JPH07316195A - 新規なＰＴＨｒＰ関連ペプチド及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ＰＴＨ等の拮抗薬及びカルシウム代謝調節剤と
して有用であり、高カルシウム血症、骨粗鬆症、副甲状
腺機能亢進症、高ＰＴＨ血症に伴う慢性腎不全及び高Ｐ
ＴＨｒＰ血症に伴う骨病変等のカルシウム代謝異常を伴
う病態の治療に効果のある新規なＰＴＨｒＰ関連ペプチ
ドを提供すること。 【構成】ＰＴＨｒＰ活性を有さず、ＰＴＨ又はＰＴＨｒ
Ｐ又はＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰ活性を有するポリペプ
チドの生理学的作用に拮抗する活性を有する新規ポリペ
プチドアミド[desamino-Leu ⁸ ,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)
¹²]hPTHrP(8-34)NH ₂又はその薬理学的に許容される
塩、及び、これを有効成分とするＰＴＨ等の拮抗薬、カ
ルシウム代謝調節剤及び高カルシウム血症、骨粗鬆症、
副甲状腺機能亢進症、高ＰＴＨ血症に伴う慢性腎不全又
は高ＰＴＨｒＰ血症に伴う骨病変の治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高カルシウム血症、骨
粗鬆症及び副甲状腺機能亢進症等に対して効果を示し、
医薬品として有用な新規なＰＴＨｒＰ関連ペプチド及び
そのＰＴＨ等の拮抗薬、カルシウム代謝調節剤としての
用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液中のカルシウム代謝調節因子には主
に副甲状腺ホルモン(Parathyroid Hormone,PTH) 、カル
シトニン、ビタミンD₃等があるが、最近 PTHと類似した
作用を持つペプチド、副甲状腺ホルモン関連ペプチド(P
arathyroid Hormone-related Protein, PTHrP)が発見さ
れ、その構造も明らかとなった〔スバ(Suva)ら、サイエ
ンス(Science) 第237 巻、893(1987)]。ヒトPTHrP （hP
THrP) は141 個のアミノ酸より成るポリペプチドで、そ
のPTH と類似した生物活性、即ち血中カルシウム濃度の
上昇、骨吸収促進、血中リン濃度低下、尿中カルシウム
濃度の低下、尿中cAMPの増加、腎臓でのビタミンD の 1
位水酸化酵素の活性化などを有することが最近報告され
た [ホリウチら、サイエンス(Science) 第238 巻、198
8; ケンプ(Kemp)ら、サイエンス(Science) 第238 巻、1
988] 。

【０００３】PTH のアミノ末端及びカルボキシル末端を
欠くフラグメント[PTH(3-34),PTH(7-34)やその誘導体]
はPTH の作用を抑制することが知られているが、PTHrP
はアミノ末端側の一部の構造が PTHと類似しており、 P
TH同様アミノ末端側の数残基を欠損するフラグメント(P
THrP(3-34)) は PTHの作用を抑制することが報告されて
いる [ラバニ(Rabbani) ら、アメリカ骨代謝学会発表、
1988] 。

【０００４】現在、血液中のカルシウム代謝調節剤とし
ては、カルシトニン関連ペプチドをはじめ様々な薬剤が
あるが、その効果は一過性のものであり有効率も低いと
言われている。これは、PTH あるいはPTHrP のレセプタ
ーを介さない部分でこれらの薬剤が作用している為であ
り、従って、その効果にも限界があると考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は高カルシウム
血症、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進症、高PTH 血症に伴
う慢性腎不全及び高PTHrP 血症に伴う骨病変等のカルシ
ウム代謝異常を伴う病態を治療できる新規なPTHrP 関連
ペプチドを提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、ヒトPTHrP 活性を有さないが、ヒトPTH あるい
はヒトPTHrP が結合する骨芽細胞上のレセプターに結合
し、それによってヒトPTH あるいはヒトPTHrP 活性を拮
抗する活性を有する新規なポリペプチドアミドを合成す
ることに成功し、この発明を完成させた。即ち、本発明
は、（１）新規ポリペプチドアミド〔desamino-Leu⁸,As
n¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂又はその薬理学
的に許容される塩、（２）上記（１）記載のポリペプチ
ドアミド又はその薬理学的に許容される塩を有効成分と
するＰＴＨ又はＰＴＨ様活性を有するポリペプチドの拮
抗薬、（３）上記（１）記載のポリペプチドアミド又は
その薬理学的に許容される塩を有効成分とするカルシウ
ム代謝調節剤、（４）上記（１）記載のポリペプチドア
ミド又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする
高カルシウム血症治療剤、（５）上記（１）記載のポリ
ペプチドアミド又はその薬理学的に許容される塩を有効
成分とする骨粗鬆症治療剤、（６）上記（１）記載のポ
リペプチドアミド又はその薬理学的に許容される塩を有
効成分とする副甲状腺機能亢進症治療剤、（７）上記
（１）記載のポリペプチドアミド又はその薬理学的に許
容される塩を有効成分とする高ＰＴＨ血症に伴う慢性腎
不全治療剤、（８）上記（１）記載のポリペプチドアミ
ド又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする高
ＰＴＨｒＰ血症に伴う骨病変治療剤、（９）有効量の上
記（１）記載のポリペプチドアミド又はその薬理学的に
許容される塩及び薬理学上許容される担体からなる医薬
組成物、に関する。

