NO332949B1

NO332949B1 - Fremgangsmate for fremstilling av et in vitro peptidekspresjonsbibliotek av DNA-bundne peptider

Info

Publication number: NO332949B1
Application number: NO20051685A
Authority: NO
Inventors: Duncan Mcgregor; Richard Odegrip; Kevin Fitzgerald; Rosemarie Hederer; Bill Eldridge; Chris Ullman; Philip Kuhlman; David Coomber
Original assignee: Isogenica Ltd
Priority date: 2002-09-06
Filing date: 2005-04-05
Publication date: 2013-02-04
Also published as: US7842476B2; CA2497496A1; WO2004022746A1; JP2005537795A; NO20051685L; DK1534830T3; EP1534830B1; AU2003260786A1; CA2497496C; EP1534830A1; PT1534830E; KR20050057216A; US20120149591A1; KR101051245B1; CN1681924A; EP2385118A1; IL166903A; US20060035232A1; CN100351375C; JP4664677B2

Abstract

Det er beskrevet en fremgangsmåte for å fremstille in vitro peptid-ekspresjonsbibliotek, og for isoleringen av nukleotidsekvenser som koder for peptider av interesse, hvori peptidet eller proteiner er spesifikt assosiert med DNA-et som koder for dem gjennom ikke-kovalent binding av protein:DNA. Fremgangsmåten beskriver hvordan å lage biblioteket i seg selv, DNA-molekyler som koder for biblioteket og anvendelser av ekspresjonsbiblioteket

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører en in vitro fremgangsmåter for å konstruere et in vitro peptidekspresjonsbibolitoek omfattende et mangfold av peptidet, hvor hvert peptid er bundet til et DNA-konstrukt som koder for peptidet, hvor fremgangsmåten omfatter de trinn som er angitt i krav 1.

Oppfinnelsens bakgrunn

Å isolere et ukjent gen som koder et ønsket peptid fra et rekombinant DNA-bibliotek kan være en vanskelig oppgave. Anvendelsen av hybridiseringssensorer kan forenkle prosessen, men deres anvendelse er generelt avhengig av å kjenne i det minste en del av sekvensen til genet som koder proteinet. Når sekvensen er ukjent, kan DNA-bibliotek uttrykkes i en ekspresjonsvektor og antistoffer har blitt anvendt for å screene plakk eller kolonier for det ønskede protein-antigen. Denne fremgangsmåten har vært nyttig for å screene små bibliotek, men sjeldne sekvenser som er representert i mindre enn omtrent 1 av IO<5>kloner, som er tilfellet med sjeldne cDNA-molekyler eller syntetiske peptider, kan lett overses og gjør screening av bibliotek større enn IO<6>kloner i beste fall arbeidskrevende og vanskelig. Å screene større bibliotek har fremtvunget utviklingen av fremgangsmåter beregnet på å isolere sjeldne sekvenser, hvilke er basert på ko-seleksjonen av molekyler, sammen med DNAer som koder dem. In vivo-fremgangsmåter har blitt utviklet for å screene store bibliotek, så som fag-fremvisning (display) og "peptider på plasmider" ved å anvende lacl-sammensmelting (fusions) av peptider.

Fag-fremvisning er basert på DNA-bibliotek koblet til den N-terminale enden til filamentære bakteriofage kappe-proteiner og deres ekspresjon i en bakteriell vert som resulterer i fremvisningen av fremmede peptider på overflaten av fag-partikkelen med DNA-et som koder for fusjonsproteinet pakket i fag-partik-kelen(Smith G. P., 1985, Science 228: 1315-1317). Bibliotek av fusjonsproteiner inkorporert i fag kan så velges for å binde elementer mot mål av interesse (ligander). Bundet fag kan så bli tillatt å re-infisere Escherichia coli ( E. coli) bakterier og deretter bli amplifikert og seleksjonsrepetert, resulterende i anrikningen av bindende element (Parmley, S. F., & Smith, G. P. 1988., gen 73: 305-318; Barrett R. W. et al., 1992, Analytical Biochemistry 204: 357-364 Williamson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90: 4141-4145; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597).

Fremvisning av Lacl-fusjonsplasmid er basert på lac-repressorens evne til å binde til DNA. Biblioteker med randomiserte peptider blir koblet til C-terminalenden til lacl-repressorproteinet. Binding av Lacl-peptidets kobling til dets kodende DNA opptrer via lacO-sekvensene på plasmidet, og danner et stabilt peptid-LacI-peptid-kompleks. Disse kompleksene blir frigjort fra deres vertsbakterie ved cellelysis, og peptider av interesse isolert ved affinitetsrensing på et immobilisert reseptormål. Plasmidene således isolert kan deretter reintroduseres i E. coli ved elektroporasjon for å øke den selekterte populasjonen for ytterligere runder med screening (Cull, M. G. et al. 1992. Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 89:1865-1869).

Disse bakterielle fremgangsmåtene er begrenset ved størrelsen på biblioteket som kan opprettes ved nåværende fremgangsmåter ved å introdusere DNA i vertsbakterier, den potensielle cellulære toksisiteten til de uttrykte peptider som er introdusert, og ved den manglende evne til å introdusere post-translasjonelle modifiseringer, eller til å inkorporere nye aminosyrer i det uttrykte peptid.

Et fullstendig in wfro-ribosomsystem har blitt beskrevet basert på bindingen av peptider til RNA-et som koder for dem gjennom ribosomet (WO91/05058). Ribosom-fremvisning har også blitt anvendt for seleksjonen av enkeltkjede-Fv-antistoff rag menter (scFv) (Matheakis, L. C. et al., 1994 Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 91: 9022-9026; Hanes, J. & Pluckthun, A. 1997 Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 94: 4937-4942). Denne fremgangsmåten lider under den dårlige stabiliteten til RNA-ets genetiske materiale og den økte degraderingen som er sannsynlig under visse seleksjonsbetingelser hvor RNAse sannsynligvis er tilstede.

In wtro-fremgangsmåten beskrevet av Griffiths og Tawfik (WO 99/02671 og WO 00/40712) tar for seg noen av disse bekymringene ved å dele inn DNA før ekspresjon av peptider, hvilket deretter modifiserer DNA-et innen seksjonen. Peptider som kan modifiseres, som resulterer fra enzymaktivitet av interesse, velges så i et etterfølgende trinn. Imidlertid er ingen direkte seleksjon av peptidbindingsaktivitet mulig for både peptid og DNA uten modifisering av DNA-et som koder det peptidet, og ved å frigjøre det modifiserte DNA-et fra seksjonen.

En annen kjent fremgangsmåte, kovalent fremvisningsteknologi, eller CDT, er beskrevet i W09837186. Denne fremgangsmåten baserer seg på kovalent binding av protein til DNA for å opprettholde bindingen av genotype til fenotype gjennom cis-virkningen til kryssbindingsproteinet. Denne fremgangsmåten hevder at to krav må oppfylles for å kunne anvende denne teknikken vellykket. For det første er proteiner nødvendige som samvirker in vitro med DNA-sekvensen som koder dem (cis-virkning), og for det andre må nevnte proteiner etablere en kovalent binding til deres eget DNA-templat. Denne fremgangsmåten lider av den ulempe at DNA-et blir kjemisk modifisert, hvilket kan forhindre gjenvinning og identifisering av bindingspeptidet av interesse.

Det gjenstår et behov for mer anvendelige in wfro-fremgangsmåter for å konstruere peptidbibliotek i tillegg til fremgangsmåten beskrevet over, hvilke kan tillate direkte seleksjon av bindingsaktivitet, så vel som for enzymatisk aktivitet, og som tillater effektiv produksjon av komplekse peptidstrukturer, og som fremdeles tillater gjenvinning av intakt genetisk materiale som koder for peptidet av interesse.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer derfor en fremgangsmåte for å fremstille et in vitro peptid ekspresjonsbibliotek omfattende et mangfold peptider, hvori hvert peptid er bundet til en DNA-konstruksjon som koder for peptidet, omfattende trinnene:

(a) å tilveiebringe en DNA-konstruksjon omfattende:

(i) en DNA-målsekvens;

(ii) DNA som koder for et bibliotekelementpeptid; og

(iii) DNA som koder et peptid som er i stand til å binde seg ikke-kovalent direkte eller indirekte til nevnte DNA-målsekvens av (ii); hvori nevnte DNA-konstruksjon og kodede protein blir valgt å ha cis-virkning; (b) å uttrykke et mangfold DNA-konstruksjoner ifølge (a), hvori nevnte DNA-konstruksjoner koder et mangfold bibliotekelementpeptider slik at hvert uttrykte peptid er ikke-kovalent bundet til DNA-et fra hvilket det var fremstilt.

Også tilveiebragt er en fremgangsmåte for å fremstille et in v/trø-peptid ekspresjonsbibliotek omfattende et mangfold peptider, hvori hvert peptid er bundet til DNA-konstruksjonen som koder peptidet, omfattende trinnene:

(a) å tilveiebringe en DNA-konstruksjon omfattende:

(i) DNA som koder for et bibliotekelementpeptid; og

(ii) DNA som koder for et peptid som er i stand til å binde seg ikke-kovalent til en bifunksjonell agens; hvori nevnte DNA-konstruksjon og kodede protein er valgt å ha cis-virkning; (b) å binde en bifunksjonell agens eller en DNA-markør som er i stand til å binde en bifunksjonell agens til nevnte DNA-konstruksjon av (a), hvori nevnte bifunksjonelle agens er i stand til å binde til peptidet kodet av nevnte DNA av (ii); og (c) å uttrykke et mangfold DNA-konstruksjoner ifølge (b), hvori nevnte DNA-konstruksjoner koder et mangfold bibliotekelementpeptider slik at hvert uttrykte peptid er bundet via nevnte bifunksjonelle agens til DNA-et fra hvilket det ble fremstilt.

Den foreliggende oppfinnelsen strekker seg til peptidbiblioteket fremstilt ved slike fremgangsmåter og til DNA-konstruksjonene anvendt i slike fremgangsmåter som angitt i krav 39 og 40.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å screene in wtro-peptidekspresjonsbibliotek ifølge oppfinnelsen. I ett aspekt er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for å identifisere og/eller rense et peptid som utviser ønskede egenskaper fra et in vitro peptid ekspresjonsbibliotek fremstilt ifølge fremgangsmåten til ethvert av de foregående krav, omfattende i det minste trinnene (a) å screene nevnte bibliotek og (b) å velge og isolere det relevante bibliotekselementet. I et andre aspekt er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for å identifisere et spesifikt ligandbindende peptid, nevnte fremgangsmåte omfatter i det minste trinnene (a) å screene et in vitro peptid-ekspresjonsbibliotek fremstilt ifølge oppfinnelsens fremgangsmåte med ligandmolekyler som er valgfritt bundet til et fast støttemateriale; (b) å velge og isolere et bibliotekselement som binder til nevnte målmolekyl; og (c) å isolere peptidet som binder spesifikt til nevnte målmolekyl. I et tredje aspekt er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for å identifisere og/eller rense et peptid med evnen til å binde en spesifikk DNA-målsekvens omfattende i det minste trinnene (a) å tilveiebringe et in vitro ekspresjonsbibliotek ifølge oppfinnelsen hvori nevnte peptid eller protein av (iii) er et bibliotekselementpeptid med DNA-bindingsaktivitet og hvori nevnte DNA-målsekvens av (i) er målsekvensen av interesse; (b) å velge og isolere et bibliotekselement i hvilket det kodede proteinet binder til nevnte målsekvens; (c) å isolere peptidet som binder til nevnte målsekvens.

I tillegg til å isolere og/eller identifisere spesifikke peptider fra bibliotekene følge oppfinnelsen, kan screeningsfremgangsmåter ifølge oppfinnelsen anvendes for å isolere og/eller identifisere DNA-kodende spesifikke peptider fra biblioteket.

Kort beskrivelse av fi<g>urene

Figur 1 gir en skjematisk fremstilling av en fremgangsmåte ved hvilken en DNA-konstruksjon ifølge oppfinnelsen kan bindes til peptidet som det koder. Figur 2 gir en skjematisk fremstilling av en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, ved hvilken et DNA-bindende protein kan omdannes til et cis-virkende DNA-bindingsprotein. Figur 3 gir en skjematisk fremstilling av hvordan et målsekvensspefikt DNA-bindingsprotein kan bli isolert fra et bibliotek ifølge oppfinnelsen. Figur 4 gir en skjematisk fremstilling av hvordan et biblioteksprotein kan bli bundet til dets kodende DNA gjennom cis-virkning og anvendelsen av et bi-spesifikt bindingsmolekyl. Figur 5 viser cis-virkning: 1:1 blanding av to input-DNAer (CK-RepA eller V5-RepA) av ulik størrelse, valgt mot hvert antistoff. 1-markør DNA; 2-PCR-amplifikasjon etter seleksjon på anti-human CK-antistoff; 3-PCR amplifikasjon etter seleksjon på anti-V5 peptid antistoff. Figur 6 viser spesifisiteten av anti-V5 antistoffbindende kloner. ELISA-screening, lest ved 450 nM, av de syv kloner (1-7) som viser spesifikk binding til anti-V5 antistoff. Søylene i grupper på fire representerer ELISA-signalet til klonene screenet mot fra venstre til høyre; anti-human kappa region antistoff, anti-V5 antistoff, BSA, og blindprøve. En negativ kontroll som verken uttrykker CK eller V5 er også presentert (8). Figur 7 viser kultursupernatant ELISA OD 450 nm signaler for peptider gjenvunnet etter 5 omganger med seleksjon mot B. globigii- sporer i eksempel 4. A. = clonele; B. = clonelf; C. = clonelg; D. = clone8a; E. = clonelOc; F. = clonelOe; G. = negativ kontroll. Figur 8 viser OD 450 nm signaler for peptider isolert etter 4 omganger med seleksjon mot anti-V5 antistoff i eksempel 5. A. = P1C12; B. = P2H1; C. = P1B5; D. = P2B8. Peptid-fag ble testet mot anti-V5 og anti-ACTH peptid antistoffer. Figur 9 viser OD 450 nm signaler for syntetiske peptider isolert etter 4 omganger med seleksjon mot ovalbumin. A. = Cl; B. = C4; C. = C6; D. = C8; E. = negativ kontroll. Peptider ble testet mot ovalbumin, anti-V5 antistoff og blokkert plate (plast). Figur 10 viser PCR-gjenvinninger av scFv DNA etter seleksjon på BSA eller BSA-mecoprop. A. Anti-mecoprop scFv selektert på BSA, 2,5 mM oks-glutasjon. B. Anti-mecoprop scFv selektert på mecoprop-BSA, 2,5 mM oks-glutasjon. C. Anti-mecoprop scFv selektert på BSA, intet oks-glutasjon. D. Anti-mecoprop scFv selektert på mecoprop-BSA, intet oks-glutasjon.

Kort beskrivelse av sekvensene

SEQ ID Nos 1 til 11, 19 til 23, 26 til 35 og 45 til 47 fremviser primerene anvendt i eksemplene.

SEQ ID NO: 12 viser sekvensen til TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI-konstruksjonen, SEQ ID NO: 13 viser sekvensen til TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI-konstruksjonen, SEQ ID NO: 24 viser sekvensen til TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408-konstruksjonen og SEQ ID NO: 25 viser sekvensen til TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408-konstruksjonen.

SEQ ID NO: 14 viser østrogenreseptormål-gjenkjenningssekvensen.

SEQ ID Nos 15 og 16 viser DNAet og aminosyresekvenser av repA-genet fra Rl-plasmidet til incFII-inkompatibilitetsgruppen. SEQ ID Nos 17 og 18 viser sekvensene til CIS DNA-elementet og ori-sekvensen som danner det samme systemet.

SEQ ID Nos 36 til 39 viser sekvensene til peptider isolert etter seleksjon i eksempel 5. SEQ ID Nos 39 til 43 viser sekvensene til kloner isolert i eksempel 6.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører konstruksjonen og og screeningen av et bibliotek for en nukleotidsekvens som koder for et peptid av interesse in vitro. Konstruksjoner som koder for peptidet av interesse er utformet slik at det uttrykte peptidet viser cis-virkning for konstruksjonen. Cis-virkning er definert som peptidets evne til å binde til DNAet fra hvilket peptidet ble fremstilt, dvs. fra hvilket det var transkribert og translatert. In vitro ekspresjon av konstruksjonen resulterer i binding av peptidet til DNAet som koder det samme peptidmolekylet ved ikke-kovalent interaksjon. Dette skiller seg fra læren til WO 98/37186, hvilken ikke tillater muligheten for in vitro ikke-kovalent interaksjon mellom protein og DNAet som det koder, og virkelig spesifikt ekskluderer slike interaksjoner fra å ha noen praktisk anvendelse for biblioteksscreening.

