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DE69328514T2 - Herstellung rekombinanter Proteine unter Verwendung von Herpes-Virus-Promotoren und VP16-Transaktivatoren - Google Patents

Herstellung rekombinanter Proteine unter Verwendung von Herpes-Virus-Promotoren und VP16-Transaktivatoren

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DE69328514T2
DE69328514T2 DE69328514T DE69328514T DE69328514T2 DE 69328514 T2 DE69328514 T2 DE 69328514T2 DE 69328514 T DE69328514 T DE 69328514T DE 69328514 T DE69328514 T DE 69328514T DE 69328514 T2 DE69328514 T2 DE 69328514T2
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DE
Germany
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gene
cell
selectable
construct
selectable agent
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Maureen Katherine Highkin
Paul Jerome Hippenmeyer
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Monsanto Co
Original Assignee
Monsanto Co
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Publication date
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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft die Herstellung rekombinanter Proteine und insbesondere ein Mittel zur Transaktivierung heterologer Gene.
    • Verwandter Stand der Technik
  • Die Fähigkeit, rekombinante Proteine in Säugetier-Zellkulturen effizient zu produzieren, ist für die Herstellung von sowohl Forschungsmitteln als auch kommerziellen Produkten wesentlich. Mehrere Wege und Wirtsvektor-Systeme für die Produktion rekombinanter Proteine sind überprüft worden (Kaufman, Genetic Engineering, Principles and Methods, Bd. 9, J. K. Setlow, Hrsg., Plenum Press, New York, 1987; Warren et al., Recombinant DNA Technology and Applications, A. Prokop, R. Bajpai und C. Ho, Hrsg., McGraw Hill, New York, 1990). Zu diesen Systemen zählt die Verwendung von episomalen Vektoren mit hoher Kopienzahl, wie boviner Papillomavirus (Howley et al., Methods in Enzymology, Bd. 101, Academic Press, New York, 1983), amplifizierbare Vektoren, wie jene, die das Dihydrofolat-Reduktase-Gen (Kaufman, s. o.), das Asparagin-Synthetase-Gen (Andrulis, Molecular Cell Genetics, Bd. 17, 1985) oder das Ornithin-Decarboxylase-Gen (McConlogue, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987) enthalten, oder starke konstitutive Promotoren, wie den Simian- Virus-40-Promotor (Mulligan et al., Science, Bd. 209, S. 1422- 1427, 1980), oder der große frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (Boshart et al., Cell, Bd. 41, S. 521-530, 1985). All diese Systeme beruhen auf den Mengen endogener Transaktivatoren im betreffenden Zelltyp zur Stimulierung der Transkription des verwendeten Promotors zur Konstruktion der Expressionsvektoren.
  • Ein alternativer Weg zu einer Produktion in großen Mengen wäre die Konstruktion von Zellen mit einem spezifischen Transkriptionsaktivator oder Transaktivator. Wenn der Transaktivator einen spezifischen Zielpromotor hat, dann kann der Zielpromotor mit einem Gen, an dem Interesse besteht, verbunden und in die konstruierte Zelle eingebracht werden. Die Menge an Zielprotein, die von dieser Zelle produziert wird, würde von mehreren Parametern abhängen. Erstens ist die inhärente spezifische Aktivität des Transaktivators ein Faktor bei der Menge an Transkription aus dem Zielpromotor. Zusätzlich beeinflußt die Menge des von der Zielzelle erzeugten Transaktivators die Menge an Transaktivierung. Beispielsweise ist in Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (Chinese hamster ovary cells, CHO) eine geringe Menge an endogenem Glucocorticoidrezeptor/Transaktivator vorhanden. Die Transfektion eines Plasmids, das den Glucocorticoidrezeptor/Transaktivator benötigt, führt zu einer sehr geringen Expression aus diesem Plasmid. Wenn jedoch die Zellen zuerst so konstruiert werden, daß sie große Mengen des Glucocorticoidrezeptors/Transaktivators exprimieren, dann wird eine hochgradige Expression aus dem selben Plasmid erhalten (Israel et al., Nuc. Acids Res., Bd. 17, S. 4589-4606, 1989). Daher hängt die Transaktivierungsmenge von der Menge an Transaktivator in der Zelle ab. Die Menge an Transaktivator hängt vom Promotor, der verwendet wird, um die Expression des Transaktivators zu betreiben, und von der Stelle der Integration der Kassette in der Wirtszelle ab. Drittens hat die Menge des Zielvektors in einer bestimmten Zelle einen Einfluss darauf, wie viele Kopien transaktiviert werden. Die Stelle der Integration des Zielpromotors kann auch eine Rolle bei der Expression des aktivierten Promotors spielen.
  • Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Spezifität des Transaktivators. Wenn der Transaktivator mit mehreren endogenen Zellpromotoren in Wechselwirkung tritt, dann wäre zu erwarten, daß diese Promotoren auch in der konstruierten Wirtszelle transaktiviert werden. Dies kann erwünscht oder auch unerwünscht sein, je nachdem, was diese Gene sind. Eine mögliche Auswirkung der Verwendung eines promiskuitiven Transaktivators ist, daß seine Bindung an die endogenen Promotoren seine freie Konzentration in der Zelle wirksam vermindert, wobei die für die Transaktivierung des angepeilten Promotors verfügbare Menge möglicherweise austitriert wird.
  • Nur weil ein Promotor unter transienten Bedingungen eine hohe Expressionsmenge aufweist, bedeutet dies noch nicht, daß er zur Erzeugung von Proteinen unter stabilen Bedingungen geeignet ist. Ein Beispiel dafür ist der unmittelbare frühe (immediate early, IE) Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (HCMV), der einer der stärksten Promotoren ist, die auf dem Gebiet für die transiente Expression verwendet werden (Foecking et al., Gene 45; S. 101-145, 1986; Hippenmeyer et al., Poultry Science 70, S. 982-992, 1991). Außerdem weisen einige virale Gene nicht die erwartete Regulierung auf, sobald sie in das Zell-Genom integriert sind, wie das Thymidinkinase-Gen des Herpes simplex-Virus (HSV) (Silver et al., Molecular and Cellular Biology 5, S. 518-528, 1985).
  • Obwohl die EP-Anmeldung 8802149.5 zeigt, daß eine Zelllinie, in welcher VP16 (auch als Vmw65, VF65 oder alpha-TIF bekannt) erzeugt wird, zur Transaktivierung des Zielpromotors unter transienten Bedingungen führt, und obwohl Post et al. (Cell, 24, S. 555-565, 1981) zeigten, daß der unmittelbare frühe (immediate early, IE) 175-Promotor (auch als ICP4 bekannt), wenn er im Genom einer Zelle vorliegt, durch eine Virusinfektion transaktiviert werden kann, zeigt keine von beiden, daß, wenn sowohl VP16 als auch der Zielpromotor, der operativ mit einem Gen, an dem Interesse besteht, verbunden ist, in die selbe Zelle integriert sind, eine Transaktivierung in großem Ausmaß stattfindet und große Protein-Produktionsmengen die Folge sind.
  • Auf diesem Gebiet besteht ein Bedarf an Zelllinien und Systemen, die mit einer Vielfalt von Genen verwendet werden können, um eine stabile, rekombinante Proteinproduktion in großen Mengen zu erzielen.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung enthält ein Verfahren zur Herstellung von Zelllinien zur Expression großer Mengen eines Genprodukts. Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:
  • Cotransfizieren einer Zelle mit einem ersten Konstrukt, welches bewirkt, daß die Zelle Herpes simplex-Virus-transaktivierendes Protein VP16 exprimiert, und einem zweiten Konstrukt, das ein selektierbares Resistenz-Gen gegen ein erstes selektierbares Mittel aufweist; Selektieren von Zellen, die gegen das erste selektierbare Mittel resistent sind; Screenen der Zellen, die gegen das erste selektierbare Mittel resistent sind, auf Zellen, die VP16 exprimieren; Cotransfizieren der Zelle, die Herpes simplex-Virus-transaktivierendes Protein VP16 exprimiert, mit einem dritten und einem vierten Konstrukt, wobei das dritte Konstrukt einen Herpes simplex-Virus-Gen-Promotor aufweist, der mit einem Gen, an dem Interesse besteht, operativ verbunden ist, und das vierte Konstrukt ein selektierbares Resistenz-Gen gegen ein zweites selektierbares Mittel umfaßt; Selektieren von Zellen, die gegen das zweite selektierbare Mittel resistent sind; und Screenen von Zellen, die gegen das zweite selektierbare Mittel resistent sind, auf Expression des Gen-Produkts des Gens, an dem Interesse besteht.
  • Es ist eine weitere Ausführungsform der Erfindung vorgesehen, in welcher eine Zelllinie eine große Menge eines Genprodukts exprimiert. Die Zelllinien umfassen: ein erstes Konstrukt, welches bewirkt, daß die Zelle. Herpes simplex-Virus-Transaktivator-Protein VP16 exprimiert; ein zweites Konstrukt, welches einen Herpes simplex-Virus-IE-Gen-Promotor umfaßt, der mit einem Gen, an dem Interesse besteht, operativ verbunden ist; ein drittes und ein viertes Konstrukt, welches jeweils ein selektierbares Resistenz-Gen gegen ein Antibiotikum umfasst.
  • Bei den obigen Ausführungsformen sind alle Arten von Herpes simplex-Virus-IE-Promotoren gemeint, vorzugsweise aus Herpes simplex-Virus-1, vorzugsweise IE175 (auch als ICP4 bekannt) oder IE110 (auch als ICP0 bekannt). Die Zelllinien stammen vorzugsweise aus der Niere von jungen Hamstern (baby hamster kidney, BHK-21) oder aus dem Eierstock des Chinesischen Hamsters (CHO- DUKX-B11 oder DG44).
  • Alle Arten von VP16 sollen in der Erfindung mit eingeschlossen sein, doch vorzugsweise VP16 von Herpes simplex-Virus-1. Es wird erwartet, daß das VP16-Gen und Protein aus HSV-2 infolge der großen Ähnlichkeit der Aminosäure-Sequenz genauso gut funktionieren werden wie das VP16-Gen und Protein aus HSV-1 (Greaves et al., Journal of Virology, 65, S. 6705-6713, 1991; Cress et al., Gene, 103, S. 235-238, 1991).
