PL185484B1 - Sposób kontroli sialowania białek wytwarzanych przez hodowle komórek ssaków - Google Patents

Abstract

1. Sposób kontroli zawartosci kwasu sialowego w bocznym lancuchu oligosacharydo wym ssaczych glikoprotein wytwarzanych w hodowli ssaczych komórek gospodarza, obej- mujacy etap hodowli ssaczych komórek gospodarza w fazie wytwarzania tej hodowli, zna- mienny tym, ze do hodowli dodaje sie kwas alkanowy lub jego sole w stezeniu okolo 0,1 mM do okolo 20 mM i utrzymuje sie stezenie osmolowe hodowli komórkowej na pozio- mie okolo 250 do 600 mOsm i temperature hodowli utrzymuje sie pomiedzy 30°C i 35°C. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ilosc kwasu sialowego obecnego w bocznych lancuchach oligosacharydowych glikoproteiny jest zwiekszona, przy czym specyficzna produktywnosc hodowli komórkowej jest zmniejszona poprzez hodowanie komórek gospodarza w stezeniu kwasu alkanowego lub jego soli pomiedzy 1 mM do okolo 6 mM i utrzymywanie stezenia osmolowego na poziomie okolo 300-450 mOsm. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze komórkami gospodarza sa komórki CHO. 20. Kompozycja terapeutyczna zawierajaca preparat TNFR1-IgG1 , znamienna tym, ze czasteczki TNFR1-IgG1 posiadaja stosunek molowy kwasu sialowego do bialka wyno-- szacy 4 do 7 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób kontroli zawartości kwasu sialowego w glikoproteinach wytwarzanych przez hodowle komórek ssaków. Sposób według wynalazku dostarcza metody zwiększania lub zmniejszania zawartości kwasu sialowego w glikoproteinach wytwarzanych przez hodowle komórek ssaków. Przedmiotem wynalazku także jest sposób wytwarzania chimery receptora czynnika nekrotycznego nowotworów (TNFR)-immunoglobulina (Ig), a także nowych preparatów TNFR1-IgG, i ich użycie w diagnostyce i leczeniu różnych stanów zapalnych i chorób immunologicznych.

Różnice we wzorze sialowania zrekombinowanych białek stały się ostatnio punktem zainteresowania społeczności naukowej, ponieważ zrekombinowane białka zaczęły być wytwarzane jako potencjalne kliniczne środki profilaktyczne i terapeutyczne. Boczne łańcuchy oligosacharydowe glikoprotein wpływają na funkcje tych białek (Wittwer A., i Howard S. C. (1990) Biochem. 29: 4175-4180)) i wewnątrzcząsteczkowe oddziaływania pomiędzy częściami glikoproteiny, co powoduje zmiany konformacji i zmiany trójwymiarowej powierzchni jaką taka glikoproteina odsłania (Hart. (1992) Curr. Op. Cell Biol., 4:1017-1023; Goochee i wsp., (1991) Bio/Technology, 9:1347-1355; Parekh R. B., (1991) Curr. Op. Struct. Biol., 1:750-754). Oligosacharydy mogą także kierować określone białka do pewnych struktur w oparciu o specyficzne komórkowe receptory węglowodanów (Bevilacqua M. P. I Nelson R. M., (1993) J. Clin. Invest. 91:379-387; Nelson R. M. I wsp., (1993) J. Clin. Invest. 91:1157-1166; Norgard K. E. i wsp., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1068-1072; Imai i wsp., (1993) Nature 361:555-557). Końcowe reszty kwasu sialowego bocznych łańcuchów oligosacharydowych glikoprotein wpływają na ich absorbcję, czas półtrwania w surowicy i klirens z surowicy, a także na ich fizyczne, chemiczne i immunologiczne właściwości (Parekh R. B. supra; Varki A., (1993) Glycobiology 3:97-100; Paulson J. (1989), TIBS, 14:272-276; Goochee i wsp., (1991) Biotechnology 9:1347-1355; Kobata A. (1992) Eur. J. Biochem. 209:483-501). Ważna jest wiec, umiejętność sterowania zawartością kwasu sialowego w glikoproteinach, szczególnie tych białek które są przeznaczone do użycia terapeutycznego.

Dużo uwagi poświecono czynnikom, które wpływają, na glikozylację w czasie wytwarzania zrekombinowanych białek, takich jak sposób wzrostu (w zawiesinie czy na podłożu), obecność surowicy bydlęcej płodowej w składzie podłoża, gęstość hodowli, natlenienie, pH,

185 484 sposób oczyszczania i tym podobne (Werner R. I Noe W. (1993), Drug Res. 43:1134-1249; Hayter i wsp., (1992) Biotech. And Bioeng. 39:327-335; Borys i wsp., (1994) Biotech and Bioeng. 43:505-514; Borys i wsp., (1993) Bio/technology 11:720-724; Hearing i wsp., (1989)

J. Cell Biol. 108:339-353; Goochee i wsp., w Frontiers in Bioprocessing II; Todd i wsp., eds (1992) American Chemical Society s. 199-240; Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr. 5096816; Chotigeat W., (1994) Cytotech. 15:217-221). Kilka grup naukowych badało parametry procesów składających się na wytwarzanie zrekombinowanych białek, szczególnie wpływ składu podłoża (Park i wsp., (1992) Biotech. Bioeng. 40:686-696; Cox McClure (1983) In Vitro, 19:1-6; Mizutani i wsp., (1992) Biochem Biophys. Res. Comm., 187:664669; Le Gros i wsp., (1985) Lymph. Res. 4:221-227).

Wiadomo że, dodanie kwasów alkanowych, takich jak kwas masłowy wpływa na przejściową ekspresję obcego DNA w hodowlach zrekombinowanych komórek (Prasad i Sinha (1976) In Vitro, 12:125-132; Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr. 62-48935; Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr. 55-150440; Klehr i wsp., (1992) Biochem. 31:3222-3229; Gorman i Howard (1983) Nucleic acid Res. 11:7631-7648). Jednakże, maślan sodowy ma rożny wpływ na ekspresję genów w różnych liniach komórkowych i w różnym podłożu do hodowli (D'Anna i wsp., (1980) Biochem. 19:2656-2671; Hagopian H. K., (1977) Celi 12:855-860) i na wytwarzanie białek (Milhaud (1980) J. Cell. Physiol. 104:163-170; Brytyjskie Zgłoszenie Patentowe Nr. GB 2 122 207 A), co sugeruje, że maślan może modyfikować ekspresję genów (Yuan i wsp., (1985) J. Biol. Chem. 3778-3783) lub hamuje ekspresję pewnych genów (Yuan i wsp., supra).

Europejski Dokument Patentowy Nr 0239 292 B1 opisuje sposób wytwarzania białka w obecności kwasu alkanowego, takiego jak kwas masłowy, lub jego soli. Publikacja ta jednakże, tylko w niewielkim stopniu wyjaśnia jakich stężeń tego dodatku powinno się używać, a ponadto nie porusza działania tego dodatku na glikozylację białek. Inni opisali, że dodanie niewielkiej ilości maślanu sodowego (0-1,5 mM) do hodowli komórkowej zwiększa specyficzną produktywność komórek i prowadzi do zwiększenia kwaśnych glikoform (odpowiadających zwiększeniu się zawartości kwasu sialowego) w wytwarzanych przez komórki zrekombinowanych białkach (Chotigeat i wsp., (1994) Cytotech. 15:217-221).

Kilka grup badało wpływ stężenia osmolowego pożywki na wzrost komórek i wytwarzanie polipeptydów(Ozturk i Palsson (1991) Biotach. And Bioeng. 37:989-993; Stubblefield i wsp., (1960) Cancer Research, 20:1646-1655; Garcia-Perez i wsp., (1989) Journal of Biological Chemistry, 264(28): 16815-16821; Miner i wsp., (1981) Invasion Metastasis, 1:158-174; GB 2.251.249; EP 481.791; Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr. 5.151.359; Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr. 4.724.206; Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr. 5.122.469; i. WO 89/04867). Proponowano różne zakresy stężeń osmolowych pożywki najlepsze dla wzrostu komórek i wytwarzania polipeptydów. Ogólnie wzrost stężenia osmolowego podłoża do hodowli komórkowych osiąga się przez dodanie NaCl lub aminokwasów. Stres środowiskowy, taki jak wzrost stężenia soli w podłożu do hodowli prowadzi do wzrostu ilości wytwarzanego przez komórki produktu. Obserwację, że przez stres osmotyczny można osiągnąć zwiększona ekspresję białek ssaków wytwarzanych przez komórki ssaków w hodowli, na przykład, dodając: do podłoża do hodowli soli, kwasu mlekowego lub amoniaku, opisano w Międzynarodowej Publikacji Patentowej WO 89/04867.Taki stres przeważnie hamuje wzrost komórek ale zwiększa ich specyficzna produktywność.

Inni opisują wpływ stężenia glukozy na wzrost komórek i wytwarzanie polipeptydów przez hodowle zrekombinowanych komórek. Patrz na przykład, (Park i wsp., (1992) Biotechnology and Bioengineering, 40:686-696; Huang i wsp., (1991) Journal ot Biotechnology, 18:181-162; EP 387.840; Reuveny i wsp., (1986) Journal of Immunological Methods, 86:53-59; Fine i wsp., (1976) In Vitro, 12 (10):693-701; Dircks i wsp., (1987; Exp. Eye Res., 44:951-958; Mizutani i wsp., (1992) Biochemical and Biophysical Research Communica-tions, 187 (2): 664-669; Sugiura, (1992) Biotechnology and Bioengineering, 39:953-959; WO 88/01643; Graf i wsp., (1989) DECHEMA Biotechnol. Conf., 3:615-618; Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr. JP 1-101882; Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr. 3.926.723; WO 87/00195; i Fleischaker Jr., Ph. D. Thesis, Massachusetts Institute of Technology, s.196-229 (czerwiec 1982).

185 484

Jednakże wcześniejsze prace nie badały wpływu różnych parametrów procesu hodowli komórek ssaków na zawartość kwasu sialowego dojrzałych białek, czynnika procesu wytwarzania glikoprotein bardzo ważnego dla powodzenia klinicznego zastosowania tych białek.

Przedmiotem wynalazku jest sposób kontroli zawartości kwasu, sialowego w glikoproteinach wytwarzanych przez hodowle komórek ssaków.

W wynalazku odkryto, że pewne parametry procesu hodowli komórek ssaków wpływają na specyficzną produktywność, a także na zakres i typ glikozylacji wytwarzanych białek. Bardziej szczegółowo odkryto, że pewne czynniki zwiększające specyficzna produktywność mają odwrotne działanie na zawartość kwasu sialowego w wytwarzanych białkach. Wynalazcy zbadali więc wpływ różnych procesów hodowli komórkowej na zwiększenie poszczególnych glikoform glikoprotein wytwarzanych przez hodowle komórek ssaków.

Przedmiotem wynalazku jest sposób kontroli zawartości kwasu sialowego w glikoproteinach wytwarzanych przez hodowle komórek ssaków. Sposobem według wynalazku zmiany tempa wytwarzania glikoprotein w fazie wytwarzania hodowli komórkowej prowadzą do zmian zawartości kwasu sialowego w dojrzałej glikoproteinie. Bardziej szczegółowo, wzrost specyficznej produktywności komórek w fazie wytwarzania glikoproteiny powoduje zmniejszenie się zawartości kwasu sialowego w dojrzałym białku. Odwrotnie, zmniejszenie specyficznej produktywności komórek powoduje zwiększenie się zawartości kwasu sialowego w dojrzałym białku.

W jednym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku umożliwia się zmianę specyficznej produktywności ssaczych komórek gospodarza w hodowli komórkowej w fazie wytwarzania białka przez kontrolę czynników wpływających na specyficzną produktywność komórek. W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku kontroluje się stężenie czynników zwiększających transkrypcję DNA. W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku kontroluje się specyficzną produktywność komórek zmieniając w określonym zakresie stężenie osmolowe podłoża do hodowli komórkowej. W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku wymienione parametry kontroluje się osobno lub jednocześnie w celu zmiany zawartości kwasu sialowego w dojrzałych glikoproteinach. W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku czynnikiem zwiększającym transkrypcję DNA jest kwas alkanowy, taki jak kwas masłowy lub jego sole, takie jak maślan sodowy w stężeniach od około 0,1 mM do około 20 mM. W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku utrzymuje się stężenie osmolowe podłoża do hodowli pomiędzy około 250-600 mOsm. W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku kontroluje się temperaturę hodowli komórkowej z granicach od około 30°C do około 37°C.