【０００７】本発明のポリペプチドアミド又はその薬理
学的に許容される塩は、ＰＴＨｒＰ活性を有さず、ＰＴ
Ｈ又はＰＴＨｒＰ又はＰＴＨあるいはＰＴＨｒＰ活性を
有するポリペプチドの生理学的作用に拮抗する活性を有
する。従って血清中のＰＴＨ又はＰＴＨｒＰ等の異常
（高値）によるカルシウム代謝異常に起因する各種疾
病、例えば高カルシウム血症、骨粗鬆症、副甲状腺機能
亢進症、慢性腎不全、骨病変の治療に、本発明化合物
（上記ポリペプチドアミド又はその薬理学的に許容され
る塩）は有用である。

【０００８】薬理学的に許容される塩としては、塩酸
塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、酒石酸塩等が挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。

【０００９】上記（２）において、ＰＴＨ様活性を有す
るポリペプチドととしては、ＰＴＨｒＰやＰＴＨあるい
はＰＴＨｒＰ活性を有する各種ポリペプチドが挙げられ
る。

【００１０】上記（６）において、副甲状腺機能亢進症
の結果として生じる疾患としては高カルシウム血症、骨
粗鬆症等が挙げられる。

【００１１】本発明の化合物（ポリペプチドアミドまた
は、その薬理学的に許容される塩）は、液相法または、
固相法によるペプチド合成法を適用することにより得る
ことができる。例えば、本発明の化合物は、Applied Bi
osystems社製ペプチド自動合成機 model ４３０Ａを用
いる固相合成により行った。固相担体としてＨＦ処理に
よりペプチドアミドを遊離するｐ−メチルベンズヒドリ
ルアミン樹脂を用い、使用アミノ酸として、α−アミノ
基を Boc基（ｔ−ブトキシカルボニル基）、側鎖官能基
を有するアミノ酸については、全てＨＦ（フッ化水素）
処理により除去可能な保護基を用いて保護したBoc-アミ
ノ酸誘導体を用いた。合成は、Boc-アミノ酸を活性エス
テル法によりＣ端側より順次導入して行い、ペプチド鎖
の延長を行った。なお、Ｎ末端のdesamino-Leuは、ロイ
シンのα−アミノ基を水素に置換した4-メチル吉草酸の
1-ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを反応させて
導入した。

【００１２】こうして、[desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D
-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂ に相当する保護ポリペプチ
ド樹脂1.0gが得られた。得られた保護ポリペプチド樹脂
は、10% アニソール存在下、液体ＨＦ処理により、全保
護基の除去とポリペプチド鎖の樹脂からの切断を行っ
た。ついで、残渣を酢酸エチルで洗浄後、50% 酢酸によ
り抽出し、粗生成物444mg を得た。得られた粗ポリペプ
チドアミドは、50% 酢酸に溶解し、YMC-Pack D-ODS-5カ
ラム（2.0 ×25cm) を用い、0.01N HCl/アセトニトリル
系を溶離溶媒とする直線濃度勾配法による逆相HPLCで精
製した。精製ポリペプチドアミドの収量は53.3mgであっ
た。精製ポリペプチドアミドは、分析用逆相HPLC、アミ
ノ酸組成分析及び FAB質量分析により、その純度を検討
した。溶出カラムとして、YMC-Pack R-ODS-5カラム(0.4
6 ×25cm) を用い、0.01N HCl とCH₃CN の混合比を30分
間で80:20 から60:40 へ変化させる溶離条件において2
2.2分に鋭い単一ピークとして検出した。また、自動ア
ミノ酸分析機(Beckman社製,Model7300)によるアミノ酸
組成分析では、1%フェノール含有6N HClによる酸分解物
のアミノ酸組成値は理論値によく一致した。 FAB質量分
析機(JMX-SX 102 mass spectrometer, JEOL,東京) によ
る分子量測定も計算値に一致した。

