DE69224360T2

DE69224360T2 - DNS Klone mit 'Enhancer' Aktivität, rekombinanter Vektor der es enthält und Verfahren zur Herstellung von Genprodukten unter Verwendung desselben

Info

Publication number: DE69224360T2
Application number: DE1992624360
Authority: DE
Inventors: Susumu Nakada; Takuma Nakajima; Takeshi Nakamura; Kinichiro Oda; Shiho Tsunoda
Original assignee: Nichirei Corp
Current assignee: Nichirei Corp
Priority date: 1991-12-03
Filing date: 1992-11-10
Publication date: 1998-07-02
Anticipated expiration: 2012-11-11
Also published as: DE69224360D1; JP2524939B2; EP0546333A1; EP0546333B1; JPH06181767A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine DNA mit Verstärkeraktivität für das Fibronectin-Gen(Fibronectin wird im folgenden auch als "FN" bezeichnet), das es wirksam unterstützt, ein Strukturgen in Säugetierzellen auszuprägen, die in einem serumfreien oder serumarmen Medium kultiviert werden.
Es gibt drei Typen von Verfahren, die üblicherweise für die Produktion genetisch veränderter Genprodukte eingesetzt werden, die nach ihrer Art, Wirte einzusetzen, eingeteilt werden, nämlich 1) die Verfahren, die Bakterien verwenden, wie zum Beispiel Escherichia coli, 2) die Verfahren, die Eumyceten verwenden, wie zum Beispiel Hefe, und 3) die Verfahren, die Säugetiere oder ihre Zellen verwenden. Was ihre Produktivität im Bezug auf große Mengen betrifft, haben die Verfahren 1) und 2) Nachteile, die darin bestehen, daß (a) die Genprodukte im allgemeinen nicht von den Zellen nach außen abgegeben werden können, daß (b) die Struktur der Genprodukte, die von Säugetieren abstammen, ändert werden kann und daß (c) die Glycosylierung und/oder Phosphorylierung der Genprodukte fehischlagen oder unvollständig sein kann. Solche Modifikationen sind aber intrinsisch für die Funktionen der Genprodukte, die von Säugetieren abstammen. Deshalb ist es für die Herstellung der Genprodukte, die von Säugetieren abstammen, wünschenswert, Säugetierzellen einzusetzen.
Die Verfahren 3) werden eingeteilt in solche, die Säugetierindividuen einsetzen, und solche, die Säugetierzellen einsetzen. Bei den Verfahren, die Säugetierindividuen einsetzen, können die Genprodukte die Wirte (das heißt, die Individuen, die die gewünschten Genprodukte erzeugen) ungünstig beeinflussen, und es ist schwer, die Unterschiede zwischen den Individuen zu steuern. So werden zur Zeit üblicherweise die Verfahren eingesetzt, die Säugetierzellen verwenden.
Zur Kultivierung von Säugetierzellen zum Zweck der Herstellung einer gewünschten Substanz werden Medien eingesetzt, die eine hohe Konzentration (5 bis 20 Vol.-%) an Säugetierserum enthalten. Die Seren, die zu solchen Medien zugegeben werden, sind teuer. Weiter schwankt ihre Qualität abhängig von der Charge, so daß der Anwender die Qualität der zu verwendenden Seren prüfen muß. So machen die Kosten für das zum Kulturmedium zuzugebende Serum den Hauptteil der Kultivierungskosten aus. Weiter machen es bei der Isolierung eines Genproduktes, das in Säugetierzellen ausgeprägt wird, oder eines seiner Metaboliten (das Genprodukt und sein Metabolit werden im folgenden gemeinsamen als "Substanz" bezeichnet) die Serumkomponenten schwer, die gewünschte Substanz zu reinigen, was die für die Reinigung der Substanz erforderlichen Kosten erhöht.
So ist es, um die Herstellungskosten zu verringern, bei der Herstellung einer Substanz, bei der kultivierte Säugetierzellen ausgenutzt werden, besonders wirksam, ein Medium einzusetzen, das serumfrei ist oder Serum in einer sehr niedrigen Konzentration (das heißt, 2,0 Vol.-% oder weniger) enthält (im folgenden als "serumarmes Medium" bezeichnet). Allerdings gibt es viele Zellen, die sich nicht an ein serumfreies Medium anpassen, und es gibt viele Gene, die nicht ausgeprägt werden, wenn die Wachstumsaktivitäten der Zellen in einem serumarmen Medium nachlassen. So gibt es in der Praxis Probleme beim Einsatz von serumfreien oder serumarmen Medien.
Fibronectin (FN), das ein Bestandteil der extrazellulären Matrix ist, wird sehr stark ausgeprägt in haftfähigen Zellen vom normalen Typ in der Ruhephase (dem Zustand, in dem das Wachstum der Zellen inhibiert ist durch Kultivieren der Zellen in einem serumarmen Medium oder durch Anheben der Zellendichte zur Verursachung von Kontaktinhibierung), und seine Ausprägung wird unterdrückt, wenn das Wachstum der Zellen einsetzt. Der Ausprägungsgrad von Fibronectin hängt von der Aktivität des Steuergens ab (Hara et al., Gene 70, 97 (1988)). Deshalb kann durch Einführen eines Gens, das ein geklontes Struktur gen enthält, in einer Region in Flußrichtung unterhalb des FN-Aktivators eine Zellenlinie (ein Transformant) geschaffen werden, die das Genprodukt in hoher Konzentration in einem serumarmen Medium herstellt.
FN-Aktivatoren wurden bereits von mehreren Sorten von Säugetierzellen einschließlich solchen von Ratte und Mensch geklont, und ihre Primärstrukturen (Nukleotidsequenz) wurden bestimmt (Patel et al., The EMBO Journal, Band 6, Nr.9, 2565, 1987).
In D.C. Dean et al., Mol. Cell. Biol., Band 9 (4), April 1989, Seiten 1498 bis 1506, sind die 5'-flankierenden Regionen der Fibronectin-Gene von Mensch und Ratte veröffentlicht. Diese Literaturstelle berichtet über die gewebespezifische Ausprägung des FN-Aktivators aufgrund eines auf CAMP ansprechenden Elementes, das in der 5'-flankierenden Region (-170) des menschlichen FN-Gens identifiziert wurde, und darüber, daß diese Sequenz die CAMP-Induktion in verschiedenen Linien menschlicher Zellen vermitteln kann (siehe Seite 1503, den von der linken Spalte zur rechten Spalte verbrückenden Absatz). Verstärkerelemente, die für die Ausprägung des FN-Aktivators wirksam sind, wurden nicht beschrieben.