  • Die Verwendung der Zelllinien bei der Entdeckung von Verbindungen, die die Transaktivierung der IE-Promotoren von HSV durch das VP16-Molekül stören, ist ebenfalls beabsichtigt. Es wird erwartet, daß eine Zelllinie, die ein rekombinantes Protein infolge der Transaktivierung eines IE-Promotors durch VP16 stabil sekretiert, mit Chemikalien, natürlichen Produkten oder unbestimmten Mischungen von Chemikalien oder natürlichen Produkten inkubiert werden kann. Wenn die Inkubation der Zelle mit diesen Verbindungen zu einer Abnahme der von der Zelle erzeugten Menge an rekombinantem Protein führt, dann wirkt die Verbindung möglicherweise auf dem VP16-vermittelten Transaktivierungsschritt der rekombinanten Protein-Expression. Diese Verbindungen würden dann getestet, um zu sehen, ob sie die Expression eines rekombinanten Proteins aus einer Zelllinie stören, bei welcher die Expression nicht unter der Kontrolle von VP16 stand. Jene Verbindungen, die die Expression der VP16-vermittelten Transaktivierung stören und nicht die Expression in anderen Systemen, sind potentielle Anti-HSV-Mittel.
  • Es wird erwartet, daß Zelllinien, die so konstruiert sind, daß sie VP16 exprimieren, für die Passage und Aufrechterhaltung von Mutanten von HSV nützlich sind, welchen ein funktioneller VP16 fehlt (Werstuck et al., Journal of Virology, Bd. 64, S. 984-991). Die DNA von HSV, welcher ein funktionelles VP16-Gen oder Protein fehlt, kann in eine Zelllinie, die VP16 exprimiert, aus den integrierten DNA-Konstrukten transfiziert werden. Das VP16-Protein transaktiviert die IE-Promotoren der HSV-DNA, was zur Herstellung von Virus-Partikeln führt. Mutanten von HSV, welchen funktioneller VP16 fehlt, können vielversprechende Kandidaten für einen Vakzin-Stamm sein.
  • Die Erfindung soll auch Zelllinien umfassen, unabhängig davon, ob diese Zelllinien nun das Gen-Produkt sekretieren oder nicht, doch vorzugsweise sekretieren die Zelllinien das Gen- Produkt.
  • Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer Zelllinie zur Expression großer Mengen eines Gen-Produkts vorzusehen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Zelllinien vorzusehen, die eine große Menge eines Gen-Produkts exprimieren.
  • Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, für das vorliegende Gebiet Zelllinien vorzusehen, die für die großtechnische Produktion eines beliebigen Genprodukts, an dem Interesse besteht, verwendet werden können.
  • Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Test zur Entdeckung antiviraler Verbindungen vorzusehen.
  • Es ist ein Vorteil der Erfindung, dem vorliegenden Gebiet stabile Zelllinien zu liefern, die für einen Zeitraum von mehr als 5 Monaten eine große Menge eines Gen-Produkts exprimieren können.
  • Es ist noch ein anderer Vorteil dieser Erfindung, daß ein Verfahren vorgesehen wird, welches die Isolierung von Zelllinien ermöglicht, die höhere Expressionsmengen eines Gen-Produkts pro Zelle pro Tag schneller erzeugen als der Stand der Technik, und daß die Zelllinie für einen Zeitraum von mehr als 5 Monaten stabil ist. Viele andere Ziele und Zwecke der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung deutlich.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 zeigt die Konstruktion eines IE175-Expressionsvektors. Dieses Expressionsplasmid hat eine unike BamHI-Stelle zwischen den Promotor-Sequenzen und den SV40 späten Polyadenylierungssequenzen.
  • Fig. 2 zeigt die Konstruktion eines IE110-Expressionsvektors. Dieses Expressionsplasmid hat eine unike BamHI-Stelle zwischen den Promotor-Sequenzen und dem SV40 späten Polyadenylierungssignal.
  • Fig. 3 zeigt die Konstruktion eines Expressionsvektors eines langen terminalen Repeats (LTR) eines Mammatumorvirus (MMTV) von Mäusen. Das SV40 Polyadenylierungssignal ist in diesem Plasmid in der frühen Orientierung.
  • Fig. 4: BHK/VP16/IE175-tPA-Linien 34, 39, 47 und 49 wurden zweimal pro Woche zu 1 : 20 bis 1 : 40 (pro Volumen) passagiert und auf tPA-Produktion getestet.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es ist eine Erkenntnis der vorliegenden Erfindung, daß stabile Transfektanten von Säugerzellen, die sowohl ein Gen, das für ein Herpes simplex-Virus-Transaktivator-Protein (VP16) kodiert, als auch einen Herpes simplex-Virus-Gen-Promotor (IE-Promotor), der an ein Gen gebunden ist, an dem Interesse besteht, aufweisen, das Gen, an dem Interesse besteht, in großer Menge exprimieren können. Besonders interessant ist die Tatsache, daß der spezifische Weg der Konstruktion der Zelllinien das Ergebnis in unerwarteter Weise beeinflussen kann. Während sich Selektionen unter Beteiligung einer Antibiotika-Resistenz in CHO-DUKX- B11-Zellen als erfolgreicher erwiesen haben, scheinen Selektionen auf Dihydrofolat-Reduktase-Expression in CHO-DUKX-B11-Zellen nachteilig für den Erhalt der gewünschten, hochproduktiven Zelllinien zu sein.
  • Der Transaktivator des Herpes simplex-Virus ist vorzugsweise das späte Virusprotein, das als VP16, VF65, Vmw65 oder alpha-TlF bekannt ist. Der Zielpromotor für die VP16-Aktivierung ist vor zugsweise vom IE175-Gen (auch bekannt als ICP4) des Herpes simplex-Virus, obwohl auch der IE110-Promotor (auch bekannt als ICP0) verwendet werden kann. BHK-21-Zellen oder dhfr-Minus-Mutanten von CHO, wie CHO-DUKX-B11 oder DG44, sind für die Praxis dieser Erfindung bevorzugte Säugetierzellen. Diese Zellen sind auf diesem Gebiet wohl bekannt und verbreitet erhältlich, zum Beispiel von der American Type Culture Collection (A.T.C.C.), Rockville, MD (BHK-21), oder von Dr. Lawrence Chasin, Columbia University, New York (CHO DUKX-B11 oder DG44). Diese Zellen passen sich gut an das Wachstum in Suspensionskulturen an und/oder können unter geringen Serumkonzentrationen wachsen. Diese Eigenschaften machen sie als Produktionsstränge für Zellprodukte im großtechnischen Rahmen nützlich (Bendig, Genetic Engineering, Bd. 7, P. W. Rigby, Hrsg., Academic Press, S. 91-127, 1988).
  • Erfindungsgemäß werden DNA-Konstrukte verwendet, um Zelllinien zu contransfizieren. Das Cotransfizieren beinhaltet das Einbringen von mindestens zwei verschiedenen DNA-Spezies in eine Zelle. Diese können lineare oder zirkuläre DNA-Moleküle, Virus- oder Plasmid-Molekülsegmente von anderen größeren Molekülen sein. Die Transfektion kann durch jegliches auf dem Gebiet bekannte Mittel erfolgen. Bevorzugte Verfahren schließen das Calciumphosphat-Verfahren (von der Eb et al., Methods in Enzymology, Bd. 65, Gross und Moldave, Hrsg., Academic Press, NY, 1980) und die Verwendung von "LIPOFECTIN"TM-Reagens (GIBCO- BRL) gemäß den Angaben des Herstellers ein. Andere Techniken wie die Elektroporation, sind ebenfalls geeignet (Chu et al., Nucleic Acids Research, Bd. 15, 1311-1326, 1987).
  • Die Expression des späten Virusproteins, VP16, kann unter der Kontrolle jeglichen Promotors stehen, von dem auf diesem Gebiet bekannt ist, daß er derart funktioniert, daß er die Transkription in Säugetierzellen initiiert, insbesondere in CHO- dhfr-Minus-Zellen und BHK-21-Zellen. Besonders bevorzugte Promotoren sind der SV40 frühe Promotor und MMTV LTR.
  • Selektierbare Antibiotikaresistenz-Gene schließen alle ein, die in Säugetierzellen als positive selektive Marker wirken können. Typischerweise werden sie aus Bakterien oder Hefe isoliert. Eine Vorbedingung ist, daß das Antibiotikum (oder ein Analoges davon) eine gewisse wachstumsinhibierende Wirkung auf Säugetierzellen aufweist. Zum Beispiel "GENETICIN"TM (GIBCO, Division of Life Technologies, Inc.) (welches das Antibiotikum G418 ist), Hygromycin-B (Blochlinger et al., Molecular and Cellular Biology, Bd. 4, S. 2929-2931, 1984), Bleomycin-Phleomycin (Mulsant et al., Somatic Cell Molecular Genetics, Bd. 14, S. 243-252, 1988) und Puromycin (de la Luna et al., Gene, Bd. 62, S. 121-126, 1988) inhibieren das eukaryontische Zellwachstum. Die Resistenz-Gene müssen unter der Kontrolle eines geeigneten Säugetier-Promotors stehen, damit sie effizient exprimiert werden. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden zwei verschiedene Antibiotika verwendet, um cotransfizierte CHO-dhfr-Minus- Zellen oder BHK-21-Zellen sequenziell zu selektieren. Das bedeutet, daß ein erstes Antibiotikum verwendet wird, um Kandidaten für die Cotransfektion zu selektieren, die VP16 exprimieren, und ein zweites Antibiotikum verwendet werden muß, um die Kandidaten für die Cotransfektion zu selektieren, die das Gen, an dem Interesse besteht, exprimieren.
  • Zellen, die gegen das selektive Antibiotikum resistent sind, sind Kandidaten für das Cotransfizieren. Es ist wahrscheinlicher, daß eine Zelle, die eines der Antibiotikaresistenz-Gen- Konstrukte aufgenommen hat, auch ein zweites Konstrukt-Molekül aufgenommen hat, als eine Zelle, die das Antibiotikaresistenz- Gen-Konstrukt nicht aufgenommen hat. Das Screening auf das zweite Konstrukt kann mit jeglichem auf diesem Gebiet bekannten Mittel erfolgen. Die Herstellung eines Produktes, für das das zweite Konstrukt kodiert, kann durch verschiedene Immunoassays nachgewiesen werden (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, S. 553-612, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), wie ELISA, durch Enzymassay oder andere standardmäßige Verfahren.
  • Es wird erwartet, daß andere Arten von selektierbaren Mitteln neben Antibiotika ebenfalls verwendet werden könnten [(MacDonald, Critical Reviews in Biotechnology, Bd. 10, S. 155- 178, 1990), durch Bezugnahme hier aufgenommen]. Die bevorzugten selektierbaren Mittel sind jedoch Antibiotika. Es wird auch bevorzugt, daß das DNA-Konstrukt, das für das Antibiotikaresistenz-Gen kodiert, mittels Cotransfekticn in die Säugetierzelle eingebracht wird, es wird jedoch auch beabsichtigt, daß das Antibiotkaresistenz-Gen unter einem geeigneten eukaryontischen Promotor mit dem IE-Promotor oder VP16-Konstrukten verbunden werden kann, so daß das Cotransfizieren nicht erforderlich ist.