Ikke-kovalent binding henviser til en forbindelse som kan brytes av fremgangsmåter velkjent av fagmannen, så som tilsettingen av et passende løse-middel, eller en endring i ionebetingelsene, for eksempel tilsettingen av glysin med lav pH eller trietylamin med høy pH. I det foreliggende tilfelle ville et typisk eksempel på ikke-kovalent binding være den ikke-kovalente interaksjonen mellom et DNA-bindingsprotein og et DNA-molekyl. Omvendt, når en kovalent binding dannes mellom DNAet og det kodede polypeptidet, vil ikke det fremviste peptid eller protein frigjøres fra DNAet ved ionebetingelser og løsemidler som ville forstyrre ikke-kovalent DNA-bindingsprotein:DNA-interaksjoner. For eksempel binder det bakterielle replikasjonsproteinet repA ikke-kovalent til dets mål-DNA-sekvens oriR og kan frigjøres fra denne mål-DNA-sekvensen ved saltkonsentrasjoner høyere enn 0,2 M KCI (Giraldo R. & Diaz R. 1992 J. Mol. Biol. 228: 787-802). Denne saltkonsentrasjonen ville ikke påvirke en kovalent binding, hvilket ville kreve mye strengere betingelser for å frigjøre det kovalent bundne proteinet, med den økte risikoen for skade på det gjenvunnede DNAet.

Den foreliggende oppfinnelsen beskriver cis-virkning og ikke-kovalent binding som tillater det kodede peptidet eller proteinet å forbli assosiert med DNA-konstruksjonen med en halveringstid tilstrekkelig til å tillate individuelle peptider og det assosierte DNA som koder for peptidet med en aktivitet av interesse å separere fra den resulterende blandingen av protein-DNA-komplekser. For eksempel kan ssosiasjonen mellom det kodede proteinet og dets DNA ha en halveringstid på opp til 30 minutter, opp til 45 minutter, opp til én time, opp til 2 timer, opp til 6 timer eller opp til 12 timer. Screeningsfremgangsmåter ifølge oppfinnelsen kan derfor utføres umiddelbart etter konstruksjon av biblioteket, eller senere, for eksempel opp til én, opp til to, opp til seks, opp til tolv timer eller opp til tjuefire timer eller mer enn tjuefire timer senere.

Overraskende demonstrerer derfor oppfinnelsen beskrevet heri at slike kodede peptider eller proteiner kan bli uttrykt in vitro og bundet til DNAet som koder for peptidet i nærvær av andre DNA-sekvenser. Oppfinnelsen demonstrerer også at kovalent binding mellom protein og DNA ikke er krevet for å opprettholde slik cis-virkning, og at en ikke-kovalent interaksjon mellom DNA og bindingsprotein er tilstrekkelig for å tillate seleksjon av peptider i et in vitro ekspresjons- og seleksjonssystem.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen er individuelle DNA-bibliotekselementer, hver av hvilke som koder for et peptid som skal uttrykkes i peptidekspresjons-biblioteket (bibliotekselementpeptid), plassert i en passende DNA-konstruksjon. DNA-konstruksjonen i hvilken DNA-bibliotekselementet er plassert inkluderer alle sekvensene nødvendig for å tillate fremstilling av bibliotekselementpeptidet fra konstruksjonen og å tillate peptidet kodet av konstruksjon til å binde til DNA-konstruksjonen som kodet for det. Hvert peptid i biblioteket vil typisk omfatte et fusjonsprotein omfattende bibliotekselementpeptidet sammensmeltet til et peptid involvert i å binde fusjonsproteinet til den relevante DNA-konstruksjonen. Slike fusjonsproteiner kan omfatte ytterligere sekvenser og nevnte bibliotekspeptid kan kobles til nevnte bindingspeptid via en bindingssekvens.

Et mangfold av slike konstruksjoner som koder for et mangfold ulike bibliotekelementpeptider, danner et DNA-bibliotek ifølge oppfinnelsen. Å uttrykke et slik bibliotek med DNA-molekyler resulterer i den ikke-kovalente bindingen av individuelle kodede proteiner til DNAet som kodet dem og fra hvilke de har blitt transkribert og translatert, i nærvær av mange andre DNA-molekyler som koder andre medlemmer i biblioteket. Sekvensen som koder peptidbibliotekselementet til stede i et spesielt kodet protein vil derfor være tilstede i DNAet som er bundet til det proteinet. Denne prosessen binder derfor bibliotekselementpeptidet i en biologisk aktiv form (normalt med en bindingsaktivitet) til dette spesifikke bibliotekselement-DNA-sekvensen som koder det peptidet, å tillate seleksjon av peptider av interesse, for eksempel på grunn av en spesiell bindingsaktivitet, og påfølgende isolasjon og identifisering av DNAet som koder for dette bibliotekselementpeptidet.

For formålet med oppfinnelsen er derfor et DNA-bibliotek en populasjon av DNA-konstruksjoner. Hver konstruksjon omfatter en DNA-sekvens som koder for et peptid til å uttrykkes som et bibliotekselementpeptid og hver inneholder passende promoter, translasjonsstart- og -stoppsignaler. Et DNA-bibliotek ifølge oppfinnelsen vil inneholde en rekke slike DNA-molekyler. Et mangfold DNA-konstruksjoner er tilveiebrakt hvor hver koder for et bibliotekselementpeptid til å tilveiebringe et mangfold ulike bibliotekselementer. Fortrinnsvis vil et DNA-bibliotek inneholde minst 10" enkeltstående DNA-molekyler. For eksempel kan et DNA-bibliotek inneholde flere enn IO<6>, flere enn 10<8>, flere enn IO<10,>flere enn IO<12>eller flere enn IO<14>enkeltstående DNA-molekyler.

Et peptidekspresjonsbibliotek er definert som en populasjon av peptidsekvenser uttrykt fra et bibliotek av DNA-molekyler. Et peptidekspresjonsbibliotek ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter derfor et bibliotek med peptider som er ikke-kovalent bundet til DNAet som kodet for dem. For eksempel kan et peptidekspresjonsbibliotek ifølge den foreliggende oppfinnelsen være et bibliotek med i det minste 10<4>enkeltstående proteiner hver omfattende en bibliotekpep-tidsekvens, uttrykt fra et bibliotek av DNA-molekyler. Et peptidekspresjons bibliotek ifølge oppfinnelsen kan være ethvert bibliotek dannet ved ekspresjonen av et DNA-bibliotek ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Et peptidbibliotekselement kan defineres som en aminosyrekjede av variabel sammensetning av i det minste to aminosyrer i lengde, eller deler eller alt av et naturlig opptredende protein så som et enzym, et bindingsmolekyl så som en reseptor eller et antistoff eller et fragment derav. Et passende peptidbibliotekselement kan være et peptid med tilfeldig aminosyresammensetning. Peptidet med variabel eller tilfeldig sammensetning kan være omgitt av kjente aminosyresekvenser i en N- og/eller C-terminal for å innslutte strukturen. Disse kjente sekvenser kan variere i lengde. Peptidet av variabel eller tilfeldig sammensetning kan være satt inn ved ulike posisjoner i en kjent proteinstruktur, så som en reseptor eller antistoff eller annet protein eller fragment derav. Peptidet kan settes inn i den samme proteinsstruktur én gang eller mer enn én gang, for eksempel to eller flere ganger.

En DNA-konstruksjon ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte DNA som koder for et bibliotekelementpeptid og midler for det kodede peptidet til å binde til den kodende DNA-konstruksjonen. I tillegg til DNA som koder for et bibliotekelementpeptid omfatter en passende DNA-konstruksjon ifølge oppfinnelsen i det minste en DNA-målsekvens samt DNA som koder for et peptid som er i stand til å binde direkte eller indirekte til DNA-målsekvensen.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen er DNA-konstruksjonen og det kodede proteinet valgt å ha cis-virkning. Det vil si at det kodede proteinet har evnen til å binde spesifikt til DNA-molekylet som kodet for det. For eksempel kan cis-virkning fungere til å tillate det kodede DNA-bindingspeptidet å binde spesifikt (direkte eller indirekte) til målsekvensen av DNA-konstruksjonen som kodet det heller enn til målsekvensen av en annen DNA-konstruksjon.

I noen tilfeller kan cis-virkning tilveiebringes på grunn av nærværet av et DNA-element som styrer cis-virkning, dvs. som tillater eller tvinger proteinet kodet av DNA-konstruksjonen til å ha cis-virkning, og derfor til å binde til dens kodende sekvens. I andre tilfeller kan et separat DNA-element perse ikke kreves hvor naturen til det kodende DNAet i seg selv gir cis-virkning på det kodede peptidet. Et DNA-element som styrer cis-virkning kan tilveiebringes i DNA-konstruksjonen sammen med DNAet som koder for et peptid som gjensidig påvirker dette cis-elementet. For eksempel i tilfellet med cis-elementet fra repA-systemet diskutert under, kan DNA som koder for et fragment av repA-sekvensen omfattende i det minste 20 aminosyrer fra C-terminalen til repA, tilveiebringes sammen med cis DNA-elementet. Det kan være mulig å gi cis-virkning på et DNA-bindingspeptid som ikke normalt utviser cis-virkning ved å inkludere i DNA-konstruksjonen så som et DNA-element og andre ytterligere sekvenser nødvendig for dets virkning. For eksempel kan DNA som koder for et peptid som gjensidig påvirker det anvendte cis-elementet, inkluderes i DNA-konstruksjonen.

Alternativt kan et peptid som gjensidig påvirker cis-elementet være del av DNA-bindingspeptidet. Foreksempel kan DNA-bindingspeptidet være repA som omfatter sekvensen som gjensidig påvirker repA-cis-elementet. Alternativt kan DNA-bindingspeptidet binde til dets kodende DNA i cis uten behov for et separat cis-element.

Et passende DNA-element kan være ethvert element som tillater eller styrer cis-virkning. Et slik DNA-element kan opptre, for eksempel, ved å gjensidig påvirke maskineriet involvert i translasjon og transkripsjon av DNA-konstruksjonen for å forsinke produksjonen og frigjøringen av det kodede peptidet.

Ethvert DNA-element som tillater det kodede peptidet å binde spesifikt til DNA-molekylet som kodet det, kan benyttes som et DNA-element ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Ett eksempel på et passende DNA-element er det til repA-cis systemet beskrevet i nærmere detalj under. I dette systemet stoppes RNA-polymerase av løkker i 5' cis-sekvensen før den rho-avhengige avslutningen av transkripsjon. Virkningen av DNA-elementet tillater derfor det kodede bindingspeptidet å binde til DNA-målsekvensen i konstruksjonen fra hvilket det ble produsert.

Fortrinnsvis vil cis DNA-elementet være plassert 3' i DNA-konstruksjonen til bibliotekselementpeptidet og til peptidet eller proteinet i stand til å binde til DNA-målsekvensen. Dette betyr at disse sekvensene kan transkriberes og translateres før RNA-polymerasen når den cis-virkende sekvensen.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bindingspeptidet bindes til DNA-konstruksjonen direkte eller indirekte. I tilfelle med direkte binding binder bindingspeptidet direkte og ikke-kovalent til DNA-målsekvensen. I tilfelle med indirekte binding tilveiebringes koblingen mellom bindingspeptidet og DNA-konstruksjonen av et ytterligere molekyl. Et slik molekyl, for eksempel en bifunksjonell agens som beskrevet under, vil assosiere med både peptidet og DNA-målsekvensen.

En passende DNA-konstruksjon kan omfatte ytterligere sekvenser, for eksempel passende promotersekvenser for å tillate ekspresjonen til det kodede peptidet.

Ett eksempel på et system med cis-virkning er a-cis virkende inkompatibilitets-gruppe plasmidreplikasjonsprotein-, benevnt repA, systemet. Aspekter ved dette systemet kan anvendes i den foreliggende oppfinnelsen som beskrevet under.

Tallrike plasmider inkluderer sekvenser som koder repA og cis DNA-elementer. repA-sekvensen og cis DNA-elementet tilstede i en DNA-konstruksjon ifølge oppfinnelsen kan være avledet fra den samme plasmidstammen eller kan være avledet fra ulike plasmidstammer.

Det er forstått at repA-cis systemet opptrer som vist i i figur 1. Kort sagt stoppes RNA-polymerase av løkker i 5'-CIS-sekvensen før rho-avhengig terminering av transkripsjon. Dette tillater transient C-terminal repA peptid interaksjon med CIS, og muligens DNA-bøying. RepA-peptid binder deretter til ori, som er en definert avstand bort fra den terminale aminosyren til den repA-kodende sekvens (Prazkier et al. 2000 J. Bacteriology 182: 3972-3980; Praszkier og Pittard 1999 J. Bacteriol. 181: 2765-2772; Masai og Arai. 1988 Nucleic Acids Res. 16: 6493-6514).

Kompatibiliteten til en RepA-sekvens fra et plasmid med en cis-sekvens fra et annet plasmid kan kan lett fastsettes ved å overvåke interaksjonen til RepA med den valgte cis-sekvensen.

Passende repA-proteiner og -sekvenser og cis DNA-elementer inkluderer de til Incl-komplekse plasmider eller IncF, IncB, IncK, IncZ og IncL/M-plasmidene, som er fjernt beslektet ved DNA-nivået, men som styrer plasmidreplikasjon gjennom funksjonen til det cis-virkende repA-proteinet (Nikoletti et al. 1986 J. Bacteriol. 170:1311-1318; PrazkierJ. et al. 1991 J. Bacteriol. 173: 2393-2397). Spesifikke plasmider som kan anvendes til å tilveiebringe disse sekvensene inkluderer Rl-plasmidet til IncII inkompatibilitetsgruppen og incB-plasmidet pMU720 (beskrevet av Praskier J. & Pittard J. 1999 Role of CIS in replication of an IncB plasmid. J. Bacteriol. 181: 2765-2772). DNA- og aminosyresekvenser av repA avledet fra Rl-plasmidet til IncII er gitt i SEQ ID Nos: 15 og 16. DNA-sekvensen til cis DNA-elementet fra Rl-plasmidet til IncII er gitt i SEQ ID NO: 17. Typisk er cis-elementet 150 til 200 nukleotider i lengde. Kortere eller lengre sekvenser kan anvendes, så fremt sekvensen opprettholder evnen til å gjensidig påvirke RepA og fremvise cis-virkning. Mindre variasjoner, så som substitusjoner eller slettinger innen cis-sekvensen er også vurdert så som modifiseringer ved 1, 5, 10 opp til 20 nukleotider innen villtype cis-sekvensen.

Cis-elementet er krevet for cis-virkning av repA-proteinet (Praszkier og Pittard 1999 J. Bacteriol. 181: 2765-2772). Cis DNA-elementet bør derfor også være plassert 3' i DNA-konstruksjonen til DNAet som koder repA-sekvensen. Ved ankomst til cis-sekvensen, vil RNA-polymerasen stoppes og tillate det kodede proteinet å binde DNA-målsekvensen.

I én utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter det DNA-bindende proteinet selv RepA eller et fragment eller variant derav i stand til å binde DNA, inkludert i det minste 20 C-terminale aminosyrer av RepA i stand til å binde til cis DNA-elementet. I denne utførelsesform en omfatter DNA-målsekvensen en ori-sekvens, for eksempel oriR-sekvensen. I alternative aspekter ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringes det DNA-bindende proteinet ved et alternativt protein med de relevante DNA-målsekvenser gjenkjent ved slik bindingsprotein inkorporert inn i sekvensen. I hver av disse utførelsesformene er DNA-proteinbinding direkte i og med at det peptidet som er kodet av DNA-konstruksjonen vil binde direkte til den kodende DNA-konstruksjonen. I alternative aspekter ifølge oppfinnelsen, som beskrevet i nærmere detalj under, kan det bindende DNA-proteinet være indirekte gjennom anvendelsen av en peptid-markør-DNA-markør, bifunksjonell agens og/eller passende bindinger.

I ett aspekt kan derfor den samme sekvensen tilveiebringe både peptidet i stand til å binde DNA-målsekvensen og de C-terminale aminosyrer av repA. En slik sekvens kan være eller kan omfatte en komplett repA-sekvens, eller et fragment eller variant derav av en repA-sekvens som bibeholder evnen til å binde til den anvendte DNA-målsekvensen. Der hvor repA opptrer som et DNA-bindende protein, kreves både cis- og ori-sekvenser (Praszkier og Pittard 1999 J. Bacteriol. 181: 2765-2772) for cis-virkning (cis) og DNA-binding (ori). I dette aspektet er derfor DNA-målsekvensen en ori-sekvens og peptidet eller proteinet som er i stand til å binde nevnte mål er et repA-protein. Posisjonen av ori i DNA-konstruksjonene ifølge oppfinnelsen kan være ulike. Som beskrevet tidligere, kan passende repA, cis og ori-sekvenser tilveiebringes av ett eller flere plasmider. For eksempel kan passende sekvenser tilveiebringes fra IncI kompleks-plasmidene eller IncF, IncB, IncK, IncZ og IncL/M-plasmidene. DNA-sekvensen til orien fra Rl-plasmidet av IncII er gitt i SEQ ID NO: 18. Denne sekvensen, eller et fragment derav, kan inkluderes i en DNA-konstruksjon ifølge oppfinnelsen. En DNA-konstruksjon ifølge oppfinnelsen kan inkludere en komplett ori-sekvens eller kan inkludere et fragment derav, hvilket er i stand til å bindes av det anvendte repA-proteinet.

