JPH01257492A - 異種蛋白質の生産増強方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ、利用分野 本発明は、組換え動物細胞の培養方法に関する詳細には
、組換え動物細胞の培養時に異種蛋白質の産生を増強さ
せる方法に関する。

口、従来技術 遺伝子組換え技術によって目的の異種蛋白質を生産する
宿主としては、当初大腸菌を中心に研究が進められ、さ
らに酵母、枯草菌等の微生物が、その培養の簡便さ及び
宿主−ベクター系の研究の進展等から繁用されていた。

（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、　ｖ、ＩＩｔａｋｕｒａ＋　
Ｋ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｈ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

ｕ、ｓ、Ａ、、　７６、１０６　（１９７９）およびＮ
ａｇａｔａ、　Ｓ、。

Ｔａ１ｒａ、　Ｓ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓｓａｎｎ
、仁、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８４＋１３１６　（１９１
３０）参照〕。

しかし、近年高分子糖蛋白質を天然型に近い形で、しか
も可溶な型で遺伝子組換え技術による物質生産をおこな
うために宿主として、動物細胞を用いる発現系に焦点が
移っている。

既知の動物細胞としては、 Ｃ１（Ｏ−Ｋ。

（チャイニーズハムスター卵巣細胞； ＡＴＣＣＣＣＬ６１） ＢＨＫ　　（新生仔ハムスター腎細胞；ＡＴＣＣＣＣＬ
ＩＯ） ＣＯ５−７ （ＣＬＩ　Ｏｒｉｇｉｎ、　５Ｖ−４０細胞ニー　　Ａ
ＴＣＣＣＲＬ１６５１） Ｖｅｒｏ　　　（アフリカミドリザル腎細胞：＾ＴＣＣ
ＣＣＬ−８１） 等がある。

ハ０本発明が解決しようとする問題点 そこで、次の関心事は異種蛋白質の産生をいかに増強さ
せるかということである。

今回、本発明者らは、組換え動物細胞の壇養時に、培地
に酪酸またはその塩を添加することにより異種蛋白質の
産生を増強できることを見出し、本発明を完成した。

二０問題点を解決するための手段 本発明は、異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列を組み込
んだベクターを用いて形質転換した動物細胞を培養して
異種蛋白質を産生ずる際に、培地に酪酸またはその塩を
添加することにより異種蛋白質の産生を増強させる方法
に関する。

（１）組換え動物細胞の調製 組換え動物細胞は、遺伝子組換え技術により目的とする
異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列を組み込んだベクタ
ーを宿主である動物細胞に導入して当該細胞を形質転換
させることにより得られる。

異種蛋白質は、高分子蛋白質または高分子糖蛋白質であ
れば特に限定されない。

このような異種蛋白質としては、ウロキナーゼ（ＵＫ）
、プロウロキナーゼ（ＰｒｏＵＫ）、組織プラスミノー
ゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原（
ＨＢｓＡｇ）、プレＳ　８Ｎ域を含むＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ
　ｇ（ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ）、インターフェロン−ｒ
（ＩＦＮ−Ｔ）、コロニー形成刺激因子（Ｃ３Ｆ）など
が挙げられる。

また、これらの活性断片（ドメイン）または誘導体であ
ってもよい。

これらの生理活性物質をコードするＤＮＡ配列およびそ
の調製方法は、 ＰｒｏＵＫ　（特開昭６Ｏ−１８０５９１）Ｐｒｏｔｌ
Ｋ　　ドメイン（特願昭６ｌ−１５６９３６）ｔ−ＰＡ
（特開昭５９−１８３６９３．　　同５９−４２３２１
）ｔｌＢｓ八８　へ（同　　５５９−３６６９８）Ｐｒ
ｅｙ−ＨＢｓＡ　（同５６−６３９９５）ＩＦＮ−ｒ　
　（同６ｌ−１０８３９７）Ｃ３Ｆ　　　　（同６ｌ−
１９９７８７）などで開示されている。

異種蛋白質発現用ベクターは、発現系遺伝子として例え
ばＳＶ　−４０に由来するエンハンサ−１初期領域プロ
モーター、ポリアブニレ−シランシグナル及び有用な異
種蛋白質をコードする遺伝子から構成される。このよう
な発現系ベクターとしては、ｐ　Ｓ　Ｖ　−Ｇｔ（特開
昭６ｌ−１７７９８７）、ｐｓＶ−Ｇｔ（特願昭６ｌ−
７９０８６）などが例示される。又他の動物ウィルスや
動物細胞に由来するプロモーターなども使用できる。

動物細胞としては、ＣＨＯ−Ｋｌ　、ＢＨＫ、ＣＯＳ　
−７、Ｖｅｒｏ、ヒト腎由来株細胞（特願昭６０−２９
０３２５参照）、チャン肝細胞（ＡＴＣＣ磁ＣＣＬ１３
）、チンパンジー肝細胞（＾ＴＣＣ１ｔｃｃＬ６３１１
）などが挙げられる。特にＣ）１０−に、が好ましい。

かくして、異種蛋白質発現用ベクターをこの宿主細胞の
核内に挿入することによって形質転換がおこなわれる。

組換えＤＮＡの細胞への導入方法は、リン酸カルシウム
沈澱法（ストレインら、Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、Ｊ、＋２１
８＋４７５−４８２．１９８４）などが挙げられる。こ
の方法は、組換えＤＮＡを含む、リン酸緩衝液に塩化カ
ルシウム溶液を滴下することによって、Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｉ
Ｊン酸カルシウムの微小沈澱を形成させ、その微小沈澱
を細胞に吸着させ、細胞内にとりこませる方法である。

