PL169926B1 - Sposób wytwarzania kowalencyjnego koniugatu oligosacharydu z nosnikiem bialkowym PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents
Sposób wytwarzania kowalencyjnego koniugatu oligosacharydu z nosnikiem bialkowym PL PL PL PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL169926B1 PL169926B1 PL91291855A PL29185591A PL169926B1 PL 169926 B1 PL169926 B1 PL 169926B1 PL 91291855 A PL91291855 A PL 91291855A PL 29185591 A PL29185591 A PL 29185591A PL 169926 B1 PL169926 B1 PL 169926B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- oligosaccharide
- protein
- protein carrier
- type
- oligosaccharides
- Prior art date
Links
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 title claims abstract description 141
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 139
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 12
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 title description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 title description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 84
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 72
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 71
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 67
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N hexanedioic acid Natural products OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 30
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 19
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 claims description 17
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 claims description 17
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 11
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 11
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 11
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 11
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 11
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 11
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 11
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 9
- -1 adipic acid diester Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N boron;pyridine Chemical compound [B].C1=CC=NC=C1 NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 claims description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims description 4
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 4
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 claims description 3
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 claims description 3
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 2
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 claims description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 2
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 claims 1
- 108010000916 Fimbriae Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 101000764294 Homo sapiens Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 claims 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 claims 1
- 108700010850 rotavirus proteins Proteins 0.000 claims 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 claims 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N pyridine Substances C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 description 38
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 30
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 30
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 23
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 22
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 18
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 10
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 10
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 9
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QRBGQECYLWNGNM-UHFFFAOYSA-N di-(N-succinimidyl) adipate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1C(=O)CCCCC(=O)N1C(=O)CCC1=O QRBGQECYLWNGNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 229960004279 formaldehyde Drugs 0.000 description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 7
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 7
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 6
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000011969 continuous reassessment method Methods 0.000 description 6
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 6
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- LZZXZDMVRZJZST-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) hexanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O LZZXZDMVRZJZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 4
- 101150044687 crm gene Proteins 0.000 description 4
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- ZSNFGVQUPMRCIP-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) butanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZSNFGVQUPMRCIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001973 pneumococcal vaccines Drugs 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 2
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N adipic acid dihydrazide Chemical compound NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001727 anti-capsular Effects 0.000 description 2
- 230000003497 anti-pneumococcal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 2
- DCERVXIINVUMKU-UHFFFAOYSA-N diclofenac epolamine Chemical compound OCC[NH+]1CCCC1.[O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl DCERVXIINVUMKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 2
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 2
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000018989 iridogoniodysgenesis Diseases 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- HFVMEOPYDLEHBR-UHFFFAOYSA-N (2-fluorophenyl)-phenylmethanol Chemical compound C=1C=CC=C(F)C=1C(O)C1=CC=CC=C1 HFVMEOPYDLEHBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDFVNEFVBPFDSB-UHFFFAOYSA-N 1,3-dioxane Chemical compound C1COCOC1 VDFVNEFVBPFDSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOXOZOPLBFXYLM-UHFFFAOYSA-N 2-(4-nitrophenyl)ethanamine Chemical compound NCCC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IOXOZOPLBFXYLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001042642 Absiella Species 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000027775 Bronchopulmonary disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N D-ribitol 5-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- VAYOSLLFUXYJDT-RDTXWAMCSA-N Lysergic acid diethylamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N(CC)CC)C2)=C3C2=CNC3=C1 VAYOSLLFUXYJDT-RDTXWAMCSA-N 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 206010036242 Post vaccination syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000722234 Pseudococcus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 239000000987 azo dye Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 239000000571 coke Substances 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000006193 diazotization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 108010089616 dinitrophenol-ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229950002454 lysergide Drugs 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007248 oxidative elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229940124733 pneumococcal vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940049548 pneumovax Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000003900 succinic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- PCYCVCFVEKMHGA-UHFFFAOYSA-N thiirane 1-oxide Chemical compound O=S1CC1 PCYCVCFVEKMHGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/832—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving bacterial toxin that has modified amino acid sequence
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/807—Hapten conjugated with peptide or protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
1 . Sposób wytwarzania kowalencyjnego koniugatu oligosacharydu z nosnikiem bial- kowym, obejmujacy redukcyjne aminowanie i koniugowanie z nosnikiem bialkowym, zna- mienny tym, ze oligosacharyd zawierajacy koncowa grupe redukujaca poddaje sie redukcyjnemu aminowaniu diaminoetanem w obecnosci kompleksu boran-pirydyna, a naste- pnie otrzymany aminowany oligosacharyd poddaje sie reakcji z czasteczka obejmujaca dwie grupy funkcyjne, taka jak diester, z których jedna reaguje z koncowa grupa aktywowanego oligosacharydu, a druga z nosnikiem bialkowym. RZECZPOSPOLITA POLSKA Urzad Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kowalencyjnego koniugatu oligosacharydu z nośnikiem białkowym użytecznego przy wytwarzaniu szczepionek, które wywołują monospecyficzną i homogenną odpowiedź immunologiczną na działanie polisacharydu otoczkowego i indukują odporność przeciw przeważającej ilości serotypów Streptococcus pneumoniae, co może mieć szczególnie znaczenie jeśli chodzi o zastosowaniu w przypadku pacjentów młodocianych, ale także 1 starszych, oraz tych, u których występuje obniżenie odporności w wyniku słabości lub choroby, włączając w to np. chorych na AlDS.
Choroby powodowane przez Streptococcus pneumoniae. Pneumokok (Streptococcus pneumoniae) jest to Gram-dodatni otorbiony ziarniak, który zazwyczaj rośnie tworząc pary lub krótkie łańcuchy. W przypadku występowania w postaci dwoinek, sąsiadujące ze sobą brzegi są zaokrąglone, a końce przeciwległe lekko zaostrzone, w wyniku czego organizm ten przybiera kształt lancetowaty.
169 926
Pneumokoki można podzielić na serotypy w oparciu o kompleksy poliasacharydowe tworzące ich otoczki. Zidentyfikowano 84 serotypy za pomocą wystawienia na działanie typowo swoistej surowicy odpornościowej (test Neufelda, niem. Quellung Reaktion). Wszystkie one są dla ludzi patogenne, ale w praktyce klinicznej najczęściej spotyka się typy 1,3,4, 7, 8 i 12. Typy 6,14,19,23 często powodują zapalenie płuc oraz zapalenie ucha środkowego u dzieci, natomiast są mniej częste u dorosłych [Austrian w: Harrison’s Principles of Internal Medicine, red Petersdorf i in., wyd. X, McGraw Hill Book Co., New York, str. 918-922/1983/]. W szczególności, pneumokok jest jednym z trzech podstawowych patogenów odpowiedzialnych za zapalanie płuc, posocznicę i zapalenie opon u dzieci [McMillan w: Core Textbook of Pediatrics, red. Kaye i in., wyd. II, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, str. 498 /1982/].
Do osobników o wyższym niż przeciętne ryzyku rozwoju zakażeń wywołanych przez pneumokoki należą pacjenci z przewlekłymi chorobami ogólnoustrojowymi, takimi jak choroba serca, choroba wątroby, przewlekła choroba oskrzelowo-płucna, niewydolność nerek i choroba o charakterze nowotworowym. Osobniki takie zaleca się szczepić przeciw zakażeniu pneumokokami. W tym przeznaczeniu dostępne są 23 szczepionki zawierające polisacharydy otoczkowe pneumokoków typu 1, 2, 3, 4, 5, óB, 7F, 8, 9N, 9V 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F, które obejmują serotypy lub grupy odpowiedzialne za 90% poważnych chorób powodowanych przez pneumokoki w Stanach Zjednoczonych Ameryki i całej reszcie świata /PneumovaxR Merck, Sharpe & Dohme oraz Pnu-ImmuneR Lederle Laboratories/. Skuteczność tego rodzaju szczepionki u dzieci jest wątpliwa, ponieważ w przypadku dzieci w wieku poniżej 6 lat zdolność do odpowiedzi immunologicznej na kontakt z rozmaitymi antygenami otoczkowymi rozwija się w różnych okresach jako rezultat pewnych właściwości związanych z dojrzewaniem układu odpornościowego i ochrona może tu trwać krócej niż obserwowano u dorosłych /Harrison i in., tamże/. Aczkolwiek przyjmuje się, że względnie niewiele serotypów pneumokoków odpowiada za większość zakeżeń pneumokokami u dzieci [Gray i in., J. Infect. Disease, 140, 979-983 /1979/], to obejmują one typy w przypadku których dojrzewanie odpowiedzi, objawiającej się wytwarzaniem przeciwciał człowieka, na kontakt z użytymi jako szczepionki oczyszczonymi polisacharydami otoczkowymi, jest najwolniejsze [Anderson i Betts, Pediatrie, Infec. Dis. J., 8, S50-S53 /1989/;Borgono i in., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 157, 148-154/1978/].
Reaktywność immunologiczną u niemowląt, jeśli chodzi o kontakt z otoczkowym polisacharydem Haemophilus influenzae b, uzyskuje się za pomocą sprzężenia antygenu otoczkowego z nośnikiem białkowym, w wyniku czego otrzymuje się szczepionkę koniugatową. Sądzi się, ze skutki działania czynnika kooperującego, limfocytów T, indukowane są przez nośnik białkowy i są odpowiedzialne za wywołanie odporności [Robbins i in., w: Bacterial Vaccines, Germanier, wyd. Academic Press, New York, str. 289-316/1984/]. Patrz także: Cruse & Lewis w: Conjugate Vaccines, red. Crese & Lewis, Karger, Bazyleja, str. 1-10 /1989/. Podobne podejście do zagadnienia wykorzystuje się przy wytwarzaniu szczepionek pneumokokowych.
Różni badacze dokonują izolacji i oczyszczania nienaruszonych polimerów otoczkowych, które mogą być użyteczne w szczepionkach, względnie jako szczepionki. I tak np., w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4220717 opisano sposób wyodrębniania i oczyszczania immunologicznie aktywnego polirybozylorybitolofosforanu /PRP/ z otoczkowego polimeru H. influenzae b. Dodatkowo, w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4210641 opisuje się ekstrakty polisacharydowe z H. influenzae o pozornej masie cząsteczkowej powyżej 200000 daltonów i złożonych przede wszystkim z galaktozy, glukozy i mannozy, z zawartością niewielkiej ilości osamin.
Te i inne nienaruszone polimery otoczkowe wykorzystuje się w szeregu badań w preparatach, w celu uzyskania lepszych odpowiedzi immunologicznych. I tak np., w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4196192 ujawniona jest szczepionka zawierająca oczyszczony nienaruszony PRP oraz preparat szczepionki zawierający całe komórki Bordetella pertussis. Takie podejście zmierzające do zwiększenia immunogenności doprowadziło w rezultacie do podwyższenia poziomu przeciwciał przeciw PRP i przeciwkrztuścowych u młodych ssaków.
Nośniki białkowe mogą dokonać czegoś więcej niż samo tylko wzmożenie immunogenności koniugowanych polimerów otoczkowych: mogą one także uczynić immunogen4
169 926 nymi hapteny. Haptenami nazywa się cząsteczki, które mogą swoiście wiązać się z przeciwciałem lub receptorem limfocytowym, jednakże same z siebie nie mogą indukować odpowiedzi immunologicznej /to jest nie są immunogenne/. Aby wywołać odpowiedź immunologiczną, małe /o małej masie cząsteczkowej, albo słabo immunogenne cząsteczki, nazywane haptenami, muszą, na ogół, wpierw zostać przyłączone do większej cząsteczki czyli nośnika, którym zazwyczaj jest białko heterologiczne. Wstrzyknięcie kompleksu hapten-białko zwierzęciu powoduje wytworzenie przez limfocyty B przeciwciał, przy czym niektóre z nich są zdolne do specyficznego wiązania się z cząsteczką wolnego, nie sprzężonego haptenu.
Wśród haptenów najwcześniej podanych badaniu znajdowały się związki azowe, takie jak barwniki azowe, np. anilina i kwas o-aminobenzoesowy. Landsteiner i Lampl [Z. Immun. Forsch., 26, 293 /1918/] dokonali sprzężenia tych związków, na drodze diazowania, z białkami surowicy. Króliki, którym wstrzyknięto te sztucznie wytworzone azoproteiny, rozwijają wytwarzanie przeciwciał precypitujących, które okazały się swoiste wobec przyłączonych ugrupowań chemicznych.
Innymi przykładowymi związkami o charakterze haptenów są : dinitrofenol, który staje się immunogenny po przyłączeniu jako grupa dinitrofenylowa /DNP/ do albuminy surowicy bydlęcej lub do gamma-globuliny bydlęcej /BGG/ oraz dietyloamid kwasu lizergowego. Wykazano, że także i formaldehyd zachowuje się jak hapten. Osoby wystawione na działanie par formaldehydu, czy to pochodzących z produktów, czy w laboratorium, zostały uczulone na ten związek w następstwie in vivo formylowania ich endogennych makrocząsteczek.
Zachowywanie się jak hapten nie jest ograniczone do małych cząsteczek organicznych. Hormony polipeptydowe, aż do rozmiarów insuliny, są często słabo, jeśli w ogóle, immunogenne. Stąd też, aby uzyskać wysokie miano przeciwciała dla tych hormonów, niezbędne jest przyłączenie ich do cząsteczki służącej za nośnik, względnie utworzenie cząsteczek większych za pomocą zsieciowania ze sobą wielu tego rodzaju polipeptydów.
Zaangażowanie cząsteczki służącej za nośnik budzi szczególne zainteresowanie z tego powodu, że nośnik pełni funkcję szerszą niż czysto transportową. Ovary i Benaceraff [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 114, 723 /1963/] wykazali to za pomocą wstrzykiwania królikom DNP-BCG. Wstrzyknięcie szeregu substancji immunogennych zwierzętom spowoduje powstanie u nich immunologicznej pamięci ekspozycji. Gdy później dokonane zostanie drugie wstrzyknięcie, wystąpi w wyniku tego o wiele bardziej energiczna odpowiedź immunologiczna. I rzeczywiście, gdy Ovary i Benaceraff wstrzyknęli ponownie DNP-GBCG, wystąpiła silna, wtórna odpowiedź, co doprowadziło do znacznie podwyższonego poziomu przeciwciał skierowanych zarówno przeciw DNP i BCG. Jednakże, gdy drugiego wstrzyknięcia dokonano z użyciem DNP-albumina jaja kurzego, zaobserwowano o wiele słabszą odpowiedź polegającą na wytworzeniu przeciwciała przeciw DNP. Ta różnica w odpowiedziach wynika z tego, co nazywa się efektem nośnikowym i jak się wydaje angażuje limfocyty T.
Wstępne rozeznanie wskazuje na to, że dla danego haptenu nie wszystkie białka mogą być jednakowo efektywnymi nośnikami białkowymi. Robbins i in. /Infect. Immun., 40, 245-256/ przedstawili dane dotyczące szepionek doświadczalnych zawierających koniugat białko-polisacharyd, w których ten sam hapten polisacharydowy skoniugowany był z rozmaitymi nośnikami białkowymi. Odpowiedź na hapten polegająca na wytworzeniu przeciwciała określono ilościowo. Zanotowano znaczne różnice w ilości powstałego przeciwciała przeciw haptenowi, co wskazuje na podstawową rolę nośnika.
Jeśli chodzi, w szczególności, o szczepionki pneumokokowe, Lin i Lee [Immunology, 46,333 /1982/] badali odpowiedzi immunologiczne u dorosłych i młodych myszy eksponowanych na polisacharydy typu 6 A i 19F jak również 19F skoniugowanego z białkiem. Zaobserwowano indukowanie wyraźne wyższego miana przeciwciał IgM i IgG2 u myszy otrzymujących koniugaty polisacharyd 19F-białko, aniżeli w grupie kontrolnej otrzymującej sam tylko polisacharyd 19F.
Badano koniugowanie polimerów otoczkowych z nośnikami białkowymi usiłując doprowadzić do wzmożenia tworzenia przeciwciał na zasadzie t. zw. efektu nośnikowego. I tak np., Schneerson i in. [Journal of Experimental Medicine, 152, 361-376 /1980/] opisują koniugaty polimer z H. influenzae b - białko ujawniając, że nadają one odporność na choroby inwazyjne powodowane przez H. influenzae b. W publikacji tej dokumentuje się związany z wiekiem behawior immunologiczny polimerów otoczkowych u niemowląt i poszukuje przezwyciężenia
169 926 tej zależności od wieku na drodze koniugowania nienaruszonego polimeru otoczkowego z szeregiem rozmaitych białek, włączając w to albuminy surowicze, hemocyjaninę Limulus polyphemus i toksynę błoniczą. W metodzie koniugowania wykorzystuje się zastosowanie łącznika, takiego jak dihydrazyd kwasu adypinowego.
Geyer i in., [Med. Microbiol. Immunol., 165, 171-288 /1979/] otrzymali koniugaty pewnych fragmentów polisacharydu otoczkowego Klebsiella pneumoniae z łącznikiem nitrofenyloetyloaminowym na drodze aminowania redukcyjnego, po czym przeprowadzony w pochodną cukier łączony był z białkiem wiązaniem azowym.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4057685 złożonym 9 maja 1974, Mclntire donosi o liposacharydzie Escherichia coli o zmniejszonej toksyczności związanym kowalencyjnie z antygenem białkowym na drodze reakcji z halogenkiem halogenoacylu.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4356170, złożonym 27 maja 1981, wydanym 26 października 1982, Jennings i in. donoszą o otrzymaniu koniugatów polisacharyd - białko na drodze aminowania redukcyjnego.
Anderson [Infection and Immunity, 39, 233-238 /1983/] donosi o koniugatach utworzonych przez oligosacharydy wywodzące się z polisacharydu otoczkowego Haemophilus influenzae typ b i CRM197, nietoksyczny, ale antygenowo identyczny wariant toksyny błoniczej.