RepA-proteinet anvendt i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan også omfatte et fragment eller variant av RepA, så lenge som slike varianter eller fragmenter av RepA opprettholder evnen til å binde til den valgte ori-sekvensen. Slike varianter eller fragmenter av RepA kan inkludere substitutioner, for eksempel ved 1, 2, 3 opp til 20 aminosyrer innen RepA-sekvensen så lenge at slike varianter opprettholder evnen til å binde til ori-sekvensen. Et passende fragment av RepA er en ori-bindende sekvens av RepA. Ori-sekvenser inkluderer de som er tilstede i villtype-plasmider som beskrevet over. Typisk er en slik ori-sekvens 170 til 220 nukleotider i lengde. Fragmenter og varianter av villtype ori-sekvenser kan også anvendes så lenge slike ori-sekvenser opprettholder evnen til å bli gjenkjent av RepA. Ytterligere cis-virkende medlemmer av RepA-proteinfamilien kan anvendes. For eksempel er RepA-familien av proteiner funnet på plasmider med et bredt vertsområde dvs. ett RepA-plasmid kan finnes i ulike bakteriearter. Isolasjon av et repA-familieplasmid fra (for eksempel) en termofil, sulfofil, halofil eller acidofil bakterie ville tilveiebringe repA-cis-ori DNA som kunne anvendes under den foreliggende oppfinnelsen ved forhøyde temperaturer eller ekstremer av salt, pH eller svovelkonsentrasjoner. Slike medlemmer av RepA-familien ville være fordelaktige ved isolering av bibliotekselementer som kan binde til målmolekyler under slike ekstreme betingelser. Passende ori-sekvenser for anvendelse i kombinasjon med valgte RepA-proteiner kan lett bestemmes ved overvåkning for gjensidig påvirkning av RepA med en slik ori-sekvens.

Hovedprinsippet ifølge oppfinnelsen kan derfor beskrives med referanse til repA/cis/ori systemet, som vist i figur 1. Dette viser et eksempel på en DNA-konstruksjon ifølge oppfinnelsen. Denne konstruksjonen omfatter, fra 5' til 3', en promotersekvens, en sekvens som koder et bibliotekselement peptid, en sekvens som koder et repA-protein, et cis DNA-element og en ori sekvens. Kort sagt transkriberes DNA-sekvensen fra promoteren av RNA-polymerase til RNA. Den rho-avhengige terminasjonsfunksjonen tilstede i cis DNA-elementet forårsaker RNA polymerasen til å avbrytes ved denne sekvensdelen. Dette tillater repA-proteinet og bibliotekpeptidet til å translateres. RepA-proteinet er så istand til å binde til ori-sekvensen, og binder det kodede proteinet til den kodende DNA-konstruksjonen.

I én foretrukket utførelsesform er bibliotekselement DNA-sekvens(er) koblet til repA, cis og oriDNA til IncFII plasmidet RI (Masai H et al. 1983 Proe Nati Acad Sei USA 80: 6814-6818). I denne utførelsesformen kan bibliotekselement DNA-sekvens(er) av interesse sammenføyes av en region av DNA som koder for en fleksibel aminosyrelinker, til 5'-enden av repA-DNAet, under kontroll av en passende promoter og translasjonssekvenser for in vitro transkripsjon/- translasjon. Mange passende promoterer er kjent for fagmennene, så som blant andre araB, tac promoter eller T7, T3 eller SP6 promoterene. Promoteren bør være oppstrøms for polypeptidsekvensen som skal uttrykkes.

repA-familien av proteiner anvendes heri som eksempel, ikke begrensning. Andre ikke-relaterte ikke-kovalent-bindende cis-virkende DNA-bindingsproteiner kunne anvendes i denne oppfinnelsen.

I en ytterligere utførelsesform kan ikke-cis-virkende DNA-bindende proteiner konverteres til å ha cis-virkning (se figur 2). Dette kan oppnås ved å benytte proteiner i stand til å binde DNA-målsekvensen, enten direkte eller indirekte, i kombinasjon med sekvenser som kan gi cis-virkning på dem. Cis-virkning kan tildeles på et bindingsprotein som ikke normalt virker i cis ved å inkludere i DNA-konstruksjon et DNA-element som styrer cis-virkning så som cis-elementet i repA-systemet. Et slikt element kan inkluderes for å sikre at DNA-bindingen av DNA-bindingsproteinet er cis, det vil si, et kodet DNA-bindingsprotein vil binde til DNA-konstruksjonen fra hvilken den har blitt transkribert og translatert.

I én utførelsesform kan en passende DNA-konstruksjon derfor omfatte DNA-elementet som styrer cis-virkning (cis DNA-elementet) fra repA-system et. Et slik element kan videre omfatte DNA som koder en del av C-terminalenden av RepA, fortrinnsvis minst 20 aminosyrer, mer foretrukket 30 aminosyrer, opp til 40, 50, 60 eller 70 aminosyrer fra C-terminaldelen av repA, hvori nevnte fragment av repA er i stand til å gjensidig påvirke DNA-elementet innen konstruksjonen. I et ytterligere eksempel kan proteiner så som de cis-virkende transposaser, Tn5 og IS903, blant andre, anvendes i den foreliggende oppfinnelse (McFall E. J Bacteriol. 1986 Aug 167:429-432; Derbyshire KM &Grindley ND. Mol Microbiol. 1996 Sep 1:1261-72.). DNA-kodende sekvenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte villtype-sekvenser som koder for det ønskede fragmentet av RepA, degenererte sekvenser som koder for fragmenter av villtype RepA eller sekvenser som koder for varianter av slike fragmenter av RepA som opprettholder evnen til å gjensidig påvirke cis-elementet inkorporert inn i DNA-konstruksjonen. Slike varianter kan inkludere substitusjon av 1, 2, 3 eller 4 aminosyrer innen 20 aminosyre C-terminalen til RepA.

repA-familien av proteiner anvendes heri som eksempel, ikke begrensning. Ethvert DNA-element som er i stand til å overføre cis-virkning på et ikke-cis-virkende protein, kan anvendes.

Ethvert ikke-cis-virkende protein kan konverteres på denne måten. Som eksempel, kan østrogen reseptor DNA-bindingsdomenet (DBD) konverteres til et cis-virkende DNA-bindingsprotein. Østrogenreseptor DNA-bindingsdomene-fragmentet (aminosyrer 176-282) har blitt uttrykt i E. coli og vist å binde til de spesifikke dobbeltkjedede DNA-østrogenreseptormål HRE nukleotidesekvens, med en lignende affinitet (0,5 nM) til opphavsmolekylet (Murdoch et al. 1990, Biochemistry 29: 8377-8385; Mader et al., 1993, DNAs Research 21: 1125-1132). I én utførelsesform er DNAet som koder for denne sekvenen fusert, fortrinnsvis ved den 3'-enden, til DNAet som koder i det minste de siste 20 aminosyrene av repA, cis DNA-elementet, og DNAet opp til ori-sekvensen etterfulgt av østrogenreseptormål gjenkjenningssekvensen (5'-TCAGG TCAGA GTGAC CTGAG CTAAA ATAAC ACATT CAG-3', SEQ ID NO: 14) som erstatter repA ori-gjenkjenningssekvensen. DNA-sekvensen(e) av interesse kan så sammenføyes av en region til DNA som koder for en fleksibel aminosyrebinding til 5'-enden til østrogenreseptor DNA-fragmentet, under kontroll av en passende promoter og translasjonsekvenser for in vitro transkripsjon/translasjon. Ekspresjon av dette polypeptidet styrer østrogen reseptoren DBD til dens målsekvens, tilstede i stedet for den normale ori-sekvensen, på DNAet som koder det polypeptidet. Protein-DNA komplekser kan deretter isoleres ved innfangelse på et målprotein. Ubundne protein-DNA-komplekser kan vaskes bort og derved tillate anriking for DNA som koder for peptider eller proteiner av interesse, hvilke deretter kan gjenvinnes ved PCR, og bli anriket ytterligere ved å utføre flere ytterligere cykler av in vitro ekspresjon og protein-DNA kompleks-innfangelse ved å anvende fremgangsmåter beskrevet tidligere.

Det vil være tydelig at denne fremgangsmåten vil kunne anvendes på andre DNA-bindingsproteiner ganske enkelt ved å anvende cis DNA-elementet og en sekvens som koder i det minste de C-terminale 20 aminosyrene av repA, eller ekvivalente elementer fra et ulikt cis-virkende system i DNA-konstruksjonene.

I en annen utførelsesform kan bibliotek av randomiserte DNA bindingsproteiner, så som sinkfingerproteiner, helix-løkke-helix proteiner eller helix-vinding-helix proteiner som eksempel, screenes for spesifikk binding til en målsekvens av interesse (se figur 3). I denne utførelsesformen kan ori-gjenkjennelsessekvensen av repA være erstattet av en målsekvens av interesse, og hoveddelen av den repA-kodende sekvensen av et bibliotek med randomiserte sinkfingerproteiner. DNA-bindingsproteinene fungerer derfor som både bibliotekelementpeptidene og proteinene i stand til å binde DNA målsekvensen i dette aspektet. DNAet som koder for hvert sinkfingerprotein, kan bindes ytterligere, ved 5'-enden, til en peptid markørsekvens som kan gjenkjennes av et annet innfangingsprotein så som et antistoff, og ved 3'-enden til DNAet som koder i det minste de siste 20 aminosyrene av repA, cis DNA-elementet og DNAet opp til ori-sekvensen etterfulgt av målsekvensen av interesse. Ekspresjonen av dette polypeptidet styrer sinkfingerproteinet til målsekvensen av interesse, tilstede i stedet for den normale ori-sekvensen, på DNAet som koder for dette polypeptidet. Binding til målsekvensen vil bare opptre hvis det randomiserte sinkfingerdomenet er i stand til å binde til sekvensen av interesse. Protein-DNA-komplekser kan så isoleres av innfanging med et bindingsprotein som gjenkjenner peptid markøren ved N-terminusen av fusjons-proteinpolypeptidet. Ubundet DNA kan vaskes bort og derved tillate anriking for DNA som koder sinkfingerproteiner som er i stand til å binde målsekvensen, og som deretter kan gjenvinnes ved PCR, og bli anriket ytterligere ved å utføre flere ytterligere cykler med in vitro ekspresjon og protein-DNA kompleks innfanging.

Som forklart over, kan bindingspeptid binde direkte til DNA-målsekvensen, for eksempel i tilfelle med et DNA-bindende protein-målsekvenspar, eller det kan binde indirekte til DNA-målsekvensen, for eksempel via en bifunksjonell agens og valgfritt en DNA-tag (se figur 4): I én utførelsesform er DNA som koder en peptid-markør som ikke er istand til å binde direkte til DNA-målsekvensen bundet til 5'-enden av bibliotekselement DNA-sekvens(er) av interesse, valgfritt av et område av DNA som koder en fleksibel aminosyrebinding, under kontroll av en passende promoter og translasjonssekvenser for in vitro transkripsjon/translasjon. Dette danner DNAet som koder for bindingspeptidet, i og med at det kodede peptidet er bundet indirekte til DNA-målsekvensen. Valgfritt ved den 3'-enden av bibliotekselement DNA-sekvensen er DNAet som koder for i det minste de siste 20 aminosyrer til repA og cis DNA-elementet, men ikke ori-målsekvensen til repA. DNA-målsekvensen kan være eller kan omfatte en DNA-markør. En slik DNA-markør kan være en enkel modifisert base. For eksempel, ved fremstilling av bibliotek DNA-konstruksjonen inneholdende elementene beskrevet, kan DNAet merkes ved 3'-enden med, som eksempel ikke begrensning, molekyler så som fluorescein eller biotin.

Før in vitro ekspresjon kan bibliotek DNA-fragmentene blandes med en bifunksjonell agens, av hvilken én funksjon er å gjenkjenne og binde til målsekvensen som kan være ved 5' enden på DNAet, i et forhold på ett DNA-fragment: ett bifunksjonelt molekyl. De andre funksjonelle elementer av denne bifunksjonelle agensen er en bindingsagens som kan gjenkjenne og binde til peptid-markøren som kan være kodet ved 5'-enden til DNA-fragmentet. Som eksempel og ikke begrensning, kan den bifunksjonelle agensen være sammensatt av et Fab-fragment som gjenkjenner fluoresceinet eller biotin-markør på DNAet, og et annet Fab-fragment som gjenkjenner peptid markøren som er kodet i DNAet. Det er klart for fagmennene at denne bifunksjonelle agensen kan lages på mange ulike fremgangsmåter så som kjemisk å kryssbinde de to elementene, eller ved å uttrykke de to elementene som et sammensmeltingsprotein, eller som et bi-spesifikt antistoff. Nevnte fremgangsmåter for å danne en bifunksjonell agens er gitt som eksempel ikke begrensning.

Den bifunksjonelle agensen kan være bundet til DNA-konstruksjonen før ekspresjon av det kodede peptidet eller kan tilveiebringes under ekspresjon.

Fusjonsproteinet transkriberes deretter og translateres fra DNA-konstruksjonen mens bundet til den bifunksjonelle agensen. Peptid-markøren translateres først og kan bindes til det andre elementet av den bifunksjonelle agensen, før frigjøring av messenger RNA eller RNA-polymerase fra DNAet. Dette danner et funksjonelt protein-DNA-kompleks hvor både uttrykt polypeptid og DNA som koder for dette peptidet er bundet gjennom den bifunksjonelle agensen. Peptidmarkør-molekylet er derfor bundet indirekte, men spesifikt, til DNA-målet (markør). Ved å binde proteinet til DNA-konstruksjonen på denne måten, er det mulig å screene for et protein med spesielle egenskaper, som beskrevet under, og deretter å identifisere det kodende DNA som er bundet til dette proteinet. Ved å anvende en bifunksjonell agens heller enn kovalent binding mellom proteinet og DNAet, kan DNA-konstruksjonen lettere separeres fra proteinet uten fare for å skade DNAet.

Protein-DNA-komplekser kan deretter isoleres ved innfanging av et målprotein. Ubundne protein-DNA-komplekser kan vaskes bort og tillate anriking for DNA som koder peptider eller proteiner av interesse, som deretter kan gjenvinnes ved PCR, og anriket ytterligere ved å utføre flere ytterligere cykler med in vitro ekspresjon og protein-DNA-kompleks-innfanging ved å anvende fremgangsmåter beskrevet tidligere.

I tillegg, under denne utførelsesformen, kan DNAet bindes direkte, for eksempel ved kovalent binding, til en bifunksjonell agens så som en polymer. En slik polymer kan inneholde mer enn ett bindingselement som kunne gjenkjenne peptid markøren, og tillate multivalent fremvisning av et peptid ekspresjonsbibliotekmolekyl i en enhet inneholdende DNAet som koder det fremviste peptidet. Som eksempel, ikke begrensning, kan nevnte polymerer være sammensatt av polyetylen så vel som andre polymere forbindelser, i stand til å være sammensmeltet til DNA. DNA-konstruksjonen ifølge oppfinnelsen kan derfor bli tilveiebrakt bundet til en slik bifunksjonell agens, eller bundet til en DNA-markør som beskrevet over, som er i stand til å være bundet av en slik bifunksjonell agens.

I alle utførelsesformer ifølge oppfinnelsen inkluderer DNA-konstruksjonene passende promoter- og translasjonssekvenser for in vitro transkripsjon/translasjon. Enhver passende promoter kan anvendes, så som ara B, tac-promoter, T7, T3 eller SP6 promotere blant andre. Promoteren plasseres slik at den er funksjonsdyktig bundet til DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen slik at slike sekvenser uttrykkes.

DNAet som koder for bibliotekelementpeptidene, kan fremstilles av ethvert kildeateriale. Spesielt kan slik DNA omfatte DNA isolert fra cDNA, oppnådd ved DNA-omstokking og syntetisk DNA.

DNA-konstruksjonen kan også kode aminosyrebindinger innen det uttrykte sammensmeltingsproteinet. Spesielt kan en fleksibel aminosyrelinker inkluderes for å binde det DNA-bindende peptidet/RepA til bibliotekselementpeptidet.

