DE69225227T2

DE69225227T2 - Screeningtest für den nachweis von dna-bindenden molekülen

Info

Publication number: DE69225227T2
Application number: DE69225227T
Authority: DE
Inventors: Beth Andrews; Charles Cantor; Cynthia Edwards
Original assignee: Genelabs Technologies Inc
Current assignee: Genelabs Technologies Inc
Priority date: 1991-06-27
Filing date: 1992-06-26
Publication date: 1998-10-29
Anticipated expiration: 2012-06-27
Also published as: EP0593618A1; US5738990A; US5693463A; HK1010058A1; DK0593618T3; EP0823486A2; CA2112130C; JPH07500491A; WO1993000446A1; US5716780A; ATE165397T1; US5744131A; EP0823486A3; EP0593618B1; CA2112130A1; US5306619A; ES2117050T3; JP3169610B2; AU2297892A; AU655839B2

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, ein System und einen Kit zur Identifizierung von Molekülen, die spezifisch an definierte Nucleinsäuresequenzen binden.

Referenzen

Ambinder, R. F., et al., J. Virol. 65 (1991), 1466-1478.
Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media PA.
Banerji, S. S., et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991), 4074-4087.
Beal, P. A., et al., Science 251 (1991), 1360-1363.
Birg, F., et al., Nucl. Acids Res. 18 (1990), 2901-2908.
Chaiet, L., et al., Arch. Biochem. Biophys. 106 (1964), 1.
Chang, H.-K., et al., Mol. Cell. Biol., November (1989), 5189- 5197.
Chen, K.-X., et al., J. Biomol. Struct. Dyn 3 (1985), 445-466.
Chin, M. T., et al., J. Virol. 63 (1989), 2967-2976.
Cooney, M., et al., Science 241 (1988), 456-459.
Courtois, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 7937-7941.
Cullinane, C., et al., FEBS Lett. 293 (1991), 195-198.
Edwards, C. A., et al., J. Mol. Biol. 180 (1984), 73-90.
Edwards, C. A., und Crabtree, G. R., Molecular regulation of T lymphocyte activation, in: Advances in Regulation of Cell Growth, Bd. 1; Regulation of Cell Growth and Acitvation, Hrsg.: Mond, J J., Weiss, A., und Cambier, J. C., New York: Raven Press (1989), S. 91-118.
Elias, P., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 17167-17173.
Elias, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 2959- 2963.
Fried, M. G., et al., Nuc. Acid. Res. 9 (1981), 6505.
Froehler, et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988), 4831.
Galas, D., et al., Nuc. Acid. Res. 5 (1981), 3157-3170.
Garner, M. M., et al., Nuc. Acid. Res. 9 (1981), 3047.
Gaugain, B., et al., Biochemistry 17 (1978), 5078.
Gaugain, B., et al., Biochemistry 17 (1978), 5071.
Gessner, R. V., et al., Biochemistry 24 (1985), 237-240.
Gilbert, D. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1988), 3006.
Gilman, A. G., et al., Hrsg., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. Aufl., Pergamon Press (1990).
Goldin, A. L., et al., J. Virol. 38 (1981), 5-58.
Green, N. M., Adv. Protein Chem. 29 (1975), 85.
Greene, W. C., Regulation of HIV-1 Gene Expression, Annu. Rev. Immunol. 8 (1990), 453-475.
Griffin, L. C., et al., Science 245 (1989), 967-971.
Gross, D. S., et al., Annu. Rev. Biochem. 57 (1988), 159-197.
Harlow, E., et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988).
Helene, C., et al., Genome 31 (1989), 413-420.
Helene, C., et al., Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990), 99- 125.
Jain, S. C., et al., J. Mol. Biol. 68 (1972), 1-20.
Kadonaga, J. T., PNAS 83 (1986), 5889-5893.
Koff, A., et al., J. Virol. 62 (1988), 4096-4103.
Kuhlmann, K. F., et al., Nucl. Acids Res. 5 (1978), 2629.
Laugaa, P., et al., Biochemistry 23 (1985), 1336.
Le Pecq, J. B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975), 2915-2919.
Luck, G., et al., Nucl. Acids Res. 1 (1974), 503.
Luckow, V. A., et al., Virology 170 (1989), 31.
Maher III, L. J., et al., Science 245 (1989), 725-730.
Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
Miller, P. S., et al., US-Patent Nr. 4 507 433, erteilt am 26. März 1985.
Miller, et al., Biochemistry 18 (1979), 5134.
Miller, et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 6959.
Miller, et al., Biochimie 67 (1985), 769.
Nielsen, P., et al., Science 254 (1991), 1497-1500.
Olivo, P. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5414-5418.
Olivo, P. D., et al., J. Virol. 3 (1989), 196-204.
Pelaprat, D., et al., J. Med. Chem. 23 (1980), 1336-1343.
Perouault, L., et al., Nature 344 (1990), 358-360.
Phillips, D. R., et al., Anti-Cancer Drug Design 5 (1990), 21- 29.
Phillips, D. R., Biochemistry 25 (1986), 7355-7362.
Polinksy, B., et al., PNAS 72 (1975), 3310-3314.
Quigley, G. J., et al., Science 232 (1986), 1255-1258.
Reisman, D., et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 1822-1832.
Salas, X., et al., FEBS Lett. 292 (1991), 223-228.
Sambrook, J., et al., in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Bd. 2, (1989). Schmidt, A., et al., J. Virol. 64 (1990), 4037-4041.
Sherman, S. E., et al., Chem. Rev. 87 (1987), 1153.
Siebenlist, U., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 122-126.
Skorobogaty, A., et al., Anti-Cancer Drug Design 3 (1988), 41- 56.
Smith, D. B., et al., Gene 67 (1988), 31.
Sobell, H. M., et al., J. Mol. Biol. 68 (1972), 21-34.
Sobell, H. M., et al., Prof. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol. 13 (1973), 153-190.
Stow, N. D., et al., J. Gen. Virol. 67 (1986), 1613-1623.
Stow, N. D., et al., Virology 130 (1983), 427-438.
Strobel, S. A., et al., Science 249 (1990), 73-75.
Summers, M. D., et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agriculture Experimental Station Bulletin, Nr. 1555, (1987).
Summerton, J. E., et al., US-Patent Nr. 5 034 506, erteilt am 23. Juli 1991.
Summerton, J. E., et al., PCT Internationale Anmeldung PCT/US86/00544, Internationale Veröffentlichung Nr. WO 86/05518, veröffentlicht am 25. Sept. 1986.
Tulilus, T. D., Ann. Rev. Biophys. Biochem. 18 (1989), 213- 237.
Wartel, R. M., et al., J. Biol. Chem. 15 (1975), 285-318.
Weir, H. M., et al., Nucl. Acids Res. 17 (1989), 1409-1425.
Woodbury, C. P., et al., Biochemistry 22 (20) (1983), 4730- 4737.
Wu, C. A., et al., J. Virol. 62 (1988), 435-443.
Young, S. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10023-10026.
Zein, N., et al., Science 240 (1988), 1198.
Zimmer, C., Pros. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 15 (1975), 285- 318.

Hintergrund der Erfindung

Mehrere Klassen kleiner Moleküle wurden identifiziert, die mit doppelstrangiger DNA in Wechselwirkung treten. Viele dieser kleinen Moleküle üben wichtige biologische Effekte aus. Z.B. binden viele Aminoacridine und polycylische Kohlenwasserstoffe an DNA und sind mutagen, teratogen oder karzinogen. Andere kleine Moleküle, die an DNA binden, umfassen: biologische Stoffwechselprodukte, von denen einige als Antibiotika und Antitumormittel eingesetzt werden, wie z.B. Actinomycin D, Echinomycin, Distamycin und Calicheamicin; planare Farbstoffe, wie z.B. Ethidium und Acridinorange; und Moleküle, die Schwermetalle enthalten, wie z.B. Cisplatin, ein wirksames Antitumormittel.
Die meisten bekannten DNA-bindenden Moleküle zeigen, soweit man weiß, keine Präferenz für die Bindung an eine bestimmte Sequenz. Jedoch gibt es einige wenige kleine DNA-bindende Moleküle, die vorzugsweise spezifische Nucleotidsequenzen erkennen, z.B. bindet Echinomycin vorzugsweise an die Sequenz [(A/T)CGT]/[ACG(A/T)] (Gilbert et al.), Cisplatin vernetzt mit einem Platinmolekül kovalent die N7-Atome von zwei nebeneinander liegenden Desoxyguanosinresten (Sherman et al.), und Calicheamicin bindet und spaltet vorzugsweise die Sequenz TCCT/AGGA (Zein et al.).
Die biologische Antwort, die durch die meisten therapeutischen DNA-bindenden Moleküle hervorgerufen wird, ist eine Toxizität, die nur insofern spezifisch ist, als diese Moleküle vorzugsweise Zellen schädigen, die ihre DNA aktiver replizieren oder transkribieren als andere Zellen. Ein gezieltes Hinsteuern auf spezifische Stellen könnte die Toxizität einfach dadurch signifikant senken, daß die Zahl der möglichen Bindungsstellen auf der DNA reduziert wird. Mit Hilfe einer Spezifität für längere Sequenzen könnte man die auf der DNA-Bindung beruhenden unspezifischen toxischen Effekte senken. Bei vielen therapeutischen DNA-bindenden Molekülen, die anfangs in einem biologischen Suchverf ahren aufgrund ihrer therapeutischen Wirkung identifiziert wurden, wurde später festgestellt, daß sie an DNA binden.
Aus diesem Grund besteht ein Bedarf für einen in vitro Test, der zum Absuchen ("Screening") nach DNA-bindenden Molekülen eingesetzt werden kann. Außerdem besteht ein Bedarf für einen Test, mit dem die Präferenzen solcher Moleküle für die Bindung an bestimmte Sequenzen ermittelt werden können. Ferner besteht ein Bedarf für einen Test zur Bestimmung der relativen Affinitäten eines DNA-bindenden Moleküls für verschiedene DNA- Sequenzen. Schließlich besteht ein Bedarf für therapeutische Moleküle, die an spezifische DNA-Sequenzen binden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screening von Molekülen oder Verbindungen bereit, die befähigt sind, an eine ausgewählte Testsequenz in einer doppelsträngigen DNA zu binden. Das Verfahren umfaßt die Zugabe eines Moleküls, das getestet werden soll, oder eines dieses Molekül enthaltenden Gemisches zu einem Testsystem. Das Testsystem umfaßt ein DNA-bindendes Protein, das an eine Screeningsequenz, d.h. an die entsprechende Bindungsstelle des DNA-bindenden Proteins, in einer doppelsträngigen DNA mit einer Bindungsaff inität binden kann, die vorzugsweise im wesentlichen unabhängig von den neben der bindenden Sequenz liegenden Sequenzen ist, wobei diese angrenzenden Sequenzen als Testsequenzen bezeichnet werden. Jedoch ist das DNA-bindende Protein empfindlich gegenüber der Bindung von Molekülen an die Testsequenz, wenn die Testsequenz neben der Screeningsequenz liegt. Ferner umfaßt das Testsystem eine doppelsträngige DNA, bei der die Screeningund Testsequenzen nebeneinander liegen. Außerdem ist das bindende Protein in einer solchen Menge vorhanden, daß die Screeningsequenz in der doppelsträngigen DNA gesättigt wird. Das Testmolekül wird zusammen mit dem Testsystem ausreichend lange inkubiert, so daß eine Bindung des zu testenden Moleküls an die Testsequenz in der doppelsträngigen DNA erfolgen kann. Die Mengen des bindenden Proteins, das vor und nach Zugabe des Testmoleküls oder Gemisches an die doppelsträngige DNA gebundenen ist, werden miteinander verglichen.
Geeignete Screeningsequenzen/bindende Proteine können aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden: EBV-Replikationsursprung/ERNA, HSV-Replikationsursprung/UL9, VZV-Replikationsursprung/UL9-ähnliches Molekül, HPV-Replikationsursprung/E2, Interleukin-2-Enhancer/NFAT-1, HIV-LTR/NFAT-1, HIV-LTR/NFKB, HBV-Enhancer/HNF-1, Fibrinogen-Promotor/HNF-1, Lambda-oL- oR/cro und im wesentlichen jede beliebige andere DNA/Protein- Wechselwirkung.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden das Protein UL9 oder davon hergeleitete DNA- bindende Proteine und SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 17 oder SEQ ID NO: 15 als seine entsprechende bindende Sequenz verwendet.
Die Testsequenzen können eine beliebige Kombination von Sequenzen von Interesse sein. Die Sequenzen können fur ein Screening im Schrotschußverfahren nach dem Zufallsprinzip erzeugt werden, oder spezifische Sequenzen können ausgewählt werden. Einige spezifische Sequenzen von medizinischem Interesse umfassen die folgenden Sequenzen, die bei DNA/Protein- Wechselwirkungen eine Rolle spielen: EBV-Replikationsursprung, HSV-Replikationsursprung, VZV-Replikationsursprung, HPV-Replikationsursprung, Interleukin-2-Enhancer, HIV-LTR, HBV-Enhancer und Fibrinogen-Promotor. Ferner könnte eine Gruppe von Assay- Testsequenzen, bestehend aus allen möglichen Sequenzen einer bestimmten Länge (z.B. allen Vier-Basenpaar-Sequenzen), getestet werden.
Im vorstehend erwähnten Verfahren kann der Vergleich des an freie DNA gebundenen Proteins durchgeführt werden, indem ein beliebiges Nachweissystem verwendet wird, vorzugsweise ein Gel-Bandenverschiebungstest, ein Filterbindungstest oder ein Einfang/Nachweistest.
In einer Ausführungsform des DNA-Einfang/Nachweistests, durch den die DNA, an die kein Protein gebunden ist, eingefangen wird, wird im Einfangsystem ein Nucleotid in der Screeningsequenz biotinyliert, wobei (i) die Fähigkeit des Proteins, an die Screeningsequenz zu binden, nicht gestört wird, (ii) die Biotineinheit befähigt ist, Streptavidin zu binden, und (iii) die Biotineinheit davor geschützt ist, mit Streptavidin in Wechselwirkung zu treten, wenn das Protein an die Screeningsequenz gebunden ist. Außerdem wird im Einfang/Nachweistest die eingefangene DNA nachgewiesen.
In einer anderen Ausführungsform des DNA-Einfang/Nachweistests werden im Einfangsystem, in dem die DNA/Protein-Komplexe eingefangen werden, Nitrocellulosefilter unter den Bedingungen einer niedrigen Salzkonzentration eingesetzt, wobei die DNA, an die Protein gebunden ist, zurückgehalten wird und die DNA, an die kein Protein gebunden ist, durch das Filter durchlaufen kann.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem ein Screeningsystem zur Identifizierung von Molekülen, die befähigt sind, an eine Testsequenz in einer doppelsträngigen DNA-Sequenz zu binden. Das System umfaßt ein DNA-bindendes Protein, das befähigt ist, an eine Screeningsequenz in einer doppelsträngigen DNA mit einer Bindungsaffinität zu binden, die im wesentlichen unabhängig ist von einer neben der Screeningsequenz liegenden Testsequenz. Die Bindung von DNA und Protein ist jedoch empfindlich gegenüber der Bindung von Molekülen an die Testsequenz, wenn die Testsequenz neben der Screeningsequenz liegt. Das System umfaßt eine doppelsträngige DNA, bei der die Screening- und Testsequenzen nebeneinander liegen. Typischerweise liegt das bindende Protein in einer solchen Menge vor, daß die Screeningsequenz in der doppelsträngigen DNA gesättigt wird.
Das System umfaßt ferner Mittel, womit die Menge des bindenden Proteins, das an die DNA gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
Wie vorstehend beschrieben können die Testsequenzen eine beliebige Anzahl von Sequenzen von Interesse sein.
Die Kombination Screeningsequenz/bindendes Protein kann aus bekannten DNA/Protein-wechselwirkungen ausgewählt werden, wobei die Kriterien und Anleitung der vorliegenden Beschreibung beachtet werden müssen. Sie kann auch auf später entdeckte DNA/Protein-Wechselwirkungen angewendet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Screeningsystems der vorliegenden Erfindung umfaßt das Protein UL9 oder ein davon hergeleitetes DNA-bindendes Protein (z.B. das verkürzte UL9- Protein, das mit UL9-COOH bezeichnet wird). In dieser Ausführungsform besitzt die doppelsträngige DNA (i) eine Screeningsequenz, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 15 ausgewählt ist, und (ii) eine Testsequenz, die neben der Screeningsequenz liegt, wobei UL9 in einer solchen Menge vorliegt, daß die Screeningsequenz gesättigt wird. Das System umfaßt außerdem Mittel zum Nachweis der Menge des DNA- gebundenen UL9, umfassend Bandenverschiebungstests, Filterbindungstests und Einfang/Nachweistests.
Die vorliegende Offenbarung beschreibt die Verfahren, die eingesetzt werden, um DNA/Protein-Wechselwirkungen daraufhin zu testen, ob sie für die Verwendung im Screeningtest der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
In der vorliegenden Erfindung werden ferner DNA-Einfangsysteme und -Nachweissysteme dargestellt. Mehrere Verfahren werden beschrieben. Ein Filterbindungstest kann verwendet werden, um die DNA/Protein-Komplexe einzufangen, oder alternativ kann die DNA, an die kein Protein gebunden ist, durch das folgende Verfahren eingefangen werden. Im ersten Teil dieses Systems wird die entsprechende DNA-Bindungsstelle des DNA-bindenden Proteins mit einer Nachweiseinheit, wie z.B. Biotin oder Digoxigenin, modifiziert. Die Modifikation muß an der Stelle auf eine Art und Weise erfolgen, so daß (i) die Fähigkeit des Proteins, an die entsprechende bindende Sequenz zu binden, nicht gestört wird, (ii) die Einheit in der DNA, an die kein Protein gebunden ist, für das Einfangmittel (das z.B. im Fall von Biotin Streptavidin ist) zugänglich ist und (iii) die Einheit vor Wechselwirkungen mit dem Einfangmittel geschützt ist, wenn das Protein an die Screeningsequenz gebunden ist.
In einem zweiten Teil dieses Systems wird das Ziel-Oligonucleotid markiert, um einen Nachweis zu ermöglichen. Die Markierung des Ziel-Oligonucleotids kann durch Standardtechniken erreicht werden, z.B. durch Radiomarkierung. In einer anderen Ausführungsform kann eine Einheit, wie z.B. Digoxigenin, in das Ziel-Oligonucleotid eingebaut werden, wobei diese Einheit sodann nach dem Einfangen nachgewiesen wird.
Drei Ausführungsformen des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Einfang/Nachweissystems sehen folgendermaßen aus:
(i) das Ziel-Oligonucleotid (enthaltend z.B. Screeningund Testsequenzen) -- Modifikation der entsprechenden Bindungsstelle mit Biotin und Einbau von Digoxigenin oder Radioaktivität (z.B. ³&sup5;S oder ³²P); Einfangen des Ziel-Oligonucleotids unter Verwendung von Streptavidin, das an einen festen Träger gekoppelt ist; und Nachweis des Ziel-Oligonucleotids unter Verwendung eines markierten Anti-Digoxigenin-Antikörpers oder durch Messung der Radioaktivität (z.B. Autoradiographie, Zählen in Szintillationsflüssigkeit oder Verwendung eines Phosphoimagers);
(ii) das Ziel-Oligonucleotid -- Modifikation der entsprechenden Bindungsstelle mit Digoxigenin und Einbau von Biotin oder Radioaktivität; Einfangen des Ziel-Oligonucleotids unter Verwendung eines Anti-Digoxigenin-Antikörpers, der an einen festen Träger gekoppelt ist; und Nachweis des Ziel-Oligonucleotids unter Verwendung von markiertem Streptavidin oder durch Messung der Radioaktivität;
(iii) Trennung des Ziel-Oligonucleotids, an das Protein gebunden ist, vom Ziel-Oligonucleotid, an das kein Protein gebunden ist, indem das Testgemisch durch ein Nitrocellulosefilter unter solchen Bedingungen passiert wird, bei denen die Protein/DNA-Komplexe durch die Nitrocellulose zurückgehalten werden, während die DNA, an die kein Protein gebunden ist, durch die Nitrocellulose durchläuft; und Nachweis des Zieloligonucleotids durch Radioaktivität, durch die Wechselwirkungen von markiertem Anti-Digoxigenin und Digoxigenin oder durch die Wechselwirkungen von markiertem Streptavidin und Biotin.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1A zeigt ein DNA-bindendes Protein, das an eine Screeningsequenz bindet. In den Figuren 1B und 1C ist dargestellt, wie ein DNA-bindendes Protein durch ein kleines Molekül verdrängt oder an der Bindung gehindert werden kann, wobei zwei unterschiedliche Mechanismen möglich sind: die Wirkung aufgrund einer sterischen Hinderung (1B) oder aufgrund von (allosterischen) Konformationsänderungen, die durch ein kleines Molekül in der DNA induziert werden (1C).
Figur 2 erläutert einen Test zum Nachweis von hemmenden Molekülen, der auf ihrer Fähigkeit basiert, vorzugsweise die Bindung eines DNA-bindenden Moleküls an seine Bindungsstelle zu verhindern. Das Protein (O) wird in Gegenwart des Inhibitors (X) von der DNA (/) verdrängt. Zwei verschiedene Einfang/Nachweissysteme werden gezeigt, das Einfangen und der Nachweis von ungebundener DNA oder das Einfangen und der Nachweis von DNA/Protein-Komplexen.
Fig. 3 zeigt ein DNA-bindendes Protein, das befähigt ist, eine Biotineinheit, die kovalent an die Oligonucleotidsequenz gebunden ist, davor zu schützen, von Streptavidin erkannt zu werden, wenn das Protein an die DNA gebunden ist.
Fig.4A zeigt den Einbau von Biotin und Digoxigenin in ein typisches Oligonucleotidmolekül für die Verwendung im erfindungsgemäßen Test. Das Oligonucleotid enthält die bindende Sequenz (d.h. die Screeningsequenz) des Proteins UL9, die unterstrichen ist, und Testsequenzen, die die Screeningsequenz flankieren. Figur 4B zeigt die Herstellung von doppelstrangigen Oligonucleotiden, die entweder mit Digoxigenin oder mit ³²P endmarkiert sind.
Figur 5 zeigt eine Reihe von Sequenzen, die im erfindungsgemäßen Test auf die Bindung von sequenzspezifischen kleinen Molekülen getestet wurden.
Figur 6 stellt die donierung einer verkürzten Form des Proteins UL9, bei der seine Fähigkeit zur sequenzspezifischen DNA-Bindung noch erhalten ist (UL9-COOH), in einen Expressionsvektor dar.
Figur 7 zeigt den Baculovirus-Vektor pVL1393, der die Codierende Sequenz des Proteins UL9 in voller Länge enthält.
Figur 8 ist ein Photo eines SDS-Polyacrylamidgels, das (i) das gereinigte UL9-COOH/Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein und (ii) das UL9-COOH-Polypeptid zeigt. In der Figur ist das UL9-COOH-Polypeptid durch einen Pfeil gekennzeichnet.
Figur 9 zeigt die Wirkung von Anderungen der Testsequenzen, welche die UL9-Screeningsequenz flankieren, auf die Bindung von UL9-COOH. Die Ergebnisse sind auf Bandenverschiebungsgelen dargestellt.
Figur 10A zeigt die Wirkung der Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von Distamycin A zu den DNA/Protein-Testreaktionen, wobei unterschiedliche Testsequenzen eingesetzt werden. Figur 10B zeigt die Wirkung der Zugabe von Actinomycin D zu den DNA/Protein-Testreaktionen, wobei unterschiedliche Testsequenzen eingesetzt werden. Figur 10C zeigt die Wirkung der Zugabe von Doxorubicin zu den DNA/Protein-Testreaktionen, wobei unterschiedliche Testsequenzen eingesetzt werden.
Figur 11A erläutert ein DNA-Einfangsystem der vorliegenden Erfindung, wobei mit Biotin und Streptavidin beschichtete magnetische Kügelchen verwendet werden. Das vorliegen der DNA wird anhand eines Substrats der alkalischen Phosphatase nachgewiesen, das ein chemilumineszierendes Produkt ergibt. Figur ile zeigt eine ähnliche Reaktion, wobei mit Biotin beschichtete Agarosekügelchen eingesetzt werden, die an Streptavidin ankoppeln, das seinerseits an die eingefangene DNA bindet.
Figur 12 zeigt eine Testmatrix, die auf DNA/Protein-Bindungswerten basiert.
In Figur 13 sind die oberen Stränge (5'-3') aller möglichen Vier-Basenpaar-Sequenzen aufgelistet, die als eine definierte Gruppe geordneter Testsequenzen im Test verwendet werden können (für eine Screeningsequenz mit n Basen, wobei n = 4).
In Figur 14 sind die oberen Stränge (5'-3') aller möglichen Vier-Basenpaar-Sequenzen aufgelistet, die die gleiche Basenzusammensetzung wie die Sequenz 5¹-GATC-3' aufweisen. Dies ist ein weiteres Beispiel einer definierten geordneten Gruppe von Sequenzen, die im Test getestet werden können.
Figur 15 zeigt ein Beispiel eines Oligonucleotidmoleküls, das Testsequenzen enthält, die eine Screeningsequenz flankieren. Die Sequenz dieses Moleküls ist als SEQ ID NO: 18 dargestellt, wobei das "X" von Figur 15 in SEQ ID NO: 18 als N wiedergegeben ist.