W korzystnym przykładzie wykonania wynalazek dostarcza sposobu zwiększenia zawartości kwasu sialowego w dojrzałych glikoproteinach wytwarzanych przez hodowle komórek ssaków obejmującego utrzymywanie niskiej specyficznej produktywności komórek przez kontrolę jednego lub wszystkich wymienionych powyżej parametrów procesu, opcjonalnie z innymi parametrami znanymi w sztuce. Według tego przykładu wykonania sposobu według wynalazku komórki gospodarza hoduje się w podłożu zawierającym kwas alkanowy, lub jego sole, w stężeniach od około 0,1 mM do około 6 mM, opcjonalnie razem z utrzymywaniem stężenia osmolowego podłoża do hodowli pomiędzy około 300-450 mOsm. Powoduje się wytwarzanie białek o zwiększonej zawartości kwasu sialowego.

W innym korzystnym przykładzie wykonania wynalazek dostarcza sposobu zmniejszenia zawartości kwasu sialowego w dojrzałych glikoproteinach wytwarzanych przez hodowle komórek ssaków, obejmującego zwiększenie specyficznej produktywności hodowanych komórek. W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku specyficzna produktywność hodowanych komórek zwiększa się sposobem który obejmuje kontrolę jednego lub wszystkich wymienionych powyżej parametrów procesu. Według tego przykładu wykonania sposobu według wynalazku hoduje się komórki gospodarza w podłożu zawierającym kwas alkanowy, lub jego sole, w stężeniach od około 6 mM do około 12 mM i utrzymuje się stężenia osmolowe podłoża do hodowli pomiędzy około 450-600 mOsm.

W innym przykładzie wykonania wynalazek dostarcza trzyfazowego sposobu hodowania komórek. W tym przykładzie wykonania wynalazek dostarcza sposobu kontrolowania

185 484 zawartości kwasu sialowego w glikoproteinach wytwarzanych przez hodowle komórek ssaków, obejmującego etap hodowania przez pewien czas komórek gospodarza wytwarzających białko w czasie wzrostu w takich warunkach w których wzrost komórek jest największy. W tym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku po fazie wzrostu następuje faza przejściowa, w której umieszcza się komórki w warunkach hodowlanych odpowiednich dla pożądanej zawartości kwasu sialowego w dojrzałych glikoproteinach. Po fazie przejściowej następuje faza wytwarzania, w której utrzymuje się parametry dobrane w fazie przejściowej i zbiera się produkt wytworzony przez komórki. Zmieniając specyficzną produktywność hodowli komórkowych w fazie wytwarzania, przez dodanie do podłoża do hodowli kwasu alkanowego lub jego soli w stężeniach od około 0,1 mM do około 20 mM i utrzymując stężenie osmolowe podłoża do hodowli pomiędzy około 250-600 mOsm, opcjonalnie w połączeniu w fazie przejściowej wytwarza się białka różniące się zawartością kwasu sialowego.

W innym korzystnym, przykładzie wykonania wynalazek dostarcza sposobu kontrolowania zawartości kwasu sialowego obecnego w rozpuszczalnym białku chimerowym receptora czynnika nekrotycznego nowotworów typu 1 (TNFR1)-immunoglobulina G, (IgG,). Wynalazcy stwierdzili, że w pewnych warunkach wytwarzania, można uzyskać nowe preparaty glikoformy TNFR1-IgG„ które mają pożądane właściwości, takie jak dłuższy klirens z krwi, a jednocześnie posiadają podobną aktywność funkcjonalną. Długi okres półtrwania pozwala ułatwić podawanie i umożliwia stosowanie dużych dawek, a także wpływa na siłę działania wytworzonych glikoprotein in vivo, co pozwala na podawanie niższych dawek.

W przykładzie wykonania sposobu według wynalazku wytwarzana jest cząsteczka TNFR1-IgG,, która zawiera więcej reszt kwasu sialowego. Parametry fazy wytwarzania hodowli komórkowej używanej do wytwarzania TNFR1-IgG, dobiera się tak, żeby uzyskać żądaną zawartość reszt kwasu sialowego.

W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku w fazie wytwarzania w podłożu obecny jest maślan sodowy w stężeniu od około 0,1 mM do około 6 mM, a stężenie osmolowe podłoża do hodowli utrzymuje się pomiędzy około 300-450 mOsm. W bardziej korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku w fazie wytwarzania w podłożu obecny jest maślan sodowy w stężeniu około 0,1 mM, a stężenie osmolowe podłoża do hodowli utrzymuje się pomiędzy około 350-400 mOsm.

Innym aspektem wynalazku jest dostarczenie preparatu glikoproteiny TNFR1-IgG, wytworzonej sposobem według wynalazku. W tym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku wytwarza się preparat zawierający TNFRł-IgG,, którego pI leży w zakresie od około 5,5 do 7,5. Ponadto wytwarza się preparat TNFR1-IgG„ którego stosunek molowy kwasu sialowego do białka leży w zakresie od około 4 do około 7, szczególnie w zakresie od około 5 do około 6. W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku wytwarza się preparat zawierający TNFRł-IgG,, który ma od około 1 mola do około 2 moli dostępnych reszt N-acetyloglukozaminowych na mol białka. W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku stosunek molowy kwasy sialowego do reszt. N-acetyloglukozaminowych wynosi od około 0,35 do około 0,5, bardziej korzystnie od około 0,4 do około 0,45.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja terapeutyczna zawierająca opisany preparat, którego można użyć do leczenia stanów patologicznych powodowanych przez TNF.

Figura 1A i 1B. Figury 1A i 1B przedstawiają sposób używany do obliczenia specyficznej produktywności typowej hodowli komórkowej w fazie wytwarzania. Specyficzną produktywność można wyrazić jako funkcję zliczeń żywych dni hodowlanych (dni w których hodowla była żywa), tak jak pokazano na figurze 1A lub objętości upakowanych komórek (PCV), tak jak pokazano na figurze 1B. Tempo specyficznego wytwarzania zostało podane z 90% przedziałem ufności.

Figura 2A i 2B. Figury 2A i 2B przedstawiają korelacje pomiędzy specyficzną produktywnością opartą na zliczeniach żywych dni hodowlanych (figura 2A) lub objętości upakowanych komórek (PCV) (figura 2B) w czasie fazy wytwarzania i zawartością kwasu sialowego (NANA) w zebranym produkcie. Pokazano wartości z 9 różnych procesów wytwarzania (A-I). Punkty wyrażają niezależne procesy wytwarzania tak jak opisano w tabeli 1.

185 484

Szczegółowy opis wynalazku

Grupy węglowodanowe omawiane w wynalazku, są opisane w odniesieniu do powszechnie używanej do opisu oligosacharydów nomenklatury. Omówienie chemii węglowodanów z użyciom tej nomenklatury można znaleźć w Hubbard i Ivatt (1981) Ann. Rev. Biochem. 50:555-583. W tej nomenklaturze na przykład, Man oznacza mannozę, GlcNAc oznacza 2-N-acetyloglukozaminę, Gal oznacza galaktozę, Gic oznacza glukozę. Kwas sialowy jest opisany w odniesieniu do zamieszczonej notatki, NeuNAc oznacza kwas 5-N-acetyloneuraminowy a, NeuNGc oznacza kwas 5-N-glikoliloneuraminowy (J. Biol. Chem. 1982, 257:3347; J. Biol. Chem., 1982, 257: 3352).

Stężenie osmotyczne jest miarą ciśnienia osmotycznego cząsteczek soli rozpuszczonych w płynnym podłożu. Cząsteczki, rozpuszczalne oznaczają zarówno jony jak i cząsteczki niezjonizowane. Stężenie osmolowe (osmolowość) jest wyrażone jako stężenie osmolowe czynnych cząsteczek (osmoli) rozpuszczonych w 1 kg roztworu (1 mOsm/kg H₂O w temperaturze 38°C odpowiada ciśnieniu osmotycznemu 19 mm Hg). Osmolamość oznacza dla odmiany ilość cząsteczek soli rozpuszczonych w 1 litrze roztworu. Użyty tu skrót „mOsm” oznacza „roztwór miliosmoli/kg”.

Użyty tu termin „glikoproteina” oznacza ogólnie peptydy lub białka mające więcej niż około 10 aminokwasów i przynajmniej jeden boczny łańcuch oligosacharydowy. Glikoproteiny mogą być homologiczne dla komórek gospodarza, lub, korzystnie heterologiczne, to znaczy obce dla użytych komórek gospodarza, na przykład glikoproteiny ludzkie wytwarzane w komórkach nabłonka jajowodów chomika chińskiego. Korzystnie, używa się glikoprotein ssaków glikoprotein które oryginalnie wywodzą się z organizmów ssaków), bardziej korzystnie, takich które są bezpośrednio wydzielane do podłoża. Przykłady glikoprotein ssaków obejmują cząsteczki takie jak, cytokiny i ich receptory, a także białka chimerowe zawierające cytokiny i ich receptory, włączając na przykład, czynnik nekrozy nowotworów alfa i beta, ich receptory (TNFR-1; EP 417,563 opublikowany 20 marca 1991 i (TNFR-2; EP 417,014 opublikowany 20 marca 1991) i ich pochodne: reninę, hormony wzrostu, włączając ludzki hormon wzrostu i bydlęcy hormon wzrostu, czynnik uwalniający hormon wzrostu, hormon przytarczyc, hormon stymulujący tarczycę, lipoproteiny: antytrypsynę alfa 1, łańcuch A insuliny, łańcuch B insuliny, proinsulinę, hormon stymulujący pęcherzyki jajnikowe, kalcytoninę, hormon luteinizujący, glukagon, czynniki zakrzepowe, takie jak czynnik VIIIC, czynnik IX, czynnik tkankowy, czynnik von Willebranda, czynniki przeciwzakrzepowe, takie jak białko C, przedsionkowy czynnik natriuretyczny, czynniki powierzchniowe płuc: aktywator plazminogenu, taki jak urokinaza lub ludzki aktywator plazminogenu, aktywator plazminogenu typu tkankowego (t-PA), bombezynę, trombinę, hemopoetyczne czynniki wzrostu, enkefalinazę, czynniki RANTES (regulowane w czasie aktywacji normalnie wytwarzane i wydzielane przez komórki T), ludzkie białko zapalne makrofagów (MIP-1-alfa), albuminę surowicy krwi, taką jak ludzka albumina surowicy krwi, związek hamujący mulerian, łańcuch A reksyny, łańcuch B reksyny, prorelaksynę, mysi peptyd związany z gonadotropiną, białka mikroorganizmów, takie jak beta-laktamaza, DNAza, inhibina, aktywina, czynnik wzrostowy nabłonka naczyń (VEGF) , reeeftory oormonów i czynników wrrostu, integrynę, białka A i D, czynniki reumatoidalne, czynnik orurotropowz, taki jak kostny czynnik orugotropowz (BDNF), orurotrofina-3, 4, 5 i 6 (NT-3, NT-4, NT-5 i NT-6) lub czynnik wzrostu nerwów, taki jak NGF-β, płytkowy czynnik wzrostu (PDGF), czynnik wzrostu fibroblastńw, taki jak aFGF i bFGF, reidrrmalny ccyyoik wzrostu (EGF), transformujący czynnik wzrostu (TGF) taki jak TGF-alfa i TGF-beta, włączając TGF-βΕ tGf^2, TGF-e3 lub TGF-e4, iysulioopodobny czynnik wzrostu I i II (IGF-I i TGF-II), dro(1-3)IGF-I (mózgowy IGF-I), białka wiążące iooulioopodobyy czynnik wzrostu, białka Cd, takie jak cD-3, CD-4, CD-8 i CD-19, ο'οζtroeoetzyn, czynniki ooteoiodukeyjoe, immuootokozoz, białko morfoeeortyeznr kości (BMP), interferon, taki jak interferon-alfa, -beta, -gamma, czynniki stymulujące wzrost kolonii (CSF), na przykład, M-CSF, GM-CSF i G-CSF, iotrrleukioy (IL), na przykład, IL-1 do IL-10, dzomutazn pooadtleokową, receptory komórek T, białka błony komórkowej, czynnik przyśpieszający rozpad, antygeny wirusowe, takie jak na przykład, część otoczki wirusa

185 484

AIDS, białka transportowe, receptory kierujące, adresyny, białka regulatorowe, przeciwciała, białka chimerowe, takie jak immunoadhezyny i fragmenty każdego z wymienionych peptydów.

Termin „podłoże do hodowli komórkowej” i „podłoże hodowlane” oznacza roztwór substancji odżywczych używanych do hodowli komórek ssaków, który przeważnie dostarcza przynajmniej jeden ze składników z jednej lub więcej wymienionych poniżej kategorii:

1) źródło energii, przeważnie w postaci węglowodanów, takich jak glukoza;

2) wszystkie niezbędne aminokwasy, przeważnie zestaw dwudziestu podstawowych aminokwasów i cysteina;

3) witaminy i/lub inne związki organiczne niezbędne w małych stężeniach;

4) wolne kwasy tłuszczowe;

5) elementy śladowe, elementy śladowe definiuje się jako związki nieorganiczne lub elementy występujące naturalnie, które typowo wymagane są w bardzo niskich stężeniach, przeważnie w zakresie mikromolamym.

