PL180372B1

PL180372B1 - Peptyd bedacy antagonista bombezyny oraz kompozycja farmaceutyczna zawierajaca ten peptyd PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL180372B1
Application number: PL94306209A
Authority: PL
Inventors: Andrew Victor Schally; Ren Zhi Cai
Original assignee: Univ Tulane
Priority date: 1993-03-15
Filing date: 1994-03-07
Publication date: 2001-01-31
Also published as: ZA941767B; HUT69727A; RU2114118C1; DE69411342D1; AU6444694A; NZ263668A; JP3838656B2; EP0646127A1; HRP940164A2; FI945378A; EP0646127B1; JPH07507330A; UA34456C2; SK136494A3; ES2120615T3; IL108851A0; IL108851A; NO944293D0; FI945378A0; DK0646127T3

Abstract

1 Peptyd, bedacy antagonista bombezyny o wzorze. X -A 1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A9-Q w którym X oznacza wodór, poje- dyncze wiazanie laczace grupe alfa-aminowaz A 1 z ugrupowaniem gamma-karboksylowym z ugrupowania 3-propionylowego z A 2, gdy A 2 jest Glu, lub grupe o wzorze R1 CO-, w którym R 1 oznacza wodór, C 1-10-alkil lub fenylo-C 1-10-alkil; A 1 oznacza reszte D- lub L-aminokwasu wybranego z grupy, skladajacej sie z Cpa, Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierscieniu benzeno- wym przez jeden lub wiecej element wybrany z grupy, skladajacej sie z F, Cl, Br, NH2 lub alkilu C1-3 lub peptydowe wiazanie laczace ugrupo- wanie acylowe R 1-CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A 2; A2 oznacza G ln, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie [-] oznacza wiazanie pojedyncze gdy X jest wiazaniem pojedynczym i A 2 oznacza Glu, laczace ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3-propionylo- wego z Glu z grupa alfa-ammowaz A 1, zas Y oznacza reszte -OR2, gdzie R oznacza C 1-3-alkil, Leu-psi- oznacza zredukowana forme Leu, w której zamiast ugrupowania C=O wystepuje -CH2, tak ze wiazanie tego ugrupowania-CH2- z gtupa alfa-aminowa sasiedniej reszty A9 jest wiazaniem pseudopeptydowym, A 9 oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen, Q oznacza NH2 lub -OQ1, gdzie Q1 oznacza wodór, alkil C 1-10, alkil C 1-10, fenyl lub fenylo-C1-10-alkil, oraz jego dopuszczalne farmaceutycznie sole 13 Kompozycja farmaceutyczna, zawierajaca substancje biologicznie czynna oraz dopuszczalny farmaceutycznie nosnik ciekly lub staly, znamienna tym, ze jako substancje biologicznie czynna zawiera peptyd, bedacy antagonista bombezyny o wzorze- X -A 1-A 2-Trp-Ala- -Va1-Gly-His-Leu-psi-A9-Q, w którym X oznacza wodór, pojedyncze wiazanie laczace grupe alfa-aminowa z A 1 z ugrupowaniem gamma- -karboksylowym z ugrupowania 3-propionylowego z A 2, gdy A 2 jest Glu, lub grupe o wzorze R 1CO-, w którym R 1 oznacza wodór, C1-10-alkil lub fenylo-C1-10-alkil.A 1 oznacza reszte D- ub L-aminokwasu wybranego z grupy, skladajacej sie z Cpa, Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierscieniu benzenowym przez jeden lub wiecej element wy brany z grupy, skladajacej sie z F ,Cl, Br,NH2 lub alkilu C1-3 lub peptydowe wiazanie laczace ugrupowanie acylowe R 1-CO-z ugrupowaniem alfa-aminowym z A 2, A 2 oz- nacza Gln, Glu [-J, Glu (Y) lub His, gdzie [-] oznacza wiazanie pojedyncze, gdy X jest wiazaniem pojedynczym i A 2 oznacza Glu, laczace ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3-propionylowego zG lu2 z grupa alfa-aminowaz A , zas Y oznacza reszte -OR2, gdzie R 2 oznacza C 1-3-alkil, Leu-psi- oznacza zredukowana forme Leu, w której zamiast ugrupowania C=O wystepuje -CH2, tak ze wiazanie tego ugrupowania-CH2-z grupa alfa-aminowa sasiedniej reszty A 9 jest wiazaniem pseudopeptydowym; A 9 oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen, 1 Q oznacza NH2 lub -OQ1, gdzie Q1 oznacza wodór, alkil C1-10, fenyl lub fenylo-C1-10-alkil,lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy peptyd, wywierający wpływ na wzrost guzów rakowych u ludzi. W szczególności wynalazek dotyczy antagonisty bombezyny, który jest Ψ⁸’⁹pseudopeptydem, zawierającym w pozycji C-końcowej resztę Tac, MTac lub DMTac, jego soli i kompozycji farmaceutycznej. Peptyd ten posiada właściwości antagonistyczne w stosunku do bombezyny lub peptydów bombezyno-pochodnych.

Wynalazek dotyczy związków polipeptydowych, posiadających właściwości antagonistyczne w stosunku do bombezyny lub peptydów bombezyno-pochodnych (takich jak peptyd uwalniający gastrynę (GRP), neuromedyna C i podobne), określanych w dalszej części opisu jako właściwości bombezyno-antagonistyczne i posiadających znaczenie na przykład w leczeniu chorób złośliwych organizmów ciepłokrwistych, takich jak człowiek. Wynalazek dotyczy nowych związków polipeptydowych i nowych kompozycji farmaceutycznych, zawierających wspomniane związki polipeptydowe do wytwarzania efektu bombezyno-antagoni stycznego w organizmach ciepłokrwistych, takich jak człowiek.

Bombezyna jest tetradekapeptydoamidem, który został po raz pierwszy wyizolowany ze skóry żaby Bombina bombina (Anastasi, Erspamer i Bucci, Experientia, 1971, 27, 166). Wiadomo jest, że bombezyna jest silnym mitogenem dla mysich komórek fibroblastów 3T3 Swiss (Rozengurt i Sinnett-Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 2936) i że stymuluje ona wydzielanie amylazy z trzustki świnki morskiej (Jensen Jones, Folkers i Gradner, Naturę, 1984, 309,61). Wiadomo jest również, że peptydy bombezyno-podobne są wytwarzane i wydzielane

180 372 przez komórki ludzkiego raka małokomórkowego płuc (SCLC) (Moody, Pert, Gazdar, Camey i Minna, Science, 1981, 214, 1246), że dodane egzogenne peptydy bombezyno-podobne mogą stymulować wzrost ludzkich komórek SCLC in vitro (Camey, Cuttita, Moody i Minna, Cancer Research, 1987,47, 821) i że przeciwciało monoklonalne specyficzne dla regionu C-końcowego bombezyny i GRP może blokować wiązanie GRP do jego receptorów i zapobiegać wzrostowi ludzkich komórek SCLC zarówno in vitro jak i in vivo (Cuttita, Camey, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler i Minna, Naturę, 1985, 316, 823).

GRP, który posiada właściwości bombezyno-podobne, jest szeroko rozpowszechnionym peptydem, zawierającym 27 aminokwasów, wyizolowanym z jelita świńskiego (McDonald, Jomvall, Nilsson, Vagne, Ghatei, Bloom i Mutt, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, 90, 227), w którym C-końcowa sekwencja aminokwasów jest prawe identyczna jak w bombezynie. Meuromedyna C jest dekapeptydoamidem, którego struktura jest identyczna jak dziesięć ostatnich aminokwasów w C-końcowym regionie GRP, wyizolowanego z jelita cienkiego psa (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke i Shiveły, J. Biol. Chem., 1983,258,5582). GRP stymuluje wiele odpowiedzi biologicznych, w tym uwalnianie gastryny w krążeniu układowym. Funkcjonuje on również jak czynnik wzrostu w mysich fibroblastach 3T3 oraz komórce małokomórkowego raka płuc (SCLC). Zaproponowano zatem, że GRP odgrywa bezpośrednią rolę patofizjologiczną w rozwoju SCLC poprzez mechanizm wzrostu autokrynnego.

Struktury bombezyny, neuromedyny C i karboksylo-zakończonego nonapeptydu GRP przedstawiono poniżej:

Bombezyna:

pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2

Neuromedyna C:

H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂

C-końcowy nonapeptyd GRP:

Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2

Poszukiwania u zwierząt ziemnowodnych innych peptydów bombezyno-podobnych doprowadziły do wyizolowania ze skóry żaby z Papui Nowa Gwinea litorinu, nonapeptydu (pGluGln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂), który okazał się wyjątkowo silnym analogiem bombezyny (Yasukara i wpółpr., Chem. Pharm. Buli., 1979, 27, 492). Badania nad analogami bombezyny wykazały, że minimalny segment 9 reszt aminokwasowych w pozycjach od 6 do 14 bombezyny posiadał pełne spektrum aktywności bombezyny.

Scharakteryzowano dotąd kilka rodzajów antagonistów bombezyny. Substancja P (ArgPro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂), która posiada niewielką homologię sekwencji aminokwasów z bombezyną, nie hamuje wiązania bombezyny i peptydów bombezyno-podobnych, ale stwierdzono, że analogi substancji P, zmodyfikowane przez zastąpienie kilku L-aminokwasów D-aminokwasami, takie jak (D-Arg¹, D-Pro², D-Trp^7,9, Leu¹¹) substancja P i (D-Arg¹, D-Phe³, D-Trp^7>9, Leu¹¹) substancja P (Moody i współpr., Fed. Proceedings, 1987, 46, 2201), blokują wydzielanie bombezyny w komórkach trzustkowych i antagonizują sprzyjające wzrostowi efekty bombezyny w komórkach Swiss 3T3 . Wykazano, że dwa typy antagonistów bombezyny, pochodzących od bombezyny, na przykład (D-Phe⁶, D-Phe¹²) bombezyna i [Leu¹³-psi-Leu¹⁴]bombezyna (Coy i współpr., J. Biol. Chem., 1988, 263, 5056 i peptydy, 1989, 10, 587) są silnymi inhibitorami odpowiedzi bombezyny in vitro i in vivo.

Z europejskich opisów patentowych nr 339193 oraz 402852 znane są związki o właściwościach antagonistów bombezyny, pozbawione wiązania pseudopeptydowego Ψ⁸'⁹.

Innym rodzajem antagonisty bombezyny ujawnionym prze Heimbrooka i współpr. (Bio. Chem., 1989, 264, 11258) jest N-acetylo-GRP(20-26) i jego analogi, w których C-końcowa reszta metioniny jest usunięta z analogów GRP(20-27). Coy [J. Biol. Chem., 264, 1989, 25,

180 372

14691] podał, że niektórzy antagoniści bombezyny o krótkich łańcuchach na bazie sekwencji litorinu, tak jak [D-Phe⁶, Leu¹³-psi-Phe¹⁴]bombezyna(6-14) i [D-Phe¹³-Leu¹³- psi-Leu¹⁴] bombezyna(6-14) wykazują znacznie silniejszą moc działania niż odpowiadający peptyd macierzysty [Leu¹³-psi-Leu¹⁴] bombezyna.

Liniowe (niecykliczne) bombezynowe analogi GRP i bombezyny ze zwierząt zimnokrwistych, ewentualnie posiadające niepeptydowe wiązanie CH₂-NH są opisane w zgłoszeniu patentowym PCT WO 90/039980 (i pokrewne analogi w WO 91/02746). Analogi te, działające jak stwierdzono jako inhibitory naturalnych peptydów bombezyny, mają wzór ^Ri \

A -A -A -Trp-A⁴-A⁵-A⁶-A⁷-A⁸-W /

R2 w którym Ri i R2 = H; A° może być usunięte; spośród wielu możliwych aminokwasów w każdej z pozycji A¹ może oznaczać D-Phe, D-Trp lub D-Nal; A² może oznaczać Gin; A⁴ może oznaczać Ala; A⁵ może oznaczać Val; A⁶ może oznaczać Gly; A⁷ może oznaczać His, a W może oznaczać

R₈ Zj Z2 o

II I II

-N - CH - Rą - CH - C - V gdzie R4 = CH2-NH; w niektórych przypadkach Zi może oznaczać identyfikujący łańcuch boczny Leu, to jest -CH2CH(CH3)2; Z2 może oznaczać identyfikujący łańcuch boczny Cys lub Met, to jest -CH2-SH lub (CH2)2S-CH3; V = N(Rć)R?; gdzie 1%, R7 i Rs mogą oznaczać H; Ri i R2 mogą oznaczać H lub COEi, gdzie Ei może oznaczać alkil Ci-20.

Pseudopolipeptydy Ψ ⁸’⁹ znane z patentu USA nr 5,244,883 udzielonego na podstawie zgłoszenia dokonanego w listopadzie 1990 r sątakże szeroko omówione w publikacji Cai i wsp. „Pseudononapeptide Bombesin Antagonists Containing C-termina Trp or Tpi” w Peptides tom 13, 1992, str. 267-271. Z publikacji tej wiadomo, że reszta Tpi w położeniu A⁹ pseudononapeptydów znanych ze wskazanego patentu USA może nie mieć wpływu na zdolność wiązania peptydu tak zakończonego z określonymi receptorami. Ustalenie to nie uprawnia jednak do postawienia tezy o braku wpływu tego ugrupowania na właściwości analogów bombezyny, które zależą od wielu różnych aspektów budowy tych związków.

W cytowanej publikacji wskazano, że analog Tpi⁹ jest korzystny, gdyż może być mniej podatny na trawienie proteazą z uwagi na podwyższoną hydrofobowość tej reszty. W świetle takiego ujawnienia oczywistym mogłoby być wprowadzenie jako A⁹ grup bardziej hydrofobowych.

W stanie techniki (publikacja WO 90/03980) znany jest peptyd, w których A⁹ oznacza Cys, jednakże reszta A¹ w tym związku oznacza D-Phe. Chociaż z cytowanej wyżej publikacji dotyczącej znanych pseudononapeptydowych antagonistów bombezyny znany jest peptyd z resztą Tpi w pozycji A¹, to brak jest w niej jakichkolwiek sugestii, co do zastąpienia końcowej reszty Tpi lub Trp w pozycji A⁹ resztą Cys lub Pen w tej pozycji.