Ifølge oppfinnelsen, med referanse til denne foretrukne utførelsesformen, kan peptid eller protein ekspresjonsbibliotek, bundet til DNAet som koder dem, genereres og peptider med den ønskede aktiviteten velges ved de følgende trinn:

Å konstruere et bibliotek av fusjonsproteiner.

Et DNA-bibliotek med peptider eller proteiner kan sammensmeltes til DNA som koder for et peptid som er i stand til å binde til DNA-målsekvensen, så som et cis-virkende DNA-bindende protein-DNA, ved et område av DNA som koder for en fleksibel aminosyrebinding, under kontroll av en passende promoter og med en translasjon, eller ribosombindingssete, start og stoppkodoner, på en måte passende for in vitro ekspresjon av peptid bibliotekselementene og bindingsproteiner. I eksempelet med repA-proteinet, er DNA- (så som DNA) bibliotekselementene sammensmeltet til repA DNA-bindingsprotein DNA, eller et fragment derav. Cis- og ori-sekvensene kan inkluderes i konstruksjonen nedstrøms for de andre elementene. I tilfelle med et DNA-bibliotek er nevnte DNA-konstruksjoner designet å være passende for in vitro transkripsjon og translasjon.

Ekspresjon og cis-binding av DNA-bibliotek sammensmeltingsproteiner.

For å kunne tillate cis-virkning kan det anvendes et koblet bakterie transkripsjons-/translasjonsmiljø så som "the S30 extract system" (Zubay, G. 1973. Ann. Rev. Genet. 7: 267). Ekspresjon av peptidet, så som DNA-bibliotekselement peptid-repA fusjonssproteinet, i dette miljøet, vil resultere i binding av fusjonsproteinet til DNAet som koder det fusjonssproteinet, forutsatt at både cis- og ori-sekvenser er tilstede. Når bibliotek av peptid-repA fusjonsproteiner uttrykkes på denne måten, resulterer denne prosessen i fremstillingen av bibliotek av protein-DNA-komplekser hvor proteinet festet til DNAet er kodet av det fragmentet av DNA fra hvilket det var uttrykt, for derved å tillate etterfølgende seleksjon av både peptider eller protein av interesse, og DNAet som koder for nevnte peptider. Kompleksiteten til disse bibliotekene blir forsterket av in vitro naturen til fremgangsmåten, bibliotek med i det minste10<10->10<14>DNA-fragmenter, hvis ikke enda større bibliotek, kan lett genereres.

Forbindelser som forhindrer nukleaseaktivitet, eller reduserer ikke-spesifikk DNA-protein eller protein-protein gjensidig påvirkning kan tilsettes under denne transkripsjons-/translasjonsreaksjonen og cis-bindingen. Eksempler på passende forbindelser inkluderer detergenter og blokkerende proteiner så som bovine serum albumin (BSA).

Seleksjon av peptidet av interesse.

Et in vitro peptid ekspresjonsbibliotek fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes til å screene for spesielle medlemmer av biblioteket. For eksempel kan biblioteket screenes for peptider med en spesiell aktivitet eller en spesiell bindingsafflnitet. Protein-DNA-komplekser av interesse kan velges fra et bibliotek ved, for eksempel, affinitet eller aktivitetanrikings-teknikker. Dette kan oppnås ved hjelp av en ligand spesifikk for proteinet av interesse, så som et antigen hvis proteinet av interesse er et antistoff. Liganden kan være tilstede på en fast overflate så som overflaten til en ELISA-platebrønn, eller i en spaltning, for eksempel, med biotinylert ligand etterfulgt av innfanging på en streptavidinbelagt overflate eller magnetiske perler, etter et bibliotek av protein-DNA komplekser hadde blitt inkubert med ligandet for å tillate ligand-ligand gjensidig påvirkning. Etterfølgende enten fast fase eller i-spaltning-inkubering fjernes ubundne komplekser ved vasking, og bundne komplekser isoleres ved å avbryte ligand-ligand gjensidig påvirkning ved å endre pHen i brønnen, eller ved andre fremgangsmåter kjent for fagfolkene så som proteasespalting, eller ved å frigjøre DNAet direkte fra kompleksene ved varming eller fenol-kloroform ekstraksjon til å denaturere repA-ori DNA-bindingen. DNA kan også frigjøres ved én av fremgangsmåtene over, direkte i PCR-buffer, og forsterket. Alternativt kan DNA PCR-forsterkes direkte uten frigjøring fra kompleksene. Valgfritt kan DNA som ikke er bundet av bindingen, for eksempel repA-protein, beskyttes fra nedbryting av ikke-spesifikke DNA-bindingsproteiner så som for eksempel histoner. Det vil være klart for fagmannen at mange andre ikke-spesifikke DNA-bindingsproteiner kan anvendes for dette formålet. Ytterligere forbindelser som forhindrer nukleaseaktivitet, eller reduserer ikke-spesifikk DNA-protein eller protein-protein gjensidig påvirkning kan være tilstede under seleksjonsprosessen. Eksempler på passende forbindelser inkluderer detergenter, blokkerende proteiner så som funnet i melkepulver eller bovine serum albumin (BSA), heparin eller aurintrikarboksylsyre.

Å gjenvinne bundne komplekser, å reforsterke det bundne DNAet, og å repetere seleksjonsprosedyren tilveiebringer en anriking av kloner som koder de ønskede sekvenser, hvilke deretter kan isoleres for sekvensering, ytterligere kloning og/eller ekspresjon. For eksempel kan DNAet som koder peptidet av interesse bli isolert og forsterket ved for eksempel PCR. I én utførelsesform kan gjentatte runder med seleksjon og DNA-gjenvinning forenkles ved anvendelse av sekvensiell nesting av PCR-primere. DNA-ender blir generelt skadet etter multiple PCR-trinn. For å gjenvinne DNA fra slike skadede molekyler krevde primerne å sammenføyes borte fra endene til DNA-konstruksjonen, for derved sekvensielt å forkorte konstruksjonen for hver seleksjonsrunde.

I ett aspekt kan DNA-konstruksjonen og/eller det kodede proteinet konfigureres til å inkludere en markør. Et slik peptid eller DNA-markør, for eksempel som beskrevet over, kan anvendes i separasjonen og isolasjonen av et bibliotekselement av interesse. En sliktag kan også anvendes til å holde bibliotekselementene, på for eksempel et fast støttemateriale for anvendelse i screeningfremgangsmåter beskrevet heri.

Det kan derfor ses at screeningsfremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan inkludere det ytterligere trinnet å velge ut og isolere det relevante bibliotekselementpeptidet, å tillate peptidet som utviser de ønskede egenskaper, og også DNAet som koder det peptidet, å identifiseres og renses.

Oppfinnelsen omfatter derfor peptider og DNAer som har blitt identifisert ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen. Disse peptidene og DNAer kan være isolert og/eller renset. Peptider eller DNAer isolert ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan modifiseres, for eksempel ved sletting, tilsetting eller substitusjon av aminosyrer eller nukleotider. Passende modifiserte peptider eller DNAer kan vise i det minste 50 %, i det minste 75 %, i det minste 90 %, i det minste 95 % eller flere aminosyre- eller nukleotidsekvensidentitet til peptidet eller DNAet isolert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Peptider identifisert ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan modifiseres for leverings- og/eller stabilitetsformål. For eksempel, kan slike peptider bli pegylert (festet til polyetylenglykol) for å forlenge serum halveringstid eller for å forhindre proteasangrep. Peptider identifisert ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan modifiseres i andre fremvisningssystemer så som fagfremvisning eller ved å syntetisere og screene peptidvarianter. En samling av slike modifiserte sekvenser kan danne et nytt bibliotek som kan inkorporeres i konstruksjoner ifølge oppfinnelsen og ytterligere screenes for å finne, for eksempel, en variantsekvens som viser forbedret binding til et spesifikt ligand. Således kan i én utførelsesform, et bibliotek av peptider for anvendelser i fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen være et bibliotek av strukturelt relaterte peptider.

Alternativt kan et bibliotek av hovedsakelig randomiserte peptidsekvenser anvendes. Mange typer bibliotek av peptider sammensmeltet til det cis-virkende DNA-bindingsproteinet kan screenes under denne utførelsesformen inkludert:

(i) Randomiserte peptidsekvenser kodet av syntetisk DNA av variabel lengde.

(ii) Antistoffer eller antistoff rag menter, for eksempel enkeltkjede Fv-antistoffragmenter. Disse består av antistoffets tunge og lette kjeders variable område-domener forbundet ved et fleksibelt bindingspeptid for å danne et enkeltkjedet antigenbindende molekyl. (iii) Randomiserte cDNA-fragmenter av naturlig forekommende proteiner isolert fra en cellepopulasjon inneholdende en aktivitet av interesse. (iv) Randomiserte peptidsekvenser innsatt i, eller som erstatter en region av et kjent protein, hvorved den kjente proteinsekvensen opptrer som en ramme, som begrenser den randomisert peptidsekvensen. Mange slike rammer har blitt beskrevet, som eksempel, CTLA-4 (WO 00/60070), som har vært anvendt som en ramme for peptidbibliotek.

I en annen utførelsesform vedrører oppfinnelsen fremgangsmåter for å screene et DNA-bibliotek hvis medlemmer krever mer enn én kjede for aktivitet, som krevet ved, for eksempel, antistoff Fab-fragmenter for ligandbinding. I denne utførelsesformen kobles tung eller lettkjedet antistoff-DNA til en nukleotidsekvens som koder for et DNA-bindende domene av, for eksempel, repA. Typisk settes det ukjente antistoff DNA-biblioteksekvenser for enten den tunge (VH og CH1) eller lette kjede- (VL og CL) gener inn i 5' regionen til repA DNAet, bak passende promoter og translasjonssekvenser. Slik fremstilles repA sammensmeltet til et DNA bibliotekselementkodet protein bundet til DNAet som koder det proteinet. Den andre kjente kjeden, som koder for enten lett eller tungt kjedeprotein, uttrykkes separat enten: (a) fra det samme DNA-fragmentet inneholdende repA og det første polypeptid fusjonsproteinbibliotek, eller (b) fra et separat fragment av DNA til stede i in vitro

transkripsjon/translasjonreaksjonen.

Den kjente kjeden forbindes med biblioteket av ukjente fusjonsproteiner som er sammensmeltet til repA-proteinet og derved bundet til DNAet for den ukjente kjeden. Det funksjonelle Fab-biblioteket kan deretter velges ved hjelp av en ligand spesifikk for antistoffet.

DNAet identifisert ved en screeningfremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, for eksempel DNAet som koder det valgte bibliotekselementpeptidet, kan klones inn i en vektor. I én utførelsesform er DNAet identifisert ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen operativt bundet til en kontrollsekvens som er i stand til å tilveiebringe ekspresjonen til den kodende sekvensen av vertscellen, dvs. vektoren er en ekspresjonsvektor. Begrepet "operativt bundet" viser til en sammenstilling hvori komponentene beskrevet er i et forhold som tillater dem å fungere på deres tiltenkte måte. En reguleringssekvens, så som en promoter, "operativt bundet" til en kodende sekvens er posisjonert på en slik måte at ekspresjonen til den kodende sekvensen oppnås under betingelser forenlig med reguleringssekvensen.

Slike ekspresjonsvektorer blir rutinemessig konstruert innen fagfeltet molekylær biologi og kan for eksempel involvere anvendelse av plasmid-DNA og passende initiatorer, promoterer, forsterkere og andre elementer, så som for eksempel polyadenyleringssignaler som kan være nødvendige, og som er posisjonert i den korrekte retningen, for å tillate proteinekspresjon. Andre passende vektorer vil være åpenbare for fagmannen. For ytterligere eksempler i dette henseende henviser vi til Sambrook et al. 1989.

Vektorene kan være for eksempel plasmid-, virus- eller fagvektorer tilveiebrakt

med replikasjonsstartpunkt, valgfritt en promoter for ekspresjonen til det nevnte DNAet og valgfritt en regulator til promoteren. Vektorene kan inneholde ett eller flere valgbare markørgener, for eksempel et ampicillin resistensgen i tilfelle med et bakterielt plasmid eller et motstandsgen for en fungal vektor. Vektorer kan anvendes in vitro, for eksempel for fremstillingen av DNA eller RNA eller anvendt for å transfektere eller transformere en vertscelle, for eksempel, en pattedyrvertscelle. Vektorer kan også tilpasses til å anvendes in vivo, for eksempel i en fremgangsmåte for genterapi.

Promoterer og andre ekspresjonsreguleringssignaler kan velges å være kompatible med vertscellen for hvilken ekspresjon er utformet. For eksempel inkluderer gjærpromoterer S. cerevisiae GAL4- og ADH-promoterer, S. pombe nmtl- og ac//7-promoter. Pattedyrspromoterer inkluderer metallotionein-promoteren som kan induseres som respons på tungmetaller så som kadmium. Virale promoterer så som SV40 stor T antigenpromoter eller adenovirus-promoterer kan også anvendes. Alle disse promoterene er lett tilgjengelige i fagområdet.

Pattedyrpromoterer så som p-actin promoterer, kan anvendes. Vevsspesiflkke promoterer er særdeles foretrukne. Virale promoterer kan også anvendes, for eksempel Moloney murint leukemivirus langt terminalt repetisjonsområde (MMLV LTR), rous sarkomavirus (RSV) LTR-promoter, SV40-promoter, human cytomegalovirus (CMV) IE-promoter, adenovirus, HSV-promoterer (så som HSV IE promoterene), eller HPV-promoterer, spesielt HPV oppstrøms regulatory region (URR). Virale promoterer er lett tilgjengelige i fagfeltet.

Vektoren kan videre inkludere sekvenser som omgir polynukleotidet av interesse og som gir opphav til polynukleotider som omfatter sekvenser homologe til eukaryotisk genome sekvenser, fortrinnsvis pattedyr genome sekvenser, eller virale genome sekvenser. Dette vil tillate introduksjonen av polynukleotidene ifølge oppfinnelsen inn i genomet av eukaryote celler eller viruser ved homolog rekombinasjon. Spesielt kan en plasmidvektor omfattende ekspresjonskassetten omgitt av virale sekvenser anvendes for å fremstille en viral vektor passende for å levere polynukleotidene ifølge oppfinnelsen til en pattedyrcelle. Andre eksempler på passende virale vektorer inkluderer herpes simplex virale vektorer og retroviruser, inkludert lentiviruser, adenoviruser, adeno-assosierte viruser og HPV-viruser. Genoverføringsteknikker som anvender disse virusene er kjent for fagmannen. Retrovirusvektorer for eksempel kan anvendes for stabilt å integrere polynukleotidet som gir økning i polynukleotidet i vertsgenomet. Replikasjons-defekte adenovirus-vektorer forblir, som kontrast, episomale og tillater derfor transient ekspresjon.

Slike ekspresjonvektorer kan anvendes for å identifisere ligander av interesse, dvs. molekyler som binder til peptidbibliotekselementet ved standard bindingsassayer så som ELISA, eller enzymatiske assayer hvor passende substrater gir, for eksempel en fargeendring, lysemisjon eller fluorescens. Andre funksjonelle assayer kan anvendes, hvor tilgjengelig.

I en alternativ utførelsesform kan et DNA idientisert ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen klones inn i en ikke-ekspresjonsvektor. En slik vektor kan anvendes for ytterligere å karakterisere DNAet, for eksempel ved sekvensiering.

Alternativt kan ligander av interesse identifiseres uten kloning. Eksempler på passende fremgangsmåter inkluderer in vitro ekspresjonen av individuelle DNA-sekvenser gjenvunnet fra en screeningfremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, og å sekvensiere individuelle DNAer gjenvunnet fra en slik screeningfremgangsmåte. Slike individuelle DNA-sekvenser kan valgfritt være forsterket.

Celler som har blitt modifisert til å uttrykke et peptid identifisert ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan dannes, for eksempel ved å introdusere en ekspresjonvektor som beskrevet over, inn i cellen. Slike celler inkluderer transiente, eller fortrinnsvis stabile høyere eukaryotiske cellelinjer, så som pattedyrceller eller insektceller, ved å anvende for eksempel et baculovirus ekspresjonsystem, lavere eukaryote celler, så som gjær eller prokaryote celler så som bakterielle celler. Spesielle eksempler på celler som kan modifiseres ved innføring av vektorer som koder for et peptid identifisert ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen inkluderer pattedyr HEK293T, CHO, HeLa og COS celler. Fortrinnsvis vil den valgte cellelinjen være en som ikke bare er stabil, men som også tilater fullt utviklet glykosylering og celleoverflateekspresjon av peptidet. Ekspresjon kan oppnås i transformerte oocytter. Et peptid identifisert ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan uttrykkes i celler av et transgent ikke-humant dyr, fortrinnsvis en mus. Et peptid identifisert ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan uttrykkes i Xenopus laevis oocytter eller melanoforer.

For at oppfinnelsen skal fullt ut forstås vil utførelsesformer nå bli beskrevet i nærmere detalj.

