KR102099730B1 - 아스파르틸­trna 합성효소의 단백질 단편에 관련된 치료적, 진단적, 및 항체 조성물의 혁신적 발견 - Google Patents

Abstract

아미노아실-tRNA 신테타아제의 신규 확인된 단백질 단편, 그 단편 및 이의 보체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물, 관련 제제, 및 진단, 약물 발견, 연구, 및 치료 적용에 사용하기 위한 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

아스파르틸­TRNA 합성효소의 단백질 단편에 관련된 치료적, 진단적, 및 항체 조성물의 혁신적 발견{INNOVATIVE DISCOVERY OF THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, AND ANTIBODY COMPOSITIONS RELATED TO PROTEIN FRAGMENTS OF ASPARTYL-TRNA SYNTHETASES}

관련 출원에 대한 교차참조

본원은 가특허출원 번호 61/363,586 (2010년 7월 12일 출원); 가특허출원 번호 61/363,589 (2010년 7월 12일 출원); 및 가특허출원 번호 61/363,583 (2010년 7월 12일 출원)을 우선권으로 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 참고로 본원에 통합되어 있다.

서열 목록에 관한 진술

본 출원에 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신 텍스트 포맷으로 제공되며, 본 명세서 내에 참조로 도입된다. 서열 목록을 함유한 텍스트 파일의 명칭은 120161_432PC_Sequence_Listing.txt이다. 텍스트 파일은 약 123KB이며, 2011.07.08.자로 생성되었고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다.

본 발명은 일반적으로 아미노아실-tRNA 합성효소 및 다른 단백질의 새로 동정된 단백질 단편을 포함하는 조성물, 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보물, 관련 제제, 그리고 진단적, 약물 발견, 연구, 및 치료적 용도에서의 이들의 사용 방법에 관한 것이다.

40년이 넘도록 아미노아실-tRNA 합성효소(AARS)는 단백질 번역 절차 동안 유전 정보 해독의 일환으로서 tRNA 분자의 아미노아실화를 촉매하는 필수적인 살림 단백질로 여겨져 왔다. AARS는 이러한 측면에서 널리 연구되었으며, 이들의 여러 전장 서열이 서열 분석을 위해 그리고 생화학적 실험의 다양한 원천을 제공하기 위해 클로닝되었다. 그러나 AARS, 및 다른 단백질의 일부 단편은 단백질 번역을 넘어서는 경로를 조정하는 세포외 신호전달 활성을 포함하여, 아미노아실화에 연관되지 않은 예상하지 못한 활성을 보유한다. 일반적으로 이러한 예상하지 못한 활성은 전장 또는 부모 단백질 서열의 맥락에서는 관찰되지 않는다; 대신에 이들은 이들의 부모 서열로부터의 AARS 단백질 단편의 제거 또는 절제 후에, 또는 단편 AARS 서열을 발현시키고 충분히 정제한 후 신규한, 비-합성효소 관련 활성을 평가함으로써 관찰된다.

AARS의 전장 서열들은 어느 정도 공지되었으나, 이러한 AARS 단백질 단편, 또는 관련 또는 연관된 단백질로부터의 단백질 단편을 규명하기 위한, 또는 아미노산 합성의 맥락 외의 신규한 생물학적 활성에 대한 전장 AARS 단백질의 잠재적 역할을 평가하기 위한 체계적 실험 분석은 수행되지 않았다. 본 명세서의 일부에서는 이러한 AARS 단백질 단편, AARS 도메인, 또는 AARS 대안적 스플라이스 변이체를 "리섹틴"으로 부른다. 그 가장 넓은 맥락에서, "리섹틴"이라는 용어는 종종 다른 방식으로 그 신규한 생물학적 활성을 차단하는 그 천연 전장 또는 부모 단백질 서열의 맥락에서 (단백분해, 대안적 스플라이싱, 돌연변이화, 또는 재조합 유전 조작에 의해) 절단 또는 소화된 단백질의 일부를 나타낸다. 마찬가지로, 이러한 리섹틴들의 다양한 의학적 상태들의 치료에서의 생물학적 치료제, 진단제, 또는 약물 표적으로서의 용도 또는 이들의 인간 질환에 대한 잠재적 연관성을 탐색하기 위한 체계적 실험 분석은 수행되지 않았다. 생명에 필수적인 포유류에서의 공지된 기능을 갖는 필수적인 살림 유전자인 AARS는 포유류에서의 약물 표적으로 간주되지도 않았고, 또는 비-합성효소 활성을 갖는 리섹틴을 동정하기 위한 표준 게놈 서열분석, 바이오인포마틱, 또는 유사한 노력으로 분석되지도 않았다. 유사하게 표준 생화학 연구 노력도 주로 이들의 대응하는 전장 부모 AARS의 사전 이해된 역할로 인해, AARS 리섹틴의 생물학적 특성 및 이들의 잠재적인 치료적 및 진단적 상관성을 특징분석하려고 해오지 않았다.

발명의 간단한 요약

본 발명의 구현예는 일반적으로, 비-전형적 생물학적 활성, 예컨대 세포외 신호전달 활성, 및/또는 치료 및 진단 관련성의 다른 특성을 갖는 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS)의 단백질 단편의 발견에 관한 것이다. AARS는 모든 유기체에서 발견된 단백질 합성 기구의 보편적이고 필수적인 요소이지만, 인간 AARS 및 이의 연관 단백질은 인간의 정상 기능에 기여하는 유력한 세포 신호전달 활성을 갖는 천연 발생 절제된 변이체를 갖는다. 이들 단백질 단편의 활성은 AARS에 대해 통상 공지된 단백질 합성 활성과 구별되고, 본 발명은 신규 생물요법제, 신규 발견 연구 시약으로서, 및 광범위한 인간 질환, 예컨대 염증성, 혈액성, 신경퇴행성, 자가면역, 조혈, 심혈관, 및 대사 질환 또는 장애를 유력하게 치료 또는 진단하기 위해 사용될 수 있는 지향된 생물 및 진단 제제에 대한 신규 항원/표적으로서 이들 절제된 단백질의 발견 및 개발을 포함한다.

본 발명의 AARS 단백질 단편(들)은 "절제", 또는 대안적으로 "어펜다크린(appendacrine)"로 언급될 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, 용어 "절제"는 그이 비-전형적 활성을 전형적으로 마스킹하는 그의 전체길이 모 AARS 서열의 문맥으로부터 주어진 주어진 AARS 단백질 단편을 잘라내거나 절체하는 과정으로부터 유래된다. 어떤 예에서, 본 발명의 AARS 단백질 단편 및 폴리뉴클레오타이드는, 천연 발생 (예, 단백질분해, 스플라이스 변이체), 인공적으로 유도되거나 예측된 것이든 이러한 절제 과정의 발생을 통해 확인되었다. 용어 "어펜다크린"는 "덧붙인(append)" (라틴어 - 어펜더(appender)로부터)의 조합으로부터 "분리하는(separate)" 또는 "포착하는(discern)" (그리스어 - 크린(crine))"로부터 유래되고, 또한 그의 상응하는 전체길이 또는 모 AARS 서열로부터의 AARS 단백질 단편의 하나 이상의 덧붙인 도메인의 분리를 반영한다.

몇 개의 AARS 단편이 비-신테타아제 활성을 갖는 것으로 이전에 보여졌을지라도, 생물요법, 발견, 또는 진단 유용성에 대한 그와 같은 단편의 발현, 단리, 정제, 및 특성화는 제한적이고, 당해분야의 숙련가는 전체 패밀리의 AARS의 각각의 수, 또는 대안적인 단편과 어울리는 그와 같은 활성을 쉽게 인식하지 못했다. 여기서, 체계적인 접근은 생물요법 발견 및 진단 유용성을 위한 20 미토콘드리아 및 20 세포질 AARS (및 연관단백질)에 대한 AARS 단백질 단편을 발견하고 확인하기 위해 이용되었다. 예를 들면, 어떤 본 AARS 단백질 단편(들) 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 단백질분해 단편을 주로 동정하기 위해 질량 분광분석법 (MS)을 사용하여 생물학적 시료로부터 동정되었고, 다른 것은 스플라이스 변이체를 주로 동정하기 위해 딥(deep) 시퀀싱 기술에 의해 동정되었다. 다른 AARS 단백질 단편(들)은 주요 경계 (예, 프로테아제 부위)를 다라 인간 및 저급 유기체로부터 신테타아제를 컴퓨터로 비교하여 아미노산 서열의 인 실리코(in silico) 예측을 사용하여 동정되고 이러한 접근은 단백질분해 단편 및 기능적 도메인 프로세싱 비-전형적 생물학적 활성을 파악하기 위해 특이적 기준을 기반으로 한 전체길이 AARS의 서열 분석을 이용한다.

AARS의 신규 절제는 예상 밖이고, 그의 차등 발현도 예상 밖이다. 특이적 절제는 상이한 성장 단계 (예, 성인 뇌 대 태아뇌)에서 및 상이한 조직 유형 (예, 췌장 대 간)을 위해 상이한 처리 (예, 혈청 유무의 배지에서 성장된 세포로부터) 하에서 전형적으로 보여진다. 발현의 패턴은, 모든 아미노아실 tRNA 신테타아제의 전형적 기능이 동일한 세포 위치에서 그리고 상대적 비례 양으로 필요하다는 사실에도 불구하고, 모든 아미노아실 tRNA 신테타아제에 대해 동일하지 않다. 동시에 다른 아미노아실 tRNA 신테타아제 활성의 양의 증가 없이 증가시키기 위한 아미노아실 tRNA 신테타아제 활성의 수준을 예상하지 못했다. 질량 분광분석법 및 딥 시퀀싱 데이타는, 아미노아실 tRNA 신테타아제 절제가 수준 변화를 가지며, 상이한 부위에서 그리고 상이한 단계에서 일어난다는 것을 나타낸다.

또한, AARS 단백질 단편은 발현되고, 생물학적 특성을 파악하기 위해 충분히 높은 순도로 정제될 수 있다. 이전에, 단편은 종종, 비-신테타아제 활성의 적절한 생물학적 특성화를 가능하도록 충분한 순도, 폴딩 (folding), 및 안정성이 있는 것은 아니었다. 세포 기반 검정은, 예를 들면, 그의 중요한 생물요법, 발견 또는 진단 활성을 밝히기 위해 충분히 순수한, 안정한, 가용성 및 폴딩된 절제와 공동으로 사용된다.

특히, 본 발명의 구현예는 아스파르틸 tRNA 신테타아제의 단백질 단편, 생물요법, 발견, 또는 진단 유용성의 관련 제제 및 조성물, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은, 본 명세서에 기재된 바와 같이 다양한 진단, 약물 발견, 및 치료 적용에 유용하다. 바람직하게는, AARS 단백질 및 단편은 그와 같은 생물요법, 발견, 또는 진단 용도에 필요한 정도로 적합한 조건 하에서 정제 및 보관된다.

어떤 구현예는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 적어도 약 5 mg/ml의 용해도를 갖는 적어도 약 100, 90, 80, 70, 60, 50 또는 40개의 아미노산의 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편을 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 본 조성물은 단백질 기준으로 한 적어도 약 95%의 순도, 및 약 10 EU 미만 / mg 단백질 내독소를 갖는다. 일 측면에서, 상기 조성물은 치료 조성물이다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 실질적으로 무혈청이다. 일부 구현예에서, AARS 단백질 단편은 비-전형적 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-전형적 생물학적 활성은 세포외 신호전달의 조절, 세포 증식의 조절, 세포 분화의 조절, 유전자 전사의 조절, 사이토킨 생성 또는 활성의 조절, 사이토킨 수용체 활성의 조절, 및 염증의 조절로부터 선택된다. 일부 구현예에서, AARS 단백질 단편은 세포 기반의 비-전형적 생물학적 활성에 대해 약 1 nM, 약 5 nM, 약 10 nM, 약 50 nM, 약 100 nM 또는 약 200 nM 미만의 EC₅₀을 갖는다.

어떤 구현예에서, AARS 단백질 단편은 이종 폴리펩타이드에 융합된다. 일부 구현예에서, AARS 융합 단백질은 실질적으로 AARS 단백질 단편의 비-전형적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, AARS 융합 단백질은 AARS 단백질 단편의 비-전형적 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 AARS 단백질 단편의 N-말단에 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 AARS 단백질 단편의 C-말단에 부착된다. 어떤 이들 구현예의 일 측면에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 정제 태그, 에피토프 태그, 표적 서열, 신호 펩타이드, 막 전좌 서열, 및 PK 수식인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

어떤 구현예에서, 본 조성물은 AARS 단백질 단편을 적어도 약 10 mg/mL의 농도로 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 AARS 단백질 단편을 포함하고, 이 단편은 적어도 90% 단분산이다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은 약 3 % 미만의 고분자량 응집 단백질을 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은, 4℃에서 1주 동안 PBS에서 적어도 10 mg/ mL의 농도로 보관될 때, 3% 미만의 응집을 나타낸다. 어떤 구현예에서, 본 조성물은,실온에서 1주 동안 PBS에서 적어도 10 mg/ mL의 농도로 보관될 때, 3% 미만의 응집을 나타낸다.

그와 같은 절제 특징을 측정하기 위한 다양한 검정은 본 명세서에 기재되어 있고, 본 발명의 측면을 한정하기 위해 사용될 수 있다. 어떤 측면에서, 이들 특징은 본 명세서에 기재된 AARS 단백질 단편의 생물요법 유용성을 위해 바람직할 것이다.

어떤 구현예는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산의 치환, 결실, 및/또는 부가에 의해, 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 아미노산 서열과 상이한 적어도 22개의 아미노산의 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편을 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 변경된 단백질 단편은 실질적으로 비-변경된 단백질의 비-전형적 활성을 보유하거나, 비-전형적 활성과 관련하여 우세한 음성 표현형을 가지며, 여기서 상기 단백질 단편은 적어도 약 5 mg/ml의 용해도를 가지며, 여기서 본 조성물은 단백질 기준으로 한 적어도 약 95%의 순도및 약 10 EU 미만 / mg 단백질 내독소를 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 실질적으로 무혈청이다.

다른 구현예는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 AARS 단백질 단편에 대한 항체의 친화도는 상응하는 전체길이 AARS 폴리펩타이드에 대한 그의 친화도보다 약 10X 더 강하다. 본 발명의 놀라운 측면들 중의 하나는 항체 또는 다른 지정된 생물제제에 접근가능한 "신규" 표면을 가지고 있는 어떤 절제를 포함하고,, 반면에 전체길이 AARS는 이들 표면을 다른 서열 또는 인접 도메인으로 "숨기거나" 덮는다. 절제 과정은 또한, 이전 미확인된 생물학적 활성을 밝히기 위해 더 큰 수성 접근성을 만들 수 있다. 일부 구현예는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 본 항체는 AARS 단백질 단편에 대해 적어도 약 10 nM의 친화도, 및 상응하는 전체길이 AARS 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 100 nM의 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, the 항체는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9 중 어떤 것에 제시된 AARS 폴리펩타이드 고유 스플라이스 연결지점 내에 위치한 에피토프에, 또는 이러한 스플라이스 부위의 아미노산 서열 C-말단에 결합한다. 어떤 구현예에서, 본 항체는 AARS 단백질 단편의 비-전형적 활성에 반대로 작용한다. 그와 같은 길항제는 임의로 상응하는 모 또는전체길이 AARS에 결합할 수 있가.

다른 측면은 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 22개의 아미노산의 실질적으로 순수한 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편, 및 AARS 단백질 단편에 결합하는 결합 파트너를 포함하는 생물검정 시스템에 관한 것이다. 일 측면에서, 상기 결합 파트너는 세포 표면 수용체 단백질, 핵산, 지질막, 세포 조절 단백질, 효소, 및 전사인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 임의로, 그와 같은 수용체는 세포, 바람직하게는 드러난 절제의 생물학과 관련된 세포의 일부일 수 있다.

어떤 구현예는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 22개의 아미노산의 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편, 세포의 제작된 군집을 포함하는 세포 조성물을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 세포는 상기AARS 단백질 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 측면에서, 세포는 무혈청 배지에서 성장할 수 있다.

표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 50 또는 100개의 아미노산의 실질적으로 순수한 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편, 단백질 단편에 결합하는 세포표면 수용체 또는 이의 세포외 부분을 포함하는 세포, 및 약 2000 미만의 달톤의 분자, 또는 AARS 단백질 단편 및 세포외 수용체의 결합 또는 상호작용을 조절하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 검출 시스템이 또한 포함된다.

특정 구현예는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 22개의 아미노산의 실질적으로 순수한 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편, 및 AARS 단백질 단편에 결합하는 세포표면 수용체 또는 이의 세포외 부분을 포함하는 세포를 포함하는 진단 시스템을 포함하고, 여기서 상기 시스템 또는 세포는 세포표면 수용체 또는 그의 세포외 부분의 수준 또는 활성의 변화의 검출을 허용하는 인디케이터 분자를 포함한다.

어떤 구현예는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 22개의 아미노산의 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편, 적어도 하나의 세포가 상기 AARS 단백질 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포의 제작된 군집, 적어도 약 10 리터의 무혈청 세포 배지, 및 멸균 용기를 포함하는 세포 성장 디바이스를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물의 어떤 것을 위해 이용된 세포는, 임의로 항생제 및 인듀서와 함께, 무혈청 배지에서 성장할 수 있다.

일부 구현예는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 AARS 스플라이스 변이체의 고유 스플라이스 연결지점에 대항하여 표적이 된 서열을 포함하는 안티센스 또는 RNA 간섭 (RNAi) 제제에 관한 것이다.

표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 22개의 아미노산의 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편을 포함하는 치료 조성물이 또한 포함되며, 여기서 상기 단백질 단편은 결합 파트너에 특이적으로 결합하며, 적어도 약 5 mg/ml의 용해도를 가지며, 여기서 본 조성물은 단백질 기준으로 한 적어도 약 95%의 순도를 갖는다. 일부 측면에서, 본 조성물은 10 EU 미만의 내독소/mg 단백질을 가질 수 있다.

표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 적어도 22개의 아미노산의 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편을 포함하는 조성물이 또한 포함되며, 여기서 상기 단백질 단편은 적어도 약 5 mg/ml의 용해도를 가지며, 여기서 본 조성물은 단백질 기준으로 한 적어도 약 95%의 순도 및 10 EU 미만의 내독소/mg 단백질을 갖는다.어떤 이들 구현예에서, 본 조성물은 그의 겉보기 분자량에 대해 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 95% 단분산인 AARS 단백질 단편을 포함할 수 있다. 어떤 이들 구현예의 또 하나의 측면에서, 본 조성물은 (단백질 기준으로 한) 약 10 % 미만의 고분자량 응집 단백질, 또는 약 5% 미만의 고분자량 응집 단백질, 또는 약 4% 미만의 고분자량 응집 단백질, 또는 약 3% 미만 고분자량 응집 단백질, 또는 약 2% 미만의 고분자량 응집 단백질, 또는 약 1% 미만의 고분자량 응집 단백질을 포함할 수 있다.

어떤 이들 구현예의 또 하나의 측면에서, 본 조성물은, 4℃에서 1주 동안 PBS에서 적어도 10 mg/ mL의 농도로 보관될 때, 약 10% 미만 응집 또는 4℃에서 1주 동안 PBS에서 적어도 10 mg/ mL의 농도로 보관될 때, 약 5% 미만 응집 또는 4℃에서 1주 동안 PBS에서 적어도 10 mg/ mL의 농도로 보관될 때, 약 3% 미만 응집 또는 4℃에서 1주 동안 PBS에서 적어도 10 mg/ mL의 농도로 보관될 때, 약 2% 미만 응집 또는 4℃에서 1주 동안 PBS에서 적어도 10 mg/ mL의 농도로 보관될 때, 약 1 % 미만 응집을 나타낸다.

어떤 구현예는, 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 22개의 아미노산의 실질적으로 순수한 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편, 및 이에 공유 또는 비공유적으로 접합된 적어도 하나의 모이어티를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 모이어티는 검출가능 표지이다. 일부 구현예에서, 모이어티는 수용성 폴리머이다. 일부 구현예에서, 모이어티는 PEG이다. 어떤 이들 구현예의 일 측면에서, 모이어티는 단백질 단편의 N-말단에 부착된다. 어떤 이들 구현예의 일 측면에서, 모이어티는 단백질 단편의 C-말단에 부착된다.

특정 구현예는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 22개의 아미노산의 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편, 또는 생물학적 활성 단편 또는 그의 변이체에 접합된 고형 기질을 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 상기 단백질 단편은 적어도 약 5 mg/ml의 용해도를 가지며, 본 조성물은 단백질 기준으로 한 적어도 약 95%의 순도를 갖는다.

표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에서 제시된 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하는 조성물이 또한 포함되며, 여기서 결합제는 단백질 단편에 대해 적어도 약 1 nM의 친화도를 갖는다. 일 측면에서, 결합제는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9 중 어떤 것에 제시된 AARS 폴리펩타이드 고유 스플라이스 연결지점 내에 위치한 에피토프, 또는 이러한 스플라이스 부위의 아미노산 서열 C-말단에 결합한다. 일부 구현예에서, 결합제는 AARS 폴리펩타이드의 비-전형적 활성에 대해 반대로 작용한다.

어떤 구현예는 본 명세서에 기재된 바와 같은 AARS 단백질 단편의 아미노산 서열, 본 명세서에 기재된 바와 같은 AARS 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 아미노산 서열, 또는 변이체 또는 그의 단편을 포함하는 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 폴리펩타이드를 포함한다. 어떤 AARS 폴리펩타이드는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9, 또는 표 E2에서 개시된 바와 같은 AARS 참조 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 AARS 폴리펩타이드는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9, 또는 표 E2에서 개시된 바와 같은 AARS 참조 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진다. 어떤 구현예에서, 폴리펩타이드는 비-전형적 생물학적 활성을 포함한다. 특정 구현예에서, 비-전형적 생물학적 활성은 세포 신호전달 (예, 세포외 신호전달)의 조절, 세포 증식의 조절, 세포 이동의 조절, 세포 분화의 조절, 아폽토시스 또는 세포사의 조절, 신생혈관형성의 조절, 세포 결합의 조절, 세포 대사의 조절, 세포 섭취의 조절, 유전자 전사, 또는 분비의 조절, 사이토킨 생성 또는 활성의 조절, 사이토킨 수용체 활성의 조절, 및 염증의 조절로부터 선택된다.

다른 측면은 본 명세서에 기재된 바와 같은 단리된 AARS 폴리펩타이드, AARS 폴리펩타이드의 결합 파트너, 또는 이 둘 모두의 복합체에 대해 결합 특이성을 나타내는 항체 및 다른 결합제를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합제의 친화도는 AARS 폴리펩타이드는 상응하는 전체길이 AARS 폴리펩타이드에 대한 그의 친화도보다 약 10X 더 강하다. 특정 구현예에서, 결합제는 펩타이드, 펩타이드 모방체, 아드넥신, 압타머, 및 소분자로부터 선택된다. 어떤 구현예에서, 본 항체는 또는 결합제는 AARS 폴리펩타이드의 비-전형적 활성에 대해 반대로 작용한다. 다른 구현예에서, 본 항체는 또는 결합제는 AARS 폴리펩타이드의 비-전형적 활성에 작용한다.

어떤 구현예는 본 명세서에 기재된 바와 같은 AARS 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열, 본 명세서에 기재된 바와 같은 AARS 단백질 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 그의 변이체, 단편, 또는 보체를 포함하는 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 어떤 AARS 폴리뉴클레오타이드는, 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9, 또는 표 E2에서 개시된 바와 같이 AARS 참조 폴리뉴클레오타이드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열, 또는 그의 보체를 포함한다. 일부 구현예에서,뉴클레오타이드 서열은 박테리아 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 일 측면에서, 뉴클레오타이드 서열은 표 E2에서 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 80% 동일하다.

특이적 AARS 폴리뉴클레오타이드는, 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9, 또는 표 E2에서 개시된 바와 같이, AARS 참조 폴리뉴클레오타이드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열, 또는 그의 보체로 본질적으로 이루어진다. 다른 AARS 폴리뉴클레오타이드는, 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9, 또는 표 E2에서 개시된 바와 같이 AARS 참조 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그것으로 본질적으로 이루어진다. 어떤 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라이머, 프로브, 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특이적 또는 고유 스플라이스 연결지점, 및/또는 AARS 폴리뉴클레오타이드 내의 이 스플라이스 부위의 서열 3'로 표적화된다.

어떤 구현예는 시료에서 AARS 단백질 단편의 존재 또는 수준을 측정하는 방법을 포함하고, 상기 방법은, 상기 시료를, 본 명세서에 기재된 바와 같은 AARS 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제를 접촉시키는 단계, 상기 결합제의 존재 또는 부재를 검출하는 단계, 및 이로써 상기 AARS 단백질 단편의 존재 또는 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 다른 구현예는 시료에서 AARS 단백질 단편의 존재 또는 수준을 측정하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 상기 시료를, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 단편을 특이적으로 확인할 수 있는 검출기로 분석하는 단계, 및 이로써 상기 AARS 단백질 단편의 존재 또는 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 검출기는 질량 분광측정기 (MS), 유세포측정기, 단백질 영상화 장치, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 또는 단백질 마이크로어레이이다. 어떤 구현예는 AARS 단백질 단편의 존재 또는 수준을 대조군 시료 또는 예정된 값과 비교하는 것을 포함한다. 어떤 구현예는 대조군으로부터 구별하기 위해 시료의 상태를 특성화하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 시료 및 대조군은 세포 또는 조직을 포함하고, 상기 방법은 상이한 종의 세포 또는 조직, 상이한 조직 또는 기관의 세포, 상이한 세포 발달 상태에 있는 세포, 상이한 세포 분화 상태에 있는 세포, 상이한 생리학적 상태에 있는 세포, 또는 건강한 및 질환있는 세포 사이를 구별하는 것을 포함한다. 예를 들면, 선택된 절제는 스트레스 또는 상해와 같은 조건 하에서 더 풍부할 수 있다.

어떤 구현예는 본 명세서에 기재된 바와 같은아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 폴리펩타이드, 또는 하나 이상의 그의 세포 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 화합물을 확인하기 위한 방법, 및 조성물을 발견하는 것을 포함하고, 상기 방법은, a) 적당한 조건 하에서 AARS 폴리펩타이드 또는 이의 세포 결합 파트너 또는 이들 모두을 적어도 하나의 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 및 b) AARS 폴리펩타이드 또는 이의 세포 결합 파트너 또는 이들 모두의 시험 화합물에의 결합을 탐지하는 단계, 이로써 AARS 폴리펩타이드 또는 이의 세포 결합 파트너 또는 이들 모두에 특이적으로 결합하는 화합물을 확인하는 단계를 포함한다. 어떤 구현예에서, 시험 화합물은 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 펩타이드 모방체, 또는 소분자이다. 어떤 구현예에서, 시험 화합물은 AARS 폴리펩타이드 또는 이의 세포 결합 파트너의 비-전형적 생물학적 활성에 작용한다. 다른 구현예에서, 시험 화합물은 AARS 폴리펩타이드 또는 이의 세포 결합 파트너의 비-전형적 생물학적 활성에 반대로 작용한다. 어떤 구현예는 상기 방법에 의한 확인된 화합물, 예컨대 작용제 (예, 소분자, 펩타이드)를 포함한다.

어떤 구현예는 시료에서 AARS 스플라이스 변이체의 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재 또는 수준을 측정하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 상기 시료를, 본 명세서에 기재된 바와 같은 AARS 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 하이브리드화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계, 시료에서 상기 올리고뉴클레오타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 단계, 및 이로써 상기 AARS 스플라이스 변이체의 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재 또는 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 다른 구현예는 시료에서 AARS 스플라이스 변이체의 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재 또는 수준을 측정하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 상기 시료를, 본 명세서에 기재된 바와 같은 AARS 폴리뉴클레오타이드를 특이적으로 증폭시키는 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계, 증폭 반응을 수행하는 단계, 증폭된 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계, 및 이로써 AARS 스플라이스 변이체의 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재 또는 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드(들)은 AARS 스플라이스 변이체에 대해 고유한 스플라이스 연결지점에 특이적으로 하이브리드화하거나 그 것을 특이적으로 증폭시킨다. 어떤 구현예는 AARS 단백질 단편의 존재 또는 수준 또는 스플라이스 변이체를 대조군 시료 또는 예정된 값과 비교하는 것을 포함한다. 어떤 구현예는 대조군으로부터 그 것을 구별하기 위해 시료의 상태를 특성화하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 시료 및 대조군은 세포 또는 조직을 포함하고, 상기 방법은 상이한 종의 세포 또는 조직, 상이한 조직 또는 기관의 세포, 상이한 세포 발달 상태에 있는 세포, 상이한 세포 분화 상태에 있는 세포, 또는 건강한 및 질환있는 세포 사이를 구별하는 것을 포함한다.

일부 구현예는, 본 명세서에 기재된 AARS 폴리뉴클레오타이드, 본 명세서에 기재된 AARS 폴리펩타이드, 본 명세서에 기재된 바와 같은 결합제, 또는 상기 방법에 의해 확인되거나 본 명세서에 기재된 화합물, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.

어떤 구현예는 세포의 세포 활성을 조절하는 방법을 포함하고, 상기 방법은, 상기 세포를, 본 명세서에 기재된 AARS 폴리뉴클레오타이드, 본 명세서에 기재된 AARS 폴리펩타이드, 본 명세서에 기재된 결합제, 상기의 또는 본 명세서에 기재된 화합물, 또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 활성은 세포 증식, 세포 이동, 세포 분화, 아폽토시스 또는 세포사, 세포 신호전달, 신생혈관형성, 세포 결합, 세포 섭취, 세포 분비, 대사, 사이토킨 생성 또는 활성, 사이토킨 수용체 활성, 유전자 전사, 및 염증으로부터 선택된다. 일 측면에서, 세포는 전-지방세포, 골수, 호중구, 혈액 세포, 간세포, 성상세포, 간엽 줄기 세포, 및 골격근 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

어떤 구현예에서, 세포는 대상체 내에 있다. 어떤 구현예는 상기 대상체를 치료하는 것을 포함하고, 여기서 상기 대상체는 신생물성 질환과 연관된 병태, 면역계 질환 또는 병태, 감염성 질환, 대사 질환, 염증성 장애, 신경/신경학적 질환, 근육/심혈관 질환, 비정상 조혈과 연관된 질환, 비정상 신생혈관형성과 연관된 질환, 또는 비정상 세포 생존과 연관된 질환을 갖는다.

하기를 포함하는 약제학적 화합물의 제조 방법이 또한 포함된다: a) 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9 중 어떤 것에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 적어도 22개의 아미노산의 AARS 단백질 단편의 존재에서 하나 이상의 후보 화합물의 시험관내 스크린을 수행하는, AARS 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 화합물을 확인하는 단계 b) 단계 a)에서 확인된 화합물을 세포 기반 검정을 수행하여, 하나 이상의 AARS 단백질 단편의 비-전형적 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 단계 c) 임의로, 단계 b)에서 확인된 화합물의 구조-활성 관계 (SAR)를 평가하여, 그의 구조를 비-전형적 활성의 조절 연관시키고, 임의로, 비-전형적 활성을 조절하는 그의 능력을 변경하기 위해 화합물을 유도체화하는 단계 및 d) 인간에서 사용하기 위해, 단계 b)에서 확인된 충분한 양의 화합물, 또는 단계c)의 상기 유도체화된 화합물을 생산하고, 이로써 약제학적 화합물을 제조하는 단계.

다른 구현예는 하기를 포함하는 약제학적 화합물의 제조 방법을 포함한다: a) 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9 중 어떤 것의AARS 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 세포 표면 수용체 또는 이의 세포외 부분의 존재에서 하나 이상의 후보 화합물의 시험관내 스크린을 수행하여, 세포 표면 수용체 또는 이의 세포외 부분에 특이적으로 결합하는 화합물을 확인하는 단계 b) 단계 a)에서 확인된 화합물로 세포 기반 검정을 수행하여, 하나 이상의 AARS 단백질 단편의 비-전형적 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 단계 c) 임의로, 단계 b)에서 확인된 화합물의 구조-활성 관계 (SAR)를 평가하여, 그의 구조를 비-전형적 활성의 조절 연관시키고, 임의로, 비-전형적 활성을 조절하는 그의 능력을 변경하기 위해 화합물을 유도체화하는 단계 및 d) 인간에서 사용하기 위해, 단계 b)에서 확인된 충분한 양의 화합물, 또는 단계c)의 상기 유도체화된 화합물을 생산하고, 이로써 약제학적 화합물을 제조하는 단계.

일부 구현예는 세포의 제작된 군집을 포함하는 세포 조성물을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 세포는 이종 전체길이 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 세포는 무혈청 배지에서 성장할 수 있다. 일 측면에서, 전체길이 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질은 AARS 단백질 단편의 정제를 촉진하기 위해 이종 정제 또는 에피토프 태그를 포함한다. 또 하나의 측면에서, 전체길이 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질은, 이종 단백질분해 부위가 절단시 AARS 단백질 단편을 생산하도록 하는 것을 포함한다.

일부 구현예는 세포내 원위치에서 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9, 또는 표 E2에서 제시된 AARS 폴리펩타이드를 생상하는 방법을 포함하고, 상기 방법은, i) 세포 내에서 이종 전체길이 아스파르틸 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질를 발현시키는 단계를 포함하고, 상기 세포는 AARS 폴리펩타이드를 생산하도록 이종 전체길이 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질을 절단할 수 있는 프로테아제를 포함한다.

일부 구현예는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9, 또는 표 E2에서 제시된 AARS 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 단리된 전체길이 아스파르틸 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질을, 전체길이 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질을 절단할 수 있는 프로테아제와 접촉시키는 단계, 및 AARS 폴리펩타이드를 생산하는 단계를 포함한다.

일부 구현예는, 이종 단백질분해 부위가 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9 또는 표 E2 중 어떤 것에서 제시된 AARS 단백질 단편의 단백질분해 발생을 가능하게 하는 것을 포함하는, 제작된 전체길이 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 단백질을 포함한다.

일부 구현예는 단리된 전체길이 아미노아실-tRNA 신테타아제 단백질을 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 상기 조성물은 단백질 기준으로 한 적어도 약 95%의 순도, 약 10 EU 미만 내독소/mg 단백질을 가지며, 실질적으로 무혈청이다. 일 측면에서, 전체길이 아미노아실-tRNA 신테타아제 단백질은 적어도 10 mg / mL의 농도로 존재하고, 적어도90% 단분산이다.

추가 구현예는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9, 또는 표 E2 중 어떤 것에서 제시된 바와 같아, AARS 단백질 단편, 또는 ARRS 단백질 단편을 인코딩하는 핵산의 투여를 통해 tRNA 신테타아제의 발현, 활성 또는 시공 위치의 조절 장애에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 이 구현예의 일 측면에서, 질환은 암, 신경병증, 당뇨병, 및 염증성 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

발명의 상세한 설명

목차

I. 개관 15

II. 정의 16

III. 정제된 AARS 단백질 단편 및 변이체 29

IV. AARS 폴리뉴클레오타이드 61

V. 항체 74

VI. 항체 대체물 및 다른 결합제 79

VII. 생체검정 및 분석 검정 84

VIII. 발현 및 정제 시스템 86

IX. 진단 방법 및 조성물 99

X. 안티센스 및 RNAI 제제 115

A. 안티센스 제제 116

B. RNA 간섭 제제 125

XI. 약물 발견 132

XII. 사용 방법 141

XIII. 약제학적 제형, 투여 및 키트 145

XIV. 실시예 154

I. 개요

본 발명은 적어도 부분적으로는 천연 생성 전장 아스파르틸 tRNA 합성효소 유전자에 비해 현저히 상이한 특징을 나타내는 신규한 형태로의 천연 야생형 단백질의 형질 전환을 나타내는 신규한 AARS 폴리펩티드의 발견 및 이들의 제조 및 사용 방법에 대한 것이다. 이러한 AARS 폴리펩티드는 신규한 생물학적 활성, 및 바람직한 치료적 약물 특징을 나타내는 안정한 가용성 단백질 도메인을 나타내는 단백질 서열을 동정하기 위해 상이한 조직에서 발현되는 아스파르틸 tRNA 합성효소의 광범위한 서열, 및 질량 분광측정 분석, 이어서 체계적 제조 및 각각의 잠재적 AARS 폴리펩티드의 평가에 근거하여 동정되었다.

상기 분석에 근거하여, 아스파르틸 tRNA 합성효소에서 유도되는 AARS 폴리펩티드의 7개 이상의 신규 패밀리가 동정되었다.

하나의 측면에서, AARS 폴리펩티드에서 유도되는 이러한 아스파르틸 RNA 합성효소는 아스파르틸 tRNA 합성효소의 아미노산 1-274를 대략 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.

두번째 측면에서, AARS 폴리펩티드에서 유도되는 이러한 아스파르틸 tRNA 합성효소는 아스파르틸 tRNA 합성효소의 대안적으로 스플라이스된 아미노산 i) 1-41 + 73-50, ii) 1-141 + 189-501, 또는 iii) 1-319 + 369-501을 대략 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.

세번째 측면에서, AARS 폴리펩티드에서 유도되는 이러한 아스파르틸 tRNA 합성효소는 아스파르틸 tRNA 합성효소의 아미노산 1-22 + 대안적으로 스플라이스된 63 아미노산 융합 단백질을 대략 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.

네번째 측면에서, AARS 폴리펩티드에서 유도되는 이러한 아스파르틸 tRNA 합성효소는 아스파르틸 tRNA 합성효소의 아미노산 297-501을 대략 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.

다섯번째 측면에서, AARS 폴리펩티드에서 유도되는 이러한 아스파르틸 tRNA 합성효소는 아스파르틸 tRNA 합성효소의 아미노산 101-501을 대략 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.

여섯번째 측면에서, AARS 폴리펩티드에서 유도되는 이러한 아스파르틸 tRNA 합성효소는 아스파르틸 tRNA 합성효소의 아미노산 38-292를 대략 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.

일곱번째 측면에서, AARS 폴리펩티드에서 유도되는 이러한 아스파르틸 tRNA 합성효소는 아스파르틸 tRNA 합성효소의 아미노산 23-154를 대략 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.

이러한 신규한 AARS 폴리펩티드 패밀리는 특히 i) 신규한 생물학적 활성, ii) 바람직한 단백질 안정성 및 응집 특징, 및 iii) 온전한 야생형 단백질에서 발견되지 않는 상당히 상이한 특징인 원핵세포 발현계에서 고수준으로 발현 및 제조되는 능력을 나타내는 이전에는 공지되지 않은 신규한 단백질 산물을 나타낸다.

II . 정의

다른 방식으로는 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재되는 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 평가에 이용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료가 기재된다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어를 아래에 정의한다.

"한" 및 "하나"라는 조사는 본원에서 물품의 문법적 대상체의 하나 또는 둘 이상(즉 하나 이상)을 나타낸다. 예로서, "요소"란 하나의 요소 또는 둘 이상의 요소를 의미한다.

"약"이란 참조한 함량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 만큼 변하는 함량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

"작동제"란 활성, 예를 들어 AARS, 또는 다른 단백질의 비-정규적 생물학적 활성을 강화 또는 모사하는 분자를 나타낸다. 작동제는 AARS 또는 그 결합 파트너와 직접 상호반응하거나 AARS가 참여하는 생물학적 경로의 성분 상에 작용함으로써 AARS의 활성을 조정하는 단백질, 핵산, 탄수화물, 소분자, 또는 임의의 다른 화합물 또는 조성물을 포함할 수 있다. 부분 및 전체 작동제가 포함된다.

본원에서 사용되는 "아미노산"이라는 용어는 천연 생성 및 비-천연 생성 아미노산뿐만 아니라 아미노산 유사체 및 모사체를 의미하려는 것이다. 천연 생성 아미노산은 단백질 생합성 동안 이용되는 20개(L)-아미노산뿐만 아니라 다른 것들, 예컨대 4-히드록시프롤린, 히드록시라이신, 데스모신, 이소데스모신, 호모시스테인, 시트룰린 및 오르니틴을 포함한다. 비-천연 생성 아미노산은, 예를 들어 당분야의 숙련자에게 공지된 (D)-아미노산, 노르류신, 노르발린, p-플루오로페닐알라닌, 에티오닌 등을 포함한다. 아미노산 유사체는 천연 및 비-천연 생성 아미노산의 개질된 형태를 포함한다. 이러한 개질은, 예를 들어 아미노산의 화학기 및 부분의 치환 또는 대체 또는 아미노산의 유도체화에 의한 것을 포함할 수 있다. 아미노산 모사체는, 예를 들어 기능적으로 유사한 특성, 예컨대 참조 아미노산의 전하 및 전하 공간배치 특징을 나타내는 유기 구조물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아르기닌(Arg 또는 R)을 모사하는 유기 구조물은 유사한 분자 공간에 배치된 양 전하 부분 및 천연 생성 Arg 아미노산의 측쇄의 e-아미노기와 같은 정도의 이동성을 가질 것이다. 모사체는 또한 아미노산 또는 아미노산 작용기의 최적 공간배치 및 전하 상호반응을 유지하기 위해 제약된 구조를 포함한다. 당분야 숙련자는 어느 구조가 기능적으로 균등한 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 구성하는지를 알거나 결정할 수 있다.

특정 구현예에서, 비-천연 아미노산의 사용을 이용하여 AARS 단백질 단편의 선택된 비-정규적 활성을 개질하거나(예로 증가시키거나) 단백질의 생체 내 또는 시험관 내 반감기를 변경시킬 수 있다. 또한 비-천연 아미노산을 사용하여 AARS 단백질의 (선택적인) 화학적 개질(예로, peg화)을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 특정 비-천연 아미노산은 주어진 단백질에 대한 중합체, 예컨대 PEG의 선택적인 부착을 허용함으로써 이들의 약동학적 특성을 개선한다.

아미노산 유사체 및 모사체의 구체예는, 예를 들어 [Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross and Meinhofer, Vol. 5, p. 341, Academic Press, Inc., 새로운 York, N.Y. (1983)]에 기재된 것들에서 찾아볼 수 있으며, 그 전체 판이 본원에 참조로 도입된다. 다른 예에는 퍼알킬화 아미노산, 특히 퍼메틸화 아미노산이 포함된다. 예를 들어 [Combinatorial Chemistry, Eds. Wilson and Czarnik, Ch. 11, p. 235, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1997)]가 참고되며, 그 전체 책이 본원에 참조로 도입된다. 또 다른 예에는 그 아미드부(및 이에 따라 생성 펩티드의 아미드 골격)가, 예를 들어 당 고리, 스테로이드, 벤조디아제핀 또는 카보사이클로 대체된 아미노산이 포함된다. 예를 들어, [Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, Ed. Manfred E. Wolff, Ch. 15, pp. 619-620, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1995)]가 참고되며, 그 전체 책이 본원에 참조로 도입된다. 펩티드, 폴리펩티드, 펩티도모사체 및 단백질의 합성 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, [U.S. 특허 번호 5,420,109; M. Bodanzsky, Principles of Peptide Synthesis (1st ed. & 2d rev. ed.), Springer-Verlag, New York, N.Y. (1984 & 1993), Chapter 7 참고; Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (2d ed.), Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)]가 참고되며, 그 각각이 본원에 참조로 도입된다). 따라서 본 발명의 AARS 폴리펩티드는 천연 생성 및 비-천연 생성 아미노산뿐만 아니라 아미노산 유사체 및 모사체로 이루어질 수 있다.

"길항제"라는 용어는 활성, 예를 들어 AARS, 또는 다른 단백질의 비-정규적 생물학적 활성을 감소 또는 약화시키는 분자를 나타낸다. 길항제는 AARS가 참여하는 생물학적 경로의 성분 상에 작용하거나 AARS 또는 그 결합 파트너와 직접 상호반응함으로써 AARS 또는 그 결합 파트너의 활성을 조정하는 단백질, 예컨대 항체, 핵산, 탄수화물, 소분자, 또는 임의의 다른 화합물 또는 조성물을 포함할 수 있다. 부분 및 전체 길항제가 포함된다.

"아미노아실-tRNA 합성효소(AARS)"라는 용어는 일반적으로 이들의 천연 또는 야생형 형태로 그 전체 상용성 인지체 tRNA 중 하나에 대한 특정 아미노산 또는 그 전구체의 에스테르화를 촉매하여 아미노아실-tRNA를 형성할 수 있는 효소를 나타낸다. 이러한 "정규적" 활성에서, 아미노아실-tRNA 합성효소는 2단계 반응을 촉매한다: 먼저, 이들은 아미노산의 카르복실이 피로포스페이트를 변위함으로써 ATP의 알파-포스페이트에 연결되는 아미노아실-아데닐레이트를 형성함으로써 이들의 대응 아미노산을 활성화한 후 정확한 tRNA가 결합하면 아미노아실-아데닐레이트의 아미노아실기가 tRNA의 2' 또는 3' 말단 OH로 전달된다.

I형 아미노아실-tRNA 합성효소는 보통 2개의 고도로 보존된 서열 모티브를 갖는다. 이러한 효소는 아데노신 뉴클레오티드의 2'-OH에서 아미노아실화를 일으키며, 통상 단량체성 또는 이량체성이다. II형 아미노아실-tRNA 합성효소는 보통 3개의 고도로 보존된 서열 모티브를 갖는다. 이들 효소는 동일한 아데노신의 3'-OH에서 아미노아실화를 일으키며, 통상 이량체성 또는 사량체성이다. II형 효소의 활성 부위는 주로 α-나선이 인접한 7개 가닥의 반-평형 β-시트로 이루어진다. 페닐알라닌-tRNA 합성효소는 II형이지만, 2'-OH에서 아미노아실화를 일으킨다.

AARS 폴리펩티드는 미토콘드리아형 및 세포질형 원천의 티로실-tRNA 합성효소(TyrRS), 트립토파닐-tRNA 합성효소(TrpRS), 글루타미닐-tRNA 합성효소(GlnRS), 글리실-tRNA 합성효소(GlyRS), 히스티딜-tRNA 합성효소(HisRS), 세릴-tRNA 합성효소(SerRS), 페닐알라닐-tRNA 합성효소(PheRS), 알라닐-tRNA 합성효소(AlaRS), 아스파라기닐-tRNA 합성효소(AsnRS), 아스파르틸-tRNA 합성효소(AspRS), 시스테이닐-tRNA 합성효소(CysRS), 글루타밀-tRNA 합성효소(GluRS), 프롤릴-tRNA 합성효소(ProRS), 아르기닐-tRNA 합성효소(ArgRS), 이소류실-tRNA 합성효소(IleRS), 류실-tRNA 합성효소(LeuRS), 라이실-tRNA 합성효소(LysRS), 트레오닐-tRNA 합성효소(ThrRS), 메티오닐-tRNA 합성효소(MetRS), 또는 발릴-tRNA 합성효소(ValRS)를 포함한다. 이들 AARS 폴리펩티드의 야생형 또는 부모 서열은 당분야에 공지되어 있다.

"코딩 서열"이란 유전자의 폴리펩티드 산물의 코딩에 기여하는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 대조적으로 "비코딩 서열"이라는 용어는 유전자의 폴리펩티드 산물의 코딩에 기여하지 않는 임의의 핵산 서열을 나타낸다.

본 명세서에 걸쳐서 문맥 상 달리 요구하지 않는 한, "포함한다", "포함하는" 및 "포함된"이라는 단어는 언급된 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군을 포함하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군을 배제하지 않음을 시사하는 것으로 이해될 것이다.

"구성된"이란 "구성된"이라는 어구가 뒤따르는 것이 무엇이든 포함하며 이에 제한된 것을 의미한다. 따라서 "구성된"이라는 어구는 열거된 요소가 필요하거나 의무적이며, 다른 요소는 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다. "본질적으로 구성된"이란 이 어구에 뒤따라 열거된 임의의 요소를 포함하며, 열거된 요소에 대해 개시물에서 특정된 활성 또는 작용에 기여하거나 방해하지 않는 다른 요소에 제한된다는 것을 의미한다. 따라서 "본질적으로 구성된"이라는 어구는 열거된 요소가 필요하거나 의무적이지만, 다른 요소는 선택적이며, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 상당히 영향을 미치는지 여부에 따라 존재하거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.

"내독소가 없는" 또는 "실질적으로 내독소가 없는"이라는 언급은 일반적으로 미량 함량(예로 대상체에 임상적으로 해로운 생리학적 효과를 갖지 않는 양) 이하의 내독소, 바람직하게는 검출할 수 없는 양의 내독소를 함유하는 조성물, 용매, 및/또는 용기에 관한 것이다. 내독소는 특정 박테리아, 보통 그람-음성 박테리아에 연관된 독소이지만, 내독소는 그람-양성 박테리아, 예컨대 리스테리아 모노사이토겐스(Listeria monocytogenes)에서도 발견될 수 있다. 가장 유행하는 내독소는 다양한 그람-음성 박테리아의 외막에서 발견되고 이들 박테리아의 질환을 일으키는 능력에서 중추적인 병원성 특징을 나타내는 지질다당질(LPS) 또는 지질올리고당질(LOS)이다. 인간에서 소량의 내독소는 다른 해로운 생리학적 효과 중에서 발열, 혈압 저하, 및 염증과 응고 활성화를 일으킬 수 있다.

따라서, AARS 폴리펩티드의 약학적 제조에서는 소량일지라도 인간에게 해로운 효과를 일으킬 수 있기 때문에 약물 제품 및/또는 약물 용기로부터 대부분 또는 모든 미량 내독소를 제거하는 것이 바람직하다. 발열원 제거 오븐을 상기 목적을 위해 이용할 수 있으며, 보통 대부분의 내독소를 분해하는 데에는 300℃ 만큼의 높은 온도가 필요하다. 예를 들어, 일차 포장재, 예컨대 시린지 또는 바이알에 따라, 유리 온도 250℃ 및 유지 시간 30분의 조합이 종종 내독소 수준을 3 로그 감소시키는데 충분하다. 예를 들어, 당분야에 공지되고 본원에 기재된 바와 같은 크로마토그래피 및 여과 방법을 포함하는 내독소를 제거하는 다른 방법이 포함된다. 또한 본 발명의 조성물에 존재하는 내독소의 위험성이 제거되지 않았다면 이를 감소시키기 위해 AARS 폴리펩티드를 진핵 세포, 예컨대 포유류 세포에서 단리하는 방법이 포함된다. AARS 폴리펩티드를 무혈청 세포에서 제조하고 단리하는 방법이 바람직하다. AARS 폴리펩티드를 포함하는 이러한 조성물은 AARS 폴리펩티드에 결합하여 신규한 생물학적 특성을 변형시킬 잠재성을 갖는 혈청 또는 내독소로 오염된 AARS 폴리펩티드 조성물에서는 발견되지 않는 신규하고 새로운 생물학적 및 치료적 특징을 나타내는 새로운 제형물을 제공한다.

내독소는 당분야에 공지된 일상적 기법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 투구게의 혈액을 이용하는 투구게 용해액(LAL) 분석은 내독소의 존재 검출을 위해 매우 감도 높은 분석이며, 상기 분석에 근거한 내독소의 검출을 위한 시약, 키트 및 장비는, 예를 들어 Lonza Group에서 시판된다. 상기 평가에서, 매우 낮은 수준의 LPS는 상기 반응을 증폭시키는 강력한 효소적 연쇄반응으로 인해 투구게 용해액의 검출 가능한 응고를 야기할 수 있다. 내독소는 또한 효소-연관 면역흡착 분석(ELISA)으로 정량할 수 있다. 실질적으로 내독소가 없기 위해, 내독소 수준은 약 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.08, 0.09, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10EU/단백질mg 미만일 수 있다. 보통 1ng의 지질다당질(LPS)은 약 1-10EU에 해당한다.

특정 구현예에서, 조성물 중 임의의 주어진 제제(예로, AARS 단백질 단편)의 "순도"는 구체적으로 정의될 수 있다. 예를 들어, 특정 조성물은, 비제한적으로 예를 들어 화합물을 분리, 동정 및 정량하기 위해 생화학 및 분석 화학에서 빈번하게 이용되는 널리 공지된 형태의 컬럼 크로마토그래피인 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정하여 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%(그 사이의 모든 소수 포함) 순수한 제제를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "기능" 및 "기능적" 등의 용어는 생물학적, 효소적, 또는 치료적 기능을 나타낸다.

"유전자"란 염색체 상에서 특정 유전자위를 점유하고 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 코딩 영역 및/또는 비-번역 서열(즉, 인트론, 5' 및 3' 미번역 서열)로 구성된 유전 단위를 의미한다.

"상동성"이란 동일하거나 보존적 치환을 이루는 아미노산의 %수를 나타낸다. 상동성은 본원에 참조로 도입되는 서열 비교 프로그램, 예컨대 GAP(Deveraux 등, 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395)을 이용하여 결정될 수 있다. 이러한 방식으로 본원에 언급된 것들과 유사하거나 실질적으로 상이한 길이의 서열이 정렬 내 갭의 삽입으로 비교될 수 있으며, 이러한 갭은, 예를 들어 GAP에 의해 이용되는 비교 알고리즘에 의해 결정된다.

"숙주 세포"라는 용어는 본 발명의 임의의 재조합 벡터(들), 단리된 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리펩티드의 수여체이거나 이것이 될 수 있는 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적인, 우연한, 또는 의도적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 원래 부모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있다(형태 또는 전체 DNA 상보성에 있어서). 숙주 세포는 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 생체 내 또는 시험관 내 전달감염되거나 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이다.

"단리된"이란 보통 그 천연 상태에서 동반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 재료를 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 그 천연-생성 상태에서 그에 인접하는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오티드, 예로 보통 상기 단편에 인접한 서열에서 제거된 DNA 단편을 포함한다. 대안적으로 본원에서 사용되는 "단리된 펩티드" 또는 "단리된 폴리펩티드" 등은 그 천연 세포 환경으로부터 그리고 세포의 다른 성분과의 연관성으로부터 펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 시험관 내 단리 및/또는 정제를 포함한다; 즉 이것은 생체 내 물질과 크게 연관되지 않는다.

본원에서 사용되는 "mRNA" 또는 때때로 "mRNA 전사체"로 불리는 용어는 비제한적으로 전-mRNA 전사체(들), 전사체 처리 중간체, 번역될 준비가 된 성숙 mRNA(들) 및 유전자 또는 유전자들의 전사체, 또는 mRNA 전사체(들)로부터 유도되는 핵산을 포함한다. 전사체 처리는 스플라이싱, 편집 및 분해를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 mRNA 전사체로부터 유도되는 핵산은 그 합성을 위해 mRNA 전사체 또는 이들의 하위서열이 궁극적으로 주형으로 작용하는 핵산을 나타낸다. mRNA로부터 역전사된 cDNA, 그 cDNA에서 전사된 RNA, cDNA에서 증폭된 DNA, 증폭된 DNA로부터 전사된 RNA 등은 모두 mRNA 전사체로부터 유도된 것이며, 이러한 유도 산물의 검출은 표본 중 원래 전사체의 존재 및/또는 풍부함의 지표이다. 따라서 mRNA 유도 표본은 비제한적으로 유전자 또는 유전자들의 mRNA 전사체, mRNA에서 역전사된 cDNA, cDNA에서 전사된 cRNA, 유전자들로부터 증폭된 DNA, 증폭된 DNA에서 전사된 RNA 등을 포함한다.

본원에서 사용되는 "비-정규적" 활성은 일반적으로 i) 온전한 천연 전장 부모 단백질이 어떠한 상당한 정도로도 보유하지 않는 본 발명의 AARS 폴리펩티드가 보유하는 새로운 활성, 또는 ii) 온전한 천연 전장 부모 단백질이 보유하지만 AARS 폴리펩티드가 온전한 천연 전장 부모 단백질에 비해 훨씬 더 높은(즉 적어도 20%를 초과하는) 특이적 활성을 나타내거나 새로운 맥락; 예를 들어 온전한 천연 전장 부모 단백질이 보유하는 다른 활성으로부터 해당 활성을 단리함으로써 나타내는 활성을 나타낸다. AARS 폴리펩티드의 경우에, 비-정규적 활성의 비제한적 예에는 세포외 신호전달, RNA-결합, 아미노산-결합, 세포 증식의 조정, 세포 이동의 조정, 세포 분화의 조정(예로, 조혈, 신경발생, 근육발생, 골발생, 및 지방형성), 유전자 전사의 조정, 아폽토시스 또는 다른 형태의 세포사의 조정, 세포 신호전달의 조정, 세포 흡수 또는 분비의 조정, 혈관신생의 조정, 세포 결합의 조정, 세포 대사의 조정, 시토카인 생산 또는 활성의 조정, 시토카인 수용체 활성의 조정, 염증의 조정 등이 포함된다.

"절반 최대 유효 농도" 또는 "EC₅₀"라는 용어는 일부 특정된 노출 시간 후 기준선 및 최대치 사이 중간의 반응을 유도하는 본원에 기재된 AARS 단백질 단편, 항체 또는 다른 제제의 농도를 나타낸다; 이에 따라 등급화된 용량 반응 곡선의 EC₅₀은 그 최대 효과의 50%가 관찰되는 화합물의 농도를 나타낸다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 제제의 EC₅₀은 상기 주지된 바와 같은 "비-정규적" 활성에 관해 시사된다. EC₅₀은 또한 생체 내 최대 효과의 50%를 수득하는데 필요한 혈장 농도를 나타낸다. 유사하게, "EC₉₀"은 그 최대 효과의 90%가 관찰되는 제제 또는 조성물의 농도를 나타낸다. "EC₉₀"은 "EC₅₀" 및 Hill 경사로부터 계산될 수 있고, 또는 당분야의 일상 지식을 이용해서 직접 데이터로부터 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, AARS 단백질 단편, 항체, 또는 다른 제제의 EC₅₀은 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100nM 미만이다. 바람직하게는, 생체치료 조성물은 약 1nM 또는 미만의 EC₅₀ 값을 가질 것이다.

"조정"이라는 용어는 대조군에 비해 보통 통계적으로 유의미하거나 생리학적으로 유의미한 양의 "증가" 또는 "자극"뿐만 아니라 "절감" 또는 "감소"를 포함한다. 따라서 "조정제"는 사용되는 상태에 따라 작동제, 길항제, 또는 이들의 임의 혼합물일 수 있다. "증가된" 또는 "증강된" 양은 보통 "통계적으로 유의미한" 양이며, 조성물 없이(제제 또는 화합물의 부재 시) 또는 대조군 조성물에 의해 생성되는 양의 1.1, 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 또는 그 초과 배(예로, 500, 1000배) (사이값 및 1을 초과하는 모든 정수 및 소수, 예로 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등을 포함)인 증가를 포함할 수 있다. "절감된" 또는 감소된 양은 보통 "통계적으로 유의미한" 양이며, 조성물 없이(제제 또는 화합물의 부재 시) 또는 대조군 조성물에 의해 생성되는 양의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(사이의 모든 정수 포함) 감소를 포함할 수 있다. 하나의 비제한적 예로서, 정규적 및 비-정규적 활성 비교에서의 대조군은 그 대응 전장 AARS에 대비되는 관심 AARS 단백질 단편, 또는 그 대응 전장 AARS에 대해 비견할 만한 정규적 활성을 갖는 단편 AARS를 포함할 수 있다. "통계적으로 유의미한" 양의 다른 예가 본원에 기재된다.

"로부터 수득된"이란 표본, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 추출물 또는 폴리펩티드 추출물이 대상체의 특정 원천으로부터 단리되거나 유도된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 추출물은 대상체에서 직접 단리된 조직 또는 생물학적 유체로부터 수득될 수 있다. "유도된" 또는 "로부터 수득된"은 또한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 원천을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AARS 서열은 천연-생성되건 아니면 인공적으로 생성되건 간에 AARS 단백분해 단편 또는 AARS 스플라이스 변이체, 또는 이들의 일부의 서열 정보에서 "유도될" 수 있으며, 따라서 해당 서열을 포함하거나, 이로써 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다.

"폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용되어 아미노산 잔기의 중합체 및 이들의 변이체 및 합성 및 천연 생성 유사체를 나타낸다. 따라서 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성 비-천연 생성 아미노산, 예컨대 대응 천연 생성 아미노산의 화학적 유사체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연-생성 아미노산 중합체 및 이들의 천연 생성 화학적 유도체에 적용된다. 이러한 유도체는, 예를 들어 AARS 참조 단편의 피로글루타밀, 이소-아스파르틸, 단백분해, 인산화, 글리코실화, 산화, 이성화 및 탈아민화 변이체를 포함하는 번역-후 개질 및 분해 산물을 포함한다.

본원에서 사용되는 "서열 동일성" 또는, 예를 들어 "와 50% 동일한 서열"을 포함하는 언급은 서열이 비교 윈도우에 걸쳐 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 기준 또는 아미노산-대-아미노산 기준에서 동일한 정도를 나타낸다. 따라서 "서열 동일성 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적 정렬된 서열을 비교하고, 두 서열 모두에서 동일한 핵산 염기(예로, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예로, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 생기는 위치의 수를 결정하여 매치되는 위치의 수를 얻고, 매치되는 위치의 수를 비교 윈도우에서 전체 위치의 수(즉 윈도우 크기)로 나누어 그 결과에 100을 곱함으로써 서열 동일성의 백분율을 얻어 계산될 수 있다.

둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이 서열 관계를 설명하는데 이용되는 용어는 "참조 서열", "비교 윈도우", "서열 동일성", "서열 동일성의 백분율" 및 "실질적 동일성"을 포함한다. "참조 서열"은 길이에 있어서 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기를 포함하여 적어도 12, 그러나 빈번하게는 15 내지 18, 종종 적어도 25 단량체 단위이다. 두 폴리뉴클레오티드는 각각 (1) 두 폴리뉴클레오티드 간에 유사한 서열(즉, 전체 폴리뉴클레오티드 서열의 단지 일부), 및 (2) 두 폴리뉴클레오티드 간에 다른 서열을 포함할 수 있으므로, 두(또는 그 초과의) 폴리뉴클레오티드 간의 서열 비교는 보통 "비교 윈도우"에 걸쳐 두 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 동정하고 비교함으로써 수행된다. "비교 윈도우"는 두 서열이 최적으로 정렬된 후 서열이 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교하여 적어도 6, 통상 약 50 내지 약 100, 더욱 통상 약 100 내지 약 150의 인접 위치를 갖는 개념적 절편을 나타낸다. 비교 윈도우는 두 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 약 20% 또는 그 미만의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 윈도우를 정렬하기 위한 최적 서열 정렬은 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(Wisconsin Genetics 소프트웨어 패키지 버전 7.0(Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해 또는 선택된 임의의 다양한 방법으로 생성되는 조사 및 최적 정렬(즉 비교 윈도우에 걸쳐 최고의 백분율 상동성을 얻게 됨)에 의해 수행될 수 있다. 또한 예를 들어 [Altschul 등, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389]에 개시된 바와 같은 프로그램의 BLAST 패밀리를 참조할 수도 있다. 서열 분석의 상세 논의는 [Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15, Unit 19.3]에서 찾아볼 수 있다.

서열 간 서열 유사성 또는 서열 동일성(본 용어들은 본원에서 상호 교환적으로 이용된다)의 계산은 다음과 같이 수행된다. 두 아미노산 서열, 또는 두 핵산 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열들은 최적 비교 목적으로 정렬된다(예로, 최적 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있으며, 비상동성 서열은 비교 목적에서 무시될 수 있다). 특정 구현예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 더욱 보다 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%, 100%이다. 이어서 대응 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제 1 서열에서의 위치가 제 2 서열에서의 대응 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로 점유된 경우, 분자는 해당 위치에서 동일하다.

두 서열 간 동일성 백분율은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려한, 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다.

두 서열 간 서열 비교 및 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 두 아미노산 서열 간 동일성 백분율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 이용하여 GCG 소프트웨어 패키지에서 갭 프로그램 내에 도입되는 Needleman and Wunsch(1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453) 알고리즘(http://www.gcg.com에서 이용 가능)을 이용하여 결정된다. 다른 바람직한 구현예에서, 두 뉴클레오티드 서열 간 동일성 백분율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 갭 가중치 40, 50, 60, 70, 또는 80 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 이용하여 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램(http://www.gcg.com에서 이용 가능)을 이용하여 결정된다. 특히 바람직한 파라미터 세트(및 다른 방식으로 특정되지 않는 한 사용해야 하는 것)는 갭 페널티 12, 갭 연장 페널티 4, 및 해독틀 변환 갭 페널티 5를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스이다.

두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 간 동일성 백분율은 PAM120 가중치 잔기표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 이용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내에 도입된 E. Meyers and W. Miller(1989, Cabios, 4: 11-17)의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.

본원에서 기재되는 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어 다른 패밀리 멤버 또는 관련 서열을 동정하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질문 서열"로 이용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul 등(1990, J. Mol. Biol, 215: 403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12로 수행되어 본 발명의 핵산 분자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3으로 수행되어 본 발명의 단백질 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST가 Altschul 등(1997, Nucleic Acids Res, 25: 3389-3402)에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램(예로, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 이용될 수 있다.

"용해도"라는 용어는 액체 용매 중에 용해되고 균질한 용액을 형성하는 본원에서 제공되는 제제의 특성을 나타낸다. 용해도는 보통 용매의 단위 부피 당 용질의 질량(용질 g/용매 kg, g/dL(100mL), mg/mL 등), 몰 농도, 중량 몰 농도, 몰 분율 또는 다른 유사한 농도 표현에 의해 농도로 표현된다. 용매의 양 당 용해할 수 있는 용질의 최대 평형 양은 온도, 압력, pH, 및 용매의 성질을 포함하는 특정된 조건 하에 해당 용매 중 해당 용질의 용해도이다. 특정 구현예에서, 용해도는 생리학적 pH에서 측정된다. 특정 구현예에서, 용해도는 물 또는 생리학적 완충액, 예컨대 PBS 중에 측정된다. 특정 구현예에서, 용해도는 생물학적 유체(용매), 예컨대 혈액 또는 혈청 중에 측정된다. 특정 구현예에서, 온도는 실온 근처(예로, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25℃) 또는 체온 근처(37℃)일 수 있다. 특정 구현예에서, 제제, 예컨대 AARS 단백질 단편은 실온 또는 37℃에서 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 또는 30mg/ml의 용해도를 갖는다.

본원에서 사용되는 "스플라이스 결찰부"는 제 1 엑손의 3' 말단이 제 2 엑손의 5' 말단과 연결되는 성숙 mRNA 전사체 또는 인코딩된 폴리펩티드에서의 영역을 포함한다. 상기 영역의 크기는 변할 수 있고, 한 엑손의 3' 말단이 다른 엑손의 5' 말단과 연결되는 어느 한쪽의 정확한 잔기에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 그 초과의(그 사이의 모든 정수 포함) 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. "엑손"이란 전구체 RNA(인트론)가 시스-스플라이싱에 의해 제거된 후 또는 둘 이상의 전구체 RNA 분자가 트랜스-스플라이싱에 의해 결찰된 후 RNA 분자의 성숙 형태로 제시되는 핵산 서열을 나타낸다. 성숙 RNA 분자는 메신저 RNA 또는 비-코딩 RNA의 기능적 형태, 예컨대 rRNA 또는 tRNA일 수 있다. 맥락에 따라, 엑손은 DNA 또는 그 RNA 전사체 내 서열을 나타낼 수 있다. "인트론"이란 단백질로 번역되지 않는 유전자 내의 비-코딩 핵산 영역을 나타낸다. 비-코딩 인트론 구획은 전구체 mRNA(전-mRNA) 및 일부 다른 RNA(예컨대 긴 비코딩 RNA)로 전사된 후 성숙 RNA로의 처리 동안 스플라이싱에 의해 제거된다.

