Glu

Asp

75

80

85

GAA

GCA

ATG

TAC

ATC

TGT

GGG

GTC

(GT

GAT

ACA

ATT

AAG

GAA

CM

360

Glu

Ala

Met

Tyr

Ue

Cyy

Wy

Vvl

Gly

Asp

Thr

Ur

Lys

Glu

Gln

90

95

100

TTT

GTG

TAT

GTT

TTC

GGG

ACC

AAG

GTC

ACT

GTC

CTA

GOT

405

Phe

Val

Tyir

Val

Phe

Gly

Wy

Thr

Lys

Val

Th·

Val

^Lru

Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:66:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 405 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 66:

PL 193 575 Β1

ATG GCC TGG ACT CCT CTC HC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AAA CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin

PL 193 575 B1

95 100

ITT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGT 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:67:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 67:

ATG GCC TGGACT CCT CTC T^C TTC TTC ΊΤΓ GCT CTT CAT TTGC TCA 45

Met Ala Tn? Tlu· Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT tct TTT TCC CAG CTT CTG CTG ACT CM TOG CCC TCT^- (GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Tur Gln Ser FPo Ser Ala Ser .5 10

GCC TCC CTG (GGA CGCC TTCG GTC MG CTC ACCC TTGC ACC TIG AGG AGT 135

Ala Ser Leu dy Ala Ser Vvl Lys Leu Tr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGTAAC TAC ACC ATT GM TOG TAT CAG CCA CAG CCA GGG 180

Gln His Ser Thr Tyr Thu Ile du Trp Tyr dn dn dn Pro Glu

PL 193 575 Β1

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin

95 100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gin Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:68 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 68:

PL 193 575 B1

ATG

GCC

TGG

ACT

CCT

CTC

TCT

GCT

CCT

CAT

TGC

TCA

45

Met

Ala

Trp

Thr

Pro

^Leu

Phe

Val

Leu

His

Cys

Ser

-15

-10

-5

GGT

TCT

TTC

TCC

CAG

CCT

GTG

CTG

ACT

CAA

TCG

CCC

TCT

GCC

TCT

90

Gly

^Ser

Phe

^Ser

Gin

Leu

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ala

Ser

1

5

10

GCC

TCC

CTG

GGA

GCC

TCG

GTC

AAG

CTC

ACC

TGC

ACC

CTG

AGT

135

Ala

^Ser

^Leu

Gly

Ala

^Ser

Val

Lys

Leu

Thr

Cys

Thr

Leu

Ser

15

20

25

CAG

CAC

AGT

ACG

TAC

ACC

ATT

GAA

TGG

TAT

CAG

CCA

GAG

180

Gin

His

^Ser

Thr

^Tyr

Thr

Ile

Glu

Trp

^Tyr

Gin

Pro

Glu

30

35

40

AAG

GGC

CCT

AAG

TAC

GTG

ATG

GAT

CTT

AAG

CAA

GAT

GGA

AGC

CAC

225

Lys

Gly

Pro

^Lys

Tyr

Val

Met

Asp

Leu

Lys

Gin

Asp

Gly

Ser

His

45

50

55

AGC

ACA

GGT

GAT

GGG

ATT

CCT

GAT

CGC

TTC

TCA

GGC

TCC

AGC

TCT

270

Ser

Thr

Gly

Asp

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

60

65

70

GGG

GCT

GAG

CGC

TAC

CTC

ACC

ATC

TCC

AGC

CTC

CAG

TCT

GAG

GAT

315

Gly

Ala

Glu

Arg

Tyr

Leu

Thr

He

Ser

Leu

Gin

Ser

Glu

Asp

75

80

85

GAG

GCT

GAC

TAT

TAC

TGT

GGT

GTG

GGT

GAT

ACA

ACT

AAG

GAA

CAA

360

Glu

Ala

Asp

Tyr

^Tyr

^Cys

Gly

Val

Gly

Asp

Thr

Ile

Lys

Glu

Gin

90

95

100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

PL 193 575 Β1

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gin Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:69 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 69:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

PL 193 575 B1

30

35

40

AAG

GGC

CCT

AAG

TAC

ctt;

AACC

GUA

CTT*

AAA

CCA

GUA

(U^/A

AAC

CAC

225

Lys

Gly

Pro

tog

Tyr

Llu

Met

AAp

Leu

LLr

(5Un

AAP

Gly

Ser

His

45

50

55

AGC

ACA

GGT

GGA

GUC

AAT

CCC

GCA

CCC

TTC

TGA

GUC

TCC

AAC

TCJ

270

Ser

Thr

Gly

Asp

GGy

Ile?

