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KR19990022473A - 포유 동물 세포 배양으로 생산되는 단백질의 시알릴화 조절 방법 - Google Patents

포유 동물 세포 배양으로 생산되는 단백질의 시알릴화 조절 방법 Download PDF

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KR19990022473A
KR19990022473A KR1019970708954A KR19970708954A KR19990022473A KR 19990022473 A KR19990022473 A KR 19990022473A KR 1019970708954 A KR1019970708954 A KR 1019970708954A KR 19970708954 A KR19970708954 A KR 19970708954A KR 19990022473 A KR19990022473 A KR 19990022473A
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토마스 라일
베르너 레슬라우어
토마스 쉬레이트물러
볼프강 리히터
Original Assignee
프리돌린 클라우스너, 롤란드 비. 보레르
에프. 호프만-라 로슈 아게
스티븐 레인스, 다릴 비. 윈터
제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 세포 배양 환경을 조종함으로써 생산되는 당단백질의 시알산 함량을 넓은 범위의 수치에 걸쳐 조절하는, 포유동물 세포 배양에 의한 당단백질 제조를 위한 신규 방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포 단위 생산성에 영향을 미치는 세포 배양 변수의 변화로 인한 당단백질의 시알산 함량이 조정되는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에는 세포 배양의 생산기 동안 전사 증진제의 농도뿐 아니라 세포 배양의 삼투질 농도도 조절되는 세포 배양 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 가용성 타입 1 종양괴사인자-면역글로불린 G1의 신규 제제, 및 염증성 또는 면역 관련 질환의 치료 분야에서의 이들의 용도를 제공한다.

Description

포유동물 세포 배양으로 생산되는 단백질의 시알릴화 조절 방법
유망한 예방 및 치료제로 생산된 재조합 단백질의 임상 응용이 멀지 않게됨에 따라 재조합으로 생산된 당단백질의 글리코실화 패턴 사이의 차이점들이 최근에는 과학계의 많은 관심을 받는 주제가 되었다. 당단백질의 올리고사카라이드 측면 사슬은 단백질의 기능 (Wittwer A., Howard, S.C. (1990) Biochem. 29:4175-4180), 및 형태를 초래하는 당단백질 부분들 사이의 분자내 상호작용에 영향을 끼치며 당단백질의 삼차원적 표면을 보여준다 (Hart, (1992) Curr. Op. Cell Biol., 4:1017-1023; Goochee, et al., (1991) Bio/Technoloty, 9:1347-1355; Parekh, R.B., (1991) Curr. Op. Struct. Biol., 1:750-754). 올리고사카라이드는 특수한 세포 탄수화물 수용체를 기초로 주어진 폴리펩티드를 특정한 구조물로 보내는 데 소용이 될 수도 있다 (Bevilacqua, M.P. Nelson, R.M., (1993) J. Clin. Invest. 91:379-387; Nelson, R.M. et al., (1993) J. Clin. Invest. 91:1157-1166; Norgard, K.E. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1068-1072; Imai, Y. et al., (1993) Nature 361:555-557). 당단백질 올리고사카라이드 측면 사슬의 말단 시알산 성분은 당단백질의 흡수, 혈청내 반감기 및 혈청으로부터의 청소율뿐 아니라 물리적, 화학적 및 면역원적 성질에 영향을 미친다 (Parekh, R.B., 상게서; Varki, A., (1993) Glycobiology 3:97-100; Paulson, J. (1989) TIBS 14:272-276; Goochee et al., (1991) Biotechnology 9:1347-1355; Kobata, A. (1992) Eur. J. Biochem. 209:483-501). 따라서 당단백질, 특히 치료제로 사용하려는 당단백질의 시알산 함량을 유지시키는 것은 중요하다.
배양 방식 (흡착 또는 현탁), 배지 조성 중의 우태아 혈청, 배양 밀도, 산소공급, pH, 정제 과정 등과 같이 재조합 단백질 생산시에 글리코실화에 영향을 미치는 요소들에 많은 주의를 기울여 왔다 (Werner, R. Noe, W. (1993), Drug Res. 43:1134-1249; Hayter et al., (1992) Biotech. and Bioeng. 39:327-335; Borys et al., (1994) Biotech. and Bioeng. 43:505-514; Borys et al., (1993) Bio/technology 11:720-724; Hearing et al., (1989) J. Cell Biol. 108:339-353; Goochee et al., Frontiers in Bioprocessing II, Todd et al.편 (1992) American Chemical Society pp. 199-240 중; 미국 특허 제5,096,816호; Chotigeat, W., (1994) Cytotech. 15:217-221). 몇몇 그룹에서는 재조합 단백질의 생산을 둘러싼 공정 변수 및 특히 재조합 단백질 생산시 배지 조성의 효과를 조사하였다 (Park et al., (1992) Biotech. Bioeng. 40:686-696; Cox McClure (1983) In Vitro. 19:1-6; Mizutani et al., (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:664-669; Le Gros et al., (1985) Lymph. Res. 4(3):221-227).
부티르산과 같은 알칸산의 첨가는 재조합 세포 배양에서 외래 DNA의 일시적인 발현을 가져오는 것으로 알려져 있다 (Prasad Sinha (1976) In Vitro. 12:125-132; 일본 특허 출원 제62-48935호; 일본 특허 출원 제55-150440호; Klehr et al., (1992) Biochem. 31:3222-3229; Gorman Howard (1983) Nucleic Acid Res. 11:7631-7648). 그러나 부티르산나트륨은 단백질 생산 (Milhaud (1980) J. Cell Physiol. 104:163-170; 영국 특허 공개 제2 122 207A호)과 여러 세포주 및 배지 조성 (D'Anna et al., (1980) Biochem. 19:2656-2671; Hagopian, H.K. (1977) Cell 12:855-860)에 걸쳐 유전자 발현에 대한 효과를 갖는데 이것은 부티르산 이온이 유전자 발현을 조절하거나 (Yuan et al., (1985) J. Biol. Chem. 3778-3783) 일부 유전자의 발현을 억제할 (Yuan et al., 상게서) 수도 있다는 것을 시사한다.
유럽 특허 제0 239 292B1호에는 부티르산과 같은 알칸산 또는 그의 염이 존재하는 가운데 단백질 생산을 강화하는 방법이 설명되어 있다. 그러나 이 공고는 상기 첨가제의 적절한 농도 선택에는 지침을 거의 제공하지 않으며 나아가 그 첨가제의 단백질 글리코실화에 대한 효과는 다루고 있지 않다. 다른 문헌에서는 세포 단위 생산성을 증가시키기 위해 세포 배양 생산 배지에 부티르산나트륨을 낮은 수준 (0-1.5 mM)으로 첨가하면 생산된 재조합 단백질의 산성 당형태 증가 (시알산 함량 증가에 해당함)가 수반된다고 기술하고 있다 (Chotigeat et al., (1994) Cytotech. 15:217-221).
몇몇 그룹은 세포 증식 및 폴리펩티드 생산에 대한 삼투질 농도의 효과에 주목하였다 (Ozturk Palsson (1991) Biotech. and Bioeng. 37:989-993; Stubblefield et al., (1960) Cancer Research 20:1646-1655; Garcia-Perez et al., (1989) Journal of Biological Chemistry 264(38):16815-16821; Miner et al., (1981) Invasion Metastasis 1:158-174; 영국 특허 제2,251,249호; 유럽 특허 제481,791호; 미국 특허 제5,151,359호, 미국 특허 제4,724,206호, 미국 특허 제5,122,469호 및 국제 특허 공개 제89/04867호). 세포 증식 또는 폴리펩티드 생산을 위한 여러 가지 삼투질 농도 범위가 제안되었다. 일반적으로 세포 배양 배지의 삼투질 농도는 NaCl 또는 아미노산의 첨가를 통해 증가시킨다. 염농도 증가와 같은 환경적 압력은 일부 경우에는 세포 생산물 생산이 증가되는 결과를 가져온다. 포유동물 단백질 생산물의 발현 증가가 포유동물 세포 배양에서 배양 배지에 대한 예컨대 염, 젖산, 암모니아와 같은 용질 압력을 통해 이루어질 수 있다는 견해가 발표된 바 있다 (국제 특허 공개 제89/04867호). 이런 압력은 일반적으로 증식 억제적이지만 세포 단위 생산성에는 유리하다.
다른 연구자들은 재조합 세포 배양에서 세포 증식 및(또는) 폴리펩티드 생산에 대한 글루코스 농도의 효과를 논의하였다. 예를 들면 문헌[Park et al., (1992) Biotechnology and Bioengineering 40:686-696; Huang et al., (1991) Journal of Biotechnology 18:161-162; 유럽 특허 제387,840호; Reuveny et al., (1986) Journal of Immunological Methods 86:53-59; Fine et al., (1976) In Vitro 12(10):693-701; Dircks et al., (1987) Exp. Eye Res. 44:951-958; Mizutani et al., (1992) Biochemical and Biophysical Research Communications 187(2):664-669; Sugiura, (1992) Biotechnology and Bioengineering 39:953-959; 국제 특허 공개 제88/01643호; Graf et al., (1989) DECHEMA Biotechnol. Conf. 3:615-618; 일본 특허 출원 제1-101882호; 미국 특허 제3,926,723호; 국제 특허 공개 제87/00195호; Fleischaker, Jr., 박사학위논문, Massachusetts Institute of Technology, pp. 196-229 (1982. 6월)]을 참조한다. 그러나 이전의 연구들에서는 당단백질 생산에서 임상적인 성공에 직결되는 요소인 성숙형 단백질의 시알산 함량에 대한 각종 공정 변수의 효과를 연구하지 않았었다.
본 발명은 포유동물 세포 배양으로 생산되는 당단백질의 시알산 함량을 조절하는 방법을 제공한다.
〈발명의 요약〉
본 발명자들은 어떤 포유동물 세포 배양 공정 변수가 세포 단위 생산성뿐 아니라 생산되는 단백질의 글리코실화 정도 및 유형에 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 더욱 구체적으로는, 본 발명자들은 세포 단위 생산성을 증진시키는 어떤 요인들이 생산되는 단백질의 시알산 함량에는 반대의 효과를 갖는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명자들은 포유동물 세포 배양에서 생산되는 당단백질의 특정한 당형태를 강화하는 여러 가지 세포 배양 공정을 고안하였다.
그에 따라 본 발명은 포유동물 세포 배양으로 생산되는 당단백질의 시알산 함량을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이 측면에 따르면, 세포 배양의 생산기에서 당단백질의 생산 속도를 변화시키면 성숙형 당단백질의 시알산 함량에 변화가 온다. 더욱 구체적으로는, 당단백질 생산기 동안의 세포 단위 생산성의 증가는 성숙형 단백질의 시알산 함량의 감소를 초래한다. 역으로, 세포 단위 생산성의 감소는 성숙형 단백질의 시알산 함량의 증가를 초래한다.