Snippe i in [Infection and Immunity, 42, 842-844 /1983/] donoszą o półsyntetycznej szczepionce przeciw Streptococcus pneumoniae typ 3, w której heksasacharyd wyizolowany z produktu częściowej hydrolizy kwasowej polisacharydu otoczkowego S3 był sprzęgany ze stearyloaminą na drodze aminowania redukcyjnego, a następnie włączony do liposomów. Zauważono, że otrzymana szczepionka typu koniugat/liposom indukowała u myszy odpowiedź ochronną na S. pneumoniae typ 3.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4663160, złożonym 14 marca
1983, wydanym 5 maja 1987, Tsay i in. donoszą o bakteriach, w których pozbawiony toksyczności polisacharyd z bakterii Gram-ujemnych jest kowalencyjnie sprzężony z pozbawionym toksyczności białkiem tego samego gatunku bakterii Gram-ujemnych, z zaangażowaniem ugrupowania zawierającego 4-12 atomów węgla.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4619828, złożonym 5 stycznia
1984, wydanym 28 października 1986, Gordon donosi o koniugatach cząsteczek polisacharydu z bakterii chorobotwórczych takich jak Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis i Escherichia coli, z antygenami zależnymi od komórek T, takimi jak toksoidy błonicze i tężcowe.
Są też doniesienia Andersona i Clementsa w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4808700, złożonym 10 sierpnia 1984, wydanym 28 lutego 1989, oraz Andersona w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4761283, złożonym 28 marca 1986, wydanym 2 sierpnia 1988, o kowalencyjnym połączeniu fragmentów polimeru otoczkowego z bakteryjnymi toksynami, toksoidami lub podjednostkami wiążącymi, na drodze aminowania redukcyjnego.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4711779, złożonym 2 lipca 1986, wydanym 8 grudnia 1987, Porro i in. donoszą o szczepionkach z koniugatem glikoproteiny, trójwartościowej aktywności immunogennej, obejmujących determinanty antygenowe z polisacharydów otoczkowych z bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, jak również albo CRM197, albo toksoid tężcowy lub toksynę błoniczą.
Wytwarzanie szczepionek stanowiących koniugat, w których hapteny będące polisacharydami otoczkowymi związane są z nośnikiem białkowym, wymaga posłużenia się następującym sposobem postępowania:
/i/ należy otrzymać polisacharyd otoczkowy; /ii/ jeżeli ma być użyty jedynie fragment polisacharydu, należy go wyodrębnić z polisacharydu nienaruszonego; /iii/ polisacharyd trzeba zaktywować, względnie należy uczynić go zdatnym do koniugowania, to znaczy należy utworzyć ugrupowania zdolne do kowalencyjnego wiązania się z białkiem, oraz /iv/ polisacharyd należy skoniugować z białkiem.
Różne, znane w tej dziedzinie metody realizacji tych czterech stadiów wyszczególnione są w poniższej tabeli 1.
169 926
Tabela 1
| Koniugacja z białkiem | Aminowanie redukcyjne z użyciem cyjanotrihydroboranu | /i/ Ugrupowane zawiejyJcee 4-12 atomów węgh przylączoee do biakaa w obecności środka kondensującego, npi karbodiimidu /I/i Polisacharyd przylączoyy do biał- ka przeprowadzoneoo w pochodną z użyciem ugrupowania zawierającego 4 - D atomrów węgta na drodee reakcji z udziaiem zasady Schiffai w obec- ności środka redukującegOi npi cyjano trihydroboranu | *Koniugownyy poprzez mzsiekpraeyłs- żenio\yy 4-8 atoirów węgla, jak w przypadku pochodnja białka stworzonya z hydjarye^em kwasu adypinowego | poprzez amino wadę reduk- cyjne w obecnośca ryjanotrihddΓoboranu /okoto 2-3 tygodni/ | Kzniugownyy z CRM 197 w buforze fzsfojazówem przy użyriu cyyanztriCd- yrotz)jauu szyowegOi w ciągu 18 dnia w temperami-ee 37°C. | |
| Aktywacja polisacharydu | Użyto kwasunadjodowegoooutworzenia grup aldehydowych | Użyto kwasu nadjodoweoo do utworzerna grup aldehydowych | *Bromek cyjanu | Stosie się szeegg różnych metod w celu wytwarzana fragmnntów antygenowych z co najmniya jeddyin końeem redukującym-ta taktoh jak npa ograniczone rozszrzepienie utlemąjące z użyiem! nayyzdanUi CddI^tliiaa z zastoszwnniem glikozyda2 albo Cydroiiaa kwasowa | Hydroliza kwasowa w OJ N HCl w ciągu 10 minu, w temp^eiraurzee 100oC, w celu utworzema fragmnntow redukujących | |
| Rozszczepienie polisacharydu | m | Polisachayydy doprowadzoee na drodze obróbki ciepła do wielkości cząsteczkk od 200000 do 2000000 daltonów. | ||||
| Otrzymywanie polisacharydu | CM | ’Όβηΐ^ type 6Aa EH Lilly Co. | ||||
| Odnośnik | — | Opśa patentowy Stanów Zjednoczonych Ameiyki na 4356100 Jenningsa, zlozony 27 mćija 19811 wydany 25 paździemika 1982. | Opśa patentowy/ Slanww Zjednoczonych Ameryki na 4663100 Tsay’a i in, złożony 14 marca 1983i wydany 5 mnaa 1987. | Opśa patentowy/ Stanww Zjednoczonych Ameryku na 4619828 Gordona, . złożony 5 styczna 1984·. wydany 28 paźyziemlka 1986. | Opśa patentowy Stantów Zjednoczo nych Ameryka na 4808700i Andersona i Clementsaa ztożody 10 sierpma 1984, wydayy 28 lutego 1989. | Roayzial 6.5 powyżazeoo opisu zatytutownyy Koniugacla fragmento polmeem otoczkowego Streptococcua pneumoniee z CRM 197 |
CRM197
169 926
Ο
Γ*Ί
1)
Ο.
Ε ο
£ .Ξ rs}
C3 Ο £ ° Ο (Λ Ο\ C3 Γ<Ί £ 3 60 OT
- £ 2υ κ 2 ® Ł ΐ£ tTg;
£
Ό C « c £ £?
x οο σ\ ω <£
Ł-S
S. ο Λτ Ο υ cm r<
c σ\ ο — '3 .2 ~ .§ - Ξ
Οΰ
C °ο «
7λ c §-§ y r
Ο
C
Ο(Λ υ
υ ο
οο < χ cu u Ο 5 .2 'LC rg o •o E O 3
169 926
Sposób według wynalazku polega na aminowaniu oligosacharydu dwuaminoetanem w obecności boranu-pirydyny i następnie sprzęganie (koniugowanie) zaminowanego oligosacharydu z nośnikiem proteinowym (białkowym), najpierw poprzez reakcję zaminowanego oligosacharydu z cząsteczką mającą dwie funkcjonalne grupy takie jak dwuester, a następnie reakcję aktywowanych oligosacharydów z nośnikiem białka.
Nowość niniejszego wynalazku polega na użyciu dwuaminoetanu do aminowania komponentów oligosacharydu (nie nośnika białka) i do zastosowaniajego w połączeniu z czynnikiem takim jak dwuester, do utworzenia koniugatów.
Zastosowanie reagenta dwuestrowego w sprzęganiu z dwuaminoetanem prowadzi do takiej reakcji sprzęgania, która pozwala na efektywną syntezę glikokoniugatów, zwłaszcza gdy chodzi o szybkość i wydajność, co stanowi znaczące ulepszenie w stosunku do opatentowanych metod. Jak wynika z tabeli 2 opisu, ta ulepszona metoda wymaga 12-26 dni mniej czasu do zakończenia procesu, niż ujawniono we wcześniej znanych sposobach. Jak wykazano w opisie, użycie dwuaminoetanu do aktywowania oligosacharydu pozwala, aby reakcja przebiegała w wyższych temperaturach, które zapewniają maksimum reaktywności końcówek redukujących reszt monosacharydu obecnych w strukturze oligosacharydu.
W istocie, w temperaturze 100°C forma otwartego pierścienia monosacharydu (jednocukru) jest jednostką daleko bardziej wydajną (w porównaniu z niereaktywną formą zamkniętego pierścienia) i to przyczynia się do nadzwyczajnej efektywności reakcji (> 70% mol/mol). Fakt, że reakcja może przebiegać w tak wysokich temperaturach jest zdumiewający, gdyż aminowanie redukujące dla cukrów (i węglowodanów) w temperaturze wyższej niż 37°C, jest generalnie traktowane jako zabieg mający zniszczyć lub zmodyfikować chemiczną i antygenową strukturę składowych monosacharydów.
Zastosowanie sposobu według wynalazku prowadzi nieoczekiwanie do wysokiej wydajności aktywowania i całkowitego utrzymania antygenowej aktywności oligosacharydów. Dwuaminoetan stosowany w sposobie według wynalazku w celu otrzymania pochodnych (z wysoką wydajnością) oligosacharydów, a nie nośnika białkowego, który wymagałby całkowicie różnej reakcji jest także zupełnie nieoczekiwane w świetle stanu techniki.
Połączone zastosowanie dwóch czynników wiążących nie wynika ze stanu techniki, natomiast gwarantuje ulepszony sposób wytwarzania glikoniugatu, mogący mieć zastosowanie na skalę przemysłową.
Redukujące aminowanie w temperaturze 37°C daje wydajność amino aktywowanego oligosacharydu rzędu 20-25%, podczas gdy czynnik wiążący jakim jest dwuaminoetan gwarantuje 70% lub większą wydajność (tabela 2), i pozostaje taką samą po reakcji z drugim czynnikiem wiążącym (ester bisimidylobursztynowy kwasu adypinowego).
Wynalazek dotyczy kowalencyjnego przyłączenia oligosacharydów wywodzących się z bakteryjnych polisacharydów otoczkowych do nośników białkowych z wykorzystaniem nowego sposobu.
Sposób ten umożliwia wydajną syntezę glikokoniugatów przy szybkości wytwarzania znacznie większej niż w przypadku metod obecnie stosowanych. Glikokoniugaty wytwarzane sposobem według wynalazku można użyć w preparatach szczepionek i wykazano, że są one immunogenne.
W konkretnym wariancie sposobu realizacji wynalazku, dotyczy on wytwarzania glikokoniugatów, w skład których wchodzą oligosacharydy wywodzące się z polisacharydów otoczkowych Streptococcus pneumoniae. Sposobem według wynalazku skutecznie wytwarza się z wysoką wydajnością glikokoniugaty pochodzące od S. pneumoniae, których można użyć w preparatach szczepionek szczególnie nadających się do stosowania w pediatrii, gdzie znaczna część głównych chorób związana jest z zakażeniem S. pneumoniae. Stwierdzono, że koniugaty immunogenne mniej są zależne od wieku, aniżeli same tylko polimery otoczkowe, oraz, że są one użyteczne jeśli chodzi o uodpornienie czynne bardzo młodych ssaków ciepłokrwistych przeciw zakażeniom ogólnoustrojowym spowodowanym przez odpowiednie otorbione bakterie.
Jak następnie nieoczekiwanie stwierdzono, glikokoniugaty wytwarzane sposobem według wynalazku wywołują monospecyficzną i homogenną odpowiedź immunologiczną, która, korzy169 926 stnie pozwala uniknąć zajścia reakcji autoimmunologicznych i pokrewnych zespołów poszczepiennych.
Jest rzeczą ważną, że immunogenne koniugaty wytwarzane sposobem według wynalazku nie zawierają potencjalnie toksycznych czynników wiążących, takich jak dihydrazyd kwasu adypinowego lub p-nitrofenyloetyloamina, używanych przy koniugowaniu węglowodanu z białkiem.
Skróty i określenia.
CRM97 : nietoksyczne białko dające antygenową reakcję krzyżową z toksyną błoniczą
DMSO : sulfotlenek dimetylowy
DP : stopień polimeryzacji
MIC , najmniejsze stężenie hamujące
SD , stopień podstawienia
SIDEA : ester disukcynoimidylowy kwasu adypinowego
SIDES : ester disukcynoimidylowy kwasu bursztynowego.
Krótki opis figur.
Figura 1. Ogólna strategia syntezy koniugatów oligosacharyd-białko.
A. Polisacharyd wielkocząsteczkowy poddaje się hydrolizie kwasowej, w wyniku czego uzyskuje się oligosacharydy o średniej masie cząsteczkowej 2,5 x 103.
B. Oligosacharydy /1/ poddaje się aktywacji za pomocą poddania ich reakcji z diaminoetanem [H2N/CH2/2NH2] w pH 9, następnie redukcji z użyciem kompleksu boran-pirydyna, a potem /2/ poddaje się reakcji z estrem disukcynoimidylowym kwasu adypinowego /SIDEa w sulfotlenku dimetylowym /DMSO/.
C. Aktywowane oligosacharydy sprzęga się z nośnikiem białkowym poprzez reszty lizyny.
Figura 2. Użycie sporządzonego na miarę przedłużacza w reakcji sprzęgania.
A. Glikokoniugat utworzony według wcześniejszej metody jak opisali Porro i in. [Mol. Immunol., 22, 907-919 /1985/], z wiązaniem amidowym /strzałka/ między oligosacharydem a czterowęglowym łącznikiem wywodzącym się z kwasu adypinowego. Całkowita długość przedłużacza wynosi około 1,04 nm.
B. Glikokoniugat utworzony sposobem według wynalazku, w którym dwuwęglowa reszta /strzałka: utworzona przez diaminoetan/, oraz wiązanie amidowe, występuje między oligosacharydem a dwuwęglowymi łącznikami wywodzącymi się z kwasu bursztynowego utworzonymi na drodze reakcji z SIDES. Całkowita długość przedłużacza wynosi około 1 nm.
C. Glikokoniugat utworzony sposobem według wynalazku, w którym dwuwęglowa reszta /strzałka; utworzona przez diaminoetan/, oraz wiązanie amidowe występuje między oligosacharydem a czterowęglową resztą wywodzącą się z kwasu adypinowego utworzoną na drodze reakcji z SIDEA. Całkowita długość przedłużacza wynosi około 1,45 nm.
Figura 3. Wydajność koniugowania CRM197 z aktywowanymi oligosacharydami zawierającymi przedłużacze stanowiące pochodne kwasu adypinowego, względem oligosacharydów zawierających przedłużacze stanowiące pochodne kwasu bursztynowego. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylosodowym produktów reakcji koniugacji /barwienie srebrowe/.
A. Ścieżka 1 : Wzorce masy cząsteczkowej /92,,5 K, 66,2 K,, 45,0 K, 31,0K,21,5 IK. Ścieżka 2 : CRM1197 /1gg/ jako odnośnik.
Ścieżka 3 : Koniugowany oligosacharyd 6A-CRM197 z’ kwasem bursztynowym jako przedłużaczem /2gg/ /stosunek 1:1 - monoester/całość grup aminowych CRMI197, w 50% DMSO/.
Ścieżka 4 : Koniugowany oligosacharyd 6A-CRM197 z kwasem bursztynowym jako przedłużaczem /2gg/ /stosunek 1:2 - monoester/całość grup aminowych CRMI197, w 50% DMSO/.
Ścieżka 5 : Koniugowany oligosacharyd 6A-CRM197 z kwasem adypinowym jako przedlużaczem/2gg//stosunek 1:2 monoester/całość grup aminowych CRM97, w 50% DMSO/.
Ścieżka 6: Koniugowany oligosacharyd 14-CRM197 z kwasem bursztynowym jako przedłużaczem /2 μg//stosunek 1:4 monoester/całość grup aminowych CRM 197, w 50% DMSO/.
169 926
Ścieżka 7: Koniugowany oligosacharyd 19F-CRMi97 z kwasem bursztynowym jako przedłużaczem /2gg//stosunek 1:4 monoester/całość grup aminowych CRMI197, w nieobecności 50% DMSO/.
Ścieżka 8: Koniugowany oligosacharyd 23F-CRM197 z kwasem bursztynowym jako przedłużaczem /2 gg//stosunek 1:2 monoester/całość grup aminowych CRM197, w 50% DMSO/.
Ścieżka 9 : CRM197 /1gg/jako odnośnik.
B. Ścieżka 1 : CRM 197 /1gg/ jako odnośnik.
Ścieżka 2 : CRM 197 /1 pg/ jako odnośnik /inna seria, w porównaniu do ścieżki 1/.
Ścieżka 3 : Koniugowany oligosacharyd 23 F-CRM197 z kwasem adypinowym jako przedłużac:»em/2gg//stosunek 1:2 monoester/całość grup aminowych CRM 197, w 50% DMSO/.
Ścieżka 4 : Wzorce masy cząsteczkowej /92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K/.
Ścieżka 5 : Koniugowany oligosacharyd 23 F-CRM 197 z kwasem adypinowym jako przedłużaczem/2gg//stosunek 1:2 monoester/całość grup aminowych CRM 197, w 50% DMSO/.
Ścieżka 6 : CRM 197 /1gg/ jako odnośnik /inna seria, w porównaniu ze ścieżką 1/.
Ścieżka 7 : Koniugowany oligosacharyd 6A-CRM97 z kwasem adypinowym jako przedłużaczem /2gg/.
C. Ścieżka 1 : Wzorce masy cząsteczkowej /92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K/.
Ścieżka 2 : CRM 197 /1gg/jako odnośnik.
Ścieżka 3 : Koniugowany oligosacharyd 6A-CRM197 z kwasem adypinowym jako przedłużaczem /2 gg/.
Ścieżka 4 : Koniugowany oligosacharyd 14-CRM197 z kwasem adypinowym jako przedłużaczem /2 gg/.
Ścieżka 5 : Koniugowany oligosacharyd 19F-CRM197 z kwasem adypinowym jako przedłużaczem /2 gg/.
Ścieżka 6 : Koniugowany oligosacharyd 23F-CRMi97 z kwasem adypinowym jako przedłużaczem /2 gg/.
Ścieżka 7 : Wzorce masy cząsteczkowej /92, 5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K/. Figura 4. Odpowiedź IgG królika na działanie koniugatów oligosacharyd S. pneumoniae
6A-CRM 197. Badanie techniką zahamowanie-ELISA wartości powinowactwa indukowanego izotypu IgG do polisacharydów otoczkowych.
A. Polisacharyd otoczkowy typ 6A.
B. Oligosacharyd typ 6A /DP = 10/ w postaci wolnej lub skoniugowany z CRMI97.
C. Oligosacharyd typ 14 /DP = 12/ aktywowany przez przedłużacz cząsteczkowy lub koniugowany z CRM197·
Wynalazek dotyczy kowalencyjnego przyłączenia oligosacharydów wywodzących się z otoczkowych polisacharydów bakteryjnych do nośników białkowych. Sposobem według wynalazku otrzymuje się glikokoniugaty z zastosowaniem nowego procesu wytwarzania.
Dla większej jasności opisu, ale nie ograniczając zakresu wynalazku, szczegółowy opis wynalazku podzielony został na następujące rozdziały.
/i/ Otrzymywanie oligosacharydów.
/ii/ Aktywacja oligosacharydów.