Allerdings sind diese Analysen nicht vollständig. Zum Beispiel bleibt der Verstärker, der für die Ausprägung des FN-Aktivators erforderlich ist, unbekannt. Weiter gibt es keinen Bericht über eine Untersuchung am FN-Aktivator mit dem Ziel, den FN-Aktivator auf die Herstellung einer Substanz anzuwenden, mit der Ausnahme von Oda et al., Saibo Kogaku Bessatsu 4, S.3, 1988, wo die Möglichkeit der Verwendung des FN-Aktivators für die Herstellung einer Substanz nahegelegt wird.
Entsprechend besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, eine DNA bereitzustellen, die eine Verstärkeraktivität aufweist, durch die eine Substanz in hoher Konzentration in Säugetierzellen in einem serumfreie oder serumarmen Medium hergestellt werden kann, und auch Verwendungen dafür bereitzustellen.
Im Rahmen der Erfindung wurde intensiv das Klonen des Aktivators untersucht, der unter serumfreien oder serumarmen Bedingungen wirkt. Als Ergebnis wurde eine DNA mit Verstärkeraktivität für FN-Gene erhalten, und es wurde festgestellt, daß ein Strukturgen wirksam ausgeprägt werden kann unter Verwendung der DNA und des Aktivators, wodurch die vorliegende Erfindung gemacht wurde.
Das heißt, die Erfindung stellt bereit
1) eine geklonte DNA-Sequenz, die aus genomisc er DNA er Ratte a geleitet ist und eine Verstärkeraktivität für das Fibronectin-Gen der Ratte besitzt,
2) einen rekombinierten Vektor, der einen funktionsfähig gebundenen Aktivator, ein Strukturgen und die DNA aus 1) umfaßt, und
3) ein Verfahren zur Herstellung eines Genproduktes, das den Schritt umfaßt, daß Säugetierzellen, die mit dem rekombinierten Vektor aus 2) transformiert wurden, kultiviert werden und das Genprodukt gesammelt wird, das durch Ausprägung des Strukturgens hergestellt wurde.
Durch die Erfindung wurde eine DNA, die eine Verstärkeraktivität für das FN- Gen der Ratte besitzt, identifiziert, abgetrennt und geklont, und ein rekombinierter Vektor, der diese enthält, wurde bereitgestellt. Da Säugetierzellen, die mit dem erfindungsgemäßen rekombinierten Vektor transformiert wurden, ein gewünschtes Strukturgen in einem serumfreien oder serumarmen Medium ausprägen, kann die gewünschte Substanz wirksam durch solche transformierten Säugetierzellen in einem serumfreien oder serumarmen Medium hergestellt werden. So wurde es durch die Erfindung möglich, eine Substanz unter Verwendung eines preisgünstigen Mediums, das kein Serum enthält, herzustellen, und der Reinigungsschritt zum Entfernen des Serums vom gewünschten Produkt ist nicht erforderlich. Deshalb kann das gewünschte Produkt wirksam bei niedrigen Kosten hergestellt werden. Weiter können, weil im erfindungsgemäßen Verfahren transformierte Säugefierzellen verwendet werden, Genprodukte hergestellt werden, die Modifikationen durch Zuckerketten aufweisen, die denen gleichen oder wenigstens ähneln, die die natürlich auftretenden Genprodukte besitzen.
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse des Southern-Blottings verschiedener Fragmente, die erhalten wurden durch Verdauen von Klonen von λ-#908phage und von λ-#916phage und unter Verwendung des DNA-Fragmentes von -1068 nt bis -531 nt der 5'-flankierenden Region des FNs der Ratte.
Fig. 2 zeigt Genkarten der Plasmide prFNpp2. 1 und prFNSn2.3, die hergestellt wurden, indem die 5'-flankierende Region, die den FN-Aktivator und den FN- Verstärker der Ratte enthielt, in den Mehrfachklonierungsbereich von pBluescript II KS+ eingebracht wurde.
Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz einer DNA, die den FN-Aktivatorbereich und den FN-Verstärkerbereich der Ratte enthält.
Fig. 4 zeigt Genkarten der Plasmidvektoren pSV2CAT-BX und pSV2-XB, die verwendet wurden zur Analyse der Wirkung des FN-Aktivatorbereiches und den FN-Verstärkerbereiches der Ratte.
Fig. 5 zeigt 26 Arten von FN-Aktivatoren und FN-Verstärkern, in denen keine oder verschiedene Löschungen oder Austausche vorgenommen wurden.
Fig. 6 zeigt eine Zeittafel eines CAT-Assays und der temporären Ausprägungsak tivität des FN-Verstärkers und des FN-Aktivators.
Fig. 7 ist eine Ansicht, die zeigt, daß die temporäre Ausprägung des FN- Verstärkers und des FN-Aktivators von XhoC-Zellen gefördert wird durch den Ersatz von Basen in der Verstärkerregion.
Fig. 8 stellt eine Genkarte eines Transduktionsvektors pF1900L dar.
Fig. 9 stellt eine Genkarte eines Transduktionsvektors pF1900Lneo dar.
Fig. 10 stellt eine Genkarte eines Transduktionsvektors pFΔb564L dar.
Fig. 11 stellt eine Genkarte eines Transduktionsvektors pFΔb564Lneo dar.
Fig. 12A stellt eine Genkarte eines Transduktionsvektors pF1900M dar.
Fig. 12B stellt eine Genkarte eines aus einem Transduktionsvektor pF1900M hergestellten Plasmides pF1900γ zur Ausprägung von menschlichem Interferon Gamma (HuIFN-γ) dar.
Fig. 13 zeigt das Wachstum der Zellenlinien I6,I7, I25 und I26 und die Produktion von HuIFN-γ durch diese Zellenlinien.
Fig. 14 zeigt die Änderung der HuIFN-γ-Konzentration, die durch die Zellenlinie 17 hergestellt wird, wobei Fig. 14A die Konzentrationsänderung zeigt, wenn das Medium nicht ersetzt wird, und Fig. 14B die Konzentrationsänderung zeigt, wenn das Medium jeden zweiten Tag ersetzt wird.
Fig. 15 zeigt die Ergebnisse der Northern-Blot-Hybridisierungsanalyse, wobei Fig. 15A die Ergebnisse von HuIFN-γ-mRNA, die durch I6, I7, I25 und I26 ausgeprägt wurde, und Fig. 15B die Ergebnisse von β-Actin-mRNA (Kontrollexperiment) darstellt.