Genaue Beschreibung der Erfindung Definitionen

Nebeneinander liegend

(angrenzend) wird verwendet, um die Beziehung bezüglich der Entfernung zwischen benachbarten DNA- Stellen zu beschreiben. Nebeneinander liegende Stellen sind 20 oder weniger bp voneinander entfernt, oder sie sind stärker bevorzugt 10 oder weniger bp voneinander entfernt, oder sie sind noch stärker bevorzugt 5 oder weniger bp voneinander entfernt, oder sie liegen am stärksten bevorzugt unmittelbar nebeneinander. "Flankierend" ist ein Synonym für nebeneinander liegend.

Gebundene DNA

bezeichnet in dieser Beschreibung die DNA, an die das im Test verwendete Protein gebunden ist (d.h. in den Beispielen dieser Beschreibung das Protein UL9).

Dissoziation

ist der Prozess, bei dem zwei Moleküle aufhören, miteinander in Wechselwirkung zu stehen. Der Prozess findet unter spezifischen physikalischen Bedingungen mit einer bestimmten durchschnittlichen Rate statt.

Funktionelle Bindung

ist die nicht-kovalente Anlagerung eines Proteins oder kleinen Moleküls an das DNA-Molekül. Im erfindungsgemäßen Test wurde die funktionelle Bindung des Proteins an die Screeningsequenz (d.h. an seine entsprechende DNA-Bindungsstelle) ermittelt, indem Filterbindungs- oder Gel- Bandenverschiebungstests eingesetzt wurden.

Heteromoleküle

sind Moleküle, die aus mindestens zwei verschiedenen Molekültypen zusammengesetzt sind: z.B. durch kovalente Kupplung von mindestens zwei kleinen organischen DNA-bindenden Molekülen (z.B. Distamycin, Actinomycin D oder Acridin) aneinander oder durch kovalente Kupplung eines solchen DNA-bindenden Moleküls oder solcher Moleküle an ein DNA- bindendes Polymer (z.B. ein Desoxyoligonucleotid).
Die On-Rate" ist hier als die Zeit definiert, die zwei Moleküle benötigen, um eine stabile ("steady state") Assoziation zu erreichen, z.B den DNA/Protein-Komplex.
Die "Off-Rate" ist hier als die Zeit definiert, die die Hälfte der assoziierten Komplexe, z.B. der DNA/Protein-Komplexe, benötigt, um zu dissoziieren.

Sequenzspezifische

Bindung bezieht sich auf DNA-bindende Moleküle, die eine starke Präferenz für die Bindung an eine bestimmte DNA-Sequenz haben. Z.B. zeigen die Restriktionsenzyme und die in Tabelle I aufgelisteten Proteine eine typische sequenz spezifische DNA-Bindung.

Sequenzbevorzugte

Bindung bezieht sich auf DNA-bindende Moleküle, die im allgemeinen an DNA binden, die jedoch eine Präferenz für die Bindung an einige DNA-Sequenzen gegenüber der an andere zeigen. Eine sequenzbevorzugte Bindung wird durch mehrere der kleinen Moleküle verkörpert, die in der vorliegenden Beschreibung getestet werden, z.B. Distamycin. Eine sequenzbevorzugte und eine sequenzspezifische Bindung kann getestet werden, indem eine Testmatrix verwendet wird, wie in Figur 12 dargestellt. Für ein bestimmtes DNA-bindendes Molekül gibt es ein Spektrum unterschiedlicher Affinitäten für verschiedene DNA-Sequenzen, die im Bereich von nicht-sequenzspezifisch (keine nachweisbare Präferenz) über sequenzbevorzugt bis zu einer absoluten Sequenzspezifität liegen (d.h. der Erkennung von nur einer einzigen Sequenz unter allen möglichen Sequenzen, wie das bei vielen Restriktionsendonucleasen der Fall ist),

Screeningsequenz

ist die DNA-Sequenz, die die entsprechende Bindungsstelle für das DNA-bindende Protein darstellt: im Fall von UL9 kann die Screeningsequenz z.B. SEQ ID NO: 1 sein.

Kleine Moleküle

sind als Therapeutika wünschenswert, wobei verschiedene, mit der Arzneistoff-Freisetzung zusammenhängende Gründe eine Rolle spielen: (i) sie weisen üblicherweise ein Molekulargewicht von weniger als 10 K auf; (ii) sie können höchstwahrscheinlich in Zellen eindringen; (iii) anders als Peptide oder Oligonucleotide sind sie weniger vom Abbau durch viele zelluläre Mechanismen betroffen; und (iv) es ist nicht sehr wahrscheinlich, daß sie eine Immunantwort auslösen. Viele pharmazeutische Betriebe besitzen umfangreiche Sammlungen von chemischen und/oder biologischen Gemischen, häufig Pilz-, Bakterien- oder Algenextrakte, deren Screening mit dem erfindungsgemäßen Test wünschenswert wäre. Die kleinen Moleküle können entweder biologische oder synthetische organische Verbindungen sein, oder sie können auch anorganische Verbindungen (z.B. Cisplatin) sein.
Die Testsequenz ist eine DNA-Sequenz, die neben der Screeningsequenz liegt. Der Test der vorliegenden Erfindung sucht nach Molekülen, die bei einer Bindung an die Testsequenz die Wechselwirkung des DNA-bindenden Proteins mit seiner entsprechenden Bindungsstelle (d.h. der Screeningsequenz) stören. Die Testsequenzen können neben einem Ende oder neben beiden Enden der Screeningsequenz liegen. Typischerweise stört die Bindung von Molekülen an die Testsequenz die Bindung des DNA- bindenden Proteins an die Screeningsequenz. Jedoch können einige Moleküle, die an diese Sequenzen binden, die umgekehrte Wirkung haben, wobei sie eine erhöhte Bindungsaffinität des DNA-bindenden Proteins für die Screeningsequenz bewirken. Einige Moleküle könnten im Test keine Wirkung zeigen, obwohl sie in sequenzspezifischer oder sequenzbevorzugter Art und Weise binden. Diese Moleküle können im Test nicht nachgewiesen werden.
Ungebundene DNA bezieht sich in der vorliegenden Beschreibung auf die DNA, an die das im Test verwendete Protein (d.h. in den Beispielen dieser Beschreibung, das Protein UL9) nicht gebunden ist.

1. Der Test

Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie einen Test zur Identifizierung kleiner Moleküle bereitstellt, die in sequenzspezifischer Art und Weise an medizinisch signifikante DNA-Zielstellen binden. Der Test erleichtert die Entwicklung einer neuen Gruppe von Arzneimitteln, deren Wirkung darin besteht, spezifische DNA-Funktionen zu stören, wie z.B. entscheidende DNA/Protein-Wechselwirkungen. Ein empfindlicher, gut durchführbarer Test zum Nachweis von DNA- bindenden Molekülen und zur Bestimmung ihrer Sequenzspezifität und Affinität wurde entwickelt. Der Test kann eingesetzt werden, um große biologische oder chemische Sammlungen abzusuchen; z.B. kann der Test verwendet werden, um sequenzspezifische DNA-bindende Moleküle in Fermentationsbrühen oder Extrakten verschiedener Mikroorganismen nachzuweisen. Ferner besteht eine weitere Anwendung des Tests darin, die Sequenzspezifität und die relativen Affinitäten bekannter DNA-bindender Arzneistoffe (und anderer DNA-bindender Moleküle) für unterschiedliche DNA-Sequenzen zu bestimmen. Die Arzneistoffe, die hauptsächlich zur Behandlung von Krebs verwendet werden, könnten Aktivitäten besitzen, die bisher nicht bekannt waren, und aufgrund derer sie als Arzneimittel oder als Arzneimittelvorstufen in ganz unterschiedlichen Bereichen der Medizin eingesetzt werden könnten.
Der Screeningtest ist im Grunde ein Kompetitionstest, der entwickelt wurde, um die Fähigkeit eines Moleküls zu testen, mit einem DNA-bindenden Protein um die Bindung an ein kurzes synthetisches doppelsträngiges Oligodesoxynucleotid zu konkurrieren, das die Erkennungssequenz für das DNA-bindende Protein enthält, die an einer Seite oder an beiden Seiten von einer variablen Teststelle flankiert ist. Die variable Teststelle kann eine beliebige DNA-Sequenz enthalten, die eine vernünftige Erkennungssequenz für ein DNA-bindendes Molekül bereitstellt. Moleküle, die an die Teststelle binden, verändern die Bindungseigenschaften des Proteins in einer Art und Weise, die einfach nachgewiesen werden kann; das Ausmaß, wie stark solche Moleküle die Bindungseigenschaften des Proteins verändern können, ist wahrscheinlich direkt proportional zur Affinität des Testmoleküls für die DNA-Teststelle. Die relative Affinität eines bestimmten Moleküls für verschiedene Oligonucleotidsequenzen an der Teststelle (d.h. die Testsequenzen) kann ermittelt werden, indem seine Wirkung auf die DNA/Protein-Wechselwirkung bei jedem der Oligonucleotide untersucht wird. Anhand der Bestimmung der DNA-Bindungsstellen, die eine hohe Affinität für die DNA-Bindung von Molekülen aufweisen, kann man spezifische Ziel-Sequenzen identifizieren, die für die Entwicklung neuer Arzneistoffe interessant sind.

A. Allgemeine Überlegungen

Der Test der vorliegenden Erfindung wurde für den Nachweis von Testmolekülen oder Testverbindungen entwickelt, die auf die Transferrate eines spezifischen DNA-Moleküls von einem Proteinmolekül auf ein anderes identisches Protein in Lösung einwirken.
Ein Gemisch aus DNA und Protein wird in Lösung hergestellt. Die Konzentration des Proteins ist gegenüber der Konzentration der DNA im Überschuß, so daß tatsächlich die gesamte DNA in DNA/Protein-Komplexen vorliegt. Die DNA ist ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das die Erkennungssequenz für ein spezifisches DNA-bindendes Protein (d.h. die Screeningsequenz) umfaßt. Das in dem Test verwendete Protein enthält eine DNA-bindende Domäne, die für die Bindung an die Sequenz im oligonucleotid spezifisch ist. Die physikalischen Bedingungen der Lösung (z.B. pH-Wert, Salzkonzentration, Temperatur) werden so eingestellt, daß die Halbwertszeit des Komplexes für die Durchführung des Tests geeignet ist (am besten ist eine Halbwertszeit von 5 bis 30 Minuten), vorzugsweise in einem Bereich, der den normalen physiologischen Bedingungen nahekommt.
Wenn ein DNA/Protein-Komplex dissoziiert, bildet die freigesetzte DNA rasch wieder einen Komplex mit einem anderen Protein in Lösung. Da das Protein gegenüber der DNA im Überschuß vorliegt, führen Dissoziationen eines Komplexes immer zu einer raschen Wiedervereinigung der DNA zu einem anderen DNA/Protein-Komplex. Im Gleichgewicht liegen sehr wenige DNA- Moleküle ungebunden vor. Der minimale Hintergrundwert des Tests ist die Menge ungebundener DNA, die während eines bestimmten meßbaren Zeitabschnitts ermittelt wird. Die untere Grenze des DNA-Hintergrundwerts des Tests wird durch den möglichst kurzen Beobachtungszeitraum und die Empfindlichkeit des Nachsweissystems festgelegt.
Figur 1 zeigt, wie ein solches Protein von seiner entsprechenden Bindungsstelle verdrängt werden kann oder wie ein Protein daran gehindert werden kann, an seine entsprechende Bindungsstelle zu binden, oder wie die Kinetiken der DNA/Protein-Wechseiwirkung verändert werden können. Ein Mechanismus besteht in der sterischen Hinderung der Proteinbindung durch ein kleines Molekül. Alternativ kann ein Molekül die Wechselwirkung der DNA/Protein-Bindung stören, indem es in der DNA eine Konformationsänderung induziert. Wenn ein an das Oligonucleotid bindendes Testmolekül die Bindung des Proteins behindert, wird in beiden Fällen die übergangsrate der DNA von einem Protein zu einem anderen Protein herabgesetzt. Dies führt zu einer Nettozunahme der Menge an ungebundener DNA. Mit anderen Worten, eine Zunahme der Menge ungebundener DNA oder eine Abnahme der Menge gebundener DNA zeigt das Vorliegen eines Inhibitors an.
In einer anderen Ausführungsform können Moleküle isoliert werden, die bei Bindung an die DNA eine gesteigerte Affinität des DNA-bindenden Proteins für seine entsprechende Bindungsstelle bewirken. In diesem Fall nimmt die Menge an ungebundener DNA (beobachtet während eines bestimmten meßbaren Zeitabschnitts nach Zugabe des Moleküls) im Reaktionsgemisch ab, wie durch das in Abschnitt II beschriebene Einfang/Nachweissystem nachgewiesen wird.

B. Andere Verfahren

Es gibt verschiedene Verfahren, die sich für ein Screening nach kleinen Molekülen eignen, welche spezifisch die Wechselwirkung eines bestimmten DNA-bindenden Proteins mit seiner Bindungssequenz (seiner entsprechenden Stelle) hemmen. Ein Verfahren besteht darin, biologische oder chemische Verbindungen auf ihre Fähigkeit zu testen, vorzugsweise die Bindung einer spezifischen DNA/Protein-Wechselwirkung, nicht jedoch die von anderen, zu blockieren. Für einen solchen Test müssen mindestens zwei, vorzugsweise drei DNA/Protein-Wechselwirkungssysteme entwickelt werden, um Kontrollen aufstellen zu können, anhand derer unterschieden werden kann zwischen allgemeinen DNA-bindenden Molekülen (Polykationen wie Heparin oder interkalierende Verbindungen wie Ethidium) und DNA-bindenden Molekülen mit Präferenzen für die Bindung an bestimmte Sequenzen, wodurch die Wechselwirkungen zwischen dem Protein und der entsprechenden Bindungsstelle in einem System, nicht jedoch in dem (den) anderen System(en), gestört werden.
Im folgenden wird erläutert, wie dieses System verwendet werden kann. Jede entsprechende Stelle kann in 5;-Richtung zu einem Reportergen (z.B. Gene, die β-Galactosidase oder Luciferase codieren) eingefügt werden, so daß die Bindung des Proteins an seine entsprechende Stelle die Transkription des Reportergens steigert. Das Vorliegen eines sequenzspezifischen DNA-bindenden Arzneistoffs, der die DNA/Protein-Wechselwirkung blockiert, vermindert dann die Steigerung der Expression des Reportergens. Mehrere DNA-Enhancer können mit Reportergenen verknüpft und anschließend die Konstrukte jeweils in Gegenwart oder Abwesenheit kleiner DNA-bindender Testmoleküle miteinander verglichen werden. In dem Fall, daß zum Screening mehrere Wechselwirkungen Protein/entsprechende Bindungs stellen verwendet werden, kann ein kompetitiver Inhibitor, der die eine Wechselwirkung blockiert, nicht jedoch die anderen, durch das Fehlen der Transkription eines Reportergens in einer transfizierten Zellinie oder in einem in vitro-Test nachgewiesen werden. Mit jedem Testsystem kann nur eine solche DNA-Bindungssequenz, die für das betreffende Protein spezifisch ist, getestet werden. Dieses Verfahren unterliegt einer Reihe von Beschränkungen, umfassend die begrenzte Testfähigkeit und die Tatsache, daß für jede einzelne interessierende Wechselwirkung von Protein und entsprechender Stelle das geeignete Reportersystem konstruiert werden muß.

C. Auswahl und Test eines geeigneten DNA-bindenden Proteins

Experimente, die zur Bestätigung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, führten zu einem zweiten Verfahren, wobei Moleküle mit einer sequenzbevorzugten DNA-Bindung nachgewiesen werden können. In diesem Verfahren können kleine Moleküle, die an Sequenzen binden, die neben der entsprechenden Bindungssequenz liegen, die Wechselwirkung des Proteins mit der entsprechenden DNA hemmen. Dieser Test wurde so konzipiert, daß anhand einer einzigen DNA/Protein-Wechselwirkung nach sequenzspezifischen oder sequenzbevorzugten DNA-bindenden Molekülen gesucht wird, die im wesentlichen eine beliebige Sequenz erkennen.
Während die Erkennungsstellen der bindenden DNA üblicherweise ziemlich klein sind (4 bis 17 bp), ist die Sequenz, die durch das bindende Protein geschützt wird, größer (normalerweise 5 bp oder mehr auf einer Seite der Erkennungssequenz, wie durch den Schutz durch DNase I (Galas et al.) oder die Beeinflussung der Methylierung (Siebenlist et al.) nachgewiesen wurde). Die zur Bestätigung der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimente zeigten, daß ein einzelnes Protein und seine entsprechende DNA-Bindungssequenz verwendet werden können, um im wesentlichen eine beliebige DNA-Sequenz zu testen, indem eine Sequenz von Interesse neben der Erkennungsstelle eingefügt wird. Ein kleines Molekül, das an die angrenzende Stelle gebunden ist, kann anhand der veränderungen der Bindungseigenschaften des Proteins an seine entsprechende Stelle nachgewiesen werden. Solche Veränderungen können entweder durch eine sterische Hinderung, die eine Dissoziation des Proteins bewirkt, oder durch induzierte Konformationsänderungen in der Erkennungssequenz des Protein zustande kommen, die entweder eine gesteigerte Bindung oder mit größerer Wahrscheinlichkeit eine verminderte Bindung des Proteins an seine entsprechende Stelle zur Folge haben können.

1. Kriterien zur Auswahl eines geeigneten DNA-bindenden Proteins

Bei der Auswahl von DNA/Protein-Komplexen, die im erfindungsgemäßen Test verwendet werden können, müssen verschiedene Überlegungen berücksichtigt werden, umfassend die folgenden Punkte:
a) Die Off-Rate (vgl. "Definitionen") sollte schnell genug sein, so daß der Test in einer vernünftigen Zeit durchgeführt werden kann. Die Wechselwirkungen einiger Proteine mit ihren entsprechenden Stellen in der DNA können in Tagen, nicht in Minuten, gemessen werden. Solche fest gebundenen Komplexe sind jedoch ungeeignet, da sie den zur Durchführung des Tests erforderlichen Zeitrahmen zu sehr verlängern.
b) Die Off-Rate sollte langsam genug sein, so daß die ungebundene DNA in einer vernünftigen Zeit gemessen werden kann. Z.B. wird der Spiegel der freien DNA vorgeschrieben durch das Verhältnis zwischen der zur Messung der freien DNA benötigten Zeit und der Menge der freien DNA, die aufgrund der Off-Rate während des Meßzeitraums von Natur aus auftritt.
Unter Berücksichtigung der beiden vorstehenden Überlegungen liegen praktisch anwendbare Off-Raten von DNA/Protein-Komplexen im Bereich von etwa zwei Minuten bis mehreren Tagen, obwohl kürzere Off-Raten durch eine schnellere Apparatur und längere Off-Raten durch die Destabilisierung der Bindungsbedingungen des Tests erhalten werden können.
c) Eine weitere Überlegung besteht darin, daß die Kinetik der Wechselwirkungen des DNA/Protein-Komplexes relativ unempfindlich gegenüber den Nucleotidsequenzen sein sollte, die die Erkennungssequenz flankieren. Die Affinität vieler DNA- bindender Proteine wird durch Unterschiede in den neben der Erkennungssequenz liegenden Sequenzen beeinträchtigt. Das deutlichste Beispiel dieses Phänomens ist die bevorzugte Bindung und Spaltung von Restriktionsenzymen, wobei eine Auswahl verschiedener identischer Erkennungsstellen mit unterschiedlichen flankierenden Sequenzen angegeben ist (Polinsky et al.). Sofern die Off-Raten durch die flankierenden Sequenzen beeinflußt werden, ist es schwierig, die vergleichenden Bindungsdaten zwischen unterschiedlichen flankierenden Oligonucleotidsequenzen zu analysieren, jedoch ist es nicht unmöglich.

2. Test der DNA/Protein-Wechselwirkungen für die Verwendung im Test

Experimente, die zur Bestätigung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigten eine DNA/Protein-Wechselwirkung, die im vorstehend beschriebenen Test besonders gut eingesetzt werden kann: das Protein UL9 des Herpes-simplex-Virus (HSV), das an den HSV-Replikationsursprung (oriS) bindet. Das Protein UL9 weist eine ziemlich strenge Sequenzspezifität auf. Drei Bindungsstellen für UL9 scheinen in oriS vorzuliegen, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 17 (Elias, P., et al., Stow et al.). Die eine Sequenz (SEQ ID NO: 1) bindet mit einer mindestens 10-mal höheren Affinität als die zweite Sequenz (SEQ ID NO: 2). In den nachstehend beschriebenen Ausführungsformen wird die Bindungsstelle mit der höheren Affinität (SEQ ID NO: 1) verwendet.
Die Reaktionen zur Anlagerung von DNA und Protein werden in Lösung durchgeführt. Die DNA/Protein-Komplexe können von der freien DNA durch verschiedene Verfahren abgetrennt werden. Ein besonders gut geeignetes Verfahren für die anfängliche Untersuchung der DNA/Protein-Wechselwirkung besteht darin, die Bindungsresultate unter Verwendung von Bandenverschiebungsgelen sichtbar zu machen (Beispiel 3A). In diesem Verfahren werden die DNA/Protein-Bindungsreaktionsgemische auf Polyacrylamiditbe-Gele aufgetragen und die markierten Komplexe und die freie markierte DNA elektrophoretisch aufgetrennt. Diese Gele werden fixiert, getrocknet und mit einen Röntgenfum in Kontakt gebracht. In den resultierenden Autoradiogrammen wird die Menge der freien Sonde bestimmt, die unabhängig vom DNA/Protein-Komplex wandert. Diese Tests umfassen (i) eine Bahn, die lediglich die freie markierte Sonde enthält, und (ii) eine Bahn, wobei die Probe die markierte Sonde und einen großen Überschuß des Bindungsproteins umfaßt. Anhand der Bandenverschiebungstests kann das Verhältnis zwischen den DNA/Protein- Komplexen und der freien Sonde sichtbar gemacht werden. Jedoch sind diese Tests bei Experimenten, die zür Bestimmung der Rate durchgeführt werden, weniger genau als die Filterbindungstests, was auf die Verzögerung zwischen dem Beladen des Gels und der elektrophoretischen Auftrennung der Komponenten zurückzuführen ist.
Das Filterbindungsverfahren ist besonders gut geeignet, um die Off-Raten für Protein/Oligonucleotid-Komplexe zu bestimmen (Beispiel 3B). Im Filterbindungstest werden die DNA/Protein-Komplexe auf einem Filter zurückgehalten, während die freie DNA durch das Filter durchläuft. Dieses Testverfahren ist für die Bestimmung der Off-Rate genauer, denn die Trennung der DNA/Protein-Komplexe von der freien Sonde geht sehr rasch vor sich. Der Nachteil des Filterbindungsverfahrens besteht darin, daß der DNA/Protein-Komplex nicht direkt sichtbar gemacht werden kann. Wenn also z.B. das kompetierende Molekül auch ein Protein ist, das um die Bindung an eine Stelle auf dem DNA-Molekül kompetiert, kann der Filterbindungstest weder zwischen der Bindung der zwei Proteine unterscheiden noch eine Information darüber liefern, ob ein Protein oder beide Proteine gebunden sind.
Es gibt viele bekannte DNA/Protein-Wechselwirkungen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassend (i) die in Tabelle I aufgeführten DNA/Protein-Wechselwirkungen, (ii) Bakterien-, Hefe- und Phagensysteme, wie z.B. Lambda oL-oR/cro, und (iii) modifizierte Restriktionsenzymsysteme (Z.B. Proteinbindung in Abwesenheit zweiwertiger Kationen). Ein beliebiges Protein, das an eine spezifische Erkennungssequenz bindet, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein einschränkender Faktor ist die Wirkung der unmittelbar angrenzenden Sequenzen (der Testsequenzen) auf die Affinität des Proteins für seine Erkennungsstelle. Die DNA/Protein-Wechselwirkungen, bei denen die Testsequenzen nur eine geringe oder keine Wirkung auf die Affinität des Proteins für seine entsprechende Stelle haben, sind für die Verwendung im beschriebenen Test bevorzugt; jedoch können auch DNA/Protein-Wechselwirkungen eingesetzt werden, die eine unterschiedliche Bindung (abhängig von der Testsequenz) zeigen, sofern für die Analyse der Daten Algorithmen verwendet werden, die die unterschiedliche Affinität kompensieren. Im allgemeinen ist die Wirkung der Zusammensetzung der flankierenden Sequenz auf die Bindung des Proteins wahrscheinlich von der Länge der Erkennungssequenz für das DNA-bindende Protein abhängig. In kurzen Worten heißt das, daß die Bindungskinetiken von Proteinen mit kürzeren Erkennungssequenzen mit größerer Wahrscheinlichkeit von den Wirkungen der flankierenden Sequenz betroffen sind, während die Bindungskinetiken von Proteinen mit längeren Erkennungsstellen mit größerer Wahrscheinlichkeit nicht von der Zusammensetzung der flankierenden Sequenz beeinflußt werden. Die vorliegende Beschreibung stellt Verfahren und Anleitungen bereit, mit denen die Eignung solcher DNA/Protein-Wechselwirkungen für den Screeningtest getestet werden kann, d.h. nicht der Wechselwirkung von UL9 und der Bindungsstelle oriS, sondern anderer Wechselwirkungen.