Roztwór substancji odżywczych można wzbogacić w jeden lub więcej składników w dowolnej kategorii wymienionej poniżej:

1) hormony i inne czynniki wzrostowe, takie jak na przykład, insulina, transferyna i epidermalny czynnik wzrostu;

2) sole i bufory takie jak na przykład, wapń, magnez i fosforany;

3) nukleozydy i zasady azotowe takie jak na przykład, adenozyna, tymina, hipoksantyna i,

4) białka i hydrolizaty tkankowe.

Termin „ssacze komórki gospodarza”, „komórki gospodarza”, „komórki ssaków” i tym podobne oznaczana linie komórkowe wyprowadzone ze ssaków i zdolne do wzrostu i przeżycia w hodowli w postaci monowarstwy lub zawiesiny, w podłożu do hodowli zawierającym odpowiedni roztwór substancji odżywczych i czynniki wzrostowe. Niezbędne czynniki wzrostowe dla określonego typu komórek łatwo można określić doświadczalnie, jak opisano na przykład, w Mammalian Cell Culture (Mather J. P. wyd., Plenum Press, N. Y. (1984)), i barnes i Sato, (1980) Celi, 22:649. Typowo, komórki są zdolne do wytwarzania i wydzielania, dużych ilości pożądanej glikoproteiny do podłoża do hodowli. Przykłady odpowiednich sposobów według wynalazku ssaczych komórek gospodarza obejmują komórki jajnika chomika chińskiego/-DHFR (CHO, Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); komórki dp12.CHO (EP 307247 opublikowany w marcu 1989), komórki nerki małpy CV-1 transformowane wirusem SV40 (COS-7, AtCc CRL 1651), linię ludzkich embrionalnych komórek nerki (293 lub komórki 293 przystosowane do hodowli w zawiesinie. Graham i wsp. J. Gen. Virol., 36:59 (1977)); komórki nerki chomika dżungarskiego (BHK, ATCC CCL 10), mysie komórki TM4 (Mather Biol. Reprod., 23:243-251 [1980]), komórki nerki małpy (CV-1 ATCC CCL 70), komórki nerki afrykańskiej małpy zielonej (VERO-76 ATCC CRL 1587), ludzkie komórki nowotworu szyjki macicy (HELA, ATCC CCL 2), komórki nerki psa (MDCK, ATCC CCL 34), komórki wątroby szczura (BRL 3A, ATCC CRL 1442), ludzkie komórki płuca (W 138, ATCC CCL 75), ludzkie komórki wątroby (HepG2, HB 8065), komórki raka sutka myszy (MMT 0605562, ATCC CCL 51), komórki TRI (Mather i wsp., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68(19820)), komórki MR.C5, komórki FS4 i ludzkie komórki hepatomy (HepG2).

Korzystnie komórki gospodarza obejmują komórki jajnika chomika chińskiego/-DHFR (CHO, Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); komórki dpl2.CHO (EP 307247 opublikowany 15 marca 1989).

Termin „pepton” w tym wynalazku oznacza dodatek do podłoża do hodowli, który jest całkowitym hydrolizatem białka zwierzęcego. Źródłem takiego białka mogą być zwierzęce półprodukty z rzeźni, oczyszczona żelatyna lub materiał roślinny. Białko typowo hydrolizuje się przy użyciu kwasu, ciepła lub różnych preparatów enzymatycznych. Korzystne preparaty peptonu to na przykład, „Primatone RL” i „Primatone HS”, oba są dostępne w handlu (Sheffield, W. Brytania).

Termin „specyficzna produktywność komórkowa”, „specyficzne tempo komórkowe” i tym podobne tu użyte, oznaczała specyficzne tempo wytwarzania produktu, to znaczy specyficzne tempo wytwarzania produktu na komórkę, lub na miarę masy komórek lub objętości

185 484 komórek. Specyficzną produktywność komórkową mierzy się na przykład, w gramach wytworzonego białka na komórkę na dzień. Specyficzną produktywność komórkową można wygodnie obliczyć metodą całkową dP/dt=qpX, lub

P=qjXdt.

w którym qp oznacza stałą specyficznej produktywności komórkowej, X jest liczbą komórek lub objętością komórek lub ekwiwalentem masy komórek, a dP/dt jest tempem wytwarzania białka. Tak więc, q_p można wyliczyć z wykresu stężenia produktu w zależności od pochodnej czasu życia komórek (JXdt „żywych dni hodowlanych”). Według tego wzoru, jeżeli wykreśli się wykres zależności ilości glikoproteiny wytworzonej od żywych dni hodowlanych, kąt nachylenia prostej odpowiada specyficznemu tempu komórkowemu. Ilość żywych komórek można określić różnymi metodami, na przykład, biomasa, tempem zużycia tlenu, testem dehydrogenazy laktozowej, objętością upakowanych komórek lub turbidymetrycznie.

Termin „faza wzrostu” hodowli komórkowej oznacza okres logarytmicznego wzrostu komórek (faza log), w której komórki gwałtownie się dzielą. W tej fazie wzrostu, komórki hoduje się przez określony czas przeważnie 3-4 dni, w takich warunkach, że wzrost komórek jest największy. Fazę wzrostu komórek gospodarza dla określonych komórek można łatwo określić bez niepotrzebnych eksperymentów. „Okres czasu w którym w określonych warunkach wzrost komórek jest największy” i tym podobne oznacza takie warunki hodowli komórek, które są optymalne dla wzrostu i podziałów komórek określonej linii komórkowej. W czasie fazy wzrostu komórki hoduje się w roztworze substancji odżywczych zawierającym niezbędne dodatki w temperaturze ogólnie 30-40°C, w wilgotnej, kontrolowanej atmosferze, odpowiedniej do osiągnięcia optymalnego wzrostu dla hodowli danej linii komórkowej. Komórki utrzymuje się w fazie wzrostu przez okres czasu od około 1 do czterech dni, przeważnie dwa do trzech linii.

„Faza przejściowa” hodowli komórkowej oznacza okres czasu w którym wprowadza się warunki odpowiednie dla fazy wytwarzania. W czasie trwania fazy przejściowej, czynniki środowiska, takie jak temperatura hodowli komórkowej, stężenie osmolowe i tym podobne, zmienia się z odpowiednich dla fazy wzrostu na odpowiednie dla fazy wytwarzania, „Faza wytwarzania” hodowli komórkowej oznacza okres czasu w którym wzrost hodowli osiąga plateu. W czasie fazy wytwarzania kończy się logarytmiczny wzrost hodowli, a najważniejsze jest wytwarzanie białka. W czasie tego okresu czasu przeważnie wzbogaca się podłoże, żeby podtrzymać ciągłość wytwarzania białka i osiągnąć pożądany produkt glikoproteinowy.

Termin „ekspresja” lub „wytwarzanie” oznacza tu proces transkrypcji i translacji zachodzący w komórkach gospodarza. Poziom ekspresji produktu genu w komórkach gospodarza określa się w oparciu o ilość odpowiedniego mRNA, który jest obecny w komórkach lub w oparciu o ilość białka kodowanego przez odpowiedni gen i jest wytwarzane w komórce. Na przykład, mRNA transkrybowany z genu korzystnie określa się ilościowo hybrydyzacją metodą northem bloting, Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, s. 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Białko kodowane przez gen określa się ilościowo badając jego aktywność biologiczną lub za pomocą testów nie badających tej aktywności, takich jak western blotting i test radioimmunosorbcyjny, przy użyciu przeciwciał zdolnych do reakcji z tym białkiem, Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, s. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Termin kwas alkanowy i jego sole oznacza, rozgałęziony lub nierozgałęziony, nasycony lub nienasycony kwas alkanowy lub jego sole. Kwas alkanowy ogólnie zawiera od 1 do 10 atomów węgla, a korzystnie od trzech do sześciu atomów węgla. Przykładem kwasu alkanowego jest kwas masłowy, a jego soli maślan sodowy.

Sposoby hodowli komórek

Wynalazca odkrył, że warunki, które zwiększją w komórkach ssaków specyficzną produktywność komórkową w czasie wytwarzania glikoproteiny, jednocześnie mają przeciwny wpływ na zawartość kwasu sialowego w wytworzonej glikoproteinie. Ponieważ glikoproteiny

185 484 mające jedną lub więcej reszt kwasu sialowego na kompleks struktury oligo-sacharydowej mają dłuższe tempo klirensu in vivo, tempo klirensu wytwarzanej przez komórki glikoproteiny można zmieniać, w szerokim zakresie zmieniając całkowity stopień sialowania preparatu. Wynalazek dostarcza sposobu kontrolowania sialowania glikoprotein wytwarzanych przez hodowle komórek ssaków. Postępując według przedstawionej tu metodyki można precyzyjnie określić parametry procesu, który umożliwia osiągniecie pożądanej zawartości kwasu sialowego w glikoproteinach wytwarzanych przez hodowle komórek ssaków.

Sposobem według wynalazku ssacze komórki gospodarza hoduje się w celu wytworzenia produktu glikoproteinowego możliwego do odzyskania. Całkowitą zawartość kwasu sialowego w glikoproteinach kontroluje się kontrolując specyficzne parametry hodowli komórkowej, które oddziaływują na specyficzną produktywność komórkową. Czynniki, które oddziaływują na specyficzną produktywność komórkową są dobrze znane w sztuce i obejmują ale bez ograniczania ich zakresu, czynniki, które wpływają na liczbę kopii DNA/RNA, czynniki, które wpływają na RNA, takie jak czynniki stabilizujące RNA, składniki odżywcze podłoża do hodowli i inne dodatki, stężenie składników wzmacniających transkrypcję, stężenie osmolowe pożywki do hodowli, temperatura i pH hodowli i tym podobne. Sposobem według wynalazku zmiana tych czynników, pojedynczo lub w kombinacji, tak, że zwiększa się specyficzną produktywność komórkową powoduje zmniejszenie zawartości kwasu sialowego. Zmiana tych czynników, pojedynczo lub w kombinacji, tak, że zmniejsza się specyficzną produktywność komórkową powoduje wytworzenie dojrzale i glikoproteiny o zwiększonej zawartości kwasu sialowego.

Wynalazek jest opisany w odniesieniu do różnych, także dobrze znanych, technik hodowli komórkowych.

Sposobem według wynalazku ssacze komórki gospodarza hoduje się w celu wytworzenia pożądanego produktu glikoproteinowego. Wybierając komórki gospodarza do wytwarzania glikoprotein sposobem według wynalazku należy zdać sobie sprawę, że różne komórki gospodarza mają charakterystyczne i specyficzne mechanizmy translacyjnej i post-translacyjnej obróbki i modyfikacji (na przykład, glikozylacji, przecinania) wyrażanych białek. W celu zapewnienia pożądanych modyfikacji post-translacyjnej należy wybrać odpowiednie komórki gospodarza. W celu zapewnienia specyficznej modyfikacji post-translacyjnej można także zmodyfikować komórki gospodarza.

Bardziej szczegółowo, komórki ssaków które wytwarzają pożądane białka powinny wytwarzać lub być tak zmodyfikowane żeby wytwarzały odpowiednie enzymy, które w odpowiednich warunkach, tu opisanych, zapewnią powstawanie odpowiednich post-translacyjnych modyfikacji in vivo. Enzymy te obejmują enzymy niezbędne dla dodania lub zakończenia reakcji dodawania Ni O- połączonych węglowodanów, tak jak te opisane dla N-połączonych oligosacharydów w Hubbard i Ivan supra. Enzymy te opcjonalnie obejmują transferazę oligosacharydów, alfa-glukozydazę I, alfa-glukozydazę II, ER alfa(1,2)mannozydazę, alfa-mannodazę I Golgiego, N-acetylglukozaminylotransferazę I, alfa-mannodazę II Golgiego, N-acetylglukozaminylotransferazę II, afla(1,6)fukozylotransferazę i P(1,4)galaktozylotransferazę. Ponadto komórki gospodarza wytwarzana odpowiednią transferazę sialilową, która jest zdolna do przeniesienia końcowej grupy kwasu sialowego do specyficznej pozycji i odpowiedniego jej połączenia, tak że stanowi część genomu komórek gospodarza Opcjonalnie można spowodować, że komórki gospodarza wytwarzają odpowiednią transferazę sialiiową na przykład, przez ich transfekcję DNA kodującym transferazę sialilową..

Transferazy sialilowe opisane powyżej powinny dodawać końcową grupę kwasu sialowego do odpowiedniej oligosacharydowej struktury rdzeniowej, takiej jak Galp-4GlcNAc. Odpowiednie transferazy sialilowe użyte sposobem według wynalazku obejmij ale bez ograniczania ich zakresu, te transferazy sialilowe, które katalizują złożoną sialilację i rozgałęzianie N- i O-połączonych oligosacharydów.