Fig. 16 zeigt die Ergebnisse der Southern-Blot-Hybridisierungsanalyse von pF1900γ, das in die Zellenlinien I6, I7, I25 und I26 eingeführt wurde und dort zurückgehalten wurde. Und
Fig. 17 zeigt das SDS-Polyacrylamid-Gelelelektrophoresebild des HuIFN-γ- Proteins (getrennt durch Immunfällung), das von den Zellen 16 und 17 hergestellt wurde.
Die erfindungsgemäße DNA, die Verstärkeraktivität für das FN-Gen aufweist, wird im folgenden auch als "erfindungsgemäße Verstärker-DNA" oder "FN- Verstärker" bezeichnet.
Der Ausdruck "Verstärker" bedeutet hier die Nukleotidsequenz in einer DNA mit folgenden Besonderheiten:
(1) Der Verstärker besitzt eine Aktivität, die Aktivität des am nächsten gelegenen Aktivators auf der selben DNA zu verstärken.
(2) Der Verstärker wirkt selbst dann, wenn er beträchtlich weit (bis zu 10000 Basen) vom Gen, auf das der Verstärker wirkt, entfernt ist.
(3) Der Verstärker muß nicht an einer bestimmten Position angeordnet sein. Das heißt, der Verstärker muß nicht in Flußrichtung oberhalb des 5'-Endes des Gens angeordnet sein, sondern kann in der Transkriptionsregion oder in Flußrichtung unterhalb davon angeordnet sein.
(4) Ein Typ der Verstärkersequenz kann bestimmte Zellen bevorzugen oder kann nur in diesen Zellen wirken (Gewebespezifität).
Durch die vorstehend genannten Besonderheiten kann der Verstärker vom Aktivator unterschieden werden.
Die Verstärkeraktivität für das FN-Gen der Ratte der erfindungsgemäßen FN- Verstärker-DNA bedeutet hier, daß die Effektivität der Transkription des FN- Aktivators verstärkt wird, das heißt, daß das Ausprägungsniveau des Strukturgens unter Kontrolle des FN-Aktivators erhöht wird, wenn die Verstärker-DNA an eine in Flußrichtung aufwärts angeordnete Region des FN-Aktivators angelagert wird. Weiter fällt das Anwachsen der Wirksamkeit der Transkription in ruhenden Zellen (siehe oben) auf, und die Transkription wird schnell unterdrückt, wenn die Zelle zu wachsen beginnt. Dies ist auch eine wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Verstärker-DNA.
Die erfindungsgemäße Verstärker-DNA kann zum Beispiel wie folgt erhalten werden: Zuerst wird durch das Verfahren unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion (PCR-Verfahren) eine Sonde hergestellt, die auf der Grundsequenz des FN-Aktivators der Ratte basiert (Patel et al., The EMBO Journal, 6(9), 2565). Unter Verwendung der so hergestellten Sonde wird eine DNA, die die FN-Aktivatorregion und die FN-Verstärkerregion der Ratte enthält, geklont. Die geklonte DNA wird mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut, wodurch eine DNA erhalten wird, die einen Teil des Strukturgens enthält, das FN und einen Teil der Region in Flußrichtung oberhalb des FN-Gens bis zu etwa 2 kbp vom 5'-Ende des FN-Gens entfernt kodiert. Die so erhaltene DNA wird dann zu einer Plasmid-DNA subkloniert, und eine rekombinierte Plasmid-DNA mit einem Chloramphenicolacetyltransferasegen (CAT-Gen) als Meldegen (reporter gen) im in Flußrichtung unteren Bereich der 2 kbp langen DNA wird konstruiert. Tierzellen werden mit dieser DNA transfiziert, und die CAT-Aktivitäten dieser Zellen werden bestimmt. Wenn CAT-Aktivität beobachtet wird, ist der Verstärker, der unter serumfreien oder serumarmen Bedingungen wirkt, innerhalb der 2 kbp langen DNA in Flußrichtung oberhalb des FN-Gens angeordnet.
Insbesondere kann der Verstärker zum Beispiel auf der Grundlage des Verfahrens von Patel et al. erhalten werden. Das heißt, daß die Genombibliothek der Ratte (J. W. Tamkun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5140 (1984)), die in Vektoren des λ-Phagen vom EMBL-3-Typ eingebaut ist, unter Verwendung der cDNA als Sonde durchmustert wird. Aus den Phagenklonen, die mit der Sonde umgesetzt wurden, werden DNAs, die die 25-kb-Region in Flußrichtung unterhalb des 3'-Endes des FN-Genomgens enthalten, extrahiert. Unter Verwendung der Region des 5'-Endes der so erhaltenen DNA des FN-Genomgens als Sonde wird eine ähnliche Klonierung wiederholt, wodurch eine Serie von DNAs des FN- Genomgens erhalten wird, die einander teilweise überlappen. Die Positionen der DNAs auf dem FN-Gen werden durch Southern-Blotting unter Verwendung der cDNA als Sonde bestimmt. Unter diesen wird die DNA, die mit der Sonde des 5'- Endes der FN-cDNA reagiert, weiter analysiert, indem eine Restriktionsenzymkarte erstellt wird, indem die Basensequenz bestimmt wird und/oder indem der RNase-Schutztest durchgeführt wird, um die Transkriptionsanfangsstelle des FN-Gens und eines Teils des Aktivators zu bestimmen.
Die Genbibliothek der Fibroblastzellenlinie 3Y1 der Ratte (Kimura et al., Int. J. Cancer, 15, 694 (1975)), die in Vektoren des X-Phagen vom EMBL-3-Typ eingebaut ist, wird durchmustert unter Verwendung eines Teils des so erhaltenen Aktivators als Sonde. DNAs, die mit der Sonde reagieren, werden aus den Phagenklonen extrahiert, und Restriktionskarten der Region der eingebrachten Rattengene werden hergestellt. Die DNA-Fragmente in Flußrichtung oberhalb der Strukturgene, zum Beispiel 2,0-kb-Fragmente, können zum Beispiel wieder zum Plasmid pBluescript II KS geklont werden.
Durch Bestimmen der Basensequenz der geklonten DNA und Vergleichen der Basensequenz mit der der CDNA kann die Position des Translationsanfangskodons auf dem Gen bestimmt werden.
Weiter kann durch das S1-Kartografierverfahren (A. J. Berk und P. A. Sharp, Cell, 2, 721(1977)) die Transkriptionsanfangsstelle des Gens bestimmt werden.