形質転換は、シャーレに約１　＝　１０　Ｘ　１０’ｃ
ｅｌ　Ｉｓ１０ｍｌ／１００ｍｄｉｓｈの割合で宿主細
胞を調製し、これに異種蛋白質発現用ベクターをＤＮＡ
量として２〜４ｐｇを加える。ＤＮＡを宿主細胞にとり
こませた後、培養を行い形質転換細胞の選別をおこなう
。

外来遺伝子が発現している細胞を選択するためには、同
時に薬剤耐性遺伝子を導入して、薬剤耐性株を選択する
方法が用いられる（スブラマニら、Ａｒａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、、　　１３５．１−１５＋　　１９８３）　　
ｅ例えば、動物細胞内でＧ−４１８に耐性を示すネオマ
イシン耐性遺伝子：ａ＋ｓｉｎｏｇｌｙｃｏｓｔｄｅ　
３’　−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｉ
Ｉを用いる。薬剤耐性遺伝子は先述の発現用ベクター中
に直接挿入するかまたはコトランスフェクション（（：
ｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）により導入される。ネ
オマイシン耐性遺伝子発現プラスミドとしては、５Ｖ４
Ｑのプロモーター、スブライシングジャンクシッン、ポ
リＡ付加シグナルを有するベクターにネオマイシン耐性
遺伝子を接続したｐ　５Ｖ−Ｇ、−Ｎｅ　ｏあるいはｐ
ＳＶ　　Ｇｔ　　Ｎｅｏなどを用いることができる。

（２）前培養 組換え動物細胞を予め、増殖・継代培養しておく　。

培地としては、ＷａＢｏｕｔｈ培地、ダルベツコ変法イ
ーグル培地、Ｆ−１２培地、ＲＩＴＣ−８０−１培地（
Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｇｉｏｌ、、１１１，１５５
−１６２（１９８２））などが挙げられ、好適にはＦ−
１２培地、ＲＩＴＣ−８０−７などが用いられる。

また、１０〜２０ｖ／ｖ％程度のウシ胎児血清を添加す
ることがより好ましい。

さらに、プロリン１０〜１００μｇ／請１を添加しても
よい。

組換え動物細胞を１〜２０万ｃｅｌ　ｌｓ／ｍｌとなる
ように培地中に植え込み、２〜３日間培養を続けた後、
必要ならば培地を交換して継代培養し、細胞数を１０〜
２００万ｃｅｌＬｓ／ｍｌに調製する。

（３）　　本培養 基本培地としては、Ｗａｙ＋＊ｏｕｔｈ培地、ダルベツ
コ変法イーグル培地、Ｆ−１２培地、ＲＩＴＣ−８０−
７培地などが挙げられ、好適にはＦ−１２培地、ＲＩＴ
Ｃ−８０−７培地などが用いられる。

本工程は、好適には無血清壇地中で行う。

これに、本発明の特徴である酪酸またはその塩（例えば
、ナトリウム塩、カリウム塩など）が添加される。

添加量としては、０．１〜１０５Ｍ程度、好適には１〜
５ｍＭが例示される。

培地にはその他うクトアルブミン氷解吻、トランスフェ
リン、各種アミノ酸、各種脂肪酸、インシュリン等のホ
ルモンなどを添加してもよい。

この培地中には空気（Ａｉｒ　９５％、ＣＯ！５％）を
適宜導入（流速：１０〜５００＋ｗｌ／分）することが
好ましく、温度は２０〜３７℃が好ましい、培養液は２
〜３日程度ごとに、交換する。

かくして、培地中または、細胞質中に異種蛋白質が産生
される。

培地からの産生物の回収は、例えば、当該培地を遠心分
離、減圧濃縮、塩析分画、ゲル濾過、濃縮、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー等を二適宜組み合わせることによって行なわれる。

細胞質からの回収は、機械的破壊または界面活性剤など
で細胞を破壊した後に得られた細胞抽出液を上記の培養
上清と同様に処理する。

ホ、効果 本発明の方法により、組換え動物細胞における異種蛋白
質の産生が２〜３倍程度増強される。

従って、本発明の方法は遺伝子工学分野における動物細
胞を用いての異種蛋白質の大量生産に極めて有用な方法
と考えられる。

へ、実施例・実験例 本発明をより詳細に説明するために、実施例・実験例を
挙げるが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。

実施例１ 参考例１により得られたＰｒｏＵに産生形質転換株（Ｃ
−６８−５３，Ｃ−６８−６１）およびＣＨＯＯＫ＋細
胞、各々２０万ｃｅｌｌｓを１０ｖ／ｖ％牛脂児血清含
有Ｆ−１２培地４ｍ＋１（６０■ｄｉｓｈ）中に植え込
み、３７°Ｃで３日間培養した。培地を除去して維持用
培地（Ｆ−１２またはＲＩＴＣ−８０−７）４甑ｌで培
養皿を洗った後に、維持用培地または５＠Ｍ酪酸ナトリ
ウム含有維持用培地を加え、３７゛Ｃで２４時間培養し
た。培養上清のＵＫ活性をフィブリン平板法により測定
した。