Do hodowli komórek ssaków wytwarzających pożądane białko i zdolnych do dodania pożądanego węglowodanu w specyficznej pozycji i odpowiedniego jej połączenia, można użyć różnych warunków hodowli w zależności od rodzaju hodowanych komórek. Odpowiednie warunki hodowli różnią się w zależności od rodzaju hodowanych komórek gospodarza i są znane w sztuce (J. Immunol. Methods (1983), 56:221-234) lub mogą być łatwo określone

185 484 przez biegłego eksperymentatora (patrz na przykład, Animal Cell Culture: A Practical Approach drugie wyd., Rickwood i Hames B. D., edytorzy, Oxford University Press, New York (1992)), i zmieniają się w zależności od wybranych komórek gospodarza.

Hodowla komórek ssaków sposobem według wynalazku prowadzona jest w podłożu odpowiednim do hodowli określonego rodzaju komórek. Przykładami roztworów składników odżywczych są dostępne w handlu podłoża, takie jak Ham F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma). Ponadto jako podłoża do hodowli można użyć każdego z podłoży opisanych w Ham i Wallace, (1979), Meth. Enz. 58:44; Bames i Sato, (1980), Anal Biochem., 102:255; Dokumenty Patentowe Stanów Zjednoczonych Numery: 4767704; 4657866; 4927762; 5122469 lub 4560655; Międzynarodowe Publikacje Numery: WO 90/03430; i WO 87/00195; zawartość których jest tu włączona przez cytowanie. Każde z tych podłoży można wzbogacić jeśli to konieczne w hormony i inne czynniki wzrostowe (takie jak insulina, transferyna lub epidermalny czynnik wzrostu), sole (takie jak chlorek sodowy, wapń, magnez i fosoforany), bufory (takie jak HEPES), nukleozydy (takie jak adenozyna i tymina), antybiotyki (takie jak Gentamycyna™), elementy śladowe (zdefiniowane jako związki nieorganiczne przeważnie obecne w stężeniach mikromolamych), lipidy (takie jak kwas linolowy i inne kwasy tłuszczowe) i ich odpowiednie nośniki i glukoza odpowiednie źródło energii. Można także dodać w odpowiednim stężeniu każdego innego niezbędnego dodatku, który jest znany biegłym w sztuce.

W jednym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, ssaczymi komórkami gospodarza są komórki CHO, korzystnie komórki dpl2.CHO, a odpowiednie podłoże do hodowli zawiera jako podstawowy składnik podłoża, podłoża takie jak podłoża oparte na formule DMEM/HAM F-12 (skład podłoży DMEM i HAM F-12 są opisane w rozdziale opisującym skład podłoży w American Type Culture Collection Catalogue of Cell and Hybridomas, wydanie szóste, 1988, strony 346-349) (szczególnie użyteczne jest podłoże opisane w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych Nr 5122469) ze zmienionymi stężeniami niektórych składników, takich jak aminokwasy, sole, cukry i witaminy, a także opcjonalnie zawierającym glicynę, hipoksantynę i tymidynę; zrekombinowaną ludzką insulinę; hydrolizat peptonu, taki jak Primatone HS lub Primatone RL (Sheffieid, W. Brytania) lub odpowiednik; związek chroniący komórki, takie jak Pluronic F68 lub odpowiednik pluronic polyol, Gentamycynę i elementy śladowe.

Gilkoproteinę wytwarzaną sposobem według wynalazku wytwarza się hodując w różnych warunkach hodowli komórki, które wytwarzają pożądane białko. Na przykład, do wytwarzania białka sposobem według wynalazku są użyteczne procedury hodowli komórek na duża i małą skalę. Procedury te obejmują, ale bez ograniczania ich zakresu, użycie bioreaktora ze złożem fluidowym, bioreaktora rurowego, obracanej hodowli w butelkach, lub bioreaktora z mieszalnikiem, w przypadku ostatnich dwóch systemach, można ich użyć z mikronośnikiem lub bez i mogą one działać w systemie pojedynczego ładowania, doładowywania lub ciągłego ładowania.

W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku komórki hoduje się w bioreaktorze z mieszalnikiem w systemie doładowywania. W korzystnym przykładzie wykonania hodowli komórkowej w systemie doładowywania, ssacze komórki gospodarza i podłoże do hodowli ładuje się do naczynia hodowlanego, a następnie dostarczane jest partiami lub w sposób ciągły dodatkowe podłoże do hodowli, jednocześnie przed zakończeniem hodowli ze zbiornika może lecz nie musi być odbierany produkt i/lub komórki. Hodowla z doładowaniem obejmuje na przykład, system hodowli z doładowaniem półciągłym, w którym okresowo wymienia się całą hodowlę (komórki wraz z podłożem) i zamienia na świeże podłoże. Hodowla w systemie doładowywania różni się od hodowli w systemie pojedynczego ładowania, w którym wszystkie składniki do hodowli komórkowej (włączając komórki i wszystkie składniki odżywcze) dostarczane są do naczynia hodowlanego na początku procesu hodowli. Hodowla w systemie doładowywania różni się także od hodowli w systemie ciągłym ponieważ supernatant nie jest usuwany z naczynia hodowlanego (w hodowli w systemie ciągłym komórki są zatrzymywane w hodowli na przykład, przez filtrację, enkapsulację,

185 484 zakotwiczenie na mikronośniku i tym podobne, a podłoże jest ciągle lub okresowo doprowadzane i odprowadzane z naczynia hodowlanego).

Hodowlę prowadzi się według dowolnego schematu, który jest odpowiedni dla danych komórek gospodarza i założonego planu wytwarzania białka. Dlatego wynalazek rozważa procedury hodowli jednoetapowej i wieloetapowej. W hodowli jednoetapowej podłoże do hodowli zaszczepia się komórkami gospodarza i realizuje określony plan wytwarzania białka sposobem według wynalazku, w jednym cyklu fazy wytwarzania budowli komórkowej. Alternatywnie używa się procedury hodowli wieloetapowej. W hodowli wieloetapowej komórki hoduje się przez kilka etapów lub faz hodowli. Na przykład, w pierwszym etapie lub fazie wzrostu hodowli komórki, wyjęte z miejsca przechowywania dodaje się do podłoża do hodowli odpowiedniego do podtrzymania ich wzrostu i utrzymania wysokiej żywotności. W fazie wzrostu, można utrzymywać komórki przez pożądany okres czasu, przez dodawanie do hodowli świeżego podłoża.

W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, stosuje się hodowlę w systemie doładowywania lub hodowlę w systemie ciągłym, w celu zwiększenia wzrostu komórek ssaków w fazie wzrostu hodowli komórkowej. W fazie wzrostu, komórki hoduje się w takich warunkach i przez taki okres czasu, żeby wzrost był jak największy. Stosuje się warunki hodowli, takie jak temperatura, pH hodowli, stężenie rozpuszczonego tlenu (dO₂) i tym podobne, oraz te które są odpowiednie dla określonego typu komórek gospodarza, a będą oczywiste dla biegłych w sztuce. Ogólnie, pH utrzymuje się na poziomie pomiędzy około 6,5 i 7,5 przy użyciu kwasu (na przykład CO₂) lub zasady (na przykład Na2CO₃ lub NaOH). Zakres temperatur odpowiedni dla hodowli komórek ssaków takich jak komórki CHO leży pomiędzy około 30 do 38°C, a odpowiednie dO2 leży pomiędzy 5-90% nasycenia powietrza.

W określonej fazie komórek można użyć do inokulacji podłoża do hodowli. Alternatywnie, jak opisano powyżej etap lub faza wytwarzania może następować po fazie lub etapie inokulacji.

Sposobem według wynalazku kontroluje się środowisko hodowli komórkowej w czasie trwania jej fazy wytwarzania.

Sposobem według wynalazku zmienia się czynniki wpływające na specyficzną produktywność ssaczych komórek gospodarza i w ten sposób osiąga się pożądany poziom zawartości kwasu sialowego w powstających glikoproteinach. Bardziej szczegółowo, kontroluje się czynniki zwiększające specyficzną produktywność komórek w fazie wytwarzania hodowli komórkowej, w taki sposób, że powstający produkt glikoproteinowy zawiera pożądaną zawartość kwasu sialowego.

W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, fazę wytwarzania hodowli komórkowej poprzedza się fazą przejściową, w czasie której wprowadza się parametry charakterystyczne dla fazy wytwarzania.

W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku kontroluje się stężenie czynników zwiększających transkrypcje DNA, takich jak kwas alkanowy, w celu zmiany specyficznej produktywności komórek i w ten sposób zmiany zawartości kwasu sialowego w powstającym ssączym produkcie glikoproteinowym.

Kwasem alkanowym może być każdy rozgałęziony lub nierozgałęziony kwas alkanowy, który zwiększa transkrypcje białek ssaków. W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku przykładem kwasu alkanowego jest kwas masłowy, a szczególnie jego sól, maślan sodowy.

Sposobem według wynalazku w celu zmiany specyficznej produktywności komórek, kontroluje się stężenie maślanu sodowego. W zależności od określonych komórek gospodarza i pożądanei zawartości kwasu sialowego w wytworzonej glikoproteinie używa się stężenia maślanu sodowego od około 0,1 mM do około 20 mM. W celu wytworzenia białka zawierającego pożądany poziom kwasu sialowego wybiera się takie stężenie maślanu sodowego, które pozwala na osiągniecie najwyższej specyficznej produktywności, przy najbardziej możliwym do zaakceptowania profilu kwasu sialowego. W celu otrzymania pożądanej zawartości kwasu sialowego sposobem według wynalazku wybiera się stężenie czynnika zwiększającego transkrypcję, takiego jak maślan sodowy.

185 484

W celu zwiększenia zawartości kwasu sialowego w dojrzałych glikoproteinach generalnie używa się niższych stężeń czynnika zwiększającego transkrypcję. Niższe stężenie zapewnia zwiększoną transkrypcję ale jednocześnie zmniejsza specyficzną produktywność komórkową przy jednoczesnym utrzymaniu żywotności hodowli komórek gospodarza. Ogólnie, stężenie czynnika zwiększającego transkrypcyję, takiego jak maślan sodowy utrzymuje się pomiędzy około 0,1 mM do około 8 mM. Bardziej korzystnie używa się stężeń pomiędzy około 0,1 mM do około 6 mM. W jednym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, używa się maślanu sodowego w stężeniu 6 mM. W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, używa się maślanu sodowego w stężeniu 1 mM.

W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku wytwarza się glikoproteinę o zmniejszonej zawartości kwasu sialowego. W tym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, komórki ssaków hoduje się w warunkach, w których specyficzna produktywność hodowanych komórek jest zwiększona.

W tym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, stężenie kwasu alkanowego lub innych czynników zwiększających transkrypcję DNA wybiera się w ten sposób, że zwiększenie specyficznej produktywności komórek powoduje wytwarzanie białek, o pożądanym, profilu zawartości kwasu sialowego. W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, stężenie kwasu alkanowego lub jego soli wynosi pomiędzy około 5 i około 20 mM, a bardziej korzystnie używa się stężeń pomiędzy około 6 mM do 12 mM. W jednym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, używa się maślanu sodowego w stężeniu 12 mM.

Przy określaniu odpowiedniego stężenia czynnika zwiększającego transkrypcje DNA, takiego jak kwas alkanowy lub lego sole, można się powoływać na figurę 2, a także na tabelę 1 infra w przykładzie 1. Sposobem według wynalazku niższe stężenie maślanu sodowego ogólnie powoduje niższą specyficzną produktywność komórek. Przy wykonywaniu sposobu według wynalazku, wybiera się zmiany stężenia maślanu sodowego, jednak należy mieć w pamięci inne parametry hodowli w fazie wytwarzania, takie jak stężenie osmolowe. Jak jest to opisane poniżej stężenie osmolowe wpływa na specyficzną produktywność komórek. Wybiera się zmiany stężenia maślanu sodowego, mając w pamięci określone stężenie osmofowe hodowli w fazie wytwarzania.

Ewentualnie, dla innych ssaczych komórek gospodarza i innych glikoprotein, można przygotować małe hodowle testowe i określone tempo wytwarzania produktu glikoproteinowego, to znaczy specyficzna produktywność komórek, a otrzymane wartości zawartości kwasu sialowego mogą być użyte do przygotowania podobnej tabeli i figury odpowiedniej dla określonego typu hodowanych komórek gospodarza. Należy pamiętać, że zmniejszenie specyficznej produktywności komórek prowadzi do zwiększenia zawartości kwasu sialowego w wytwarzanej glikoproteinie. Kwas alkanowy lub jego sole, takie jak maślan sodowy, lub innego odpowiedniego czynnika zwiększającego transkrypcje DNA, dodaje się do hodowli komórek gospodarza w czasie lub w niedalekim czasie od wejścia hodowli w fazę wytwarzania. Dla wygody w procesie hodowli komórek przed fazą wytwarzania, wprowadza się fazę przejściową, w czasie której wprowadza się dyskutowane tu warunki hodowli, umożliwiające osiągnięcie pożądanej specyficznej produktywności komórek, a co za tym idzie pożądanego profilu glikoformy.

Kwas alkanowy lub jego sole dodaje się w sposób znany biegłym w sztuce. W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, maślan sodowy dodaje się porcjami do systemu hodowlanego z doładowaniem, razem lub bez innych składników odżywczych, tak jak tu opisano lub jak jest to znane biegłym w sztuce.