/iii/ Koniugowanie oligosacharydów z białkiem.
/iv/ Immunochemiczna charakterystyka glikokoniugatów.
NI Formułowanie szczepionki i jej podawanie.
/vi/ Użyteczność szczepionek przeciwpneumokokowych zawierających koniugaty oligosacharydów.
Wielkocząsteczkowy polisacharyd otoczkowy można nabyć w handlu /American Type Culture Collection /ATCC/, Rockville, MD/, względnie otrzymać z wykorzystaniem metod opisanych przez Porro i in. [J. Biol. Stand., 11, 65-71 /1983/]. Użyć tu można jakiegokolwiek polisacharydu, włącznie /ale bez ograniczania się jedynie do nich/ z polisacharydami występującymi w otoczkach Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Gryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa.
169 926
Fragmenty antygenowe zawierające co najmniej jeden koniec redukujący można wytworzyć z polimerów otoczkowych różnymi sposobami, w zależności od cech strukturalnych poszczególnych polimerów otoczkowych. Ograniczone rozszczepienie utleniające z użyciem nadjodanu /lub zbliżonych odczynników/ doprowadzi do pozostawienia zakończeń aldehydowych. Takie podejście do zagadnienia ograniczone będzie do polimerów o wicynalnych grupach dihydroksylowych przy reszcie niecyklicznej. W wyniku hydrolizy wiązania glikozydowego otrzymuje się koniec w postaci cukru redukującego. Hydrolizy takiej w sposób najbardziej specyficzny można dokonać na drodze enzymatycznej z użyciem glikozydaz, jednakże takie ich zastosowanie ograniczone będzie do względnie niewielu polimerów otoczkowych, np. Streptococcus pneumoniae 8, dla których glikozydy są znane. Dla dokonania hydrolizy wiązań glikozydowych najczęściej przeprowadza się hydrolizę kwasową. To z kolei podejście ulegnie ograniczeniu wtedy, gdy polimer zawiera wrażliwe na działanie kwasu wiązania nieglikozydowe, albo jeżeli polimer zawiera wrażliwe na działanie kwasu wiązania boczne, ważne pod względem specyficzności antygenowej.
W konkretnym wariancie sposobu według wynalazku, polisacharyd otoczkowy S. pneumoniae typ 6A poddaje się hydrolizie w około 10’2 M kwasie octowym, w temperaturze około 100°C w ciągu około 30 godzin; polisacharyd otoczkowy S. pneumoniae typ 14 poddaje się hydrolizie w około 0,5 M kwasie trifluorooctowym w temperaturze około 70°C w ciągu około 7 godzin; polisacharyd S. pneumoniae typ 19F poddaje się hydrolizie w około 10‘2 M kwasie octowym w temperaturze około 50°C w ciągu około 48 godzin; oraz polisacharyd S. pneumoniae typ 23F poddaje się hydrolizie w około 0,25 M kwasie trifluorooctowym w temperaturze około 70°C, w ciągu około 3 godzin.
Oligosacharydy, które mają zostać skoniugowane z białkiem sposobem według wynalazku korzystnie złożone są z 3-6 jednostek powtarzalnych /albo z około 10-30 reszt monosacharydowych/, a korzystniej złożone są z 3-4 jednostek powtarzalnych /albo około 15 reszt monosacharydowych/, gdyż stwierdzono, że jako oligosacharydy o tej właśnie długości po włączeniu do glikokoniugatów, są w sposób optymalny immunogenne.
Oligosacharydy można zaktywować na drodze reakcji aminowania redukcyjnego, po którym następuje reakcja z cząsteczką dwufunkcyjną, taką jak diester. Zarys tego sposobu według wynalazku przedstawiono na fig. 1 oraz w tabeli 2, w której porównano sposób według niniejszego wynalazku ze sposobem opisanym przez Porro i in. [Mol. Immunol., 22, 907-919 /1985/]. Należy zauważyć, że czas aktywowania w przypadku poprzedniej metody wynosił 7-14 dni. W sposobie według wynalazku czas ten uległ skróceniu do 15 minut. Także, należy zauważyć, że czas redukcji w poprzedniej metodzie wynosił 7-14 dni, a w sposobie według wynalazku został skrócony do 48 godzin. Zgodnie z tym, sposób według wynalazku wymaga do przeprowadzenia całości procesu 12-26 dni mniej niż metoda dotychczasowa. Oznacza to ważną korzyść ze względu na to, że poddanie węglowodanów działaniu podwyższonej temperatury, takiej jak np. 50°C, może prowadzić do ich rozkładu.
Tabela 2
Chemiczna aktywacja jednostki oligosacharydów S pneumoniae z redukującym końcem
| Parametry | Metoda dotychczasowa | Sposób według wynalazku |
| 1 | 2 | 3 |
| Grupa wprowadzana Odczynnik /pH/ Temperatura aktywacji Czas aktywacji Odczynnik redukujący Temperatura redukcji Czas redukcji Otrzymany produkt | NH2 Bufor amoniakalny /9/ 50°C 7-14 dni Cyjanotrihydroboran sodowy 50°C 7-14 dni Oligo-NH2 | NH/CH 2/ 2NH 2 Diaminoetan /9/ 100°C 15 minut Kompleks boran-pirydyna 50°C 48 godzin Oligo-NH/CH2/2NH2 |
169 926
c. d .tabeli2
| 1 | 2 | 3 |
| Aktywujący przedłużacz dwufunkcyjny Temperatura reakcji Czas reakcji Otrzymany produkt Wydajność reakcji | SIDEA /ester disukcynoimidylowy kwasu adypinowego/ 25°C 4 godziny Oligo-NH-monoester 25-30% | SIDES lub SIDEA /ester disukcynoimidylowy kwasu bursztynowego lub adypinowego/ 4°C 2 godziny Oligo-NH/CH 2/ 2NH-monoester 70% |
Sposobem według wynalazku, aminowania redukcyjnego jednostki oligosacharydu z końcem redukującym dokonuje się przy wykorzystaniu cząsteczki zawierającej dwie grupy aminowe. W korzystnym wariancie sposobu według wynalazku, aminowanie redukcyjne przeprowadza się za pomocą poddania danej ilości moli oligosacharydu reakcji z diaminoetanem, użytym w 10-krotnym nadmiarze, w 0,2 M roztworze KH2PO4, w pH około 9, w temperaturze około 25- 100°C, korzystnie w temperaturze 100°C, w ciągu około 1-60 minut, korzystnie w ciągu około 15 minut. Po tym, dodaje się kompleks boran-pirydyna w ilości molowo równoważnej 25 molowemu stężeniu oligosacharydu w preparacie i reakcję prowadzi się w temperaturze w zakresie około 25-100°C, korzystnie w temperaturze około 50°C, w ciągu około 1-72 godzin, korzystnie w ciągu około 48 godzin.
Następnie otrzymany produkt aminowania redukcyjnego poddaje się reakcji z cząsteczką dwufunkcyjną, której każda grupa funkcyjna jest zdolna do reakcji z każdą z końcowych grup aminowych aktywowanego oligosacharydu oraz grup aminowych występujących w strukturze nośnika białkowego tak, że cząsteczka dwufunkcyjną może służyć do połączenia ze sobą oligosacharydu i nośnika białkowego. W korzystnym wariancie, grupę dwufunkcyjną jest diester, a w szczególności diester kwasu adypinowego, co do którego stwierdzono, że jest on związany ze skuteczniejszym glikozylowaniem białka. W korzystnym, konkretnym wariancie sposobu według wynalazku, oligosacharyd, który poddano aminowaniu redukcyjnemu sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu, poddaje się dalej reakcji z estrem disukcynyloimidylowym kwasu bursztynowego lub, korzystniej, kwasu adypinowego. Reakcję tę, najlepiej, przeprowadza się z użyciem aminowanego oligosacharydu, zastosowanego w stężeniu molowym /w przeliczeniu na grupy aminowe/ równoważnym około 1/5 molowego stężenia SIDEA /lub SIDES/, w roztworze w sulfotlenku dimetylowym /DMSO/ w temperaturze około 0-25°C, a korzystnie w temperaturze około 4°C w ciągu około 0,5-5 godzin i korzystnie około 2 godzin. Aktywowany oligosacharyd wyodrębnia się za pomocą wytrącenia z użyciem 1,4-dioksanu /80% obj/obj/, z pozostawieniem w supernatancie nadmiaru SIDEA /lub SIDES/.
Do białek, które można wykorzystać w sposobie według wynalazku, należy dowolne białko bezpieczne, jeśli chodzi o podawanie młodym ssakom i które może służyć jako immunologicznie skuteczny nośnik białkowy. W poszczególnych wariantach sposobu według wynalazku można użyć białek powierzchniowych komórki, białek błony, toksyn i toksoidów. Do kryteriów bezpieczeństwa należy nieobecność pierwotnej toksyczności i minimalne ryzyko reakcji alergicznej. Kryteria te spełniają toksoidy błoniczy i tężcowy, co oznacza, że jeżeli zostały otrzymane w sposób właściwy, są nietoksyczne, a częstość reakcji alergicznych jest dopuszczalnie niska. Aczkolwiek ryzyko wystąpienia reakcji alergicznej może być znaczne w przypadku osób dorosłych, to jednak u niemowląt jest minimalne. W dodatkowych korzystnych wariantach sposobu według wynalazku, do stosownych nośników białkowych należą /ale bez ograniczania się jedynie do nich/flagelina Salmonella, pilina Haemophilus, białko błony Haemophilus 15 kDa, 28-30kDa i 40 kDa, ciepłochwiejna enterotoksyna LTB Escherichia coli, toksyna przecinkowca cholery i białka wirusowe włącznie w białkami rotawirusa VP7 i wirusa oddechowego F i G.
W efekcie nośnikowym słaby antygen, dzięki przyłączeniu do silniejszego antygenu jako nośnika /to jest do białka heterologicznego/ staje się bardziej immunogenny niż gdyby występował sam. Gdy zwierzę zostało uprzednio uodpornione samym tylko nośnikiem,
169 926 może ono zostać napiętnowane i dawać wzmocnioną odpowiedź immunologiczną nie tylko na antygen nośnikowy, ale także na przyłączone grupy haptenowe. Niemowlęta są rutynowo uodporniane toksoidami tężcowymi i błoniczymi. Stąd też, będą one uczulone na następne zaprezentowanie antygenu stanowiącego polimer otoczkowy koniugowany z którymkolwiek z tych toksoidów.
Ogólnie, jako nośnik antygenowy może służyć jakiekolwiek białko heterologiczne. Jednakże, pewne toksyny bakteryjne, takie jak tężcowa i błonicza, mogą dawać dodatkową korzyść przez to, że są złożone z dwu części, z których jedna /podjednostka wiążąca/ wykazuje silne powinowactwo, jeśli chodzi o wiązanie się z powierzchnią komórek ssaków. Nie jest wykluczone, że koniugacja z tego rodzaju wiążącym białkiem umożliwia antygenowi z nośnikiem bardziej efektywne indukowanie odpowiedzi z komórkach układu immunologicznego.
Nośnikami białkowymi, z którymi koniuguje się polimer otoczkowy, mogą być toksyna natywna lub toksyna pozbawiona toksyczności /toksoid/. Także, z wykorzystaniem względnie współczesnych technik mutacyjnych, można wytwarzać genetycznie zmienione białka, które są antygenowo podobne do toksyn, a mimo to nietoksyczne. Nazywane są one substancjami reagującymi krzyżowo lub CRM. Godne uwagi jest CRM97 ponieważ ma ono pojedynczą zmianę aminokwasu w porównaniu z natywną toksyną błoniczą i immunologicznie nie można go od niej odróżnić.
Koniugowanie polimeru otoczkowego z natywną toksyną może zmniejszyć toksyczność, ale w znacznej mierze toksyczność może pozostać. To też, dla dalszego pozbawienia białka toksyczności używa się formaliny, która reaguje z wolnymi grupami aminowymi białka. Jednakże, niepokój może budzić toksyczność szczątkowa. Dalej, możliwe jest zajście detoksyfikacji spontanicznej w przypadku jakiejś szczególnej serii szczepionek i stanowi to problem, który należy brać po uwagę w tej kwestii.
Alternatywnie, toksynę natywną, przed skoniugowaniem jej z polimerem otoczkowym, można pozbawić toksyczności przy użyciu formaliny z utworzeniem typowego toksoidu. Jednakże uprzednie, podziałanie formaliną prowadzi do zmiejszenia ilości wolnych grup aminowych dostępnych do reakcji z grupami redukującymi fragmentu polimeru otoczkowego. Tak więc, CRM są wyraźnie korzystne przez to, że nie mają naturalnej toksyczności i nawet ani jedna z ich grup aminowych nie jest zajęta przez formalinę. Dalszą korzyść stanowi to, że przy stosowaniu CRM nie występują zagrozenia dla życia.
W przypadku CRM197, które immunologicznie jest identyczne z toksyną natywną, podziałanie formaliną /aczkolwiek nie występuje tu potrzeba detoksyfikacji/ znacznie wzmacnia odpowiedź immunologiczną. Sądzi się, że wynika to z ustabilizowania cząsteczki jeśli chodzi o rozkład w rezultacie działania mechanizmów występujących w organizmie i/lub agregacji na drodze sieciowania/immunogenność cząstek wzrasta wraz z wielkością/.
Dla tych wszystkich powyższych powodów, pierwszymi kandydatami na nośnik białkowe są toksyny tężcowa i błonicza, aczkolwiek są i inne, które także mogą się do tego nadawać. Pomimo tego, że te inne toksyny nie mają swojej historii jeśli chodzi o bezpieczeństwo stwierdzone odnośnie do błonicy i tężca, to jednak mogą występować inne, przeważające powody ich zastosowania. I tak np., mogą być one nawet bardziej skuteczne jako nośniki, albo też okaże się w tym przypadku możliwość uzyskania znacznych oszczędności produkcyjnych. Innymi kandydatami na nośniki są toksyny Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, B.pertussis i Escherichina coli.
Aktywowane oligosacharydy można powiązać z białkiem CRM97, którego oczyszczanie przeprowadza się sposobem następującym.
CRM97, wytworzone przez szczep Corynebacterium diphtheriae, wydziela się z podłoża hodowli za pomocą przepuszczenia hodowli bakterii przez błonę Millipore, wytrącenia białka z przesączu 1 oczyszczenia CRMI97 metodą chromatografii jonowymiennej, jak to opisano w poniższej części niniejszego opisu. Alternatywnie, zasadniczo czyste CRM97 można otrzymać jakąkolwiek metodą znaną w tej dziedzinie techniki.
Aktywowany oligosacharyd wiąże się kowalencyjnie z nośnikiem białkowym w obecności rozpuszczalnika organicznego 1 ewentualnie jakiegoś innego czynnika, takiego jak środek kondensujący, w celu ułatwienia wiązania końcowej grupy funkcyjnej aktywowanego oligosa14
169 926 cCaryds z białkiem. W szczególnie korzystnym wariancie sposobu według wynalazku, aktywowany oligosacCardd zawierający końcową grupę estrową łączy się kowalencyjnie z wolnymi grupami aminowymi obecnymi w nośniku białkowym w sposób następujący.
Aktywowany oligosarharyy rozpuszcza się w sulfotlenku dimetdlowdm, a następnie dodaje do wodnego roztworu nośnika białkowego, takiego jak np. /ale bez ograniczania się jedynie do niego/ CRM 197, w stężeniu około 2 mg/ml, tak, że stosunek molowy aktywowany monoestrem oligosachardd/całość grup aminowych nośnika białkowego wynosi okołol:2, a końcowe stężenie DMSO wynosi około 5O% obj/obj. Reakcję koniugacji przeprowadza się w temperaturze 4°C i aczkolwiek reakcja bliskajest zakończenia w ciągu około 2 godzin, stosowne jest pozwolić jej zachować przez noc, w celu podwyższenia wydajności reakcji do najwyższych wartości dla każdego typu konkretnie otrzymywanego glikokoniugatu. Tak otrzymane glikokon^gaty poddaje się następnie oczyszczaniu metodą chromatografii żelowej.
W celu wytworzenia szczepionki jednoważnej, doprowadza się do koniugacji z białkiem zligosarCaryyów pochodzących od bakterii pojedynczego serotypu. W celu wytworzenia szczepionki wieloważnej, glikokoniugaty otrzymuje się za pomocą połączenia z nośnikiem białkowym mieszaniny oligosacharydów pochodzących z bakterii różnych gatunków lub różnych serotypów. Alternatywnie, można zmieszać ze sobą gllkokoniugatd wytworzone na drodze reakcji oligosacCarydu pojedynczego typu z nośnikiem białkowym w osobnych procesach z użyciem rozmaitych oligosacharddów. Tak więc, szczepionka wieloważna może zawierać nośnik białkowy związany z populacją Comogennyrh lub heterogennych oligosarCardyów.
Potwierdzenia immunogenności glieokoniugatów wytworzonych sposobem według wynalazku dokonać można za pomocą poddania ich badaniu, zanim zostaną podane człowiekowi, w dowolnym odpowiednim układzie zwierzęcym, włączając w to /ale bez ograniczania się jedynie do nich/ króliki, świnie, świnki morskie, myszy, szczury lub kozy. W konkretnym wariancie sposobu według wynalazku, królikom zaszczepia się podskórnie koniugat glikoproteinow^ ewentualnie w obecności fosforanu glinowego lub wodorotlenku glinowego, używa się królików o ciężarze około 2 kg. Stosowną dawką dla 2 kg królika jest około 2,5 fig oligosacharyds. Następnie można obliczyć miano przeciwciała posługując się techniką ELlSA lub jakąkolwiek inną metodą znaną w tej dziedzinie techniki. Ponieważ przeciwciała wytworzone przeciw gliezeoniugatzm wytwarzanym sposobem według wynalazku mogą okazać się niezdolne do immunoprecypitacji antygenu, metod badania przeciwciał polegających na immunoprecypitacji nie zaleca się do oznaczania miana.
Do odpowiednich podłoży nośnych przy formułowaniu szczepionki należy roztwór soli buforowany fosforanem sodowym /pH 7,4/ albo 0,125 M żel fosforanu glinowego zawieszony w roztworze soli buforowanym fosforanem sodowym /pH 6/, oraz inne typowe podłoża.