【００１３】以上のことより、本発明化合物の構造は前
記の通りであることが決定された。

【００１４】医薬品として使用される場合の製剤化及び
投与方法は従来既知の様々な方法が適応できる。即ち、
投与方法は注射、筋肉内埋め込みなどが可能である。製
剤形態としては製剤化の際には本発明化合物に悪影響を
与えない限り、医薬品に用いられる様々な補助剤、即ち
担体や、必要によりその他の助剤、例えば安定剤、防腐
剤、無痛化剤、乳化剤等と混合して注射剤等として使用
される。

【００１５】製剤において、本発明化合物の含量は製剤
形態により変えることが可能であり、一般には本発明化
合物を0.001 〜10%(重量) 、好ましくは0.01〜1%( 重
量) 含有し、残りは通常医薬用に使用される担体その他
の補助剤から成る。本発明化合物の投与量は症状や投与
方法により異なるが、成人一人一日当たり1 〜100mg 程
度である。

【００１６】

【作用】以下、本発明の作用について具体的に説明す
る。 １. インビトロ PTHrP拮抗作用 ( 実験方法）活性の測定は長崎らの方法[B.B.R.C. 第15
8 巻、1036-1042(1989)]に準じて行った。即ち、ラット
由来の骨芽肉腫細胞培養株UMR-106 を用いて、cAMP産生
量を指標として本発明のペプチド誘導体のPTHrP 拮抗作
用を測定した。培養細胞を24穴のカルチャープレートに
1.0 ×10⁵ 細胞／穴ずつ播き、3 日間37℃、5% CO₂イン
キュベーター内で培養した。培養した細胞を無血清培地
で2 回洗浄し、0.5ml の(D-MEM＋0.1% BSA＋0.5mM IBMX
＋1mM HEPES)培地(pH7.4) を加えて更に20分間培養し
た。本発明化合物は最終濃度が10^-6〜10^-9M になるよう
に調製し、10μg/穴ずつ加えた。37℃の水浴上で、プレ
ートを10分間温めた後、PTHrP(1 -34)の2.5 ×10^-9M を
10μl/穴ずつ加え、更に10分間インキュベートした。1
規定HCl を100 μl/穴ずつ加え反応を停めた後、各細胞
及び培養液チューブに移し変えて1500g で20分間遠心し
た。各上清の300 μl を採取し、遠心乾燥により濃縮し
た後、250 μl のAssay bufferに再溶解してcAMP濃度を
EIA kit.(Amersham Japan)を用いて測定した。2.5 ×10
^-9M のPTHrP(1-34) により産生されるcAMP量から無処置
群より産生されるcAMP量を差し引いたcAMP量を100%とし
て、本発明化合物によるcAMP産生量の50% 阻害率(I
C₅₀ ) を求めた。なお、比較対照物としては、従来から
PTHrP(1-34) の拮抗物質として知られているPTHrP(7-3
4)NH₂を用いた。

【００１７】（結果）

【表１】 表１ antagonist IC₅₀(×10^-8M) PTHrP(7-34)NH₂ 1.7 [desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂ 0.21

【００１８】表1 に示すように、[desamino-Leu⁸,As
n¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂はPTHrP(7-34)N
H₂の約1/8 の濃度で50% 阻害を示した。