  • Dies kann durch die Verwendung von routinemäßigen rekombinanten DNA-Techniken erreicht werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kodiert ein DNA-Konstrukt für das Herpes simplex-Virus VP16. Cotransfizierungskandidaten können mittels Western Blotting mit anti-VP16-Antiseren auf VP16-Produktion untersucht werden. Andere Verfahren, wie sie auf diesem Gebiet bekannt sind, können ebenfalls verwendet werden und sind im Folgenden beschrieben.
  • Jedes Gen von Interesse kann unter die Kontrolle des HSV- Gen-Promotors IE175 oder IE110 gestellt werden. Wenn das Gen stromabwärts vom Promotor ohne intervenierende Transkriptionsterminationssignale platziert wird, wird gesagt, daß das Gen operativ mit dem Promotor verbunden ist und transkribiert wird, wenn die Transkription am Promotor eingeleitet wird.
  • Hohe Expressionsmengen des Gens von Interesse sind ein wünschenswertes Ziel der Erfindung. Dies ist eine Expression, die über das Ausmaß hinaus gesteigert ist, das in Abwesenheit von VP16 oder einem VP16-steigerbaren Promotor erhalten wird. Es ist wünschenswert, so viele dieser Transfektanten hochgradiger Expression wie möglich zu sammeln. Diese können in der Folge mutagenisiert, selektiert, konstruiert oder mit Verbindungen behandelt werden, um die Expression noch weiter zu steigern. Wenn die Expressionskonstrukte zum Beispiel mit einem Gen cotransfiziert wurden, so daß die Amplifikation der transfizierten DNA möglich ist, können höhere Expressionsmengen erzielt werden (MacDonald, s. o.). Eine solche Amplifikation führt oft zu einer Überexpression von Genen, die co-amplifiziert worden sind.
  • Es ist möglich, die VP16-kodierende Region derart zu mutieren, daß die Nukleotidsequenz verändert wird, die Aminosäuresequenz jedoch ident ist (aufgrund der Degeneration im genetischen Code). Es ist auch möglich, daß Deletionen oder Substitutionen in der Aminosäuresequenz von VP16 gemacht werden können und VP16 seine funktionelle Aktivität behalten würde. Daher ist beabsichtigt, daß die Erfindung alle funktionellen Formen des VP16-Gens und Proteins und Derivaten davon einschließt.
  • Es ist bekannt, daß in den IE-Promotoren von HSV die Nukleotidsequenz (TAATGARAT R = Purin) für eine funktionelle Transaktivierung der IE-Gene durch VP16 notwendig ist. Es wird erwartet, daß ein Promotor, der nur TAATGARAT enthält und nicht den Rest der Sequenzen eines IE-Promotors, immer noch transaktiviert werden kann. Die Hauptziele von VP16 sind die IE-Promotoren von HSV-1 oder 2; vorzugsweise IE-175- oder IE-110-Promotoren. Es ist jedoch beabsichtigt, daß andere Promotoren, natürliche oder synthetische, die auf VP16 reagieren, im Gebiet der Erfindung eingeschlossen sind.
  • Ohne weiter ins Detail zu gehen wird angenommen, daß ein Fachmann unter Verwendung der vorstehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in vollstem Umfang nützen kann. Die folgenden bevorzugten Ausführungsformen sind daher als rein illustrativ und den Rest der Offenbarung in keiner Weise einschränkend anzusehen.
  • Die folgenden Beispiele werden gebracht, um die vorliegende Erfindung darzustellen, und sind nicht dazu gedacht, ihren Umfang einzuschränken. Ein Fachmann wird leicht verstehen, daß bekannte Variationen der Bedingungen und Verfahren der folgenden Herstellungsverfahren verwendet werden können, um diese Zelllinien herzustellen.
    • Zelllinien:
  • Die Zelllinie (CHO-DUKX-B11) vom Eierstock des Chinesischen Hamsters (CHO) wurde von L. Chasin (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 77, S. 4216-4220, 1980) erhalten und in Ham's F12 kultiviert, das 5% bovines Fetalserum (JRH Biosciences) und 2 mM L-Glutamin (JRH Biosciences) enthielt. Diese Formulierung wird CHO-Wachstumsmedium genannt.
  • Die BHK-21 Zelllinie wurde von A.T.C.C. (Rockville, MD) erhalten. BHK-21-Zellen wurden auf übliche Weise in Dulbecco's Modified Eagle-Medium (DMEM), hoher Glukose (JRH Biosciences, Lenexa, KS), supplementiert mit 2 mM L-Glutamin und 10% bovinem Kälberserum (GIBCO-BRL, Grand Island, NY) und 100 Einheiten Streptomycin und 100 Mikrogramm (ug) Penicillin pro Milliliter kultiviert. Diese Formulierung wird als BHK-21-Wachstumsmedium bezeichnet. Um BHK/VP16 zu isolieren, wurde 10% Holzkohlen-gestripptes (Danesch et al., EMBO J., Bd. 6, S. 625-630, 1987) bovines Fetalserum anstelle von Kälberserum verwendet. Mit pSV2neo (A.T.C.C.) und/oder pMON1118 (Highkin et al., Poultry Science, Bd. 70, S. 970-981, 1991) transfizierte BHK-21-Zellen wurden in Medien kultiviert, die mit "GENETICIN"TM (400 ug/ml) und/oder Hygromycin B (Calbiochem, San Diego, CA) (453 Einhei ten/ml) supplementiert waren. Diese Medien werden als selektive Medien bezeichnet. Die Konzentrationen von "GENETICIN"TM sind in aktiver Stärke angegeben. pMON1118 (Highkin et al., s. o.) exprimiert das Hygromycin-B-Resistenz-Gen vom SV40-Promotor. Ein ähnliches Plasmid ist von A.T.C.C. erhältlich: pSV2-hph. Plasmide, die das dhfr-Gen exprimieren, wie SV2-dhfr, sind ebenfalls von A.T.C.C. erhältlich, wie auch pSV2neo.
    • Konstrukte:
  • Restriktionsenzym-Digestion und andere molekulare Klonierungstechniken, wie das Einfüllen von 5'-überhängenden Restriktionsfragmentenenden, folgten Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Vektoren wurden vor der Ligation unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, oder Biolabs, Beverly, MA) mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (Boehringer Mannheim) behandelt. Restriktionsfragmente wurden aus 1% Agarosegelen durch Elektroeluieren auf DEAE-Zellulose (D-Gel- Apparat, Kontes Scientific Glassware/Instruments, Vineland, NJ) isoliert.
  • Ein Expressionsvektor, der einen Teil der IE175-Promotorregion (-380 bis +26) enthielt, wurde in mehreren Schritten konstruiert (Fig. 1). Plasmid pPOH23 (O'Hare et al., J. Vir., Bd. 61, S. 190-199, 1987), das die IE175-Promotorregion von -108 bis +26 (in Bezug auf den Start der Transkription) enthält, wurde mit EcoRI und BamHI verdaut. Das 134 Basenpaar-Fragment, das die -108 bis +26 Promotorregion enthält, wurde in die BamHI-Stelle von pMON3327 (Highkin et al., s. o.) subkloniert, das ein pUC18- Derivat ist, das das SV40-Polyadenylierungssignal (Nukleotide 2533 bis 2770 vom SV40 Virusgenom) enthält. Das neue Plasmid wird -108 bis +26 IE175/polyA genannt. Um die restlichen Sequenzen des Teils der oben beschriebenen HSV IE175 Promotorregion zu isolieren, wurde pPOH13 (O'Hare, s. o.), das die IE175 Promotorregion von -380 bis +26 enthält, mit EcoRI verdaut, und das 301 Basenpaar-Fragment wurde in -108 bis +26 IE175/polyA an der EcoRI-Stelle ligiert. Das neue Plasmid hat die -380 bis +26 Region des IE175 Promotors stromaufwärts von einer uniken BamHI- Stelle, der ein Teil der SV40 späten Polyadenylierungsregion folgt, und wird als IE175/polyA bezeichnet.
  • Ein Expressionsvektor, der die IE110 Promotorregion ent hielt, wurde wie folgt konstruiert. Die HSV IE110 (-800 bis +120) Promotorregion und eine geringe Menge pBR322-Sequenz wurden von pGH83 (Roberts et al., J. Vir., Bd. 62, S. 4307-4320, 1988) durch Digerieren mit EcoRI und BamHI isoliert. Das 951 Basenpaar-Fragment wurde isoliert und mit pMON3327 ligiert, das mit EcoRI und BamHI verdaut worden war (Fig. 2). Das neue Plasmid wird IE-110/polyA genannt.
  • Ein Vektor, der den langen terminalen Repeat des Mammatumorvirus von Mäusen (MMTV LTR) enthielt, wurde durch Isolieren der 1,4 kbp MMTV-Sequenzen aus p201 (A.T.C.C.) durch PstI-Digestion und Ligation in das PstI-verdaute pMON3327 konstruiert. Dieser neue Vektor wird MMTV/polyA genannt (Fig. 3).
  • Die VP16-Kodierungssequenzen wurden aus pGH62 (ApRhys et al., Journal of Virology, 63, S. 2797-2812, 1989) durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach dem Verfahren des Herstellers unter Verwendung des "GENEAMP"TM (Perkin Eimer Cetus, Norwalk, CT) DNA Amplification Reagent Kit und der "AMPLITAQ"TM (Perkin Eimer Cetus) rekombinanten Taq-Polymerase isoliert. Dieses Plasmid enthält 4,7 Kilobasenpaare (kbp) BamHI F-Fragment von HSV-1 (Strang MP). Die Sequenz von VP16 ist in der GenBank Datenbank, Zugriffsnummer X03141. Der 5'-Primer hat die Sequenz 5'- GATCGGATCCAACCCCACCCAATGGACCTC-3' (SEQ ID Nr 1). Dieser Primer beinhaltet eine BamHI-Stelle (GGATCC) am 5'-Ende des PCR-Produktes. Der Initiator Methionin ist unterstrichen. Der 3'-Gegensinnprimer hat die Sequenz 5'-GATCGGATCCGCGCCCCCTACCCACC-3' (SEQ ID Nr 2). Dieser Primer beinhaltet eine BamHI-Stelle am 3'-Ende des PCR-Produktes. Das Terminationskodon ist als Bezugspunkt unterstrichen. Die VP16-Kodierungsregion ist auch in Plasmid pMSVP16 (Novagen Inc., Madison, WI) erhältlich. Das PCR-Produkt wurde in pUC18 subkloniert, das mit BamHI verdaut worden war. Das VP16-Gen in pUC18 wurde durch BamHI-Digestion isoliert, und die 5'-überhängenden Enden wurden vor der Ligation in MMTV/polyA, das vorher mit SalI verdaut und mit Klenow-Polymerase behandelt worden war, unter Verwendung der Klenow-Polymerase eingefüllt. Dieser VP16-Vektor wird als MMTV-VP16 bezeichnet.