"스플라이스 변이체"란 RNA(일차적 유전자 전사체 또는 전-mRNA)의 엑손이 RNA 스플라이싱 동안 여러 방식으로 재연결되는 절차인 대안적 스플라이싱에 의해 생성되는 성숙 mRNA 및 그 인코딩된 단백질을 나타낸다. 생성되는 상이한 mRNA는 상이한 단백질 이소형으로 번역되어 단일 유전자가 다중 단백질을 코딩할 수 있게 된다.

본원에서 사용되는 "대상체"는 본 발명의 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로 치료하거나 진단할 수 있는 증상을 나타내거나 증상을 나타낼 위험에 처한 임의의 동물을 포함한다. 또한 진단적 또는 다른 목적을 위한 본 발명의 AARS 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 수준을 감정하기 바람직한 대상체가 포함된다. 적합한 대상체(환자)는 실험실 동물(예컨대 마우스, 래트, 토끼, 또는 기니아픽), 농장 동물, 및 가축 동물 또는 애완동물(예컨대 고양이 또는 개)을 포함한다. 비-인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자가 포함된다.

본원에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 비-정규적 활성에 의해 영향받을 수 있는 질환 또는 상태의 증상 또는 병리에 대한 임의의 바람직한 효과를 포함하며, 치료받는 질환 또는 상태의 하나 이상의 측정 가능한 마커에서의 최소 변화 또는 개선을 포함할 수 있다. 또한 본원에서 기재되는 AARS 서열이 치료의 임상적 마커를 제공하는 비-AARS 요법에 관련된 치료가 포함된다. "치료" 또는 "치료하는"은 반드시 질환 또는 상태, 또는 이들의 연관된 증상의 완벽한 근절 또는 치유를 나타내지는 않는다. 본 치료를 받는 대상체는 이를 필요로 하는 임의의 대상체이다. 임상적 개선의 예시적인 마커는 당분야의 숙련자에게 자명할 것이다.

본 발명의 실시는 구체적으로 달리 특정되지 않는 한, 당분야 기술 내의 분자 생물학 및 재조합 DNA 기법의 통상적 방법을 채용할 것이며, 그 다수가 예시 목적으로 하기에 기재된다. 이러한 기법은 문헌에서 충분히 설명된다. 예로 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd Edition, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 5^th Ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3^rd Edition 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3^rd Edition 2005), Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-3, 4-2), 1855. Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, N.Y., Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); 및 Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, (2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3)]을 참고하라.

본원에서 언급되는 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 이들의 전문이 본원에 참조로 도입된다.

III. 치료적 및 다른 용도를 위한 정제된 AARS 단백질 단편 및 변이체

놀랍게도, 그리고 이들의 아미노아실화-활성에 대해서만 공지된 이들의 전장 부모 서열과는 달리, AARS 단편은 생체치료, 발견 및 진단적 용도를 위해 중요한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 구현예는 생물학적 활성 변이체 및 이들의 단편에 부가하여 아미노아실-tRNA 합성효소(AARS)의 전장 단백질, 성숙 단백질 이소형 및 단백질 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질 및 단편은 다른 기전 중에서 내인성 단백분해, 시험관 내 단백분해, 스플라이스 변화, 또는 컴퓨터 내 예측을 통해 얻어질 수 있다.

본원에서 기재되는 AARS 단백질 단편 및 이들의 변이체는 적어도 하나의 "비-정규적" 생물학적 활성을 보유할 수 있다. 본 발명의 AARS 단백질 단편(들)은 또한 본원에서 "AARS 폴리펩티드" 또는 "AARS 참조 폴리펩티드"로 불린다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 AARS 폴리펩티드는 아스파르틸 tRNA 합성효소의 다양한 단편의 아미노산 서열(들)을 나타내는, 하기 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에 나타낸 바와 같은 전체 또는 일부의 AARS 폴리펩티드 "참조 서열(들)"을 포함하거나 이들로 본질적으로 구성된다. 마우스 및 인간 AARS 단백질 서열은 보통 전체 서열, 특정 도메인, 또는 특정 단백질 단편 내에서 몇몇 아미노산 이하만큼 다르며 고도로 관련되어 있다.

N-말단 AARS 폴리펩티드: (표 1, 2 & 3)

"단백질 단편" 또는 단백질 단편, 예컨대 단백분해 단편 또는 스플라이스 변이체 단편의 아미노산 서열은 다양한 기법에 따라 특징분석, 동정 또는 유도될 수 있다. 예를 들어, 스플라이스 변이체는 심층 서열분석(예로 [Xing 등, RNA. 14:1470-1479, 2008; 및 Zhang 등, 게놈 Research. 17:503-509, 2007] 참고)과 같은 기법으로 동정될 수 있다. 추가 예로서, 단백질 단편, 예컨대 단백분해 단편은 시험관 내에서, 예컨대 전장 또는 다른 AARS 폴리펩티드를 선택된 프로테아제와 인큐베이션함으로써 동정될 수 있고, 또는 이들은 내인적으로(예로, 생체 내에서) 동정될 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질 단편, 예컨대 내인성 단백분해 단편은, 예를 들어 하나 이상의 선택된 프로테아제를 함유하도록 개질되거나, 선택된 AARS 폴리펩티드에 대해 작용할 수 있는 하나 이상의 프로테아제를 자연적으로 함유하는 선택된 미생물 또는 진핵 세포 중에서 전장 또는 다른 AARS 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하고, 이들로부터 내인적으로 생성된 단백질 단편을 단리 및 특징분석함으로써 생성되거나 동정될 수 있다.

특정 구현예에서, 단백질 단편, 예컨대 내인성(예로, 천연-생성) 단백분해 단편은, 예를 들어 면역 세포, 예컨대 단핵구, 수지상 세포, 대식구(예로, RAW 264.7 대식구), 호중구, 호산구, 호염기구, 및 림프구, 예컨대 Jurkat T-세포뿐만 아니라 천연 킬러(NK) 세포와 같은 일차 T-세포 및 T-세포주를 포함하는 B-세포 및 T-세포(예로, CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 킬러 세포)를 포함하는 다양한 세포 유형의 다양한 세포 분획(예로 세포질, 막, 핵) 및/또는 성장 배지로부터 생성되거나 동정될 수 있다.

그러나 특정 구현예에서, 단백질 단편, 예컨대 내인성 단백분해 단편은 질량 분광측정, 또는 균등한 기법과 같은 기법으로 동정될 수 있다. 일단 시험관 내 또는 내인적으로 동정된 단백질 단편이 생성되거나 동정되면, 이는 맵핑되거나 서열분석될 수 있고, 예를 들어 재조합 생산용 발현 벡터 내로 클로닝되거나 합성적으로 제조될 수 있다.

다양한 프로테아제를 이용하여 AARS 단백질 단편, 예컨대 단백분해 단편의 서열을 제조, 동정, 유도 또는 특징분석할 수 있다. 일반적으로 프로테아제는 통상 3가지 주요 기준에 따라 분류된다: (i) 촉매되는 반응, (ii) 촉매 부위의 화학적 성질, 및 (iii) 구조로 드러나는 진화적 상관관계. 촉매의 기전에 의해 분류되는 프로테아제 또는 프로티나아제의 일반예는 아스파르틱 프로테아제, 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제 및 메탈로프로테아제를 포함한다.

대부분의 아스파르틱 프로테아제는 펩신 패밀리에 속한다. 상기 패밀리는 소화 효소, 예컨대 펩신 및 키모신뿐만 아니라 리소좀 카텝신 D 및 처리 효소, 예컨대 레닌, 및 특정 진균성 프로테아제(예로, 페니실로펩신, 리조푸스펩신, 엔도티아펩신)를 포함한다. 아스파르틱 프로테아제의 두번째 패밀리는 바이러스 프로티나아제, 예컨대 레트로펩신으로도 불리는 AIDS 바이러스(HIV)로부터의 프로테아제를 포함한다.

세린 프로테아제는 2가지 독특한 패밀리를 포함한다. 첫번째는 포유류 효소, 예컨대 키모트립신, 트립신, 엘라스타아제, 및 칼리크레인을 포함하는 키모트립신 패밀리이고, 두번째는 박테리아 효소, 예컨대 서브틸리신을 포함하는 서브틸리신 패밀리이다. 이러한 두 패밀리 간에 일반적인 3D 구조는 상이하지만, 이들은 동일한 활성 부위 구조를 가지며, 촉매는 동일한 기전을 통해 진행된다. 세린 프로테아제는 상이한 기질 특이성을 나타내며, 그 차이는 주로 다양한 효소 서브부위(기질 잔기 상호반응 부위) 내의 아미노산 치환에 관련된다. 일부 세린 프로테아제는 기질과 연장된 상호반응 부위를 갖는 반면, 다른 것들은 P1 기질 잔기에 제한된 특이성을 갖는다.

시스테인 프로테아제 패밀리는 식물 프로테아제, 예컨대 파파인, 액티니딘 및 브로멜라인, 몇몇 포유류 리소좀 카텝신, 세포질 칼파인(칼슘-활성화물)뿐만 아니라 몇몇 기생충 프로테아제(예로, 트리파노소마, 스키스토소마)를 포함한다. 파파인은 이 패밀리의 원형으로 가장 많이 연구된 멤버이다. 인터류킨-1-베타 전환 효소의 X-선 구조에 대한 최근 규명은 시스테인 프로티나아제에 대한 신규한 유형의 폴딩을 드러내었다.

메탈로프로테아제는 박테리아, 진균, 및 고등 유기체에서 발견되는 오래된 프로테아제 클래스 중 하나이다. 이들은 이들의 서열 및 이들의 3D 구조가 크게 다르지만, 상당히 다수의 효소는 촉매 활성이 있는 아연 원자를 함유한다. 일부 경우에서, 아연은 단백분해 활성의 손실 없이 다른 금속, 예컨대 코발트 또는 니켈로 대체될 수 있다. 박테리아 써모라이신은 특징이 잘 분석되어 있으며, 그 결정학적 구조는 아연이 두 히스티딘 및 하나의 글루탐산에 결합되어 있음을 나타낸다. 여러 메탈로프로테아제는 서열 모티브 HEXXH를 함유하며, 이는 아연을 위한 두 히스티딘 리간드를 제공한다. 세번째 리간드는 글루탐산(써모라이신, 네프리라이신, 알라닐 아미노펩티다아제) 또는 히스티딘(아스타신, 세라라이신)이다.

예시적 프로테아제는, 예를 들어 아크로모펩티다아제, 아미노펩티다아제, 안크로드, 안지오텐신 전환 효소, 브로멜라인, 칼파인, 칼파인 I, 칼파인 II, 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 B, 카르복시펩티다아제 G, 카르복시펩티다아제 P, 카르복시펩티다아제 W, 카르복시펩티다아제 Y, 카스파아제 1, 카스파아제 2, 카스파아제 3, 카스파아제 4, 카스파아제 5, 카스파아제 6, 카스파아제 7, 카스파아제 8, 카스파아제 9, 카스파아제 10, 카스파아제 11, 카스파아제 12, 카스파아제 13, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 G, 카텝신 H, 카텝신 L, 키모파파인, 키마아제, 키모트립신, 클로스트리파인, 콜라게나아제, 보체 C1r, 보체 C1s, 보체 인자 D, 보체 인자 I, 쿠쿠미신, 디펩티딜 펩티다아제 IV, 엘라스타아제(백혈구), 엘라스타아제(췌장), 엔도프로티나아제 Arg-C, 엔도프로티나아제 Asp-N, 엔도프로티나아제 Glu-C, 엔도프로티나아제 Lys-C, 엔테로키나아제, 인자 Xa, 피신, 푸린, 그랜자임 A, 그랜자임 B, HIV 프로테아제, IG아제, 칼리크레인 조직, 류신 아미노펩티다아제(일반), 류신 아미노펩티다아제(세포질), 류신 아미노펩티다아제(마이크로솜), 기질 메탈로프로테아제, 메티오닌 아미노펩티다아제, 뉴트라아제, 파파인, 펩신, 플라스민, 프롤리다아제, 프로나아제 E, 전립선 특이 항원, 스트렙토미세스 그리세우스 유래의 프로테아제 알칼로필릭, 아스페르길러스 유래의 프로테아제, 아스페르길러스 사이토이 유래의 프로테아제, 아스페르길러스 소재 유래의 프로테아제, B. 리케니포르미스 유래의 프로테아제(알칼린 또는 알칼라아제), 바실러스 폴리믹사 유래의 프로테아제, 바실러스 종 유래의 프로테아제, 리조푸스 종 유래의 프로테아제, 프로테아제 S, 프로테아좀, 아스페르길러스 오리재 유래의 프로티나아제, 프로티나아제 3, 프로티나아제 A, 프로티나아제 K, 단백질 C, 피로글루타메이트 아미노펩티다아제, 렌닌, 렌닌, 스트렙토키나아제, 서브틸리신, 써모라이신, 트롬빈, 조직 플라스미노겐 활성화제, 트립신, 트립타아제 및 유로키나아제를 포함한다.

특정 구현예는 내인성, 천연-생성 AARS 폴리펩티드 단편에서 유도된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로써 본질적으로 구성되거나, 구성된 단리 AARS 폴리펩티드, 및 상기 단편을 포함하는 약학적 조성물, 및 이들의 사용 방법에 관한 것이다. 상기 및 관련 구현예는 생체 내, 생체 외 및/또는 시험관 내에서 생성되거나 동정될 수 있다. 특히 바람직한 시험관 내 구현예에서, AARS 단백분해 단편은 AARS 폴리펩티드, 예컨대 전장 AARS 폴리펩티드를 하나 이상의 단리된 인간 프로테아제, 주로 인간에서 내인성 또는 자연적인 프로테아제, 예컨대 엘라스타아제 및 본원에서 기재되고 당분야에 공지된 다른 것들과 인큐베이션함으로써 생성되거나 동정된다. 다른 구현예는 내인성, 천연-생성 AARS 스플라이스 변이체에서 유도된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로써 본질적으로 구성되거나, 구성된 단리 AARS 폴리펩티드, 및 상기 단편을 포함하는 약학적 조성물, 및 이들의 사용 방법에 관한 것이다. 본질적으로, AARS 단백질 단편은 생체 내 또는 시험관 내 여부와 상관없이 프로테아제에 노출된 표본으로부터 단리될 수 있다.

특정 구현예에서, AARS 단백질 단편은 질량 분광측정, 또는 균등한 기법과 같은 기법에 의해 동정될 수 있다. 단순히 비제한적인 예로써, 특정 구현예에서 다양한 생리적 상태(예로 저산소, 식사, 연령, 질환)의 다양한 세포 유형, 조직, 또는 체액 또는 이들의 분획에서 유래되는 프로테옴은 1D SDS-PAGE 및 고정된 간격의 밴드로 절단된 겔 레인에 의해 분리될 수 있다; 이후 밴드는 적절한 프로테아제, 예컨대 트립신으로 선택적으로 소화되어 펩티드가 방출될 수 있고, 이는 1D 역상 LC-MS/MS로 분석될 수 있다. 생성 프로테옴 데이터는 좌측 패널에 수평 단위로 주어진 단백질의 서열 커버(좌측에서 우측으로 N에서 C 말단) 대 수직 단위의 SDS-PAGE 이동(위에서 아래로 고분자량에서 저분자량)를 도식화하는 소위 펩토그래프에 통합될 수 있다. 이어서 특정 펩티드 단편은 서열 분석되거나 맵핑될 수 있다. 특정 구현예에서, AARS 참조 단편은, 예를 들어 대응 전장 AARS의 분자량에 대비되는 그 독특한 분자량을 특징으로 할 수 있다.

앞서 주지된 바와 같이, 본 발명의 구현예는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에 나타낸 AARS 폴리펩티드를 포함한다. 또한 AARS 참조 폴리펩티드의 "변이체"를 포함한다. 폴리펩티드 "변이체"라는 언급은 적어도 하나의 아미노산 잔기의 부가, 결실, 및/또는 치환에 의해 참조 AARS 폴리펩티드와 구별되며, 보통 참조 AARS 폴리펩티드의 하나 이상의 비-정규적 활성을 유지(예로 모사)하거나 조정(예로 길항)하는 폴리펩티드를 나타낸다.

또한 인간 아스파르틸 tRNA 합성효소는 수백개의 고도로 관련된 다형성 형태를 포함하며, 이들은 일부 이상 기능적으로 상호 교환가능한 것으로 당분야에 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어 표 A에 열거된 단일 뉴클레오티드 다형성 형태를 포함하는 아스파르틸 tRNA 합성효소의 천연 생성 변이체를 선택하여 인간뿐만 아니라 다른 종의 아스파르틸 tRNA 합성효소의 임의의 상동체, 오르쏘로그 및 천연 생성 이소형의 서열에 근거한 하나 이상의 아미노산 변화를 함유하는 AARS 폴리펩티드를 생성하는 것은 일상적인 방식일 것이다.

특정 구현예에서, 폴리펩티드 변이체는 본원에 기재된 바와 같으며 당분야에 공지된 보존적 또는 비-보존적일 수 있는 하나 이상의 치환에 의해 참조 폴리펩티드와 구별된다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 변이체는 보존적 치환을 포함하며, 이와 관련해서 일부 아미노산은 폴리펩티드의 활성 성질을 변화시키지 않고 폭넓게 유사한 특성을 갖는 다른 것들로 변화될 수 있다는 것이 당분야에서 널리 이해된다.

특정 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 AARS 참조 폴리펩티드의 대응 서열에 대해 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 실질적으로 상기 참조 폴리펩티드의 비-정규적 활성을 보유한다. 또한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 또는 그 초과 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의해 참조 AARS 서열과 상이하지만 참조 AARS 폴리펩티드의 특성을 보유하는 서열이 포함된다. 특정 구현예에서, 아미노산 부가 또는 결실은 AARS 참조 폴리펩티드의 C-말단 및/또는 N-말단에서 일어난다. 특정 구현예에서, 아미노산 부가는 AARS 참조 폴리펩티드의 C-말단 및/또는 N-말단에 인접한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 그 초과의 야생형 잔기(즉, 대응 전장 AARS 폴리펩티드 대비)를 포함한다.

특정 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 대응 AARS 참조 서열과 1% 이상, 그러나 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만의 잔기가 상이하다(이러한 비교에 정렬이 필요한 경우, 서열은 최대 유사성에 대해 정렬되어야 한다. 결실 또는 삽입, 또는 미스매치로 인해 "루프를 형성해 내는" 서열은 차이로 간주된다). 차이는 적합하게는 비-필수적인 잔기에서의 차이 또는 변화이거나 보존적 치환이다. 특정 구현예에서, 변이체 AARS 폴리펩티드의 분자량은 AARS 참조 폴리펩티드의 분자량과 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 또는 그 초과로 상이하다.

또한 AARS 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 "단편", 즉 AARS 단백질 단편의 생물학적 활성 단편이 포함된다. 대표적인 생물학적 활성 단편은 일반적으로 상호반응, 예로 분자내 또는 분자간 상호반응에 참여한다. 분자간 상호반응은 특이적 결합 상호반응 또는 효소적 상호반응일 수 있다. 분자간 상호반응은 AARS 폴리펩티드 및 세포 결합 파트너, 예컨대 세포 수용체 또는 AARS 폴리펩티드의 비-정규적 활성에 참여하는 다른 숙주 분자 사이에서 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, AARS 단백질, 이들의 변이체, 및 생물학적 활성 단편은 하나 이상의 세포 결합 파트너에 적어도 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 또는 50nM의 친화도로 결합한다. 선택된 세포 결합 파트너, 특히 비-정규적 활성에 참여하는 결합 파트너에 대한 AARS 단백질 단편의 결합 친화도는 보통 AARS 단백질 단편의 대응 전장 AARS 폴리펩티드의 친화도 대비 적어도 약 1.5x, 2x, 2.5x, 3x, 3.5x, 4x, 4.5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1000x 또는 그 초과만큼(그 사이 모든 정수 포함) 더 강하다. AARS의 적어도 하나의 정규적 활성에 참여하는 결합 파트너에 대한 AARS 단백질 단편의 결합 친화도는 보통 AARS 단백질 단편의 대응 전장 AARS 폴리펩티드의 친화도 대비 적어도 약 1.5x, 2x, 2.5x, 3x, 3.5x, 4x, 4.5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1000x 또는 그 초과만큼 더 약하다.

보통 생물학적 활성 단편은 AARS 참조 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 갖는 도메인 또는 모티브를 포함하며, 하나 이상의(일부 경우에서는 전체의) 다양한 활성 도메인을 포함할 수 있고, 비-정규적 활성을 갖는 단편을 포함한다. 일부 경우에서, AARS 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편은 전장 AARS 폴리펩티드가 상기 활성을 갖지 않을 수 있을 정도로 특정한 절단 단편에 독특한 생물학적 활성을 갖는다. 특정 경우에서, 생물학적 활성은 생물학적 활성 AARS 폴리펩티드 단편을 다른 전장 AARS 폴리펩티드 서열로부터 분리함으로써 또는 전장 AARS 야생형 폴리펩티드 서열의 특정 잔기를 생물학적 활성 도메인을 차폐하지 않도록 변형함으로써 드러날 수 있다.

AARS 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편은, 예를 들어 본원에 기재된 임의 하나의 AARS 참조 폴리펩티드에 나타낸 아미노산 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 또는 그 초과(그 사이 모든 정수(예로, 101, 102, 103) 및 범위(예로, 50-100, 50-150, 50-200)를 포함)의 인접 또는 비-인접 아미노산을 갖지만 보통 전장 AARS는 제외하는 폴리펩티드 단편일 수 있다. 특정 구현예에서, 생물학적 활성 단편은 비-정규적 활성-관련 서열, 도메인, 또는 모티브를 포함한다. 특정 구현예에서, 임의의 AARS 참조 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단 영역은 절단된 AARS 폴리펩티드가 참조 폴리펩티드의 비-정규적 활성을 보유하는 한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 또는 700 또는 그 초과의 아미노산이, 또는 약 10-50, 20-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700 또는 그 초과의 아미노산이 그 사이 모든 정수 및 범위를 포함하여(예로, 101, 102, 103, 104, 105) 절단될 수 있다. 보통 생물학적 활성 단편은 이것이 유도된 생물학적 활성(즉, 비-정규적 활성) AARS 참조 폴리펩티드의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 25%, 또는 약 50% 이상의 활성을 갖는다. 이러한 비-정규적 활성을 측정하기 위한 예시적인 방법은 실시예에 기재된다.

앞서 주지된 바와 같이, AARS 폴리펩티드는 아미노산 치환, 결실, 절단, 및 삽입을 포함하는 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 이러한 조작 방법은 당분야에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, AARS 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 DNA 내 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이화 및 뉴클레오티드 서열 변형을 위한 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 [Kunkel(1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel 등(1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), U.S. 특허 번호 4,873,192, Watson, J. D. 등("Molecular Biology of the Gene", 4th Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)] 및 본원에서 언급되는 참조문헌을 참고하라. 관심 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 가이드는 Dayhoff 등의 모델[(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]에서 찾아볼 수 있다.

유사하게, 이들이 AARS 폴리펩티드를 이용하여 생성되는 경우, 예로 자동화된 컴퓨터 인식 프로그램을 이용하여 잠재적 T 세포 에피토프를 동정하고, 면역원성이 더 적은 형태를 동정하기 위한 지정 진화적 접근법을 이용함으로써 면역원성 우려사항을 해결하고/하거나 완화하는 것은 당분야에의 기술 범위 내이다.

점 돌연변이 또는 절단에 의해 제조되는 조합 라이브러리의 유전자 산물의 스크리닝 방법 및 선택된 특성을 갖는 유전자 산물에 대한 cDNA 라이브러리의 스크리닝 방법은 당분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 AARS 폴리펩티드의 조합 돌연변이화에 의해 생성되는 유전자 라이브러리의 고속 스크리닝에 적용 가능하다. 라이브러리 내의 기능적 돌연변이체의 빈도를 증강시키는 기법인 재귀적 앙상블 돌연변이화(REM)는 AARS 폴리펩티드 변이체를 동정하기 위해 스크리닝 분석과 조합되어 이용될 수 있다(Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave 등, (1993) Protein Engineering, 6: 327-331). 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같은 보존적 치환, 예컨대 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 것으로 교환하는 것이 바람직할 수 있다.

생물학적 활성을 가진 절단된 및/또는 변이체 AARS 폴리펩티드는 참조 AARS 아미노산 잔기에 비해 이들의 서열에 걸쳐 다양한 위치에서 보존적 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 부가적으로, AARS 단백질의 천연 생성 변이체는 서열 분석되었으며, 적어도 부분적으로는 기능적으로 상호 변경가능한 것으로 당분야에 공지되어 있다. 따라서 AARS 단백질의 인간뿐만 아니라 다른 종의 공지된 AARS 단백질 상동체, 오르쏘로그, 및 천연-생성 이소형 가운데 천연 생성 서열 변화에 근거하여 AARS 폴리펩티드 내로 보존적, 또는 비-보존적 돌연변이를 도입하기 위한 아미노산 위치를 선택하는 것은 일상적인 방식일 것이다.

"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당분야에 정의되어 있으며, 일반적으로 하기와 같이 하위 분류할 수 있다:

산성: 잔기는 생리학적 pH에서 H 이온의 소실로 인해 음 전하를 가지며, 잔기는 펩티드가 생리학적 pH에서 수성 매질 중에 있을 때 함유되는 펩티드의 입체형태에서 표면 위치를 점유하기 위해 수성 용액에 의해 이끌린다. 산성 측쇄를 갖는 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다.

염기성: 잔기는 생리학적 pH에서 또는 이들의 1이나 2 pH 단위 내에서 (예로, 히스티딘) H 이온과의 연합으로 인해 양 전하를 가지며, 잔기는 펩티드가 생리학적 pH에서 수성 매질 중에 있을 때 함유되는 펩티드의 입체형태에서 표면 위치를 점유하기 위해 수성 용액에 의해 이끌린다. 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다.

하전됨: 잔기는 생리학적 pH에서 하전되며, 이에 따라 산성 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(즉, 글루탐산, 아스파르트산, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘)을 포함한다.

소수성: 잔기는 생리학적 pH에서 하전되지 않으며, 잔기는 펩티드가 수성 매질 중에 있을 때 함유되는 펩티드의 입체형태에서 내부 위치를 점유하기 위해 수성 용액에 의해 반발된다. 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 티로신, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판을 포함한다.

중성/극성: 잔기는 생리학적 pH에서 하전되지 않지만, 잔기는 펩티드가 수성 매질 중에 있을 때 함유되는 펩티드의 입체형태에서 내부 위치를 점유하기 위해 수성 용액에 의해 충분히 반발되지 않는다. 중성/극성 측쇄를 갖는 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 히스티딘, 세린 및 트레오닌을 포함한다.

상기 설명은 또한 측쇄에 극성기가 없음에도 소수성을 부여하기 충분히 크지 않기 때문에 특정 아미노산을 "소" 아미노산으로 특징화한다. 프롤린을 제외하고, "소" 아미노산은 적어도 하나의 극성 기가 측쇄 상에 있는 경우 4개 이하의 탄소를 갖고, 그렇지 않은 경우 3개 이하의 탄소를 갖는 것들이다. 소 측쇄를 갖는 아미노산은 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌을 포함한다. 유전자-인코딩된 이차적 아미노산 프롤린은 펩티드쇄의 이차적 입체형태에 대한 그 공지된 효과로 인해 특별한 경우이다. 프롤린의 구조는 그 측쇄가 α-아미노기의 질소뿐만 아니라 α-탄소에 결합되어 있다는 점에서 다른 모든 천연-생성 아미노산과 상이하다. 몇몇 아미노산의 유사성 매트릭스는 당분야에 공지되어 있다(예를 들어 [Dayhoff 등, 1978, A model of evolutionary change in proteins]에 개시된 바와 같은 PAM120 매트릭스 및 PAM250 매트릭스 참고). 그러나 거리 상관관계 결정을 위한 매트릭스[M. O. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, pp. 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC]; 및 [Gonnet 등, Science, 256: 14430-1445, 1992]는 프롤린을 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌과 동일한 그룹에 포함한다. 따라서 본 발명의 목적을 위해, 프롤린은 "소"아미노산으로 분류된다.

극성 또는 비극성으로 분류하기 위해 필요한 유인 또는 반발 정도는 임의적인 것이며, 따라서 본 발명에 의해 구체적으로 포함되는 아미노산은 어느 하나 또는 다른 하나로 분류된다. 구체적으로 거론되지 않은 대부분의 아미노산은 공지된 거동에 기준하여 분류될 수 있다.

아미노산 잔기는 잔기의 측쇄 치환기 그룹 및 작고 큼에 따라 시클릭 또는 비-시클릭, 및 방향족 또는 비-방향족, 자체 설명 분류로서 추가 하위분류될 수 있다. 잔기는 부가적 극성 치환기가 존재하는 경우에 이것이 카르복실 탄소를 포함하여 총 4개 이하의 탄소수를 함유하는 경우; 부가적 극성 치환기가 존재하지 않는 경우에는 총 3개 이하의 탄소수를 함유하는 경우 작은 것으로 간주된다. 작은 잔기는 당연히 항상 비-방향족이다. 이들의 구조적 특성에 따라, 아미노산 잔기는 둘 이상의 클래스에 속할 수 있다. 천연-생성 단백질 아미노산에 있어서, 이러한 방식에 따른 하위분류를 표 B에 나타낸다.

보존적 아미노산 치환은 또한 측쇄에 근거한 그룹화를 포함한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이며; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 예를 들어, 류신의 이소류신 또는 발린으로의 대체, 아스파르테이트의 글루타메이트로의 대체, 트레오닌의 세린으로의 대체, 또는 아미노산의 구조적 관련 아미노산으로의 유사한 대체는 생성 변이체 폴리펩티드의 특성에 큰 효과를 갖지 않을 것임을 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능적인 절단된 및/또는 변이체 AARS 폴리펩티드를 생성하는지 여부는 본원에 기재된 바와 같은 그 비-정규적 활성의 분석에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 보존적 치환을 예시적인 치환이라는 표제 하에 표 C에 나타낸다. 본 발명의 범위 내에 속하는 아미노산 치환은 일반적으로 (a) 치환 영역 내 펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, (c) 측쇄의 벌키함, 또는 (d) 생물학적 기능을 유지하는 이들의 효과에 대해 크게 상이하지 않은 치환을 선택함으로써 달성된다. 치환이 도입된 후, 변이체는 생물학적 활성에 대해 스크리닝된다.

대안적으로, 보존적 치환을 하기 위한 유사 아미노산은 측쇄의 동일성에 근거하여 3가지 분류로 그룹화될 수 있다. [Zubay, G., Biochemistry, third edition, Wm.C. Brown Publishers (1993)]에 기재된 바와 같이 첫번째 그룹은 모두 하전된 측쇄를 갖는 글루탐산, 아스파르트산, 아르기닌, 라이신, 히스티딘을 포함한다; 두번째 그룹은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 글루타민, 아스파라긴을 포함한다; 세번째 그룹은 류신, 이소류신, 발린, 알라닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌을 포함한다.

따라서 절단된 및/또는 변이체 AARS 폴리펩티드 내에서 예측되는 비-필수적인 아미노산 잔기는 보통 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 대안적으로, 돌연변이는 AARS 코딩 서열의 전체 또는 일부에 걸쳐 무작위로, 예컨대 포화 돌연변이화에 의해 도입될 수 있고, 생성 돌연변이체는 부모 폴리펩티드의 활성에 대해 스크리닝되어 상기 활성을 보유하는 돌연변이체를 동정할 수 있다. 코딩 서열의 돌연변이화 후, 인코딩된 펩티드는 재조합적으로 발현될 수 있고, 펩티드의 활성이 결정될 수 있다. "비--필수적인" 아미노산 잔기는 하나 이상의 그 활성의 폐지 또는 실질적 변형 없이 구현예 폴리펩티드의 참조 서열에서 변형될 수 있는 잔기이다. 적합하게는 변형은 이들 활성 중 하나를 실질적으로 폐지하지 않는다, 예를 들어 그 활성은 참조 AARS 서열의 적어도 20%, 40%, 60%, 70% 또는 80%, 100%, 500%, 1000% 또는 그 초과이다. "필수적" 아미노산 잔기는 AARS 폴리펩티드의 참조 서열에서 변형되는 경우 참조 활성의 20% 미만이 존재하는 정도로 부모 분자의 활성 폐지를 일으키는 잔기이다. 예를 들어, 이러한 필수적인 아미노산 잔기는 다양한 원천의 AARS 폴리펩티드의 활성 결합 부위(들) 또는 모티브(들)에서 보존된 서열을 포함하여, 상이한 종에 걸쳐 AARS 폴리펩티드에서 보존된 것들을 포함한다.

일반적으로 폴리펩티드 및 융합 폴리펩티드(뿐만 아니라 이들의 인코딩 폴리뉴클레오티드)가 단리된다. "단리된" 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 그 원래 환경에서 제거된 것이다. 예를 들어, 천연-생성 단백질은 이것이 자연계의 일부 또는 전체 공존 재료에서 분리되는 경우 단리된다. 바람직하게는 이러한 폴리펩티드는 적어도 약 90% 순수하며, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 순수하고, 가장 바람직하게는 적어도 약 99% 순수하다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 이것이 천연 환경의 일부가 아닌 벡터 내로 클로닝되는 경우 단리된 것으로 간주된다.

특정 구현예는 또한 AARS 폴리펩티드의 이량체를 포함한다. 이량체는, 예를 들어 두 동일한 AARS 폴리펩티드 간 동종이량체, 두 상이한 AARS 폴리펩티드(예로, 전장 YRS 폴리펩티드 및 절단된 YRS 폴리펩티드; 절단된 YRS 폴리펩티드 및 절단된 WRS 폴리펩티드) 간 이종이량체, 및/또는 AARS 폴리펩티드 및 이종성 폴리펩티드 간 이종이량체를 포함할 수 있다. 특정 이종이량체, 예컨대 AARS 폴리펩티드 및 이종성 폴리펩티드 간의 이종이량체는 본원에 기재된 바와 같이 이중-기능적일 수 있다.

또한 하나 이상의 치환, 절단, 결실, 부가, 화학적 개질, 또는 이들 변형의 조합으로 인한 것인지 여부와 무관하게, 제 2 AARS 폴리펩티드로 실질적으로 이량체화되지 않은 단리된 AARS 폴리펩티드 단량체를 포함하는 AARS 폴리펩티드의 단량체가 포함된다. 특정 구현예에서, 단량체성 AARS 폴리펩티드는 이량체 또는 다량체 AARS 폴리펩티드 복합체가 보유하지 않는 비-정규적 활성을 포함하는 생물학적 활성을 보유한다.

본 발명의 특정 구현예는 또한 본원에 기재된 바와 같은 AARS 폴리펩티드의 목적 특징을 개선하는 개질을 포함하는 개질된 AARS 폴리펩티드의 용도를 포함한다. 본 발명의 AARS 폴리펩티드의 개질은 아세틸화, 히드록실화, 메틸화, 아미드화, 및 탄수화물 또는 지질 부분, 보조인자의 부착 등을 포함하는 측쇄 개질, 골격 개질, 및 N- 및 C-말단 개질을 포함하는 하나 이상의 구성 아미노산에서의 화학적 및/또는 효소적 유도체화를 포함한다. 예시적인 개질은 또한 AARS 폴리펩티드의 peg화를 포함한다(예로 둘 다 본원에서 참조로 도입되는 [Veronese and Harris, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 453-456, 2002; 및 Pasut 등, Expert Opinion. Ther. Patents 14(6) 859-894 2004] 참고).

PEG는 물 및 여러 유기 용매 중의 용해도, 독성의 부재 및 면역원성의 부재 특성을 갖는 널리 공지된 중합체이다. 또한 투명하며, 무색 무취이고, 화학적으로 안정하다. 이들 및 다른 이유로 인해, PEG는 부착을 위해 바람직한 중합체로 선택되었으나, 제한이 아닌 예시적인 목적만을 위해 채용되었다. 하기를 비제한적으로 포함하는 다른 수용성 중합체로 유사한 산물이 수득될 수 있다; 폴리비닐 알코올, 다른 폴리(알킬렌 옥시드), 예컨대 폴리(프로필렌 글리콜) 등, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 예컨대 폴리(옥시에틸화 글리세롤) 등, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 푸롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물, 및 폴리아미노산. 당분야의 숙련자는 목적 투여량, 순환 시간, 단백분해에 대한 내성, 및 다른 고려사항에 근거하여 목적 중합체를 선택할 수 있을 것이다.

특히, 다양한 PEG 유도체는 PEG-콘쥬게이트의 제조에서의 용도를 위해 이용 가능하고 적합하다. 예를 들어, 상표명 SUNBRIGHT® 계열 하에 시판되는 NOF Corp.의 PEG 시약은 AARS 폴리펩티드의 N-말단, C-말단 또는 임의의 내부 아미노산으로 다양한 방법에 의해 커플링하기 위한 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 활성화된 PEG 유도체, 예컨대 메톡시-PEG 아민, 말레이미드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 및 카르복실산을 포함하는 여러 PEG 유도체를 제공한다. Nektar Therapeutics의 개선된 peg화 기술은 또한 AARS 폴리펩티드 기반 치료제의 안전성 및 유효성을 잠재적으로 개선하기 위한 다양한 PEG-커플링 기술을 제공한다.

특허, 공개 특허 출원, 및 관련 공보의 검색은 또한 본 개시물을 독서하는 당분야의 숙련자에게 유의미하게 이용 가능한 PEG-커플링 기술 및 PEG-유도체를 제공할 것이다. 예를 들어, 그 전문이 참조로 도입되는 US 특허 번호 6,436,386; 5,932,462; 5,900,461; 5,824,784; 및 4,904,584는 상기 기술 및 유도체, 및 이들의 제조 방법을 기재한다.

특정 구현예에서, 화학선택적 결찰 기술을 이용하여, 예컨대 중합체를 부위-특이적 및 조절되는 방식으로 부착함으로써 본 발명의 AARS 폴리펩티드를 개질할 수 있다. 이러한 기술은 보통 화학적, 또는 재조합 수단에 의해 화학선택적 앵커를 단백질 골격 내로 도입한 뒤 상보적 링커를 수반하는 중합체로 개질하는데 의존한다. 그 결과, 생성 단백질-중합체 콘쥬게이트의 조립 공정 및 공유 구조가 조절되어 약물 특성, 예컨대 유효성 및 약동학적 특성의 합리적 최적화가 가능해진다(예로 [Kochendoerfer, Current Opinion in Chemical Biology 9:555-560, 2005] 참고).

다른 구현예에서, 다른 단백질에 대한 AARS 폴리펩티드의 융합 단백질이 또한 포함되며, 이들 융합 단백질은 AARS 폴리펩티드의 생물학적 활성, 분비, 표적화, 생물학적 수명, 세포막 또는 혈액 뇌 장벽의 투과 능력, 또는 약동학적 특성을 증가시킬 수 있다. 약동학적 특성을 개선하는 융합 단백질("PK 개질제")의 예에는 인간 알부민(Osborn 등: Eur. J. Pharmacol. 456(1-3): 149-158 (2002)), 항체 Fc 도메인, 폴리 Glu 또는 폴리 Asp 서열, 및 트랜스페린에 대한 융합물이 비제한적으로 포함된다. 부가적으로, 아미노산 Pro, Ala, 및 Ser으로 이루어진('PAS화') 입체형태적으로 불규칙한 폴리펩티드 서열 또는 히드록시에틸 전분(상표명 HESYLATION® 하에 시판됨)을 갖는 융합물은 AARS 폴리펩티드의 수력학적 부피를 증가시키기 위한 단순한 방식을 제공한다. 이러한 부가적 연장으로 벌키한 무작위 구조가 채용되며, 이는 생성 융합 단백질의 크기를 크게 증가시킨다. 이러한 수단에 의해, 보통 신장 여과를 통한 더 작은 AARS 폴리펩티드의 신속한 제거가 여러 단위 수준만큼 지연된다. Ig G 융합 단백질의 부가적 사용은 또한 일부 융합 단백질이 혈액 뇌 장벽을 투과할 수 있도록 하는 것으로 나타났다(Fu 등, (2010) Brain Res. 1352:208-13).

세포막을 통한 투과를 개선하는 융합 단백질의 예는 막 전위 서열의 융합물을 포함한다. 이러한 맥락에서, "막 전위 서열"이라는 용어는 세포막에 걸쳐 막 전위가 가능한 천연 생성 및 합성 아미노산 서열을 나타낸다. 대표적인 막 전위 서열은 Tat 단백질, 및 호메오틱 전사 단백질 Antennapedia에서 유도되는 천연 생성 막 전위 서열뿐만 아니라 폴리 아르기닌 및 라이신 잔기에 전체 또는 일부 근거한 합성 막 전위 서열을 포함한다. 대표적인 막 전위 서열은, 예를 들어 하기 특허에 개시된 것들을 포함한다: US5,652,122; US 5,670,617; US5,674,980; US5,747,641; US5,804,604; US6,316,003; US7,585,834; US7,312,244; US7,279,502; US7,229,961; US7,169,814; US7,453,011; US7,235,695; US6,982,351; US6,605,115; US7,306,784; US7,306,783; US6,589,503; US6,348,185; US6,881,825; US7,431,915; WO0074701A2; WO2007111993A2; WO2007106554A2; WO02069930A1; WO03049772A2; WO03106491A2; 및 WO2008063113A1.

가요성 분자 링커(또는 스페이서)가 선택적으로 본원에서 개시되는 AARS 폴리펩티드 및 임의의 융합 단백질 사이에 배치되고 공유 결합시킬 수 있음이 이해될 것이다.

부가적으로 일부 구현예에서, AARS 폴리펩티드는 다른 널리 특징분석된 분비 단백질에서 유도되는 합성, 또는 천연 생성 분비 신호 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 단백질은 단백분해 절단에 의해 처리되어 원 위치에서 AARS 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 이러한 융합 단백질은, 예를 들어 새로운 N-말단 아미노산을 제공하기 위한 유비퀴틴에 대한 AARS 폴리펩티드의 융합물 또는 AARS 폴리펩티드의 세포외 배지 내로의 고수준 분비를 매개하기 위한 분비 신호의 사용, 또는 정제 또는 검출을 개선시키기 위한 N, 또는 C-말단 에피토프 태그의 사용을 포함한다.

본원에서 기재되는 AARS 폴리펩티드는 당분야의 숙련자에게 공지된 임의의 적합한 절차, 예컨대 재조합 기법에 의해 제조될 수 있다. 재조합 제조 방법에 부가하여, 본 발명의 폴리펩티드는 고상 기법을 이용한 직접적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). 단백질 합성은 수동 기법을 이용해서 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어 Applied Biosystems 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer)를 이용해서 달성될 수 있다. 대안적으로, 다양한 단편이 별도로 화학적으로 합성되고 화학적 방법을 이용하여 조합되어 목적 분자를 제조할 수 있다.

IV . AARS 폴리뉴클레오티드

본 발명의 구현예는 이들의 상보물, 변이체, 및 단편에 부가하여 아미노아실-tRNA 합성효소(AARS)의 하나 이상의 새로 동정된 단백질 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, AARS 폴리뉴클레오티드는 아스파르틸 tRNA 합성효소의 스플라이스 변이체, 단백분해 단편, 또는 다른 유형의 단편을 나타내는 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9에 나타낸 바와 같은 AARS 폴리펩티드 참조 서열(들)의 전부 또는 일부를 인코딩한다. 특정 구현예는 이들의 상보물, 변이체, 및 단편에 부가하여 이들 스플라이스 변이체의 하나 이상의 스플라이스 결찰부 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 보통 새롭거나 예외적인 방식으로 엑손을 조합하는 선택된 AARS 스플라이스 변이체의 단독 성질로 인해, AARS 폴리뉴클레오티드 참조 서열은 독특하거나 예외적인 스플라이스 결찰부를 포함한다. 특정 구현예는 대응 전장 AARS 폴리뉴클레오티드를 배제한다.

또한 본 발명의 AARS 폴리뉴클레오티드 내에는 본원에 기재된 바와 같이 이들 참조 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 상보적이거나 이들 참조 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 이들 참조 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 포함하는 프라이머, 탐침, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 RNA 간섭 제제가 포함된다.

본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"이라는 용어는 mRNA, RNA, cRNA, cDNA 또는 DNA를 나타낸다. 용어는 보통 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드의 적어도 10 염기 길이 뉴클레오티드의 중합체성 형태 또는 두 가지 중 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 개질된 형태를 나타낸다. 상기 용어는 DNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 용어 "DNA" 및 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 특정 종의 전체 게놈 DNA에서 단리된 DNA 분자를 나타낸다. 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 DNA 절편은 하나 이상의 코딩 서열을 함유하지만 DNA 절편이 수득된 종의 전체 게놈 DNA에서 실질적으로 단리되거나 정제된 DNA 절편을 나타낸다. 또한 AARS 폴리펩티드를 인코딩하지 않는 비-코딩 폴리뉴클레오티드(예로, 프라이머, 탐침, 올리고뉴클레오티드)가 포함된다. "DNA 절편" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어 내에는 DNA 절편 및 상기 절편의 더 작은 단편, 그리고 또한, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 파지, 바이러스 등을 포함하는 재조합 벡터가 포함된다.

부가적 코딩 또는 비-코딩 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만 반드시 그래야 하는 것은 아니며, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지 재료에 연결될 수 있지만 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열 자체의 길이와는 무관하게 이들의 전체적 길이가 상당히 변할 수 있는 정도로 다른 DNA 서열, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 부가적 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 절편 등과 조합될 수 있다.

따라서 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오티드 단편이 채용될 수 있다는 것이 포함된다; 전체 길이는 바람직하게는 목적하는 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 및 사용의 용이성에 의해 제한된다. AARS 참조 폴리뉴클레오티드의 임의의 부 또는 단편(예로, 약 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드 초과 길이), 또는 그 상보물을 포함하는(예로, 염기 수 X-Y(여기서 X는 약 1-3000 또는 그 초과이고 Y는 약 10-3000 또는 그 초과임)) 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 270, 280, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 또는 그 초과(사이의 모든 정수 포함) 염기 길이의 폴리뉴클레오티드가 포함된다,

본 발명의 구현예는 또한 AARS 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 "변이체"를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 "변이체"는 참조 폴리뉴클레오티드에 관해 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 일반적으로, AARS 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 변이체는 디폴트 파라미터를 이용하여 본원에서 다른 곳에서 기재되는 서열 정렬 프로그램에 의해 결정되는 바와 같이 특정 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 30%, 40% 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 일반적으로 적어도 약 75%, 80%, 85%, 바람직하게는 약 90% 내지 95% 또는 그 초과, 보다 적합하게는 약 98% 또는 그 초과의 서열 동일성을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 변이체는 참조 서열에 대해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100(사이의 모든 정수 포함) 또는 그 초과 염기만큼 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 예컨대 폴리뉴클레오티드 변이체가 비-정규적 활성을 갖는 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 경우, 인코딩된 AARS 폴리펩티드의 목적 활성은 미개질된 폴리펩티드에 대비해 실질적으로 감소되지 않는다. 인코딩된 폴리펩티드의 활성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가된다.

특정 구현예는 후술되는 엄격성 조건 하에 참조 AARS 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이들의 상보물에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 "낮은 엄격성, 중간 엄격성, 높은 엄격성, 또는 매우 높은 엄격성 조건 하에 혼성화한다"라는 용어는 혼성화 및 세척을 위한 조건을 나타낸다. 혼성화 반응의 수행 가이드는 [Ausubel 등, (1998, 상동), Sections 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있다. 수성 및 비-수성 방법이 상기 참조문헌에 기재되며, 어느 방법도 이용될 수 있다.

본원에서 낮은 엄격성 조건이란 42℃에서의 혼성화를 위해 적어도 약 1%v/v 내지 적어도 약 15%v/v 포름아미드 및 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M 염을, 그리고 42℃에서 세척을 위해 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M 염을 포함하는 것이다. 낮은 엄격성 조건은 또한 65℃에서의 혼성화를 위해 1% 소 혈청 알부민(BSA), 1mM EDTA, 0.5M NaHPO₄(pH 7.2), 7% SDS, 및 실온에서의 세척을 위해 (i) 2×SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1mM EDTA, 40mM NaHPO₄(pH 7.2), 5% SDS를 포함할 수 있다. 낮은 엄격성 조건의 한 구현예는 약 45℃에서 6×염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중의 혼성화에 이어 적어도 50℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS 중 2회 세척을 포함한다(세척 온도는 낮은 엄격성 조건을 위해 55℃로 증가될 수 있다).

중간 엄격성 조건은 42℃에서의 혼성화를 위해 적어도 약 16%v/v 내지 적어도 약 30%v/v 포름아미드 및 적어도 약 0.5M 내지 적어도 약 0.9M 염, 그리고 55℃에서의 세척을 위해 적어도 약 0.1M 내지 적어도 약 0.2M 염을 포함한다. 중간 엄격성 조건은 또한 65℃에서의 혼성화를 위해 1% 소 혈청 알부민(BSA), 1mM EDTA, 0.5M NaHPO₄(pH 7.2), 7% SDS, 및 60-65℃에서의 세척을 위해 (i) 2×SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1mM EDTA, 40mM NaHPO₄(pH 7.2), 5% SDS를 포함할 수 있다. 중간 엄격성 조건의 한 구현예는 약 45℃에서 6×SSC 중의 혼성화에 이어 60℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS 중 1회 이상의 세척을 포함한다. 높은 엄격성 조건은 42℃에서의 혼성화를 위해 적어도 약 31%v/v 내지 적어도 약 50%v/v 포름아미드 및 약 0.01M 내지 약 0.15M 염, 그리고 55℃에서의 세척을 위해 약 0.01M 내지 약 0.02M 염을 포함한다.

높은 엄격성 조건은 또한 65℃에서의 혼성화를 위해 1% BSA, 1mM EDTA, 0.5M NaHPO₄(pH 7.2), 7% SDS, 및 65℃를 초과하는 온도에서의 세척을 위해 (i) 0.2×SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1mM EDTA, 40mM NaHPO₄(pH 7.2), 1% SDS를 포함할 수 있다. 높은 엄격성 조건의 한 구현예는 약 45℃에서 6×SSC 중의 혼성화에 이어 65℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS 중 1회 이상의 세척을 포함한다. 매우 높은 엄격성 조건의 한 구현예는 65℃에서 0.5M 인산나트륨, 7% SDS 중에서의 혼성화에 이어 65℃에서 0.2×SSC, 1% SDS 중 1회 이상의 세척을 포함한다.

다른 엄격성 조건은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 당분야 숙련자는 혼성화의 특이성을 최적화하기 위해 다양한 요인을 조작할 수 있음을 인지할 것이다. 최종 세척의 엄격성 최적화는 고도의 혼성화를 보장하는 작용을 할 수 있다. 상세한 예에 대해서는 [Ausubel 등, 상동, pages 2.10.1 내지 2.10.16 및 Sambrook 등, (1989, 상동), sections 1.101 내지 1.104]를 참고하라.

엄격한 세척은 보통 약 42℃ 내지 68℃의 온도에서 수행되지만, 당분야의 숙련자는 다른 온도가 엄격한 조건을 위해 적합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 최대 혼성화 속도는 보통 DNA-DNA 하이브리드의 형성을 위한 T_m보다 약 20℃ 내지 25℃ 낮은 온도에서 일어난다. T_m이 용융 온도, 또는 두 상보적 폴리뉴클레오티드 서열이 해리되는 온도라는 것은 당분야에 널리 공지되어 있다. T_m의 산출 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다 ([Ausubel 등, 상동, page 2.10.8] 참고).

일반적으로, 완벽하게 매치되는 DNA 듀플렉스의 T_m은 하기 공식의 근사로 예측될 수 있다: T_m = 81.5 + 16.6(log₁₀ M) + 0.41(%G+C) - 0.63(%포름아미드) -(600/길이)(여기서, M은 바람직하게는 0.01 몰 농도 내지 0.4 몰 농도 범위의 Na⁺의 농도이고; %G+C는 30% 내지 75% G+C 범위 내의 전체 염기수의 백분율로서의 구아노신 및 시토신 염기의 합이고; %포름아미드는 부피 기준 %포름아미드 농도 백분율이고; 길이는 DNA 듀플렉스 중 염기 쌍의 수이다). 듀플렉스 DNA의 T_m은 무작위로 미스매치되는 염기 쌍의 수가 1% 증가할 때마다 대략 1℃씩 감소한다. 세척은 일반적으로 높은 엄격성에 있어서는 T_m-15℃에서, 또는 중간 엄격성에 있어서는 T_m-30℃에서 수행된다.

혼성화 절차의 한 예에서, 고정화된 DNA를 함유하는 막(예로, 니트로셀룰로오스 막 또는 나일론 막)은 표지된 탐침을 함유하는 혼성화 완충액(50% 탈이온화 포름아미드, 5×SSC, 5×Denhardt 용액(0.1% 피콜, 0.1% 폴리비닐피롤리돈 및 0.1% 소 혈청 알부민), 0.1% SDS 및 200mg/mL 변성된 연어 정자 DNA) 중에 42℃에서 밤새 혼성화된다. 이어서 막은 2회의 순차적 중간 엄격성 세척(즉, 2×SSC, 0.1% SDS로 45℃에서 15분, 이어서 2×SSC, 0.1% SDS로 50℃에서 15분), 이어서 2회의 순차적인 더 높은 엄격성 세척(즉, 0.2×SSC, 0.1% SDS로 55℃에서 12분, 이어서 0.2×SSC 및 0.1% SDS 용액으로 65-68℃에서 12분)을 거친다.

앞서 주지된 바와 같이, 특정 구현예는 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 AARS 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 다른 용도 가운데, 이들 구현예를 이용하여 목적 AARS 폴리펩티드 또는 이들의 변이체를 재조합적으로 제조하거나 선택된 세포 또는 대상체 중에서 AARS 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 당업자는 유전자 코드 방종성의 결과 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 인코딩하는 여러 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드의 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소 상동성을 가질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용에서의 차이로 인해 변하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 인간 및/또는 영장류 코돈 선택을 위해 최적화된 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 구체적으로 포함된다.

따라서, 다중 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 AARS 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 서열은 다양한 이유를 위해 조작될 수 있다. 그 예로는 다양한 개체 중 폴리뉴클레오티드의 발현을 증강시키기 위한 바람직한 코돈의 도입을 비제한적으로 포함한다(일반적으로 [Nakamura 등, Nuc. 산. Res. (2000) 28(1): 292] 참고). 부가적으로, 침묵 돌연변이가 제한 부위의 도입 또는 제거, CpG 디뉴클레오티드 모티브의 밀도 감소(예를 들어 [Kameda 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2006) 349(4): 1269-1277] 참고) 또는 줄기-루프 구조를 형성하는 단일쇄 서열의 능력 감소(예로 [Zuker M., Nucl. Acid Res. (2003); 31(13): 3406-3415] 참고)를 위해 도입될 수 있다. 부가적으로, 포유류 발현은 시작 코돈에 Kozak 공통 서열[즉, (a/g)cc(a/g)ccATGg]을 포함시켜 더욱 최적화될 수 있다. 상기 목적을 위해 유용한 Kozak 공통 서열은 당분야에 공지되어 있다(Mantyh 등, PNAS 92: 2662-2666 (1995); Mantyh 등, Prot. Exp. & Purif. 6,124 (1995)).

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열 자체의 길이와는 무관하게, 이들의 전체 길이가 상당히 변할 수 있는 정도로 다른 DNA 서열, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 부가적 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 절편 등과 조합될 수 있다. 따라서 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오티드 단편이 채용될 수 있다는 것이 포함된다; 전체 길이는 바람직하게는 제조의 용이성 및 목적하는 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 의해 제한된다.

폴리뉴클레오티드 및 이들의 융합물은 당분야에 공지되고 이용 가능한 임의의 다양한 널리 구축된 기법을 이용하여 제조, 조작 및/또는 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드, 또는 이들의 융합 단백질 또는 기능적 균등물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 DNA 분자에서 사용되어 적절한 숙주 세포 중에서 AARS 폴리펩티드의 발현을 지시할 수 있다. 유전자 코드의 내재적 방종성으로 인해, 실질적으로 동일하거나 기능적으로 균등한 아미노산 서열을 인코딩하는 다른 DNA 서열이 제조될 수 있고, 이들 서열을 이용하여 주어진 폴리펩티드를 클로닝 및 발현할 수 있다.

당분야의 숙련자에게 이해될 바와 같이, 일부 경우에는 비-천연 생성 코돈을 보유하는 폴리펩티드 인코딩 뉴클레오티드 서열을 제조하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 특정 원핵 또는 진핵 숙주에 바람직한 코돈이 선택되어 단백질 발현율을 증가시키거나 바람직한 특성, 예컨대 천연 생성 서열에서 생성되는 전사체에 비해 더 긴 반감기를 갖는 재조합 RNA 전사체를 제조할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 통상 "코돈-최적화된" 것으로 불린다. 본원에서 기재되는 임의의 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화된 형태로 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 특정 박테리아, 예컨대 대장균 또는 효모, 예컨대 S. 세레비시애에서의 사용을 위해 코돈 최적화될 수 있다(예로, [Burgess-Brown 등, Protein Expr Purif. 59:94-102, 2008; Ermolaeva MD (2001) Curr. Iss. Mol. Biol. 3 (4) 91-7; Welch 등, PLoS ONE 4(9): e7007 doi:10.1371/journal.pone.0007002] 참고).

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 산물의 클로닝, 처리, 발현 및/또는 활성을 개질하는 변형을 비제한적으로 포함하는, 다양한 이유로 폴리펩티드 인코딩 서열을 변형하기 위해 당분야에 일반적으로 공지된 방법을 이용하여 조작될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 대상체 생체 내로, 예로 유전자 치료 기법을 이용하여 전달될 수 있다. 유전자 치료란 일반적으로 상기 치료가 필요한 장애 또는 상태를 갖는 포유류, 특히 인간의 특정 세포, 표적 세포에 대한 이종성 핵산의 전달을 나타낸다. 핵산은 이종성 DNA가 발현되고 이에 의해 인코딩된 치료적 산물이 제조되도록 하는 방식으로 선택된 표적 세포 내로 도입된다.

본원에서 교시하는 바와 같이 유전자 치료를 위해 이용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 박시니아, 아데노-연관 바이러스(AAV), 또는 바람직하게는 RNA 바이러스, 예컨대 레트로바이러스를 포함한다. 바람직하게는 레트로바이러스 벡터는 설치류 또는 조류 레트로바이러스의 유도체이거나 렌티바이러스 벡터이다. 바람직한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 단일 외래 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 몰로니 설치류 백혈병 바이러스(MoMuLV), 하베이 설치류 육종 바이러스(HaMuSV), 설치류 유방암 바이러스(MuMTV), SIV, BIV, HIV 및 라우스 육종 바이러스(RSV). 여러 부가적 레트로바이러스 벡터는 다중 유전자를 도입할 수 있다. 이들 벡터는 모두 형질도입된 세포가 동정되거나 생성될 수 있도록 선택적 마커에 대한 유전자를 전달하거나 도입할 수 있다. 예를 들어, 특정 표적 세포 상 수용체에 대한 리간드를 인코딩하는 다른 유전자와 함께, 바이러스 벡터 내로 아연 핑거 유도-DNA 결합 관심 폴리펩티드 서열을 삽입함으로써, 벡터는 표적 특이적으로 될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는, 예를 들어 단백질(이량체)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 표적 특이적으로 될 수 있다. 예시적 표적화는 레트로바이러스 벡터를 표적화하는 항체를 이용하여 달성될 수 있다. 당분야의 숙련자는 과도한 실험 없이 아연 핑거-뉴클레오티드 결합 단백질 폴리뉴클레오티드를 함유하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특이적 전달을 허용하기 위해 레트로바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있는 특정 폴리뉴클레오티드 서열을 인지하거나 쉽게 인지할 수 있을 것이다.

재조합 레트로바이러스는 결함이 있으므로, 이들이 감염성 벡터 입자를 제조하기 위해서는 보조가 필요하다. 이러한 보조는, 예를 들어 LTR 내 조절 서열의 조절 하에 레트로바이러스의 전체 구조 유전자를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 헬퍼 세포주를 이용함으로써 제공될 수 있다. 이들 플라스미드는 캡슐화를 위한 RNA 전사체를 인지하기 위한 패키징 기전을 가능케 하는 뉴클레오티드 서열이 없다. 패키징 신호가 결실된 헬퍼 세포주는, 예를 들어 비제한적으로 PSI.2, PA317 및 PA12를 포함한다. 이들 세포주는 게놈이 패키지되지 않으므로 빈 비리온을 제조한다. 패키징 신호는 온전하지만 구조 유전자가 다른 관심 유전자로 대체된 이러한 세포 내로 레트로바이러스 벡터가 도입되는 경우, 벡터가 패키지되고 벡터 비리온이 제조될 수 있다. 이어서 상기 방법으로 제조된 벡터 비리온을 이용하여 조직 세포주, 예컨대 NIH 3T3 세포를 감염시켜 다량의 키메라성 레트로바이러스 비리온을 제조할 수 있다.

예를 들어, DNA-리간드 복합체, 아데노바이러스-리간드-DNA 복합체, DNA의 직접 주입, CaPO₄ 침전, 유전자 총 기법, 전기천공, 리포좀, 리포펙션 등을 포함하는 유전자 치료를 위한 "비-바이러스" 전달 기법을 또한 이용할 수 있다. 임의의 이들 방법은 당분야의 숙련자에게 널리 이용 가능하며, 본 발명에서 사용하기에 적합할 것이다. 다른 적합한 방법이 당분야의 숙련자에게 이용 가능하며, 본 발명이 임의의 이용 가능한 전달감염 방법을 이용하여 달성될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 리포펙션은 단리된 DNA 분자를 리포좀 입자 내로 캡슐화하고 리포좀 입자를 표적 세포의 세포막과 접촉시켜 달성될 수 있다. 리포좀은 양친매성 분자, 예컨대 포스파티딜 세린 또는 포스파티딜 콜린으로 이루어진 지질 이중층이 친수성 내부를 둘러싸도록 일부 주위 매질을 캡슐화하는 자기 조립성 콜로이드 입자이다. 단층 또는 다층 리포좀은 내부가 목적 화학제, 약물, 또는 본 발명에서와 같이 단리된 DNA 분자를 함유하도록 구축될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 AARS 폴리펩티드를 세포 요법을 통해 발현 및 전달할 수 있다. 따라서 다른 측면에서, 본 발명은 AARS 폴리펩티드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포의 투여를 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세포 요법을 포함한다.

세포 요법은 신체 밖에서 선택되고, 증폭되고, 약리학적으로 처리 또는 변형된(즉 유전적으로 개질된) 세포의 투여가 관여된다(Bordignon, C. 등, Cell Therapy: Achievements and Perspectives (1999), Haematologica, 84, pp.1110-1149). 이러한 숙주 세포는, 예를 들어 AARS 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 개질된 대식구, 및 줄기 세포를 포함하는 일차 세포를 포함한다. 세포 요법의 목적은 손상된 조직 또는 기관의 생물학적 기능을 대체, 수선 또는 증강시키기 위함이다.

이식된 세포의 사용은 여러 내분비 장애, 예컨대 빈혈 및 왜소증, 혈액학적 장애, 신장 및 간 부전, 뇌하수체 및 CNS 결핍증 및 당뇨병의 치료를 위해 조사되었다(Uludag 등, Technology of Mammalian Cell Encapsulation (2000), Advanced Drug Delivery Reviews, 42, pp. 29-64). 이식된 세포는 효과를 내는 시스템에 부재하거나 불충분한 양으로 생성되는 내인성 AARS 폴리펩티드를 대체하기 위해 생물활성 화합물, 예컨대 본 발명의 AARS 폴리펩티드를 방출함으로써 기능할 수 있다.

본 발명의 구현예는 또한 검출, 증폭, 안티센스 요법, 또는 다른 목적을 위한 것인지 여부와 상관없이 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이들 및 관련 목적을 위해, "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고" 또는 "올리고머"라는 용어는 단수의 "올리고뉴클레오티드"뿐만 아니라 복수의 "올리고뉴클레오티드"를 포함하려는 것이며, 본 발명의 증폭 방법뿐만 아니라 후속 검출 방법에서 시약으로 사용되는 둘 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 뉴클레오염기 또는 관련 화합물의 임의 중합체를 나타낸다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 및/또는 RNA 및/또는 이들의 유사체일 수 있다.

올리고뉴클레오티드라는 용어는 반드시 시약에 대한 임의의 특정 기능을 나타내는 것이 아니며, 본원에서 기재되는 이러한 모든 시약을 일반적으로 커버하기 위해 사용된다. 올리고뉴클레오티드는 다양한 상이한 기능을 나타낼 수 있다, 예로 상보쇄와 혼성화할 수 있고 핵산 폴리머라아제의 존재 하에 추가 연장될 수 있는 경우 프라이머로서 기능할 수 있으며, RNA 폴리머라아제에 의해 인지되고 전사를 허용하는 서열을 함유하는 경우 프로모터를 제공할 수 있고, 적절히 놓이고/놓이거나 개질되는 경우 혼성화를 방지하거나 프라이머 연장을 방해하는 기능을 할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 탐침, 또는 안티센스 제제로 기능할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예로 증폭 반응에서, 증폭 반응의 증폭 산물 검출에서, 또는 안티센스 또는 RNA 간섭 용도에서의 그 특정 기능에 의해서만 제한되며, 실제로 모든 길이일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오티드를 프라이머, 탐침, 안티센스 올리고머, 또는 RNA 간섭 제제로 사용할 수 있다.

본원에서 사용되는 "프라이머"라는 용어는 4가지 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합을 위한 제제, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리머라아제 또는 역전사효소의 존재 하에, 예를 들어 완충액 및 온도로 정의되는 적합한 조건 하에서 주형으로 지시되는 DNA 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있는 단일쇄 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 프라이머의 길이는 임의의 주어진 경우에, 예를 들어 프라이머의 목적 용도에 의존하며 일반적으로 약 15 내지 30 뉴클레오티드 범위이지만, 더 짧거나 더 긴 프라이머를 사용할 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정한 하이브리드 복합체를 형성하기 위해 더 저온을 필요로 한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영해야 할 필요는 없지만, 이러한 주형과 혼성화하기 위해 충분히 상보적이어야 한다. 프라이머 부위는 프라이머가 혼성화하는 주형의 영역이다. 프라이머쌍은 증폭될 서열의 5' 말단과 혼성화하는 5' 상류 프라이머 및 증폭될 서열의 3' 말단의 상보물과 혼성화하는 3' 하류 프라이머를 포함하는 프라이머 세트이다.