본 발명은, 한 특정한 실시태양에서, 세포 단위 생산성에 영향을 미치는 요소들을 제어함으로써 포유동물 세포 배양의 단백질 생산기 동안 포유동물 숙주세포의 세포 단위 생산성을 변화시키는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 한 측면에 따르면, DNA 전사를 증진시키는 요소들의 농도를 조절한다. 다른 한 실시태양에서는, 세포 배양의 삼투질 농도를 특정한 한도 내로 유지함으로써 세포 단위 생산성을 조절한다. 본 발명에 따르면, 상기한 변수들 어느 것이든 단독으로, 또는 다른 것과 함께 조절함으로써 성숙형 당단백질의 시알산 함량에 영향을 끼친다. 본 발명의 한 특정한 실시태양에서, DNA 전사를 증진시키는 요소는 농도가 약 0.1 mM 내지 약 20 mM인 부티르산나트륨과 같은 알칸산 또는 그의 염이다. 본 발명의 다른 측면에 따르면, 세포 배양의 삼투질 농도를 약 250-600 mOsm 사이로 유지한다. 또다른 측면에서는, 세포 배양의 온도를 약 30℃ 및 37℃ 사이로 조절한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 경우에 따라서는 당업계에 공지된 다른 변수들과 함께 상기 공정 변수들 중 어느 하나 또는 모두를 조절함으로써 낮은 세포 단위 생산성을 유지하는 것으로 이루어지는, 포유동물 세포 배양으로 생산되는 성숙형 당단백질의 시알산 함량을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 이 측면에 따르면, 약 0.1 mM 내지 약 6 mM의 알칸산 또는 그의 염 농도에서, 그리고 경우에 따라서는 세포 배양의 삼투질 농도를 약 300-450 mOsm로 유지하면서 숙주세포를 배양하면 시알산 함량이 증가된 단백질이 생산된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 세포 배양의 세포 단위 생산성을 증가시키는 것으로 이루어지는, 포유동물 세포 배양으로 생산되는 성숙형 당단백질의 시알산 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 세포 단위 생산성은 바람직한 실시태양에서는, 숙주세포를 약 6 mM 내지 약 12 mM의 알칸산 또는 그의 염 농도에서 배양하기 및 세포 배양의 삼투질 농도를 약 450-600 mOsm로 유지하기 중 어느 하나로 이루어진 세포 배양 공정을 제공함으로써 증가한다.
본 발명은 또한 특정한 실시태양에서, 세포 배양의 세 가지 기(phase)를 갖춘 세포 배양 공정을 제공한다. 본 발명은 따라서, 단백질을 발현하는 숙주세포를 세포 증식이 극대화되는 조건 하에서 일정 기간 동안 증식기로 배양하는 단계로 이루어지는, 포유동물 세포 배양으로 생산되는 당단백질의 시알산 함량을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이 측면에 따르면 성숙형 당단백질의 목적하는 시알산 함량에 대응하는 세포 배양 변수가 선택되고 확보되는 전이기가 증식기를 뒤따른다. 전이기 뒤에는 전이기에 선택된 변수들이 유지되며 당단백질 생산물이 생산되고 수득되는 세포 배양의 생산기가 따른다. 전이기 동안 알칸산 또는 그의 염을 약 0.1 mM 내지 약 20 mM의 농도로 세포 배양에 가하거나 세포 배양의 삼투질 농도를 약 250 내지 600 mOsm로 고정시키며 경우에 따라서는 이들을 함께 적용함으로써 세포 배양의 생산기의 세포 단위 생산성을 변화시키면 시알산의 양이 다른 단백질이 생산된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 가용성 타입 1 종양괴사인자 수용체 (TNFR1)-면역글로불린 G1(IgG1) 키메라 단백질에 존재하는 시알산의 양을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 특정한 생산 조건 하에서는, 중요한 기능적 활성을 보존하면서도 혈액으로부터의 청소 시간이 연장되는 바람직한 성질을 나타내는 신규 TNFR1-IgG1당형태 제제를 얻을 수도 있다는 것을 발견하였다. 긴 기능적 반감기는 단순화된 대용량 투여를 가능하게 하고 생산된 당단백질의 생체내 역가에 기여하여 당단백질의 저용량형을 허용한다.
본 발명의 이 측면에 따르면 더 많은 시알산 잔기를 함유한 TNFR1-IgG1당단백질 분자가 생산된다. TNFR1-IgG1의 생산기에 대한 세포 배양 변수는 목적하는 시알산 함량을 얻도록 선택한다. 바람직한 실시태양에서는, 부티르산나트륨은 생산기에 약 0.1 내지 약 6 mM의 농도로 존재하며 삼투질 농도는 약 300-450 mOsm로 유지된다. 더욱 바람직한 측면에서는 부티르산나트륨 농도는 약 1 mM이고 삼투질 농도는 약 350-400 mOsm로 유지된다.
또다른 실시태양에서는, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된 TNFR1-IgG1당단백질 제제를 제공한다. 본 발명의 이 측면에 따르면, 제제의 pI 범위가 약 5.5내지 7.5 사이인, TNFR1-IgG1을 함유한 제제가 제공된다. 또한 단백질에 대한 시알산의 몰비가 약 4 내지 약 7, 특별하게는 약 5 내지 약 6인 TNFR1-IgG1제제가 제공된다. 또다른 측면에서, 상기 TNFR1-IgG1제제는 단백질 몰 당 약 1 내지 약 2 몰의 노출된 N-아세틸글루코스아민 잔기를 지닌다. 또다른 측면에서, 상기 제제는 N-아세틸글루코스아민에 대한 시알산의 몰비가 약 0.35 내지 약 0.5 및 더욱 바람직하게는 약 0.4 내지 약 0.45이다.
본 발명은 또한 TNF-매개 병적 상태의 치료에 유용한, 상기 제제를 함유한 치료 조성물을 제공한다.
본 발명은 포유동물 세포 배양에서 생산되는 당단백질의 시알산 함량을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 포유동물 세포 배양으로 생산되는 당단백질의 시알산 함량을 증가 및 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 나아가 종양괴사인자 수용체 (TNFR)-면역글로불린 (Ig) 키메라의 생산 방법 및 신규 TNFR1-IgG1제제 및 각종 염증 및 면역 장해의 진단 및 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
도 1A 및 도 1B는 생산기에 있는 대표적인 세포 배양 공정의 단위 생산성을 계산하는 데 사용된 방법을 보여준다. 단위 생산성은 도 1A에 도시된 바와 같은 생존가능 세포 계수 (생존가능 세포 일수)의 함수로, 또는 도 1B에 도시된 바와 같은 침적 세포 부피 (PCV)의 함수로 표현할 수 있다. 단위 생산 속도는 90% 신뢰도 구간에 대한 범위로 나타내었다.
도 2A 및 도 2B는 생산기 동안의 생존가능 세포 일수 (도 2A) 및 침적 세포 부피 (PCV) (도 2B)에 기초한 단위 생산성과 수득된 생산물의 시알산 (NANA) 함량 사이의 상관관계를 보여준다. 9 개의 상이한 공정 (A-I)에 대한 수치를 보였다. 데이터 점들은 표 1에 설명된 것과 같은 독립적인 생산 공정을 나타낸다.
I. 정의
본 발명의 탄수화물 잔기는 올리고사카라이드의 설명에 통상 사용되는 명명법을 참조하여 설명될 것이다. 이 명명법을 사용하는 탄수화물 화학에 대한 개관은 문헌 [Hubbard Ivatt (1981) Ann. Rev. Biochem. 50:555-583]에서 찾아볼 수 있다. 이 명명법에는 예를 들면 만노스를 나타내는 Man, 2-N-아세틸글루코스아민을 나타내는 GlcNac, 갈락토스를 나타내는 Gal, 글루코스를 나타내는 Glc가 포함된다. 시알산은 5-N-아세틸뉴라민산을 나타내는 NeuNAc 및 5-글리콜릴뉴라민산을 나타내는 NeuNGc라는 단축 표기를 참조하여 기술된다 (J. Biol. Chem. 1982 257:3347, J. Biol. Chem. 1982. 257:3352).
삼투질 농도는 수성 용액에 용해된 용질 입자의 삼투압을 나타내는 척도이다. 용질 입자에는 이온과 비이온화 분자 모두가 포함된다. 삼투질 농도는 1 kg의 용액에 용해된 삼투활성 입자 (즉, 오스몰)의 농도로 표현된다 (38℃에서 1 mOsm/kg H2O는 19 mm Hg의 삼투압과 동등하다). 이와 대조적으로 오스모몰 농도는 1 리터의 용액에 용해된 용질 입자의 수를 말한다. 본 명세서에서 사용할 때 mOsm이란 약자는 밀리오스몰/용액 kg을 뜻한다.
본 명세서에서 사용할 때 당단백질은 일반적으로 약 10개를 넘는 아미노산과 하나 이상의 올리고사카라이드 측면 사슬을 가진 펩티드 및 단백질을 말한다. 당단백질은 숙주세포와 동종일 수도 있지만 바람직하게는, 중국 햄스터 난소세포에서 생산되는 사람 단백질처럼, 사용되는 숙주세포에 대해 이종, 즉 외래이다. 바람직하게는 포유동물 당단백질 (원래는 포유동물 기관에서 유래한 당단백질)을 사용하며, 더욱 바람직하게는 배지로 직접 분비되는 것을 사용한다. 포유동물 당단백질의 예에는 예컨대 종양괴사인자 알파 및 베타, 그의 수용체 (TNFR1-1991년 3월 20일 공고된 유럽 특허 제417,563호, TNFR2-1991년 3월 20일 공고된 유럽 특허 제417,014호) 및 그의 유도체, 레닌, 사람 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 지단백질, 알파-1-안티트립신, 인슐린 A-사슬, 인슐린 B-사슬, 프로인슐린, 난포 자극 호르몬, 칼시토닌, 황체 형성 호르몬, 글루카곤, 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자와 같은 응혈 인자, 단백질 C와 같은 항응혈 인자, 심방 나트륨배설 인자, 폐 계면활성제, 유로키나아제 또는 사람 뇨 또는 조직형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA)와 같은 플라스미노겐 활성화제, 봄베신, 트롬빈, 조혈세포 성장 인자, 엔케팔리나제, RANTES (활성화시 제어, 정상적으로는 T-세포 발현 및 분비), 사람 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파), 사람 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 뮬러리안-억제 물질, 릴랙신 A-사슬, 릴랙신 B-사슬, 프로릴랙신, 생쥐 성선자극호르몬 부수 펩티드, 베타-락타마제와 같은 미생물 단백질, DNase, 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 호르몬 또는 성장인자에 대한 수용체, 인테그린, 단백질 A 또는 D, 류마티즘성 인자, 골유래 향신경성 인자 (DBNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, NT-6)와 같은 향신경성 인자 또는 NGF-β와 같은 신경 성장인자, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), aFGF 및 bFGF와 같은 섬유아세포 성장인자, 상피 성장인자 (EGF), TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 비롯하여 TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 변형 성장인자 (TGF), 인슐린 유사 성장인자-I 및 II (IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질, CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19와 같은 CD 단백질, 적혈구생성촉진인자, 골유도성 인자, 면역독소, 골 형태형성 단백질 (BMP), 인터페론-알파, -베타 및 -감마와 같은 인터페론, 콜로니 자극인자 (CSF), 예컨대 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF, 인터루킨(IL), 예컨대 IL-1에서 IL-10까지, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, T-세포 수용체, 표면 막단백질, 붕괴 가속인자, 예를 들어 AIDS 엔벨롭의 일부분과 같은 바이러스 항원, 수송 단백질, 귀착형 수용체, 어드레신, 조절 단백질, 항체, 이뮤노어드헤신과 같은 키메라 단백질, 그리고 상기한 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편을 비롯하여 사이토킨 및 그의 수용체, 그리고 사이토킨 또는 그 수용체를 함유한 키메라 단백질과 같은 분자들이 포함된다.
세포 배양 배지 및 배양 배지라는 용어는 포유동물 세포를 증식시키는 데 사용되는, 전형적으로 다음 범주 중 하나 이상에서 1 종 이상의 성분을 제공하는 영양 용액을 말한다:
1) 에너지원, 통상 글루코스와 같은 탄수화물 형태로 있는 것,
2) 모든 필수 아미노산, 및 통상 20 종의 아미노산으로 된 기본 집합 더하기 시스테인,
3) 낮은 농도로 요구되는 비타민 및(또는) 기타 유기 화합물,
4) 유리 지방산, 및
5) 미량 원소, 여기서 미량 원소는 전형적으로 아주 낮은 농도, 통상 마이크로몰 범위로 요구되는 무기 화합물 또는 천연 원소로 정의함.