Oprócz czynników opisanych powyżej sposobem według wynalazku, w celu kontroli stopnia sialowania dojrzałych glikoprotein, kontroluje się także stężenie osmolowe środowiska hodowlanego. W jednym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, w celu kontroli zawartości kwasu sialowego w dojrzałych glikoproteinach, kontroluje się stężenie osmolowe niezależnie od innych czynników wpływających na specyficzną produktywność komórkową. W innym przykładzie wykonania 'sposobu według wynalazku, stężenie osmolowe kontroluje się razem z innymi czynnikami wpływającymi na specyficzną produktywność

185 484 komórkową. W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku kontroluje się stężenie osmolowe i stężenie kwasu alkanowego.

Stężenie osmolowe środowiska hodowlanego kontroluje się w celu wytworzenia odpowiedniej równowagi pomiędzy specyficzną produktywnością komórkową i profilem kwasu sialowego w powstających glikoproteinach. Ogólnie, specyficzna produktywność komórkowa zwiększa się jeżeli zwiększa się stężenie osmolowe. Stężenie osmolowe prowadzące do wytworzenia białka o pożądanym profilu kwasu sialowego wybiera się mając w pamięci, że wzrost stężenia osmolowego ogólnie prowadzi do zwiększenia tempa wytwarzania określonego białka. W celu zmniejszenia tempa wytwarzania i zwiększenia zawartości kwasu sialowego w dojrzałej glikoproteinie stężenie osmolowe ogólnie utrzymuje się na poziomie niższym niż typowy dla określonego typu hodowanych komórek.

Stężenie osmolowe podłoża do hodowli używanego do hodowli komórek ssaków ogólnie utrzymuje się pomiędzy około 290-330 mOsm. Jednakże, wzrost stężenia osmolowego ogólnie prowadzi do zwiększenia tempa wytwarzania białek. Stężenie osmolowe wybiera się tak, żeby tempo wytwarzania białka odpowiadało pożądanemu profilowi produktu. W celu zwiększenia zawartości kwasu sialowego, zmniejsza się tempo wytwarzania i stężenie osmolowe ogólnie utrzymuje się na poziomie niższym niż typowy dla określonego typu hodowanych komórek. Dla zwiększenia zawartości kwasu sialowego, stężenie osmolowe utrzymuje się w zakresie pomiędzy około 250-450 mOsm. Bardziej korzystnie, sposobem według wynalazku stężenie osmolowe utrzymuje się w zakresie pomiędzy około 300-450 mOsm, bardziej korzystnie w zakresie pomiędzy około 350-400 mOsm, najbardziej korzystnie około 400 mOsm.

W celu otrzymania niższej zawartości kwasu sialowego wybiera się stężenie osmolowe, które zwiększa specyficzną produktywność komórkową. W tym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku stężenie osmolowe utrzymuje się w zakresie pomiędzy około 350600 mOsm, bardziej korzystnie w zakresie pomiędzy około 450-550 mOsm.

Biegły w sztuce wie, że stężenie osmolowe zależy od stężenia osmolowie aktywnych cząsteczek w płynach hodowlanych i od kilku czynników, które wpływają na złożoność stężenia osmolowego w pożywkach do hodowli komórek ssaków. Początkowe stężenie osmolowe podłoża do hodowli określone test przez, skład podłoża do hodowli. Stężenie osmolowe mierzy się osmometrem, takim jak na przykład, sprzedawany przez Fisher Scientific, Pittsburg, Pensylwania, pod nazwą handlową OSMETTE (lub Osmette model 2007, rozprowadzany przez Precision Systems, Inc., Natick, MA). W celu otrzymania pożądanego stężenia osmolowego podłoża do hodowli można zmieniać różne jego składniki.

W celu zwiększenia stężenia osmolowego do podłoża do hodowli dodaje się substancji rozpuszczalnych, takich jak białka, peptydy, aminokwasy, zhydrolizowane białka zwierzęce, takie jak peptony, nie metabolizowane polimery, witaminy, jony, sole, cukry, metabolity, kwasy organiczne, lipidy. W jednym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, stężenie osmolowe kontroluje się dodając pepton do hodowli komórkowej, razem z innymi składnikami podłoża do hodowli w czasie procedury doładowywania hodowli.

Sposobem według wynalazku stężenie osmolowe utrzymuje się lub doprowadza do pożądanego zakresu przez dodanie poza peptonem, na przykład, podłoża podstawowego, włączając aminokwasy, różnych soli (na przykład, NaCl). W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku do podłoża dodaje sio na przykład, podłoża podstawowego zawierającego nadmiar aminokwasów (patrz, na przykład, podłoże „Super” Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr 5122469), glukozę i pepton.

Należy być świadomym, że w celu osiągnięcia pożądanego, opisanego powyżej zakresu stężenia osmolowego można też modyfikować stężenie innych składników podłoża do hodowli. Dzięki okresowej lub stałej kontroli w podłożu do hodowli stężenia na przykład, glukozy (pierwotnego źródła energii), także można utrzymywać stężenie osmolowe w opisanym pożądanym zakresie. Kontrola stężenia glukozy służy do dostarczenia odpowiedniego źródła węgla i jednocześnie do kontroli wytwarzania przez komórki gospodarza kwasu mlekowego. Ma to tę przewagę, że ogranicza spadek pH w podłożu do hodowli, który z kolei wymusza dodawanie czynnika zobojętniającego (na przykład, zasady, takiej jak Na₂CO₃ lub NaOH), powodującego wzrost stężenia osmolowego.

185 484

W celu utrzymywania stężenia osmolowego w pożądanym zakresie podłoża do hodowli dodaje się w dowolnym momencie prowadzenia hodowli komórkowych. W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku system do hodowli jest systemem hodowli z doładowaniem, a położę do hodowli dodaje się jednorazowo w czasie fazy wytwarzania hodowli. Ponadto podłoże można dodawać w czasie trwania fazy wytwarzania jak opisano infra.

Alternatywnie prowadzi się okresową kontrolę próbek podłoża do hodowli. Stężenie osmolowe podłoża do hodowli modyfikuje się w czasie doładowywania hodowli.

Biegli w sztuce zdają sobie sprawę, że procedury hodowli komórkowej sposobem, według wynalazku wybrano, żeby osiągnąć pożądany poziom sialowania wytwarzanych białek. Inne parametry procesu hodowli komórkowych, które wpływają na stopień sialowania a nie zostały tu opisane obejmują poziom tlenu i poziom glukozy. Na poziom sialowania wpływa także gęstość hodowli, czas i sposób przechowywania. Wynalazek obejmuje też te parametry procesu, które są dodatkowo najbardziej korzystne dla zwiększenia sialowania.

Odzyskiwanie glikoprotein.

Po fazie wytwarzania, polipeptydu, interesujący polipeptyd odzyskuje się z podłoża do hodowli znanymi w sztuce sposobami.

Korzystnie interesujący polipeptyd odzyskuje się podłoża do hodowli jako polipeptyd wydzielany, chociaż można go odzyskiwać także z lizatów komórek gospodarza.

W pierwszym etapie hodowlę komórek gospodarza lub lizat odwirowuje się żeby usunąć składniki cząsteczkowe. Następnie oczyszcza się polipeptyd z zanieczyszczających go białek i polipeptydów za pomocą następujących procedur, które są tu przykładowo wymienione: frakcjonowanie na kolumnach immunopowinowactwa lub jonowymiennych, precypitacja etanolem, HPLC odwrotnej fazy, chromatografia na żelu krzemionkowym lub na żywicach kationowymiennych, takich jak DEAE; ogniskowanie chromatograficzne; SDS-PAGE; precypitacja siarczanem amonu, filtracja na żelu przy użyciu, na przykład, Sephadex G-75 i kolumny A Sepharose żeby usunąć zanieczyszczenia, takie jak IgG. Do hamowania degradacji proteolitycznej polipeptydu w czasie izolacji używa się inhibitora proteaz, takiego jak fluorek fenylo-metylosulfonylu (PMSF). Biegli w sztuce wiedzą że odpowiednie dla danego polipeptydu sposoby oczyszczania mogą wymagać modyfikacji zależących od charakteru polipeptydu po wytworzeniu go przez zrekombinowane komórki ssaków.

Szczególnie korzystne do wykorzystania, sposobem według wynalazku są takie techniki i procesy oczyszczania, które pozwalana na wybranie węglowodanu według wynalazku. Pożądane glikoformy wytworzone sposobem według wynalazku można wzbogacić w cząsteczki zawierające więcej kwasu sialowego używając na przykład, jonowymiennej chromatografii na miękkim żelu lub HPLC przy użyciu kationo- lub anionowymiennych żywic, dziki którym odzyskuje się bardziej kwasowe formy.

Analiza glikoprotein

Jeśli bo konieczne część węglowodanową kompleksu glikoproteiny wytworzoną sposobem według wynalazku można łatwo przeanalizować za pomocą tradycyjnych technik analizy węglowodowanów. Na przykład, dobrze znane w sztuce techniki, takie jak bloting lektynowy, pozwalają określić proporcje końcowych grup mannozy lub innych cukrów takich lak galaktoza. Zakończenie pojedynczych, podwójnych, potrójnych i poczwórnych wystających oligosacharydów przez grupy kwasy sialowego można potwierdzić przez uwolnienie cukrów z białka za pomocą bezwodnej hydrazyny lub metod enzymatycznych i frakcjonowanie oligosacharydów za pomocą chromatografii jonowymiennej lub chromatografii wykluczania wielkości lub innych dobrze znanych w sztuce sposobów. Można także określić pi glikoprotein, przed i po traktowaniu neuramidazą w celu usunięcia kwasu sialowego. Wzrost pi po traktowaniu neuramidazą wskazuje na obecność kwasu sialowego w glikoproteinie.

Struktury węglowodanowe wytworzone sposobem według wynalazku występują na białkach wytwarzanych jako N-połączone lub O-połączone. N-połączone i O-połączone węglowodany różnią się strukturą rdzenia. N-glikozylacja oznacza przyłączenie reszty węglowodanu przez G1cNAc do reszty asparaginy w łańcuchu polipeptydowym. N-połączone węglowodany wszystkie zawierają pospolity motyw Man 1-6(Manl -3)ManP 1-4GlcNAcP 1-GlcNAe[31-Rshuturyy rdzenia. W opisanej strukturze rdzenia R oznacza resztę argininy wytworzonego białka. Sekwencja

185 484 peptydowa wytworzonego białka zawiera asparaginę-X-prolinę, asparaginę-X-treoninę i asparaginę-X-cysteinę, gdzie X oznacza każdy aminokwas oprócz proliny. O-połączone węglowodany charakteryzują się natomiast pospolitym motywem rdzenia, którym jest GalNAc przyłączony do grupy hydroksylowej treoniny lub seryny. Wśród N-połączonych i O-połączonych węglowodanów najważniejsze są złożone N- i O-połączone węglowodany. Takie złożone węglowodany zawierają kilka wystających struktur. Wystające pojedyncze, podwójne, potrójne i poczwórne struktury są ważne z punktu widzenia końcowego podstawienia kwasem sialowym. Takie wystające z łańcucha struktury stanowią dodatkowe miejsca dla specyficznych cukrów i ich połączeń, które zawierają węglowodany sposobem według wynalazku.

Wytworzone węglowodany analizuje się jednym ze znanych w sztuce sposobów włączając sposoby tu opisane. Kilka sposobów analizy glikozylacji jest znanych w sztuce i użytecznych sposobem według wynalazku. Takie sposoby dostarczają informacji dotyczących identyfikacji i składu oligosacharydu przyłączonego do peptydu. Sposoby analizy węglowodanów użyteczne sposobem według wynalazku, ale bez ograniczania, obejmują chromatografię lektynową; HPAEC-PAD, w którym do rozdzielenia oligosacharydów w oparciu o ich ładunek używa się żywic anionowymiennych o wysokim pH; NMR, spektrometrii masowej; HPLC; GPC; analizy kompozycyjnej monosacharydów, sekwencyjnego trawienia enzymatycznego.

Ponadto znane są sposoby uwalniania oligosacharydów. Metody te obejmują 1) metodę enzymatyczną, która z reguły prowadzi się przy użyciu peptydo-N-glikozydazy F/ endo-βgalatkozydazy; 2) metodę β-eliminacji, w której używa się ostrego środowiska zasadowego do uwolnienia głównie struktur O-połączonych; 3) metod chemicznych, w których używa się bezwodnej hydrazyny do uwolnienia zarówno N- jak i O-połączonych oligosacharydów.