Liniowe peptydowe analogi bombezyny sąrównież opisane w opisie EP 309297. Peptydy te mogą mieć C-końcową resztę Met i wiązanie pseudopeptydowe [CH₂-NH] między resztą Ckońcową i resztą z nią sąsiadującą.

Nieoczekiwanie okazało się, że modyfikując charakter grup A¹ i A⁹ w znanych antagonistach bombezyny z grupy Pseudopolipeptydów Ψ⁸'⁹ między innymi przez wprowadzenie reszt Tac, MTac i DMTac w miejsce reszty Tpi⁹ jest korzystne, choć sprzeczne z wiedzą wynikającą z patentu USA nr 5,244,883 - bowiem grupy te - ze względu na obecność ugrupowania -S- w ich

180 372 strukturze, są bardziej hydrofilowe mźli Τρί,ι a zgodnie zatem z przywołanym stanem techniki fachowiec unikałby wprowadzenia grup bardziej hydrofitowych niż Tpi jako A⁹.

Zgodnie z wynalazkiem polipeptyd będący antagonistąbombezyny ma budowę określoną wzorem:

X-A'-A²-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A⁹-Q w którym

X oznacza wodór, pojedyncze wiązanie łączące grupę alfa-ammowąz A¹ z ugrupowaniem gamma-karboksylowym z ugrupowania 3-propionylowego z A², gdy A² jest Glu, lub grupę o wzorze R’CO-, w którym R¹ oznacza wodór, C₁.₁₀-alkil lub fenylo-Ć].₁₀-alkil;

A¹ oznacza resztę D- lub L-aminokwasu wybranego z grupy, składającej się z Ćpa, Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierścieniu benzenowym przez jeden lub więcej element wybrany z grupy, składającej się z F, Cl, Br, NH₂lub alkilu Cj.₃ lub peptydowe wiązame łączące ugrupowanie acylowe R^CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A²;

A² oznacza Gin, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie

[-] oznacza wiązanie pojedyncze, gdy X jest wiązaniem pojedynczym i A² oznacza Glu, łączące ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3-propionylowego z Glu² z grupą alfa-aminową z A¹, zaś

Y oznacza resztę -OR², gdzie R² oznacza C].₃-alkil;

Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu, w której zamiast ugrupowania C=O występuje -CH₂, tak że wiązanie tego ugrupowania -CH₂- z grupą alfa-aminową sąsiedniej reszty A⁹ jest wiązaniem pseudopeptydowym;

A⁹ oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen; i

Q oznacza NH₂ lub -OQ', gdzie Q' oznacza wodór, alkil Cj.₁₀, fenyl lub fenylo-C].₁₀-alkil, oraz jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.

Korzystną grupę związków zdefiniowanych powyżej, stanowią te określone powyższym wzorem, w którym X oznacza wodór lub resztę R^JCO, gdzie R¹ oznacza H lub alkil C].1O; A¹oznaczaD-Cpa, D-Nal, L- lub D-Pal, D-Phe, D- lub L-Tpi, lub D-Trp; A² oznacza Gin lub His; i Q oznacza NH2.

Wyodrębnić można wśród tych związków korzystną podgrupę, w której A⁹ oznacza Tac. Dodatkowo, korzystnie wóczas X oznacza H lub Ac, A¹ oznacza D-Phe, L- lub D-Tpi, zaś A²oznacza Gin.

Szczególnie korzystnymi peptydami z tej grupy są związki o wzorze:

D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gły-His-Leu-psi-Tac-NH2 oraz

D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2Inną korzystną podgrupę wskazanych korzystnych związków stanowią te, w których A⁹oznacza DMTac. Dodatkowo, korzystnie wówczas X oznacza H lub Ac, A¹ oznacza D-Phe, Llub D-Tpi, zaś A² oznacza Gin.

Szczególnie korzystnym peptydem z tej podgrupy jest związek o wzorze:

D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH2.

Korzystnie, wynalazek obejmuje także peptyd będący antagonistą bombezyny o wzorze X-A¹-A²-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A⁹-Q w którym

X oznacza wodór, pojedyncze wiązanie łączące grupę alfa-aminowąz A¹ z grupągamma-

-karboksylową z ugrupowania 3-propionylowego z A², gdy A² jest Glu, lub grupę o wzorze R‘CO-, w którym R¹ oznacza wodór, C]._]0-alkil, lub fenylo-C^^-alkil;

180 372

A¹ oznacza nie wy stępujący naturalnie aminokwas wybrany z grupy, składającej się z Llub D-Pal, lub L- lub D-Tpi;

A² oznacza Gin, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie

[-] oznacza wiązanie pojedyncze, gdy X jest wiązaniem pojedynczym i A² oznacza Glu, łączące ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3-propionylowego z A² z grupą alfa-aminową z A¹, zaś

Y oznacza resztę -OR², gdzie R² oznacza alkil Ci_₃;

Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu, w której zamiast ugrupowania C=O występuje -CH₂-, tak że wiązanie tego ugrupowania -CH₂- z grupąalfa-aminowąsąsiedniej reszty A⁹ jest wiązaniem pseudopeptydowym;

A⁹ oznacza Cys lub Pen;

Q oznacza NH₂ lub -OQ¹, gdzie Q' oznacza wodór, alkil C].^, fenyl lub fenylo-C].₁₀-alkil, oraz jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.

Korzystnie, peptyd będący antagonistą bombezyny według wynalazku ma budowę określoną wzorem

X-A¹-A²-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A⁹-Q, w którym

X oznacza R’CO-,

A¹ oznacza wiązanie peptydowe łączące ugrupowanie acylowe z R'CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A²;

A² oznacza Gin lub His; i Q oznacza NH₂.

Korzystnie, X oznacza Hca; A² oznacza Gin, zaś A⁹ oznacza Tac.

Korzystnym takim peptydem jest związek o wzorze:

Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2.

Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca substancję biologicznie czynną oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik ciekły lub stały, według wynalazku cechuje się tym, że jako substancję biologicznie czynną zawiera ona peptyd, będący antagonistą bombezyny o wzorze:

X-A'-A²-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A⁹-Q I w którym

X oznacza wodór, pojedyncze wiązanie łączące grupę alfa-aminowąz A¹ z ugrupowaniem gamma-karboksylowym z ugrupowania 3-propionylowego z A², gdy A² jest Glu, lub grupę o wzorze R'CO-, w którym R¹ oznacza wodór, Cj.^-alkil lub fenylo-C_].₁₀-alkil;

A¹ oznacza resztę D- lub L-aminokwasu wybranego z grupy, składającej się z Ćpa, Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierścieniu benzenowym przez jeden lub więcej element wybrany z grupy, składaj ącej się z F, Cl, Br, NH₂łub alkilu C,_₃ lub peptydowe wiązanie łączące ugrupowanie acylowe R’-CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A²;

A² oznacza Gin, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie

Y oznacza resztę -OR², gdzie R² oznacza C^-alkil;

Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu, w której zamiast ugrupowania C=O występuje -CH₂, także wiązanie tego ugrupowania -CH₂- z grupąalfa-aminowąsąsiedniej reszty A⁹ jest wiązaniem pseudopeptydowym;

A⁹ oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen; i

Q oznaczaNH₂ lub -OQ‘, gdzie Q' oznacza wodór, alkil C_M0, fenyl lub fenylo-C;.₁₀-alkil, lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.

180 372

W związkach według wynalazku grupa A⁹ oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen.

Wyjaśnić należy, że człon Tac stanowi utlenioną formę reszty Cys, zaś MTac i DMTac stanowią dalsze modyfikacje grupy Tac. Podkreślić należy, że skoro grupy Tac, MTac oraz DMTac stanowiąutlenione i dodatkowo zmodyfikowane reszty Cys to związki z tymi grupami są jednoznacznie mniej podatne na utlenianie, są więc trwalsze od znanych antagonistów bombezyny.

Wskazane wyżej różnice pomiędzy Cys i Tac oraz Trp i Tpi sprawiają, iż nowe związki według wynalazku są nowe i nieoczywiste w świetle znanego stanu techniki.

Peptydy zdefiniowane powyżej stanowią związki syntetyczne.

Gdy A¹ oznacza wiązanie pojedyncze, pseudopeptyd o wzorze I jest oktapeptydem, ale gdy A¹ jest aminokwasem lub jego analogiem, pseudopeptyd jest nonapeptydem.

Gdy A⁹ = Tac, MTac lub DMTac, to w A⁹ obecny jest 5-członowy pierścień heterocykliczny. Pierścień ten generalnie tworzy się przez utlenianie łańcucha bocznego reszty A⁹ w pewnym punkcie syntezy nonapeptydu o wzorze I, korzystnie za pomocą formaldehydu lub aldehydu octowego, przebiegające z cyklizacją łańcucha bocznego z grupą alfa-aminową z A⁹. Tożsamość uzyskanej scyklizowanej reszty A⁹ zależy od tożsamości pierwotnej, nieutlenionej reszty A⁹ oraz użytego reagenta utleniającego.

Zatem, gdy grupa -CH₂-SH z Cys⁹ ulega cyklizacji z grupąalfa-aminowąCys⁹ sąsiadującą z wiązaniem pseudopeptydowym Leu-psi w reakcji z formaldehydem, uzyskany pierścień ma strukturę o wzorze IIA (pokazaną tu jako fragment -Leu⁸-psi-Tac⁹-NH₂ nonapeptydu o wzorze I):

S / \ h₂c ch₂

- NH - CH - CH₂ - N - CH - CO - NH₂

IIA

CH₂-CH(CH₃)₂

Pseudopeptydy te mają większą czynność biologiczną i dłuższą trwałość niż peptydy nie zawierające pierścienia, w których A⁹ oznacza Cys lub Pen. Pomimo to, w niektórych korzystnych postaciach peptydów o wzorze I, w którym A⁹ nie jest scyklizowane, X, A² i Q mają znaczenie takie jak podano powyżej, A⁹ oznacza Cys lub Pen, a A¹ jest nie wy stępującym naturalnie aminokwasem wybranym z grupy, składającej się z L- lub D-Pal, L- lub D-Tpi.

W niektórych korzystnych postaciach X oznacza R'CO, R¹ oznacza wodór lub alkil C].1O (korzystnie metyl); A¹ = D-Cap, D-Nal, D-Phe, D- lub L-Tpi, lub D-Trp; A² - Gin; A⁹ = Tac lub DMTac, a Q = NH2.

Jednakże, gdy w innych korzystnych postaciach A¹ oznacza wiązanie peptydowe łączące ugrupowanie acyl owe R⁽CO- z grupą alfa-aminową A², to wtedy

A² oznacza Gin lub His;

A⁹ oznacza Tac, Μ-Tac, DM-Tac, a Q oznacza NH₂. W korzystnej postaci tych peptydów X oznacza Hca; A² oznacza Gin, a A⁹ oznacza Tac.

Antagoniści bombezyny o wzorze I mogą być zsyntetyzowani na drodze syntezy w fazie stałej. Według pierwszego protokołu wszystkie aminokwasy kolejno łączy się ze sobą po przyłączeniu reszty C-końcowej do fazy nośnika w postaci żywicy. Po przyłączeniu wszystkich reszt aminoacylowych do żywicy, tworzy się 5-członowy pierścień heterocykliczny pseudopeptydu poprzez reakcję łańcucha bocznego reszty C-końcowej z reagentem utleniającym. Następnie pseudopeptyd poddaje się działaniu HF w celu usunięcia go z fazy żywicy-nośnika. W wyniku tej reakcji następuje również usunięcie grup zabezpieczających łańcuch boczny.

180 372

Według drugiego protokołu pseudopeptydu o wzorze I syntetyzuje się w postaci dwóch fragmentów, które buduje się w fazie stałej lub w fazie ciekłej. Tripeptyd zawierający C-koniec łączy się z oligopeptydem, otrzymując całkowitego antagonistę bombezyny o wzorze I.

-Członowy pierścień heterocykliczny tworzy się przez reakcję łańcucha bocznego A⁹ z reagentem utleniającym. Peptyd poddaje się następnie działaniu HF, w wyniku czego następuje usunięcie wszystkich grup zabezpieczających z łańcuchów bocznych reszt aminoacylowych i odszczepienie peptydu z żywicy.

Pseudopeptydy o wzorze I mogą być stosowane w kompozycjach farmaceutycznych do leczenia niektórych nowotworów ssaków, jak również i innych stanów, przez podawanie efektywnej dawki pseudopeptydu lub dopuszczalnego terapeutycznie kwasu lub jego soli w nośniku farmaceutycznym. Mogą być one podawane razem z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem w dawkach od około 1 do 1000 mikrogramów na kg wagi ciała dziennie. Taka kompozycja może być podawana pozajelitowo, dożylnie, podskórnie, domięśniowo, donosowo, za pomocą aerozolu płucnego lub w formie depot.

Opis rysunków

Figura 1 jest wykresem obrazującym wpływ podawania niektórych antagonistów bombezyny na raka sutka ΜΧΤ u myszy na podstawie danych z tabeli 2 w przykładzie VII.

Figura 2 jest wykresem obrazującym wpływ podawania niektórych antagonistów bombezyny na objętość guza SCLC u nagich myszy w oparciu o dane z tabeli 4 w przykładzie VIIL

Figura 3 jest wykresem obrazującym wpływ podawania niektórych antagonistów bombezyny na objętość guza trzustki MIA PACA-2 u nagich myszy w oparciu o dane z tabeli 5 w przykładzie IX.

Figura 4 jest wykresem obrazującym wpływ podawania niektórych antagonistów bombezyny na objętość guza trzustki CAPAN-2 u nagich myszy w oparciu o dane z tabeli 6 w przykładzie X.