이 영양 용액에는 경우에 따라 다음 범주 중 어느 하나에서 고른 1 종 이상의 성분을 보충할 수 있다:
1) 호르몬 및 기타 성장인자, 예컨대 인슐린, 트란스페린 및 상피 성장인자와 같은 것,
2) 염 및 완충액, 예컨대 칼슘, 마그네슘 및 인산염 같은 것,
3) 뉴클레오시드 및 염기, 예컨대 아데노신, 티미딘 및 하이포크산틴과 같은 것, 그리고
4) 단백질 및 조직 가수분해물.
포유동물 숙주세포, 숙주세포, 포유동물 세포 등의 용어는 적절한 영양소와 성장인자를 함유한 배지 중의 단층 배양 또는 현탁 배양으로 두었을 때 증식 및 생존할 수 있는, 포유동물에서 유래한 세포주를 말한다. 특정한 세포주에 필요한 성장인자는 예컨대 문헌 [Mammalian Cell Culture (Mather, J.P.편, Plenum Press, 뉴욕 (1984), Barnes Sato (1980) Cell, 22:649]에 설명된 것과 같이 과도한 실험을 거치지 않고도 실험적으로 쉽게 결정할 수 있다. 전형적으로는, 이 세포는 주목하는 특정한 당단백질 다량을 배양 배지 속으로 발현 및 분비할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 적절한 포유동물 숙주세포의 예로는 중국 햄스터 난소세포/-DHFR (CHO, Urlaub Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), dp12.CHO 세포 (1989년 3월 15일 공고된 유럽 특허 제307,247호), SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651), 사람 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁 배양에서 증식시키기 위해 서브클로닝한 293 세포, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)), 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10), 생쥐 세르톨리 지주세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), 원숭이 신장 세포 (CV1, ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587), 사람 경부암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로쥐 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442), 사람 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 사람 간세포 (Hep G2, HB 8065), 생쥐 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL 51), TRI 세포 (Mather et al., Annals. N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)), MRC 5 세포, FS4 세포 및 사람 간암 세포주 (Hep G2) 등이 있다.
바람직한 숙주세포에는 중국 햄스터 난소세포/-DHFR (CHO, Urlaup Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), dp12.CHO 세포 (1989년 3월 15일 공고된 유럽 특허 제307,247호)가 포함된다.
본 명세서의 문맥에서 펩톤이란 용어는 본질적으로 가수분해된 동물성 단백질인 배지 보충물을 말하려는 것이다. 이 단백질의 출처는 식물성 재료, 정제 젤라틴 또는 도축장에서 나온 동물 부산물일 수 있다. 단백질은 대개 산, 열 또는 각종 효소 제제를 사용하여 가수분해한다. 바람직한 펩톤 혼합물은 예컨대 Primatone RL 및 Primatone HS인데, 이들 둘은 시판되는 것이다 (Sheffield, 잉글랜드).
세포 단위 생산성(cell specific productivity), 세포 단위 속도 등은 본 명세서에서는 단위, 즉 세포 당 또는 세포 질량 또는 부피의 단위 당 생산물 발현 속도를 말한다. 세포 단위 생산성은 예를 들면 일일 세포 당 생산된 단백질의 그람으로 측정한다. 세포 단위 생산성은 다음 적분법에 의거해 간편하게 측정할 수 있다:
dP/dt = qpX, 또는
P = qp∫Xdt.
식 중, qp는 세포 단위 생산성 상수이고, X는 세포 수 또는 세포 부피, 또는 세포 질량 당량이며, dP/dt는 단백질 생산 속도이다. 그러므로 qp는 생산물 농도 대 생존가능 세포의 시간 적분(∫Xdt 생존가능 세포 일수)의 그래프로부터 얻을 수 있다. 상기 식에 따르면, 생산된 당단백질 산물의 양을 생존가능 세포 일수에 대응하여 작도하면 기울기는 세포 단위 속도와 같다. 생존가능 세포는 몇 가지 수단, 예를 들면 생물량, O2흡수 속도, 락타제 탈수소화효소 (LDH), 침적 세포 부피 또는 탁도에 의해 산정할 수 있다.
세포 배양의 증식기는 세포가 전반적으로 신속히 분열하는 지수적 세포 증식 기간 (지수기)을 말한다. 이 증식기 동안 세포를 일정 기간, 통상 1 내지 4일 동안 세포 증식이 극대화하는 조건 하에서 배양한다. 숙주세포의 증식 사이클 측정은 과도한 실험을 하지 않고도 계획한 특정 숙주세포에 대해 측정할 수 있다. 세포 증식이 극대화하는 조건 하에서 및 기간 등은 특정한 세포주에 대해 세포 증식 및 분열에 최적이라고 결정된 배양 조건을 말한다. 증식기 동안, 세포는 가습, 조절 분위기 중, 약 30-40℃에서 필요한 첨가제를 함유한 영양 배지에서 배양하여 특정한 세포주에서 최적의 증식이 이루어지도록 한다. 세포는 증식기에 1 내지 4일, 통상은 2 내지 3일의 기간 동안 유지시킨다.
세포 배양의 전이기는 생산기를 위한 배양 조건을 확보하는 기간을 말한다. 전이기 동안 세포 배양의 온도, 배지 삼투질 농도 등과 같은 환경적 요소들을 증식 조건에서 생산 조건으로 옮겨간다.
세포 배양의 생산기는 세포 증식이 정체된 기간을 말한다. 생산기 동안에는, 지수적 세포 증식이 이미 끝나고 단백질 생산이 주가 된다. 이 기간 동안에는 지속되는 단백질 생산을 지원하고 목적하는 당단백질 산물을 얻기 위해 배지를 일반적으로 보충한다.
발현 또는 발현한다라는 용어는 본 명세서에서는 숙주세포 내에서 일어나는 전사 및 번역을 말하기 위해 사용한다. 숙주세포에서 생산물 유전자의 발현 수준은 세포에 존재하는 대응 mRNA의 양 또는 세포에 의해 생산된, 생산물 유전자에 코딩된 단백질의 양을 기초로 측정할 수 있다. 예를 들면, 생산물 유전자에서 전사된 mRNA는 바람직하게는 노던 혼성화에 의해 정량된다. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989). 생산물 유전자에 코딩된 단백질은 단백질의 생물학적 활성에 대해 분석함으로써, 또는 그 단백질과 반응할 수 있는 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 또는 방사성면역분석과 같이 그러한 활성과는 독립적인 분석법을 사용함으로써 정량할 수 있다. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).
알칸산 또는 그의 염은 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 알칸산 또는 그의 염을 뜻한다. 알칸산은 일반적으로 탄소 원자가 1 내지 10 개이며, 바람직하게는 탄소 원자가 3 내지 6 개다. 대표적인 알칸산은 부티르산이며, 대응하는 염은 부티르산나트륨이다.
II. 세포 배양 과정
본 발명자들은 포유동물 세포 배양으로 생산되는 당단백질의 생산시 세포 단위 생산성을 증가시키는 요인은 생산되는 당단백질의 시알산 함량에는 반대의 효과를 가진다는 것을 발견하였다. 복합 올리고사카라이드 구조 하나 당 한 개 이상의 시알산 잔기를 발현하는 단백질은 생체내에서 청소 시간이 더 길기 때문에 생산되는 당단백질의 청소율은 제제의 총시알릴화 정도를 통해 넓은 한계 내로 조종할 수 있다. 본 발명은 포유동물 세포 배양으로 생산되는 당단백질의 시알릴화 정도를 조절하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 설명된 방법론을 따르면, 포유동물 세포 배양으로 생산되는 당단백질의 원하는 시알산 함량을 제공하는 정확한 공정 변수를 결정할 수 있다.
본 발명에 따르면 포유동물 숙주세포를 배양하여 회수가능한 당단백질 생산물을 생산한다. 당단백질 내의 시알산 총함량은 세포 단위 생산성에 영향을 미치는 세포 배양 변수를 조절함으로써 조절한다. 세포 단위 생산성에 영향을 미치는 요인은 당업계에 공지되어 있으며, DNA/RNA 갯수에 영향을 미치는 요인, RNA를 안정화하는 요인과 같이 RNA에 영향을 미치는 요인, 배지 영양분 및 기타 보충물, 전사 인핸서의 농도, 배양 환경의 삼투질 농도, 세포 배양의 온도 및 pH 등을 포함하지만 거기에 한정되지는 않는다. 본 발명에 따르면 상기 요인들을 단독으로, 또는 함께 조정하여 세포 단위 생산성을 증가시키면 시알산 함량이 감소된 단백질이 생성된다. 상기 요인들을 단독으로, 또는 함께 조정하여 세포 단위 생산성을 감소시키면 시알산 함량이 증가된 성숙형 단백질이 생성된다.
이제 본 발명을 공지된 것을 포함하여 여러가지의 세포 배양 기술 및 원리를 참조하여 설명한다.
본 발명에 따르면 포유동물 세포를 배양하여 원하는 당단백질 생산물을 생산한다. 본 발명의 맥락에서 당단백질의 생산을 위한 숙주세포를 선택할 때에는 상이한 숙주세포들은 발현되는 단백질의 번역 및 번역 후 프로세싱 및 수식 (예, 글리코실화, 절단)을 위한 특징적이고 고유한 메카니즘을 가진다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 원하는 번역 후 수식이 가능하다는 것을 확실히 하기 위해 적합한 세포주를 선택해야 한다. 다른 방법으로는, 특정한 번역 후 수식에 요구되는 원하는 유전자 산물을 발현하도록 숙주세포를 변경할 수 있다.
특히, 원하는 단백질을 발현하는 포유동물 세포는 본 명세서에서 설명하는 적합한 조건 하에서 적합한 번역 후 수식이 생체내에서 일어나도록 특정한 효소를 발현하거나, 발현하도록 조종되어야 한다. 이 효소에는 N-연결 올리고사카라이드의 경우에 대해 문헌[Hubbard Ivan, 상게서]에 설명된 것들과 같이 N- 또는 O-연결 탄수화물의 부가 또는 완결에 필요한 효소들이 포함된다. 이 효소에는 경우에 따라 올리고사카릴트랜스퍼라제, 알파-글루코시다제 I, 알파-글루코시다제 II, ER 알파(1,2)만노시다제, 골지체 알파-만노다제 I, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 I, 골지체 알파-만노다제 II, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 II, 알파(1,6)푸코실트랜스퍼라제 및 β(1,4)갈락토실트랜스퍼라제가 포함된다. 또한, 숙주세포는 말단 시알산을 특정한 위치 및 연결부에 부착할 것으로 예상할 수 있는 적절한 시알릴 트랜스퍼라제를 숙주세포 게놈의 일부로 발현한다. 경우에 따라서는, 예컨대 시알릴 트랜스퍼라제를 코딩한 DNA로 숙주세포를 트랜스펙션시킴으로써 숙주세포가 적절한 시알릴 트랜스퍼라제를 발현하게 만들 수 있다.
상기한 시알릴 트랜스퍼라제는 Galβ1-4GlcNAc과 같이 적절한 올리고사카라이드 중심 구조에 말단 시알산 잔기를 부가하리라고 예상될 것이다. 본 발명의 맥락에서 적절한 시알릴 트랜스퍼라제는 N- 및 O-연결 올리고사카라이드의 복합 시알릴화 및 분지를 촉매하는 시알릴 트랜스퍼라제를 포함하지만 거기에 한정되지는 않는다.
원하는 단백질을 발현하고 원하는 탄수화물을 특정한 위치 및 연결부에 부가할 수 있는 포유동물 세포의 배양을 위해서는, 배양되는 숙주세포에 특별히 주의를 기울이면서 수많은 배양 조건을 사용할 수 있다. 포유동물 세포에 적절한 배양 조건은 당업계에 공지되어 있거나 (J. Immunol. Methods (1983) 56:221-234), 당업계의 숙련자가 쉽게 결정할 수 있고 (예를 들면 Animal Cell Culture: A Practical Approach 2판, Rickwood, D. Hames, B.D. 편, Oxford University Press, 뉴욕 (1992)), 선택된 특정한 숙주세포에 따라 달라진다.