  • Plasmid pCA21 (erhalten von G. Hayward, Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, MD) hat die VP16-Kodierungsregion unter Kontrolle des SV40-Virus-frühen Promotors. Ein ähnliches Plasmid kann konstruiert werden, indem die VP16-Kodierungsregion aus pMSVP16 (Novagen, Madison, WI) entfernt und unter Verwendung von Techniken, die auf diesem Gebiet bekannt sind (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982), in Plasmid pSVK3 (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) eingeschleust wird, so daß sich die VP16- Kodierungsregion unter der Kontrolle des SV40-frühen Promotors befindet.
    • Western Blotting:
  • Die Zellen wurden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (erhältlich von GIBCO-BRL) gewaschen, durch Abkratzen in 1,0 ml PBS geerntet und in einer Mikrofuge in 3 Minuten zu Pellets geformt. Die Zellen wurden in 100 Mikrolitern 1,5X Probenpuffer (3X = 7,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 30% Glycerin, 4% SDS, 1,5 mM EDTA, 400 Mikrogramm/ml Bromphenolblau und 60 mM Dithiolthreit) lysiert, 10 min lang auf 70ºC erhitzt und 3 min lang gekocht. Der Abfall wurde zu Pellets geformt, bevor 10 bis 20 Mikroliter Überstand auf 10% SDS-PAGE-Minigels (Daiichi, Integrated Separation Systems, Hyde Park, MA) geladen wurden. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine unter Verwendung eines halbtrockenen Blotters (Janssen, JKA-Biotech, Dänemark) auf Immobilon-P (Integrated Separation Systems) transferiert. Nach dem Transfer wurden die restlichen, ungebundenen Bindungsstellen der Membran durch Inkubation mit Blocklösung (0,25% Gelatine, 100 mM Tris · HCl, pH 9,0) über Nacht bei Zimmertemperatur gebunden. Die Blocklösung wurde entfernt, und die Membran wurde in NET-Puffer (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) plus 0,25% Gelatine und 0,05% NP40, der Hasen-Antiseren (1 : 2000 verdünnt) enthielt, die gegen ein Carboxylterminuspeptid von VP16 (Aminosäuren 477-490) gezüchtet worden waren, bei 37ºC 2 Stunden lang inkubiert. Die Membran wurde mit NET/Gelatine/- NP40-Puffer minus die Antiseren bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang gewaschen und mit NET/Gelatine/NP40-Puffer, der 0,3 mCi/ml ¹²&sup5;I-Protein A (Amersham, Arlington Heights, IL, 0,1 mCi/Mikroliter) enthielt, 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Das Isotop wurde durch Waschen in hochsalzigem NET (1 M NaCl), das 0,4% Sarkosyl enthielt, entfernt. Nach dem Spülen mit Wasser und Lufttrocknen wurden die Blots unter Verwendung eines Verstärkerschirms "DUPONT LIGHTNING PLUSTM" auf Röntgenfilm "KODAK, X-OMAT ARTM" belichtet.
    • Stabile Transfektionsbedingungen:
  • Die Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion in 60 mm Gewebekulturschalen zu 2 bis 3 · 10&sup5; Zellen pro Schale gesät. Die Zellen wurden entweder durch das CaPO&sub4;-Verfahren (von der Eb et al., Methods in Enzymology, Bd. 65, Grossman und Moldave, Hrsg., Academic Press, NY, 1980) transfiziert, gefolgt von einem Glycerinschock 4 Stunden nach der Transfektion (Frost et al., Virology, Bd. 91, S. 539-560, 1978), oder durch Verwendung des "LIPOFECTIN"TM-Reagens (GIBCO-BRL) gemäß den Empfehlungen des Herstellers und unter Verwendung von 40 ug "LIPOFECTIN"TM-Reagens in 3,0 ml "OPTIMEM"TM/Beta-mercaptoethanol (GIBCO-BRL) pro 60 mm Schale mit Zellen. Das Transfektionsmedium wurde nach 6 Stunden abgesaugt und durch Wachstumsmedium ersetzt. Die Zellen wurden nach 2 Tagen in 5 bis 10 100 mm-Gefäße transferiert und mit selektivem Medium gefüttert. Antibiotikaresistente Kolonien wurden 2 bis 3 Wochen später isoliert und in Gewebeclusterplatten mit 24 Vertiefungen transferiert. Als die Vertiefungen 50 bis 100% konfluent waren, wurde der Überstand auf das Produkt des Gens, an dem Interesse besteht, untersucht. Positive Linien wurden expandiert und als Produzentenlinien bezeichnet.
    • Standardassay zur Bestimmung der tPA- und bGH-Produktion:
  • Produzentenlinien wurden in 2 Vertiefungen einer Gewebeclusterschale mit 6 Vertiefungen zu 2,5 bis 5,0 · 10&sup5; Zellen pro Vertiefung gesät und mit 3 ml Wachstumsmedium (ohne Vorhandensein selektierbarer Mittel) gefüttert. Am nächsten Tag wurde das Medium durch 3 ml frisches Medium ersetzt, und 24 Stunden später wurden Duplikat-Aliquote des Überstandes geerntet und bis zum Assay bei -20ºC gelagert. Die endgültige Zellzahl wurde ermittelt, und die Proteinproduktion wurde für Mikrogramm Protein, hergestellt pro 24 Stunden pro 1 · 10&sup6; Zellen genormt.
    • Beispiel 1: Generierung stabiler Zelllinien, die VP16 in BHK-21-Zellen exprimieren, und folgende Expression von tPA und bGH
  • BHK-21-Zellen, die mit MMTV-VP16 (20 ug) und pSV2neo (2 ug) cotransfiziert waren, wurden auf "GENETICIN"TM Resistenz selektiert, und 34 Zelllinien wurden isoliert. Die Linien wurden zuerst durch Western Blotting unter Verwendung von Hasen-Antiseren, gezüchtet gegen das Carboxyterminuspeptid von VP16 (Aminosäuren 477-490) gescreent. Eine Linie, Nr. 2, hatte ein schwa ches Band im Western Blot, das mit VP16 mitwanderte (Daten nicht dargestellt). Linie Nr. 2 wurde zusammen mit 5 anderen möglichen positiven Linien durch transiente Transfektion mit 5 ug IE175- CAT (pPOH13) weiter getestet. Ein ähnliches Plasmid, pICP4CAT, ist von Novagen, Inc. (Madison, WI) erhältlich. Am Tag nach der Transfektion wurde das Wachstumsmedium gegen ein Medium ausgetauscht, das mit 1 uM Dexamethason (Sigma, St. Louis, MO) supplementiert war. Am nächsten Tag wurden die Zellen geerntet und auf CAT-Aktivität untersucht (Neumann et al., BioTechniques, Bd. 5, S. 444-447, 1987). Um eine VP16-Expressorzelllinie zu identifizieren, wurde die CAT-Aktivität in den putativ positiven Linien mit der in den BHK-21-Eltern zu sehenden CAT-Aktivität verglichen. Linie 2 wies einen 12-fachen Anstieg der CAT-Aktivität im Vergleich zur BHK-21-Elternkontrolle auf und wurde BHK/VP16 genannt (Daten nicht dargestellt). Obwohl Western Blotting das Verfahren zur Isolierung der BHK/VP16-Linie war, könnte ein funktioneller Assay unter Verwendung eines IE175-Beta-galactosidase- (B-gal-)Konstrukts ein bevorzugtes Verfahren sein. Das B-gal-Gen von E. coli (GenBank Zugriffsnummer V00296) wurde als ein BamHI-Fragment (etwa 3,3 kbp) aus einem Plasmid isoliert, das das Gen unter Kontrolle des Ratten-Prolactin-Promotors enthält. Ähnliche B-gal-Kassetten sind im Handel erhältlich (Promega, Madison, WI; Pharmacia-LKB, Pistaway, NJ). Das BamHI- Fragment wurde in IE175/polyA subkloniert, um IE175-B-gal zu bilden. Zelllinien wurden wie folgt auf VP16-Aktivität untersucht. Die Zellen wurden zu etwa 1 · 10&sup4; Zellen pro Vertiefung in eine Gewebeclusterschale mit 48 Vertiefungen gesät und unter Verwendung von "LIPOFECTIN"TM-Reagens mit IE175-B-gal transfiziert. Etwa 40 Stunden später wurden die Zellen in situ durch die Zugabe von 0,5% NP40 in Hank's gepufferter Kochsalzlösung (GIBCO-BRL), die O-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranosid (ONPG, Sigma) enthielt, gemäß Lim et al. (BioTechniques, Bd. 7, S. 576- 579, 1989) lysiert. Nach 60 Minuten wurde eine 200 Mikroliter- Probe in eine Vertiefung einer Gewebeclusterplatte mit 96 Vertiefungen transferiert. Die Platte mit 96 Vertiefungen wurde zentrifugiert (Beckman JS 5,2 Rotor, 500xg, 10 min), und 100 Mikroliter wurden in jede Vertiefung einer neuen Gewebeclusterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Die optische Dichte bei 410 nm wurde unter Verwendung eines Plate Reader (Dynatech, MR600) ermittelt. Die Proteinmenge wurde durch Assay von 20 Mikrolitern Lysat in 200 Mikrolitern BCA-Proteinreagens (Pierce, Rockford, Ill) bestimmt.
  • Die cDNA des menschlichen Gewebeplasminogen-Aktivators (tPA) wurde durch stellengerichtete Mutagenese modifiziert, um die nicht kodierenden 5'- und 3'-Regionen zu verkürzen und unike BamHI-Stellen an den Enden zu platzieren. Die modifizierte cDNA enthält 19 Basenpaare der 5'-nicht translatierten Sequenz und terminiert 4 Basenpaare nach dem Terminationskodon, was ein 1,7 kbp-Fragment ergibt. Dieses Fragment wurde mit BamHI verdaut und in die BamHI-Stelle von IE175/polyA ligiert, um Plasmid IE175- tPA zu bilden, und in die BamHI-Stelle von IE110/polyA ligiert, um Plasmid IE110-tPA zu bilden.