본원에서 사용되는 "탐침"이라는 용어는 표면-고정화되거나 가용성이지만 특정 표적에 의해 인식될 수 있는 고정화될 수 있는 분자를 포함한다. 예로, 10, 12, 및 그 초과 염기를 갖는 모든 가능한 탐침 조합을 갖는 어레이의 예에 대해서는 U.S. 특허 번호 6,582,908을 참고하라. 본원에서 사용되는 탐침 및 프라이머는 보통 공지된 서열의 적어도 10-15 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 특이성을 증강시키기 위해, 더 긴 탐침 및 프라이머, 예컨대 AARS 참조 서열 또는 그 상보물의 적어도 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 적어도 150 뉴클레오티드를 포함하는 탐침 및 프라이머를 또한 채용할 수 있다. 탐침 및 프라이머는 이들 예에서보다 훨씬 더 길 수 있고, 표, 도, 및 서열 목록을 포함하는 명세서 및 당분야의 지식에 의해 지지되는 임의의 길이를 이용할 수 있음이 이해된다.

탐침 및 프라이머의 제조 및 사용 방법은 참조문헌, 예를 들어 [Sambrook, J. 등, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview N.Y.; Ausubel, F. M. 등, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York N.Y.; Innis, M. 등, (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego Calif]에 기재되어 있다. PCR 프라이머쌍은, 예를 들어 Primer(버전 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge Mass.)와 같이 해당 목적을 위한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 공지된 서열로부터 유도될 수 있다.

프라이머 또는 탐침으로 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 당분야에 공지된 소프트웨어를 이용하여 선택될 수 있다. 예를 들어, OLIGO 4.06 소프트웨어는 각각 최대 100 뉴클레오티드의 PCR 프라이머쌍의 선택을 위해, 그리고 최대 32 킬로염기의 입력 폴리뉴클레오티드 서열로부터 최대 5,000 뉴클레오티드의 더 큰 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드의 분석을 위해 유용하다. 유사한 프라이머 선택 프로그램은 확장된 역량을 위한 부가적 특징을 도입한다. 예를 들어, PrimOU 프라이머 선택 프로그램(University of Texas South West Medical Center(Dallas Tex.)의 게놈 센터에서 공개 이용 가능함)은 메가염기 서열로부터 특이적 프라이머를 선택할 수 있으며, 따라서 게놈 범위 규모에서 프라이머를 설계하는데 유용하다.

Primer3 프라이머 선택 프로그램(게놈 연구를 위한 Whitehead Institute/MIT Center(Cambridge Mass.)에서 공개 이용 가능함)은 프라이머 결합 부위로서 회피하기 위한 서열이 사용자 지정되는 "미스프라이밍 라이브러리"를 사용자가 입력할 수 있도록 해준다. Primer3은 특히 마이크로어레이를 위한 올리고뉴클레오티드의 선택을 위해 유용하다(후자의 두 프라이머 선택 프로그램에 대한 소스 코드는 또한 이들 각각의 소스로부터 수득되고 사용자의 특정 용도에 부합하도록 개질될 수 있다). PrimeGen 프로그램(UK 인간 게놈 맵핑 프로젝트 리소스 센터(Cambridge UK)에서 공개 이용 가능함)은 다중 서열 정렬에 근거하여 프라이머를 설계함으로써 정렬된 핵산 서열의 가장 많이 보존되거나 가장 적게 보존된 영역에 혼성화하는 프라이머의 선택을 허용한다. 따라서, 상기 프로그램은 독특하고 보존된 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 단편 모두의 동정을 위해 유용하다. 임의의 상기 선택 방법에 의해 동정된 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 단편은 핵산 표본 중 전체적 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 동정하기 위한 혼성화 기술, 예를 들어 PCR 또는 서열분석 프라이머, 마이크로어레이 요소, 또는 특이적 탐침으로서 유용하다. 올리고뉴클레오티드 선택 방법은 본원에 기재된 것들에 제한되지 않는다.

특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 혼합물 또는 비하전된 양이온성 골격 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성에 대해 하기 및 상기 언급된 참조문헌에서 상세히 설명된 방법을 채용하여 단계식 고상 합성에 의해 제조될 수 있다. 일부 경우에서, 예로 화합물의 약동학을 증강시키거나 포획 또는 검출을 촉진하기 위해 올리고뉴클레오티드에 부가적 화학 부분을 부가하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 부분은 표준 합성 방법에 따라 보통 올리고머의 말단으로 공유 부착될 수 있다. 예를 들어, 10-100 단량체성 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌글리콜 부분 또는 다른 친수성 중합체의 부가는 용해도 증강에 유용할 수 있다. 하나 이상의 하전된 기, 예로 음이온성으로 하전된 기, 예컨대 유기 산은 세포 흡수를 증강시킬 수 있다.

다양한 검출 가능한 분자, 예컨대 직접(예로, 광 방출에 의해) 또는 간접(예로, 형광-표지된 항체의 결합에 의해) 검출될 수 있는 방사선 동위원소, 형광색소, 염료, 효소, 나노입자, 화학발광 마커, 바이오틴, 또는 다른 단량체를 이용하여 올리고뉴클레오티드, 또는 단백질을 검출 가능하게 만들 수 있다.

방사선 동위원소는 본 발명의 특정 구현예에서 이용될 수 있는 검출 가능한 분자의 예를 제공한다. 예를 들어, ³²P, ³³P, ³⁵S, ³H, 및 ¹²⁵I를 포함하는 몇몇 방사선 동위원소를 뉴클레오티드 또는 단백질의 표지를 위해 검출 가능한 분자로 이용할 수 있다. 이들 방사선 동위원소는 특정 프로토콜의 필요에 따라 맞춤화될 수 있는 상이한 반감기, 붕괴 유형, 및 에너지 수준을 갖는다. 예를 들어, ³H는 낮은 배경 수준을 일으키는 낮은 에너지 방출기이지만, 이러한 낮은 에너지는 또한 자가 방사선 기록에 있어 더 긴 시기로 이어진다. 방사활성 표지된 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 및 아미노산은 상업적으로 이용 가능하다. 제 1, 또는 α포스페이트 기, 또는 제 3, 또는 γ 포스페이트 기에 방사활성 표지된 뉴클레오티드가 이용 가능하다. 예를 들어, [α-³²P]dATP 및 [γ-³²P]dATP가 모두 상업적으로 이용 가능하다. 부가적으로, 방사활성 표지된 뉴클레오티드에 대한 상이한 특이적 활성이 또한 상업적으로 이용 가능하며, 상이한 프로토콜에 대해 맞춤화될 수 있다.

올리고뉴클레오티드를 검출하기 위해 사용될 수 있는 검출 가능한 분자의 다른 예는 형광단을 포함한다. 예를 들어, 플루오레신, 테트라메틸로다민, 텍사스 레드, 및 여러 다른 것들을 포함하는 몇몇 형광단을 뉴클레오티드의 표지에 사용할 수 있다(예로, [Haugland, Handbook of Fluorescent Probes - 9th Ed., 2002, Molec. Probes, Inc., Eugene OR; Haugland, The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies-10th Ed., 2005, Invitrogen, Carlsbad, CA] 참고.

하나의 예로서, 뉴클레오티드 합성 동안 아민 또는 티올의 도입이 형광단의 부가를 허용하므로, 올리고뉴클레오티드는 화학적 합성 동안 형광 표지될 수 있다. 형광 표지된 뉴클레오티드는 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 스펙트럼을 커버하기 위해 10가지 상이한 형광단에 콘쥬게이션된 유리딘 및 데옥시유리딘 트리포스페이트가 이용 가능하다. 뉴클레오티드에 직접 결합될 수 있는 형광 염료가 또한 검출 가능한 분자로 사용될 수 있다. 예를 들어, FAM, JOE, TAMRA, 및 ROX는 뉴클레오티드에 부착된 아민 반응성 형광 염료이며, 자동화된 DNA 서열분석에서 사용된다. 이들 형광 표지된 뉴클레오티드, 예를 들어, ROX-ddATP, ROX-ddCTP, ROX-ddGTP 및 ROX-ddUTP는 상업적으로 이용 가능하다.

비-방사활성 및 비-형광 검출 가능 분자가 또한 이용 가능하다. 앞서 주지된 바와 같이, 바이오틴이 뉴클레오티드에 직접 부착되어 비색 반응을 촉매하는 효소(예컨대 포스파타아제, 루시퍼라아제, 또는 페록시다아제)에 화학적으로 커플링된 애비딘 또는 스트렙타비딘에 대한 특이적이고 높은 친화도 결합에 의해 검출될 수 있다. 디곡시제닌 표지된 뉴클레오티드는 또한 핵산의 비-동위원소성 검출을 위해 유사하게 사용될 수 있다. 바이오틴화되고 디곡시제닌-표지된 뉴클레오티드는 상업적으로 이용 가능하다.

나노입자로 불리는 매우 작은 입자도 또한 올리고뉴클레오티드 탐침을 표지하는데 사용될 수 있다. 이들 입자는 1-1000nm 크기 범위이며, 다양한 화학적 구조, 예컨대 금 및 은 입자 및 컨텀 도트를 포함한다. 각을 가지고 백색 입사광으로 조사되는 경우, 40-120nm 범위의 은 또는 금 나노입자는 높은 강도로 단색 광을 산란할 것이다. 산란 광의 파장은 입자의 크기에 의존한다. 매우 가까운 4 내지 5가지 상이한 입자는 각각 단색 광을 산란할 것이며, 이들은 적층되는 경우 특정하고 독특한 색상을 나타낼 것이다. 입자는 Genicon Sciences(Carlsbad, CA)와 같은 회사들에서 제조된다. 유도체화된 은 또는 금 입자는 단백질, 항체, 소분자, 수용체 리간드, 및 핵산을 포함하는 다양한 분자 어레이에 부착될 수 있다. 예를 들어, 입자 표면은 화학적으로 유도체화되어 뉴클레오티드에 대한 부착을 허용할 수 있다.

검출 가능한 분자의 검출을 위해 사용될 수 있는 다른 유형의 나노입자는 퀀텀 도트를 포함한다. 퀀텀 도트는 넓은 범위의 파장에 걸쳐 빛에 의해 여기될 수 있는 1-5nm 지름의 형광 결정이다. 적절한 파장을 갖는 빛에 의해 여기 시, 이들 결정은 이들의 화학적 조성 및 크기에 근거한 파장을 갖는 광, 예컨대 단색 광을 방출한다. 퀀텀 도트, 예컨대 CdSe, ZnSe, InP, 또는 InAs는 독특한 광학적 특성을 보유한다; 이들 및 유사한 퀀텀 도트는 여러 상업적 원천에서 이용 가능하다(예로, NN-Labs, Fayetteville, AR; Ocean Nanotech, Fayetteville, AR; Nanoco Technologies, Manchester, UK; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

수십 가지 클래스의 입자를 퀀텀 도트 결정의 크기 클래스의 수에 따라 생성할 수 있다. 결정의 크기 클래스는 1) 각각의 목적하는 입자 크기 클래스를 생성하기 위한 결정 형성 파라미터의 엄격한 조절에 의해, 또는 2) 느슨하게 조절되는 결정 형성 파라미터 하의 결정 배치 생성 후 목적 크기 및/또는 방출 파장에 따른 정렬에 의해 생성된다. 퀀텀 도트가 반도체 광 방출/검출 장치의 내재적 규소 에피택셜층 내에 구현된 2 참조문헌의 예는 미국 특허 번호 5,293,050 및 5,354,707(Chapple Sokol 등)이다.

특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 탐침은 하나 이상의 광-방출 또는 다른 방식으로는 검출 가능한 염료로 표지될 수 있다. 염료에 의해 방출되는 광은 가시광 또는 비가시광, 예컨대 자외선 또는 적외선일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 염료는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 염료; 잔텐 염료, 예컨대 플루오레신 및 로다민; 알파 또는 베타 위치에 아미노기를 갖는 염료(예컨대 나프틸아민 염료, 1-디메틸아미노나프틸-5-설포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌데 설포네이트 및 2-p-톨루이디닐-6-나프탈렌 설포네이트); 3-페닐-7-이소시아나토쿠마린을 갖는 염료; 아크리딘, 예컨대 9-이소티오시아나토아크리딘 및 아크리딘 오렌지; 피렌, 벤족사디아졸 및 스틸벤; 3-(ε-카르복시펜틸)-3'-에틸-5,5'-디메틸옥사카르보시아닌(CYA)을 갖는 염료; 6-카르복시 플루오레신(FAM); 5&6-카르복시로다민-110(R110); 6-카르복시로다민-6G(R6G); N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA); 6-카르복시-X-로다민(ROX); 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신(JOE); ALEXA FLUOR™; Cy2; 텍사스 레드 및 로다민 레드; 6-카르복시-2',4,7,7'-테트라클로로플루오레신(TET); 6-카르복시-2',4,4',5',7,7'-헥사클로로플루오레신(HEX); 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레신(ZOE); NAN; NED; Cy3; Cy3.5; Cy5; Cy5.5; Cy7; 및 Cy7.5; IR800CW, ICG, Alexa Fluor 350; Alexa Fluor 488; Alexa Fluor 532; Alexa Fluor 546; Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 680, 또는 Alexa Fluor 750일 수 있다.

본 발명의 AARS 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 본원에서 기재되는 임의의 치료적, 진단적, 연구, 또는 약물 발견 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.

V. 항체

다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 AARS 폴리펩티드, 또는 그 천연 세포 결합 파트너(즉 세포 수용체, 지질, 탄수화물, 단백질, 또는 핵산 결합 파트너), 또는 이들의 복합체에 대한 결합 특이성을 나타내는 항체, 및 그 사용 방법을 제공한다. 항체라는 용어는 본원에 기재된 바와 같고 당분야에 공지된 그 다양한 변화, 예컨대 FAB, 인간 항체, 개질된 인간 항체, 단일쇄, 비인간 항체, 및 항원에 대한 면역계 리간드의 근거가 되는 면역글로불린 폴딩을 갖는 다른 유도체를 포함한다. 항체는 본원에서 제공되는 임의의 치료적, 진단적, 약물 발견, 또는 단백질 발현/정제 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.

본 발명의 특정 항체는 보통 대응 전장 AARS 대비 AARS 단백질 단편에 대해 더 큰 친화도를 갖는 결합에 의해 표(들) 1-3, 또는 표(들) 4-6, 또는 표(들) 7-9의 AARS 단백질 단편 및 이들의 대응 전장 AARS 간을 구별할 수 있기 때문에, 이전에 제조된 특정 항체와 상이하다. 일반적으로 이러한 항체는 본 발명의 AARS 단백질 단편을 생성하는 스플라이스 변화, 단백분해, 또는 다른 세포 처리(예로, 단백질 구조를 변화시키는 인산화 및 다른 개질을 비제한적으로 포함하는 번역 후 처리)에 의해 생성되거나 드러나는 독특한 서열 또는 구조에 결합할 수 있다. 일부 측면에서, 항체는 독특한 스플라이스 결찰부의 근처 서열에(예를 들어 표 2B, 5B, 또는 8B에 열거된 스플라이스 결찰부 서열에서 선택된 적어도 5개의 인접 아미노산의 하나 이상의 영역으로, 또는 대안적으로, 예를 들어 표 2B, 5B, 또는 8B에 열거된 바와 같은 상기 스플라이스 부위의 임의의 아미노산 서열 C-말단으로) 결합할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 AARS 단백질 단편에는 노출되어 있지만 전장 AARS에는 노출되어 있지 않은 하나 이상의 비-용매 노출면에 대한 전장 AARS에서 발견되지 않거나 다른 방식으로 접근할 수 없는 서열에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다. 항체는 또한 AARS 단백질 단편 및 전장 AARS 간 폴딩 차이에서 기인하는 독특한 3차원 구조에 결합할 수 있다. 이러한 폴딩 차이는 편재되거나(예로, 특정 도메인 또는 영역에) 또는 전체화될 수 있다. 하나의 예로서, AARS 단백질 단편의 폴딩은 대응 또는 부모 AARS에서 발견되지 않는 독특한 연속적 또는 불연속적 에피토프를 생성할 수 있다. 그 예는 또한 스플라이스 변화, 단백분해, 또는 다른 세포 처리에 의해 생성되는 N- 또는 C-말단에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다; 상기 말단은 전장 AARS에 비해 독특할 수 있고, 또는 이들의 말단이 더 큰 AARS 부모 분자의 전체 구조에 전체적으로 또는 부분적으로 묻혀 있기 때문에 전장 버전에서는 항체 결합을 위해 노출되지 않을 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 응집물을 형성하지 않으며, 원하는 용해도를 가지고, 및/또는 본원에 기재된 바와 같고 당분야에 공지된 인간에서의 사용에 적합한 면역원성 프로필을 갖는다. 또한 예컨대 본원에서 기재된 AARS 단백질 단편을 정제하기 위한 제조 작업에 적합한 항체가 포함된다. 바람직하게는, 활성 항체는 적어도 약 10mg/ml로 농축될 수 있으며, 생체치료 용도를 위해 선택적으로 제형화될 수 있다.

특정 구현예에서, 항체는 본 발명의 AARS 폴리펩티드에 의해 매개되는 하나 이상의 비-정규적 활성의 조정에 유효하다. 특정 구현예에서, 예를 들어 항체는 AARS 폴리펩티드 및/또는 그 결합 파트너에 결합하고, 서로 상호반응하는 이들의 능력을 저해하고, 및/또는 AARS 폴리펩티드의 비-정규적 활성을 길항하는 것이다. 특정 구현예에서, 예를 들어 항체는 AARS 폴리펩티드의 세포 결합 파트너에 결합하며, 예컨대 AARS 폴리펩티드에 의해 매개되는 비-정규적 활성을 증가 또는 작동시킴으로써 AARS 폴리펩티드 활성을 모사한다. 따라서, 항체는, 예컨대 부분적으로 또는 전체적으로 그 활성을 길항 또는 작동시킴으로써 본 발명의 AARS 폴리펩티드에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 다른 상태를 진단, 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.

항체, 또는 이들의 항원-결합 단편은 이것이 폴리펩티드와 검출 가능한 수준(예를 들어, ELISA 분석 내에서)으로 결합하고 유사한 조건 하에 미관련 폴리펩티드와 통계적으로 유의미한 방식으로 검출 가능하게 반응하지 않는 경우, 본 발명의 폴리펩티드에 "특이적으로 결합한다", "면역학적으로 결합한다" 및/또는 "면역학적으로 반응성이다"라고 불린다. 특정 예에서, 결합 제제는 AARS 폴리펩티드의 전장 버전과 유의미하게 상호반응하지 않는다.

이러한 맥락에서 이용되는 바와 같은 면역학적 결합은 일반적으로 면역글로불린 분자 및 면역글로불린이 특이적인 항원 사이에 일어나는 유형의 비-공유 상호반응을 나타낸다. 결합, 예컨대 면역학적 결합 상호반응의 강도 또는 친화도는 상호반응의 해리 상수(K_d)의 관점으로 표현될 수 있으며, 여기서 더 작은 K_d가 더 큰 친화도를 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 정량화할 수 있다. 예로 [Davies 등, (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473]을 참고하라. 특정한 예시적 구현예에서, 항체는 AARS 단백질 단편에 대해 적어도 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 또는 50nM의 친화도를 갖는다. 특정 구현예에서, AARS 단백질 단편에 대한 항체의 친화도는 대응 전장 AARS 폴리펩티드에 대한 그 친화도에 비해 보통 약 1.5x, 2x, 2.5x, 3x, 3.5x, 4x, 4.5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1000x 또는 그 초과(사이의 모든 정수 포함)만큼 더 크다. 특정 구현예에서, 대응 전장 AARS 단백질에 대한 항체의 친화도는 적어도 약 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20μM이다. 특정 구현예에서, 항체는 전장 AARS 단백질에 대해 약하게 또는 실질적으로 검출 불가능하게 결합한다.

항체의 "항원-결합 부위" 또는 "결합부"는 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 일부를 나타낸다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기로 형성된다. 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내 3 고분기형 연신물은 "틀 영역" 또는 "FR"로 공지되는 더 잘 보존된 측면 연신물 사이에 배치된 "고가변 영역"으로 불린다. 따라서 "FR"이라는 용어는 면역글로불린에서 고가변 영역 사이 및 근처에서 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 나타낸다. 항체 분자에서, 경쇄의 3 고가변 영역 및 중쇄의 3 고가변 영역은 3차원 공간에서 서로에 대해 배치되어 항원-결합 표면을 형성한다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적이며, 각각의 중쇄 및 경쇄의 3 고가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로 불린다.

항체는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기법으로 제조될 수 있다. 예로, [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]을 참고하라. 관심 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체는, 예를 들어 [Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976]의 기법 및 이에 대한 개선을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 인간 항체를 발현하기 위한 유전자 삽입 동물, 예컨대 마우스를 이용하는 방법이 포함된다. 예로 [Neuberger 등, Nature Biotechnology 14:826, 1996; Lonberg 등, Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101, 1994; 및 Lonberg 등, Internal Review of Immunology 13:65-93, 1995]를 참고하라. 특정 예로는 REGERNEREX®에 의한 VELOCIMMUNE® 플랫폼을 포함한다(예로 U.S. 특허 번호 6,596,541을 참고하라). 항체는 또한 파지 디스플레이 또는 효모 디스플레이 라이브러리를 이용하여 생성되거나 동정될 수 있다(예로 U.S. 특허 번호 7,244,592; [Chao 등, Nature Protocols. 1:755-768, 2006]을 참고하라). 이용 가능한 라이브러리의 비제한적 예는 클로닝된 또는 합성 라이브러리, 예컨대 인간 항체 레퍼토리의 구조적 다양성을 7개 중쇄 및 7개 경쇄 가변 영역 유전자에 의해 나타내는 인간 조합 항체 라이브러리(HuCAL)를 포함한다. 이들 유전자의 조합은 마스터 라이브러리에 49개 틀을 만들어 낸다. 이들 틀 상에 고가변 유전 카세트(CDR = 상보성 결정 영역)를 중첩함으로써, 다양한 인간 항체 레퍼토리가 재현될 수 있다. 또한 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 인간-공여자 유래 단편, 중쇄 CDR-3, 중쇄 CDR-1의 다양성을 인코딩하는 합성 DNA, 및 중쇄 CDR-2의 다양성을 인코딩하는 합성 DNA를 갖도록 설계된 인간 라이브러리가 포함된다. 사용에 적합한 다른 라이브러리는 당분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 단계의 정제 공정에서 사용될 수 있다.

"Fv" 단편은 IgM, 그리고 드문 경우에는 IgG 또는 IgA 면역글로불린 분자의 선호적 단백분해 절단에 의해 제조될 수 있다. 그러나 Fv 단편은 당분야에 공지된 재조합 기법을 이용하여 보다 일반적으로 유도된다. Fv 단편은 천연 항체 분자의 항원 인식 및 결합 능력의 상당부를 보유하는 항원-결합 부위를 포함하는 비-공유 V_H::V_L 이종이량체를 포함한다. 예로 [Inbar 등, (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman 등, (1976) Biochem 15:2706-2710; 및 Ehrlich 등, (1980) Biochem 19:4091-4096]을 참고하라.

단일쇄 Fv("sFv") 폴리펩티드는 펩티드-인코딩 링커로 연결된 V_H- 및 V_L-인코딩 유전자를 포함하는 유전자 융합물에서 발현되는 공유 연결된 V_H::V_L 이종이량체이다[Huston 등, (1988) PNAS USA. 85(16):5879-5883]. 천연 응집되었지만 화학적으로 분리된 항체 V 영역의 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 항원-결합 부위 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조로 폴딩할 sFv 분자로 전환하기 위한 화학적 구조를 식별하는 여러 방법이 설명되었다. 예로, U.S. 특허 번호 5,091,513 및 5,132,405(Huston 등); 및 U.S. 특허 번호 4,946,778(Ladner 등)을 참고하라.

각각의 상술된 분자는 각각 CDR에 대한 지지를 제공하고 서로에 대해 CDR의 공간적 상관관계를 정의하는 중쇄 및 경쇄 FR 세트 사이에 배치된 중쇄 및 경쇄 CDR 세트를 포함한다. 본원에서 사용되는 "CDR 세트"라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3 고가변 영역을 나타낸다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에서 시작하여, 이들 영역은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"로 표시된다. 따라서 항원-결합 부위는 각각의 중쇄 또는 경쇄 V 영역에서 유래되는 CDR 세트를 포함하는 6 CDR을 포함한다. 단일 CDR(예로, CDR1, CDR2 또는 CDR3)을 포함하는 폴리펩티드는 본원에서 "분자적 인식 단위"로 불린다. 여러 항원-항체 복합체의 결정학적 분석은 CDR의 아미노산 잔기가 결합된 항원과 광범위한 접촉을 형성하며, 대부분의 광범위한 항원 접촉은 중쇄 CDR3과 일어난다는 것을 드러내었다. 따라서 분자 인식 단위가 항원-결합 부위의 특이성에 일차적으로 관여한다.

본원에서 사용되는 "FR 세트" 라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 CDR 세트의 CDR 틀을 형성하는 4 인접 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 FR 잔기는 결합된 항원과 접촉할 수 있다; 그러나 FR, 특히 CDR에 직접 인접한 FR 잔기는 일차적으로 V 영역의 항원-결합 부위 내로의 폴딩에 관여한다. FR 내에서, 특정 아미노 잔기 및 특정 구조적 특징은 매우 고도로 보존된다. 이에 관해, 모든 V 영역 서열은 약 90 아미노산 잔기의 내부 디설피드 루프를 함유한다. V 영역이 결합-부위 내로 폴딩하면, CDR은 항원-결합 표면을 형성하는 돌출하는 루프 모티브로서 디스플레이된다. 이는 일반적으로 정확한 CDR 아미노산 서열과는 무관하게 특정하게 CDR 루프의 "정규적" 구조로의 폴딩된 형태에 영향을 미치는 FR의 보존된 구조적 영역이 존재하는 것으로 인식된다. 또한, 특정 FR 잔기는 항체 중쇄 및 경쇄의 상호반응을 안정화하는 비-공유 도메인간 접촉에 참여하는 것으로 공지되어 있다.

특정 구현예는 단일 단량체성 가변 항체 도메인으로 구성된 항체 단편을 나타내는 단일 도메인 항체(sdAb 또는 "나노바디")를 포함한다(예로 U.S. 특허 번호 5,840,526; 5,874,541; 6,005,079, 6,765,087, 5,800,988; 5,874,541; 및 6,015,695 참고). 이러한 sdAB는 보통 약 12-15 kDa의 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, sdAB 및 다른 항체 분자는 종종 카멜리드로 불리는 면역화된 낙타 및 라마의 독특한 중쇄 항체에서 유도 또는 단리될 수 있다. 예로 [Conrath 등, JBC. 276:7346-7350, 2001]을 참고하라.

인간 불변 도메인에 융합된 설치류 V 영역 및 이들의 연관 CDR(Winter 등, (1991) Nature 349:293-299; Lobuglio 등, (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224; Shaw 등, (1987) J Immunol. 138:4534-4538; 및 Brown 등, (1987) Cancer Res. 47:3577-3583), 적절한 인간 항체 불변 도메인으로의 융합 전에 인간 지지 FR 내로 이식된 설치류 CDR(Riechmann 등, (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen 등, (1988) Science 239:1534-1536; 및 Jones 등, (1986) Nature 321:522-525), 및 재조합적으로 씌워진 설치류 FR에 의해 지지되는 설치류 CDR(유럽 특허 공보 번호 519,596, 1992.12.23.)을 갖는 키메라성 항체를 포함하는 비-인간 면역글로불린에서 유도된 항원-결합 부위를 포함하는 여러 "인간화된" 항체 분자가 기재되어 있다. 이들 "인간화된" 분자는 인간 수여자에서 이들 부분의 치료적 적용의 기간 및 유효성을 제한하는 설치류 항인간 항체 분자에 대한 원치않는 면역학적 반응을 최소화하도록 설계된다. 예로 U.S. 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762; 6,180,370; 및 7,022,500을 참고하라.

본 발명의 항체는 본원에 기재되는 임의의 치료적, 진단적, 약물 발견, 단백질 정제, 및 분석 방법 그리고 조성물에 사용될 수 있다.

VI . 항체 대안물 및 다른 결합 제제

다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 본원에서 개시되는 바와 같은 AARS 폴리펩티드 또는 그 세포 결합 파트너에 대한 결합 특이성을 나타내는 항체 대안물 또는 다른 결합 제제, 예컨대 가용성 수용체, 아드넥틴, 펩티드, 펩티드 모사체, 소분자, 앱타머 등이나 이들의 일부, 변이체 또는 유도체, 및 그 조성물 및 사용 방법을 제공한다. 결합 제제는 본원에서 기재되는 임의의 치료적, 진단적, 약물 발견, 또는 단백질 발현/정제, 그리고 분석 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 생물학적 제제 기반 결합 제제, 예컨대 아드넥틴, 가용성 수용체, 애비머, 및 트리넥틴이 특히 유용하다.

특정 구현예에서, 이러한 결합 제제는 본 발명의 AARS 폴리펩티드에 의해 매개되는 하나 이상의 비-정규적 활성을 조정하는데 유효하다. 일부 구현예에서, 예를 들어 결합 제제는 AARS 폴리펩티드 및/또는 그 결합 파트너에 결합하고, 이들이 서로 상호반응하는 능력을 저해하고, 및/또는 AARS 폴리펩티드의 비-정규적 활성을 길항하는 것이다. 특정 구현예에서, 예를 들어 결합 제제는 AARS 폴리펩티드의 세포 결합 파트너에 결합하며, 예컨대 AARS 폴리펩티드에 의해 매개되는 비-정규적 활성을 증가시키거나 작동시킴으로써 AARS 폴리펩티드 활성을 모사한다. 따라서, 이러한 결합 제제는, 예컨대 그 활성을 부분적 또는 전체적으로 길항하거나 작동시킴으로써 본 발명의 AARS 폴리펩티드에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 다른 상태의 진단, 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.

결합 제제는 이것이 폴리펩티드 또는 그 세포 결합 파트너와 검출 가능한 수준(예를 들어, ELISA 분석 내에서)으로 반응하며 유사한 조건 하에 미관련 폴리펩티드와 통계적으로 유의미한 방식으로 검출 가능하게 반응하지 않는 경우, 본 발명의 AARS 폴리펩티드, 또는 그 세포 결합 파트너에 "특이적으로 결합한다"고 불린다. 특정 예에서, 결합 제제는 AARS 폴리펩티드의 전장 버전과 유의미하게 상호반응하지 않는다. 특정한 예시적 구현예에서, 결합 제제는 AARS 단백질 단편 또는 그 세포 결합 파트너에 대해 적어도 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 또는 50nM의 친화도를 갖는다. 특정 구현예에서, AARS 단백질 단편에 대한 결합 제제의 친화도는 대응 전장 AARS 폴리펩티드에 대한 그 친화도에 비해 보통 약 1.5x, 2x, 2.5x, 3x, 3.5x, 4x, 4.5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1000x 또는 그 초과(사이의 모든 정수 포함)만큼 더 크다. 특정 구현예에서, 결합 제제는 대응 전장 AARS 단백질에 대해 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20μM의 친화도를 갖는다.

앞서 주지된 바와 같이, "펩티드"가 결합 제제로서 포함된다. 펩티드라는 용어는 보통 아미노산 잔기의 중합체 및 이들의 변이체 및 합성 유사체를 나타낸다. 특정 구현예에서, "펩티드"라는 용어는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 아미노산(그 사이 모든 정수 및 범위(예로, 5-10, 8-12, 10-15)를 포함함)으로 구성되고 AARS 폴리펩티드, 그 세포 결합 파트너, 또는 둘 다와 상호반응하는 펩티드를 포함하는, 상대적으로 짧은 폴리펩티드를 나타낸다. 펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 천연-생성 아미노산 및/또는 비-천연 생성 아미노산으로 이루어질 수 있다.

천연-생성 아미노산만으로 구성된 펩티드에 부가하여, 펩티도모사체 또는 펩티드 유사체가 또한 제공된다. 펩티드 유사체는 통상 주형 펩티드와 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 약학 산업에서 이용된다. 이들 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모사체" 또는 "펩티도모사체"로 불린다(Luthman, 등, A Textbook of Drug Design and Development, 14:386-406, 2nd Ed., Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:1699-1720 (1994); Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS, p. 392 (1985); 및 Evans, 등, J. Med. Chem. 30:229 (1987)). 펩티도모사체는 펩티드의 생물학적 활성을 모사하지만 화학적 성질 상 더 이상 펩티드가 아닌 분자이다. 펩티도모사체 화합물은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 U.S. 특허 번호 6,245,886에 기재되어 있다.

본 발명은 또한 펩토이드를 포함한다. 펩티드의 펩토이드 유도체는 생물학적 활성을 위한 중요한 구조적 결정자는 보유하지만 펩티드 결합은 제거되어 단백분해에 내성을 부여하는 다른 형태의 개질된 펩티드를 나타낸다(Simon, 등, PNAS USA. 89:9367-9371, 1992). 펩토이드는 N-치환 글리신의 올리고머이다. 각각 천연 아미노산의 측쇄에 대응하는 여러 N-알킬기가 기재되어 있다. 본 발명의 펩티도모사체는 적어도 하나의 아미노산, 소수의 아미노산 또는 전체 아미노산 잔기가 대응 N-치환 글리신으로 대체된 화합물을 포함한다. 펩토이드 라이브러리는, 예를 들어 U.S. 특허 번호 5,811,387에 기재되어 있다.

결합 제제는 하나 이상의 소분자를 또한 포함할 수 있다. "소분자"란 합성 또는 생물학적 기원(생체분자)이지만 보통 중합체가 아닌 유기 화합물을 나타낸다. 유기 화합물은 그 분자가 탄소를 함유하는 큰 클래스의 화학적 화합물을 나타내며, 카보네이트, 단순한 탄소의 옥시드, 또는 시아니드만을 함유하는 것은 보통 배제된다. "생체분자"란 일반적으로 큰 중합체성 분자(생체중합체), 예컨대 펩티드, 다당류, 및 핵산뿐만 아니라 소분자, 예컨대 일차 이차 대사물, 지질, 인지질, 당지질, 스테롤, 글리세로지질, 비타민, 및 호르몬을 포함하는, 생체에 의해 생성되는 유기 분자를 나타낸다. "폴리머"란 보통 공유 화학 결합에 의해 연결되는 반복 구조 단위로 이루어진 큰 분자 또는 거대분자를 일반적으로 나타낸다.

특정 구현예에서, 소분자는 약 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 500, 650, 600, 750, 700, 850, 800, 950, 1000 또는 2000달톤을 포함하는 1000-2000달톤 미만, 보통 약 300 내지 700달톤의 분자량을 갖는다. 소분자 라이브러리는 본원에서 다른 곳에 기재된다.

앱타머가 또한 결합 제제로서 포함된다(예로 [Ellington 등, Nature. 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk 등, Science. 249, 505-10, 1990] 참고). 앱타머의 예는 핵산 앱타머(예로, DNA 앱타머, RNA 앱타머) 및 펩티드 앱타머를 포함한다. 핵산 앱타머는 일반적으로 다양한 분자 표적, 예컨대 소분자, 단백질, 핵산, 나아가 세포, 조직 및 개체에 결합하도록 반복되는 회수의 시험관 내 선택 또는 균등한 방법, 예컨대 SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화)를 통해 조작된 핵산 종을 나타낸다(예로 U.S. 특허 번호 6,376,190; 및 6,387,620 참고). 따라서, 본원에 기재된 AARS 폴리펩티드 및/또는 이들의 세포 결합 파트너에 결합하는 핵산 앱타머가 포함된다.

펩티드 앱타머는 보통 펩티드 앱타머의 결합 친화도를 항체의 친화도에 비견할 만한 수준(예로 나노몰 농도 범위)으로 증가시키는 이중 구조 제약인 단백질 스캐폴드에 양단이 부착된 가변 펩티드 루프를 포함한다. 특정한 구현예에서, 가변 루프 길이는 약 10-20 아미노산(사이의 모든 정수 포함)으로 이루어질 수 있으며, 스캐폴드는 우수한 용해도 및 컴팩트한 특성을 갖는 임의의 단백질을 포함할 수 있다. 특정 예시적인 구현예는 스캐폴드 단백질로서 가변 루프가 환원성 활성 부위(야생형 단백질에서 -Cys-Gly-Pro-Cys- 루프) 내에 삽입되고 2 시스테인 측쇄는 디설피드 가교를 형성할 수 있는 박테리아 단백질인 티오레독신-A를 이용할 수 있다. 펩티드 앱타머의 동정 방법은, 예를 들어 U.S. 출원 번호 2003/0108532에 기재되어 있다. 따라서, 본원에 기재된 AARS 폴리펩티드 및/또는 이들의 세포 결합 파트너에 결합하는 펩티드 앱타머가 포함된다. 펩티드 앱타머 선택은 효모 2-하이브리드 시스템을 포함하는 당분야에 공지된 상이한 시스템을 이용하여 수행될 수 있다.

또한 본 발명의 AARS 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 ADNECTINS™, AVIMERS™, 아나폰 및 안티칼린이 포함된다. ADNECTINS™은 다른 단백질에 자연 결합하는 풍부한 세포외 단백질인 인간 피브로넥틴에서 유도되느 표적화된 생물학적 제제 클래스를 나타낸다. 예로 U.S. 출원 번호 2007/0082365; 2008/0139791; 및 2008/0220049를 참고하라. ADNECTINS™은 보통 천연 피브로넥틴 골격뿐만 아니라 인간 피브로넥틴의 특정부의 다중 표적화 도메인으로 구성된다. 표적화 도메인은 ADNECTINS™이 관심 치료 표적, 예컨대 본 발명의 AARS 단백질 단편을 특이적으로 인지할 수 있도록 조작될 수 있다.

AVIMER™는 시험관 내 엑손 셔플링 및 파지 디스플레이를 이용하여 조작된 다량체 결합 단백질 또는 펩티드를 나타낸다. 다중 결합 도메인은 연결되어, 단일 에피토프 면역글로불린 도메인에 비해 더 큰 친화도 및 특이성을 만들어낸다. 예로 [Silverman 등, Nature Biotechnology. 23:1556-1561, 2005; U.S. 특허 번호 7,166,697; 및 U.S. 출원 번호 2004/0175756, 2005/0048512, 2005/0053973, 2005/0089932 및 2005/0221384]를 참고하라.

또한 약물 발견 및 약물 개발에서 표적 결합을 위해 항체에 비해 이점을 제공할 수 있는 비-면역글로불린 단백질 클래스를 포함하는, 고안된 안키린 반복 단백질(DARPin)이 포함된다. 다른 용도 가운데, DARPin은 작은 크기 및 높은 안정성을 포함하는 이들의 바람직한 분자 특성으로 인해, 생체 내 조영 또는 독소나 다른 치료적 부담의 전달을 위해 이상적으로 적합하다. 박테리아에서의 낮은 제조 비용 제조 및 여러 표적-특이적인 DARPin의 신속한 생성은 DARPin 접근법을 약물 발견에 유용하게 만든다. 부가적으로, DARPin은 다중 특이적 포맷으로 쉽게 생성되어, 효과기 DARPin을 특정 기관으로 표적화하거나 몇몇 DARPin으로 이루어진 하나의 분자로 다중 수용체를 표적화하기 위한 가능성을 제공할 수 있다. 예로 [Stumpp 등, Curr Opin Drug Discov Devel. 10:153-159, 2007; U.S. 출원 번호 2009/0082274; 및 PCT/EP2001/10454]를 참고하라.

특정 구현예는 보통 표적 결합을 위해 다중 표면 루프를 디스플레이하는 스캐폴드로서 인간 피브로넥틴의 제 10 피브로넥틴 III형 도메인(FNfn10)을 이용하는 "모노바디"를 포함한다. FNfn10은 면역글로불린 폴딩과 유사한 β-샌드위치 구조를 갖는 작은(94 잔기) 단백질이다. 디설피드 결합 또는 금속 이온 없이 매우 안정하며, 박테리아에서 높은 수준으로 정확하게 폴딩된 형태로 발현될 수 있다. FNfn10 스캐폴드는 실제로 모든 디스플레이 기술과 호환된다. 예로 [Batori 등, Protein Eng. 15:1015-20, 2002; 및 Wojcik 등, Nat Struct Mol Biol., 2010; 및 U.S. 특허 번호 6,673,901]을 참고하라.

안티칼린은 구조적으로 단단한 틀에 의해 지지되는 고가변 루프 영역을 갖는 결합 단백질 패밀리인 인간 리포칼린에서 보통 합성되는 항체 모사체 클래스를 나타낸다. 예로 U.S. 출원 번호 2006/0058510을 참고하라. 안티칼린은 보통 약 20kDa의 크기를 갖는다. 안티칼린은 부착된 α-나선 및 4 펩티드 루프에 의해 쌍으로 연결되는 8개 반-평형 β-가닥(안정한 β-배럴 스캐폴드)에 의해 형성된 배럴 구조로 특징지워질 수 있다. 특정 구현예에서, 특이적 결합을 달성하기 위한 입체형태적 일탈은 고가변 루프 영역(들)에서 생긴다. 예로 본원에서 참조로 도입되는 [Skerra, FEBS J. 275:2677-83, 2008]을 참고하라.

VII . 약물 방출 분석을 위한 생체분석 및 분석적 분석 및 산물 명세, 진단제 , 및 시약

AARS 단백질 단편에 관련된 생체분석 및 치료적 및 진단적 시약으로서의 관련 제제가 또한 포함된다. 그 예는 다수가 본원에 기재되는 다른 것들 중에서, 순도, 생물학적 활성, 친화도, 용해도, pH, 내독소 수준을 측정하는 생체분석 및 분석적 분석을 포함한다. 또한 상이한 제제 배치를 비교하기 위한 하나 이상의 기준을 제공하고/하거나 용량 반응 곡선을 확립하는 분석이 포함된다. 배치 비교는 임의의 하나 이상의 화학적 특징분석, 생물학적 특징분석, 및 임상적 특징분석에 근거할 수 있다. 단백질 제제에 있어서, 또한 선택된 제제의 역가, 안정성, 약동학, 및 면역원성의 평가 방법이 포함된다. 다른 용도 가운데, 이들 및 다른 방법을 AARS 단백질 단편, 항체, 결합 제제, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 제제 및 벡터 그리고 본원에 기재되는 다른 것들을 포함하는 생물학적 제제 또는 화학적 제제의 로트 방출 평가를 위해 이용할 수 있다.

특정 구현예는 생체친화도 분석의 이용을 포함한다. 이러한 분석을 이용하여, 예를 들어 AARS 단백질 단편 및 세포 결합 파트너 간, 또는 AARS 단백질 단편 및 항체 간 결합 친화도를 평가할 수 있다. 결합 친화도는 또한 AARS 단백질 단편 및 대안적 결합 제제, 예컨대 후보물 또는 선도 평가 화합물(예로 AARS의 소분자 조정제) 간, 또는 AARS 세포 결합 파트너 및 후보물 또는 선도 평가 화합물 간에 측정될 수 있다. 특정한 예시적인 결합 친화도 분석은 본원에 기재된 바와 같고 당분야에 공지된 ELISA 분석을 이용할 수 있다. 특정 분석은 고성능 수용체 결합 크로마토그래피를 이용한다(예로 [Roswall 등, Biologicals. 24:25-39, 1996] 참고). 다른 예시적인 결합 친화도 분석은 표면 플라즈몬 공명(SPR)-기반 기술을 이용할 수 있다. 그 예는 그 일부가 SPR 기술을 마이크로유체 시스템에 통합하여 pM 내지 mM 범위 농도에서 분자 상호반응을 실시간으로 모니터링하는 BIACore 기술을 포함한다. 또한 결합 특이성, 결합 친화도, 및 결합 역학/속도 상수의 정확한 측정을 제공하는 KINEXA™ 분석이 포함된다.

특정 구현예는 단백질 제제의 면역원성을 평가 또는 최적화하기 위한 면역분석에 관한 것이다. 그 예는 치료적 단백질의 면역원성 가능성에 대한 유용한 정보를 제공하는 생체 외 인간 세포 분석 및 시험관 내 면역-효소적 분석을 포함한다. 생체 외 세포-반응 분석은, 예를 들어 항원-제시 세포(APC) 및 T-세포 간에 세포 협동을 재현함으로써 관심 단백질과의 접촉 후 T-세포의 활성화를 측정하는데 이용될 수 있다. 특정한 시험관 내 효소적 분석은 관련 인간 모집단의 유의미한 부분을 커버하는 재조합 HLA-DR 분자 수집물을 이용할 수 있으며, 펩티드(치료적 단백질의 단편화에서 얻어짐)와 HLA-DR 분자의 결합을 평가하기 위한 자동화된 면역-효소적 분석을 포함할 수 있다. 또한, 예컨대 이들 및 관련 방법을 이용하여 단백질 제제로부터 하나 이상의 T-세포 에피토프를 동정한 뒤, 이를 제거하거나 변형시키기 위한, 선택된 단백질의 면역원성 감소 방법이 포함된다.

또한 파라미터, 예컨대 비-정규적 생물학적 활성, 및 세포독성을 포함하는 특이적 생물학적 활성을 측정하기 위한 생물학적 방출 분석(예로 세포-기반 분석)이 포함된다. 특정한 특이적 생물학적 분석은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 비-정규적 생물학적 활성의 송신정보, 예컨대 형광 또는 발광 표지자에 기능적으로 커플링된 선택된 AARS 단백질 단편의 세포 결합 파트너(예로, 세포-표면 수용체)를 이용하는 세포-기반 분석을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예는 AARS 단백질 단편에 결합하는 세포-표면 수용체 또는 이들의 세포외 부분을 포함하는 세포를 포함하며, 여기서 세포는 검출기 또는 송신정보를 포함한다. 또한 보통 조작된 마우스 또는 다른 포유류를 이용하여 제제, 예컨대 AARS 폴리펩티드 또는 항체의 약동학을 특징분석하는 생체 내 생물학적 분석이 포함된다(예로 [Lee 등, The Journal of Pharmacology. 281:1431-1439, 1997] 참고). 세포독성-기반 생물학적 분석의 예는 다양한 규제 기관, 예컨대 식약청(FDA)에 의한 허가에 관련된 용량 반응 곡선, 배치 평가, 또는 다른 특성을 확립하기 위한 것인지 여부와 무관하게, 다른 것들 중에서 AARS 단백질 단편의 세포독성을 평가할 수 있는 방출 분석(예로 아폽토시스를 측정하기 위한 크롬 또는 유로퓸 방출 분석; 예로 [von Zons 등, Clin Diagn Lab Immunol.4:202-207, 1997] 참고)을 포함한다.

이러한 분석은, 예를 들어 선택된 AARS 단백질 단편 또는 다른 제제에 대한 용량 반응 곡선을 만들고/만들거나 상이한 배치의 단백질 또는 다른 제제의 용량 반응 곡선을 비교하기 위해 이용될 수 있다. 용량-반응 곡선은 수용기 반응에 대한 스트레서의 크기에 관련된 X-Y 그래프이다; 반응은 생리학적 또는 생화학적 반응, 예컨대 시험관 내 세포 또는 생체 내 세포 또는 조직에서의 비-정규적 생물학적 활성, 생체 내에서 측정되는 치료적 유효량(예로 EC₅₀으로 측정됨), 또는 시험관 내 또는 생체 내에서 측정되는지 여부와 무관한 사멸(예로 세포사, 개체사)일 수 있다. 사멸은 통상 모델화된 모집단의 50%에 치명적인 통계적 유도 용량인 LD₅₀으로 나타내지만, LC₀₁(동물 평가 모집단의 1%에 대한 치사 용량), LC₁₀₀(동물 평가 모집단의 100%에 대한 치사 용량), 또는 LC_LO(치사를 유도하는 최저 용량)으로 나타낼 수도 있다. 거의 모든 목적 효과 또는 종점이 이러한 방식으로 특징분석될 수 있다.

반응 곡선의 측정 용량은 보통 X축에 도시되며, 반응은 Y축에 도시된다. 보다 일반적으로, 용량의 로그가 X축에 도시되며, 가장 빈번하게는 중앙에 가장 가파른 부분을 갖는 S자형 곡선이 생성된다. 무영향 수준(NOEL)은 측정 가능한 효과가 관찰되지 않는 최저 실험 용량을 나타내며, 역치 용량은 그래프에서의 0을 초과하는 반응을 나타내는 최초 지점을 나타낸다. 일반적 규칙으로, 약물이 더 강할수록 더 가파른 용량 반응 곡선이 생성된다. 여러 약물에 있어서, 목적 효과는 종종 더 낮은 용량이 상대적으로 무효하고 더 높은 용량이 원치않는 부작용을 일으키기 때문에, 역치 용량보다 조금 더 큰 용량에서 확인된다. 생체 내 생성되는 용량 반응 곡선에 있어서, 곡선은 필요한 경우 그 값, 예컨대 ㎍/체중kg, mg/체중kg, 또는 g/체중kg으로 특징지워질 수 있다.

배치 비교를 위해, 부분적으로는 CV가 상이한 단위 또는 상이한 수단의 데이터 세트 간 비교를 허용하기 때문에, 상이한 배치의 상이한 용량 반응 곡선 간(예로 AARS 단백질 단편, 항체, 또는 다른 제제의 상이한 배치 간) 변화 계수(CV)를 계산하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어 특정한 예시적 구현예에서, AARS 단백질 단편 또는 다른 제제의 2 또는 3 이상의 상이한 배치는 이들 간에 4, 5, 6, 7, 또는 8점 용량 곡선에 대해 약 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 CV를 갖는다. 특정 구현예에서, 용량 반응 곡선은 세포-기반 분석에서 측정되며, 그 송신정보는 AARS 단백질 단편의 선택된 비-정규적 활성의 증가 또는 감소에 관련된다. 특정 구현예에서, 용량 반응 곡선은 세포 방출 분석 또는 동물 모델(예로, 마우스 모델)에서 측정되며, 그 송신정보는 세포사 또는 동물사에 관련된다. 다른 변화는 당분야의 숙련자에게 자명할 것이다.

VIII. 발현 및 정제 시스템

본 발명의 구현예는 본 발명의 AARS 단백질 단편 또는 다른 폴리펩티드-기반 제제의 발현 및 정제를 위한 방법 및 관련 조성물을 포함한다. 이러한 재조합 AARS 폴리펩티드는, 예를 들어 [Sambrook, 등, (1989, 상동), 특히 Sections 16 및 17; Ausubel 등, (1994, 상동), 특히 Chapters 10 및 16; 및 Coligan 등, Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997), 특히 Chapters 1, 5 및 6]에 기재된 바와 같은 표준 프로토콜을 이용하여 편리하게 제조될 수 있다. 하나의 일반예로서, AARS 폴리펩티드는 하나 이상의 하기 단계를 포함하는 절차에 의해 제조될 수 있다: (a) AARS 폴리펩티드를 인코딩하며 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 구축물의 제조; (b) 숙주 세포 내로의 구축물의 도입; (c) AARS 폴리펩티드를 발현하기 위한 숙주 세포의 배양; 및 (d)　숙주 세포로부터의 AARS 폴리펩티드의 단리.

AARS 폴리뉴클레오티드는 본원에서 다른 곳에 기재된다. 목적 폴리펩티드를 발현하기 위해, 폴리펩티드, 또는 기능적 균등물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필요 요소를 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 당분야의 숙련자에 널리 공지된 방법을 이용하여 관심 폴리펩티드 및 적절한 전사 및 번역 조절 요소를 인코딩하는 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기법은 [Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology (1989)]에 기재되어 있다.

다양한 발현 벡터/숙주 시스템이 공지되어 있으며, 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하고 발현하는데 이용될 수 있다. 이들은 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예로, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예로, 컬리플라워 모자이크 바이러스 CaMV; 담배 모자이크 바이러스 TMV)로 또는 박테리아 발현 벡터(예로, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포, 보다 구체적으로 인간 세포 시스템을 포함하는 동물 세포 시스템을 비제한적으로 포함한다.

발현 벡터에 존재하는 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비-번역 영역--인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 미번역 영역--이다. 이러한 요소는 이들의 강도 및 특이성이 다를 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 항상성 및 유도 가능한 프로모터를 포함하는 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 이용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 시스템에 클로닝하는 경우, 유도 가능한 프로모터, 예컨대 PBLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, La Jolla, Calif.) 또는 PSPORT1 플라스미드(Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) 등의 하이브리드 lacZ 프로모터가 이용될 수 있다. 포유류 세포 시스템에서는 포유류 유전자 또는 포유류 바이러스로부터의 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 다중 사본을 함유하는 세포주를 생성하는 것이 필요한 경우, 적절한 선택 마커를 갖는 SV40 또는 EBV 기반 벡터가 유리하게 이용될 수 있다

박테리아 시스템에서, 발현되는 폴리펩티드의 목적 용도에 따라 여러 발현 벡터가 선택될 수 있다. 예를 들어 다량이 필요한 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질의 높은 발현 수준을 지시하는 벡터가 이용될 수 있다. 이러한 벡터는 다기능적 대장균 클로닝 및 발현 벡터, 예컨대 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열이 아미노-말단 Met 및 β-갈락토시다아제의 후속 7 잔기에 대한 서열과 틀에 맞게 결찰되어 하이브리드 단백질이 생성되는 BLUESCRIPT(Stratagene); pIN 벡터(Van Heeke & Schuster, J.　Biol. Chem. 264:5503 5509 (1989)) 등을 비제한적으로 포함한다. pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.)가 또한 외래 폴리펩티드를 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GST)와의 융합 단백질로 발현하기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 글루타치온-아가로오스 비드에 대한 흡착, 이어서 유리 글루타치온의 존재 중 용출에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. 이러한 시스템에서 제조되는 단백질은 클로닝된 관심 폴리펩티드가 의도 시 GST 부분에서 방출될 수 있도록 헤파린, 트롬빈, 또는 인자 XA 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계될 수 있다.

특정 구현예는 대장균-기반 발현계(예로 [Structurals Genomics Consortium 등, Nature Methods. 5:135-146, 2008] 참고)를 채용할 수 있다. 이들 및 관련 구현예는 적합한 발현 벡터를 제조하기 위해 결찰-무관 클로닝(LIC)에 부분적으로 또는 전체적으로 의존할 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질 발현은 T7 RNA 폴리머라아제(예로, pET 벡터 시리즈)에 의해 조절될 수 있다. 이들 및 관련 구현예는 T7-매개 발현을 지지하고 개선된 표적 단백질 안정성을 위해 lon 및 ompT 프로테아제가 결핍된 BL21의 λDE3 용해소원인 발현 숙주 균주 BL21(DE3)을 이용할 수 있다. 또한 대장균에서 거의 사용되지 않는 tRNA를 인코딩하는 플라스미드를 수반하는 발현 숙주 균주, 예컨대 ROSETTA™(DE3) 및 Rosetta 2(DE3) 균주가 포함된다. 세포 용해 및 표본 취급은 또한 상표명 BENZONASE® 뉴클레아제 하에 판매되는 시약 및 BUGBUSTER® 단백질 추출 시약을 이용하여 개선될 수 있다. 세포 배양을 위해, 자가 유도 배지가 고처리량 발현계를 포함하는 여러 발현계의 효율을 개선시킬 수 있다. 이러한 유형의 배지(예로, OVERNIGHT EXPRESS™ 자가유도 시스템)은 인공적 유도제, 예컨대 IPTG의 부가 없이 대사적 이동을 통해 단백질 발현을 점차적으로 야기한다. 특정 구현예는 헥사히스티딘 태그(예컨대 상표명 HIS·TAG® 융합물 하에 판매되는 것들), 이어서 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 정제, 또는 관련 기법을 채용한다. 그러나 특정 구현예에서, 임상적 등급 단백질은 친화도 태그를 사용하거나 사용하지 않고 대장균 봉입체로부터 단리될 수 있다(예로 [Shimp 등, Protein Expr Purif. 50:58-67, 2006] 참고). 추가 예로서, 특정 구현예는 저온에서 대장균에서의 단백질 발현이 이들의 용해도 및 안정성을 개선시키기 때문에, 저온-쇼크 유도된 대장균 고수율 제조 시스템을 채용할 수 있다(예로 [Qing 등, Nature Biotechnology. 22:877-882, 2004] 참고).

또한 고밀도 박테리아 발효 시스템이 포함된다. 예를 들어, 랄스토니아 유트로파의 높은 고밀도 세포 배양은 150g/L를 초과하는 세포 밀도에서의 단백질 제조를 허용하며, 재조합 단백질의 발현 역가는 10g/L를 초과한다.

효모 사카로마이세스 세레비시애에서, 항상성 또는 유도 가능한 프로모터, 예컨대 알파 인자, 알코올 옥시다아제, 및 PGH를 함유하는 여러 벡터가 이용될 수 있다. 리뷰를 위해서는 [Ausubel 등, (상동) 및 Grant 등, Methods Enzymol. 153:516-544 (1987)]을 참고하라. 또한 피치아 판도리스 발현계가 포함된다(예로 [Li 등, Nature Biotechnology 24, 210 -215, 2006; 및 Hamilton 등, Science, 301:1244, 2003] 참고). 특정 구현예는 다른 것들 중에서 인간화된 N-글리코실화 경로를 갖는 효모를 포함하여 단백질을 선택적으로 글리코실화하도록 조작된 효모 시스템을 포함한다(예로 [Hamilton 등, Science. 313:1441-1443, 2006; Wildt 등, Nature Reviews Microbiol. 3:119-28, 2005; 및 Gerngross 등, Nature Biotechnology. 22:1409-1414, 2004; U.S. 특허 번호 7,629,163; 7,326,681; 및 7,029,872] 참고). 단순히 예로서, 재조합 효모 배양물은 다른 것들 중에서 Fernbach 플라스크 또는 15L, 50L, 100L, 및 200L 발효기에서 배양될 수 있다.

식물 발현 벡터가 이용되는 경우, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 발현은 임의 수의 프로모터로 유도될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 프로모터, 예컨대 CaMV의 35S 및 19S 프로모터는 단독으로 또는 TMV의 오메가 리더 서열과의 조합으로 이용될 수 있다(Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). 대안적으로, 식물 프로모터, 예컨대 RUBISCO의 소 서브유닛 또는 열 쇼크 프로모터가 이용될 수 있다(Coruzzi 등, EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie 등, Science 224:838-843 (1984); 및 Winter 등, Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). 이들 구축물은 직접 DNA 형질전환 또는 병원체-매개 전달감염에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 기법은 일반적으로 이용 가능한 여러 리뷰에 기재되어 있다(예로 [Hobbs in McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, pp. 191-196 (1992)] 참고).

곤충 시스템이 또한 관심 폴리펩티드의 발현에 이용될 수 있다. 예를 들어 이러한 하나의 시스템에서, 오토그래파 칼리포르니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)가 스포돕테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플러시아 세포에서 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 이용된다. 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 바이러스의 비-필수적인 영역, 예컨대 폴리헤드린 유전자 내로 클로닝되고, 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 놓일 수 있다. 폴리펩티드-인코딩 서열의 성공적 삽입 시 폴리헤드린 유전자가 불활성화되고 피막 단백질이 없는 재조합 바이러스를 제조할 것이다. 이어서 재조합 바이러스가, 예를 들어 관심 폴리펩티드가 발현될 수 있는 S. 프루기페르다 세포 또는 트리코플러시아 세포를 감염시키는데 이용될 수 있다(Engelhard 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224-3227 (1994)). 또한 SF9, SF21, 및 T. ni 세포를 이용하는 것을 포함하는 배큘로바이러스 발현계가 포함된다(예로 [Murphy and Piwnica-Worms, Curr Protoc Protein Sci. Chapter 5:Unit5.4, 2001] 참고). 곤충 시스템은 포유류 시스템과 유사한 번역 후 개질을 제공할 수 있다.

포유류 숙주 세포에서, 여러 바이러스-기반 발현계가 일반적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 아데노바이러스가 발현 벡터로서 이용되는 경우, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열이 후기 프로모터 및 3자간 리더 서열로 구성된 아데노바이러스 전사/번역 복합체 내로 결찰될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수적인 E1 또는 E3 영역 내 삽입을 이용하여 감염된 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 생활성 바이러스를 수득할 수 있다(Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)). 부가적으로 전사 인핸서, 예컨대 Rous 육종 바이러스(RSV) 인핸서를 이용하여 포유류 숙주 세포에서의 발현을 증가시킬 수 있다.

유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293세포[Graham 등, J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방암(MMT 060562, ATCC CCL 51); TR1 세포(Mather 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)를 포함한다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포(Urlaub 등, PNAS USA 77:4216 (1980))를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대 NSO 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 제조에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주에 대한 리뷰로는, 예로 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K.C Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268]을 참고하라. 특히 바람직한 포유류 세포 발현계는 CHO 및 HEK293-세포 기반 발현계를 포함한다. 포유류 발현계는 당분야에 공지된 것들 중에서, 예를 들어 T-플라스크, 롤러 병, 또는 세포 공장에서의 부착 세포주, 또는 예를 들어 1L 및 5L 스피너, 5L, 14L, 40L, 100L 및 200L 교반 탱크 바이오반응기, 또는 20/50L 및 100/200L 웨이브 바이오반응기에서의 현탁 배양을 이용할 수 있다.

또한 단백질의 무세포 발현이 포함된다. 이들 및 관련 구현예는 보통 정제된 RNA 폴리머라아제, 리보솜, tRNA 및 리보뉴클레오티드를 이용한다; 이들 시약은 세포 또는 세포-기반 발현계로부터 추출에 의해 제조될 수 있다.

특정 개시 신호가 또한 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 보다 효율적인 번역의 달성을 위해 이용될 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 그 개시 코돈, 및 상류 서열이 적절한 발현 벡터 내로 삽입된 경우, 부가적 전사 또는 번역 조절 신호가 필요없을 수 있다. 그러나 코딩 서열, 또는 이들의 일부만이 삽입된 경우, ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 조절 신호가 제공되어야 한다. 또한, 개시 코돈은 정확한 해독틀 내에 놓여 전체 삽입물의 번역이 보장되어야 한다. 외인성 번역 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성 등의 다양한 기원일 수 있다. 발현 효율은 이용되는 특정 세포 시스템에 적절한 인핸서, 예컨대 문헌에 기재된 것들의 도입에 의해 증강될 수 있다(Scharf. 등, Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).

부가적으로 숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조정하거나 목적하는 방식으로 발현되는 단백질을 처리하기 위한 그 능력에 의해 선택될 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 개질에는 번역후 개질, 예컨대 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화, 및 아실화가 비제한적으로 포함된다. 단백질의 "프리프로" 형태를 절단하는 번역 후 처리는 또한 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 촉진하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 번역후 활성에 대한 특정 세포 기구 및 특정 기전을 갖거나 갖지 않는 박테리아 세포에 부가하여 상이한 숙주 세포, 예컨대 효모, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, 및 W138이 선택되어 외래 단백질의 정확한 개질 및 처리를 보장하기 위해 선택될 수 있다.

재조합 단백질의 장기, 고수율 제조를 위해, 안정한 발현이 일반적으로 바람직하다. 예를 들어, 관심 폴리뉴클레오티드를 안정하게 발현하는 세포주는 동일하거나 별도의 벡터 상에 바이러스 복제 기원 및/또는 내인성 발현 요소 및 선택적 마커 유전자를 함유할 수 있는 발현 벡터를 이용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포는 이들이 선택적 배지로 교체되기 전에 농축 배지 중에서 약 1-2일 성장할 수 있다. 선택적 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것이며, 그 존재로 인해 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수가 가능해진다. 안정하게 형질전환된 세포의 내성 클론은 세포 유형에 적절한 조직 배양 기법을 이용하여 증식될 수 있다. 예컨대 일시적 전달감염 또는 감염에 의한 일시적 제조가 또한 채용될 수 있다. 일시적 제조에 적합한 예시적인 포유류 발현계는 HEK293 및 CHO-기반 시스템을 포함한다.

임의 수의 선택 시스템을 이용하여 형질전환되거나 형질도입된 세포주를 회수할 수 있다. 이들은 각각 tk- 또는 aprt-세포에 채용될 수 있는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler 등, Cell 11:223-232 (1977)) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Lowy 등, Cell 22:817-823 (1990)) 유전자를 포함한다. 또한 항대사제, 항생제 또는 제초제 내성이 선택을 위한 기준으로 이용될 수 있다; 예를 들어 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980)); 아미노글리코시드, 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 부여하는 npt(Colbere-Garapin 등, J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); 및 각각 클로르설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제에 대한 내성을 부여하는 als 또는 pat(Murry, 상동). 부가적 선택적 유전자, 예를 들어 세포가 트립토판 대신 인돌을 이용할 수 있게 하는 trpB, 또는 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 이용할 수 있게 하는 hisD(Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988))가 기재되어 있다. 가시적 마커, 예컨대 형질전환체의 동정을 위해서만이 아니라 특정 벡터 시스템에 기인할 수 있는 일시적 또는 안정한 단백질 발현량을 정량하기 위해서도 널리 이용되고 있는 녹색 형광 단백질(GFP) 및 다른 형광 단백질(예로, RFP, YFP)과 같은 마커, 안토시아닌, β-글루쿠로니다아제 및 그 기질 GUS, 및 루시퍼라아제 및 그 기질 루시페린의 이용이 널리 이용되고 있다(예로 [Rhodes 등, Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)] 참고).

본 발명의 구현예는 또한 고처리량 단백질 제조 시스템, 또는 마이크로-제조 시스템을 포함한다. 특정 측면은, 예를 들어 금속 킬레이트-개질된 슬라이드 표면 또는 MagneHis Ni-입자 상 단백질 발현 및 정제를 위한 헥사-히스티딘 융합 태그를 이용할 수 있다(예로 [Kwon 등, BMC Biotechnol. 9:72, 2009; 및 Lin 등, Methods Mol Biol. 498:129-41, 2009)] 참고). 또한 고처리량 무세포 단백질 발현계가 포함된다(예로 [Sitaraman 등, Methods Mol Biol. 498:229-44, 2009] 참고). 이들 및 관련 구현예는, 예를 들어 AARS 단백질 단편(들)의 마이크로어레이의 생성에 이용될 수 있고, 이는 AARS 단백질 단편(들)과 상호작용하는 제제를 동정하기 위한 스크리닝 라이브러리에 이용될 수 있다.

산물에 특이적인 결합 제제 또는 항체, 예컨대 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 이용하여 폴리뉴클레오티드-인코딩 산물의 발현을 검출 및 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 당분야에 공지되어 있다. 그 예는 효소-연관 면역흡착 분석(ELISA), 웨스턴 면역블롯, 방사선면역분석(RIA), 및 형광 활성화된 세포 정렬(FACS)을 포함한다. 이들 및 다른 분석은 다른 것들 중에서 [Hampton 등, Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) 및 Maddox 등, J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983)]에 기재되어 있다.