実施例２ 参考例２により得られたＰｒｅｙ−ＨＢｓＡｇ産生形質
転換株を用いて実施例１に準じて培養を行った（培地は
Ｆ−１２）。

ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇの定量はＥＬＩＳＡ法で行った。

第　　２　　表 実施例３ 参考例３により得られたＴＰＡ産生形質転換株を用いて
実施例１に準じて培養を行った。培地はＦ−１２または
３５μｇ／ｍｌプロリン含有ダルベツコ変法イーグル培
地（ＤＭＥ）を用いた。ｔ−ＰＡの定量はフィブリン平
板法を用いた。標準試料としてＵＫを用い、活性はＵＫ
の国際単位に換算した第　　３　　表 実験例１（濃度） 参考例１により得られたＰｒｏＵＫ産生形質転換株（Ｃ
−６８−５３株）　２０万ｃｅｌｌｓを１０ｖ／ｖ％牛
脂児血清含有Ｆ−１２培地４　ｍｌ　（６０ｍｄｉｓｈ
）に植え込み、３７℃で３日間培養したところ、細胞数
が２．．８Ｘ１０’に達した。培地を取り除き、培養皿
を４＋ｉｌのＦ−１２で洗った後、酪酸ナトリウム（最
終濃度Ｏ〜２０ｓＭ）含有Ｆ−１２を４ｍ＋１ずつ分注
した。２４時間培養後、培養上清のＵＫ活性をフィブリ
ン平板法により測定した。またＵＫ活性測定用の試料を
採取後、トリプシン処理を行い、細胞を培養皿か・らは
がし、コールタ−カウンターを用いて細胞数を測定した
。

第　　４　　表 実験例２（種類） 参考例１により得られたＰｒｏＵＫ産生形質転換株（Ｃ
−６８−５３株）２０万ｃｅｌｌｓをＩＱｖ／ｖ％牛脂
児血・涜含有Ｆ−１２培地４　ｍｌ　（６０ｍｄｉｓｈ
）に植え込み、３７℃で３日間培養したところ、細胞数
が２．８　Ｘ　１０’に達した。培地を取り除き、４■
ｌのＦ−１２で洗った後、各種添加剤含有Ｆ−１２培地
を４＋ｉｌずつ分注した。３７℃で２４時間培養後、培
養上清のＵＫ活性をフィブリン平板法により測定した。

第　　５　　表 実験例３（培養時間） 参考例１により得られたＰｒｏ［ＩＫ産生形質転換株（
Ｃ−６８−５３株）２０万ｃｅｌｌｓを１０ｖ／ｖ％牛
脂児血清含有Ｆ−１２培地４ｍ１（６０閣ｄｉｓｈ）に
植え込み、３７°Ｃで３日間培養したところ、細胞数が
２．８　Ｘ　１０’に達した。培地を取り除き、４１の
Ｆ−１２で洗った後、５ＩＩＭ酪酸ナトリウム含有Ｆ−
１２培地を４＋１１ずつ分注した。３７℃で６〜２４時
間培養後、培養上清のＵＫ活性をフィブリン平板法で測
定した。Ｆ−１２培地のみで培養した場合の活性を対照
として、各時間における酪酸ナトリウムのＰｒｏＵＫ産
生の増強効果を百分率で示した。

第　　６　　表 実験例４ 酪酸ナトリウムによるＰｒｏＵＫ産生の活性化のメカニ
ズムについて調べるために、ＵＫ産生株の培養上清と細
胞抽出液を調製してＵＫ活性と蛋白含量を測定した。

参考例１により得られたＰｒｏＵＫ産生形質転換株（Ｃ
−６８−５３）　６６万ｃｅｌｌｓを１０ｖ／ｖ％牛脂
児血清含存Ｆ−１２培地１０ｍｌ（１１０ｍ１（１００
）に植え込み、３日間培養後、１０１のＦ−１２で洗っ
た。５ｎ＋Ｍ酪酸ナトリウム含有Ｆ−１２培地またはＦ
−１２培地を各々１０ｍ１ずつ分注した。３７°Ｃで２
４時間培養後に細胞抽出液と培養上清のＵＫ活性と蛋白
含量を各々、フィブリン平板法とローリ−法で測定した
。

細胞抽出液の調製方法：単層状となっている細胞（細胞
数は約５００万）をトリプシン処理で集め、１０ｍ１の
等張リン酸緩衝液で２度洗った後に、０．５ｍｌの等張
リン酸緩衝液に細胞を懸濁し、０．５ｍｌの０．５ｖ八
％トリトンＸ−１００溶液を加えて撹拌した後、３７°
Ｃで５分間装置することにより得られる。