【００１９】２．高カルシウム血症誘発腫瘍移植ヌード
マウスの血中カルシウム濃度に及ぼす効果 ( 実験方法)高カルシウム血症を誘発する可移植性腫瘍L
C-1( ヒト肺扁平上皮癌) を約3 ×3×3mm に細切し、そ
の腫瘍片をBALB/cヌードマウス(7週齡,3匹/ 群) の背側
部皮下に移植した。それぞれの腫瘍が約1000mm³ になっ
た時点で眼窩採血を行い、補正カルシウム値 [実測カル
シウム値(mg/dl) ＋4 −アルブミン濃度(g/dl)] が約14
mg/dl になったマウスを実験に用いた。本発明化合物及
び比較対照物の500μg/day をそれぞれマウスに連日 5
日間、筋肉内投与した。投与開始後、非担癌対照群、無
処置担癌対照群及び治療群のそれぞれのマウスより週 2
回(2〜3 回毎)の割合で採血し、血中カルシウム濃度を
測定した。対照群と治療群の血中カルシウム濃度を比較
することにより、本発明化合物の効果を検討した。ま
た、無処置担癌対照群の生存率を100 % とした時の、治
療群の生存率をT/C(%)として求めた。

【００２０】（結果） 図１ 血中カルシウム濃度の変化

【表２】 表２ 延命効果 生存日数中間値(T/C(%) ） 無処置担癌対照群 100 PTHrP(7-34)NH₂ 144 [desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂ 177

【００２１】図1 に示すように、本発明化合物は投与期
間中、血中カルシウム濃度の上昇を抑制した。その効果
は比較対照物のPTHrP(7-34)NH₂よりも強かった。また、
表２に示すように、本発明化合物はLC-1誘発高カルシウ
ム血症によるマウスの死亡を救命し、延命効果を示し
た。その効果は比較対照物のPTHrP(7-34)NH₂よりも強か
った。

【００２２】

【実施例】 実施例 １．本発明化合物の製造法 1-1 自動ペプチド合成機 [desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)
NH₂ の合成は、AppliedBiosystems社製ペプチド自動合
成機 model 430A を用い、固相法によって行った。その
合成プログラムを以下に示す。

【表３】 表３ [desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂の合成のためのＢｏ ｃアミノ酸導入プログラム ──────────────────────────────────── 活性化槽 濃縮槽 反応槽 ──────────────────────────────────── (1)Boc アミノ酸活 (2) 濾過 (3) 50% TFA/CH₂Cl₂を用いた 性エステル調製 N₂ガス気流下で10- Nα-Boc基の脱保護(20 20分間濃縮 -25 分間） 2mmol Boc アミノ酸 (4)CH₂Cl₂ による洗浄(3回） 2mmol DCC(0.5MDCC/CH₂Cl₂) (5)10% DIEA/DMF による中和 (2回） 2mmol HOBt(0.5MHOBt/DMF) (6)DMFによる洗浄(6回） (7) 縮合反応 DMF-CH₂Cl₂中で30 60分間攪拌 -35 分間攪拌 (8)DMF(6回),CH₂Cl₂(3回） による洗浄 ──────────────────────────────────── DCC; Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド HOBt;１−ヒドロキシベンゾトリアゾール DMF; ジメチルホルムアミド TFA; トリフルオロ酢酸 DIEA;ジイソプロピルエチルアミン

【００２３】1-2 固相担体樹脂 担体樹脂は、目的とするポリペプチドアミドがＣ末端が
アミド型であることから、ＨＦ処理によりポリペプチド
アミドを得ることができるｐ−メチルベンズヒドリルア
ミン樹脂を用いた。

【００２４】1-3 保護アミノ酸 使用したアミノ酸はα−アミノ基をBoc 基で保護し、側
鎖保護基はいずれも最終的にＨＦで処理することにより
除去が可能なものを用いた。[desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu
¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂ の合成に用いた保護ア
ミノ酸を以下に示す。（アミノ酸の絶対立体配置は特に
記載のない場合、全て天然型のＬ体を示す）

【表４】表４保護アミノ酸 Boc-Ala-OH Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Asn-OH Boc-Asp(OcHex)-OH Boc-Gln-OH Boc-Glu(OBzl)-OH Boc-His(Bom)-OH Boc-Ile-OH Boc-Leu-OH ・H₂O Boc-lys(Cl-Z)-OH Boc-Phe-OH Boc-D-Phe(4-F)-OH Boc-Ser(Bzl)-OH Boc-Thr(Bzl)-OH Tos; トシル基 cHex; シクロヘキシル基 Bzl; ベンジル基 Bom; ベンジルオキシメチル基 Cl-Z; ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル基