다양한 표지 및 접합 기법이 당분야의 숙련자에 의해 공지되어 있으며, 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 이용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 관련된 검출 서열에 대한 표지된 혼성화 또는 PCR 탐침의 제조 수단은 표지된 뉴클레오티드를 이용한 올리고표지, 닉 번역, 말단-표지 또는 PCR 증폭을 포함한다. 대안적으로 서열, 또는 이들의 임의 부분은 mRNA 탐침 제조용 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 벡터는 당분야에 공지되어 있으며, 상업적으로 이용 가능하고, 적절한 RNA 폴리머라아제, 예컨대 T7, T3, 또는 SP6 및 표지된 뉴클레오티드의 부가에 의해 시험관 내에서 RNA 탐침을 합성하는데 이용될 수 있다. 이들 절차는 다양한 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용하여 수행될 수 있다. 이용될 수 있는 적합한 리포터 분자 또는 표지는 방사성핵종, 효소, 형광, 화학발광, 또는 색소 제제뿐만 아니라 기질, 보조인자, 저해제, 자기 입자 등을 포함한다.

관심 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양으로부터 단백질의 발현 및 회수에 적합한 조건 하에 배양될 수 있다. 특정한 구현예는 무혈청 세포 발현계를 이용한다. 그 예는 무혈청 배지에서 자랄 수 있는 HEK293 세포 및 CHO 세포를 포함한다(예로 [Rosser 등, Protein Expr. Purif. 40:237-43, 2005; 및 U.S. 특허 번호 6,210,922] 참고).

재조합 세포에 의해 제조되는 단백질은 이용되는 서열 및/또는 벡터에 따라 세포내에서 분비 또는 함유될 수 있다. 당분야의 숙련자에게 이해될 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 인코딩된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 신호 서열을 함유하도록 설계될 수 있다. 다른 재조합 구축을 이용하여 가용성 단백질의 정제 및/또는 검출을 촉진할 폴리펩티드 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 결합할 수 있다. 이러한 도메인의 예는 절단 가능 및 절단 불가능한 친화도 정제 및 에피토프 태그, 예컨대 애비딘, FLAG 태그, 폴리-히스티딘 태그(예로, 6xHis), cMyc 태그, V5-태그, 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GST) 태그 등을 포함한다.

재조합 세포에 의해 제조되는 단백질은 당분야에 공지된 다양한 기법에 따라 정제 및 특징분석될 수 있다. 단백질 정제를 수행하고 단백질 순도를 분석하기 위한 예시적인 시스템은 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)(예로, AKTA 및 Bio-Rad FPLC 시스템), 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)(예로, Beckman 및 Waters HPLC)를 포함한다. 정제를 위한 예시적인 화학은 당분야에 공지된 것들 중에서 이온 교환 크로마토그래피(예로, Q, S), 크기 배제 크로마토그래피, 염 구배, 친화도 정제(예로, Ni, Co, FLAG, 말토오스, 글루타치온, 단백질 A/G), 겔 여과, 역상, 세라믹 HYPERD® 이온 교환 크로마토그래피, 및 소수성 상호반응 컬럼(HIC)을을 포함한다. 또한 제조 또는 정제 공정의 임의 단계 동안 이용되어 보통 단백질 조성물의 순도를 측정할 수 있는 분석 방법, 예컨대 SDS-PAGE(예로, 쿠마시, 은 염색), 면역블롯, 브래드포드, 및 ELISA가 포함된다.

또한 AARS 단백질 단편의 농축 방법 및 농축된 가용성 단백질을 포함하는 조성물이 포함된다. 상이한 측면에서, AARS 폴리펩티드의 이러한 농축 용액은 약 5mg/mL; 또는 약 8mg/mL; 또는 약 10mg/mL; 약 15mg/mL; 또는 약 20mg/mL 농도의 단백질을 포함할 수 있다.

하나의 측면에서, 이러한 조성물은 실질적으로 단분산성일 수 있다, 즉 AARS 폴리펩티드 조성물은 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 동적 광 산란, 또는 분석적 원심분리에 의해 평가되는 경우, 일차적으로(즉 적어도 약 90%, 또는 그 초과) 하나의 뚜렷한 분자량 형태로 존재한다.

다른 측면에서, 이러한 조성물은 적어도 약 90% 순도, 또는 일부 측면에서 적어도 약 95% 순도, 또는 일부 구현예에서 적어도 98% 순도(단백질 기준)를 갖는다. 순도는 당분야에 공지된 바와 같은 임의의 일상적 분석 방법을 통해 결정될 수 있다.

다른 측면에서, 이러한 조성물은 존재하는 단백질의 전체 양에 비해 약 10% 미만의 고분자량 응집물 함량을 갖거나, 또는 일부 구현예에서 이러한 조성물은 약 5% 미만의 고분자량 응집물 함량을 갖거나, 또는 일부 측면에서 이러한 조성물은 약 3% 미만의 고분자량 응집물 함량을 갖거나, 또는 일부 구현예에서 약 1% 미만의 고분자량 응집물 함량을 갖는다. 고분자량 응집물 함량은, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 동적 광 산란, 또는 분석적 원심분리를 포함하는 다양한 분석 기법을 통해 결정될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에서 주지되는 바와 같이 AARS 폴리펩티드 조성물은 약 10 EU 미만/AARS 폴리펩티드 mg, 또는 약 5 EU 미만/AARS 폴리펩티드 mg, 약 3 EU 미만/AARS 폴리펩티드 mg, 또는 약 1 EU 미만/AARS 폴리펩티드 mg의 내독소 함량을 갖는다.

본원에서 포함되는 농도 접근법의 예는 용액이 관심 단백질 이외 소수의 가용성 성분을 함유하는 경우 보통 채용되는 동결건조를 포함한다. 동결건조는 종종 HPLC 수행 후에 진행되며, 혼합물로부터 대부분 또는 전체 휘발성 성분을 제거할 수 있다. 또한 단백질 용액을 농축하기 위해 보통 하나 이상의 선택적인 투과막을 채용하는 초여과 기법이 포함된다. 이 막은 물 및 소분자는 통과시키고 단백질은 보유할 수 있도록 해준다; 용액은 다른 기법 중에서 기계적 펌프, 기체 압력, 또는 원심분리에 의해 막에 대해 밀려날 수 있다.

특정 구현예에서, 시약, AARS 단백질 단편, 또는 관련 제제(예로, 항체)는 당분야에서 일상적 기법에 따라 측정되는 적어도 약 90%의 순도를 갖는다. 특정 구현예, 예컨대 진단적 조성물 또는 특정 치료적 조성물에서, 본 발명의 AARS 조성물은 적어도 약 95%의 순도를 갖는다. 특정 구현예, 예컨대 치료적 또는 약학적 조성물에서, 본 발명의 AARS 조성물은 적어도 약 97% 또는 98% 또는 99%의 순도를 갖는다. 다른 구현예에서, 예컨대 참조 또는 연구 시약으로 사용되는 경우, AARS 단백질 단편은 더 적은 순도를 가질 수 있고, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 또는 80%의 순도를 가질 수 있다. 순도는 전체적으로 또는 선택된 성분, 예컨대 다른 단백질, 예로 단백질 기준 상의 순도에 관해 측정될 수 있다.

정제된 AARS 단백질 단편은 또한 이들의 생물학적 특징에 따라 특징분석될 수 있다. 그 예는 본원에 기재된 바와 같은 선택된 리간드(예로, AARS 단백질 단편의 세포 결합 파트너, 예컨대 세포-표면 수용체 또는 이들의 세포외 도메인)에 대한 결합 친화도 또는 결합 역학, 및 하나 이상의 정규적 또는 비-정규적 생물학적 활성의 존재 또는 수준을 포함한다. 결합 친화도 및 결합 역학은 당분야에 공지된 다양한 기법, 예컨대 실시간으로 미표지된 상호반응물을 검출할 수 있게 하는 광학적 현상인 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하는 Biacore® 및 관련 기술에 따라 측정될 수 있다. SPR-기반 바이오센서는 친화도 및 역학 모두의 관점에서 활성 농도, 스크리닝 및 특징분석의 결정에 이용될 수 있다. 하나 이상의 정규적 또는 비-정규적 생물학적 활성의 존재 또는 수준은 본원에 기재된 바와 같은 비-정규적 생물학적 활성의 송신정보 또는 표지자, 예컨대 형광 또는 발광 표지자에 기능적으로 커플링된 선택된 AARS 단백질 단편의 세포 결합 파트너(예로, 세포-표면 수용체)를 이용하는 것을 포함하는 세포-기반 분석에 따라 측정될 수 있다.

특정 구현예에서, 앞서 주지된 바와 같이 AARS 폴리펩티드 조성물은, 예를 들어, 약 95% 내독소가 없는, 바람직하게는 약 99% 내독소가 없는, 보다 바람직하게는 약 99.99% 내독소가 없는 것을 포함하여 거의 실질적으로 내독소가 없다. 내독소의 존재는 본원에 기재된 바와 같은 당분야의 일상적 기법에 따라 검출될 수 있다. 특정 구현예에서, AARS 조성물은 실질적으로 무혈청 배지 중에서 진핵 세포, 예컨대 포유류 또는 인간 세포로부터 제조된다.

특정 구현예에서, AARS 폴리펩티드 조성물은 약 10% wt/wt 미만의 고분자량 응집물, 또는 약 5% wt/wt 미만의 고분자량 응집물, 또는 약 2% wt/wt 미만의 고분자량 응집물, 또는 약 1% wt/wt 미만의 고분자량 응집물을 포함한다.

또한 다른 특징 가운데, 예를 들어 단백질 순도, 크기, 용해도, 및 응집도를 평가하기 위해 이용될 수 있는 단백질-기반 분석적 분석 및 방법이 포함된다. 단백질 순도는 여러 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 순도는 일차 구조, 보다 규칙화된 구조, 크기, 전하, 소수성, 및 글리코실화에 근거하여 평가될 수 있다. 일차 구조의 평가 방법의 예는 N- 및 C-말단 서열분석 및 펩티드-맵핑을 포함한다(예로 [Allen 등, Biologicals. 24:255-275, 1996] 참고). 보다 규칙화된 구조의 평가 방법의 예는 원편광 이색성(예로 [Kelly 등, Biochim Biophys Acta. 1751:119-139, 2005] 참고), 형광 분광측정(예로 [Meagher 등, J. Biol. Chem. 273:23283-89, 1998] 참고), FT-IR, 아미드 수소-중수소 교환 역학, 시차 주사 열량계, NMR 분광측정, 입체형태적으로 민감한 항체를 이용한 면역반응성을 포함한다. 보다 규칙화된 구조는 또한 다양한 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 또는 첨가된 염의 함수로서 평가될 수 있다. 단백질 특징, 예컨대 크기의 평가 방법의 예는 분석적 원심분리 및 크기 배제 HPLC(SEC-HPLC)를 포함하며, 전하 측정의 예시적인 방법은 이온-교환 크로마토그래피 및 등전위 포커싱을 포함한다. 소수성은, 예를 들어 역상 HPLC 및 소수성 상호반응 크로마토그래피 HPLC에 의해 평가될 수 있다. 글리코실화는 약동학(예로 제거), 입체형태 또는 안정성, 수용체 결합, 및 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있고, 예를 들어 질량 분광측정 및 핵 자기 공명(NMR) 분광측정에 의해 평가될 수 있다.

앞서 주지된 바와 같이, 특정 구현예에는 다른 용도 중에서 단백질 특징, 예컨대 순도, 크기(예로 크기 동질성) 또는 응집도를 평가하고/하거나 단백질을 정제하기 위한 SEC-HPLC의 용도가 포함된다. 겔-여과 크로마토그래피(GFC) 및 겔-투과 크로마토그래피(GPC)를 또한 포함하는 SEC은 용액 중 분자가 이들의 크기, 또는 보다 구체적으로 이들의 수력학적 부피, 확산 계수, 및/또는 표면 특성에 근거하여 다공성 재료에서 분리되는 크로마토그래피 방법을 나타낸다. 공정은 일반적으로 생물학적 분자를 분리하고 중합체의 분자량 및 분자량 분포를 결정하기 위해 이용된다. 보통 생물학적 또는 단백질 표본(예컨대 본원에서 제공되고 당분야에 공지된 단백질 발현 방법에 따라 제조되는 단백질 추출물)은 정의된 정지상(다공성 재료), 바람직하게는 표본 중 단백질과 상호작용하지 않는 상을 갖는 선택된 크기-배제 컬럼 내로 로딩된다. 특정 측면에서, 정지상은 유리 또는 스틸 컬럼 내에서 밀집한 3차원적 매트릭스 내로 패킹된 불활성 입자로 이루어진다. 이동상은 순수한 물, 수성 완충액, 유기 용매, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 정지상 입자는 보통 특정 크기 미만의 분자만이 도입될 수 있도록 하는 작은 기공 및/또는 채널을 갖는다. 따라서 큰 입자는 이들 기공 및 채널로부터 배제되며, 정지상과 이들의 제한된 상호반응은 이들이 실험 개시 시 "완전 배제된" 피크로 용출되도록 한다. 기공 내에 들어갈 수 있는 더 작은 분자는 유동 이동상으로부터 제거되며, 이들이 정지상 기공 중에 고정화되어 보내는 시간은 부분적으로 이들이 기공 내로 얼마나 멀리 투과하는지에 의존한다. 이들의 이동상으로부터의 제거는 컬럼에서의 용출을 더 오래 걸리게 만들고 이들의 크기 차이에 기반한 입자간 분리를 일으킨다. 주어진 크기 배제 컬럼은 분리될 수 있는 분자량 범위를 갖는다. 전체적으로, 상한치보다 큰 분자는 정지상에 의해 트랩되지 않을 것이며, 하한치보다 작은 분자는 고상으로 완전히 도입되어 단일 밴드로 용출될 것이며, 범위 내의 분자는 이들의 특성, 예컨대 수력학적 부피에 의해 정의되는 상이한 속도로 용출될 것이다. 약학적 단백질을 이용한 수행에서의 이들 방법의 예로써 [Bruner 등, Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis. 15: 1929-1935, 1997]을 참고하라.

임상적 적용을 위한 단백질 순도는 또한, 예를 들어 [Anicetti 등, (Trends in Biotechnology. 7:342-349, 1989)]에서 논의된다. 단백질 순도를 분석하기 위한 보다 최근의 기법은 단백질 역가의 고처리량 분석, 체질, 및 순도 분석을 제공하는 단백질 및 핵산의 신속한 분석을 위한 자동화된 플랫폼인 LabChip GXII를 비제한적으로 포함한다. 특정한 비제한적 구현예에서, 임상적 등급 단백질, 예컨대 단백질 단편 및 항체는 다른 방법 중에서 적어도 두 교차 단계로 크로마토그래피 재료의 조합을 이용하여 수득될 수 있다(예로 [Therapeutic Proteins: Methods and Protocols. Vol. 308, Eds., Smales and James, Humana Press Inc., 2005] 참고). 보통, 단백질 제제(예로, AARS 단백질 단편, 항체, 결합 제제) 및 다른 제제(예로, 안티센스, RNAi, 소분자)는 당분야에 공지되고 본원에서 기재된 기법에 따라 측정되어 실질적으로 내독소가 없다.

단백질 용해도 분석이 또한 포함된다. 이러한 분석은, 예를 들어 재조합 제조를 위한 최적 성장 및 정제 조건의 결정, 완충액(들)의 선택 최적화, 및 AARS 단백질 단편 또는 이들의 변이체의 선택 최적화를 위해 이용될 수 있다. 용해도 또는 응집은 온도, pH, 염, 및 다른 첨가제의 존재 또는 부재를 포함하는 다양한 파라미터에 따라 평가될 수 있다. 용해도 스크리닝 분석의 예는 다른 것들 중에서 종점으로 탁도 또는 다른 척도를 이용하는 단백질 용해도 측정의 마이크로플레이트-기반 방법, 정제된 재조합 단백질의 용해도 분석을 위한 고처리량 분석(예로 [Stenvall 등, Biochim Biophys Acta. 1752:6-10, 2005] 참고), 생체 내 단백질 폴딩 및 용해도를 모니터링하고 측정하기 위해 유전적 마커 단백질의 구조적 상보화를 이용하는 분석(예로 [Wigley 등, Nature Biotechnology. 19:131-136, 2001] 참고), 및 주사 전기화학 현미경(SECM)을 이용하는 대장균에서의 재조합 단백질 용해도의 전기화학적 스크리닝(예로 [Nagamine 등, Biotechnology and Bioengineering. 96:1008-1013, 2006] 참고)을 비제한적으로 포함한다. 증가된 용해도(또는 감소된 응집)를 갖는 AARS 단백질 단편은 단백질 용해도에 대한 단순 생체 내 분석을 포함하여, 당분야의 일상적 기법에 따라 동정 또는 선택될 수 있다(예로 [Max웰 등, Protein Sci. 8:1908-11, 1999] 참고).

단백질 용해도 및 응집은 또한 동적 광 산란 기법에 의해 측정될 수 있다. 응집은 가용성/불용성, 공유/비공유, 가역적/비가역적, 및 천연/변성된 상호반응 및 특징을 포함하는 몇몇 유형의 상호반응 또는 특징을 포괄하는 일반적 용어이다. 단백질 치료제에 있어서, 응집물의 존재는 보통 응집물이 면역원성 반응(예로 소응집물)을 일으킬 수 있거나, 또는 투여 시 역효과(미립자)를 일으킬 수 있다는 우려사항 때문에 바람직하지 않은 것으로 간주된다. 동적 광 산란이란 용액 중 단백질과 같은 중합체 또는 현탁액 중 소립자의 크기 분포 프로필을 결정하는데 이용될 수 있는 기법을 나타낸다. 상기 기법은 또한 광자 연관 분광측정(PCS) 또는 쿼지 탄성 광 산란(QELS)으로 불리며, 단백질 입자의 확산 속도를 측정하기 위해 산란광을 이용한다. 산란 강도의 변동은 용액 중 분자 및 입자의 브라운 운동으로 인해 관찰될 수 있다. 상기 운동 데이터는 표본에 대해 크기 분포를 유도하도록 통상 조절될 수 있으며, 여기서 그 크기는 단백질 입자의 스트로크 반경 또는 수력학적 반경으로 주어진다. 수력학적 크기는 질량 및 형태(입체형태) 모두에 의존한다. 동적 산란은 큰 범위의 질량을 함유하는 표본 중에서도 매우 소량의 응집 단백질(< 0.01중량%)의 존재를 검출할 수 있다. 또한, 예를 들어 승온에서 변화의 실시간 모니터링에 의존하는 용도를 포함하여, 상이한 제형의 안정성 비교를 위해 이용될 수 있다. 따라서, 특정 구현예는 본 발명의 AARS 단백질 단편, 항체, 또는 다른 제제를 함유하는 표본 중 응집물의 용해도 및/또는 존재를 분석하기 위한 동적 광 산란의 용도를 포함한다.

IX . 진단적 방법 및 조성물

본원에 기재된 AARS 제제, 예컨대 AARS 단백질 단편, AARS 폴리뉴클레오티드, 및 항체 및 다른 결합 제제는 진단적 분석 및 진단적 조성물에서 이용될 수 있다. 다른 것들 중에서, 생화학적, 조직학적, 및 세포-기반 방법 및 조성물이 포함된다.

이들 및 관련 구현예는 AARS 폴리펩티드로도 불리는 하나 이상의 새로 동정된 AARS 단백질 단편의 AARS 폴리뉴클레오티드 서열(들) 또는 대응 AARS 폴리펩티드 서열(들) 또는 이들의 일부의 검출을 포함한다. 예를 들어, 특정 측면은 하나 이상의 새로 동정된 AARS 스플라이스 변이체의 AARS 폴리뉴클레오티드 서열(들) 또는 대응 폴리펩티드 서열(들) 또는 이들의 일부, 및/또는 이들 스플라이스 변이체의 하나 이상의 스플라이스 결찰부의 검출을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 스플라이스 결찰부의 폴리뉴클레오티드 또는 대응 폴리펩티드 서열(들)은 특정 AARS 스플라이스 변이체에 독특한 것이다.

또한 스플라이스 변이체, 단백분해 단편 등을 포함하는 AARS 단백질 단편의 직접적 검출이 포함된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 새로 동정된 AARS 단백질 단편의 존재 또는 수준은 하나 이상의 세포 유형 또는 세포 상태와 연관되거나 관련된다. 따라서, AARS 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 수준은 상이한 세포 유형 또는 상이한 세포 상태 간 구별을 위해 이용될 수 있다. AARS 단백질 단편 또는 이들의 관련 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 수준은 본원에 기재된 바와 같고 당분야에 공지된 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드-기반 진단적 기법에 따라 검출될 수 있다.

특정 측면은 보통 대상체 또는 모집단 대상체가 특정 의학적 치료에 대해 우호적으로 반응할 것인지 여부를 평가하기 위해 동반 진단 방법의 일환으로 AARS 단백질 단편, 항체, 또는 AARS 폴리뉴클레오티드를 채용할 수 있다. 예를 들어, 주어진 AARS 치료적 제제(예로 단백질 단편, 안티센스, RNAi, 항체, 결합 제제)는 대상체(들)가 주어진 질환 또는 상태에 대해 하나 이상의 선택된 바이오마커를 갖는지 여부에 근거하여 대상체 또는 대상체의 특정 모집단에 적합한 것으로 동정될 수 있다. 바이오마커의 예는 혈청/조직 마커뿐만 아니라 의학적 조영 기법에 의해 동정될 수 있는 마커를 포함한다. 특정 구현예에서, 천연-생성 AARS 단백질 단편(또는 그 대응 폴리뉴클레오티드)은 자체가 특정 대상체 또는 대상체의 특정 모집단에서 약물 사용의 필요성을 평가하거나 약물 결과를 측정하기 위해 이용될 수 있는 혈청 및/또는 조직 바이오마커를 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, AARS 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 참조 서열의 동정은 본원에 기재된 바와 같고 당분야에 공지된 선택된 대상체, 선택된 조직, 또는 다른 방식인지 여부와 무관하게 해당 서열의 상이한 발현을 특징분석하는 것을 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 특정 방법은 조건 또는 세포, 조직, 또는 대상체의 상태를 특징 분석하고 이를 다른 세포, 조직, 또는 대상체와 구별하기 위한 AARS 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 상이한 발현에 의존한다. 비제한적 예는 일차 세포 배양물 및 다른 세포 배양물, 예컨대 무한증식 세포 배양물에 부가하여 상이한 종의 세포 또는 조직 간, 상이한 조직 또는 기관, 세포 발달 상태, 예컨대 신생아 및 성인, 세포 분화 상태, 상태, 예컨대 건강한, 병이 있는 및 치료받은 상태, 세포내 및 세포외 분획의 세포 간을 구별하기 위한 생물학적 표본 중 AARS 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 수준의 검출 방법을 포함한다.

상이한 발현은 적절한 대조군에서 동일한 서열의 발현 수준에 비해 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열의 하나 이상의 유전자 발현 수준의 통계적으로 유의미한 차이를 포함한다. 통계적으로 유의미한 차이는 RNA 수준, 단백질 수준, 단백질 기능, 또는 임의의 다른 유전자 발현 관련 척도, 예컨대 본원에서 기재되는 것으로 측정되는 발현 수준의 증가 또는 감소에 관련될 수 있다. 또한 본 발명의 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 및 보통 동일하거나 대응하는 유형의 전장 또는 야생형 세포질 또는 미토콘드리아 AARS 서열 간 비교가 포함된다. 상이한 발현은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 기반 기법, 예컨대 실시간 PCR, 감산 혼성화, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 어레이 등을 포함하여, 본원에서 기재되는 당분야의 다양한 기법으로 검출될 수 있다.

우연히 일어날 것 같지 않은 경우, 결과는 보통 통계적으로 유의미한 것으로 언급된다. 평가 또는 결과의 유의성 수준은 전통적으로 가장 빈번한 통계적 가설 평가 개념에 관련된다. 단순한 경우에서, 통계적 유의성은 귀무 가설이 실제로 사실인 경우 귀무 가설을 거부하는 결정(I형 오류로 공지된 결정, 또는 "위양성 결정")을 수행할 개연성으로 정의될 수 있다. 이러한 결정은 종종 p-값을 이용하여 수행된다: p-값이 유의성 수준 미만이면, 귀무 가설은 거부된다. 더 작은 p-값이 더 유의미한 결과를 나타낸다. Bayes 인자가 또한 통계적 유의성 결정에 이용될 수 있다(예로 [Goodman S., Ann Intern Med 130:1005-13, 1999] 참고).

보다 복잡하지만 실제로 중요한 경우에서, 평가 또는 결과의 유의성 수준은 귀무 가설이 실제로 사실인 경우 귀무 가설을 거절하는 결정을 수행할 개연성이 언급되는 개연성 이하인 분석을 반영할 수 있다. 이러한 유형의 분석은 이러한 용도에 대해 거절하기로 결정할 개연성이 귀무 가설 내에 포괄된 일부 가정 세트에 대한 유의성 수준보다 훨씬 더 작을 수 있게 한다.

특정한 예시적 구현예에서, 통계적으로 유의미한 상이한 발현은 주어진 AARS 서열의 발현 수준이 적절한 대조군에 비해 추정되는 생물학적 표본 중에서 그 사이의 모든 정수 및 소수를 포함하여(예로 1.24X, 1.25X, 2.1X, 2.5X, 60.0X, 75.0X, 등) 적어도 약 1.2X, 1.3X, 1.4X, 1.5X, 1.6X, 1.7X, 1.8X, 1.9X, 2.0X, 2.2X, 2.4X, 2.6X, 2,8X, 3.0X, 4.0X, 5.0X, 6.0X, 7.0X, 8.0X, 9.0X, 10.0X, 15.0X, 20.0X, 50.0X, 100.0X, 또는 그 초과 발현차를 제공하는(즉, 더 높거나 더 낮은 발현일 수 있는 상이한 발현) 상황을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 통계적으로 유의미한 상이한 발현은 주어진 AARS 서열의 발현 수준이 적절한 대조군에 비해 추정되는 생물학적 표본 중에서 그 사이의 모든 정수 및 소수를 포함하여 적어도 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000퍼센트(%) 또는 그 초과 발현차(즉, 더 높거나 낮을 수 있는 상이한 발현)를 제공하는 상황을 포함할 수 있다.

부가적 예로서, 상이한 발현이 또한 본원에 기재된 바와 같으며 당분야에 공지된(실시예 1 참고) Z-평가를 수행하여, 즉 절대 Z 스코어를 계산하여 결정될 수 있다. Z-평가는 보통 표본 평균 및 모집단 평균 간 유의미한 차이를 동정하는데 이용된다. 예를 들어, 표준 정상 표(예로 대조군 조직)에 비교되는 바와 같이 95% 신뢰도 구간에서(즉, 5% 유의성 수준에서), 1.96을 초과하는 절대 값을 갖는 Z-스코어는 비-무작위성을 나타낸다. 99% 신뢰도 구간에 대해서, 절대 Z가 2.58 초과인 경우 이는 p<0.01이며 차이가 더욱 더 유의미하다는 것을 의미한다-귀무 가설은 더 큰 신뢰도로 거부될 수 있다. 이들 및 관련 구현예에서, 사이의 모든 소수를 포함해서(예로, 10.1, 10.6, 11.2 등) 1.96, 2, 2.58, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 초과의 절대 Z-스코어는 통계적 유의성의 강력한 척도를 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 6을 초과하는 절대 Z-스코어는 예외적으로 높은 통계적 유의성을 제공할 수 있다.

실질적으로 유사하게란 일반적으로 생물학적 표본 및 참조 대조군 간 발현 수준의 통계적으로 유의미한 차이의 부재에 관련된다. 실질적으로 유사한 발현 수준의 예는 참조 표본 대비 추정되는 생물학적 표본에서의 주어진 SSCIGS의 발현 수준이 사이의 모든 소수를 포함해서(예로, 0.15X, 0.25X, 0.35X 등) 약 0.05X, 0.1X, 0.2X, 0.3X, 0.4X, 0.5X, 0.6X, 0.7X, 0.8X, 0.9X, 1.0X, 1.1X, 1.2X, 1.3X, 또는 1.4X 미만의 발현차(즉, 더 높거나 더 낮은 발현일 수 있는 상이한 발현)를 제공하는 상황을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상이한 발현은 참조 표본 대비 추정되는 생물학적 표본에서의 주어진 AARS 서열의 발현 수준이 사이의 모든 소수를 포함해서 약 0.25. 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50퍼센트(%) 미만의 발현차(즉, 더 높거나 더 낮을 수 있는 상이한 발현)을 제공하는 상황을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 예컨대 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열의 발현 수준을 측정하기 위해 Affymetrix 마이크로어레이를 이용하는 경우, 상이한 발현은 또한 보통 1000의 척도화된 평균 발현 값을 갖는 Affymetrix 마이크로어레이 Suite 5 소프트웨어(Affymetrix, Santa Clara, CA), 또는 다른 유사한 소프트웨어에 의해 요약되는 평균 발현 값으로 결정될 수 있다.

본 발명의 구현예는 세포 또는 조직 간 또는 상이한 개체 또는 종의 다른 생물학적 표본 간을 구별하기 위한 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열 또는 이들의 일부의 존재 또는 수준의 검출 방법을 포함하며, 해당 서열의 존재 또는 수준은 선택된 개체 또는 종에 연관된다. 일반 예는 인간 및 임의 조합의 박테리아, 진균, 식물, 및 다른 비-인간 동물 간 구별 방법을 포함한다. 동물 내에서는 인간 및 임의 조합의 척추동물, 예컨대 어류, 양서류, 파충류, 조류 및 비인간 포유류를 포함하는 척추동물, 및 무척추동물, 예컨대 곤충, 연체동물, 갑각류 및 산호를 포함하는 무척추동물 간 구별 방법이 포함된다. 비-인간 포유류 내에서는 인간 및 임의 조합의 아프리카땃쥐목, 코끼리땃쥐목, 관치목, 바위너구리목, 장비목, 해우목, 피갑목, 필로사목, 나무두더지목, 날원숭이목, 영장목, 쥐목, 토끼목, 고슴도치목, 땃쥐목, 박쥐목, 유린목, 고래목, 식육목, 말목 또는 소목 유래의 비-인간 포유류 간 구별 방법이 포함된다. 영장류 내에는 당분야에 공지된 다른 것들 중에서 원숭이, 유인원, 고릴라 및 침팬지가 포함된다. 따라서 본원에 기재된 바와 같은 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열 또는 변이체의 존재 또는 수준은 임의 조합의 이들 개체 간의 구별에 의해 또는 인간 및 임의의 하나 이상의 이들 개체, 예컨대 개체 패널 간 구별에 의해 주어진 생물학적 표본, 예컨대 세포, 조직, 또는 기관의 원천을 동정하는데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 주어진 생물학적 표본의 원천은 또한 AARS 서열 또는 이들의 일부의 존재 또는 수준을 소정값과 비교하여 결정될 수 있다.

본 발명의 구현예는 상이한 조직 또는 기관에서 기원하는 다른 생물학적 표본 또는 세포 간 구별을 위한 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열 또는 이들의 일부의 존재 또는 수준의 검출 방법을 포함한다. 비제한적 예는 임의 조합의 피부(예로 진피, 표피, 피하층), 모낭, 신경계(예로 뇌, 척추, 말초 신경), 청각계 또는 균형 기관(예로 내이, 중이, 외이), 호흡계(예로 코, 기관, 폐), 위식도 조직, 위장관계(예로 입, 식도, 위, 소장, 대장, 직장), 혈관계(예로 심장, 혈관 및 동맥, 간, 방광, 림프계/면역계(예로 림프절, 림프여포, 비장, 흉선, 골수), 비뇨생식계(예로 신장, 자궁, 방광, 요도, 자궁경부, 난관, 난소, 자궁, 외음, 전립선, 구요도선, 부고환, 전립선, 정낭, 고환), 근골격계(예로 골격근, 평활근, 뼈, 연골, 힘줄, 인대), 지방 조직, 유선 조직, 및 내분비계(예로 시상하부, 뇌하수체, 갑상선, 췌장, 부신)에서 기원하는 세포 또는 다른 생물학적 표본 간 구별 방법을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 연관성에 근거하여, 이들 방법은 세포 또는 다른 생물학적 표본이 유도된 조직 또는 기관을 동정하거나 특징분석하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 구현예는 세포의 발달 또는 분화 상태 간 구별이나 특징분석을 위한 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열 또는 이들의 일부의 존재 또는 수준의 검출 방법을 포함한다. 또한 생식 세포, 줄기 세포, 및 체세포 간 구별 방법이 포함된다. 발달 상태의 예는 신생아 및 성인을 포함한다. 세포 분화 상태의 예는 만능 세포, 다능 세포, 다능 전구체 줄기 세포 및 완전 분화된 성숙 세포 간의 독특하고 식별 가능한 전체 단계를 포함한다.

전능 세포는 전체 잠재력을 가지며, 보통 유성 및 무성 생식 동안 생기고, 포자 및 접합체를 포함하지만, 특정 예에서는 세포가 탈분화하여 전능성을 회복할 수 있다. 다능 세포는 내배엽(내부 위 내층, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 및 외배엽(표피 조직 및 신경계)을 포함하는 임의의 3배엽층으로 분화할 잠재력을 갖는 줄기 세포를 포함한다. 다능 전구체 세포는 보통 제한된 수의 조직 유형으로 분화할 수 있다. 다능 세포의 예는 면역 세포, 예컨대 적혈구, 백혈구, 및 혈소판을 만드는 골수 유래의 조혈 줄기 세포(성인 줄기 세포), 간질 세포, 지방 세포, 및 다양한 유형의 뼈 세포를 만드는 골수 유래의 중간엽 줄기 세포(성인 줄기 세포), 다양한 유형의 피부 세포를 만드는 상피 줄기 세포(전구체 세포), 및 분화된 근육 조직에 기여하는 근육 위성 세포(전구체 세포)를 비제한적으로 포함한다. 따라서, 특정 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열(예로, AARS 스플라이스 변이체, AARS 단백분해 단편의 스플라이스 결찰부)의 존재 또는 수준은 대조군 또는 소정 수준 대비 상기 주지된 세포 분화 상태 간 구별이나 특징분석을 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 구현예는 상태 또는 세포, 조직, 기관, 또는 대상체의 특징분석 또는 진단을 위한 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열의 존재 또는 수준의 검출 방법을 포함하며, 여기서 상태는 건강하거나, 병이 있거나, 병이 있을 위험성이 있거나 또는 치료받은 것으로 특징분석될 수 있다. 이러한 진단적 목적을 위해, "진단적" 또는 "진단되는"이라는 용어는 병리학적 상태의 존재 또는 성질의 동정, 이러한 상태가 발생할 위험성의 특징분석, 및/또는 요법에 대해 반응한 병리학적 상태의 변화(또는 변화 없음) 측정을 포함한다. 진단적 방법은 이들의 감수성 및 특이성이 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 진단적 분석의 "감수성"은 양성으로 평가되는 병이 있는 세포, 조직 또는 대상체의 백분율("실제 양성" 퍼센트)을 나타낸다. 분석에서 검출되지 않는 병이 있는 세포, 조직 또는 대상체는 보통 "위음성"으로 불린다. 병이 없으며 분석에서 음성으로 평가된 세포, 조직 또는 대상체는 "진음성"으로 명명될 수 있다. 특정 구현예에서, 진단적 분석의 "특이성"은 1-위양성 비율로 정의될 수 있으며, 여기서 "위양성" 비율은 양성으로 평가되로 질환이 없는 표본 또는 대상체의 비율로서 정의된다. 특정한 진단적 방법이 상태의 확진을 제공하지 않을 수도 있지만, 방법이 진단을 보조하는 양성 표지를 제공한다면 충분하다.

특정 예에서, 병리학적 상태의 존재 또는 발생 위험성은 적합한 대조군에 비해 증가되거나 감소된 수준에 의한 것인지 여부와는 무관하게 상태와 연관되는 하나 이상의 선택된 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열 또는 이들의 일부의 존재 또는 수준을 비교하여 진단될 수 있다. "적합한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 예를 들어 정상 형질, 예컨대 상태의 부재를 나타내는 세포 또는 조직 또는 개체의 다른 생물학적 표본, 예로 대조군 또는 정상 세포, 조직 또는 개체에서 결정되는 값, 수준, 특색, 특징, 또는 특성을 포함한다. 특정 구현예에서, "적합한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 사전 정의된 값, 수준, 특색, 특징, 또는 특성이다. 다른 적합한 대조군은 당분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 질환 및 상태의 예는 본원에서 다른 곳에 기재된다.

본 발명의 구현예는 검출 감수성으로 인해 특정 이점을 제공하는 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 핵산-기반 검출 기법을 포함한다. 따라서, 특정 구현예는 진단적 방법 또는 분석의 일부로서 AARS 폴리뉴클레오티드의 이용 또는 검출에 관한 것이다. AARS 폴리뉴클레오티드의 존재 및/또는 수준은 다른 것들 중에서 혼성화 분석, 예컨대 노던 블롯, 정량적 또는 정성적 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), 정량적 또는 정성적 역전사효소 PCR(RT-PCR), 마이크로어레이, 도트 또는 슬롯 블롯, 또는 원 위치 혼성화, 예컨대 형광 원 위치 혼성화(FISH)를 포함하는 당분야에 공지된 임의의 방법으로 측정될 수 있다. 이들 방법의 일부는 하기에서 보다 상세히 기재된다.

AARS 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA는 당분야에 공지된 기법, 예컨대 [Kingston. (2002) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (예로 [Nelson 등, Proc Natl Acad Sci U S A, 99: 11890-11895, 2002]에 기재된 것 참고)] 및 다른 곳에 기재된 기법을 이용하여 혈액, 생물학적 유체, 조직, 기관, 세포주, 또는 다른 관련 표본으로부터 수집되고/되거나 생성될 수 있다.　 또한, RNA를 구축하기 위한 다양한 상업적으로 이용 가능한 키트가 본 발명에서 이용되기 위한 RNA의 제조를 위해 유용하다.　 RNA는 건강한 정상 대상체에서 획득된 기관/조직/세포에서 구축될 수 있다; 그러나 본 발명은 또한 병이 있는 대상체에서의 RNA 구축을 포함한다.　 특정 구현예는 임의 유형의 대상체 또는 동물 유래의 임의 유형의 기관의 이용을 포함한다. 표본을 평가하기 위해, RNA는 조직 표본, 생물학적 유체(예로 전혈) 등으로부터 가시적인 질환을 갖거나 갖지 않는 개체(예로 포유류를 포함하는 임의의 동물)로부터 획득될 수 있다.

특정 구현예에서, cDNA 서열의 증폭 또는 구축은 검출 능력을 증가시키는데 도움이 될 수 있다. 본 개시물뿐만 아니라 당분야에서는 이러한 업무를 수행하기 위한 자세한 전제 수준을 제공한다. 하나의 예시적인 구현예에서, 전혈이 RNA의 원천으로 사용되며, 이에 따라 RNA 안정화 시약, 예컨대 [Thach 등, J. Immunol. Methods. Dec 283(1-2):269-279, 2003 및 Chai 등, J. Clin. Lab Anal. 19(5):182-188, 2005(둘 다 참조로 도입됨)]에 기재된 바와 같은 PAX 튜브가 선택적으로 사용된다. 상보적 DNA(cDNA) 라이브러리는 당분야에 공지된 기법, 예컨대 [Ausubel 등, (2001 Current Protocols in Molecular biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Sambrook 등, (1989 Molecular Cloning, 제 2 Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Maniatis 등, (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)] 및 다른 곳에서 기재된 기법을 이용하여 생성될 수 있다.　 또한, cDNA 라이브러리의 구축을 위해 상업적으로 이용 가능한 다양한 키트가 본 발명의 cDNA 라이브러리를 제조하는데 유용하다.　 라이브러리는 건강한 정상 대상체에서 수득되는 기관/조직/세포로부터 구축될 수 있다.

특정 구현예는 AARS 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 혼성화 방법을 채용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 혼성화 분석을 수행하기 위한 방법은 당분야에서 잘 개발되어 있다. 혼성화 분석 절차 및 조건은 용도에 따라 다를 것이며, [Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed. Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987); Young and Davis, PNAS. 80: 1194 (1983)]에 나타낸 것을 포함하는 공지된 일반적 결합 방법에 따라 선택된다. 반복되고 조절되는 혼성화 반응을 수행하기 위한 방법 및 장치는 그 각각이 본원에 참조로 도입되는 U.S. 특허 번호 5,871,928, 5,874,219, 6,045,996 및 6,386,749, 6,391,623에 기재되어 있다.

특정 구현예는 AARS 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 핵산 증폭 방법을 채용할 수 있다. "증폭" 또는 "핵산 증폭"이라는 용어는 목적하는 특정 표적 핵산 서열의 적어도 일부를 함유하는 표적 핵산의 다중 사본의 제조를 나타낸다. 다중 사본은 앰플리콘 또는 증폭 산물로 불릴 수 있다. 특정 구현예에서, 증폭된 표적은 전체 표적 유전자 서열(인트론 및 엑손) 또는 발현되는 표적 유전자 서열(엑손의 스플라이스된 전사체 및 인접 미번역 서열) 미만을 함유한다. 예를 들어, 특정 앰플리콘은 표적 폴리뉴클레오티드의 내부 위치로 혼성화하고 이로부터 중합을 개시하는 증폭 프라이머를 사용한 표적 폴리뉴클레오티드의 일부의 증폭에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는 증폭된 부분은 임의의 다양한 널리-공지된 방법을 이용하여 검출될 수 있는 검출 가능한 표적 서열을 함유한다.

본원에서 사용되는 "선택적 증폭" 또는 "특이적 증폭"은 본 발명에 따른 표적 핵산 서열의 증폭을 나타내며, 표적 서열의 검출 가능한 증폭은 일부 다른 표본 원천, 예로 증폭 반응이 수행되는 환경에서 또는 증폭 반응 동안 사용되는 시약에 존재하는 오염에 기인하는 표적 핵산 서열에 기인하지 않고 평가되는 관심 핵산 표본에 기인하는 표적 서열의 증폭으로 실질적으로 제한된다.

"증폭 조건"이라는 용어는 본 발명에 따른 핵산 증폭을 허용하는 조건을 나타낸다. 증폭 조건은, 일부 구현예에서 본원에 기재된 바와 같은 "엄격한 혼성화 조건"보다 덜 엄격할 수 있다. 본 발명의 증폭 반응에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 증폭 조건 하에 이들의 목적 표적과 혼성화하지만, 엄격한 혼성화 조건 하에서는 혼성화하거나 혼성화하지 않을 수 있다. 반면, 본 발명의 검출 탐침은 보통 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화한다. 본 발명에 따른 핵산 증폭을 수행하기 위해 허용 가능한 조건은 채용되는 특정 증폭 방법에 따라 당업자에 의해 쉽게 지정될 수 있다.

핵산 증폭의 여러 널리-공지된 방법은 이중쇄 핵산을 대안적으로 변성시키고 프라이머를 혼성화하기 위해 열 사이클링을 필요로 한다; 그러나 다른 널리-공지된 핵산 증폭 방법은 등온을 이용한다. 통상 PCR로 불리는 폴리머라아제 연쇄 반응(U.S. 특허 번호 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188)은 표적 서열의 복제수를 지수적으로 증가시키기 위해 여러 사이클의 변성, 프라이머 쌍의 반대 가닥으로의 어닐링, 및 프라이머 연장을 이용한다. RT-PCR로 불리는 변형에서, 역전사효소(RT)는 mRNA로부터 상보적 DNA(cDNA)를 제조하기 위해 사용되며, 이어서 cDNA는 DNA의 다중 사본을 제조하기 위해 PCR로 증폭된다.

앞서 주지된 바와 같이, "PCR"이라는 용어는 표적 핵산 종을 선택적으로 증폭하는 다중 증폭 사이클을 나타낸다. 정량적 PCR(qPCR), 실시간 PCR, 역전사 PCR(RT-PCR) 및 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)이 포함되며 당분야에서 잘 설명되어 있다. "pPCR"이라는 용어는 정량적 폴리머라아제 연쇄 반응을 나타내며, "qRT-PCR"이라는 용어는 정량적 역전사 폴리머라아제 연쇄 반응을 나타낸다. qPCR 및 qRT-PCR은 표적화된 cDNA 분자를 증폭하고 동시에 정량하는데 이용될 수 있다. 이는 cDNA 풀에서 특정 서열, 예컨대 선택된 AARS 유전자 또는 전사체의 검출 및 정량을 모두 가능케 한다.

"실시간 PCR"이라는 용어는 PCR 중의 모든 이중쇄(ds) DNA에 결합하여 염료의 형광을 일으키는 DNA-결합 염료를 이용할 수 있다. 따라서 PCR 동안 DNA 산물의 증가는 형광 강도의 증가를 일으키며, 각 사이클마다 측정되어 DNA 농도를 정량할 수 있다. 그러나 dsDNA 염료, 예컨대 SYBR Green은 모든 dsDNA PCR 산물에 결합할 것이다. 형광은 실시간 PCR 열 사이클러에서 검출 및 측정되며, 산물의 지수적 증가에 대응하는 그 기하적 증가를 이용하여 각 반응에서의 역치 사이클("Ct")을 결정한다.

"Ct 스코어"라는 용어는 PCR 증폭이 역치 수준을 능가하는 사이클인 역치 사이클 수를 나타낸다. 표본 중 특정 유전자에 대한 mRNA의 양이 더 많은 경우, 증폭할 출발 RNA가 더 많기 때문에 저발현되는 유전자보다 더 빠르게 역치를 통과할 것이다. 따라서 낮은 Ct 스코어는 표본 중 높은 유전자 발현을 시사하며, 높은 Ct 스코어는 낮은 유전자 발현을 시사한다.

특정 구현예는 통상 LCR로 불리며 표적 핵산의 인접 영역에 혼성화하는 2세트의 상보적 DNA 올리고뉴클레오티드를 이용하는 리가아제 연쇄 반응을 채용할 수 있다(Weiss, Science. 254: 1292, 1991). DNA 올리고뉴클레오티드는 검출 가능한 이중쇄 결찰 올리고뉴클레오티드 산물을 제조하기 위해 반복된 사이클의 열 변성, 혼성화 및 결찰로 DNA 리가아제에 의해 공유 연결된다.

다른 방법은 통상 SDA로 불리며 표적 서열의 반대 가닥에 대한 프라이머 서열의 어닐링쌍, 듀플렉스 헤미포스포로티오에이트화 프라이머 연장 산물의 제조하기 위한 dNTPαS의 존재 하 프라이머 연장, 반개질된 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위의 엔도뉴클레아제-매개 닉 형성, 및 기존 가닥을 변위하고 다음 회의 프라이머 어닐링, 닉 형성 및 가닥 변위를 위한 가닥 제조를 위한 닉의 3-말단으로부터의 폴리머라아제-매개 프라이머 연장으로 산물의 기하적 증폭을 일으키기 위한 사이클을 이용하는 가닥 변위 증폭이다(Walker, G. 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396; U.S. 특허 번호 5,270,184 및 5,455,166). 호열성 SDA(tSDA)는 본질적으로 동일한 방법(유럽 특허 번호 0 684 315)으로 더 높은 온도에서 호열성 엔도뉴클레아제 및 폴리머라아제를 이용한다.

다른 증폭 방법은, 예를 들어 하기를 포함한다: 통상 NASBA로 불리는 핵산 서열 기반 증폭(U.S. 특허 번호 5,130,238); 통상 Qβ레플리카아제로 불리는, 탐침 분자 자체를 증폭하기 위해 RNA 레플리카아제를 이용하는 것(Lizardi, P. 등, 1988, BioTechnol. 6: 1197-1202); 전사 기반 증폭 방법(Kwoh, D. 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177); 자가 유지 서열 복제(Guatelli, J. 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878); 및 통상 TMA로 불리는 전사 매개 증폭(U.S. 특허 번호 5,480,784 및 5,399,491). 공지된 증폭 방법을 더 논의하려면 [Persing, David H., 1993, "In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques", Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications (Persing 등, Eds.), pp. 51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC)]을 참고하라.

본 발명의 예시적 전사-기반 증폭 시스템은 표적 영역의 다중 RNA 전사체를 제조하기 위해 RNA 폴리머라아제를 채용하는 TMA를 포함한다(U.S. 특허 번호 5,480,784 및 5,399,491). TMA는 RNA 폴리머라아제가 RNA 전사체를 제조하는 이중쇄 프로모터를 형성하기 위해 역전사효소 및 RNA 폴리머라아제의 존재 하에 표적 핵산에 혼성화하는 "프로모터-프라이머"를 이용한다. 이들 전사체는 RNA 전사체에 혼성화할 수 있는 제 2 프라이머의 존재 하에 추가 회의 TMA를 위한 주형이 될 수 있다. 열 변성을 필요로 하는 PCR, LCR 또는 다른 방법과는 달리, TMA는 RNA:DNA 하이브리드의 RNA 가닥을 소화함으로써 DNA가닥을 프라이머 또는 프로모터-프라이머와이 혼성화에 이용 가능하게 하는 RNase H 활성을 이용하는 등온 방법이다. 일반적으로, 증폭을 위해 제공되는 역전사효소와 연관된 RNase H 활성이 사용된다.

예시적 TMA 방법에서, 하나의 증폭 프라이머는 표적 RNA의 결합 부위에 혼성화할 수 있는 표적-결합 서열의 5' 에 위치한 이중쇄가 증폭될 서열에 대해 3' 위치에 있는 경우 기능적이 되는 프로모터 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로모터-프라이머이다. 프로모터-프라이머는 T7 RNA 폴리머라아제 인식을 위해 특이적인 경우 "T7-프라이머"로 불릴 수 있다. 특정 상황 하에, 프로모터-프라이머의 3' 말단, 또는 이러한 프로모터-프라이머의 하위집단은 프라이머 연장을 차단하거나 감소시키기 위해 개질될 수 있다. 미개질된 프로모터-프라이머로부터 역전사효소는 표적 RNA의 cDNA 사본을 생성하는 반면, RNase H 활성은 표적 RNA를 분해한다. 이어서 제 2 증폭 프라이머가 cDNA에 결합한다. 상기 프라이머는 이를 "T7-프라이머"와 구별하기 위해 "비-T7 프라이머"로 불릴 수 있다. 상기 제 2 증폭 프라이머로부터 역전사효소는 다른 DNA 가닥을 생성하여 한 말단에 기능적 프로모터를 갖는 이중쇄를 만든다. 이중쇄가 되는 경우, 프로모터 서열은 RNA 폴리머라아제에 결합하여 프로모터-프라이머가 혼성화되는 표적 서열의 전사를 시작할 수 있다. RNA 폴리머라아제는 상기 프로모터 서열을 이용하여 다중 RNA 전사체(즉, 앰플리콘)를, 일반적으로 약 100 내지 1,000 사본을 생성한다. 각각의 새로 합성된 앰플리콘은 제 2 증폭 프라이머와 어닐링할 수 있다. 이어서 역전사효소가 DNA 사본을 생성할 수 있는 반면, RNase H 활성은 상기 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA를 분해한다. 이어서 프로모터-프라이머는 새로 합성된 DNA에 결합하여 RNA 폴리머라아제가 다중 앰플리콘을 생성하는 이중쇄 DNA를 역전사효소가 생성할 수 있게 된다. 따라서 2 증폭 프라이머를 이용하여 수십억배의 등온 증폭이 달성될 수 있다.

특정 구현예에서, 마이크로어레이 분석 및 SAGE(유전자 발현의 연속 분석)를 포함하는 다른 기법이 특정 cDNA 라이브러리로부터 전사체의 RNA 전사체를 평가하는데 이용될 수 있다(Han, M., 등, Nat Biotechnol, 19: 631-635, 2001;　Bao, P., 등, Anal Chem, 74: 1792-1797, 2002; Schena 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-19, 1996; 및 Heller 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-55, 1997).　 MPSS와 마찬가지로 SAGE는 디지털이며, 다수의 특징적 서열을 생성할 수 있으나(예로 [Velculescu, V. E., 등, Trends Genet, 16: 423-425., 2000; Tuteja R. and Tuteja N. Bioessays. 2004 Aug; 26(8):916-22] 참고), MPSS와 같은 기법에서 이용 가능한 것보다 규모가 여러 단위 더 낮다.

특정 구현예에서, "마이크로어레이"라는 용어는 기질-결합된 복수의 핵산을 갖는 "핵산 마이크로어레이"를 포함하며, 복수의 결합된 핵산 각각에 대한 혼성화는 별도로 검출 가능하다. 기질은 고형 또는 다공성, 평면형 또는 비-평면형, 단일물이거나 분포된 것일 수 있다. 핵산 마이크로어레이는 소위 [Schena (ed.), DNA Microarrays: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford University Press (1999); Nature Genet. 21(1) (suppl.): 1-60 (1999); Schena (ed.), Microarray Biochip: Tools and Technology, Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000)]의 모든 장치를 포함한다. 핵산 마이크로어레이는 복수의 핵산이, 예를 들어 [Brenner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4): 1665-1670 (2000)]에 기재된 바와 같이 단일 평면형 기질 보다는 복수의 비드 상에 배치된 기질-결합된 복수의 핵산을 포함할 수 있다. 핵산 마이크로어레이의 예는 그 개시가 참조로 도입되는 U.S. 특허 번호 6,391,623, 6,383,754, 6,383,749, 6,380,377, 6,379,897, 6,376,191, 6,372,431, 6,351,712 6,344,316, 6,316,193, 6,312,906, 6,309,828, 6,309,824, 6,306,643, 6,300,063, 6,287,850, 6,284,497, 6,284,465, 6,280,954, 6,262,216, 6,251,601, 6,245,518, 6,263,287, 6,251,601, 6,238,866, 6,228,575, 6,214,587, 6,203,989, 6,171,797, 6,103,474, 6,083,726, 6,054,274, 6,040,138, 6,083,726, 6,004,755, 6,001,309, 5,958,342, 5,952,180, 5,936,731, 5,843,655, 5,814,454, 5,837,196, 5,436,327, 5,412,087, 및 5,405,783에서 찾아볼 수 있다.

부가적 예는 상표명 GENECHIP™ 하에 Affymetrix(Santa Clara, Calif.)에서 상업적으로 이용 가능한 핵산 어레이를 포함한다. 또한 어레이 제작 및 이용의 예시적인 방법은, 예를 들어 US. 특허 번호 7,028,629; 7,011,949; 7,011,945; 6,936,419; 6,927,032; 6,924,103; 6,921,642; 및 6,818,394에 제공된다.

어레이 및 마이크로어레이에 관련된 본 발명은 또한 고형 기질에 부착된 중합체에 대한 여러 용도를 포함한다. 이들 용도는 유전자 발현 모니터링, 감정, 라이브러리 스크리닝, 유전자형 분석 및 진단제를 포함한다. 유전자 발현 모니터링 및 감정 방법 그리고 유전자 발현 모니터링 및 감정에 유용한 방법은 U.S. 특허 번호 5,800,992, 6,013,449, 6,020,135, 6,033,860, 6,040,138, 6,177,248 및 6,309,822에 나타낸다. 유전자형 분석 및 이에 따른 용도는 U.S. 일련 번호 10/442,021, 10/013,598(U.S. 출원 번호 2003/0036069), 및 U.S. 특허 번호 5,925,525, 6,268,141, 5,856,092, 6,267,152, 6,300,063, 6,525,185, 6,632,611, 5,858,659, 6,284,460, 6,361,947, 6,368,799, 6,673,579 및 6,333,179에 나타낸다. 본원에 개시된 방법과 조합 이용될 수 있는 핵산 증폭, 표지 및 분석의 다른 방법은 U.S. 특허 번호 5,871,928, 5,902,723, 6,045,996, 5,541,061, 및 6,197,506에서 구현된다.

당분야의 숙련자에게 자명할 바와 같이, 특정 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 증폭 또는 검출용 올리고뉴클레오티드, 예컨대 프라이머 또는 탐침을 채용할 수 있다. 정의된 서열 및 화학적 구조의 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 기법, 예컨대 화학적 또는 생화학적 합성에 의해, 및 재조합 핵산 분자, 예로 박테리아 또는 바이러스 벡터로부터의 시험관 내 또는 생체 내 발현에 의해 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 야생형 염색체 DNA 또는 이들의 생체 내 전사 산물만으로 구성되지 않는다.

올리고뉴클레오티드 또는 프라이머는 주어진 개질이 주어진 올리고뉴클레오티드의 목적 기능과 상용성인 한 임의의 방식으로 개질될 수 있다. 당업자는 주어진 개질이 본 발명의 임의의 주어진 올리고뉴클레오티드에 대해 적합하거나 의도하는 바인지를 쉽게 결정할 수 있다. 관련 AARS 올리고뉴클레오티드는 본원에서 다른 곳에서 더 상세히 기재된다.

올리고뉴클레오티드의 설계 및 서열은 본원에 기재된 바와 같은 이들의 기능에 의존하지만, 몇몇 변수가 일반적으로 고려된다. 가장 관련된 것들 중에는 다음과 같은 것들이 있다: 길이, 용융 온도(Tm), 특이성, 시스템 내 다른 올리고뉴클레오티드와의 상보성, G/C 함량, 폴리피리미딘(T, C) 또는 폴리퓨린(A, G) 연신물, 및 3'-말단 서열. 이들 및 다른 변수의 조절은 올리고뉴클레오티드 설계의 표준이고 널리 공지된 측면이며, 다양한 컴퓨터 프로그램이 최적 목적을 위해 다수의 잠재적 올리고뉴클레오티드를 스크리닝하는데 쉽게 이용 가능하다.

따라서 특정 구현예는 a) 혼성화 복합체가 상기 탐침 및 상기 표적 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 단편 간에 형성되는 조건 하에 표본 중 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함하며 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 탐침과 표본의 혼성화, 및 b) 상기 혼성화 복합체의 존재 또는 부재, 및 선택적으로 존재하는 경우 이들의 양의 검출을 포함하는, 표본 중 표적 AARS 폴리뉴클레오티드의 검출 방법이 포함되며, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 참조 AARS 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한 a) 표적 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 단편의 증폭, 및 b) 상기 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 단편의 존재 또는 부재, 및 선택적으로 존재하는 경우 이들의 양 검출을 포함하는, 표본 중 표적 AARS 폴리뉴클레오티드의 검출 방법이 포함되며, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 참조 AARS 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예는 혼성화, 증폭, 또는 다른 검출 방법에 의한 것인지 여부와는 무관하게, 예컨대 스플라이스 변이체의 독특한 스플라이스 결찰부의 검출에 의한 AARS 스플라이스 변이체의 검출에 관한 것이다.

본 발명의 구현예는 항체-기반 검출 기법을 포함하는 다양한 AARS 폴리펩티드-기반 검출 기법을 포함한다. 이들 구현예에는 항체 또는 다른 결합제를 생성한 후 세포 또는 보통 대상체로부터의 세포 또는 다른 생물학적 표본 중 선택된 AARS 폴리펩티드를 검출 또는 정량하기 위한 진단적 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 AARS 폴리펩티드의 용도가 포함된다.

특정 구현예는 표준 방법론 및 검출기, 예컨대 웨스턴 블로팅 및 면역침전, 효소-연관 면역흡착 분석(ELISA), 유세포 측정, 및 조영 장치를 이용하는 면역형광 분석(IFA)을 채용할 수 있다. 이들 널리-공지된 방법은 보통 본 발명의 선택된 AARS 폴리펩티드, 또는 상기 AARS 폴리펩티드의 독특한 영역에 특이적으로 결합하며 일반적으로 다른 AARS 폴리펩티드, 예컨대 전장 AARS 폴리펩티드에는 유의미하게 결합하지 않는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 이용한다. 특정 구현예에서, AARS 폴리펩티드의 독특한 영역은 AARS의 새로 동정된 단백질 단편에 의해 보유되는 독특한 3차원적 구조를 나타낼 수 있다.

특정 구현예는 "어레이", 예컨대 "마이크로어레이"를 채용할 수 있다. 특정 구현예에서, "마이크로어레이"는 또한 기질-결합된 집합 또는 복수의 폴리펩티드를 갖는 "펩티드 마이크로어레이" 또는 "단백질 마이크로어레이"를 나타낼 수 있으며, 각각의 복수의 결합된 폴리펩티드에 대한 결합은 별도로 검출 가능하다. 대안적으로, 펩티드 마이크로어레이는 본원에 기재된 AARS 폴리펩티드의 결합을 특이적으로 검출할 수 있는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 파지 디스플레이 결합제, 효모 2 하이브리드 결합제, 및 앱타머를 비제한적으로 포함하는 복수의 결합제를 가질 수 있다. 어레이는, 예를 들어 [Robinson 등, Nature Medicine 8(3):295-301 (2002)]에 기재된 바와 같이 이들 AARS 폴리펩티드의 자가항체 검출에 근거할 수 있다. 펩티드 어레이의 예는 WO 02/31463, WO 02/25288, WO 01/94946, WO 01/88162, WO 01/68671, WO 01/57259, WO 00/61806, WO 00/54046, WO 00/47774, WO 99/40434, WO 99/39210, 및 WO 97/42507 및 U.S. 특허 번호 6,268,210, 5,766,960 및 5,143,854]에서 찾아볼 수 있으며, 그 각각이 참조로 도입된다.

특정 구현예는 AARS 폴리펩티드 서열의 진단적 검출을 위해 MS 또는 다른 분자량-기반 방법을 채용할 수 있다. 질량 분광측정(MS)은 일반적으로 표본 또는 분자의 원소 조성을 결정하기 위한 분석 기법을 나타낸다. MS는 또한 분자, 예컨대 펩티드 및 다른 화학적 화합물의 화학적 구조 결정을 위해서 이용될 수 있다.

일반적으로, MS 원리는 하전된 분자 또는 분자 단편을 생성한 후 이들의 질량-대-전하비를 측정하기 위한 이온화 화학적 화합물로 구성된다. 예시적 MS 절차에서: 표본은 MS 기구 상에 로딩되며 기화를 거치고, 표본 성분은 다양한 방법 중 하나로 이온화되어(예로 이들에 전자 빔으로 충격을 가하여) 양으로 하전된 입자가 형성되며, 이어서 양이온이 자기장에 의해 가속화되고, 이들이 전자기장을 통과함에 따라 이온의 상세 운동에 기반하여 입자의 질량-대-전하비(m/z)에 대한 계산이 수행되고, m/z에 따라 전 단계에서 정렬된 이온이 검출된다.

예시적 MS 기구는 하기 3 모듈을 갖는다: 기상 표본 분자를 이온으로 전환시키는(또는 전자분무 이온화의 경우, 용액 중 이온을 기상 내로 이동시키는) 이온원; 이온에 전자기장을 가하여 이들의 질량에 따라 정렬하는 질량 분석기; 및 양의 표지값을 측정하여 존재하는 각 이온의 풍부함을 계산하기 위한 데이터를 제공하는 검출기.

MS 기법은 미공지된 화합물의 동정, 분자 중 원소의 동위원소 조성의 결정, 및 그 단편화의 관찰에 의한 화합물의 구조 결정을 포함하는 정성적 및 정량적 용도를 모두 갖는다. 다른 용도는 표본 중 화합물의 양 정량 또는 기상 이온 화학(진공 중 이온 및 중성의 화학)의 기초 연구를 포함한다. 기체 크로마토그래피-질량 분광측정(GC/MS 또는 GC-MS), 액체 크로마토그래피 질량 분광측정(LC/MS 또는 LC-MS), 및 이온 이동성 분광측정/질량 분광측정(IMS/MS 또는 IMMS)이 포함된다. 따라서, MS 기법은 본원에서 제공되는 임의 방법에 따라 생물학적 표본 중 본 발명의 AARS 폴리펩티드의 존재 또는 수준을 측정하고, 이들 수준을 대조군 표본 또는 소정 값과 비교하는데 이용될 수 있다.

특정 구현예는 세포-정렬 또는 세포 가시화 또는 조영 장치/기법에 채용하여 AARS 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 존재 또는 수준을 검출 또는 정량할 수 있다. 그 예는 유세포 측정 또는 FACS, 면역형광 분석(IFA), 및 원 위치 혼성화 기법, 예컨대 형광 원 위치 혼성화(FISH)를 포함한다.

특정 구현예는 진단적 목적을 위한 종래 생물학 방법, 소프트웨어 및 시스템을 채용할 수 있다. 본 발명의 컴퓨터 소프트웨어 제품은 보통 본 발명의 방법의 논리적 단계를 수행하기 위한 컴퓨터 실행 가능 지침을 갖는 컴퓨터가 읽을 수 있는 미디어를 포함한다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 적합한 미디어는 플로피 디스크, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, 하드디스크 드라이브, 플래쉬 메모리, ROM/RAM, 자기 테이프 등을 포함한다. 컴퓨터 실행 가능 지침은 적합한 컴퓨터 언어 또는 몇몇 언어의 조합으로 작성될 수 있다. 기본적인 연산 생물학 방법은, 예를 들어 [Setubal and Meidanis 등, Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000) 및 Ouelette and Bzevanis, Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed., 2001)]에 기재되어 있다. U.S. 특허 번호 6,420,108을 참고하라.

특정 구현예는 다양한 목적, 예컨대 탐침 설계, 데이터 관리, 분석, 및 기구 운영을 위해 다양한 컴퓨터 프로그램 제품 및 소프트웨어를 채용할 수 있다. U.S. 특허 번호 5,593,839, 5,795,716, 5,733,729, 5,974,164, 6,066,454, 6,090,555, 6,185,561, 6,188,783, 6,223,127, 6,229,911 및 6,308,170을 참고하라.

전체 게놈 샘플링 분석(WGSA)은, 예를 들어 [Kennedy 등, Nat. Biotech. 21, 1233-1237 (2003), Matsuzaki 등, Gen. Res. 14: 414-425, (2004) 및 Matsuzaki, 등, Nature Methods 1:109-111 (2004)]에 기재되어 있다. 맵핑 분석에 사용하기 위한 알고리즘은, 예를 들어 [Liu 등, Bioinformatics. 19: 2397-2403 (2003) 및 Di 등, Bioinformatics. 21:1958 (2005)]에 기재되어 있다. WGSA 및 WGSA의 용도에 유용한 어레이 및 WGSA 관련 부가 방법은, 예를 들어 U.S. 특허 출원 번호 60/676,058(2005.04.29. 출원), 60/616,273(2004.10.05. 출원), 10/912,445, 11/044,831, 10/442,021, 10/650,332 및 10/463,991에 개시되어 있다. 맵핑 분석을 이용하는 게놈 범위 연관성 연구는, 예를 들어 [Hu 등, Cancer Res.; 65(7):2542-6 (2005), Mitra 등, Cancer Res., 64(21):8116-25 (2004), Butcher 등, Hum Mol Genet., 14(10):1315-25 (2005), 및 Klein 등, Science. 308(5720):385-9 (2005)]에 기재되어 있다.

부가적으로, 특정 구현예는, 예를 들어 U.S. 출원 번호 10/197,621, 10/063,559(미국 공보 번호 2002/0183936), 10/065,856, 10/065,868, 10/328,818, 10/328,872, 10/423,403, 및 60/482,389에 나타낸 바와 같이 네트워크, 예컨대 인터넷을 통해 유전적 정보를 제공하기 위한 방법을 포함할 수 있다.