  • Die BHK/VP16-Zelllinie wurde verwendet, um 3 Sets hochproduktiver, Protein produzierender Zelllinien herzustellen. Das erste Set wurde durch Cotransfizieren von BHK/VP16 mit dem IE175-tPA (20 ug) und pMON1118 (2 ug) Plasmid erzeugt. 55 Zelllinien, die gegen "GENETICIN"TM und Hygromycin B resistent sind, wurden isoliert und auf tPA-Produktion untersucht, und 41 waren positiv.
  • Gewebeplasminogen-Aktivator (tPA) wurde im konditionierten Medium cotransfizierter Zelllinien durch Teilchenkonzentrations- Fluoreszenz-Immunoassay (PFCIA) (Jolly et al., Journal of Immunological Methods, 67, S. 21-35, 1985) untersucht. Epicon- Testplatten, Particle Concentration Analyzer (PCA) und Polystyrolpartikel wurden von IDEXX Laboratories, Inc. (Westbrook, Maine) erworben. Gereinigte menschliche tPA- und antihuman-tPA- Antikörper von Ziegen wurden von American Diagnostica Inc. (Greenwich, CT) erworben. Die Reagenzien wurden gemäß den Protokollen des Lieferanten hergestellt, und der Basis-PFCIA wurde gemäß den Herstellerprotokollen festgestellt. Kurz gesagt wurden Polystyrolteilchen mit den anti-tPA-Antikörpern der Ziegen beschichtet, um tPA im konditionierten Medium zu fangen. Die konditionierten Mediumproben wurden mit den Ziegen-anti-tPA-Polystyrolteilohen und mit Fluorescein-markierten Ziegen-anti-tPA- Antikörpern inkubiert. Nach 30 min hatte sich auf den Polystyrolpartikeln ein Komplex gebildet. Der Komplex wurde gewaschen, und die Fluoreszenzmenge wurde mittels PCA quantifiziert. Die Antikörper wurden mit Fluorescein markiert, wobei Fluorescein isothiocyanat (Sigma, St. Louis, MO) verwendet wurde. Ein alternativer Ansatz besteht darin, ein Festphasen-Enzymimmunoassay- (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA-) Kit für tPA von American Diagnostica zu erwerben.
  • Die 16 produktivsten Zelllinien vom ersten Screening wurden unter Standardbedingungen auf tPA-Produktion getestet. 9 Linien waren positiv, wobei 5 Linien tPA-Konzentrationen über 1 ug/10&sup6; Zellen/24 Stunden produzierten (Tabelle 1). Als Kontrolle wurden BHK-21-Zellen, die VP16 nicht exprimieren und mit IE175-tPA und pMON1118 contransfiziert waren, auf tPA-Produktion getestet. Von 64 Hygromycin-resistenten Linien waren beim ersten Screening 41 positiv für tPA-Produktion. 15 Linien wurden unter Standardbedingungen nochmals getestet, und 6 waren für tPA positiv. Die Werte der tPA-Produktion lagen im Bereich von 0,007 ug bis 0,176 ug/10&sup6; Zellen/24 Stunden (Tabelle 1).
  • Um festzustellen, ob die hochgradige Proteinproduktion nur auf den IE175-Promotor beschränkt war, wurde ein zweites Set von Zelllinien konstruiert, indem die Transaktivatorlinie BHK/VP16 mit IE110-tPA und pMON1118 cotransfiziert wurde. 14 der 19 isolierten "GENETICIN"TM/Hygromycin-Linien waren positiv für die tPA-Produktion. Von diesen 14 Linien produzierten 3 Linien große Mengen tPA, wobei diese Werte im Bereich von 4 bis 21 ug/10&sup6; Zellen/24 Stunden lagen (Tabelle 1). Um die Menge der tPA-Produktion in Abwesenheit des VP16-Transaktivators zu bestimmen, wurden BHK-21-Elternzellen mit IE110-tPA und pMON1118 transfiziert. 18 Hygromycin-resistente Linien wurden auf tPA-Produktion untersucht. Die 3 produktivsten Produzentenlinien erzeugten 0,014 bis 0,08 ug tPA/10&sup6; Zellen/24 Stunden (Tabelle 1). Dieses Experiment demonstriert, daß das stabile, hohe Ausmaß der Expression von tPA von den BHK-21-Zellen in Gegenwart von VP16- Expression nicht auf die Transaktivierung des IE175-Promotors beschränkt ist, sondern sich auch auf andere HSV IE-Promotoren erstreckt.
  • Um zu zeigen, daß das hohe Ausmaß der Proteinproduktion keine Funktion des tPA-Moleküls selbst war, wurde ein drittes Set von Experimenten durchgeführt, wobei bovines Wachstumshormon- (bGH-) Gen verwendet wurde.
  • Das genomische bGH-Gen (GenBank Zugriffsnummer J00008) wurde von pBR-bGH (Ramabhadran et al., Gene 38, S. 111-118, 1985) mit tels PCR erhalten. Der 5'-Primer reassoziiert etwa 60 Basenpaare stromaufwärts vom Initiatorkodon und hat die Sequenz 5'-GACCAATTCCAGGATCCCAGGACCCAGT-3' (SEQ ID Nr 3) und enthält eine natürliche BamHI-Stelle. Der 3'-Gegensinn-Primer endet etwa 20 Basenpaare stromabwärts vom Terminationskodon und enthält eine konstruierte BamHI-Stelle. Dieser Primer hat die Sequenz 5'- GATCGGTACCGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGA-3' (SEQ ID Nr 4). Das PCR- Produkt (etwa 1,7 kbp) wurde mit BamH verdaut und in die BamHI- Stelle von Plasmid IE175/polyA insertiert, um IE175-bGH zu ergeben.
  • Die Transaktivatorlinie BHK/VP16 wurde mit IE175/bGH (20 ug) und pMON1118 (2 ug) cotransfiziert. 42 "GENETICIN"TM/Hygromycin- resistente Linien wurden auf bGH-Produktion untersucht. 40 dieser Linien waren für bGH in den konditionierten Medien positiv. Der Assay zum Nachweis von bGH war ein PCFIA, wie auch der tPA- Assay (siehe oben). In diesem Fall wurden zwei verschiedene Affinitäts-gereinigte monoklonale Antikörper verwendet. Ein Antikörper wurde verwendet, um die Kügelchen zu beschichten, und der andere wurde mit Fluorescein markiert und verwendet, um das gefangene bGH an den Kügelchen zu bestimmen. Biologisch aktives bGH wurde aus E. coli gereinigt und als Standard verwendet. Standardassays von 15 positiven Linien zeigten, daß sie 3 bis 19 ug bGH/10&sup6; Zellen/24 Stunden produzierten (Tabelle 1). Als Kontrolle wurden BHK-21-Elternzellen mit IE175-bGH und pMON1118 cotransfiziert. 53 Hygromycin-resistente Linien wurden auf bGH- Produktion untersucht, und 50 waren positiv. Standardassays von 19 der produktivsten Linien, die im Screening identifiziert worden waren, zeigten, daß sie 0,33 bis 5 ug bGH/10&sup6; Zellen/24 Stunden produzierten. Dieses Ergebnis war erstaunlich, da die auf Grund der Versuche mit IE175-tPA und IE110-tPA vorhergesagten Werte < 0,3 ug tPA/10&sup6; Zellen/24 Stunden betrugen. Die von der VP16 Transaktivatorlinie produzierte Menge bGH war jedoch im Durchschnitt um ein Vielfaches höher als von der elterlichen BHK-21-Linie. bGH muß jedoch kein repräsentatives Markerprotein sein, da es ein hohes Ausmaß an konstitutiver Produktion in anderen Systemen in Abwesenheit von Induktion zu geben scheint (G. Hayward, persönliche Kommunikation).
  • Daher kann das mit VP16-Transaktivator gekoppelte Säugetier- Expressionssystem für die effiziente Isolierung von Zelllinien verwendet werden, die große Mengen Protein produzieren, indem die IE110- oder IE175-Promotoren verwendet werden. Dies impliziert, daß die Promotorregionen der anderen unmittelbaren frühen Gene von HSV-1 oder HSV-2 ebenfalls gute Ziele für Transaktivations-gekoppeltes Vektordesign sind.
    • Stabilität der Expression:
  • Die Zelllinien, die sich am längsten in kontinuierlicher Kultur befanden, sind diejenigen, die durch Cotransfizieren von IE175-tPA und pMON1118 in die BHK/VP16-Linie erzeugt werden (Fig. 4). Der anfängliche Standardassay in Passage 3 zeigte Expressionsmengen von weniger als 10 ug tPA/10&sup6; Zellen/24 Stunden für alle 4 Linien. Bei Passage 6 war in 3 der Linien eine überraschende Steigerung der tPA-Produktion zu erkennen, wobei die Werte im Bereich von 27 bis 44 ug/10&sup6;/24 Stunden lagen. tPA-Werte nach Passage 6 sanken für diese 3 Linien und schienen sich bei etwa 10 bis 15 ug/10&sup6;/24 Stunden zu stabilisieren. Für eine 4. Linie, Nr. 34, die keinen großen Anstieg der tPA-Produktion in Passage 6 zeigte, scheinen die Werte über die Zeit hinweg gleichmäßiger zu sein. Das Ausmaß der tPA-Produktion blieb im Bereich von 5 bis 20 ug/10&sup6; Zellen/24 Stunden, wie durch PFCIA über etwa 52 Passagen gemessen wurde. Jede Passage repräsentiert 3 bis 5 Populationsverdoppelungen pro Woche. tPA-Werte wurden durch den Amidolytic Assay (T. C. Wun, Daten nicht dargestellt) verifiziert, wie unten beschrieben ist. Aliquote der tPA-konditionierten Medien wurden in 1M NH&sub4; HCO&sub3; plus 1 mg/ml BSA verdünnt. Zu 20 Mikrolitern der verdünnten tPA-Probe in einer Wegwerfküvette wurden 0,225 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,7, plus 0,5% Triton X-100 zugesetzt. Die Mischung wurde 3 min lang bei 37ºC inkubiert. 5 Mikroliter konditioniertes Medium wurden zugesetzt, und in einem Gilford Spektrophotometer wurde die Veränderung der Extinktion bei 405 nm gemessen. Einzelkettiger tPA-Aktivitätsstandard (American Diagnostica Produkt Nr. 115), gelöst in 1M NH&sub4; HCO&sub3; plus 1 mg/ml BSA, wurde als Referenz verwendet.