Eksempler på noen av utførelsesformene ifølge oppfinnelsen er gitt under:

Materialer og fremgangsmåter

De følgende prosedyrene anvendt av den foreliggende søker er beskrevet i Sambrook, J., et al., 1989 supra.: analyse av restriksjonsenzym-spaltningsprodukter på agarosegeler, DNA-opprenskning ved bruk av fenol/kloroform stamoppløsninger, fremstilling av fosfatbufret fysiologiske saltvannsoppløsninger.

Reagenser av normal type ble innkjøpt fra SIGMA-Aldrich Ltd (Poole, Dorset, U.K.). Oligonukleotider ble anskaffet fra SIGMA-Genosys Ltd (Cambridgeshire, U.K.). Aminosyrer og S30-ekstrakter ble anskaffet fra Promega Ltd (Southampton, Hampshire, U.K.). Deep Vent og Taq DNA polymeraser ble anskaffet fra New England Biolabs (Cambridgeshire, U.K.). Taqplus DNA polymerase ble anskaffet fra Stratagene Inc. (Amsterdam, Netherland). GeneClean DNA gel-opprenskningssett ble anskaffet fra BIO101 (La Jolla, California, U.S.A.), anti-human Igic antistoffer fra Immunologicals Direct Ltd (Oxfordshire, U.K.), anti-c-myc polyklonal fra Vektor Labs Inc (Cambridgeshire U.K.) og anti-V5-antistoff fra Abcam Ltd (Cambridgeshire U.K.). Superblock blokkeringsagens ble anskaffet fra Perbio Science (Cheshire, U.K.).

Eksempel 1. Isolasjon av spesifikke cis- virkende protein- DNA-komplekser

In vitro ekspresjonkonstruksjonene ble fremstilt ved sekvensielt å tilsette TAC-promoteren, c-myc epitop, enten den humane kappa konstante regionen eller V5-epitopen til RepA-CIS-ORI-regionen, ved PCR-opparbeidelse. Slike konstruksjoner kan fremstilles ved mange fremgangsmåter kjent for fagmannen, for eksempel ved å amplifikere ulike fragmenter av DNA etterfulgt av sammensetning-PCR. I dette eksemplet var den initiale amplifikasjonsmodellen Rl-plasmidet som inneholder RepA-CIS-ORI-regionen (Masai, H. og Arai, K.(1988). DNAs Res. 16, 6493-6514). (a) Primær amplifikasjon. RepA-CIS-ORI-regionen ble PCR-amplifikert fra en enkelt koloni av stammen ECO K12 som inneholder plasmid RI hvor det anvendes 12,5 pmol av hver av primerene REPAFOR (SEQ ID 01) og ORIREV (SEQ ID 02) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter Taqplus Precision DNA polymerase, lx PCR reaksjonsbuffer (Stratagene Inc, Amsterdam, Nederland). REPAFOR-primeren fester seg til 5'-enden av den RepA-kodende regionen. ORIREV-primeren fester seg til 3'-enden av den ikke-kodende ORI-regionen.

PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cykel på 4 minutter og 15 sekunder ved 94 °C etterfulgt av 30 cyklus ved 94 °C, 45 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 45 sekunder, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, fjernet og produkter renset fra gelen i 40^1 sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California, U.S.A.).

(b) Sekundær amplifikasjon. Én ul (500 pg) 100 ganger fortynnet gel-renset primærreaksjonsprodukt ble re-amplifikert ved å anvende 12,5 pmol av hver av primerene CKREPFOR (SEQ ID 03) og ORIREV (SEQ ID 02) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter Taqplus Precision DNApolymerase, og lx PCR-reaksjonsbuffer (Stratagene Inc, Amsterdam, Nederland). CKREPFOR-

primeren fester seg til 5'-enden av primærreaksjonsproduktet og forlenger 3' delen av kappa konstant region-DNAet. ORIREV-primeren fester seg til 3'-enden av primærreaksjonsproduktet.

PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 2 minutter og 15 sekunder ved 94 °C etterfulgt av 30 cykler på 94 °C, 45 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 2 minutter, etterfulgt av én enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen inn i 40 |i.l sterilt vann ved anvendelse av et Geneclean II sett ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California, U.S.A.). (c) Tredje amplifikasjon. Én ul (500 pg) 100 ganger fortynnet gel-renset primær reaksjonsprodukt ble re-ampliflkert ved å anvende 12,5 pmol av hver av primerene V5REPFOR (SEQ ID 04) og ORIREV (SEQ ID 02) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter Taqplus Precision DNA polymerase, og lx PCR reaksjonsbuffer (Stratagene Inc, Amsterdam, Nederland). V5REPFOR-primeren fester seg til 5'-enden av primærreaksjonsproduktet og fester seg til 3' delen av V5 epitopt DNA. ORIREV-primeren fester seg til 3'-enden av primærreaksjonsproduktet. PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 2 minutter og 15 sekunder ved 94 °C etterfulgt av 30 cykler på 94 °C, 45 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 2 minutter, etterfulgt av en enkelt cyklus 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen i 40 |xl sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California, U.S.A.).

(d) Fjerde amplifikasjon. Én ul (500 pg) 100 ganger fortynnet pCKV5 plasmid ved å anvede 12,5 pmol av hver av primerene MYCCKFOR (SEQ ID 05) og CKREV (SEQ ID 06) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter Taqplus Precision DNA polymerase, og lx PCR reaksjonsbuffer (Stratagene Inc, Amsterdam, Nederland). pCKV5-plasmidet inneholder det humane kappa konstant region cDNA-et (McGregor DP, Molloy PE, Cunningham C, & Harris WJ. 1994 Mol. Immunol. 31: 219-26) og V5-epitop-DNA (Southern JA, Young DF, Heaney F, Baumgartner WK, Randall RE. 1991 J. Gen. Virol. 72: 1551-7). MYCCKFOR-primeren fester seg til 5'-enden av kappa konstant region

DNA-et og fester seg til 3' delen av MYC epitope DNA. CKREV-primeren fester seg til 3'-enden av kappa konstant region DNA-et.

PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 2 minutter og 15 sekunder ved 94 °C etterfulgt av 30 cykler på 94 °C, 45 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 2 minutter, etterfulgt av en enkelt cyklus 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen i 40 |xl sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California, U.S.A.). (e) Femte amplifikasjon. Én ul (500 pg) 100 ganger fortynnet pCKV5-plasmid anvendende 12,5 pmol av hver av primerene MYCV5FOR (SEQ ID 07) og V5REV (SEQ ID 08) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter Taqplus Precision DNA polymerase, og lx PCR-reaksjonsbuffer (Stratagene Inc, Amsterdam, Nederland). MYCV5FOR-primeren fester seg til 5'-enden av V5 epitope DNA-et og fester seg til 3' delen av MYC epitope DNA-et. V5REV-primeren fester seg til 3'-enden av V5 epitope DNA-et.

PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 2 minutter og 15 sekunder ved 94 °C etterfulgt av 30 cykler på 94 °C, 45 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 30 sekunder, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen i 40^1 sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California,

U.S.A.).

(f) Sjette amplifikasjon. Én ul (500 pg) av 100 ganger fortynnet pTACP2A plasmid (ref) anvendende 12,5 pmol av hver av primerene TAC3 (SEQ ID 09) og MYCTACREV (SEQ ID 10) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter Taqplus Precision DNA polymerase, og lx PCR reaksjonsbuffer (Stratagene Inc, Amsterdam, Nederland). TAC3-primeren fester seg til 5'-enden til TAC promoter DNA-et. MYCTACREV-primeren fester seg til 3'-enden av TAC promoter DNA-et og fester seg til 5' delen til MYC epitope DNA-et.

PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 2 minutter og 15 sekunder ved 94 °C etterfulgt av 30 cykler ved 94 °C, 45 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 30 sekunder, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen i 40 ul sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California, U.S.A.). (g) Første sammensetning PCR. Én jxl (50 ng) av hver av reaksjonesproduktene i (f) og (d) anvendende 50 pmol av hver av primereme TAC5 (SEQ ID 11) og CKREV (SEQ ID 06) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter TaqDeepVent DNA-polymeraseblanding (20:1), og lx PCR-reaksjonsbuffer (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). TAC5-primeren fester seg til 5'-enden av reaksjonsproduktet (f) og tilfører 20 nukleotider. CKREV-primeren fester seg til 3'-enden av reaksjonsproduktet (d).

PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 2 minutter og 15 sekunder ved 94 °C etterfulgt av 30 cykler ved 94 °C, 45 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 45 sekunder, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen i 40 ul sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California, U.S.A.). (h) Andre sammensetning PCR. Én jxl (50 ng) av hver av reaksjonsproduktene i (f) og (e) anvendende 50 pmol av hver av primerene TAC5 (SEQ ID 11) og V5REV (SEQ ID 08) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter TaqDeepVent DNA polymeraseblanding (20:1), og lx PCR-reaksjonsbuffer (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). TAC5-primeren fester seg til 5'-enden på reaksjonsproduktet (f) og tilfører 20 nukleotider. V5REV-primeren fester seg til 3'-enden på reaksjonsproduktet (e).

PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 2 minutter og 15 sekunder ved 94 °C etterfulgt av 30 cykler på 94 °C, 45 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 45 sekunder, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen inn i 40^1 sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California,

U.S.A.).

(i) Tredje sammensetning PCR. Én jaI (50 ng) av hver av reaksjonsproduktene i (b) og (g) eller anvendende 50 pmol av hver av primerene TAC3 (SEQ ID 09) og ORIREV (SEQ ID 02) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter TaqDeepVent DNA polymeraseblanding (20:1), og lx PCR-reaksjonsbuffer (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). TAC3-primeren fester seg 20 nukleotider nedstrøms til 5'-enden til reaksjonsproduktet (g). ORIREV-primeren fester seg til 3'-enden til reaksjonsproduktet (b). Reaksjonsproduktet i (i) kalles TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI (SEQ ID 12). PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cykel på 2 minutter og 15 sekunder ved 94 °C etterfulgt av 30 cykler på 94 °C, 45 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 1 minutt, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen inn i 40 |xl sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California,

U.S.A.).

(j) Fjerde sammensetning PCR. Én jaI (50 ng) av hver av reaksjonsblandingene i (b) og (h) eller anvendende 50 pmol av hver av primerene TAC3 (SEQ ID 09) og ORIREV (SEQ ID 02) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter TaqDeepVent DNA polymeraseblanding (20:1), og lx PCR-reaksjonsbuffer (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). TAC3-primeren tilfører 20 nukleotider nedstrøms til 5'-enden til reaksjonsproduktet (g). ORIREV-primeren fester seg til 3'-enden til reaksjonsblandingen (b). Reaksjonsblandingen i (i) kalles TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI (SEQ ID 13).

PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 2 minutter og 15 sekunder ved 94 °C etterfulgt av 30 cykler of 94 °C, 45 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 1 minutt, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen inn i 40^1 sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California,

U.S.A.).

Fremstilling av in vitro transkripsjon/translasjon reaksjon. Reaksjonen ble satt opp på is, anvendende en Promega bakterielt lineært templat S30 koplet in vitro med transkripsjon/translasjon reaksjonskit som følger: 20 ul TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI-templat (0,5 ug sluttkonstruksjon DNA SEQ ID 012 over); 20 ul TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI-templat (0,5^g sluttkonstruksjon DNA SEQ ID 013 over); 20 y\ komplett aminosyreblanding (Promega); 80^1 S30 Premix; 60 |xl S30 mix;

og reaksjonen ble tillatt å fortsette ved 25 °C i 30 minutter og plassert på is, deretter fortynnet 10 ganger med blokkeringsbuffer (Superblock (Perbio Ltd), 0,1 % Tween 20, 200 pg/ml sildesperma DNA).

DNA-protein kompleks-innfanging. NUNC star immunorør ble belagt med 10 ug/ml enten anti-c-myc-antistoff, anti-V5 antistoff, eller anti-human kappakjede-antistoff, i 500 pl PBS per rør over natten ved 4 °C. Et ytterligere rør ble etterlatt uten tilsetning som en negativ kontroll. Rør ble vasket 2x PBS og blokkert i 1 time ved romtemperatur med Superblock/PBS/0,1 mg/ml sildemelke-DNA/ 0,1 % Tween 20 og deretter vasket 2x PBS. 500^1 fortynnet transkripsjons-/translasjonsreaksjon ble tilsatt til hvert rør og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Rør ble vasket 5x PBS/0,1 % Tween 20, deretter lx 30 minutter med 2 ml Superblock/PBS/0,1 mg/ml sildemelke-DNA/ 0,1 % Tween 20, deretter 5x PBS. DNA ble gjenvunnet med 300^1 T.E. buffer pluss 300^1 fenol/kloroform i 5 minutter med risting. Dette ble sentrifugert ved 13,200 g i 5 minutter og DNA presipitert med 0,5 volumdelerav 7,5 M ammoniumacetat, 20 fxg glykogen og tre volumdeler absolutt etanol. Etter sentrifugering ble pelleter vasket med 70 % etanol, vakuumtørket og resuspendert i 20^1 vann. 10^1 gjenvunnet DNA ble reamplifikert i 50 ul reaksjoner med TAC3- (SEQ ID 09) og ORIREV- (SEQ ID 02) primere. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en 1 % agarose/TAE-gel (figur 5).

Eksempel 2. Å separere RepA-DNA-komplekset

De to in vitro ekspresjonskonstruksjoner (SEQID12 og SEQID13) allerede beskrevet i eksempel 1 ble anvendt i et seleksjonseksperiment mot anti-human C-kappa antistoff som beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at DNA ble gjenvunnet og frigjort fra RepA ved anvendelse av enhver av de følgende fremgangsmåter; glysin, trietylamin, fenol/kloroform, Proteinase K, og EDTA. Disse fremgangsmåter er beskrevet under.

Glysin: rør ble inkubert med 500 ul 200 mM glysin, 150 mM NaCI (pH 2,0) i 10 minutter. Glysineluatet ble deretter overført til et ubrukt eppendorfrør og 50 pl 2M Tris (pH 8,5) tilsatt.

Trietylamin: røret ble inkubert med 500 pl 0,1 M trietylamin i 10 minutter og trietylamineluatet ble deretter overført til en ubrukt eppendorfrør og 250 pl IM Tris (pH 7,4) tilsatt.

Fenol/Kloroform: som eksempel 1 over.

Proteinase K: røret ble inkubert med 500 pl 100 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 % SDS i 30 minutter ved 37 °C. Proteinase K-eluatet ble deretter overført til en ubrukt eppendorfrør.

EDTA: røret ble inkubert med 250 pl 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA 500 mM NaCI og 250 pl fenol/kloroform i 5 minutter. EDTA-eluatet ble deretter overført til en ubrukt eppendorfrør.

Etter gjenvinning av DNA ble DNA fenol-/kloroformekstrahert, hvor passende, etterfulgt av etanol-presipitering som beskrevet i eksempel 1. 10 pl resuspendert DNA ble reamplifikert i 50 pl reaksjoner med TAC3 (SEQID09) og CISREV (SEQID019) primere. CISREV-primeren tilfører 196 baser oppstrøms for bindingssetet til ORIREV (SEQID02). Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en 1 % agarose/TAE gel (data ikke vist). Bare CK-DNA-inneholdende konstruksjon (SEQID 12) ble amplifikert i omtrent ekvivalente mengder.

Dette forteller oss ikke bare at enhver av fremgangsmåtene beskrevet over for å gjenvinne og å frigjøre DNA fra RepA kan anvendes, men dette resultatet viser også at RepA utviser gjensidig påvirkning på en ikke-kovalent måte med dets kognate DNA.

Eksempel 3. Deteksjon av spesifikke anti- V5 hindere i et V5- tilsettende eksperiment anvendende CIS fremvisninqsteknoloqi.

In vitro ekspresjonkonstruksjonene ble fremstilt ved å tilsette TAC-promoteren og enten V5-epitopen eller et 12-mer NNB-bibliotek til RepA-CIS-ORI-regionen, ved PCR-amplifikasjon. Slike konstruksjoner kan fremstilles ved mange fremgangsmåter kjent for fagmannen, for eksempel, ved å amplifikere ulike fragmenter DNA etterfulgt av PCR-sammensetning. I dette eksemplet var det initielle amplifikasjonStemplat Rl-plasmidet som inneholder RepA-CIS-ORI-regionen (Masai, H. og Arai, K.(1988). Nucleic Acids Res. 16, 6493-6514). (a) . Primæramplifikasjon. RepA-CIS-ORI-regionen ble PCR-amplifikert fra en enkel koloni av stammen ECO K12 som huser plasmid RI anvendende 12,5 pmol av hver av primerene REPAFOR (SEQ ID 01) og ORIREV408 (SEQ ID 20) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter TaqDeepVent DNA polymeraseblanding (20:1), og lx PCR-reaksjonsbuffer (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). REPAFOR-primeren fester seg til 5'-enden til den RepA kodende regionen. ORIREV408-primeren fester seg til nedstrøms for 3'-enden til den ikke-kodende ORI-regionen.

PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 4 minutter og 30 sekunder ved 94 °C etterfulgt av 25 cykler ved 94 °C, 30 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 1 minutt, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen i 40 ul sterilt vann ved å anvende Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California,

U.S.A.).

(b) . Sekundær amplifikasjon. Én ul (500 pg) 100 ganger fortynnet gel-renset primærreaksjonsprodukt ble re-amplifikert anvendende 12,5 pmol av hver av primerene V5(NNB)REPFOR (SEQ ID 21) og ORIREV408 (SEQ ID 20) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter TaqDeepVent DNA-polymeraseblanding (20:1), og lx PCR reaksjonsbuffer (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). V5(NNB)REPFOR-primeren fester seg til 5'-enden til primærreaksjonsproduktet og fester seg til det V5 epitope DNA-et. ORIREV408-primeren fester seg til 3'-enden på primærreaksjonsproduktet. PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 4 minutter og 30 sekunder på 94 °C etterfulgt av 25 cykler på 94 °C, 30 sekunder; 60 °C, 45 sekunder; 72 °C, 1 minutt, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen i 40 |xl sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California, U.S.A.). (c) . Tredje amplifikasjon. Én^1 (500 pg) 100 ganger fortynnet gel-renset primærreaksjonsprodukt ble re-amplifikert anvendende 12,5 pmol av hver av primerene NNBREPFOR (SEQ ID 22) og ORIREV408 (SEQ ID 20) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter TaqDeepVent DNA polymeraseblanding (20:1), og lx PCR reaksjonsbuffer (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). NNBREPFOR-primeren fester seg til 5'-enden av primærreaksjonsproduktet og fester seg til et tilfeldig aminosyre 12-mer NNB bibliotek DNA. ORIREV408-primeren fester seg til 3'-enden av primær rea ksj o n p rod u ktet. PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 4 minutter og 30 sekunder på 94 °C etterfulgt av 25 cykler på 94 °C, 30 sekunder; 60°C, 45 sekunder; 72 °C, 1 minutt, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen inn i 40 |xl sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California,

U.S.A.).

(d) . Fjerde amplifikasjon. Én ul (500 pg) 100 ganger fortynnet pTACP2A plasmid (ref) anvendende 12,5 pmol av hver av primerene TACFARUP (SEQ ID 23) og TAC REV (SEQ ID 27) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter TaqDeepVent DNA-polymeraseblanding (20:1), og lx PCR-reaksjonsbuffer (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). TACFARUP-primeren fester seg til 5'-enden avTAC-promoter DNAet. TACREV-primeren fester seg til 3'-enden av TAC-promoter DNA.

PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 1 minutter og 45 sekunder på 94 °C etterfulgt av 25 cykler på 94 °C, 15 sekunder; 60 °C, 30 sekunder; 72 °C, 30 sekunder, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen inn i 40^1 sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California,

U.S.A.).

(e) . Første sammensetning PCR. Én jxl (50 ng) av hvert av reaksjonsproduktene i (b) og (d) anvendende 50 pmol av hver av primerene TAC FA RU P (SEQ ID 23) og ORIREV408 (SEQ ID 20) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter TaqDeepVent DNA polymeraseblanding (20:1), og lx PCR reaksjonsbuffer (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). TACFARUP-primeren fester seg til 5'-enden av reaksjonsproduktet (d). ORIREV480-primeren fester seg til 3'-enden av reaksjonsproduktet (b). Reaksjonsproduktet i (e) kalles TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408 (SEQ ID 24).

PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler for 1 cyklus på 1 minutter og 45 sekunder på 94 °C etterfulgt av 25 cykler på 94 °C, 15 sekunder; 60 °C, 30 sekunder; 72 °C, 1 minutt og 30 sekunder, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen i 40^1 sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California, U.S.A.). (f) . Andre sammensetning PCR. Én ul (50 ng) av hver av reaksjonsblandingene i (c) og (d) anvendende 50 pmol av hver av primerene TAC FA RU P (SEQ ID 23) og ORIREV408 (SEQ ID 20) i en 50 pl reaksjon inneholdende 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter TaqDeepVent DNA polymeraseblanding (20:1), og lx PCR reaksjonsbuffer (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). TACFARUP-primeren fester seg til 5'-enden av reaksjonsblandingen (d). ORIREV480-primeren fester seg til 3'-enden til reaksjonsblandingen (c). PCR-reaksjoner ble utført på en Eppendorf Master Cycler i 1 cyklus på 1 minutter og 45 sekunder på 94°C etterfulgt av 25 cykler på 94 °C, 15 sekunder; 60 °C, 30 sekunder; 72 °C, 1 minutt og 30 sekunder, etterfulgt av en enkelt cyklus på 10 minutter ved 72 °C. Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en agarosegel, spaltet fra og produkter renset fra gelen i 40 ul sterilt vann ved å anvende et Geneclean II kit ifølge produsentens instruksjoner (BiolOl, La Jolla, California, U.S.A.). Reaksjonsblandingen i (0 kalles TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408 (SEQ ID 25).

Fremstilling av in vitro transkripsjons-/translasjonsreaksjon: Reaksjonssettet ble satt opp på is, anvendende et Promega bakterielt lineært templat S30 koplet in vitro til transkripsjon/translasjon reaksjonskit som følger: 20 pl 5000 ganger fortynnet TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408 templat (0,1 ng sluttkonstruksjon DNASEQ ID 24 over) 20 pl 5 TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408 templat (0,5 pg sluttkonstruksjon DNASEQ ID 25 over)

20 pl komplett aminosyreblanding (Promega)

80 pl S30 Premix

60 pl S30 blanding

og reaksjonen ble tillatt å fortsette ved 25 °C i 30 minutter og plassert på is, deretter fortynnet 10 ganger med 2 % Marvel/PBS.

DNA-proteinkompleks-isolering. NUNC star immunorør ble belagt med 10 pg/ml anti-V5 antistoff i 500 pl PBS over natten ved 4 °C. Et ytterligere rør ble etterlatt uten tilsetning som en negativ kontroll. Rør ble vasket 2x PBS og blokkert i 1 time ved romtemperatur med blokkeringsbuffer (2 % Marvel, 0,1 % Tween 20, 0,lmg/ml sildemelke-DNA) og deretter vasket 2x PBS. 1 ml fortynnet transkripsjon/translasjonsreaksjon ble tilsatt til hvert rør og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Rør ble vasket 5x PBS/0,1 % Tween 20 og deretter 5x PBS. DNA ble gjenvunnet med 500 pl TE buffer pluss 500 pl fenol/kloroform. Dette ble sentrifugert ved 13,200 g i 5 minutter og DNA presipitert med 1/10 volum 3 M natriumacetat, 50 pg/ml glykogen og to volumdeler absolutt etanol. Etter sentrifugering ble pelleter vasket med 70 % etanol, vacuumtørket og resuspendert i 40 pl vann. 20 pl gjenvunnet DNA ble reamplifikert i 50 pl reaksjoner med de biotinylerte primererne bTAC6 (SEQ ID 26) og bCISREV (SEQ ID 19). Reaksjonsprodukter ble utsatt for elektroforese på en 1 % agarose/TAE-gel.

Kloning av gjenvunnet DNA i ekspresjonvektoren pDMG-K (SEQ ID 27). Reaksjonsproduktet ble gelrenset og eluert med 50 ul sterilt vann ved å anvende et QIAquick Gelextracation kit ifølge produsentens instruksjoner (QIAGEN LtdWest Sussex, U.K.)- Bade de rensede reaksjonsprodukter og plasmidet pDMG-K ble spaltet med 20 enheter Ncol og Noti (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). De spaltede plasmidene ble gelrenset ved å anvende et QIAquick Gelextracation kit ifølge produsentens instruksjoner (QIAGEN LtdWest Sussex, U.K.), deretter behandlet med 0,01 enheter Kalvetarm alkalisk fosffatase (Promega, Southampton, U.K.) etterfulgt av fenol/kloroform-ekstraksjon og etanolpresipitering som beskrevet over. Presipitert DNA ble oppløst i 20 pl vann. Det spaltede PCR-produktet ble overført til Streptavidin-belagte strimler (Roche Diagnostics Ltd, East Sussex, U.K.) i lx TBS, 0,3 mg/ml BSA, 0,1 % Tween 20 og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur, risting. Denne fremgangsmåten fjerner det flankerende biotinylerte DNAet oppstrøms og nedstrøms for Ncol- og Notl-setet til PCR-produktet og muliggjør gjenvinning av det lille DNA-fragmentet inneholdende den utvalgte peptidsekvensen. Supernatanten ble fenol/kloroform-ekstraktet og etanol-presipitert som beskrevet over. Presipitert DNA ble oppløst i 10 pl vann. Kuttplasmid og det isolerte lille DNA-fragmentet inneholdende den utvalgte peptidsekvensen, begge med Ncol og Noti overheng, ble utsatt for ligering ved å anvende et Quick ligeringskit ifølge produsentens instruksjoner (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.) etterfulgt av fenol/kloroformekstraksjon og etanolpresipitering som beskrevet over. Presipitert DNA ble oppløst i 10 pl vann og utsatt for elektroforese inn i elektrokompetente TGl-celler ifølge produsentens instruksjoner (Stratagene, U.S.A.) og selektert på plater med 2xTY, 100 pg/ml ampicillin og 2 % glukose.

Anti-V5 antistoff ELISA-screening av selekterte kloner. 88 kolonier ble tilført i 400 pl 2x TY, 2 % glukose, og 100 pg/ml ampicillin og dyrket natten over ved 37 °C, ristet 300 rpm. 50 pl av nattekulturene ble overført i 1 ml 2x TY, 2 % glukose, og 100 pg/ml ampicillin og dyrket ved 37 °C, ristet 300 rpm inntil OD 0,5. Deretter ble cellene sentrifugert ved lOOOx g i 10 minutter. Supernatantene ble fjernet og pelleter resuspendert i 600 pl 2x TY, 0,4 M sukrose, 100 pg/ml ampicillin, og 1 mM IPTG og dyrket i 4 timer ved 37 °C, 300 rpm. Etter induksjon ble cellene sentrifugert ved lOOOx g i 10 minutter. 150 pl av supernatantene ble anvendt i ELISA-testen. NUNC Maxisorp plater ble belagt med 100 pl 1 pg/ml i lx PBS av enten anti-human kappa region antistoff eller anti-V5-antistoff eller 50 pg/ml BSA i 7 timer ved romtemperatur. En ytterligere plate ble etterlatt uten tilsetning, kun belagt med PBS. Brønner ble skylt med 2x PBS etterfulgt av blokkering i 1 time ved romtemperatur med 300 pl 4 % Marvel, 0,1 % Tween i lx PBS. Brønner ble skylt 2x med PBS, deretter 150 ul supernatant og 150 pl 4 % Marvel, 0,1 % Tween 20 i lx PBS ble tilsatt til brønner og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Brønnene ble deretter vasket 2x med PBS, 0,1 % Tween 20 og 2x PBS. Sekundært antistoff anti-human kappa region antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (HRP)(sluttkonsentrasjon 1,6 pg/ml) ble fortynnet 500 ganger i 4 % Marvel, 0,1 % Tween 20, lx PBS og tilsatt til brønner og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Brønner ble deretter vasket 4x PBS, 0,1 % Tween 20 og 2x PBS. HRP-signalet ble påvist ved tilsetting av 200 pl TMB-substrat. Reaksjon ble stanset med 100 pl 0,5 M svovelsyre. Absorbans ble lest ved 450 nm. 35 av 88 kloner uttrykte brønner vurdert ut fra HRP-signal fra kloner screenet mot anti-human kappa region antistoff. 7 av disse 35 kloner viste spesifikk binding til anti-V5 antistoff, for derved å anrike V5-peptider fra 1 av 5000 til 1 av 5, dvs. en anrikelsesfaktor på 1000 (Figur 6).

Eksempel 4: CIS fremvisning bibliotekkonstruksion, seleksjon & screening mot Bacillus globiaii

Bibliotekkonstruksion

For å utvikle bibliotek-DNA må et promoterbibliotek DNA-fragment og RepA-CIS-ori-fragmentet genereres, deretter bindes sammen ved spalting-ligasjon. Tac-promoteren fra en P2A-HA-vektor ble anvendt i dette eksemplet, men mange tilgjengelige promoterer kan anvendes, og er godt kjent for fagmannen. De initielle PCR til Rep-CIS-ori og TAC-f rag menter fester seg til henholdsvis Bspl20I-sete og randomiserte bibliotek/Notl-sete. To masterblandinger ble fremstilt: 10 pl 1:50 fortynnet P2A-HA plasmid DNA (25 ng/reaksjon) ble PCR-amplifikert i 20 x 50 pl reaksjonsvolum inneholdende 200 pM dNTPs, lxNEB polymerase amplifikasjonsbuffer (10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04, 20mM Tris-HCI pH 8,8, 2 mM MgS04, 0,1 % TritonX-100) med 10 pmol av hver av primerene TACFARUP (SEQ ID 23) og NTERM18MER (SEQ ID 28) primere og 2 enheter på 20:1 Taq DNA polymerase: Deep Vent DNA polymeraseblanding (NEB) i 25 cykler på 94 °C, 40 sekunder; 60 °C, 40 sekunder; 72 °C, 60 sekunder; etterfulgt av en 5 minutter forlengelse ved 72 °C. 20 pl reaksjonsprodukt ble utsatt for elektroforese på en 1 % agarose-/TAE-gel og fotografert, mens det gjenværende ble Qiagen-kolonnerenset i 200 pl vann. 10 pl Bspl20I korrigert Rep-CIS-ori DNA (50 ng/reaksjon) ble PCR-ampliflkert i 10 x 50 pl reaksjonsvolum inneholdende 200 pM dNTPs, lxNEB polymeraseamplifikasjonsbuffer (10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04, 20 mM Tris-HCI pH 8,8, 2 mM MgS04, 0,1 % TritonX-100) med 10 pmol av hver av primerene BSPREPAFOR (SEQ ID 29) og ORIREV (SEQ ID 02) primere og 2 enheter på 20:1 Taq DNA polymerase: Deep Vent DNA polymeraseblanding (NEB) i 30 cykler på 94 °C, 40 sekunder; 60 °C, 40 sekunder; 72 °C, 90 sekunder; etterfulgt av en 5 minutter forlengelse ved 72 °C. 20 pl reaksjonsprodukt ble utsatt for elektroforese på en 1 % agarose-/TAE-gel og fotografert, mens det gjenværende ble Qiagen-kolonnerenset i 120 pl vann.

Bibliotek-TAC-produkt ble deretter spaltet med 10 pl Noti (NEB) (100 pl) i 1 time ved 37 °C i et 300 pl reaksjonsvolum, deretter Qiagen-kolonnerenset i 120 pl volum vann. De to produkter ble deretter forent ved restriksjons-ligering som følger:

Reaksjon ble utført ved 37 °C i to timer. 20 pl ble testet ved gelelektroforese, 30 pl ble PCR-amplifikert direkte i 10 x 50 pl reaksjoner, og det gjenværende ble gelrenset og bibliotekbåndet spaltet fra, Qiagen-kolonnerenset og PCR-ampliflkert i 20x 50 pl reaksjoner med primere TACFAR4 (SEQ ID 30) og ORIREV (SEQ ID 02) i 30 cykler på 94 °C, 40 sekunder; 60 °C, 40 sekunder; 72 °C, 90 sekunder; etterfulgt av en 5-minutters forlengelse ved 72 °C. DNA ble gelrenset i 4 Qiagen-kolonner og 200 pl eluatet satt sammen for ITT reaksjoner/seleksjon.

Runde 1 Seleksjon

2 x 200 pl ITT reaksjon ble satt opp og inkubert ved romtemperatur i 1 time som følger: 1 ml blokkeringsbuffer ble tilsatt til hver reaksjon (blokkbuffer er 4 % Marvel, 100 pg/ml skjærbehandlet laksemelke- DNA, 0,1 % Tween 20, 2,5 mg/ml heparin, i TBS), sentrifugert ved 10,000 g i 2 minutter, overført til et ubrukt rør, deretter plassert på is.

100 ul Bacillus globigii (Sg) spore-suspensjon ble vasket to ganger med lml TBS/0,1 % Tween 20 og ble resuspendert i 100 ul Blokkbuffer. Dette ble deretter tilsatt til Blokkbufferen og tillatt å binde ved romtemperatur i 1 time under blanding.

Blandingen ble deretter sentrifugert ved 16,100 g i 1 minutt og sporepelleten ble vasket seks ganger med 1 ml TBS/0,1 % Tween 20 ved å blande med en pipette og virvles sterkt før sentrifugering. Pelleten ble til slutt vasket i 1 ml TBS og supernatanten ble forkastet.