Analizę prowadzi się w następujących etapach:

1. Dializa próbki przeciw wodzie dejonizowanej, w celu usunięcia wszystkich soli z buforów, a następnie liofilizację;

2. Uwolnienie nienaruszonych łańcuchów oligosacharydowych za pomocą bezwodnej hydrazyny;

3. Traktowanie nienaruszonych łańcuchów oligosacharydowych bezwodnych metanolowanym HCl w celu uwolnienia pojedynczych monosacharydów jako pochodnych O-metylowych;

4. N-acetylacja pierwszorzędowych grup aminowych;

5. Derywatyzacja w celu uzyskania per-O-trimetylosililometyloglikozydów;

6. Rozdzielenie tych pochodnych za pomocą kapilarnej GLC (chromatografii gazowocieczowej) na kolumnie CP-SIL8;

7. Identyfikacji poszczególnych pochodnych glikozydów przez określenie czasu zatrzymania na GLC i spektroskopii masowej, po porównaniu ze standardami;

8. Określenie ilościowe poszczególnych pochodnych za pomocą FID ze standardem wewnętrznym (13-O-metylo-D-glukoza).

Cukry obojętne i aminocukry można zidentyfikować za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii anionowymiennej połączonej z pulsową detekcją amperometryczną (HPAEPAD Carbohydrate System, Dionex Corp.). Na przykład, cukry uwalnia się przez hydrolizę w 20% (objętościowo/objętościowy) kwasie trójoctowym w temperaturze 100°C przez 6 godzin. Hydrolizaty następnie suszy się przez liofilizację lub na wirówce próżniowej (SpeedVac, Savant Instruments). Pozostałość rozpuszcza się w 1% roztworze trójwodnego octanu sodowego i analizuje na kolumnie HPLC-AS6, tak jak opisał Anumula i wsp. (Anal. Biochem. 195:269-280(1991).

Kwas sialowy można określić osobno przez bezpośrednie oznaczenie kolorymetryczne metodą Yao i wsp. (Anal. Biochem. 179:332-335 (1991)) stosując trzy powtórzenia. W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku używa się kwasu tiobarbiturowego (TBA) (Warren L., J. Biol. Chem. 238 (8) (1959)).

Alternatywnie węglowodany analizuje się metodą immunoblotingu. Wykonując tę metodę węglowodany związane z białkiem wykrywa się dostępnym w handlu systemem wykrywania glikanu (Boehringer), który jest oparty na procedurze oksydacyjnego immunoblotu

185 484 opisanej przez Haselbecka i Hosel (Haselbeek i wsp., Glycoeoojugatr J., 7:63 (1990)). Barwienie prowadzi się według zaleceń producenta, oprócz tego, że białka przenosi się na błony z dwufluorku winylydieou zamiast błon nitrocelulozowych i buforu blokującego zawierającego 5% albuminy surowicy bydlęcej 10 mM buforze Tris, pH 7,4 z dodatkiem 0,9% chlorku sodowego. Wykrywanie prowadzi się za pomocą przeciwciał przeciw digoksygenmie sprzężonych z fosfatazą alkaliczną (Boehriyger), roccirńccroir 1:1000 w buforze tris/chlorek sodowy i jako substratów dla fosfatazy używa się chlorku błękitu 4-yitrotetracolowego 0,03% (wagowo/objętościowy) i 5-bromo-4-chloro-3-mdoilo-fosforayu 0,03% (wagowo/objętościowy) w 100 mM buforze Tris, pH 9,5 zawierającym 100 mM chlorek sodowy i 50 mM chlorek magnezowy. Prążki białka zawierającego węglowodany przeważnie ukazują się po około 10 do 15 minutach.

Węglowodany można analizować również metodą trawienia peptydo-N-glikozydazą F. Według tej procedury pozostałość rozpuszcza się w 14 μΐ buforu zawierającego 0,18%, SDS, 18 mM e-merkaptoetayolu, 90 mM fosforanów, 3,6 mM EDTA, pH 8,6 i inkubujr w temperaturze 100°C przez 3 minuty. Po oziębieniu do temperatury pokojowej próbkę dzieli się na dwie równe części. Jednej części nie traktuje się niczym i służy ona jako kontrola. Do drugiej części dodaje się detergentu NP-40 do stężenia 1% i 0,2 jednostki prptzdo-N-glikocydacy F (Boohriygrr). Obie próbki ogrzewa się do temperatury 37°C i inkubie przez 2 godziny, a następnie analizuje za pomocą elektroforezy na żelu eoliakrylamidowzm z SDS.

Chimery receptor czynnika nekrotycznego oowotworów-immuooglobulioa.

W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku wytwarza się chimery receptor czynnika oekrotyczyego nowotworów (TN^Rj-I^munoglobulina (Ig). Szczególnie korzystne w tej klasie białek jest rozpuszczalne białko TNFR typu 1-I.gG,. Białko chimerowe TNFR1-IgG,, jest użyteczne w leczeniu lub diagnozowaniu wielu chorób i zaburzeń związanych z TNF. Termin „leczyć” oznacza tu zarówno profilaktykę „zapobieganie”, hamowanie (na przykład objawów) jak i leczenie istniejących stanów chorobowych. Stany patologiczne związane z TNF obejmują ale bez ograniczania, zakażenia wywołane przez gramdodatnie i gramujemne bakterie, szok rodotoksyoowz, reakcję odrzucania przeszczepu, gościec przewlekły postępujący, rumień systemowy, chorobę Crohna i inne choroby autoimmunologiczne i stany zapalne związane z TNF.

Preparaty TNFR1-IgG, wytworzone sposobem według wynalazku są użyteczne przy takich wskazaniach w których stwierdzono, że użyteczne są moooklonaloe przeciwciała przeciw TNF. Na przykład, na modelach zwierzęcych stwierdzono, ze monoklonalne przeciwciała przeciw TNF-alfa działają ochronnie w zastosowaniach profilaktzccyych (Tracey.K.J. i wsp., (1987) Naturę 330:662). W pierwszej fazie badań kliniccyych opisanych przez EKley^ A.R. i wsp., ((1990) Lancet 335:1275) stwierdzono, że mysie przeciwciała moyoklonalor przeciw zrekombioowanemu ludzkiemu TNF-alfa są bezpieczne, gdy podaje się je ludziom w stanie ostrego szoku septyccoego. TNFR1-IgG, jest użyteczny w leczeniu gośćca przewlekłego postępującego i szoku srptycznego.

Sposób leczenia choroby lub zaburzenia związanego z TNF polega na podaniu terapeutycznie aktywnej ilości preparatu TNFR1-IgG_; pacjentowi potrzebującemu leczenia. Korzystnym pacjentem jest człowiek.

Efektywna ilość preparatu glikoformy TNFR1-IgGi wytworzonej sposobem według wynalazku użyta do leczenia chorób lub zaburzeń leży w zakresie dawek pomiędzy 0,01-100 mg/pacjenta; korzystnie pomiędzy 1-75 mg/pacjenta i najbardziej korzystnie pomiędzy około 10-50 mg/pacjenta.

W celu podania preparat TNFR1-IgG, powinien być wykonany w postaci odpowiedniej farmaceutycznej lub terapeutycznej kompozycji. Taka kompozycja typowo zawiera terapeutycznie aktywną ilość preparatu TNFR1-IgG, i farmaceutycznie akceptowany nośnik, taki jak solanka, zbuforowana solanka, dekstroza lub woda. Kompozycja może także zawierać speczficcyr związki stabilizujące, takie jak cukry, włączając marnozę i manniMl oraz w przypadku kompozycji do wstrzykiwań miejscowe związki znieczulające, włączając lidokainę.

Sposób według wynalazku dostarcza kompozycji, która zawiera terapeutycznie aktywną ilość dodatkowego składnika aktywnego, takiego jak przeciwciała moooklooalor (na przy18

185 484 kład, przeciwciała przeciw TNF, przeciwciała przeciw Mac1 lub LFA1) lub innym receptorom związanym z wytwarzaniem TNF, na przykład, receptory IL-1 lub IL-2.

Korzystna kompozycja terapeutyczna do pojedynczej lub kombinowanej terapii, taka jak opisana powyżej, zawiera nowy preparat TNFR1-IgG! wytworzony sposobem według wynalazku, który charakteryzuje się przedłużonym klirensem z ciała człowieka a jednocześnie zachowuje znaczną aktywność działania. Taki przedłużony funkcjonalny czas półtrwania pozwala na uproszczone podawanie w postaci dawki pojedynczej i wpływa na aktywność in vivo. Korzystne chimery TNFR1-IgG₁ w kompozycjach terapeutycznych obejmują TNFR1IgG, i jego preparaty tu opisane, na przykład:

(1) preparaty TNFR1-IgG, zawierające złożone oligosacharydy zakończone jedną lub więcej reszt kwasu sialowego;

(2) preparaty TNFR1-IgG, których zakres wartości punktu izoelektrycznego pI wynosi pomiędzy 5,5 i 7,5, jak oznacza się metodą ogniskowania chromatograficznego, i których pI wrażliwe jest na traktowanie neuramidazą;

(3) preparaty TNFR1-IgG, mające około 1-2 mola dostępnych reszt N-acetyloglukozaminowych na 1 mol białka;

(4) preparaty TNFR1-IgG, mające stosunek molowy kwasu sialowego do białka około 4-7, szczególnie około 5-6;

(5) preparaty TNFR1-IgG_s mające stosunek molowy kwasu sialowego do reszt Nacetyloglukozaminowych od około 0,35 do około 0,5, bardziej korzystnie od około 0,4 do około 0,45.

Sposoby podawania pojedynczych i kombinowanych kompozycji terapeutycznych wytworzonych sposobem według wynalazku obejmują standardowe sposoby podawania, takie jak na przykład, infizje dożylne lub wstrzyknięcia jednorazowe.

Dostarcza się także sposobu użycia preparatu TNFR1-IgG, wytworzonego sposobem według wynalazku do wytwarzania medykamentów do leczenia ludzi i zwierząt.

Po ogólnym opisaniu wynalazku, będzie on lepiej zrozumiały dzięki odniesieniu do następujących przykładów, które zamieszczono są tu dla ilustracji sposobu według wynalazku, a nie dla jego ograniczenia, chyba, że napisano inaczej.

Przykłady

Przykład I

Działanie biologiczne TNF-alfa i TNF-beta zależy od dwóch specyficznych receptorów (Dembic i wsp., (1990) Cytokines, 2:231). Klonowanie molekularne wykazało istnienie dwóch osobnych typów receptorów TNF (TOFR) o różnych masach cząsteczkowych 55 kD (typ 1) (Shall i wsp., (1990) Cell 61:361) i 75 kD (typ 2) (Smith i wsp., (1990) Science 248:1019), jednakże każdy z nich w naturze wiąże się zarówno z TNF-alfa i TNF-beta (Loetscher i wsp., (1990) Cell 61: 351; Shall i wsp., (1990) Celi 61:361; Kohno i wsp., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8331). Zewnątrzkomórkowe części obu receptorów znaleziono w stanie naturalnym jako rozpuszczalne białka wiążące TNF (Kohno i wsp., supra). Stworzono także agony TNF blokujące działanie TNF w różnych chorobach immunologicznych i stanach zapalnych (Peppel i wsp., (1991) J. Exp. Med. 174: 1483-1489; Ulich (1993) Am. J. Path. 142:1335-1338; Howard O.M.Z. (1993) Pnie. Natl. Acad. Sci. USA 90:2335-2339; Wooley P.H. (1993) J. Immunol. 151:6602-6607). Jeden z takich agonów (Werner i wsp., (1991) J. Celi. Biochem. Abstracts 20^:ίι Annual Meeting s. 115) łączy w sobie zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego 55 kD TNF typu 1 i część zawiasową oraz region Fc ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny G,.

W tym przykładzie hoduje się komórki ssaków transfekowane wektorem zawierającym cDNA kodujące białko chimerowe TN FR1 - IgG_P

Metody

A. Linie komórkowe

Użyta jako ssacze komórki gospodarza linia komórek jajnika (chomika chińskiego (CHO) została wyprowadzona z komórek CHO-K1 (ATCC No CCL61 CHO-K1). Mutanta komórek CHO-K1 pozbawionego aktywności reduktazy dwuwodorofolianu o oznaczeniu CHO-K1 DUX-B11 (DHFR) (otrzymanego od Dr Chasina Columbia University: Simonsen.

185 484

C.C. i Levinson, A.D. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:2495-2499; Urlaub G. i Chasin, L. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216-4220) użyto do otrzymania linii komórek 0 zmniejszonym zapotrzebowaniu na insulinę przez transfekcję wektorem zawierającym cDNA preproinsuliny (Sures i wsp., (1980) Science 208:57-59). Wybrany klon oznaczony dp12.CHO wymaga do wzrostu glicyny, hipoksantyny i tymidyny, ma więc genotyp DHFR.

B. Konstrukcja rozpuszczalnego białka chimerowego TNFRl-IgG,

Rozpuszczalne białko chimerowe TNFR1-IgG, konstruuje się przez fuzję genów zewnętrzkomórkowej domeny ludzkiego TNF typu 1 i części zawiasowej oraz domen C_H2 i C_H3 ciężkiego łańcucha IgG, (dalej oznaczone jako TNFR1-IgG,).