    • Beispiel 2: Gefäßpermeabilitätsfaktor (VPF):
  • Komplementäre DNA (cDNA), die die VPF-kodierende Region enthielt, wurde zu erst aus einer Phorbolester-induzierten U937- Zellbibliothek isoliert, wie beschrieben (Keck et al., Science 246, S. 1309-1312, 1989). Die cDNA kodiert für ein Protein von 189 Aminosäuren und wird als VPF189 bezeichnet [EMBL/GenBank Zugriffsnummer X15997 oder M27281]. Unter Verwendung von PCR-Technologie wurden 2 andere Formen von VPF cDNA isoliert. Eine Form kodiert für ein Protein von 165 Aminosäuren, das mit VPF189 ident ist, mit der Ausnahme, daß die Aminosäuren 116 bis 138 durch alternierendes Spleißen deletiert sind, und als VPF165 bezeichnet wird. Eine andere Form kodiert für ein Protein von 121 Aminosäuren und ist ident mit VPF189 mit der Ausnahme, daß die Aminosäuren 116 bis 158 durch alternierendes Spleißen deletiert worden sind, und wird als VPF121 bezeichnet.
  • Alle obigen cDNAs von VPF (VPF189, VPF165 und VPF121) wurden in die BamHI-Stelle von IE175/polyA subkloniert. Außerdem wurden die 3 cDNAs von VPF unter der Kontrolle des Mäuse-Metallothionein-Promotors (Keck et al., s. o.) in einen bovinen Papillomavirus- (BPV-) Vektor, pMON1123, subkloniert. Schließlich wurden die 3 cDNAs von VPF unter der Kontrolle des langen terminalen Repeat-Promotors des Rous sarcoma-Virus (RSV LTR) in ein Plasmid subkloniert, das auch eine SV2-dhfr Expressionskassette enthält. Die von IE175/polyA abgeleiteten VPF-Expressionsplasmide wurden mit pMON1118 in die BHK/VP16-Transaktivatorlinie cotransfiziert, wie oben beschrieben. Die von BPV abgeleiteten VPF-Expressionsplasmide wurden in C127-Zellen von Mäusen (A.T.C.C.) mit SV2neo cotransfiziert und auf "GENETICIN"TM-Resistenz selektiert. Die von RSV LTR/SV2-dhfr abgeleiteten VPF-Expressionsplasmide wurden in CHO-DUKX-B11-Zellen transfiziert und auf Expression von DHFR selektiert (Kaufman, Methods in Enzymology, Bd. 185, D. V. Goeddel, Hrsg., Academic Press, New York, S. 537-566, 1990). Zelllinien von jedem der obigen Sets von Transfektionen wurden unter Verwendung des geeigneten Selektionsverfahrens isoliert, und konditioniertes Medium von den Linien wurde auf das Vorhandensein von VPF getestet, ursprünglich unter Verwendung des Miles-Assays (Connolly et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 264, S. 20017-20024, 1989), jedoch vorzugsweise durch Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA) (Harlow et al., s. o.) wie folgt.
  • Anti-VPF IgG von Ziegen wurde an eine Mikrotiterplatte aus Polyvinylchlorid gebunden, indem jede Vertiefung mit 50 Mikrolitern einer 20 ug/ml Lösung des Antikörpers, verdünnt in PBS, 2 bis 3 Stunden lang bei Zimmertemperatur inkubiert wurde. Die Antikörperlösung wurde entfernt, und die Vertiefungen wurden 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur mit 1% fettfreier Trockenmilch (Casein), verdünnt in PBS, inkubiert, um jegliche ungebundene Stellen zu blockieren. Die Vertiefungen wurden 4 Mal mit 0,15 M NaCl gewaschen, das 0,05% Tween 20 (Sigma) enthielt. Konditioniertes Medium wurde den Vertiefungen zugesetzt, und sie wurden über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden 4 Mal mit der NaCl/Tween 20-Lösung gewaschen. 50 Mikroliter 2,5 ug/ml biotinyliertes Ziegen-anti-VPF-IgG wurden zugesetzt und 2 bis 3 Stunden lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden 4 Mal gewaschen, und ein 50 Mikroliter Aliquot der 1/1600-Verdünnung einer Lösung von Meerrettichperoxidase-Strepavidin (KPL, Gaithersburg, MD) wurde 90 Minuten lang bei Zimmertemperatur zugesetzt. Die Vertiefungen wurden gewaschen, und 100 Mikroliter Merrettichperoxidasesubstrat wurden zugesetzt und gemäß den Instruktionen des Herstellers untersucht. Die Konzentrationen von VPF wurden aus einer Standardkurve bestimmt, wobei U937-Zell-deriviertes VPF, verdünnt in PBS, das 0,05% Tween 20 und 1% fettfreie Trockenmilch enthielt, verwendet wurde. Tabelle 2 zeigt, daß die BHK/VP16-Linie die 3 Formen von VPF genau so effizient produzierte wie die C127-Zellen, eine Linie, in der der BPV-Vektor typischerweise von 10 bis 200 Kopien pro Zelle amplifiziert ist (Stephens et al., Biochemical Journal 248, S. 1-11, 1987), und viel effizienter war als das CHO-DUKX-B11-System vor der Amplifizierung. Weiters haben BHK-21-Zellen die Nachteile nicht, die C127-Zellen während des Scale-up aufweisen (McKillip et al., Bio/Technology 9, S. 805-810, 1991). Die Produktion von VPF189 war auf Grund des Abbaus des Proteins im Medium (Daten nicht dargestellt) in allen getesteten Zellsystemen gering (< 0,1 ug/ml). Die Werte von VPF189 mRNA in den Zellen waren gerade so hoch wie die Werte von VPF165 und VPF121 in den jeweiligen Zelllinien (Daten nicht dargestellt), was darauf hinweist, daß das Ausmaß der Transaktivierung nicht für die anscheinend zurückgegangene Produktion von VPF189-Protein verantwortlich ist.
    • Beispiel 3: Menschliches Interzelluläradhäsionsmolekül (ICAM):
  • Eine cDNA (GenBank Zugriffsnummer J03132), die für die aminoterminale extrazelluläre Domäne, die transmembrane Domäne und die carboxyterminale intrazelluläre Domäne von ICAM kodiert, wurde mittels PCR auf folgende Weise isoliert. RNA von SK-Hepatom-Zellen (A.T.C.C.) wurde als Template für spezifisch geprimte Erststrang-Synthese unter Verwendung eines 3'-Gegensinn-Primers 5'-GCTAGGATCCCGGGATAGGTTCAGGGAGGCG-3' (SEQ ID Nr 5) verwendet, die zu den Nukleotiden 1646 bis 1669 der ICAM cDNA komplementär ist. Die 20 Mikroliter Reaktion enthielt 10 ug RNA, 20 Picomoleküle Primer, 20 Einheiten "RNASIN"TM (promega, Madison, Wisconsin), 2,5 mM dNTPs und 200 Einheiten reverse Transkriptase. Die Synthese wurde bei 37ºC 30 Minuten lang durchgeführt und dann sofort für die Amplifikation unter Verwendung von PCR nach den Vorschriften des Herstellers verwendet. Der 5'-Primer hat die Sequenz 5'-GATCGGATCCTCAGCCT-CGCTATGGCTCCC-3' (SEQ ID Nr 6) und ist zu den Nukleotiden 45 bis 66 der ICAM cDNA komplementär (Staunton et al., Cell, 52, S. 925-933, 1988). Außerdem enthält der Primer eine konstruierte BamHI (GGATCC) Restriktionsstelle. Das resultierende Fragment von etwa 1,6 kbp wurde als Template für eine folgende PCR-Reaktion unter Verwendung des gleichen 5'-Primers und eines neuen 3'-Gegensinn-Primers verwendet, so daß der 3'-Primer zur Trunkierung des Moleküls bei Aminosäure 453 führte, wodurch die Transmembran- und Zytoplasma-Domänen des Moleküls ausgeschlossen wurden (Marlin et al., Nature 344, S. 70-72, 1990). Die Sequenz des zweiten 3'-Gegensinn-Primers war 5'-GATCGATCATGGATCCCTCAT-ACCGGGGGGAGAG-3' (SEQ ID Nr 7) und ist komplementär zu den Nukleotiden 1480 bis 1497 der ICAM cDNA und führt eine BamHI-Stelle unmittelbar 3' zum Glutaminsäurekodon (Aminosäure 435) ein. Plasmid IE175/polyA wurde durch Digestion mit BamHI modifiziert und mit einem DNA-Fragment ligiert, das eine BamHI-Stelle am 5'-Ende, eine Sequenz, die für ein Decapeptid kodiert (YPTDVPDYAS) (Huse et al., Science, 246, S. 1275-1281, 1989, Einbuchstaben-Code), ein Terminationskodon und eine BglII-Stelle am 3'-Ende enthielt. Dieses Fragment wurde durch Wiederverbinden von 2 Oligonukleotiden, 5'- GATCCTACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCTTAAGAGCTC-3' (SEQ ID Nr 8) und 5'-GATCGAGCTCTTAAGAAGCGTAGTCCGGAACGTCGTACGGGTAG-3' (SEQ ID Nr 9) hergestellt. Dieses modifizierte IE175/polyA-Plasmid wurde als IE175/deca-polyA bezeichnet, mit BamHI verdaut und mit dem verkürzten ICAM cDNA-Fragment ligiert, das ebenfalls mit BamHI verdaut worden war, wodurch sich das Plasmid IE175-sICAM&sub4;&sub5;&sub3; deca-polyA ergab. Der sICAM&sub4;&sub5;&sub3;-Expressionsvektor wurde in die BHK/VP16-Linie mit pMON1118 cotransfiziert, wie beschrieben, und Produzenten von großen Mengen sICAM&sub4;&sub5;&sub3;-Decapeptid wurden selektiert. Die "GENETICIN"TM/Hygromycin B-resistenten Zelllinien wurden auf Expression von sICAM&sub4;&sub5;&sub3;-Decapeptid untersucht, indem mittels Immunblotting-Analyse auf den Decapeptid-Teil des Fusionsproteins untersucht wurde. Bei Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen in serumfreiem DMEM 24 Stunden lang inkubiert. Ein 100 Mikroliter Aliquot von konditioniertem Medium wurde geerntet und unter Verwendung eines Mehrkammern-Slot-Blot-Apparats (Schleicher and Schuell) auf Nitrozellulose-Filterpapier filtriert. Die Nitrozellulose wurde dann wie folgt mit polyklonalen Hasen-Antiseren sondiert, die gegen das Decapeptid (Huse et al., s. o.) gezüchtet worden waren. Die Nitrozellulose wurde 1 Stunde lang bei 37ºC in einer 5% Lösung von bovinem Serumalbumin (BSA) in TNT-Puffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,05% Tween 20) inkubiert, um die nicht spezifischen Antikörperbindungsstellen zu blockieren. Nach dem Waschen mit TNT-Puffer wurde das Nitrozellulosepapier mit dem Hasen-anti-Decapeptid-Antikörper bei einer Verdünnung von 1 : 4000 in 1% BSA/TNT 1,5 Stunden lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Der ungebundene Antikörper wurde durch 3 Mal 20 Minuten Waschen des Papiers mit TNT-Puffer entfernt. Der Hasen-Antikörper wurde unter Verwendung eines Ziegen- anti-IgG-alkalische Phosphatase-Detektionssystems wie jenem, das von Promega (Madison, WI) erhältlich ist, gemäß den Vorschriften des Herstellers nachgewiesen. sICAM&sub4;&sub5;&sub3;-Decapeptid im konditionierten Medium wurde durch Verdrängung des ¹²&sup5;I-markierten sICAM&sub4;&sub5;&sub3;-Decapeptids von Platten, die mit einem polyklonalen Antiserum an das Decapeptid gebunden waren, quantifiziert. Hasen-anti-Decapeptid-IgG wurde auf einem "Affi-Gel 15"®-Harz (registrierte Schutzmarke von BioRed, Richmond, CA), an das das Decapeptid gekoppelt wurde, gereinigt. Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen werden mit dem Anti-Decapeptid- IgG gebunden, nicht spezifische Bindungsstellen werden mit BSA blockiert, und dann werden die Vertiefungen mit 25 Mikrolitern konditioniertem Medium von den Produzentenlinien und 25 Mikrolitern (50 000 cpm) ¹²&sup5;I-markiertem sICAM&sub4;&sub5;&sub3;-Decapeptid inkubiert. Nach dem Waschen wird die Menge Radioaktivität, die durch die Vertiefungen gebunden ist, ermittelt und mit der Menge Radioaktivität verglichen, die nach der Konkurrenz durch eine bekannte Menge unmarkiertes sICAM&sub4;&sub5;&sub3;-Decapeptid gebunden bleibt. Tabelle 2 zeigt, daß der größte Produzent 100 Mikrogramm sekretiertes ICAM pro ml synthetisierte, was mit Expressionswerten vergleichbar ist, die von Hybridomen erzielt werden (Bendig, Genetic Engineering, Bd. 7, S. 90-127, 1988).