D. Herstellung der Polypeptide UL9 in voller Länge und UL9- COOH

Das Protein UL9 wurde durch verschiedene Rekombinationstechniken hergestellt (Beispiel 2). Das Protein UL9 in voller Länge wurde aus Baculovirus-infizierten Insektenkulturen zubereitet (Beispiel 3A, B und C). Außerdem wurde ein Teil des Proteins UL9, der die DNA-bindende Domäne enthält (UL9-COOH), in einen bakteriellen Expressionsvektor doniert und durch Bakterienzellen hergestellt (Beispiel 3D und E). Die DNA-bindende Domäne von UL9 ist in den 317 C-terminalen Aminosäuren des Proteins enthalten (Weir et al.). Das Polypeptid UL9-COOH wurde zusammen mit dem Protein Glutathion-S-Transferase (gst) in den Expressionsvektor im Raster eingefügt. Das gst/UL9-Fusionsprotein wurde mit Hilfe von Affinitätschromatographie gereinigt (Beispiel 3E). Der Vektor enthielt an der Verbindungsstelle der beiden Polypeptide außerdem eine Thrombin-Spaltstelle. Deshalb wurde das Fusionsprotein, sobald es isoliert war (Figur 8, Bahn 2), mit Thrombin behandelt, wodurch das gst-Polypeptid aus dem UL9-COOH/gst-Fusionsprotein abgespalten wurde (Figur 8, Bahn 3). Das UL9-COOH/gst-Fusionspolypeptid wurde mit einer Proteinreinheit von mehr als 95 % erhalten, dies wurde durch Coomassie-Färbung bestimmt.
Auch andere Hybridproteine können für die Herstellung von DNA-bindenden Proteinen von Interesse verwendet werden. Ein Beispiel ist die Fusion einer Sequenz, die ein DNA-bindendes Protein codiert, im Raster mit einer Sequenz, die die Thrombinstelle codiert, und außerdem im Raster mit der β-Galactosid-codierenden Sequenz. Solche Hybridproteine können durch Affinitäts- oder Immunoaffinitätssäulen isoliert werden (Maniatis et al.; Pierce, Rockford, IL). Außerdem können DNA-bindende Proteine durch Affinitätschromatographie aufgrund ihrer Fähigkeit isoliert werden, mit ihrer entsprechenden DNA-Bindungsstelle in Wechselwirkung zu treten. Z.B. kann die DNA- Bindungsstelle von UL9 (SEQ ID NO: 1) kovalent an einen festen Träger gebunden werden (z.B. CnBr-aktivierte Sepharose 4B-Kügelchen, Pharmacia, Piscataway, NJ), anschließend können Extrakte über den Träger passiert, der Träger gewaschen und die an DNA gebundene Substanz sodann mit einem Salzgradienten vom Träger isoliert werden (Kadonaga). In einer anderen Ausführungsform können weitere Expressionssysteme in Bakterien, Hefen, Insektenzellen oder Säugerzellen verwendet werden, wodurch geeignete Spiegel eines DNA-bindenden Proteins für die Verwendung in diesem Test exprimiert werden können.
Die nachstehend dargestellten Ergebnisse bezüglich der DNA-Bindungsfähigkeit des verkürzten UL9-Proteins legen nahe, daß für den erfindungsgemäßen DNA/Protein-Test nicht unbedingt DNA-bindende Proteine in voller Länge erforderlich sind; möglicherweise ist nur ein Teil des Proteins nötig, der die entsprechende Stelle mit der Erkennungsfunktion enthält. Der Teil eines DNA-bindenden Proteins, der für die DNA-Bindung erforderlich ist, kann unter Einsatz eines funktionellen Bindungstests ermittelt werden (Beispiel 4A). Die Dissoziationsrate kann bestimmt werden (Beispiel 4B) und mit der Dissoziationsrate des DNA-bindenden Proteins in voller Länge verglichen werden. Jedoch kann im Test ein beliebiges DNA-bindendes Protein, verkürzt oder in voller Länge, eingesetzt werden, solange es die Kriterien erfüllt, die in Abschnitt I.C.1., "Kriterien zur Auswahl eines geeigneten DNA-bindenden Proteins", beschrieben werden. Dies behält seine Richtigkeit, unabhängig davon, ob die verkürzte Form des DNA-bindenden Proteins die gleiche Affinität besitzt wie das DNA-bindende Protein in Voller Länge.

E. Funktionelle Bindung und Dissoziationsrate

Die Proteine UL9 in voller Länge und gereinigtes UL9-COOH wurden in Bandenverschiebungstests auf ihre funktionelle Aktivität getestet (vgl. Beispiel 4A). Die Pufferbedingungen wurden für die DNA/Protein-Bindung optimiert (Beispiel 4C), wobei das Polypeptid UL9-COOH verwendet wurde. Diese Bedingungen für die DNA-Bindung waren auch für das Protein UL9 in voller Länge gut geeignet. Radiomarkierte Oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), welche die 11 bp-große Erkennungssequenz für die DNA-Bindung von UL9 (SEQ ID NO: 1) enthielten, wurden mit dem jeweiligen UL9-Protein in einem geeigneten Bindungspuffer gemischt. Die Reaktionsansätze wurden bei Raumtemperatur zehn Minuten inkubiert (die Bindung erfolgt in weniger als zwei Minuten) und die Produkte elektrophoretisch auf nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen aufgetrennt (Beispiel 4A). Das Ausmaß der DNA/Protein-Bindung konnte aus dem Verhältnis der in den DNA/Protein-Komplexen vorliegenden markierten Sonde zu der frei vorliegenden markierten Sonde bestimmt werden. Dieses Verhältnis wurde typischerweise durch ein optisches Scannen von Autoradiogrammen und durch Vergleich der Intensitäten der Banden bestimmt. Für diese Bestimmung können auch andere Standardverfahren verwendet werden, z.B. die Szintillationszählung der ausgeschnittenen Banden. Das Polypeptid UL9-COOH und das Polypeptid UL9 in voller Länge zeigten unter den jeweils für sie geeigneten Pufferbedingungen beide eine gleich gute Bindung an das Ziel-Oligonucleotid.
Die Dissoziationsrate wurde mit Hilfe von Kompetitionstests bestimmt. Ein Überschuß eines unmarkierten Oligonucleotids, das die UL9-Bindungsstelle enthielt, wurde zu jedem Reaktionsansatz zugefügt. Dieses unmarkierte Oligonucleotid wirkt als spezifischer Inhibitor, der das Protein UL9 einfängt, wenn es vom markierten Oligonucleotid dissoziiert (Beispiel 4B). Die Dissoziationsrate, die durch einen Bandenverschiebungstest bestimmt wurde, betrug sowohl für UL9 in voller Länge als auch für UL9-COOH bei 400 etwa vier Stunden oder bei Raumtemperatur etwa zehn Minuten. Mit dem Oligonucleotid, das die UL9-Bindungsstelle enthielt, konkurrieren weder unspezifische Oligonucleotide (ein 10 000-facher Überschuß) noch gescherte Heringsperma-DNA (ein 100 000-facher Überschuß) um die Bindung.

F. Variationen der oriS-flankierenden Secuenz

Wie vorstehend erwähnt, besteht ein Merkmal eines DNA/Protein-Bindungssystems zur Verwendung im erfindungsgemäßen Test darin, daß die DNA/Protein-Wechselwirkung nicht durch die Nucleotidsequenz der Bereiche beeinträchtigt wird, die neben der DNA-Bindungsstelle liegen. Die Empfindlichkeit einer beliebigen DNA/Protein-Bindungsreaktion gegenüber der Zusammensetzung der flankierenden Sequenzen kann durch den funktionellen Bindungstest und den Dissoziationstest ermittelt werden, wie vorstehend beschrieben.
Um die Wirkung von Variationen der flankierenden Sequenz auf die Bindung von UL9 an die oriS-SEQ ID NO: 1-Sequenzen zu testen, wurden Oligonucleotide mit 20 bis 30 unterschiedlichen Sequenzen (d.h. Testsequenzen) konstruiert, die die 5- und der 3'-Seite der UL9-Bindungsstelle flankieren. Außerdem wurden Oligonualeotide mit Punktmutationen an mehreren Positionen in der UL9-Bindungsstelle konstruiert. Die meisten Punktmutationen in der Bindungsstelle verhinderten die Erkennung. Mehrere Änderungen verhinderten die Erkennung nicht, wobei diese Variationen an den Stellen lagen, die bei den drei UL9-Bindungsstellen (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 17) verschieden waren, wobei die zweite UL9-Bindungsstelle (SEQ ID NO: 2) eine um das Zehnfache niedrigere UL9/DNA-Bindungsaffinität zeigte als die erste (SEQ ID NO: 1) (Elias et al.). Andererseits hatte eine Sequenzvariation an der Teststelle (auch Testsequenz genannt), die neben der Screeningstelle lag (Figur 5, Beispiel 5), im wesentlichen keine Wirkung auf die Bindung oder die Dissoziationsrate.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Nucleotidsequenz der Teststelle, die die Screeningstelle flankiert, in jedem der getesteten Oligonucleotide keine Wirkung auf die Kinetiken der Bindung von UL9 hat, dies ist ein wichtiges Ergebnis. Somit ist der direkte Vergleich der jeweiligen Wirkung eines DNA- bindenden Moleküls auf Test-Oligonucleotide, die unterschiedliche Testsequenzen enthalten, möglich. Da sich die Test-Oligonucleotide lediglich in der Nucleotidsequenz der Teststelle(n) voneinander unterscheiden und da die Nucleotidsequenz der Teststelle keine Wirkung auf die Bindung von UL9 hat, muß eine Wirkung, die bei zwei Test-Oligonucleotiden als Antwort auf ein DNA-bindendes Molekül verschieden ist, alleine auf der unterschiedlichen Wechselwirkung des DNA-bindenden Moleküls mit der (den) Testsequenz(en) zurückzuführen sein. Auf diese Weise wird die Interpretation der Ergebnisse deutlich dadurch erleichtert, daß UL9 gegenüber den die UL9-Bindungsstelle flankierenden Testsequenzen unempfindlich ist. Jedes Test- Oligonucleotid wirkt als Kontrollprobe für alle anderen Test- Oligonucleotide. Dies trifft insbesondere zu, wenn geordnete Gruppen von Testsequenzen getestet werden (z.B. Testen aller 256 Vier-Basenpaare-Sequenzen (Figur 13) auf Bindung an einen einzigen Arzneistoff)
Die vorstehenden Ergebnisse bestatigen, daß die Bindung des Polypeptids UL9-COOH an die Sequenz SEQ ID NO: 1 erfolgt mit (i) geeigneter Stärke, (ii) akzeptabler Dissoziationszeit und (iii) Unempfindlichkeit gegenüber den Nucleotidsequenzen, die die Test-(Bindungs)stelle flankieren. Diese Merkmale legen nahe, daß mit dem UL9/oriS-System ein vielseitiger Test bereitgestellt werden kann, der zum Nachweis der Bindung eines kleinen Moleküls an DNA, umfassend eine beliebige Zahl spezifischer Nucleotidsequenzen, verwendet werden kann.
Das vorstehend beschriebene Experiment kann zum Screening anderer DNA/Protein-Wechselwirkungen eingesetzt werden, wobei bestimmt werden kann, ob sie für den vorliegenden Test geeignet sind.

G. Kleine Moleküle als sequenzspezifische kompetitive Inhibitoren

Um die Zweckmäßigkeit des vorliegenden Testsystems zu untersuchen, wurden mehrere kleine Moleküle getestet, die Sequenzpräferenzen aufwiesen (z.B. eine Bevorzugung AT-reicher Sequenzen gegenüber GC-reichen Sequenzen).
Distamycin A bindet relativ schwach an DNA (KA = 2 x 10&sup5; M&supmin;¹) mit einer Präferenz für nicht-alternierende AT-reiche Sequenzen (Jain et al.; Sobell; Sobell et al.). Actinomycin D bindet stärker an DNA (KA = 7,6 x 10&supmin;&sup7; M&supmin;¹) als Distamycin A und hat eine relativ starke Präferenz für die Dinucleotidsequenz dGdC (Luck et al.; Zimmer; Wartel). Jedes dieser Moleküle stellt für den Test einen überzeugenden Partner dar. Mit Distamycin A kann die Empfindlichkeit des Tests ermittelt werden, da es relativ schwach bindet. Actinomycin D bietet die Möglichkeit, beliebige flankierende Sequenzen zu verwenden, da die Erkennungsstelle von UL9 ein dGdC-Dinucleotid enthält. Aus diesem Grund kann vorausgesagt werden, daß alle Oligonucleotide, unabhängig von der Testsequenz, die die Assay-Stelle flankiert, von Actinomycin D gleichermaßen beeinträchtigt werden.
Außerdem wurde Doxorubicin, ein bekanntes Mittel gegen Krebs, das in sequenzbevorzugter Art und Weise an DNA bindet (Chen, K.-X., et al.), auf die bevorzugte Bindung einer DNA- Sequenz getestet, wobei der Test der vorliegenden Erfindung eingesetzt wurde.
Actinomycin D, Distamycin A und Doxorubicin wurden auf ihre Fähigkeit getestet, vorzugsweise die Bindung von UL9 an Oligonucleotide zu hemmen, die neben der UL9-Bindungsstelle unterschiedliche Sequenzen enthielten (Beispiel 6, Figur 5) Bindungstests wurden durchgeführt, wie in Beispiel 5 beschrieben. Diese Untersuchungen erfolgten unter Bedingungen, wobei UL9 gegenüber der DNA im Überschuß vorhanden war (d.h., der größte Teil der DNA lag im Komplex vor).
Distamycin A wurde mit fünf unterschiedlichen, die UL9- Screeningsequenz flankierenden Testsequenzen getestet: SEQ ID NO: 5 bis SEQ ID NO: 9. Die in Figur 10A gezeigten Ergebnisse machen deutlich, daß Distamycin A vorzugsweise die Bindung an die Testsequenzen UL9 polyT, UL9 polyA und, in geringerem Ausmaß, UL9 ATAT spaltet. Figur 10A zeigt außerdem die Konzentrationsabhängigkeit der Hemmwirkung von Distamycin A: Bei 1 uM Distamycin A sind die meisten DNA/Protein-Komplexe intakt (obere Bande), wobei in den Bahnen von UL9 polyT und UL9 polyA freie Sonde erscheint und etwas freie Sonde in der Bahn von UL9 ATAT zu sehen ist; bei 4 uM erscheint freie Sonde in den Bahnen von UL9 polyT und UL9 polyA; bei 16 uM ist freie Sonde in den Bahnen von UL9 polyT und UL9 polyA zu sehen; und bei 40 uM sind die DNA/Protein-Komplexe in den Bahnen von polyT, UL9 polyA und UL9 ATAT nahezu vollständig gespalten, während in den anderen Bahnen noch etwas der DNA/Protein-Komplexe vorliegt. Diese Ergebnisse stimmen mit der bekannten Präferenz von Distamycin A für die Bindung an nicht-alternierende AT- reiche Sequenzen überein.
Actinomycin D wurde mit acht unterschiedlichen, die UL9- Screeningsequenz flankierenden Testsequenzen getestet: SEQ ID NO: 5 bis SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 11 bis SEQ ID NO: 13. Die in Figur 10B dargestellten Ergebnisse machen deutlich, daß Actinomycin D vorzugsweise die Bindung von UL9-COOH an die Oligonucleotide UL9 CCCG (SEQ ID NO: 5) und UL9 GGGC (SEQ ID NO: 6) spaltet. Diese Oligonucleotide enthalten drei bzw. fünf dGdC-Dinucleotide zusätzlich zum dgdc-Dinucleotid in der UL9- Erkennungssequenz. Dieses Ergebnis stimmt mit den bekannten Bindungspräferenzen von Actinomycin D für die Dinucleotidsequenz dGdC überein. Offensichtlich wird die Funktion des Tests nicht durch das Vorliegen einer möglichen Zielstelle in der Screeningsequenz (oriS, SEQ ID NO: 1) gestört, wie vorstehend erwähnt.
Doxorubicin wurde mit acht unterschiedlichen die UL9- Screeningsequenz flankierenden Testsequenzen getestet: SEQ ID NO: 5 bis SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 11 bis SEQ ID NO: 13. Die in Figur 100 dargestellten Ergebnisse machen deutlich, daß Doxorubicin vorzugsweise die Bindung an oriEco3 spaltet, dessen Testsequenz sich von oriEco2 nur in einer Base unterscheidet (vgl. SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13). Figur 100 zeigt außerdem die Konzentrationsabhängigkeit der Hemmwirkung von Doxorubicin: Bei 15 uM Doxorubicin ist die Bindung von UL9 an die Screeningsequenz stark beeinträchtigt, wenn oriEco3 die Testsequenz ist, und schwächer beeinträchtigt, wenn polyT, UL9 GGGO oder oriEco2 die Testsequenz ist; und bei 35 uM Doxorubicin sind die meisten DNA/Protein-Komplexe fast vollständig gespalten, wobei bei UL9 polyT und UL9 ATAT noch etwas DNA zu sehen ist, die im Komplex mit dem Protein vorliegt. Bei Einsatz von 150 nM Doxorubicin wurden auch Effekte beobachtet, die ähnlich waren wie die bei 15 uM, nur wurden sie erst zu einem späteren Zeitpunkt festgestellt.
Die längere Inkubation mit dem jeweiligen Arzneistoff führte zu einer weiteren Spaltung der Bindung. Wenn man davon ausgeht, daß die Inkubationszeit von einer Stunde in den vorstehenden Tests mehreren Halbwertszeiten des DNA/Protein-Komplexes entspricht, läßt die weitere Spaltung der Bindung vermuten, daß die On-Rate für die Arzneistoffe vergleichsweise langsam ist.
Die Tatsache, daß mit diesem Test unter Verwendung von schwach DNA-bindenden Molekülen mit wenig Sequenzspezifität (wie z.B. Distamycin A) die Präferenzen für die Bindung an bestimmte Sequenzen bestimmt werden können, spricht überzeugend für den Test. Daraus kann man folgern, daß der vorliegende Test für die Identifizierung von Molekülen, die eine bessere Sequenzspezifität und/oder eine höhere Bindungsaffinität für bestimmte Sequenzen besitzen, gut geeignet ist. Ferner machen die Ergebnisse deutlich, daß der bekannte Antikrebs-Arzneistoff Doxorubicin sequenzbevorzugt bindet. Dieses Ergebnis zeigt, daß der Test für das Screening von Gemischen nach Molekülen verwendet werden kann, die ähnliche Eigenschaften besitzen und die anschließend auf Antikrebs-Aktivitäten und auch auf eine sequenzspezifische Bindung getestet werden können.
Andere Verbindungen, die für den Test des vorliegenden DNA/Protein-Systems oder zur Definition anderer DNA/Protein- Systeme verwendet werden können, umfassen die folgenden: Echinomycin, das vorzugsweise an die Sequenz (A/T)CGT bindet (Quigley et al.); kleine anorganische Moleküle, wie z.B. Cobalthexamin, die bekanntermaßen die Z-DNA-Bildung in Regionen induzieren, die repetitive GC-Sequenzen enthalten (Gessner et al.); und andere DNA-bindende Proteine, wie z.B. EcoRI, eine Restriktionsendonuclease.

H. Theoretische Überlegungen zur Konzentration von Testkomponenten

Im Test gibt es zwei Komponenten, die Testsequenz (Oligonucleotid) und die DNA-bindenden Domäne von UL9, die nachstehend beschrieben wird. Bei der Entwicklung des erfindungsgemäßen Testsystems wurden verschiedene theoretische Überlegungen berücksichtigt. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Test als Massenscreeningtest eingesetzt. In diesem Fall sind kleine Volumina und Konzentrationen wünschenswert. In einem typischen Test werden etwa 0,1 ug DNA in einem Reaktionsvolumen von 15 bis 20 ul (etwa 0,3 nM) eingesetzt. Die Proteinkonzentration liegt im Überschuß vor und kann variiert werden, wodurch die Empfindlichkeit des Tests erhöht oder verringert kann. Im einfachsten Fall, wenn das kleine Molekül als kompetitiver Inhibitor über eine sterische Hinderung wirkt, können die Kinetiken des Systems durch die folgenden Gleichungen beschrieben werden:
D + P D : P, wobei kfp/kbp = Keq,p = [D : P]/[D][P]
und
D + X D : X, wobei kfx/kbx = Keq,x = [D : X]/[D][X]
D = DNA, P Protein, X = DNA-bindendes Molekül, kfp und kfx sind die Raten der Vorwärts-Reaktion für die DNA/Protein-Wechselwirkung bzw. die DNA/Arzneistoff-Wechselwirkung und kbp und kbx sind die Raten der Rückwärts-Reaktionen für die entsprechenden Wechselwirkungen. In den Klammern [] sind die mclaren Konzentrationen der Komponenten angegeben.
Im Test konkurrieren das Protein P und das DNA-bindende Molekül oder der Arzneistoff X um die DNA. Wenn die Hemmung durch eine sterische Hinderung zustande kommt, kann man annehmen, daß die zwei Moleküle um dieselbe Stelle konkurrieren. Wenn die Konzentration der DNA und die Konzentration des DNA/Arzneistoff- oder DNA/Protein-Komplexes gleich sind, ist die Gleichgewichts-Bindungskonstante Keq gleich dem Kehrwert der Proteinkonzentration (1/[P]). Für UL9 beträgt die berechnete Keg,UL9 = 2,2 x 10&sup9; M&supmin;¹. Wenn alle drei Komponenten mit einander gemischt werden, kann die Beziehung zwischen dem Arzneistoff und dem Protein beschrieben werden als
Keq,p = z(Keq,x
wobei "z" den Unterschied in der Affinität für die DNA zwischen P und X darstellt. Wenn z.B. z = 4, dann ist die Affinität des Arzneistoffs für das DNA-Molekül viermal niedriger als die Affinität des Proteins für das DNA-Molekül. Die Konzentration von X muß daher viermal größer sein als die Konzentration von P, damit beide gleich stark um das DNA-Molekül konkurrieren können. Somit definiert die Gleichgewichts-Affinitätskonstante von UL9 den minimalen Spiegel, der nachgewiesen werden kann, bezogen auf die Konzentration und/oder Affinität des Arzneistoffs. DNA-bindende Moleküle mit niedriger Affinität können nur bei hohen Konzentrationen nachgewiesen werden; entsprechend können Moleküle mit hoher Affinität in relativ niedrigen Konzentrationen nachgewiesen werden.
Bei bestimmten Testsequenzen wurde eine vollständige Hemmung der UL9-Bindung bei deutlich niedrigeren Konzentrationen beobachtet, als man aus diesen Analysen schließen konnte, was möglicherweise darauf hinweist, daß einige der Stellen, die für Untersuchungen der praktischen Anwendbarkeit ausgewählt wurden, Affinitäten besitzen, die höher sind als früher veröffentlicht. Zu beachten ist, daß relativ hohe Konzentrationen bekannter Arzneistoffe dazu verwendet werden können, die Sequenzspezifität zu testen. Außerdem kann die Bindungskonstante von UL9 einfach erniedrigt werden, indem der pH-Wert oder die Salzkonzentration im Test verändert werden, sofern dies wünschenswert ist, um nach Molekülen zu suchen, die in einer niedrigen Konzentration vorliegen (z.B. in einer Fermentationsbrühe oder in einem Extrakt).
Die Analysen, die vorstehend dargestellt wurden, werden komplexer, wenn die Hemmung allosterisch (nicht-kompetitive Hemmung) und nicht durch eine Kompetition mittels sterischer Hinderung erfolgt. Trotzdem ist die Wahrscheinlichkeit ziemlich groß, daß die relative Wirkung eines Inhibitors auf verschiedene Testsequenzen auf seine relative und charakteristische Affinität für die verschiedenen Testsequenzen zurückzuführen ist. Dies trifft insbesondere bei den Tests zu, bei denen alle Sequenzen in einer geordneten Gruppe getestet werden (z.B. mögliche Sequenzen einer bestimmten Länge oder alle möglichen Variationen einer bestimmten Basenzusammensetzung und definierten Länge). In kurzen Worten, falls die Hemmwirkung im Test für eine einzelne Sequenz besonders stark ist, ist es wahrscheinlich, daß der Inhibitor an diese besondere Sequenz mit einer höheren Affinität bindet als an die anderen Sequenzen. Während die absolute Affinität des Inhibitors möglicherweise schwierig zu bestimmen ist, sind die relativen Affinitäten mit großer Wahrscheinlichkeit ziemlich genau. Diese Information ist z.B. sehr nützlich, um molekulare Modellsysteme verbessern zu können.