Die so erhaltene, erfindungsgemäße Verstärker-DNA ist im DNA-Fragment vom -1908. bis zum -1081. Nukleotid in der DNA-Sequenz erhalten, die in Fig. 3 dargestellt ist.
Als Aktivator können die DNAs eingesetzt werden, die "TATAA", "GGGCGG" und "CCAAT" enthalten und in Fig. 5 in The EMBO Journal, 6, 2563 bis 2572 (1987) dargestellt sind.
Das Strukturen, das in den rekombinierten Vektor eingebracht wird, kann von einer beliebigen Spezies abgeleitet sein, und ein beliebiges Strukturgen, das in Säugetierzellen ausgeprägt werden kann, kann eingesetzt werden.
Beispiele des Strukturgens schließen das Gen, das die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodiert, die aus dem transponierbaren Element Tng stammt, das Gen, das das menschliche γ-Interferon (IFN-γ) kodiert, und den menschlichen Nervenwachstumsfaktor 2 (NGF-2) (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 386 752 A1) ein.
Der Vektor, in den die erfindungsgemäße Verstärker-DNA, die Verstärkerregion und das Strukturgen eingebracht sind, kann ein beliebiger Vektor sein einschließlich der Vektoren für Säugetierzellen, wie zum Beispiel dem PCD-Vektor, dem CDMB-Vektor (A. Aruffo und B. Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8573 (1987)), dem Retrovirusvektor (R. D. Cone, und R. C. Muiligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6349 (1984)) und anderen Vektoren, wie zum Beispiel der PBR- Serie und der pUC-Serie.
Die erfindungsgemäße Verstärker-DNA, die Aktivatorregion und das Strukturgen können durch die folgende Verfahrensweise in den Vektor eingebracht werden:
Zuerst wird ein Vektor mit einem oder mehreren geeigneten Restriktionsenzy men verdaut, so daß eine fremde DNA eingebracht werden kann. Auf der anderen Seite werden die FN-Verstärker-DNA, die Aktivatorregion und das Strukturgen (unter der Annahme, daß diese auf der gleichen DNA und aufeinanderfolgend angeordnet sind) aus einer geeigneten Quelle ausgeschnitten, und es werden, wenn nötig, die beiden Enden des ausgeschnittenen DNA-Fragmentes bearbeitet. Danach werden der Vektor und das DNA-Fragment, das die FN- Verstärker-DNA, die Aktivatorregion und das Strukturgen enthält, gemischt und durch eine Ligase aneinander gelagert.
Der so erhaltene, rekombinierte Vektor wird in Säugetierzellen eingeführt, um so die Säugetierzellen zu transformieren.
Bevorzugte Beispiele der Säugetierzelle, die als Wirt eingesetzt wird, schließen die 3Y1-Zelle, die von der Fibroblastzelle der Ratte abstammt, die 3T3-Zelle, die von der Fibroblastzelle der Maus abstammt, die WI38-Zelle, die von der menschlichen Fibroblastzelle abstammt, die HUH7-Zelle, die von der menschlichen Häpatocarzinomzelle abstammt, und die HmLu1-Zelle, die von der Lungenkrebszelle des Hamsters abstammt, ein. Unter diesen ist die 3Y1-Zelle der Ratte besonders bevorzugt.
Der rekombinierte Vektor kann in die Säugetierzelle zum Beispiel durch das Calciumphosphatverfahren (M. Wigler et al., Cell, 16, 777 (1979)), das DEAE- Dextranverfahren (M. A. Lopata et al., Nucleic Acid Res., 12, 5707 (1984)), das Elektroporationsverfahren (Ishizaki et al., Saibo Kogaku, Band 5, S.557, 1986) oder das Mikroinjektionsverfahren eingeführt werden.
Der Säugetierzellentransformant kann durch die konventionellen Verfahren kultiviert werden. Beispiele der bevorzugten Medien schließen das MEM-Medium (Science, 122, 501 (1952)), das DMEM-Medium (Virology, 8, 396 (1959)), das RPMI- 1640-Medium ("The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)) und das Medium 199 (Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)) ein. Der pH-Wert des Mediums liegt bevorzugt bei 6 bis 8. Die Kultivierung kann üblicherweise bei etwa 30 bis 40ºC etwa 15 bis 96 h lang durchgeführt werden. Wenn nötig, kann das Kulturmedium belüftet und/oder gerührt werden. Die Transformanten können zuerst in einem Medium, das Serum enthält, kultiviert werden und dann in ein serumfreies oder serumarmes Medium übertragen werden.
In der Anfangskultur kann ein serumfreies Medium oder ein Medium, das 0,1 bis 20 Vol.-% Rinderserum enthält, eingesetzt werden. Ublicherweise ist eine Serumkonzentration von 10 Vol.-% ausreichend (oder 5 Vol.-% sind ausreichend für einige Zellen). Nach Vermehrung der Zellen zu einer angemessenen Zahl unter diesen Bedingungen werden die Zellen dann in ein serumfreies oder serumarmes (etwa 0,1 bis 2 Vol.-%) Medium übertragen. Durch Kultivieren der Zellen in diesem serumfreien oder serumarmen Medium kann das gewünschte Genprodukt in großer Menge erhalten werden. Es ist bevorzugt, das Medium gegen ein frisches Medium zum Beispiel alle 3 Tage auszutauschen. Das Serum kann zum Beispiel ein Kälberserum, ein Kalbsfötenserum und dergleichen sein, und das Kalbsfötenserum ist besonders bevorzugt.
Durch das vorstehend beschriebene Verfahren kann ein beliebiges, gewünschtes Strukturgen wirksam unter serumfreien oder serumarmen Bedingungen ausgeprägt werden, indem die erfindungsgemäße Verstärker-DNA und der Aktivator verwendet werden.
Der rekombinierte Vektor pF1900L, der die erfindungsgemäße Verstärker-DNA und den Aktivator enthält, der in Beispiel 1(3), das im folgenden beschrieben wird, erhalten wurde, wurde am Fermentation Research Institute of Japan am 9. September 1991 gemäß dem Budapester Abkommen unter der Zugriffsnummer FERM BP-3552 hinterlegt.
Die Erfindung wird im folgenden mit Hilfe von Beispielen dafür beschrieben. Es sei angemerkt, daß die Beispiele nur zu Veranschaulichungszwecken vorgelegt werden und nicht auf irgendwie begrenzende Weise aufgefaßt werden sollten.