Opis korzystnych postaci

A. Peptydy syntetyczne

1. Nomenklatura

Dla celów wygody opisu mniej szego wynalazku użyto typowych skrótów dla aminokwasów, peptydów i ich pochodnych, generalnie stosowanych w nauce o peptydach i zalecanych przez Komisję Nomenklatury Biochemicznej IUPAC-IUB [European J. Biochem. 1984, 138, 9-37],

Skróty dla poszczególnych reszt aminokwasowych są oparte na nazwie pospolitej aminokwasu, na przykład Ala oznacza alaninę, Cys oznacza Cysteinę, Gin oznacza glutaminę, Glu oznacz kawas glutaminowy, pGlu oznacza kwas piroglutaminowy, Gly oznacza glicynę, His oznacza histydynę, Leu oznacza leucynę, Phe oznacza fenyloalaninę, Trp oznacza tryptofan, a Val oznacza walinę. Glu może mieć grupy funkcyjne połączone z gamma-karboksylowym łańcuchem bocznym: [-] lub Y, zdefiniowane powyżej. Dpa oznacza kwas 2,3-diaminopropionowy. Gdy reszta aminokwasu posiada formy izomeryczne, to jeśli wskazano inaczej za pomocą symbolu D- lub DL- występującego przed symbolem aminokwasu, to występuje on w formie L.

Skróty nietypowych aminokwasów stosowane w niniejszym wynalazku są następujące:

Cpa oznacza para-chlorofenyloalaninę

Dpa oznacza kwas 2,3-diaminopropionowy pGlu oznacza kwas piroglutaminowy

Nal oznacza 3-(2-naftylo)alaninę

Pal oznacza 3-(3-pirydylo)alaninę

Pen oznacza penicyloaminę

Tpi oznacza kwas 2,3,4,9-tetrahydro-lH-pirydo[3,4-b]indolo-3-karboksylowy

Tac oznacza kwas tiazolidyno-4-karboksylowy

Mtac oznacza 2-metylotiazolidyno-4-karboksylowy

DMTac oznacza kwas 5,5-dimetylotiazolidyno-4-karboksylowy

180 372

Analog aminokwasu obejmuje:

Hca oznacza kwas hydrocynamonowy lub des-amino-fenyloalaninę

Zastosowano następujące skróty:

AC acyl

Ac acetyl

AcOH kwas octowy

BHA benzhydryloamina

Boc tert-butoksykarbonyl (BOC)₂O diwęglan di-tert-butylu

Bom benzyloksymetyl

But butyl

Bzl benzyl

BSA bydlęca albumina osocza

DIC 1,3-diizoprpylokarbodiimid

DMEM pożywka Eagle'a zmodyfikowana przez Dulbecco

DMF dimetyloformamid

Et etyl

EDTA kwas etylenodiaminotetraoctowy

FCBS cielęca surowica płodowa

Fmoc 9-fluorenylometyłoksykarbonyl

For formy 1

HITES pożywka RPMI16 4D plus 10'⁸M hydrokortyzonu, 5 μ/ml insuliny bydlęcej, 10 pg/ml ludzkiej transferyny, 10‘⁸M β-estradiolu i 3 x 10’⁸M Na₂SeO₃

HOBt 1 -hydroksybenzotriazol

HPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa

Leu-psi jest zredukowaną formą Leu, w której zamiast wiązania C=O jest wiązanie -CH₂-, tak że wiązanie tego ugrupowania -CH₂- z ugrupowaniem aminokwasowym A⁹ jest wiązaniem pseudopeptydowym

Me metyl

MeCN acetonitryl

MeOH alkohol metylowy

PBS solanka buforowana fosforanem

TEA trietyloamina

TFA kwas trifluorooctowy

Sekwencje peptydów sąpisane zgodnie z konwencją według której aminokwas N-końcówy jest po lewej stronie, a aminokwas C-końcowy jest po prawej stronie. Należy jednakże zwrócić uwagę, że jeśli nie wskazano inaczej, to nie jest stosowana konwencja numerowania reszt aminokwasów we fragmentarycznym peptydzie zgodnie z odpowiadającą pozycją w kompletnym tetradekapeptydowym antagoniście bombezyny. Jeśli konwencja ta byłaby stosowana, to reszty w opisanym tu nonapeptydzie o wzorze I byłyby numerowane od 6 do 14, a rdzeń antagonistów bombezyny Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu byłby numerowany A⁸-A⁹-A¹⁰-A¹¹-A¹²-A¹³. W celu uniknięcia pomyłki, antagoniści bombezyny są zamiast tego numerowani w sposób następujący: A¹ oznacza aminokwas N-końcowy; A⁹ oznacza C-końcową resztę aminokwasu (lub analogu aminokwasu): a reszty leżące między nimi są numerowane kolejno od A² (sąsiadująca z N-końcową resztą A¹) wzrastającymi liczbami do A⁸ (sąsiadująca z resztą C-końcową A⁹).

2. Korzystne postacie

Pseudopeptydy, będące antagonistami bombezyny według wynalazku scharakteryzowane sąprzez sekwencje aminokwasów, w szczególności przy resztach A¹, A² i A⁹, jak również przez obecność wiązania pseudopeptydowego między A⁸ i A⁹ oraz przez obecność 5-cżłonowego pierścienia heterocyklicznego przy A⁹. Struktura pierścienia jest zdeterminowana przez tożsa180 372 mość reszty A⁹ oraz związku użytego do jej utlenienia. Zatem, gdy użyje się formaldehydu i A⁹oznacza Cys, powstały pierścień ma strukturęTac o wzorze IIA (pokazaną tu jako fragment Leu⁸-psi-Tac⁹-Q peptydu o wzorze I, w którym Q = NH₂):

S / \ h₂c ch₂

- NH - CH - CH₂ - N - CH - CO - NH₂

CH₂-CH(CH₃)₂

Gdy Cys zamiast formaldehydem utleni się aldehydem octowym, to powstały 5-członowy pierścień heterocykliczny ma strukturę MTac o wzorze IIB (pokazanątu jako fragment Leu⁸-psi-MTac ⁹-Q peptydu o wzorze I, w którym Q = NH₂):

S / \ ch₃hc ch₂

I I

- NH-CH-CH₂ - N -CH- CO -NH₂

CH₂-CH(CH₃)₂

Gdy A⁹ zamiast Cys oznacza Pen i jest utleniane formaldehydem, uzyskany pierścień ma strukturę DMTac o wzorze IIC (pokazanątu jako fragment Leu⁸-psi-DMTac⁹-Q nonapeptydu o wzorze I, w którym Q = NH₂):

S / \

H₂C C(CH₃)₂ ^{1 1} ne

-nh-ch-ch₂-n-ch-co-nh₂ ^iic

CH₂-CH(CH₃)₂

W tych korzystnych postaciach korzystne jest, gdy X = H lub Ac, A¹ = D-Phe, A² = Gin, a Q = NH₂.

180 372

Najbardziej korzystne pseudopeptydy będące antagonistami bombezyny według wynalazku przedstawiono poniżej.

Numer peptydu Struktura

1. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psi-T ac-NH2

2. D-Phe-Gln-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psi-T ac-NH2

3. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-MTac-NH₂

4. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

5. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psi-T ac-NH2

6. D-Cpa-Gln-T rp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psi-MT ac-NH2

7. D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH₂

8. Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

9. D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH₂

10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

11. Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

12. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

13. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH₂

14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

15. D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

16. D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

17. D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH₂

18. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH₂

19. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psi-DMT ac-NH2

20. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH2

21. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH2

22. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH₂

Do szczególnie korzystnych postaci pseudopeptydów należą następujące:

2.

13.

18.

D-Phe-Gln-Trp-AIa-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH2

180 372

Pełną charakterystykę związków według wynalazku, określa 27 sekwencji scharakteryzowanych w dalszej części opisu wynalazku

B. Metody syntetyczne

1. Przegląd

Pseudopeptydy o wzorze I mogą być otrzymywane dowolną z technik znanych specjalistom z dziedziny peptydów. Podsumowanie takich dostępnych technik można znaleźć w książce M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.

Wszystkie pseudopeptydy o wzorze I mogą być syntetyzowane zgodnie z procedurami syntezy w fazie stałej. Synteza w fazie stałej jest szczególnie korzystną metodą otrzymywania peptydów według wynalazku i peptydów pośrednich. Techniki syntezy prowadzonej całkowicie w fazie stałej są przedstawione w podręczniku J. M. Stewart i J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (wyd. 2) oraz w przeglądzie G. Barany i współpr., Int. J. Peptide Protein Res., 30,705_T7739, 1987. (Dodatkowy etap utleniania C-końcowej reszty A⁹ w celu scyklizowania charakterystycznego łańcucha bocznego reszty z jej grupą alfa-aminową może być przeprowadzony w jednym z kilku punktów syntezy peptydów o wzorze I).

Dla wytworzenia pseudopeptydów, będących antagonistami bombezyny o wzorze I można stosować co najmniej dwa protokoły syntetyczne. Zgodnie z pierwszym protokołem po przyłączeniu reszty C-końcowej A⁹ do fazy żywicy-nośnika, wszystkie aminokwasy łączy się kolejno ze sobą. Zgodnie z drugim protokołem na żywicy buduje się tripeptyd. Jest on następnie łączony z oligopeptydem przenoszącym pozostałe aminokwasy z utworzeniem antagonisty bombezyny. W obu protokołach synteza rozpoczyna się przy reszcie C-końcowej-A⁹ i dołącza się kolejno reszty aminokwasów, a wzrost przebiega w kierunku reszty N-końcowej.

1. (a) Protokół pierwszy. Jako fazę żywicy-nośnika w syntezie pseudopeptydów w fazie stałej można stosować dostępne w handlu, żywicę benzhydryloaminową (BHA) lub 1% chlorometylowaną żywicę polistyrenową, usieciowaną diwinylobenzenem. Reszta C-końcowa A⁹jest przyłączona do tej żywicy poprzez swoją grupę karboksylową. Reakcji między dwoma takimi resztami zapobiega się przez przyłączenie chemicznej grupy zabezpieczającej do grupy alfa-aminowej każdej reszty A⁹ przed jej przyłączeniem do żywicy. Grupą zabezpieczającą dla grupy alfa-aminowej reszty A⁹ i każdej następnie przyłączanej reszty aminokwasu może być grupa 9-fluorenylometyloksykarbonylowa (Fmoc) albo grupa tert-butoksykarbonylowa (Boc). Fmoc jest preferowana przy sprzęganiu od C-końcowej reszty A⁹ aż do A², ponieważ w reakcji usuwania Boc, usuwa się również grupę zabezpieczającą łańcuch boczny z C-końcowej reszty A⁹. Podczas tych reakcji łączenia, charakterystyczne grupy funkcyjne łańcuchów bocznych niektórych aminokwasów mogą być również zabezpieczone przed niepożądaną reakcją chemiczną przez przyłączenie do nich przed reakcją łączenia chemicznych grup zabezpieczających (dla A⁹odpowiednia jest But).

Po przyłączeniu reszty C-końcowej Fmoc- A⁹(But) do fazy nośnika, odbezpiecza się jej grupy alfa-aminowe i sprzęga z niąFmoc-Leu-CHO, tworząc w ten sposób wiązanie pseudopeptydowe.

Pozostałe reszty A⁵, A⁴, A³ i A², odpowiednio zabezpieczone przez Fmoc, oraz A¹, odpowiednio zabezpieczoną przez Boc, dodaj e się etapowo w odwrotnym porządku numerowym (A⁷, A⁶, etc.), konstruując żądany pseudopeptyd.

Gdy w pseudopeptydzie obecny jest His lub Glu, to ich łańcuchy boczne mogą być podczas reakcji ich przyłączenia lub reakcji przyłączenia innych reszt, narażone na niepożądane reakcje chemiczne. W związku z tym do takich łańcuchów bocznych mogą być przed połączeniem tych aminokwasów w reakcji łączenia, przyłączone chemiczne grupy zabezpieczające.

Po przyłączeniu wszsytkich reszt aminokwasów do żywicy BHA, grupa Boc pseudopeptydu na N-końcu może być usunięta. 5-Członowy pierścień heterocykliczny Tac, MTac lub DMTac tworzy się przez reakcję odsłoniętego ugrupowania -CH₂-SH Cys (lub -C(CH₃)₂SH Pen) oraz drugorzędowej grupy aminowej ze zredukowanego wiązania łączącego reszty A⁸i A⁹ (to jest

180 372 grupy alfa-aminowej A⁹) z reagentem utleniającym, takim jak formaldehyd lub aldehyd octowy. Przejściowy pseudopeptyd, nadal obarczony grupami zabezpieczającymi łańcuchy boczne, poddaje się działaniu HF w celu odszczepienia go od fazy żywicy-nośnika oraz w celu usunięcia grup zabezpieczających łańcuchy boczne.

1. (b) Protokół drugi. W drugim protokole metodami syntezy w fazie stałej buduje się tnpeptyd na żywicy BHA, otrzymując zabezpieczoną tripeptydo-żywicę:

Boc-His(Bom)⁷-Leu⁸-psi-Cys(But)⁹-żywica BHA

Grupę Boc¹ oraz grupę But usuwa się, a ugrupowanie -CH2-SH z Cys cyklizuje się z drugorzędową grupą aminową ze zredukowanego wiązania łączącego reszty A⁸1 A⁹, otrzymując His(Bom)⁷-Leu⁸-psi-Tac⁹-żywica BHA. Po obróbce HF otrzymuje się wolny tripeptyd His⁷-Leu⁸-psi-Tac-NH2.

Boc-A’-A²-Trp-Ala-Val-Gly-OCH2-żywica buduje się etapowo na Gly-CH2-żywica zgodnie ze standardowymi metodami syntezy w fazie stałej, a następnie działa przez 12 godzin 95% metanolem, zawierającym 1% KCN w celu odszczepienia Boc-oligopeptydu. Po skonstruowaniu dwóch fragmentów Boc-oligopeptyd dołącza się do wolnego tripeptydu His⁷-Leu⁸-psi-Tac⁹-NH2 za pomocą reagenta BOP. Grupę Boc następnie usuwa się, otrzymując żądany peptyd.