【００２５】1-4 反応試薬 本合成では、脱Boc 化剤として0.02% 1,2-エタンジオー
ル含有50% TFA/CH₂Cl₂溶液を使用した。TFA による脱Bo
c 化後、これを中和するために10%DIEA/DMF 溶液を用い
た。また縮合反応は、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
エステルによる活性エステル法、または、DIEA/DMFを塩
基として用い、HOBt存在下、BOP 試薬（１−ベンゾトリ
アゾリル−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホ
ニウムヘキサフルオロリン化物塩）にて行った。

【００２６】1-5 縮合反応試験 各縮合反応後、反応の進行度は未反応のα−アミノ基の
有無を検出するカイザー試験により行った。試験法は、
縮合反応後の保護ペプチド樹脂に (1) 76%フェノール／
エタノール溶液、(2) 0.2mM KCN/ピリジン溶液、 (3)
0.28M ニンヒドリン／エタノール溶液をそれぞれ0.1m
l, 0.2mlおよび0.1ml 加え、100 ℃で7 分間加熱した。
液相が黄色を呈した場合は、反応の完結を意味し、次の
Boc-アミノ酸を導入した。また、青色を呈した場合は、
未反応のアミノ基の存在を意味し、再度縮合反応を繰り
返した。

【００２７】1-6 [desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe
(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂ の合成 担体樹脂であるｐ−メチルベンズヒドリルアミン(MBHA)
樹脂HCl 塩(NH₂含量:0.62 mmol/g, 0.5mmol, 806mg) を
反応槽に加えCH₂Cl₂中で一晩膨潤し、次いでMBHA樹脂中
に含まれる塩酸塩を10% DIEAで中和した後、Ｃ末端アミ
ノ酸に相当するBoc-Ala-OHを樹脂上のアミノ基に対して
４倍量（2mmol)用いて縮合反応を行い、出発物質である
Boc-Ala-MBHA樹脂を得た。続いて、表3に示したプログ
ラムに従って、活性化槽において、Boc-アミノ酸 2mmo
l、DCC 2mmol 、HOBt 2mmolにより、活性エステルを調
整し、濃縮槽で溶媒の濃縮を行う一方、反応槽におい
て、50%TFA による脱Boc 化反応および10% DIEAによる
中和反応を行い、先に調整したBoc-アミノ酸の活性エス
テルを添加することによって、縮合反応を行った。反応
の進行度はカイザー試験によって確認し、反応陽性時に
はDIEA存在下、BOP 試薬、HOBt(Boc- アミノ酸 2mmol、
BOP 試薬 2mmol、HOBt 2mmol、DIEA 4mmol) を用いて再
度縮合反応を行い、反応を完結させた。

【００２８】この操作を繰り返し行うことによりペプチ
ド鎖を延長し、[desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)
¹²]hPTHrP(8-34)NH₂ に相当する保護ポリペプチド樹脂
1.0gを得た。なお、Ｎ末端のdesamino-Leuは、ロイシン
のα−アミノ基を水素に置換した4-メチル吉草酸の1-ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールエステルを反応させて導入
した。表５に本合成に用いた保護アミノ酸の分子量、使
用量および反応回数を示す。

【表５】 表５ [desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂合成に用いられ た保護アミノ酸のアミノ酸配列にそった一覧表 ──────────────────────────────────── 段階 Bocアミノ酸 分子量 mg(mmol) 反応回数 ──────────────────────────────────── 1 Boc-Ala-OH 189 378 (2) 2 2 Boc-Thr(Bzl)-OH 309 618 (2) 2 3 Boc-His(Bom)-OH 375 750 (2) 2 4 Boc-Ile-OH 240 480 (2) 1 5 Boc-Glu(OBzl)-OH 337 674 (2) 2 6 Boc-Ala-OH 189 378 (2) 3 7 Boc-Ile-OH 240 480 (2) 1 8 Boc-Leu-OH 249 498 (2) 2 9 Boc-His(Bom)-OH 375 750 (2) 3 10 Boc-His(Bom)-OH 375 750 (2) 3 11 Boc-Leu-OH 249 498 (2) 2 12 Boc-Phe-OH 265 530 (2) 4 13 Boc-Phe-OH 265 530 (2) 3 14 Boc-Arg(Tos)-OH 429 858 (2) 4 15 Boc-Arg(Tos)-OH 429 858 (2) 3 16 Boc-Arg(Tos)-OH 429 858 (2) 3 17 Boc-Leu-OH 249 498 (2) 2 18 Boc-Asp(OcHex)-OH 315 630 (2) 2 19 Boc-Glu-OH 246 492 (2) 3 20 Boc-Ile-OH 240 480 (2) 3 21 Boc-Ser(Bzl)-OH 295 590 (2) 3 22 Boc-Lys(Cl-Z)-OH 415 830 (2) 3 23 Boc-D-Phe(4-F)-OH 283 566 (2) 2 24 Boc-Leu-OH 249 498 (2) 2 25 Boc-Asn-OH 232 464 (2) 3 26 Boc-His(Bom)-OH 375 750 (2) 1 27 des-NH₂-Leu-OH 116 232 (2) 2 ────────────────────────────────────