I. Verwendung des Tests unter Bedingungen einer hohen Proteinkonzentration

Wenn das Screeningprotein in sehr hohen Konzentrationen zum Testsystem zugegeben wird, bindet das Protein, außer an die Screeningsequenz, noch an unspezifische Stellen auf dem Oligonucleotid. Dieser Effekt wurde unter Verwendung von Bandenverschiebungsgelen gezeigt. Insbesondere wenn Verdünnungsreihen des Proteins UL9 hergestellt und die verschiedenen Verdünnungen jeweils mit einer konstanten Konzentration eines Oligonucleotids gemischt wurden, wurde bei sehr starken Verdünnungen (z.B. 1:100 000) keine Bindung (die durch eine Bandenverschiebung angezeigt wird) beobachtet, bei mittleren Verdünnungen (z.B. 1:100) war eine einzelne Bandenverschiebung zu sehen und bei hohen Proteinkonzentrationen (z.B. 1:10) war ein verschmierter Fleck zu erkennen, der höher wanderte als die bei mittleren Verdünnungen beobachtete einzelne Bande. Im Bandenverschiebungstest bedeutet ein verschmierter Fleck eine gemischte Population von Komplexen, die alle vermutlich das Screeningprotein enthalten, das mit hoher Affinität an die Screeningsequenz bindet (z.B. für UL9, K&sub2; = 1,1 x 10&sup9; M&supmin;¹), die jedoch außerdem eine größere Zahl von Proteinen umfassen, die mit deutlich geringerer Affinität gebunden sind.
Einige der mit geringer Affinität bindenden Proteine werden an die Testsequenz gebunden. In Experimenten, die zur Bestätigung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wobei Gemische aus UL9 und Glutathion-S-Transferase eingesetzt wurden, sind die mit geringer Affinität bindenden Proteine wahrscheinlich UL9 oder weniger wahrscheinlich Glutathion-S- Transferase, da diese beiden die einzigen Proteine im Testgemisch sind. Diese mit geringer Affinität bindenden Proteine sind signifikant empfindlicher gegenüber einer störung durch ein an die Testsequenz bindendes Molekül, wobei zwei Gründe eine Rolle spielen. Erstens kommt die Störung wahrscheinlich durch eine direkte sterische Hinderung zustande und beruht nicht auf induzierten Konformationsänderungen in der DNA; zweitens ist das Protein, das an die Teststelle bindet, ein mit geringer Affinität bindendes Protein, da die Teststelle nicht seine entsprechende Bindungssequenz darstellt. Im Fall von UL9 scheint der Unterschied in der Affinität zwischen der Bindung mit geringer Affinität und der Bindung mit hoher Affinität mindestens zwei Größenordnungen auszumachen.
Experimente, die zur Bestätigung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigen, daß bei den Filterbindungstests mehr DNA/Protein-Komplexe eingefangen werden, wenn mehr Protein an die DNA gebunden ist. Die relativen Ergebnisse sind genau, jedoch bindet bei mittleren Proteinkonzentrationen nicht die gesamte gebundene DNA (wie durch Bandenverschiebungstests gezeigt) an das Filter, außer wenn mehr als ein DNA/Protein-Komplex pro Oligonucleotid vorliegt (z.B. im Fall von UL9 mehr als ein UL9/DNA-Komplex). Aus diesem Grund zeigt der Test unter Bedingungen mit einer hohen Proteinkonzentration eine ausgezeichnete Empfindlichkeit. Wenn z.B. Actinomycm an die DNA an eine Teststelle unter Bedingungen bindet, wobei ein einziger DNA/UL9-Komplex pro Oligonucleotid vorliegt, wurde eine charakteristische Bindung an GC-reichen Oligonucleotiden beobachtet (vgl. Beispiel 6). Unter Bedingungen einer hohen Proteinkonzentration, wobei mehr als ein DNA/UL9- Komplex pro Oligonucleotid vorliegen, ist der charakteristische Effekt von Actinomycin D noch stärker ausgeprägt. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Wirkung von Actinomycin D auf eine Teststelle, an die ein Protein schwach gebunden ist, einfacher nachgewiesen werden kann als die Wirkung von Actinomycm D auf die benachbarte Screeningsequenz. Aus diesem Grund kann die Empfindlichkeit des Tests durch die Verwendung hoher Proteinkonzentrationen gesteigert werden.

II. Einfang/Nachweissysteme

Als Alternative zu den vorstehend beschriebenen Bandenverschiebungsgelen und Filterbindungstests können Inhibitoren entweder durch die Messung des spiegels der ungebundenen DNA in Anwesenheit von Testmolekülen oder -gemischen oder durch die Messung des Spiegels des DNA/Protein-Komplexes, der in Anwesenheit von Testmolekülen oder -gemischen verbleibt, bestimmt werden. Die Messungen können entweder im Gleichgewicht oder in einem kinetischen Test vor Erreichen des Gleichgewichts durchgeführt werden. Auf welche Art und Weise die Messung durchgeführt wird, wird durch praktische Faktoren bestimmt, wie z.B. die Zeitspanne bis zum Erreichen des Gleichgewichts, die sowohl durch die Kinetiken der DNA/Protein-Wechselwirkung als auch durch die Kinetiken der DNA/Arzneistoff- Wechselwirkung bestimmt wird. Die Ergebnisse (d.h. der Nachweis von DNA-bindenden Molekülen und/oder die Bestimmung ihrer Sequenzpräferenzen), die mit den unterschiedlichen Messverfahren (Kinetik oder Gleichgewicht) erhalten werden, sollten jedoch die gleichen sein.
In Figur 2 wird ein Test zum Nachweis von hemmenden Molekülen erläutert, der auf ihrer Fähigkeit beruht, vorzugsweise die Bindung eines DNA-bindenden Proteins zu verhindern. In Anwesenheit eines inhibitorischen Moleküls (X) wird das Gleichgewicht zwischen dem DNA-bindenden Protein und seiner Bindungsstelle (Screeningsequenz) gestört. Das DNA-bindende Protein (O) wird von der DNA (/) in Gegenwart des Inhibitors (X) verdrängt, die DNA, an die kein Protein gebunden ist, oder alternativ die DNA/Protein-Komplexe, kann oder können sodann eingefangen und nachgewiesen werden.
Um eine maximale Empfindlichkeit zu erreichen, sollten ungebundene DNA und DNA/Protein-Komplexe effizient und schnell voneinander getrennt werden. Das Verfahren zum Einfangen von DNA sollte so erfolgen, daß die ungebundene DNA rasch aus dem proteinreichen Gemisch, das die DNA/Protein-Komplexe enthält, entfernt wird.
Auch wenn die Testmoleküle eine spezifische Wechselwirkung mit der DNA eingehen, können sie eine relativ niedrige Affinität aufweisen, außerdem können sie schwach an unspezifische DNA binden oder unspezifische Wechselwirkungen mit DNA in niedrigen Konzentrationen zeigen. In jedem dieser Fälle kann es sein, daß die Bindung an die DNA nur transient ist, wie die transiente Bindung eines Proteins in Lösung. Demgemäß besteht ein Merkmal des Tests darin, einen molekularen Schnappschuß des Gleichgewichtsstadiums einer Lösung aufzunehmen, die zusammengesetzt ist aus der Ziel/Test-DNA, dem Protein und dem inhibitorischen Testmolekül. In Gegenwart eines Inhibitors ist die Menge der DNA, an die kein Protein gebunden ist, größer als in Abwesenheit eines Inhibitors. Genauso ist in Gegenwart eines Inhibitors die Menge der DNA, an die Protein gebunden ist, kleiner als in Abwesenheit eines Inhibitors. Ein beliebiges Verfahren, das zur Auftrennung der DNA/Protein-Komplexe und der ungebundenen DNA eingesetzt wird, sollte schnell sein, denn, wenn das Einfangsystem in einer Lösung angewendet wird (sofern das Einfangsystem irreversibel ist), ändert sich das Verhältnis von ungebundener DNA zu DNA/Protein-Komplex mit einer bestimmten Rate, die gänzlich auf der Off-Rate des DNA/Protein-Komplexes beruht. In diesem Schritt wird somit festgelegt, wie hoch der Hintergrund ist. Das Einfangsystem sollte die DNA oder den DNA/Protein-Komplex schnell und fest binden, nicht jedoch das Protein und den Inhibitor. Je länger das Einfangsystem mit dem gesamten Gemisch aus ungebundener DNA und DNA/Protein-Komplexen in Lösung in Kontakt gelassen wird, desto höher wird der Hintergrund, unabhängig vom Vorliegen oder von der Abwesenheit des Inhibitors.
Zwei Beispiele von Einfangsystemen für die Verwendung im vorliegenden Test werden nachstehend beschrieben. Das eine Einfangsystem wurde so konstruiert, daß es ungebundene DNA einfängt (Abschnitt II.A). Das andere Einfangsystem wurde so konstruiert, daß es DNA/Protein-Komplexe einfängt (Abschnitt II.B). Beide Systeme können für Screeningtests mit hohem Durchlauf verwendet werden. Zum Nachweis der Moleküle, die mit Hilfe der beiden Einfangsysteme eingefangen werden, können die gleichen Verfahren eingesetzt werden (Abschnitt II.c)

A. Einfangen von ungebundener DNA

In einem Einfangsystem, das im Lauf von Experimenten entwickelt wurde, die zur Bestätigung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wird die Wechselwirkung von Streptavidin und Biotin dafür genutzt, ungebundene DNA rasch aus dem proteinreichen Gemisch einzufangen, das ungebundene DNA, DNA/Protein-Komplexe, überschüssiges Protein und die Testmoleküle oder Testgemische enthält. Streptavidin bindet mit extrem hoher Affinität an Biotin (Kd - 10&supmin;¹&sup5; M) (Chaiet et al; Green), somit zeigt das Streptavidin/Biotin-System zwei Vorteile, nämlich die Bindung der zwei Moleküle aneinander kann rasch erfolgen und die Wechselwirkung ist die stärkste nicht-kovalente Wechselwirkung, die man kennt.
In diesem Nachweissystem ist ein Biotinmolekül kovalent mit der Oligonucleotid-Screeningsequenz (d.h. der Bindungsstelle des DNA-bindenden Proteins) verknüpft. Diese Verknüpfung erfolgt so, daß die Bindung des DNA-bindenden Proteins an die DNA nicht gestört wird. Außerdem verhindert das Protein, wenn es an die biotinylierte Sequenz gebunden ist, die Bindung von Streptavidin an das Biotin. Mit anderen Worten ist das DNA-bindende Protein befähigt, das Biotin davor zu schützen, von einem Streptavidin erkannt zu werden. Diese DNA/Protein- Wechselwirkung wird in Figur 3 erläutert.
Das Einfangsystem wird in der vorliegenden Beschreibung zusammen mit dem vorstehenden UL9/oriS-System eingesetzt. Die folgenden allgemeinen Grundsätze des Tests können jedoch auch für die Bestimmung anderer DNA/Protein-Wechselwirkungen angewendet werden. Ob dieses Systems eingesetzt werden kann, hängt von den biophysikalischen Eigenschaften der jeweiligen DNA/Protein-wechselwirkung ab.

1. Modifikation der Protein-Erkennungssequenz mit Biotin

Die Erkennungssequenz für die Bindung des Proteins UL9 (Kaff et al.) ist in Figur 4 unterstrichen. Oligonucleotide wurden synthetisiert, die die UL9-Bindungsstelle enthielten und die an mehreren Positionen innerhalb der Bindungssequenz stellenspezifisch biotinyliert waren (SEQ ID NO: 14; Beispiel 1, Figur 4). Diese biotinylierten Oligonucleotide wurden sodann in Bandenverschiebungstests eingesetzt, wobei die Fähigkeit des Proteins UL9 bestimmt wurde, an das Oligonucleotid zu binden. Diese Experimente unter Verwendung der biotinylierten Sonde und einer nicht-biotinylierten Sonde als Kontrolle zeigen, daß das Vorliegen eines Biotins in Position #8-T (biotinyliertes Desoxyuridin) des unteren Strangs die vorstehend aufgezählten Bedingungen erfüllt. So führt das Vorliegen einer Biotineinheit in Position #8 des unteren Strangs zu keiner deutlichen Beeinträchtigung der Spezifität von UL9 für die Erkennungsstelle; ferner erkennt Streptavidin in Gegenwart von gebundenem UL9 nicht das Vorliegen der Biotineinheit im Oligonucleotid. Eine Biotinylierung in anderen A- oder T-Positionen ergab nicht die zwei erforderlichen Eigenschaften (d.h die Bindung von UL9 und den Schutz vor Streptavidin). So verhinderte die Biotinylierung des Adenosinrestes in Position #8 des oberen Strangs die Bindung von UL9; nach der Biotinylierung von Adenosin- oder Thymidinresten (oberer oder unterer Strang) in den Positionen #3, #4, #10 oder #11 konnte jeweils die Bindung von UL9 erfolgen, jedoch war in jedem Fall Streptavidin befähigt, auch in Gegenwart von UL9 die vorliegende Biotineinheit zu erkennen und darüber an das Oligonucleotid zu binden.
Das vorstehende Ergebnis (die Fähigkeit von UL9, an ein Oligonucleotid zu binden, das ein Biotin innerhalb der Erkennungsstelle enthält, und das Biotin vor Streptavidin zu schützen) war unerwartet, denn Daten zur Beeinflussung durch Methylierung (Kaff et al.) zeigen, daß die Methylierung der Desoxyguanosinreste in den Positionen #7 und #9 der Erkennungssequenz (auf beiden Seiten des biotinylierten Desoxyuridinrestes) die Bindung von UL9 blockiert. In diesen Experimenten zur Beeinflussung durch Methylierung erfolgt die Methylierung der Guanosinreste durch Dimethylsulfat in Position N&sup7;, was strukturell der Position 5 des Pyrimidinrings entspricht, an der das Desoxyuridin biotinyliert ist. Diese Einheiten ragen alle in die große Furche der DNA hinein. Die Ergebnisse bezüglich der Beeinflussung durch Methylierung zeigen, daß die Desoxyguanosinreste in den Positionen #7 und #9 Kontaktpunkte für UL9 sind, deshalb kam das Ergebnis unerwartet, daß die Bindung durch eine zwischen diesen Resten vorliegende Biotineinheit nicht gestört wird.
Die Bindung des Proteins in voller Länge war relativ unbeeinflußt durch das Vorliegen einer Biotineinheit in Position #8 innerhalb der UL9-Bindungsstelle. Die Dissoziationsraten für UL9 in voller Länge von sowohl biotinylierten als auch nicht-biotinylierten Oligonucleotiden waren ähnlich. Jedoch war die Dissoziationsrate des verkürzten Polypeptids UL9-COOH von den biotinylierten Oligonucleotiden höher als von nichtbiotinylierten Oligonucleotiden, wobei diese Dissoziationsrate mit derjenigen des Proteins in voller Länge von den beiden DNAs vergleichbar war.
Die Bedingungen für die Bindung wurden für UL9-COOH optimiert, so daß die Off-Rate des verkürzten UL9 vom biotinylierten Oligonucleotid 5 bis 10 Minuten betrug (die optimierten Bedingungen sind in Beispiel 4 wiedergegeben), dies ist eine Rate, die für einen Test zum Massenscreening geeignet ist. Ein Massenscreening unter Verwendung des DNA/Protein-Tests der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden, indem z.B. Platten mit vielen Vertiefungen eingesetzt werden.

2. Einfangen von stellenspezifisch biotinylierten Oligonucleotiden

Die Streptavidin/Biotin-Wechselwirkung kann auf verschiedene Art und Weise eingesetzt werden, um ungebundene DNA aus der Lösung zu entfernen, die die DNA, das Protein und das Testmolekül oder -gemisch enthält. Magnetische Polystyroloder Agarosekügelchen, an die Streptavidin kovalent gekoppelt oder über ein kovalent gekoppeltes Biotin verknüpft ist, können kurzzeitig mit der Lösung in Kontakt gebracht werden und dann durch Verwendung von Magneten bzw. einer Filtriervorrichtung wieder entfernt werden. Das Verfahren der Wahl sind zur Zeit magnetische Kügelchen, an die Streptavidin gekoppelt ist. Streptavidin wurde in vielen Experimenten eingesetzt, jedoch kann genauso gut auch Avidin verwendet werden.
Ein Beispiel eines zweiten Verfahrens zur Entfernung der ungebundenen DNA besteht darin, Streptavidin an ein Filter zu koppeln, indem zuerst Biotin an das Filter gebunden wird und daran dann Streptavidin gekoppelt wird, und anschließend die unspezifischen Proteinbindungsstellen auf dem Filter mit einem unspezifischen Protein, wie z.B. Albumin, zu blockieren. Das Gemisch wird sodann durch das Filter passiert, die ungebundene DNA wird festgehalten und die gebundene DNA läuft durch das Filter durch.
Ein herkömmliches Verfahren zur Abtrennung der eingefangenen DNA besteht in der Verwendung von superparamagnetischen Polystyrolkügelchen, an die Streptavidin konjugiert ist, wie in Beispiel 7 beschrieben. Diese Kügelchen werden zum Testgemisch zugegeben, um die ungebundene DNA einzufangen. Nach dem Einfangen der DNA können die Kügelchen wiedergewonnen werden, indem die Reaktionsröhrchen in einen magnetischen Ständer gestellt werden, wobei die Kügelchen zur Wand der Reaktionskammer angezogen werden, whrend das Testgemisch entfernt wird, sodann werden die Kügelchen gewaschen. Die eingefangene DNA wird anschließend mit Hilfe eines der nachstehend beschriebenen DNA-Nachweissysteme nachgewiesen.
In einer anderen Ausführungsform können mit Avidin beschichtete Agarosekügelchen verwendet werden. Biotinylierte Agarosekügelchen (immobilisiertes D-Biotin, Pierce) werden mit Avidin verknüpft. Avidin besitzt wie Streptavidin vier Bindungsstellen für Biotin. Eine dieser Bindungsstellen wird verwendet, um das Avidin an das Biotin zu binden, das über einen 16-Atom-Abstandshalterarm an die Agarosekügelchen gekoppelt ist. Hierbei bleiben die anderen Biotin-Bindungsstellen verfügbar. Zum Einfangen biotinylierter DNA werden die Kügelchen mit Bindungsgemischen gemischt (Beispiel 7). Andere Verfahren, die anstelle der gerade beschriebenen Kügelchen-Einfangverfahren verwendet werden können, umfassen die folgenden Träger, an die Streptavidin oder Avidin gekoppelt ist: Filter, die eine niedrige Proteinkonzentration binden, oder Platten mit 96 Vertiefungen.

B. Einfangen von DNA/Protein-Komplexen

Die relative Wirkung eines inhibitorischen Moleküls kann auch gemessen werden, indem die Menge des DNA/Protein-Komplexes, die im Testgemisch in Gegenwart des inhibitorischen Moleküls zurückbleibt, bestimmt wird. Eine Nettoabnahme der Menge des DNA/Protein-Komplexes als Antwort auf ein Testmolekül ist ein Zeichen für das Vorliegen eines Inhibitors. DNA-Moleküle, an die Protein gebunden ist, können auf Nitrocellulosefiltern eingefangen werden. Unter Bedingungen einer niedrigen Salzkonzentration kann DNA, an die kein Protein gebunden ist, direkt durch das Filter durchlaufen. Auf diese Weise können die DNA/Protein-Komplexe und die ungebundenen DNA-Moleküle rasch voneinander getrennt werden, indem das Testgemisch schnell durch ein Nitrocellulosefilter passiert wird. Dies erfolgte auf Nitrocelluloseplättchen unter Verwendung einer Vakuumfiltrierapparatur oder auf Slot-Blot- oder Dot-Blot-Vorrichtungen (die alle von Schleicher und Schuell, Keene, NH, verfügbar sind). Hierbei wird das Testgemisch auf die angefeuchtete Nitrocellulose aufgetragen und läuft rasch durch, wobei Vakuum- Bedingungen angewendet werden. Für dieses System kann eine beliebige Vorrichtung verwendet werden, wobei Nitrocellulosefilter oder andere Filter eingesetzt werden, die befähigt sind, Protein zurückzuhalten, während freie DNA durch das Filter durchlaufen kann.

C. Nachweissysteme

Für jedes der vorstehenden Einfangverfahren wird die eingefangene DNA-Menge quantitativ bestimmt. Das Verfahren zur quantitativen Bestimmung hängt davon ab, wie die DNA präpariert wurde. Wenn die DNA radioaktiv markiert ist, können die Kügelchen in einem Szintillationszähler gezählt werden oder Autoradiogramme von getrockneten Gelen oder Nitrocellulosefiltern erstellt werden. Die DNA-Menge wurde im letzteren Fall durch ein Densitometer (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) quantitativ bestimmt; alternativ können Filter oder Gele, die radioaktiv markierte Proben enthalten, unter Verwendung eines "Phosphoimager" (Molecular Dynamics) gemessen werden. Die eingefangene DNA kann auch unter Einsatz eines Chemilumineszenzoder Kolorimetrie-Nachweissystems nachgewiesen werden.
Die radioaktive Markierung und die Chemilumineszenz sind (i) sehr empfindlich, wobei Mengen eines Oligonucleotids nachgewiesen werden können, die unter dem Femtomol-Bereich liegen, und werden (ii) anhand bewährter Techniken durchgeführt. Im Fall des Nachweises mittels Chemilumineszenz wurden die Vorschriften so entwickelt, daß der Test zum Massenscreening eingesetzt werden kann. Bei Techniken zum Nachweis von Nicht-Isotopen-DNA wird prinzipiell als nachweisbare Markierung alkalische Phosphatase verwendet, wobei die Fähigkeit des Enzyms genutzt wird, ein Substrat mit hohem Umsatz zu einem Produkt umzuwandeln, und Substrate verfügbar sind, die chemilumineszierende oder gefärbte Produkte ergeben.

1. Radioaktive Markierung

Bei vielen vorstehend beschriebenen Experimenten bzgl. UL9 zur Untersuchung der DNA/Protein-Bindung wurden radioaktiv markierte Oligonucleotide eingesetzt. Die Techniken, die zur Radiomarkierung von Oligonucleotiden verwendet wurden, wurden vorstehend diskutiert. Eine spezifische Aktivität von 10&sup8; bis 10&sup9; cpm pro ug DNA wird routinemäßig unter Verwendung von Standardverfahren erreicht (z.B. Endmarkierung des Oligonucleotids mit Adenosin-γ- [³²P]-5'-triphosphat und T4-Polynucleotidkinase). Dieser Level der spezifischen Aktivität macht es möglich, kleine DNA-Mengen zu messen, entweder durch Autoradiographie von Gelen oder Filtern, die mit einem Film in Kontakt gebracht werden, oder durch direktes Zählen von Proben in Szintillationsflüssigkeit.