Przed szczegółowym opisaniem syntezy antagonistów bombezyny o wzorze I, opisanych zostanie kilka operacji syntetycznych wspólnych dla jednego lub obu powyższych protokołów.

2. Ogólne operacje syntezy polipeptydów.

Operacja 1: tworzenie niektórych syntetycznych reszt lub reagentów.

a) L- i D-Tpi: 2,04 g (10 mM) L-Trp rozpuszcza się w 25 ml wrzącej wody, zawierającej 2,1 g kwasu cytrynowego. Dodaje sięO,5 ml 40% wodnego roztworu formaldehydu, po czym rozpoczyna się natychmiastowe powstawanie osadu. Mieszaninę chłodzi się w łaźni lodowej i osady zbiera się oraz przemywa zimną wodą i powietrzem, po czym suszy w temperaturze pokojowej, otrzymując 2,14 g lub 99% osadu o t.t. (z rozkładem) ok. 310°. Izomer D tworzy się w ten sam sposób z D-Trp i ma on również t.t. (z rozkładem) ok. 310°.

b) L- i D-Boc-Tpi: Do mieszanej zawiesiny 10,8 g (50 mM) D-Tpi w 250 ml 0,2N NaOH i 7,5 ml trietyloaminy dodaje się 10 g diwęglanu di-tert-butylu, mieszaninę miesza się przez 4 godziny, po czym dodaj e się następne 10 g diwęglanu, oraz kolejne 10 g po następnych 3 godzinach mieszania. Mieszaninę miesza się przez noc i ekstrahuje eterem (2 x 100 ml), który odrzuca się. Do warstwy wodnej dodaje się kwas cytrynowy w celu uzyskania pH 3-5. Osad zbiera się, przemywa wodą i suszy na powietrzu przez noc.

Osad zawiesza się w 100 ml tetrahydrofuranu. Prawie cały osad ulega rozpuszczeniu. Substancje nierozpuszczalne usuwa się przez odsączenie i usuwa się THF pod próżnią. Pozostałość rozciera się z eterem, otrzymując 9,20 g lub 58%. Materiał ten ma taką samąt t. jak materiał wyjściowy, ale różni się rozpuszczalnością oraz TLC na żelu krzemionkowym przy użyciu układu rozwijającego CHC1₃: MeOH : HOAc 85 : 15 · 0,5.

2,55 g L-Tpi przy użyciu tej samej metody daje 2,22 g lub 59% Boc-Tpi.

c) Fmoc-Leu-CHO. Ester metylowy Fmoc-leucyny (35 g, 134 mmole) w suchym toluenie (250 ml) podN₂ ochładza się w łaźni suchy lód/aceton i dodaje w ciągu 30 minut 150 ml 25% wodorku di-izobutyloghnowego. Po dodaniu wodorku di-izobutyloglinowego mieszaninę miesza się w łaźni suchy lód/aceton przez 20 minut, po czym ostrożnie dodaje metanol (15 ml). Mieszaninę wylewa się do 1000 ml lodowato-zimnej wody, wytrząsa się 1 sączy. Toluen oddziela się, a warstwę wodnąre-ekstrahuje eterem (3 x 300 ml). Ekstrakty toluenowe 1 eterowe łączy się 1 suszy nad Na₂SO₄. Uzyskany olej przepuszcza się szybko przez kolumnę z żelem krzemionkowym (3 x 50 cm) w 1500 ml 15% EtOAc/nafta. Otrzymuje się w postaci osadu Fmoc-Leu-CHO (27,6 g).

d) Syntetyczne aminokwasy lub analogi aminokwasów do włączania do pseudopeptydów, będących antagonistami bombezyny według wynalazku są ogólnie dostępne ze źródeł handlowych. Zatem Hca jest dostępny w handlu z Aldrich Co., 1001 St. Paul Avenue, Milwaukee, WI53233. Aminokwasy zabezpieczone Boc lub Fmoc są dostępne w handlu z Advanced

180 372

ChemTech, 5609 Fem Valley Road, Louisville, KY 40228; lub Bachem Califomia, 3132 Kashiwa Street, Torrance, CA 90505.

Operacja 2: Otrzymywanie żywicy i dołączanie reszty A^{B) 9}

Żywicę BHA przygotowuje się przez działanie 10% TEA w CH₂C1₂ (zobojętnianie) dwa razy po trzy minuty i przemywanie sześć razy CH₂C1₂. Resztę Fmoc-A⁹(But) wiąże się z żywicą przez dodanie 1,35 mmola Fmoc-A⁹(But) i 1,50 mmola 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) w DMF i mieszanie przez trzy minuty. Dodaje się 20% 1,3-diizopropylokarbodiimid (DIC) z 1,3 mmola CH2C12. Mieszaninę wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Uzyskany Fmoc-A⁹(But)-żywica BHA przemywa się po dwa razy CH2C1₂ i metanolem oraz trzy razy CH₂C1₂, po czympoddaje się testowi Kaisera (Anal. Biochem. 34,595 (1970). W przypadku niekompletnego sprzężenia procedurę powtarza się.

Operacja 3: Tworzenie wiązania pseudopeptydowego

Odbezpieczenie grupy Fmoc z A⁹ przeprowadza się przez dodanie 50% piperydyny w DMF i mieszanie przez 30 minut, przemycie DMF (6x1 minuta), a następnie i) dodanie FmocLeu-CHO (3 równoważniki) w DMF, zawierającym 1% AcOH i ii) dodanie NaBH₃CN (3,5 równoważnika) w DMF i wytrząsanie przez 60 minut. Następnie przemywa się 50% MeOH (3 x 1 minuta), 100% MeOH (3x1 minuta) i DMF (3x1 minuta).

Operacja 4: Sprzęganie aminokwasów i tworzenie wiązania peptydowego

Grupą zabezpieczającą dla grupy alfa-aminowej reszty A⁹ i każdej kolejno dołączanej reszty aminokwasu może być grupa 9-fluorenylometyloksykarbonylowa (Fmoc) albo grupa tert-butoksykarbonylowa (Boc). Fmoc jest preferowana przy sprzęganiu A⁹ z resztami aż do reszty sąsiadującej z N-końcową resztą aminokwasu, ponieważ w reakcji usuwania Boc następuje również usunięcie grupy zabezpieczającej łańcuch boczny A⁹.

A) Stosowanie Fmoc-aminokwasu

W celu wprowadzenia Fmoc-aminokwasu do pośredniego Fmoc-peptydu przeprowadza się następujące procedury.

(1) Pośredni Fmoc-peptyd odbezpiecza się i zobojętnia, po czym przemywa CH₂C1₂ (3 x 1 minuta) i DMF (3x1 minuta).

(2) Fmoc-aminokwas sprzęga się z odbezpieczonym peptydem pośrednim przez: i) dodanie Fmoc-aminokwasu (3 równoważniki) i HOBt (3,3 równoważnika) w DMF (3 minuty) do peptydu pośredniego; ii) dodanie 3 równoważników DIC (jako 20% roztworu w CH₂C1₂) i wytrząsanie mieszaniny przez 90 minut..

(3) Następnie mieszaninę przemywa się etanolem (3x1 minuta) i DMF (3 x 1 minuta).

W celu sprzężenia dalszcyh reszt nowo sprzężony Fmoc-aminokwas odbezpiecza się za pomocą 50% piperydyny w DMF przez 30 minut oraz przemywa DMF (6 x 1 minuta). Pozostałe sprzęgania przebiegają w sposób opisany w etapie (2).

Za każdym razem, gdy nowy aminokwas jest sprzęgany z żywicą lub peptydem, przeprowadza się test Kaisera; w przypadku, gdy sprzężenie nie było kompletne, reakcję powtarza się.

Do sprzęgania Fmoc-Gly i Fmoc-Gln etap (2) tej Operacji modyfikuje się następująco: do roztworu mieszaniny Fmoc-aminokwasu (3,0 równoważnika) i HOBt (3,3 równoważnika) w DMF dodaje się 3 równoważniki DIC (jako 20%CH₂Cl₂) w ciągu 15 minut i w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną dodaje się do peptydo-żywicy, wytrząsa przez 1 godzinę w przypadku Fmoc-Gly i przez 2 godziny w przypadku Fmoc-Gln.

B) Stosowanie Boc-aminokwasu

W celu wprowadzenia Boc-aminokwasu do pośredniego Fmoc-peptydu przeprowadza się następujące procedury.

(1) Grupę Boc usuwa się przez dodanie 50% TFA w CH₂C1₂;

(2) dodaje się 50% TFA w CH₂C1₂, zawierającym 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu przez 25 minut; i (3) przemywa się CH₂C1₂ (2 razy po 1 minucie), MeOH (2 razy po 1 minucie) i DMF (3 razy po 1 minucie).

180 372 (4) Sprzęganie reszty Boc-aminokwasu przeprowadza się przez dodanie 3 równoważników Boc-aminokwasu i 3,3 równoważników HOBt w DMF i mieszanie przez 3 minuty. Następnie dodaj e się 3 równoważniki 20% diizopropylokarbodiimidu w CH₂C1₂ i wytrząsa przez 90 minut. Mieszaninę reakcyjną następnie przemywa się MeOH (3 razy przez 1 minutę) i CH₂C1₂ (3 razy po 1 minucie).

(5) Grupę Boc usuwa się (odbezpieczenie) przez przemycie produktu etapu (5) 50% TFA w CH₂C1₂, zawierającym 5% merkaptoetanol (5 minut) i 5% anizol (25 minut). Następnie dodatkowo przemywa się CH₂C1₂ (2 razy po 1 minucie), MeOH (2 razy po 1 minucie) i DMF (3 razy po 1 minucie).

Należy pamiętać o tym, że usuwanie grupy Boc powoduje również usunięcie grupy zabezpieczającej But, odpowiednio sprzężonej z łańcuchem bocznym A⁹. Zatem usuwanie Boc przeprowadza się zwykle dopiero bezpośrednio przed cyklizacją reszty A⁹.

Operacja 5: Tworzenie 5-członowego pierścienia heterocyklicznego

Strukturę pierścieniową o wzorze ΠΑ tworzy się przez wytrząsanie peptydu pośredniego, mającego odbezpieczoną Cys⁹ w mieszaninie 50% AcOH, 3,7% HCHO i DMF (1:1:8) w temperaturze pokojowej przez 10 minut i odsączenie. Produkt przemywa się po trzy razy DMF, MeOH i CH₂C1₂.

Strukturę pierścieniową o wzorze IIB tworzy się przez wytrząsanie peptydu pośredniego, mającego odbezpieczoną Cys⁹ w mieszaninie 50% AcOH, 10% CH₃CHO i DMF (1,5:0,5:8) w temperaturze pokojowej przez 10 minut i odsączenie. Produkt przemywa się po trzy razy DMF, MeOH i CH₂C1₂.

Strukturę pierścieniową o wzorze IIC tworzy się przez wytrząsanie peptydu pośredniego, mającego odbezpieczoną Pen⁹ w mieszaninie 50% AcOH, 3,7% HCHO i DMF (1:1:8) w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i odsączenie. Produkt przemywa się po trzy razy DMF, MeOH i CH₂C1₂.

Operacja 6: Odłączenie peptydu od żywicy

Po dołączeniu wszystkich żądanych reszt aminokwasów na pośrednią peptydo-żywicę działa się ciekłym HF w obecności anizolu w celu odszczepieniapolipeptydu od fazy nośnika. W wyniku tej reakcji usuwa się również grupy zabezpieczające łańcuch boczny. Gdy stosuje się żywicę BHA, uzyskany peptyd pośredni ma Q = NH₂.

Jeśli X jest inne niż H, to grupę X umieszcza się przy N-końcu albo przez wprowadzenie aminokwasu już obarczonego grupąX (na przykład Ac-D-Phe) lub przez reakcję odbezpieczonej grupy alfa-aminowej przy N-końcowym A¹ pośrdniego pseudopeptydu z odpowiednim reagentem. Zatem kompletny peptyd po usunięciu z fazy nośnika-żywicy można odpowiednio poddać reakcji z KOCN, uzyskując X = NH₂CO-.

Operacja 7/ Oczyszczanie peptydów.

Pseudopeptydy o wzorze I oczyszcza się generalnie za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) na kolumnie z odwróconymi fazami, przeprowadzanej na układzie Rainin HPLC (Rainin Inc., Co., Wobum, MA), składającym się z trzech pomp do HPLC typu Rabbit HP, kontrolowanych przez komputer Apple Macintosh Plus, wstrzykiwacza typu Rheodyne oraz monitora UV zmiennej długości fali typu Knauer Model 87. Surowe peptydy (10-40 mg) załadowuje się na kolumnę Dynamax Macro (21,2 x 250 mm) wypełnioną sferycznym żelem krzemionkowym C₁₈ (wielkość porów: 300 A; wielkość cząstek: 12 pm) (Rainin Inc. Co.)ieluuje w gradiencie liniowym, stosując układ rozpuszczalników składający się z (A) 0,1% TFA i (B) 0,1 % TFA w 70% wodnym acetonitrylu przy prędkości przepływu 2,0 ml/min. Wszystkie frakcje ocenia się pod względem czystości i czasu retencji za pomocą analitycznego HPLC opisanego poniżej.

Jakość oraz charakterystykę elucji surowego i oczyszczonego peptydu ocenia się za pomocą analitycznego HPLC na chromatografie cieczowym model Hewlett-Packard 1090, wyposażonym w detektor z diodą szeregową nastawioną na 220 i 280 nm oraz kolumnę z odwróconymi fazami 4,6 x 250 mm W-porex C₁₈ (wielkość porów: 300A, wielkość cząstek: 5 μτη). Otrzymuje

180 372 się prędkość przepływu układu rozpuszczalników (A) i (B) opisanego powyżej równą 1,2 ml/min, a rozdziały przeprowadza się w temperaturze pokojowej.

W większości przpadków pseudopeptydy, będące antagonistami bombezyny są dodatkowo oczyszczane przez ponowną chromatografię na tej samej kolumnie przy niewielkiej modyfikacji warunków gradientu. Jednorodność oczyszczonych peptydów zgodnie z wynikami analitycznej HPLC wynosi powyżej 97%.