Ogólnie, szczepionki zawierające od około 5 do około 100 gg, korzystnie około 10 do 50 gg zligzsarCarydu są zdolne do powodowania wystąpienia u młodych ssaków riepłokrwlstych skutecznego poziomu przeciwciała przeciw polimerowi otoczkowemu. Oczywiście, dokładną dawkę będzie można ustalić po przeprowadzeniu rutynowych eksperymentów typu dawka/oypzóieyź. Stężenie koniugatów glieoproteinowdrh przy wytwarzaniu szczepionek dla dzieci mieści się w zakresie od około 25 do 2OO gg oligosacCarddu. Dawki większe można podawać na podstawie ciężaru ciała. Można się spodziewać, że kilka niewielkich dawek podanych kolejno okaże się lepszymi w działaniu od tej samej ilości koniugatu podanej we wstrzyknięciu pojedynczym.
Szczepionki zawierające produkt wytworzony sposobem według wynalazku można podawać ssakom ciepłokrwistym w każdym wieku i są one specjalnie przystosowane do indukowania uodporniania czynnego przeciw zakażeniom ogólnoustrojowym występującym u młodych ssaków, a spowodowanym przez patogenny Haemophilus influenzae typ b, Escherichia coli, Streptzcocrss pneumoniae, Neisseria menintitidis i Pseudomonas aeruginosa.
Szczepionki te można podawać podskórnie, dożylnie, domięśniowo, dootrzewnowo, doustnie lub donosowo. Szczepionki mogą zawierać glikokoniugat rozpuszczony lub w postaci subtelnie rozdrobnionej, albo też wprowadzony do mikroskopijndcC kuleczek lub pęcherzyków, włączając w to liposomy.
169 926
Produkt uzyskany sposobem według wynalazku ma zastosowanie w szczepionkach skierowanych przeciw otorbionym bakteriom chorobotwórczym do ochrony podatnych osobników przed rozwojem zakażeń powodowanych przez te czynniki. Do osobników podatnych należą małe dzieci z niedojrzałymi układami odpornościowymi, osobniki nie posiadające śledziony jak również każdy osobnik z upośledzonym układem odpornościowym lub chorobą przewlekłą, a w szczególności z zespołem nabytego upośledzenia odporności /AIDS/, hematopoetyczną chorobą nowotworową, cukrzycą, przewlekłą chorobą serca, przewlekłą chorobą płucną oraz niedokrwistością sierpowatokomórkową. Immunogenność oligosacharydów zawartych w glikokoniugatach wytwarzanych sposobem według wynalazku jest wzmożona dzięki temu, że są koniugowane z nośnikiem białkowym.
To też, glikokoniugaty wytwarzane sposobem według wynalazku można stosować w celu zapewnienia ochrony przeciw zakażeniu jakimkolwiek bakteriami posiadającymi otoczkę polisacharydową, włączając w to Streptococcus pneumoniae, Haemophilus, influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus i Pseudomonas aureginosa. Szczepy S. pneumoniae szczególnie patogenne w stosunku do dzieci i specjalnie nadające się do wykorzystania w niniejszym wynalazku obejmują typy: 1,2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F,14, 15B, 17F,18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 i 33F.
Szczepionki można stosować do indukowania monospecyficznej i homogennej odpowiedzi immunologicznej, Monospecyficzna odpowiedź immunologiczna związana jest z wieloma korzyściami, włączając w to dostarczanie przeciwciał o: /i/ homogenne swoistości, przy czym zasadniczo wszystkie przeciwciała skierowane są przeciw konkretnemu epitopowi i charakteryzują się tą samą wartością stałej powinowactwa, /ii/ wysokiej wartości stałej powinowactwa i wyższej aktywności przeciwbakteryjnej, /iii/ podwyższości swoistości docelowej i nieobecności reaktywności krzyżowej z pokrewnymi antygenami gospodarza, w wyniku czego powstaje bezpieczniejsza szczepionka, oraz./iv/obniżonej aktywności dopełniacza w rezultacie obniżonej aktywności precypitacyjnej przeciwciał monospecyficznych, co także doprowadza do uzyskania bezpieczniejszej szczepionki.
Szczepionki te rozpoznają peptydy lub lipooligosacharyd albo inne powierzchniowe hapteny oligosacharydowe związane, sposobami według wynalazku, z nośnikami białkowymi. Tego rodzaju szczepionek można użyć np. do indukowania odporności skierowanej przeciw komórkom nowotworowym, albo przy wytwarzaniu przeciwciał przeciw nowotworom, koniugowanych z czynnikiem chemoterapeutycznym lub bakteryjnym. Taką aktywność przeciwnowotworową można indukować za pomocą wiązania antygenu nowotworowego swoistego, lub jego epitopu, z nośnikiem białkowym z zastosowaniem sposobów według wynalazku.
Immunogenność glikokoniugatów pochodzących z S. pneumoniae. Sporządzono szereg preparatów czterech antygenów stanowiących glikokoniugaty i poddano je badaniu na królikach według schematu wyszczególnionego w poniższej tabeli 6: typowo swoiste glikokoniugaty w preparacie jednowaznym /2,5 lub 5,0 pg oligosacharydu na dawkę/ lub preparacie wieloważnym /2,5 pg każdego oligosacharydu na dawkę/, ewentualnie z wodorotlenkiem glinowym [Al/oH/3] jako adiuwantem mineralnym /podawano jedynie w preparacie wieloważnym w ilości 1 mg na dawkę/. Zachodziła całkowita absorpcja czterech glikokoniugatów do Al/OH/3 w przyjętych warunkach, gdyż obróbka supernatantu preparatu wieloważnego, czy to metodą elektroforezy w zelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylo-sodowym, czy to metodą lmmunoelektroforezy rakietowej, nie potwierdziła istnienia jakiejkolwiek wykrywalnej ilości wolnego białka. Przeciętna dawka każdego zawartego w preparacie glikokoniugatu wynosi około 2.5 pg oligosacharydu i 13 pg nośnika białkowego CRMI197 /co jest porównywalne z przeciętną dawką toksoidu błoniczego w przypadku wakcynacji ludzi. Schemat uodporniania obejmuje dawkę piętnującą 1 dwie dawki przypominające co cztery tygodnie. Krew upuszcza się w tygodniu 0, 4, 6 i 10.
169 926
Tabela 6
Schemat uodporniania dla królików i myszy oraz dawki szczepionek
Uodpornienie w tygodniu 0,4 i 8;
Upuszczenie krwi w tygodniu 0,4, 6 i 10.
A. Rozpuszczalny preparat jednowazny /pojedynczy typ/ dawka /0,5 ml/: 2,5 pg oligosacharydu i 13 pg /5Lf/ CRM 197 dawka /0,5 ml/: 5,0 pg oligosacharydu i 26 pg /10Lf/ CRM 197
B. Rozpuszczalny preparat wieloważny /mieszanina 4 typów/ dawka /0,5 ml/: 2,5 pg typowo swoistego oligosacharydu /ogółem pg oligosacharydów/ i ogółem 52 pg /20Lf/ CRM 197
C. Preparat wieloważny /mieszanina 4 typów/ adsorbowany na Al/OH/ 3 dawka /0,5 mH . 2,5 pg typowo swoistego oligosacharydu /ogółem pg oligosacharydów/ i ogółem 52 pg /20Lf/ CRM 197 z 1 mg Al/OH/3
Tabela 7 przedstawia ustaloną techniką radioimmunologiczną /RIA- metoda Farra/ ilość typowo swoistych przeciwciał, jak również ilość osobników dających odpowiedź nad liczbą zwierząt uodpornianych. Stosunek /R/ wskazuje krotność wzrostu osiągniętą po każdej dawce uodporniającej.
Tabela 8 przedstawia miana ELISA w sensie przeciwciał izotypowo IgG, jak również ilość osobników dających odpowiedź w stosunku do ilości zwierząt poddanych uodpornianiu. Stosunki -R1, -R2, -R3 wskazują na krotność wzrostu mian po każdej dawce uodporniającej, podczas gdy stosunki -R1, -R2’, -R3’ wskazują krotność wzrostu mian dla danej dawki uodporniającej w odniesieniu do premiana.
Tabela 9 przedstawia wyniki jakościowe w sensie funkcjonalności utworzonych przeciwciał IgG w rozpoznawaniu polisacharydowej otoczki na żywych streptokokach /test pęcznienia otoczek lub test Neufelda/.
Tabela 10 przedstawia miana neutralizacji toksyny błoniczej wywołane u królików przez nośnik białkowy CRM 197, jak to oznaczono w teście z komórkami Vero. Ponieważ jako kontroli używa się tu wzorcowej surowicy odpornościowej FDA, załączono także miana wyrażone w p/ml.
Tabela 7
Miana ustalone techniką radioimmunologiczną*u królików uodpornianych** oligosacharydami***
S. pneumoniae typ 6A, 14,19F i 23F, kowalencyjnie związanymi z nośnikiem białkowym CRM 197****
| Postać rozpuszczalna | ||||
| tydzień 0 | tydzień 4 | tydzień 6 | tydzień 11 | |
| typ 6A | n.d. | n.d. | 150/2/6/ | 495 /6/6/ |
| typ 14 | n.d. | n.d. | 230/1/6/ | 195/2/6/ |
| typ 19F | n.d. | n.d. | n.d. | 75 /6/6/ |
| typ 23F | n.d. | n.d. | 400/1/6/ | 140/1/5/ |
169 926
| Zaadsorbowane na Al/OH/3 | ||||
| typ 6A typ 14 typ 19F typ 23F | n.d. n.d. n.d. n.d. | 538 /5/5/ 77 /3/6/ 72 /6/6/ 283 /3/6/ | 3190/5/5/ R = 6,0 203 /4/5/ R = 2.6 1018 /5/5/ R = 1.5 n.d. | 4064/5/5/ R = 1,3 216/5/5/ R = 1,1 188/5/5/ R = 1,7 246/5/5/ |
W powyższej tabeli 7 użyto następujących oznaczeń:
* Dane wyrażone jako średnia geometryczna mian w ngNpreciwciaii/ml. W nawiasach podano ilość osobników dających odpowiedź na ogólną ilość zwierząt.
** Wielowazne preparaty czterech glikokoniugatów w postaci rozpuszczonej i zaadsorbowane na Al/OH/3 /1 mg/dawkę. Każdy glikokoniugat zawiera średnio 2,5 gg oligosacharydu oraz średnio 13 gg białka CRM 197. Uodpornianie w tygodniu 0, 4 i 9. Upuszczanie krwi w tygodniu 0, 4, 6 i 11.
*** Oligosacharydy typu 6 A 1 19F wykazują średni DP = 3. Oligosacharydy typu 14 1 23F wykazują średni DP = 5. **** Glikokoniugat typu 6A wykazują średni stopień podstawienia /SD/ oligosacharydów na jednostkę nośnika białkowego /mol/mol/ = 7.
SD dla glikokomugatu typu 14 wynosi 6, dla typu 19F wynosi 4 1 dla typu 23F wynosi 5.
Tabela 8
Wyniki oznaczenia ELISA mian przeciwciał izotypowo IgG *, indukowanych przez wieloważną szczepionkę obejmującą glikokoniugaty oligosacharydów otoczkowych DP = 3 + 6 S. pneumoniae typ 6A, 14, 19F1 23F zaadsorbowanych na adiuwancie mineralnym /Al/OH/3/
| Premiano /tydzień 1 / | Napiętnowanie /tydzień 4/ | 1 -a dawka przypominająca /tydzień 6/ | 2-a dawka przypominająca /tydzień 11 / | |
| typ 6 A | <50/0/5/ R1 > 96,0 | 4800/5/5/ | 51200/5/5/ | 13(0003/5/5/ |
| R2 = 10,7/α <0,01/ R3 = 2,5 /α < 0,01/ R2' >1027 R3' > 2600 | ||||
| typ 14 | <50/0/5/ R1 > 7,2 | 360 /5/5/ | 4480/5/5/ | 19000/5/5/ |
| R2 = 12,4/α <0,01/ R3 = 4,4/α <0,01/ R2' > 89,3 R3’ > 396,0 | ||||
| typ 19F | <50/0/5/ R1>41,6 | 2080/5/5/ | 18560/5/5/ | 352(0)/5/5/ |
| R2 = 9,0/α <0,01/ R3 = 1,9/α <0,01/ R2 ’> 371,2 R3’> 704,0 | ||||
| typ 23F | <50/0/5/ R1 > 17,6 | 880/5/5/ | 1280/5/5/ | 11880** |
| R2 = 1,5 /α <0,01/ R3 = 9,3 /α < 0,01/ R2' > 25,6 R3’ > 237,6 |
W powyższej tabeli 8 użyto następujących oznaczeń:
* Miana wyrażone jako średnia geometryczna z odwrotności najwyższego rozcieńczenia surowicy wykazującego wartość ABS dwukrotnie większą niż podłoże reakcyjne. W nawiasach podano ilość zwierząt /osobniki dające odporność nad ogólną ilością zwierząt zaszczepionych/.
** Wartość dotyczy miana u królika będącego osobnikiem dającym niezwykle wysoką odpowiedź. Od^i^ci^wszy dwa z pięciu uodpornionych królików /osobniki dające najlepszą i najgorszą odpowiedź/, otrzymuje się podane poniżej wyniki dla trzech pozostałych królików dla serotypu 23F:
/tydzień 0/ /tydzień 4/ /tydzień 6/ /tydzień 11/ <50/0/5/ 667 WU' 1333/3/3/ 2667/3/3/
R2 = 2,0/ α <0,01/
R1 > 13,3
R2’ > 26,7
R3 = 2,0 /α <0,01/ R3' > 53,3
169 926
Tabela 9
Immunologiczna funkcjonalność przeciwciał surowicy króliczej wobec oligosacharydów DP = 3-6 skoniugowanych z CRM197.
| Analiza jakościowa /test | pęcznienia otoczek * do rozpoznawania bakterii otoczkowych/. | |
| S. pneumoniae | typ 6A: | Reakcja pozytywna |
| S. pneumoniae | typ 14 : | Reakcja pozytywna |
| S. pneumoniae | typ 19F: | Reakcja pozytywna |
| S. pneumoniae | typ 23F: | Reakcja pozytywna |
W powyższej tabeli 9 użyto następującego oznaczenia :
* Wykonano według metody podanej przez Austriana [Mt. Sinai J. Med., 43, 699 - 709 /1976/].
Tabela 10
Miana przeciwbłonicze *, z zastosowaniem testu z komórkami Vero, wywołane u królików uodpornionych wielowaznymi glikokoniugatami syntetyzowanymi z użyciem oligosacharydów S. pneumoniae kowalencyjnie związanych w nośnikiem białkowym CRM197.
| Premiano /tydzień 0/ | Napiętnowanie /tydzień 4 | /1-a dawka przypominająca /tydzień 6/ | 2-a dawka przypominająca /tydzień 11/ | |
| Postać rozpuszczalna | < 10 | < 10 R = 2,5 | 25 /0,019 p/ml/ R = 77,0 | 1920 /1,4 p/ml/ |
| Zaadsorbowane na Al/OH/3 | < 10 | 20 /0,015 p/ml/ R = 64,0 | 1280 /0,96 p/ml/ R = 3,0 | 3840 /2,9 p/ml/ |
Wzorcowa surowica odpornościowa FDA zawiera 6 μ/ml i daje 50% ochronę w rozcieńczeniu 1/8000.
W powyższej tabeli 10 użyto następującego oznaczenia;
* Miana wyrażone jako odwrotność rozcieńczenia, przy którym pula surowic odpornościowych wykazuje 50% ochronę komórek, jak oznaczona na podstawie włączenia JH-leucyny po ekspozycji komórek na toksynę błoniczą.
Liczby w nawiasach wskazują miana w μ/ml jak oznaczono przy użyciu wzorcowej surowicy odpornościowej FDA jako kontroli.
Oligosacharydy o długości łańcucha DP = 10-20 są suboptymalnie immunogenne. Dwie grupy szczepionek stanowiących glikokoniugaty syntetyzuje się według schematu syntezy opisanego w powyższej części niniejszego opisu, z tym, że używa się oligosacharydów S. pneumoniae 6A, 14, 19F i 23F o dwu różnych wartościach granicznych długości łańcucha, a mianowicie DP = 3-5 oraz DP = 10-20. Wyłania się kwestia, czy oligosacharyd o długości łańcucha wynoszącej DP = 20, albo większej, będzie także optymalnym immunogenem /po koniugacji z wybranym nośnikiem białkowym CRM197/pod względem zdolności napiętnowania i wspomagania, w porównaniu z oligosacharydem o łańcuchu znacznie krótszym, takim jak oligosacharyd DP = 3.
Króliki uodpornia się według protokołu przedstawionego w poniższej tabeli 11. Jak się okazuje z porównania wyników zamieszczonych w poniższych tabelach 12 i 13, które dotyczą rezultatów oznaczenia techniką ELISA mian przeciwciał izotypowo IgG, indukowanych przez rozpuszczalne oligosacharydy z S. pneumoniae, odpowiednio, o DP = 10-14 i DP = 3-6, jak również zamieszczonych w poniższych tabelach 14 i 15, które dotyczą rezultatów oznaczania techniką ELISA miana przeciwciał izotypowo IgG indukowanych przez zaadsorbowane na Al/OH/3 oligosacharydy S. pneumoniae, odpowiednio, o DP = 10-14 i DP = 3-6, oligosacharydy DP = 10-14 nie były związane ze wzmożoną immunogennością. I rzeczywiście aktywność napiętnowania i wspomagania wykazywana przez koniugaty oligosacharydu DP = 3-5 była daleko większa od aktywności obserwowanej w przypadku użycia koniugatów oligosacharydów
169 926
DP =10-14. Nie przypadkowo podobne wyniki związane są ze wszystkimi czterema strukturami badanych węglowodanów. Dalej, neutralizacja toksyny błoniczej przez glikokoniugaty o DP = 10-14 okazała się mniej efektywna od uzyskanej przy użyciu glikokoniugatów o Dp = 3-6 /poniższa tabela 16/. Tak więc, w koniugatach wytwarzanych sposobem według wynalazku funkcjonalne są ollgosacCaryyy o długości łańcucha DP = 10-20, chociaż oligosacharydy o DP = 3-6 wywołują wyższe miano przeciwciała.