Beispiel 1

(1) Isolierung des FN-Aktivators und des Verstärkers der Ratte

Eine Genom-DNA-Bibliothek wurde aus Klon b 1-6 der Fibroblastzellenlinie 3Y1 der Ratte ((Kimura et al., Int. J. Cancer 15, 694 (1975)), im folgenden kurz als 3Y1" bezeichnet) unter Verwendung des y-Phagenvektors vom Typ EMBL3 (kommerziell erhältlich von Stratagene Inc., der Phagenvektor wird im folgenden als "Stg" bezeichnet) hergestellt. Ein DNA-Fragment mit der Sequenz vom -1067. Nukleotid (die Nukleotidzahl wird im folgenden beispielsweise so ausgedrückt: "-1067 nt") bis -529 nt in der 5'-flankierenden Region von FN, dessen Sequenz von Patel bestimmt wurde (die Transkriptionsanfangsstelle wird als +1 nt gezählt und das Nukleotid in Flußrichtung direkt oberhalb der Position +1 nt wird als -1 nt gezählt), wurde durch das Verfahren mit Polymerasekettenreakfion (im folgenden als "PCR-Verfahren" bezeichnet) unter Verwendung der genomischen DNA von 3Y1 als Matrize hergestellt.
Das 5'-Ende des so erhaltenen DNA-Fragmentes wurde radiomarkiert unter Verwendung von (γ-³²P)ATP und T4-Polynukleotidkinase, wodurch eine DNA- Sonde erhalten wurde. Unter Verwendung der so hergestellten DNA-Sonde wurden 1500000 Klone der vorstehend genannten, genomischen DNA-Bibliothek durchmustert, um zwei Klone #908 und #916 zu erhalten, die den FN-Aktivator enthalten. Southern-Blot-Analyse ergab, daß der Klon #908 ein Sal-I-Fragment von etwa 10 kbp, das die 5'-flankierende Region des FNS einschließt, enthielt und daß der Klon #916 ein Sal-I-Fragment von etwa 5,7 kbp, das die 5'- flankierende Region des FNs einschließt, enthielt (Fig. 1).
Aus dem Klon #908 wurden ein Pst-I-Fragment von 2,1 kbp und ein (Sal-I- Nhe- I)-Fragment von 2,3 kbp, die die 5'-flankierende Region des FNS enthalten, herausgeschnitten, und diese Fragmente wurden an einen Plasmid pBluescript II KS + (Stg) subkloniert, wodurch prFNpp2. 1 beziehungsweise prFNsn2.3 erhalten wurden (Fig. 2). Die Basensequenz von prFNpp2. 1 wurde bestimmt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß prFNpp2. 1 die Nukleotidsequenz von -1908 nt bis -1081 nt enthält, die bisher nicht veröffentlicht wurde (Fig. 3, es sei angemerkt, daß die Numeotidsequenz von -1080 nt bis +2460 nt von Patel et al. (The EMBO Journal, 6(9), 2565 (1987) veröffentlicht wurde). Die Basensequenz und die Restriktionskarte der Region in Flußrichtung unterhalb von -1080 nt waren iden tisch mit denen, die von Patel et al. veröffentlicht wurden.

(2) Untersuchungen über die Wirkregionen des FN-Aktivators und des FN-Verstärkers

Die Wirkregionen des FN-Aktivators und des FN-Verstärkers wurden durch das Assay (CAT-Assay) der temporären Ausprägungsaktivität von Chloramphenicolacetyltransferase (CAT-Assay) untersucht. Das heißt, verschiedene Plasmide (pFCATs, siehe Fig. 5) wurden hergestellt, die die 5'-flankierende Region von FN (die den Aktivator und den Verstärker enthält) enthalten, in die verschiedene Löschungen und Substitutionen von Basen eingeführt worden waren und die in Flußrichtung oberhalb des CAT-Gens eingebracht ist. Der 3Y1-Klon b 1-6 wurde mit jedem der pFCATs transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die CAT- Aktivitäten in den Zellextrakten gemessen, und die gemessenen Aktivitäten wurden miteinander verglichen.