W razie potrzeby analizę aminokwasów w pseudopeptydach o wzorze I można przeprowadzić za pomocą analizatora aminokwasów typu Beckmann 6300 na próbkach hydrolizowanych przez 20 godzin w 110°C w zamkniętych, ewakuowanych probówkach za pomocą4M kwasu metanosulfonowego, zawierającego 0,2% 3-(2-aminoetylo)indolu.

C. Syntetyczne związki poślednie

1. Grupy zabezpieczające łańcuchy boczne

W syntezie, w fazie stałej powszechnie stosuje się zabezpieczanie reaktywnych grup funkcyjnych w łańcuchach bocznych różnych ugrupowań aminokwasów lub fragmentów peptydów. Grupy funkcyjne w łańcuchach bocznych mogą być zabezpieczone w celu zapobiegania przebiegu niepożądanej reakcji chemicznej na wspomnianych łańcuchach. W związku z tym powszechne jest otrzymywanie peptydu pośredniego, który zawiera wszystkie reszty aminoacylowe umiejscowione w żądanej sekwencji w łańcuchu peptydowym z grupami zabezpieczającymi łańcuch boczny, przyłączonymi do odpowiednich reszt.

Przy doborze konkretnych grup zabezpieczających łańcuch boczny w syntezie peptydów, postępuje się na ogół według następujących zasad:

(a) grupa zabezpieczająca zachowuje z reguły swoje właściwości zabezpieczające w warunkach sprzęgania, (b) grupa zabezpieczająca powinna być stabilna w stosunku do reagentów sprzęgających, korzystnie jest stabilna w warunkach sprzęgania dobranych tak, aby usuwać grupy zabezpieczające grupy alfa-aminowe w każdym etapie syntezy i (c) grupa zabezpieczająca łańcuch boczny musi być usuwalna po zakończeniu syntezy żądanej sekwencji aminokwasów w warunkach reakcji nie zmieniających w sposób niepożądany łańcucha peptydowego.

Grupy zabezpieczające łańcuchy boczne przyłącza się do reszt aminokwasów metodami znanymi ze stanu techniki. Do odpowiednich grup zabezpieczających łańcuch boczny dla His należy Bom, a dla Glu i Cys But.

2. Syntetyczne związki pośrednie

Zakresem wynalazku objęte sąrównież pośrednie peptydy z kolejnych etapów syntezy. Zilustrowano tu peptydy pośrednie dla peptydu 2 na trzech etapach.

Etap A: po połączeniu wszystkich aminokwasów i żywicy:

Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Vał-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica-BHA(„l/02/A”);

Etap B: po usunięciu N-końcowej grupy Boc:

D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-żywica-BHA („1/02/B”);

Etap C: po cyklizacji A⁹:

D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica-BHA („1/02/C”).

Jest jeden dalszy etap, Etap D, zilustrowany w syntezie peptydu nr 17 w poniżej przedstawionym przykładzie II. Związek pośredni z etapu D usuwa się z żywicy, ale nie ma jeszcze pojedynczego wiązania X, łączącego A¹ z A².

Zastosowania medyczne

Antagoniści bombezyny są użyteczni w leczeniu stanów hipergastrynemii, na przykład anemii złośliwej, chronicznego zanikowego nieżytu żołądka, zespołu Zollingera-Ellisona i bielactwa nabytego, z towarzyszącą hiperplazją komórek gastrycznych typu komórek srebmochłonnych, a także ze zwiększonym ryzykiem rozwinięcia się wieloogniskowych guzów rakowatych żołądka. Ponadto, hiperplazja komórek typu srebmochłonnego powstaje zwykle u zwierząt hipergastrynemicznych.

180 372

Leczenie takie ma pewne zalety w stosunku do obecnie stosowanych leków, ponieważ antagoniści H₂, jak cimetydyna, powodująhipergastrynemię i mogąprowadzić u łudzi do guzów rakowatych. Ponadto, przerwanie terapii antagonistami H₂ powoduje natychmiastowy nawrót wrzodów z powodu istniejącej hipergastrynemii.

Ponieważ związki według wynalazku są antagonistami receptorów bombezyny/GRP, mogą być stosowane w leczeniu raka płuc, raka okrężmcy i raka żołądka.

Antagoniści bombezyny o wzorze I mogą być podawani w postaci dopuszczalnych farmaceutycznie, nietoksycznych soli, takich jak sole addycyjne z kwasami. Przykładowymi takimi solami addycyjnymi z kwasami są chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, fosforan, fumaran, glukonian, taninian, maleinian, octan, cytrynian, benzoesan, bursztynian, alginian, pamoesan, jabłczan, askorbinian, winian i podobne.

Te kompozycje farmaceutyczne będą zawierać pseudopeptydy o wzorze I w połączeniu z typowym, dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem, na przykład dopuszczalną jest solanka fizjologiczna, chociaż mogą być stosowane inne nośniki znane ze stanu techniki.

Leczenie osób za pomocątych kompozycji farmaceutycznych może być prowadzone w ten sam sposób jak leczenie kliniczne przy użyciu innych agonistów i antagonistów LHRH lub analogów somatostatyny. Zatem antagoniści bombezyny o wzorze I mogą być podawani dożylnie, podskórnie, domięśniowo, donosowo lub za pomocą aerozolu płucnego albo w formie depot (na przykład mikrokapsułek, mikrogranulek lub cylindrycznych implantów typu pałeczki), wytworzonych z odpowiedniego biodegradowalnego polimeru (takiego jak DL-laktydokoglikohd). W zakres wynalazku wchodzą również inne równoważne sposoby podawania, na przykład wlewy ciągłe, pompa infuzyjna i sposoby uwalniania rozłożonego w czasie, takie jak mikrokapsułki i podobne.

Efektywne dawki peptydów o wzorze I zależeć będą od postaci podawania i konkretnego leczonego gatunku ssaka. Dawka będzie wynosić około od 1 do 1000 mikrogramów peptydu na kilogram wagi ciała gospodarza na dzień przy podawaniu pozajelitowym. Te zakresy sąjedynie zakresami preferowanymi i w odpowiednich okolicznościach mogąbyć wybrane wyższe dawki. Może być podawany roztwór soli fizjologicznej zawierający peptyd, zapewniając dawkę w zakresie od około 0,01 do 0,20 mg/kg wagi ciała dziennie, z wyjątkiem form depot, dla których wstrzykiwana ilość jest wyliczana tak, aby działanie trwało od około 15 do około 30 dni lub dłużej.

W poniższych przykładach zastosowano trzyliterowy kod, identyfikujący peptydy pośrednie na niektórych etapach syntezy. Peptyd zakodowany „1/01/A” jest peptydem pośrednim dla peptydu „01”, wytworzonego w przykładzie I, który zakończył etap A syntezy. Podobnie „2/08/B” i „4/19/C” są peptydami pośrednimi dla peptydów odpowiednio „08” i „19” w· przykładach II i VI, które zakończyły syntezę etapów odpowiednio B i C.

Przykład I

Nr peptydu

1. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

2. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

4. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

5. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

7. D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

8. Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

9. D-Pal-Gln-Trp-AIa-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

180 372

11. Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

12. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

13. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH₂

Peptydy te mogą być odpowiednio syntetyzowane ze wspólnego związku pośredniego 1-1, Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica-BHA w sposób opisany poniżej.

Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-żywica-BHA otrzymuje się następująco: 2,0 g żywicy BHA (0,55 mmola NH₂/g) otrzymuje się przez działanie 20 ml 10% TEA w CH₂C1₂ (zobojętnianie) dwa razy po 3 minuty i przemycie sześć razy 20 ml CH₂C1₂; następnie miesza się z 3,3 mmola Fmoc-Cys(But) i 3,6 mmola HOBt w DMF przez trzy minuty. Dodaje się 3 równoważniki DIC (jako 20% roztwór w CH₂C1₂), Mieszaninę wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Uzyskany związek Fmoc-Cys(But)-żywica-BHA przemywa się po dwa razy CH₂C1₂ i metanolem oraz trzy razy CH₂C1₂, a następnie poddaje testowi Kaisera.

Sprzęganie Fmoc-Leu-CHO z utworzeniem wiązania pseudopeptydowego przeprowadza się następująco. Odbezpieczenie grupy Fmoc z A⁹ przeprowadza się przez dodanie 15 ml 50% piperydyny w DMF i mieszanie przez 30 minut i przemycie 15 ml DMF (6 x 1 minuta). Następnie dodaje się 3.3 mmola Fmoc-CHO (3 równoważniki) w DMF, zawierającym 1% AcOH, a następnie NaBH₃CN (3,5 równoważnika) w DMF i wytrząsa przez 1 godzinę. Następnie przemywa się 15 ml 50% MeOH (3 x 1 minuta); 15 ml 100% MeOH (3 x 1 minuta); i 15 ml DMF (3x1 minuta).

Usuwanie grupy Fmoc (odbezpieczanie) z Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-żywica-BHA przeprowadza się jak w operacji 4A.

Po usunięciu grupy Fmoc z Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-żywica-BHA i zobojętnieniu, przeprowadza się sprzęganie Fmoc-His(Bom) tak jak opisano dla operacji 4A.

Sprzęganie Fmoc-Gly przeprowadza się jak w operacji 4. Do roztworu 3,3 mmola Fmoc-Gly i 3,6 mmola HOBt dodaje się w 0°C 20% roztwór 1,3-diizopropylokarbodiimidu (3,3 mmola) w CH₂C1₂, miesza się chłodząc przez 15 minut oraz przez 15 minut w temperaturze pokojowej, odsącza precypitat i dodaje do żywicy oraz wytrząsa przez 60 minut. Następnie przez sprzęganie w ten sam sposób wprowadza się kolejno dalsze reszty aminokwasowe Fmoc-Val, Fmoc-Ala i Fmoc-Trp, uzyskując 3,80 g związku pośredniego 1-1, zabezpieczonej peptydo-żywicy o strukturze Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA.

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-pGlu z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się: Boc-D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/01 /A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Phe z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się: Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/02/A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Ac-D-Phe zpośrednim peptydem I-1 otrzymuje się: Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/04/A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Cpa z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się: Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/05/A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Nal z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się: Boc-D-Nal-Gln-Trp-A.la-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/07/A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-Pal z pośrednim peptydem 1-1 otrzymuje się: Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/08/A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Pal z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się: Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/09/A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Trp z pośrednim peptydem 1-1 otrzymuje się: Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/10/A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Ac-D-Trp z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się: Ac-D-trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/11/A”).

180 372

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-Tpi z pośrednim peptydem 1-1 otrzymuje się: Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/12/A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Tpi z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się: Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/13/A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Hca z pośrednim peptydem 1-1 otrzymuje się: Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/14/A”).

Następnie N-końcową grupę Boc peptydu pośredniego 1/01/A usuwa się przez dwukrotne działąnie 50% TFA w CH₂C1₂, zawierającym 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu, po raz pierwszy przez 5 minut i następnie przez 25 minut. Peptyd pośredni przemywa się następnie CH₂C1₂(2 razy po 1 minucie), MeOH (2 razy 1 minuta) i DMF (3 razy 1 minuta). W ten sposób usuwa się również grupy zabezpieczające But z Cys, otrzymując peptyd pośredni D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-żywica BHA („1/01/B”), który następnie przemywa się CH₂C1₂, MeOH i DMF, po trzy razy przez 1 minutę każdy.

W tym punkcie łańcuch boczny Cys peptydu pośredniego 1/01/B cyklizuje się przez utlenianie z wytworzeniem 5-członowego pierścienia heterocyklicznego pokazanego we wzorze IIA, stosując Operację 5. Dodaje się 10 ml mieszaniny AcOH, 3,7% HCHO i DMF (1:1:8). Mieszaninę reakcyjną wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, przemywa się po trzy razy wodą, DMF i Ch₂Cl₂, otrzymując peptyd pośredni 1/01/C, D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA.

Następnie na peptyd pośredni 1/01/C działa się HF i anizolem za pomocą Operacji 6 w celu usunięcia grupy zabezpieczającej Bom z His i jednocześnie odszczepienia nonapeptydu z fazy nośnika-żywicy, uzyskując C-końcową grupę Q, którą jest NH₂. Peptyd oczyszcza się za pomocą HPLC jak w Operacji 7. W ten sposób otrzymuje się będący antagonistą bombezyny peptyd numer 1.

Te same etapy usuwania grupy Boc i grupy But oraz cyklizacji grupy -CH₂-SH w Cys z drugorzędową aminą ze zredukowanego wiązania przeprowadza się na peptydach pośrednich 1/02/A, 1/05/A, 1/07/A, 1/08/A, 1/09/A, 1/10/A i 1/12/A, otrzymując następujące peptydy pośrednie:

1/02/B D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gły-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA

1/04/B Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA

1/05/B D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA

1/07/B D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA

1/08/B Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA

1/09/B D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA

1/10/B D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA

1/11/B Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA

1/12/B Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA

1/13/B D-Tpi-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA

1/14/B Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA

180 372

Surowe peptydy odszczepia się z żywicy BHA, a następnie oczyszcza za pomocą Operacji 6 i 7, otrzymując czyste peptydy 2,4,5 i 7-14.

Czasy retencji dla tych peptydów są następujące.

Dane z analitycznej HPLC
Nr peptydu	Gradient %B/min	Czas retencji na kolumnie D
1	25-65	14,40
2	25-65	14,20
3	25-75	15,17
5	25-65	16,11
7	20-60	23,75
8	20-60	13,19
9	25-65	12,00
10	25-65	16,98
11	25-65	24,50
12	25-65	19,91
13	25-65	16,99
14	40-80	13,68

Alternatywnie, 5-członowy pierścień heterocykliczny może byc utworzony w roztworze za pomocą następującej procedury:

mg pośredniego peptydu, zawierającego strukturę Leu-psi-Cys-NH₂, otrzymanego przez syntezę w fazie stałej w 0,8 ml lodowatego kwasu octowego miesza się ze 100 μΐ 1% formaldehydu (% wagowy roztworu wodnego) w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, a następnie dodaje się 20 μΐ 50% roztworu octanu amonu. Mieszaninę reakcyjną poddaje się oczyszczaniu, otrzymując żądany peptyd, który zawiera strukturę -Leu-psi-Tac-NH₂.