    • Beispiel 4: Sekretierte Fucosyltransferase:
  • Der Expressionsvektor für eine sekretierte Form der Fucosyltransferase (Zugriffsnummer X53578, Kukowska-Latallo et al., Genes and Development 4, S. 1288-1303, 1990) wurde in mehreren Schritten hergestellt. Plasmid IE110/polyA (Fig. 2) wurde mit BamHI verdaut. In die BamHI-Stelle wurde ein Fragment doppelsträngiger DNA kloniert, die für die menschliche IL3-Signalsequenz (unterstrichen) mit konstruierten, komplementären BamHI- Enden kodiert, 5'-GATCCACCATGAGCCGCCGTCCCGTCCTGCTCCTGCTCCAACT- CCTGGTCGGCCCCGCCATGGCTAAGCTTGGATC-3' (SEQ ID Nr 10) und die konstruierte NcoI- (CCATGG) und die konstruierte HindIII- (AAGCTT) Stelle beim 3'-Ende der Signalpeptid-Kodierungssequenz aufweist. Das resultierende Plasmid (IE110-IL3/polyA) wurde mit NcoI und HindIII verdaut. In diese Stelle wurde ein Fragment von DNA ligatiert, das für ein Decapeptid [YPYDVPDYAS, Einbuchstaben- Code; SEQ ID Nr 11] mit einer NcoI-Stelle am 5-Ende und einer HindIII-Stelle am 3'-Ende kodiert. Dieses Fragment wurde durch Wiederverbinden des Oligonukleotids 5'-GATCGACCATGGCTGCCATA- CCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCTAAGCTT-3' (SEQ ID Nr 12) mit seinem komplementären Oligonukleotid erhalten. Das resultierende Plasmid wird IE110-IL3-deca/polyA genannt. Ein DNA-Fragment, das für einen Teil des Fucosyltransferase-Gens kodiert, wurde aus A431- Zellen-RNA (A.T.C.C.) mittels POP. isoliert und hat konstruierte HindIII-Enden. Die Fucosyltransferase kodierende Sequenz des Fragments beginnt mit Aminosäure 44 (Serin) und endet 4 bp nach der natürlichen Terminationskodierung. Dieses Fragment wurde in die HindIII-Stelle ligiert, die sich hinter der Decapeptidsequenz in IE110-IL3-deca/polyA befindet. Das resultierende Fusionsgen hat die menschliche IL3-Signalsequenz (erste 19 Aminosäuren), eine synthetische Decapeptid-Kodierungsregion und die Fucosyltranferase-Kodierungsregion, die mit Aminosäure 44 beginnt, und wird als IE110-IL3-deca-FT-polyA bezeichnet.
  • BHK/VP16-Zellen wurden mit IE110-IL3-deca-FT-polyA und pMON1118 cotransfiziert, wie oben beschrieben. Zelllinien wurden gemäß Prieels et al. (Journal of Biological Chemistry, 256, S. 10456-10463, 1981) auf sekretierte Fucosyltransferase-Aktivität untersucht. Umgerechnet in ug/ml erzeugte die produktivste Produzentenlinie 70 Mikrogramm pro Milliliter (Tabelle 2).
    • Beispiel 5:
  • Dieses Beispiel zeigt die Konstruktion von CHO-Zelllinien, die hochgradige Produzenten von tPA sind.
  • Dieses Beispiel zeigt, daß die Selektion auf die Expression von Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) in Gegenwart von Herpes-Virus VP16 zu einer geringeren Anzahl von hochproduktiven tPA-Produzenten in CHO DUKX-B11-Zellen führt. Die Selektion auf einen Antibiotikaresistenz-Marker führt zu einem höheren Prozentsatz an hochproduktiven Produzenten in CHO DUKX-B11-Zellen.
  • Die Zellen wurden entweder mit pCA21 oder MMTV-VP16 und pSV2neo cotransfiziert. Es wurden Transfektanten selektiert, die gegen "GENETICIN"TM resistent waren, und auf VP16-Expression mittels Transfektion mit IE175-B-gal untersucht, wie oben beschrieben.
  • Zellen, die VP16 exprimierten, wurden entweder mit IE175-tPA oder IE110-tPA; und pMON1118 oder pSV2dhfr cotransfiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
  • Die Daten zeigen, daß nur 3/127 CHO/VP16/175-tPA-Zelllinien, die auf DHFR-Expression selektiert worden waren, große Mengen tPA (d. h. über 1,0 ug/10&sup6; Zellen/24 Stunden) exprimierten. Wenn demgegenüber Hygromycin als Selektionsmittel verwendet wurde, exprimierten 6% der Zelllinien mehr als 1,0 ug/10&sup6; Zellen/24 Stunden tPA.
  • Die Kontroll-Transfektionen in Eltern-CHO-DUKX-B11, die VP16 nicht exprimieren, war etwas anormal. Bei Verwendung von Hygromycin-Selektion produzierten 0/87 Zelllinien mehr als zu erwarten gewesen wäre. Bei DHFR-Selektion in Abwesenheit von VP16 jedoch produzierten 7/112 Zelllinien mehr. Dieser hohe Anteil an produktiveren Produzenten kann ein gewisses Ausmaß an Amplifikation der DHFR- und tPA-Gene in Abwesenheit von Methotrexat widerspiegeln. Wir haben jedoch keine Daten, um diesen Gedanken zu stützen.
    • Weitere Anwendungen:
  • Die oben beschriebenen Zellinien exprimieren VP16 und pro duzieren signifikante Mengen sekretierter Proteine aus Genen, die operativ mit einem HSV IE-Promotor, einem Transaktivierungsziel von VP16, verbunden sind. Diese sekretierten Proteine sind leicht zu quantifizieren, und daher wird erwartet, daß diese Zelllinien bei der Entdeckung von Verbindungen hilfreich sein können, die das von VP16 vermittelte Transaktivierungsereignis inhibieren. Genauer gesagt können natürliche Produkte, Chemikalien oder andere Substanzen zu den oben beschriebenen Zelllinien zugesetzt werden, und die Wirkung auf die produzierte Menge Proteinprodukt kann bestimmt werden. Diese Chemikalien, natürlichen Produkte oder andere Substanzen, die die Produktion des Proteinproduktes senken, sind Mittel für die Identifizierung von Verbindungen, die die VP16-induzierte Transaktivierung stören. Kontroll-Zellkulturen, die Proteine unter der Kontrolle anderer Promotoren sekretieren, würden ebenso mit den gleichen Verbindungen getestet werden, um festzustellen, ob das Sinken der Proteinproduktion für die VP16-Linien spezifisch war. Verbindungen, die spezifisch die Produktion von Protein in der VP16-Linie senken, würden weiter analysiert und auf antivirale Wirkung getestet werden. Der gleiche Ansatz kann auch mit transienten Assays verwendet werden. Transiente Assays würden jedoch viel arbeitsintensiver sein, da sie für jeden Assay eine DNA-Transfektion erforderlich machen würden. Da die oben beschriebenen Zelllinien die Proteinprodukte stabil produzieren, kann in vielen Assays eine wesentlich homogenere Zellzufuhr verwendet werden. Dies führt zu einer Zeitersparnis und besserer Reproduzierbarkeit von Assay zu Assay. Eine solche Praxis unter Verwendung stabiler Zelllinien wurde jüngst verwendet, um Verbindungen zu entdecken, die die Transaktivierung von HIV LTR mittels TAT-Transaktivator inhibieren können (Hsu et al., Science, 254, S. 1799-1802, 1991). Ein ähnlicher Ansatz ist in Anmeldung WO 91/01379 (internationale Anmeldenummer PCT/US90/04021) beschrieben.
  • Es wird erwartet, daß die BHK/VP16- und die CHO/VP16-Linien bei der Produktion von Mutanten von HSV nützlich sein werden, denen ein funktionelles VP16-Gen fehlt. Wie von Werstuck et al. (Journal of Virology, 64, S. 984-991, 1990) gezeigt wurde, verstärkt eine Zelllinie, die VP16 exprimiert, die Infektivität von HSV DNA. Da den VP16-Minus-Mutanten von HSV und nackter HSV DNA die Fähigkeit fehlt, die unmittelbaren frühen Ereignisse der HSV-Replikation zu transaktivieren, ermöglicht die Zufuhr von VP16 in trans durch die Wirtszelllinie eine effiziente Replikation der VP16-Minus-Mutanten von HSV und verstärkt die Infektivität der nackten HSV DNA. Die Nützlichkeit einer solchen VP16 exprimierenden Zelllinie würde in der Passage möglicher Lebendvakzinformen von HSV liegen, die auf Grund von Mutationen des VP16-Gens nicht infektiös gemacht worden sind. Es wird erwartet, daß die VP16 exprimierenden Linien auch mit anderen HSV-Genen konstruiert werden können, die zusätzliche HSV-Mutanten in trans komplementieren, um die volle Palette von notwendigen Genen für das defektive HSV-Virus zur Verfügung zu stellen.