DNA ble eluert ved inkubering av sporene i 120 pl 0,5 M natriumacetat pH 5,5 i 10 minutter i en blander. Sporene ble sentrifugert ved 16,100 g i 1 minutt og supernatanten ble nøytralisert ved tilsetting av 120 pl Tris pH 8,0 og deretter fenol/CHCI3ekstrahert i 5 minutter ved 16,100 g. DNA ble presipitert med 20 pg bærerglykogen og to og et halvt volum etanol. DNA ble pelletert ved 16,100 g i 20 minutter og pelleten vasket tre ganger med 0,75 ml 70 % etanol, sentrifugering i 3 minutter ved 16,100 g mellom hver vask, deretter lufttørket og re-suspendert i 20 pl vann.

10 pl gjenvunnet DNA ble PCR-amplifikert i 10 x 50 pl reaksjon med primere CISREV (SEQ ID 19) og TACFAR5 (SEQ ID 31) og 2 enheter 20:1 Taq DNA polymerase: Deep Vent DNA polymeraseblanding (NEB) i 30 cykler på 94 °C, 40 sekunder; 60 °C, 40 sekunder; 72 °C, 90 sekunder; etterfulgt av en 5 minutter forlengelse ved 72 °C. DNAet ble renset, etanol-presipitert og re-suspendert i 10 pl vann. 5 |i.l ble ytterligere amplifikert ved de anvendte PCR-betingelsene over, men ved å bruke primerene NOTRECREV2 (SEQ ID 32) og TACFAR5 (SEQ ID 31) i 10 cykler. Produktet ble renset ved å anvende et Qiagen PCR opprenskningssett og eluert i 50 pl 5 mM Tris pH 8,0.

Restriksion- lioasion

Dette ble utført i en 30 pl reaksjon i 1 time ved 37 °C for fornyet festing av RepA-CIS-ori-DNA til gjenvunnede peptider for en ytterligere seleksjonsrunde.

20 pl ble PCR-amplifikert direkte i 10x 50 pl reaksjoner med primere TACFAR5.1 (SEQ ID 33) og ORIREV (SEQ ID 02) i 20 cykler på 94 °C, 40 sekunder; 60 °C, 40 sekunder; 72 °C, 90 sekunder; etterfulgt av en 5 minutter forlengelse ved 72 °C. DNA ble gelrenset i 1 Qiagen-kolonne og eluatet anvendt for Runde 2 av ITT reaksjoner/seleksjon (58 pl anvendt i R2).

Runde 2

Andre runde utvalg ble utført som for runde 1, med de følgende endringer: Omtrent 3 jxg inntaks-DNA ble anvendt. Blokkbuffer var 2 % bovine serum albumin, 1 % gelatin, 100 pg/ml skjærbehandlet laksemelke-DNA, 2,5 mg/ml heparin i TBS. 10 |xl vaskede sporer ble anvendt i hvert utvalg. Gjenvinnings-PCRs anvendte TACFAR5.2 (SEQ ID 34) og NOTRECREV2 (SEQ ID 32) primere. Til slutt, totalt gjennomført PCR anvendte TACFAR5.2 (SEQ ID 34) og ORIREV (SEQ ID 02)-primere i 10 cykler.

Runde 3

Tredje runde utvalg ble utført som for runde 2, med de følgende endringer: Omtrent 2,5^g inntaks- tilført DNA ble anvendt. Gjenvinning-PCRs anvendte TACFAR6 (SEQ ID 35) og NOTRECREV2 (SEQ ID 32) primere. Til slutt, anvendte totalt gjennomført PCR TACFAR6 (SEQ ID 35) og ORIREV (SEQ ID 02)-primere i 10 cykler.

Runde 4

Runde 4 ble utført som for runde 3, bortsett fra at omtrent 2 ug tilført DNA ble anvendt for utvalget. Gjenvinning-PCRs anvendte TAC3 (SEQ ID 09) og NOTRECREV2 (SEQ ID 32) primere. Til slutt, anvendte totalt gjennomført PCR TAC3 (SEQ ID 09) og ORIREV (SEQ ID 02)-primere i 10 cykler.

Runde 5

Runde 5 ble utført som for runde 4.

For å klone ut som Ncol-Notl fragmenter, ble de lagrede gjenvunnede DNA fra runde 5 PCR-amplifikert med biotinylert TAC6 (SEQ ID 26) primer og NOTRECREV2 (SEQ ID 32). Spalting med Noti ble etterfulgt av rensing anvendende Qiagen PCR opprenskningskit, spalting med Ncol etterfulgt av inkubering i en plate belagt med streptavidin. Etterfølgende fenol/CHCI3-rensing og etanol-presipitering, ble det spaltede DNA deretter ligert i en lignende spaltet pVIII fagmid-vektor og transformert i ER2738 E. coli, deretter lagt på plate i 2 % glukose, 2xTY, 100 pg/ml ampicillinplater og inkubert o/n ved 37 °C.

Individuelle kolonier ble høstet i 200 pl 2 % glukose, 2xTY, 100 pg/ml ampicillin medium i 96-brønnplater, og dyrket ved 37 °C/200rpm i 6 timer. 100 pl ble overført til en dypbrønnplate inneholdende 100 pl 2 % glukose, 2xTY, 100 pg/ml ampicillin pluss 10 pl M13K07 hjelpefag/brønn og inkubert i 1 time uten risting ved 37 °C. 500 pl per brønn på 2xTY, 100 pg/ml ampicillin/ 25 pg/ml kanamycin/ 20 pM IPTG-medium ble tilsatt og inkubering utført o/n ved 37 °C/200 rpm.

ELISA- screeninq

Rundbunnet 96-brønnplater ble blokkert med 4 % Marvel i TBS/0,1 % Tween 20 i PBS i 1 time ved romtemperatur. Valgte fagkulturer ble sentrifugert ved 3000 g i 5 minutter og fagsupernatanten ble analysert i en ELISA. I hver brønn ble 50 |xl fagsupernatant blandet med 5 |xl Sg-sporer i 50 |xl 4 % bovine serum albumin, 1 % gelatin i TBS og inkubert under risting ved romtemperatur i 1 time. Brønnene ble vasket 5 x med 200 [ i\ TBS/0,1 % Tween20 ved sentrifugering ved 3000 g i 5 minutter imellom hver vask før inkubering med anti-M13 pepperrot peroksidase-konjugert antistoff 0,2 ug/ml i 4 % bovine serum albumin, 1 % gelatin i TBS. Sporene ble inkubert ved romtemperatur i 1 time under risting. Brønnene ble deretter vasket 5 x med TBS/0,1 % Tween20 og sporene ble overført på en ubrukt plate. Sporene ble deretter vasket én gang med TBS som beskrevet overfør behandling med TMB-substrat. Behandlingen ble stanset med 0,5 M H2S04og løsningen ble overført til en ubrukt flatbunnet plate for lesing ved 450 nm. Bindingsdata for utvalgte peptider er vist i figur 7.

Eksempel 5. CIS fremvisninasbibliotekkonstruksion, utvala & screening mot anti- V5 antistoff

Bibliotekkonstruksjon ble utført som beskrevet i Eksempel 4.

Runde 1 Utvalg

lx 200 pl in vitro transkripsjon/translasjonsreaksjon (ITT) reaksjon ble satt opp og inkubert ved romtemperatur i 1 time som beskrevet i eksempel 4. 1 ml blokkeringsbuffer ble tilsatt til hver reaksjon (Blokkbuffer er 5 % skummet melkepulver, 100 pg/ml skåret laksemelke-DNA, 2,5 mg/ml heparin, i TBS), deretter plassert på is.

For den første runden av bibliotekutvalg ble en 70x11 mm NUNC Maxisorp Immunorør (Life Technologies, Paisley, Scotland U.K.) belagt med 1 ml 10 pg/ml polyklonalt anti-V5 peptid antistoff (Harlan-Seralab) i PBS i 1 time ved 37 °C. Røret ble vasket ut tre ganger med PBS (fyll & tøm) og blokkert med 3 ml blokkbuffer i 1 time ved 37 °C og vasket som før. Bibliotek protein-DNA-komplekser i blokkbuffer ble tilsatt og inkubert i 1 time stående i romtemperatur. Røret ble vasket fem ganger med PBS/0,1 % Tween 20, deretter ytterligere fem ganger med kun PBS.

DNA ble eluert i 500 pl 1 M natriumacetat pH 5,2 i 10 minutter på blodblanderen, nøytralisert med 100 pl !M Tris-HCI pH 8,0, deretter fenol/CHCI3 ekstrahert i 5 minutter ved 16,100 g. DNA ble presipitert med 20 pg bærerglykogen, Vi volum 7,5 M ammoniumacetat, og tre volumer etanol. DNA ble pelletert ved 16,100 g i 20 minutter og pelleten vasket med 0,5 ml 70 % etanol i 5 minutter ved 16,100 g deretter vakuumtørket, og re-suspendert i 20 pl vann. 10 pl gjenvunnet DNA ble PCR-ampliflkert i lx 50 pl reaksjon med primere NOT1RECREV2 (SEQ ID 32) og TACFAR4 (SEQ ID 30) og 2 enheter 20:1 Taq DNA polymerase: Deep Vent DNA polymeraseblanding (NEB) i 30 cykler på 94 °C, 40 sekunder; 60 °C, 40 sekunder; 72 °C, 90 sekunder; etterfulgt av en 5 minutter forlengelse ved 72 °C. 50 pl reaksjonsprodukt ble utsatt for elektroforese på en 1 % agarose-/TAE-gel og fotografert, deretter GeneClean-renset i 10 pl vann. DNA ble festet på nytt til RepA DNA og reamplifikert for runde to som beskrevet i eksempel 4 anvendende TACFAR5- (SEQ ID 31) og ORIREV- (SEQ ID 02) primere.

Andre runde utvalg ble utført som for runde 1, anvendende de samme primerpar som beskrevet i eksempel 4, med de følgende endringer: Anti-V5-antistoff belegningskonsentrasjon ble redusert til 5pg/ml. Inntaks-DNA var omtrent 4 pg.

Tredje runde utvalg ble utført som for runde 2, med de følgende endringer: Omtrent 4 jxg inntaks-DNA ble anvendt. Gjenvinnings-PCRs anvendende TACFAR5.1- (SEQ ID 33) og NOTRECREV2- (SEQ ID 32) primere. Til slutt, totalt gjennomført PCR anvendende TACFAR6 (SEQ ID 35) og ORIREV (SEQ ID 02) primere i 10 cykler. Runde 4 ble utført som for runde 3.

For å klone ut som Ncol-Notl fragmenter, ble de lagrede gjenvunnede DNA fra runde 4 de gjenvunnede DNA fra runde 4 PCR-amplifikert med biotinylert (SEQ ID 26) TAC6 og NOTIREPRECREV2 (SEQ ID 32)-primere og klonet i pVIII fagmid-vektor og utsatt for elektroforese inn i elektrokompetent TG-1 E. coli, som beskrevet i eksempel 4.

Individuelle kolonier ble plassert i 200 pl 2 % glukose, 2xTY, 100 pg/ml ampicillin medium i 96-brønnplater, og dyrket ved 37 °C/200 rpm i 6 timer. 100 pl ble overført til en dypbrønn-plate inneholdende 100 pl 2 % glukose, 2xTY, 100 pg/ml ampicillin pluss 10<9>kru M13K07 hjelpefag/-brønn og inkubert i 1 time uten risting ved 37 °C. 400 pl per brønn på 2xTY, 100 pg/ml ampicillin/ 25 pg/ml kanamycin/ 20 pM IPTG-medium ble tilsatt og fagamplifikering fortsatt i 16 timer ved 37 °C under risting ved 200 rpm. Bakteriekulturer ble sentrifugert i mikrotiterplatebærere ved 2 000 g i 10 minutter ved 4 °C i en benkeplate-sentrifuge til pel let-bakterie og kultur-supernatant anvendt for ELISA.

En NUNC Maxisorp ELISA-plate ble belagt med 100 ng/brønn anti-V5 peptid antistoff i 100 pl /brønn PBS én gang ved 37 °C. Platen ble vasket 2x200 pl/brønn PBS og blokkert i 1 time ved 37 °C med 200 pl/brønn 2 % BSA/PBS og deretter vasket 2 x 200 pl/brønn PBS. 50 pl fagkultur-supernatant ble tilsatt til hver brønn inneholdende 50 pl/brønn 4 % BSA/PBS, og tillatt å binde i 1 time ved romtemperatur. Platen ble vasket to ganger med 200 pl/brønn PBS/0,1 % Tween 20, deretter to ganger med 200 pl/brønn PBS. Bundet fag ble detektert med 100 pl/brønn, 1:5000 fortynnet anti-M13-HRP konjugat (Amersham-Pharmacia) i 2 % BSA/PBS i 1 time ved romtemperatur og platen vasket fire ganger som over. Platen ble fremkalt i 5 minutter ved romtemperatur med 100 pl/brønn TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) substratbuffer. Reaksjonen ble stanset med 100 pl/brønn 0,5N H2S04og lest ved 450 nm. Fagmid- DNA av ELISA-positive kloner ble deretter sekvensert med standard pUC fremadrettede og reverse sekvenseringsprimere. Aminosyresekvensen til disse isolerte klonene er vist under. Fire ELISA-positive kloner ble dyrket i 10 ml dyrkningsvolum og fag-partikler presipitert med PEG-NaCI og re-suspendert i 1 ml PBS og 50 pl testet om igjen i ELISA som beskrevet over. OD450 nm signaler mot anti-V5 og kontroll anti-ACTH-peptid antistoff er vist i figur 8.

Peptidsekvenser isolert etter seleksjon:

Eksempel 6. Utvalg av ovalbuminbindinqspeptider fra et CIS displav-bibliotek

For enhver utvalgsmetodologi er det viktig at de utvalgte enheter er i stand til å binde til målet de er utvalgt til, uavhengig av bærermolekylet forbundet med det under utvelgelse og screening. I dette eksempel er utvalgte peptider utvalgt og syntetisert for å tillate bekreftelse av målbinding. Randomisert 12mer peptid bibliotek-konstruksjon ble utført som beskrevet i Eksempel 3. Fire runder med utvalg ble utført som beskrevet i eksempel 4 med 100 pg/ml ovalbumin (SIGMA, Dorset, UK) belagt på immunorør.

For å klone ut som Ncol-Notl fragmenter, ble de gjenvunnede DNA fra runde 4 PCR-ampliflkert med biotinylert TAC6 (SEQ ID 26) og NOTIREPRECREV2 (SEQ ID 32)-primere og klonet inn i en pVIII fagmid-vektor og utsatt for elektroforese inn i elektrokompetent TG-1 E. coli, som beskrevet i eksempel 4.

Individuelle kolonier ble høstet i 200 pl 2 % glukose, 2xTY, 100 pg/ml ampicillin-medium i 96-brønnplater, og dyrket ved 37 °C/200 rpm i 6 timer. 100 pl ble overført til en dypbrønnplate inneholdende 100 pl 2 % glukose, 2xTY, 100 pg/ml ampicillin pluss IO<9>kru M13K07 hjelper-fag/brønn og inkubert i 1 time uten risting ved 37 °C. 400 pl per brønn 2xTY, 100 pg/ml ampicillin/ 25 pg/ml kanamycin/ 20 pM IPTG-medium ble tilsatt og fagamplifikasjon fortsatt i 16 timer ved 37 °C under risting ved 200 rpm. Bakteriekulturer ble sentrifugert i mikrotiterplate-bærere ved 2000 g i 10 minutter ved 4 °C i en benkeplate-sentrifuge til bakteriepellet og kultursupernatant anvendt for ELISA.

En NUNC Maxisorp ELISA-plate ble belagt med 100 pg/brønn ovalbumin i 100 pl /brønn PBS natten over ved 4 °C. Platen ble vasket 2x200 pl/brønn PBS og blokkert i 1 time ved 37 °C med 200 pl/brønn 2 % BSA/PBS og deretter vasket 2x200 pl/brønn PBS. 50 pl fagkultur-supernatant ble tilsatt til hver brønn inneholdende 50 pl/brønn 4 % BSA/PBS, og tillatt å binde i 1 time ved romtemperatur. Platen ble vasket to ganger med 200 pl/brønn PBS/0,1 % Tween 20, deretter to ganger med 200 pl/brønn PBS. Bundet fag ble detektert med 100 pl/brønn, 1:5000 fortynnet anti-M13-HRP konjugat (Amersham-Pharmacia) i 2 % BSA/PBS i 1 time ved romtemperatur og platen vasket fire ganger som over. Platen ble fremkalt i 5 minutter ved romtemperatur med 100 pl/brønn TMB-(3,3',5,5'-tetrametylbenzidin) substratbuffer. Reaksjonen ble stanset med 100 pl/brønn 0,5N H2S04og lest ved 450 nm. Fagmid-DNA av ELISA positive kloner ble så sekvensert med M13REV-primer. Aminosyresekvensen til disse klonene isolert er vist under.