第７表中、抽出画分での結果は、酪酸ナトリウム処理に
より選択的に細胞に導入した異種の蛋白合成が促進され
ることを証明している。

また、非分泌性産物をコードしているプラスミドを用い
た場合にも、酪酸処理が適用できることを示唆するもの
である。

参考例１ ｐｒｏＬＩＫ産生形質転換株は特開昭６１−１７７９８
７に開示された方法により調製される。

すなわち、当該株はネオマイシン耐性遺伝子とＰｒｏＵ
に遺伝子を共導入（コトランスフェクション）したＣＨ
ＯＫ＋細胞に由来する。

（１）ｃＤＮＡ ＵＫ′＠産生する大賢由来株化細胞から抽出されたｍＲ
ＮＡからｃ　ＤＮＡを調製する。

解析された全塩基配列を以下に表わす。

このようなＰｒｏＵＫの全塩基配列を含むプラスミドと
して常法により、ｐＵＫ３３を調製する。

（２）　　ベクターのウロキナーゼＤＮＡ配列の挿入（
１）で得たｐ　ＩＪ　Ｋ３３　（全長約２．２Ｋｂｐの
ウロキナーゼｃＤＮＡを含む）をＰｓｔ　　Ｉで部分消
化し、１．７Ｋｂｐ断片を単離してｐＳＶ−Ｇ、に挿入
した。この際の反応は、反応混合液（ｐＵＫ３３１川μ
ｇ、１０ＸＰｓｔ　　Ｉｂｕｆｆｅｒ　５０　ｐ　１．
　Ｐｓｔ　　Ｉ　　１０　ｔｔ　１．　（６０Ｕ　）　
、　ｄＨ！Ｏを加え５００μｅ＞　を、３７゛Ｃに保ち
、反応開始後１０分、１５分および２０分で、それぞれ
約１６０μｒサンプリングし、６５’Ｃ，５分間加熱処
理後、それぞれの、反応液を混合して、１％アガロース
ゲルにて電気泳動にかけ、１．７Ｋｂｐ断片を約１０μ
ｇ回収した。回収された約１．７Ｋｂｐ断片の約５μｇ
を用い、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ処理で付着末端を平
滑末端にかえＫｐｎ　　Ｉリンカ−を付加した。その後
Ｋｐｎ　　Ｉで消化したｐｓＶ−Ｇ、　　と連結して、
大腸菌ＪＩＢ １０１を形質転換して、ｐＳＶ−Ｇ、−ｐｒｏＵＫ（第
１図）を得た。

ｐＳＶ　−Ｃｚ−ｐｒｏＵＫは、５Ｖ−４０のｍＲＮＡ
転写調節域の下流にｐｒｏＵＫｃＤＮＡの５′−非コー
ド化領域、シグナル配列コード化領域、ｐｒｏＵＫコー
ド化領域及び３″−非コード化領域が挿入されており、
適当な受容細胞へＤＮＡを導入することでヒト−Ｐｒｏ
ＬＪＫの産生を行いうる（３）　　ドミナント選択マー
カーを含むプラスミドＤＮＡの調製 上記ｐＳＶ−Ｇ、を用いて培養細胞を形質転換する際の
ドミナント選択マーカーとして用いるプラスミドである
ｐｓＶ７Ｇ、−Ｎｅｏ’　は、以下の様にして作製した
。

Ｔｎ５由来のネオマイシン耐性遺伝子がクローニングさ
れているプラスミドｐ　Ｎ　Ｅ　Ｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
。

Ｐ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｐ、　Ｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅ
ｃ、　ａｎｄ　ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔ、、　１．３
２７−３４１　（１９８２）　　をＢａｍＨＩと旧ｎｄ
ｌｌｌで切断後、エタノール沈澱してＤＮＡ断片を回収
した。回収したＤＮＡは４ｄＮＴＰ存在下でＥ。

ｃｏｌｉＤＮＡ−ポリメラーゼＩ、クレノー断片で付着
末端を平滑末端に変更した。　１．５ＫｂｐＤ　Ｎ　Ａ
断片はアガロースゲル電気泳動で分離回収し、次にＴ、
−ＤＮＡリガーゼによる反応でその末端に前述の様にし
てにｐｎ　　Ｉリンカ−を付加した。

にｐｎ　　１リンカ−の付加後、Ｘｐｎ１６ＵでＤＮＡ
断片を完全に消化し、リンカ−の付加された目的の約１
．５ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。

回収したＤＮＡ断片は、そのうち１５ｎｇを前述の様に
してＫｐｎ　　Ｉで切断したｐ　Ｓ　Ｖ　　Ｇ＋　２０
ｎｇと連結し、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換して目的の
プラスミドｐｓＶ−Ｇ、　　−Ｎｅｏ’を得た（第２図
）。

（４）　　受容細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　ｃｅｌｌ）
の調製受容細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細
胞（ＣＨＯ−に、、＾ＴＣＣＣＣＬ６１（Ｆｌｏｗ−Ｌ
ａｂｏ、　Ｉｎｃ。

より購入））を用い、細胞の培養を１０シ／Ｖ％ウシ胎
児血清（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ社製）
を含むハムのＦ　−１２（Ｇｉｂｃｏ社製）で行った。

細胞はファルコン３０２８フラスコで継代維持した。形
質転換に用いる細胞は、接種後２日の単層なものを用い
た。

トリプシン処理で細胞を集め、前記培養液に懸濁後、フ
ァルコン３００３（１００ｍ）培養シャーレに５×１０
Ｓｃｅ１１ｓ／１０＠ｌで植え込んだ。２４時間５％の
Ｃ０８−９５％ａｉｒのＣＯ，−インキュベータで培養
後、形質転換に用いた。この時シャーレあたりの細胞数
は、？、０ｘｌＯ’　ｃｅｌｌｓであった。