(2)-1 Herstellung der pFCATs

Zuerst wurden, um den FN-Aktivator und den FN-Verstärker in eine Region in Flußrichtung oberhalb des CAT-Gens einzubringen, Plasmide pSV2CAT-BX und pSV2CAT-XB hergestellt (Fig. 4). Das Plasmid PSV2CAT-BX ist das gleiche wie das PSV2CAT, das von Gorman et al. (Molecular and Cellular Biology, 2(9), 1044 (1982)) veröffentlicht wurde, mit der Ausnahme, daß die Acc-I-Restriktionsstelle und die Nde-I-Restriktionsstelle durch die Bgl-II-Stelle beziehungsweise die Xho- I-Stelle ausgetauscht sind. Das Plasmid pSV2CAT-XB ist das gleiche wie das pSV2CAT, mit der Ausnahme, daß die Acc-I-Restriktionsstelle und die Nde-I- Restriktionsstelle durch die Xho-I-Stelle beziehungsweise die Bgl-II-Stelle ausgetauscht sind. Die 5'-flankierende Region von FN mit verschiedenen Löschungen und Substitutionen von Basen wurde in Flußrichtung oberhalb des CAT-Gens in die Plasmide pSV2CAT-BX und pSV2CAT-XB eingebracht, wodurch 26 pFCATs erhalten wurden (siehe Fig. 5, die hergestellten Plasmide wurden aus Gründen der Bequemlichkeit von 1 bis 26 durchnumeriert). Das Verfahren zur Konstruktion eines jeden dieser pFCAT-Plasmide wird im folgenden beschrieben.
pF1900CAT und pF202CAT (siehe Fig. 5; 1, 7)
Plasmid prFNpp2.1 wurde mit Bam HI oder Sau 3AI und Hind III verdaut, um ein DNA-Fragment von 2,1 kbp (enthaltend -1908 nt bis +136 nt der 5'-flankierenden Region des FNs) und ein DNA-Fragment von 351 bp (enthaltend -202 nt bis +136 nt der 5'-flankierenden Region des FNS) zu erhalten. Diese DNA-Fragmente wurden zwischen der Hind-III-Stelle und der Bgl-II-Stelle von pSV2CAT- XB eingebracht, um pF1900CAT beziehungsweise pF202CAT zu erhalten.
pFC1079CAT (siehe Fig. 5; 2)
Nach Verdauen von prFNsn2.3 mit Eco RI wurde das sich ergebende Material mit T4DNA-Polymerase unscharf abgeschnitten und ein Bam-HI-Linker angehängt. Das sich ergebende Material wurde mit Bam HI und Pst I verdaut, und das erhaltene DNA-Fragment mit 1,4 kbp (enthaltend -1079 nt bis +136 nt der 5'-flankierenden Region des FNS) wurde zwischen der Hind-III-Stelle und der Bgl-II-Stelle von pSV2CAT-XB unter Verwendung eines Hind-III-Pst-I-DNA- Linkers (5'AGCTTGCA3') eingebracht, wodurch pFC1079CAT erhalten wurde.
pF882CAT, pF564CAT, pF414CAT und pF166CAT (siehe Fig; 3, 5, 6, 8)
Plasmid prFNpp2.1 wurde mit Stu I, Sma I, Dra I und Rsa I verdaut, und ein Bgl-II-Linker wurde angehängt. Die sich ergebenden DNA-Fragmente mit einer Größe von 1 kbp (enthaltend -882 nt bis +136 nt der 5'-flankierenden Region des FNs), 710 bp (enthaltend -564 nt bis +136 nt), 560 bp (enthaltend -414 nt bis +136 nt) beziehungsweise 310 bp (enthaltend -166 nt bis +136 nt) zwischen der Hind-III-Stelle und der Bgl-II-Stelle von pSV2CAT-XB eingebracht, wodurch pF882CAT, pF564CAT, pF414CAT beziehungsweise pF166CAT erhalten wurden.
pF746CAT und pF123CAT (siehe Fig. 5; 4, 10)
Plasmid prFNpp2. 1 wurde mit Apa LI oder Eag I verdaut, und die sich ergebenden Materialien wurden mit T4DNA-Polymerase unscharf abgeschnitten, worauf ein Bgl-II-Linker angehängt wurde (die Eag-I-Stelle wurde durch Anhängen des Linkers repariert). Die sich ergebenden Materialien wurden mit Bgl II und Hind III verdaut, um ein DNA-Fragment mit 900 bp (enthaltend -746 nt bis +136 nt der 5'-flankierenden Region des FNS) und ein DNA-Fragment mit 270 bp (enthaltend -123 nt bis +136 nt) zu erhalten. Jedes dieser DNA-Fragmente wurde zwischen der Hind-III-Stelle und der Bgl-II-Stelle von pSV2CAT-XB eingebracht, wodurch pF746CAT beziehungsweise pF123CAT erhalten wurden.
pF154CAT (siehe Fig. 5; 9)
Plasmid prFNpp2.1 wurde mit Aat II und Hind III verdaut, um ein DNA-Fragment mit 300 bp (enthaltend -154 nt bis +136 nt der 5'-flankierenden Region des FNs) zu erhalten. Das DNA-Fragment wurde zwischen der Hind-III-Stelle und der Bgl-II-Stelle von pSV2CAT-XB unter Verwendung eines Sau-3AI-Aat-II- DNA-Linkers (5'GATCACGT3') eingebracht, wodurch pF154CAT erhalten wurde.
pFΔa882CAT, pFΔa746CAT, pΔa564CAT, pFΔa414CAT und pFΔa123CAT (siehe Fig. 5; 11, 12, 13, 14 und 16)
Nach Verdauen von prFNsn2.3 mit Eco RI wurde das sich ergebende Material mit T4DNA-Polymerase unscharf abgeschnitten und dann ein Bgl-II-Linker angehängt. Das sich ergebende Material wurde mit Bgl II und Xho I verdaut, um ein DNA-Fragment mit 1 kbp (enthaltend -1908 nt bis -1075 nt des FN-Verstärkers) zu erhalten. Das DNA-Fragment wurde zwischen der Bgl-II-Stelle und der Xho-I-Stelle von pSV2CAT-BX eingebracht, wodurch pSV2CAT-FNa erhalten wurde.
Die Bgl-II-Hind-III-Fragmente, die den FN-Aktivator und den FN-Verstärker enthielten, wurden von pF882CAT, pF746CAT, pF564CAT, pF414CAT beziehungsweise pF123CAT eingebracht, und jedes der DNA-Fragmente wurde zwischen der Hind-III-Stelle und der Bgl-II-Stelle von PSV2CAT-FNa eingebracht, wodurch pFΔa882CAT, pFΔa746CAT, pFΔa564CAT, pFΔa414CAT beziehungsweise pFΔa123CAT erhalten wurde.