X. 안티센스 및 RNAi 제제

본 발명의 구현예는 또한 AARS 폴리뉴클레오티드 서열을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 RNAi 제제, 그리고 선택된 AARS 전사체 및/또는 단백질 단편의 발현을 감소시키기 위한 이들의 사용 방법을 포함한다. 특정 구현예는 본 발명의 AARS 단백질 단편인 스플라이스 변이체를 생성하는 하나 이상의 스플라이스 결찰부(종종 독특한)의 표적화에 관한 것이다. 또한 선택된 단백질 단편의 스플라이싱을 권장하거나 좌절시키는 특정 스플라이스 형태를 표적화하는 안티센스 또는 RNAi 저해 방법이 포함된다. 바람직한 특정 구현예에서, AARS 단백질 단편을 생성하는 스플라이스 결찰부는 특정 조직에 대해 과발현되고, 해당 스플라이스 변이체에 대해 독특하다. 이들 및 관련 구현예에서, 이러한 스플라이스 변이체는 표적화된 세포 유형에서 세포질 AARS 활성의 유일한 원천이 아니다. 예를 들어, 표적화될 특정 스플라이스 변이체는 주어진 세포 또는 조직 중 AARS RNA 스플라이스 변이체의 전체 복제수의 약 10% 내지 50%, 바람직하게는 주어진 세포 또는 조직 중 AARS RNA 스플라이스 변이체의 전체 복제수의 약 1-10%를 나타낼 수 있다. 주어진 세포 또는 조직 중 AARS RNA 스플라이스 변이체의 전체 복제수의 약 <1%인 스플라이스 변이체가 또한 표적화될 수 있다.

특정 구현예에서, 안티센스 또는 RNAi 제제는 이러한 전장 단백질이 단백질 합성의 중추 단계에 관여하여 종종 야생형 AARS 녹아웃에서 생기는 치사성을 회피하기 때문에 전장 단백질을 표적화하지 않는다. 따라서 본원에서 기재되는 특정 방법은 원치않는 효과, 예컨대 만성 및 급성 치료 모두에서 독성을 회피하기 위해 그리고 AARS 단백질 단편의 비-정규적 활성을 선택적으로 조정하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 특정 구현예는, 예컨대 표적 세포 또는 조직의 세포 생리학을 사멸시키거나 실질적으로 혼란시키기 위해 전장 AARS 서열을 포함하는 AARS 서열을 일반적으로 표적화할 수 있다.

특정 구현예에서, 표적화될 AARS 스플라이스 변이체는 비-정규적 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, AARS 스플라이스 변이체는 감소되거나 검출할 수 없는 정규적 AARS 활성을 가지며, 안티센스 또는 RNAi-관련 방법은 보다 특이적으로 그 비-정규적 활성을 조정한다. 특정 구현예에서, 안티센스 또는 RNAi-관련 제제는 비-표적화된 세포 또는 조직에 대한 원치않는 전신 효과를 경감시키기 위한 표적화 또는 국소 전달 접근법과 조합될 수 있다. 본원에 기재된 다른 것들 중에서, 이러한 방식으로 표적화될 수 있는 예시적인 세포 또는 조직은 이들을 국소 표적화시키는 조직, 예컨대 국소 적용을 통한 종양 또는 상피에 대한 세포 및 암 세포를 포함한다.

A. 안티센스 제제

"안티센스 올리고머" 또는 "안티센스 화합물" 또는 "안티센스 올리고뉴클레오티드"라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며, 염기 쌍 형성 부분이 Watson-Crick 염기 쌍 형성에 의해 핵산(보통 RNA) 중 표적 서열에 혼성화하여 표적 서열 내에서 핵산:올리고머 헤테로듀플렉스를 형성하고, 보통 이에 의해 RNA의 번역을 방지할 수 있도록 하는, 서브유닛 간 연결에 의해 연결된 염기 쌍형성 부분을 각각 보유한 시클릭 서브유닛 서열을 나타낸다. 또한 선택된 AARS 전사체, 예컨대 스플라이스 변이체 또는 단백분해 단편, 및/또는 그 대응 폴리펩티드의 발현을 조정하기 위한 이들의 사용 방법이 포함된다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 40 서브유닛, 보통 약 8-25 서브유닛, 바람직하게는 약 12 내지 25 서브유닛을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 아래에 정의된 바와 같이 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 유사 상보성을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 및 안티센스 표적화 서열 간 상보성 정도는 안정한 듀플렉스를 형성하기 충분하다. 표적 RNA 서열과 안티센스 올리고머의 상보성 영역은 8-11 염기만큼 짧을 수 있지만, 바람직하게는 12-15 염기 또는 그 초과, 예로 12-20 염기, 또는 12-25 염기이며, 이들 범위 내 모든 정수를 포함한다. 약 14-15 염기의 안티센스 올리고머는 일반적으로 선택된 AARS 유전자의 표적화에서 독특한 상보적 서열을 갖기에 충분한 길이이다. 특정 구현예에서, 본원에서 논의되는 바와 같은 필요 결합 Tm을 달성화기 위해 최소 길이의 상보적 염기가 요구될 수 있다.

특정 구현예에서, 적어도 최소 수의 염기, 예로 10-12 염기가 표적 서열에 상보적인 경우 40 염기만큼 긴 안티센스 올리고머가 적합할 수 있다. 그러나 일반적으로 세포 내 촉진된 또는 활성 흡수는 약 30 미만의 올리고머 길이에서 최적화된다. 또한 하기에 더 기재된 특정 올리고머에 있어서, 결합 안정성 및 흡수 간 최적 균형은 일반적으로 18-25 염기 길이에서 일어난다. 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 염기로 구성된 안티센스 올리고머(예로, PNA, LNA, 2'-OMe, MOE)가 포함되며, 여기서 적어도 약 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 인접 또는 비-인접 염기가 이들의 AARS 표적 서열, 또는 이들의 변이체에 상보적이다.

특정 구현예에서, 안티센스 올리고머는 AARS 핵산 표적 서열에 100% 상보적일 수 있고, 또는 올리고머 및 AARS 핵산 표적 서열 간 형성된 헤테로듀플렉스가 생체 내에서 일어날 수 있는 세포 뉴클레아제 및 다른 분해 방식의 작용을 견디기에 충분히 안정한 한, 예로 변이체를 수용하기 위한 미스매치를 포함할 수 있다. "표적 서열"이라는 용어는 올리고뉴클레오티드가 지정된 표적 RNA의 일부, 즉 올리고뉴클레오티드가 상보적 서열의 Watson-Crick 염기 쌍 형성에 의해 혼성화할 서열을 나타낸다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 AARS mRNA의 인접 영역(예로 AARS mRNA의 독특한 스플라이스 결찰부)일 수 있고, 또는 mRNA의 비-인접 영역으로 이루어질 수 있다.

뉴클레아제에 의한 절단에 감수성이 더 적은 올리고머 골격이 아래에 논의된다. 미스매치는 존재하는 경우 중간 보다 하이브리드 듀플렉스의 말단 영역을 더 적게 불안정화시킨다. 허용되는 미스매치의 수는 듀플렉스 안정성에 대해 널리 이해되는 원리에 따라, 올리고머의 길이, 듀플렉스 중 G:C 염기 쌍의 백분율, 및 듀플렉스 중 미스매치(들)의 위치에 의존할 것이다. 이러한 안티센스 올리고머가 AARS 핵산 표적 서열에 100% 상보적일 필요는 없지만, 핵산 표적의 생물학적 활성, 예로 AARS 단백질(들)의 발현이 조정되는 정도로 표적 서열에 안정하고 특이적으로 결합하는 것이 효과적이다.

올리고머 및 표적 서열 간 형성된 듀플렉스의 안정성은 결합 Tm 및 세포 효소적 절단에 대한 듀플렉스의 감수성의 함수이다. 상보적-서열 RNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 Tm은 종래 방법, 예컨대 [Hames 등, Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, pp.107-108 또는 Miyada C.G. and Wallace R.B., 1987, Oligonucleotide hybridization techniques, Methods Enzymol. Vol. 154 pp. 94-107]에 기재된 것들에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고머는 상보적-서열 RNA에 대해 체온 초과, 바람직하게는 50℃ 초과의 결합 Tm을 가질 수 있다. 60-80℃ 또는 그 초과 범위의 Tm이 바람직하다. 널리 공지된 원리에 따르면, 상보적-기반 RNA 하이브리드에 대한 올리고머 화합물의 Tm은 듀플렉스 중 C:G 쌍 형성 염기의 비 증가에 의해 및/또는 헤테로듀플렉스의 길이(염기 쌍) 증가에 의해 증가될 수 있다. 동시에 세포 흡수의 최적화 목적을 위해, 안티센스 올리고머의 크기를 제한하는 것이 유리할 수 있다. 상기 이유를 위해, 25 염기 또는 그 미만 길이에서 높은 Tm(50℃ 또는 그 초과)을 나타내는 화합물은 일반적으로 높은 Tm 값에 대해 25 염기 초과를 필요로 하는 것에 비해 바람직하다.

안티센스 올리고머는 mRNA 번역을 차단 또는 저해하거나 천연 전-mRNA 스플라이스 처리를 저해하거나, 또는 표적화된 mRNA의 분해를 유도하도록 설계될 수 있으며, 혼성화하는 표적 서열"에 대해 지정된다" 또는 "에 대해 표적화된다"로 불릴 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 AARS mRNA 전사체의 임의의 코딩 또는 비-코딩 서열을 포함할 수 있고, 따라서 엑손 내 또는 인트론 내에 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 AARS(예로 전장 AARS) 중에서 상대적으로 독특하거나 예외적이며, 선택된 AARS 단백질 단편, 예컨대 단백분해 단편 또는 스플라이스 변이체의 발현 감소를 위해 선택적이다. 특정 구현예에서, 표적 부위는 전-처리된 mRNA의 3' 또는 5' 스플라이스 부위, 또는 분기점을 포함한다. 스플라이스 부위에 대한 표적 서열은 전처리된 mRNA의 스플라이스 공여자 결찰부의 상류 또는 스플라이스 수용자 결찰부의 하류 그 5' 말단에 1 내지 약 25 내지 약 50 염기 쌍을 갖는 mRNA 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 대안적으로 스플라이스 AARS mRNA의 스플라이스 결찰부, 예컨대 전장 AARS에서는 일어나지 않는 스플라이스 결찰부를 포함할 수 있고, 또는 다른 AARS 스플라이스 변이체에서는 일어나지 않거나 매우 드물게만 일어난다는 점에서 전사체에 대해 독특하거나 예외적이다. 올리고머는 보다 일반적으로 이것이 본원에 기재된 방식으로 표적 핵산에 대해 표적화되는 경우, 생물학적으로 관련된 표적, 예컨대 참조 AARS 폴리뉴클레오티드"에 대해 표적화된다"고 불린다.

올리고뉴클레오티드는 보통 표적 서열, 예컨대 표적 DNA 또는 RNA에 대해 상보적이다. "상보적" 및 "상보성"이라는 용어는 염기-쌍 형성 규칙에 의해 관련된 폴리뉴클레오티드(즉 뉴클레오티드 서열)를 나타낸다. 예를 들어, 서열 "A-G-T"는 서열 "T-C-A"에 대해 상보적이다. 핵산-염기의 일부만이 염기 쌍 형성 규칙에 따라 매치되는 경우 상보성은 "부분적"일 수 있다. 또는 핵산 간에 "완전한" 또는 "전체" 상보성(100%)이 존재할 수 있다. 핵산 가닥 간의 상보성 정도는 핵산 가닥 간 혼성화의 효율 및 강도 상에 상당한 효과를 갖는다. 종종 완벽한 상보성이 필요하지만, 일부 구현예는 표적 서열에 대해 하나 이상의, 그러나 바람직하게는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1의 미스매치를 포함할 수 있다. 올리고머 내 임의 위치에서의 변화가 포함된다. 특정 구현예에서, 올리고머 말단 근처 서열에서의 변화는 내부에서의 변화에 비해 일반적으로 바람직하며, 존재하는 경우 보통 5' 및/또는 3' 말단의 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 뉴클레오티드 이내이다.

"표적화 서열" 또는 특정 구현예에서 "안티센스 표적화 서열"이라는 용어는 DNA 또는 RNA 표적 분자에서 표적 서열에 대해 상보적인(즉 또한 실질적으로 상보적인) 올리고뉴클레오티드 내 서열을 나타낸다. 안티센스 화합물의 전체 서열, 또는 일부만이 표적 서열에 상보적일 수 있다. 예를 들어, 20-30 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드에서, 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29 염기는 표적 영역에 상보적인 표적화 서열일 수 있다. 보통, 표적화 서열은 인접 염기로 형성되지만, 대안적으로 예로 올리고뉴클레오티드의 반대 말단으로부터 함께 배치되는 경우 비-인접 서열이 표적 서열을 거치는 서열을 구성하는 비인접 서열로 형성될 수 있다.

표적 및 표적화 서열은 혼성화가 반-평형 배치로 일어나는 경우 서로 "상보적인" 것으로 기재된다. 표적화 서열은 표적 서열에 대해 "거의" 또는 "실질적인" 상보성을 가지고 여전히 본 발명의 목적을 위해 기능할 수 있다, 즉 이는 여전히 기능적으로 "상보적"일 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 10 뉴클레오티드 중 표적 서열과 최대 1의 미스매치를, 바람직하게는 20 중 최대 1의 미스매치를 가질 수 있다. 대안적으로 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 AARS 참조 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그 상보물과 적어도 약 80%, 85%, 90% 서열 상동성, 바람직하게는 적어도 95% 서열 상동성을 가질 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 올리고머가 생리학적 조건 하에, 실질적으로 45℃ 초과, 바람직하게는 적어도 50℃, 보통 60℃-80℃ 또는 그 초과의 Tm으로 표적(예로 AARS 참조 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보물)과 혼성화하는 경우 표적 폴리뉴클레오티드에 "특이적으로 혼성화한다". 이러한 혼성화는 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건에 해당된다. 주어진 이온 강도 및 pH에서, Tm은 표적 서열의 50%가 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 온도이다. 다시, 이러한 혼성화는 표적 서열에 대한 안티센스 올리고머의 "거의" 또는 "실질적인" 상보성뿐만 아니라 정확한 상보성을 가지고 일어날 수 있다.

특이적으로 결합한 또는 특이적으로 혼성화한다라는 용어는 일반적으로 선택된 혼성화 조건 하에서 표본 중 그 목적 표적 유전자 서열에 결합할뿐만 아니라 표본 중 다른 표적 서열에 유의미하게 결합하지 않음으로써 표적 풀 중에서 그 목적 표적 및 모든 다른 표적 간을 구별하는 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 그 목적 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 탐침은 또한 본원에 기재된 바와 같은 선택된 혼성화 조건 하에 농도차를 검출할 수 있다.

"뉴클레아제-내성" 올리고머 분자(올리고머)란 체내의 일반적인 세포외 및 세포내 뉴클레아제에 의해 그 골격이 비-혼성화 또는 혼성화 형태에서 뉴클레아제 절단에 실질적으로 내성이 있는 것을 나타낸다; 즉 올리고머는 올리고머가 노출된 체내 정상 뉴클레아제 조건 하에서 뉴클레아제 절단을 거의 또는 전혀 나타내지 않는다.

"헤테로듀플렉스"란 올리고뉴클레오티드 및 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 표적 DNA 또는 RNA의 상보적 부분간 듀플렉스를 나타낸다. "뉴클레아제-내성 헤테로듀플렉스"는 헤테로듀플렉스가 이중쇄 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 복합체를 절단할 수 있는 세포내 및 세포외 뉴클레아제, 예컨대 RNaseH에 의한 생체 내 분해에 실질적으로 내성이 되도록 올리고머의 그 상보적 표적에 대한 결합으로 형성되는 헤테로듀플렉스를 나타낸다.

올리고뉴클레오티드의 "서브유닛"이란 하나의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 단위를 나타낸다. 상기 용어는 부착된 서브유닛 간 연결이 있거나 없는 뉴클레오티드 단위를 나타낼 수 있지만, "하전된 서브유닛"을 언급할 때 전하는 보통 서브유닛 간 연결(예로, 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 연결 또는 양이온성 연결) 내에 존재한다.

올리고뉴클레오티드의 시클릭 서브유닛은 리보오스 또는 다른 5탄당에, 또는 특정 구현예에서, 대안적 또는 개질된 기에 기반할 수 있다. 개질된 올리고뉴클레오티드 골격의 예는 정상 3'-5'연결을 갖는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결 유사체, 및 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍이 3'-5'에서 5'-3'으로 또는 2'-5'에서 5'-2'으로 역전된 극성을 갖는 것들을 비제한적으로 포함한다. 또한 당분야에 공지된 다른 올리고뉴클레오티드 중에서 펩티드 핵산(PNA), 잠긴 핵산(LNA), 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드(2'-OMe), 2'-메톡시에톡시 올리고뉴클레오티드(MOE)가 포함된다.

퓨린 또는 피리미딘 염기 쌍 형성 부분은 보통 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실, 티민 또는 이노신이다. 또한 염기, 예컨대 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 수도우라실, 2,4,6-트리메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 디히드로유리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘(예로, 5-메틸시티딘), 5-알킬유리딘(예로, 리보티미딘), 5-할로유리딘(예로, 5-브로모유리딘) 또는 6-아자피리미딘 또는 6-알킬피리미딘(예로 6-메틸유리딘), 프로핀, 쿠에소신, 2-티오유리딘, 4-티오유리딘, 위부토신, 위부톡소신, 4-아세틸티딘, 5-(카르복시히드록시메틸)유리딘, 5'-카르복시메틸아미노메틸-2-티오유리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸유리딘, β-D-갈락토실쿠에오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오유리딘, 5-메틸아미노메틸유리딘, 5-메틸카보닐에틸유리딘, 5-메틸옥시유리딘, 5-메틸-2-티오유리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, β-D-만노실쿠에오신, 유리딘-5-옥시아세트산, 2-티오시티딘, 트레오닌 유도체 및 다른 것들(Burgin 등, 1996, Biochemistry, 35, 14090; Uhlman & Peyman, 상동)이 포함된다. 이러한 측면에서의 "개질된 염기"란 상기 나타낸 바와 같은 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T), 및 우라실(U) 이외의 뉴클레오티드 염기를 의미한다; 이러한 염기는 안티센스 분자에서 임의 위치에서 이용될 수 있다. 당분야 숙련자는 올리고머의 용도에 따라 Ts 및 Us이 상호 교환 가능하다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 다른 안티센스 화학, 예컨대 좀더 RNA에 유사한 2'-O-메틸 안티센스 올리고뉴클레오티드에서는 T 염기가 U으로 나타날 수 있다.

앞서 주지된 바와 같이, 본원에서 제공되는 특정 올리고뉴클레오티드는 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다. 펩티드 핵산(PNA)은 골격이 피리미딘 또는 퓨린 염기가 부착된 N-(2-아미노에틸) 글리신 단위로 구성된 데옥시리보오스 골격과 구조적으로 준동형인 DNA 유사체이다. 천연 피리미딘 및 퓨린 염기를 함유하는 PNA는 Watson-Crick 염기-쌍 형성 규칙을 따라 상보적 올리고뉴클레오티드에 혼성화하며, 염기 쌍 인식의 관점에서 DNA를 모사한다(Egholm, Buchardt 등, 1993). PNA의 골격은 포스포디에스테르 결합보다는 펩티드 결합에 의해 형성되어 이들을 안티센스 용도에 대해 널리 적합하게 만든다(하기 구조 참고). 골격은 비하전되어 정상에 비해 더 큰 열 안정성을 나타내는 PNA/DNA 또는 PNA/RNA 듀플렉스를 생성한다. PNA는 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해서는 인식되지 않는다.

PNA는 당분야에 공지된 임의의 기법을 이용하여 합성적으로 제조될 수 있다. PNA는 폴리아미드 골격이 DNA의 전통적인 포스페이트 리보오스 고리를 대체하는 DNA 유사체이다. 천연 구조에 대한 급격한 구조적 변화에도 불구하고, PNA는 DNA 또는 RNA에 대해 나선 형태로 서열-특이적 결합을 할 수 있다. PNA의 특징은 상보적 DNA 또는 RNA에 대한 높은 결합 친화도, 단일-염기 미스매치로 야기되는 탈안정화 효과, 뉴클레아제 및 프로테아제에 대한 내성, 염 농도와 무관한 DNA 또는 RNA와의 혼성화 및 호모퓨린 DNA와의 트리플렉스 형성을 포함한다. Panagene™은 그 독자적 Bts PNA 단량체(Bts; 벤조티아졸-2-설포닐기) 및 독자적 올리고머화 공정을 개발하였다. Bts PNA 단량체를 이용한 PNA 올리고머화는 탈보호, 커플링 및 캡핑의 반복적 사이클로 이루어진다. 상기 기술에 대한 Panagene의 특허는 US 6969766, US 7211668, US 7022851, US 7125994, US 7145006 및 US 7179896을 포함한다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 U.S. 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262를 비제한적으로 포함하며, 그 각각이 본원에서 참조로 도입된다. 또한 PNA 화합물의 교시는 [Nielsen 등, Science, 1991, 254, 1497]에서 찾을 수 있다.

또한 "잠긴 핵산" 서브유닛(LNA)이 포함된다. LNA의 구조는 당분야에 공지되어 있다: 예를 들어 [Wengel, 등, Chemical Communications (1998) 455; Tetrahedron (1998) 54, 3607, 및 Accounts of Chem. Research (1999) 32, 301); Obika, 등, Tetrahedron Letters (1997) 38, 8735; (1998) 39, 5401, 및 Bioorganic Medicinal Chemistry (2008)16, 9230].

올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA를 혼입할 수 있다; 일부 경우에서, 화합물은 전체적으로 LNA로 이루어질 수 있다. 개별 LNA 뉴클레오시드 서브유닛의 합성 및 이들의 올리고뉴클레오티드 내로의 혼입을 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다: U.S. 특허 7,572,582; 7,569,575; 7,084,125; 7,060,809; 7,053,207; 7,034,133; 6,794,499; 및 6,670,461. 전형적인 서브유닛 간 링커는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 부분을 포함한다; 대안적으로, 비-인 함유 링커가 채용될 수 있다. 바람직한 구현예는 각각의 LNA 서브유닛이 DNA 서브유닛(즉, 데옥시리보오스 뉴클레오티드)에 의해 분리된 LNA 함유 화합물이다. 또한 바람직한 화합물은 서브유닛 간 링커가 포스포로티오에이트인 교대 LNA 및 DNA 서브유닛으로 이루어진다.

특정 올리고뉴클레오티드는 비하전 또는 실질적으로 비하전된 연결에 의해 연결된 염기-쌍 형성 부분을 보유하는 모르폴리노계 서브유닛을 포함할 수 있다. "모르폴리노 올리고머" 또는 "PMO"(포스포라미데이트- 또는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머)라는 용어는 (i) 구조가 1 내지 3 원자 길이, 바람직하게는 2 원자 길이, 및 바람직하게는 비하전되거나 양이온성인 인-함유 연결에 의해 함께 연결되어 한 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접 서브유닛의 5' 엑소시클릭 탄소로 접합하며, (ii) 각각의 모르폴리노 고리는 염기 특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오티드 중 염기에 결합하는데 유효한 퓨린 또는 피리미딘 또는 균등한 염기-쌍 형성 부분을 보유하는 모르폴리노 서브유닛 구조로 이루어진 올리고뉴클레오티드 유사체를 나타낸다.

이들이 결합 또는 활성을 방해하지 않는 한 변화가 상기 연결에 만들어질 수 있다. 예를 들어, 인에 부착된 산소는 황으로 치환될 수 있다(티오포스포로디아미데이트). 5' 산소는 아미노 또는 저급 알킬 치환된 아미노로 치환될 수 있다. 인에 부착된 돌출 질소는 (선택적으로 치환된)저급 알킬로 미치환, 1치환, 또는 2치환될 수 있다. 퓨린 또는 피리미딘 염기 쌍 형성 부분은 보통 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실, 티민 또는 이노신이다. 모르폴리노 올리고머의 합성, 구조, 및 결합 특징은 U.S. 특허 번호 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,063, 및 5,506,337, 그리고 PCT 출원 번호 PCT/US07/11435(양이온성 연결) 및 US08/012804(개선된 합성)에 기재되어 있으며, 그 전체가 본원에 참조로 도입된다.

모르폴리노 서브유닛은 더 후술되는 바와 같이, 적어도 하나의 연결이 상술된 바와 같은 돌출 양이온성 기로 개질된 비-인계 서브유닛 간 연결에 의해서도 연관될 수 있다. 이들의 비개질된 상태에서는 비하전되었지만 역시 돌출 아민 치환기를 보유한 다른 올리고뉴클레오티드 유사체 연결이 이용될 수 있다. 예를 들어, 모르폴리노 고리 상 5' 질소 원자가 설파미드 연결 또는 요소 연결(여기서 인은 각각 탄소 또는 황으로 대체됨)에서 채용되고 상기 구조(b3)의 5'-질소 원자와 유사한 방식으로 개질될 수 있다.

특정 구현예는 실질적으로 비하전된 모르폴리노 올리고머, 예컨대 실질적으로 비하전된 포스포로디아미데이트-연결 모르폴리노 올리고머를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 유사체 중 실질적으로 비하전된 인 함유 골격은 다수의 서브유닛 연결, 예로 그 연결의 50-100%, 보통 적어도 60% 내지 100% 또는 75% 또는 80%가 생리학적 pH에서 비하전되고, 단일 인 원자를 함유하는 것이다. 인-함유 골격 연결을 갖는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 예는 포스포로아미데이트 및 포스포로디아미데이트-연결 모르폴리노 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예는 바람직하게는 이들 골격 연결의 약 10%-50%가 양으로 하전된 기를 함유할 수 있다.

모르폴리노-기반 서브유닛의 특성은, 예를 들어 안정한, 비하전 또는 양으로 하전된 골격 연결에 의해 올리고머 형태로 연결되는 능력, 형성된 중합체가 표적 RNA를 포함하는 상보적-염기 표적 핵산과 혼성화할 수 있도록 뉴클레오티드 염기(예로, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 우라실 및 하이포잔틴)를 지지하는 능력, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오티드(예로, 10-15 염기)에서 약 45℃를 초과하는 Tm 값, 포유류 세포 내로 능동적으로 또는 수동적으로 수송되는 올리고뉴클레오티드의 능력, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드:RNA 헤테로듀플렉스가 각각 RNase 및 RNaseH 분해에 저항하는 능력을 포함한다.

특정 구현예에서, 실질적으로 비하전된 올리고뉴클레오티드는 하전된 연결, 예로 매 2-5 비하전된 연결 당 최대 약 1, 예컨대 매 10 비하전된 연결 당 약 4-5의 하전된 연결을 포함하도록 개질될 수 있다. 특정 구현예에서, 안티센스 활성의 최적 개선은 약 25%의 골격 연결이 양이온성인 경우 볼 수 있다. 특정 구현예에서, 증강은 소수로, 예로 10-20% 양이온성 연결로, 또는 양이온성 연결의 수가 50-80% 범위, 예컨대 약 60%인 경우 볼 수 있다. 특정 구현예에서, 양이온성 골격 전하는, 예로 8 양이온성 골격 연결을 갖는 20-머 올리고뉴클레오티드에서, 이들 하전된 연결의 적어도 70%가 10의 최중심 연결에 편재된 경우, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 "중심-영역" 골격 연결에 가까운 전하의 벌키함을 배분하여 더욱 증강될 수 있다.

AARS 폴리뉴클레오티드 참조 서열 또는 그 상보물의 하나 이상의 부분을 표적화하는 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재되고 당분야의 숙련자에게 자명한 임의의 치료적, 진단적, 또는 약물 스크리닝 방법에서 사용될 수 있다.

B. RNA 간섭 제제

특정 구현예는 단편 및 이들의 스플라이스 변이체를 포함하는 아미노아실-tRNA 합성효소(AARS) 참조 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 mRNA 전사체를 표적화하는 RNA 간섭(RNAi) 제제에 관한 것이다. 또한 선택된 AARS 전사체, 예컨대 AARS 스플라이스 변이체 또는 내인성 단백분해 단편의 수준을 조정하기 위한 이들의 사용 방법이 포함된다.

"이중쇄"라는 용어는 가닥의 적어도 일부가 수소 결합에 대해 충분히 상보적이며 듀플렉스 구조를 형성하는 영역을 포함하는 두 개별 핵산 가닥을 의미한다. "듀플렉스" 또는 "듀플렉스 구조"라는 용어는 두 개별 가닥이 실질적으로 상보적이어서 각각 서로 혼성화하는 이중쇄 분자의 영역을 나타낸다. "dsRNA"란 두 상보적인 반-평형 핵산 가닥(즉, 센스 및 안티센스 가닥)을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는 리보핵산 분자를 나타낸다. dsRNA의 모든 뉴클레오티드가 Watson-Crick 염기 쌍을 나타내야 하는 것은 아니다; 두 RNA 가닥은 실질적으로 상보적일 수 있다. RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다.

특정 구현예에서, dsRNA는 표적 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 영역이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, dsRNA는 표적 RNA에 대해 완전 상보적이다. dsRNA 및 표적 간에 완벽한 상보성이 있을 필요는 없지만, 대응이 dsRNA 또는 이들의 절단 산물이, 예컨대 표적 RNA의 RNAi절단에 의해 서열 특이적 침묵화를 지정할 수 있도록 충분해야 한다. 표적 가닥과의 상보성, 또는 상동성 정도는 보통 안티센스 가닥에서 가장 중요하다. 특히 안티센스 가닥에서 완벽한 상보성이 종종 요구되지만, 일부 구현예는 표적 RNA에 대해 하나 이상의, 그러나 바람직하게는 6, 5, 4, 3, 2, 또는 그 미만의 미스매치를 포함할 수 있다. 미스매치는 말단 영역에서 가장 잘 관용되며, 존재하는 경우 바람직하게는 말단 영역 또는 예로 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4, 또는 3 뉴클레오티드 이내 영역에 있다. 센스 가닥은 분자의 전체적인 이중쇄 특징을 유지하기 위해 단지 안티센스 가닥과 실질적으로만 상보적이면 된다.

본원에서 사용되는 "개질된 dsRNA"란 이를 동일한 표적 RNA를 인식하는 동일한 dsRNA 분자에 비해 뉴클레아제(예로, 단백질 키나아제)에 대해 보다 내성으로 만드는 적어도 하나의 변형을 포함하는 dsRNA 분자를 나타낸다. 개질된 dsRNA는 단일쇄 뉴클레오티드 오버행 및/또는 적어도 하나의 치환된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "뉴클레오티드 오버행"이란 하나의 RNA 가닥의 3'-말단이 다른 상보적 가닥의 5'-말단을 넘어 연장되는 또는 반대되는 경우 듀플렉스 구조로부터 돌출한 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들을 나타낸다. "둔한" 또는 "둔단"이란 해당 dsRNA의 말단에 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드가 없다, 즉 뉴클레오티드 오버행이 없다는 것을 의미한다. "둔단화된" dsRNA는 그 전체 길이에 걸쳐 이중쇄인, 즉 분자의 어느 말단에도 뉴클레오티드 오버행이 없는 dsRNA이다.

본원에서 사용되는 "말단 염기쌍"이라는 용어는 이중쇄 분자의 듀플렉스 영역의 한 말단에서의 마지막 뉴클레오티드 염기쌍을 나타낸다. 예를 들어 dsRNA 또는 다른 분자가 둔단화된 경우(즉, 뉴클레오티드 오버행이 없는 경우), 분자 양단에서 마지막 뉴클레오티드 염기쌍이 말단 염기쌍이다. dsRNA 또는 다른 분자가 듀플렉스 구조의 한단 또는 양단에서 뉴클레오티드 오버행을 갖는 경우, 뉴클레오티드 오버행(들)에 바로 인접한 마지막 뉴클레오티드 염기쌍(들)은 그 분자의 말단(들)에서의 말단 염기쌍이다.

특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 방법은 AARS 전사체, 예컨대 선택된 단편 또는 스플라이스 변이체의 발현을 감소시키기 위한 조정제로서 이중쇄 리보핵산(dsRNA) 분자를 이용할 수 있다. dsRNA는 일반적으로 두 단일 가닥을 포함한다. dsRNA의 한 가닥은 표적 유전자 또는 표적 영역의 일부와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열("센스" 가닥)을 포함하며, 다른 가닥("상보적" 또는 "안티센스" 가닥)은 표적 영역의 일부에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 가닥들은 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성하기에 충분히 상보적이다. 특정 구현예에서, 상보적 RNA 가닥은 30 뉴클레오티드 미만, 25 뉴클레오티드 미만 길이, 또는 심지어 19 내지 24 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, 상보적 뉴클레오티드 서열은 20-23 뉴클레오티드 길이, 또는 22 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

특정 구현예에서, 적어도 하나의 RNA 가닥은 1 내지 4 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 다른 구현예에서, dsRNA는 또한 적어도 하나의 화학적으로 개질된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 1 내지 4 뉴클레오티드의 단일쇄 오버행을 포함하는 dsRNA는 말단 뉴클레오티드쌍에 직접 인접한 단일쇄 오버행의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드가 퓨린 염기를 함유하는 분자를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, dsRNA의 양단에서 마지막 상보적 뉴클레오티드쌍은 G-C쌍이거나, 또는 마지막 4 말단 뉴클레오티드쌍 중 적어도 둘은 G-C쌍이다.

본 발명의 특정 구현예는 마이크로RNA를 포함할 수 있다. 마이크로-RNA는 개체에서 천연 생성되는 커다란 군의 소 RNA이며, 이들 중 일부는 표적 유전자의 발현을 조절한다. 마이크로-RNA는 Dicer에 의해 대략 70 뉴클레오티드의 단일쇄 헤어핀 전구체 전사체로부터 형성된다(V. Ambros 등, Current Biology 13:807, 2003). 특정 마이크로-RNA는 헤어핀 RNA 전구체로서 전사될 수 있으며, 이어서 Dicer 효소에 의해 이들의 성숙 형태로 처리된다.

특정 구현예는 또한 단간섭 RNA(siRNA)를 채용할 수 있다. 특정 구현예에서, 이중쇄 올리고뉴클레오티드의 제 1 가닥은 제 2 가닥보다 2개 더 많은 뉴클레오시드 잔기를 함유한다. 다른 구현예에서, 제 1 가닥 및 제 2 가닥은 동일한 수의 뉴클레오시드를 갖는다; 그러나 제 1 및 제 2 가닥은 제 1 및 제 2 가닥 상의 두 말단 뉴클레오시드가 상보적 가닥 상의 잔기와 쌍을 형성하지 않는 정도로 상쇄될 수 있다. 특정 예에서, 쌍을 형성하지 않은 두 뉴클레오시드는 티미딘 잔기이다.

또한 짧은 헤어핀 RNA(shRNAs) 및 마이크로 RNA(miRNAs)가 포함된다. shRNA의 이중쇄 구조는 단일 자가-상보적 RNA 가닥에 의해 형성되며, RNA 듀플렉스 형성은 세포 내부 또는 외부에서 개시될 수 있다. 마이크로 RNA(miRNA)는 보통 전-miRNAs로 공지된 ~70 뉴클레오티드의 되접힘 RNA 전구체 구조로부터 절단된 20~22 뉴클레오티드의 작은 비-코딩 RNA이다.

조정제가 siRNA를 포함하는 경우, 제제는 표적 영역에 대해 충분한 상동성 영역을 포함해야 하며, 뉴클레오티드의 관점에서 siRNA 제제 또는 이들의 단편이 표적 RNA의 하향 조절을 매개할 수 있을 정도로 충분한 길이어야 한다. "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"라는 용어는 개질된 RNA 또는 뉴클레오티드 대리물의 경우 하나 이상의 위치에서 개질된 뉴클레오티드, 또는 대리물 대체 부분을 또한 나타낼 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, siRNA 제제는 본원에 기재된 바와 같은 표적 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 영역이거나 또는 이를 포함한다.

부가적으로 siRNA 조정제는 뉴클레오시드 대리물로 개질되거나 이를 포함할 수 있다. siRNA 제제의 단일쇄 영역은 뉴클레오시드 대리물, 예로 헤어핀 구조의 쌍을 형성하지 않은 영역 또는 영역들로 개질되거나 이를 포함할 수 있으며, 예로 두 상보적 영역을 연결하는 영역은 개질 또는 뉴클레오시드 대리물을 가질 수 있다. siRNA 제제의 하나 이상의 3'- 또는 5'-말단을, 예로 엑소뉴클레아제에 대해 안정화시키거나 안티센스 siRNA 제제의 RISC 내 진입을 선호하게 만드는 개질이 또한 유용하다. 개질은 C3(또는 C6, C7, C12) 아미노 링커, 티올 링커, 카르복실 링커, 비-뉴클레오티드성 스페이서(C3, C6, C9, C12, 무염기성, 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜), 포스포라미디트로 나타나고 다른 DMT-보호된 히드록실기를 가져서 RNA 합성 중 다중 커플링을 허용하는 플루오레신 시약 또는 특수 바이오틴을 포함할 수 있다.

siRNA 제제는, 예를 들어 인터페론 반응을 유발하지 않는 충분히 짧은 분자(또한 Dicer에 의해 절단될 수 있고/있거나 RISC로 들어갈 수 있는 분자), 예로 RISC내로의 진입을 허용하는 크기의 분자, 예로 Dicer-절단 산물과 유사한 분자에 부가하여 인터페론 반응을 유발하기 충분한 길이의 분자(Dicer에 의해 절단될 수 있고(Bernstein 등, 2001. Nature, 409:363-366) RISC로 들어갈 수 있음(RNAi-유도된 침묵화 복합체))를 포함할 수 있다. siRNA 조정제, 또는 이들의 절단 산물은, 예로 표적 RNA, 바람직하게는 AARS 표적, 예컨대 선택된 스플라이스 변이체에 대해 RNAi를 유도함으로써 표적 유전자를 하향 조절할 수 있다.

siRNA 제제의 각 가닥은 35, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 또는 15 뉴클레오티드 길이 이하일 수 있다. 가닥은 바람직하게는 적어도 19 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 각각의 가닥은 21 내지 25 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 바람직한 siRNA 제제는 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24, 또는 25 뉴클레오티드쌍의 듀플렉스 영역, 및 2~3 뉴클레오티드의 하나 이상의 오버행, 바람직하게는 1 내지 2개의 3' 오버행을 갖는다.

표적 RNA에 대한 상동성 및 표적 유전자의 하향 조절 능력에 부가하여, siRNA 제제는 하나 이상의 하기 특성들을 가질 수 있다: 이는 개질에도 불구하고, 매우 다수 또는 전체 뉴클레오시드가, 예로 표적 RNA의 절단에 의한 표적의 하향 조절을 허용하기 충분한 상동성 표적 RNA와 듀플렉스 구조를 형성하고 정확한 염기 쌍 형성을 이룰 수 있기 위해 적절한 3차원 틀의 염기(또는 개질된 염기)를 제공할 수 있는 안티센스 가닥을 가질 수 있다; 이는 개질에도 불구하고 매우 다수 또는 전체 뉴클레오시드가 여전히 "RNA-유사" 특성을 가질 수 있다, 즉 비배타적으로 또는 심지어 부분적으로 리보뉴클레오티드-기반 컨텐츠를 갖는 RNA 분자의 전체적인 구조적, 화학적 및 물리적 특성을 보유할 수 있다. 예를 들어, siRNA 제제는, 예로 모든 뉴클레오티드 당이 예로 2' 히드록실 대신 2' 플루오로를 함유하는 센스 및/또는 안티센스 가닥을 함유할 수 있다. 상기 데옥시리보뉴클레오티드-함유 제제는 여전히 RNA-유사 특성을 나타낼 것으로 예측할 수 있다. 이론에 구애되지 않으면서, 전기음성적 불소는 리보오스의 C2' 위치에 부착된 경우 축 배향을 선호한다. 불소의 이러한 공간적 선호는 다시 당이 C₃'-엔도 퍼커를 채용하도록 만들 수 있다. 이는 RNA 분자에서 관찰되는 바와 동일한 퍼커 방식이며, RNA-특이적 A-패밀리-유형 나선을 만든다. 또한 불소는 우수한 수소 결합 수용기이므로, RNA 구조를 안정화시키는 것으로 공지된 물 분자와 동일한 수소 결합 상호반응에 참여할 수 있다. 일반적으로, 2' 당 위치의 개질된 부분이 데옥시리보뉴클레오티드의 H 부분보다 리보뉴클레오티드의 OH 부분의 더 큰 특징인 H-결합 내로 도입될 수 있을 것임이 바람직하다.

본원에서 사용되는 "단일쇄 RNAi 제제"는 단일 분자로 만들어진 RNAi 제제이다. 이는 가닥내 쌍 형으로 형성된 듀플렉스화 영역을 포함할 수 있고, 예로 헤어핀 또는 팬-손잡이 구조이거나 이를 포함할 수 있다. 단일 가닥 RNAi 조정제는 바람직하게는 표적 분자에 대해 안티센스이다. 단일 가닥 RNAi 제제는 표적 mRNA의 RISC 내로 들어갈 수 있고 RISC 매개 절단에 참여할 수 있게 충분히 길어야 한다. 단일 가닥 RNAi 제제는 적어도 14, 보다 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 29, 35, 40, 또는 50 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는 200, 100, 또는 60 뉴클레오티드 길이 미만이다.

헤어핀 RNAi 조정제는 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24, 또는 25 뉴클레오티드 쌍만큼 또는 그 이상의 듀플렉스 영역을 가질 수 있다. 듀플렉스 영역은 바람직하게는 200, 100, 또는 50 길이 또는 그 이하일 수 있다. 듀플렉스 영역에 대한 특정 범위는 15-30, 17 내지 23, 19 내지 23, 및 19 내지 21 뉴클레오티드쌍 길이이다. 헤어핀은 바람직하게는 헤어핀의 3', 및 바람직하게는 안티센스측에 단일 가닥 오버행 또는 쌍을 형성하지 않은 말단 영역을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 오버행은 2-3 뉴클레오티드 길이이다.

본원에서 제공되는 방법에 따라 이용되는 특정 조정제는 각각 적어도 하나의 단량체 단위, 즉 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우 하나의 뉴클레오티드로로 만들어진 둘 이상의 화학적 개별 영역을 함유하는 RNAi 올리고뉴클레오티드, 예컨대 키메라성 올리고뉴클레오티드, 또는 "키메라"를 포함할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 보통 올리고뉴클레오티드에 뉴클레아제 분해에 대한 내성 증가, 세포 흡수 증가 및/또는 표적 핵산에 대한 결합 친화도 증가를 부여하기 위해 개질된 적어도 하나의 영역을 함유한다. 결과적으로, 키메라성 올리고뉴클레오티드가 사용되는 경우 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드에 비해 더 짧은 올리고뉴클레오티드로 종종 비견할 만한 결과가 수득될 수 있다. 키메라성 올리고뉴클레오티드는 상술된 바와 같은 둘 이상의 올리고뉴클레오티드, 개질된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모사체의 복합 구조로 형성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 또한 하이브리드 또는 갭머로서 당분야에서 불려 왔다. 이러한 하이브리드 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 U.S. 특허 번호 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 5,700,922; 및 5,955,589를 비제한적으로 포함하며, 그 각각이 본원에서 참조로 도입된다. 특정 구현예에서, 키메라성 올리고뉴클레오티드는 RNA-DNA, DNA-RNA, RNA-DNA-RNA, DNA-RNA-DNA, 또는 RNA-DNA-RNA-DNA이며, 올리고뉴클레오티드는 5 내지 60 뉴클레오티드 길이이다.

본 발명의 하나의 측면에서, RNAi 제제는 변형된 또는 비-천연 뉴클레오염기에 연결된 적어도 하나의 리간드를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 다수의 화합물이 변형된 염기로 기능할 수 있다. 변형된 염기의 구조는 변형된 염기가 그 표적, 예로 mRNA에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합을 실질적으로 방지하지 않는 정도인 것이 중요하다. 특정 구현예에서, 변형된 염기는 본원에 기재된 임의의 한 비-천연 뉴클레오염기의 2가 라디칼 또는 디플루오로톨릴, 니트로피롤릴, 니트로이미다졸릴, 니트로인돌릴, 나프탈레닐, 안트라세닐, 피리디닐, 퀴놀리닐, 피레닐이다. 특정 구현예에서, 비-천연 뉴클레오염기는 디플루오로톨릴, 니트로피롤릴, 또는 니트로이미다졸릴이다. 특정 구현예에서, 비-천연 뉴클레오염기는 디플루오로톨릴이다. 다양한 리간드가 당분야에 공지되어 있으며, 본 발명에 이용 가능하다. 예를 들어, 리간드는 스테로이드, 담즙산, 지질, 엽산, 피리독살, B12, 리보플라빈, 바이오틴, 방향족 화합물, 폴리시클릭 화합물, 크라운 에테르, 삽입제, 클레버 분자, 단백질-결합 제제, 또는 탄수화물일 수 있다. 특정 구현예에서, 리간드는 스테로이드 또는 방향족 화합물이다. 특정 예에서, 리간드는 콜레스테릴이다.

다른 구현예에서, RNAi 제제는 세포 표적화 및 흡수의 개선 목적을 위해 리간드에 연결된 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어, RNAi 제제는 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편에 연결될 수 있다. 부가적 예로서, RNAi 제제는 특정 리간드 결합 분자, 예컨대 특정 세포-표면 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편에 연결될 수 있다.

다른 구현예에서, 조정제는 본원에 기재된 바와 같은 비-천연 뉴클레오염기를 포함한다. 특정 예에서, 뉴클레오시드에서 천연 생성되는 리보오스 당 부분은 6탄당으로 대체된다. 특정 구현예에서, 6탄당은 알로오스, 알트로오스, 글루코오스, 만노오스, 굴로오스, 이도오스, 갈락토오스, 탈로오스, 또는 이들의 유도체이다. 바람직한 구현예에서, 헥소오스는 D-헥소오스이다. 특정 예에서, 뉴클레오시드에서 천연 생성되는 리보오스 당 부분은 폴리시클릭 헤테로알킬 고리 또는 시클로헥세닐기로 대체된다. 특정 예에서, 폴리시클릭 헤테로알킬기는 고리 중 하나의 산소 원자를 함유하는 비시클릭 고리이다. 특정 예에서, 폴리시클릭 헤테로알킬기는 비시클로[2.2.1]헵탄, 비시클로[3.2.1]옥탄, 또는 비시클로[3.3.1]노난이다. 개질된 RNAi 제제의 예는 또한 본원에 기재된 바와 같은 개질된 골격 또는 비-천연 뉴클레오시드 간 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 또한 리보자임을 채용하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 고특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 촉매하는 합성 RNA 분자 및 이들의 유도체는 리보자임으로 공지되어 있다(예로, U.S. 특허 번호 5,543,508(Haseloff 등), 및 U.S. 특허 번호 5,545,729(Goodchild 등) 참고). 절단 반응은 RNA 분자 자체에 의해 촉매된다. 천연 생성 RNA 분자에서, 자가 촉매된 절단 부위는 RNA 이차 구조의 고도로 보존된 영역 내에 배치된다(Buzayan 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 8859; Forster 등, Cell, 1987, 50, 9). 천연 생성 자가촉매성 RNA 분자는 높은 특이도로 특정 세포 또는 병원성 RNA 분자에 표적화될 수 있는 리보자임을 생성하도록 개질된다. 따라서 리보자임은 안티센스 올리고뉴클레오티드와 동일한 일반적 목적으로 기능하며(즉, 특정 유전자의 발현 조정), 올리고뉴클레오티드와 마찬가지로 상당한 단일쇄 부분을 보유하는 핵산이다.

특정 예에서, 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-리간드기로 개질될 수 있다. 여러 비-리간드 분자가 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 세포 표적화, 또는 세포 흡수를 증강시키기 위해 올리고뉴클레오티드에 접합되며, 이러한 접합의 수행 절차는 과학 문헌에서 이용 가능하다. 이러한 비-리간드 부분은 지질 부분, 예컨대 콜레스테롤(Letsinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 아르기닌-풍부 펩티드, 콜산(Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예로 헥실-5-트리틸티올(Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤(Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예로 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras 등, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예로 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 부분(Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 부분(Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 상기에 열거된다. 전형적인 접합 프로토콜에는 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 보유하는 올리고뉴클레오티드의 합성이 관여된다. 이어서 아미노기가 적절한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 콘쥬게이션된 분자와 반응된다. 접합 반응은 고형 지지체에 여전히 결합된 올리고뉴클레오티드와 또는 용액상 중 올리고뉴클레오티드의 절단 후 수행될 수 있다. HPLC에 의한 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 정제로 보통 순수한 콘쥬게이트가 산출된다.

RNAi 제제의 부가적 예는 U.S. 출원 공개 번호 2007/0275465, 2007/0054279, 2006/0287260, 2006/0035254, 2006/0008822에서 찾아볼 수 있으며, 이는 참조로 도입된다. 또한 본원에서 기재된 AARS-표적화 서열을 발현할 수 있는 벡터 전달 시스템이 포함된다. siRNA 또는 다른 듀플렉스-형성 RNA 간섭 분자를 발현하는 벡터가 포함된다.

벡터 또는 핵산 구축물 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있으며, 이들은 함께 숙주 세포의 게놈, 또는 트랜스포존 내로 도입될 전체 DNA를 함유한다. 벡터의 선택은 보통 벡터가 도입될 숙주 세포에 대한 벡터의 상용성에 의존할 것이다. 본 발명의 경우에서, 벡터 또는 핵산 구축물은 바람직하게는 포유류 세포, 예컨대 근육 세포에서 작동 가능하게 기능하는 것이다. 벡터는 또한 적합한 형질전환체 또는 전달감염체의 선택 또는 동정을 위해 이용될 수 있는 선택 마커, 예컨대 항생제 또는 약물 내성 유전자, 또는 리포터 유전자(즉, 녹색 형광 단백질, 루시퍼라아제)를 포함할 수 있다. 예시적인 전달 시스템은 당분야에 공지된 다른 것들 중에서 레트로바이러스(예로, 렌티바이러스) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 및 헤르페스 바이러스 벡터를 비제한적으로 포함하는 바이러스 벡터 시스템(즉, 바이러스-매개 형질도입)을 포함할 수 있다.

XI . 약물 발견

특정 구현예는 보통 참조 AARS 폴리펩티드, 예로 AARS 단백질 단편의 하나 이상의 비-정규적 활성을 조정하는 제제를 동정하기 위한 약물 발견에서의 AARS 폴리펩티드, 항체, 또는 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예는 직접 또는 물리적으로 AARS 폴리펩티드와 상호반응하는 AARS 참조 폴리펩티드의 하나 이상의 "세포 결합 파트너", 예컨대 세포 단백질, 지질, 핵산 또는 다른 숙주 분자의 동정 방법을 포함한다. 특정 예는, 예를 들어 세포-표면 수용체, 예컨대 GPCR, 단백질-단백질 상호반응 도메인, 및 이들의 세포외 또는 세포내 도메인을 포함한다.

또한 비-정규적 활성에서 그 역할을 조절하거나, 또는 결합 파트너에 의해 조절되는 세포 결합 파트너와 직접 또는 간접 상호반응하는 분자를 포함하는, AARS 폴리펩티드의 하나 이상의 비-정규적 활성에 참여하는 숙주 분자의 동정 방법이 포함된다. 이러한 숙주 분자는 보통 세포 결합 파트너/AARS 단백질 상호반응에 비해 경로에서 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과의 동정 가능한 단계로 관련된 비-정규적 경로의 상류 및 하류 성분 모두를 포함한다.

특정 측면은, 예컨대 AARS 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 그 세포 결합 파트너와의 상호반응에 의해 AARS 참조 폴리펩티드 또는 이들의 활성 변이체의 비정규적 활성을 작동시키거나 길항시키는 화합물(예로, 폴리펩티드) 또는 다른 제제의 동정 방법을 포함한다. 또한 AARS 스플라이스 변이체의 발현(예로 스플라이싱)을 조정하거나 또는 다른 방식으로는 단백질 수준에서 내인성 AARS 단백질 단편(리섹틴)의 제조를 조절하는 프로테아제의 활성을 조정하는 제제의 동정 방법이 포함된다.

따라서 특정 구현예는 a) AARS 폴리펩티드와 생물학적 표본을 적합한 조건 하에 조합하고, b) 결합 파트너에 대한 AARS 폴리펩티드의 특이적 결합을 검출함으로써 AARS 참조 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 파트너를 동정하는 것을 포함하는, AARS 참조 폴리펩티드의 결합 파트너 동정 방법이 포함된다. 또한 a) 폴리펩티드 또는 결합 파트너와 적어도 하나의 평가 화합물을 적합한 조건 하에 조합하고, b) 평가 화합물에 대한 폴리펩티드 또는 결합 파트너의 결합을 검출하여 폴리펩티드 또는 그 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 화합물을 동정하는 것을 포함하는, AARS 참조 폴리펩티드 또는 AARS 폴리펩티드의 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 화합물의 스크리닝 방법이 포함된다. 특정 구현예에서, 화합물은 폴리펩티드 또는 펩티드이다. 특정 구현예에서, 화합물은 소분자 또는 다른(예로, 비-생물학적) 화학적 화합물이다. 특정 구현예에서, 화합물은 펩티드 모사체이다.

AARS 참조 폴리펩티드와 상호반응하거나, 하나 이상의 그 세포 결합 파트너와 상호반응하거나, 또는 둘 다인 세포 단백질의 동정을 위해 단백질-단백질 상호반응을 검출하기 적합한 임의 방법이 채용될 수 있다. 채용될 수 있는 전통적 방법의 예는 주로 AARS 폴리펩티드와 상호반응하는 용해액 중 단백질을 동정하기 위한 세포 용해액 또는 세포 용해액에서 수득되는 단백질의 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공-정제, 공면역침전 및 가교가 포함된다.

이들 및 관련 구현예에서, AARS 폴리펩티드 또는 그 결합 파트너와 상호반응하는 아미노산 서열의 적어도 일부는 당분야의 숙련자에게 널리 공지된 기법을 이용하여, 예컨대 Edman 분해 기법을 통해 지정될 수 있다. 예로 [Creighton Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y., pp. 34 49, 1983]을 참고하라. 수득된 아미노산 서열은 이러한 단백질을 인코딩하는 유전자 서열에 대한 스크리닝을 위해 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 혼합물 생성을 위한 가이드로 이용될 수 있다. 스크리닝은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같고 당분야에 공지된 표준 혼성화 또는 PCR 기법에 의해 달성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 혼합물의 생성 및 스크리닝을 위한 기법은 널리 공지되어 있다. 예로 [Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; 및 Innis 등, eds. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., New York, 1990]을 참고하라.

부가적으로, 결합 파트너 또는 다른 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 동시적 동정에서 방법이 채용될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 표지된 AARS 단백질, 또는 다른 폴리펩티드, 펩티드 또는 융합 단백질, 예로 마커(예로 효소, 형광, 발광 단백질, 또는 염료), 또는 Ig-Fc 도메인에 융합된 변이체 AARS 폴리펩티드 또는 AARS 도메인을 이용하는 lambda-gt11 라이브러리의 항체 탐침분석의 널리 공지된 기법과 유사한 방식의 탐침분석 발현 라이브러리를 포함한다.

생체 내 단백질 상호반응을 검출하는 한 방법인 2-하이브리드 시스템이 단지 예로서 비제한적으로 상세히 기재된다. 이러한 시스템의 한 예가 설명되어 있으며(Chien 등, PNAS USA 88:9578 9582, 1991) Clontech(Palo Alto, Calif.)에서 상업적으로 이용 가능하다.

간략하게, 이러한 시스템을 이용하여 2 하이브리드 단백질을 인코딩하는 플라스미드가 구축될 수 있다: 하나의 플라스미드는 AARS 참조 뉴클레오티드 서열(또는 특정 구현예에서, 그 결합 파트너)에 융합된 전사 활성화제 단백질의 DNA-결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 또는 이들의 변이체로 구성되며, 다른 플라스미드는 cDNA 라이브러리의 일부로서 플라스미드 내로 재조합된 미공지 단백질(들)을 인코딩하는 cDNA(또는 cDNA의 집합)에 융합된 전사 활성화제 단백질의 활성화 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드로 구성된다. DNA-결합 도메인 융합 플라스미드 및 활성화제 cDNA 라이브러리는 그 조절 영역에 전사 활성화제의 결합 부위를 함유하는 리포터 유전자(예로, HBS 또는 lacZ)를 함유하는 효모 사카로마이세스 세레비시애 균주 내로 형질전환될 수 있다. 하이브리드 단백질 단독으로는 리포터 유전자의 전사를 활성화시킬 수 없다: DNA-결합 도메인 하이브리드는 활성화 기능을 제공하지 않기 때문에 불가능하며, 활성화 도메인 하이브리드는 활성화제의 결합 부위로 편재할 수 없기 때문에 불가능하다. 두 하이브리드 단백질의 상호반응은 기능적 활성화제 단백질을 재구성하여 리포터 유전자의 발현을 일으키며, 이는 리포터 유전자 산물에 대한 분석으로 검출된다.

2-하이브리드 시스템 또는 이러한 다른 방법론은 "미끼" 유전자 산물과 상호반응하는 단백질에 대한 활성화 도메인 라이브러리를 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 예로서 그리고 비제한적으로, AARS 참조 폴리펩티드 또는 변이체는 미끼 유전자 산물로 사용될 수 있다. AARS 결합 파트너는 또한 "미끼"유전자 산물로 사용될 수 있다. 전체 게놈 또는 cDNA 서열은 활성화 도메인을 인코딩하는 DNA에 융합된다. 상기 라이브러리 및 DNA-결합 도메인에 융합된 미끼 AARS 유전자 산물의 하이브리드를 인코딩하는 플라스미드는 효모 리포터 균주 내로 공형질전환되며, 생성 형질전환체는 리포터 유전자를 발현하는 것들에 대해 스크리닝된다.

미끼 AARS 유전자 산물과 상호반응하는 단백질이 검출될 세포주의 cDNA 라이브러리는 당분야에서 일상적으로 실시되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, cDNA 단편은 이들이 GAL4의 전사 활성화 도메인으로 번역 가능하게 융합되도록 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이러한 라이브러리는 GAL4 활성화 서열을 함유하는 프로모터로 유도되는 lacZ 유전자를 함유하는 효모 균주 내로 미끼 유전자-GAL4 융합 플라스미드와 함께 공형질전환될 수 있다. 미끼 유전자 산물과 상호반응하는 GAL4 전사 활성화 도메인에 융합된 cDNA 인코딩된 단백질은 활성 GAL4 단백질을 재구성하여 HIS3 유전자를 발현시킬 것이다. HIS3을 발현하는 콜로니는 히스티딘이 없는 반고체 한천계 배지를 함유하는 페트리 디쉬 상에서의 이들의 성장에 의해 검출될 수 있다. 이어서 cDNA는 이들 균주로부터 정제되고 당분야에서 일상적으로 실시되는 기법을 이용하여 미끼 AARS 유전자-상호반응 단백질를 제조 및 단리하기 위해 사용될 수 있다.

또한 효모에서 RNA-단백질 상호반응의 검출을 허용하는 3-하이브리드 시스템이 포함된다. 예로 [Hook 등, RNA. 11:227-233, 2005]를 참고하라. 따라서, 이들 및 관련 방법이 AARS 폴리펩티드의 세포 결합 파트너를 동정하고, AARS 폴리펩티드, 세포 결합 파트너, 또는 둘 다와 상호반응하는 다른 단백질 또는 핵산을 동정하기 위해 이용될 수 있다.

특정 구현예는 인터랙톰 스크리닝 접근법의 이용에 관한 것이다. 특정 예는 단백질 도메인-기반 스크리닝을 포함한다(예로 [Boxem 등, Cell. 134:534-545, 2008; 및 Yu 등, Science. 322:10-110, 2008] 참고).

앞서 주지된 바와 같이, 일단 단리된 결합 파트너는 동정될 수 있고, 다시 이것이 상호반응하는 단백질 또는 다른 화합물을 동정하기 위한 표준 기법과 함께 이용될 수 있다. 따라서 특정 구현예는 a) 결합 파트너를 적어도 하나의 평가 화합물과 적합한 조건 하에 조합하고, b) 평가 화합물에 대한 결합 파트너의 결합을 검출하여 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 화합물을 동정하는 것을 포함하는, AARS 참조 폴리펩티드의 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 화합물에 대한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 평가 화합물은 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 평가 화합물은 화학적 화합물, 예컨대 소분자 화합물 또는 펩티드 모사체이다.

특정 구현예는 a) 폴리펩티드의 활성을 허용하는 조건 하에 폴리펩티드와 적어도 하나의 평가 화합물을 조합하고, b) 평가 화합물의 존재 하에 폴리펩티드의 활성을 평가하고, c) 평가 화합물의 존재 하 폴리펩티드의 활성과 평가 화합물의 부재 하 폴리펩티드의 활성을 비교하는 것을 포함하는, AARS 참조 폴리펩티드의 활성을 조정하는 화합물에 대한 스크리닝 방법을 포함하며, 평가 화합물 존재 하에 폴리펩티드의 활성 변화는 폴리펩티드의 활성을 조정하는 화합물을 시사한다. 특정 구현예는 a) 결합 파트너의 활성을 허용하는 조건 하에 폴리펩티드와 적어도 하나의 평가 화합물을 조합하고, b) 평가 화합물의 존재 하에 결합 파트너의 활성을 평가하고, c) 평가 화합물의 존재 하 결합 파트너의 활성과 평가 화합물의 부재 하 결합 파트너의 활성을 비교하는 것을 포함하는, AARS 참조 폴리펩티드의 결합 파트너의 활성을 조정하는 화합물에 대한 스크리닝 방법을 포함하며, 평가 화합물 존재 하에 결합 파트너의 활성 변화는 결합 파트너의 활성을 조정하는 화합물을 시사한다. 보통, 이들 및 관련 구현예는 AARS 폴리펩티드 또는 그 결합 파트너에 연관된 선택된 비-정규적 활성의 평가를 포함한다. 시험관 내 및 생체 내 조건, 예컨대 세포 배양 조건이 포함된다.

특정 구현예는 a) 폴리펩티드를 포함하는 표본을 화합물에 노출시키고, b) 표본 중 작동제 활성을 보통 AARS 폴리펩티드의 비-정규적 활성의 증가를 측정함으로써 검출하는 것을 포함하는, AARS 참조 폴리펩티드 또는 이들의 활성 단편 또는 변이체의 전체 또는 부분 작동제로서의 유효성에 대한 화합물 스크리닝 방법을 포함한다. 특정 방법은 a) AARS 폴리펩티드의 결합 파트너를 포함하는 표본을 화합물에 노출시키고, b) 표본 중 작동제 활성을 보통 AARS 폴리펩티드의 선택된 비-정규적 활성의 증가를 측정함으로써 검출하는 것을 포함한다. 특정 구현예는 상기 방법으로 동정된 작동제 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포함한다.

또한 a) 폴리펩티드를 포함하는 표본을 화합물에 노출시키고, b) 표본 중 길항제 활성을 보통 AARS 폴리펩티드의 비-정규적 활성의 감소를 측정함으로써 검출하는 것을 포함하는, AARS 참조 폴리펩티드의 전체 또는 부분 길항제로서의 유효성에 대한 화합물 스크리닝 방법이 포함된다. 특정 방법은 a) AARS 폴리펩티드의 결합 파트너를 포함하는 표본을 화합물에 노출시키고, b) 표본 중 길항제 활성을 보통 AARS 폴리펩티드의 선택된 비-정규적 활성의 감소를 측정함으로써 검출하는 것을 포함한다. 특정 구현예는 상기 방법으로 동정된 길항제 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포함한다.

특정 구현예에서, 시험관 내 시스템은 AARS 참조 서열 또는 그 결합 파트너와 상호반응하거나 이를 조정할 수 있는 화합물을 동정하기 위해 설계될 수 있다. 이러한 시스템에 의해 동정된 특정 화합물은, 예를 들어 경로의 활성 조정에 그리고 경로 자체의 성분을 상세히 밝히는데 있어 유용할 수 있다. 이들은 또한 경로의 성분간 상호반응을 손상시키는 화합물의 동정을 위한 스크리닝에 이용될 수 있으며; 또는 이러한 상호반응을 직접 손상시킬 수 있다. 하나의 예시적인 접근법에는 AARS 폴리펩티드 및 평가 화합물의 반응 혼합물을 둘이 상호반응하고 결합하는 것을 허용하는 조건 하에 충분한 시간 동안 제조하여 반응 혼합물에서 제거되고/되거나 검출될 수 있는 복합체를 형성하는 것이 관여된다.

시험관 내 스크리닝 분석은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, AARS 폴리펩티드, 세포 결합 파트너, 또는 평가 화합물(들)은 고상에 부착될 수 있다. 이들 및 관련 구현예에서, 생성 복합체는 반응 말기에 고상에서 포획 및 검출될 수 있다. 이러한 방법의 한 예에서, AARS 폴리펩티드 및/또는 그 결합 파트너는 고형 표면 상에 부착되며, 부착되지 않은 평가 화합물(들)은 고형 표면 상 성분에 의해 이들의 포획이 검출될 수 있도록 직접 또는 간접 표지될 수 있다. 다른 예에서, 평가 화합물(들)은 고형 표면으로 부착되며, 부착되지 않은 AARS 폴리펩티드 및/또는 그 결합 파트너는 표지되거나 일부 방식으로 검출 가능하다. 특정 구현예에서, 마이크로타이터 플레이트는 고상으로 편리하게 이용될 수 있다. 부착된 성분(또는 평가 화합물)은 비-공유 또는 공유 부착에 의해 고정화될 수 있다. 비-공유 부착은 단백질 용액으로 고형 표면을 단순 코팅하고 건조하여 수행될 수 있다. 대안적으로 고정화될 단백질에 대해 특이적인 고정화된 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 이용하여 단백질을 고형 표면으로 부착할 수 있다. 표면은 미리 제조 및 보관될 수 있다.

예시적인 분석을 수행하기 위해, 비-고정화된 성분은 보통 부착된 성분을 함유하는 코팅 표면으로 첨가된다. 반응 완료 후, 미반응 성분은 형성된 임의의 특이적 복합체가 고형 표면 상에서 계속 고정화되도록 하는 조건 하에 제거된다(예로 세척에 의해). 고형 표면 상에 부착된 복합체의 검출은 여러 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 이전에 비-고정화된 성분이 미리-표지된 경우, 표면 상에 고정화된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 시사한다. 이전에 비-고정화된 성분이 미리 표지되지 않은 경우, 표면 상에 부착된 복합체를 검출하기 위해 간접 표지; 예로 이전에 비-고정화된 성분에 대해 특이적인 표지 항체를 이용하여 이용될 수 있다(항체는 다시 표지된 반-Ig 항체로 직접 표지 또는 간접 표지될 수 있다).