본 발명의 포유동물 세포 배양은 배양되는 특정한 세포에 적합한 배지에서 마련된다. Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘베코 수정 이글 배지 ([DMEM], Sigma)와 같은 시판 배지가 대표적인 영양 용액이다. 또한, 개시 내용을 본 명세서에 참고로 포함시키는 문헌 [Ham Wallace, (1979) Meth. Enz., 58:44, Barnes Sato (1980) Anal. Biochem. 102:255, 미국 특허 제4,767,704호, 동 4,657,866호, 동 4,927,762호, 동 5,122,469호 또는 동 4,560,655호, 국제 특허 공개 제90/03430호 및 동 87/00195호]에 기술된 배지들 어느 하나를 배양 배지로 사용할 수도 있다. 이들 배지들 중 어느 것이나 필요에 따라 호르몬 및(또는) 기타 성장인자 (인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장인자와 같은 것), 염 (염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염과 같은 것), 완충액 (HEPES와 같은 것), 뉴클레오시드 (아데노신 및 티미딘과 같은 것), 항생제 (겐타마이신(상표명) 약물과 같은 것), 미량 원소 (통상 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 지질 (리놀레산 또는 기타 지방산과 같은 것) 및 이들의 적당한 담체, 그리고 글루코스 또는 동등한 에너지원을 보충할 수 있다. 다른 필요한 보충물 역시 당업계에 공지되어 있을 적절한 농도로 포함시킬 수 있다.
특정한 실시태양에서, 포유동물 숙주세포는 CHO 세포, 바람직하게는 dp12.CHO 세포이고, 적절한 배지는 아미노산, 염, 당 및 비타민과 같은 일부 성분들의 농도가 수정되고 경우에 따라서는 글리신, 하이포크산틴 및 티미딘, 재조합 사람 인슐린, 가수분해된 펩톤, 예컨대 Primatone HS 또는 Primatone RL (Sheffield, 잉글랜드), 또는 균등물, 세포 보호제, 예컨대 Pluronic F68 또는 동등한 플루로닉 폴리올, 겐타마이신, 및 미량 원소를 함유하는 DMEM/HAM F-12 기재 제제 (DMEM과 AHM 512 배지의 조성에 대해서는 문헌[American Type Culture Collection Catalogue fo Cell Lines and Hybridomas, 6판, 1988, pp. 346-349]에 있는 배양 배지 제제를 참조) (미국 특허 제5,122,469호에 기술된 배지의 조성이 특히 적절함)와 같은 기본 배지 성분을 함유한다.
본 발명의 당단백질은 다양한 세포 배양 조건 하에서 원하는 단백질을 발현하는 세포를 증식시킴으로써 생산할 수 있다. 예를 들면, 대규모 또는 소규모 단백질 생산을 위한 세포 배양 절차는 본 발명의 맥락에서는 유용할 수도 있다. 유동화 베드 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 회전 병 배양, 또는 교반 탱크 생물반응기 방식을 포함하지만 여기에 한정되지는 않는 방법들을 사용할 수 있고, 뒤의 두 가지 방식에서는 미세담체를 사용하거나 사용하지 않을 수 있으며, 배치, 공급-배치, 또는 연속 방식 중 한 가지로 운용할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 세포 배양은 교반 탱크 생물반응기 방식으로 수행하며 공급 배치 배양 절차를 채택한다. 이 바람직한 공급 배치 배양에서는, 포유동물 숙주세포와 배양 배지를 먼저 배양 용기에 공급하고 부가적인 배양 양분을 배양 도중 배양액에 연속적으로, 또는 불연속적인 증분으로 공급하는데, 배양이 종결되기 전에 주기적으로 세포 및(또는) 생산물을 채취하거나 하지 않을 수 있다. 공급 배치 배양은 주기적으로 전체 배양액 (세포와 배지를 포함하는 것)을 수거하고 새로운 배지로 대체하는 반연속식 공급 배치 배양을 포함할 수 있다. 공급 배치 배양은 세포 배양을 위한 모든 성분 (세포와 모든 배양 양분을 포함)을 배양 공정의 시초에 배양 용기에 공급하는 단순 배치 배양과는 구별된다. 공급 배치 배양은 공정 도중 배양 용기에서 상징액이 수거되지 않는 한은 관류 배양과도 구별될 수 있다 (관류 배양에서는, 세포는 여과, 캡슐화, 미세담체에 고정 등에 의해 배양액 내에 제한되어 있고 배양 배지는 연속적으로나 간헐적으로 배양 용기에 도입되고 수거된다). 또한, 배양의 세포는 특정한 숙주세포 및 구상하고 있는 특정한 생산 계획에 적합할 수 있는 임의의 도식 또는 차례에 따라 전파시킬 수 있다. 그러므로 본 발명은 단단계 또는 다단계 배양 절차를 구상한다. 단단계 배양에서는 숙주세포를 배양 환경에 접종하고 한 번의 세포 배양 생산기 동안 본 발명의 방법을 사용한다. 별법으로는, 다단계 배양이 계획된다. 다단계 배양에서는, 세포를 여러 단계 또는 기에서 배양할 수 있다. 예를 들면, 아마도 저장 상태에서 꺼낸 세포를 증식과 높은 생존가능성을 촉진하는 데 적합한 배지에 접종하는 제1 단계 또는 증식기 배양에서 세포를 증식시킬 수 있다. 숙주세포 배양액에 새로운 배지를 첨가함으로써 적절한 기간 동안 세포를 증식기로 유지할 수도 있다.
본 발명의 한 바람직한 측면에 따르면, 공급 배치 또는 연속 세포 배양 조건은 세포 배양의 증식기에서 포유동물 세포의 증식을 증진시키도록 고안된다. 증식기에서는 증식을 극대화시키는 조건 및 기간으로 세포를 증식시킨다. 온도, pH, 용존 산소 (dO2) 등과 같은 배양 조건은 특정한 숙주의 경우에 사용되는 것이며 당업자에게는 자명할 것이다. 일반적으로, pH는 산 (예, CO2) 또는 염기 (예, Na2CO3또는 NaOH)를 사용하여 약 6.5 내지 7.5 수준으로 조정한다. CHO 세포와 같은 포유동물 세포를 배양하는 데 적절한 온도 범위는 약 30 내지 38℃이고, 적절한 dO2는 5-90%의 공기 포화도이다.
특정한 단계에서는, 세포를 사용하여 세포 배양의 생산기 또는 단계를 접종할 수도 있다. 다른 방법으로는, 위에 설명된 것처럼 생산기 또는 단계가 접종 또는 증식기 또는 단계와 연속될 수도 있다.
본 발명에 따르면, 세포 배양의 생산기 동안의 세포 배양 환경을 조절한다. 본 발명의 방법에 따르면, 포유동물 숙주세포의 세포 단위 생산성에 영향을 미치는 요인들을 최종 당단백질에서 원하는 시알산 함량이 달성되도록 조종한다. 특히, 세포 단위 생산성을 증가시키는 요인들은 세포 배양 공정의 생산기 동안 최종 당단백질 생산물이 원하는 시알산 함량을 지니도록 조절한다.
바람직한 측면에서는 세포 배양의 생산기를 위한 변수들이 도입되는 세포 배양의 전이기가 세포 배양 공정의 생산기에 선행한다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 알칸산과 같은 전사 증진제의 농도를 조종하여 세포 단위 생산성 및 그에 따라 귀결되는 포유동물 세포 당단백질 생산물의 시알산 함량에 영향을 끼친다. 알칸산은 포유동물 단백질의 전사를 증진시키는 다수의 단쇄 또는 분지쇄 알칸산 중 임의의 것일 수 있다. 바람직한 실시태양에서는, 알칸산은 부티르산 및 특히 그의 염, 부티르산나트륨이다.
본 발명에 따르면 부티르산나트륨의 농도는 세포 단위 생산성을 조절하기 위해 조절한다. 0.1 내지 20 mM의 부티르산나트륨 농도를 사용하며, 배양되는 특정한 숙주세포 및 생산되는 당단백질의 원하는 시알산 함량에 따라 조정한다. 원하는 시알산 함량을 가진 단백질을 생성시키기 위해서는 부티르산나트륨의 농도는 가장 만족스러운 시알산 프로필과 함께 최고의 세포 단위 생산성을 제공하는 것을 선택한다. 그러므로 본 발명에 따르면 부티르산나트륨과 같은 전사 증진제의 농도는 원하는 시알산 함량을 얻도록 선택한다.
성숙형 당단백질의 시알산 함량을 증가시키려면 일반적으로 낮은 쪽의 전사 증진제 농도를 이용한다. 낮은 농도는 증진된 전사를 제공하지만 숙주세포 배양의 생존가능성을 유지하면서 낮은 세포 단위 생산성을 유지시킨다. 일반적으로 부티르산나트륨과 같은 전사 증진제의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 8 mM가 사용된다. 더욱 바람직하게는 약 1.0 내지 6.0 mM의 농도가 사용된다. 한 특정한 실시태양에서는 약 6 mM 부티르산나트륨이 사용된다. 다른 한 실시태양에서는 약 1 mM 부티르산나트륨이 사용된다.
다른 한 실시태양에서는 당단백질이 감소된 수준의 시알산을 함유한 상태로 생산된다. 본 발명의 이 측면에 따르면 포유동물 세포를 세포 단위 생산성이 증가되는 조건 하에서 배양한다. 본 발명의 이 측면에 따르면, 알칸산 또는 기타 적절한 전사 증진제의 농도는 증가된 세포 단위 생산성이 원하는 시알산 프로필을 가진 단백질을 생성시키도록 선택한다. 바람직한 실시태양에서 알칸산 또는 그의 염의 농도는 약 5 내지 20 mM이며 더욱 바람직하게는 약 6 mM 내지 12 mM이다. 특정한 실시태양에서는, 부티르산나트륨의 농도가 약 12 mM이다.
알칸산 또는 그의 염과 같은 전사 증진제의 적절한 농도를 결정할 때에는 도 2와 하기 실시예 1에 있는 표 1을 참조할 수 있다. 본 발명에 따르면, 낮은 부티르산 이온 농도는 대체로 낮은 세포 단위 생산성을 초래한다. 본 발명에 따르면 부티르산나트륨의 농도는 생산기의 삼투질 농도와 같은 다른 공정 변수를 유념하면서 선택한다. 아래에 논의된 것처럼 삼투질 농도는 세포 단위 생산성에 영향을 미칠 수 있다. 부티르산 이온의 농도는 생산기에 유지해야 할 특정한 삼투질 농도를 유념하면서 선택한다.
이와 달리 다른 포유동물 숙주세포 및 다른 당단백질의 경우에는, 작은 시험 배양을 마련하여 당단백질 생산물 생산의 속도, 즉 세포 단위 생산성을 측정하고, 세포 단위 생산성의 감소가 생산되는 당단백질의 시알산 함량의 증가로 이어진다는 것을 유념하면서 최종적인 시알산 함량을 이용하여 배양되는 특정한 숙주세포에 적합한 비슷한 표와 도면을 마련할 수 있다. 세포배양의 생산기가 시작되는 때에, 또는 그 즈음에 부티르산나트륨과 같은 알칸산 또는 그의 염, 또는 기타 적절한 전사 증진제를 숙주세포 배양에 첨가한다. 편의상, 원하는 세포 단위 생산성 및 그에 따라 원하는 당형태 프로필을 위해 본 명세서에서 논의된 것과 같은 세포 배양 조건이 도입되는 전이기를 생산기에 선행하는 세포 배양 공정에서 사용한다.
알칸산 또는 그의 염은 당업계에 공지된 임의의 수단으로 첨가한다. 바람직한 실시태양에서는, 본 명세서에서 설명되었거나 포유동물 세포 배양 분야의 업자에게 공지된 다른 적절한 양분을 함유하거나 하지 않은 공급 배치 배양 기구에 부티르산나트륨을 배치에 첨가한다.