PfΔa154CAT (siehe Fig. 5; 15)
Plasmid prFNpp2. 1 wurde mit Aat II und Hind III verdaut, um ein DNA-Fragment mit 300 bp (enthaltend -154 nt bis +136 nt der 5'-flankierenden Region des FNs) zu erhalten. Das DNA-Fragment wurde zwischen der Hind-Ih-Stelle und der Bgl-II-Stelle von PSV2CAT-FNA, das im vorstehend genannten Absatz hergestellt wurde, unter Verwendung eines Sau-3M-Aat-II-DNA-Linkers (5'GATCACGT3') eingebracht, wodurch pFΔa154CAT erhalten wurde.
pFΔb746CAT und pFΔb564CAT (siehe Fig. 5; 17 und 18)
Plasmid prFNpp2.3 wurde mit Stu I verdaut, und ein Bgl-II-Linker wurde angehängt. Das sich ergebende Material wurde mit Bgl II und Xho I verdaut, um ein DNA-Fragment mit 1,1 kbp (enthaltend -1908 nt bis -882 nt des FN-Verstärkers) zu erhalten. Das DNA-Fragment wurde zwischen der Bgl-II-Stelle und der Xho-I-Stelle von pSV2CAT-BX eingebracht, wodurch pSV2CAT-FNB erhalten wurde.
Die Bgl-II-Hind-III-Fragmente, die den FN-Aktivator und den FN-Verstärker enthielten, wurden aus pF746CAT beziehungsweise pF564CAT isoliert, und die erhaltenen Fragmente wurden zwischen der Hind-III-Stelle unä der Bgl-II-Stelle von PSV2CAT-FNB eingebracht, wodurch pfΔb746CAT beziehungsweise pFΔb564CAT erhalten wurde.
pFΔc564CAT (siehe Fig. 5; 19)
Nach Verdauen von prFNpp2.3 mit Apa LI wurde das sich ergebende Material mit T4DNA-Polymerase unscharf abgeschnitten und ein Bgl-II-Linker angehängt. Das sich ergebende Material wurde mit Bgl II und Xho I verdaut, um ein DNA-Fragment mit 1,3 kbp (enthaltend -1908 nt bis -742 nt des FN-Verstärkers) zu erhalten. Das DNA-Fragment wurde zwischen der Bgl-II-Stelle und der Xho-I-Stelle von pSV2CAT-BX eingebracht, wodurch pSV2CAT-FNc erhalten wurde.
Das Bgl-II-Hind-III-Fragment, das den FN-Aktivator und den FN-Verstärker enthielt, wurde aus pF564CAT isoliert und zwischen der Hind-III-Stelle und der
Bgl-II-Stelle von pSV2CAT-FNc eingebracht, wodurch pFΔc564CAT erhalten wurde.
pFgGGCAT, pFggGCAT, pFgGgCAT und pFgggCat (siehe Fig. 5; 20, 21, 22 und 23)
Um die Wirkung des FN-Aktivators und des FN Verstärkers zu stärken, wurden Substitutionen von Basen in drei G-reiche Regionen eingeführt, das heißt, in die Regionen, die von -239 nt bis -229 nt, von -105 nt bis -95 nt und von -54 nt bis -44 nt angeordnet sind und die aus 10 G (Guanin) oder 9 G plus 1 C (Cytosin) im Zentrum der 10 Basen bestehen (diese Regionen werden im folgenden als "G10- Regionen" bezeichnet), um die pFCATs herzustellen, die in diesem Abschnitt und im nächsten Abschnitt beschrieben sind.
Plasmid pFS64CAT wurde mit Bgl II und Hind III verdaut, um ein DNA-Fragment von 720 bp zu erhalten, das den FN-Aktivator enthält. Dieses DNA-Fragment wurde zwischen der Bam-HI-Stelle und der Hind-III-Stelle des Phagenvektors M13mp 19 eingebracht, um einen Phagen M13F564 zu erhalten. E. coli CJ236 wurde mit dem Phagen M13F564 infiziert, um eine einsträngige Phagen- DNA herzustellen. Unter Verwendung dieser einsträngigen Phagen-DNA als Matrize und unter Verwendung von synthetischen DNA-Startern und eines ortsspezifischen, mutationseinführenden Systems "Mutan-K", das kommerziell erhältlich ist von Takara Shuzo, wurden die drei GGGG-Sequenzen, die bei (a) -236 nt bis -233 nt, (13)-98 nt bis -95 nt beziehungsweise (c) -54 nt bis -51 nt angeordnet sind, mit dem Verfahren nach Kunkel et al. durch ATCC, beziehungsweise ATCC und CTTA substituiert. Durch diese Substitutionen wurden die G10-Regionen zerstört.
Unter den basensubstituierten, mutierten Phagen wurde der Phage, in dem nur (a) substituiert war, als MI3FgGG bezeichnet, der Phage, in dem (a) und (1,) substituiert waren, als M13FggG bezeichnet, der Phage, in dem (a) und (c) substituiert waren, als MI3FgGg bezeichnet und der Phage, in dem (a), (1,) und (c) substituiert waren, als M13Fggg bezeichnet. So bedeutet also der Buchstabe "g" im unterstrichenen Bereich die substituierte Mutation und der Buchstabe "G" im unterstrichenen Bereich bedeutet den Wildtyp der Sequenz. Weiter bezeichnet das erste "g" die Position (a), das zweite "g" die Position (b) und das dritte "g" die Position (c).
Aus MI3FgGG, MI3FggG, MI3FgGg und M13Fggg wurden pFgGGCAT, pFggGCAT, pFgGgCAT beziehungsweise pFgggcat in der gleichen Weise konstruiert wie bei der Konstrukfion von pF414CAT.
pFΔGCAT, pFΔGgCAT und pFΔggCAT (siehe Fig. 5; 24, 25 und 26)
Aus M13FggG, M13FgGg und M13Fggg, die im vorhergehenden Abschnitt hergestellt wurden, wurden pFΔgGCAT, pFΔGgCAT beziehungsweise pFΔggCAT in der gleichen Weise konstruiert wie bei der Konstruktion von pF123CAT. Der Buchstabe "A" im unterstrichenen Bereich bedeutet, daß die Sequenz (a) gelöscht ist.