Peptidsekvenser fra fire representative ELISA-positive kloner ble syntetisert (SIGMA-Genosys Ltd) med biotin tilsatt til C-terminusen for å hjelpe deteksjon i ELISA. Disse peptider ble testet i ELISA mot ovalbumin, sammen med et kontrollpeptid tidligere isolert ved fag fremvisning utvalg mot B. globigii- sporer. A NUNC Maxisorp ELISA-plate ble belagt med 100 pg/brønn ovalbumin i 100 pl /brønn PBS, eller 200 ng/brønn ant-V5 polyklonalt antistoff i PBS, natten over ved 4 °C. Platen ble vasket 2x200 pl/brønn PBS og blokkert i 1 time ved 37 °C med 200 pl/brønn 2 % skummet melkepulver/PBS og deretter vasket 2x 200 pl/brønn PBS. 1 pg fortynnede peptider ble tilsatt til hver brønn i 100 pl/brønn 2 % BSA/PBS, og tillatt å binde seg i 1 time ved romtemperatur. Platen ble vasket to ganger med 200 pl/brønn PBS/0,1 % Tween 20, deretter to ganger med 200 pl/brønn PBS. Bundede peptider ble detektert med 100 pl/brønn, 1:2000 fortynnet streptavidin-HRP-konjugat (Pierce) i 2 % BSA/PBS i 1 time ved romtemperatur og platen vasket fire ganger som over. Platen ble fremkalt i 5 minutter ved romtemperatur med 100 pl/brønn TMB (3,3',5,5'-tetrametylbenzidin) substratbuffer. Reaksjonen ble stanset med 100 pl/brønn 0,5 N H2S04og lest ved 450 nm (Figur 9).

Eksempel 7. Fremvisning av enkelkiede Fv antistoff- fscFvl- fraamenter i et CIS- fremvisninassvstem

En tac-scFv-RepA-CIS-ori-konstruksjon ble konstruert ved PCR overlappforlengelse hovedsakelig som beskrevet tidligere i eksempel 1. Anti-mecoprop scFv DNA (Haptogen Ltd, Aberdeen, UK) ble amplifikert i et 50 pl reaksjonsvolum inneholdende 200 pM dNTPs, lxNEB polymerase amplifikasjonsbuffer (10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04, 20 mM Tris-HCI pH 8, 2 mM MgS04, 0,1 % TritonX-100) med 10 pmol av hver av primerene TAC M ECO FO R (SEQ ID 45) og REPAMECOBAK (SEQ ID 46) og 2 enheter 20:1 Taq DNA polymerase: Deep Vent DNA-polymeraseblanding (NEB) i 30 cykler på 94 °C, 40 sekunder; 60 °C, 40 sekunder; 72 °C, 80 sekunder; etterfulgt av en 5 minutter forlengelse ved 72 °C. Produkter ble utsatt for elektroforese på en 1 % agarose/TAE-gel og renset med et Geneclean II-kit i 20 pl vann. Dette ble satt sammen med RepA-CIS-ori-DNA generert med ORIREV408 (SEQ ID 20) og MECOREPAFOR (SEQ ID 47), og Tac promoter-DNA generert med TACFARUP (SEQ ID 23) og MECOTACBAK (SEQ ID 48) i et 50 pl reaksjonsvolum inneholdende 200 pM dNTPs, lxNEB polymerase amplifikasjonsbuffer (10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04, 20 mM Tris-HCI pH 8,8, 2 mM MgS04, 0,1 % TritonX-100) med 10 pmol av hver av primerene TAC3 (SEQ ID 09) og ORIREV (SEQ ID 02) og 2 enheter 20:1 Taq DNA polymerase: Deep Vent DNA-polymeraseblanding (NEB) i 30 cykler på 94 °C, 40 sekunder; 60 °C, 40 sekunder; 72 °C, 80 sekunder; etterfulgt av en 5 minutter forlengelse ved 72 °C. Produkter ble utsatt for elektroforese på en 1 % agarose/TAE-gel og renset med et Geneclean II-kit i 20 pl vann.

DNA ble reamplifikert i 10x 50 pl reaksjoner inneholdende 200 pM dNTPs, lxNEB polymerase amplifikasjonsbuffer (10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04, 20 mM Tris-HCI pH 8,8, 2 mM MgS04, 0,1 % TritonX-100) med 10 pmol av hver av primerene TAC3 (SEQ ID 09) og ORIREV (SEQ ID 02) og 2 enheter av 20:1 Taq DNA polymerase: Deep Vent DNA-polymeraseblanding (NEB) i 30 cykler på 94 °C, 40 sekunder; 60 °C, 40 sekunder; 72 °C, 80 sekunder; etterfulgt av en 5 minutter forlengelse ved 72 °C. Produkter ble utsatt for elektroforese på en 1 % agarose/TAE-gel og renset med et Geneclean II-kit i 100 pl vann.

ScFvDNA ble deretter translatert i de følgende to reaksjonsbetingelser:

Reaksjoner ble inkubert ved 30 °C i 30 minutter deretter 1 ul 0,25 M oks-glutation tilsatt til reaksjon 2 og inkubering ved 30 °C fortsatt i ytterligere 30 minutter. 1 ml blokkeringsbuffer ble tilsatt til hver reaksjon (Blokkbuffer er 1 % gelatin, 100 ug/ml skjærbehandlet laksemelke-DNA, 2,5 mg/ml heparin, i TBS), sentrifugert ved 10,000 g i 2 minutter, deretter plassert på is.

NUNC star immunotuber ble belagt med 0,5 ml 10 pg/ml BSA-mecoprop konjugat, eller 10 pg/ml BSA i PBS i 1 time ved 37 °C. Rør ble vasket 2x PBS, deretter blokkert i 1 time ved romtemperatur med 3 ml blokkeringsbuffer på en blodblander, deretter ble rørene vasket 2x PBS.

0,5 ml av hver fortynnet ITT ble tilsatt til enten et blokkert BSA-belagt eller BSA-mecopropbelagt rør og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Rør ble vasket 5x TBS/0,1 % Tween 20, 5x TBS.

Bundet DNA ble eluert i 10 minutter ved romtemperatur med 0,5 ml 0,5 M NaCI/10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, deretter ekstrahert med 0,5 ml_ fenol/kloroform og presipitert med 20 pg bærerglykogen, Vi volum 7,5 M ammoniumacetat, og tre volumer etanol. DNA ble pelletert ved 14,000 g i 20 minutter og pelleten vasket med 0,5 ml 70 % etanol i 5 minutter ved 14,000 g deretter vacuumtørket, og re-suspendert i 20 pl vann. 10 pl gjenvunnet DNA ble PCR-amplifikert i en 50 pl reaksjonsvolum inneholdende 200 pM dNTPs, lxNEB polymerase amplifikasjonsbuffer (10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04, 20 mM Tris-HCI pH 8,8, 2 mM MgS04, 0,1 % TritonX-100) med 10 pmol av hver av primerene TAC M ECO FO R (SEQ ID 45) og REPAMECOBAK (SEQ ID 46) og 2 enheter 20:1 Taq DNA polymerase: Deep Vent DNA-polymeraseblanding (NEB) i 30 cykler på 94 °C, 40 sekunder; 60 °C, 40 sekunder; 72 °C, 80 sekunder; etterfulgt av en 5 minutter forlengelse ved 72 °C. Produkter ble utsatt for elektroforese på en 1 % agarose/TAE-gel og fotografert. Større mengder DNA ble observert fra utvalg på antistoffmål enn med gjenvunnede fra BSA-belagte rør, hvilket indikerer at funksjonelle scFv-RepA-DNA-komplekser ble utvalgt (Figur 10).

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et in vitro peptid ekspresjonsbibliotek omfattende et mangfold peptider, hvori hvert peptid er bundet til et DNA-konstrukt som koder for peptidet, omfattende trinnene: (a) å tilveiebringe et DNA-konstrukt omfattende: (i) en DNA-målsekvens; (ii) DNA som koder for et bibliotekelementpeptid; og (iii) DNA som koder for et peptid som er i stand til å binde seg ikke-kovalent direkte eller indirekte til nevnte DNA-målsekvens av (i); hvori nevnte DNA-konstrukt og kodet protein er valgt å ha cis-aktivitet, (b) å uttrykke et mangfold DNA-konstrukter ifølge (a) hvori nevnte DNA-konstrukter koder for et mangfold bibliotekelementpeptider slik at hvert uttrykte peptid er ikke-kovalent bundet til DNA-et fra hvilket det var produsert.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori nevnte DNA-konstrukt ytterligere omfatter: (iv) et DNA-element som styrer cis-aktivitet.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, hvori nevnte DNA-konstrukt av (a) ytterligere omfatter (v) DNA som koder for et fragment omfattende i det minste de C-terminale 20 aminosyrer til et repA-protein hvori nevnte fragment er i stand til å gjensidig påvirke nevnte DNA-element av (iv); hvori nevnte DNA-element av (iv) er plassert 3' for nevnte DNA av (ii), (iii) og (v).

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvori peptidet kodet av nevnte DNA av (iii) er i stand til å gjenkjenne og direkte binde nevnte DNA-målsekvens av (i).

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvori peptidet kodet av nevnte DNA av (iii) er et repA-protein og hvori nevnte DNA-målsekvens av (i) er ori.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, hvori nevnte DNA av (ii) blir bundet til nevnte DNA av (i) og (iii) ved restriksjonsenzym-spalting og ligering.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 3 til 6 hvori nevnte repA er selektert fra repA av de Incl-komplekse plasmidene og repA av IncF-, IncB-, IncK-, IncZ- og IncL/M-plasmider.

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 2 til 6, hvor nevnte DNA-konstrukt omfatter et DNA-element som angitt i krav 2, og nevnte DNA-element er valgt fra cis DNA-elementet av IncI kompleks-plasmidene og cis DNA-elementet fra IncF-, InkB-, IncK-, IncZ- og IncL/M-plasmider.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 5 hvori nevnte DNA-konstrukt omfatter sekvensen som koder for repA, cis-DNA-elementet og ori-DNA-et av IncFII-plasmidet RI.

10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvori nevnte repA-protein har sekvensen gitt i SEQ ID NO: 16 og hvori nevnte cis-DNA-element har sekvensen gitt i SEQ ID NO: 17.

11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav hvori DNA som ikke er bundet av peptidet kodet av nevnte DNA av (iii), er bundet av ikke-spesifikke DNA-bindingsprotein.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvori peptidet kodet av nevnte DNA av (iii) er et østrogen reseptor DNA-bindingsdomene og hvori nevnte DNA-målsekvens av (i) er en østrogen reseptor målsekvens.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 10, hvori nevnte DNA-bindingsdomene omfatter aminosyrer 176 til 282 av østrogen reseptor DNA-bindingsfragmentet og hvori nevnte DNA-målsekvens omfatter østrogenreseptor-målsekvensen gitt i SEQ ID NO: 14.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 eller 3, hvori peptidet kodet av nevnte DNA av (iii) indirekte binder nevnte DNA-målsekvens av (i) via en bifunksjonell gruppe, hvorav én del binder nevnte DNA-målsekvens av (i) og en andre del av hvilken binder peptidet kodet av nevnte DNA av (iii).

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvori nevnte DNA-målsekvens omfatter en DNA-markør som er i stand til å bindes av nevnte bifunksjonelle gruppe, hvor nevnte markør er valgfritt valgt fra biotin og fluorescein.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14 eller 15, hvori bindingsaktivitetene til nevnte bifunksjonelle gruppe blir tildelt ved hjelp av to antistoffer eller fragmenter derav.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvori ett eller begge av nevnte bindingsaktiviteter er tildelt ved hjelp av et Fab-fragment.

18. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 14 til 17, hvori nevnte bifunksjonelle gruppe blir tilveiebragt før trinn (b).

19. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvori nevnte bifunksjonelle gruppe blir bundet til nevnte DNA-målsekvens av (i) og er i stand til å binde til peptidet kodet av nevnte DNA av (iii).

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, hvori nevnte bifunksjonelle gruppe er en polymer.

21. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvori nevnte DNA står under kontroll av passende promoter- og translasjonssekvenser for å tillate in vitro transkripsjon og translasjon.

22. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvori nevnte bibliotekelementpeptid er et antistoff eller fragment derav.

23. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvori nevnte bibliotek omfatter i minst IO<4>molekyler.

24. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvori nevnte ekspresjon blir utført i nærvær av en forbindelse som forhindrer nukleaseaktivitet, eller reduserer ikke-spesifikke DNA-protein eller protein-protein-interaksjoner.

25. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, hvori nevnte ekspresjon blir utført i et koblet bakterietranskripsjons-/-translasjonsmiljø.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 25, hvori nevnte koblede bakterietranskripsjons-/translasjonsmiljø er S30-ekstraksjonssystemet.

27. Fremgangsmåte for fremstilling av et in vitro peptid ekspresjonsbibliotek omfattende et mangfold peptider, hvori hvert peptid er bundet til DNA-konstruksjonen som koder for peptidet, omfattende trinnene: (a) å tilveiebringe et DNA-konstrukt omfattende: (i) DNA som koder for et bibliotekelementpeptid; og (ii) DNA som koder for et peptid som er i stand til å binde til en bifunksjonell gruppe; hvori nevnte DNA-konstruksjon og kodede protein er valgt å ha cis-aktivitet; (b) å binde en bifunksjonell gruppe eller en DNA-markør som er i stand til å binde en bifunksjonell gruppe til nevnte DNA-konstrukt av (a), hvori nevnte bifunksjonelle gruppe er i stand til å binde til peptidet kodet av nevnte DNA av (ii); og (c) å uttrykke et mangfold DNA-konstrukter ifølge (b), hvori nevnte DNA-konstrukter koder for et mangfold bibliotekelementpeptider slik at hvert uttrykte peptid er bundet via nevnte bifunksjonelle gruppe til DNA-et fra hvilket det var fremstilt.

28. Fremgangsmåte for å identifisere og/eller rense et peptid som innehar ønskede egenskaper fra et in vitro peptidekspresjonsbibliotek fremstilt ifølge fremgangsmåten til ethvert av de foregående krav, omfattende i det minste trinnene (a) å screene nevnte bibliotek og (b) å selektere og isolere det relevante bibliotekelementet.

29. Fremgangsmåte for å identifisere et spesifikt ligandbindende peptid, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter i det minste trinnene (a) å screene et in vitro peptidekspresjonsbibliotek fremstilt ifølge fremgangsmåten til ethvert av kravene 1 til 27 med ligandmolekyler som er valgfritt bundet til et fast støttemateriale; (b) å velge ut og isolere et bibliotekselement bundet til nevnte ligandmolekyl; og (c) å isolere peptidet som binder spesifikt til nevnte ligandmolekyl.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 28 eller 29, hvori nevnte bibliotekelementpeptider er enzymer eller antistoffer eller fragmenter derav.

31. Fremgangsmåte for å identifisere og/eller rense et peptid som har evnen til å binde en spesifikk DNA-målsekvens omfattende i det minste trinnene: (a) å tilveiebringe et in vitro ekspresjonsbibliotek ifølge ethvert av kravene 1 til 27, hvori peptidet kodet av DNA-et av (iii) er et bibliotekselementpeptid med DNA-bindingsaktivitet og hvori nevnte DNA-målsekvens av (i) er målsekvensen av interesse; (b) å selektere og isolere et bibliotekselement hvori det kodede proteinet binder til nevnte målsekvens; og (c) å isolere peptidet som binder til nevnte målsekvens.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 31, hvori nevnte bibliotekelementpeptider er sinkfingerproteiner, helix-løkke-helix proteiner eller helix-vinding-helix proteiner.

33. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 28 til 32, hvori nevnte screening og/eller seleksjonstrinn blir utført i nærvær av en forbindelse som forhindrer nukleaseaktivitet eller reduserer ikke-spesifikk DNA-protein- eller protein-protein-interaksjoner.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33, hvori nevnte forbindelse er heparin.

35. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 28 til 34, hvori i tillegg DNAet som uttrykker nevnte isolerte peptid blir isolert.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 35, ytterligere omfattende å klone nevnte DNA i en ekspresjonsvektor.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 36, ytterligere omfattende å introdusere nevnte ekspresjonsvektor i en celle in vitro.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 36 eller 37 ytterligere omfattende å uttrykke peptidet kodet av nevnte DNA.

39. In vitro peptid-ekspresjonsbibliotek fremstilt ifølge fremgangsmåten til ethvert av kravene 1 til 27.

40. DNA-konstrukt som beskrevet i ethvert av kravene 1 til 27.