【００２９】1-7 樹脂からのペプチドの切断と保護基の
除去 得られた保護ポリペプチド樹脂は、ＨＦ処理により保護
基の除去およびペプチド鎖の樹脂からの切断を行った。
[desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)
NH₂ に相当する保護ポリペプチド樹脂1.0gとテフロン被
膜攪拌子をＨＦ反応容器に添加し、アニソール1.0ml を
加えて室温、減圧下、30分間放置した後、反応容器をド
ライアイス−アセトン浴で冷却し、液体ＨＦ10mlを添
加、0 ℃で1時間攪拌した。ＨＦを減圧除去後、残渣を
酢酸エチルで洗浄した。これを濾過して減圧乾燥を行っ
た後、50% 酢酸により抽出し、粗ポリペプチドアミド44
4mg を得た。

【００３０】1-8 粗ポリペプチドアミドの検定と精製 得られた粗ポリペプチドアミドは、分析用カラムYMC-Pa
ck R-ODS-5 (4.6 ×250mm)を用いた逆相HPLCによりその
純度を検定した( 図２) 。溶離液として0.01N HCl とCH
₃CN の混合溶媒系を用い、30分間でその混合比を85:15
から55:45 に変化させる直線濃度勾配法により溶出し、
210nm の紫外部吸収により検定を行った。その結果、主
要ピークが認められ、そのピークのアミノ酸組成を検討
した結果、理論値と一致したため、逆相ＨＰＬＣ分取用
カラムYMC-Pack D-ODS-5 (20×250mm)を用い、0.01N HC
l とCH₃CN の混合比を30分間で72:28 から57:43 に変化
させる直線濃度勾配法により精製を行い、精製ポリペプ
チドアミド53.3mgを得た。

【００３１】1-9 精製ポリペプチドアミドの純度検定 得られた精製ポリペプチドアミドの純度検定は逆相HPL
C、アミノ酸組成分析、 FAB質量分析及びTLC による分
析により行った。

【００３２】1-9-1 逆相HPLCによる検定 図３に精製ポリペプチドアミドの溶離条件および溶出パ
ターンを示すが、[desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe
(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂ は22.2分に単一の鋭いピークと
して検出された。

【００３３】1-9-2 酸分解物のアミノ酸分析 精製ポリペプチドアミドを硬質ガラス性試験管中1%フェ
ノール含有6N HCl(0.3ml) の存在下、脱気封管し、110
℃で, 24時間加水分解した。開管後、80℃湯浴中、減圧
下で溶媒を除去し、クエン酸リチウム緩衝溶液に溶解
し、不溶物をマイクロフィルターで除去後、その一部を
自動アミノ酸分析機(Beckman社製, Model 7300) によ
り、アミノ酸組成を分析した。表６にその結果を示す
が、理論値とよく一致した。

【表６】 表６[desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹² ]hPTHrP(8-34)NH₂の酸加水分解物 のアミノ酸組成。 ──────────────────────────────────── Asp(2)2.01 Thr(1)0.97 Ser(1)0.93 Glu(2)2.17 Ala(2)1.99 Ile(3)2.8 Leu(4)4.11 Phe(2)2.08 Lys(1)0.89 His(4)3.89 Arg(3)2.99 ──────────────────────────────────── （ ）内は理論値 加水分解条件：１％フェノール含有6N HCl, 110℃,24h
r

【００３４】1-9-3 FAB質量分析による検定 精製ポリペプチドアミドを10mg秤量し、マトリックスと
してグリセロール：１−チオグリセロール(1:2,v/v) を
20ml加えて試料とした。この試料を、FAB 質量分析機(J
MX-SX 102 mass spectrometer, JEOL,東京) を用いてそ
の分子量を測定した。表７に示した様に、測定値と計算
値はよい一致を示した。