（５）　　形質転換 長田等の方法（蛋白質核酸・酵素、　２８　（１４）　
。

１５６９〜１５８１．１９８３）に準じて調製したプラ
スミドＤＮＡ　（ｐＳＶ−Ｇ＋　　−ｐｒｏＵＫ及びｐ
ＳＶ−Ｇ、−Ｎｅｏ’　　（混合比率は１００；１）〕
をＤＮＡ量として２．０μｇ／ｍｌおよびキャリアＤＮ
Ａとしてサケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ　（ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ）を２０　ｐ　ｇ／＋ｗｌ含有するＤＮＡ−Ｃ
ａＰＯ，微小沈澱液を（４）で調製したシャーレあたり
１１づつ加えた。シャーレを十字に動かして静置し、Ｄ
　Ｎ　Ａ　　Ｃａ　Ｐ　Ｏａ微小沈澱液を細胞に吸着さ
せた後、再びインキュベータで培養を開始した。１８時
間後壇地交換を行い、さらに４８時間以上壇培養た後に
、形質転換細胞の選別を開始した。

（６）　　形質転換細胞の選別 真核細胞において、Ｇ−４１８耐性を与えるＴｎ５由来
のネオマイシン耐性遺伝子を ドミナントマーカーとして用い（前述のｐＳＶ−ＧＩＮ
　ｅ　ｏ’　）　５ｏｕｔｈｅｒｎ等の方法（Ｊ、　Ｍ
ｏ１ｅｃ、　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、、
　１．３２７−３４１．１９８２）に準じて細胞をＧ−
４１８含有培地（４００μｇ／ｌ）で培養することによ
ってトランスフエクシゴンした細胞の選別を行った。な
お、Ｇ−４１８はＧｔｂｃｏ社製（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ
、　Ｇｉｂｃｏ、　　ｌｏｔ　Ｎｏ、７５　Ｋ６０４３
　及び７４Ｎ８０４０）を用いた。

４日おきに培地を交換し、Ｇ−４１８耐性コロニーを順
次クローニングして成育させ、１０日回定８３クローン
を得た。得られたクローンをヒト−ウロキナーゼＲＰＩ
（Ａ試薬（ミドリ十字社製）及びフィブリン平板法でウ
ロキナーゼの踵体を調べた。ＲＰＨＡ試薬で、第一次の
スクリーニングを行った結果、Ｇ−４１８耐性株のうち
約２５％で凝集がみられ、ヒト−ウロキナーゼ様物質が
産生されていると推定できた。

凝集のみられた１５株をフィブリン平板法によってプラ
スミノーゲンアクキベーター活性を調べたところ培養上
清に活性が認められ、しかもこの活性は、ウロキナーゼ
抗原カラムで精製した抗ヒト−ウロキナーゼ抗体で中和
された。スクリーニングによって得たウロキナーゼ様物
質の産生量の高いと思われる形質転換体Ｃ−６８を選び
、低密度培養によるクローニングを行って、Ｃ−６８−
５３とＣ−６８−６１の２株を得た。

これらのクローンの培養上清を用いて、合成・分泌され
たヒトーＵＫ様蛋白の性状を検討した。

なお、Ｃ−６８−５３とＣ−６８−６１の両クローンは
、１００日以上にわたって安定にさらに構成的に培地中
にヒトーＵＫ様蛋白を分泌した。そして、形質転換細胞
から、分子量が５４．０００ダルトンの糖鎖の付加され
たｐ　ｒ　ｏ−ＵＫの産生が確認された。

参考例２ ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ産生形質転換株として、ＳＶ４０
エンハンサ−および初期プロモーターの下流にＰｒｅＳ
−ＨＲｓＡｇ遺伝子を接続して導入したＣＨＯ−に、細
胞を用いた。

（１）　　Ｐ　Ｓ　Ｖ　−３ｒ　ｄ組換えＤＮＡの作製
（第３図） Ｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ構造遺伝子全体がｐＢＲ３２２
のＨｉｎｄｌ［［部位に挿入されているプラスミドｐＰ
ｓ４１１から、Ｐｒｅ　Ｓ　ｊｌ域の３番目のＡＴＧか
らＨＢ’ｓＡ’ｇ遺伝子領域までを含んだ１．２Ｋｂｐ
断片（３ｒｄ　Ｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ）をＭｓｔ　Ｉ
Ｌ　Ｈｉｎｄｌにより切り出し、動物細胞発現ベクター
ｐ　Ｓ　Ｖ　Ｇ　ｘ　　　Ｅ　ｃ　ｏのＥｃｏＲ１部位
に正方向に挿入したプラスミドｐｓＶ−３ｒｄを作製す
る。

ｐＰ５４１１　１０μｇをＭｓｔ　　ｎ　　１２Ｕ、　
Ｈｉｎｄｌｌ１１２Ｕで３７°Ｃ５時間反応させ、フェ
ノール抽出を２回行い、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。

このＤＮＡは４０閣Ｈトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）
、８ｓ＋Ｍ硫酸マグネシウム、８０μＭジチオスレイト
ール、２ｓ＋ＭｄＮＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼ！
クレノー断片１０Ｕにより室温で３０分反応させ、付着
末端を平滑末端にし、さらに５０ＩＩＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８，２）で牛小腸由来アルカリホスファターゼ
ＩＵにより３７℃１時間反応し、５′末端を脱リン酸化
したのち、クロロホルム、フェノール抽出を２回行いエ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収する。このＤＮＡ４μ
ｇに６６ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）　６．
６　ｓＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、１．ＯｓＭ　　Ａ　Ｔ　Ｐ　、　ＥｃｏＲＩリンカ
−（９ＧＧＡＡＴＴＣＣ）　２　＃　ｇ存在下、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ５．６Ｕを１６℃−晩反応させ、ＥｃｏＲ
Ｉリンカ−を接続する。このＤＮＡをエタノール沈澱に
より回収し、Ｉ！ｃｏＲＩ　５０　Ｕで３７°Ｃ５時間
反応させ、０，８％低融点アガロースゲル電気泳動を行
い、１．２Ｋｂｐ断片をゲルから切り出し、フェノール
抽出を２回行い、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収す
る。