Tabela 11
Schemat uodporniania królików
Wstrzykuje się modele gllkzezniugatów w dawce 2,5 gg węglowodanu. Ponieważ modele badane różnią się między sobą jedynie pod względem długości łańcucha kowalencyjnie związanych zllgzsarCardyów, zypzwleynia ilość nośnika białkowego wynosi:
| Dawka węglowodanu /gg/ | Dawka nośnika białkowego /gg/ | Stosunek wagowy /wag/wag/ | ||
| Ollgzsarhardy DP = 3-6 - CRM197 OligosacCardd DP = 10-14 - CRM197 | 2,5 2,5 | 12,5 2,5 | 0,2 1,0 | |
| Uodpornienie w tygodniu 0, 4 i 8/ Upuszczenie krwi w tygodniu 0, 4 i 10. Tabela 12 Wyniki oznaczeń techniką ELISA mian przeciwciał izztdpowo IgG indukowanych szczepionką wieloważną obejmującą glikokzniugatd otoczkowych oligosacCarddów o DP = 10-14 S^neumomae typ 6A, 14, 19F i 23F w postaci rozpuszczalnej. | ||||
| Premiano /tydzień 0/ | Napiętnowanie /tydzień 4/ | 1 -a dawka przypominająca /tydzień 6/ | 2-a dawka przypominająca /tydzień 10/ | |
| Typ 6A | <100 | <100 | <100 | 500/2/5/ |
| Typ 14 | <100 | 300 | 2400/3/5/ | 4600/3/5/ |
| Typ 19F | <100 | <100 | <100 | <100 |
| Typ 23F | <100 | <100 | <100 | <100 |
| Tabela 13 Wyniki oznaczeń techniką ELISA mian przeciwciał iaotdpzwo Ig obejmującą gllkzkzniugaty otoczkowych zllgzsacCary typ 6A, 14, 19F i 23F w postaci roz | G indukowanych szczepionką wieloważną dów o DP = 3-6 S. pneumoniae 5usacaalney. | |||
| Premiano /tydzień 0/ | Napiętnowanie /tydzień 4/ | 1 -a dawka przypominająca /tydzień 6/ | 2-a dawka przypominająca /tydzień 11/ | |
| Typ 6A | <50 | <200 | 967 /6/6/ | 8500/6/6/ |
| R3 = 8,8 /α < 0,01/ | ||||
| Typ 14 | <50 | 1800 | 3266 /3/6/ | 3650/4/6/ |
| Typ 19F | <50 | <50 | 675 /4/6/ | 1750/6/6/ |
| Typ 23F | <50 | <50 | <50 | <50 |
169 926
Tabela 14
Wyniki oznaczeń techniką ELISA mian przeciwciał izotypowo IgG indukowanych szczepionką wieloważną obejmującą glikokoniugaty otoczkowych oligosacharydów o DP = 10-14 S. pneumoniae typ 6A, 14, 19F i 23F zaadsorbowane na adiuwancie mineralnym Al/OH/3.
| Premiano /tydzień 0/ | Napiętnowanie /tydzień 4/ | 1 -a dawka przypominająca /tydzień 6/ | 2-a dawka przypominająca /tydzień 10/ | |
| Typ 6A | < 100 R1> 2,4 | 240/5/5/ R2 = 3,8 R2’ | 900/5/5/ α <0,01/ > 9,0 | 5001515/ |
| Typ 14 | < 100 | 300/5/5/ | 1040/5/5/ | 8480/5/5/ |
| R1>3,0 | R2 = 3,5 /α < 0,01/ R3 = 8,2 /α < 0,01/ R2' >10,4 R3' > 84,9 | |||
| Typ 19F | < 100 | <100 | 400/1/5/ | 800/1/5/ |
| Typ 23F | < 100 | <100 | < 100 | 200 /1/5/ |
Tabela 15
Wyniki oznaczeń techniką ELISA mian przeciwciał izotypowo IgG* indukowanych szczepionką wieloważną obejmującą glikokoniugaty otoczkowych oligosacharydów o DP = 3-6 S. pneumoniae typ 6A, 14, 19F i 23F zaadsorbowane na adiuwancie Al/OH/3.
| Premiano /tydzień 0/ | Napiętnowanie /tydzień 4/ | 1 -a dawka przypominająca /tydzień 6/ | 2-a dawka przypominająca /tydzień 11 / | |
| typ 6 A | <50/0/5/ R1 > 96,0 | 4800/5/5/ | 51200/5/5/ | 130000/5/5/ |
| R2 = 10,7/α <0,01/ R3 = 2,5 /α < 0,01/ R2' >1027 R 3'>2600 | ||||
| typ 14 | <50/0/5/ Rl > 7,2 | 360/5/5/ | 4480/5/5/ | 19800/5/5/ |
| R2 = 12,4/α <0,01/ R 3 = 4,4 /α < 0,01/ R2' > 89,3 R3’ > 396,0 | ||||
| typ 19F | <50/0/5/ R1 >41,6 | 2080/5/5/ | 18560/5/5/ | 35200/5/5/ |
| R2 = 9,0/α < 0,01/ R 3 = 1,9/α <0,01/ R2’> 371,2 R3’ > 704,0 | ||||
| typ 23F | <50 /0/5/ R1 > 17,6 | 880/5/5/ | 1280/5/5/ | 11880 |
| R2 = 1,5/α <0,01/ R 3 = 9,3 /α < 0,01/ R2' > 25,6 R3’ > 237,6 |
* Miana wyrażone jako średnia geometryczna odwrotności najwyższego rozcieńczenia surowicy wykazującego wartość ABS dwukrotnie większą niż podłoże reakcyjne. W nawiasach podano ilość zwierząt /osobniki dające odporność nad ogólną ilością zwierząt zaszczepionych/.
169 926
Tabela 16
In vitro zobojętnianie * toksyny błoniczej przy użyciu surowic królików uodpornionych glikokoniugatami oligosacharydów S. pneumoniae z CRM197.
| Premiano /tydzień 0/ | Napiętnowanie /tydzień 4/ | 1-a dawka przypominająca /tydzień 6/ | 2-a dawka przypominająca /tydzień 10/ | |
| DP = oligo 3-6 - CRM 197 | ||||
| Rozpuszczalny | < 1/10 | < 1/10 | 1,20 | 1/1280 |
| /0,03 0 /ml/ /2,05 0 /ml | ||||
| Zaadsorbowany na Al/OH/3 | < 1/10 | 1/10 | 1/640 | 1/2560 |
| /0,016 0 /ml/ /1.02 0 /ml/ /4,10 0 /ml/ | ||||
| DP = oligo 10-14 - CRM 197 | ||||
| Rozpuszczalny | < 1/10 | < 1/10 | 1,10 | 1/10 |
| /0,016 0 /ml/ | ||||
| Zaadsorbowany na Al/OH/3 | < 1/10 | < 1/10 | 1/40 | 1/80 |
| /0,06 0 /ml/ /0,13 0 /ml/ |
* Miana wyrażone jako odwrotność rozcieńczenia, w którym pula króliczych surowic odpornościowych wykazuje 50% ochronę nadaną komórkom, jak oznaczono za pomocą włączenia 3H-leucyny po ekspozycji komórek na toksynę błoniczą. Liczby w nawiasach wskazują miana w pg/ml jak oznaczono przy użyciu wzorcowej surowicy odpornościowej FDA jako kontroli. MPL oznacza u ludzi: 0,01 pg/ml.
Odpowiedź immunologiczna na glikokoniugaty jest monospecyficzna i homogenna. Porównanie wyników pokazanych w powyższych tabelach 7 i 8, które odnoszą się do mian przeciwciał oznaczonych techniką radioimunologiczną /RIA/ i techniką immunosorpcyjną ze związanym enzymem /ELISA/, potwierdza że miana oznaczone techniką RIA były konsekwentnie niższe od mian oznaczonych techniką ELISA. Obserwacja ta, razem z nieobecnością immunoprecypitatów w żelach agarozowych stosowanych do analizy surowicy odpornościowej przeciw glikokoniugatom metodą immunodyfuzji radialnej i elektroforezy rakietowej potwierdza, że królicze surowice odpornościowe przeciw koniugatom oligosacharyd S. pneumoniaeCRM197 zawierają wysokoswoiste przeciwciała izotypowo IgG, które są zdolne do precypitacji odpowiednich oczyszczonych polimerów węglowodanowych użytych do wytworzenia oligosacharydów.
Brak strącających przeciwciał w surowicy odpornościowej wskazuje na monospecyficzność, to znaczy rozpoznawanie przez przeciwciała tylko jednego epitopu w antygenowym receptuarze danej cząsteczki [Berzofsky-Schechter, Molecular Immunol., 18,751-763 /1981/]. Precypitacja kompleksów antygen-przeciwciało wymaga uformowania sieci przestrzennej w celu utworzenia trójwymiarowego, rozgałęziającego się usieciowania związanych cząsteczek antygenu i przeciwciała. Aby taka sytuacja zaistniała, potrzeba wielowartościowości zarówno antygenu jak i przeciwciała, gdyż więcej niż jedno przeciwciało musi być zdolne do jednoczesnego wiązania się z pojedynczą cząsteczka antygenu. To też, brak zauważalnej immunoprecypitacji zachodzącej z udziałem króliczej surowicy odpornościowej przeciw koniugatom oligosacharyd P. pneumoniae-CRMi97 i homologicznych, oczyszczonych, wielkocząsteczkowych polisacharydów otoczkowych bardzo wyraźnie wskazuje na to, że surowice odpornościowe zawierają przeciwciała swoiste dla polimeru węglowodanowego /jak to pokazano w badaniach techniką ELISA i zahamowanie-ELISA/ ale skierowane przeciw tylko jednemu determinantowi/epitopowi/ polisacharydu.
Oprócz przejawiania aktywności immunoprecypitacji, heterogenna populacja jest także, na ogół, stowarzyszona z następującą właściwością.
169 926
Pojedynczy epitop antygenu użytego do wywołania odpowiedzi objawiającej się wytworzeniem przeciwciała, nie może całkowicie zahamować wiązania całej populacji przeciwciał przeciw kompletnemu antygenowi, ale będzie hamować tylko te przeciwciała, które się wiążą z tym jednym epitopem, z pozostawieniem innych przeciwciał wolnych, dla wiązania się z pozostałymi epitopami występującymi na kompletnym antygenie. Populację przeciwciał można ocenić pod względem heterogenności za pomocą badania techniką zahamowanie-ELISA. W badaniu tym, zdolność populacji przeciwciał do wiązania się z kompletnym antygenem można zmierzyć w obecności inhibitorów wiązania antygenu z przeciwciałem, takich jak wyizolowane epitopy antygenu. Przy graficznym przedstawieniu pomiaru wiązania przeciwciała ze znakowanym kompletnym antygenem w obecności wzrastających stężeń nieznakowanego kompletnego antygenu, otrzymuje się krzywą sigmoidalną, której użyć można jako krzywej standardowej dla wiązania przeciwciała z antygenem. W przypadku gdy populacja przeciwciał jest heterogenna, wiązanie między przeciwciałem a kompletnym adiuwantem nie może ulec całkowitemu zahamowaniu przez dodanie pojedynczego epitopu antygenowego i krzywa standardowa wiązania przeciwciała z antygenem jest tylko częściowo przesunięta /częściowo pokrywa się lub częściowo jest równoległa/ ponieważ przeważają inne wzajemne oddziaływania antygen/przeciwciało, inne niż występujące w przypadku epitopu poddawanego badaniu, I na odwrót, wiązanie homogennej populacji przeciwciał z antygenem może ulec całkowitemu zahamowaniu przez dodanie wyizolowanego epitopu. Standardowa sigmoidalna krzywa wiązania antygenu z przeciwciałem dla homogennej populacji przeciwciał będzie się pokrywać, lub być równoległą do krzywej wykonanej przy dodawaniu izolowanego epitopu odpowiadającego swoistości populacji.
Eksperymentalnie, przy badaniu w ten sposób króliczej IgG indukowanej glikokoniugatem S. pneumoniae, zaobserwowano model powinowactwa odpowiadający modelowi przewidywanemu dla homogennej populacji przeciwciał /figura 4/. Oligosacharyd S. pneumoniae 6A /czy to w postaci nieskoniugowanej, czy w postaci koniugatu, związany był z sigmoidalną krzywą hamowania wiązania w przybliżeniu równoległą do krzywej otrzymanej w przypadku stosowania wielkocząsteczkowego polisacharydu otoczkowego, serotyp 6A. Tak jak oczekiwano, oligosacharyd heterogenny /typ 14/czy to wolny /aktywowany łącznikiem/, czy też skoniugowany, nie wywiera działania hamującego w stosunku do populacji izotypowo IgG swoistej dla antygenu typu 6A.
Jakkolwiek szczepionki nie wchodzą w zakres wynalazku, w celach informacyjnych podano przykłady ich wytwarzania.
Przykład. Otrzymywanie wieloważnej przeciwpneumokokowej szczepionki zawierającej koniugowany oligosacharyd.
A. Otrzymywanie polisacharydu. Polisacharyd otoczkowy S. pneumoniae typ 6A, polisacharyd otoczkowy S. pneumoniae typ 14, polisacharyd otoczkowy S. pneumoniae typ 19F i polisacharyd otoczkowy S. pneumoniae typ 23F otrzymano z American Type Culture Collection.
B. Hydroliza polisacharydu. Hydroliza polisacharydu S. pneumoniae typ 6A. 2 mg polisacharydu otoczkowego S. pneumoniae typ 6A rozpuszcza się w 1 ml wodnego roztworu zawierającego 10 mM kwasu octowego w pH 3,4, po czym pozostawia w celu zajścia hydrolizy, w zatopionych ampułkach, zanurzonych w łaźni olejowej, w temperaturze 100°C, w ciągu 30 godzin. Otrzymane oligosacharydy wydziela się następnie z mieszaniny reakcyjnej za pomocą chromatografii na Sephadex G15 /Pharmacia, Uppsala/, kondycjonowanym przy użyciu 15 mM roztworu NaCl, w pH 7,0, w temperaturze 4°C.
Następnie odcieki chromatograficzne poddaje się analizie według sposobów postępowania podanych przez Kabata [w : Experimental Immunochemistry, red. E.A. Rabat i Mayer, str. 538-541 /1964/], Chena i in. [Anal. Chem., 28,1756- 1758/1956/] iPorroi in. [Anal. Biochem., 118, 301-306 /1981/], w celu ustalenia obecności grup metylopentozowych, fosforowych i redukujących, np. aldehydowych. Analiza wykazała stosunek metylopentoza/aldehyd 3,96, metylopentoza/fosfor 0,96 i fosfor/aldehyd 4,12.
Badanie metodą chromatografii żelowej na Sephadex G-50 Superfine /Pharmacia/ przy użyciu buforu, wykazało wartość stałej podziału /Kd/ 0,538 /przez oznaczenie heksozy/ co odpowiada masie cząsteczkowej około 2500.
169 926
NMR, chromatografia gazowa i analiza elementarna wykazała, że oligosacharydy złożone są z mniej więcej 3-4 podstawowych jednostek powtarzalnych, wśród których stwierdzono obecność galaktozy, która jest tu cukrem immunodominującym.
Hydroliza polisacharydu S. pneumoniae typ 14. 2 mg polisacharydu otoczkowego S. pneumoniae typ 14 rozpuszcza się w 1 ml wodnego roztworu zawierającego 0,5 M kwas trifluorooctowy, po czym pozostawia w celu zajścia hydrolizy, w zatopionych ampułkach zanurzonych w łaźni olejowej, w temperaturze 70°C, w ciągu 7 godzin. Następnie otrzymane oligosacharydy wydziela się z mieszaniny reakcyjnej za pomocą chromatografii na Sephadex G15 /Pharmacia, Uppsala/, kondycjonowanym przy użyciu 15 mM roztworu NaCl, w pH 7,0, w temperaturze 4°C.
Następnie odcieki chromatograficzne poddaje się analizie na zawartość heksozaminy i aldehydu. Stwierdzono stosunek heksozamina/aldehyd 3,17. Chromatografia gazowa i analiza elementarna wykazały wielkość cząsteczki odpowiadającą 3-4 podstawowym jednostkom powtarzalnym. Metodą chromatografii gazowej stwierdzono, że odszczepienie galaktozy nie przekracza 10%. Badanie metodą chromatografii żelowej na Sephadex G-50 Superfine /Pharmacia/ przy użyciu 15 mM NaCl w pH 7,0, wykazało, że dla oligosacharydu stała podziału /Kd/ wynosi 0,30, jak to oznaczono przez pomiar całkowitej heksozy.
Hydroliza polisacharydu S. pneumoniae typ 19F. 2 mg polisacharydu otoczkowego, S. pneumoniae typ 19F rozpuszcza się w 1 ml wodnego roztworu zawierającego 10 mM kwasu octowego, w pH 3,4, a następnie pozostawia w celu zajścia hydrolizy w zatopionych ampułkach, zanurzonych w łaźni olejowej, w temperaturze 50°C, w ciągu 48 godzin. Następnie otrzymane oligosacharydy wydziela się z mieszaniny reakcyjnej za pomocą chromatografii na Sephadex G-15 /Pharmacia, Uppsala/, kondycjonowanym przy użyciu 15 mM roztworu NaCl, w pH 7,0, w temperaturze 4°C.
Następnie odcieki chromatograficzne poddaje się analizie według sposobów postępowania podanych przez Kabata [w : Experimental Immunochemistry, red. E.A. Rabat i Mayer, str. 538-541 /1964/], Chena i in. [Anal. Chem., 28, 1756-1758 /1956/] i Porro i in. [Anal. Biochem., 118, 301-306 /1981/], w celu ustalenia obecności grup metylopentozowych, fosforowych i redukujących, np. aldehydowych. Analiza wykazała stosunek metylopentaza/zredukowana metylopentaza 3,5 i metylopentoza/fosfor 3,2.
Badanie metodą chromatografii żelowej na Sephadex G-50 Superfine /Pharmacia/ wykazało dla oligosacharydu wartość Kd = 0,46 /przez pomiar całkowitej heksozy/, a połączona analiza metodą chromatografii gazowej i analiza elementarna wykazała wielkość cząsteczki odpowiadającą 3-4 podstawowym jednostkom powtarzalnym.
Hydroliza polisacharydu S. pneumoniae typ 23F. 2 mg polisacharydu otoczkowego S. pneumoniae typ 23F rozpuszcza się w 1 ml wodnego roztworu 0,25 M kwasu trifluorooctowego, po czym pozostawia w celu zajścia hydrolizy w zatopionych ampułkach, zanurzonych w łaźni olejowej, w temperaturze 70°C, w ciągu 3 godzin. Następnie otrzymane oligosacharydy wydziela się z mieszaniny reakcyjnej za pomocą chromatografii na Sephadex G-15 /Pharmacia, Uppsala/, kondycjonowanym przy użyciu 15 mM roztworu NaCl, w pH 7,0, w temperaturze 4°C.