Sekwencję DNA kodującą ludzkie TNFR typu 1 (patrz Loetscher i wsp., (1990) Cell 61:351) otrzymano z plazmidu pRK-TNF-R (Shall i wsp., (1990) Cell 61:361). Do otrzymania tego plazmidu 2,1 kpz klon łożyskowego cDNA (Shall i wsp., supra) wstawiono w ssaczy wektor ekspresyjny RK5, konstrukt ten opisano w EP Pub. Nr 307,247, opublikowanej 15 marca 1989. Ten cDNA zaczyna się od 64 nukteotydu sekwencji opisanej przez Loetscher i wsp. ze startową metioniną 118 pz poniżej.

Źródłem sekwencji kodującej IgG, jest plazmid pRKCD4₂F_c, zawierający CD4-IgG (Capon D. J. Nature 337:525 (1989); Bym i wsp., Nature 344:667 (1990)). Plazmid ten zawiera sekwencję cDNA kodującą hybrydowy polipeptyd zawierający reszty 1-180 dojrzałego ludzkiego białka CD4 (dwa N-końcowe zmienne domeny CD4) połączone z sekwencją ludzkiej IgG, zaczynającą się od kwasu asparaginowego w pozycji 216 (przyjmując, że aminokwas 114 jest pierwszym aminokwasem regionu ciężkiego stałego łańcucha (Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie 4, (1987)) i jest pierwszą resztą regionu zawiasowego IgG, po reszcie cysteiny, biorącej udział w wiązaniu łańcuch ciężkilekki), a kończąca się na reszcie 441, to znaczy że zawiera domeny dH2 i Ch3 Fc IgG,.

TNFR1-IgG, konstruuje się tworząc fragmenty restrykcyjne plazmidów pRK-TNF-R 1 pRKCD4₂Fc i łącząc je przy zastosowaniu techniki mutagenezy delecyjnej w ten sposób, że reszta treoniny 171 dojrzałego TNFR jest nałożona na resztę kwasu asparaginowego 216 ciężkiego łańcucha IgG, (Kabat i wsp. supra). Powstający plazmid pRKTNFR-IgG zawiera pełnej długości sekwencję kodująca TNFR1-IgG,.

C. Hodowla komórek

Gen kodujący rozpuszczalny TNFR typu 1 -IgG, wprowadza się do komórek dp12.CHO metodą transfekcji. Do transfekcji DNA do komórek ssaków używa się metody precypitacji fosforanem wapniowym. Dwa dni po transfekcji komórki odtrypsynizowuje się i przesiewa do podłoża selekcjonującego (podłoże Ham F12 DMEM w stosunku objętościowym 1:1 z dodatkiem 2% dializowanej surowicy bez glicyny-hipoksantyny-tyminy). Wyizolowane klony bada się pod kątem wytwarzania TNFR1-IgG,. Klony wytwarzające TNFR1-IgG, namnaża się w obecności metotreksatu co powoduje powstanie klonów o wysokiej ekspresji, a następnie stopniowo adaptuje do podłoża bez surowicy. Komórki takie hoduje się w warunkach stałej presji czynników selekcjonujących do momentu zaszczepienia podłoża nieselektywnego w celu umożliwienia im dalszego wzrostu.

W celu dostosowania komórek wytwarzających TNFR1-IgG, do wzrostu w hodowli komórkowej opisane powyżej klony rosnące w obecności metotreksatu namnaża się przez kilkakrotne przesiewanie do naczyń hodowlanych o coraz większych objętościach w podłożu nie zawierającym metotreksatu.

W tych etapach procesu stosuje się nieselektywne podłoże hodowlane DMEM/HAM F-12 oparte na formule (patrz na przykład, Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych 5122469) ze zmienionymi stężeniami niektórych składników, takich jak glukoza, aminokwasy, sole, cukry, witaminy, glicyna, hipoksantyna, tymidyna, zrekombinowana ludzka insulina; hydrolizat peptonu (Primatone HS lub Primatone RL), związek chroniący komórki, taki jak Pluronic f68 (pluronic polyol) lub odpowiednik, Gentamycyna, lipidy i elementy śladowe.

Hodowlę prowadzi się w warunkach kontrolowanego pH 7,2 +/-0,4 dzięki użyciu gazowego CO₂ i/lub zasadowego Na₂CO₃. W czasie wzrostu, temperaturę utrzymuje się około 37°C. Poziom rozpuszczonego tlenu utrzymuje się powyżej 5% nasycenia powietrza dzięki bezpośredniemu napowietrzaniu powietrzem i/lub tlenem.

185 484

Stężenie osmolowe w czasie fazy zwiększania inokulum utrzymuje się pomiędzy około 250 mOsm i 350 mOsm.

Po fazie wzrostu hodowli następuje druga faza lub faza przejściowa w czasie trwania której parametry hodowli zmienia się z optymalnych dla wzrostu na odpowiednie dla fazy wytwarzania. W czasie fazy przejściowej obniża się temperaturę hodowli, ogólnie do około 30-35°C, dodaje się maślan i ustala stężenie osmolowe na odpowiednim poziomie. Wytwarzany produkt analizuje się pod kątem ilości kwasu sialowego.

W typowym schemacie wytwarzania około 1,2x10^fc komórek pochodzących z inokulum z fazy selekcji hoduje się w czasie fazy wzrostu wychodząc z poziomu stężenia osmolowego 300 mOsm. Podłoże do hodowli wzbogaca się w substancje śladowe, zrekombinowaną ludzką insulinę i hydrolizat peptonu. W tych warunkach hoduje się komórki przez 2 dni. Na początku trzeciego dnia hodowli obniża się temperaturę hodowli. Jednocześnie z obniżeniem temperatury do hodowli dodaje się maślan sodowy i poprzez dodanie różnych składników podłoża doprowadza się stężenie osmolowe do pożądanego poziomu. W tych warunkach hoduje się komórki 9-10 dni ciągle je dokarmiając. Komórki dokarmia się różnymi składnikami podłoża wtedy kiedy to konieczne.

Tabela 1 opisuje warunki wytwarzania różnych procesów produkcyjnych.

Tabela I

Wersja procesu	Stężenie maślanu	Stężenie osmolowe w czasie fazy wytwarzania mOsmol/kg	Specyficzna produktywność komórkowa pomiędzy dniem5 i 10 (pg/d)	Zawartość kwasu sialowego w TNFR1-IgG, po 10 dniach (mohmol)
A	1	360-420	0,6-1,5	6,4-7,2 N=4
B	1	480-510	1,7-2,2	6,0-6,3 N=3
C	6	460	4,8	4,7 N=1
D	6	370-420	2,4-2,8	5,5-5,6 N=3
E	6	350-370	1,4-2,2	5,4-6,3 N=3
F	12	390	4,0	5,3 N=1
G	12	490-510	2,9-5,2	4,0-5,2 N=4
H	12	400-430	2,0-2,8	5,8-6,0 N=3
I	12	370-380	2,0-2,2	5,5-5,9 N=3

D. Odzyskiwanie TNFRł-IgG,

Białko chimerowe TNFR1-IgG, oczyszcza się do homogenności większej niż 95% metodą chromatografii powinowactwa na immobilizowanym białku A Staphylococcus aureus jak opisał (Capon i wsp., supra).

E. Analiza węglowodanów

Zawartość kwasu sialowego analizuje się metodą opisaną przez (Warren L., (1959) J. Biol. Chem. 234:1971-1975).

Wyniki

Narysowano wykres zależności specyficznej produktywności komórkowej każdej hodowli opisanej w tabeli 1 od zawartości kwasu sialowego w zebranym produkcie. Wyniki przedstawiono na fig. 1. Najwyższą zawartość kwasu sialowego obserwowano, gdy utrzymywano odpowiednie parametry procesu, stężenie osmolowe pomiędzy około 360 i 420 mOsm i stężenie maślanu około 1 mM. Zmieniając parametry hodowli można kontrolować w szerokim zakresie zawartość kwasu sialowego.

Przykład II

Ocenia się farmakokinetyczny czas półtrwania i/lub klirens rożnych preparatów. Preparaty charakteryzujące się wyższa zawartością kwasu sialowego wykazują zwiększony czas półtrwania i/lub niższy klirens całkowity w porównaniu do preparatów charakteryzujących się niższą zawartością kwasu sialowego.

185 484

Metody

Siedemnaście samców szczura rasy Spraąue-Dawley ważących 272-315 g losowo dzieli się na trzy grupy traktowane białkiem chimerowym TNFRl-IgG, (N=5 lub 6). Zwierzętom podaje się materiał dożylnie do żyły udowej w dawce nominalnej 5 mg/kg. Materiał zawierał dwa preparaty TNFRl-IgG, z procesu w którym stężenie maślanu w czasie trwania fazy wytwarzania wynosiło 6 mM, a stężenie osmolowe utrzymywano na poziomie około 400 mOsm (Proces I) i trzeci preparat z procesu w którym stężenie maślanu w czasie trwania fazy wytwarzania wynosiło 12 mM, a stężenie osmolowe utrzymywano na poziomie około 500 mOsm (Proces II). Pobiera się 2 ml próbki krwi na EDTA (8,5%) przed wstrzyknięciem, i w 5 minucie oraz 2, 6, 10, 24, 34, 48, 56, 72, 96 i 120 godzinie po wstrzyknięciu dawki. Próbki krwi odwirowuje się, zbiera się surowice i próbki analizuje się pod kątem zawartości białka chimerowego TNFR1-IgG,.

Do oceny ilości TNFR1-IgG, w surowicy krwi używa się enzymatycznego imununosorpcyjnego testu biologicznego wiązania (ELIBA). Test ten oparty jest na zdolności TNFalfa sprzężonego z peroksydazą korzenia chrzanu (TNF-alfa-HPR) do wiązania się z częścią receptorową białka chimerowego TNFR1-IgG,. W tym teście do wiązania TNFRl-IgG^i, dzięki interakcji z częścią Fc cząsteczki, używa się płytek do mikrotitracji opłaszczonych fragmentem Fab przeciwciała IgGFc kozy przeciw człowiekowi. Do studzienek dodaje się TNFalfa-HPR i pozwala związać się z częścią receptorową białka chimerowgo TNFR1-IgG,. Ocenę ilościową prowadzi się za pomocą kolorymetrycznej oceny intensywności koloru wytworzonego w reakcji peroksydazy z nadtlenkiem i ortofenylenodiaminą (OPD). Zakres testu wynosi 0,003 do 0,02 mg/ml. Nie stwierdzono wpływu obecności EDTA w próbkach surowicy na wyniki testu.

Dawki normalizuje się biorąc pod uwagę różnice stężeń użytych roztworów. Wszystkie obliczenia oparto na zależności stężenia od czasu we wszystkich testowanych punktach czasowych do 120 godzin. Odcięty obszar pod krzywą (AUC_o.i₂o) oblicza się ze wzoru na pole trapezu i oblicza się zależność ciężar-normalizowany odcięty klirens (CLo_₁₂oW) jako dawka/AUCo-20.

Wyniki

Klirens zależy od wersji procesu użytego do wytwarzania białka (proces I w porównaniu z procesem II) i od ilości kwasu sialowego obecnego w produkcie. W tabeli II przedstawiono wartości klirensu dla poszczególnych zwierząt, średniej i odchylenia standardowego. Białko wytworzone w procesie I charakteryzuje się wolniejszym klirensem.

Tabela II

Klirens 0-120 (ml/godzinę/kg)

	Proces I	Proces I	Proces II
	2,12	2,08	2,144
	2,03	2,31	2,99
	1,63	2,20	2,61
	1,89	2,22	3,27
	1,85	1,99	2,82
		1,66	3,42
	1,91	2,08	2,88
	0,02	0,23	0,45
średnia	1,91	2,08	2,88
STDEV	0,02	0,23	0,45

185 484

Przykład III

Skład monosacharydowy w TNFR1-IgG1

Określenie składu oligosacharydu i struktury TNFR1-IgG₁wytwordoeego tak jak opisano w przykładzie I wykazało, że zawartość kwasu sialowego zmieniała się w zależności od użytego procesu wytwarzania. Gwałtowny klirens z surowicy związany jest z dużą dostępnością GlcNAc, niższą ilością kwasu sialowego w łańcuchach oligosacharydowych i (przez interferencję) dostępem białka do receptorów manozy i galaktozy. Wolny klirens z surowicy jest związany z większą ilością końcowych reszt kwasu sialowego.

A. Źródła materiału testowego

TNFR1-IgG, wytwarza się sposobem opisanym w przykładzie I powyżej. Materiał oznaczony proces I wytworzono za pomocą hodowli komórkowej rosnącej w czasie trwania fazy wytwarzania w stężeniu maślanu 6 mM, a stężenie osmolowe utrzymywano na poziomie około 400 mOsm. Materiał oznaczony proces II wytworzono za pomocą hodowli komórkowej rosnącej w czasie trwania fazy wytwarzania w stężeniu maślanu 12 mM, a stężenie osmolowe utrzymywano na poziomie około 500 mOsm.