ＳＶ４０のエンハンサ−、プロモーター、スプライシン
グジャンクション、ポリアデニル化シグナルを有する動
物細胞発現ベクターｐｓＶＧｔ　　ＥｃｏのＥｃｏＲ１
部位に、Ｉ！ｃｏＲＩリンカ−の接続したＰｒｅ　５−
ＨＢｓＡｇ　１．２Ｋｂｐ断片を挿入する。ｐｓＶＧ。

−Ｅｃｏ３ＩｊｇをＥｃｏＲＩ　１０　Ｕで３７℃６時
間反応させ、さらに５０ｍＭ　）リス塩酸（９１１８，
２）緩衝液中で、牛小腸由来アルカ・リフオスファター
ゼ２０Ｕで３７°Ｃ１時間反応させ、５′末端を脱リン
酸化した後、０．８％低融点アガロースゲル電気泳動を
行う。

泳動後、断片を切り出し、フェノール抽出２回、エタノ
ール沈澱によりＤＮＡを回収する。ＥｃｏＲ１ン肖　化
　ｐＳＶＧｚ−Ｅｃｏｌ　　μ　ｇ　　１１！：　Ｐｒ
ｅＳ−ＨＢｓＡｇ　　１゜’２Ｋｂｐ断片０．５μｇを
６６ｎ＋Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）　、６．
６　ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、１．０ｍ門Ａ　Ｔ　Ｐ反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ８．４Ｕにより１６°Ｃ−晩反応させ、大腸菌ＨＢ
　ｌ　０１に形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体
を得る。形質転換体のなかから、ＥｃｏＲＩ　、　Ｂａ
ｌ１＋Ｈｌ　、　Ｓａｌ　Ｉ　＋Ｘｂａ　　Ｉの切断パ
ターンを分析することにより、Ｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇ
断片が正方向に入ったｐＳＶ−３ｒｄを得る。

（２）　　動物細胞の形質転換 ＣＨＯ−に、細胞の形質転換は、リン酸カルシウム沈澱
法により行う。２倍濃度のヘペス緩衝液（２ＸＨＢＳ）
（ヘペス（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸）　１０ｇ　／　ｉ、Ｎａ
Ｃｅ　６ｇ７１．ｐＨ７，１に調節）　２．５ｍｌ、７
０ｍＭ　ＮａＨｚＰＯ４と７０ＩＩＩＭ　Ｎａ２ＨＰＯ
４の水？容液５０μｆｆｉ。

ｌμｇ／＋ｎｌサケ精子ＤＮＡ１００μｆｆｉ、組み換
えＤＮＡ［ｐＳＶ−３ｒｄ　　　１０４ｇ、　ｐＳＶ　
　　Ｃｔ＋　　　ＮｅＯ′　（図２）　　０．１μｇｌ
　　１００μｆｆｉをチューブに加え、滅菌水で全量４
．７ｍｌにしたＢ液を調製する。このＢ液にＡ液（２Ｍ
　ＣａＣｊ！　ｚ）　３００ＩＩｌを加える、Ｂ液に空
気を送りながら撹拌し、Ａ液をゆっくり滴下する。Ａ液
を加え終った後、１〜２分空気を送りつづけ、均質な沈
澱を形成させ、１０分間静置する。ＣＨＯＫ＋　細胞は
、トランスフェクションの前日に、１００　ｍシャーレ
に５ＸＩＯ’個まき、２４時間ＣＯ□インキュベーター
で培養する。培養液は１０ｖ／ｖ％胎仔牛血清を含むハ
ムのＦ−１２培地を用いる。この培養シャーレに、微小
沈澱液１ｍｌを滴下し、均一に拡散させる。１０分間の
静置により、ＤＮＡ−リン酸カルシウム微小沈澱を細胞
に吸着させた後、再びＣＯ□インキュベーターで培養す
る。トランスフェクションの１８時間後に、培地交換を
行い、さらに４８時間後Ｇ−４１８含有培地と交換する
。　Ｇ−４１８の濃度は４００ｇｇ／ｍｌである。

Ｇ−４１８含有培地で成育したコロニーをシリンダー法
で分離し、Ｇ−４１８耐性形質転換細胞を得る。

（３）　　Ｐｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇの生産上記のＧ−４
１８耐性細胞の培養液中のＨＢｓＡｇ活性をＲＰＨＡ法
（アンティヘプセル：ミドリ十字！り及びＥＩＡ法（オ
ースザイム■、グイナボット社製）により検討した。Ｇ
−４１８耐性株のなかから、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ陽性株が
高頻度に得られる。さらにポリアルブミン（ｐＨ３Ａ）
結合活性をポリアルブミン（ｐＨ３Ａ）のＰＨＡ法（レ
ンケイら、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１６．２３−３０．１９７７）によ
り検討し、ＨＢｓＡｇ陽性細胞上清にｐＨ３Ａ結合活性
が認められ、Ｐｒｅ　Ｓ　８５域が発現していることを
、確認した。この上清を塩化セシウム密度勾配遠心分離
法を用いて精製した。この精製サンプルをＳＯ３ＰＡＧ
Ｅによって分子量を求めたところ約３５，０００、約２
７，０００、約２４　、０００の３本のバンドを確認し
た。このことにより形質転換した細胞がＰｒｅ　Ｓ−Ｈ
ＢｓＡｇペプタイドを産生じていることを確認した。な
お本発明で得られたＰｒｅ　Ｓ−ＨＢｓＡｇの粒子を電
子顕微鏡で観察したところ直径的２２ｎｍの球形粒子で
あった。