Następnie odcieki chromatograficzne poddaje się analizie według sposobów postępowania podanych przez Kabata [ w : Experimental Immunochemistry, red. E.A. Rabat i Mayer, str. 538-541 /1964/], Chena i in. [Anal. Chemi., 28,1756-1758 /1956/] i Porro i in. [Anal. Biochem., 118, 301-306 /1981/], w celu ustalenia obecności grup metylopentozowych, fosforowych i redukujących, np. aldehydowych. Analiza wykazała stosunek heksoza/aldehyd 4,5-4,5, heksoza/metylopentoza 2,3 i fosfor/aldehyd 2,9.
Chromatografia gazowa i analiza elementarna wykazały obecność od 3,5 do 4,5 podstawowych jednostek powtarzalnych. Jak oznaczono metodą chromatografii gazowej, odszczepienie ramnozy nie przekracza 8%.
Badanie metodą chromatografii żelowej na Sephadex G-50 Superfine /Pharmacia/ wykazało stałą podziału /Kd/ 0,38 /przez oznaczenie heksozy/.
Immunochemiczna charakterystyka haptenów oligosacharydowych S. pneumoniae. Zdolność oligosacharydów S. pneumoniae typ 6A, 14, 19F i 23F do wzajemnego oddziaływania z przeciwciałami skierowanymi przeciw nienaruszonym polisacharydom otoczkowym zbadano
169 926 metodą opisaną przez Porro i in. [Mol. Immunol., 22,907-919/1985/] z zastosowaniem techniki z pomiarem zdolności haptenu /to jest oligosacharydu/ do hamowania homologicznego antygenu /polisacharydu otoczkowego/ pod względem odczynu immunoprecypitacji /hapteny o małej masie cząsteczkowej nie dają reakcji immunoprecypitacji przy badaniu względem przeciwciał homologicznych/.
Badanie metodą nazywaną immunoelektroforezą różnicową przeprowadza się w' sposób następujący.
Podstawa na płytki z tworzywa sztucznego do immunoelektroforezy zawiera trzy przedziały z 1% /wag/obj/ agarozą /Agarose M-LKB, Bromma, Szwecja/. Przedział pierwszy zawiera 0,05% /obj/obj/ wzorcowej surowicy odpornościowej przeciw polisacharydowi otoczkowemu. Przedział drugi zawiera 0,05% /obj/obj/ wzorcowej surowicy odpornościowej przeciw polisacharydowi otoczkowemu, którą wcześniej inkubowano ze znaną ilością wzorcowego polisacharydu otoczkowego w temperaturze 37°C, w ciągu 15 minut. Przedział trzeci zawiera 0,05% /obj/obj/ wzorcowej surowicy przeciw polisacharydowi otoczkowemu, którą wcześniej inkubowano ze znaną ilością haptenu stanowiącego oligosacharyd. Następnie przeprowadza się elektroforetyczny rozdział polisacharydu otoczkowego w czterech seryjnych dwukrotnych rozcieńczeniach, przy 70 V/cm w buforze Tris-barbituran /20 mM/, pH 8,8, w ciągu 90 minut. Po przeprowadzeniu elektroforezy płytki wybarwia się srebrowo, suszy i następnie dokonuje się oceny ilościowej. Zahamowanie przez cząsteczki oligosacharydu wykazuje się poprzez wyższe rakietkowe immunoprecypitaty pojawiające się w przedziale zawierającym wzorcową surowicę odpornościową preinkubowaną z haptenem. Najmniejsze stężenie hamujące haptenu oblicza się według wzoru:
MICHa =CHaxghH hHa w którym:
Ch = stężenie badanego haptenu w żelu, hAg = odcinek linii prostej określony przez wysokość immunoprecypitatów rakietkowych otrzymanych w obecności w żelu antygenu wzorcowego, hHa = odcinek linii prostej określony przez, wysokość akietkowych otrzymanych w obecności w żelu badanego haptenu;
Podobnie : MKAg = CAg x hAg
Δβ
Swoistość =
MICHa; MICHa ;
Badaniu poddaje się hapteny oligosacharydowe rozmaitej wielkości.
Zdolność oligosacharydów do blokowania immunoprecypitacji polisacharydów otoczkowych przez swoiste przeciwciało badano także posługujące się nieelektroforetyczną metodą immunodyfuzji radialnej. Według tej metody, zachamowanie przez cząsteczki oligosacharydu wykazuje się poprzez zwiększony promień immunoprecypitatu utworzonego w wyniku dyfuzji antygenu /polisacharydu otoczkowego/ przez 1% /wag/obj/ agarozę zawierającą swoiste przeciwciało po uprzedniej inkubacji z daną ilością inhibitora /oligosacharydu/. Po oznaczeniu na drodze eksperymentalnej wartości najmniejszego stężenia wiążącego /MCC/ dla danego haptenu, oblicza się swoistość według poprzednio wspomnianego wzoru:
Swoistość =
MCGahAso
MCCna/óligo/
169 926
Tabela 3
Charakterystyka immunologiczna Haptenów stanowiących zllgosarCardyd S. pneumoniae
| OligzsacCardd typ | DP | MW | MICps/MIChp /metodą DIEP/ | MCCps/MCChp /metodą IRID/ |
| 6A | 2 | 1,5 K | 10-3 | |
| 3,5 | 2,5 K | 10- | 10-3 | |
| 10 | 7,0 K | 10-' | ||
| 14 | 5 | 3,5 K | n.t. | 10-1 |
| 15 | 10,4 K | n.t. | 10-1 | |
| 19F | 3,5 | 2,2 K | 10-3 | O-4 |
| 23F* | 3 | 2,3 K | 10-3 | 10-2 |
| 6 | 4,5 K | 10-1 | 10-1 | |
| ** | 4,5 | 3,4 K | 10-4 | 5 x 10-3 |
| 9,5 | 7,2 K | 10-1 | 10’1 |
W powyższej tabeli 3 użyto następujących oznaczeń:
n.t. = nie daje się zbadać
DIEP = immunoelektroforeza różnicowa
IRID = zahamowanie w immunodyfuzji radialnej
MIC = najmniejsze stężenie hamujące
MCC = najmniejsze stężenie wiążące
DP = średni stopień polimeryzacji
MW = średnia masa cząsteczkowa * = hydroliza z udziałem kwasu octowego ** = hydroliza z udziałem kwasu trlfluoroortowego.
C. Aktywacja jednostki a redukującym końcem oligosacgarydów S. pneumoniae. Hapteny stanowiące oligosacCarddy, otrzymane sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu, rozpuszcza się w wodzie do uzyskania końcowego stężenia około 5 mg/ml. Do każdego roztworu dodaje się 0,1 ml 0,2 M KH2PO4 na każdy mililitr objętości roztworu, po czym podwyższa się pH do wartości 9,2-9,4 za pomocą dodania potrzebnej ilości yiamlnzetanu. Na ogół, potrzeba użyć 2 gl yiamlnoetans na każdy milimetr roztworu. Otrzymaną mieszaninę utrzymuje się w temperaturze 100°C w ciągu 15 minut i po upływie tego czasu dodaje się około 4 gl kompleksu boran-pirydyna na każdy mililitr objętości roztworu. pH doprowadza się do wartości 9,2 za pomocą dodania 1 N NaOH. Następnie, otrzymaną mieszaninę, w zatopionej ampułce, przenosi się do łaźni olejowej, o temperaturze 50°C, na okres 48 godzin. Po upływie tego czasu, otrzymany oligosacharyd zaktywowany w wyniku reakcji aminowania redukcyjnego, w postaci roztworu, poddaje się zobojętnieniu przy użyciu 1 N HCl i oczyszcza na Sephadex G-15 Superfine /15 mM NaCl, pH 7,01/. Odebrane frakcje chromatograficzne łączy się i liofilizsye. Następnie, produkt liofilizacji rozpuszcza się w stężeniu 10 mg/ml w DMSO, po czym dodaje do SIDEA /lub SIDES/ użytych w ilości moli odpowiadającej stosunkowi 5 : 1 mol/mol w odniesieniu do ilości grup aminowych obecnych w zliofilizzwandm związku. Reakcja zachodzi w temperaturze pokojowej w ciągu 4 godzin, po czym do roztworu dodaje się 4 objętości M-dioksanu /stężenie końcowe 80% w 1,4-dioksanie/ w celu wytrącenia oligosacharddu zaktywowanego w wyniku reakcji z estrem. Osad zbiera się za pomocą odwirowania, przemywa 3 razy ^-dioksanem i przetrzymuje w temperaturze -20°C, lub niższej, aż do chwili użycia w procesie koniugacji. Wydajność procesu aktywacji dla każdego z czterech ollgosacharyyów jest przedstawiona w poniższej tabeli 4.
169 926
Tabela 4
Aktywacja oligosacharydu S. pneumoniae. Wydajność procesu /% wag/wag/
| Serotyp | Oligo- NH/CH 2/2NH2 | mllgo-NH/CH2/2NH- monoester | Ogółem |
| 6A | 75 | 93 | 70 |
| 14 | 73 | 90 | 66 |
| 19F | 100 | 100 | 100 |
| 23F | 50 | 90 | 45 |
| Xg /± odchylenie standardowe/ | 74,5 /± 20/ | 93,3 /± 4,7/ | 70 /+23/ |
D. Koniugacju akcywawynego oligosochorydh ar yiałkiem CRM c. Otozymywynie binłiea CRM 197. CRM 197 wytworzone przez Corynebacterium diphtheriae C7 /B^^y, wydziela się z podłoża hodowli za pomocą sączenia molekularnego z użyciem błony Millipore XM-5- /NMWL 5 x l(0'7. Następnie wytrąca się białko za pomocą dodania do przesączu nasyconego roztworu si arczanu amonowego /aż do 65% wag/obj/. Wytrącone białko zbiera się za pomocą odwirowania i ponownie rozpuszcza w 0,01 M buforze /pH 7,2/.
Dalsze oczyszczenie CRM 197 uzyskano za pomocą chromatografii jonowymiennej przy użyciu kolumny 2,5 x 100 cm DEAE-Sepharose 6B/CL /Pharmacia, Uppsala/ kondycjonowanej w 0,01 M buforze fosforanowym, w pH 7,2 z zastosowaniem do elucji 0,09 M NaCl w 0,01 buforze fosforanowym.
Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylo-sodowym w warunkach redukujących [Pappenheimer i in., Immunochem., 9, 891-906 /1972/] wykazała, że 80% otrzymanego CRM 197 występowało w natywnej postaci cząsteczkowej. Stwierdzono, że czystość białka wynosi w przybliżeniu 400 jednostek flukulacyjnych /Lf/ na miligram.
Koniugacja aktywowanych oligosacharydów. Sposób postępowania przy koniugowaniu obejmuje sprzęganie haptenów stanowiących oligosacharydy aktywowane w wyniku reakcji estrem monosukcynoimidylowym z grupą ε-aminową reszty lizynowej nośnika białkowego, a mianowicie CRM97.
Do 0,1 M roztworu wodorowęglanu, pH 8,0, zawierającego 2 mg/ml CRM97, dodaje się sulfotlenek dimetylowy zawierający oligosacharydy, aktywowane w wyniku reakcji z estrem dlsukcenolmldylowem /kwasu adypinowego/, wywodzące się z polisacharydów otoczkowych S. pneumoeime tnp o A, 14,1 9Fi 23F 1 w wy w ku czeuopows tojw soatwór, wiano wancy 50% W0dnw roztwór, w którym stosunek molowy oligosacharydu zaktywowanego w wyniku reakcji z estrem do całości grup aminowych nośnika białkowego wynosi 1:2.
Tak otrzymaną mieszaninę przetrzymuje się, przy łagodnym mieszaniu w temperaturze 4°C w ciągu 15 godzin. Oligosacharydy pochodzące z każdego z czterech serotypów koniuguje się z białkiem w oddzielnych reakcjach. Podsumowanie charakterystyki flzjochemlczoet tak wytworzonych glikokoniugatów przedstawione jest w poniższej tabeli 5.
Tabela 5
Charakterystyka glikokoniugatu
| Serotyp | DP oligo | MW oligo | MW koniugat /SDS-PAGE/ | SD /mole oligo/mole białka/ % /wag/wag/ | Koniugowane białko |
| 6A | 3 | 2,1 K | 77,6 K | 7 | 100 |
| 14 | 5 | 3,5 K | 85,1 K | 6 | 100 |
| 19F | 3 | 1,9 K | 69,2 K | 4 | 100 |
| 23F | 6 | 4,5 | 85,0 K | 5 | 100 |
169 926
Porównanie wydajności koniugacji przy użyciu jako łącznika estru disukcynoimidylowego kwasu adypinowego i estru disukcynoimidylowego kwasu bursztynowego.
Aktywowane oligosacharydy utworzone w wyniku reakcji z estrem disukcynoimidylowym kwasu bursztynowego /SIDES/ mają budowę przedstawioną wzorem 1. Wzór 2 przedstawia budowę oligosacharydów utworzonych w wyniku reakcji z estrem disukcynoimidylowym kwasu adypinowego /SIDEA/. Łączniki między oligosacharydem a skoniugowanym białkiem mają różne rozmiary /patrz fig. U, co wynika z użycia estrów różnych kwasów. Dokonuje się oceny skuteczności koniugacji oligosacharydów aktywowanych przy użyciu SIDES w porównaniu z oligosacharydami aktywowanymi przy użyciu SEDEA. Jak to przedstawia fig. 3A, B i C, jedynie wtedy gdy łącznik wywodzi się z SEDEA, białko wydaje się występować w postaci całkowicie glikozylowanej /nie dało się w ogóle wykryć wolnego pasma CRM197, względnie tylko w niewielkim stopniu/.
169 926
Ο Ο
II II
Oligosacharyd —ΝΗζΟΗ^ΝΗ— CiCH^C — Ο — Ν
WZÓR1 //
Ο ο
II II
Oligosacharyd — ΝΗζΟΗ^ΝΗ— CCCH^C — Ο //
WZÓR 2
169 926
169 926
123456789
FIG. 3A
2 3 4 5 6 7
FIG. 3B
2 3 4 5 6 7
FIG.3C
169 926
2.0 4
«ο «ο
ΌΟ
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł
Claims (9)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania kowalencyjnego koniugatu oligosacharydu z nośnikiem białkowym, obejmujący redukcyjne aminowanie i koniugowanie z nośnikiem białkowym, znamienny tym, że oligosacharyd zawierający końcową grupę redukującą poddaje się redukcyjnemu aminowaniu diaminoetanem w obecności kompleksu boran-pirydyna, a następnie otrzymany aminowany oligosacharyd poddaje się reakcji z cząsteczką obejmującą dwie grupy funkcyjne, takąjak diester, z których jedna reaguje z końcową grupą aktywowanego oligosacharydu, a druga z nośnikiem białkowym.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aminowania redukcyjnego dokonuje się w temperaturze około 100°C.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję z kompleksem boran-pirydyna przeprowadza się w temperaturze około 50°C.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako cząsteczkę obejmującą dwie grupy funkcyjne stosuje się diester kwasu adypinowego lub diester kwasu bursztynowego.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako oligosacharyd stosuje się oligosacharyd pochodzący z polisacharydu otoczkowego Streptococcus pneumoniae.
- 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako oligosacharyd stosuje się oligosacharyd pochodzący ze Streptococcus pneumoniae o dobranym serotypie, wybranym z grupy złożonej z typów: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 20, 22F, 23F i 33F.
- 7. Sposób według zastrz. 1, albo 6, znamienny tym, że jako oligosacharyd stosuje się oligosacharyd pochodzący z polisacharydu otoczkowego bakterii wybranych z grupy złożonej z Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Escherichia coli, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae i Straphylococcus aureus.