Przykład II

Nr peptydu

15. D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

16. D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

17. D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2

Peptydy w tym przykładzie mogą być zsyntetyzowane ze wspólnego związku pośredniego 1-2, Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA, budowanego etap po etapie na 0,5 g żywicy BHA (0,55 mmola NH₂/g). Pośredni peptyd 1-2 otrzymuje się według Operacji i procedur przedstawionych w przykładzie I. Porcję 150 mg związku pośredniego 1-2 dzieli się następnie na 3 jednakowe części i poddaje dwóm kolejnym sprzęganiem zgodnie z procedurą opisaną w Operacji 4, otrzymując końcowe żywice nonapeptydowe.

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-His(Bom) i Boc-D-Phe z pośrednim peptydem 1-2 otrzymuje się: Boc-D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („2/15/A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Glu(OMe) i Boc-D-Phe z pośrednim peptydem 1-2 otrzymuje się: Boc-D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („2/16/A”).

W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Glu(But) i Boc-D-Phe z pośrednim peptydem 1-2 otrzymuje się: Boc-D-Phe-Glu(But)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („2/17/A”).

180 372

Usunięcie grupy Boc z pośredniego peptydu 2/15/A przeprowadza się stosując 50% TFA w CH₂C1₂, zawierający 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu w Operacji 4. W reakcji tej następuje również usunięcie grupy But z reszty A⁹, w wyniku czego otrzymuje się pośredni peptyd 2/15/B:

D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-żywica BHA

W tym punkcie łańcuch boczny Cys peptydu pośredniego 2/15/B cyklizuje się przez utlenianie z wytworzeniem 5-członowego pierścienia heterocyklicznego pokazanego we wzorze IIA za pomocą Operacji 5. Dodaje się 10 ml mieszaniny AcOH, 3,7% HCHO i DMF (1:1:8). Mieszaninę reakcyjną wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, przemywa po 3 razy wodą, DMF i CH₂C1₂, otrzymując peptyd pośredni 2/15/C:

D-Phe-Glu(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA.

Następnie na peptyd pośredni 2/15/C działa się świeżo destylowanym HF (5 ml) i anizolem (0,25 ml) w 0°C przez 1 godzinę, usuwając w ten sposób również grupę zabezpieczającą Bom z His. Rozpuszczalnik odparowuje się pod próżnią i przemywa octanem etylu, ekstrahuje 70-80% wodnym roztworem kwasu octowego i liofilizuje. Po oczyszczeniu otrzymuje się będący antagonistą bombezyny peptyd nr 15.

Te same etapy usuwania N-końcowego Boc, cyklizacjiGys⁹, usuwania peptydu pośredniego z żywicy BHA i oczyszczania za pomocą HPLC przeprowadza się na peptydach pośrednich 2/16/A i 2/17/A, otrzymując peptyd numer 16 i peptyd pośredni 2/17/D:

D-Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2.

Mieszaninę 15 mg 2/17/D i 15 mg HOBt w 0,8 ml DMF w 0^QC dodaje się do 50 mikrolitrów 25% roztworu diizopropylokarbodiimidu w CH₂C1₂ i miesza w 0°C przez 2 godziny. Powstaje wiązanie pojedyncze peptydu 17, łączące grupę alfa-aminowąD-Phe¹ z ugrupowaniem gammakarboksylowym grupy 3-propionylowej w Glu²:

D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2.

Mieszaninę reakcyjną oczyszcza się za pomocą HPLC według Operacji 7.

Czasy retencji dla tych peptydów są następujące.

	Dane analitycznej HPLC
Nr peptydu 15 16 17	Gradient %B/min Czas retencji na kolumnie D 20-60 17,23 25-65 19,13 20-60 20,34

Przykład III

Nr peptydu

3. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gły-His-Leu-psi-MTac-NH₂

6. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-MTac-NH2

Powyższych antagonistów bombezyny można zsyntetyzować ze wspólnego związku pośredniego 1-3, to jest Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA. Ten związek pośredni buduje się na 1,0 g żywicy BHA (0,55 mmoli NH₂/g) poprzez kolejne sprzęganie w warunkach syntezy w fazie stałej, takich jak opisano w przykładzie I, rozpoczynając odFmoc-Cys(But), następnie Fmoc-Leu-CHO z (NaBH₃CN) i Fmoc-His(Bom), etc., dalej zgodnie z przykładem I. Fmoc-Gln łączy się z N-końcowym zgodnie z Operacją 4, otrzymując związek pośredni 1-3. Końcowe sprzęganie Boc-D-Phe lub Boc-D-Cpa do związku pośredniego

180 372

1-3 przeprowadza się zgodnie z procedurąz Operacji 4, otrzymując peptydy pośrednie odpowiednio „3/3/A” lub „3/6/A”.

Usuwanie grupy Boc przeprowadza się za pomocą 50% TFA w CH₂C1₂, zawierającym 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu za pomocą Operacji 4.

W tym punkcie łańcuch boczny Cys w peptydzie pośrednim 3/3/B cyklizuje się przez utlenianie z utworzeniem 5-członowego pierścienia heterocyklicznego pokazanego we wzorze IIB za pomocą Operacji 5. Dodaje się 10 ml mieszaniny 50% AcOH, 10% CH₃CHO i DMF (1,5:0,5:8). Mieszaninę reakcyjną wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 10 minut, przemywa po 3 razy wodą DMF i CH₂C1₂, otrzymując peptyd pośredni 3/3/C: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-MTac-żywica BHA.

Peptydy pośrednie 3/3/C i 3/6/C usuwa się z żywicy za pomocą Operacji 6, poprzez działanie HF (5 ml) i anizolem (0,25 ml) w 0°C przez 1 godzinę. W procesie tym następuje również usunięcie grupy zabezpieczającej Bom z His, w wyniku czego otrzymuje się końcowe nonapeptydy 3 i 6.

Peptydy oczyszcza się za pomocą HPLC, jak w Operacji 7; ich czasy retencji podano poniżej.

Nr peptydu 3

Dane analitycznej HPLC

Gradient %B/min Czas retencji na kolumnie D

25-65 15,71

25-65 17,37

Alternatywnie, 5-członowy pierścień heterocykliczny może być utworzony w roztworze przez dodanie do 25 mg peptydu pośredniego, zawierającego strukturę Leu-psi-Cys-NH₂ w temperaturze pokojowej 0,8 ml lodowatego kwasu octowego zmieszanego ze 100 mikrolitrami 10% aldehydu octowego. Miesza się to przez 5 minut, następnie dodaje się 100 mikrolitrów octanu amonu. Mieszaninę reakcyjnąpoddaje się oczyszczaniu, otrzymując żądany peptyd, zawierający strukturę Leu-psi-MTac-NH₂.

Przykład IV

Nr peptydu

18. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH₂

19. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac

20. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH₂

21. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH₂

22. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH₂

Polipeptydy te mogą być zsyntetyzowane odpowiednio ze wspólnego związku pośredniego 1-4, Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA. Ten związek pośredni buduje się etapowo na żywicy benzhydryloaminowej (BHA) zgodnie ze standardowymi metodami syntezy w fazie stałej, jak opiasno w przykadach I i II.

Zatem na 1,0 g żywicy BHA (0,55 mmola NH₂/g) przygotowanej zgodnie z Operacją 3, działa się dwa razy po trzy minuty 10 ml 10% TE A w CH₂C1₂ (zobojętnianie) i przemywa sześć razy 10 ml CH₂C1₂; następnie miesza się przez trzy minuty z 1,6 mmola Fmoc-Pen(But) i 1,8 mmola 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) w DMF. Dodaje się 1,6 mmola 20% roztworu 1,3-diizopropylokarbodiimidu (DIC) w CH₂C1₂. Mieszaninę wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Uzyskany związek Fmoc-Pen(But)-BHA przemywa się po dwa razy CH₂C1₂ i metanolem oraz trzy razy CH₂C1₂, po czym poddaje testowi Kaisera.

180 372

Usuwanie grupy Fmoc (odbezpieczanie) z Fmoc-Pen(But)-żywica BHA przeprowadza się za pomocą operacji 4A.

Sprzęganie Fmoc-Leu-CHO przeprowadza się zgodnie z Operacją 3. Związek A⁹(But)-żywica BHA przemywa się 2 razy DMF. Następnie dodaje się 1,6 mmola Fmoc-Leu-CHO w DMF, zawierającym 1% AcOH, po czym 1,8 mmola NaBH₃CN w DMF. Mieszaninę reakcyjną wytrząsa się przez 60 minut, następnie przemywa 2 razy 50% metanolem w H₂O, 2 razy 100% MeOH i 3 razy CH₂C1₂, za każdym razem przez 1 minutę.

Po usunięciu z Fmoc-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA grupy Fmoc i zobojętnieniu przeprowadza się sprzęganie Fmoc-His(Bom) w sposób opisany w Operacji 4.

Sprzęganie Fmoc-Gly przeprowadza się jak w Operacji 4, przez dodanie w 0°C do roztworu 1,5 mmoli Fmoc-Gly i 1,65 mmoli HOBt w DMF 20% roztworu 1,3-diizopropylokarbodiimidu (1,5 mmola) w CH₂C1₂, mieszanie z chłodzeniem przez 15 minut i w temperaturze pokojowej przez 15 minut, odsączenie wytrąconego osadu i dodanie do żywicy oraz wytrząsanie przez 60 minut. Następnie przez sprzęganie w ten sam sposób kolejno wprowadza się następne reszty aminokwasów Fmoc-Val, Fmoc-Ala i Fmoc-Trp, otrzymując 1,9 g związku pośredniego 1-4, zabezpieczonej peptydo-żywicy o strukturze Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA.

0,91 g związku pośredniego 1-4 dzieli się na pięć równych części (około 200 mg każda), które używa się do syntezy zabezpieczonych żywic polipeptydowych zgodnie z procedurami opisanymi w Operacji 4:

Kolejne sprzęganie Fmoc-Gln i Boc-D-Phe do peptydu pośredniego 1-4 daje: Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA („4/18/A”). Kolejne sprzęganie Fmoc-Gln i następnie Ac-D-Phe do peptydu pośredniego 1-4 daje: Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA („4/19/A”). Kolejne sprzęganie Fmoc-Gln i Boc-D-Cpa do peptydu pośredniego 1-4 daje: Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA („4/20/A”). Kolejne sprzęganie Fmoc-Gln i Boc-Tpi do peptydu pośredniego 1-4 daje: Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA („4/21/A”).

Kolejne sprzęganie Fmoc-Gln i Boc-Tpi do peptydu pośredniego 1-4 daje:

Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA („4/22/A”).

Następnie grupę Boc usuwa się z peptydu pośredniego 4/18/A za pomocą 50% TFA w CH₂C1₂, zawierającego 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu, otrzymując peptyd pośredni 4/18/B: D-Phe-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen-żywica BHA.

W tym punkcie łańcuch boczny Pen w peptydzie pośrednim 4/18/B cyklizuje się przez utlenianie za pomocą Operacji 5 z utworzeniem 5-członowego pierścienia heterocyklicznego pokazanego we wzorze IIC. Dodaje się 10 ml mieszaniny AcOH, 3,7% HCHO i DMF (1:1:8), otrzymując mieszaninę reakcyjną, którą wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, przemywa po 3 razy wodą, DMF i CH₂C1₂, otrzymując peptyd pośredni 4/18/C: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-DMTac-żywica BHA.

Następnie peptyd pośredni 4/18/C przemywa się CH₂C1₂, metanolem i CH₂C1₂ po trzy razy każdy i działa w 0°C przez 1 godzinę świeżo destylowanym HF (5 ml) i anizolem (0,25 ml). Rozpuszczalnik odparowuje się pod próżnią, przemywa eterem lub octanem etylu, po czym ekstrahuje 70-80% kwasem octowym i liofilizuje, otrzymując surowąnonapeptydożywicę. Mieszaninę reakcyjną oczyszcza się, otrzymując będący antagonistą bombezyny peptyd nr 18.

Te same etapy usuwania grup zabezpieczających, cyklizacji odbezpieczonego A⁹ i odłączenia peptydu pośredniego od żywicy BHA przeprowadza się dla pośrednich peptydów 4/19/A, 4/20/A, 4/21/A i 4/22/A, otrzymując peptydy o numerach 19, 20, 21 i 22.

Oczyszczanie przeprowadza się za pomocąHPLC układem rozpuszczalników składającym się z (A) 0,1% TFA i (B) 1% TFA w 70% acetonitrylu, zgodnie z Operacją 7. Za pomocą analitycznej HPLC wykazano, że oczyszczone peptydy mają czystość powyżej 97%. Czasy retencji tych peptydów podano poniżej.

Dane analitycznej HPLC

Nr peptydu	Gradient %/min.	Czas retencji na kolumnie D
18	25-65	14,01
19	25-65	22,96
20	25-65	15,97
21	25-65	19,19
22	25-65	16,53

Alternatywnie, reszta A⁹ może być cyklizowana w roztworze przez dodanie 25 mg wolnego peptydu zawierającego strukturę -Leu-psi-Pen-NH₂ do 25 mg HOBt w 0,8 ml lodowatego kwasu octowego zmieszanego ze 100 mikro litrami 10% formaldehydu i mieszanie w 0°C przez 30 minut z wytworzeniem peptydu mającego strukturę 5-członowego pierścienia -Leu-psi-DMTac-NH₂.

Przykład V.

Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2

D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH₂

Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2

D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2

Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2

Peptydy te można syntetyzować ze wspólnego związku pośredniego 1-5 Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA.

Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA otrzymuje się następująco: 1,0 g żywicy BHA (0,55 mmola NH₂/g) sprzęga się kolejno z Fmoc-Cys(But) i Fmoc-Leu-CHO metodą wskazaną w Operacjach 2 i 3.