2. Nachweis von Chemilumineszenz

Der Nachweis von Chemilumineszenz kann durch Nachweis von Digoxigenin-markierten Oligonucleotiden (Beispiel 1) erfolgen, wobei das von Tropix, Inc., entwickelte Chemilumineszenz-Nachweissystem "SOUTHERN LIGHTS" eingesetzt wird. Das Nachweissystem ist in den Figuren 11a und 11b schematisch dargestellt. Die Technik kann zum Nachweis von DNA verwendet werden, die auf Kügelchen, Filtern oder in Lösung eingefangen wurde.
Die alkalische Phosphatase wird an die eingefangene DNA gekoppelt, ohne das Einfangsystem zu beeinflussen. Hierfür können verschiedene Verfahren angewendet werden, die von üblicherweise verwendeten ELISA-Techniken (Harlow et al.; Pierce, Rockford, IL) hergeleitet werden. Z.B. wird eine Antigeneinheit in die DNA an Stellen eingebaut, so daß keine Beeinflussung (i) der DNA/Protein-wechselwirkung, (ii) der DNA/Arzneistoff-wechselwirkung oder (iii) des Einfangsystems erfolgt. Im DNA/Protein-Biotinsystem für UL9 wurde die DNA mit Digoxigenin-11-dUTP (dig-dUTP) und terminaler Transferase endmarkiert (Beispiel 1, Figur 4). Nachdem die DNA eingefangen und aus dem DNA/Protein-Gemisch abgetrennt worden war, wurde ein mit alkalischer Phosphatase konjugierter Anti-Digoxigenin- Antikörper (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) mit dem Digoxigenin-enthaltenden Oligonucleotid umgesetzt. Die Digoxigenin-Antigeneinheit wurde vom Antikörper-Enzym-Konjugat erkannt. Das Vorliegen von dig-dTUP veränderte weder die Fähigkeit des Proteins UL9-COOH, an die oriS-SEQ ID NO: 1-enthaltende DNA zu binden, noch die Fähigkeit von Streptavidin, an das eingebaute Biotin zu binden.
Die eingefangene DNA wurde unter Verwendung von mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antikörpern gegen Digoxigenin folgendermaßen nachgewiesen. Ein chemilumineszierendes Substrat für alkalische Phosphatase ist 3-(2'-Spiroadamantan)-4- methoxy-4-(3-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan-Dinatriumsalz (AMPPD) (Beispiel 7). Die Dephosphorylierung von AMPPD führt zu einer instabilen Verbindung, die zerfällt und dabei eine langfristige gleichmäßige Emission von Licht bei 477 nm bewirkt. Die Lichtmessung ist sehr empfindlich, wobei winzige DNA-Mengen nachgewiesen werden können (z.B. 10² bis 10³ Attomole) (Beispiel 7).
Außerdem wurden für das Alkalische-Phosphatase-System kolorimetrische Substrate getestet, die im vorliegenden Testsystem verwendet werden können.
Eine Alternative zum vorstehenden Biotin-Einfangsystem besteht darin, anstelle von Biotin Digoxigenin zu verwenden, wodurch das Oligonucleotid an einer Stelle modifiziert wird, die durch Bindung des DNA-bindenden Proteins an die Assaystelle geschützt wird. Anschließend wird Biotin anstelle der im vorstehend beschriebenen Nachweissystem verwendeten Digoxigenineinheiten eingesetzt. In dieser Zusammenstellung wird der Anti-Digoxigenin-Antikörper zum Einfangen der Oligonucleotidsonde eingesetzt, an die kein Protein gebunden ist. Sodann wird anhand des mit alkalischer Phosphatase konjugierten Streptavidins das Vorliegen eingefangener Oligonucleotide nachgewiesen.

D. Andere Verfahren zum Nachweis von Molekülen, die die Affinität des DNA-bindenden Proteins für seine entsprechende Stelle erhöhen

Einerseits können Moleküle oder Verbindungen identifiziert werden, die eine verminderte Affinität des DNA-bindenden Proteins für die Screeningsequenz bewirken, andererseits können jedoch auch Moleküle identifiziert werden, die die Affinität des Proteins für seine entsprechende Bindungsstelle erhöhen. In diesem Fall kann eine kqnstante Off-Rate für eine DNA/Protein-Wechselwirkung (z.B. SEQ ID NO: 1/UL9) bestimmt werden, indem das Einfangsystem für ungebundene DNA mit dem Testgemisch länger in Kontakt gelassen wird. In Gegenwart eines stabilisierenden Moleküls wird die Off-Rate, die durch das Einfangsystem zu bestimmten Zeitpunkten nachgewiesen wird, herabgesetzt.
Wenn das Einfangsystem für DNA/Protein-Komplexe zum Nachweis von Molekülen verwendet werden soll, die die Affinität des DNA-bindenden Proteins für die Screeningsequenz erhöhen, muß ein Überschuß an unmarkiertem Oligonucleotid, das die UL9- Bindungsstelle enthält (nicht jedoch die Testsequenzen), zum Testgemisch zugegeben werden. Dies ist ein Experiment, mit dem die Off-Rate bestimmt werden kann. In diesem Fall zeigt die Kontrollprobe (keine Testmoleküle oder -gemische werden zugegeben) eine konstante Off-Rate (d.h., Proben werden in bestimmten Abständen nach der Zugabe des unmarkierten Kompetitions-DNA-Moleküls entnommen, auf Nitrocellulose aufgetragen und eine abnehmende Menge des radioaktiv markierten DNA/Protein-Komplexes festgestellt). In Gegenwart eines DNA-bindenden Testmoleküls, das die Bindung von UL9 steigerte, wäre die Off- Rate dann herabgesetzt (d.h., die beobachtete Menge der radioaktiv markierten DNA/Protein-Komplexe hat zu den bestimmten Zeitpunkten nicht so stark abgenommen wie in der Kontrollprobe).

III. Verwertbarkeit

A. Die Anwendbarkeit von sequenzspezifischen DNA-bindenden Molekülen

Die vorliegende Erfindung beschreibt einen in vitro- Screeningtest mit hohem Durchsatz, mit dem große Sammlungen von biologischen oder chemischen Gemischen auf das Vorliegen von DNA-bindenden Molekülen abgesucht werden können, die eine Präferenz für die Bindung an eine bestimmte Sequenz aufweisen. Mit dem Test können auch die Sequenzspezifität und die relative Affinität bekannter DNA-bindender Moleküle oder gereinigter unbekannter DNA-bindender Moleküle bestimmt werden. Sequenzspezifische DNA-bindende Moleküle sind aus mehreren, hier genannten Gründen von besonderem Interesse. Anhand dieser Gründe können die Voraussetzungen für die Verwendung der DNA-bindenden Moleküle als Arzneimittel skizziert werden.
1. Im allgemeinen liegen für eine bestimmte DNA/Protein- Wechselwirkung in einer Zelle mehrere Tausend weniger Ziel- DNA-Bindungssequenzen vor als Proteinmoleküle, die an die DNA binden. Aus diesem Grund können sogar ziemlich toxische Moleküle noch in einer Konzentration, die niedrig genug ist, verabreicht werden, wobei sie eine biologische Wirkung zeigen, indem sie an die Ziel-DNA-Sequenzen binden.
2. Die Struktur der DNA ist im Vergleich zu RNA oder Protein genauer definiert. Da die DNA im allgemeinen in der Tertiärstruktur weniger Variationen aufweist, kann man annehmen, daß es einfacher ist, spezifische Moleküle, die an die DNA binden, neu zu gestalten, als solche Moleküle, die an RNA oder Protein binden. Die doppelsträngige DNA ist ein Gebilde aus sich wiederholenden Desoxyribonucleotiden, die so aufeinander gestapelt sind, daß eine lineare Helix-Struktur entsteht. Somit besitzt die DNA eine regelmäßige sich wiederholende "Gitter"- struktur, die für die Weiterentwicklung von Molekülmodellen und folglich für die Neugestaltung und die Entwicklung von Arzneistoffen besonders gut geeignet ist.
3. Viele Einzelkople ("single-copy")-Gene (von denen pro Zelle nur eine oder zwei Kopien vorliegen) werden in zahlreiche, möglicherweise Tausende RNA-Moleküle transkribiert, aus jedem dieser RNA-Moleküle können durch Translation wiederum viele Proteine entstehen. Aus diesem Grund kann ein Arzneistoff, dessen Ziel eine beliebige DNA-Stelle ist, die eine regulatorische Sequenz oder eine codierende oder nicht-codierende Sequenz sein kann, in einer viel niedrigeren Dosis verabreicht werden als ein Arzneistoff, dessen Ziel RNAs oder Proteine sind.
Die meisten zur Zeit verwendeten Therapeutika wirken auf Proteine (z.B. Enzyme, Rezeptoren oder Strukturproteine). Kürzlich wurden Antisense- oder Ribozym-Therapeutika eingeführt, derehziele RNA-Moleküle sind.
4. Wenn die Funktion einer RNA, die ein Protein codiert, oder die Funktion eines entsprechenden Proteins blockiert wird und dieses Protein mehrere zellulären Gene reguliert, kann sich dies schädigend auswirken, insbesondere dann, wenn eines der regulierten Gene für das Überleben der Zelle wichtig ist. Wenn jedoch eine DNA-Bindungsstelle blockiert wird, die nur für ein einziges Gen spezifisch ist, das durch ein solches Protein reguliert wird, wirkt sich das weniger toxisch aus.
Eine solche Situation (4) läßt sich z.B. mit der Bindung von HNF-1 an das Hepatitis-B-Virus (HBV) beschreiben. HNF-1 bindet an die HBV-Enhancer-Sequenz und stimuliert die Transkription der HBV-Gene (Chang et al.). In einer normalen Zelle ist HNF-1 ein Kernprotein, das für die Regulation zahlreicher Gene, insbesondere leberspezifischer Gene, wichtig zu sein scheint (Courtois et al.). Wenn man nun Moleküle isolieren würde, die spezifisch an die DNA-bindende Domäne von HNF-1 binden, käme es bei allen Gene, die durch HNF-1 reguliert werden, zu einer Regulierung nach unten, wobei sowohl virale als auch zelluläre Gene betroffen wären. Ein solcher Arzneistoff könnte sogar letal sein, da viele der durch HNF-1 regulierten Gene möglicherweise für die Leberfunktion erforderlich sind. Der erfindungsgemäße Test dagegen bietet die Möglichkeit, nach einem Molekül zu suchen, das zwischen der HNF-1-bindenden Region der Hepatitis-B-Virus-DNA und den zellulären HNF-1-Stellen unterscheiden kann, indem beim Screening nach dem Molekül z.B. abweichende flankierende Sequenzen berücksichtigt werden können. Ein solches Molekül würde spezifisch die Expression von HBV blockieren, ohne auf die Expression zellulärer Gene zu wirken.

B. Allgemeine Verwendung des Tests

Die allgemeine Verwendung des Tests umfaßt, ist jedoch nicht beschränkt auf das Screening von Sammlungen von noch nicht charakterisierten Verbindungen (z.B. biologischen, chemischen oder synthetischen Verbindungen) auf sequenzspezifische DNA-bindende Moleküle (Abschnitt III.B.1); die Bestimmung der Sequenzspezifität oder -präferenz und/oder der relativen Affinitäten von DNA-bindenden Molekülen (Abschnitt III.B.2); und den Test von modifizierten Derivaten der DNA-bindenden Moleküle auf eine veränderte Spezifität oder Affinität (Abschnitt III.B.3). Da jede Testverbindung auf bis zu 4N Sequenzen getestet wird, wobei N die Anzahl der in der Testsequenz vorliegenden Basenpaare ist, werden insbesondere anhand des Verfahrens bis zu 4N Struktur/Aktivität-Werte erhalten, mit denen die Beziehung zwischen der Struktur der Verbindung und der Bindungsaktivität analysiert werden kann, dies wird durch die Bindung eines Proteins an eine benachbarte Sequenz erreicht.

1. Massenscreening von Sammlungen auf das Vorliegen von sepuenzspezifischen DNA-bindenden Molekülen

Viele Organisationen (z.B. die National Institutes of Health, pharmazeutische und chemische Betriebe) besitzen große Sammlungen von chemischen oder biologischen Verbindungen aus synthetischen Verfahren, Fermentationsbrühen oder Extrakten, die möglicherweise bisher nicht identifizierte DNA-bindende Moleküle enthalten. Eine Anwendungsmöglichkeit des erfindungsgemäßen Tests besteht darin, das Testsystem für das Massenscreening solcher Sammlungen von verschiedenen Brühen, Extrakten oder Gemischen einzusetzen, um die spezifischen Proben zu identifizieren, die DNA-bindende Moleküle enthalten. Sobald die spezifischen Gemische, die die DNA-bindenden Moleküle enthalten, identifiziert wurden, kann mit Hilfe des Test des weiteren die Reinigung des DNA-bindenden Moleküls aus dem rohen Gemisch überwacht werden.
Wenn das Gemisch durch bestimmte Reinigungsverfahren gereinigt wird, können mit Hilfe des Tests die DNA-bindende Aktivität der jeweiligen Fraktionen getestet werden. Der Test ist für einen großen Durchlauf geeignet (z.B. im Format von Platten mit 96 Vertiefungen, automatisiert auf einer Roboter- Vorrichtung, z.B. einer Beckman Biomek Workstation [Beckman, Palo Alto, CA], wobei der Nachweis unter Verwendung von halbautomatischen Plattenlese-Densitometer, Luminometer oder "Phosphoimager" erfolgt).
2. Der Test der vorliegenden Erfindung kann auch zum Screening von Molekülen eingesetzt werden, die in der Literatur als DNA-bindende Moleküle beschrieben werden, deren Sequenzspezifität für die DNA-Bindung jedoch noch unbekannt ist (d.h., ihre Präferenz für die Bindung an spezifische DNA-Sequenzen wurde noch nicht bestimmt oder sie zeigen für bestimmte Bindungsstellen eine höhere Affinität, ohne daß jedoch die relative Präferenz für alle möglichen DNA-Bindungssequenzen definiert wurde). Der Test kann verwendet werden, um die spezifischen Bindungsstellen DNA-bindender Moleküle zu bestimmen, wobei alle möglichen Kombinationen von Sequenzen getestet werden können, an die das DNA-bindende Molekül mit hoher, niedriger oder mittlerer Affinität bindet. Actinomycin D, Distamycin A und Doxorubicin (Beispiel 6) sind Beispiele von Molekülen mit diesen Bindungstypen. Viele gegen Krebs eingesetzte Arzneistoffe, wie z.B. Doxorubicin (vgl. Beispiel 6), zeigen eine Bindungspräferenz für bestimmte identifizierte DNA-Sequenzen, wobei jedoch die Sequenzen, für die die absolut höchste und niedrigste Spezifität besteht, noch bestimmt werden müssen, denn bevor die vorliegende Erfindung beschrieben wurde, gab es nur beschränkte Verfahren (Salas, X., und Portugal, J.; Cullinane, C., und Phillips, D. R.; Phillips, D. R.; und Phillips, D. R. et al.), mit denen die DNA-Bindungsstellen eines beliebigen Arzneistoffs nachgewiesen werden konnten, an die er mit unterschiedlichen Affinitäten bindet. Doxorubicin zählt zu den am häufigsten gegen Krebs verwendeten Arzneistoffen, die zur Zeit verfügbar sind. Wie in Beispiel 6 gezeigt wird, weiß man, daß Doxorubicin an einige Sequenzen bevorzugt bindet. Ein weiteres Beispiel einer solchen Sequenzbindungspräferenz ist Daunorubicin (Chen et al.), das sich in der Struktur geringfügig von Doxorubicin unterscheidet (Goodman et al.). Sowohl Daunorubicin als auch Doxorubicin zählen zu der Familie der Anthracyclin-Antibiotika. Die Antibiotika dieser Familie und ihre Derivate sind wichtige Antitumormittel (Goodman et al.).
Mit dem Test der vorliegenden Erfindung können Sequenzpräferenzen oder -spezifitäten DNA-bindender Moleküle bestimmt werden. Die DNA-bindenden Moleküle, deren Sequenzpräferenz oder -spezifität bestimmt werden kann, umfassen kleine Moleküle, wie z.B. Aminoacridine und polycyclische Kohlenwasserstoffe, planare Farbstoffe, verschiedene DNA-bindende Antibiotika und Antikrebs-Arzneistoffe, außerdem DNA-bindende Makromoleküle, wie z.B. Peptide und Polymere, die an Nucleinsäuren binden (z.B. DNA und die derivatisierten DNA-Homologe, die an die DNA-Helix binden).
Die Moleküle, die im Test auf Sequenzpräferenz/spezifität und relative Affinität für unterschiedliche DNA-Stellen untersucht werden können, umfassen sowohl Stoffe, die an die große Furche als auch an die kleine Furche binden, ferner interkalierende und nicht-interkalierende DNA-bindende Substanzen.
3. Mit dem Test der vorliegenden Erfindung können einfacher Moleküle nachgewiesen werden, die aus bekannten DNA-bindenden Molekülen hergeleitet wurden und unterschiedliche Bindungsaffinitiäten aufweisen. Ein Beispiel ist die Identifizierung von Derivaten und der Test dieser Derivate auf DNA-bindende Aktivität unter Verwendung des erfindungsgemäßen Tests. Anschließend werden die Derivate mit einer DNA-bindenden Aktivität auf ihre Wirkung gegen Krebs getestet, wobei z.B. eine Testreihe des National Cancer Institute (Bethesda, MD) durchgeführt wird. Ferner kann der erfindungsgemäße Test zum Testen von Derivaten bekannter Antikrebsmittel verwendet werden, wobei die Wirkung verschiedener Modifikationen untersucht wird (z.B. Methylierung, Ethylierung und andere Derivatisierungen). Der Test stellt bereit: (i) ein primäres Absuchverfahren, mit dessen Hilfe bessere therapeutische Derivate bekannter Mittel gefunden werden können, und (ii) ein Verfahren, anhand dessen die Wirkweise solcher therapeutischen Derivate besser gezeigt werden kann.
4. Die Screeningkapazität dieses Tests ist viel größer, als wenn jede einzelne DNA-Sequenz mit einzelnen entsprechenden DNA-Bindungssequenz getestet wird. Für Massenscreeningtests werden üblicherweise meist direkte Kompetitionstests unter Verwendung einzelner Rezeptor/Ligand-Komplexe (z.B. eines spezifischen DNA/Protein-Komplexes) verwendet, wobei für jeden Test die Testkomponenten identifiziert, isoliert, gereinigt und hergestellt werden müssen. Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Tests können mit Hilfe eines einzigen Testsystems Sammlungen synthetischer Chemikalien oder biologischer Moleküle abgesucht werden, wobei Moleküle nachgewiesen werden können, die vorzugsweise an im Grunde jede beliebige spezifische DNA-Sequenz binden. Sekundäre Screeningverfahren, die die spezifische DNA/Protein-Wechselwirkung betreffen, sind möglicherweise nicht erforderlich, da die im Test nachgewiesenen inhibitorischen Moleküle direkt in einem biologischen System getestet werden können (z.B. auf die Fähigkeit, in einer Gewebekultur oder einem Tiermodell die Virusreplikation zu verhindem).

C. Die Ziel-Sequenzen des Tests

Der erfindungsgemäße DNA/Protein-Test wurde für ein Screening nach Verbindungen entwickelt, die an ein breites Spektrum von DNA-Sequenzen binden, die sich in Länge und Zusammensetzung unterscheiden. Die durch den Test entdeckten sequenzspezifischen DNA-bindenden Moleküle können als molekulare Reagenzien, Arzneimittel oder Arzneimittelvorstufen verwendet werden. In Tabelle 1 sind verschiedene mögliche spezifische Testsequenzen aufgelistet. Die sequenzspezifischen DNA-bindenden Moleküle sind wirksame Therapeutika für im wesentlichen jede beliebige Krankheit oder jeden Zustand, bei der/dem auf eine beliebige Art und Weise DNA beteiligt ist. Beispiele von Testsequenzen für den Test umfassen: a) Bindungssequenzen von Faktoren, die an der Erhaltung oder Vermehrung von Infektionserregern, insbesondere Viren, Bakterien, Hefen und anderen Pilzen, beteiligt sind, b) Sequenzen, die eine ungeeignete Expression bestimmter zellulärer Gene bewirken, und c) Sequenzen, die an der Replikation schnell wachsender Zellen beteiligt sind.
Außerdem muß die Genexpression oder Replikation nicht unbedingt dadurch gestört werden, daß die Bindung spezifischer Proteine blockiert wird. Auch spezifische Sequenzen innerhalb der codierenden Regionen von Genen (z.B. onkogenen) sind geeignete Testsequenzen, da kleine Moleküle, die an diese Sequenzen binden, wahrscheinlich die Transkription und/oder Replikation der Region stören. Schließlich können auch beliebige Moleküle, die an die DNA mit einer gewissen Sequenzspezifität binden, d.h. sie binden nicht direkt an eine einzige bestimmte Testsequenz, möglicherweise noch als Mittel gegen Krebs eingesetzt werden. Mehrere kleine Moleküle mit einer gewissen Sequenzpräferenz sind bereits als Medikamente gegen Krebs im Einsatz. Die durch den vorliegenden Test identifizierten Moleküle können insbesondere als "Leit"-Verbindungen dienen, aus denen verwandte Verbindungen (d.h. chemische Derivate eines Moleküls mit unterschiedlichen Spezifitäten) entwickelt werden können, die entweder eine unterschiedliche Spezifität oder eine unterschiedliche Affinität aufweisen können.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß man mit Hilfe des Tests nach einer Bindungsaktivität suchen kann, die gegen eine beliebige DNA-Sequenz gerichtet ist. Solche Sequenzen können medizinisch signifikante Zielsequenzen (vgl. Abschnitt 1, Medizinisch signifikante Zielstellen, in diesem Kapitel), gestreute oder nach dem Zufall erzeugte DNA- Sequenzen oder wohldef inierte, geordnete Gruppen von DNA-Sequenzen sein (vgl. Abschnitt 2, Geordnete Gruppen von Testsequenzen, in diesem Kapitel), die für ein Screening nach Molekülen verwendet werden können, die eine sequenzbevorzugte Bindung zeigen (wie Doxorubicin), wobei die Sequenzen mit der höchsten Bindungsaffinität und/oder die relativen Affinitäten zwischen einer großen Zahl unterschiedlicher Sequenzen bestimmt werden können. Beide Verfahren können eingesetzt werden, um neue Medikamente nachzuweisen und/oder um solche neu zu gestalten. In Abschnitt 3 dieses Kapitels, Theoretische überlegungen zur Auswahl von Zielsequenzen, werden die theoretischen überlegungen beschrieben, anhand derer bestimmte DNA- Zielstellen in einem biologischen System ausgewählt werden können.