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako nośnik białkowy stosuje się CPMI197.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako nośnik białkowy stosuje się nośnik białkowy wybrany w grupy złożonej z flageliny Salmonella, piliny Haemophilus, białka błony Haemophilus 15 kDa, 28-30 kDa lub 40 kDa, ciepłochwiejnej enterotoksyny LTB Escherichia coli, toksyny błonicznej, toksyny tężcowej, toksyny przecinkowca cholery, białka rotawirusa VP7 i białka wirusa oddechowego F lub G.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/590,649 US5153312A (en) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | Oligosaccharide conjugate vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL291855A1 PL291855A1 (en) | 1992-10-05 |
| PL169926B1 true PL169926B1 (pl) | 1996-09-30 |
Family
ID=24363087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL91291855A PL169926B1 (pl) | 1990-09-28 | 1991-09-27 | Sposób wytwarzania kowalencyjnego koniugatu oligosacharydu z nosnikiem bialkowym PL PL PL PL PL PL PL PL |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5153312A (pl) |
| EP (1) | EP0477508B1 (pl) |
| JP (1) | JP3027452B2 (pl) |
| KR (1) | KR100217317B1 (pl) |
| CN (1) | CN1034054C (pl) |
| AT (1) | ATE124868T1 (pl) |
| AU (1) | AU634663B2 (pl) |
| CA (1) | CA2052323C (pl) |
| CZ (1) | CZ285650B6 (pl) |
| DE (1) | DE69111168T2 (pl) |
| FI (1) | FI104046B1 (pl) |
| HU (1) | HU211210B (pl) |
| IE (1) | IE71671B1 (pl) |
| IL (1) | IL99119A (pl) |
| NO (1) | NO300759B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ239878A (pl) |
| PL (1) | PL169926B1 (pl) |
| PT (1) | PT99067B (pl) |
| SK (1) | SK280112B6 (pl) |
| TW (1) | TW324664B (pl) |
| ZA (1) | ZA917771B (pl) |
Families Citing this family (223)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5153312A (en) * | 1990-09-28 | 1992-10-06 | American Cyanamid Company | Oligosaccharide conjugate vaccines |
| US7279162B1 (en) | 1990-10-22 | 2007-10-09 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Isolated broadly reactive opsonic immunoglobulin for treating a pathogenic coagulase-negative staphylococcus infection |
| US5622649A (en) * | 1991-06-27 | 1997-04-22 | Emory University | Multiple emulsions and methods of preparation |
| FR2682388B1 (fr) * | 1991-10-10 | 1995-06-09 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de preparation d'un oligoside par depolymerisation d'un polyoside issu d'un agent pathogene, oligoside ainsi obtenu et son utilisation notamment comme agent vaccinal. |
| JP3917172B2 (ja) * | 1992-02-11 | 2007-05-23 | ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデーション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン | 二重担体の免疫原性構成体 |
| US7141244B1 (en) * | 1992-03-02 | 2006-11-28 | Chiron Srl | Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics |
| US5445817A (en) * | 1992-08-21 | 1995-08-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Pertussis toxin used as a carrier protein with non-charged saccharides in conjugate vaccines |
| AU5128593A (en) * | 1992-09-16 | 1994-04-12 | University Of Tennessee Research Corporation, The | Antigen of hybrid m protein and carrier for group a streptococcal vaccine |
| US6531156B1 (en) | 1994-04-15 | 2003-03-11 | Temple University | Aqueous solven encapsulation method, apparatus and microcapsules |
| EP0769018B1 (en) * | 1994-07-01 | 2002-12-18 | Chiron Corporation | Helicobacter proteins and vaccines |
| US5565204A (en) * | 1994-08-24 | 1996-10-15 | American Cyanamid Company | Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections |
| US5866132A (en) * | 1995-06-07 | 1999-02-02 | Alberta Research Council | Immunogenic oligosaccharide compositions |
| IL121585A0 (en) * | 1995-06-07 | 1998-02-08 | Alberta Res Council | Immunogenic and immunostimulatory oligosaccharide compositions and methods of preparing and using them |
| US6284884B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-09-04 | North American Vaccine, Inc. | Antigenic group B streptococcus type II and type III polysaccharide fragments having a 2,5-anhydro-D-mannose terminal structure and conjugate vaccine thereof |
| US5695768A (en) * | 1995-06-07 | 1997-12-09 | Alberta Research Council | Immunostimulating activity of Streptococcus pneumoniae serotype 8 oligosaccharides |
| NZ312132A (en) | 1995-06-23 | 1999-04-29 | Smithkline Beecham Biolog | A vaccine composition comprising a polysaccharide conjugate antigen adsorbed onto aluminium phosphate |
| US6872398B2 (en) * | 1995-12-22 | 2005-03-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Conjugate vaccine against gram-negative bacterial infections |
| WO1997025429A1 (en) | 1996-01-04 | 1997-07-17 | Rican Limited | Helicobacter pylori bacterioferritin |
| ZA97248B (en) * | 1996-01-18 | 1997-07-18 | Rohm & Haas | Method for identifying and quantifying polymers utilizing immunoassay techniques |
| US6207157B1 (en) | 1996-04-23 | 2001-03-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Conjugate vaccine for nontypeable Haemophilus influenzae |
| US6309646B1 (en) | 1996-05-09 | 2001-10-30 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Protein-polysaccharide conjugate vaccines and other immunological reagents prepared using homobifunctional and heterobifunctional vinylsulfones, and processes for preparing the conjugates |
| CA2264735C (en) * | 1996-08-27 | 2008-01-29 | Chiron Corporation | Neisseria meningitidis serogroup b glycoconjugates and methods of using the same |
| US6299881B1 (en) * | 1997-03-24 | 2001-10-09 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts |
| US6610293B1 (en) | 1997-06-16 | 2003-08-26 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Opsonic and protective monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of gram positive bacteria |
| US5847110A (en) * | 1997-08-15 | 1998-12-08 | Biomedical Frontiers, Inc. | Method of reducing a schiff base |
| KR100680014B1 (ko) | 1997-10-03 | 2007-02-09 | 갈레니카 파마슈티칼스 인크. | 이민 형성 폴리사카라이드, 이의 제조 방법 및 이것의 아쥬반트 및 면역자극제로서의 용도 |
| AU763349B2 (en) | 1998-02-05 | 2003-07-17 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Simplified method for removing free protein during preparation of protein-polysaccharide conjugates and vaccines using restricted-access media |
| AU759391B2 (en) * | 1998-02-12 | 2003-04-10 | Wyeth Holdings Corporation | Pneumococcal and meningococcal vaccines formulated with interleukin-12 |
| US7018637B2 (en) * | 1998-02-23 | 2006-03-28 | Aventis Pasteur, Inc | Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines |
| CA2329897A1 (en) | 1998-04-28 | 1999-11-04 | Galenica Pharmaceuticals, Inc. | Polysaccharide-antigen conjugates |
| US7250494B2 (en) * | 1998-06-15 | 2007-07-31 | Biosynexus Incorporated | Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram positive bacteria |
| US6858211B1 (en) | 1998-07-20 | 2005-02-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vaccines against Escherichia coli O157 infection |
| HUP0103100A3 (en) * | 1998-08-19 | 2005-11-28 | Baxter Healthcare Sa | Immunogenic betha-propionamido-linked polysaccharide protein conjugate useful as a vaccine produced using an n-acryloylated polysaccharide |
| US6797275B1 (en) * | 1998-12-04 | 2004-09-28 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of immunizing humans against Salmonella typhi using a Vi-rEPA conjugate vaccine |
| US6146902A (en) * | 1998-12-29 | 2000-11-14 | Aventis Pasteur, Inc. | Purification of polysaccharide-protein conjugate vaccines by ultrafiltration with ammonium sulfate solutions |
| GB9928196D0 (en) * | 1999-11-29 | 2000-01-26 | Chiron Spa | Combinations of B, C and other antigens |
| FR2806304B1 (fr) * | 2000-03-17 | 2002-05-10 | Aventis Pasteur | Conjugues polysaccharidiques du pneumocoque a usage vaccinal contre le tetanos et la diphterie |
| US7749511B2 (en) | 2000-04-18 | 2010-07-06 | Endobiologics, Incorporated | Anti-sepsis conjugate vaccine |
| EP1278548A2 (en) * | 2000-04-18 | 2003-01-29 | Endobiologics, Incorporated | Lipopolysaccharide-conjugate vaccine for sepsis treatment |
| WO2002016440A2 (en) * | 2000-08-25 | 2002-02-28 | Aventis Pasteur Limited | Haemophilus influenzae lipopolysaccharide inner-core oligosaccharide epitopes as vaccines for the prevention of haemophilus influenzae infections |
| US7723296B2 (en) | 2001-01-18 | 2010-05-25 | Genzyme Corporation | Methods for introducing mannose-6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins and its application thereof |
| CA2435681C (en) | 2001-01-23 | 2011-06-21 | Aventis Pasteur | Multivalent meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine |
| GB0115176D0 (en) | 2001-06-20 | 2001-08-15 | Chiron Spa | Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines |
| GB0118249D0 (en) | 2001-07-26 | 2001-09-19 | Chiron Spa | Histidine vaccines |
| GB0121591D0 (en) | 2001-09-06 | 2001-10-24 | Chiron Spa | Hybrid and tandem expression of neisserial proteins |
| US20050175629A1 (en) * | 2001-08-31 | 2005-08-11 | Giuseppe Del Giudice | Helicobacter pylori vaccination |
| GB0129007D0 (en) * | 2001-12-04 | 2002-01-23 | Chiron Spa | Adjuvanted antigenic meningococcal compositions |
| AU2003215316A1 (en) * | 2002-02-20 | 2003-09-09 | Chiron Corporation | Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules |
| DE60325696D1 (de) * | 2002-02-22 | 2009-02-26 | Ca Nat Research Council | Synthese von lipopolysaccharid-protein konjugatvaccinen über die lipid-a region nach entfernung des glycosidischen phosphatresidüs |
| WO2003094961A1 (en) * | 2002-05-09 | 2003-11-20 | Massimo Porro | Improved polysaccharide and glycoconjugate vaccines_____________ |
| MXPA04011249A (es) | 2002-05-14 | 2005-06-06 | Chiron Srl | Vacunas mucosales con adyuvante de quitosano y antigenos meningococicos. |
| GB0211118D0 (en) | 2002-05-15 | 2002-06-26 | Polonelli Luciano | Vaccines |
| MY149591A (en) | 2002-08-02 | 2013-09-13 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccines comprising l2 and/or l3 los from neisseria |
| SI2351579T1 (sl) | 2002-10-11 | 2017-05-31 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Polipeptidna cepiva za široko zaščito proti hipervirulentnim meningokoknim linijam |
| MY145693A (en) | 2002-11-01 | 2012-03-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | A method of drying without freezing or bubbling |
| GB0227346D0 (en) | 2002-11-22 | 2002-12-31 | Chiron Spa | 741 |
| CA2511512C (en) | 2002-12-27 | 2013-10-29 | Chiron Corporation | Immunogenic compositions containing phospholipid |
| FR2850106B1 (fr) * | 2003-01-17 | 2005-02-25 | Aventis Pasteur | Conjugues obtenus par amination reductrice du polysaccharide capsulaire du pneumocoque de serotype 5 |
| CA2514328C (en) | 2003-01-30 | 2020-01-14 | Chiron Srl | Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups |
| WO2004087153A2 (en) | 2003-03-28 | 2004-10-14 | Chiron Corporation | Use of organic compounds for immunopotentiation |
| EP2386313A1 (en) | 2003-05-07 | 2011-11-16 | Sanofi Pasteur, Inc. | Multivalent meningococcal derivatized polysaccharide-protein conjugates and vaccine |
| CN1819843A (zh) | 2003-05-07 | 2006-08-16 | 安万特巴斯德公司 | 增强脑膜炎球菌疫苗接种免疫原性的方法 |
| DE602004022286D1 (de) | 2003-06-02 | 2009-09-10 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunogene zusammensetzungen auf basis von biologisch abbaubaren mikroteilchen enthaltend ein diphtherie- und ein tetanustoxoid |
| GB0313916D0 (en) | 2003-06-16 | 2003-07-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine composition |
| WO2005000345A2 (en) | 2003-06-23 | 2005-01-06 | Aventis Pasteur, Inc. | Immunization method against neisseria meningitidis serogroups a and c |
| JP4918356B2 (ja) * | 2003-06-23 | 2012-04-18 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | Ｙ群髄膜炎菌ワクチン及びそれらの髄膜炎菌組合せワクチン |
| AU2004277758A1 (en) | 2003-10-02 | 2005-04-14 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Liquid vaccines for multiple meningococcal serogroups |
| GB0323103D0 (en) | 2003-10-02 | 2003-11-05 | Chiron Srl | De-acetylated saccharides |
| AU2004277342B2 (en) | 2003-10-02 | 2010-12-16 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Pertussis antigens and use thereof in vaccination |
| KR101157694B1 (ko) | 2003-12-17 | 2012-06-20 | 와이어쓰 엘엘씨 | 면역원성 펩티드 캐리어 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법 |
| KR101158147B1 (ko) | 2003-12-17 | 2012-07-17 | 와이어쓰 엘엘씨 | Ａβ 면역원성 펩티드 캐리어 컨쥬게이트 및 이의 제조방법 |
| US7422755B2 (en) * | 2004-01-15 | 2008-09-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antimultiorganism glycoconjugate vaccine |
| EP1713508A2 (en) * | 2004-01-29 | 2006-10-25 | Biosynexus Incorporated | Use of amino-oxy functional groups in the preparation of vaccine conjugates |
| GB0406013D0 (en) | 2004-03-17 | 2004-04-21 | Chiron Srl | Analysis of saccharide vaccines without interference |
| GB0408978D0 (en) | 2004-04-22 | 2004-05-26 | Chiron Srl | Meningococcal fermentation for preparing conjugate vaccines |
| EP1740217B1 (en) | 2004-04-30 | 2011-06-15 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Meningococcal conjugate vaccination |
| GB0409745D0 (en) | 2004-04-30 | 2004-06-09 | Chiron Srl | Compositions including unconjugated carrier proteins |
| GB0500787D0 (en) | 2005-01-14 | 2005-02-23 | Chiron Srl | Integration of meningococcal conjugate vaccination |
| GB0411387D0 (en) | 2004-05-21 | 2004-06-23 | Chiron Srl | Analysis of saccharide length |
| GB0413868D0 (en) | 2004-06-21 | 2004-07-21 | Chiron Srl | Dimensional anlaysis of saccharide conjugates |
| CA2571421A1 (en) | 2004-06-24 | 2006-01-05 | Nicholas Valiante | Compounds for immunopotentiation |
| EP1768662A2 (en) | 2004-06-24 | 2007-04-04 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Small molecule immunopotentiators and assays for their detection |
| US20060165716A1 (en) | 2004-07-29 | 2006-07-27 | Telford John L | Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae |
| US20060088554A1 (en) | 2004-08-30 | 2006-04-27 | Ryall Robert P | Multivalent meningococcal derivatized polysaccharide-protein conjugates and vaccine |
| GB0420466D0 (en) * | 2004-09-14 | 2004-10-20 | Cassone Antonio | Anti-glucan antibodies |
| AU2005286798A1 (en) | 2004-09-21 | 2006-03-30 | Sanofi Pasteur, Inc. | Multivalent meningococcal derivatized polysaccharide-protein conjugates and vaccine |
| GB0502096D0 (en) | 2005-02-01 | 2005-03-09 | Chiron Srl | Purification of streptococcal capsular polysaccharide |
| GB0502095D0 (en) | 2005-02-01 | 2005-03-09 | Chiron Srl | Conjugation of streptococcal capsular saccharides |
| GB0505518D0 (en) | 2005-03-17 | 2005-04-27 | Chiron Srl | Combination vaccines with whole cell pertussis antigen |
| GB0505996D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Fermentation process |
| CN113198013B (zh) * | 2005-04-08 | 2024-02-20 | 惠氏有限责任公司 | 多价肺炎球菌多糖－蛋白质缀合物组合物 |
| US7955605B2 (en) | 2005-04-08 | 2011-06-07 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| AU2011253684B8 (en) * | 2005-04-08 | 2013-07-11 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| US20070184072A1 (en) * | 2005-04-08 | 2007-08-09 | Wyeth | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| US7709001B2 (en) | 2005-04-08 | 2010-05-04 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| SI1896063T1 (sl) | 2005-06-27 | 2012-03-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Imunogeni sestavek |
| BRPI0615420A2 (pt) | 2005-09-01 | 2011-05-17 | Novartis Vaccines & Diagnostic | vacinação múltipla que inclui meningococo do sorogrupo c |
| JP5044754B2 (ja) * | 2005-09-21 | 2012-10-10 | アメリカ合衆国 | カンピロバクター・ジェジュニに対するワクチン成分として使用される免疫原莢膜組成物 |
| US9999591B2 (en) * | 2005-09-21 | 2018-06-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Immunogenic composition against Campylobacter jejuni |
| US7700578B2 (en) * | 2005-09-21 | 2010-04-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Capsule composition for use as immunogen against Campylobacter jejuni |
| GB0522303D0 (en) | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Chiron Srl | Culture method |
| EP2360175B1 (en) | 2005-11-22 | 2014-07-16 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Norovirus and Sapovirus virus-like particles (VLPs) |
| GB0524066D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Chiron Srl | 741 ii |
| GB0607088D0 (en) | 2006-04-07 | 2006-05-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| EA014107B1 (ru) | 2005-12-22 | 2010-10-29 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae |
| JP4822854B2 (ja) * | 2006-01-18 | 2011-11-24 | 株式会社有沢製作所 | フレキシブルプリント配線板用ポリアミドイミド樹脂、並びに該樹脂を用いた金属張り積層板、カバーレイ、フレキシブルプリント配線板、及び樹脂組成物 |
| US20080026002A1 (en) | 2006-03-22 | 2008-01-31 | Lisa Danzig | Regimens for immunisation with meningococcal conjugates |
| GB0605757D0 (en) | 2006-03-22 | 2006-05-03 | Chiron Srl | Separation of conjugated and unconjugated components |
| ES2376492T3 (es) | 2006-03-23 | 2012-03-14 | Novartis Ag | Compuestos de imidazoquinoxalina como inmunomoduladores. |
| CA2647100A1 (en) * | 2006-03-23 | 2007-09-27 | Novartis Ag | Methods for the preparation of imidazole-containing compounds |
| ES2388556T3 (es) | 2006-03-23 | 2012-10-16 | Novartis Ag | Compuestos inmunopotenciadores |
| US8808707B1 (en) | 2006-05-08 | 2014-08-19 | Wyeth Llc | Pneumococcal dosing regimen |
| EP2054431B1 (en) | 2006-06-09 | 2011-08-31 | Novartis AG | Conformers of bacterial adhesins |
| TWI565713B (zh) * | 2006-08-07 | 2017-01-11 | 哈佛大學校長及研究員協會 | 蛋白基質疫苗以及該疫苗的製造與使用方法 |
| CN101553246B (zh) * | 2006-08-07 | 2019-05-21 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 蛋白质基质疫苗及这种疫苗的制备和给药方法 |
| EP2066344B2 (en) | 2006-09-07 | 2016-06-29 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Inactivated Poliovirus combination vaccine |
| GB0700136D0 (en) | 2007-01-04 | 2007-02-14 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Process for manufacturing vaccines |
| GB0700562D0 (en) | 2007-01-11 | 2007-02-21 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Modified Saccharides |
| CN102978185B (zh) | 2007-01-18 | 2015-02-11 | 建新公司 | 包含氨基氧基基团的寡糖及其轭合物 |
| EA201490303A1 (ru) | 2007-05-02 | 2014-05-30 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Вакцина |
| RU2009149359A (ru) | 2007-06-04 | 2011-07-20 | Новартис АГ (CH) | Состав вакцин против менингита |
| PT2167121E (pt) | 2007-06-26 | 2015-12-02 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vacina compreendendo conjugados de polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae |
| CA2699513C (en) | 2007-09-12 | 2018-03-13 | Novartis Ag | Gas57 mutant antigens and gas57 antibodies |
| GB0818453D0 (en) | 2008-10-08 | 2008-11-12 | Novartis Ag | Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom |
| AU2008339551B2 (en) | 2007-12-21 | 2013-10-24 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Mutant forms of streptolysin O |
| DK2349520T3 (en) | 2008-10-27 | 2016-08-15 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Purification Procedure for Group A Streptococcus Carbohydrate |
| GB0822633D0 (en) | 2008-12-11 | 2009-01-21 | Novartis Ag | Formulation |
| CN103432566A (zh) | 2008-12-16 | 2013-12-11 | 建新公司 | 寡糖-蛋白缀合物 |
| CN102481349B (zh) | 2009-01-12 | 2014-10-15 | 诺华股份有限公司 | 抗革兰氏阳性细菌疫苗中的Cna_B结构域 |