Kolejne sprzęganie Fmoc-His(Bom), Fmoc-Gly, Fmoc-Val, Fmoc-Ala, Fmoc-Trp i FmocGln daje Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywicę BHA, pośredni peptyd 1-5.

150 mg podwielokrotność tego związku pośredniego 1-5, wspólnego dla wszystkich peptydów z tego przykładu, poddaje się jednemu dalszemu sprzęganiu za pomocą procedur opisanych w Operacji 4, otrzymując końcowe peptydo-żywice.

Kolejne sprzęganie Boc-Pal z pośrednim peptydem 1-5- daje:

Boc-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („5/08/A”).

Kolejne sprzęganie Boc-D-Pal z pośrednim peptydem 1-5- daje:

Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („5/09/A”).

Kolejne sprzęganie Boc-Tpi z pośrednim peptydem 1-5- daje:

Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („5/12/A”).

Kolejne sprzęganie Boc-D-Tpi z pośrednim peptydem 1-5 daje:

Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („5/13/A”). Kolejne sprzęganie Hca z pośrednim peptydem 1-5 daje:

Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („5/14/A”).

N-końcową grupę Boc usuwa się z pośredniego peptydu 5/01/A przez działanie dwa razy 50% TFA w CH₂C1₂, zawierającym 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu, za pierwszym razem przez 5 minut, a za drugim razem przez 25 minut. W wyniku tego działania usuwa się grupę zabezpieczającą z Cys. Następnie peptyd przemywa się CH₂C1₂, MeOH i DMF jak w Operacji 4, otrzymując pośredni peptyd 5/08/B: Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-żywica BHA.

180 372

Następnie na pośredni peptyd 5/08/B działa się świeżo destylowanym HF (5 ml) i anizołem (0,25 ml) w 0°C przez 1 godzinę, usuwając również grupę zabezpieczającą Bom z His. Rozpuszczalnik odparowuje się pod próżnią i przemywa octanem etylu, ekstrahuje 70-80% kwasem octowym i liofilizuje, otrzymując następujący peptyd:

Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2.

Grupę zabezpieczającą i żywicę BHA usuwa się z pośrednich peptydów 5/08/A, 5/09/A, 5/11/A, 5/12/A, 5/13/A i 5/14/A, otrzymując peptydy wymienione na początku tego przykładu. Peptydy te poddaje się testowi czystości zgodnie z Operacją 7.

Dane analitycznej HPLC

Nr peptydu	Gradient %B/min.	Czas retencji na kolumnie D
5/08	20-60	5,56
5/09	25-65	4,60
5/12	25-6.5	12,78
5/13	25-65	9.62
5/14	40-80	7,39

Alternatywnie, peptydy te mogą być odpowiednio zbudowane etapowo na żywicy BHA z Boc-zabezpieczonymi aminokwasami, przy użyciu Bz w celu zabezpieczenia grupy -SH z Cys⁹zgodnie ze standardowymi metodami syntezy w fazie stałej, z uzyskaniem następujących peptydów pośrednich:

BocPal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-żywica BHA („5/08/A”). Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-żywica BHA („5/09/A”). Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-żywica BHA („5/12/A”). Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-żywica BHA („5/13/A”). Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-żywica BHA („5/14/A”).

Grupę Boc usuwa się przez działanie 50% TFA w CH₂C1₂ zawierającym 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu, i następnie działanie HF i anizołem w celu odszczepienia peptydu od żywicy, w wyniku czego usuwa się również grupę zabezpieczającą Bom z His i Bz z Cys, otrzymując peptydy wymienione na początku tego przykładu.

Przykład VI. Procedury testowe.

(A) Test wiązania receptora

Wiązanie ¹²⁵I-Tyr⁴-bombezyny i jej wypieranie przez pseudopeptydy będące antagonistami bombezyny testuje się na 24-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowych (GIBCO) przy użyciu komórek Swiss 3T3. Mysie fibroblasty Swiss 3T3 utrzymuje się przez cotygodniowe pasażowanie w DMEM zawierającym 10% FCBS i środki przeciwgrzybicze. Hodowle inkubuje się w powietrzu zawierającym 5% CO₂ w 37°C. Studzienki posiewa się 10³komórek/studzienkę (żywotność > 95%), namnaża do podpłynięcia i uspokojenia. Procedurę wiązania prowadzi się w 7 dni po posianiu. Komórki przemywa się 2 razy po 0,5 ml buforu wiążącego (pożywka Eagle'a zmodyfikowana przez Dulbecco, zawierająca 20 nM HEPES-NaOH (pH 7,4), 0,2% BSA i 100 mcg/ml bacytracyny). Następnie komórki inkubuje się z 0,2 nM ¹²⁵I-Tyr⁴-bombezyny w obecności lub w nieobecności różnych stężeń antagonistów (6 χ 10’¹¹ - 6 x 10'⁶M, objętość całkowita 0,4 ml).

Komórki inkubowano przez 30 minut w 37°C, ponieważ według Zachary i Rozengurta (1985) oraz Laytona i współpr. (1988) wiązanie ¹²⁵I-GRP w 37°C osiąga maksymalną wartość po 30 minutach i następnie maleje. Następnie komórki przemywa się 2 razy lodowato-zimnym (4°C) buforem wiążącym i 2 razy lodowato-zimną solanką buforowaną fosforanem (PBS, mM): NaCl 138, KC12,8,Na₂HPO₄ 8, KH₂PO₄ 1,45, CaCl₂ 0,91, MgCl₂ 0,49. Przemyte hodowle ekstrahuje się 0,5 ml 0,5 M NaOH i przenosi do probówek do zliczeń. Studzienki przemywa się raz 0,5 ml wody destylowanej (jałowej), a przemywki dodaje do odpowiednich probówek. Następnie ra

180 372 dioaktywność próbek zlicza się w automatycznym liczniku gamma (Micromedic System, Inc., Huntsville, Ala).

Do ustalenia typów wiązania receptora, stałych dysocjacji (Kd), stałej asocjacji (Ka) i maksymalnej pojemności wiążącej receptorów (Bmax) użyto programu komputerowego PC Munsona i Rodbarda Ligand, służącego do dopasowywania krzywej.

Dane wiązania polipeptydów według wynalazku są zestawione poniżej w tabeli I. Do oznaczenia zdolności do wypierania specyficznego wiązania ¹²⁵I-Tyr⁴-bombezyny stosowano zmieniające się dawki nieznakowanych polipeptydów. Pokazano średnią wartość z 2-3 niezależnych testów dla każdego peptydu (każdy przeprowadzony trzykrotnie).

Tabela 1

125 4

Hamowanie wiązania I-Tyr -bombezyny w komórkach Swiss 3T3 przez antagonistów bombezyny

Nr peptydu	K, [nM]
01	5,0
02	0,078
03	13
04	13
05	0,007
06	4,3
07	0,009
08	4,5
09	8,8
10	0,11
11	5,4
12	<0,001
13	<0,001
14	<0,001
15	0,26
16	12
17	213
18	0,93
19	20
20	13
21	0,07
22	0,074
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2	0,20
Bombezyna	0,28

a: Wartość średnia z 6 testów;

b: wartość średnia z 11 testów

Przykład VII.

Wpływ antagonistów bombezyny na objętość guza w niezależnych od estrogenu mysich rakach sutka ΜΧΤ testowano w spoób następujący: 40 myszy samic B6D2F_1; otrzymanych z Na

180 372 tional Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility (Frederick, Maryland) trzymano w temperaturze 211°C i wilgotności 555%. Zwierzęta trzymano w automatycznie regulowanym harmonogramie 12 godzin światła/12 godzin cimności i podawano karmę dla gryzoni laboratoryjnych 50001 i wodę wodociągową do woli. Dojrzałym myszom samicom zaszczepiano podskórnie jeden mm³ tkanki estrogeno-niezależnego raka sutka ΜΧΤ (3,2)/Ovex, otrzymanej od dr A.E. Bogdena (Biomeasure Inc., Hopkinton, MA) i przechowywanej w stanie zamrożonym.

Dwa dni po transplantacji guzów, myszy podzielono przypadkowo na cztery grupy i rozpoczęto terapię za pomocą systemów o przedłużonym uwalnianiu (mikrokapsułki). Stworzono następujące cztery grupy:

1) Kontrola, tylko wehikulum do iniekcji;

2) [D-Tpi⁶, Leu¹³-psi-Leu¹⁴]Bn(6-14),

3) [D-Phe⁶, Leu¹³-psi-Tac¹⁴]Bn(6-14),

4) Chirurgiczna dwustronna owariektomia

W skrótach dla antagonistów bombezyny zastosowano typową numerację dla reszt fragmentu peptydowego; każda reszta jest numerowana zgodnie z pozycją, którą zajmuje w pełnym fragmencie. Jednakże antagonistów bombezyny jest dużo łatwiej porównywać z innymi peptydami, jeśli numeracja rozpoczyna się od Jeden” na N-końcu. Zatem ,,[D-Tpi⁶-Leu¹³-psi-Leu¹⁴]Bn(6-14) jest D-Tpi¹-Gln²-Trp³-Ala⁴-Val⁵-Gly⁶-His⁷-Leu⁸-psi-Leu⁹-NH₂ (w dalszym ciągu „BI”), natomiast [D-Phe⁶-Leu¹³-psi-Tac¹⁴]Bn(6-14) jest tym samym peptydem co powyższy peptyd nr 2.

Dwóch antagonistów bombezyny zsyntetyzowano metodami syntezy w fazie stałej. Grupa myszy nr 2 otrzymywała preparat o przedłużonym działaniu „BI”, natomiast grupa nr 3 otrzymywała preparat powyższego peptydu nr 2. Ten preparat o przedłużonym uwalnianiu utrzymywał ciągłe uwalnianie B1 lub peptydu nr 2 w ilości 25 mikrogramów/dzień przez 15 dni.

Do przedłużonego dostarczania zastosowano pompy osmotyczne Alzet (Alzo Co., Pało Alto, CA). Pompę model Alzet 2002 uwalniającą 0,48 μΐ/h implantowano podskórnie w dolnej tylnej części grzbietu. Peptydy przed napełnieniem minipomp osmotycznych rozpuszczano w 50% (v/v) roztworze glikolu propylenowego w wodzie.

Eksperymenty kończono w eksponencjalnej fazie wzrostu guza. Pierwszy pomiar objętości guza przeprowadzano po 10 dniach. Różnice w objętości guza między kontrolą a grupami leczonymi antagonistami bombezyny jak również między obiema grupami leczonymi antagonistami bombezyny były istotne statystycznie. Rezultaty pomiarów objętości guza podano w tabeli 2 i zilustrowano na figurze 1.

Tabela 2

Wpływ antagonistów bombezyny na objętość guza w estrogeno-niezależnych rakach sutka ΜΧΤ u myszy

Peptyd	Objętość guza w czasie (dni)
10	14	17
Kontrola	729	2565	5000
[D-Tpi^ć-Leu’³-psi-Leu¹⁴]-Bn(6-14) („B1 ”)	363*	2437	3742*
13 14 [D-Phe-Leu -psi-Tac ]-Bn(6-14), to jest peptyd nr 2	360*	1477*	3323**
Obustronna owariektomia chirurgiczna

*p<0,05 ** p<0,01

Po zakończeniu eksperymentów myszy skrwawiono pod znieczuleniem metofanowym, po czym zmierzono ciężary guzów i poddano analizie statystycznej za pomocą testu Duncana i testu Studenta. Rezultaty przedstawiono w tabeli 3.

180 372

Tabela 3

Związek podawany myszom obarczonym estrogeno-niezależnym guzem sutka ΜΧΤ	Ciężar guza (g)
Kontrola	8,450,23
[D-Tpi⁶-Leu¹³-psi-Leu' ⁴]Bn(6-14)	7,360,46
Peptyd nr 2	5,481,00**

Wartości są średnimi ± S.E. **p0,01

Przykład ΥΠΙ.

Wpływ jednego analogu somatostatyny i trzech antagonistów bombezyny na ludzkiego raka małokomórkowego płuc u nagich myszy testowano w sposób następujący. Bezgrasicze nagie myszy samce w wieku, w chwili przybycia około 6 tygodni, otrzymane z National Cancer Institute (Belthesda, MD) przetrzymywano w warunkach ograniczonego dostępu patogenów.

Komórki ludzkiego raka małokomórkowego płuc (SCLC, linia H69) namnażano w postaci monowarstwy w medium rpmi 1640 (Gipco, Grand Island, NY) suplementowanym 10% albuminy surowicy bydlęcej, antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi w temperaturze3 7°C i w wilgotnej atmosferze, zawierającej 5% CO₂. Wzrost przeszczepów inicjowano przez iniekcję podskórną 1 x 10⁷ komórek z hodowli tkankowej komórek w fazie wzrostu eksponencjalnego do prawego boku pięciu nagich myszy. Wytworzone guzy po trzech tygodniach aseptycznie wycięto i rozdrobniono mechanicznie. Następnie kawałki tkanki guza objętości 3 mm³ transplantowano podskórnie za pomocą trokaru 60 zwierzętom. Dwa tygodnie po traknsplantacji guzy urosły do objętości około 10 mm³, a zwierzęta podzielono w sposób przypadkowy na 5 grup eksperymentalnych, leczonych 5 różnymi związkami, począwszy od dnia następnego po dwóch tygodniach od transplantacji. Przez następne 5 tygodni guzy mierzono co tydzień. Obliczono objętości guza jako (długość x szerokość x wysokość x pi)/6. W każdej grupie w celu pomiaru ciężaru guza zabito 8 myszy.

Pierwszym z leków podawanych nagim myszom w celu terapii jest analog somatostatyny D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂, oznaczony tu jako „SI”.

Pierwszym z trzech antagonistów bombezyny jest D-Tpi¹-Gln²-Trp³-Ala⁴-Val⁵-Gly⁶-His⁷-Leu⁸-psi-Leu⁹-NH2, to jest BI. Drugim antagonistą bombezyny jest [Tpi⁶-Leu¹³-psi-Tpi¹⁴]Bn-(6-14), to jestD-Tpi'-Gln²-Trp³-Ala⁴-Val⁵-Gly⁶-His⁸-Leu⁸-psi-Tpi⁹-NH2, oznaczony „B2”, a trzecim antagonistą peptyd nr 2.