1. Medizinisch signifikante Zielsequenzen

Zur Zeit sind nur wenige wirksame Medikamente gegen Viren verfügbar; jedoch wurden schon mehrere mögliche Zielsequenzen für antivirale DNA-bindende Arzneistoffe gut charkaterisiert. Außerdem wird in Zukunft, je mehr Sequenzdaten aller biologischen Systeme verfügbar sind, umfassend virale Genome, zelluläre Genome, Genome von Krankheitserregern (Bakterien, Pilzen, eukaryotischen Parasiten usw.), die Zahl der Zielstellen für DNA-bindende Arzneistoffe deutlich zunehmen. Medizinisch signifikante Zielstellen können als kurze DNA-Sequenzen definiert werden (etwa 4 bis 30 Basenpaare), die für die Expression und Replikation genetischen Materials erforderlich sind. Z.B können Sequenzen, an die regulatorische Faktoren, entweder für die Transkription oder die Replikation, binden, ideale Zielstellen für eine Veränderung der Gen- oder Virusexpression sein. Zweitens können codierende Sequenzen geeignete Zielstellen sein, um eine Genfunktion zu stören. Drittens können auch nicht-codierende, nicht-regulatorische Sequenzen interessante Zielstellen sein (z.B. zur Störung von Replikationsprozessen oder zur Einführung einer gesteigerten Mutationsfrequenz). Einige spezifische Beispiele von medizinisch signifikanten Zielstellen sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Medizinisch signifikante DNA-Bindungssequenzen
(Abkürzungen: EBV, Epstein-Barr-Virus; ERNA, Epstein-Barr-Virus-Kernantigen; HSV, Herpes-simplex-Virus; VZV, Varicella-Zoster-Virus; HPV, menschliches Papillomavirus; HIV LTR, Human Immunodeficiency Virus Long Terminal Repeat ("lange endständige Wiederholung" von HIV); NFAT, Kernfaktor von aktivierten T- Zellen; NFKB, Kernfaktor kappaB; AIDS, Acquired Immune Deficiency Syndrom; ARC, AIDS-related Complex; HBV, Hepatitis B- Virus; HNF, Hepatitis-Kernfaktor).
Die an den Replikationsursprung bindenden Proteine, Epstein-Barr-Virus-Kernantigen 1 (EBNA-1) (Ambinder, R. F., et al.; Reisman, D., et al.), E2 (das durch das menschliche Papillomavirus codiert wird) (Chin, M. T., et al.), UL9 (das durch Herpes-simplex-Virus Typ 1 codiert wird) (McGeoch, D. J., et al.) und das homologe Protein in Varicella-Zoster-Virus (VZV) (Stow, N. D., und Davison, A. J.) haben kurze wohldefinierte Bindungsstellen innerhalb des Virusgenoms und stellen aus diesem Grund sehr gute Zielstellen für einen kompetitiven DNA-bindenden Arzneistoff dar. Genauso sind auch die Erkennungssequenzen für DNA-bindende Proteine, die als Faktoren zur Regulation der Transkription wirken, gute Zielstellen für antivirale DNA-bindende Arzneistoffe. Beispiele umfassen die Bindungsstelle für den hepatischen Kemfaktor (HNF-1), der für die Expression des menschlichen Hepatitis B-Virus (HBV) erforderlich ist (chang, H.-K.), und NFkB- und NFAT-1-bindende Stellen im Long Terminal Repeat (LTR) des Human Immunodeficiency-Virus (HIV), von denen eine oder beide Stellen möglicherweise an der Expression des Virus beteiligt sind (Greene, W. C).
Außerdem sind in Tabelle 1 Beispiele von nicht-viralen DNA-Zielen für DNA-bindende Arzneistoffe angegeben, wodurch das große Spektrum von Anwendungsmöglichkeiten für sequenzspezifische DNA-bindende Moleküle verdeutlicht wird. Z.B. ist der Kemfaktor von aktivierten T-Zellen (NFAT-1) ein regulatonscher Faktor, der für die induzierbare Expression des Interleukin 2 (IL-2) -Gens als Antwort auf Signale aus dem Antigenrezeptor wichtig ist, das seinerseits für die Kaskade der molekularen Ereignisse während der Aktivierung von T-Zellen erforderlich ist (eine Übersicht findet sich in Edwards, C. A., und Crabtree, G. R.) . Der Wirkmechanismus der beiden Immunsuppressiva cyclosporin A und FK506 besteht vermutlich in der Blockierung der induzierbaren Expression von NFAT-1 (Schmidt, A., et al., und Banerji, S. S., et al.). Jedoch sind die Effekte dieser Arzneistoffe nicht für NFAT-1 spezifisch; aus diesem Grund ware ein Arzneistoff, dessen spezifisches Ziel die NFAT-1-Bindungsstelle im IL-2-Enhancer ist, vermutlich ein besseres Immunsuppressivum.
Ein DNA-bindender Arzneistoff, dessen Ziel eine DNA-Stelle ist, ist besser geeignet als ein Arzneistoff, der auf das DNA-bindende Protein einwirkt (wie das vermutlich bei den zur Zeit verfügbaren Immunsuppressiva der Fall ist), wobei mindestens zwei Gründe eine Rolle spielen. Erstens gibt es viel weniger Zielstellen in Form von spezifischen DNA-Sequenzen als spezifischen Proteinen (z.B. steht im Fall des Glucocorticoid- Rezeptors in jeder Zelle eine Handvoll DNA-Bindungsstellen etwa 50 000 Proteinmolekülen gegenüber) und zweitens beeinflußt ein DNA-bindender Arzneistoff nur die Ziel-Gene, während ein Protein-bindender Arzneistoff alle zellulären Funktionen des Proteins lahmlegt
Ein Beispiel des letzteren Punkts ist die Bindungsstelle für HNF-1 im menschlichen Fibrinogen-Promotor. Der Fibrinogenspiegel zählt zu den wichtigsten Faktoren, die mit der Herz- Kreislauf-Krankheit in Zusammenhang stehen. Ein Arzneistoff, der entweder auf HNF-1 oder auf die HNF-1-Bindungsstelle im Fibrinogen-Promotor wirkt, könnte verwendet werden, um die Expression von Fibrinogen bei Personen zu senken, bei denen aufgrund einer überexpression von Fibrinogen ein hohes Risiko für diese Krankheit vorliegt. Da jedoch HNF-1 auch für die Expression mehrerer normaler Lebergene gebraucht wird, würde eine Blockierung des Proteins HNF-1 für die Leberfunktion toxisch sein. Andererseits kann man durch die Blockierung einer DNA- Sequenz, die zum Teil aus der HNF-1-Bindungsstelle und zum Teil, zur Divergenz, aus flankierenden Sequenzen zusammengesetzt ist, das Fibrinogen-Gen mit einer hohen Selektivität hemmen, ohne die normalen zellulären Funktionen von HNF-1 zu stören.
Der Test wurde für das Screening einer im wesentlichen beliebigen DNA-Sequenz konzipiert. Wie vorstehend beschrieben, umfassen die Testsequenzen von medizinischer Signifikanz genomische Sequenzen von viralen oder mikrobiellen Krankheitserregern und Sequenzen, die innerhalb von Onkogenen oder anderen falsch exprimierten zellulären Genen liegen oder deren Expression regulieren. Der Test der vorliegenden Erfindung kann zum Nachweis möglicher antiviraler Arzneistoffe und außerdem zum Nachweis möglicher Arzneistoffe verwendet werden, die (i) den Stoffwechsel anderer Infektionserreger stören, (ii) die Transkription von falsch exprimierten zellulären Genen (z.B. von Onkogenen oder Genen, die mit bestimmten genetischen Störungen assoziiert sind) blockieren oder reduzieren und (iii) die Expression bestimmter zellulärer Gene steigern oder verändern.

2. Definierte Gruppen von Testsequenzen

Im vorstehenden Abschnitt wird das Screening großer Zahlen von Fermentationsbrühen, Extrakten oder anderen Gemischen aus unbekannten Stoffen mit spezifischen, medizinisch signifikanten DNA-Zielsequenzen beschrieben. Der Test kann auch für das Screening einer großen Zahl von DNA-Sequenzen mit bekannten DNA-bindenden Arzneistoffen eingesetzt werden, wobei die relative Affinität des einzelnen Arzneistoffs für jede mögliche definierte spezifische Sequenz bestimmt werden kann. Z.B. gibt es 4n mögliche Sequenzen, wobei n die Zahl der Nucleotide in der Sequenz ist. Somit gibt es 4³ - 64 verschiedene Drei- Basenpaar-Sequenzen, 4&sup4; = 256 verschiedene Vier-Basenpaar-Sequenzen, 4&sup5; - 1024 verschiedene Fünf-Basenpaar-Sequenzen usw.. Wenn diese Sequenzen an der Teststelle, der Stelle, die neben der Screeningsequenz liegt (in dieser Erfindung wird als Beispiel die UL9-Bindungsstelle verwendet), eingefügt werden, kann jede der unterschiedlichen Testsequenzen gegen viele verschiedene DNA-bindende Moleküle getestet werden. Die Testsequenzen können auf einer Seite oder auf beiden Seiten der Screeningsequenz eingefügt werden, und die Sequenzen, die auf der anderen Seite die Testsequenzen flankieren, sind fixe Sequenzen zur Stabilisierung des Doppelstrangs und dienen am 3'- Ende des oberen Strangs als Anelierungsstelle für den Primer (vgl. Beispiel 1). Z.B. können die Oligonucleotidsequenzen konstruiert sein, wie in Figur 15 dargestellt (SEQ ID NO: 18). In Figur 15 sind die TEST- und SCREENING-Sequenzen bezeichnet.
Die Herstellung solcher doppelsträngigen Oligonucleotide wird in Beispiel 1 beschrieben und in Figur 4A und 4B erläutert. Die Testsequenzen, die in Figur 15 als X:Y wiedergegeben sind (wobei X = A, C, G oder T und Y = die komplementäre Sequenz T, G, C oder A), können beliebige Sequenzen der 256 unterschiedlichen Vier-Basen-Sequenzen sein, die in Figur 13 gezeigt werden.
Sobald eine Gruppe von Testoligonucleotiden synthetisiert wurde, in der alle möglichen Vier-Basenpaar-Sequenzen enthalten sind (vgl. Beispiel 1), kann die Gruppe einem Screening mit einem beliebigen DNA-bindenden Arzneistoff unterworfen werden. Die relative Wirkung des Arzneistoffs auf jedes Oligonucleotid-Testsystem zeigt die relative Affinität des Arzneistoffs für die Testsequenz. Auf diese Weise kann für einen bestimmten DNA-bindenden Arzneistoff das gesamte Spektrum von Affinitäten für die jeweiligen speziellen DNA-Sequenzen bestimmt werden. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse können dazu dienen, Molekülmodell-Programme zu verbessern und/oder direkt neue DNA-bindende Moleküle mit einer gesteigerten Affinität und Spezifität zu entwerfen.
Eine andere Art von geordneten Gruppen von Oligonucleotiden, die im Screening verwendet werden können, sind Gruppen, die aus gestreuten Sequenzen mit einer fixen Basenzusammensetzung bestehen. Wenn z.B. die Erkennungssequenz fur ein Protein 5'-GATC-3' ist und Sammlungen auf DNA-bindende Moleküle abgesucht werden sollen, die diese Sequenz erkennen, ist es wünschenswert, Sequenzen ähnlicher Größe und Basenzusammensetzung als Kontrollsequenzen für den Test zu testen. Am genauesten ist ein Experiment, bei dem alle möglichen 4-bp-Sequenzen abgesucht werden; dies sind 4&sup4; = 256 verschiedene Testsequenzen, eine Zahl, die sicher nicht in jeder Situation durchführbar ist. Jedoch gibt es viel weniger mögliche 4-bp-Sequenzen mit der gleichen Basenzusammensetzung (wobei die Basen 1G, 1A, 1T, 1G verwendet werden, was n! = 24 unterschiedliche 4-bp-Sequenzen mit dieser besonderen Basenzusammensetzung ergibt), wodurch man sehr gute Kontrollen erhält, ohne eine große Anzahl von Sequenzen testen zu müssen.

3. Theoretische Überlegungen zur Auswahl biologischer Zielstellen: Spezifität und Toxizität

Eine Überlegung zur Auswahl von Sequenzen, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Tests getestet werden sollen, betrifft die Zugänglichkeit der Testsequenz, d.h. inwieweit die Sequenz in vivo für die bindenden Moleküle erreichbar ist. Die zelluläre DNA ist in Chromatin verpackt, weshalb die meisten Sequenzen relativ unzugänglich sind. Sequenzen, die aktiv transkribiert werden, insbesondere diejenigen Sequenzen, die vön regulatorischer Natur sind, sind weniger geschützt und besser für sowohl Proteine als auch kleine Moleküle zugänglich. Diese Beobachtung wird durch eine große Zahl von Veröffentlichungen über die Empfindlichkeit gegenüber DNase I, "Foot print"-Studien mit Nualeasen und kleinen Molekülen und allgemeine Studien über die Chromatin-Struktur bestätigt (Tulhus). Die relative zugänglichkeit einer regulatorischen Sequenz, die anhand der Überempfindlichkeit gegenüber DNase I bestimmt wird, ist wahrscheinlich um mehrere Größenordnungen größer als die eines inaktiven Teils des zellulären Genoms. Aus diesem Grund sind die regulatorischen Sequenzen zellulärer Gene und auch die regulatorischen oder Replikationssequenzen von Viren geeignete Regionen, die ausgewählt werden können, um damit spezifische inhibitorische kleine Moleküle unter Verwendung des erfindungsgemäßen Tests zu selektieren.
Eine weitere Überlegung zur Auswahl von Sequenzen, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Tests getestet werden sollen, betrifft die Einmaligkeit der möglichen Testsequenz. Wie vorstehend im Zusammenhang mit dem Kernprotein HNF-1 diskutiert, ist es wünschenswert, daß kleine inhibitorische Moleküle für ihr Ziel spezifisch sind und eine minimale Kreuzreaktivität aufweisen. Sowohl die Zusammensetzung der Sequenz als auch ihre Länge wirken sich auf die Einmaligkeit der Sequenz aus. Außerdem werden bestimmte Sequenzen im menschlichen Genom seltener gefunden als in den Genomen anderer Organismen, z.B. von Säugerviren. Aufgrund von Unterschieden in der Basenzusammensetzung und der Codonverwendung unterscheiden sich die viralen Sequenzen deutlich von den Säugersequenzen. Z.B. wird die Dinucleotidsequenz CG in Säugerzellen viel seltener gefunden als die Dinucleotidsequenz GC. Ferner liegen in SV40, einem Säugervirus, die Sequenzen AGCT und ACGT 34- bzw. 0-mal vor. Spezifische virale regulatorische Sequenzen können als Testsequenzen ausgewählt werden, indem diese charakteristische Verteilung berücksichtigt wird. Bei den auf diese Weise identifizierten kleinen inhibitorischen Molekülen, die an solche Testsequenzen binden, ist es dann weniger wahrscheinlich, daß sie zelluläre Funktionen stören.
Es gibt im menschlichen Genom etwa 3 x 10&sup9; Basenpaare (bp). Von den bekannten DNA-bindenden Arzneistoffen, für die es kristallographische Daten gibt, binden die meisten an Sequenzen von 2 bis 5 bp. Es gibt 4&sup4; 256 unterschiedliche Vier-Basen-Sequenzen; somit tritt eine einzelne 4-bp-Stelle im menschlichen Genom im Durchschnitt 1,2 x 10&sup7;-mal auf. Eine einzelne Acht-Basen-Stelle würde im Genom im Durchschnitt etwa 50 000-mal vorkommen. Oberflächlich kann das den Eindruck erwecken, daß Arzneistoffe, deren Ziel sogar eine 8-bp-Stelle ist, für die Zelle schädlich sein könnten, da es so viele Bindungsstellen gibt; jedoch müssen noch einige andere überlegungen berücksichtigt werden. Erstens ist der größte Teil der DNA fest in chromosomale Proteine eingepackt und relativ unzugänglich für eindringende DNA-bindende Moleküle, wie durch die unspezifische endonucleolytische Spaltung von Chromatin im Zellkern gezeigt wird (Edwards, C. A., und Firtel, R. A.).
Aktive Transkriptionseinheiten sind besser zugänglich als die in chromosomalen Proteinen gebundene DNA, jedoch sind die am besten zugänglichen Bereiche der im Chromatin vorliegenden DNA die Stellen, an die regulatorische Faktoren binden. Wie durch die Überempfindlichkeit gegenüber DNase T gezeigt wurde (Gross, D. S., und Garrard, W. T.), können regulatorische Stellen gegenüber einem endonucleolytischen Angriff 100- bis 1000-mal empfindlicher sein als das Chromatin im Ganzen. Dies ist ein Grund dafür, daß regulatorische Sequenzen ein geeignetes Ziel für DNA-bindende Arzneistoffe sind. Zweitens weist das Argument, daß mehrere Antikrebs-Arzneistoffe, die an 2-, 3- oder 4-bp-Sequenzen binden, doch eine so niedrige Toxizität aufweisen, daß sie als Arzneistoffe eingesetzt werden können, darauf hin, daß, wenn festgestellt werden könnte, daß die Hochaffinitäts-Bindungsstellen bekannter Arzneistoffe mit spezifischen viralen Zielsequenzen übereinstimmen, es möglich wäre, die zur Zeit verfügbaren Arzneistoffe als antivirale Mittel einzusetzen, wobei sie in niedrigeren Konzentrationen als bisher verwendet werden könnten und deshalb weniger toxisch wären.

D. Verwendung von Testmatrizes und Muster-Vergleich ("pattern matching") zur Analyse der Daten

Der hier beschriebene Test wurde so ausgelegt, daß eine einzelne DNA/Protein-Wechselwirkung zum Screening nach sequenzspezifischen und sequenzbevorzugten DNA-bindenden Molekülen verwendet wird, die im wesentlichen eine beliebige spezifische Sequenz erkennen können. Indem man verschiedene Sequenzen einsetzt, die die Erkennungsstelle für eine einzelne DNA/Protein-Wechselwirkung flankieren, kann man eine sehr große Zahl unterschiedlicher Sequenzen testen. Die Daten, die durch solche Experimente erhalten, in Matrizes dargestellt und durch Muster-Vergleichs-Techniken analysiert wurden, können Informationen über die Verwandtschaft von DNA-sequenzen liefern.
Das Hauptprinzip, das dem DNA/Protein-Test der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, besteht darin, daß durch die Bindung von Molekülen an DNA-sequenzen, die die Erkennungsstelle für ein spezifisches Protein flankieren, die Bindung dieses Proteins blockiert wird. Die Beeinträchtigung der Proteinbindung erfolgt wahrscheinlich durch einen der beiden folgenden Mechanismen (oder durch beide): 1) direkt durch eine sterische Hinderung oder 2) indirekt durch Störungen, die durch das DNA-Molekül hindurch bis zur Erkennungsstelle übertragen werden, eine Art allosterischer Störung.
Bei diesen beiden Mechanismen spielt vermutlich die Entfernung eine Rolle. Für die Hemmung durch eine direkte stensche Hinderung liegen direkte Ergebnisse für sehr kleine Moleküle vor, die aus Studien zur Beeinflussung durch Methylierung und Ethylierung stammen. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die sterische Wirkung aufgrund von Entfernungseffekten auf 4 bis 5 Basenpaare beschränkt ist. Auch dann ist die Zahl der unter schiedlichen Sequenzen, die theoretisch für diese sehr kleinen Moleküle getestet werden können, immer noch sehr groß (d.h., Kombinationen aus 5 Basenpaaren ergeben insgesamt 4&sup5; (= 1024) verschiedene Sequenzen).
In der Praxis kann die Größe der getesteten Sequenzen für Moleküle, die an unterschiedlich große Test-DNA binden, empirisch ermittelt werden. Ein reiches Spektrum von Sequenzen, die immer komplizierter werden, kann routinemäßig untersucht werden. Dies kann effizient erreicht werden, indem degenerierte Oligonucleotide synthetisiert und Oligonucleotide im Testverfahren vervielfacht werden (d.h., unter Verwendung einer Gruppe unterschiedlicher Oligonucleotide in einem einzigen Test) oder indem vereinigte Sequenzen in Testmatrizes eingesetzt werden.
Unter Berücksichtigung des vorstehenden Sachverhaltes können Tests, bei denen ein spezifisches Protein und Oligonucleotide eingesetzt werden, die die spezifische Erkennungsstelle für dieses Protein und angrenzend auf einer Seite der Erkennungsstelle unterschiedliche Sequenzen enthalten, für das gleichzeitige Screening nach vielen verschiedenen Molekülen verwendet werden, umfassend kleine Moleküle, die Bindungspräferenzen für einzelne Sequenzen oder Familien verwandter Sequenzen aufweisen. Figur 12 zeigt, wie man durch Analyse einer Testmatrix Informationen erhalten kann, welche Art von Sequenzspezifität beim Kompetitor vorliegt. Z.B. könnten für das Screening nach Molekülen, die vorzugsweise jeweils eine der möglichen 256 Tetranucleotidsequenzen erkennen (Figur 13), Oligonucleotide konstruiert werden, die diese 256 Sequenzen unmittelbar neben einer 11 bp-großen Erkennungsstelle von UL9 oriS (SEQ ID NO: 15) enthalten, die in jedem Konstrukt identisch ist.
In Figur 12 bedeutet "+", daß das Gemisch die Bildung von DNA/Protein-Komplexen in Lösung verzögert oder blockiert, und "-" bedeutet, daß das Gemisch keine deutliche Wirkung auf die DNA/Protein-Wechselwirkungen zeigt. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse des Tests aus Figur 12 ist in der Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
Diese Ergebnisse zeigen, wie die in einer solchen Matrix dargestellten Daten eine sequenzspezifische Bindungsaktivität in einem Testgemisch nachweisen und gleichzeitig enthaltene Kontrollen für die unspezifische Bindung bereitgestellt werden. Z.B. zeigt die Wirkung von Testgemisch #8 auf die verschiedenen Testansätze, daß das Testgemisch vorzugsweise diejenigen Oligonucleotide angreift, die die Sequenz CCCT enthalten. Zu beachten ist, daß die Sequenz nicht innerhalb der Teststelle für Testgemisch #8 liegen muß, um die Beeinflussung zu zeigen. Die Analyse der Sequenzen, die durch die unterschiedlichen Testgemische beeinflußt werden, kann vereinfacht werden, indem die Daten in Matrixform dargestellt werden.

E. Weitere Anwendungen

Für die sequenzspezifischen DNA-bindenden Moleküle gibt es die verschiedensten therapeutischen Verwendungsmöglichkeiten, umfassend Mittel gegen Viren, gegen Pilze, gegen Bakterien und gegen Tumoren, Immunsuppressiva und Herz-Kreislauf- Medikamente. Die sequenzspezifischen DNA-bindenden Moleküle können auch als molekulare Reagenzien, z.B. als Sonden mit einer spezifischen Sequenz, eingesetzt werden.
Je mehr Moleküle nachgewiesen werden, desto mehr Informationen über die Art der DNA-bindenden Moleküle können gesammelt werden, die möglicherweise dazu beitragen, neue Moleküle mit unterschiedlichen oder spezifischen Aktivitäten einfacher konzipieren und/oder modifizieren zu können.
Obwohl der Test als Nachweis von sequenzspezifischen DNA- bindenden Molekülen beschrieben wurde, kann auch der umgekehrte Test durchgeführt werden, indem DNA im Überschuß zum Protein zugegeben wird, wobei nach peptidsequenzspezifischen Protein-bindenden Inhibitoren gesucht werden kann.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung, sie sollen jedoch den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken.

Material und Methoden

Synthetische Oligonucleotide wurden hergestellt, wobei im Handel verfügbare automatische Oligonucleotid-Synthesizer verwendet wurden. In einer anderen Ausführungsform können die im Auftrag des Kunden synthetisierten Oligonucleotide bezogen werden, z.B. von Synthetic Genetics (San Diego, CA). Doppelstrangige Oligonucleotide wurden durch die Anlagerung komplementärer Stränge hergestellt.
Die Restriktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) oder New England Biolabs (Beverly, MA) bezogen und nach den Anweisungen des Herstellers eingesetzt.
Distamycin A und Doxorubicin wurden von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. Actinomycin D wurde von Boehringer Mannheim oder Sigma bezogen.

Beispiel 1

Herstellung der Oligonucleotide welche die Screeningsequenz enthalten

In diesem Beispiel wird die Herstellung von (i) biotinylierten/Digoxigenin/radiomarkierten und (ii) radiomarkierten doppelsträngigen Oligonucleotiden beschrieben, welche die Screeningsequenz und ausgewählte Testsequenzen enthalten.