본 발명에 따르면, 위에서 성숙형 당단백질의 시알릴화 정도를 제어한다고 언급한 요인들 외에도 세포 배양 환경의 삼투질 농도를 조절한다. 한 실시태양에서는, 세포 단위 생산성에 영향을 미치는 다른 요인들과는 무관하게 성숙형 단백질의 시알산 함량을 조절하기 위해 삼투질 농도를 조절한다. 다른 한 실시태양에서는 세포 단위 생산성에 영향을 미치는 다른 요인들을 조절하는 데 더하여 삼투질 농도를 조절한다. 바람직한 실시태양에서는 삼투질 농도와 알칸산의 농도 모두를 조절한다.
세포 배양 환경의 삼투질 농도는 세포 단위 생산성과 최종 당단백질의 시알산 프로필 사이에 원하는 균형이 이루어지도록 조절한다. 일반적으로는 삼투질 농도를 증가시키면 세포 단위 생산성이 증가한다. 원하는 시알산을 함유한 단백질이 생성되게 하는 삼투질 농도는 삼투질 농도의 증가가 대체로 특정한 단백질의 생산 속도 증가로 이어진다는 것을 유념하고 선택한다. 생산 속도를 감소시키고 성숙형 당단백질의 시알산 함량을 증가시키기 위해서는, 삼투질 농도를 배양되는 특정한 세포 유형에서 볼 때 낮은 수준으로 유지하는 것이 일반적이다.
포유동물 세포 배양의 경우 배양 배지의 삼투질 농도는 일반적으로 약 290-330 mOsm이다. 그러나 삼투질 농도의 증가는 대체로 단백질 생산 속도의 증가로 이어진다. 생산 속도가 원하는 생산물 프로필에 부응하도록 삼투질 농도를 선택한다. 시알산 함량을 증가시키려면, 생산 속도를 감소시키고 삼투질 농도는 배양되는 특정한 숙주세포를 유념하면서 일반적으로 최저 한도에 가깝게 유지한다. 증가된 시알산 함량을 위해서는 약 250 mOsm 내지 약 450 mOsm 범위의 삼투질 농도가 적절하다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 이 측면에 따르면 삼투질 농도를 약 300 내지 450 mOsm 정도로 유지하며, 더욱 바람직하게는 약 350 내지 400 mOsm, 가장 바람직하게는 약 400 mOsm로 유지한다.
낮은 시알산 함량을 위해서는, 증가된 생산 속도를 제공하는 삼투질 농도를 선택한다. 본 발명의 이 측면에 따르면, 삼투질 농도는 약 350-600 mOsm 정도로 유지하며, 바람직하게는 약 450 내지 550 mOsm이다.
숙련된 업자는 배지 삼투질 농도가 배양액 중의 삼투활성 입자의 농도에 의존하며 복잡한 포유동물 세포 배양 배지를 구성하는 다수의 변수가 삼투질 농도에 강한 영향을 준다는 것을 인식할 것이다. 배양 배지의 초기 삼투질 농도는 배양 배지의 조성에 의해 결정된다. 삼투질 농도는 예를 들면 Fisher Scientific사 (미국 펜실바니아주 피츠버그 소재)에서 OSMETTE이란 상표명으로 판매하는 것 (또는 미국 메사추세츠주 나틱 소재 Precision Systems사에서 구입할 수 있는 Osmette 모델 2007)과 같은 삼투압계를 사용하여 측정할 수 있다. 원하는 범위의 삼투질 농도를 얻기 위해서 배양 배지 중의 각종 성분의 농도를 조정할 수 있다.
배양 배지의 삼투질 농도를 증가시키기 위해 배지에 첨가할 수 있는 용질에는 단백질, 펩티드, 아미노산, 펩톤과 같은 가수분해한 동물 단백질, 비대사 중합체, 비타민, 이온, 염, 당, 대사물질, 유기산, 지질 등이 포함된다. 한 실시태양에서는 공급 배치 배양 절차에서 배양 배지의 다른 성분과 함께 펩톤을 세포 배양액에 첨가함으로써 삼투질 농도를 조절한다.
본 발명에 따르면 삼투질 농도는 예컨대 펩톤 외에도 각종 염 (예, NaCl), 아미노산을 포함하는 기본 배지 제제의 첨가를 통해 원하는 범위로 유지 또는 조정한다. 바람직한 실시태양에서는, 배양 배지에 과량의 아미노산을 함유한 기본 배양 배지 (예, 미국 특허 제5,122,469호의 Super 배지를 참조), 글루코스 및 펩톤을 보충한다.
그러나 위에 제시한 삼투질 농도 범위를 얻기 위해 배양 배지 중의 다른 성분의 농도(들)을 수정할 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 예를 들어 배양의 시작부터 끝까지 배양 배지 중의 글루코스 (주에너지원) 농도를 간헐적으로나 지속적으로 조절함으로써 배지의 삼투질 농도를 규정된 바람직한 범위 정도로 유지할 수 있다. 글루코스 농도를 조절하는 것은 세포에 알맞은 탄소원을 제공하면서 동시에 숙주세포에 의한 젖산의 생산을 조절하는 데 도움이 된다. 이것은 삼투질 농도를 상승시키는 중화제 (예, Na2CO3또는 NaOH와 같은 염기)의 첨가를 피할 수 없게 만드는 배양 배지의 pH 저하를 제한한다는 점에서 유익하다.
삼투질 농도를 세포 배양을 유지하는 데 사용되는 임의의 계획에 따른 적절한 한도 내로 유지하기 위해 배지를 보충할 수 있다. 바람직한 실시태양에서는, 배양 기구가 공급 배치 배양 기구이고 배지는 세포 배양의 생산기 동안 공급 장치에서 배치로 보충한다. 그 밖에도 배지는 아래에 설명된 대로 생산기에 보충할 수 있다.
별법으로는, 배양 배지의 간헐적 오프-라인 채취를 행할 수 있다. 그 다음 요구되는 공급 용액의 조정에 의해 배양 배지의 삼투질 농도를 변경할 수 있다.
당업자는 본 발명의 세포 배양 절차가 생산되는 단백질의 시알릴화가 원하는 수준으로 이루어지도록 선택된다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에서 설명된 것들 외에 시알릴화 정도에 영향을 미치는 공정 변수에는 산소 농도 및 글루코스 농도가 포함된다. 배양 밀도, 시간, 및 온도와 같은 저장 조건 역시 시알릴화에 영향을 미친다. 본 발명은 그 외에 증진된 시알릴화에 가장 적합한 공정 변수들을 포함하기로 한다.
III. 당단백질의 회수
폴리펩티드 생산기에 이어서는, 당업계에서 확립된 기술을 사용하여 주목하는 폴리펩티드를 배양 배지에서 회수한다.
주목하는 폴리펩티드는 숙주세포 용해물에서 회수할 수도 있기는 하지만 바람직하게는 배양 배지에서 분비된 폴리펩티드로 회수된다.
첫단계로, 배양 배지 또는 세포 용해물을 원심분리하여 입상 세포 파편을 제거한다. 그 다음 폴리펩티드를 오염 가용성 단백질 및 폴리펩티드에서 분리정제하는데, 대표적인 적절한 정제 과정은 다음 과정들이다: 면역친화도 또는 이온교환 칼럼 상에서의 분류, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상이나 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, Sephadex G-75 등을 이용한 겔 여과, 및 IgG와 같은 오염물질을 제거하는 단백질 A Sepharose 칼럼. 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF)와 같은 프로테아제 억제제 역시 정제시의 단백질분해효소에 의한 분해를 억제하는 데 유용할 수 있다. 당업자는 주목하는 폴리펩티드에 적합한 정제 방법이 재조합 세포 배양에서의 발현에서 기인한 폴리펩티드의 특성 변화를 처리하기 위해 변경을 요할 수도 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 맥락에서 특히 바람직한 것은 본 발명의 탄수화물을 선별하는 정제 기술 및 방법이다. 본 발명의 원하는 당형태는 예를 들면 이온교환 연성 겔 크로마토그래피 또는 양이온 또는 음이온 교환수지를 사용한 HPLC (이 때 보다 산성인 분획을 수집함)에 의해 시알산 함유 분자를 강화할 수도 있다.
IV. 당단백질의 분석
본 발명의 방법으로 생산되는 당단백질의 복합 탄수화물 부분은 원한다면 종래의 탄수화물 분석 기술로 쉽게 분석할 수 있을 것이다. 예를 들어 당업계에 공지되어 있는 렉틴 블로팅과 같은 기술은 말단 만노스 또는 갈락토스와 같은 다른 당의 비율을 밝혀준다. 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라-안테나상 올리고사카라이드가 시알산으로 종결되는 것은 무수 히드라진 또는 효소적 방법을 사용하여 단백질에서 당을 방출시키고, 이온교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의한 올리고사카라이드의 분류에 의해 확인할 수 있다. 당단백질의 pI 역시 뉴라미니다제로 처리하여 시알산을 제거하기 전과 후에 측정할 수 있다. 뉴라미니다제 처리 후 pI가 상승하는 것은 당단백질에 시알산이 존재하는 것을 지시한다.
본 발명의 탄수화물 구조는 N-연결 또는 O-연결 탄수화물로 표현되는 단백질에 존재한다. N-연결 및 O-연결 탄수화물은 코어 구조에서 주로 차이가 난다. N-연결 글리코실화는 탄수화물 잔기가 GlcNAc를 통해 펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기에 부착되는 것을 말한다. N-연결 탄수화물은 모두 공통적인 Man1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R 코어 구조를 함유한다. 따라서 상기한 코어 구조에서 R은 생산된 단백질의 아스파라긴 잔기를 나타낸다. 생산된 단백질의 펩티드 서열은 모두 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인을 함유할 것인데, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. O-연결 탄수화물은 이와 대조적으로 트레오닌 또는 세린의 히드록실기에 부착된 GalNAc라는 공통된 코어 구조를 특징으로 한다. N-연결 및 O-연결 탄수화물들에서 가장 중요한 것은 복합 N- 및 O-연결 탄수화물이다. 이러한 복합 탄수화물은 몇 개의 안테나상 구조를 함유할 것이다. 모노-, 비-, 트리- 및 테트라- 외곽 구조는 말단 시알산의 첨가에 중요하다. 그러한 외곽 사슬 구조는 본 발명의 탄수화물을 이루는 특수한 당 및 연결부를 위한 부가적인 자리를 제공한다.
그 결과 생성되는 탄수화물은 본 명세서에 설명된 방법을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 방법으로 분석할 수 있다. 글리코실화 분석에 대해 몇 가지 방법이 당업계에 공지되어 있는데 본 발명의 맥락에서 유용하다. 그러한 방법은 펩티드에 부착된 올리고사카라이드의 정체 및 조성에 관한 정보를 제공한다. 본 발명에서 유용한 탄수화물 분석을 위한 방법으로는 렉틴 크로마토그래피, 고pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 전하를 기준으로 올리고사카라이드를 분리하는 HPAEC-PAD, NMR, 질량 분광분석법, HPLC, GPC, 모노사카라이드 조성 분석, 순차적 효소 소화 등이 있지만 이것이 전부는 아니다.
그밖에, 올리고사카라이드를 방출시키는 방법이 공지되어 있다. 이들 방법으로는 1) 보통 펩티드-N-글리코시다제 F/엔도-β-갈락토시다제를 사용하여 수행되는 효소적 방법 2) 강알칼리성 환경을 이용하여 주로 O-연결 구조를 방출시키는 β 제거 및 3) 무수 히드라진을 사용하여 N- 및 O- 연결 올리고사카라이드를 모두 방출시키는 화학적 방법이 있다.