B. Metody

Uwolnione nienaruszone cukry obojętne i aminocukry identyfikuje się za pomocą chromatografii anionowymiennej w wysokim pH połączonej z pulsową detekcją amperometryczną.

Analizę prowadzi się w następujących etapach:

1. Wymiana buforu próbki TNFR1-IgG, (około 50 pg/ml) i odpowiednich próbek odniesienia, tak że próbki końcowe zawierają 1% kwasu octowego.

2. Około 90 pg TNFR1-IgG, i odpowiednich próbek odniesienia zamraża się w łaźni suchy lód z alkoholem i zamrożoną próbkę liofilizuje się przez noc.

3. Zliofilizowane próbki zawiesza się w 500 pl kwasu trój chlorooctowego i inkubuje w temperaturze 120°C przez 1 godzinę.

4. Po kwaśnej hydrolizie TNFR1-IgG, i odpowiednie próbki odniesienia oziębia się i odparowuje do sucha.

5. Próbki zawiesza się w wodzie do stężenia końcowego około 0,6 mg/ml.

6. Rozdział monosacharydów prowadzi się w temperaturze pokojowej metodą chromatografii anionowymiennej w wysokim pH połączonej z pulsową detekcją amperometryczną na kolumnach Dionex CarboPac PA1 (4x250 mm) (Dionex Corp., Sunnyvale, CA).

7. Ocenę ilościową poszczególnych monosacharydów prowadzi się w oparciu o monosacharydy odniesienia.

C. Wyniki

Względną zawartość molamą każdego monosacharydu w dwóch preparatach pokazano w tabeli III poniżej.

Tabela III

Względna zawartość molama monosacharydów w dwóch preparatach TNFR1-IgG1

Monosacharyd	Proces I	Proces II
Fukoza	4,3±0,2	4,4
Galaktoza	6,5±0,0	4,7
Mannoza	12,2±0,6	12,5
N-acetyloglukozamma	14,1±0,6	14,3
Kwas sialowy	4,9±0,3	3,7±0,3
Nlacetylogalaktozamlea	0,5±0,1	0,3
Stosunek kwas sialowy/GlcNAc	0,35	0,26

Wyniki powyższe pokazują że wybrane parametry fazy wytwarzania procesu wytwarzania glikoproteiny wpływają na skład węglowodanowy dojrzałej glikoproteiny. Preparaty

185 484 mające wyższą zawartość kwasu sialowego wykazują ogólnie dłuższy czas półtrwania w surowicy.

Tabele IV i V przedstawione poniżej pokazują skład węglowodanowy bocznych łańcuchów oligosacharydowych preparatu chimerowego TNFR1-IgG1 wytworzonego w warunkach według procesu I i procesu II. Tabela V pokazuje dane dla węglowodanów części receptorowej chimerowej cząsteczki, po odjęciu miejsc glikozylacji F_c.

Tabela IV

	PI	PI	PI	PI	PII	PII
Kwas sialowy	5,8	5,8	5,7	5,8	3,7	3,5
Fukoza	4,0	4,0	3,6	4,1	4,4	4,3
Gal NAc	0,3	0,2	0,2	0,4	0,3	0,4
Glc NAc	12,9	15,0	14,8	14,3	14,3	14,4
Gal	7,4	7,6	7,1	7,0	4,7	4,1
Man	12,0	12,0	10,0	12,0	12,5	11,9
Stosunek kwas sialowy/GlcNAc	0,45	0,39	0,39	0,41	0,26	0,24

Tabela V

	PII	PII	PI	PI
Moee' dostępnych GlcNac na mol	3,18	3,2	1,11	1,32
Mole dostępnych Gal na mol	0,97	-0,08	1,45	-0,26
Gal anteny	4,47	4,72	6,45	6,24
kwas sialowy na mol	3,5	4,8	5,00	6,5

Wyniki przedstawione w tabeli IV i V pokazują, że skład TNFR1-IgG1 jest typowy pod względem zakończonych kwasem sialowym pojedynczych, podwójnych, potrójnych, poczwórnych złożonych oligosacharydów. Można wywnioskować, że TNFR1-IgG, wytworzony według procesu I zawiera znacząco większą porcję kwasu sitalowego i znacząco mniejszą porcję dostępnych grup GlcNAc. Zawartość kwasu sialowego na mol białka wskazuje, że ten materiał powinien mieć niższy punkt izoelektryczny niż materiał wytworzony w procesie II. Po porównaniu z wynikami z tabeli II wyniki te wskazują również na wolniejszy klirens z surowicy krwi materiału z procesu I co koreluje z niższą dostępnością grup GlcNAc i ogólną wyższą zawartością kwasu sialowego.

Tabele IV i V wskazują, że preparaty TNFR1-IgG, zawierają złożone oligosacharydy zakończone jedną lub więcej reszt kwasu sialowego. Korzystne preparaty TNFR1-IgG, zawierają cząsteczki TNFR1-IgG, mające około 1-2 mole dostępnych reszt N-acetyloglukozaminy na mol białka. Stosunek molowy kwasu sialowego do białka wynosi 4-7. Preparaty TNFR1-IgG, mają stosunek molowy kwasu sialowego do N-acetyloglukozoaminy około 0,4 do około 0,45.

Przykład IV

Wartość pi preparatów o wysokim stopniu sialowania jest niższa niż wartość pI preparatów o niskim stopniu sialowania.

Metody

Różne preparaty opisane w przykładzie II zbadano metodą ogniskowania izoelektrycznego. Żele użyte w metodzie ogniskowania izoelektrycznego rozdzielają glikoproteiny obecne w preparatach według ich punktu izoelektrycznego, pi, dzięki wykorzystaniu gradientu pH tworzonego przez amfolity o różnym pH. W tym badaniu, prowadzono analizę preparatów przy użyciu gradientu pH od 10 do 4.

185 484

Wyniki

Badanie metodą ogniskowania chromatograficznego wykazało, że preparaty TNFR1IgG, mają punkty izoelektryczne w zakresie około 5,5 do około 7,5, a pI jest wrażliwy na trawienie neuramidazą

Odnośniki cytowane powyżej są włączone w zakres wynalazku.

Chociaż wynalazek opisano w połączeniu ze specyficznymi przykładami wykonania, jest zrozumiałe, że można go poddawać dalszym modyfikacjom. Zgłoszenie to jest tak napisane, aby objąć wszystkie zmiany, sposoby użycia lub adaptacje sposobu według wynalazku, które ogólnie trzymają się sposobu postępowania sposobem według wynalazku, włączając takie zmiany obecnego opisu, które wynikają z praktyki w dziedzinie do której wynalazek jest przewidziany i które mają istotne cechy objęte zakresem dołączonych zastrzeżeń.

185 484

Ο 1 10⁷ 2 ΙΟ⁷ 3 ίο⁷ 4 ίο⁷ 5 ΙΟ⁷ 6 ΙΟ⁷ 7 ΙΟ⁷ żywe dni hodowlane

Fig ΙΑ

100'

90'

80'

-Ρ λ:

Ο μ

Ch

Φ

Η

C φ

•Ν

Φ*

-Ρ σι

75 ./-0 04

70'

60’

50’ ’

30' ·« f*

10' ο '

Ζ ·* 6 8 10 1Ζ '·* ^PCV dni

185 484

Zawartość NANA w zależności od specyficznej produktywności komórkowej

Zawartość ΝΑΝΑ w zebranym

ność komórkowa

Fg. 2A

Zawartość NANA w zależności od specyficznej produktywności komórkowej PCV

S >1 c

rt μ

o

N <

Z

Ό xn

O

-U μ

(0

IS3 i ^s·⁵

8° α β ▲ c O o β £ O F ♦ o

Δ H ▼ I s <^s

O 4

CU

S

05 1 15 specyficzne produktyw- (a/i/d) ność PCV

Fg . 28

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł

Claims (23)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób kontroli zawartości kwasu sialowego w bocznym łańcuchu oligosacharydowym ssaczych glikoprotein wytwarzanych w hodowli ssaczych komórek gospodarza, obejmujący etap hodowli ssaczych komórek gospodarza w fazie wytwarzania tej hodowli, znamienny tym, że do hodowli dodaje się kwas alkanowy lub jego sole w stężeniu około 0,1 mM do około 20 mM i utrzymuje się stężenie osmolowe hodowli komórkowej na poziomie około 250 do 600 mOsm i temperaturę hodowli utrzymuje się pomiędzy 30°C i 35°C.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ilość kwasu sialowego obecnego w bocznych łańcuchach oligosacharydowych glikoproteiny jest zwiększona, przy czym specyficzna produktywność hodowli komórkowej jest zmniejszona poprzez hodowanie komórek gospodarza w stężeniu kwasu alkanowego lub jego soli pomiędzy 1 mM do około 6 mM i utrzymywanie stężenia osmolowego na poziomie około 300-450 mOsm.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że komórkami gospodarza są komórki

   CHO.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że kwasem alkanowym lub jego solą jest maślan sodowy.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarzmąglikoproteinąjest chimera receptor czynnika nekrozy nowotworów-immunoglobulina.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że komórkami gospodarza są komórki dhfr CHO transfekowane wektorem niosącym cDNA kodujący rozpuszczalną chimerę receptora czynnika nekrozy nowotworów typu 1 i TNFR1-lgG].
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ilość kwasu sialowego obecnego w bocznych łańcuchach oligosacharydowych glikoprotein jest zmniejszona, przy czym specyficzna produktywność hodowli komórkowej jest zwiększona przez hodowanie komórek gospodarza w stężeniu kwasu alkanowego lub jego soli pomiędzy około 6 mM do około 12 mM i utrzymywanie stężenia osmolowego na poziomie około 450-600 mOsm.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że komórkami gospodarza są komórki

   CHO.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że kwasem alkanowym lub jego soląjest maślan sodowy.
10. 10. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że wytwarzaną glikoproteiną jest chimera receptor czynnika nekrozy nowotworów-immunoglobulina.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że komórkami gospodarza są komórki linii dhfr CHO transfekowane wektorem niosącym cDNA kodującym rozpuszczalną chimerę receptor czynnika nekrozy nowotworów typu 1-immunoglobulina TNFR1-IgG_P
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w fazie produkcyjnej hodowli komórkowej komórki hoduje się w obecności maślanu sodowego w stężeniu od 6 mM do 12 mM, a stężenie osmolowego w czasie trwania fazy wytwarzania na poziomie około 450-600 mOsm.
13. 13. Sposób wytwarzania białka chimerowego receptor czynnika nekrozy nowotworówimmunoglobulina TNFR1-IgG,, znamienny tym, że hoduje się ssacze komórki gospodarza w hodowli w fazie wzrostu w obecności maślanu sodowego w stężeniu 0,1 mM do około 6 mM, a stężenie osmolowe utrzymuje się w czasie trwania fazy wytwarzania na poziomie około 300-450 mOsm.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się komórki cHo.
15. 15. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako komórki, gospodarza stosuje się komórki linii dp12.CHO.

    185 484
16. 16. Preparat zawierający TNFR1-IgG„ znamienny tym, że cząsteczki TNFR1-IgG, posiadają stosunek molowy kwasu sialowego do białka wynoszący 4 do 7.
17. 17. Preparat TNFR1-IgG,, znamienny tym, że cząsteczki TNFR1-TgG, posiadają 1-2 cząsteczek dostępnych reszt N-acetyloglukozaminowych na mol białka TNFR1-IgG_t.
18. 18. Preparat TNFR1-IgG_l5 znamienny tym, że cząsteczki TNFR1-IgG, posiadają stosunek molowy kwasu sialowego do N-acetyloglukozaminy wynoszący 0,35 do 0,5.
19. 19. Preparat TNFR1-IgG,, według zastrz. 18, znamienny tym, że cząsteczki TNFR1IgG, posiadają stosunek molowy kwasu sialowego do N-acetyloglukozaminy wynoszący 0,39 do 0,45.
20. 20. Kompozycja terapeutyczna zawierająca preparat TNFR1-IgG_l9 znamienna tym, że cząsteczki TNFR1-IgG^! posiadają stosunek molowy kwasu sialowego do białka wynoszący 4 do 7 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
21. 21. Kompozycja terapeutyczna zawierająca preparat TNFR1-IgG_b znamienna tym, że cząsteczki TNFR1-IgG, posiadają 1-2 moli dostępnych reszt N-acetyloglukozaminowych na 1 mol białka TNFR1-TgG, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
22. 22. Kompozycja terapeutyczna zawierająca preparat TNFR1-IgG_t, znamienna tym, że cząsteczki TNFR1-IgG^, posiadają stosunek molowy kwasu sialowego do reszt N-acetyloglukozaminowych 0,35 do 0,5 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
23. 23. Kompozycja terapeutyczna według zastrz 22, znamienna tym, że cząsteczki TNFR1-IgG, mają stosunek molowy kwasu sialowego do reszt N-acetyloglukozaminowych wynoszący 0,39 do 0,45 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.