【表７】 表７ FAB質量分析により測定した [desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPT HrP(8-34)NH₂の分子量 ──────────────────────────────────── [desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂ 測定値 計算値 ──────────────────────────────────── C₁₅₄H₂₄₀N₄₇O₃₅F 3329 3328 ────────────────────────────────────

【００３５】1-9-4 TLC及び比旋光度 薄層クロマトグラフィー(TLC) において、Rf値を検討し
た。 TLCプレートはDC-Alufolien Kieselgel 60/kiesel
gur F245 (メルク社, F.R.G.) を用い、発色剤にはクロ
リン試薬を用いた。精製ポリペプチドアミドは単一のス
ポットとして検出された。また、比旋光度はポリペプチ
ドアミドを1M AcOH に溶かし、濃度を0.1 に調製して測
定した。比旋光度の測定はDIP-140 Digital Polarimete
r (JASCO, 東京) を用いた。

【表８】 表８ [desamino-Leu⁸,Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂のＲｆ値と比施 光度 ──────────────────────────────────── ＴＬＣのＲｆ値 Rf 0.43(n-BuOH : ピリジン : 蟻酸 : H₂O = 20 : 12 : 3 : 10) 比施光度 [α]²⁰ _D :-77.3°(c 0.1, 1M AcOH) ────────────────────────────────────

【００３５】２．本発明化合物を用いた製剤の製造例 本発明化合物の１部及びD-マンニトール２０部を注射用
蒸留水２０００部に溶解し、メンブランフィルターで濾
過した後、バイアルに分注して、常法により凍結乾燥
し、ゴム栓で密栓して注射用製剤を得た。

【００３６】

【発明の効果】本発明のポリペプチドアミドは強いＰＴ
Ｈ及びＰＴＨｒＰ拮抗作用を有しており、ＰＴＨ及びＰ
ＴＨｒＰの関与するカルシウム代謝異常症、例えば高カ
ルシウム血症、骨粗鬆症及び副甲状腺機能亢進症等の治
療薬として有用である。

【００３７】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明化合物のLC-1担癌ヌードマウスに
投与した時の血中カルシウム濃度の変化を示す。

【図２】図２は本発明化合物の逆相ＨＰＬＣによる粗ポ
リペプチドアミドの純度検定を示す。

【図３】図３は本発明化合物の逆相ＨＰＬＣによる精製
ポリペプチドアミドの純度検定を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＥＧ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＧ (72)発明者 才野 哲之 埼玉県与野市八王子５−11 14−101

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】新規ポリペプチドアミド〔desamino-Leu⁸,
   Asn¹⁰,Leu¹¹,D-Phe(F)¹²]hPTHrP(8-34)NH₂又はその薬理
   学的に許容される塩。
2. 【請求項２】請求項１記載のポリペプチドアミド又はそ
   の薬理学的に許容される塩を有効成分とするＰＴＨ又は
   ＰＴＨ様活性を有するポリペプチドの拮抗薬。
3. 【請求項３】請求項１記載のポリペプチドアミド又はそ
   の薬理学的に許容される塩を有効成分とするカルシウム
   代謝調節剤。
4. 【請求項４】請求項１記載のポリペプチドアミド又はそ
   の薬理学的に許容される塩を有効成分とする高カルシウ
   ム血症治療剤。
5. 【請求項５】請求項１記載のポリペプチドアミド又はそ
   の薬理学的に許容される塩を有効成分とする骨粗鬆症治
   療剤。
6. 【請求項６】請求項１記載のポリペプチドアミド又はそ
   の薬理学的に許容される塩を有効成分とする副甲状腺機
   能亢進症治療剤。
7. 【請求項７】請求項１記載のポリペプチドアミド又はそ
   の薬理学的に許容される塩を有効成分とする高ＰＴＨ血
   症に伴う慢性腎不全治療剤。
8. 【請求項８】請求項１記載のポリペプチドアミド又はそ
   の薬理学的に許容される塩を有効成分とする高ＰＴＨｒ
   Ｐ血症に伴う骨病変治療剤。
9. 【請求項９】有効量の請求項１記載のポリペプチドアミ
   ド又はその薬理学的に許容される塩及び薬理学上許容さ
   れる担体からなる医薬組成物。