参考例３ ｔ−ＰＡ産生形質転換株として、５Ｖ−４０エンハンサ
−および初期プロモーターの下流にｔ−ＰＡ遺伝子を接
続して導入したＣＨＯ（Ｏ−Ｋｌ細胞を用いた。

（１）　　発現ベクターの構築 メラノーマ細胞Ｇ−３６１株由来ｔ−ＰＡｃＤＮＡを有
するプラスミドｐＴＰＡ−２より、ｔ−ＰＡの全コード
化領域を含む断片を取り出し、動物細胞用発現ベクター
ｐ　Ｓ　Ｖ　　Ｇ　ｔの発現調節領域の間に挿入してｔ
−ＰＡ発現ベクターｐＤＸ−２を構築する。

（１−ｉ）ｐＸＫ−２の作製（第４図）プラスミドｐＴ
ＰＡ−２をＨｉｎｄｌ［Ｉ及びＸｍｎ１で消化し、アガ
ロースゲル電気泳動によりｔ−ＰＡｃＤＮＡを含む２．
９ＫｂのＤＮＡバンドを切り取り、エレクトロエル−シ
ランにてＤＮＡを回収した。

この２．９Ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ−Ｘｍｎ■断片の両末端
をフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）　　シ、Ｋｐｎ　　Ｉ
リンカ−を付加した。

Ｋｐｎ　　Ｉリンカ−の結合した断片は、さらにＫｐｎ
　　１を用いて消化し、アガロースゲル電気泳動により
２．９Ｋｂ付近のバンドを切り取りエレクトロエル−シ
コンにてＤＮＡを回収した。

一方、動物細胞用発現ベクターｐＳＶ　　ＧｘをＫｐｎ
　　Ｉ消化し、さらにＣＨＯＰ　（牛小腸由来アルカリ
ホスファターゼ）処理により５′末端のリン酸基を除い
た０次にこの３．２Ｋｂ　ｐ　Ｓ　Ｖ　−Ｇｔ　−Ｋｐ
ｎｉ断片と先に調製した２、９Ｋｂ　　ｔ　−Ｐ　Ａ　
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含む断片を連結した０反応後二の溶液
を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換した。

形質転換体より抽出したプラスミドＤＮＡから、目的と
するプラスミドＰＸＫ−２を選択した。

（１−ｉｉ）ｐＤＤ−２プラスミドの作製（第５図）プ
ラスミドｐＴＰＡ−２をＢｂｅ　　Ｉと旧ｎｄｌｌｌで
消化し、このＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけゲ
ルよりＧ−Ｃテイル及びｔ−ＰＡｃＤＮＡの１部を含む
１．ＩＫｂのＤＮＡバンドを切り取り、エレクトロエル
−ジョンによりＤＮＡを回収した。

そしてこのＨｉｎｄ　ｍ　−Ｂｂｅ　　ｎ断片をＯｄｅ
　　Ｉで消化し、次に５′側の突出末端をフィルイン（
ｆｉｌｌ−ｉｎ）　シた後ポリアクリルアミドゲルにか
け２７０ｂｐ断片のバンドをゲルより切り出しエレクト
ロエル−シランにてＤＮＡを回収した。このＧ−Ｃテイ
ルが除かれた２７０ｂｐ　Ｏｄｅ　　１断片の両末端に
Ｋｐｎ　　Ｉリンカ−を付加した。この断片を一旦Ｋｐ
ｎ　　Ｉ消化した後ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけ、リンカ−ＤＮＡ由来のＤＮＡ切断片を除いた。泳
動後ゲルより２７０ｂｐ付近のバンドを切り取り、エレ
クトロエル−ジョンにてＤＮＡを回収した。

（１−ｉ）で調製した［ｐｎ　　Ｉ処理ｐＳＶ　　Ｇｔ
と先に調製した２７０ｂｐ　Ｋｐｎ　　ｎ断片を連結し
た。反応後この液を用い大腸菌ＤＨＩを形質転換した。

形質転換体より抽出したプラスミドＤＮＡから目的とす
るプラスミドｐＤＤ−２を選択した。

（１−’ｉｉｉ　　　Ｄ　Ｘ　−２プラスミドの　　’
（６−’）（１−ｉ）で作製したプラスミドｐＸＫ−２
をＲａｎ　ｍ　（Ｃ１ａ　　Ｉのｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍ
ｅｒ　）消化し、さらにＢｇｌ　　ｕを用い部分消化し
、ｔ−ＰＡのＮ末付近に位置するＢｇｌ　　１１部位だ
けを切断しアガロースゲル電気泳動にてゲルより４．８
Ｋｂ　Ｒａｎ　ｍ　−Ｂｇｌ　Ｉｎ断片のＤＮＡバンド
を切り取り、エレクトロエル−ジョンにてＤＮＡを回収
した後この断片をＢＡＰ　（バクテリア由来アルカリホ
スファターゼ）処理した一方、（１−ｉｉ　）で作製し
たｐＤＤ−２をＲａｎ■とＢｇｌ　　ＩＩを用い消化し
た。これをアガロースゲルにかけ、ゲルよりＳＶ４０初
期プロモーターを含む７３０ｂｐのＤＮＡバンドを切り
取り、エレクトロエル−シランにてＤＮＡを回収した。