A. Biotinylierung

Die Oligonucleotide wurden hergestellt, wie vorstehend beschrieben. Die aus HSV erhaltene wildtyp-Kontrollsequenz für die UL9-Bindungsstelle ist in Figur 4 dargestellt. Die Screeningsequenz, d.h. die UL9-Bindungssequenz, ist die Sequenz CGTTCGCACTT (SEQ ID NO: 1), die in Figur 4A unterstrichen ist. Typischerweise wurden die 5 und/oder 3' zur Screeningsequenz liegenden Sequenzen durch eine ausgewählte Testsequenz ersetzt (Figur 5).
Ein Beispiel der Herstellung eines stellenspezifisch biotinylierten Oligonucleotids ist in Figur 4 skizziert. Ein Primer-Oligonucleotid wurde synthetisiert, das zu den 3'-Sequenzen des Screeningsequenz-enthaltenden Oligonucleotids komplementär war. Dieses Oligonucleotid endete mit dem Rest, der dem C in Position 9 der Screeningsequenz entsprach. Das Primer- Oligonucleotid wurde mit dem die Screeningsequenz enthaltenden Oligonucleotid hybridisiert. Biotin-11-dTUP (Bethesda Research Laboratories (BRL), Gaithersburg, MD) und Klenow-Enzym wurden zu diesem Komplex zugegeben (Figur 4) und die resultierenden partiell doppelsträngigen, biotinylierten Komplexe von den nicht-eingebauten Nucleotiden abgetrennt, wobei entweder vorpräparierte Sephadex G-25-"Spin"-Säulen (Pharmacia, Piscataway, NJ) oder "NENSORB "-Säulen (New England Nuclear) gemäß den Anweisungen der Hersteller verwendet wurden. Der restliche einzelsträngige Bereich wurde unter Einsatz von DNA-Falymerase I-Klenow-Fragment und dNTPs in Doppelstränge überführt, wodurch ein vollständiges doppelstrangiges Oligonucleotid erhalten wurde. Eine zweite Sephadex G-25-Säule wurde zur Reinigung der doppelstrangigen Oligonualeotide eingesetzt. Die oligonucleotide wurden in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl und 1 mM EDTA verdünnt oder resuspendiert und bei -20ºC gelagert. Wenn die Komplexe radioaktiv markiert werden sollten, wurde im Schritt zur vollständigen Auffüllung des Doppelstrangs ³²P-α-dCTP (New England Nudear, Wilmington, DE) anstelle von dCTP eingesetzt. In einer anderen Ausführungsform wurden der obere Strang, der Primer oder das vollständig doppelsträngige Oligonucleotid mit γ-³²P-ATP und Polynucleotidkinase (NEB, Beverly, MA) radioaktiv markiert. In vorausgehenden Studien wurden radiomarkierte, doppelsträngige Oligonucleotide verwendet. Die Oligonucleotide wurden hergestellt, indem der Primer mit T4-Polynucleotidkinase und γ-³²P-ATP radiomarkiert, an das Oligonucleotid des "oberen"-Strangs in voller Länge angelagert und mit Klenow-Fragment und Desoxynucleotidtriphosphaten aufgefüllt wurde. Nach der Phosphorylierung und der Synthese des zweiten Strangs wurden die Oligonucleotide vom Puffer und nicht-eingebauten Triphosphaten abgetrennt, wobei Sephadex G-25-"Spin"-Säulen (IBI oder Biorad) verwendet wurden. Dieses Verfahren ist in Figur 4B dargestellt. Die Reaktionsbedingungen für die vorstehenden Klenow- Reaktionen sahen folgendermaßen aus: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM Dithioerythrit, 0,33 bis 100 uM Desoxytriphosphate, 2 Einheiten Klenow-Enzym (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Die Klenow-Reaktionsansätze wurden 15 Minuten bis eine Stunde bei 25ºC inkubiert. Die Polynucleotidkinase-Reaktionsansätze wurden 30 Minuten bis eine Stunde bei 37ºC inkubiert.

B. Endmarkierung mit Digoxigenin

Die biotinylierten, radiomarkierten Oligonucleotide oder die radiomarkierten Oligonucleotide wurden wie vorstehend isaliert und in 0,2 M Kaliumkakadylat (pH 7,2), 4 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin resuspendiert. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden Digoxigenin-11-dTUP (ein Analog von dTTP, 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat, gekoppelt an Digoxigenin über einen 11-Atom-Spacerarm, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und terminale Desoxynualeotidyl-Transferase (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) zugegeben. Die Anzahl der unter Verwendung dieses Verfahrens eingebauten Dig- 11-dTUP-Einheiten schien weniger als 5 (möglicherweise nur 1 oder 2) zu betragen, was anhand der Mobilität bei der Polyacrylamidgel-Elektrophorese des behandelten Fragments im Vergleich zu Oligonucleotiden bekannter Länge beurteilt wurde.
Die biotinylierten oder nicht-biotinylierten, Digoxigenin enthaltenden, radiomarkierten Oligonucleotide wurden wie vorstehend isoliert und für die Verwendung in den Bindungstests in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 7,5, resuspendiert.
Mit dem vorstehenden Verfahren kann auch der andere Strang biotinyliert werden, wobei ein die Screeningsequenz enthaltendes Oligonucleotid, das zu dem in Figur 4 dargestellten Oligonucleotid komplementär ist, und ein Primer, der zu dem 3'-Ende dieses Moleküls komplementär ist, verwendet werden. Zur Durchführung der Biotinylierung wurde Biotin-7-dATP anstelle von Biotin-ll-dTUP eingesetzt. Die Biotinylierung kann auch durch chemische Syntheseverfahren erfolgen, wobei z.B. ein aktiviertes Nucleotid in das Oligonucleotid eingebaut und die aktive Gruppe anschließend mit NHS-LC-Biotin (Pierce) umgesetzt wird. Auch andere Biotin-Derivate können verwendet werden.

C. Radiomarkierung der Oligonucleotide

Im allgemeinen wurden die Oligonucleotide mit γ-³²P-ATP oder α-³²P-Desoxynucleotidtriphosphaten und T4-Polynucleotidkinase bzw. dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase radioaktiv markiert. Die Markierungsreaktionen erfolgten in Puffern und nach Verfahren, die von den Herstellern empfohlen werden (New England Biolabs, Beverly, MA; Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD; oder Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Die Oligonucleotide wurden vom Puffer und von den nichteingebauten Triphosphaten unter Verwendung von Sephadex G-25- "Spin"-Säulen (IBI, New Haven, CT; oder Biorad, Richmond, CA) oder "NENSORB " Säulen (New England Nuclear, Wilmington, DE) nach den Anweisungen der Hersteller abgetrennt.
Mehrere Gründe sprechen für eine enzymatische Synthese des zweiten Strangs. Die zwei Hauptgründe bestehen darin, daß unter Verwendung eines Primer-Überschusses die Synthese des zweiten Stranges annähernd vollständig abläuft, so daß nahezu alle oberen Stränge an untere Stränge angelagert sind, wodurch verhindert wird, daß die als Einzelstrang vorliegenden oberen Stränge sich wieder falten und zusätzliche und nicht-dazugehörige doppelsträngige Strukturen erzeugen, und daß zweitens, da alle Oligonucleotide mit einem gemeinsamen Primer geprimt werden, der Primer die Endmarkierung enthalten kann, so daß alle Oligonucleotide mit genau der gleichen spezifischen Aktivität markiert werden können.

Beispiel 2

Herstellung des Proteins UL9

A. Clonierung der UL9-codierenden Sequenzen in pAC373

Zur Expression des Proteins UL9 in voller Länge wurde ein Baculovirus-Expressionssystem verwendet. Die Sequenz der UL9- codierenden Region von Herpes-simplex-Virus wurde von McGeoch et al. beschrieben und ist als eine EMBL-Nucleinsäuresequenz verfügbar. Das rekombinante Eaculovirus AcNPV/UL9A, das die UL9-codierende Sequenz enthielt, wurde von Mark Challberg (National Institutes of Health, Bethesda, MD) erhalten. Die Konstruktion dieses Vektors wurde kürzlich beschrieben (Olivo et al. (1988, 1989)). Kurz gesagt wurde das NarI/EcoRV-Fragment aus pMC160 hergeleitet (Wu et al.). Dieses Fragment wurde mit glatten Enden versehen, indem alle vier dNTPs und das Klenow- Fragment der DNA-Polymerase 1 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) zum Auffüllen der terminalen Überhänge verwendet wurden. Das resultierende Fragment wurde in die einzige BamHI- Stelle des Baculovirus-Vektors pAC3T3 mit glatten Enden ligiert (Summers et al.).

B. Clonierung der UL9-codierenden Sequenz in pVL1393

Die UL9-codierende Region wurde in einen zweiten Baculovirus-Vektor, pVL1393, aloniert (Luckow et al.). Das 3077 bp- große NarI/EcoRV-Fragment, das das UL9-Gen enthielt, wurde aus dem Vektor pEcoD (erhalten von Dr. Bing Lan Rong, Eye Research Institute, Boston, MA) herausgeschnitten. Das Plasmid pEcoD enthält ein 16,2 kb-großes EcoRI-Fragment, das aus HSV-I stammt und das UL9-Gen trägt (Goldin et al.). Glatte Enden wurden auf dem UL9-enthaltenden Fragment erzeugt, wie vorstehend beschrieben. EcoRI-Linker (10 Nucleotide) wurden mit dem mit glatten Enden versehenen NarI/EcoRV-Fragment mit glatten Enden ligiert (Ausubel et al.; Sambrook et al.).
Der Vektor pVL1393 (Luckow et al.) wurde mit EcoRI gespalten und der linearisierte Vektor isoliert. Dieser Vektor enthält stromaufwärts der Polylinker-Clonierungsstelle 35 Nucleotide des 5'-Endes des codierenden Bereichs des Polyhedringens. Das ATG des Polyhedringens wurde zu ATT mutiert, um in rekombinanten Clonen, die keine codierende Sequenz mit einem funktionellen ATG enthalten, eine Initiation der Translation zu verhindern. Das EcoRI/UL9-Fragment wurde in den linearisierten Vektor ligiert, das Ligierungsgemisch in E. coli transformiert und Ampicillin-resistente done selektiert. Die aus den Clonen gewonnenen Plasmide wurden durch Restriktionsspaltung analysiert und die Plasmide, die den Einschub mit den aminoterminalen UL9-codierenden Sequenzen, in Richtung 5'-Ende des Polyhedringens liegend enthielten, wurden selektiert. Dieses Plasmid wurde mit pVL1393/UL9 bezeichnet (Figur 7).
pVL1393/UL9 wurde zusammen mit Wildtyp-Baculovirus-DNA (AcMNPV; Summers et al.) in Sf9 (Spodoptera frugiperda)-Zellen (Summers et al.) cotransfiziert. Die mit rekombinantem Baculovirus infizierten Sfg-Zellen wurden identifiziert und mittels donierung gereinigt (Summers et al.).

C. Expression des Proteins UL9

Clon-Isolate der mit rekombinantem Baculovirus infizierten Sfg-Zellen wurden in Grace-Medium gezüchtet, wie von Summers et al. beschrieben. Die Zellen wurden von den Gewebekulturplatten abgeschabt und abzentrifugiert (2000 UpM, 5 Minuten, 4ºC). Anschließend wurden die Zellen einmal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen (Maniatis et al.). Die Zellpellets wurden bei 70ºC eingefroren. Zur Lyse wurden die Zellen in 115 Volumina 20 mM HEPES, pH 7,5, 10 % Glycerin, 1,7 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM Dithiothreit (DTT) und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) resuspendiert. Die Zellysate wurden durch Ultrazentrifugation geklärt (Beckman Tisch-Ultrazentrifuge, Rotor TLS 55, 34 kUpM, 1 Stunde, 4ºC). Der Überstand wurde über Nacht bei 4ºC gegen 2 Liter Dialysepuffer (20 mM HEPES, pH 7,51 10 % Glycerin, 50 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT und 0,1 mM PMSF) dialysiert.
Diese teilweise gereinigten Extrakte wurden hergestellt und in DNA/Protein-Bindungsexperimenten eingesetzt. Sofern erforderlich wurden die Extrakte eingeengt, wobei die Filtriervorrichtung "CENTRICON 30" (Amicon, Danvers, MA) verwendet wurde.

D. Clonierung des verkürzten UL9-Proteins

Die Sequenz, die das C-terminale Drittel von UL9 codiert, und die 3-flankierenden Sequenzen, ein etwa 1,2 kb-großes Fragment, wurden in den bakteriellen Expressionsvektor pGEX-2T subcloniert (Figur 6). Der Vektor pGEX-2T wurde durch eine Modifikation des Vektors pGEX-1 von Smith et al. erhalten, wobei eine Thrombin-Spaltsequenz mit dem Glutathion-S-Transferase- Protein (gst) im Raster eingefügt wurde.
Ein 1 194 bp-großes BamHI/EcoRV-Fragment von pEcoD wurde isoliert, das einen 951 bp-großen Bereich, der die 317 C-terminalen Aminosäuren von UL9 codiert, und 243 bp der 3'-untranslatierten Region enthielt.
Dieses, das carboxy-Ende von DLg (UL9-COOH) enthaltende BamHI/EcoRV-Fragment wurde mit glatten Enden versehen und mit EcoRI-Linkern versetzt, wie vorstehend beschrieben. Die EcoRI Linker wurden so gestaltet, daß die UL9-codierende Sequenz mit den gst-Thrombin-codierenden Sequenzen im Raster fusioniert werden konnte. Das mit Linker versehene Fragment wurde isoliert und mit EcoRI gespalten. Der Vektor pGEX-2T wurde mit EcoRI gespalten, mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) behandelt und der lineare Vektor isoliert. Das mit Linker versehene UL9-COOH-EcoRI-Fragment wurde an den linearen Vektor ligiert (Figur 6). Das Ligierungsgemisch wurde in E. Coli transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien selektiert. Aus den Ampicillin-resistenten Kolonien wurden Plasmide isoliert und durch Restriktionsenzym-Spaltung analysiert. Ein Plasmid, das eine im-Raster-Fusion gst/Thrombin/UL9-COOH zeigte, wurde identifiziert (Figur 6) und mit pGEX-2T/UL9-COOH bezeichnet.

A. Expression des verkürzten UL9-Proteins

Der E. coli Stamm JM109 wurde mit pGEX-2T/C-UL9-COOH transformiert und bei 37ºC über Nacht bis zur Sättigungsdichte gezüchtet. Die Übernachtkultur wurde 1:10 mit Ampicillin enthaltendem LB-Medium verdünnt und eine Stunde bei 30ºC gezüchtet. IPTG (Isopropylthio-β-galactosid) (GIBCO-BRL) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben und die Inkubation zwei bis fünf Stunden fortgesetzt. Die das Plasmid enthaltenden Bakterienzellen wurden einem Temperatursprung und IPTG-Bedingungen unterworfen, wodurch die Transkription vom tac-Promotor aus induziert wurde.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in MTPBS (150 mM NaCl, 16 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 4 mM NaH&sub2;PO&sub4;) in 1/100 des Kulturvolumens resuspendiert. Die Zellen wurden durch Beschallung lysiert und die Lysate durch Zentrifugation von den Zelltrümmern gereinigt.
Das Fusionsprotein wurde über eine Glutathion-Agarose-Affinitätssäule gereinigt, wie ausführlich von Smith et al. beschrieben. Das Fusionsprotein wurde von der Affinitätssäule mit reduziertem Glutathion eluiert, gegen UL9-Dialysepuffer (20 mM HEPES, pH 7,51 50 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT und 0,1 mM PMSF) dialysiert und mit Thrombin (2 ug/ug Fusionsprotein) gespalten.
Ein Aliquot des Überstands, der aus IPTG-induzierten Kulturen von pGEX-2T/C-UL9-COOH-enthaltenden Zellen erhalten wurde, und ein Aliquot des affinitätsgereinigten, mit Thrombin gespaltenen Proteins wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert. Das Ergebnis dieser Analyse ist in Figur 8 dargestellt. Das 63 Kilodalton-große GST/C-UL9-Fusionsprotein ist die größte Bande in der mit GST-UL9 bezeichneten Bahn (Bahn 2). Die erste Bahn enthält Proteine als Größenstandards. Die UL9-COOH-Proteinbande (Bahn GST-UL9 + Thrombin, Figur 8, Bahn 3) ist die Bande, die zwischen 30 und 46 kD liegt; das Glutathion-Transferase-Protein liegt direkt unter dem 30 kD-Größenstandard. In einem getrennten Experiment wurde eine ähnliche Analyse durchgeführt, wobei die nicht-induzierte Kultur verwendet wurde. Hier war kein Protein zu sehen, das in der Größe dem Fusionsprotein entsprach.
Die Extrakte werden vor der Verwendung dialysiert. Außerdem können die Extrakte, falls erforderlich, eingeengt werden, typischerweise durch Filtration unter Verwendung eines "CEN- TRICON 30"-Filters.

Beispiel 3

Bindungstests

A. Bandenverschiebungsgele

Die DNA/Protein-Bindungsreaktionsansätze, die sowohl markierte Komplexe als auch freie DNA enthielten, wurden elektrophoretisch auf 4 bis 10 % Polyacrylamid/Tris-Borat-EDTA (TBE) - - Gelen aufgetrennt (Freid et al.; Garner et al.) . Sodann wurden die Gele fixiert, getrocknet und mit einem Röntgenfilm in Kontakt gebracht. Die Autoradiogramme der Gele wurden auf Bandenverschiebungsmuster untersucht.

B. Filterbindungstests

Ein zweites Verfahren, das hauptsächlich zur Bestimmung der Off-Raten für Protein/Oligonucleotid-Komplexe eingesetzt wurde, ist die Filterbindung (Woodbury et al.). Nitrocelluloseplättchen (Schleicher und Schuell, BA85 Filter), die in Bindungspuffer eingeweicht worden waren (vgl. nachstehend), wurden auf eine Vakuum-Filtriervorrichtung aufgelegt. Die DNA/Protein-Bindungsreaktionsansätze (vgl. nachstehend; typischerweise 15 bis 30 ul) wurden mit Bindungspuffer auf 0,5 ml verdünnt (dies verdünnt die Konzentration der Komponenten, ohne daß die Komplexe dissoziieren) und auf die Plättchen unter angelegtem Vakuum auftragen. Unter Bedingungen einer niedrigen Salzkonzentration bleibt der DNA/Protein-Komplex an dem Filter hängen, während die freie DNA durchläuft. Die Plättchen wurden in Szintillationszählflüssigkeit (New England Nuclear) gelegt und die cpm mit Hilfe eines Szintillationszählers bestimmt.
Diese Technik wurde so modifiziert, daß sie für Nitrocellulosefilterplatten mit 96 Vertiefungen und 72 Kerben (Schleicher und Schuell) angewendet werden konnte, wobei das vorstehende Protokoll eingesetzt wurde, mit der Ausnahme, daß (i) die Volumina von Reaktionsansatz-Verdünnung und waschlösung kleiner sind und (ii) die Durchflußgeschwindigkeit durch das Filter mittels Einstellung des Vakuumdrucks geregelt wird. Dieses Verfahren erleichtert das Testen von größeren Mengen von Testproben. Die Proben, bei denen radioaktive Oligonucleotide verwendet werden, werden auf die Nitrocellulosefilter aufgetragen, die Filter mit Röntgenfilmen in Kontakt gebracht und anschließend unter Verwendung eines Molecular Dynamics Scanning-Densitometers analysiert. Mit diesem System können die Daten direkt in Rechenprogramme (z.B. Excel) überführt und anhand des Computers analysiert und grafisch dargestellt werden.

Beispiel 4

Test der funktionellen UL9-Bindung

A. Test der funktionellen DNA-Bindungsaffinität

Gereinigtes Protein wurde auffunktionelle Aktivität getestet, wobei Bandenverschiebungstests verwendet wurden. Die radiomarkierten Oligonucleotide (hergestellt wie in Beispiel B), welche die 11 bp-große Erkennungssequenz enthielten, wurden mit dem Protein UL9 in Bindungspuffer gemischt (optimierte Reaktionsbedingungen: 0,1 ug ³²P-DNA, 1 ul UL9-Extrakt, 20 mM HEPES, pH 7,2, 50 mM KCl und 1 mM DTT). Die Reaktionsansätze wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert (wobei die Bindung in weniger als zwei Minuten stattfindet) und anschließend auf 4 bis 10 % nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt. Die spezifische Bindung von UL9 an das Oligonucleotid wird durch eine Verschiebung der Mobilität des Oligonucleotids auf dem Gel angezeigt, die in Anwesenheit des Proteins UL9, nicht jedoch in seiner Abwesenheit zu sehen ist. Bakterienextrakte, die das Protein UL9 enthielten (+) oder nicht enthielten (-), und affinitätsgereinigtes Protein UL9 wurden in diesem Test untersucht. Lediglich die Bakterienextrakte, die UL9 enthielten, oder das affinitätsgereinigte Protein UL9 bewirkten auf dem Gel eine Bandenverschiebung, die eine Bindung des Proteins anzeigt.
Wieviel des Extraktes zum Reaktionsgemisch zugegeben werden muß, daß das Protein UL9, bezogen auf das Oligonucleotid, im Überschuß vorliegt, wurde für jedes/jeden Proteinpräparat/extrakt empirisch bestimmt. Aliquots des Präparats wurden zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und wie vorstehend behandelt. Die Extraktmenge, bei der der größte Teil des markierten Oligonucleotids im DNA/Protein-Komplex vorliegt, wurde durch Bandenverschiebungs- oder Filterbindungstests ermittelt. Der Test ist unter Bedingungen am empfindlichsten, bei denen die kleinstmögliche Proteinmenge zugegeben wird, bei der noch der größte Teil der DNA gebunden wird. Überschüssiges Protein kann die Empfindlichkeit des Tests mindern.

B. Dissoziationsrate

Die Dissoziationsrate wurde unter Verwendung eines Kompetitionstests bestimmt. Ein Oligonucleotid, das die in Figur 4 gezeigte Sequenz aufwies, in der die Bindungsstelle für UL9 enthalten war (SEQ ID NO: 14), wurde mit ³²P-ATP und Polynucleotidkinase (Bethesda Research Laboratories) radioaktiv markiert. Die Kompetitor-DNA war ein aus 17 Basenpaaren bestehendes Oligonucleotid (SEQ ID NO: 16), das die Bindungsstelle für UL9 enthielt.
In den Kompetitionstests wurden die Bindungsreaktionsansätze (Beispiel 4A) mit jedem der Oligonucleotide zusammengebracht und auf Eis gestellt. Unmarkiertes Oligonucleotid (1 ug) wurde zugegeben und der Reaktionsansatz 1, 2, 4, 6 oder 21 Stunden nach der Zugabe auf ein 8 % Polyacrylamidgel aufgetragen (Lauf in TBE-Puffer (Maniatis et al.)), wodurch die Reaktionskomponenten aufgetrennt wurden. Die Dissoziationsraten für das verkürzte UL9 (UL9-COOH) und das UL9 in voller Länge betrugen unter diesen Bedingungen bei 4ºC etwa vier Stunden. Außerdem wurden nach dem Zufall hergestellte Oligonucleotide (ein 10 000-facher Überschuß), die nicht die UL9-bindende Sequenz enthielten, und gescherte Heringsperma-DNA (ein 100 000facher Überschuß) getestet, wobei keine dieser Kontroll-DNAs mit dem Oligonucleotid, das die UL9-Bindungsstelle enthielt, um die Bindung konkurrierte.

C. Optimierung des UL9-Bindungstests

(i) Verkürztes UL9 aus dem bakteriellen Expressionssystem

Die Effekte der folgenden Komponenten auf die Bindungsraten von UL9-COOH an seine entsprechende Bindungsstelle und auf seine Dissoziationsraten wurden getestet und optimiert: Pufferbedingungen (einschließlich pH-Wert, Art des Puffers und Konzentration des Puffers); Art und Konzentration von einwertigen Kationen; Vorliegen von zweiwertigen Kationen und Schwermetallen; Temperatur; verschiedene mehrwertige Kationen in unterschiedlichen Konzentrationen; und verschiedene Redox- Reagenzien in unterschiedlichen Konzentrationen. Die Wirkung einer bestimmten Komponente wurde ermittelt, indem mit den Reaktionsbedingungen begonnen wurde, die vorstehend angegeben sind und die auf Dissoziationsreaktionen beruhen, die in Beispiel 4B beschrieben sind.
Die optimierten Bedingungen, die für die Bindung des in Bakterienextrakten enthaltenen UL9-COOH (Beispiel 2E) an Oligonucleotide, die die HSV-ori-Sequenz (SEQ ID NO: 1) enthielten, eingesetzt wurden, sahen folgendermaßen aus: 20 mM HEPES, pH 7,2, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,005 bis 0,1 ug radiomarkierte (spezifische Aktivitat etwa 10&sup8; cpm/ug) oder digoxigenierte, biotinylierte Oligonucleotidsonde und 5 bis 10 ug rohes UL9- COOH-Proteinpräparat (1 mM EDTA kann gegebenenfalls im Reaktionsgemisch enthalten sein). Unter optimierten Bedingungen bindet UL9-COOH sehr rasch und weist bei 400 mit nicht-biotinyliertem Oligonucleotid eine Dissoziationsrate von etwa vier Stunden und mit biotinylierten Oligonucleotiden von 5 bis 10 Minuten auf. Die Dissoziationsrate von UL9-COOH ist unter unterschiedlichen physikalischen Bedingungen deutlich verschieden. Typischerweise wurde als Standardisierungsverfahren die Aktivität eines UL9-Proteinpräparats unter Verwendung des Gel- Bandenverschiebungstests ermittelt und auf den Gesamt-Proteingehalt des Extraktes bezogen. Wieviel Heringsperma-DNA zugegeben werden mußte, war von der Reinheit des im Experiment verwendeten UL9 abhängig. Die Bindungstestansätze wurden 5 bis 30 Minuten bei 25ºC inkubiert.