다음 단계를 이용하여 분석을 행할 수 있다:
1. 탈이온수를 상대로 시료를 투석하여 모든 완충염을 제거한 다음 동결건조,
2. 무수 히드라진을 써서 온전한 올리고사카라이드 사슬 방출,
3. 무수 메탄올계 HCl로 온전한 올리고사카라이드 사슬을 처리하여 개별 모노사카라이드를 O-메틸 유도체로 방출,
4. 존재하는 일차 아미노기의 N-아세틸화,
5. 유도체화로 퍼-O-트리메틸실릴 메틸 글리코시드 형성,
6. CP-SIL8 칼럼 상의 모세관 GLC(기체-액체 크로마토그래피)로 상기 유도체 분리,
7. 기지의 기준물질과 비교한, GLC에서 보이는 체류 시간과 질량 분광분석으로 개별 글리코시드 유도체 동정,
8. 내부 기준물질 (13-O-메틸-D-글루코스)을 사용한 FID로 개별 유도체 정량.
중성 당 및 아미노당은 펄스 전류 검출법과 결합된 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAE-PAD Carbohydrate System, Dionex Corp.)로 측정할 수 있다. 예를 들면, 당은 100℃의 20% (v/v) 트리플루오로아세트산에서 6 시간 동안 가수분해함으로써 방출시킬 수 있다. 그 다음 가수분해물을 동결건조로, 또는 Speed-Vac (Savant Instruments)으로 건조한다. 그런 다음 잔류물을 1% 아세트산나트륨 삼수화물 용액에 용해시키고 문헌[Anumula et al., Anal. Biochem. 195:269-280 (1991)]에 설명된 대로 HPLC-AS6 칼럼에서 분석한다.
시알산은 3중 시료로 문헌[Yao et al., Anal. Biochem. 179:332-335 (1989)]의 직접 비색법을 써서 별도로 측정할 수 있다. 바람직한 실시태양에서는 문헌[Warren, L.J. Biol. Chem. 238:(8) (1959)]의 티오바르바투르산 (TBA)을 사용한다.
다른 방법으로는, 면역블롯 탄수화물 분석을 행할 수 있다. 이 절차에 따르면, 하셀벡과 호셀이 문헌[Haselbeck et al., Glycoconjugate J., 7:63 (1990)]에서 기술한 산화성 면역블롯법을 기초로 한 시판 글리칸 검출 시스템 (Boehringer)을 사용하여 단백질결합 탄수화물을 검출한다. 단백질을 니트로셀룰로오스막이 아니라 폴리비닐리덴 디플루오라이드막으로 옮기며 블로킹 완충액이 0.9% 염화나트륨이 첨가된 pH 7.4의 10 mM 트리스 완충액 중에 5% 소혈청 알부민을 함유하는 것을 제외하고는 제조사에서 권장하는 염색 프로토콜을 따른다. 검출은 100 mM 염화나트륨 및 50 mM 염화마그네슘을 함유한 pH 9.5의 100 mM 트리스 완충액 중의 포스파타제 기질인 4-니트로블루 테트라졸륨 클로라이드 0.03% (w/v) 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트 0.03% (w/v)를 사용하여 트리스 완충 염수에 1:1000으로 희석한, 알칼린 포스페이트 결합체에 연결된 항-디곡시제닌 항체 (Boehringer)로 한다. 탄수화물을 함유한 단백질 밴드는 통상 약 10 내지 15 분이면 눈에 보인다.
탄수화물은 펩티드-N-글리코시다제 F를 사용한 소화에 의해서도 분석할 수 있다. 이 방법에 따르면 잔류물을 pH 8.6의, 0.18% SDS, 18 mM 베타-머캅토에탄올, 20 mM 포스페이트, 3.6 mM EDTA를 함유한 완충액 14 ㎕에 현탁시키고 100℃에서 3 분 동안 가열한다. 실온으로 냉각시킨 후 시료를 두 개의 동등한 부분으로 나눈다. 한 등분은 더 이상 처리하지 않고 대조용으로 이용된다. 두 번째 분획은 약 1% NP-40 계면활성제가 되도록 조정한 뒤 0.2 단위의 펩티드-N-글리코시다제 F (Boehringer)를 가한다. 두 시료를 모두 37℃에서 2 시간 동안 가온시킨 다음 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 분석한다.
V. 종양괴사인자 수용체-면역글로불린 키메라
바람직한 실시태양에서는 본 발명의 방법을 사용하여 종양괴사인자 수용체 (TNFR)-면역글로불린 (Ig) 키메라를 생산한다. 이 종류의 키메라 단백질 가운데 특히 바람직한 것은 가용성 타입 1 TNFRIgG1이다. 생산된 TNFR1-IgG1키메라는 많은 TNF-매개 또는 TNF-관련 질병 및 질환의 치료 또는 진단에 유용하다. 이 문맥에서 치료라는 용어는 예방 (방지), 억제 (예, 증상의 억제) 및 현존하는 상태의 치료 모두를 포함한다. TNF에 연관된 병적 상태는 그람 음성 및 그람 양성 세균혈증, 내독소성 쇼크, 이식 거부 현상, 류마티스성 관절염, 전신 낭창, 크론씨병 및 기타 TNF에 연관된 자가면역 및 염증성 질병을 포함하지만 여기에 한정되지는 않는다.
본 발명의 TNFR1-IgG1제제는 대체로 TNF에 대한 단일클론 항체가 유용한 것으로 밝혀진 적응증에 유용하다. 예를 들면, 동물 모델에서는 TNF-알파에 대한 단일클론 항체가 예방목적으로 사용되었을 때 보호 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 (Tracy, K.J. et al., (1987) Nature 330:662). 문헌[Exley, A.R. et al., (1990) Lancet 335:1275]에서 보고된 I기 임상 연구에서는 재조합 사람 TNF-알파에 대한 쥐 단일클론 항체가 심각한 패혈증 쇼크가 있는 사람 환자에게 투여했을 때 안전한 것으로 밝혀졌다. TNFR1-IgG1은 패혈증 쇼크뿐 아니라 류마티스성 관절염의 치료에도 적절히 사용된다.
TNF에 연관된 질병 또는 질환을 치료하는 방법에서는 치료 활성량의 TNFR1-IgG1제제를 치료가 필요한 대상에게 투여한다. 바람직한 대상은 사람이다.
질병 또는 질환의 치료를 위한, 본 발명의 TNFR1-IgG1당형태 제제의 유효량은 0.01-100 mg/환자, 바람직하게는 1-75 mg/환자, 그리고 가장 바람직하게는 약 10 내지 약 50 mg/환자의 복용량 범위이다.
투여를 위해서는, TNFR1-IgG1제제를 적절한 제약 또는 치료 조성물로 구성해야 한다. 그러한 조성물은 대개 치료 활성량의 TNFR1-IgG1제제와 제약상 허용되는 부형제 또는 담체, 예컨대 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 또는 물을 함유한다. 조성물은 만노스 및 만니톨을 비롯한 당과 같은 특수한 안정화제, 및 주사용 조성물을 위한 예컨대 리도카인을 비롯한 국소 마취제를 포함할 수도 있다.
본 발명은 단일클론 항체 (예, 항-TNF 항체, Mac 1 또는 LFA 1에 대한 항체) 또는 TNF 생산에 관련된 다른 수용체, 예컨대 IL-1 또는 IL-2 수용체 등과 같은 부가적인 활성 성분을 치료 활성량으로 더 포함하는 조성물을 제공한다.
단독 또는 상기와 같은 병용 치료법에 바람직한 치료 조성물은 현저한 기능적 활성을 보존하면서도 혈액으로부터의 청소시간이 연장된 본 발명의 신규 TNFR1-IgG1제제로 이루어진다. 그러한 연장된 기능적 반감기는 단순화된, 거환 투여를 허용하며 생체내 역가에 기여한다. 치료 조성물에서 바람직한 TNFR1-IgG1키메라는 본 명세서에서 설명된 TNFR1-IgG1및 제제를 포함하는데, 예컨대:
(1) 하나 이상의 시알산 잔기로 종료되는 복합 올리고사카라이드로 이루어진 TNFR1-IgG1제제.
(2) pI가 뉴라미니다제 처리에 민감해지는 크로마토포커싱으로 측정할 때 제제의 등전점 pI의 범위가 5.5 내지 7.5인 TNFR1-IgG1제제.
(3) 단백질 1 몰 당 약 1-2 몰의 노출된 N-아세틸글루코스아민 잔기를 갖는 TNFR1-IgG1제제.
(4) 단백질에 대한 시알산의 몰비가 약 4-7, 특히 약 5-6인 TNFR1-IgG1제제.
(5) N-아세틸글루코스아민에 대한 시알산의 몰비가 약 0.35 내지 약 0.5이고 더욱 바람직하게는 약 0.4 내지 약 0.45인 TNFR1-IgG1제제.
본 발명의 개별적 또는 병용 치료 조성물의 투여경로는 표준 경로, 예컨대 정맥내 관주 또는 대용량 주사 같은 것을 포함한다.
사람 또는 동물의 치료를 위한 의약의 제조에 대한 본 발명의 TNFR1-IgG1제제의 용도 역시 제공된다.
이제까지 본 발명을 개괄적으로 설명하였으므로, 본 발명을 예시하는 것으로서, 특기하지 않는 한 제한의 의도는 없는 다음의 실시예를 참조하면 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
실시예 Ｉ
TNF-알파 및 TNF-베타의 생물학적 효과는 특수한 수용체를 통해 매개된다 (Dembic et al., (1990) Cytokines, 2:231). 분자 클로닝법으로 겉보기 분자량이 55 kD (타입 1) (Schall et al., (1990) Cell 61:361) 및 75 kD (타입 2) (Smith et al., (1990) Science 248:1019)인 두 가지 독특한 타입의 TNF 수용체 (TNFR)의 존재가 밝혀졌는데, 이들 각각은 본래 TNF 알파와 TNF 베타 모두에 결합한다 (Loetscher et al., (1990) Cell 61:351, Shall et al., (1990) Cell 61:361, Kohno et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8331). 두 수용체의 세포외 부분은 본래 가용성 TNF 결합 단백질로 발혀졌다 (Kohno et al., 상게서). 각종 면역 및 염증성 사건에서 TNF의 해로운 효과를 차단하는 TNF 아고니스트가 고안되었다 (Peppel et al., (1991) J. Exp. Med. 174:1483-1489, Ulich, (1993) Am. J. Path. 142:1335-1338, Howard, O.M.Z., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2335-2339, Wooley, P.H., (1993) J. Immunol. 151:6602-6607). 그러한 아고니스트 중 하나 (Werner et al., (1991) J. Cell. Biochem. Abstracts, 20차 연례 회의, p. 115)는 사람 55 kD 타입 1 TNFR의 세포외 도메인을 사람 면역글로불린 G1 중쇄의 힌지 및 Fc 영역의 일부와 결합시킨다.
본 실시예에서는 TNFR1-IgG1키메라를 코딩한 cDNA를 함유한 벡터로 트랜스펙션시킨 포유동물 세포를 배양하였다.
방법
A. 세포주
중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주는 CHO-K1 (ATCC 번호 CCL61 CHO-K1)에서 유래한 것이다. CHO-K1 DUX-B11 (DHFR-)으로 명명된 CHO-K1 돌연변이 디하이드로폴레이트 리덕나제 (DHFR) 결핍 세포주 (콜롬비아 대학교의 L. Chasin 박사로부터 입수, Simonsen, C.C. Levinson, A.D. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2495-2499, Urlaub, G.. Chasin, L., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220)를 사용하여 프리프로인슐린에 대한 cDNA를 함유한 벡터를 이용한 트랜스펙션에 의해 인슐린에 대한 요구가 감소된 세포주를 얻었다 (Sures et al., (1980) Science 208:57-59). dp12.CHO로 지칭된 선택된 클론은 증식을 위해 글리신, 하이포크산틴 및 티미딘을 필요로 하여 그의 DHFRR-유전자형을 확인시켜 주었다.