  • Aus der obigen Beschreibung kann ein Fachmann leicht die essentiellen Charakteristika dieser Erfindung feststellen, und ohne von ihrem Geist und Umfang abzuweichen, kann er verschiedene Veränderungen und Modifikationen der. Erfindung durchführen, um sie verschiedenen Verwendungen und Bedingungen anzupassen. Daher ist der Umfang der Erfindung nicht als auf die besonderen gezeigten oder vorgeschlagenen Ausführungsformen beschränkt anzusehen, sondern durch Bezugnahme auf die beigefügten Ansprüche zu bestimmen. Tabelle 1: Produktion von tPA und bGH in BHK-Linien
  • * Anzahl von Kolonien, die mehr als 1 ug/1 Million Zellen/24 Stunden produzieren.
  • ** ug/Million Zellen/24 Stunden der 3 größten Produzentenlinien Tabelle 2 Produktion von Proteinen durch verschiedene Expressiossysteme
  • * N: nicht getestet
  • ** sekretiertes ICAM-Decapeptid
  • *** sekretiertes Fucosyltransferase-Decapeptid Tabelle 3 Expression von tPA in CHO-Zellen
  • * Ergebnisse von SV40/VP16- und MMTV/VP16-Linien zusammengefasst.
    • SEQUENZLISTE (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
  • (i) ANMELDER:
  • (A) NAME: Monsanto Co.
  • (B) STRASSE: 800 N. Lindbergh
  • (C) STADT: St. Louis
  • (D) STAAT: Missouri
  • (E) LAND: USA
  • (F) POSTLEITZAHL (ZIP): 63167
  • (G) TELEFON: (314)694-5402
  • (H) TELEFAX: (314)694-9009
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Herstellung rekombinanter Proteine unter Verwendung von Herpes-Virus-Promotoren und VP16- Transaktivatoren
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 12
  • (iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
  • (A) ART DES MEDIUMS: Floppy disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR 1:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 1:
  • GATCGGATCC AACCCCACCC AATGGACCTC
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr 2:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 26 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 2:
  • GATCGGATCC GCGCCCCCTA CCCACC
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr 3:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 28 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 3:
  • GACCAATTCC AGGATCCCAG GACCCAGT
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr 4:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 37 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 4:
  • GATCGGTACC GCAAACAACA GATGGCTGGC AACTAGA
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr 5:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 31 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 5:
  • GCTAGGATCC CGGGATAGGT TCAGGGAGGC G
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr 6:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 6:
  • GATCGGATCC TCAGCCTCGC TATGGCTCCC
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr 7:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 34 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 7:
  • GATCGATCAT GGATCCCTCA TACCGGGGGG AGAG
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr 8:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 44 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 8:
  • GATCCTACCC GTACGACGTT CCGGACTACG CTTCTTAAGA GCTC
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr 9:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 44 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 9:
  • GATCGAGCTC TTAAGAAGCG TAGTCCGGAA CGTCGTACGG GTAG
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr 10:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 76 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 10:
  • GATCCACCAT GAGCCGCCGT CCCGTCCTGC TCCTGCTCCA ACTCCTGGTC
  • GGCCCCGCCA
  • TGGCTAAGCT TGGATC
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr 11:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 11:
    • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr 12:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 54 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr 12:
  • GATCGACCAT GGCTGCCATA CCCGTACGAC GTTCCGGACT ACGCTTCTAA
  • GCTT

Claims (28)

1. Verfahren zur Herstellung einer Zelllinie zur Expression eines Genprodukts, umfassend die folgenden Schritte:
Cotransfizieren einer Zelle mit einem ersten Konstrukt, welches bewirkt, daß die Zelle Herpes simplex-Virus-transaktivierendes Protein VP16 exprimiert, und einem zweiten Konstrukt, das ein selektierbares Resistenz-Gen gegen ein erstes selektierbares Mittel aufweist;
Selektieren von Zellen, die gegen das erste selektierbare Mittel resistent sind;
Screenen der Zellen, die gegen das erste selektierbare Mittel resistent sind, auf Zellen, die VP16 exprimieren;
Cotransfizieren der Zelle, die Herpes simplex-Virus-transaktivierendes Protein VP16 exprimiert, mit einem dritten und einem vierten Konstrukt, wobei das dritte. Konstrukt einen Herpes simplex-Virus-Gen-Promotor aufweist, der mit einem Gen, an dem Interesse besteht, operativ verbunden ist, und das vierte Konstrukt ein selektierbares Resistenz-Gen gegen ein zweites selektierbares Mittel aufweist;
Selektieren von Zellen, die gegen das zweite selektierbare Mittel resistent sind; und
Screenen von Zellen, die gegen das zweite selektierbare Mittel resistent sind, auf Expression des Gen-Produkts des Gens, an dem Interesse besteht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle von BHK-21- Zellen oder dhfr-minus-Mutanten von CHO stammt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Herpes simplex-Virus- Gen-Promotor aus dem IE175- oder IE110-Bereich stammt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste selektierbare Mittel ein Antibiotikum ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zweite selektierbare Mittel ein Antibiotikum ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Resistenz-Gen gegen das selektierbare Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Genen, die für Hygromycin-Phosphotransferase, Aminoglycosid- Phosphotransferase-3'-H, Puromycinacetyltransferase und Bleomycin-Phleomycin-bindendes Protein codieren.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gen, an dem Interesse besteht, für ein sekretiertes Protein codiert.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gen, an dem Interesse besteht, für tPA, sekretiertes ICAM, sekretierte Fucosyltransferase oder sekretierte Gefäßpermeabilitätsfaktoren codiert.
9. Zelllinie, die ein Gen-Produkt exprimiert, wobei die Zelllinie aufweist:
ein erstes Konstrukt, welches bewirkt, daß die Zelle Herpes simplex-Virus-Transaktivator-Protein VP16 exprimiert;
ein zweites Konstrukt, welches einen Herpes simplex-Virus- Gen-Promotor aufweist, der mit einem Gen, an dem Interesse besteht, operativ verbunden ist; und
ein drittes und ein viertes Konstrukt, welches jeweils ein selektierbares Resistenz-Gen gegen ein selektierbares Mittel aufweist.
10. Zelllinie nach Anspruch 9, wobei das erste selektierbare Mittel ein Antibiotikum ist.
11. Zelllinie nach Anspruch 9, wobei das zweite selektierbare Mittel ein Antibiotikum ist.
12. Zelllinie nach Anspruch 9, wobei die Zelle von BHK-21- Zellen stammt.
13. Zelllinie nach Anspruch 9, wobei die Zelle von dhfr-minus- Mutanten von CHO-Zellen stammt.
14. Zelllinie nach Anspruch 13, wobei keines der Resistenz- Gene für Dihydrofolat-Reduktase kodiert.
15. Zelllinie nach Anspruch 9, wobei der Herpes simplex-Virus- Gen-Protomor aus dem IE175- oder dem IE110-Bereich stammt.
16. Zelllinie nach Anspruch 14, wobei das Resistenz-Gen gegen das selektierbare Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Genen, die für Hygromycin-Phosphotransferase, Aminoglycosid- Phosphotransferase-3'-H, Puromycinacetyltransferase und Bleomycin-Phleomycin-bindendes Protein codieren.
17. Zelllinie nach Anspruch 9, wobei das Gen, an dem Interesse besteht, für ein sekretiertes Protein codiert.
18. Zelllinie nach Anspruch 9, wobei das Gen, an dem Interesse besteht, für tPA, sekretiertes ICAM, sekretierte Fucosyltransferase oder sekretierte Gefäßpermeabilitätsfaktoren codiert.
19. Verfahren zur Entdeckung antiviraler Mittel, umfassend die folgenden Schritte:
Cotransfizieren einer Zelle mit einem ersten Konstrukt, welches bewirkt, daß die Zelle Herpes simplex-Virus-transaktivierendes Protein VP16 exprimiert, und einem zweiten Konstrukt, das ein selektierbares Resistenz-Gen gegen ein erstes selektierbares Mittel aufweist;
Selektieren von Zellen, die gegen das erste selektierbare Mittel resistent sind;
Screenen der Zellen, die gegen das erste selektierbare Mittel resistent sind, auf Zellen, die VP16 exprimieren;
Cotransfizieren der Zelle, die Herpes simplex-Virus-transaktivierendes Protein VP16 exprimiert, mit einem dritten und einem vierten Konstrukt, wobei das dritte Konstrukt einen Herpes simplex-Virus-Gen-Promotor aufweist, der mit einem Gen, an dem Interesse besteht, operativ verbunden ist, und das vierte Konstrukt ein selektierbares Resistenz-Gen gegen ein zweites selektierbares Mittel aufweist;
Selektieren von Zellen, die gegen das zweite selektierbare Mittel resistent sind; und
Screenen von Zellen, die gegen das zweite selektierbare Mittel resistent sind, auf Expression des Gen-Produkts des Gens, an dem Interesse besteht,
Inkubieren von Zellen mit zu testenden Substanzen;
Bestimmen der Menge des Genprodukts des Gens, an dem Interesse besteht, welches von der Zelle nach Einwirkung der Substanzen produziert wurde; und
Testen von Substanzen, die die Menge des Genprodukts des Gens, an dem Interesse besteht, verringern, auf Hemmung der Replikation eines viralen Mittels mit herkömmlichen Virustests.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Zelle von BHK-21 oder dhfr-minus-Mutanten von CHO stammt.
21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Herpes simplex- Virus-Gen-Promotor aus dem IE175- oder IE110-Bereich stammt.
22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei des erste selektierbare Mittel ein Antibiotikum ist.
23. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das zweite selektierbare Mittel ein Antibiotikum ist.
24. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Resistenz-Gen gegen das selektierbare Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Genen, die für Hygromycin-Phosphotransferase, Aminoglycosid- Phosphotransferase-3'-H, Puromycinacetyltransferase und Bleomycin-Phleomycin-bindendes Protein codieren.
25. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das virale Mittel ein Herpes simplex-Virus ist.
26. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Gen, an dem Interesse besteht, für ein sekretiertes Protein codiert.
27. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Gen, an dem Interesse besteht, für tPA, sekretiertes ICAM, sekretierte Fucosyltransferase oder sekretierte Gefäßpermeabilitätsfaktoren codiert.
28. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die zu testenden Substanzen synthetische oder natürliche Verbindungen aus Pflanzen, Tieren oder mikrobiellen Quellen sind.
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