(ii) UL9-Protein in voller Länge aus dem Baculovirus-System

Die Bedingungen der Bindungsreaktion für das durch Baculovirus produzierte UL9-Polypeptid in voller Länge wurden auch optimiert. Die hierei erhaltenen optimalen Bedingungen für den vorliegenden Test sahen folgendermaßen aus: 20 mM HEPES; 100 mM NaCl; 0,5 mM Dithiothreitol; 1 mM EDTA; 5 % Glycerin; von bis 10&sup4;-facher Überschuß gescherter Heringsperma-DNA; 0,005 bis 0,1 ug radiomarkierte (spezifische Aktivität etwa 10&sup8; cpm/ug) oder digoxigenierte, biotinylierte Oligonucleotidsonde und 5 bis 10 ug rohes UL9-Proteinpräparat. Das Protein in Voller Länge bindet auch gut unter den optimierten Bedingungen, die für das verkürzte UL9-COOH aufgestellt wurden.

Beispiel 5

Wirkung von Variationen der Testsequenz auf die Off-Rate des Proteins UL9

Die in Figur 5 dargestellten Oligonucleotide wurden radioaktiv markiert, wie vorstehend beschrieben. Die Kompetitionstests wurden unter Verwendung von UL9-COOH durchgeführt, wie in Beispiel 48 beschrieben. Die radioaktiv markierten Oligonucleotide wurden mit dem Protein UL9-COOH in Bindungspuffer gemischt (typischer Reaktionsansatz: 0,1 ug Oligonucleotid-³²P-DNA, 1 ul UL9-COOH-Extrakt, 20 mM HEPES, pH 7,2, 50 mM KCl, 1 mM EDTA und 1 mM DTT). Die Reaktionsansätze wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde eine Probe zum Zeitpunkt Null genommen und auf ein 8 % Polyacrylamidgel aufgetragen (Lauf unter Verwendung von TEE). Ein ug des unmarkierten 17 bp-großen Oligonucleotids (SEQ ID NO: 16) (Beispiel 4B) wurde als kompetitive DNA zugegeben und 5, 10, 15, 20 oder 60 Minuten danach eine Probe des Reaktionsansatzes auf das Gel aufgetragen. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Figur 9 dargestellt. Die Screeningsequenzen, die die UL9-Bindungsstelle flankieren (SEQ ID NO: 5 bis SEQ ID NO: 13), sind sehr verschieden, haben jedoch kaum eine Wirkung auf die Off- Rate von UL9. Demgemäß zeigen diese Ergebnisse, daß das DNA- bindende Protein UL9 wirksam an eine Screeningsequenz in doppelsträngiger DNA mit einer Bindungsaffinität bindet, die im wesentlichen unabhängig von den Testsequenzen ist, die neben der Screeningsequenz liegen. Mit Filterbindungsexperimenten wurde das gleiche Ergebnis erhalten.

Beispiel 6

Die Wirkung von Actinomycin D, Distamycin A und Doxorubicin auf die Bindung von UL9 an die Screeningsequenz ist abhängig von der spezifischen Testsequenz

Mit verschiedenen Oligonucleotiden, von denen jedes die Screeningsequenz (SEQ ID NO: 1) enthielt, die auf der 5'- und der 3'-Seite von einer Testsequenz (SEQ ID NO: 5 bis SEQ ID NO: 13) flankiert war, wurden Effekte von Distamycin A, Actinomycin D und Doxorubicin auf die Bindung von UL9-COOH getestet.
Die Bindungstests wurden durchgeführt, wie in Beispiel 5 beschrieben. Die in den Tests verwendeten Oligonucleotide sind in Figur 5 dargestellt. Das Testgemisch wurde vor der Zugabe des Arzneistoffs 15 Minuten bei Raumtemperatur zur Voräquilibrierung stehengelassen.
Eine konzentrierte Lösung von Distamycin A in dH&sub2;O wurde zubereitet und zu den Bindungsreaktionsansätzen in den folgenden Konzentrationen zugegeben: 0, 1, 4, 16 und 40 um. Der Arzneistoff wurde zugegeben und der Ansatz eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Reaktionsgemische auf ein 8 % Polyacrylamidgel aufgetragen (Beispiel 5) und die Komponenten elektrophoretisch aufgetrennt. Die Autoradiogramme dieser Gele sind in Figur 10A dargestellt. Die folgenden Testsequenzen wurden getestet: UL9 polyT, SEQ ID NO: 9; UL9 CCCG, SEQ ID NO: 5; UL9 GGGC, SEQ ID NO: 6; UL9 poly A, SEQ ID NO: 8; und UL9 ATAT, SEQ ID NO: 7. Diese Ergebnisse zeigen, daß Distamycin A vorzugsweise die Bindung an UL9 poly- T, UL9 polyA und UL9 ATAT spaltet.
Eine konzentrierte Lösung von Actinomycin D in dH&sub2;O wurde hergestellt und zu den Bindungsreaktionsansätzen in den folgenden Konzentrationen zugegeben: 0 und 50 um. Der Arzneistoff wurde zugefügt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Zu den Kontrollproben wurde dH&sub2;O in den gleichen Volumina zugegeben. Anschließend wurden die Reaktionsgemische auf ein 8 % Polyacrylamidgel aufgetragen (Beispiel 5) und die Komponenten elektrophoretisch aufgetrennt. Die Autoradiogramme dieser Gele sind in Figur 10B dargestellt. Zusätzlich zu den Testsequenzen, die vorstehend mit Distamycin A getestet wurden, wurden mit Actinomycin D außerdem die folgenden Testsequenzen getestet: Atoril, SEQ ID NO: 11; oriEco2, SEQ ID NO: 12 und oriEco3, SEQ ID NO: 13. Diese Ergebnisse zeigen, daß Actinomycin D vorzugsweise die Bindung von UL9 an die Oligonucleotide UL9 CCCG und UL9 GGGC spaltet.
Eine konzentrierte Lösung von Doxorubiam in dH&sub2;O wurde zubereitet und zu den Bindungsreaktionsansätzen in den folgenden Konzentrationen zugegeben: 0, 15 und 35 j£m. Der Arzneistoff wurde zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Zu den Kontroliproben wurde dH&sub2;O in den gleichen Volumina zugegeben. Anschließend wurden die Reaktionsgemische auf ein 8 % Polyacrylamidgel aufgetragen (Beispiel 5) und die Komponenten elektrophoretisch aufgetrennt. Die Autoradiogramme dieser Gele sind in Figur 10C dargestellt. Die gleichen Testsequenzen wie bei Actinomycin D wurden getestet. Diese Ergebnisse zeigen, daß Doxorubicin vorzugsweise die Bindung von UL9 an die Oligonualeotide UL9 polyT, UL9 GGGC, oriEco2 und oriEco3 spaltet. Doxorubicin scheint die Wechselwirkung von UL9 und Screeningsequenz insbesondere dann aufzubrechen, wenn die Testsequenz oriEco3 vorliegt. Die Sequenzen der Testsequenzen für oriEco2 und oriEco3 unterscheiden sich lediglich in einer Base: einem zusätzlichen T-Rest, der in Position 12 eingefügt ist, vgl. SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13.

Beispiel 7

Verwendung des Biotin/Streptavidin-Reportersystems

A. Einfangen von proteinfreier DNA

Verschiedene Verfahren wurden verwendet, um ungebundene DNA von DNA/Protein-Komplexen zu trennen.

(i) Magnetische Kügelchen

Mit Streptavidin konjugierte superparamagnetische Polystyrolkügelchen (Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynal AS, 6 bis 7 x 10&sup8; Kügelchen pro ml) werden in Bindungspuffer gewaschen und anschließend zum Einfangen biotinylierter Oligonucleotide eingesetzt (Beispiel 1). Die Kügelchen werden zu 15 ul Bindungsreaktionsgemisch zugegeben, das Bindungspuffer und ein biotinyliertes Oligonucleotid enthält. Das Gemisch aus Kügelchen und Oligonucleotid wird mit dem Bindungsgemisch unterschiedlich lange inkubiert, wobei die Inkubationszeit bestimmt wird, bei der die proteinfreien biotinylierten Oligonucleotide maximal eingefangen werden. Nach dem Einfangen des biotinylierten Oligonucleotids können die Kügelchen wiedergewonnen werden, indem die Reaktionsröhrchen in einen magnetischen Ständer gestellt werden (Magnete für Platten mit 96 Vertiefungen sind von Dynal verfügbar). Sodann werden die Kügelchen gewaschen.

(ii) Agarosekügelchen

Biotinylierte Agarosekügeichen (immobilisiertes D-Biotin, Pierce, Rockford, IL) werden mit Avidin verknüpft, indem die Kügelchen über Nacht bei 4ºC mit 50 ug/ul Avidin in Bindungspuffer behandelt werden. Die Kügelchen werden in Bindungspuffer gewaschen und zum Einfangen biotinylierter DNA verwendet. Wenn die biotinylierte DNA eingefangen werden soll, werden die Kügelchen mit den Bindungsansätzen gemischt. Sodann werden die Kügelchen abzentrifugiert oder auf einem nicht-bindenden Filterplättchen gesammelt.
In den beiden vorstehenden Verfahren hängt die Frage, wie das vorliegende Oligonucleotid quantitativ bestimmt werden kann, davon ab, auf welche Weise das Oligonucleotid markiert wurde. Wenn das Oligonucleotid radioaktiv markiert wurde, können (i) die Kügelchen und der Überstand auf Polyacrylamidgele aufgetragen werden, wobei die Protein/DNA-Komplexe von den Kügelchen/DNA-Komplexen durch Elektrophorese getrennt werden können, anschließend kann eine Autoradiographie durchgeführt werden; und (ii) können die Kügelchen in Szintillationsflüssigkeit eingebracht und in einem Szintillationszähler gezählt werden. Alternativ kann das vorliegende Oligonucleotid unter Verwendung eines Chemilumineszenz- oder Kolorimetrie-Nachweissystems bestimmt werden.

B. Nachweis von proteinfreier DNA

Die DNA wird mit Digoxigenin-11-dUTP endmarkiert (Beispiel 1). Die antigene Digoxigenineinheit wird durch das Antikörper-Enzym-Konjugat Anti-Digoxigenin-alkalische Phosphatase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) erkannt. Das DNA/Antikörper-Enzym-Konjugat wird sodann mit dem Substrat der Wahl in Kontakt gebracht. Das Vorliegen von dig-dTUP verändert nicht die Fähigkeit des Proteins, an die DNA zu binden, oder die Fähigkeit von Streptavidin, an Biotin zu binden.

(i) Nachweis von Chemilumineszenz

Mit Digoxigenin markierte Oligonucleotide werden unter Verwendung des Nachweissystems "SOUTHERN LIGHTS " nachgewiesen, das von Tropix, Inc. (Bedford, MA) entwickelt wurde. Die Verwendung dieses Nachweissystems ist in den Figuren 11A und 11B dargestellt. Die Technik kann zum Nachweis von DNA verwendet werden, die auf Kügelchen oder auf Filtern eingefangen wurde.
Biotinylierte Oligonucleotide, die terminale Digoxigeninenthaltende Reste aufweisen (Beispiel 1), werden auf magnetischen Kügelchen (Figur 11A) oder auf Agarosekügelchen (Figur 11B) eingefangen, wie vorstehend beschrieben. Die Kügelchen werden isoliert und zur Blockierung unspezifischer Bindung 30 Minuten bei Raumtemperatur in I-Light-Blockierungspuffer (Tropix) inkubiert. Die vorliegenden Oligonucleotide werden unter Verwendung von gegen Digoxygenin gerichteten Antikörpern, die mit alkalischer Phosphatase konjugiert sind, nachgewiesen. Anti-Digoxigenin-alkalische Phosphatase (anti-dig-AP, Verdünnung 1:5000, 0,75 Einheiten/ul, Boehringer Mannheim) wird mit der Probe 30 Minuten inkubiert, dekantiert und die Probe mit 100 mM Tris-HCl, pH 715, 150 mM NaCl, gewaschen. Die Probe wird mit zwei Waschgängen 50 mM Natriumbicarbonat, pH 9,5, 1 M MgCl&sub2;, Voräquilibriert und anschließend im gleichen Puffer, der 0,25 mM 3-(2-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3'-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan-Dinatriumsalz (AMPPD) enthält, fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. AMPPD wurde als chemilumineszierendes Substrat für alkalische Phosphatase entwickelt (Tropix Inc.). Die Dephosphorylierung von AMPPD führt zu einer instabilen Verbindung, die zerfällt und dabei eine langfristige gleichmäßige Emission von Licht bei 477 nm bewirkt.
Die überschüssige Flüssigkeit wird von den Filtern entfernt, und die Lichtemission, die durch die Dephosphorylierung von AMPPD durch alkalische Phosphatase bewirkt wird, kann durch Inkontaktbringen mit einem Röntgenfilm oder durch Nachweis in einem Luminometer gemessen werden.
In Lösung wird der Komplex Kügelchen-DNA-anti-dig-AP in "SOUTHERN LIGHT "-Testpuffer und AMPPD resuspendiert und direkt in einem Luminometer gemessen. Screeningtests im großen Umfang können unter Verwendung eines Luminometers durchgeführt werden, in dem Platten mit 96 Vertiefungen abgelesen werden können ("96-well plate reading luminometer", Dynatech Laboratones, Chantilly, VA). Unter Einsatz des Tropix-Systems in Verbindung mit dem Plattenlese-Luminometer können DNA-Mengen von weniger als Picogramm können nachgewiesen werden (102 bis 10³ Attomole (ein Attomol ist 10&supmin;¹&sup8; Mol)).

(ii) Nachweis durch Kolorimetrie

Für die vorstehenden Nachweisreaktionen können auch herkömmuche kolorimetrische Substrate der alkalischen Phosphatase verwendet werden. Typischerweise umfassen die Substrate 4-Nitrophenylphosphat (Boehringer Mannheim). Die Ergebnisse von kolorimetrischen Tests können in Platten mit vielen Vertiefungen (wie vorstehend) unter Verwendung eines Plattenlese- Spetrophotometers (Molecular Devices, Menlo Park, CA) abgelesen werden. Jedoch sind die kolorimetrischen Systeme nicht so empfindlich wie das System zur Messung der Lichtemission.

SEQUENZ PROTOKOLL

(1) Allgemeine Angaben:
(i) Anmelder: Edwards, Cynthia A.
Cantor, Charles R.
Andrews, Beth M.
(ii) Titel der Erfindung: Screeningtest für den Nachweis von DNA-bindenden Molekülen
(iii) Anzahl der Sequenzen: 18
(iv) Korrespondenzadresse:
(A): Empfänger: LAW OFFICES OF PETER J. DEHLINGER
(B) Straße: P.O. Box 60850
(C) Stadt: Palo Alto
(D) Staat: CA
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl: 94306
(v) Computerlesbare Form:
(A) Art des Mediums: Floppy Disk
(B) Computer: IBM-PC-kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: Patent In Release #1.0, Version #1.25
(vi) Daten der Anmeldung:
(A) Anmeldungsnummer:
(B) Tag der Anmeldung:
(C) Klassifizierung:
(vii) Daten früherer Anmeldung:
(A) Anmeldungsnummer: 07/723 618
(B) Tag der Anmeldung: 27. Juni 1991
(C) Klassifizierung:
(viii) Anwalt/Bevollmächtigter:
(A) Name: Fabian, Gary R.
(B) Zulassungsnummer: 33 875
(C) Referenz/Prozeßnummer: 4600-0075.41
(ix) Telekommunikation:
(A) Telefon: (415) 323-8302
(B) Telefax: (415) 323-8306
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 1:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 11 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(c) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologle: linear
(ii) Art des Moleküls DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9-Bindungsstelle, HSV oriS, höhere Affinität
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 1:
CGTTCGCACT T 11
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 2:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 11 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9-Bindungsstelle, HSV oriS, niedrigere Affinität
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 2:
TGCTCGCACT T 11
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 3:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9Z1-Iestsequenz / UL9- Assaysequenz
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 3:
GCGCGCGCGC GTTCGCACTT CCGCCGCCGG 30
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 4:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9Z2-Testsequenz / UL9- Assaysequenz
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 4:
GGCGCCGGCC Gttcgcactt CGCGCGCGCG 30
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 5:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9 CCCG-Testsequenz / UL9-Assaysequenz
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 5:
GGCCCGCCCC GTTCGCACTT CCCGCCCCGG 30
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 6:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologle: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL GGGC-Testsequenz UL9-Assaysequenz
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 6:
GGCGGGCGCC GTTCGCACTT GGGCGGGCGG 30
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 7:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Tapologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9 ATAT-Testsequenz / UL9-Assaysequenz
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 7: GGATATATAC GTTCGCACTT TAATTATTGG 30
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 8:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9 polyA-Testsequenz / UL9-Assaysequenz
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 8:
GGAAAAAAC GTTCGCACTT AAAAAAAAGG 30
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 9:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9 polyT-Testsequenz / UL9-Assaysequenz
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 9:
GGTTTTTTTC GTTCGCACTT TTTTTTTTGG 30
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 10:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9 GCAC-Testsequenz / UL9-Assaysequenz
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 10:
GGACGCACGC GTTCGCACTT GCAGCAGCGG 30
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 11:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9 Atori-l-Testsequenz / UL9-Assaysequenz
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 11:
GCGTATATAT CGTTCGCACT TCGTCCCAAT 30
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 12:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 31 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) StrangforM: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: oriEco2-Testsequenz UL9-Assaysequenz
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 12:
GGCGAATTCG ACGTTCGCAC TTCGTCCCAA T 31
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 13:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 32 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: oriEco3-Testsequenz UL9-Assaysequenz
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 13:
GGCGAATTCG ATCGTTCGCA CTTCGTCCCA AT 32
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 14:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 36 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologle: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: Wildtyp
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 14:
AAGTGAGAAT TCGAAGCGTT CGCACTTCGT CCCAAT 36
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 15:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 9 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: Verkürzte UL9-Bindungsstelle, vgl. SEQ ID NO: 1
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 15:
TTCGCACTT 9
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 16:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 17 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologle: linear
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: HSVBI/4, Sequenz von Kompetitor-DNA-Molekül
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 16:
GGTCGTTCGC ACTTCGC 17
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 17:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 11 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9-Bindungsstelle, HSV oriS
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 17:
CGTTCTCACTT 11
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 18:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 37 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: ja
(iv) Antisense: nein
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(C) Individuelles Isolat: UL9-Assaysequenz, Figur
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID NO: 18:
GCGTAANNNNCGTTCGCACTTNNNNCTTCGTCCCAAT 37

Claims

1. Verfahren zum Sareening nach Molekülen, die befähigt sind, an eine ausgewählte Testsequenz in einer doppelsträngigen DNA zu binden, umfassend

(i) die Zugabe eines Moleküls, das gesareent werden soll, zu einem Testsystem, das zusammengesetzt ist aus (a) einem DNA bindenden Protein, das an eine Screeningsequenz in einer doppelsträngigen DNA mit einer Bindungsaffinität binden kann, die im wesentlichen unabhängig von der neben der screeningsequenz liegenden Testsequenz ist, wobei jedoch die Proteinbindung empfindlich ist gegenüber einer Bindung von Molekülen an die Testsequenz, und (b) einer doppelsträngigen DNA, bei der die screening- und Testsequenzen nebeneinander liegen,

(ii) die Inkubation des Moleküls im Testsystem ausreichend lange, so daß die Bindung der getesteten Verbindung an die Testsequenz in der doppelsträngigen DNA erfolgen kann, und

(iii) den Nachweis der Menge des bindenden Proteins, das vor und nach der Zugabe an die doppelsträngige DNA gebunden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Screeningsequenz/bindendes Protein ausgewählt ist aus der Gruppe Replikationsursprung des Epstein-Barr-Virus (EBV)/Epstein-Barr-Virus- Kernantigen (EBNA), Replikationsursprung des Herpes-simplex-Virus (HSV)/HSV-codierte DNA bindendes Protein UL9, Replikationsursprung des Varicella-Zoster-Virus (VZV) /Varicella-Zoster-Virus-codierten Replikationsursprung bindendes Protein, Replikationsursprung des menschlichen Papillomavirus (HPV)/HPV-codierte DNA bindendes Protein E2, und Lambda-Phagen-DNA oL-oR/Phagen-DNA bindendes Protein cro.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die DNA-Screeningsequenz vom Replikationsursprung des Herpes-simplex-Virus (HSV) stammt und das bindende Protein UL9 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die DNA-Screeningsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 17.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis durch Verwendung eines Gelbanden-Verschiebungstests ("gel band shift assay") oder eines Filterbindungstests erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 11 wobei die Testsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe EBV-Replikationsursprung, HSV- Replikationsursprung, VZV-Replikationsursprung, HPV-Replikationsursprung, Interleukin-2-Enhancer, HIV-LTR, HBV- Enhancer und Fibrinogen-Promotor.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Testsequenz ausgewählt ist aus einer Nucleinsäuresequenz aus einer definierten Gruppe von DNA-Sequenzen mit [XN]N-Kombinationen, wobei XN eine Sequenz von Desoxyribonucleotiden und N die Anzahl der Desoxyribonucleotide in der Sequenz darstellt, wobei N größer oder gleich drei ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei N 3 bis 20 ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei N 4 bis 10 ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei N 4 ist und die Anzahl der Kombinationen 256 beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge des bindenden Proteins, das an die doppelsträngige DNA gebunden ist, in einem Einfangsystem gemessen wird, das die doppelsträngige DNA einfängt, an die kein Protein gebunden ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei im Einfangsystem ein Nucleotid in der Screeningsequenz biotinyliert wird, wodurch (i) die Fähigkeit des Proteins, an die Sareeningsequenz zu binden, nicht gestört wird, (ii) die Biotineinheit befähigt ist, Streptavidin zu binden und (iii) die Biotineinheit davor geschützt ist, mit Streptavidin in Wechselwirkung zu treten, wenn das Protein an die Screeningsequenz gebunden ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das bindende Protein in einer molaren Konzentration vorliegt, die kleiner oder gleich groß ist wie die molare Konzentration der in der doppelsträngigen DNA vorliegenden Screeningsequenz.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das bindende Protein gegenüber der in der doppelsträngigen DNA vorliegenden Screeningsequenz in einem molaren Überschuß vorliegt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zum Screening nach Molekülen, die befähigt sind, an eine ausgewählte Testsequenz zu binden, wodurch die Bindung eines DNA-bindenden Proteins an die doppelsträngige DNA gehemmt wird, ferner umfassend die Selektion eines Moleküls, das befähigt ist, an eine ausgewählte Testsequenz zu binden, wodurch es die Bindung des Proteins an eine Screeningsequenz hemmt, sofern es die Menge des bindenden Proteins, das vor und nach der Zugabe an die doppelsträngige DNA gebunden ist, verringert.

16. Screeningkit zur Identifizierung von Molekülen, die befähigt sind, an eine Testsequenz in einer doppelsträngigen Ziel-DNA zu binden, umfassend

eine doppelsträngige DNA, bei der die Screening- und restsequenzen nebeneinander liegen,

ein DNA bindendes Protein, das an die Screeningsequenz in der doppelsträngigen DNA mit einer Bindungsaffinität binden kann, die im wesentlichen unabhängig von der neben der Screeningsequenz liegenden Testsequenz ist, die jedoch empfindlich ist gegenüber einer Bindung von Molekülen an die Testsequenz,

und Mittel zum Nachweis der Menge des bindenden Proteins, das an die DNA gebunden ist.

17. Kit nach Anspruch 16, wobei die Testsequenzen wie in den Ansprüchen 6 bis 11 definiert sind.

18. Kit nach Anspruch 16, wobei Screeningsequenz/bindendes Protein wie in den Ansprüchen 2 bis 4 definiert ist.

19. Kit nach Anspruch 18, wobei die DNA-Screeningsequenz SEQ ID NO: 1 ist.

20. Kit nach Anspruch 19, wobei der Rest U in Position 8 biotinyliert ist.

21. Kit nach Anspruch 20, wobei das Mittel zum Nachweis Streptavidin umfaßt und das Streptavidin an einen festen Träger gebunden ist.

22. Kit nach Anspruch 21, wobei Streptavidin zum Einfangen der doppelsträngigen DNA verwendet wird, an die kein Protein gebunden ist.