B. 가용성 타입 1 TNFR-IgG1키메라의 구성
사람 타입 1 TNFR의 세포외 도메인과 IgG1중쇄의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인의 유전자 융합에 의해 가용성 타입 1 TNFR-IgG1키메라를 구성하였다 (이하에서 TNFR1-IgG1으로 지칭함).
플라스미드 pRK-TNF-R [Schall et al., Cell 61, 361 (1990)]에서 사람 타입 1 TNFR 코딩 DNA 서열 (Loetscher et al., 상게서 참조)을 얻었다. 이 출발 플라스미드를 구성하기 위해서는, 1989년 3월 15일 공고된 유럽 특허 공고 제307,247호에 구성법이 설명되어 있는 포유동물 발현 벡터 pRK5에 2.1 kb 태반 cDNA 클론 (Schall et al., 상게서)을 삽입하였다. 이 cDNA는 Loetscher et al.이 보고한 서열의 뉴클레오티드 위치 64에서 시작하며 개시 메티오닌이 118 bp 하류에 있다.
IgG1코딩 서열의 출처는 성숙형 사람 CD4 단백질의 잔기 1-180 (두 개의 N-말단 CD4 가변 도메인)이 중쇄-경쇄 결합에 관련된 시스테인 잔기 이후 IgG1힌지의 첫 번째 잔기인 아스파트산 216 (아미노산 114를 중쇄 보존 영역의 첫 번째 잔기로 간주함 [Kabat etl al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 4판 (1987)])에서 시작하고 잔기 441에서 끝나서 IgG1의 CH2 및 CH3 Fc도메인을 포함하는 사람 IgG1서열에 융합되어 이루어진 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 서열을 함유한, CD4-IgG 발현 플라스미드 pRKCD42Fc1[Capon, D.J. et al., Nature 337, 525 (1989), Byrn et al., Nature 344, 667 (1990)]이었다.
TNFR1-IgG1은 플라스미드 pRK-TNF-R과 pRKCD42Fc1의 제한 단편을 생성시키고, 결실 돌연변이유발을 이용해 이것들을 연결시켜 성숙형 TNFR의 트레오닌 잔기 171이 IgG1중쇄의 아스파트산 잔기 216과 병렬되게 함으로써 구성하였다 [Kabat et al., 상게서]. 그 결과 생성된 플라스미드 pRKTNFR-IgG는 TNFR1-IgG1을 위한 완전한 길이의 코딩 서열을 함유하였다.
C. 세포 배양
가용성 타입 1 TNFR-IgG1을 코딩한 유전자를 트랜스펙션에 의해 dp12.CHO 세포에 도입시켰다. 이것은 포유동물 세포에 DNA를 도입하기 위한 인산칼슘법을 사용하여 수행하였다. 트랜스펙션 2일 후에 세포를 트립신처리하고 선택 배지 (글리신-하이포크산틴 및 티미딘 배제 Ham's F-12 DMEM, 2% 투석된 혈청과 1:1 (v/v))에 다시 평판배양하였다. 후속적으로 나온 단리물을 TNFR1-IgG1의 분비에 대해 스크리닝하였다. TNFR1-IgG1을 발현하는 클론은 메토트렉세이트 중에서 증폭시켜 고발현 클론을 생산하며 후속적으로는 무혈청 배지에 적응시킨다. 이들 세포는 접종물의 증식 및 팽창을 위해 비선택 배지로 옮길 때까지 지속적인 선택압력 하에 두었다.
TNFR1-IgG1생산 배양을 위한 세포를 제공하기 위해, 위에 설명한 세포 집단을 메토트렉세이트를 함유한 배지에서부터 메토트렉세이트를 함유하지 않은 증식 배지까지 부피가 점증하는 용기에서 단계적인 계대배양에 의해 확장시켰다. 공정의 이들 단계에서 비선택적 증식 배지는 글루코스, 아미노산, 염, 당, 비타민, 글리신, 하이포크산틴 및 티미딘, 재조합 사람 인슐린, 가수분해한 펩톤 (Primatone HS 또는 Primatone RL), Pluronic F68 (플루로닉 폴리올) 또는 그 균등물과 같은 세포 보호제, 겐타마이신, 지질 및 미량 원소와 같은 일부 성분의 농도를 조정한 DMEM/HAM F-12 기재 제제 (예, 미국 특허 제5,122,469호 참조)였다 .
배양은 CO2기체 (산) 및(또는) Na2CO3(염기)의 사용에 의해 pH 7.2 ± 0.4로 조절하였다. 온도는 증식 기간 동안 37℃ 부근으로 조절하였다. 용존 산소는 공기 및(또는) 산소 기체를 사용한 직접 스파징으로 공기 포화도의 5%를 넘게 유지하였다.
접종물 확장기 동안의 삼투질 농도는 약 250 mOsm 내지 350 mOsm로 유지하였다.
각 배양의 증식기에는 배양 변수가 최적 증식에서 생산 조건으로 바뀌는 제2의 기 또는 전이기가 이어졌다. 이 전이기 동안 배양계의 온도는 일반적으로 약 30 내지 35℃로 감소시켰다. 부티르산 이온을 첨가하고 일정한 삼투질 농도 범위를 확보하였다. 이 생산기 동안 축적된 생산물을 시알산 함량 면에서 분석하였다.
전형적인 생산 계획에서는, 300 mOsm의 출발 삼투질 농도로 증식기에서 배양되는 선택 단계로부터 접종물의 확장에서 대략 1.2 x 106세포가 파생되었다. 증식 배지에 미량 원소, 재조합 사람 인슐린 및 가수분해된 펩톤을 보충하였다. 세포를 이러한 조건에서 2 일 동안 배양하였다. 제3일이 시작되면 세포 배양액의 온도를 낮추었다. 온도 변동과 동시에, 또는 그에 이어 부티르산나트륨을 세포 배양액에 첨가하고 각종 배지 성분의 첨가로 원하는 생산 삼투질 농도를 확보하였다. 공급이 되는 이러한 조건에서 세포를 9-10일 동안 배양하였다. 필요할 때에는 세포에 각종 배지 성분을 공급하였다.
하기 표 1은 각종 생산 공정에 대한 생산 조건을 설명하는 것이다.
공정형 부티르산 이온 농도 (mmol/l) 생산기의 삼투질 농도 (mOsmol/kg) 제5일과 제10일 사이의 세포 단위 생산성 (pg/일) 제10일에 TNFR1-IgG1의 시알산 함량 (mol/mol)
A 1 360-420 0.6-1.5 6.4-7.2 N=4
B 1 480-510 1.7-2.2 6.0-6.3 N=3
C 6 460 4.8 4.7 N=1
D 6 370-420 2.4-2.8 5.5-5.6 N=3
E 6 350-370 1.4-2.3 5.4-6.3 N=3
F 12 390 4.0 5.3 N=1
G 12 490-510 2.9-5.2 4.0-5.2 N=4
H 12 400-430 2.0-2.8 5.8-6.0 N=3
I 12 370-380 2.0-2.2 5.5-5.9 N=3
D. TNFR-IgG의 회수
문헌[Capon et al., 상게서]에 설명된 것과 같이 고정화 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 단백질 A 상에서 행한 친화도 크로마토그래피로 TNFR1-IgG1키메라를 95% 이상의 균질도까지 정제하였다.
E. 탄수화물 분석
시알산 함량은 문헌[Warren, L. (1959) J. Biol. Chem. 234:1971-1975]의 방법으로 분석하였다.
결과
표 1에 기술된 생산 배양 각각의 세포 단위 생산성을 수득된 산물의 시알산 함량에 대해 작도하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 최고의 시알산 함량은 공정 변수를 약 360 내지 420 mOsm의 생산 삼투질 농도 및 약 1 mM의 부티르산 이온 농도로 유지했을 때 관찰되었다. 시알산 함량은 공정 변수를 조정함으로써 넓은 수치 범위에 걸쳐 조절할 수 있었다.
실시예 II
여러 가지 제제의 혈장 약물동력학적 반감기 및(또는) 청소율을 측정하였다. 높은 시알산 함량을 가진 제제가 일반적으로 감소된 시알산 함량을 가진 제제에 비해 증가된 혈장 반감기 및(또는) 낮은 총청소율을 보였다.
방법
체중이 272-315 g인 17 마리의 수컷 스프라그-돌리-파생 흰쥐를 세 가지의 TNFR1-IgG1융합 단백질 처치군 중 하나에 무작위적으로 할당하였다 (처치군 당 N=5 또는 6). 대퇴정맥 카뉼라를 통해 시험 물질을 5 mg/kg의 명목 용량으로 동물에 정맥내 주사하였다. 선택된 시험 물질에는 생산기 동안의 부티르산 이온 농도가 6 mM이고 생산기 동안의 삼투질 농도가 약 400 mOsm로 유지된 공정-공정 I-에서 얻은 두 가지 TNFR1-IgG1제제와 부티르산 이온 농도가 12 mM이고 생산기 동안의 삼투질 농도가 약 500 mOsm였던 공정-공정 II-에서 얻은 또하나의 TNFR1-IgG1제제가 포함되었다. 투약전, 그리고 투약후 5 분 및 2, 6, 10, 24, 34, 48, 56, 72, 92 및 120 시간에 2 ml 혈액 시료를 EDTA (8.5%) 상에 수집하였다. 혈액 시료를 원심분리하고, 혈장을 수득한 다음 TNFR1-IgG1융합 단백질의 농도에 관해 시료를 분석하였다.
효소연결 면역학적 및 생물학적 결합 검정법 (ELIBA)을 사용하여 흰쥐 혈장 중의 TNFR1-IgG1을 정량하였다. 이 검정법은 호스라디쉬 퍼옥시다제에 연결된 TNF-알파 (TNF-알파-HRP)가 TNFR1-IgG1융합 단백질의 수용체 부분에 결합하는 능력을 기초로 한 것이다. 이 검정법에서는, 마이크로타이터 플레이트의 웰에 코팅된 염소의 항사람 IgGFc의 Fab 단편을 사용하여 TNFR1-IgG1분자의 Fc 부분과의 상호작용에 의해 TNFR1-IgG1을 포획하였다. TNF-알파-HRP를 웰에 가하고 포획된 TNFR1-IgG1의 수용체 부분에 결합하게 하였다. 정량은 퍼옥시다제와 퍼옥사이드 및 오르토-페닐렌디아민 (OPD) 기질의 반응에서 나오는 색을 측정함으로써 결정하였다. 분석 범위는 0.003 내지 0.2 mg/ml였다. 혈장 시료 중 EDTA의 존재는 분석의 수행에 전혀 영향을 끼치지 않는 것으로 밝혀졌다.
투약 용액의 농도 차이를 해결하기 위해 투약량을 정규화시켰다. 모든 계산은 120 시간의 시점에 걸친 농도 대 시간 데이터에 기초하였다. 사다리꼴 규칙을 사용하여 곡선 아래의 단절 면적 (AUC0-120)을 계산하고 가중치-정규화 절단 청소율 (CL0-120/W)은 투약량/AUC0-120으로 계산하였다.
결과
청소율은 사용된 공정 형태 (공정 II와 대비한 공정 I) 및 생산물에 존재하는 시알산의 양에 따라 변하였다. 이 연구에서 얻은 개별 동물에 대한 청소율 및 거기에서 나오는 평균 및 표준편차를 하기 표 2에 제시하였다. 공정 I이 더 느리고 더 바람직한 청소율을 보인다.