この７３０ｂｐ　Ｒａｎ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ｎ断片と先に
調製した４、８ＫｂＲａｎ　Ｉｎ　−Ｂｇｌ　ｎ断片を
連結し、この反応液を用い大腸菌ＤＨＩを形質転換した
。

形質転換体より抽出したプラスミドＤＮＡから目的とす
るプラスミドｐＤＸ−２を選択した。

（２）ｔ−ＰＡ産生形質転換株の調製 （１）で得られたプラスミドｐＤＸ−２を用い、参考例
１または２の方法に準じて、ｐ　Ｓ　Ｖ　−Ｇ　＋−Ｎ
ｅｏ’　と共に、ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈澱法によ
り、ＣＨＯＫ１１ｉｎ胞をコトランスフェクションした
。

導入効率は１．８　Ｘ　１０−’〜４．６　Ｘ　１０−
’コロニー／ｐｇ　ＤＮＡ／ｄｉｓｈ程度であった。

この中から、目的とするｔ−ＰＡ産生形質転換株（Ｒ−
７２−３）を選別した。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐ　ＵＫ３３　（ｐ　ｒ　ｏ　ＵＫのｃＤＮＡ
を担持）とｐ　Ｓ　Ｖ　　Ｇ＋（Ｓ　Ｖ４０初期プロモ
ーターを担持）からｐ　Ｓ　Ｖ　−Ｇ　ｒ　　ｐ　ｒ　
ｏ　Ｕ　Ｋ　（両者を担持）を構築する手順を示す。 第２図はｐＮＥＯ（ネオマイシン耐性遺伝子を担持）　
トｐ　Ｓ　Ｖ　　Ｇ　ｔ（Ｓ　Ｖ４０初期プロモーター
を担持）からｐＳＶ−Ｇ、Ｎｅｏ’　　（両者を担持）
を構築する手順を示す。 第３図はｐＰｓ４１１　（ｐｒｅＳ−ＨＢｓＡｇのｃＤ
ＮＡを担持）とｐｓＶ−Ｇｔ−Ｅｃｏ　　（ＳＶ４０初
期プロモーターを担持）からｐＳＶ−３ｒｄ（両者を担
持）を構築する手順を示す。 第４図はｐＴＰＡ−２（ｔ−ＰＡのｃＤＮＡを（Ｕ持）
　（！：　ｐ　Ｓ　Ｖ　　Ｇｚ（Ｓ　Ｖ４０初朋プロモ
ーターを１ｕ持）からｐＸＫ−２を構築する手順を示す
。 第５図はｐＴＰＡ−２とｐＳＶ−Ｇ、からｐ［）Ｄ−２
を構築する手順を示す。 第６図はｐＸＫ−２とｐＤＤ−２からｐＤＸ−２（ＴＰ
Ａのｃ　ＤＮＡとＳＶ４０初朋プ初子プロモーターを担
持）を構築する手順を示す。 回申、ニー囚はＳＶ４０エンハンサ− ※燕μｓはＳＶ４０初朋プロモーター ｍはネオマイシン耐性遺伝子 一一一は外来ＤＮＡ 口二二はＳＶ４０ポリアデニル化シグナルＡＰ’　はア
ンピシリン耐性 Ｔｃ’　はテトラサイクリン耐性 □　はｐＢＲ３２２由来 を表わす。 また、制限酵素部位は以下のように表わされる。 Ａｃ：Ａｃｃ　　Ｉ、　　Ｂ　：Ｂａｍｔｌｌ、　Ｂａ
：Ｂａｌ　Ｉ＋Ｂｂ：ＢｂｅＩ、Ｃ：Ｃｆｆ１ａＩ、Ｄ
：ＤｄｅＩ。 ＧＩ：Ｂｇｌ２１．　　ＧＩＩ　：Ｂｇｌ　Ｉ［、Ｈ：
Ｈ４ｎｄＩ［Ｉ。 ｔｉｐ：Ｉ（ｐａ　　Ｉ、　　Ｋ　　：Ｋｐｎ　　Ｉ、
　　Ｐ　　：Ｐｓｔ　　ＩＰｖ：Ｐｖｕ　　ＩＩ、　　
Ｓ　　：Ｓａｌ　　！＋　　Ｓｃ：Ｓｃａ　　Ｉ＋Ｓａ
：Ｓｐｈ　　ｌ、　　Ｔ　　：Ｔｔｈ　　ＩＶ、　　Ｘ
　　：Ｘｈｏ　　Ｉ。 （ばか３名） 第　　４　　図 第　　５　　図 １Ｆ篇“；。、−□、６ 第　　６　　図 手続補正力 昭和６２年５り／日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ
   ベクターを用いて形質転換した動物細胞を培養して異種
   蛋白質を産生する際に、培地に酪酸またはその塩を添加
   することを特徴とする異種蛋白質の産生増強方法。
2. （２）動物細胞がＣＨＯ−Ｋ＿１である特許請求の範囲
   第（１）項記載の方法。
3. （３）ベクターがＳＶ４０初期プロモーターを含む特許
   請求の範囲第（１）項記載の方法。