대안적으로, 평가 화합물 결합의 존재 또는 부재는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(SPR) 및 공명 각의 변화를 지수로 이용하여 결정될 수 있으며, AARS 폴리펩티드 또는 세포 결합 파트너는 종래 방법에 따라 상업적으로 이용 가능한 센서칩(예로 BIACORE™ 제작 칩)의 표면 상에 고정화되며, 평가 화합물은 이와 접촉되고, 센서 칩에는 특정 각으로 특정 파장을 갖는 광이 조사된다. 평가 화합물의 결합은 또한 AARS 폴리펩티드 또는 세포 결합 파트너가 질량 분광측정기에 이용 가능한 단백질 칩의 표면 상에 고정화되고, 평가 화합물이 이와 접촉되고, 이온화 방법, 예컨대 MALDI-MS, ESI-MS, FAB-MS 등이 질량 분광측정기(예로, 더블 포커싱 질량 분광측정기, 쿼드로폴 질량 분광측정기, 비행 시간 질량 분광측정기, 푸리에 형질전환 질량 분광측정기, 이온 사이클로트론 질량 분광측정기 등)와 조합되는 방법에 의해 평가 화합물에 대응하는 피크의 출현 검출에 의해 검출될 수 있다.

특정 구현예에서, 세포-기반 분석, 막 소포-기반 분석, 또는 막 분획-기반 분석은 선택된 AARS 폴리펩티드의 비-정규적 경로에서 상호반응을 조정하는 화합물을 동정하기 위해 이용될 수 있다. 상기 목적을 위해, AARS 폴리펩티드 및/또는 결합 파트너, 또는 이러한 단백질의 도메인 또는 단편을 함유하는 융합 단백질(또는 이들의 조합)를 발현하는 세포주, 또는 상기 단백질(들) 또는 융합 단백질(들)을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포주(예로, COS 세포, CHO 세포, HEK293 세포, Hela 세포 등)가 이용될 수 있다. 비-정규적 활성에 영향을 미치는 평가 화합물(들)은 대조군 또는 소정량 대비 활성 변화(예로, 통계적으로 유의미한 변화)를 모니터링함으로써 동정될 수 있다.

안티센스 및 RNAi 제제에 관한 구현예에 있어서, 예를 들어 a) AARS 참조 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표본을 화합물, 예컨대 잠재적 안티센스 올리고뉴클레오티드에 노출시키고, b) AARS 폴리뉴클레오티드의 변형된 발현을 검출하는 것을 포함하는, AARS 참조 폴리뉴클레오티드의 발현 변형에서의 유효성에 대한 화합물의 스크리닝 방법이 또한 포함된다. 특정 비제한적 예에서, 이들 및 관련 구현예는 당분야에서 일상적 기법에 따라 세포-기반 분석 또는 무세포 번역 분석에서 채용될 수 있다. 또한 이러한 방법에 의해 동정된 안티센스 및 RNAi 제제가 포함된다.

AARS 단백질 단편에 대한 항체는 또한 스크리닝 분석에서, 예컨대 AARS에 특이적으로 결합하는 제제를 동정하기 위해, AARS 단백질 단편에 결합하는 제제의 특이성 또는 친화도를 확인하기 위해, 또는 제제 및 AARS 단백질 단편 간 상호반응 부위를 동정하기 위해 이용될 수 있다. 항체가 제제의 경쟁적 저해제로 사용되는 분석이 포함된다. 예를 들어, 공지된 친화도를 갖는 AARS 단백질 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 선택된 제제의 경쟁적 저해제로서 작용할 수 있고, AARS 단백질 단편에 대한 제제의 친화도를 계산하기 위해 이용될 수 있다. 또한 AARS 단백질 단편의 공지된 에피토프 또는 부위에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체가 경쟁적 저해제로서 제제가 동일한 부위에 결합하는지 여부를 확인하는데 이용될 수 있다. 다른 변화는 당분야의 숙련자에게 자명할 것이다.

또한 고처리량 스크리닝(HTS)을 위해 적용된 임의의 상기 방법 또는 당분야에 공지된 다른 스크리닝 방법이 포함된다. HTS는 보통 후보 화합물의 라이브러리에 대한 분석, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 비-정규적 활성의 증가 또는 감소를 측정하는 분석의 스크리닝을 수행하기 위해 자동화를 이용한다.

본원에서 제공되는 임의의 스크리닝 방법은 조합 화학에 의해 생성되는 소분자 라이브러리 또는 라이브러리들을 이용할 수 있다. 화학적 및/또는 생물학적 혼합물, 예컨대 진균, 박테리아, 또는 조류 추출물의 라이브러리는 당분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 임의 분석으로 스크리닝될 수 있다. 분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 [Carell 등, 1994a; Carell 등, 1994b; Cho 등, 1993; DeWitt 등, 1993; Gallop 등, 1994; Zuckermann 등, 1994]에서 찾아볼 수 있다.

화합물의 라이브러리는 용액 중에(Houghten 등, 1992) 또는 비드 상에(Lam 등, 1991), 칩 상에(Fodor 등, 1993), 박테리아, 포자에(Ladner 등, U.S. 특허 번호 5,223,409, 1993), 플라스미드에(Cull 등, 1992) 또는 파지 상에(Cwirla 등, 1990; Devlin 등, 1990; Felici 등, 1991; Ladner 등, U.S. 특허 번호 5,223,409, 1993; Scott and Smith, 1990) 제공될 수 있다. 본 발명의 구현예는 하나 이상의 AARS 단백질 단편, 이들의 세포 결합 파트너, 및/또는 이들의 관련 비-정규적 활성의 소분자 조정제의 동정을 위한 상이한 라이브러리의 사용을 포함한다. 본 발명의 목적에 유용한 라이브러리는 (1) 화학적 라이브러리, (2) 천연 산물 라이브러리, 및 (3) 무작위 펩티드, 올리고뉴클레오티드 및/또는 유기 분자로 이루어진 조합 라이브러리를 비제한적으로 포함한다.

화학적 라이브러리는 공지된 화합물 또는 천연 산물 스크리닝을 통한 "히트" 또는 "비드"로 동정된 화합물의 구조적 유사체로 구성된다. 천연 산물 라이브러리는 하기의 스크리닝을 위한 혼합물 생성에 이용되는 미생물, 동물, 식물, 또는 해양 유기체의 집합에서 유도된다: (1) 토지, 식물 또는 해양 미생물로부터 액체 배지의 발효 및 추출 또는 (2) 식물 또는 해양 유기체의 추출. 천연 산물 라이브러리는 폴리펩티드, 비-리보솜 펩티드, 및 이들의 변이체(비-천연 생성)를 포함한다. 예로 [Cane 등, Science 282:63-68, 1998]을 참고하라. 조합 라이브러리는 혼합물로서 다수의 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 유기 화합물로 이루어질 수 있다. 이들은 전통적인 자동화 합성 방법, PCR, 클로닝 또는 독자적 합성 방법에 의해 제조하기 비교적 쉽다.

보다 구체적으로, 조합 화학적 라이브러리는 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 여러 화학적 "구성 블록", 예컨대 시약의 조합에 의해 생성되는 다양한 화학적 화합물의 집합이다. 예를 들어, 선형 조합 화학적 라이브러리, 예컨대 폴리펩티드 라이브러리는 주어진 화합물 길이(즉, 폴리펩티드 화합물 중 아미노산의 수)에 대해 가능한 모든 방식으로 화학적 구성 블록(아미노산)의 세트를 조합하여 형성된다. 수백만개의 화학적 화합물이 이러한 화학적 구성 블록의 조합 혼합을 통해 합성될 수 있다.

조합 화학 및 이로부터 생성되는 라이브러리에 대한 리뷰는, 예로 [Huc, I. and Nguyen, R. (2001) Comb. Chem. High Throughput Screen 4:53-74; Lepre,C A. (2001) Drug Discov. Today 6:133-140; Peng, S. X. (2000) Biomed. Chromatogr. 14:430-441; Bohm, H. J. and Stahl, M. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:283-286; Barnes, C and Balasubramanian, S. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:346-350; Lepre, Enjalbal, C, 등 (2000) Mass Septrom Rev. 19:139-161; Hall, D. G., (2000) Nat. Biotechnol. 18:262-262; Lazo, J. S., and Wipf, P. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 293:705-709; Houghten, R. A., (2000) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40:273-282; Kobayashi, S. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. (2000) 4:338-345; Kopylov, A. M. and Spiridonova, V. A. (2000) Mol. Biol. (Mosk) 34:1097-1113; Weber, L. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:295-302; Dolle, R. E. (2000) J. Comb. Chem. 2:383-433; Floyd, C D., 등, (1999) Prog. Med. Chem. 36:91-168; Kundu, B., 등, (1999) Prog. Drug Res. 53:89-156; Cabilly, S. (1999) Mol. Biotechnol. 12:143-148; Lowe, G. (1999) Nat. Prod. Rep. 16:641-651; Dolle, R. E. and Nelson, K. H. (1999) J. Comb. Chem. 1:235-282; Czarnick, A. W. and Keene, J. D. (1998) Curr. Biol. 8:R705-R707; Dolle, R. E. (1998) Mol. Divers. 4:233-256; Myers, P. L., (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:701-707; 및 Pluckthun, A. and Cortese, R. (1997) Biol. Chem. 378:443]을 참고하라.

조합 라이브러리의 제조를 위한 장치는 상업적으로 이용 가능하다(예로 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass. 참고). 부가적으로, 여러 조합 라이브러리 자체가 상업적으로 이용 가능하다(예로 Comgenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Mo., ChemStar, Ltd., Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Biosciences, Columbia, Md., 등 참고).

XII . 사용 방법

본 발명의 구현예는 치료의 치료적 방법을 포함한다. 따라서, AARS 폴리펩티드, AARS 폴리뉴클레오티드, AARS 폴리뉴클레오티드-기반 벡터, AARS 발현 숙주 세포, 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi 제제뿐만 아니라 결합 제제, 예컨대 펩티드, 항체 및 항원-결합 단편, 펩티드 모사체 및 다른 소분자를 포함하는 본원에서 기재된 AARS 제제는 참조 AARS의 비-정규적 활성에 연관된 다양한 비제한적 질환 또는 상태를 치료하는데 이용될 수 있다. 이러한 비-정규적 활성의 예는 세포외 신호전달의 조정, 세포 증식의 조정, 세포 이동의 조정, 세포 분화의 조정(예로 조혈, 신경발생, 근육발생, 골발생, 및 지방형성), 아폽토시스 또는 다른 형태의 세포사 조정, 혈관신생의 조정, 세포 결합의 조정, 세포 대사의 조정, 시토카인 생산 또는 활성의 조정, 시토카인 수용체 활성의 조정, 세포 흡수 또는 분비의 조정, 면역조정, 염증의 조정, 대사 공정의 조정, 예컨대 글루코오스 조절 등을 포함한다.

보통 표적 분자, 예컨대 AARS의 내인성 단편, 또는 AARS 폴리펩티드의 세포 결합 파트너의 발현 감소에 관련되며, 다른 방식으로는 그 비-정규적 활성에 기여하는 폴리뉴클레오티드-기반 요법, 예컨대 안티센스 요법 및 RNAi 간섭 요법이 포함된다. 안티센스 또는 RNAi 요법은 보통 예컨대 AARS 참조 폴리펩티드의 발현을 감소시켜 비-정규적 활성을 길항시킨다. 또한 예컨대 AARS 폴리펩티드, 그 세포 결합 파트너(들) 또는 둘 다와의 직접적 상호반응에 의해 AARS 참조 폴리펩티드의 비-정규적 활성을 작동시키거나 길항시키는 폴리펩티드 또는 펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편, 펩티드 모사체, 또는 다른 소분자-기반 요법이 포함된다.

이들 및 관련 구현예는 세포, 조직 또는 대상체의 치료를 위한 본 발명의 AARS 제제 또는 조성물의 사용 방법을 포함한다. 본 발명에 의해 치료받거나 조정될 수 있는 세포 또는 조직은 바람직하게는 포유류 세포 또는 조직이거나, 보다 바람직하게는 인간 세포 또는 조직이다. 이러한 세포 또는 조직은 건강한 상태이거나 병이 있는 상태일 수 있다.

특정 구현예에서, 세포와 본원에 기재된 바와 같은 AARS 제제 또는 조성물을 접촉시키는 것을 포함하여, 예를 들어 세포 대사, 세포 분화, 세포 증식, 세포 흡수, 세포 분비, 세포사, 세포 가동화, 세포 이동, 유전자 전사, mRNA 번역, 세포 임피던스, 면역 반응, 염증 반응 등을 비제한적으로 포함하는 치료적으로 관련된 세포 활성을 조정하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 세포는 대상체 내에 있다. 따라서 AARS 조성물은 하나 이상의 이러한 활성 조정으로 이득을 얻을 임의의 세포 또는 조직 또는 대상체를 본질적으로 치료하는데 채용될 수 있다.

AARS 제제 및 조성물은 또한, 예를 들어 신생물 질환, 면역계 질환 또는 상태(예로, 자가면역 질환 및 염증), 감염성 질환, 대사성 질환, 뉴론/신경학적 질환, 근육/심혈관계 질환, 비정상적 조혈에 연관된 질환, 비정상적 근육발생에 연관된 질환, 비정상적 신경발생에 연관된 질환, 비정상적 지방형성에 연관된 질환, 비정상적 골발생에 연관된 질환, 비정상적 혈관신생에 연관된 질환, 비정상적 세포 생존에 연관된 질환, 비정상적 지질 흡수에 연관된 질환, 노화에 연관된 질환(예로 청력 손실, 말초 또는 자율 신경병증, 노인성 치매, 망막병증) 등의 치료 또는 예방에 관련된 것들을 포함하여 임의의 여러 치료적 맥락에서 사용될 수 있다.

예를 들어 특정 예시적 구현예에서, 본 발명의 AARS 조성물은, 예로 내피 세포 증식 및/또는 신호전달의 조정을 통해 혈관신생을 조정하는데 이용될 수 있다. 내피 세포 증식 및/또는 신호전달은 적절한 세포주(예로 인간 미세혈관 내피 폐 세포(HMVEC-L) 및 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC))를 이용하여, 그리고 적절한 분석(예로, 내피 세포 이동 분석, 내피 세포 증식 분석, 튜브-형성 분석, 매트리겔 플러그 분석 등)을 이용하여 모니터링될 수 있으며, 이중 다수는 공지되어 있고 당분야에서 이용 가능하다.

따라서 관련 구현예에서, 본 발명의 조성물은 혈관신생의 조정에서 이득을 얻을 임의의 세포 또는 조직 또는 대상체를 본질적으로 치료하는데 채용될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 혈관신생(예로, 혈관신생 상태)을 겪고 있거나 감수성인 세포 또는 조직 또는 대상체는 혈관신생 상태를 저해하기 위해 본 발명의 적합한 조성물과 접촉될 수 있다. 예시적인 혈관신생 상태는 노화 관련 황반 퇴화(AMD), 암, 발달 비정상성(기관발생), 당뇨병성 실명, 자궁내막증, 안구 신생혈관증식, 건선, 류마티스성 관절염 및 피부 변색(예로 혈관종, 불꽃모반 또는 단순모반)을 포함한다. 다른 구현예에서, 불충분한 혈관신생(예로, 혈관정지 상태)를 겪고 있거나 감수성인 세포 또는 조직은 혈관정지 활성을 방해하고/하거나 혈관신생을 촉진하기 위해 본 발명의 적절한 조성물과 접촉될 수 있다. 예시적인 혈관정지 상태는 심혈관계 질환, 재협착, 허혈성 조직 또는 심장 부전의 재관류 후 조직 손상, 만성 염증, 상처 치유 및 당뇨병성 궤양의 치료를 포함한다.

또한 조혈 및 관련 상태의 조정 방법이 포함된다. 본 발명의 AARS 폴리펩티드로 조정될 수 있는 조혈 공정의 예는 골수성 세포(예로 적혈구 세포, 비만 세포, 단핵구/대식구, 골수성 수지상 세포, 과립구, 예컨대 호염기구, 호중구, 및 호산구, 거핵구, 혈소판) 및 림프구 세포(예로, 천연 킬러 세포, 림프구 수지상 세포, B-세포, 및 T-세포)의 형성을 비제한적으로 포함한다. 특정 조혈 공정은 적혈구 생성, 과립구 생성, 림프구 생성, 거핵구 생성, 혈소판 생성 등을 포함한다. 또한 조혈 줄기 세포, 전구체 세포, 백혈구, 과립구, 림프구, 거핵구, 및 거대혈소판을 포함하는 조혈 세포의 이동 또는 가동화의 조정 방법이 포함된다.

조혈 조정 방법은 생체 내, 시험관 내, 생체 외 또는 이들의 임의 조합으로 실시될 수 있다. 이들 방법은 조혈 계통으로 분화할 수 있는(예로, 지방 조직 유래 줄기 세포) 조혈 줄기 세포, 조혈 전구체 세포, 또는 다른 줄기 또는 전구체 세포를 함유하는 임의의 생물학적 표본, 세포 배양물, 또는 조직 상에서 실시될 수 있다. 시험관 내 및 생체 외 방법을 위해, 조혈 기원인지 또는 다른 기원인지 여부와 무관하게 줄기 세포 및 전구체 세포는 본원에서 기재되고 당분야에 공지된 기법 및 특징에 따라 단리되고/되거나 동정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 직접 또는 간접으로 자가면역 및/또는 염증 질환, 상태 및 장애를 매개하는 세포를 조정함으로써 반- 또는 친-염증 적응증을 치료하기 위한 면역조정제로서 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 면역조정제 또는 염증 조정제로서의 유용성은, 예를 들어 이동 분석(예로 백혈구 또는 림프구 이용) 또는 세포 생활성 분석(예로 B-세포, T-세포, 단핵구 또는 NK 세포 이용)을 포함하여, 당분야에서 임의의 여러 공지되고 이용 가능한 기법을 이용하여 모니터링될 수 있다.

"염증"이란 일반적으로 해로운 자극, 예컨대 병원체, 손상된 세포(예로, 상처), 및 자극제에 대한 조직의 생물학적 반응을 나타낸다. "염증 반응"이라는 용어는 단순히 예로서, 다른 것들 중에서 본원에서 기재되고 당분야에 공지된 면역 세포 활성화 또는 이동, 시토카인 생산, 키닌 방출, 섬유소 용해, 및 응고를 포함하는 혈관확장을 포함하여 염증이 획득되고 조절되는 특정 기전을 나타낸다.

만성 염증의 임상적 징후는 질병 기간, 염증 병소, 원인 및 영향받는 해부학적 부위에 의존한다(예로 [Kumar 등, Robbins Basic Pathology-8^th Ed., 2009 Elsevier, London; Miller, LM, Pathology Lecture Notes, Atl항c Veterinary College, Charlottetown, PEI, Canada] 참고). 만성 염증은 본원에서 기재되고 당분야에 공지된 다른 것들 중에서, 예를 들어 알러지, 알츠하이머 질환, 빈혈, 동맥 판막 협착, 관절염, 예컨대 류마티스성 관절염 및 골관절염, 암, 울혈성 심부전, 섬유근육통, 섬유화, 심장 발작, 신장 부전, 루푸스, 췌장염, 뇌졸중, 수술 합병증, 염증성 폐 질환, 염증성 장 질환, 아테롬성경화, 신경학적 장애, 당뇨병, 대사적 장애, 비만 및 건선을 포함하는 다양한 병리학적 상태 또는 질환에 연관된다. 따라서, AARS 조성물은 만성 염증의 치료 또는 관리, 임의의 하나 이상의 개별 만성 염증 반응의 조정, 또는 만성 염증에 연관된 임의의 하나 이상의 질환 또는 상태의 치료에 이용될 수 있다.

감별 진단 수행 및 또한 예로 허용되는 임상 요건에 따른 개선을 결정함으로써 치료 모니터링, 예컨대 치료 유효 용량이 치료 과정에서 투여되었는지 여부를 결정하기 위한 목적을 포함하는, 염증 및 다른 상태의 징후 및 증상의 평가 요건은 당분야의 숙련자에게 자명할 것이며, 예로 [Berkow 등, eds., The Merck Manual, 16^th edition, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Goodman 등, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10^th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (2001); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD. (1987); Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, (1985); Osolci al., eds., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990); Katzung, Basic and Clinical Pharmacology, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992)]의 교시에 의해 예시된다.

다른 구현예에서, 본 발명의 AARS 조성물은 세포 증식 및/또는 생존을 조정하기 위해, 그리고 이에 따라 세포 증식 및/또는 생존의 비정상성을 특징으로 하는 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 특정 구현예에서, AARS 조성물은 아폽토시스의 조정 및/또는 비정상 아폽토시스에 연관된 질환 또는 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다. 아폽토시스는, 예를 들어 DNA의 단편화, 막 비대칭성의 변형, 아폽토시스성 카스파아제의 활성화 및/또는 시토크롬 C 및 AIF의 방출을 측정하는 분석을 포함하는, 당분야에서 임의 수의 이용 가능한 공지 기법에 의해 모니터링될 수 있다.

이들 및 다른 요법(예로, 생체 외 요법)의 진행은 의사 또는 당분야의 숙련자에게 공지된 요건에 근거하여 그리고 종래 방법 및 분석에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.

XIII. 약학적 제형물, 투여 및 키트

본 발명의 구현예는 AARS 폴리뉴클레오타이드, AARS 폴리펩타이드, AARS 폴리펩타이드를 발현시키는 숙주세포, 결합제, 조절 제제, 또는 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 치료 양상과 조합하여, 세포 또는 동물에의 투여를 위해 약제학적으로 허용가능한 또는 생리학적으로 허용가능한 용액에서 제형된 본 명세서에 기재된 다른 화합물을 포함한다. 필요하다면, 본 발명의 조성물은 다른 제제, 예컨대, 예를 들면, 다른 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다양한 약제학적 활성 제제와 또한 조합하여 투여될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다. 조성물 내에 또한 포함될 수 있는 다른 성분에 대한 제한은 사실상 없고, 단, 부가 제제는 달성될 조절 또는 원하는 다른 효과에 역효과를 주지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물에서, 약제학적으로 허용가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은 예를 들면, 경구, 비경구, 정맥내, 비강내, 피하, 및 근육내 투여 및 제형을 포함하는 다양한 치료 계획에서 본 명세서에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적당한 복용 및 치료 계회의 개발에서와 같이, 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있다.

어떤 적용에서, 본 발명의 약제학적 또는 치료 조성물은 면역 반응을 자극하지 않는다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 AARS 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 전형적으로 포함하는 본 발명의 약제학적 또는 치료 조성물은 백신 또는 관련 조성물에서 보조제로서 쓰이거나 별개의 보조제 또는 제제와 함께 조성물에서 존재하는 바와 같이 면역 반응을 자극한다.

어떤 구현예에서, AARS 제제 예컨대 AARS 폴리펩타이드, AARS 폴리뉴클레오타이드, 및 항체는 특정 투여 방식, 예컨대 정맥내 투여에 대해 바람직한 용해도를 갖는다. 바람직한 용해도의 예는 적어도 약 1 mg/ml, 적어도 약 10 mg/ml, 적어도 약 25 mg/ml, 및 적어도 약 50 mg/ml를 포함한다.

어떤 적용에서, 본 명세서에서 개시된 약제학적 조성물은 경구 투여를 통해 대상체에 전달될 수 있다. 그것으로서, 이들 조성물은 불활성 희석제 또는 with an 흡수할 수 있는 식용 담체와 함께 제형될 수 있고, 또는 경질- 또는 연질-쉘 젤라틴 캡슐 내에 포함될 수 있고, 또는 정제로 압축될 수 있고, 또는 다이어트의 음식과 함께 직접 혼입될 수 있다.

어떤 상황에서, 예를 들면 하기에 기재된 바와 같이 본 명세서에서 개시된 약제학적 조성물을 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 뇌실질내, 수조내, 뇌실내, 전립선관내, 흉골내, 두개내, 활막내, 또는 심지어 복강내로 전달하는 것이 바람직할 것이다: 미국 특허 번호　5,543,158; 미국 특허 번호　5,641,515 및 미국 특허 번호　5,399,363 (이들 각각은 구체적으로 그 전체가 참조로 통합되어 있다). 비경구 투여에 대한 적합한 디바이스는 니들 (마이크로니들 포함) 주입기, 니들 없는 주입기, 및 주입 기술이다.

자유 염기 또는 약리학적으로 허용 가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액은 적합하게는 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로오스와 혼합되어 수중에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일 중에 제조될 수 있다. 일반 저장 및 사용 조건 하에, 이들 제조물은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.

주사 가능한 용도에 적합한 약학적 형태는 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 체외 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(U.S. 특허 번호　5,466,468, 본원에 그 전문이 구체적으로 참조로 도입됨). 모든 경우에 있어서, 형태는 멸균되어야 하며, 용이한 주사 가능성이 존재하는 범위로 유체여야 한다. 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하며, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예로, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아 및 항진균 제제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 촉진될 수 있다. 여러 경우에서, 등장성 제제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물 중 흡수를 지연하는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 일어날 수 있다.

수용액 중 비경구 투여를 위해, 예를 들어 용액은 필요한 경우 적합하게는 완충되어야 하며, 액체 희석제가 먼저 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장화된다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여를 위해 특히 적합하다. 이와 관련해서, 채용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시의 견지에서 당분야의 숙련자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량은 1ml의 등장성 NaCl 용액 중에 용해되고, 1000ml의 피하주입 유체로 첨가되거나 제시되는 주입 부위로 주사될 수 있다(예로 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 및 1570-1580] 참고). 일부 투여량 변화가 치료받은 대상체의 상태에 따라 필요할 것이다. 투여 담당자는 모든 경우에 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 또한 인간 투여를 위해, 제조물은 FDA 사무국의 생물학적 제제 표준이 요구하는 바와 같은 멸균성, 발열성, 및 일반 안전성 및 순도 표준에 부합해야 한다.

멸균 주사 가능한 용액은 필요에 따라 상기 예시된 다양한 다른 요소와 함께 적절한 용매 중 필요량의 활성 화합물을 도입한 후 여과 멸균하여 제조될 수 있다. 일반적으로 분산액은 기본 분산액 매질 및 상기 예시된 것들 중 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 소포 내로 다양한 멸균 활성 성분을 도입하여 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말+이들의 이전 멸균 여과 용액으로부터의 임의의 부가적 목적 성분을 제공하는 진공-건조 및 동결-건조 기법이다.

본원에서 개시되는 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산 부가 염(단백질의 자유 아미노기로 형성됨)을 포함하며, 이는 무기 산, 예컨대 염화수소산, 또는 인산, 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등으로 형성된다. 자유 카르복실기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 철 수산화물, 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등에서 유도될 수 있다. 제형화 시, 용액은 치료적으로 유효한 양으로, 그리고 투여 제형과 상용성인 방식으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여 형태, 예컨대 주사 가능한 용액, 약물-방출 캡슐 등으로 쉽게 투여된다.

본원에서 사용되는 "담체"는 임의의 모든 용매, 분산액 매질, 운반체, 코팅, 희석제, 항박테리아 및 항진균 제제, 등장성 및 흡수 지연 제제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 성분과 비상용성인 정도를 제외하고, 치료적 조성물 중에서의 그 사용이 포함된다. 보충 활성 성분이 또한 조성물 내로 도입될 수 있다.

"약학적으로-허용 가능한"이라는 어구는 인간에게 투여되는 경우 알러지성 또는 유사한 원치 않는 반응을 일으키지 않는 분자 대상체 및 조성물을 나타낸다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당분야에서 잘 이해된다. 보통 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 주사 가능하게 제조된다; 주입 전 액체에서 용액 중 또는 현탁액 중 용액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 제조물은 또한 유화될 수 있다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물은 비강내 스프레이, 흡인, 및/또는 다른 에어로졸 전달 운반체에 의해 전달될 수 있다. 비강 에어로졸 스프레이를 통해 폐로 직접 유전자, 폴리뉴클레오티드, 및 펩티드 조성물을 전달하기 위한 방법은, 예로 U.S. 특허 번호　5,756,353 및 U.S. 특허 번호　5,804,212에 기재되어 있다(각각은 특히 본원에서 그 전문이 참조로 도입됨). 마찬가지로 비강내 마이크로입자 수지를 이용한 약물 전달(Takenaga 등, 1998) 및 라이소포스파티딜-글리세롤 화합물(U.S. 특허 번호　5,725,871, 특히 본원에서 그 전문이 참조로 도입됨)도 약학 분야에서 널리-공지되어 있다. 마찬가지로 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 기질 형태의 점막통과 약물 전달은 U.S. 특허 번호　5,780,045에 기재되어 있다(특히 본원에서 그 전문이 참조로 도입됨).

약학적 조성물은 즉시 및/또는 연장 방출되도록 제형화될 수 있다. 연장 방출 조성물은 연장된, 개질된, 펄스화된, 조절된, 표적화된, 그리고 프로그램화된 방출을 포함한다. 따라서 조성물은 AARS 폴리뉴클레오티드, AARS 폴리펩티드, 결합 제제, 조정 제제 및 다른 활성 제제의 연장 방출을 제공하는 이식된 디팟으로서 투여하기 위한 현탁액으로 또는 고체, 반고체, 또는 틱소트로픽 액체로 제형화될 수 있다. 이러한 제형의 예는 약물-로딩 폴리(DL-락틱-코-글리콜)산(PGLA), 폴리(DL-락티드-코-글리콜리드)(PLG) 또는 폴리(락티드)(PLA) 층상 소포 또는 마이크로입자, 히드로겔(Hoffman AS: Ann. N.Y. Acad. Sci. 944: 62-73 (2001))을 포함하는 반고체 및 현탁액 및 약물-코팅 스텐트, Flamel Technologies Inc.에서 개발하고 상표명 MEDUSA® 하에 판매되는 폴리-아미노산 나노입자 시스템, Atrix, Inc.에서 개발하고 상표명 ATRIGEL® 하에 판매되는 비-수성 겔 시스템 및 Durect Corporation에서 개발하고 상표명 SABER® 하에 판매되는 수크로오스 아세테이트 이소부티레이트 연장 방출 제형, 및 SkyePharma에서 개발하고 상표명 DEPOFOAM® 하에 판매되는 지질-기반 시스템을 비제한적으로 포함한다.

연장된 시기 동안 목적 용량의 약학적 조성물을 전달할 수 있는 연장 방출 장치는 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, US 특허 번호 5,034,229; 5,557,318; 5,110,596; 5,728,396; 5,985,305; 6,113,938; 6,156,331; 6,375,978; 및 6,395,292는 연장된 시기에 걸쳐(즉, 1주 초과에서부터 1년 또는 그 초과 범위의 기간에 걸쳐) 목적 속도로 활성 제제 제형물, 예컨대 용액 또는 현탁액을 전달할 수 있는 삼투압 구배 장치를 교시한다. 다른 예시적인 연장 방출 장치는 유익한 제제 제형물의 일정한 흐름, 조절 가능한 흐름, 또는 프로그래밍 가능한 흐름을 제공하는 조절기 유형 펌프를 포함하며, 이는 상표명 SYNCHROMED INFUSION SYSTEM® 하에 판매되는 경막 내 펌프를 포함하여 Medtronic에서, 상표명 CODMAN® 분할 펌프 및 INSET® 기술 펌프 하에 판매되는 Johnson and Johnson systems에서 이용 가능하다. 또한 장치의 예는 US 특허 번호 6,283,949; 5,976,109; 5,836,935; 및 5,511,355에 기재되어 있다.

특정 구현예에서, 전달은 적합한 숙주 세포 내로 본 발명의 조성물의 도입을 위한 리포좀, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로스피어, 지질 입자, 소포 등의 사용으로 일어날 수 있다. 특히 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노스피어, 나노입자 등에 캡슐화된 전달을 위해 제형화될 수 있다. 제형 및 이러한 전달 운반체의 사용은 공지된 및 종래 기법을 이용하여 수행될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 제제는 생체적합성 및 생분해성 기질, 예컨대 중합체 및 기질을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 고형 기재에 부착될 수 있다. 이러한 고형 기재의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(U.S. 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 폴리(락틱-코-글리콜 산)(PLGA) 및 LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사 가능한 마이크로스피어), 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산, 콜라겐, 금속, 히드록시아파타이트, 바이오유리, 알루미네이트, 바이오세라믹 재료, 및 정제된 단백질을 비제한적으로 포함한다.

하나의 특정 구현예에서, 고형 기질은 상표명 ATRIGEL™(QLT, Inc., Vancouver, B.C.) 하에 판매되는 생분해성 중합체를 포함한다. ATRIGEL® 약물 전달 시스템은 생체적합성 담체 중에 용해된 생분해성 중합체로 구성된다. 약학제는 제조 시에 상기 액체 전달 시스템 내로 배합될 수 있거나, 또는 제품에 따라 사용 시 의사에 의해 이후에 첨가될 수 있다. 액체 제품이 작은 게이지의 바늘을 통해 피하 공간 내로 주사되거나 캐뉼라를 통해 접근 가능한 조직 부위 내로 배치되는 경우, 조직 유체 중 물이 중합체를 침전시키고 고체 이식물 중에 약물을 트랩핑한다. 이어서 이식물 내에 캡슐화된 약물은 중합체 기질이 경시적으로 분해됨에 따라 조절되는 방식으로 방출된다.

본 발명에 사용하기 위한 약학적 조성물은 또한 피부 또는 점막으로 국소, 피(내), 또는 경피 투여될 수 있다. 상기 목적을 위한 전형적인 제형은 겔, 히드로겔, 로션, 용액, 크림, 연고, 분진 분말, 드레싱, 발포제, 필름, 피부 패치, 웨이퍼, 이식물, 스폰지, 섬유, 밴드, 및 마이크로에멀션을 포함한다. 리포좀도 이용될 수 있다. 전형적인 담체는 알코올, 물, 미네랄 오일, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 및 프로필렌 글리콜을 포함한다. 침투 증강제가 도입될 수 있다--예로 [Finnin and Morgan: J. Pharm. Sci. 88(10): 955-958, (1999)] 참고. 다른 국소 투여 수단은 전기천공, 이온영동법, 음성영동법, 초음파영동법, 및 예를 들어 상표명 POWDERJECT™ 및 BIOJECT™ 하에 판매되는 시스템을 이용하는 마이크로바늘 또는 무바늘 주사에 의한 전달을 포함한다.

제형화 방법은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 20th edition, ISBN: 0683306472 (2000)]에 개시되어 있다. 본원에서 제공되는 조성물 및 제제는 임의의 치료 유효 용량 요법으로 본 발명의 방법에 따라 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 유해 효과 없이 제제의 유효 수준을 생성하도록 선택된다. 본 발명의 화합물의 유효량은 투여 경로, 치료받는 온혈 동물의 유형, 및 고려 중인 특정 온혈 동물의 신체적 특징에 의존할 것이다. 상기 양을 결정하기 위한 이들 인자 및 이들의 상관관계는 의학 분야의 숙련된 시술자들에게 널리 공지되어 있다. 상기 양 및 투여 방법은 최적 유효성을 달성하도록 맞춤화될 수 있지만, 체중, 식이, 병용 약제 및 의학 분야 전문가가 인지할 다른 인자와 같은 인자에 의존할 것이다.

특정 구현예에서, 투여되는 조성물 또는 제제의 양은 경구 또는 정맥내 투여되는 경우 약 0.1 내지 약 100mg/kg/일, 보통 약 0.1 내지 10mg/kg의 투여량 범위일 것이다. 특정 구현예에서, 투여량은 5mg/kg 또는 7.5mg/kg이다. 다양한 구현예에서, 투여량은 약 50-2500mg/일, 100-2500mg/일, 300-1800mg/일, 또는 500-1800mg/일이다. 하나의 구현예에서, 투여량은 약 100 내지 600mg/일이다. 다른 구현예에서, 투여량은 약 300 내지 1200mg/일이다. 특정 구현예에서, 조성물 또는 제제는 하나 이상의 용량/일(즉 조합된 용량으로 목적 1일 투여량을 달성하는 경우)로 100mg/일, 240mg/일 300mg/일, 600mg/일, 1000mg/일, 1200mg/일, 또는 1800mg/일의 투여량으로 투여된다. 관련 구현예에서, 투여량은 100mg 1일 2회, 150mg 1일 2회, 240mg 1일 2회, 300mg 1일 2회, 500mg 1일 2회, 또는 600mg 1일 2회이다. 다양한 구현예에서, 조성물 또는 제제는 단일 또는 반복 투여로 투여된다. 초기 투여량 및 후속 투여량은 동일하거나 상이할 수 있다.

특정 구현예에서, 조성물 또는 제제는 0.1 내지 10mg/kg 또는 0.5 내지 5mg/kg의 단일 투여량으로 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물 또는 제제는 0.1 내지 50mg/kg/일, 0.5 내지 20mg/kg/일, 또는 5 내지 20mg/kg/일의 투여량으로 투여된다.

특정 구현예에서, 조성물 또는 제제는 예로 약 10분 내지 90분의 시기에 걸쳐, 예로 주입에 의해 경구 또는 정맥내 투여된다. 다른 관련 구현예에서, 조성물 또는 제제는 일정 시기에 걸쳐, 예로 약 0.1 내지 약 10mg/kg/hr의 투여량으로 연속적 주입에 의해 투여된다. 시기는 변할 수 있지만, 특정 구현예에서 시기는 약 10분 내지 약 24시간, 또는 약 10분 내지 약 3일일 수 있다.

특정 구현예에서, 유효량 또는 치료적 유효량은 대상체의 혈액 혈장 중 조성물 또는 제제의 전체 농도가 약 0.1㎍/ml 내지 약 20㎍/ml 또는 약 0.3㎍/ml 내지 약 20㎍/ml의 C_max를 달성하기 충분한 양이다. 특정 구현예에서, 경구 투여량은 약 0.1㎍/ml 내지 약 5㎍/ml 또는 약 0.3㎍/ml 내지 약 3㎍/ml의 혈액 혈장 농도(C_max)를 달성하기 충분한 양이다. 특정 구현예에서, 정맥내 투여량은 약 1㎍/ml 내지 약 10㎍/ml 또는 약 2㎍/ml 내지 약 6㎍/ml의 혈액 혈장 농도(C_max)를 달성하기 충분한 양이다. 관련 구현예에서, 대상체의 혈액 혈장 중 제제의 전체 농도는 약 20㎍/ml 미만의 평균 최저 농도 및/또는 약 20㎍/ml 미만의 일정 상태 농도를 갖는다. 추가 구현예에서, 대상체의 혈액 혈장 중 제제의 전체 농도는 약 10㎍/ml 미만의 평균 최저 농도 및/또는 약 10㎍/ml 미만의 일정 상태 농도를 갖는다.

다른 구현예에서, 대상체의 혈액 혈장 중 제제의 전체 농도는 약 1ng/ml 내지 약 10㎍/ml의 평균 최저 농도 및/또는 약 1ng/ml 내지 약 10㎍/ml의 일정 상태 농도를 갖는다. 하나의 구현예에서, 대상체의 혈액 혈장 중 제제의 전체 농도는 약 0.3㎍/ml 내지 약 3㎍/ml의 평균 최저 농도 및/또는 약 0.3㎍/ml 내지 약 3㎍/ml의 일정 상태 농도를 갖는다.

특정 구현예에서, 조성물 또는 제제는 포유류에서 약 1ng/ml 내지 약 10㎍/ml의 평균 최저 농도 및/또는 약 1ng/ml 내지 약 10㎍/ml의 일정 상태 농도를 갖는 혈액 혈장 농도를 달성하기 충분한 양으로 투여된다. 관련 구현예에서, 포유류의 혈액 혈장 중 제제의 전체 농도는 약 0.3㎍/ml 내지 약 3㎍/ml의 평균 최저 농도 및/또는 약 0.3㎍/ml 내지 약 3㎍/ml의 일정 상태 농도를 갖는다.

본 발명의 특정 구현예에서, 조성물 또는 제제의 유효량, 또는 조성물 또는 제제의 혈액 혈장 농도는, 예로 적어도 15분, 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 60분, 적어도 90분, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 8시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 1달, 적어도 2달, 적어도 4달, 적어도 6달, 적어도 1년, 적어도 2년 또는 2년 초과 동안 달성되거나 유지된다.

특정 폴리펩티드-기반 구현예에서, 투여되는 폴리펩티드의 양은 보통 약 0.1㎍/환자 체중kg 내지 약 0.1mg/환자 체중kg 내지 약 50mg/환자 체중kg 범위일 것이다. 질환 유형 및 중증도에 따라, 폴리펩티드의 약 0.1㎍/체중kg 내지 약 0.1mg/체중kg 내지 약 50mg/체중kg(예로, 약 0.1-15mg/kg/용량)이, 예를 들어 하나 이상의 별도 투여, 또는 연속적 주입에 의한 것인지 여부와 무관하게 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 예를 들어, 투여 요법은 약 4mg/kg의 초기 로딩 용량 투여에 뒤따르는 약 2mg/kg의 폴리펩티드, 또는 약 절반의 로딩 용량인 주당 유지 용량을 포함할 수 있다. 그러나 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 0.1㎍/kg 내지 약 1㎍/kg 내지 100mg/kg 또는 그 초과 범위일 수 있다. 수일 또는 그 초과에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라 목적하는 질환 증상의 억제가 일어날 때까지 치료가 유지된다.

특정 구현예에서, 유효 투여량은 본원에서 기재된 조성물 또는 제제의 혈액 혈장 수준 또는 평균 최저 농도를 달성한다. 이들은 일상적 절차를 이용하여 쉽게 결정될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명의 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체, 다단위 복합체, 이들의 조성물 등으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 이러한 조성물의 사용 방법에 대한(예로 세포 신호전달, 혈관신생, 암, 염증 상태, 진단 등을 조정하기 위한) 서면 지침을 포함할 수 있다.

본원에서 키트는 또한 치료받는 적응증을 위해 또는 목적하는 진단적 용도를 위해 적합하거나 필요한 하나 이상의 부가적 치료적 제제 또는 다른 성분을 포함할 수 있다. 부가적 치료 제제는 필요한 경우, 제 2 용기에 함유될 수 있다. 부가적 치료 제제의 예는 항-신생물 제제, 항-염증 제제, 항박테리아 제제, 항바이러스 제제, 혈관신생 제제 등을 비제한적으로 포함한다.

본원에서 키트는 또한 목적하는 전달 방식(예로 스텐트, 이식 가능한 디팟 등)을 촉진하기 위해 요구되거나 필요한 하나 이상의 시린지 또는 다른 성분을 포함할 수 있다.

본 명세서에 언급되는 모든 공보, 특허 출원 및 허여된 특허는 각각의 개별 공보, 특허 출원, 또는 허여된 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 도입됨을 나타내는 것과 마찬가지로 본원에 참조로서 도입된다.

상기 발명이 명확한 이해의 목적으로의 예로서 그리고 예시로서 일부 상세히 설명되었으나, 당업자에게는 본 발명의 교시의 견지에서 특정 변화 및 개질이 첨부된 특허청구범위의 요지 또는 범위에서 벗어나지 않고 수행될 수 있다는 것이 매우 자명할 것이다. 하기 실시예는 단지 예로서 비제한적으로 제공된다. 당분야의 숙련자는 다양한 미결정적 파라미터들이 변경 또는 개질되어 본질적으로 유사한 결과를 낼 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다.

도 1은 도식적으로 나타낸 동정된 N-말단 AARS 폴리펩티드의 상대적 위치 및 크기와 함께 나타낸 아스파르틸 아미노아실 tRNA 합성효소의 도메인 구조를 나타낸다. 도 1a는 질량 분광측정 분석에서 동정된 단편을 나타내며, 도 1b는 트랜스크립톰의 심층 서열분석에서 동정된 단편을 나타내고, 도 1c는 바이오인포마틱스 분석에서 동정된 단편을 나타낸다.
도 2는 도식적으로 나타낸 동정된 C-말단 AARS 폴리펩티드의 상대적 위치 및 크기와 함께 나타낸 아스파르틸 아미노아실 tRNA 합성효소의 도메인 구조를 나타낸다. 도 2a는 질량 분광측정 분석에서 동정된 단편을 나타내며, 도 2b는 바이오인포마틱스 분석에서 동정된 단편을 나타낸다.
도 3은 도식적으로 나타낸 동정된 내부 AARS 폴리펩티드의 상대적 위치 및 크기와 함께 나타낸 아스파르틸 아미노아실 tRNA 합성효소의 도메인 구조를 나타낸다. 도 3a는 질량 분광측정 분석에서 동정된 단편을 나타내며, 도 3b는 바이오인포마틱스 분석에서 동정된 단편을 나타낸다.

XIII. 실시예

일반적 방법 아래 실시예에서 다른 방식으로 나타내지 않는 한, 유전자 최적화, 작은 및 큰 스케일의 단백질 발현, 단백질 정제, 전사 감정 및 스크리닝을 위한 하기 일반적 방법을 아래 실시예에 기재된 AARS 폴리펩티드의 제조 및 특징분석에 이용하였다.

유전자 합성 및 발현 벡터 내로의 클로닝

AARS 폴리펩티드의 에피토프 태그화된 버전을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 아래에 열거된 방법을 이용하여 코돈 최적화되고, 박테리아 발현 벡터 내로 클로닝되었다.

방법 (1)에서, 각각의 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 대장균 코돈-최적화된 DNA(Welch 등, PLoS ONE 4(9): e7007 doi:10.1371/journal.pone.0007002)가 DNA 2.0(Menlo Park, CA)에 의해 합성되며, 6 히스티딘 태그 및 V5 에피토프 태그를 모두 포함하는 N-말단 또는 C-말단 조합 에피토프 태그를 함유하는 각각의 AARS 폴리펩티드의 2 버전이 합성된다.

N-말단이 태그화된 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA는 예측되는 AARS 폴리펩티드 개방 해독틀에 틀을 맞춰 융합된 5'에서 3'으로의 배향, 리보솜 결합 부위(rbs(아래에 밑줄침)), NdeI 제한 부위, 6 히스티딘 태그, 및 V5 에피토프 태그, (AGGAGGTAAAACATATGCATCATCATCATCATCACGGTAAGCCTATCCCTAACCCTTTGCTCGGTCTCGATTCTACG) (서열 목록 번호 1)를 인코딩하는 5' 연장부를 가지고 합성된다. AARS 폴리펩티드가 예측되는 천연 개시 메티오닌(ATG) 잔기를 포함하는 경우, 또는 예측되는 AARS 폴리펩티드의 제 1 아미노산 잔기가 Met인 경우 이를 결실시켰다. 예측되는 AARS 폴리펩티드 개방 해독틀의 말단에, 두 정지 코돈 및 XhoI 부위(TAATGACTCGAG)(서열 목록 번호 2)를 추가한다.

C-말단이 태그화된 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA는 예측되는 AARS 폴리펩티드 개방 해독틀(AGGAGATAAAACATATG)(서열 목록 번호 3)에 틀을 맞춰 AARS 폴리펩티드에 대해 예측되는 천연 시작 코돈을 재현하거나 ATG를 삽입하는 NdeI 제한 부위 및 rbs(아래에 밑줄침)를 인코딩하는 5' 연장부를 갖도록 합성된다. 상이한 구현예에서, 리보솜 결합 부위는 서열 "AGGAGGTAAAACAT"(서열 목록 번호 4), "AGGAGATAAAACAT"(서열 목록 번호 5), 또는 GAAGGAGATATACAT(서열 목록 번호 6)을 포함할 수 있다. 예측되는 AARS 폴리펩티드 개방 해독틀의 3' 말단에, 예측되는 AARS 폴리펩티드 개방 해독틀에 틀을 맞춰 융합된 5'에서 3'으로의 V5 에피토프 태그, 6 히스티딘 태그, 2 정지 코돈 및 XhoI 부위(GGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCACCACCATCATCACCATTAATGACTCGAG)(서열 목록 번호 7)를 인코딩하는 3' 연장부가 합성된다. AARS 폴리펩티드가 예측되는 천연 정지 코돈을 포함하는 경우, 이는 결실되었다.

AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 합성된 DNA 서열은 pJExpress411 벡터(DNA 2.0) 내로 서브클로닝된다. 정확한 산물 합성을 확인하기 위한 서열분석 후, 발현 벡터는 아래에 보다 상세히 기재되는 바와 같이 단백질 발현을 위한 박테리아 내로 형질전환된다.

방법 (2)에서, 각각의 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 대장균 코돈-최적화된 DNA(Ermolaeva MD (2001) Curr. Iss. Mol. Biol. 3 (4) 91-7)은 GENEWIZ(South Plainfield, NJ)에서 합성된다. AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드 서열은 후속 클로닝을 위한 독특한 제한 부위를 포함하는 짧은 5' 및 3' 연장부를 갖도록 합성되었다.

구체적으로 BamHI 제한 부위가 예측되는 개방 해독틀의 5' 말단에 삽입되었다. AARS 폴리펩티드가 예측되는 천연 개시 메티오닌 잔기(ATG)를 포함하거나, 또는 예측되는 AARS 폴리펩티드의 제 1 아미노산 잔기가 Met인 경우, 이는 결실되었다. 부가적으로 XhoI 제한 부위는 예측되는 개방 해독틀의 3' 말단에 삽입되었다. AARS 폴리펩티드가 예측되는 천연 정지 코돈을 포함하는 경우, 이는 결실되었다.

제한 소화 후, 생성 DNA 서열은 6 히스티딘 및 V5 에피토프 태그를 모두 포함하는 N-말단(pET24b_N-6XHis/V5), 또는 C-말단 (pET24b_C-V5/6XHis) 조합된 에피토프 태그를 함유하는 개질된 pET-24b 벡터(EMD, Gibbstown, NJ) 내로 서브클로닝되었다(GENEWIZ(South Plainfield, NJ)에 의한 벡터 개질).

제한 소화, 및 클로닝 후, N-태그화된 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA는 NdeI 제한 부위 내에 포함된 개시 코돈(ATG)과 틀에 맞는 6 히스티딘 및 V5 에피토프 태그 (CATATGCATCATCATCATCATCACGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGGGATCC)(서열 목록 번호 8)을 인코딩하는 5' DNA 서열을 포함하는 N-태그화된 벡터(pET24b_N-6XHis/V5) 내로 클로닝된다. 상기 5' 연장부는 짧은 2 아미노산 링커(GS)를 통해 예측되는 AARS 폴리펩티드 개방 해독틀에 융합된다.

예측되는 개방 해독틀의 3' 말단에, N-태그화된 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA는 2 아미노산 연장(LE)에 뒤따르는 2 정지 코돈을 인코딩하는 DNA 서열(CTCGAGTAATGA)(서열 목록 번호 9)을 포함한다.

제한 소화 및 클로닝 후, C-태그화된 벡터(pET24b_C-V5/6XHis) 내로 클로닝된 C-태그화된 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA는 짧은 2 아미노산 링커(GS)를 통해 예측되는 AARS 폴리펩티드 개방 해독틀에 융합된 NdeI 제한 부위 내에 포함된 개시 코돈(ATG)을 인코딩하는 5' 서열(CATATGGGATCC)(서열 목록 번호 10)을 포함한다.

예측되는 개방 해독틀의 3' 말단에서, C-태그화된 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA는 짧은 링커 2 아미노산 링커(LE), 뒤따르는 V5 에피토프 태그, 이어지는 6 히스티딘, 및 2 정지 코돈을 인코딩하는 3' DNA 서열 CTCGAGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCT CGATTCTACGCACCACCACCACCACCACTAATGA(서열 목록 번호 11)을 포함한다.

AARS 폴리펩티드 발현, 정제 및 생물리적 특징분석

6xHis-태그화된 AARS 폴리펩티드는 필요한 단백질량에 따라 중간 처리량 포맷 및/또는 더 큰 스케일의 플라스크 배양으로 박테리아에서 발현된다. AARS 폴리펩티드는 아래에 기재된 바와 같고 특정 실험에 대해 지정된 바와 같은 친화도 및 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제된다.

박테리아 배양 : 각각의 AARS 폴리펩티드(상술된 바와 같은)를 인코딩하는 코돈 최적화된 DNA를 포함하는 발현 벡터 100ng을 42℃에서 30초 간 PCR 플레이트에서 BL21(DE3)(EMD Chemicals, cat. no. 69450) 적격 대장균 박테리아 내로 형질전환한다. C41(DE3)(Lucigen, cat. no. 60442), HMS174(DE3)(EMD chemicals, cat. no. 69453) 및 Origami2(DE3)(EMD chemicals, cat. no. 71345) 균주도 평가되었다. 플레이트를 2분간 얼음 위에 놓고, SOC 배지 100㎕를 첨가한 후 37℃에서 1-시간 인큐베이션한다. 카나마이신(100㎍/mL)이 보강된 자가 유도 배지(EMD chemicals, cat. no. 71491) 5mL을 24-웰 블록(Qiagen, cat. no. 19583)의 각각의 웰에 첨가한다. 형질전환 반응물을 개별 웰에 첨가하고, 블록을 접착 필름(VWR, cat. no. 60941-078)으로 밀봉하고 밤새 250rpm으로 37℃ 진탕기에서 인큐베이션한다. 저온(25℃) 조건을 이용하는 경우, 대신 48시간 동안 인큐베이션을 수행한다.

더 큰 스케일의 발현을 위해, 카나마이신(100㎍/mL)이 보강된 자가 유도 배지 200mL을 벤트 캡이 있는 500-mL 에를렌마이어 플라스크(Corning, cat. no. 431401) 내로 첨가한다. 형질전환 반응물을 개별 플라스크로 첨가하고, 30시간 동안 250rpm에서 37℃ 진탕기 중에 인큐베이션한다. 1L 스케일을 위해, TB 배지(BD Biosciences, cat. no. 243820)를 자가 유도 배지 대신 사용하고, 배양물이 0.6-1 OD₆₀₀에 도달할 때 4-시간 유도(0.5mM IPTG)를 개시한다.

단백질 단리: 배양물이 정지상(전형적인 OD₆₀₀ 3-6)에 도달한 후, 블록을 3600xg에서 10분 동안 원심분리한다. 배지를 조심스럽게 흡인하고 블록을 -80℃ 또는 -20℃에서 10분 동안 냉동한다. 이어서 블록을 실온에서 해동하고 용해 완충액(200㎕ 라이소나아제(EMD chemicals, cat. no. 71370) 및 프로테아제 저해제 "완전 미니 무-EDTA"(Roche, cat. no. 11 836 170 001)이 보강된 100mL Bugbuster) 1mL을 각각의 웰 내로 첨가한다. 펠렛을 덩어리가 보이지 않을 때까지 반복 피펫팅에 의해 재현탁하고 에펜도르프 튜브로 옮긴 후 실온에서 진탕기 상에서 10-20분 인큐베이션한다. 4℃에서 16,000g로 10분 동안 원심분리 후, 용해액을 Ni-NTA Superflow 96 BioRobot 키트(Qiagen, cat. no. 969261)에 포함된 TurboFilter 96 플레이트 상에 로딩하고 500g에서 5-10분 동안 원심분리한다.

더 큰 스케일의 발현을 위해, 정지상 배양을 500-mL 병 내로 옮기고 6,000g에서 10분 동안 원심분리한다. 배지를 따라내고 펠렛을 추가 처리 전에 -80℃ 또는 -20℃에서 보관한다. 이어서 펠렛을 실온에서 해동하고 용해 완충액 20mL을 각 병 내로 첨가한다. 펠렛을 덩어리가 보이지 않을 때까지 반복 피펫팅에 의해 재현탁한 후, 실온에서 진탕기 상에서 20분 인큐베이션한다. 4℃에서 10,000g로 30분 동안 원심분리 후, 용해액을 깨끗한 튜브 또는 병으로 옮긴다. 미량의 파편이 전달 동안 운반되는 경우, 표본을 다시 원심분리하거나 추가 청정화를 위해 0.45㎛ 셀룰로오스 아세테이트 막(Corning, cat. no. 430314)을 통해 통과시킨다. 1L 스케일을 위해, 14,000 psi에서의 마이크로유체화(Microfluidics, cat. no. 110L)를 용해 완충액 대신 이용한다.

친화도 정제: QIAFilter 96 플레이트에 Ni-NTA Superflow 96 BioRobot 키트에 포함된 200㎕ Ni-NTA Superflow 슬러리를 로딩하고, 수지에 600㎕ 결합 완충액(20mM 인산나트륨, 500mM 염화나트륨 및 10mM 이미다졸, pH 7.5)을 첨가하여 평형화한다. 모든 완충액이 수지를 통해 통과할 때까지 -15in.Hg의 진공을 적용한다. 이어서 이전 단계에서 청정화된 세포 용해액을 QIAFilter® 96 플레이트 상에 로딩하고 5분 동안 결합시킨다. 모든 표본이 수지를 통해 통과할 때까지 대략 5분 동안 -3in.Hg의 진공을 적용한다. 이어서 수지를 1mL 결합 완충액으로 세척한 후, 0.1% Triton X-100을 함유하는 1mL 결합 완충액으로 2회 세척한다. 그리고 수지를 Triton X-100이 없는 1mL 결합 완충액으로 10회 세척한다. 결합된 6xHis-태그화된 AARS 폴리펩티드를 450㎕ 용출 완충액(20mM 인산나트륨, 500mM 염화나트륨 및 500mM 이미다졸, pH 7.5)으로 용출하고, 4℃에 보관한다.

더 큰 스케일의 발현을 위해, 빈 일회용 컬럼 "Poly-Prep"(Bio-Rad, cat. no. 731-1550)에 1mL Ni-NTA Superflow 슬러리(Qiagen, cat. no. 30450)를 로딩하고 0.5mL 수지에 5mL 결합 완충액을 첨가하여 평형화한다. 이어서 이전 단계에서 청정화된 세포 용해액을 컬럼 상에 로딩하고 중력에 의해 통과시킨다. 수지를 먼저 50mL 결합 완충액+0.1% Triton X-100으로 세척한 후 Triton X-100이 없는 50mL 결합 완충액으로 세척한다. 결합된 6xHis-태그화된 AARS 폴리펩티드를 2mL 용출 완충액으로 용출하고 4℃에 보관한다.

탈염 및 연마 단계: 분자량 >10kDa인 AARS 폴리펩티드에 있어서, AcroPrep 96 필터 플레이트(Pall, cat. no. 5034)의 Omega 10K 막을 20㎕ 1X PBS로 헹구고, 모든 액체가 통과해나갈 때까지 플레이트를 진공 매니폴드 상에 놓는다(>10in.Hg). 이전 단계(Ni-NTA)로부터의 용출액을 각각의 웰 내로 분배하고 모든 액체가 통과해나갈 때까지 진공을 적용한다. 전체 용출액 부피(450㎕)가 처리될 때까지 이들 단계를 반복한다. 각각의 웰에 180㎕ 1X PBS(pH 7.4)를 첨가하고 조심스럽게 10회 위 아래로 피펫팅한 후 깨끗한 블록으로 옮겨서 AARS 폴리펩티드를 회수한다. 상기 단계를 반복하여 웰 당 전체 부피 360㎕을 산출하고, 블록을 4℃에 보관한다. 분자량 <10kDa인 AARS 폴리펩티드에 있어서, Ni-NTA로부터의 용출액을 Ultracel-3 막을 갖는 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 단위(Millipore, cat. no. UFC900308) 상에 로딩한 후 10mL 1X PBS를 첨가하고 부피가 360㎕ 미만이 될 때까지 3,600g에서 10-30분 동안 원심분리한다. 표본을 회수하고 1X PBS을 최종 부피 360㎕가 되도록 첨가한다.

내독소를 제거하기 위해, Mustang Q 막을 갖는 AcroPrep Advance 필터 플레이트(Pall, cat. no. 8171)를 300㎕ 1X PBS로 헹구고 1,000g에서 5분 동안 원심분리하여 완충액을 제거한다. 탈염된 AARS 폴리펩티드(360㎕/웰)를 필터 플레이트로 첨가하고 진탕기 상에서 5-10분 동안 인큐베이션한다. 이어서 플레이트를 1,000g에서 5-10분 동안 원심분리하고, AARS 폴리펩티드를 함유하는 흘러나가는 분획을 수집하여 4℃에 보관한다.

더 큰 스케일의 발현을 위해, Ni-NTA로부터의 용출액을 AARS 폴리펩티드의 분자량에 따라 Ultracel-3 또는 Ultracel-10 막(Millipore, cat. no. UFC900308 또는 UFC901008)을 갖는 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 단위 상에 로딩한 후, 부피가 250㎕로 감소될 때까지 3,600g에서 10-30분 동안 원심분리한다. 표본을 10mL 1X PBS(pH7.4) 중에 혼합하고, 부피가 약 250㎕로 될 때까지 3,600g에서 10-30분 동안 원심분리한다. 상기 단계를 한번 더 반복하여 상청액을 회수하고 1X PBS를 최종 부피 1.5mL이 되도록 첨가한다. 1L 스케일을 위해, Ni-NTA 용출액을 여과를 이용하는 대신 1X PBS에 대해 밤새 투석한다.

내독소를 제거하기 위해, Sartobind Q5 강력 음이온 교환기 막(Sartorius, cat. no. Q5F)을 1mL 1X PBS로 플러싱하고, AARS 폴리펩티드를 플라스틱 시린지를 이용하여 천천히 막을 통해 통과시킨다. AARS 폴리펩티드를 함유하는 흘러나가는 분획을 밀봉된 96-딥 웰 블록으로 수집하고, 4℃에 보관한다.

박테리아에서 발현되고 봉입체에서 발견되는 6xHis-태그화된 AARS 폴리펩티드를 아래에 기재되는 바와 같이 친화도 크로마토그래피 및 일련의 재폴딩 단계를 이용하여 정제한다.

박테리아 배양: 각각의 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 100ng 플라스미드를 42℃에서 30초 간 PCR 플레이트에서 BL21(DE3)(EMD Chemicals, cat. no. 69450) 또는 C41(DE3)(Lucigen, cat. no. 60442) 적격 대장균 박테리아 내로 형질전환한다. 플레이트를 2분간 얼음 위에 놓고, SOC 배지 100㎕를 첨가한 후 37℃에서 1-시간 인큐베이션한다. 카나마이신(100㎍/mL)이 보강된 자가 유도 배지(EMD chemicals, cat. no. 71491) 5mL을 24-웰 블록(Qiagen, cat. no. 19583)의 각각의 웰에 첨가한다. 형질전환 반응물을 개별 웰에 첨가하고, 블록을 접착 필름(VWR, cat. no. 60941-078)으로 밀봉하고 밤새 250rpm으로 37℃ 진탕기에서 인큐베이션한다.

더 큰 스케일의 발현을 위해, 카나마이신(100㎍/mL)이 보강된 자가 유도 배지 200mL을 벤트 캡이 있는 500-mL 에를렌마이어 플라스크(Corning, cat. no. 431401) 내로 첨가한다. 형질전환 반응물을 개별 플라스크로 첨가하고, 30시간 동안 250rpm에서 37℃ 진탕기 중에 인큐베이션한다. 1L 스케일을 위해, TB 배지(BD Biosciences, cat. no. 243820)를 자가 유도 배지 대신 사용하고, 배양물이 0.6-1의 OD₆₀₀에 도달할 때 4-시간 유도(0.5mM IPTG)를 개시한다.

단리: 배양물이 정지상(전형적인 OD₆₀₀ 3-6)에 도달한 후, 블록을 3600xg에서 10분 동안 원심분리한다. 배지를 조심스럽게 흡인하고 블록을 -80℃ 또는 -20℃에서 10분 동안 냉동한다. 이어서 블록을 실온에서 해동하고 용해 완충액(200㎕ 라이소나아제(EMD chemicals, cat. no. 71370) 및 프로테아제 저해제 "완전 미니 무-EDTA"(Roche, cat. no. 11 836 170 001)가 보강된 100mL Bugbuster) 1mL을 각각의 웰 내로 첨가한다. 펠렛을 덩어리가 보이지 않을 때까지 반복 피펫팅에 의해 재현탁하고 에펜도르프 튜브로 옮긴 후 실온에서 진탕기 상에서 10-20분 인큐베이션한다. 4℃에서 16,000×g로 10분 동안 원심분리 후, 가용성 용해액을 버리고 봉입체를 변성 결합 완충액(20mM 인산나트륨, 500mM 염화나트륨, 6M 구아니딘 히드로클로라이드, 10mM 이미다졸, pH 7.5) 중에 철저히 재현탁한다. 표본을 16,000g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 Ni-NTA Superflow 96 BioRobot 키트에 포함된 TurboFilter 96 플레이트(Qiagen, cat. no. 969261) 상에 로딩한 후 500g로 5-10분 동안 원심분리한다. 여액을 깨끗한 96-웰 블록(Greiner, cat. no. 780286)에 수집한다.

더 큰 스케일의 발현을 위해, 정지상 배양물을 500-mL 병 내로 옮기고 6,000g에서 10분 동안 원심분리한다. 배지를 따라내고 펠렛을 추가 처리 전에 -80℃ 또는 -20℃에서 보관한다. 이어서 펠렛을 실온에서 해동하고 용해 완충액 20mL을 각 병 내로 첨가한다. 펠렛을 덩어리가 보이지 않을 때까지 반복 피펫팅에 의해 재현탁한 후, 실온에서 진탕기 상에서 20분 인큐베이션한다. 4℃에서 10,000g로 30분 동안 원심분리 후, 가용성 용해액을 버리고 불용성 봉입체를 변성 결합 완충액 중에 철저히 재현탁한다. 1L 스케일을 위해, 14,000psi에서의 마이크로유체화(Microfluidics, cat. no. 110L)를 용해 완충액 대신 이용한다. 봉입체의 재현탁 후, 10,000g에서 30분 동안의 원심분리 단계를 추가한 후 0.45㎛ PES 막(VWR, ca. no. 87006)을 통해 여과한다.

친화도 정제: QIAFilter 96 플레이트에 Ni-NTA Superflow 96 BioRobot 키트에 포함된 200㎕ Ni-NTA Superflow 슬러리를 로딩하고, 수지에 600㎕ 변성 결합 완충액(상기 참고)을 첨가하여 평형화한다. 모든 완충액이 수지를 통해 통과할 때까지 -15in.Hg의 진공을 적용한다. 이어서 이전 단계에서 청정화된 변성된 표본을 QIAFilter® 96 플레이트 상에 로딩하고 5분 동안 결합시킨다. 모든 표본이 수지를 통해 통과할 때까지 대략 3in.Hg의 진공을 대략 5분 동안 적용한다. 이어서 수지를 1mL 변성 결합 완충액으로 세척한 후, 0.1% Triton X-100을 함유하는 1mL 변성 결합 완충액으로 5회 세척한다. 그리고 수지를 Triton X-100 없는 1mL 변성 결합 완충액으로 15회 세척한다. 결합된 6xHis-태그화된 AARS 폴리펩티드를 450㎕ 변성 용출 완충액(20mM 인산나트륨, 500mM 염화나트륨, 6M 구아니딘 히드로클로라이드 및 500mM 이미다졸, pH 7.5)으로 용출하고, 4℃에 보관한다.

더 큰 스케일의 발현을 위해, 빈 일회용 컬럼 "Poly-Prep"(Bio-Rad, cat. no. 731-1550)에 1mL Ni-NTA Superflow 슬러리(Qiagen, cat. no. 30450)를 로딩하고 0.5mL 수지에 5mL 변성 결합 완충액(상기 참고)을 첨가하여 평형화한다. 이어서 이전 단계에서 변성된 봉입체를 컬럼 상에 로딩하고 중력에 의해 통과시킨다. 수지를 먼저 50mL 변성 결합 완충액+0.1% Triton X-100으로 세척한 후 Triton X-100이 없는 50mL 변성 결합 완충액으로 세척한다. 결합된 6xHis-태그화된 AARS 폴리펩티드를 2mL 변성 용출 완충액으로 용출하고 4℃에 보관한다.