| US9050283B2 (en) | 2009-01-16 | 2015-06-09 | University Of Maryland, Baltimore | Broad spectrum vaccine against non-typhoidal Salmonella |
| US20120135037A1 (en) | 2009-06-01 | 2012-05-31 | Mizel Steven B | Flagellin fusion proteins and conjugates comprising pneumococcus antigens and methods of using the same |
| WO2011017101A2 (en) | 2009-07-27 | 2011-02-10 | Fina Biosolutions, Llc | Method for producing protein-carbohydrate vaccines reduced in free carbohydrate |
| MX338753B (es) | 2009-09-30 | 2016-04-29 | Novartis Ag | Conjugacion de polisacaridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8 de staphylococcus aureus. |
| GB0917647D0 (en) | 2009-10-08 | 2009-11-25 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Expression system |
| CN109134677A (zh) | 2009-10-30 | 2019-01-04 | 诺华股份有限公司 | 金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的纯化 |
| BR122022002139B1 (pt) | 2009-12-17 | 2022-08-23 | Fina Biosolutions, Llc | Processo de conjugação de carboidratos na preparação de vacinas conjugadas e suas respectivas vacinas |
| ES2707778T3 (es) | 2009-12-30 | 2019-04-05 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Inmunógenos polisacáridos conjugados con proteínas portadoras de E. coli |
| GB201003924D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
| GB201003922D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
| CN102869377A (zh) | 2010-03-10 | 2013-01-09 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 免疫原性组合物 |
| EP2547357A1 (en) | 2010-03-18 | 2013-01-23 | Novartis AG | Adjuvanted vaccines for serogroup b meningococcus |
| JP2013529894A (ja) | 2010-04-07 | 2013-07-25 | ノバルティス アーゲー | パルボウイルスｂ１９のウイルス様粒子を生成するための方法 |
| CA2797052A1 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | Ancora Pharmaceuticals Inc. | Synthetic oligosaccharides for staphyloccocus vaccine |
| ES2743156T3 (es) | 2010-04-23 | 2020-02-18 | Serum Institute Of India Pvt Ltd | Método simple para eliminación simultánea de múltiples impurezas a partir de sobrenadantes de cultivo a niveles ultrabajos |
| US8716469B2 (en) | 2010-04-27 | 2014-05-06 | Ancora Pharmaceuticals, Inc. | Synthetic oligosaccharides for Moraxella vaccine |
| WO2011149778A1 (en) | 2010-05-26 | 2011-12-01 | Ancora Pharmaceuticals Inc. | Synthetic oligosaccharides for neisseria meningitis vaccine |
| WO2011149564A1 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | Tetris Online, Inc. | Interactive hybrid asynchronous computer game infrastructure |
| CA2804501C (en) | 2010-07-06 | 2021-01-26 | Novartis Ag | Noro virus derived immunogenic compositions and methods |
| GB201015132D0 (en) | 2010-09-10 | 2010-10-27 | Univ Bristol | Vaccine composition |
| GB201101665D0 (en) | 2011-01-31 | 2011-03-16 | Novartis Ag | Immunogenic compositions |
| WO2012085668A2 (en) | 2010-12-24 | 2012-06-28 | Novartis Ag | Compounds |
| CN102068690A (zh) * | 2010-12-31 | 2011-05-25 | 北京民海生物科技有限公司 | 多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗及其制备方法 |
| JP6191082B2 (ja) | 2011-03-02 | 2017-09-06 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | より低用量の抗原および／またはアジュバントを有する混合ワクチン |
| ES2641090T3 (es) | 2011-03-29 | 2017-11-07 | Covestro Deutschland Ag | Uso de una preparación acuosa para el revestimiento de superficies de madera para lograr un efecto de tacto natural |
| WO2012130764A1 (en) | 2011-03-29 | 2012-10-04 | Bayer Materialscience Ag | Use of an aqueous preparation for the coating of wood surfaces to achieve a natural-touch effect |
| GB201106225D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Fermentation process |
| EP2729178A1 (en) | 2011-07-08 | 2014-05-14 | Novartis AG | Tyrosine ligation process |
| US10030052B2 (en) | 2011-07-25 | 2018-07-24 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Parvovirus Vp1 unique region polypeptides and compositions thereof |
| TR201909110T4 (tr) | 2011-09-14 | 2019-07-22 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Sakarit-protein glikokonjugatları yapmaya yönelik yöntemler. |
| RU2636350C2 (ru) | 2011-11-07 | 2017-11-22 | Новартис Аг | МОЛЕКУЛА, СОДЕРЖАЩАЯ SPR0096 и SPR2021 |
| GB2495341B (en) | 2011-11-11 | 2013-09-18 | Novartis Ag | Fermentation methods and their products |
| DE102011122891B4 (de) | 2011-11-11 | 2014-12-24 | Novartis Ag | Fermentationsmedium, das frei von tierischen Bestandteilen ist, zur Herstellung von Diphtherie-Toxoiden zur Verwendung bei der Impfung von Menschen |
| EP2592137A1 (en) | 2011-11-11 | 2013-05-15 | Novartis AG | Fermentation media free of animal-derived components for production of diphtheria toxoids suitable for human vaccine use |
| DE102011118371B4 (de) | 2011-11-11 | 2014-02-13 | Novartis Ag | Zur Impfung von Menschen geeignete Zusammensetzung, die ein Diphtherie-Toxoid umfasst, sowie Verfahren zu deren Herstellung |
| GB201121301D0 (en) | 2011-12-12 | 2012-01-25 | Novartis Ag | Method |
| US20150125486A1 (en) | 2012-03-08 | 2015-05-07 | Novartis Ag | Adjuvanted formulations of pediatric antigens |
| SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
| JP2015518845A (ja) | 2012-05-22 | 2015-07-06 | ノバルティス アーゲー | 髄膜炎菌血清群ｘコンジュゲート |
| KR102057217B1 (ko) | 2012-06-20 | 2020-01-22 | 에스케이바이오사이언스 주식회사 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 |
| MX2015002717A (es) | 2012-09-06 | 2015-05-15 | Novartis Ag | Vacunas combinadas con meningococo del serogrupo b y toxoides de difteria/tetanos/tosferina. |
| EP2903650B1 (en) | 2012-10-02 | 2018-04-04 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Nonlinear saccharide conjugates |
| RU2015106791A (ru) | 2012-10-03 | 2016-11-20 | Глэксосмитиклайн Байолоджикалз Са | Иммуногенные композиции |
| CA2886938A1 (en) | 2012-10-12 | 2014-04-17 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Non-cross-linked acellular pertussis antigens for use in combination vaccines |
| KR20140075196A (ko) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | 에스케이케미칼주식회사 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 |
| EP2743695A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-18 | Nanogap Sub NM Powder, S.A. | Methods and reagents for the detection of biomolecules using luminescence |
| CA2894260A1 (en) | 2012-12-18 | 2014-06-26 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Conjugates for protecting against diphtheria and/or tetanus |
| CA2893343C (en) * | 2012-12-20 | 2019-05-14 | Pfizer Inc. | Glycoconjugation process |
| ITMI20130142A1 (it) * | 2013-01-31 | 2014-08-01 | Biosynth Srl | Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporati |
| EA030749B1 (ru) | 2013-03-08 | 2018-09-28 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Бесклеточная противококлюшная вакцина |
| SG11201600042YA (en) * | 2013-07-07 | 2016-02-26 | Max Planck Ges Zur Förderung Der Wissenschaften E V | Synthetic vaccines against streptococcus pneumoniae type 1 |
| CA2918076A1 (en) | 2013-07-11 | 2015-01-15 | Novartis Ag | Site-specific chemoenzymatic protein modifications |
| EP3041502A2 (en) | 2013-09-08 | 2016-07-13 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| MX371453B (es) * | 2014-01-21 | 2020-01-29 | Pfizer | Polisacaridos capsulares de streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos. |
| WO2016044773A1 (en) * | 2014-09-18 | 2016-03-24 | University Of Maryland, Baltimore | Broad spectrum conjugate vaccine to prevent klebsiella pneumoniae and pseudomonas aeruginosa infections |
| US9107906B1 (en) | 2014-10-28 | 2015-08-18 | Adma Biologics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency |
| US10500261B2 (en) | 2014-11-05 | 2019-12-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Synthetic antigen constructs against campylobacter jejuni |
| CA2966754A1 (en) | 2014-11-05 | 2016-05-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Synthetic antigen constructs against campylobacter jejuni |
| EP3034516A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-22 | Novartis AG | Purification of streptococcal capsular polysaccharide |
| GB201518684D0 (en) | 2015-10-21 | 2015-12-02 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| WO2017085586A1 (en) * | 2015-11-20 | 2017-05-26 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
| GB201610599D0 (en) | 2016-06-17 | 2016-08-03 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic Composition |
| WO2017220753A1 (en) | 2016-06-22 | 2017-12-28 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| EP3269385A1 (en) | 2016-07-12 | 2018-01-17 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| EP3530285B1 (en) | 2016-10-20 | 2023-08-09 | KM Biologics Co., Ltd. | METHOD FOR PRODUCING HIB CONJUGATE VACCINE USING PRP WITH
LOWERED MOLECULAR WEIGHT |
| US20210108002A1 (en) | 2016-12-06 | 2021-04-15 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Purification Process For Capsular Polysaccharide |
| CN116870144A (zh) | 2017-01-31 | 2023-10-13 | 默沙东有限责任公司 | 制备多糖-蛋白缀合物的方法 |
| PE20191107A1 (es) | 2017-01-31 | 2019-08-26 | Pfizer | Composiciones de neisseria meningitidis y metodos respectivos |
| US10259865B2 (en) | 2017-03-15 | 2019-04-16 | Adma Biologics, Inc. | Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection |
| GB201721582D0 (en) | 2017-12-21 | 2018-02-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | S aureus antigens and immunogenic compositions |
| GB201721576D0 (en) | 2017-12-21 | 2018-02-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hla antigens and glycoconjugates thereof |
| WO2019152925A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-08-08 | Sanofi Pasteur Inc. | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| EP3782642A4 (en) * | 2018-04-18 | 2022-04-13 | SK Bioscience Co., Ltd. | Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and immunogenic conjugate thereof |
| MX2021000548A (es) | 2018-07-19 | 2021-07-02 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Procesos para preparar polisacáridos en seco. |
| WO2020043874A1 (en) | 2018-08-31 | 2020-03-05 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Conjugated haemophilus influenzae vaccine using bordetella outer membrane vesicle |
| US20220054632A1 (en) | 2018-12-12 | 2022-02-24 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modified carrier proteins for o-linked glycosylation |
| CA3129425A1 (en) | 2019-02-11 | 2020-08-20 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| EP3757217A1 (en) | 2019-06-27 | 2020-12-30 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Methods for protein purification |
| EP3777884A1 (en) | 2019-08-15 | 2021-02-17 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| KR20220069992A (ko) | 2019-09-27 | 2022-05-27 | 화이자 인코포레이티드 | 네이세리아 메닌기티디스 조성물 및 그의 방법 |
| EP3799884A1 (en) | 2019-10-01 | 2021-04-07 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Immunogenic compositions |
| EP3900739A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-27 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Synthetic streptococcus pneumoniae saccharide conjugates to conserved membrane protein |
| EP3919076A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-08 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Synthetic oligosaccharide vaccines against streptococcus pneumoniae with microparticle adjuvant formulations |
| EP4164681A1 (en) | 2020-06-12 | 2023-04-19 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Bacterial immunization using nanoparticle vaccine |
| US20230293657A1 (en) | 2020-06-25 | 2023-09-21 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccine |
| EP4243862A1 (en) | 2020-11-13 | 2023-09-20 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Bacterial protein carriers and conjugation methods |
| WO2023111826A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-22 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Bacterial immunization using qbeta hairpin nanoparticle constructs |
| IL316130A (en) | 2022-04-11 | 2024-12-01 | Sanofi Pasteur Inc | Protein-saccharide conjugate with sodium cyanoborohydride |
| CN116942804A (zh) | 2022-04-19 | 2023-10-27 | 上海瑞宙生物科技有限公司 | 多价肺炎球菌多糖结合疫苗的成分及其应用 |
| GB202215414D0 (en) | 2022-10-18 | 2022-11-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccine |
| GB202302579D0 (en) | 2023-02-23 | 2023-04-12 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic composition |
| WO2025021704A1 (en) | 2023-07-21 | 2025-01-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccine |
| WO2025032534A2 (en) | 2023-08-09 | 2025-02-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modified proteins |
| WO2025032535A2 (en) | 2023-08-09 | 2025-02-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modified proteins |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4057685A (en) * | 1972-02-02 | 1977-11-08 | Abbott Laboratories | Chemically modified endotoxin immunizing agent |
| US4314988A (en) * | 1979-10-31 | 1982-02-09 | Baker Instruments Corp. | Folic acid derivatives and process for preparation |
| US4356170A (en) * | 1981-05-27 | 1982-10-26 | Canadian Patents & Development Ltd. | Immunogenic polysaccharide-protein conjugates |
| US4619828A (en) * | 1982-07-06 | 1986-10-28 | Connaught Laboratories, Inc. | Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines |
| US4557931A (en) * | 1982-12-02 | 1985-12-10 | Regents Of The University Of California | Antigenic compositions and methods for using same |
| US4663160A (en) * | 1983-03-14 | 1987-05-05 | Miles Laboratories, Inc. | Vaccines for gram-negative bacteria |
| US4761283A (en) * | 1983-07-05 | 1988-08-02 | The University Of Rochester | Immunogenic conjugates |
| US4808700A (en) * | 1984-07-09 | 1989-02-28 | Praxis Biologics, Inc. | Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers |
| NZ214503A (en) * | 1984-12-20 | 1990-02-26 | Merck & Co Inc | Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates |
| IT1187753B (it) * | 1985-07-05 | 1987-12-23 | Sclavo Spa | Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente |
| NZ223009A (en) * | 1986-12-31 | 1990-06-26 | Nl Rivm Of Thoven | Oligosaccharides containing d-ribose d-ribitol and phosphate units mimicing haemophilus influenzae type b antigens |
| US5153312A (en) * | 1990-09-28 | 1992-10-06 | American Cyanamid Company | Oligosaccharide conjugate vaccines |
-
1990
- 1990-09-28 US US07/590,649 patent/US5153312A/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-08-06 DE DE69111168T patent/DE69111168T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-08-06 EP EP91113163A patent/EP0477508B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-08-06 AT AT91113163T patent/ATE124868T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-08-07 IL IL9911991A patent/IL99119A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-08-29 TW TW080106853A patent/TW324664B/zh active
- 1991-09-20 NZ NZ239878A patent/NZ239878A/xx unknown
- 1991-09-24 JP JP3270517A patent/JP3027452B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-26 PT PT99067A patent/PT99067B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-09-26 CA CA002052323A patent/CA2052323C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-27 CZ CS912969A patent/CZ285650B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-09-27 IE IE339991A patent/IE71671B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-27 HU HU913103A patent/HU211210B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-09-27 KR KR1019910016912A patent/KR100217317B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-27 NO NO913812A patent/NO300759B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-09-27 PL PL91291855A patent/PL169926B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-09-27 SK SK2969-91A patent/SK280112B6/sk unknown
- 1991-09-27 ZA ZA917771A patent/ZA917771B/xx unknown
- 1991-09-27 AU AU84833/91A patent/AU634663B2/en not_active Ceased
- 1991-09-27 FI FI914564A patent/FI104046B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-09-27 CN CN91109424A patent/CN1034054C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-07-30 US US07/921,678 patent/US5306492A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL169926B1 (pl) | Sposób wytwarzania kowalencyjnego koniugatu oligosacharydu z nosnikiem bialkowym PL PL PL PL PL PL PL PL | |
| Anderson | Antibody responses to Haemophilus influenzae type b and diphtheria toxin induced by conjugates of oligosaccharides of the type b capsule with the nontoxic protein CRM197 | |
| JP2736248B2 (ja) | 莢膜ポリマーフラグメントの製造方法 | |
| Beuvery et al. | Comparison of the induction of immunoglobulin M and G antibodies in mice with purified pneumococcal type 3 and meningococcal group C polysaccharides and their protein conjugates | |
| Paoletti et al. | Effects of chain length on the immunogenicity in rabbits of group B Streptococcus type III oligosaccharide-tetanus toxoid conjugates. | |
| Powers et al. | Reactogenicity and immunogenicity of a protein-conjugated pneumococcal oligosaccharide vaccine in older adults | |
| Paoletti et al. | Neonatal mouse protection against infection with multiple group B streptococcal (GBS) serotypes by maternal immunization with a tetravalent GBS polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine | |
| JP4001625B2 (ja) | ２，５−アンヒドロ−ｄ−マンノース末端構造を持つ、抗原性グループｂ連鎖球菌２型および３型多糖断片とその複合ワクチン | |
| KR19990007777A (ko) | 면역성 및 면역자극성 올리고당 조성물 및 이를 제조하고 이용하는 방법 | |
| Devi et al. | Preclinical evaluation of group B Neisseria meningitidis and Escherichia coli K92 capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines in juvenile rhesus monkeys | |
| Eby | Pneumococcal conjugate vaccines | |
| Cryz Jr et al. | Synthesis and characterization of Escherichia coli O18 O-polysaccharide conjugate vaccines | |
| Peeters et al. | Preparation of polysaccharide-conjugate vaccines | |
| Lee | Bacterial capsular polysaccharides: immunogenicity and vaccines | |
| Svenson et al. | Artificial Salmonella vaccines. | |
| Porro et al. | A molecular model of artificial glycoprotein with predetermined multiple immunodeterminants for gram-positive and gram-negative encapsulated bacteria | |
| Lifely et al. | Specificity of the immune response to the group B polysaccharide of Neisseria meningitidis | |
| Malcolm et al. | Surface layers from Bacillus alvei as a carrier for a Streptococcus pneumoniae conjugate vaccine | |
| Paoletti et al. | Group B Streptococcus type III glycoconjugate vaccines | |
| Liao et al. | Characterization of a human monoclonal immunoglobulin M (IgM) antibody (IgMBEN) specific for Vi capsular polysaccharide of Salmonella typhi | |
| Robbins et al. | Bacterial antigens cross-reactive with the capsular polysaccharides of Hae-mophilus influenzae type b, Neisseria meningiti-dis groups A and C and Diplococcus pneumoniae types I and III | |
| Chi-Jen Lee et al. | BACTERIAL POLYSACCHARIDES AS VACCINES-IMMUNITY AND CHEMICAL CHARACTERIZATION | |
| Peeters et al. | Induction of anti-pneumococcal cell wall polysaccharide antibodies by type 4 pneumococcal polysaccharide-protein conjugates | |
| Somarajan et al. | Immunogenicity of capsular polysacharide of Pasteurella multocida B: 2 conjugated to protein carrier in rabbits | |
| CN114073761A (zh) | 一种寡糖缀合物及其作为预防v型b族链球菌感染糖疫苗的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20050927 |