Pro

AAp

AAg

PPe

Ser

C^Uyr

Ser

^Ser

60

66

70

GGG

GCT

GAG

CCGC

TAC

CTCC

AAC

AAG

TGC

AAC

CTT

CCA

TCJ

GUA

GCA

315

Gly

Ala

Glu

tog

Tyr

Llu

TGr

He?

Ser

Llu

GUn

Ser

GUu

Asp

75

80

05

GAG

GCT

GAG

TAT

TAC

TCT

(CU

GCG

GUC

GUA

AAC

AAT

MA

GM

CM

360

Glu

Ala

Asp

Tyr

Cyy

GCjy

Val

GUy

AAp

TTr

11(3

Lyy

GUu

Cln

90

99

100

TTT

GTG

TAC

CUG

TTC

OC

GCC

GUC

AAC

AM

CCT

AAC

GTC

CCTA

(CC

405

Phe

Val

Tjt

Val

PPh

GUy

GUi^

GUy

TGr

LLr

Ll?

Thr

Val

Ll?

Uly

105

110

115

CAG

CCC

41

11

Gin

Pro

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:70:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 70:

PL 193 575 B1

ATG

GCC

TGG

ACT

CCT

CTC

TTC

nc

ne

τπ

GTT

CTT

CAT

TG

TCA

45

Mt

^Ala

Tn)

Thr

Pro

Leu

Phe

Val

Leu

His

Cys

Ser

-15

-10

-5

GGT

TCT

TTC

TCC

CAG

cn

GTG

CTG

ACT

CT^

TG

CCC

TCT

GC

TCT

94

Gly

Ser

Phe

Ser

Gin

Leu

Val

Leu

TTir

Gin

Ser

Ho

Ser

Ala

Ser

1

5

14

GAC

TCC

CTG

«GA

GCC

TG

GTC

MG

CTC

ACC

ra

AG

TTG

AGT

135

Ala

^Ser

Leu

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Thr

Cys

TTu·

Leu

Ser

^Ser

15

20

25

CAG

CAC

AGT

ACG

TAC

ACC

ATT

GM

ra

TAT

(TAG

CA

CAG

C^^

(GAG

18Θ

Gin

His

Ser

CTir

Τ3Π-

CTr

Ile

Glu

Trp

Tyr

Gin

Pro

Glu

34

35

44

AAG

GGC

CCT

AG

TAC

GTG

ATG

GAT

ctt

MG

CCAA

GAT

GA

AG

CC^C

225

Lys

Gly

Pro

Mg

Tyr

Val

Mee

Asp

Leu

Lys

Gin

Asp

Gly

Ser

His

45

50

55

AGC

ACA

GGT

GAT

GG

ΑΠ

CCT

GAT

ra

ne

TCA

dGC

T(TC

AttC

TCT

274

Ser

Thr

Gty

Asp

Gly

Ile

Pro

Asp

Mg

Phe

Ser

Gly

Ser

^Ser

64

65

74

GGG

GCT

GAG

TTTT

TAC

CTC

ACC

ATC

tcc:

AGC

(CTC

CAG

TCT

G/AG

GAT

315

Gly

Ala

Glu

fog

Tyr

Leu

Uu·

Ile

Ser

Leu

Gin

Ser

Glu

Asp

75

80

85

GAG

GCT

GAC

TAT

TAC

TGT

(UT

GTG

GT

GAT

AATA

ΑΊΓ

MG

GM

CM

36Q

Glu

Ala

As^a

Tyr

Cys

Gly

Val

Gly

Aap

Thr

Ile

Lys

Glu

Gin

94

9f5

144

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

PL 193 575 Β1

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 71:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu

PL 193 575 B1

35 40

AAG GGC CCT AAG

TAC

CTG

ATG

GAT

CTT

AAG

CAA

GAT

GGA

AGC

CAC

225

Lys Gly Pro Lys

Tyr

Leu

Met

Asp

Leu

Lys

Gin

Asp

Gly

Ser

His

45

50

55

AGC ACA GGT GAT

GGG

ATT

CCT

GAT

CGC

TTC

TCA

GGC

TCC

AGC

TCT

270

Ser Thr Gly Asp

Gly

Tle

Pro

Asp

^Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

60

65

70

GGG GCT GAG CGC

TAC

CTC

ACC

ATC

TCC

AGC

CTC

CAG

TCT

GAG

GAT

315

Gly Ala Glu Arg

Tyr

Leu

Thr

Tle

Ser

Leu

Gin

Ser

Glu

Asp

75

80

85

GAG GCT GAC TAT

ATC

TGT

GGT

GTG

GGT

GAT

ACA

ATT

AAG

GAA

CAA

360

Glu Ala Asp Tyr

Tle

Cys

Gly

Val

Gly

Asp

Thr

Ile

Lys

Glu

Gin

90

95

100

TTT GTG TAC GTG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAA

CTG

ACC

GTC

CTA

GGC

405

Phe Val Tyr Val

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

105

110

115

CAG CCC 411

Gin Pro

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:72 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pod^wójn<

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 72:

PL 193 575 B1

ATG

GCC

TGG

ACT

CCT

CTC

TTC

CTC

TCT

GCT

CCT

CTT

TGC

TCT

45

Met

Ala

Trp

Thr

Pro

Leu

Phe

Val

Leu

His

Cys

^Ser

-15

-10

-5

GGT

TCT

TTC

TCC

CCG

CTT

GTG

CTG

CCT

CAA

TCG

CCC

TCT

GCC

TCT

90

Gly

Ser

Phe

Ser

Gln

Leu

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Tla

Ser

1

5

10

GCC

TCC

CTG

GGA

GCC

TCG

GTC

AAG

CTC

TCC

TGC

TCC

CTG

TGT

135

Ala

Ser

Leu

Gly

Cla

Ser

Val

Lys

Leu

Thr

Cys

Thr

Leu

Ser

15

20

25

CAG

CAC

AGT'

TCC

TTC

TCC

ATT

GAA

TOG

TAT

cag

CAG

C/TG

(CC<

GGT

180

Gln

His

Ser

Thr

Tt

Thr

Ile

Glu

Trp

Tr

Gln

FPo

Glu

30

3i5

40

AAG

GGC

CCT

TTGi

TCC

CTG

ATG

GAT

CIT

^ATG

(CTT

GAT

(GGA

ATG

CAC

225

L^ys

Gly

Pro

tog

Tir

Leu

Met

Asp

Leu

Lys

Gln

Asp

Gly

Ser

His

45

50

55

AGC

ACA

GGT

GGG

ATT

CCT

GAT

α£

TTC

TCA

(GGC

TCC

ATG

TCT¹

270

Ser

Thr

Gly

Ατρ

Gliy

Ile

Asp

tog

Phe

Ser

Gly

Ser

60

65

70

GGG

GCT

GAG

GGG

TCC

CTC

ACC

ATC

TCC

A<£

CTC

CAG

TCT

GGT

315

Gl^y

Ala

G1g

Awg

Tr

Leu

Tlu-

Ile

Ser

Ser·

Leu

Gln

Ser

Ghi

Asp

75

80

85

GAG

GCT

GAG

TAT

ATC

TGT

(GGT

GTG

(GIT

GAT

ACA

ATT

AAG

GGA

CCC

360

^Glu

Ala

Asa

Tyr

Ile

Cys

Gly

Val

GGy

Ατρ

Thr

Ile

Lys

GGu

Gin

90

9f5

100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

PL 193 575 B1

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATC GAT CTT AAG CAA WT GAA ACC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Ταγ Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His

50 55

AGA AAA GGG GGA GGG AAG CCT GAT CAGA GGA TCA GGA TCC A(A TGT 270

Ser Ghr GGy AAp GGy Ile; Pro Asp AAg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GA GAG GGA CAG TAA CTG A<AT ATC ICC AGA CTC CAG ΆΑΓ GAG GGA 315

Gly Ala GGu AAr Tys Llu CTur Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp

80 85

GAG GAG GGA TAA AAC ΕΠ' (AT GTG O^T GAT ACA ATI' AAG GM CAA 360

Glu Ala AAp Ταγ Ile Cas Gly Val GGy Asp Tlhr IUe Lys Glu Gln

95 100

CCG GGG TAA GGG TGC GGA GA GGA ACC MA CTG ATC GTC CTA GGG 405

Phe Val Ταγ Val PPe GGy Gly Gly Άτ Lys Leu Hu· Val Leu Gly

105 110 115

TAG ATA 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:74 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:74:

PL 193 575 Β1

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gły Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:73:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 73:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC HG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu

PL 193 575 B1

ATG

GCC

TGG

ACT

CCT

CTC

TTC

CTC

TCT

GCT

CCT

CAT

TGC

TCA

45

Met

Ala

Ίτρ

Thr

Pro

Leu

Phe

Val

Leu

His

Cys

Ser

15

-10

-5

GGT

TCT

TTC

TCC

CAG

CTT

yGy

CTG

ACT

CAA

TCG

CCC

TCT

GCC

TCT

90

Gly

Ser

Phe

Ser

Gln

Leu

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Ala

Ser

1

5

10

GCC

TCC

CTG

CCA

GCC

TCG

GTC

AAG

CTC

ACC

TGC

ACC

CTC

AGT

135

Ala

Ser

Leu

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Thr

Cys

Thr

Leu

Ser

15

20

25

CAG

CAC

AGT

ACG

TAC

ACC

ACT

GAA

τyc

TAT

CAG

CCA

GAG

180

Gln

His

Ser

Thr

^Tyr

Thr

Tle

^Glu

Trp

Tyr

Gln

dn

Gln

Pro

Glu

30

35

40

AAG

GGC

CCT

AAG

TTA

CTC

ATG

GAT

CIT

MG

CM

GAT

GGA

AdC

C^^

225

Lys

Gly

Pro

tog

Tyr

Val

^Met

Asp

Leu

^Lys

Gln

Asp

Gly

Ser

His

45

50

55

AGC

ACA

GGG

TGA

Gd

ATT

(CT

G/AT

ακ

TTC

TOA

(GG

TCC

Ad

TTC

270

Ser

Thr

Gly

AAP

dy

Ile

Fho

Asp

tog

Phe

Ser

Gly

Ser

60

GE5

70

GGG

GCT

GAG

GCG

TAC

CTC

ACC

ATC

TCC

AdC

crc

CAG

TCT

GGA

315

Gly

Ala

GIg

tog

Tyy

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

CGn

Ser

du

Asp

75

80

85

GAG

GCT

GAC

CAA

AAT

TGT

(£T

GTC

(GT

GAT

AACA

AAT

AAA

GM

CAA

360

Glu

Ala

Asp

Tyr

Ile

Cys

Gly

Val

Gly

Asp

Tir

Ile

Lys

du

Gln

90

9i5

100

TTT GTG TAC CGC TTC (GGC GGA (GG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

PL 193 575 Β1

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:75:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 75:

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile 15 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 25 30

Ile His Thr Ala

Claims

1. Zastosowanieprzeciwciała przeciwko białku pokrewnemu z hormonem przytarczyc (PTHrP) do wctwnrenein Icku ds enosbicgnein lub Iczecein OnzOcOoji ieduOswnecj prece rnOn.

2. ZastooowarłiewaCłuuz entrzl ,z znmieenntym. ż e p rzeciwaiałojest fbanmuntern p rzeciwaiał łn precziw THHrT i/lub jcgo modcfiOownecm frngmcetcm.

3. Zastosowasie waCług penSz. 1 I ub 2, pznmieenn tym, że przeciwaiało ject przeciwaiałem Oumneieownecm lub orecziwzinłcm zOimcrczeecm.

4. ZastosowasiewaCłub zenRZe b, pznmieenntym. że przeciwaiało bomusizewasejent przec ziwzinłcm Oumneieownecm #23-57-137-1.

5. anotooowneic wcdług enotre. 1 lub 2, znamienne tym, żc orecziwzinło jcot typu moeoOloenlecgo.

6. anotooowneic wcdług enotre. 1, znamienne tym, ec orecziwzinło jcot n) nOtcwec w enoobicgneiu lub lczeceiu OnzOcOoji i

b) eic Onmujc werootu OomórcO eowotworowczO OCC-1.