재폴딩: >10kDa인 AARS 폴리펩티드에 있어서, AcroPrep 96 필터 플레이트의 Omega 10K 막(Pall, cat. no. 5034)을 20㎕ 1X PBS로 헹구고, 모든 액체가 통과해나갈 때까지 플레이트를 진공 매니폴드 상에 놓는다(>10 in.Hg). 이전 단계(Ni-NTA)로부터의 용출액을 각각의 웰 내로 분배하고 모든 액체가 통과해나갈 때까지 진공을 적용한다. 전체 용출액 부피(450㎕)가 처리될 때까지 이들 단계를 반복한다. 각각의 웰에 50mM Tris, 250mM 염화나트륨, 10mM 염화칼륨, 2mM 염화마그네슘, 2mM 염화칼슘, 400mM 수크로오스, 500mM 아르기닌, 1mM DTT 및 0.01% 폴리소르베이트 80(pH 7.4)을 함유하는 200㎕ 재폴딩 완충액을 첨가하고 조심스럽게 10회 위 아래로 피펫팅한 후 깨끗한 블록으로 옮겨서 AARS 폴리펩티드를 회수한다. 상기 단계를 반복하여 웰 당 전체 부피 400㎕을 산출하고, 블록을 4℃에서 밤새 진탕기 상에 둔다. <10 kDa인 AARS 폴리펩티드에 있어서, Ni-NTA로부터의 용출액을 Ultracel-3 막을 갖는 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 단위(Millipore, cat. no. UFC900308) 상에 로딩한 후 10mL 재폴딩 완충액을 첨가하고 부피가 400㎕ 미만이 될 때까지 3,600g에서 10-30분 동안 원심분리한다. 표본을 회수하고 추가 재폴딩 완충액을 최종 부피 400㎕가 되도록 첨가한다. 표본을 96-웰 블록으로 옮기고, 필름으로 밀봉하고, 4℃에서 밤새 진탕기 상에 둔다.

더 큰 스케일의 발현을 위해, Ni-NTA로부터의 용출액을 Ultracel-3 또는 Ultracel-10 막(Millipore, AARS 폴리펩티드의 분자량에 따라 cat. no. UFC900308 또는 UFC901008)을 갖는 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 단위 상에 로딩한 후, 부피가 약 500㎕로 감소될 때까지 3,600g에서 10-30분 동안 원심분리한다. pI>7인 AARS 폴리펩티드에 대해서는 표본을 하기 완충액 중에 20배 희석한다: 50mM 아세트산나트륨, 10mM 염화나트륨, 0.4mM 염화칼륨, 1mM EDTA, 400mM 수크로오스, 500mM 아르기닌, 1mM DTT 및 0.01% 폴리소르베이트 80(pH 6.0). pI<7인 AARS 폴리펩티드에 대해서는 표본을 하기 완충액 중에 20배 희석한다: 50mM Tris, 250mM 염화나트륨, 10mM 염화칼륨, 2mM 염화마그네슘, 2mM 염화칼슘, 400mM 수크로오스, 500mM 아르기닌, 1mM DTT 및 0.01% 폴리소르베이트 80(pH 8.0). 표본을 4℃에서 밤새 진탕기 상에서 인큐베이션한다.

탈염 및 연마 단계: 밤새 인큐베이션 후, 96-웰 블록을 3,600g에서 원심분리하여 임의의 잠재적 응집물을 제거한다. 이어서 상청액을 1XPBS(Invitrogen, cat. no. 10010)로 완충액 교환한다. >10 kDa인 AARS 폴리펩티드에 있어서, AcroPrep 96 필터 플레이트의 Omega 10K 막을 20㎕ 1X PBS로 헹구고, 모든 액체가 통과해나갈 때까지 플레이트를 진공 매니폴드 상에 놓는다(>10in.Hg). 재폴딩 완충액 중의 표본을 각각의 웰 내로 분배하고 모든 액체가 통과해나갈 때까지 진공을 적용한다. 전체 표본 부피(400㎕)가 처리될 때까지 이들 단계를 반복한다. 각각의 웰에 180㎕ 1X PBS(pH 7.4)를 첨가하고 조심스럽게 10회 위 아래로 피펫팅한 후 깨끗한 블록으로 옮겨서 AARS 폴리펩티드를 회수한다. 상기 단계를 반복하여 웰 당 전체 부피 360㎕을 산출하고, 블록을 4℃에 보관한다. <10kDa인 AARS 폴리펩티드에 있어서, 재폴딩된 표본을 Ultracel-3 막을 갖는 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 단위(Millipore, cat. no. UFC900308) 상에 로딩한 후 10mL 1X PBS를 첨가하고 부피가 360㎕ 미만이 될 때까지 3,600g에서 10-30분 동안 원심분리한다. 표본을 회수하고 1X PBS을 최종 부피 360㎕가 되도록 첨가한다.

내독소를 제거하기 위해, Mustang Q 막을 갖는 AcroPrep Advance 필터 플레이트(Pall, cat. no. 8171)를 300㎕ 1X PBS로 헹구고 1,000g에서 5분 동안 원심분리하여 완충액을 제거한다. AARS 폴리펩티드(360㎕/웰)를 필터 플레이트로 첨가하고 진탕기 상에서 5-10분 동안 인큐베이션한다. 이어서 플레이트를 1,000g에서 5-10분 동안 원심분리하고, AARS 폴리펩티드를 함유하는 흘러나가는 분획을 수집하여 4℃에 보관한다.

더 큰 스케일의 발현을 위해, 밤새 인큐베이션 후 재폴딩된 표본을 10,000g에서 10분 동안 원심분리하여 임의의 불용성 응집물을 제거한다. 상청액을 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 단위 상에 로딩한 후, 부피가 250㎕로 감소될 때까지 3,600g에서 원심분리한다. 표본을 10mL 1X PBS 중에 혼합하고, 부피가 약 250㎕로 될 때까지 3,600g에서 10-30분 동안 원심분리한다. 1XPBS의 pH는 pH 6.0 또는 pH 8.0인 재폴딩 완충액의 pH에 매치되도록 조정됨을 주지한다. 상기 단계를 한번 더 반복하여 상청액을 회수하고 1X PBS를 최종 부피 1.5mL이 되도록 첨가한다. 1L 스케일을 위해, 재폴딩된 표본을 여과를 이용하는 대신 1X PBS에 대해 밤새 투석한다.

내독소를 제거하기 위해, Sartobind Q5 강력 음이온 교환기 막(Sartorius, cat. no. Q5F)을 1mL 1X PBS로 플러싱하고, AARS 폴리펩티드를 플라스틱 시린지를 이용하여 천천히 막을 통해 통과시킨다. AARS 폴리펩티드를 함유하는 흘러나가는 분획을 밀봉된 96-딥 웰 블록으로 수집하고, 4℃에 보관한다.

생물리적 특징분석: 모든 정제된 AARS 폴리펩티드를 SDS-PAGE로 분석하고, 이들의 농도를 A₂₈₀ 및 계산된 흡광 계수(ExPASy 서버 상의 ProtParam)에 근거해 결정하였다. 내독소 수준은 제조자의 지시에 따라 QCL-1000 종점 색소 LAL 분석(Lonza, cat. no. 50-648U)에 의해 측정한다.

동적 광 산란: Wyatt Technology DynaPro 99 기구 및 온도 조절기(20℃)를 실험 15분 전에 가온한 뒤 기구에 Dynamics 소프트웨어를 연결한다. 다중 획득을 위한 획득 시간을 10초로 설정하고, 레이저 파워는 100%로 설정한다. 석영 큐벳을 단백질 표본(PBS 중 대략 1mg/mL 농도 15㎕)의 부가 전에 탈이온수 및 메탄올로 철저히 세척한다. 프로스트된 쪽이 왼쪽으로 가도록 홀더 내로 삽입하기 전에 큐벳을 탭핑하여 공기 방울을 제거한다. 강도가 너무 높은 경우(화면에 경고 메시지가 나타남), 강도가 정상 범위로 감소될 때까지 표본을 PBS로 추가 희석한다. 수집한 데이터는 수력학적 반경, 다분산성, 예측되는 평균 분자량, 강도 백분율 및 질량 백분율을 포함한다.

크기 배제 크로마토그래피 : 단백질 표본을 Generic Electric AKTA FPLC 상 100㎕ 표본 루프 내로 로딩하기 전에 PBS 중에 약 5-10mg/mL의 농도로 희석한다. 분리를 위해 Superdex 200 10/300 GL 크기 배제 컬럼(Generic Electric, cat. no. 17-5175-01)을 이용한다. 컬럼을 먼저 1XPBS 완충액 1.5 컬럼 부피(CV)로 평형화한 후 표본을 주입한다. 컬럼을 280nm에서의 흡광도를 모니터링하면서 1xPBS 완충액(등용매류) 1CV로 주행한다. 피크 면적을 적분하고, 백분율을 Unicorn 소프트웨어로 계산하였다. 용출 부피를 이용하여 겔 여과 적정 키트(Generic Electric, cat. no. 28-4038-41 및 28-4038-42)와의 비교에 근거하여 분자량을 추정한다.

고농도 저장 시 단백질 회수 : Amicon Ultra-15 필터 단위(Millipore, 분자량에 따라 cat. no. UFC901024 또는 UFC900324)를 이용하여 ≥10mg/mL로 농축된 AARS 폴리펩티드 10㎕을 깨끗한 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 표본을 1주 동안 실온에서 보관한 후 16,000g에서 10분 동안 원심분리하여 임의 침전물을 펠렛화한다. 상청액 농도를 브래드포드 단백질 분석으로 결정하고, 실온으로의 주 단위 노출 전에 측정한 농도와 비교한다. 회수는 시작 농도의 백분율로 표시된다.

LC-MS에 의한 AARS 폴리펩티드의 특징분석: 정제된 AARS 폴리펩티드(1mg/mL)를 0.1% 포름산 내로 1:10으로 희석하고, 0.6㎍ 단백질을 C4 모세관 컬럼 상에 Dionex 오토샘플러로 로딩한다. 모세관 컬럼은 용융 실리카 튜브(0.36mM OD, 0.1mm ID, Polymicro Technologies, cat. no. 2000023) 150mm를 절단하여 제조한다. 모세관을 Suter Instrument Laser Fiber Puller로 한쪽 말단을 당기고, 용융 실리카 커터로 절단하여 5㎛ 팁을 생성한다. 모세관을 압력 봄베를 이용해서 C4 수지(5㎛, 300Å Michrom, cat. no. PM5/64300/00)로 75mm 길이로 충전한다. Dionex Ultimate3000 HPLC 시스템에 커플링된 ThermoFisher LTQ 이온 트랩 질량 분광측정기 상에서 LC-MS 분석을 수행한다. 분석물을 0.9㎕/분의 유속으로 0.1% 포름산 중 5-70% 아세토니트릴의 35분 구배를 이용해서 컬럼에서 용출한다. LTQ를 스프레이 전압 2.5kV와 함께 전체 MS 스캔 방식(300-2,000m/z)으로 작동시킨다.

데이터 집합 및 분석: 질량 분광측정 원데이터를 LTQ XL 질량 분광측정기에서 수행하는 XCalibur에 의해 생성되는 RAW 파일에 저장한다. 크로마토그래피의 주요 피크의 MS 스펙트럼을 ThermoFisher 디컨볼루션 알고리즘 ProMass로 추가 분석하여 AARS 폴리펩티드 분자량을 수득한다.

AARS 폴리펩티드의 기능적 분석

전사 감정

배경 및 치료적 상관성: 전통적 표적 동정 기법에 추가하여, 게놈 도구는 최근 AARS 폴리펩티드 작용 기전의 규명을 보조하는 중요한 접근법으로 나타나고 있으며, 약물 발견 공정에서 조기에 치료적 상관성에 대한 직접적 통찰을 제공할 수 있다. 잠재적 치료 유용성의 이해를 촉진하기 위해, 일차 인간 세포 유형을 AARS 폴리펩티드와 배양하고, AARS 폴리펩티드와의 인큐베이션 후 두 별도 시점에 전사 감정을 평가한다.

전사 감정을 위해 선택된 세포 유형은 AARS 폴리펩티드의 직접적 치료 가치를 동정하기 위한 관심 세포의 다능 역량 및 잠재력에 근거한다. 예를 들어, 중간엽 줄기 세포(MSC)는 특정 자극에 노출되는 경우, 골발생, 지방형성, 연골발생, 심근 또는 신경 계통으로 분화할 수 있어서, 이들을 광범위한 세포 유형 및 질환에 대한 AARS 폴리펩티드의 잠재적 상관성 이해에 매력적으로 만든다.

조혈 세포의 지지에 부가하여, 골수 간질 세포는 또한 상이한 연결 조직 계통, 예컨대 뼈, 연골, 및 지방으로 분화하도록 유도될 수 있다. 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)가 다중역량을 유지하고 시험관내에서 광범위하게 증식할 수 있는 잠재력은 손상되거나 병이 있는 조직의 회복에서 세포-기반 요법을 위한 새로운 수단을 제공한다. 최근 보고는 또한 HMSC가 배엽층 경계를 넘어서는 세포 운명을 가질 수 있음을 시사한다. 다계통의 중배엽으로의 분화에 부가하여, 이들 세포는 또한 외배엽 기원의 뉴론 및 내배엽 기원의 간세포 유사 세포로 분화할 수 있다. 분화 절차 동안, 이들 세포는 특정 계통에 특이적인 전사체의 발현 패턴을 개질할 수 있다.

따라서 특정 AARS 폴리펩티드가 시간 의존적 방식으로 HMSC 중 유전자의 특정 패턴을 조정하는 능력은 이들 단백질이 광범위한 분화 경로에서 잠재적으로 중요한 역할뿐만 아니라 이들 절차 또는 대응 세포 유형의 기능부전, 또는 열화로 일어나는 질환 및 장애에 작용한다는 것을 나타낸다. 또한 MSC 중 유전자 전사를 조정하는 능력을 갖는 AARS 폴리펩티드는 조혈, 신경발생, 근육발생, 골발생, 및 지방형성뿐만 아니라 예를 들어 염증 반응, 자가면역성, 암, 신경 퇴화, 근육 위축, 골다공증, 및 지방이상증을 포함하는 광범위한 장애 및 질환의 시험관 내 또는 생체 내 조정을 가능케 하는 중요한 치료적 유용성을 갖는다.

인간 골격근 세포(HSkMC)는 액틴 및 미오신 미오필라멘트를 나타내는 분화를 거칠 수 있고, 유전적 근육 질환, 예컨대 악성 고열1의 연구에 이용되었다. HSkMC는 또한 심장에 대한 손상을 수리하는 심장 이식물로 작용하는 잠재력을 가지고 있다. 최근 배양된 인간 골격근 세포는 인간 골격근에 대한 낮은 중력 환경의 효과를 연구하기 위한 마이크로 중력 실험에 이용되었다.

따라서 특정 AARS 폴리펩티드가 시간 의존적 방식으로 HSkMC에서 유전자의 특정 패턴을 조정하는 능력은 이들 단백질이 근육발생 절차에서 잠재적으로 중요한 역할뿐만 아니라 이들 절차와 더불어 근육 세포 발달 또는 대사의 기능부전, 또는 열화로 일어나는 질환 및 장애에 작용한다는 것을 나타낸다. 따라서 근육 세포에서 유전자 전사를 조정하는 능력을 갖는 AARS 폴리펩티드는, 예를 들어 대사적 질환, 악액질, 다양한 근육 소모 상태뿐만 아니라 근골격 질환의 치료를 포함하여, 광범위한 질환에서 치료적 유용성을 갖는다.

방법: AARS 폴리펩티드의 유전자 발현 조정 능력은 인간 골수 간질 세포(HMSC) 및 인간 골격근 세포(HSkMC)에서 고처리량 마이크로유체 실시간 정량 PCR(RT-qPCR) 접근법(Fluidigm Corporation)을 이용하여 평가한다([Petriv 등, (2010) PNAS (doi/10.1073/pnas.1009320107] 참고). 여기에 보고된 실험에서, 인간 HSkMC(Cat # 150-05f) 및 HMSC(Cat # 492-05f)는 Cell Applications에서 구매하였다. HMSC 세포를 제 2계대에서 동결보존하고, 10 모집단 더블링까지 배양 및 증식시킬 수 있다. 여기서는 제 6 계대의 HMSC를 사용한다. 인간 골격근 세포(HSkMC)를 제 2계대에서 동결보존하고, 적어도 15 모집단 더블링까지 배양 및 증식시킬 수 있다. 　여기 보고된 실험에서는 정상 인간 공여자로부터의 수확 후 제 6 계대의 HSkMC를 사용한다.

두 경우 모두, 세포를 100㎕ 부피의 성장 배지 중에 50000세포/mL로 접종하고, 24시간 및 72시간 동안 250nM 농도의 AARS 폴리펩티드에 또는 아래 나타낸 다른 농도로 노출시킨다. 대조군은 (1) 지방형성, (2) 골발생, (3) 연골발생 및 (4) 골격근 근튜브 형성을 촉진하기 위한 표준 칵테일을 포함하는 분화 배지를 포함한다.　 부가적 대조군은 성장 배지만을 함유하는 미처리 웰을 포함한다. 두 웰을 각각의 분화 대조군에 대해 실험하였다. 대조군: 모든 배지는 DMEM을 기본 배지로 이용하여 제조하였다. 표준 문헌을 따랐으며, Cell Applications에서 분화 배지를 구매하였다. 공급자 별로, 분화 배지는 하기 첨가제를 함유하였다: 골격근 분화 칵테일: FBS, 인슐린, 글루타민, FGF, EGF; 지방형성 칵테일: 인슐린, 덱타메타손 및 IBMX; 골발생 칵테일: FBS, 덱타메타손, 아스코르베이트 2 포스페이트, 베타-글리세로포스페이트; 연골발생 칵테일: 인슐린, 아스코르베이트-2-포스페이트, 및 TGF-β1.

ABI(Applied Biosystems, Item # AM1728) TAQMAN® 유전자 발현 Cells-to-CT™ 키트 사용을 위한 표준 프로토콜을 이용하여 세포를 용해하고 게놈 재료를 수확한다.　 ABI Pre-Amp Mix(Applied Biosystems, Item# 4391128)를 이용하여 사전-증폭을 개시한다.　 Primer 3 프로그램을 이용하여 유전자 특이적 프라이머를 생성하고 IDT technologies에서 구매한다. 표준 Fluidigm 로딩 시약 및 피펫팅 장치를 이용한 실제 정량적 PCR을 위해 Fluidigm 감정 어레이(Item # BMK-M-96.96)를 이용하였다. 하기 표 E1에 감정된 유전자를 기재한다.

바이오인포마틱스 분석: Fluidigm에 의해 Bioma 기계에서.csv 포맷으로 받은 데이터를 원래 형광값과 함께 표본, mRNA, 및 복제 정보를 포함하는 테이블 포맷으로 변환한다. 실패한 PCR 반응은 누락으로 표시한다. 전체 발현 mRNA종에 대한 표준화 후 여러 실험을 조합하였다. 모든 측정 mRNA 발현을 평가된 모든 생물학적 복제본에서 적어도 2회 검출 요건에 근거하여 필터링한다. 전체 데이터 세트의 기술적, 생물학적 및 세트 일탈 평균을 평가하였다.

데이터 분석을 위해 모든 관심 유전자의 Ct값을 먼저 대응 표본의 살림 유전자의 평균화된 Ct 값으로 표준화하여 ΔCt 값(ΔCt = Ct_유전자-Ct_{살림 유전자 평균})을 수득한다. 이어서 각 표본의 유전자를 미처리 대조군에서의 동일 유전자에 대해 표준화하여 ΔΔCt 값(ΔΔCt =ΔCt대조군 표본-ΔCt처리 표본)을 수득한다.

변화 배율값을 수득하기 위해, 상향 조절된 유전자(즉 ΔΔ Ct가 0 초과)로 다음을 계산한다: 변화 배율 = 2^ΔΔCt. 하향 조절된 유전자(즉 ΔΔCt가 0 미만)에 대해서는: 변화 배율 = -(2^|ΔΔCt|).

세포 증식 분석(아래 데이터 표에서의 분석 A1-A11)

배경 및 치료적 상관성: 상이한 세포 유형의 세포 증식 및 아폽토시스 비율을 조정하는 능력은 여러 치료적 화합물의 기본 특성을 나타내며, 광범위한 질환 및 장애의 치료 및 예방에 직접적 상관성을 갖는다.

따라서 세포 증식 및/또는 아폽토시스 비율을 조정하는 능력을 갖는 AARS 폴리펩티드는 암을 포함하는 광범위한 질환에서, 줄기 세포에 대한 성장 인자 및 분화 인자와 같이, 그리고 생체 내 또는 시험관 내 특정 관심 세포 유형, 예를 들어 조혈 세포, 면역조정 세포의 증식을 증강 또는 억제하기 위한 치료 요법에서, 그리고 예를 들어 신경 퇴화, 말초 신경병증 및 근육 및 연조직 긴장도 소실을 포함하는 노화와 연관된 질환의 치료 및 예방을 위해 중요한 치료적 유용성을 갖는다.

방법: 세포 증식에 대한 AARS 폴리펩티드의 효과를 아래에 열거된 하나 이상의 방법을 이용하여, 그리고 아래 방법에 보다 구체적으로 설명된 바와 같이 평가한다.

Hoechst 33432. 증식을 평가하기 위한 표준 세포 계수를 dsDNA에 결합되는 경우 청색 형광을 방출하는 세포 투과성 핵 대조염색인 Hoechst 33432를 이용해 수행한다. 이는 배지 또는 PBS 중 1ug/mL의 최종 농도로 사용되는 용액(Invitrogen Cat # H-3570)으로 이용 가능하다. 세포를 48시간의 표준 성장 시간 동안 또는 아래 실시예에 기재된 바와 같이 세포 유형에 따라 더 길게 AARS 폴리펩티드의 존재 하에 96웰 플레이트에서 배양한다.

ATP-lite. 세포 ATP 수준은 세포 건강과 관련되며, 상업적으로 이용 가능한 다양한 키트를 이용해서 쉽게 결정할 수 있다. 용해 용액 및 ATP-검출 시약의 균일한 혼합물인 ATP-lite(Perkin-Elmer, Cat #6016947 Boston, MA 02481)를 사용 전에 예비 혼합하고, 배양 세포와 1:1의 v:v비로 사용한다. 플레이트를 5분 동안 인큐베이션하여 용해를 촉진하고, 발광 플레이트 리더를 이용하여 플레이트를 측정한다. 세포를 48시간의 표준 성장 시간 동안 또는 아래 실시예에 기재된 바와 같이 세포 유형에 따라 더 길게 AARS 폴리펩티드의 존재 하에 96웰 플레이트에서 배양한다.

ALAMARBLUE® (레사주린)은 세포의 산화환원 상태에 기반한 세포 생활성 표시자이다. 활성 성분인 레사주린은 그 산화된 형태로 존재하는 경우 색상이 청색이며 실제로 무형광인 무독성 세포 투과성 화합물이다. 그러나 정상 생활성 세포에 들어가면, 레사주린은 적색 형광 신호를 생성하는 레소루핀으로 신속하게 환원된다. 생활성 세포는 계속해서 레사주린을 레소루핀으로 변환함으로써 생활성-및 세포독성의 정량적 계측을 일으킨다. 독성의 부재로 부정적 영향 없이 세포를 레사주린에 장기 노출시킬 수 있다; 레사주린의 존재 하에 배양된 세포는 유세포 측정 분석에서 결정되는 대조군 세포와 유사한 수의 생활성 세포를 생성하는 것으로 나타났다.

측정은 레사주린/ALAMARBLUE® 용액을 세포에 첨가하고, 이들을 1-4시간 동안 인큐베이션하여 형광 또는 흡광도를 읽어 수행한다. 형광 또는 흡광도의 양은 살아있는 세포의 수와 비례하며 세포의 대사적 활성에 해당한다. 손상된 비생활성 세포는 더 낮은 내재적 대사 활성을 가지므로 건강한 세포에 비해 비례적으로 더 낮은 신호를 생성한다. ALAMARBLUE®과의 인큐베이션 후, 형광 및 흡광도 장비 상에서 표본을 쉽게 측정할 수 있다. 형광을 읽으려면: 530nm 여기 및 590nm 방출 필터 설정을 이용한다.

세포를 48시간의 표준 성장 시간 동안 또는 아래 실시예에 기재된 바와 같이 세포 유형에 따라 더 길게 AARS 폴리펩티드의 존재 하에 96웰 플레이트에서 배양한다.

HepG2C3a 인간 간세포에서 아세틸화된 LDL 의 흡수(아래 데이터 표에서의 분석 B1).

배경 및 치료적 상관성: LDL은 혈장 중 콜레스테롤의 60% 초과를 차지하는, 혈액 중 콜레스테롤의 주요 담체이다. 인간에서, 간 LDL 수용체는 순환으로부터 약 70%의 혈장 LDL의 제거에 관여한다. 내부화된 LDL은 라이소좀에서 자유 콜레스테롤 및 아미노산으로 분해된다. 간은 인간에서 LDL 이화 및 LDL 수용체 활성을 위해 가장 중요한 기관이다. 내부화되지 않고 순환 중에 남아 있는 LDL은 내피 세포에 의해 혈관벽 내로 수송되어 아테롬성 경화판을 형성할 수 있다. 순환 LDL은 또한 대식구에 의해 섭취될 수 있으며, 이것도 경화판 형성에 기여할 수 있다. 간 조직 내로의 LDL 흡수 증가는 인간 건강에 유익할 것으로 여겨지며, 상기 절차를 긍정적으로 조절할 수 있는 안전하고 효과적인 치료제의 발견은 심혈관계 및 대사성 질환을 위한 새로운 요법을 제공할 수 있다. AARS 폴리펩티드의 독특한 특성이 아세틸화된 LDL의 흡수를 조절할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 아세틸화된 LDL 흡수를 측정하기 위한 표준 분석을 HepG2C3a 세포에 채용한다.

따라서 LDL 흡수를 조정하는 능력을 갖는 AARS 폴리펩티드는, 예를 들어 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 1형 및 2형 당뇨병, 대사 증후군 및 아테롬성 경화를 포함하는 혈관 질환의 치료를 포함하는 광범위한 질환에서 중요한 치료적 유용성을 갖는다.

방법 : HEPG2C3a 세포(ATCC# CRL-10741)를 75mL 플라스크 내에서 15mL 배지 중 10% FBS(Hyclone Cat #SH30910.03), 50u/mL 페니실린/50㎍/mL 스트렙토마이신(Invitrogen)이 보강된 Eagles 최소 필수(EMEM) 배지 중에 유지한다. 세포를 37℃, 5% CO_2, 다습 환경에서 배양하고, 멸균 기법 및 고글, 장갑 및 실험실 코트를 포함하는 적절한 개인 보호 장비를 이용하여 BSL2 인증 조직 배양 후드에서 이용한다. HEPG2C3a는 LDL-수용체를 발현하며, 투명 바닥 콜라겐 코팅 플레이트 상에 배양되는 경우 아세틸화된 LDL 흡수에 대해 적격이다. 세포 100㎕ 부피를 50,000세포/mL의 세포 밀도로 완전 배지(상기) 중에 밤새 콜라겐 코팅 플레이트(Invitrogen Cat #A11428) 상에 접종한다. 세포를 PBS(Invitrogen Cat # 10010)로 1회 세척하고, 80㎕의 무혈청 EMEM을 각각의 웰에 첨가한다. 웰 당 최종 농도 250nM의 AARS 폴리펩티드를 각 웰로 멸균 PBS 중에 일정 부피로 첨가한다. 독특한 AARS 폴리펩티드를 각각의 웰에 넣는다. 세포를 혈청 결핍시키고 16시간 동안 AARS 폴리펩티드에 노출시킨다. 16시간 인큐베이션 후, 상청액을 수집하고 가용성 ICAM을 RND 시스템의 표준 ELISA 키트(Cat # DY643)를 이용해 측정하고, 5㎍/mL ac-LDL(Alexa Fluor 488 표지물, Cat # L23380, Invitrogen)이 보강된 무혈청 배지를 각각의 웰에 첨가한다. 37℃, 5% CO₂에서 2시간 인큐베이션 후, 정량을 위해 100㎕의 PBS를 각각의 웰에 첨가하기 전에 세포를 멸균 PBS로 2회 세척한다. 485nm를 중심으로 하는 여기 파장 및 약 535nm를 중심으로 하는 방출 파장에서 Victor X5 형광 플레이트 리더(Perkin Elmer) 상에서 저부 리딩을 이용하여 전체 형광 강도에 대해 플레이트를 분석하였다. 세포를 Hoechst 염료로 염색하고, 405nm 여기/450nm 방출에서의 형광 강도를 읽어 전체 세포수가 플레이트에 걸쳐 일정함을 확인한다.

인간 호중구의 산화적 분출 및 엘라스타아제 제조의 조절(아래 데이터 표에서의 분석 C1-C3)

호중구의 산화적 분출

배경 및 치료적 상관성: 다형핵 호중구 및 단핵구에 의한 포식작용은 박테리아 및 진균을 포함하는 미생물에 의한 감염에 대한 숙주 방어의 필수적 공격부를 구성한다. 포식 절차는 몇몇 주요 단계로 구분될 수 있다: 화학주성(염증 부위로의 포식세포 이동), 포식세포 세포 표면으로의 입자 부착, 섭취(포식작용) 및 산소-의존적(산화적 분출) 및 산소-비의존적 기전에 의한 세포내 사멸. 감소되거나 누락되는 분출 활성이 만성 육아종 질환(CGD)과 같은 선천적 결함에서 관찰된다. CGD는 탄생 후 최초 2년 동안 통상 자체 발현되는 불균일한 유전 장애군이다. 상기 질환은 박테리아 및 진균 유기체에 의해 야기되는 반복되고 치명적인 감염을 특징으로 한다. 이들 감염은 보통 림프절, 폐, 및 간이 관여되는 폐렴, 림프절염, 또는 농양으로 구성된다. NADPH 옥시다아제는 빠르게 과산화수소 및 히드록실 라디칼로 전환되는 과산화물 음이온 생성에 관여하는 효소 시스템이다. NADPH 옥시다아제 효소 시스템의 구성 펩티드에서의 비정상성은 CGD의 기능부전 특징으로 이어진다. CGD 환자의 호중구는 자극 후 유의미한 산화적 분출을 일으키지 못한다. 상이한 형태의 CGD가 기재되어 있다(전통적인 X-연관 CGD 및 상염색체 열성 패턴). 이식, HIV 감염 후기 단계 및 노령층에서는 과립구의 산화적 분출이 손상되어 이들 모집단이 이차적 감염 및 염증 질환의 악화에 에 보다 감수성이 된다. 다양한 면역조정제(예로, 시토카인(GM-CSF, G-CSF, TNF) 또는 약물)는 또한 산화적 분출에 효과를 갖는 것으로 보인다. 여러 상이한 질환 상태에 유용할 치료적 방식으로 산화적 분출을 상향 조절 또는 하향 조절하는 능력을 갖는 단백질의 가능성이 존재한다.

방법 : 단백질 키나아제 C 리간드 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 상기 분석에서 산화적 분출 공정의 작동제로서 이용할 수 있다. 헤파린화된 전혈을 1시간 동안 멸균 덱스트란(0.6% 최종 농도)과 혼합하여 층으로 분리되도록 한다. 하부층은 호중구, 단핵구 및 적혈구를 함유한다. 염화암모늄 용해 단계를 이용하여 모든 RBC를 제거하고, 대략 3% 단핵구로 오염된 97% 순수한 호중구 모집단이 용해 단계 후에 남는다. 자극 시, 과립구 및 단핵구는 포식소체 내부에서 박테리아를 소멸시키는 반응성 산소 대사물(초산화물 음이온, 과산화수소, 염화수소산)을 생성한다. 산화적 분출 동안의 반응성 산화제의 형성은 Amplex Red의 부가 및 산화에 의해 모니터링할 수 있다. 이어서 생성된 반응성 산소 라디칼을 갖는 세포의 백분율뿐만 아니라 이들의 평균 형광 강도를 형광 플레이트 리더를 이용해 분석한다. 상기 반응을 위한 전형적인 시간 코스는 10분이며, 뚜렷한 분출은 2분경에 보이고, 신호 쇠퇴는 20분쯤 보인다. 상기 분석은 AARS 폴리펩티드 및 PMA를 상기 화합물의 EC50 미만 농도로 동시 투여하는 길항제 방식으로 또는 PMA의 부재 하 작동제 방식으로 수행할 수 있다.

인간 호중구 엘라스타아제 제조의 조절

배경 및 치료적 상관성: 호중구 엘라스타아제는 폐 및 심혈관계의 염증 장애를 포함하는 광범위한 인간 질환의 발생에 특정 역할을 갖는 것으로 제시되는 세린 프로테아제이다. 그 중추적 생리학적 역할은 선천적 숙주 방어에 있지만, 이는 또한 조직 리모델링에 참여할 수 있고, 현재 국소 염증 신호에 중요한 것으로 인지되는 분비촉진 작용을 보유한다. 호중구 엘라스타아제 활성은 수십년 동안 폐기종의 발생에 시사되었지만, 상대적으로 최근에 와서야 과도한 세포외 기질 침착이 일어나는 상황에서 상기 세린 프로티나아제에 병리적 기능이 추론되었다. 그 작용이 섬유성 폐 복구에 영향을 미칠 수 있는 잠재적 방식을 알아내기 위해 유전적으로 조작된 동물 모델의 사용이 시작되고 있다. 나타나는 증거는 섬유발생 매개자 생성 및 콜라겐 합성에 보다 직접적 효과를 갖는 세포 경로의 관여가 폐 기질 축적을 촉진하는 호중구 엘라스타아제의 작용을 지지하는 것으로 나타난다고 제시한다. 인간 호중구 엘라스타아제는 또한 동맥류 형성 및 경화판 파열의 합병증에 연관된 혈관벽 약화 및 기질 분해에 기여하는 아테롬성 경화판 내에 존재한다. 이는 이들 작용에 있어서 다른 세포외 프로테아제와 연합하지만, 호중구 탈과립에 연관된 활성에 커플링된 상기 효소의 역가 및 광범위한 기질은 아테롬성 경화 질환에서 상기 붕괴성 프로테아제를 치료적 표적으로 강조해 낸다.

방법: 상기 분석은 ENZCHEK® 엘라스타아제 분석 키트(Invitrogen Catalog # E-12056)를 이용한다. 6% 덱스트란 용액을 이용하여 신선한 인간 혈액으로부터 호중구를 제조하고, 세포를 RPMI 배지(배지는 혈청, 항생체로 보강되지 않아야 한다)에 접종하기 전에 적혈구를 용해한다. 동결건조된 기질을 함유한 3 바이알 중 하나에 직접 1.0mL 탈이온수(dH2O)를 첨가하고 혼합하여 용해시킴으로써 DQ 엘라스틴 기질의 1.0mg/mL 스톡 용액을 제조한다. 6mL 10X 반응 완충액을 54mL dH2O 중에 희석하여 1X 반응 완충액을 제조한다. DQ 엘라스틴 스톡 용액을 1X 반응 완충액 중에 10배 희석하여 DQ 엘라스틴 기질의 100㎍/mL 작업 용액을 제조한다. 100U/mL 스톡 용액을 dH2O 중에 제조하여 돼지 췌장 엘라스타아제 스톡 용액을 제조한다. 엘라스타아제 활성에 대해 분석하기 위해, 50㎕ 1X 반응 완충액을 30㎕ 부피로 500,000호중구/mL을 함유하는 각각의 분석 웰 내로 피펫팅한다. 8㎕의 각 AARS 폴리펩티드를 웰 당 첨가하고 표본을 37℃에서 20분 동안 인큐베이션한다. 50㎕의 100㎍/mL DQ 엘라스틴 작업 용액을 각각의 웰에 첨가하고 혼합한다. 표본을 실온에서 인큐베이션하고, 빛으로부터 30분 동안 보호한다. 표준 플루오레신 필터(여기 485/방출 535)가 장착된 형광 마이크로플레이트 리더에서의 형광 강도는 형광을 다중 시점에 걸쳐 측정할 수 있다.

Toll -유사 수용체로의 결합 및 NF κB의 활성화(아래 데이터 표에서의 분석 D1 - D4 )

배경 및 치료적 상관성: 대식구는 선천성 면역계의 주요 작용자로, 면역 반응의 강력한 조절제 및 조절자인 Toll-유사 수용체(TLR) 패밀리를 포함하는 상이한 클래스의 패턴 인식 수용체(PRR)의 큰 레퍼토리를 나타낸다.

미생물 병원체 및 내인성 리간드에 의한 TLR의 자극은 하류 적응 면역 반응을 지시하는 전-염증 시토카인 및 효과기 시토카인의 분비를 유도하는 신호전달 연쇄반응을 개시한다. 내인성 리간드뿐만 아니라 미생물 성분이 TLR에 의해 인지되고 이를 활성화할 수 있으므로, 이들 수용체가 다중 질환에 대한 새로운 요법의 개발을 위한 결정적 표적일 수 있다는 가능성을 제기한다.

따라서 TLR 수용체 활성을 조정하는 AARS 폴리펩티드는, 예를 들어 염증 질환 및 장애, 자가면역 질환, 조직 이식/기관 거부, 암 예방 또는 치료, 조혈 및 감염의 조정을 포함하는 광범위한 질환 및 장애에서 치료적 유용성을 갖는다.

RAW-BLUE 세포에서의 TLR 활성화의 측정

상표명 RAW-BLUE™ 세포(Invivogen, Catalog code: raw-sp) 하에 판매되는 마우스 대식구는 TLR5를 제외한 모든 TLR을 발현하며, NF-kB 및 AP-1 전사 인자에 의해 유도 가능한 분비된 배아 알칼린 포스파타아제(SEAP) 유전자를 포함한다. TLR 자극 시, RAW-BLUE™ 세포는 NF-kB 및/또는 AP-1을 활성화하여 SEAP 검출 배지 이용 시 측정 가능한 SEAP의 분비를 일으킨다.

방법: RAW-BLUE™ 세포를 PBS로 2회 세척하고, 트립신화하고, 신선한 성장 배지(성장 배지: DMEM, 4.5g/l 글루코오스, 10% 열-불활성화 소 태아 혈청(56℃에서 30분), 100mg/mL ZEOCIN™, 2mM L-글루타민) 중에 재현탁한다. 세포를 전체 부피 100㎕로 96 웰 플레이트 중에 50,000세포/웰의 농도로 접종하고, AARS 폴리펩티드, 대조군, 또는 AARS 폴리펩티드(+LPS)를 각각의 웰에 아래 개략한 실험에 나타낸 농도로 첨가한다. 세포를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 18시간 동안 인큐베이션한다. 실험일 2일째에, SEAP 검출 배지(QUANTI-BLUE™)(Invivogen Catalog code: rep-qb1)를 지침에 따라 제조하고, 120㎕을 깨끗한 편평 바닥 96 웰 플레이트의 웰 당 첨가하고, 세포 상청액을 첨가한다(20㎕). 표본을 37℃에서 약 30분 내지 최대 2시간 동안 인큐베이션한다. 분광측정기를 이용하여 SEAP 수준을 결정하고, 650nM에서 흡광도를 읽는다.

TLR 활성화를 특이적으로 차단하는 AARS 폴리펩티드를 검출하기 위해, 상기 분석을 개질하여 잠재적 TLR 길항제를 동정한다. 이 경우, 50ng/mL LPS 첨가 1시간 전에 AARS 폴리펩티드를 웰 당 약 250nM의 최종 농도로(또는 아래 실시예에 특정된 다른 농도로) 세포에 첨가한다. 세포를 인큐베이션하고, SEAP을 상술된 바와 같이 검출한다. LPS가 없거나 AARS 폴리펩티드만이 첨가된 PBS 대조군 웰을 이용하여 측정 시 TLR 자극의 기준 수준을 확인한다. 대조군 웰을 PBS 및 공지된 TLR 작동제 및 길항제로 사전 처리한다. 감산 배경 [PBS + LPS 신호] 대 [AARS 폴리펩티드 + LPS 신호]의 비를 이용하여 길항 백분율을 결정한다.

Hek293 세포에서의 인간 TLR 스크리닝

인간 HEK293 세포는 유전적으로 개질되어 상표명 HEK-Blue™ TLR 세포(Invivogen) 하에 판매된다. 상기 세포 유형의 TLR2 및 TLR4 버전은 선택적으로 모든 TLR2 또는 TLR4를 발현하며, 5개 NF-kB 및 AP-1 전사 인자 결합 부위에 융합된 IFN-베타 최소 프로모터의 조절 하에 분비된 배아 알칼린 포스파타아제(SEAP) 리포터 유전자를 포함한다. 특이적 TLR 2 또는 4 작동제(각각)의 사용으로, HEK-BLUE™ TLR2 및 HEK-BLUE™ TLR4 세포는 NF-kB 및/또는 AP-1을 활성화시켜 SEAP 검출 시약을 사용하는 경우 측정 가능한 SEAP 분비를 일으킨다. HEK-BLUE™ TLR2 세포는 LPS 공-수용체 단백질 CD14와 공-전달감염되어 TLR2 반응성을 증강시키고 신호 품질을 개선시킨다. 부모 세포는 내인성 수준의 TLR1, 3, 5, 6 및 NOD1을 또한 발현한다.

방법: HEK-BLUE™-TLR2 또는 HEK-BLUE™-TLR4 세포를 PBS로 2회 세척하고, 트립신 처리하고, 신선한 성장 배지(성장 배지: DMEM, 4.5g/L 글루코오스, 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청(56℃에서 30분), 100mg/mL ZEOCIN™, 2mM L-글루타민) 중에 재현탁한다. 세포를 96웰 플레이트에 50,000세포/웰의 농도로 전체 부피 100㎕로 접종하고, AARS 폴리펩티드, 대조군, 또는 AARS 폴리펩티드(+LPS)를 아래 개요한 실험에 나타낸 농도로 각각의 웰에 첨가한다. 세포를 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 중에 18시간 동안 인큐베이션한다. 실험일 2일째에, SEAP 검출 배지(QUANTI-BLUE™)(Invivogen Catalog code: rep-qb1)를 지침에 따라 제조하고, 투명한 편평 바닥 96-웰 플레이트에 웰 당 120㎕ 첨가하고, 세포 상청액(20㎕)을 첨가한다. 표본을 37℃에서 약 30분 내지 2시간까지 인큐베이션한다. SEAP 수준은 분광측정기를 이용하여 650nM에서의 흡광도를 읽어 결정한다. 대조군 웰은 PBS 및 공지된 TLR 작동제, 예컨대 초순수 LPS(TLR-4) 또는 PAM3CSK4(TLR-2)로 사전 처리한다. 감산 배경[PBS+LPS 신호] 대 [AARS 폴리펩티드+LPS 신호]의 비를 이용하여 작동 백분율을 결정한다.

시토카인 방출(아래 데이터 표에서의 분석 E1-E17)

배경 및 치료적 상관성: 시토카인은 세포간 커뮤니케이션을 위해 널리 이용되며, 면역조정 및 조절을 포함하여 정상 신체 항상성에 있어서 중요한 역할을 수행하는 다양한 세트의 세포 신호전달 단백질 소분자이다. 따라서 시토카인의 방출, 또는 생물학적 활성을 조정하는 AARS 폴리펩티드는, 예를 들어 염증 질환 및 장애, 자가면역 질환, 조직 이식/기관 거부, 암 예방 또는 치료, 조혈 및 감염의 조정을 포함하는 광범위한 질환 및 장애에서 치료적 유용성을 갖는다.

배양 세포로부터의 시토카인 방출

방법: 평가 세포를 1mL의 성장 매질 중 약 백만개 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한다. 세포에 AARS 폴리펩티드(아래 실시예에 나타낸 농도로) 또는 동일 부피의 PBS를 처리하고, 밤새 37℃에서 5% CO₂로 인큐베이션한다. 세포 처리 후, 표본을 2,000xg로 5분 동안 스윙 버킷 원심분리에서 4℃에서 원심분리한다. 세포 펠렛을 교란하지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하여 새로운 튜브로 옮긴다. 표본을 즉시 분석하거나 후속 분석을 위해 액체 질소 중에 급속 냉동한다. 상업적으로 이용 가능한 키트(R&D Systems, Inc, MN, USA)를 이용하거나 계약 연구 협회(MD Biosciences (St. Paul, MN))를 통해 시토카인 방출(시토카인 MIF, IL-8, IL-10, Serpin E1, GM-CSF, GRO, IL-1 알파, IL-1베타, IL-1ra, IL-6, MCP-1, MIP-1, RANTES 및 TNF-알파 포함)을 결정한다.

인간 전혈로부터의 시토카인 방출

방법: 정상 인간 공여자로부터 인간 전혈을 수득하고, 표준 수집 튜브 내 헤파린과 함께 수집한다. 적절한 세포 건강을 보장하기 위해 혈액은 수집한 날짜에 사용한다. 혈액을 부드럽게 혼합하고 96웰 폴리카보네이트 V형 바닥 플레이트 내로 100㎕ 부피로 접종한다. AARS 폴리펩티드를 첨가하고 50㎕ 상 멀티채널 피펫 세트를 이용하여 혈액 내로 2회 천천히 혼합한다. 모든 실험을 위해 필터 팁을 사용하며, 완전 PPE를 착용한다. 모든 실험은 인간 혈액 실험에 적합한 규정된 생체안전 후드에서 수행한다. 혈액은 밤새 37℃에서 5% CO₂로 인큐베이션한다. 세포 처리 후, 표본을 2,000xg로 5분 동안 스윙 버킷 원심분리에서 원심분리한다. 상청액을 시토카인 ELISA를 위해 수집한다. ELISA는 전술한 바와 같이 수행한다.

PBMC로부터의 시토카인 방출

방법: 말초 혈액 단핵구를 단리하기 위해, 신선하게 단리된 인간 전혈을 실온에서 50mL 코니칼 튜브 중 1:1의 비로 Sigma HISTOPAQUE®-1077에 걸쳐 부드럽게 층화한다. 층화된 표본을 브레이크 없이 실온에서 30분 동안 스윙 버킷 임상 원심분리에서 400xg로 원심분리한다. 이어서 혈장 및 밀도 구배 간 계면의 백색 세포층을 피펫팅으로 제거한다. 이들 말초 혈액 단핵구를 희석 및 250xg에서 10분 동안 원심분리에 의해 RPMI-1640(Invitrogen #22400-105)으로 2회 세척한다. 세척된 PBMC를 RPMI-1640+10% FBS 중에 재현탁하고 1x10⁶세포/mL로 접종한다.

THP-1 및 HL60 세포로부터의 시토카인 방출

방법: THP1 및 HL60 세포를 RPMI-1640+10% FBS 중에 배양하고 96웰 플레이트에서 1x10⁶세포/mL로 접종한다. 달리 나타내지 않는 한, 세포를 250nM의 농도의 AARS 폴리펩티드로 48시간 동안 처리한다. 이들 두 세포 유형은 보통 단핵구-유사 또는 대식구-유사한 것으로 간주되며, 골수성 계통임을 시사하는 여러 마커를 갖는다. 결과적으로 이들 세포는 다양한 생물학적 자극에 반응하여 다양한 시토카인을 생산하며, 종종 시험관 내 염증 및 항-염증 반응을 살펴보기 위해 이용된다. 상업적으로 이용 가능한 키트(R&D Systems, Inc, MN, USA)를 이용하여 또는 계약 연구 협회(MD Biosciences (St. Paul, MN))를 통해 시토카인 방출(시토카인 MIF, IL-8, IL-10, 세르핀 E1, GM-CSF, GRO, IL-1알파, IL-1베타, IL-1ra, IL-6, MCP-1, MIP-1, RANTES 및 TNF-알파 포함)을 결정한다.

인간 윤활막 세포로부터의 시토카인 방출

배경 및 치료적 상관성: 여러 연구에서 IL-6 및 IL-8가 몇몇 질환에서 과생산되며, 따라서 염증 질환의 병리에 근원적 역할을 수행할 수 있다는 것을 설명하였다. IL-6은 내피 세포 생산을 활성화하여, IL-8 및 단핵구 화학주성 단백질의 방출, 접착 분자의 발현, 및 백혈구의 염증 부위로의 모집을 일으킨다. 이들 시토카인은 전신성 소아 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 크론씨 질환, 및 류마티스성 관절염의 병리에 관여하는 세포를 포함하는 염증 질환에 연관된 세포 유형에서 발현된다. 시토카인 생산의 가장 중요한 전신 작용 중 하나는 급성상 반응의 유도이다. 급성상 단백질은 일차적으로 간에 의해 생산되며, 보체의 활성화, 전염증성 시토카인의 유도 및 호중구 화학주성의 자극을 통해 면역 반응을 촉진하는 단백질을 포함한다. 대안적으로 급성상 반응은 도움이 될 수 있으며, 급성상 단백질, 예컨대 프로티나아제 길항제, 옵소닌, 및 프로코아굴린은 염증을 해결하여 조직 파괴를 제한하는 것을 돕는다. 특히, IL-6은 윤활막 세포 증식 및 파골세포 활성화를 자극하여 윤활 판누스 형성 및 보수를 일으킨다. IL-6은 관절 및 연골 파괴에 기여할 수 있는 기질 메탈로프로티나아제 생산을 증가시키는 IL-1과 함께 작용한다. 그러나 IL-6은 또한 상기 시토카인이 항원-유도된 관절염을 갖는 마우스 관절 내로 주사되는 경우 메탈로프로티나아제의 조직 저해제 발현을 유도하고 프로테오글리칸 합성을 자극한다는 발견에서 시사되는 바와 같이, 관절에서 보호적 효과도 가질 수 있다. 인간 섬유아세포-유사 윤활막 세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)는 류마티스성 관절염(RA)을 갖는 환자에서 수득된 윤활 조직으로부터 단리된다. 이들은 제 2계대에서 동결보존되며, 적어도 5 모집단 더블링까지 배양 및 증식될 수 있다. HFLS는 연골 분해에 기여하는 시토카인 및 메탈로프로티나아제 생산에 의한 관절 파괴에서의 이들의 역할이 오랫동안 공지되어 있다.

따라서 섬유아세포-유사 윤활막 세포-류마티스성 관절염(HFLS-RA)의 성장, 분화, 또는 시토카인 방출 프로필을 조정하는 능력을 갖는 AARS 폴리펩티드는, 예를 들어 전신성 소아 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 크론씨 질환 및 류마티스성 관절염을 포함하는 염증 질환 및 장애의 치료를 포함하는 광범위한 질환에서 치료적 유용성을 갖는다.

방법: HFLS-RA, 성인 세포(Cell Application Cat # 408RA-05a)를 사용 전에 1계대 동안 125mL 플라스크에서 15mL 배지 중 윤활막 세포 성장 배지(Cell Application Cat # 415-50)에서 유지한다. 세포를 37℃, 5% CO_2, 다습 환경 하에 유지하고, 고글, 장갑 및 실험실 코트를 포함하는 적절한 개인 보호 장비 및 멸균 기법을 이용하여 BSL2 인증 조직 배양 후드에서 사용한다. 80㎕ 부피의 세포를 약 50,000세포/mL의 세포 밀도로 성장 배지 중에 밤새 접종한다. 웰 당 최종 농도 250nM의 AARS 폴리펩티드(또는 아래 실시예에 나타낸 다른 농도로)를 각 웰로 멸균 PBS 중에 첨가한 후 밤새 부착시킨다. 대조군 웰은 미처리 세포를 함유하며, 균등한 부피의 PBS와 인큐베이션한다. 세포를 24시간 동안 기본 배지(Cell Application Cat #310-470) 중 단백질 또는 PBS에 노출시킨다. 상청액을 제거하고, 제조자의 지시에 따라 IL-8, IL-6 및 TNFa ELISA 분석을 수행한다(RND Systems, Cat # DY206 및 DY-208, DY-210 Duo-set 키트). 상청액 제거 후 플레이트에 레사주린을 함유한 신선한 배지를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여 전술한 바와 같이 레사주린으로 증식을 평가한다. 플레이트를 형광 플레이트 리더 상에서 측정하고, 생활성/증식은 AARS 폴리펩티드 처리 웰의 레소루핀 연관 형광을 PBS만 처리한 웰의 레소루핀 연관 형광으로 나눈 함수로 표시한다.

인간 별아교세포 증식 및 염증성 시토카인 생산

배경 및 치료적 상관성: 인간 별아교세포(HA)는 인간 대뇌 피질에서 유도된다. 이들은 제 2계대에 동결보존되며, 10 모집단 더블링까지 배양 및 증식될 수 있다. HA는 중추 신경계에서 가장 풍부한 세포이며, 이들은 여러 기능, 예컨대 뉴론에 대한 기계적 지지 및 영양분 제공, 및 뉴론으로부터의 노폐물 제거를 수행한다. 최적 뉴론 기능을 위한 결정적 지지 역할 수행에 부가하여, 이들은 또한 혈액-뇌 장벽을 형성하는 내피 세포의 생화학적 지지를 제공한다. 최근 연구는 줄기 세포에 신경 운명에 순응하도록 지시하고, 뇌내 정보의 전달 및 저장에 능동적으로 참여하는 단일 시냅스의 기능을 조절함으로써 별아교세포가 신경발생을 조절할 수 있음을 보여주었다. 신경계 기능에서 별아교세포의 중요성은 점점 더 중요하게 인식되고 있다. HA는 별아교세포 기능의 다양성 탐색을 위해 유용한 시험관 내 모델로 작용할 수 있다. 별아교세포는 IL6 및 TNF알파에 반응하여 증식하는 것으로 나타났다. 부가적으로 이들 세포는 이들 자체의 IL6 및 TNF알파를 제조할 수 있다. 따라서 HA에서 증식 및 시토카인 생산을 조정하는 AARS 폴리펩티드는 신경염증, 신경퇴화, 뇌의 종양발생 및 뇌 허혈과 복구를 포함하는 다양한 신경학적 질환에서 치료적 유용성을 갖는다.

방법: Cell Applications(Cat # 882K-05f)의 인간 별아교세포(HA)를 제조자의 지시에 따라 Cell Applications HA 세포 성장 배지(Cat # 821-500) 중에 유지한다. 세포를 37℃, 5% CO_2, 다습 환경 하에 유지하고, 고글, 장갑 및 실험실 코트를 포함하는 적절한 개인 보호 장비 및 멸균 기법을 이용하여 BSL2 인증 조직 배양 후드에서 사용한다. 80㎕ 부피의 세포를 약 50,000세포/mL의 세포 밀도로 완전 배지(상기 참조) 중에 밤새 콜라겐 코팅 플레이트 상에 접종한다. 세포를 PBS로 1회 세척하고, 80㎕의 무혈청 성장 배지를 각각의 웰에 첨가한다. 웰 당 최종 농도 250nM의 AARS 폴리펩티드(또는 아래 실시예에 나타낸 다른 농도로)를 각 웰로 멸균 PBS 중에 일정 부피로 첨가한다. 세포를 AARS 폴리펩티드에 48시간 동안 노출시키고, 발생 배지는 시토카인 평가를 위해 제거한다(전술한 바와 같이). 세포를 48시간 동안 기본 배지(Cell Application Cat #310-470) 중 단백질 또는 PBS에 노출시킨다. 상청액을 제거하고, 제조자의 지시에 따라 IL-8 및 IL-6 ELISA 분석을 수행한다(RND Systems, Cat # DY206 및 DY-208, DY-210 Duo-set 키트). 상청액 제거 후 플레이트에 레사주린을 함유한 신선한 배지를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여 전술한 바와 같이 레사주린으로 증식을 평가한다. 플레이트를 형광 플레이트 리더 상에서 측정하고, 생활성/증식은 AARS 폴리펩티드 처리 웰의 레소루핀 연관 형광을 PBS만 처리한 웰의 레소루핀 연관 형광으로 나눈 함수로 표시한다.

인간 폐 미세혈관 내피 세포( HLMVEC ) 증식 및 염증성 시토카인 생산

배경 및 치료적 상관성: 폐 혈관계는 매우 큰 생리학적/병리학적 중요성을 갖는다. 이것은 현재 전신 동맥혈의 조성을 조절하고, 표적 기관 기능에 영향을 미치고, 혈전증, 지혈 및 면역 반응뿐만 아니라 종양 전이에 기여하는 방식으로 순환 기질 및 형성된 성분과 상호작용하는 대사적으로 활성이며 기능적으로 반응성인 세포로 이루어진 조직으로 인지된다. 인간 폐 미세혈관 내피 세포(HLMVEC)는 급성 폐 손상 동안 지시되는 폐내로의 백혈구 이동을 위한 결정적 단서를 제공하는 세포 접착 분자 및 화학주성 시토카인의 상승된 발현을 나타낸다. 상기 일차 세포 유형은 시험관 내 폐 미세혈관계의 병리 및 생물학의 다양한 측면을 연구하기 위한 유용한 도구일 수 있다. 염증 자극에 반응하는 미세혈관계의 구조 및 기능 변형은 기관 손상에서 중요 인자로 여겨지며, 적절한 조건 하에 복구를 위한 자극을 제공할 수 있다. 이들 혈관 변형의 중요 원인은 백혈구 침습이 관여하는 염증 반응의 유도이다. 내피에 대한 과립구 접착에 초점을 맞춘 다양한 연구는 백혈구 모집 및 이동에 널리 조화된 접착 연쇄반응이 관여한다는 것을 드러내었다. 접착 연쇄반응은 과립구가 내피에 부착되고 낮은 속도로 유체 흐름 방향으로 구르기 시작될 때 시작된다. 과립구는 구르면서 활성화되어 내피에 단단히 부착하며, 내피를 통과해서 혈관밖 공간으로 이동한다. 이들 접착 이벤트는 부분적으로 과립구 표면 상의 CAM 및 내피 상에 존재하는 인지체 당단백질 사이에서 일어나는 분자 상호반응에 의해 매개된다. 다양한 연구는 내피 세포 접착 분자 E-셀렉틴이 SLex-유형 글리칸 제시 과립구 리간드와 상호작용하여 접착 연쇄반응의 부착 및 구르는 단계를 매개할 수 있음을 드러내었다. 연쇄반응의 하류 단계에는 내피-발현 세포간 접착 분자와 과립구-발현 CD18 인테그린의 상호반응이 관여된다.

따라서 인간 폐 미세혈관 내피 세포의 증식 및/또는 시토카인 생산을 조정하는 AARS 폴리펩티드는, 예를 들어 폐 고혈압, 만성 폐색성 폐 질환, 특발성 폐 섬유화 및 천식을 포함하는 염증성 및 폐색성 폐 질환을 포함하는 다양한 혈관 및 폐 질환에서 치료적 유용성을 갖는다.

방법: HUMVEC(Cell Application, Catalog # 540-05)은 Cell Applications 미세혈관 내피 세포 성장 배지(Cat # 111-500) 중에 유지한다. 적절한 성장을 위해, 콜라겐 함유 부착 인자 용액(Cell Application, Catalog # 123-100)을 사용하여 세포 접종 전에 플레이트 및 플라스크를 코팅한다. 세포를 37℃, 5% CO_2, 다습 환경 하에 유지하고, 고글, 장갑 및 실험실 코트를 포함하는 적절한 개인 보호 장비 및 멸균 기법을 이용하여 BSL2 인증 조직 배양 후드에서 사용한다. 80㎕ 부피의 세포를 50,000세포/mL의 세포 밀도로 완전 배지(상기 참조) 중에 밤새 콜라겐 코팅 플레이트 상에 접종한다. 세포를 PBS로 1회 세척하고, 80㎕의 무혈청 성장 배지를 각각의 웰에 첨가한다. 웰 당 최종 농도 250nM의 AARS 폴리펩티드(또는 아래 실시예에 나타낸 다른 농도로)를 각 웰로 멸균 PBS 중에 일정 부피로 첨가한다. 세포를 AARS 폴리펩티드에 48시간 동안 노출시키고, 발생 배지는 세포 접착 분자 및 시토카인 평가용 ELISA를 위해 제거한다(전술한 바와 같이). 가용성 VCAM 및/또는 ICAM을 포함하는 세포 접착 분자를 RND 시스템의 표준 ELISA 키트(각각 Cat # DY643 및 DY720)을 이용하여 측정한다. 상청액 제거 후 플레이트에 레사주린을 함유한 신선한 배지를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여 전술한 바와 같이 레사주린으로 증식을 평가한다. 플레이트를 형광 플레이트 리더 상에서 측정하고, 생활성/증식은 AARS 폴리펩티드 처리 웰의 레소루핀 연관 형광을 PBS만 처리한 웰의 레소루핀 연관 형광으로 나눈 함수로 표시한다.

세포 접착(아래 데이터 표에서의 분석 F1-F7)

배경 및 치료적 상관성: 세포 접착 분자(CAM)는 세포 접착으로 불리는 절차에서 다른 세포 또는 세포외 기질(ECM)과의 결합에 관여되는 세포 표면 상에 위치한 단백질이다. 이들 단백질은 보통 막통과 수용체이며, 하기 3 도메인으로 이루어진다: 세포골격과 상호반응하는 세포내 도메인, 막통과 도메인, 및 동일한 종류의 다른 CAM(동종친화성 결합)과 또는 다른 CAM이나 세포외 기질(이종친화성 결합)과 상호반응하는 세포외 도메인. 대부분의 CAM은 하기 4 단백질 패밀리에 속한다: Ig(면역글로불린) 수퍼패밀리(IgSF CAM), 인테그린, 카데린, 및 셀렉틴. 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF) 세포 접착 분자는 하기를 포함하는 칼슘-비의존적 막 통과 당단백질이다: 신경 세포 접착 분자(NCAM), 세포간 세포 접착 분자(ICAM), 혈관 세포 접착 분자(VCAM), 혈소판-내피 세포 접착 분자(PECAM-1), 내피 세포-선택적 접착 분자(ESAM), 결찰부 접착 분자(JAM), 넥틴, 및 다른 세포 접착 분자.

세포 접착 분자는 다양한 염증성 간 질환에서 굴형 내피에 대한 백혈구 접착 및 이주 그리고 세포독성에 중요한 세포 표면 당단백질이다. ICAM-1은 염증에서 중요한 역할을 수행하며, 내피 세포 상 ICAM-1의 증가된 발현은 내피 세포의 활성화에 반영된다. ICAM-1은 강한 내피 접착을 매개하고 백혈구 이주를 촉진하기 때문에 특히 중요하다. 염증성 간 상태, 예컨대 B형 바이러스 감염, 자가면역 간 장애, 알코올성 간염, 및 간 동종이식 거부에서 굴형 세포 및 간세포 모두에서 ICAM-1이 상향조절되는 것으로 연구에서 나타났다.

따라서 내피 세포에 대한 세포 접착 및 세포 접착 분자 생산을 조정하는 AARS 폴리펩티드는, 예를 들어 심혈관계 질환, 아테롬성경화, 자가면역성 및 폐 고혈압을 포함하는 다양한 염증성 질환에서 치료적 유용성을 갖는다.

방법: 인간 탯줄 정맥 세포(ATCC, Cat # CRL-2873)(HUVEC)를 제시된 ATCC 배지 및 보강제 중 인간 피브로넥틴 부착 용액이 코팅된 12웰 플레이트에 약 1.2 x 10⁵세포/웰의 농도로 접종하고 제조자의 지시에 따라 배양한다. 세포를 나타낸 농도의 AARS 폴리펩티드 또는 PBS 단독으로 자극하고, 성장 배지 중에서 밤새 인큐베이션한다. 인간 급성 단핵 백혈병(THP-1(TIB-202)) 세포를 칼세인 AM(6㎕/mL; Invitrogen Cat # C1430)이 포함된 0.1% BSA/RPMI 무혈청 배지 내로 재현탁하고, 30분 동안 인큐베이션한다. 표지된 세포를 수집하고, 10% FBS 함유 RPMI 배지 중에 재현탁하여 밀도를 2x10^6세포/mL로 조정한다.

100㎕(2x10⁵)의 표지된 THP-1 세포를 1mL의 성장 배지 중 HUVEC 단층의 각 웰 내에 넣고 15분 동안 인큐베이션한다. 웰을 PBS로 2회 세척하여 미결합된 세포를 제거한 뒤, 여기 파장 488nm 및 방출 파장 530nm로 세포를 형광 플레이트 리더에서 측정한다.

THP-1 세포로부터의 세포 접착 분자 방출

방법 : THP1 세포를 RPMI-1640+10% FBS 중에 배양하고 1x10⁶ 세포/mL로 접종한다. 세포를 달리 나타내지 않은 한 250nM 농도의 AARS 폴리펩티드로 48시간 동안 처리하고, 전술한 바와 같이 TNF-알파, IL-6 및 IL-8뿐만 아니라 다양한 세포 접착 분자용 ELISA로 평가하였다. 상기 세포 유형은 보통 단핵구-유사 또는 대식구-유사 성질인 것으로 간주되며, 이들이 골수성 계통인 것으로 시사하는 여러 마커를 갖는다. 결과적으로 이들 세포는 다양한 생물학적 자극에 반응하여 다양한 시토카인을 생산하며, 종종 세포 접착 분자 조절 및 생산을 포함하여 시험관 내 염증성 및 항-염증성 반응을 확인하는데 이용된다.

세포 분화(아래 데이터 표에서의 분석 G1-G4)

일차 인간 전-지방세포에서의 지방세포 분화 및 증식.

배경 및 치료적 상관성: 비만 및 지방이상증은 모두 통상 당뇨병 및 심혈관계 질환을 포함하는 병리에 연관된다. 이제 지방 조직은 다양한 인자를 분비하는 내분비성 기관이며 조절곤란해진 분비는 지방형성뿐만 아니라 전신 글루코오스/인슐린 항상성에 영향을 미치는 것으로 인지된다. 비만으로 이어지는 과도한 지방 조직은 공중 보건에 대한 심각한 위협이 되고 있다. 지방 조직 발달은 유전적 배경, 호르몬 균형, 식사, 및 신체 활성에 영향을 받을 수 있다. 지방 조직 질량은 더 높은 트리아실글리세롤 축적으로 인해 지방 세포 크기가 증가되는 경우 증가할 수 있다. 부가적으로 전구체 세포의 지방세포로의 분화에서 발생하는 지방 세포수의 증가는 또한 고탄수화물 또는 고지방 식사를 섭취하는 중증 인간 비만 및 설치류에서 관찰되는 바와 같이 성인에서도 일어날 수 있다. 지방세포는 특히 위탁 및 분화 공정인 지방형성을 거치는 중간엽 세포에서 일어나는 것으로 여겨진다. 전-지방세포 세포주는 합성 글루코코르티코이드, 덱타메타손(DEX), 이소부틸메틸잔틴(IBMX), 및 인슐린으로 이루어진 지방형성 제제로의 치료 시 지방세포 분화를 겪을 수 있으며 이들 연구에서 중요하다. 전사인자의 페록시좀 증식제-활성화된 수용체 γ(PPARγ) 및 CCAAT 인핸서-결합 단백질(C/EBP) 패밀리는 지방세포 분화에서 결정적 역할을 수행하는 것으로 확고히 확립되었다. 지방세포 분화의 초기에, C/EBPβ 및 C/EBPδ는 각각 DEX 및 IBMX에 의해 유도되며, 이어서 함께 PPARγ 및 C/EBPα가 지방세포 기능에 필요한 다양한 지방세포 마커를 활성화시키도록 유도한다. 다른 전사 인자도 또한 지방형성을 긍정적 또는 부정적으로 조절하며, 다양한 성장 인자 및 호르몬은 지방형성 전사 인자의 발현을 조절함으로써 지방세포 분화에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보고되었다. 실제로 트리아실글리세롤을 저장하고 필요 시 지방산을 방출함으로써 포유류에서 에너지 저장을 위한 주요 부위인 것에 부가하여, 지방 조직은 면역 반응, 혈관 기능, 및 에너지 항상성을 포함하는 다양한 생리학적 절차에 관여하는 광범위한 분자를 분비한다. 시토카인, 예컨대 TNF-α 및 IL-6은 지방세포로부터 분비된다. 이들 인자의 일부는 또한 자가분비/주변분비에 의해 지방 조직의 성장 및 발달에 영향을 미칠 수 있다.