청소율 0-120 (mL/시/kg)
공정 I 공정 I 공정 II
2.12 2.08 2.144
2.03 2.31 2.99
1.63 2.20 2.61
1.89 2.22 3.27
1.85 1.99 2.82
1.66 3.42
평균 1.91 2.08 2.88
표준편차 0.02 0.23 0.45
실시예 III
TNFR1-IgG1의 모노사카라이드 조성
실시예 I에서 설명된 것과 같이 조제된 TNFR1-IgG1의 올리고사카라이드 탄수화물 조성 및 구조를 조사한 결과 각종 공정형의 시알산 함량이 서로 다르게 나타났다. 신속한 혈장 청소는 올리고사카라이드 사슬 상에서 많이 노출된 GlcNAc, 낮은 시알산 함량 및 (추론컨대) 만노스 또는 갈락토스 수용체에 대한 단백질의 접근성과 연관되었다. 느린 혈장 청소는 더 많은 말단 시알산 잔기와 연관되었다.
A. 시험 물질의 출처
상기 실시예 I에 개략적으로 설명된 방법에 따라 TNFR1-IgG1을 생산하였다. 공정 I 물질은 생산기 동안 6 mM 부티르산 이온 및 약 400 mOsm의 삼투질 농도를 사용한 세포 배양에서 얻었다. 공정 물질 II는 생산기 동안 12 mM 부티르산 이온 및 약 500 mOsm의 삼투질 농도를 사용한 세포 배양에서 얻었다.
B. 방법
온전한 중성 및 아미노-당의 방출은 펄스 전류 검출법과 결합된 고-pH 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 분석은 다음 단계들을 써서 수행하였다:
1. TNFR1-IgG1(대략 50 ㎍/ml) 및 적절한 기준 시료에 대해 최종 시료가 1% 아세트산을 함유하도록 완충액 교환을 수행하였다.
2. 기준 물질의 시료와 함께 대략 90 ㎍의 TNFR1-IgG1을 드라이아이스 및 알코올조에서 냉동시키고 냉동된 시료를 밤새 동결건조시켰다.
3. 동결건조된 시료를 500 ㎕의 트리플루오로아세트산에 녹여 액체로 만들고 120℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.
4. 산 가수분해 후 TNFR1-IgG1과 기준 시료를 냉각시키고 증발건조하였다.
5. 시료에 물을 가해 대략 0.6 mg/ml의 최종 농도로 만들었다.
6. Dionex CarboPac PA1 (4 x 250 mm) 칼럼 (Dionex Corp., 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)을 사용하여 펄스 전류 검출기가 있는 고-pH 음이온 교환 크로마토그래피로 주변온도에서 모노사카라이드의 분리를 수행하였다.
7. 개별 모노사카라이드의 정량은 기준 모노사카라이드와의 비교에 의하였다.
C. 결과
두 가지 제제에서 각 모노사카라이드의 상대적 몰함량을 하기 표 3에 나타내었다.
두 가지 TNFR1-IgG1제제에서 모노사카라이드의 상대적 몰함량
모노사카라이드 공정 I 공정 II
푸코스 4.3±0.2 4.4
갈락토스 6.5±0.0 4.7
만노스 12.2±0.6 12.5
N-아세틸글루코스아민 14.1±0.6 14.3
시알산 4.9±0.3 3.7±0.3
N-아세틸갈락토스아민 0.5±0.1 0.3
시알산/GlcNAc의 비 0.35 0.26
상기 결과는 당단백질의 생산기를 위해 선택된 공정 변수가 성숙형 당단백질의 탄수화물 조성에 영향을 미친다는 것을 증명한다. 보다 높은 시알산 함량을 가진 제제가 일반적으로 연장된 혈청 반감기를 나타내었다.
하기 표 4 및 표 5는 공정 I 및 공정 II 조건 하에서 생산된 TNFR1-IgG1키메라 제제의 올리고사카라이드 측면 사슬의 탄수화물 조성을 보여준다. 표 5는 Fc 글리코실화 부위를 뺀, 키메라 분자의 수용체 부분에 있는 탄수화물에 대한 데이터를 보여준다.
PI PI PI PI PII PII
시알산 5.8 5.8 5.7 5.8 3.7 3.5
푸코스 4.0 4.0 3.6 4.1 4.4 4.3
Gal NAc 0.3 0.2 0.2 0.4 0.3 0.4
Glc NAc 12.9 15.0 14.8 14.3 14.3 14.4
Gal 7.4 7.6 7.1 7.0 4.7 4.1
Man 12.0 12.0 10.0 12.0 12.5 11.9
SA/GlcNAc의 비 0.45 0.39 0.39 0.41 0.26 0.24
PII PII PI PI
몰 당 노출된 GlcNAc 몰 3.18 3.2 1.11 1.32
몰 당 노출된 Gal 몰 0.97 -0.08 1.45 -0.26
Gal 안테나 4.47 4.72 6.45 6.24
몰 당 시알산 3.5 4.8 5.00 6.5
표 4 및 표 5에 제시된 결과는 TNFR1-IgG1의 조성이 시알산이 말단에 있는 모노-, 비- 및 트리-안테나상 복합 올리고사카라이드를 대표한다는 것을 증명한다. 공정 I에 의해 제조된 TNFR1-IgG1이 현저히 높은 비율의 시알산과 현저히 낮은 비율의 노출된 GlcNAc를 함유한다고 결론지을 수 있다. 단백질 1몰 당 시알산 수치는 이 물질이 공정 II에 의해 제조된 물질보다 더 낮은 등전점을 가질 것임을 시사한다. 표 2에 있는 결과와 비교해 보면, 상기 결과는 공정 I 물질의 보다 느린 혈장 청소율이 보다 낮은 비율의 노출된 GlcNAc 및 대체로 보다 높은 시알산 함량과 상관된다는 것을 시사한다.
표 4 및 표 5는 하나 이상의 시알산 잔기로 끝나는 복합 올리고사카라이드를 함유한 TNFR1-IgG1제제를 설명한다. 바람직한 TNFR1-IgG1제제는 단백질 1 몰 당 약 1-2 몰의 노출된 N-아세틸글루코스아민 잔기를 갖는 TNFR1-IgG1분자로 이루어진다. 단백질에 대한 시알산의 몰비는 약 4-7이다. 이 TNFR1-IgG1제제의 N-아세틸글루코스아민에 대한 시알산의 몰비는 약 0.4 내지 약 0.45이다.
실시예 IV
심하게 시알릴화된 제제의 pI는 약간 시알릴화된 제제의 pI보다 낮다.
방법
실시예 II에서 설명된 여러 가지 제제에 대해 등전 포커싱을 수행하였다. 등전 포커싱 겔은 pH가 상이한 양쪽성 전해질을 써서 만들어낸 pH 구배를 사용하여 제제의 당단백질을 그의 등전점, pI에 따라 분리한다. 이 연구에서 제제의 분석은 10에서 4까지의 pH 구배를 사용하여 수행하였다.
결과
TNFR1-IgG1제제는 pI가 뉴라미니다제 처리에 민감한 크로마토포커싱으로 측정했을 때 약 5.5 내지 약 7.5의 등전점 범위를 보였다.
이상에서 인용된 참고문헌은 구체적으로 포함되었는지의 여부와 관계없이 모두 본 명세서에 참고로 포함시킨다.
본 발명을 특정한 실시태양과 관련하여 설명하였지만 더 많은 변경이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본 출원은 본 발명의 원칙을 대체로 따르고, 또한 본 발명이 관계되는 업계의 공지되거나 관습적인 관례 내에 있고 첨부된 청구의 범위 영역에서와 같이 설명된 본질적인 특징에 적용할 수 있는 본 발명과의 벗어나는 점을 포함하는 본 발명의 모든 변형, 용도 또는 응용을 포함하려는 것이다.
.

Claims (23)

  1. i) 알칸산 또는 그의 염을 세포 배양에 약 0.1 mM 내지 약 20 mM의 농도로 첨가하고,
    ii) 세포 배양의 삼투질 농도를 약 250 내지 약 600 mOsm로 유지하는 것
    을 특징으로 하는 배양의 생산기에서 포유동물 숙주세포를 배양하는 것으로 구성되는, 포유동물 세포 배양으로 생산되는 당단백질의 올리고사카라이드 측면 사슬상에 존재하는 시알산 양을 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 약 0.1 내지 약 6 mM의 알칸산 또는 그의 염 농도에서 숙주 세포를 배양 및 약 300-450 mOsm의 삼투질 농도를 유지함으로써 세포 배양의 세포 단위 생산성이 감소되며, 당단백질의 올리고사카라이드 측면 사슬상에 존재하는 시알산의 양이 증가되는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 숙주세포가 CHO 세포인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 알칸산 또는 그의 염이 부티르산나트륨인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 생산되는 당단백질이 포유동물 당단백질인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 당단백질이 종양괴사인자 수용체-면역글로불린 키메라인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 숙주세포가 가용성 타입 1 종양괴사인자-면역글로불린 G1키메라를 코딩하는 cDNA를 담은 벡터로 트랜스펙션된 dp12.CHO 세포주인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 약 6 mM 내지 약 12 mM의 알칸산 또는 그의 염 농도에서 숙주 세포를 배양 및 약 450-600 mOsm로 삼투질 농도를 유지함으로써 세포 배양의 세포 단위 생산성이 증가되며, 당단백질의 올리고사카라이드 측면 사슬상에 존재하는 시알산의 양이 감소되는 방법,
  9. 제8항에 있어서, 숙주세포가 CHO 세포인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 알칸산 또는 그의 염이 부티르산나트륨인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 생산되는 당단백질이 포유동물 당단백질인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 당단백질이 종양괴사인자 수용체-면역글로불린 키메라인 방법.
  13. 제14항에 있어서, 숙주세포가 가용성 타입 1 종양괴사인자-면역글로불린 G1(TNFR1-IgG1) 키메라를 코딩하는 cDNA를 담은 벡터로 트랜스펙션된 dp12.CHO 세포주인 방법.
  14. (a) 최대의 세포 증식이 이루어지는 조건 하에서 일정 기간 동안 TNFR-IG 키메라를 발현하는 포유동물 숙주세포를 증식기로 배양하는 것,
    (b) 약 6 mM 내지 약 12 mM 농도의 부티르산나트륨이 존재하는 가운데 숙주세포를 생산기로 배양하는 것,
    (c) 생산기의 삼투질 농도를 약 450-600 mOsm로 유지하는 것
    으로 구성되는, 종양괴사인자 수용체-면역글로불린 TNFR1-IgG1키메라 단백질의 생산 방법.
  15. (a) 최대의 세포 증식이 이루어지는 조건 하에서 일정 기간 동안 TNFR-IG 키메라를 발현하는 포유동물 숙주세포를 증식기로 배양하는 것,
    (b) 약 1 mM 내지 약 6 mM 농도의 부티르산나트륨이 존재하는 가운데 숙주세포를 생산기로 배양하는 것,
    (c) 생산기의 삼투질 농도를 약 300-450 mOsm로 유지하는 것
    으로 구성되는, 종양괴사인자 수용체-면역글로불린 TNFR1-IgG1키메라 단백질의 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서, 숙주세포가 CHO 세포인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 숙주세포가 dp12.CHO 세포주인 방법.
  18. 제17항의 방법으로 생산된 TNFR1-IgG1으로 이루어진 제제.
  19. 제15항의 방법으로 생산된 TNFR1-IgG1및 제약상 허용되는 부형제로 이루어진 치료 조성물.
  20. 단백질에 대한 시알산의 몰비가 약 4-7인 TNFR1-IgG1 분자를 포함하는 TNFR1-IgG1 제제.
  21. TNFR1-IgG1 단백질 1몰 당 약 1-2몰의 노출된 N-아세틸글루코스아민 잔기가 있는 TNFR1-IgG1 분자를 포함하는 TNFR1-IgG1 제제.
  22. N-아세틸글루코스아민에 대한 시알산의 몰비가 약 0.35 내지 약 0.5인 TNFR1-IgG1 분자를 포함하는 TNFR1-IgG1 제제.
  23. 제22항에 있어서, N-아세틸글루코스아민에 대한 시알산의 몰비가 약 0.39 내지 약 0.45인 제제.
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