Mikrogranulki soli pamoesanowej SI w poli(DL-laktydo-koglikolidzie) przygotowano w Cytotech SA i zaprojektowano tak, aby z podwielokrotności 16 mg wydzielały około 100 mikrogramów/dzień przez 2 tygodnie. Mikrogranulki te wstrzykiwano podskórnie co 15 dni na stronie przeciwnej do guza. Każdy z antagonistów bombezyny rozpuszczano w 0,1% dimetylosulfotlenku w roztworze solanki i wstrzykiwano podskórnie dwa razy dziennie w dawce 20 mikrogramów/dzień.

Wpływ tej terapii lekowej na objętość guza widoczny jest w tabeli 4 i jest zilustrowany na figurze 2.

Tabela 4

Wpływ antagonistów bombezyny na objętość guza SCLC

Peptyd	Objętość guza w czasie (dni)
0	7	14	21	28	35
Kontrola	10,5 ±0,5	19,3 ± 1,4	31,6 ± 5,6	63,8 ± 10,6	142,8 ±37,5	249,7 ± 74,3
SI	9,8 ± 0,8	14,4 ± 1,5	15,8 ± 1,3	18,4 ±2,9	33,2 ± 9,0	66,0 ± 12,1
BI	11,2 ±0,8	13,3 ± 1,2	17 ± 3,4	24,7 ± 8,2	55 ± 24,5	80,2 ± 27,2
B2	10± 1,1	11,7± 1,2	14,7 ± 2,4	24,5 ± 7,9	45 ± 15	74,1 ±31,8
Peptyd nr 2	11,6 ± 1,7	7,4 ± 1,8	8,9 ±2,3	14,3 ± 6,3	19,2 ±9,4	49,0 ±21,0

180 372

Przykład IX.

Wpływ antagonistów bombezyny na guzy raka trzustki MIA PAC A-2 mierzono w sposób następujący.

Nagim myszom podobnie jak w przykładzie VIII wstrzyknięto podskórnie komórki ludzkiego raka trzustki MIA PAC A-2, pochodzące z hodowli tkankowej komórek,- namnażanych tak jak SCLC w przykładzie VIII. Objętość guza mierzono dla dwóch grup eksperymentalnych tak jak w przykładzie VIII.

Dwie grupy eksperymentalne były następujące: grupa myszy otrzymujących antagonistę bombezyny peptyd 2 oraz grupa kontrolna, otrzymująca tylko iniekcję roztworu wehikulum. Każdej myszy podawano dwa razy dziennie za pomocą iniekcji poskómej 50 pg roztworu wehikulum lub peptydu 2.

Rezultaty pomiarów objętości guza podano w tabeli 5 i zilustrowano je na figurze 3.

Tabela 5

Wpływ antagonistów bombezyny na objętość (mm ) guza trzustki MIA PACA-2

Peptyd	Objętość guza po czasie (dm)
0	7	11	15
Kontrola	45,6 ± 7,9	254,2 ± 59,8	645,1 ± 128,6	855,9 ± 145,4
Peptyd nr 2	29,8 ± 4,3	252,3 ± 98,9	427,9 ± 122,6	634,1 ± 174,0

Przykład X.

Wpływ leczenia antagonistą bombezyny na nagie myszy obarczone ludzkim rakiem trzustki CAPAN-2 jest następujący.

Nagim myszom podobnym jak w przykładzie VII podano heteroprzeszczepy ludzkiego guza trzustki CAPAN-2, otrzymane z hodowli komórkowej namnażanej jak w przykładzie VII. Myszy podzielono na dwie grupy, z których grupa kontrolna otrzymywała tylko roztwór wehikulum do iniekcji, a druga otrzymywała antagonistę bombezyny, peptyd nr 2, w ilości 50 mg dwa razy dziennie w postaci iniekcji podskórnej.

Objętość guza mierzono jak w przykładzie VIII, a rezultaty pomiarów objętości guza przedstawiono w tabeli 6 oraz zilustrowano na figurze 4.

T a b e 1 a 6

Wpływ antagonistów bombezyny na objętość (mm ) guza trzustki CAPAN-2

Peptyd	Objętość guza po czasie (dni)
0	7	14	21	28
Kontrola	21,2 ± 1,7	28,3 ±2,3	43,0 ±3,6	51,4 ±8,9	78,8 ± 16,7
Peptyd nr 2	19,7 ± 1,7	27,8 ±3,3	32,2 ±3,5	46,4 ± 3,0	50,5 ± 17,8

Chociaż wynalazek został opisany w odniesieniu do jego korzystnych postaci, należy rozumieć, że bez odchodzenia poza zakres wynalazku przedstawiony w zastrzeżeniach mogą być dokonane zmiany i modyfikacje oczywiste dla specjalisty, mającego zwykłe umiejętności w tej dziedzinie. W wynalazku można zastosować substytuty znane ze stanu techniki, które nie wpływają w sposób istotny na efektywność wynalazku.

180 372

WYKAZ SEKWENCJI (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-pGlu” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 8 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 1:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1

180 372 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 1 = D-Phe” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 8 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 2:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 1 — D-Phe” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 = MTac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 3:

180 372

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = Ac-D-Phe” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 - Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 4:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

180 372 (A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Cpa” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 8 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= Reszta 8 = zredukowany izoster Leu” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 5:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Cpa” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = MTac-NH2”

180 372 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 6: Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Nal” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 8 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga^ „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 7:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

180 372 (A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = Pal” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 8:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Pal” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2”

180 372 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 9:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWAZKLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Trp” (ix) CECHA:

(A) NAZWAZKLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 8 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu” (ix) CECHA:

(A) NAZWAZKLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 - Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 10:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd

180 372 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 - Ac-D-Trp” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 11:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 1 = Tpi” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 8 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 8 - zredukowany izoster Leu” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9

180 372 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 12:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 1 = D-Tpi” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 13:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd

180 372 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = Hca-Gln” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 7 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga— Reszta 7 = zredukowany izoster Leu” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 8 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 8 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 14:

Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga— „Reszta 1 = D-Phe” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9

180 372 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 15:

Xaa His Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Phe” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 2 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 2 = Glu(OMe)” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 16:

Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

180 372 (A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 2 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 2 = Glu[-]” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 - Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 17:

Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana

180 372 (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 1 - D-Phe” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 = DMTac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 18:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 1 - Ac-D-Phe” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 - DMTac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 19:

180 372

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 8 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga¹¹ „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 - DMTac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 20:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

180 372 (A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga^ „Reszta 1 = Tpi” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 8 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 - zredukowany izoster Leu” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = DMTac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 21:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Tpi” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = DMTac-NH2”

180 372 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 22:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 1 - Χ-Α1, gdzie Χ-Η, wiązanie pojedyncze łączące grupę alfa-aminową Al z grupą gamma-karboksylową na grupie 3propionylowej Glu gdy Res 2 =Glu; lub RICO, gdzie Rl-H, alkil Cl-10, fenylo- Cl-10 -alkil; a Al = reszta D-, L- lub DL-aminokwasu wybranego z Cpa, Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, niepodstawiony Trp lub Trp podstawiony w pierścieniu benzenowym przez jeden lub więcej F, Cl, Br, NH2 lub alkil Cl-3; lub wiązanie peptydowe łączące ugrupowanie acylowe RICO z ugrupowaniem alfa-aminowym Reszty 2 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 2 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 2 = Gin, Glu[-], Glu(Y) lub His” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9

180 372 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = A9-Q, gdzie A9 = Tac, MTac lub DMTac; a Q = NH2 lub OQ1, gdzie Q1 = H, fenyl lub fenylo-Cl-10-alkil” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 23:

Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: Zuwaga= „Reszta 1 = D-Phe” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 24:

Xaa Glu Tip Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza

180 372 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 1 = Χ-Α1, gdzie X = H lub Ac;

Al -D-Phe, L- lub D-Tpi” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 - Tac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 25:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

Al - D-Phe, L- lub D-Tpi” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 8

180 372 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 = DMTac-NH2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 26:

Xaa Gin Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 1 = Χ-Α1, gdzie X = H, wiązanie pojedyncze łączące grupę alfa-aminową Al z grupą gamma-karboksylową ugrupowania 3-propionylowego Glu gdy Res 2 = Glu; lub RICO, gdzie RI = H, alkil Cl-10, a Al = L- lub D-Pal lub L- lub D-Tpi” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 2 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 2 - Gin, Glu[-], Glu)Y) lub His” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana (B) UMIEJSCOWIENIE: 9

180 372 (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = A9-Q, gdzie A9 = Cys lub Pen; a Q = NH2 lub OQ1, gdzie Q1 = H, alkil C1 -10, fenyl lub fenylo-C 1 -10-alkil” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 27:

Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa

5

180 372

KONTROLA

TYGODNIE LECZENIA

1OOOr

O 5 10 15

DNI LECZENIA ______I

O 5 10 15 20 25 30

DNI LECZENIA

FIG. 4

180 372

unn νζηΰ ososżrao z. ^{z z}

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Peptyd, będący antagonistą bombezyny o wzorze:

X-A¹-A²-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A⁹-Q w którym

X oznacza wodór, pojedyncze wiązanie łączące grupę alfa-aminowąz A¹ z ugrupowaniem gamma-karboksylowym z ugrupowania 3-propionylowego z A?, gdy A² jest Glu, lub grupę o wzorze R’CO-, w którym R¹ oznacza wodór, C_bl0-alkil lub fenylo-Ć^o-alkil;

A¹ oznacza resztę D- lub L-aminokwasu wybranego z grupy, składającej się z Ćpa, Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierścieniu benzenowym przezjeden lub więcej element wybrany z grupy, składającej się z F, Cl, Br, NH₂lub alkilu C].3 lub peptydowe wiązanie łączące ugrupowanie acylowe R*-CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A²;

A² oznacza Gin, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie [-] oznacza wiązanie pojedyncze, gdy X jest wiązaniem pojedynczym i A² oznacza Glu, łączące ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3-propionylowego z Glu² z grupą alfa-aminową z A¹, zaś

Y oznacza resztę -OR², gdzie R² oznacza C₁.₃-alkil;

Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu, w której zamiast ugrupowania C=O występuje -CH₂, tak ze wiązanie tego ugrupowania -CH₂- z grupąalfa-aminowąsąsiedniej reszty A⁹ jest wiązaniem pseudopeptydowym;

A⁹ oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen;

Q oznacza NH₂ lub -OQ', gdzie Q’ oznacza wodór, alkil C^o, alkil C]_₁₀, fenyl lub fenylo-Cj.jo-alkil, oraz jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
2. Peptyd według zastrz. l,wktórym X oznacza wodór lub R¹ CO, gdzie R¹ oznaczaHlub alkil Cj.jo; A¹ oznacza D-Cpa, D-Nal, L- lub D-Pal, D-Phe, D- lub L-Tpi, lub D-Trp; A² oznacza Gin lub His; i Q oznacza NH₂.
3. Peptyd według zastrz 2, w którym A⁹ oznacza Tac.
4. Peptyd według zastrz. 2, w którym A⁹ oznacza DMTac.
5. Peptyd według zastrz. 3, w którym X oznacza H lub Ac, A¹ oznacza D-Phe, L- lub D-Tpi i A² oznacza Gin.
6. Peptyd według zastrz 4, w którym X oznacza H lub Ac, A¹ oznacza D-Phe, L- lub D-Tpi i A² oznacza Gin.
7. Peptyd według zastrz. 3 o wzorze

D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH₂.
8. Peptyd według zastrz. 3 o wzorze

D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2.
9. Peptyd według zastrz. 4 o wzorze

D-Phe-Gln-Trp-Ala-V al-Gly-His-Leu-psi-DMT ac-NH2.
10. Peptyd według zastrz. 1, w którym X oznacza R*CO-, A¹ oznacza wiązanie peptydowe łączące ugrupowanie acylowe z R'CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A²; A² oznacza Gin lub His; i Q oznacza NH₂.

180 372
11. Peptyd według zastrz. 10, w którym X oznacza Hca, A² oznacza Gin, a A⁹ oznacza Tac.
12. Peptyd według zastrz. 11 o wzorze

Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2-
13. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca substancję biologicznie czynną oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik ciekły lub stały, znamienna tym, że jako substancję biologicznie czynną zawiera peptyd, będący antagonistą bombezyny o wzorze:

K-A^A^Trp-Ala-Yal-Gly-His-Leu-psi-A^ę, w którym

X oznacza wodór, pojedyncze wiązanie łączące grupę alfa-aminowąz A¹ z ugrupowaniem gamma-karboksylowym z ugrupowania 3-propionylowego z A², gdy A² jest Glu, lub grupę o wzorze R‘CO-, w którym R¹ oznacza wodór, Cj.^-alkil lub fenylo-Ć|.₁₀-alkil;

A¹ oznacza resztę D- lub L-aminokwasu wybranego z grupy, składającej się z Ćpa, Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierścieniu benzenowym przez jeden lub więcej element wybrany z grupy, składającej się z F, Cl, Br, NH₂lub alkilu C lub peptydowe wiązanie łączące ugrupowanie acylowe R¹ -CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A²;

A² oznacza Gin, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie [-] oznacza wiązanie pojedyncze, gdy X jest wiązaniem pojedynczym i A² oznacza Glu, łączące ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3-propionylowego z Glu² z grupą alfa-aminową z A¹, zaś

Y oznacza resztę -OR², gdzie R² oznacza Cj^-alkil;

Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu, w której zamiast ugrupowania C=O występuje -CH₂, tak że wiązanie tego ugrupowania -CH₂- z grupą alfa-aminową sąsiedniej reszty A⁹ jest wiązaniem pseudopeptydowym;

A⁹ oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen; i

Q oznacza NH₂ lub -OQ¹, gdzie Q' oznacza wodór, alkil C].₁₀₎ fenyl lub fenylo-C_M0-alkil, lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.

* * *