따라서 정상 인간 전-지방세포의 분화 및/또는 증식을 조정하는 능력을 갖는 AARS 폴리펩티드는, 예를 들어 대사성 질환, 심혈관계 질환, 비만 및 지방이상증뿐만 아니라 당뇨병의 장기 합병증 치료 및 예방을 포함하는 광범위한 질환에서 치료적 유용성을 갖는다.

방법: HPAd(인간 전-지방세포)(Cell Application Cat # 803sD)를 공급자 지시에 따라 유지한다. 배양을 위해, 세포를 신속히 해동하고 15mL의 지방세포 성장 배지(Cell Application Cat # 811M-250) 내로 바로 옮겨 표준 멸균 조직 배양 처리 플라스크 내로 접종한다. 세포가 >60% 융합성이 될 때까지 2일 마다 배지를 신선한 지방세포 성장 배지로 교체한다. 세포를 37℃, 5% CO_2, 다습 환경 하에 배양하고, 고글, 장갑 및 실험실 코트를 포함하는 적절한 개인 보호 장비 및 멸균 기법을 이용하여 BSL2 인증 조직 배양 후드에서 사용한다. 세포를 약 50,000세포/mL의 농도로 분화를 위해 투명 바닥 흑벽 96웰 조직 배양 처리 분석 플레이트에 접종한다. 웰 당 최종 농도 250nM의 AARS 폴리펩티드(또는 아래 실시예에 나타낸 다른 농도로)를 각 웰에 첨가한다. 지방형성 분화 배지(Cell Application Cat #811D-250)로 자극한 양성 대조군을 제외한 모든 세포를 2일 동안 성장 배지에서 유지한다. 세포를 AARS 폴리펩티드에 48시간 동안 노출시킨다. 가용성 VCAM 및/또는 ICAM을 포함하는 세포 접착 분자를 RND 시스템의 표준 ELISA 키트(각각 Cat # DY643 및 DY720)를 이용하여 측정한다. 상청액 제거 후 플레이트에 레사주린을 함유한 신선한 배지를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여 전술한 바와 같이 레사주린으로 증식을 평가한다. 플레이트를 형광 플레이트 리더 상에서 측정하고, 생활성/증식은 AARS 폴리펩티드 처리 웰의 레소루핀 연관 형광을 PBS만 처리한 웰의 레소루핀 연관 형광으로 나눈 함수로 표시한다. 신선한 배지를 첨가하고, 초기 배지 교환 후 16일 동안 세포 건강을 유지하기 위해 2일 마다 신선한 배지로 교환하면서 분화를 유지한다. 15일째에 세포에 무혈청 배지를 넣는다. 16일째에 성숙 지방세포로의 분화를 Nile Red(Invitrogen, 최종 3 μM의 농도) 염색으로 평가하고 적절한 파장을 이용한 형광 플레이트 리더로 정량한다. 상기 분석을 수행하기 위해, 세포를 10% 파라포름알데히드로 고정하고, PBS 중에 세척하고, 0.5% BSA 및 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS 중에 투과화한다. 전술한 바와 같이 1ug/mL 최종 농도로 Hoechst 염료 33432를 이용하여 형광 리더 상에서 강도 측정으로 세포 증식을 평가한다. 지방형성은 Nile Red 신호의 강도로 표시된다. Hoechst 염료 신호를 이용하여 세포 수를 평가한다.

인간 골격근 세포 분화 및 증식.

배경 및 치료적 상관성: 골격근 발달은 다능 중배엽 세포의 근모세포 생성 결정, 세포주기에서 근모세포의 배제 및 근육 세포로의 분화, 그리고 최종적으로 골격근 섬유로의 성장 및 성숙이 관여되는 다단계 절차이다. 골격근 분화에는 조절 및 구조적 근육-특이적 유전자의 유도와 함께 근모세포 정렬, 연신 및 다핵 근관으로의 융합이 관여된다. 분자 수준에서, 근육성 위탁 및 근육-특이적 유전자 발현에는 단백질의 골격근-특이적 나선-루프-나선(bHLH) MyoD 패밀리가 관여하며, MyoD, 미오게닌, myf-5, 및 MRF4, 그리고 근세포 인핸서-결합 인자 2(MEF2)가 포함된다. MyoD 패밀리 단백질의 DNA 결합 활성은 증식 세포에서 E2a 유전자 산물과 복합체를 형성하며 분화하도록 유도되는 경우 하향조절되는 Id에 의해 약화된다. 근관으로의 분화 결정은 몇몇 인자에 의해 부정적인 영향을 받는다. 소 태아 혈청, 염기성 섬유아세포 성장 인자 2, 또는 형질전환 성장 인자 β1을 이용한 근모세포의 처리는 근모세포의 분화를 저해하는 것으로 공지되어 있다. 근육발생은 또한 종양유전자, 예컨대 c-myc, c-jun, c-fos, H-ras, 및 E1a에 의해 부정적으로 조절된다. MyoD 패밀리 유전자 발현의 유도 및 근육 분화를 일으키는 혈청 제거 시 근모세포에서 유도되는 신호전달에 대해서는 거의 정보가 없다. 근육성 분화는 근모세포의 혈장막 상에 존재하는 인테그린의 활성화에 의존하는 것으로 나타나, 인테그린이 상류 분자종인 "외부에서 내부로의" 생화학적 경로의 작동을 시사한다. 인슐린-유사 성장 인자(IGF)-I 및 -II와 이들의 수용체의 상호반응은 또한 골격근 분화의 긍정적 조절제이다.

따라서 근육 발달을 조정하는 능력을 갖는 AARS 폴리펩티드는, 예를 들어 대사성 질환, 악액질, 다양한 근육 소모 상태뿐만 아니라 근 위축증이 병리 및 증후학에서 중요 역할을 수행하는 근골격 질환의 치료를 포함하는 광범위한 질환에서 치료적 유용성을 갖는다. 인간 골격근 세포(HSkMC)는 분화를 거치며 액틴 및 미오신 미오필라멘트를 나타낼 수 있다. HSkMC는 유전적 근육 질환, 예컨대 악성 고열의 연구에 이용되어 왔다. HSkMC는 또한 심장에 대한 손상을 보수하는 심장 이식물로 작용할 가능성을 가져서 근육 발달을 조정하는 능력을 갖는 AARS 폴리펩티드는 또한 근육 발달의 시험관 내 및 생체 내 조절제로서 유용성을 갖는다.

방법: 상기 절차에서 AARS 폴리펩티드의 잠재적 역할을 평가하기 위해, 골격근 세포 분화의 표준 분석을 채용하였다. 상기 분석을 위해, 인간 성인 골격근 세포(HSkMC, Cell Application Cat # 150-05f)는 수족 골격근으로부터 건강한 인간 공여자에게서 단리된다. 세포는 HSkMC 성장 배지(Cell Application, Cat # 151-500)에서 유지한다. 이들 세포는 적어도 15 모집단 더블링까지 배양 및 증식될 수 있다. 분화를 위해 세포를 1계대 동안 성장 배지에서 유지한 후 약 50,000세포/배지mL의 농도로 웰당 100㎕의 콜라겐이 처리된 96웰 투명 바닥 흑벽 TC 처리 플레이트에 접종한다. 세포를 밤새 부착시킨다. PBS 중 AARS 폴리펩티드 또는 PBS 단독을 각 웰에 최종 농도 250nM 단백질(또는 아래 실시예에 나타낸 다른 농도)로 첨가한다. 이때 대조군 웰에는 동일 부피의 분화 배지(Cell Application Cat # 151D-250)를 처리한다. 세포를 단백질 또는 분화 배지와 함께 48시간 동안 인큐베이션한다. 48시간째에 모든 웰에서 세포 배양 상청액을 수집하고, 분화 배지를 성장 배지만에 유지된 대조군 웰을 제외한 전체 플레이트에 150㎕의 부피로 첨가한다. 상청액을 이용하여 전술한 바와 같이 IL6 및 IL8을 포함하는 시토카인 생산에 대해 평가한다. 상청액 제거 후 플레이트에 레사주린을 함유한 신선한 배지를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여 전술한 바와 같이 레사주린으로 증식을 평가한다. 세포를 현미경 하에서 모니터링하고, 2일 마다 배지를 신선한 분화 배지로 교체한다. 10일째에 배지를 제거하고, 세포를 10% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정한다. 세포를 PBS 중 0.1% Triton X-100으로 15분 동안 투과화하고, 세포를 TR-표지된 팔로이딘 및 Hoechst 염료 33432(전술한 바와 같이)를 이용하여 염색하여 액틴과 핵을 각각 정의한다. 핵 강도를 이용하여 각 웰의 세포 증식을 결정하고, 팔로이딘 강도를 이용하여 전체 액틴 함량을 결정한다. 세포는 또한 알파 액틴 골격근 항체(GenTex Cat # GTX101362)로 염색한다. 모든 웰에 대해 형광 형미경을 이용한 디지털 사진뿐만 아니라 육안 검사 및 스코어링을 수행한다.

인간 골수 중간엽 줄기 분화 및 증식.

배경 및 치료적 상관성: 중간엽 줄기 세포(MSC)는 골모세포, 연골세포, 근세포, 지방세포, 베타-췌장 섬 세포 및 잠재적으로 신경 세포를 포함하는 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능 줄기 세포이다. 여러 경로로부터의 전사 인자, 보조인자 및 신호전달 중간체의 복합 네트워크의 협력을 포함하는 여러 상이한 사건이 MSC의 다른 계통으로의 위탁에 기여한다. MSC는 광범위한 급성 및 퇴화성 질환을 치료할 잠재력을 가진 세포 모집단을 나타내기 때문에, 집중적인 치료적 관심의 대상이 된다.

또한 MSC의 상이한 발달 경로로의 분화를 조정하는 능력을 갖는 AARS 폴리펩티드는 조혈, 신경발생, 근육발생, 골발생, 및 지방형성뿐만 아니라 예를 들어 염증 반응, 자가면역성, 암, 신경 퇴화, 근육 위축, 골다공증, 및 지방이상증을 포함하는 광범위한 장애 및 질환에서의 시험관 내 또는 생체 내 조정을 가능케 하는 중요한 치료적 유용성을 갖는다. 인간 MSC는 면역-격리되며, 거부 위험성 및 이식 합병증을 감소시켜 동종 이식을 위한 유리한 세포 유형을 나타낸다. 최근에는 또한 연골 및 반달연골, 힘줄 및 뼈 골절을 포함하는 인간 조직의 재생을 위한 자가 중간엽 줄기 세포의 이용에서 중요한 진전이 있었다. 여러 연구는 또한 래트에서 MI 후 심장 기능의 개선을 위해 혈관 내피 성장 인자로 전달 감염된 MSC 이식, 마우스에서 종양 내로의 인터페론-β 전달을 위한 운반체로서의 MSC 및 뼈 형성을 촉진하기 위한 BMP를 발현하는 MSC를 이용한 유전자 치료를 포함하는 유전자 치료를 위한 MSC의 이용을 연구해왔다. 따라서 직접적이고 개질된 치료제로서의 MSC에 대한 집중적 관심뿐만 아니라 생체 내 MSCs의 분화를 조절하기 위한 치료제로서 작용하는 AARS 폴리펩티드의 잠재력으로 인해, AARS 폴리펩티드를 MSC 증식 및 분화의 잠재적 유도제로서 평가하였다.

방법: hMSC(인간 골수 간질 세포)(Cell Application Cat # 492-05f)를 공급자의 지시에 따라 유지한다. 배양을 위해, 세포를 신속히 해동하고 15mL의 골수 간질 세포 성장 배지(Cell Application Cat # 419-500) 내로 바로 옮겨 표준 멸균 조직 배양 처리 플라스크 내로 접종한다. 세포가 >60% 융합성이 될 때까지 2일 마다 배지를 신선한 골수 간질 세포 성장 배지로 교체한다. 세포를 37℃, 5% CO_2, 다습 환경 하에 유지하고, 고글, 장갑 및 실험실 코트를 포함하는 적절한 개인 보호 장비 및 멸균 기법을 이용하여 BSL2 인증 조직 배양 후드에서 사용한다. 세포를 50,000세포/mL의 농도로 분화를 위해 투명 바닥 흑벽 96웰 조직 배양 처리 분석 플레이트에 접종한다. 웰 당 최종 농도 250nM(또는 아래 실시예에 나타낸 다른 농도)의 tRNA 합성효소 유도 단백질을 각각의 분석 웰에 첨가한다. 골형성 또는 연골형성 분화 배지(StemPro, Invitrogen, 각각 Cat # A10072-01 및 A10071-01)로 자극한 양성 대조군을 제외한 모든 세포를 2일 동안 성장 배지에서 유지한다. 세포를 AARS 폴리펩티드에 48시간 동안 노출시킨다. 가용성 VCAM을 RND 시스템의 표준 ELISA 키트(Cat # DY643)를 이용하여 측정한다. 상청액 제거 후 플레이트에 레사주린을 함유한 신선한 배지를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여 전술한 바와 같이 레사주린으로 증식을 평가한다. 플레이트를 형광 플레이트 리더 상에서 측정하고, 생활성/증식은 AARS 폴리펩티드 처리 웰의 레소루핀 연관 형광을 PBS만 처리한 웰의 레소루핀 연관 형광으로 나눈 함수로 표시한다. 세포 생활성의 평가 후, 레사주린을 2회 배지 교환으로 제거하고, 모든 웰에 0.5X 분화 배지를 첨가한다. 배지 교환 후 10일 동안 세포 건강을 유지하기 위해 2일 마다 신선한 배지로 교환하면서 모든 웰의 분화를 시각적으로 검사하여 모니터링한다. 최초 분화 교환 후 10일째에 ELF-97 염색(Invitrogen Cat # E6601)을 이용한 알칼린 포스파타아제 염색으로 분화를 평가했다(Yang 등, Nature Protocols (6) 187-213 (2011) doi:10.1038/nprot.2010.189).

인간 폐 동맥 평활근 세포(hPASMC) 증식 및 분화.

배경 및 치료적 상관성: 정상 인간 성인 폐 혈관에서의 폐 동맥 평활근 세포(PASMC)는 주로 휴지기이고 비이동성이며, 주로 폐에서 이들의 수축 기능을 수행하도록 위탁되어 있다. 그러나 PASMC는 최종 분화된 것이 아니며, 변화하는 국소 환경 단서에 반응하여 이들의 표현형을 조정하고 이들의 휴지 상태에서 빠져나오는 능력을 보유한다. 상기 분화 상태는 조직 필요의 변화에 반응하는 발달, 조직 손상, 및 혈관 리모델링에서 일어날 수 있다. 폐 고혈압(PH)은 증가된 혈관 긴장도 및 PASMC 수축성과 혈관 리모델링의 결과인 말초 폐 혈관 저항 증가를 포함하는 다양한 내재 상태에 연관된다. 혈관 리모델링에는 폐 소동맥(PA) 벽에서 세포-세포 및 세포-기질 상호반응의 PASMC 성장, 기질 재료 합성, 및 변형이 관여되며, 이는 혈관벽의 평활근 성분의 증가된 두께 및 보통 비근육화되는 원위 PA의 비정상적 근육화를 일으킨다. 상기 절차는 감소된 관강 지름 및 증가된 말초 저항에 기여한다. 질환의 초기 원인에 있어서 PASMC의 정확한 역할은 논란의 여지가 있지만, 일어나는 변화는 질환의 임상적 결과에 중요한 역할을 수행한다. 세포 분화 연구에서 결정적 단계는 세포의 분화 기능(들)에 기여하는 세포-특이적 또는 세포-선택적 유전자 세트를 동정하는 것이다. 혈관 SMC의 상대적 분화 또는 성숙 상태의 유용한 마커로 작용하는 다양한 평활근 세포(SMC) 유전자, 예컨대 SM 알파-액틴, SM MHC, h1-칼포닌, SM22-알파, 데스민, 메타빈쿨린, 스무텔린 등이 동정되었다. 가장 널리 이용되는 마커는 부분적으로는 상기 단백질에 대한 다수의 고친화도 및 고선택적 항체의 상업적 이용 가능성으로 인해 SM 알파-액틴이다. PASMC에서의 변화가 PASMC 성장을 지배하는 분자적 사건의 내재적 특징 또는 조절저하로부터 일어나는지 여부는 여전히 의문으로 남아 있다. 그러나 조절 단서의 결정 및 잠재적 조절저하의 관리는 폐 고혈압, 혈관 질환을 포함하는 다양한 혈관 및 폐 질환의 관리에 중요한 치료적 시야를 제공한다.

따라서 성인 인간에서 유도되는 정상 인간 PASMC의 분화 및/또는 증식을 조정하는 능력을 갖는 AARS 폴리펩티드는, 예를 들어 폐 고혈압, 만성 폐색성 폐 질환, 특발성 폐 섬유증, 및 천식을 포함하는 염증성 및 폐색성 폐 질환을 포함하는 다양한 혈관 및 폐 질환에서 치료적 유용성을 갖는다.

방법: HPASMC(Cell Application Cat # 352-05a)를 사용 전에 1계대 동안 125mL 플라스크에서 15mL 배지 중 HPASMC 성장 배지(Cell Application Cat # 352-05a)에서 유지한다. 세포를 37℃, 5% CO_2, 다습 환경 하에 유지하고, 고글, 장갑 및 실험실 코트를 포함하는 적절한 개인 보호 장비 및 멸균 기법을 이용하여 BSL2 인증 조직 배양 후드에서 사용한다. 80㎕ 부피의 세포를 50,000세포/mL의 세포 밀도로 성장 배지 중에 밤새 코팅된 콜라겐 상에 접종한다. 웰 당 최종 농도 250nM(또는 아래 실시예에 나타낸 다른 농도로)의 AARS 폴리펩티드를 각 웰로 멸균 PBS 중에 첨가한다. 대조군 웰에는 균등한 부피의 PBS만을 첨가한다. 양성 대조군 표본은 공급자가 공급하는 HPASMC 분화 배지(Cell Application Cat # 311D-250)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 48시간 동안 기본 배지(Cell Application Cat #310-470) 중 AARS 폴리펩티드 또는 PBS에 노출시킨 후 전체 플레이트에 대해 분화 배지로 배지를 교환한다. 상청액을 수집하고, 전술한 바와 같이 IL-8 및 IL-6을 포함하는 시토카인 생산을 평가하기 위해 이용한다. 상청액 제거 후 플레이트에 레사주린을 함유한 신선한 배지를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여 전술한 바와 같이 레사주린으로 증식을 평가한다. 세포를 10일 동안 2일 마다 배지를 교환하면서 모니터링한다. 세포를 상술된 바와 같은 고정 및 0.1% Triton X-100으로의 투과화 후에 항-SMA-알파 항체(GeneTex Cat #GTX101362) 및 Alexa 405 접합 이차 항체를 이용한 평활근 액틴-알파 염색에 대한 염색을 정량하여 분화를 평가한다. 증식은 세포를 30분 동안 10% 포름알데히드로 세포 고정 후 Hoechst 염색으로 평가한다. Hoechst 염료는 여기 파장(Ex) 405nm, 및 방출 파장(Em) 450nm로 바닥 리딩 형광 플레이트 리더를 이용해 측정한다. 전체 액틴 염색은 Alexa-488 표지된 팔로이딘 염색(Invitrogen Cat # A12379)을 이용해서 평가한다.

세포에 대한 AARS 폴리펩티드의 결합 분석(아래 데이터 표에서의 분석 H1-H10)

배경 및 치료적 상관성: 특정 세포 유형에 대한 AARS 폴리펩티드의 결합은 관심 세포 유형이 관심 AARS 폴리펩티드에 대한 특이적 수용체를 발현한다는 것을 나타낸다. 관심 세포 유형에 따라, 세포 결합은 세포 또는 생체 내 유사한 세포 유형의 활성 또는 거동 조절에서 AARS 폴리펩티드에 대한 잠재적 역할을 시사한다. 이러한 조절 역할의 구체예는, 예를 들어 B-세포 및 T-세포(면역조정/화학주성/자가면역성/염증); HepG2 세포(대사, 콜레스테롤 흡수 또는 대사의 조절); THP-1, Jurkat, Raji 세포(면역조정/화학주성/자가면역성/염증), 혈소판(혈소판 형성), 3T3L1 지방세포(지방형성/대사), 및 C2C12 마우스 근모세포(근육발생, 골발생)의 결합 및 조정을 포함한다.

혈액 세포로의 결합

방법: 건강한 공여자의 혈액을 EDTA 튜브에 수집한다. 2mL 전혈을 5mL Falcon FACS 튜브 내로 넣는다. 2mL의 염색 완충액(PBS + 2% FBS)을 첨가하고, 3-5초 볼텍싱하고, 300xg에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡인하고, 세척을 반복하고, 펠렛을 2mL의 염색 완충액 중에 재현탁한다.

100㎕의 세척된 혈액을 깨끗한 5mL FACS 표본 튜브로 옮긴다. His6- 또는 V5-His6-태그화된 AARS 폴리펩티드를 하기 개요된 특정 실험에 나타낸 농도로 튜브에 첨가하고, 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 상이한 세포 유형 표면 마커에 대한 항체(BD Pharmigen Cat No. 560910, 555398, 555415, 340953, 560361), 및 FITC 표지된 항-V5 태그 항체(V5-FITC, Invitrogen Cat # R96325) 또는 FITC 표지된 항-His6 항체(AbCam Cat #ab1206)를 튜브에 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 암소에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 2mL의 BD FACS 용해 용액(cat #349202)을 튜브에 첨가했다. 표본을 볼텍싱하고, 15분 동안 얼음 위에 둔다. 표본을 1x2mL PBS로 세척하고, FACS 분석 전에 PBS 중 2mL의 2% 포름알데히드 중에 재현탁했다. 25% 초과의 세포 모집단에 결합하고 항체 단독으로는 유의미한 신호를 갖지 않는 AARS 폴리펩티드는 히트로서 간주된다.

혈소판 결합 분석 : 50㎕의 세척된 혈액을 깨긋한 5mL FACS 표본 튜브로 옮기고, His6- 또는 V5-His6-태그화된 AARS 폴리펩티드를 하기에 개요한 특정 실험에 나타낸 농도로 튜브에 첨가하고, 튜브를 45분 동안 얼음 상에 둔다. 20㎕의 CD61 pan 혈소판 항체(BD Pharmigen, Cat # 555754) 및 0.5㎕ 항-V5-FITC 표지 항체(Invitrogen, R96325) 또는 FITC 표지된 항-His6 항체(AbCam Cat #ab1206)를 각각의 튜브에 첨가한다. 튜브를 얼음 위에 두고 30분 동안 빛으로부터 보호한다. 표본을 PBS 중 1% 포름알데히드 중에 2mL의 전체 부피로 채우고 24시간 내에 유세포 측정으로 분석한다. 25% 초과의 세포 모집단에 결합하고 항체 단독으로는 유의미한 신호를 갖지 않는 AARS 폴리펩티드는 히트로서 간주된다.

배양 세포에 대한 결합: 100㎕의 완전 RPMI 배지 중 대략 1x10⁶ 세포를 5mL FACS 튜브 내로 넣는다. His6- 또는 V5-His6-태그화된 AARS 폴리펩티드를 하기에 개요한 특정 실험에 나타낸 농도로 튜브에 첨가하고, 튜브를 45분 동안 얼음 상에 둔다. 세포 표본을 1mL 염색 완충액(PBS + 2% FBS)으로 2회 세척한 후, 200㎍/mL 인간 IgG를 포함하는 염색 완충액 중 FITC 표지된 항-His6 항체(AbCam Cat #ab1206) 또는 항-V5-FITC 항체(Invitrogen R96325) 0.5㎕를 첨가하고, 표본을 얼음 위에서 인큐베이션하고 30분 동안 빛으로부터 보호한다. 표본을 1mL 염색 완충액으로 2회 세척한 후, PBS 중 1% 포름알데히드 중에 2mL의 전체 부피로 채우고 24시간 내에 유세포 측정으로 분석한다. 25% 초과의 세포 모집단에 결합하고 항체 단독으로는 유의미한 신호를 갖지 않는 AARS 폴리펩티드는 히트로서 간주된다.

동물 연구: 조혈 및 순환 시토카인의 조정

배경 및 치료적 상관성: 조혈(대안적으로 혈구형성)은 혈액 세포 성분의 형성이다. 모든 세포 혈액 성분은 뼈의 수질(골수)에 존재하는 조혈 줄기 세포(HSC)에서 유도되며, 상이한 전체 성숙 혈액 세포 유형이 될 수 있는 독특한 능력을 갖는다. HSC는 자가 재생된다: 이들은 증식하는 경우, 이들 딸 세포의 적어도 일부가 HSC로서 남아서, 줄기 세포의 풀이 결핍되지 않는다. 그러나 HSC의 다른 딸(골수성 및 림프성 전구체 세포)은 각각 하나 이상의 특정 혈액 세포 유형을 만들지만 스스로는 재생할 수 없는 임의의 대안적 분화 경로로 위탁될 수 있다. 따라서 AARS 폴리펩티드에 대한 노출에 반응한 혈액 성분의 변화는 AARS 폴리펩티드가 조혈을 조정하고 조혈 줄기 세포의 발달을 조절할 수 있음을 제시한다.

모든 혈액 세포는 하기 3 계통으로 구분될 수 있다; 적혈구 세포, 림프구 및 골수구.

적혈구 세포는 산소를 운반하는 적혈구이다. 망상 적혈구 및 백혈구는 모두 기능적이며, 혈액 내로 방출된다. 따라서 망상 적혈구수로 적혈구 생성 속도를 산출하며, 적혈구수의 변화는 AARS 폴리펩티드가 적혈구 생성을 조정함을 제시한다.

림프구는 적응 면역계의 초석이다. 이들은 일반 림프구 전구체에서 유도된다. 림프구 계통은 일차적으로 T-세포 및 B-세포(백혈구 유형)로 이루어진다. 따라서 AARS 폴리펩티드로의 노출에 반응한 백혈구의 수 또는 조성의 변화는 AARS 폴리펩티드가 림프구형성을 조정함을 제시한다.

과립구, 거핵구 및 대식구를 포함하며 일반 골수성 전구체에서 유도하는 골수구는 선천성 면역, 적응 면역 및 혈액 응고를 포함하는 다양한 역할에 관여된다. 따라서 AARS 폴리펩티드에 대한 노출에 반응한 골수성 세포의 수 또는 조성의 변화는 AARS 폴리펩티드가 골수형성을 조정함을 제시한다. AARS 폴리펩티드로의 노출에 반응한 과립구 수의 변화를 측정함으로써 AARS 폴리펩티드가 과립구형성을 조정하는지 여부를 확립하는데 동일한 논리가 이용될 수 있다. 거핵구형성 조정에서의 AARS 폴리펩티드의 역할은 혈액 중 거핵구 또는 혈소판의 조성 또는 수의 변화로 참조될 수 있다.

야생형 마우스, 또는 염증의 다양한 동물 모델 시스템에서의 시토카인 방출은 염증성 반응을 조정하는 AARS 폴리펩티드의 잠재적 능력의 초기 평가를 제공한다. 예를 들어 급성 만성 염증성 절차 조정에서의 AARS 폴리펩티드의 역할은 식사 유도 비만(DIO)의 마우스 모델을 이용하여 쉽게 평가될 수 있다. DIO 모델은 몇달 동안 고지방 식사에 설치류를 배치하는 것에 기반하여 증가된 비만, 인슐린 내성 및 면역계 기능부전을 일으킨다. 상기 면역계 조절부전의 특정 결과로 DIO 동물에서 전염증성 시토카인 생산이 증가되어 만성 전신성 염증 상태로 이어진다. 낮은 등급의 염증이 대사 증후군으로 명명된 인간 상태에서 유사하게 관찰되는 비만 및 당뇨병성 표현형의 발생 및 유지에 기여함을 제시하는 증거가 계속 증가하고 있다. 이처럼, 면역계를 조정하고 상기 만성 염증성 상태의 해결을 향한 항상성 균형을 복귀시키는 AARS 폴리펩티드의 능력은 대사적 질환, 당뇨병, 심혈관계 질환, 동맥경화증, 비만뿐만 아니라, 예를 들어 다발성 경화증, 혈관 및 알러지성 장애를 포함하는 다양한 자가면역 질환 및 장애의 증상 및 부작용의 치료 및 예방을 비제한적으로 포함하는 여러 질환 및 장애에서 특히 유익할 것이다.

방법: 웅성 야생형 대조군(C57BL/6) 또는 식사 유도된 비만 마우스(C57BL/6NHsd)를 Harlan(Indianapolis, IN)에서 구매하고 개별 수용한다. DIO 마우스에게는 고지방 식사(Cat. #TD.06414-지방으로부터 60% kcal)를 제공하고 대조군 마우스에게는 정상 식사(Cat. #2018S-지방으로부터 18% kcal)를 제공한다. DIO 마우스는 총 10주 동안 6주령부터 시작해서 고지방 식사에 배치한다. DIO 및 대조군 마우스 모두 자유롭게 식사 및 음용하게 둔다. 16주령째에 마우스를 정렬하여, 체중에 근거해 무작위로 5 동물군으로 나눈다. 2일째에, 마우스를 칭량하고 치료 전 전혈수(CBC) 분석을 위해 꼬리 정맥에서 채혈한다(100㎕). 1일째에, 마우스를 칭량하고, 운반체(PBS) 또는 개별 AARS 폴리펩티드 10mg/kg을 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사한다. 주입 4시간 후, 후속 시토카인 분석을 위해 마우스의 안면 정맥에서 채혈한다(150-200㎕). 2, 3, & 4일째에, 1일째와 마찬가지로 마우스에 정맥내 투여한다. 5일째에 마우스를 칭량하고, 희생시키고, 심장 천자에 의해 전혈수 분석(CBC 분석)(혈장-EDTA) 및 시토카인 검사(혈청)를 위한 혈액을 수집한다.

CBC 및 시토카인 분석: 전혈수를 주입 전(-2일) 및 최종 주입 24시간 후(5일) 혈액 인취물로부터 분석한다. 전체 백혈구수 및 전체 적혈구 형태에 대해 CBC 값을 평가한다. 백혈구는 또한 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구 & 호염기구의 전체 및 분획 백분율로 특징분석한다. 적혈구 분해는 헤모글로빈(dL), 적혈구 용적율(%), 평균 혈구 부피(fL), 평균 혈구 헤모글로빈, 평균 혈구 헤모글로빈 농도(%), 및 전체 혈소판수(10³/㎕) 측정을 포함한다. CBC 분석은 Antech Diagnostics(Fishers, IN)에서 수행한다.

순환 시토카인 수준은 주입 4시간 후(1일) 및 최종 주입 24시간 후(5일)에 검사한다. 혈청을 단리하고, 급속 냉동하여 다분석물 감정을 위해 Rules Based Medicine(Austin, TX)으로 보낸다. 혈청 표본은 Apo A-1, CD40, CD40-L, CRP, ET-1, 에오택신, EGF, 인자 VII, 피브리노겐, FGF-9, 염기성 FGF, GST-α, GCP-2, GM-CSF, KC/GROα, 햅토글로빈, IgA, IFNγ, IP-10, IL-1α, IL-1β, IL-10, IL-11, IL-12p70, Il-17A, IL-18, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, LIF, 림포택틴, M-CSF-1, MIP-1α, MIP-1β, MIP-1γ, MIP-2, MIP-3β, MDC, MMP-9, MCP-1, MCP-3, MCP-5, MPO, 미오글로빈, SAP, SGOT, SCF, RANTES, TPO, 조직 인자, TIMP-1, TNF-α, VCAM-1, VEGF-A, 및 vWF를 포함하는 59개의 독특한 바이오마커를 포함하는 RodentMap 패널을 이용해서 분석한다. 시토카인 수준의 변화는 시토카인이 운반체 대조군에 비해 적어도 2배 증가하거나 적어도 50% 감소하는 경우 히트로서 계수하였다.

실시예 1

단백질 형태검사 및 이동 분석 플랫폼을 이용한 AARS 의 단백분해 단편 및 대안적 스플라이싱 산물의 동정

세포주, 조건화 배지 및 조직으로부터 AARS 단편을 동정하기 위해, 표본을 하기 방식으로 제조한다:

마우스 대식구(RAW 264.7), 세포질 및 조건화 배지: 세포를 15x10⁶세포/플라스크의 밀도로 무혈청 DMEM 배지로 처리한다. 48시간 후, 조건화 배지 및 세포 펠렛을 수집하여 처리한다. 세포질 프로테옴 분획 및 분비된 단백질 200㎍을 SDS-PAGE로 분리하고, 겔 조각을 질량 분광측정에 의한 분석을 위해 제조한다.

마우스 췌장 조직: 3마리 마우스의 췌장을 다져서 던스 호모게나이즈하고, 프로테아제 저해제가 포함된 PBS 중에 소니케이션한다. 세포질 프로테옴을 원심분리로 단리하고, 단백질 200㎍을 SDS-PAGE로 분리하고, 겔 조각을 질량 분광측정에 의한 분석을 위해 제조한다.

마우스 간 조직: 3마리 마우스의 간을 다져서 던스 호모게나이즈하고, 프로테아제 저해제가 포함된 PBS 중에 소니케이션한다. 세포질 프로테옴을 원심분리로 단리하고 단백질 200㎍을 SDS-PAGE로 분리하고, 겔 조각을 질량 분광측정에 의한 분석을 위해 제조한다.

겔내 분해물을 ultimate 3000μLC 시스템(Dionex)이 장착된 LTQ XL 이온 트랩 질량 분광측정기(ThermoFisher)로 분석한다. 표본을 먼저 10분 동안 Dionex 오토샘플러를 이용하여 0.1% 포름산 중 5% 아세토니트릴로 PepTrap(michrom) 상에 로딩한다. 이어서 표본을 10cm의 C18 수지(michrom)를 함유한 100㎛(내경) 용융 실리카 모세관 컬럼으로 분석한다. 펩티드를 110분 내에 0.1% 포름산 중 5-33.5% 아세토니트릴의 선형 구배를 이용하여 0.45㎕/분의 유속으로 질량 분광측정기 내 컬럼에서 용출한다.

LTQ는 1개의 전체 MS 스캔에 7가지 가장 풍부한 이온의 7개 MS/MS 스캔이 뒤따르는 데이터-의존적 스캐닝 방식으로 작동한다. 반복 카운트 1, 반복 기간 20초, 배제 목록 크기 300 및 배제 기간 60초로 동적 배제를 활성화한다.

LC-MS/MS 분석 후, 원데이터를 마우스 IPI 데이터베이스의 콘카테네이트화 표적/디코이 변이체를 이용하여 BioWorks3.3.1(SEQUEST)에서 검색한다. SEQUEST 데이터를 DTASelect로 필터링 및 정렬한다. 표 1, 4 및 7은 이러한 방식으로 동정된 서열을 나타낸다.

실시예 2

심층 서열분석을 이용한 스플라이스 변이체의 동정

아미노아실 tRNA 합성효소의 스플라이스 변이체를 아미노아실 tRNA 합성효소 전사체에 대해 농축된 cDNA 라이브러리의 고처리량 서열분석을 이용하여 동정한다. cDNA 주형은 조직, 예컨대 인간 성인 및 태아 뇌의 전체 RNA 추출물에서 제조하고, 설명된 모든 인간 아미노아실 tRNA 합성효소 및 이들의 연관된 단백질의 모든 설명된 엑손에 특이적인 프라이머 서열을 이용하여 아미노아실 tRNA 합성효소 전사체에 대해 농축한다.

인간 전체 RNA는 Clontech에서 입수한다. 세포주 및 마우스 조직 표본에 있어서, 전체 RNA는 RNA 추출 II 키트(MN)를 이용해 추출한다. 게놈 DNA는 DNAase I에 의해 전체 RNA 표본에서 소화시킨다. 성숙 메신저 RNA(mRNA)를 수득하기 위해, RNA 표본은 5'-포스페이트 의존적 엑소뉴클레아제에 의해 5'-캡이 없는 RNA 소화 및 폴리 A+ RNA 결합에 의해 2배 농축한다. 상보적 DNA(cDNA)는 아미노아실 tRNA 합성효소 유전자의 엑손 서열에 어닐링하는 프라이머를 이용해서 성숙 RNA에서 합성한다. 아미노아실 tRNA 합성효소 유전자에 대해 농축된 트랜스크립톰은 아미노아실 tRNA 합성효소-엑손 특이적 cDNA 및 상이한 조합의 아미노아실 tRNA 합성효소-엑손 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR에 의해 증폭한다. 이중쇄 아미노아실 tRNA 합성효소-농축 트랜스크립톰 PCR 산물은 복구된 단편의 3' 말단에 A-오버행을 첨가하기 전에 양단에서 효소적으로 복구된다. 이어서 서열분석 어댑터 및 인덱스 서열을 아미노아실 tRNA 합성효소-농축 트랜스크립톰 PCR 산물에 추가하여 Illumina의 멀티플렉스 서열분석 키트를 이용한 심층 서열분석용 cDNA 라이브러리를 생성한다. 요약하면, 3'-A 오버행을 갖는 아미노아실 tRNA 합성효소-농축 트랜스크립톰 PCR 산물을 키트에 제공되는 InPE 어댑터 올리고뉴클레오티드에 결찰한다. 인덱스 서열을 InPE 어댑터를 갖는 PCR 산물에 추가한다. 심층 서열분석을 위한 충분한 DNA 단편을 수득하기 위해, 인덱스 서열을 갖는 PCR 산물을 또한 PCR로 증폭한다. 상이한 인덱스를 갖는 아미노아실 tRNA 합성효소-농축 cDNA 라이브러리를 풀링하고 Illumina DNA 서열분석기를 이용해 서열분석하여 50 염기 쌍 말단을 읽는다. 서열분석 측정을 대안적 스플라이싱 사건의 동정을 위해 인간 또는 마우스 게놈에 맵핑한다. "Splicemap" 소프트웨어(http://www-stat.stanford.edu/~kinfai/SpliceMap/ 에서 공개 다운로드받을 수 있음)를 이용하여 스플라이스 결찰부를 동정한다.

이들 cDNA의 심층 서열분석을 수행하여 약 50 뉴클레오티드 길이의 약 백만개의 서열분석 측정부를 생성한다. 아미노아실 tRNA 합성효소의 엑손에 특이적인 서열을 설명된 엑손 결찰부에 대해 검색하고, 새로운 엑손 결찰부를 대안적 스플라이싱 사건으로 동정한다.

표 2, 5, 및 8에서 "5' 엑손" 및 "3' 엑손"으로 표지된 단은 존재하는 경우 어느 엑손이 cDNA 서열에서 함께 융합되는지를 나타낸다. 표 2, 5, 및 8은 대안적 스플라이스 사건에 대해 동정된 서열, 이러한 스플라이스 사건을 함유하는 전사체, 및 이들 전사체에 의해 발현되는 폴리펩티드를 나타낸다. 심층 서열분석으로 동정된 대안적 스플라이스 변이체는 표 2, 5 및 8에서 인간 성인 또는 태아 뇌에서 "서열분석 측정부"로 표지된 단에서 0을 초과하는 수로 나타낸 것으로 동정된다.

실시예 3

바이오인포마틱스를 이용한 AARS 폴리펩티드의 동정

AARS 단백질 단편(리섹틴 또는 아펜다크린 펩티드)을 바이오인포마틱스를 이용해 동정한다. 전장 인간 아미노아실 tRNA 합성효소의 아미노산 서열을 프로그램, 예컨대 FASTA(http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi 웹사이트에서 이용 가능) 또는 NCBI의 BLASTP 프로그램( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthom 웹사이트에서 이용 가능)을 이용해 박테리아 대장균으로부터 그 오르쏘로그의 전장 아미노산 서열과 정렬한다. 인간 단백질의 리섹틴 서열은 정렬에서 박테리아 서열에 갭이 있는 영역 또는 두 종 사이 낮은 상동성을 갖는 영역을 포함하는 서열로서 동정된다. 표 3, 6 및 9의 펩티드, 및 대응 DNA 서열은 이러한 방식으로 동정된 예를 포함한다.

실시예 4

질량 분광측정에 의해 동정된 AARS 폴리펩티드의 상이한 발현

실시예 1에 기재된 바와 같은 PROTOMAP 기법을 이용하여 상이한 조직/세포 유형에서 아스파르틸 tRNA 합성효소의 상이한 서열을 비교한다(서열 및 비교를 위해서는 표 1, 4, 및 7 참고): 아미노아실-tRNA 합성효소 리섹틴 발현을 마우스 간 조직 및 마우스 췌장 조직 간에 비교한다. 아미노아실-tRNA 합성효소 리섹틴 발현을 RAW264.7의 세포질 및 혈청 결핍 48시간 후 수확한 RAW264.7 세포의 조건화 배지 간에 비교한다.

실시예 5

심층 서열분석에 의해 동정된 AARS 폴리펩티드의 상이한 발현

스플라이스 사건의 상이한 발현에 대해 평가하기 위해, 상이한 조직에서 제조된 cDNA에 대한 심층 서열분석을 수행한다.

아미노아실 tRNA 합성효소에 대한 특이적인 대안적 스플라이스 사건의 발현은 예상되지 않으며, 생물학적 중요성을 나타낸다. 상이한 트랜스크립톰 표본의 심층 서열분석에서 나타나는 측정부의 상대적 수의 변화는 아미노아실 tRNA 합성효소의 대안적 스플라이스 사건이 단지 표본 취급에 따른 인공적인 것이 아니라 상이하게 조절되는 것임을 시사한다.

실시예 6

항체 스크리닝

특정 아미노아실 tRNA 합성효소 단편에 대한 선호적 결합(예로 부모 전장 효소에 대비할 때 ≥10배 더 높은 친화도)을 나타내는 항체 발견을 촉진하기 위해, 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 친화도 농축 기법(패닝)을 이용하여 AbD Serotec(MORPHOSYS™의 지부, Martinsried/Plangg, Germany)에서 스크리닝한다. 아미노아실 tRNA 합성효소 단편을 이용한 다회 스크리닝 후 농축된 항체를 단편 및 부모 전장 효소에 대한 반응성에 대해 ELISA로 후속 특징분석한다. 아미노아실 tRNA 합성효소 단편에 대해 선호적 결합(예로 ≥10배 더 높은 친화도)을 나타내는 클론을 추가 특징분석한다.

상기 공정의 말기에 필요한 특이성이 획득되지 않은 경우, 제거 전략, 예컨대 전장 효소에 대한 전-흡착 단계 및/또는 카운터-스크리닝을 이용하여 교차 반응 항체를 제거하고 선택 공정을 아미노아실 tRNA 합성효소 단편 상의 독특한 에피토프(들)에 대해 유도한다.

실시예 7

체계적 PCR을 이용한 스플라이스 변이체의 동정

PCR 반응을 위한 cDNA 주형을 조직 또는 세포(예로, 인간 뇌, IMR-32 및 HEK293T)의 전체 RNA 추출물에서 역전사한다. 아미노아실 tRNA 합성효소 특이적 프라이머, 유전자의 5' 절반에서 5' 미번역 영역 또는 엑손에 어닐링하도록 설계된 쌍 형성 전방 프라이머(FP1)와 유전자 또는 3' UTR의 3' 절반에서 엑손에 어닐링하도록 설계된 역위 프라이머(RP1)를 이용하여 PCR 반응을 수행한다. 증폭된 DNA 산물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하여 정규 전사체에서 증폭된 단편과 상이한 크기를 갖는 PCR 산물을 동정한다. 이들 상이한 PCR 산물을 절단하고 겔에서 정제하여 DNA 서열 분석을 위해 표준 클로닝 벡터로 결찰한다. 대안적 스플라이싱 변이체가 정규 전사체와 상이한 서열로 동정된다. 이러한 체계적 PCR 접근법으로 동정된 스플라이스 변이체를 표 2, 5 및 8에 나타낸다.

실시예 8

선택된 AARS 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화

대표적인 AARS 폴리펩티드(표 E2에 요약함)는 하나 이상의 하기 요건에 기반하여 추가적인 생화학적, 생물리적 및 기능적 특징분석을 위해 선택된다: i) AARS 폴리펩티드 단백분해 단편의 동정, ii) AARS 폴리펩티드 스플라이스 변이체의 동정, iii) 바이오인포마틱 분석에 의한 AARS 폴리펩티드의 동정, iv) 특정 AARS 폴리펩티드의 상이한 발현의 증거, v) AARS 단백질의 도메인 구조, vi) AARS 폴리펩티드의 크기, 및 vii) 유사한 중복 서열의 최소화.

적절한 N 또는 C-말단 에피토프 태그와 함께 표 E2에 열거된 선택된 AARS 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 표 E2에 열거된 유전자 합성 방법론을 이용하여 일반적 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 합성 및 클로닝한다.

실시예 9

작은 스케일의 박테리아 발현 및 정제

표 E2에 열거된 AARS 폴리펩티드를 일반적 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 대장균에서 발현한다. 가용성 및 봉입체에 국소화된 AARS 폴리펩티드의 상대적 발현은 아래 표 E3에 요약한다.

놀랍게도, 단백질 발현 데이터는 대장균에서 발현되는 경우 가용성 단백질의 고수준 발현을 나타내는 적어도 하나의 단백질 도메인 패밀리의 존재를 드러낸다. 구체적으로 데이터는 AARS 폴리펩티드 AspRS1^N3(아미노산 1-224), 및 AspRS1^N4(아미노산 1-184)가 대장균에서 고발현되는 최초의 신규한 단백질 도메인의 경계를 정의한다는 것을 나타낸다. 부가적으로 다수의 나머지 단백질이 후속 재폴딩을 위해 봉입체 내에서 쉽게 발현될 수 있었다.

실시예 10

AARS 폴리펩티드의 큰 스케일의 제조

대표적인 AARS 폴리펩티드를 추가적인 기능적 및 생물리적 특징분석을 가능케 하기 위해 더 다량으로 제조한다. 표 E4에 열거된 AARS 폴리펩티드를 일반적 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 큰 스케일의 배양으로 대장균에서 발현한다. 발현되는 각각의 가용성 단백질에 대한 수율 및 특정된 생물리적 특징을 표 E4에서 아래에 요약한다.

이들 연구 결과는 AARS 단백질의 AspRS1^N4 및 AspRS1^I3 패밀리로부터의 대표적인 AARS 단백질이 상당한 초기 단백질 발현 수율 및 용해도 특징을 나타냄을 확립한다.

실시예 11

대표적인 AARS 폴리펩티드의 전사 감정

유전자 발현을 조정하는 AARS 폴리펩티드의 능력에 대해 평가하기 위해, 선택된 AARS 폴리펩티드를 표 E5에 나타낸 농도 및 시간 동안 중간엽 줄기 세포 또는 인간 골격근 세포와 인큐베이션하였다.

표 E5에서, 각 단에서의 수는 일반적 방법 섹션에 기재된 바와 같이 대조군 표본에 비해 적어도 4배 긍정적으로 또는 부정적으로 조정된 유전자의 수를 나타낸다. 데이터는 평가된 특정 형태의 AARS 폴리펩티드가 전사를 조절하는, 따라서 중간엽 줄기 세포(MSC) 및/또는 인간 골격근 세포(HSkMC)에 첨가되는 경우 발달 운명 또는 분화 상태를 잠재적으로 조정하는 놀라운 능력을 가지는 것을 나타난다. 표에 진한 수로 나타낸 음영을 넣은 세포는 AARS 폴리펩티드가 표에 나타낸 시간 및 세포주에서 유전자 전사의 조절에 유의미한 영향을 나타내는 예를 나타낸다.

AspRS1^N2, AspRS1^N3, AspRS1^N4, AspRS1^N6, AspRS1^N7, AspRS1^N8, AspRS1^N9, AspRS1^C1, AspRS1^C2, AspRS1^I1, AspRS1^I2, 및 AspRS1^I3은 중간엽 줄기 세포 및/또는 인간 골격근 세포 유전자 발현의 주요 조절제인 것으로 보인다고 결론지워진다.

실시예 12

AARS 폴리펩타이드의 기능적 프로파일링

표현형 프로세스의 범위를 조절하는 AARS 폴리펩타이드의 능력을 시험하기 위해, 선택된 AARS 폴리펩타이드는 일반적인 방법 섹션, 및 표 E5 및 E6에서 제공된 세포 유형 및 조건으로 인큐베이팅되었다.

결론적으로, AspRS1^N2, AspRS1^N3, AspRS1^N4, AspRS1^N6, AspRS1^N7, AspRS1^N8, AspRS1^N9, AspRS1^C1, AspRS1^C2, AspRS1^I1, 및 AspRS1^I3은 증식, 분화, 사이토킨 방출, 호중구 활성화, 아세틸화된 LDL 섭취, 세포 접착 및 주화성의 주요 조절자인 것으로 보인다. 주석 중에서, 많은 경우에, N 및 C-말단 융합 단백질은 전사 프로파일링 실험에서, 뿐만 아니라 표현형 스크리닝 실험에서 활성의 차등 패턴을 갖는다는 것이 있다. 이러한 데이타는, 이들 AARS 폴리펩타이드에 대해, 신규 생물학적 활성은 AARS 폴리펩타이드는 온전한 tRNA 신테타아제의 일부일 때 억제되거나 다른 단백질에 말단에서 번역적으로 융합되지만, 이러한 생물학적 활성은, AARS 폴리펩타이드가 유리 아미노 또는 카복시 말단을 가질 때 드러난다는 가설과 일치한다.

전사 프로파일링 연구의 맥락에서 볼 때, 표현형 스크리닝 데이타의 증명에 따르면, AARS 폴리펩타이드 AspRS1^N2 (아미노산1-274), AspRS1^N3 (아미노산1-224), 및 AspRS1^N4 (아미노산1-184)은 표현형 스크리닝 검정의 넓은 어레이에서 고활성인 제1 신규 단백질 도메인의 경계를 마련한다.

따라서 결론적으로, 아스파르틸 tRNA 신테타아제의 아미노산 1-274을 포함하는 AARS 폴리펩타이드는 i) 고기능 활성이고, ii) 쉽게 만들어질 수 있고 대장균에서 생성될 수 있고, iii) 양호한 단백질 안정성 및 응집 특성을 보여주는 제1 신규의 고활성 AARS 폴리펩타이드 도메인의 근접 경계 (즉, 약 +/- 5 아미노산 내)를 마련한다. 당해분야의 숙련가에 의해 인식되는 바와 같이, 아스파르틸 tRNA 신테타아제의 제1의 274개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 크기에 대해 아스파르틸 tRNA 신테타아제의 제1의 184개 아미노산 정도만을 포함하는 어떤 AARS 폴리펩타이드는 기재된 특이적 AARS 폴리펩타이드의 기능적 동등물을 나타낸다.

또한 표현형 스크리닝 데이타의 증명에 따르면, AARS 폴리펩타이드 AspRS1^N6 (아미노산 1-41 + 73-501), AspRS1^N7 (아미노산 1-141 + 189-501), AspRS1^N8 (아미노산1-319 + 369-501)는 표현형 스크리닝 검정의 넓은 어레이에서 고활성인 신규 대안적으로 스플라이스된 단백질 도메인의 제2 세트의 경계를 의미한다. 따라서 결론적으로, 상기 기재된 AARS 폴리펩타이드는 고기능 활성이고, ii) 쉽게 만들어질 수 있고 대장균에서 생성될 수 있고, iii) 양호한 단백질 안정성 및 응집 특성을 나타내는 대안적으로 스플라이스된 단백질의 제2의 신규 세트의 근접 경계 (즉, 약 +/- 5 아미노산 내)를 마련한다.

또한 표현형 스크리닝 데이타의 증명에 따르면, AARS 폴리펩타이드 AspRS1^N9 (아미노산 1-22 + 63 aa)는 표현형 스크리닝 검정의 넓은 어레이에서 고활성인 제3 신규 단백질 도메인의 경계를 마련한다. 따라서 결론적으로, 아스파르틸 tRNA 신테타아제의 아미노산 1-22 (플러스 대안적으로 스플라이스된 서열의 최대 약 63개 아미노산)을 포함하는 AARS 폴리펩타이드는 i) 고기능 활성이고, ii) 쉽게 만들어질 수 있고 대장균에서 생성될 수 있고, iii) 양호한 단백질 안정성 및 응집 특성을 보여주는 제3 신규의 고활성 AARS 폴리펩타이드 도메인의 근접 경계 (즉, 약 +/- 5 아미노산 내)를 마련한다. 당해분야의 숙련가에 의해 인식되는 바와 같이, 최대 부가 63개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 아스파르틸 tRNA 신테타아제의 아미노산 1-22 만큼만 포함하는 어떤 AARS 폴리펩타이드는 기재된 특이적 AARS 폴리펩타이드의 기능적 동등물을 나타낸다.

또한 표현형 스크리닝 데이타의 증명에 따르면, AARS 폴리펩타이드 AspRS1^C1 (아미노산 297-501)는 표현형 스크리닝 검정의 넓은 어레이에서 고활성인 제4 신규 단백질 도메인의 경계를 마련한다.

따라서 결론적으로, 아스파르틸 tRNA 신테타아제의 아미노산 297-501을 포함하는 AARS 폴리펩타이드는 i) 고기능 활성인, ii) 쉽게 만들어질 수 있고 대장균에서 생성될 수 있고, iii) 양호한 단백질 안정성 및 응집 특성을 보여주는 제4 신규의 고활성 AARS 폴리펩타이드 도메인의 근접 경계 (즉, 약 +/- 5 아미노산 내)을 마련한다.

또한 표현형 스크리닝 데이타의 증명에 따르면, AARS 폴리펩타이드 AspRS1^C2 (아미노산 101-501)는 표현형 스크리닝 검정의 넓은 어레이에서 고활성인 제5 신규 단백질 도메인의 경계를 마련한다. 따라서 결론적으로, 아스파르틸 tRNA 신테타아제의 아미노산 101-501를 포함하는 AARS 폴리펩타이드는 i) 고기능 활성이고, ii) 쉽게 만들어질 수 있고 대장균에서 생성될 수 있고, iii) 양호한 단백질 안정성 및 응집 특성을 보여주는 제5 신규의 고활성 AARS 폴리펩타이드 도메인의 근접 경계 (즉, 약 +/- 5 아미노산 내)를 마련한다.

또한 표현형 스크리닝 데이타의 증명에 따르면, AARS 폴리펩타이드 AspRS1^I1 (아미노산 38-292)는 표현형 스크리닝 검정의 넓은 어레이에서 고활성인 제6 신규 단백질 도메인의 경계를 마련한다. 따라서 결론적으로, 아스파르틸 tRNA 신테타아제의 아미노산 38-292를 포함하는 AARS 폴리펩타이드는 i) 고기능 활성이고, ii) 쉽게 만들어질 수 있고 대장균에서 생성될 수 있고, iii) 양호한 단백질 안정성 및 응집 특성을 보여주는 제6 신규의 고활성 AARS 폴리펩타이드 도메인의 근접 경계 (즉, 약 +/- 5 아미노산 내)를 마련한다.

또한 표현형 스크리닝 데이타의 증명에 따르면, AARS 폴리펩타이드 AspRS1^I3 (아미노산 23-154)는 표현형 스크리닝 검정의 넓은 어레이에서 고활성인 제7 신규 단백질 도메인의 경계를 마련한다. 따라서 결론적으로, 아스파르틸 tRNA 신테타아제의 아미노산 38-292를 포함하는 AARS 폴리펩타이드는 i) 고기능 활성이고, ii) 쉽게 만들어질 수 있고 대장균에서 생성될 수 있고, iii) 양호한 단백질 안정성 및 응집 특성을 보여주는 제7 신규의 고활성 AARS 폴리펩타이드 도메인의 근접 경계 (즉, 약 +/- 5 아미노산 내)를 마련한다.

<110> ATYR PHARMA, INC. PANGU BIOPHARMA LIMITED <120> INNOVATIVE DISCOVERY OF THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, AND ANTIBODY COMPOSITIONS RELATED TO PROTEIN FRAGMENTS OF ASPARTYL-tRNA SYNTHETASES <130> IPA120929 <150> US 61/363,583 <151> 2010-07-12 <150> US 61/363,586 <151> 2010-07-12 <150> US 61/363,589 <151> 2010-07-12 <160> 105 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 aggaggtaaa acatatgcat catcatcatc atcacggtaa gcctatccct aaccctttgc 60 tcggtctcga ttctacg 77 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 taatgactcg ag 12 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 aggagataaa acatatg 17 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 aggaggtaaa acat 14 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 aggagataaa acat 14 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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gagagcattg tggatgtaga aggtgttgtg 360 agaaaagtga atcagaaaat tggaagctgt acacagcaag acgttgagtt acatgttcag 420 aagatttatg tgatcagttt ggctgaaccc cgtctgcccc tg 462 <210> 14 <211> 274 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Pro Ser Ala Ser Ala Ser Arg Lys Ser Gln Glu Lys Pro Arg Glu 1 5 10 15 Ile Met Asp Ala Ala Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Arg Tyr Gly Ile Ser 20 25 30 Ser Met Ile Gln Ser Gln Glu Lys Pro Asp Arg Val Leu Val Arg Val 35 40 45 Arg Asp Leu Thr Ile Gln Lys Ala Asp Glu Val Val Trp Val Arg Ala 50 55 60 Arg Val His Thr Ser Arg Ala Lys Gly Lys Gln Cys Phe Leu Val Leu 65 70 75 80 Arg Gln Gln Gln Phe Asn Val Gln Ala Leu Val Ala Val Gly Asp His 85 90 95 Ala Ser Lys Gln Met Val Lys Phe Ala Ala Asn Ile Asn Lys Glu Ser 100 105 110 Ile Val Asp Val Glu Gly Val Val Arg Lys Val Asn Gln Lys Ile Gly 115 120 125 Ser Cys Thr Gln Gln Asp Val Glu Leu His Val Gln Lys Ile Tyr Val 130 135 140 Ile Ser Leu Ala Glu Pro Arg Leu Pro Leu Gln Leu Asp Asp Ala Val 145 150 155 160 Arg Pro Glu Ala Glu Gly Glu Glu Glu 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atcagaaaat tggaagctgt acacagcaag acgttgagtt acatgttcag 420 aagatttatg tgatcagttt ggctgaaccc cgtctgcccc tgcagctgga tgatgctgtt 480 cggcctgagg cagaaggaga agaggaagga agagctactg ttaaccagga tacaagatta 540 gacaacagag tcattgatct taggacatca actagtcagg cagtcttccg tctccagtct 600 ggcatctgcc atctcttccg agaaacttta attaacaaag gttttgtgga aatccaaact 660 cctaaaatta tttcagctgc cagtgaagga ggagccaatg tttttactgt gtcatatttt 720 aaaaataatg catacctggc tcagtcccca cagctatata agcaaatgtg catttgtgct 780 gattttgaga aggttttctc tattggacca gtattcagag cg 822 <210> 16 <211> 224 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Pro Ser Ala Ser Ala Ser Arg Lys Ser Gln Glu Lys Pro Arg Glu 1 5 10 15 Ile Met Asp Ala Ala Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Arg Tyr Gly Ile Ser 20 25 30 Ser Met Ile Gln Ser Gln Glu Lys Pro Asp Arg Val Leu Val Arg Val 35 40 45 Arg Asp Leu Thr Ile Gln Lys Ala Asp Glu Val Val Trp Val Arg Ala 50 55 60 Arg Val His Thr Ser Arg Ala Lys Gly Lys Gln Cys Phe Leu Val Leu 65 70 75 80 Arg Gln Gln Gln Phe Asn Val Gln Ala Leu Val 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ccaggctctt gtggcggtgg gagaccatgc aagcaagcag 300 atggttaaat ttgctgccaa catcaacaaa gagagcattg tggatgtaga aggtgttgtg 360 agaaaagtga atcagaaaat tggaagctgt acacagcaag acgttgagtt acatgttcag 420 aagatttatg tgatcagttt ggctgaaccc cgtctgcccc tgcagctgga tgatgctgtt 480 cggcctgagg cagaaggaga agaggaagga agagctactg ttaaccagga tacaagatta 540 gacaacagag tcattgatct taggacatca actagtcagg cagtcttccg tctccagtct 600 ggcatctgcc atctcttccg agaaacttta attaacaaag gttttgtgga aatccaaact 660 cctaaaatta tt 672 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Ile Gly Ser Cys Thr Gln Gln Asp Val Glu Leu His Val Gln Lys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 81 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Ile Tyr Val Ile Ser Leu Ala Glu Pro Arg Leu Pro Leu Gln Leu Asp 1 5 10 15 Asp Ala Ile Arg Pro Glu Val Glu Gly Glu Glu Asp Gly Arg Ala Thr 20 25 30 Val Asn Gln Asp Thr Arg Leu Asp Asn Arg Val Ile Asp Leu Arg Thr 35 40 45 Ser Thr Ser Gln Ala Ile Phe Arg Leu Gln Ser Gly Ile Cys His Leu 50 55 60 Phe Arg Glu Thr Leu Ile Asn Lys Gly Phe 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polynucleotide <400> 105 ggatcctcga tgatccagtc acaagagaaa ccagatcgtg tgctggtccg tgttcgtgac 60 ctgaccatcc agaaagcgga tgaagttgtt tgggtccgtg ctcgtgttca tacaagccgt 120 gccaaaggca aacagtgctt cctggttctg cgtcaacagc agtttaacgt tcaggccctg 180 gtagccgttg gtgatcacgc ctcaaaacaa atggtgaaat tcgccgccaa catcaacaaa 240 gagagcatcg tcgacgttga aggtgtcgtc cgtaaagtga atcagaaaat cggctcctgt 300 acacagcaag atgtggagct gcatgtccaa aaaatctatg tcatctcact ggccgaacct 360 cgtctgcctc tgctcgag 378

Claims (125)

1. 서열번호 16 또는 14와 적어도 98% 동일하고 서열번호 16 또는 14의 220개 이상의 인접한 아미노산인, 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함하는, 염증성 장애, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 1형 및 2형 당뇨병, 대사 증후군, 또는 혈관 질환의 치료를 위한 치료 조성물로서,
   상기 폴리펩타이드는 세포외 신호전달 활성을 가지고 적어도 5 mg/mL의 용해도를 가지며, 상기 조성물은 단백질 기준으로 적어도 95%의 순도 및 단백질 mg 당 10EU 미만의 내독소를 갖는, 치료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 AARS 폴리펩타이드는 서열번호 16 또는 14로 이루어지거나, 세포외 신호전달 활성을 보유하면서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 이들의 조합에 의해 서열번호 16 또는 14와 상이한 것인, 치료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 AARS 폴리펩타이드는 이종 폴리펩타이드에 융합된 것인, 치료 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 이종 폴리펩타이드는 정제 태그, 에피토프 태그, 표적 서열, 신호 펩타이드, 막 전좌 서열, 및 PK 수식인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것인, 치료 조성물.
5. 세포외 신호전달 활성을 가지는, 서열번호 16 또는 14와 적어도 98% 동일하고 서열번호 16 또는 14의 220개 이상의 인접한 아미노산인, 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 폴리펩타이드 또는 이의 단편.
6. 제5항에 있어서, 상기 AARS 폴리펩타이드는 서열번호 16 또는 14로 이루어지거나, 세포외 신호전달 활성을 보유하면서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 이들의 조합에 의해 서열번호 16 또는 14와 상이한 것인, 단리된 AARS 폴리펩타이드.
7. 제5항에 있어서, 상기 AARS 폴리펩타이드는 이종 폴리펩타이드에 융합된 것인, 단리된 AARS 폴리펩타이드.
8. 제7항에 있어서, 상기 이종 폴리펩타이드는 정제 태그, 에피토프 태그, 표적 서열, 신호 펩타이드, 막 전좌 서열, 및 PK 수식인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것인, AARS 폴리펩타이드.
9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 폴리펩타이드를 포함하는, 염증성 장애, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 1형 및 2형 당뇨병, 대사 증후군, 또는 혈관 질환의 치료를 위한 조성물로서,
   상기 폴리펩타이드는 실온 또는 37℃의 물 또는 생리학적 pH의 생리학적 완충액에서 적어도 5mg/mL의 용해도를 가지며, 상기 조성물은 단백질 기준으로 적어도 95%의 순도 및 단백질 mg 당 10 EU 미만의 내독소를 가지는, 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드에 적어도 하나의 모이어티 또는 고형 기질이 공유결합 또는 비공유결합으로 부착된 것인, 조성물.
11. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 폴리펩타이드, 및 적어도 하나의 세포가 상기 AARS 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 무혈청 배지에서 성장할 수 있는 세포의 제작된 군집을 포함하는, 세포 조성물.
12. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 폴리펩타이드, 적어도 하나의 세포가 상기 AARS 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포의 제작된 군집, 적어도 10 리터의 무혈청 성장 배지, 및 멸균 용기를 포함하는, 세포 성장 디바이스.
13. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 AARS 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 폴리뉴클레오타이드.
14. 제13항의 단리된 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
15. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 아미노아실-tRNA 신테타아제 (AARS) 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 화합물을 확인하는 방법으로서, 상기 방법은,
    a) 적당한 조건 하에서 AARS 폴리펩타이드를 적어도 하나의 시험 화합물과 조합하는 단계, 및
    b) 시험 화합물에 대한 AARS 폴리펩타이드의 결합을 검출하고, 이로써 AARS 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 화합물을 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
16. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 AARS 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 염증성 장애, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 1형 및 2형 당뇨병, 대사 증후군, 또는 혈관 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물.
17. 제13항의 AARS 폴리뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 염증성 장애, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 1형 및 2형 당뇨병, 대사 증후군, 또는 혈관 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물.
18. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 세포 활성 또는 단백질을 조절하기 위해 사용될 수 있는, 단리된 AARS 폴리펩타이드.
19. 제5항 또는 제6항의 AARS 폴리펩타이드의 단백질분해적 생성을 가능하게 하는 이종 단백질분해 부위를 포함하는, 제작된 전체 길이 아미노아실-tRNA 신테타아제(AARS) 단백질.
    
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