(2)-2 CAT-Assay

Ausprägung in 3Y1-Zellen (siehe Fig. 6)
Unter Verwendung der 26 pFCATs, die in den vorhergehenden Abschnitten hergestellt wurden, dem CAT ausprägenden Plasmid ptkcat (Hayashi et al., Genes & Development, 1, 818) als Kontrollexperiment und pSV2CAT wurden CAT- Assays an wachsenden 3Y1-Zellen und ruhenden 3Y1-Zellen in einem serumarmen Medium, das 0,5 Vol -% Rinderserum enthielt (Fig. 6A) durchgeführt. Die Transfektion der DNA wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

Wachsende 3Y1-Zellen:

Etwa 5×10&sup6; Zellen wurden in jeder Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm verteilt. Am nächsten Tag wurde zu den Zellen DNA in einer Menge von 20 µg pro Schale mit Hilfe des Verfahrens unter Verwendung der gemeinsamen Fällung von Calciumphosphat 4,5 bis 6 h lang zugegeben (Chen et al., Molecular and Cellular Biology, 7(8), 2745).

Ruhende 3Y1-Zellen:

Etwa 1×10&sup6; Zellen wurden in jeder Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm verteilt. Zwei Tage später wurde die Transfektion der DNA in der gleichen Weise wie für die wachsenden 3Y1-Zellen durchgeführt, wie es gerade vorstehend erwähnt wurde.
In beiden Fällen wurden die Zellen 48 bis 50 h nach der Transfektion geerntet. Die Zellen wurden dreimal einem Einfrier-Auftau-Zyklus in einem 0,25 M Tris- HCl-Puffer (pH 7,8) unterworfen, wodurch Zellextrakte erhalten wurden.
Das CAT-Assay wurde gemäß dem Verfahren von Gorman et al. durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 68 dargestellt. Wie in Fig. 68 gezeigt, wurde folgendes gefunden. In der folgenden Beschreibung werden die pFCATS in Form der Zahl bezeichnet, die in Fig. 5 dargestellt ist.
(a) Aus der Gesamtzahl der Ergebnisse kann erkannt werden, daß der FN- Aktivator stärker in ruhenden 3Y1-Zellen als in wachsenden 3Y1-Zellen wirkte.
(b) Aus der Gesamtzahl der Ergebnisse kann erkannt werden, daß der FN- Verstärker und der FN-Aktivator eine höhere Ausprägungsaktivität als die des tk-Aktivators und des SV2-Aktivators aufweisen.
(c) Aus den Vergleichen zwischen 1 und 2 und zwischen 3 bis 6 und 11 bis 14 wurde gefunden, daß eine Region, die die Ausprägung verstärkt, in der Sequenz von -1908 nt bis -1079 nt im FN-Verstärker enthalten ist.
(d) Aus den Vergleichen zwischen 1 und 18 und zwischen 2 bis 4 und 5 wurde gefunden, daß eine Region, die die Ausprägung unterdrückt, in der Sequenz von -882 nt bis -564 nt im FN-Verstärker erhalten ist.
(e) Aus den Vergleichen zwischen 6, 14 und 9,15 oder 10, 16 wurde gefunden, daß eine Region, die erforderlich ist für das Wirken der ausprägungsverstärkenden Region, die von -1908 nt bis -1079 nt enthalten ist und unter
(c) beschrieben ist, in der Sequenz zwischen -414 nt und -154 nt enthalten ist.
Ausprägung in transformierten 3Y1-Zeiien (XhoCl4-Zellen) (Fig. 7)
In der Zellenlinie XhoC14, die durch Transformieren von 3Y1-Zellen mit Adenovirus-E1-Gen hergestellt wurde, ist die Ausprägung von Fibronectin viel geringer als in normalen 3Y1-Zellen. Unter Verwendung von XhoC-Zellen wurden wie im vorhergehenden Abschnitt CAT-Assays durchgeführt. Als Ergebnis betrug die Ausprägung der pFCATs 1 bis 19 nur etwa 1/10 des Wertes in 3Y1-Zellen ([)ie Bedingungen der Transfektion und das Verfahren des CAT-Assays waren die gleichen die für wachsende 3Y1-Zellen im vorhergehenden Abschnitt). Auf der anderen Seite wurden die pFCATs 20 bis 26 (siehe Fig. 5), in die Basensubstitutionsmutationen in den G10-Regionen eingeführt worden waren, auf XhoC- Zellen transfiziert, und es wurden CAT-Assays durchgeführt. Die Ausprägungsniveaus wurden mit pF414CAT (= pFGGGCAT) und pF123CAT (= pFΔGGCAT) verglichen, wodurch die Ergebnisse erhalten wurden, die in Fig. 7 dargestellt sind. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde folgendes gefunden:
(f) Die drei G-reichen Regionen (G10-Regionen), die im FN-Aktivator und im FN-Verstärker erhalten sind, unterdrücken die Ausprägung in der transformierten Zellenlinie (XhoC).
(g) Deshalb erreichen, indem die drei G10-Regionen zum Beispiel durch Einführen von Mutationen, wie zum Beispiel Substitutionen von Basen, zerstört werden, der FN-Verstärker und der FN-Aktivator selbst in der transformierten Zellenlinie wieder eine starke Ausprägungsaktivität.
(3) Konstruktion der Vektoren pF1900L, pFΔb564L, pF1900Lneo und pFΔb564Lneo für die Transduktion
Auf der Grundlage der in den vorhergehenden Abschnitten beschriebenen Ergebnisse wurden die Transduktionsvektoren pF1900L, pFΔb5641, pF1900Lneo und pFΔb564Lneo konstruiert (Fig. 8).
Die Plasmide pF1900L und pFΔb564L sind jeweils die gleichen wie die Plasmide pF1900CAT und pFΔB564CAT, mit der Ausnahme, daß ihre CAT-Gene ersetzt sind durch ein Fragment von +198 nt bis +312 nt (die Region, die das FN-Sekretionssignal kodiert). Die neu eingebrachte Region des FN-Sekretionssignals besitzt eine Hind-III-Stelle am 5'-Ende und eine Bgl-II-Stelle am 3'-Ende, so daß diese Region unter Verwendung dieser Restriktionsenzyme herausgeschnitten werden kann. Weiter können diese Stellen als Klonierungsstellen für ein beliebiges Strukturgen eingesetzt werden. Es sei allerdings angemerkt, daß, wenn ein Gen an der Bgl-II-Stelle geklont wird, der Kodonrahmen gleichlautend mit dem Aminosäurekode des FN-Sekretionssignals sein muß.
Die Plasmide pF1900Lneo und pFΔb564Lneo wurden hergestellt, indem ein Bam-HI-Linker an die Nde-I-Stelle von pSV2neo angehängt wurde, das sich ergebende Material mit Bam HI verdaut wurde und das DNA-Fragment, das den SV2-Aktivator und ein neomycinresistentes Gen enthielt, an der Bam-HI-Stelle von pF1900L beziehungsweise pFΔb564L eingebracht wurde. Nach Einbringen dieser Plasmide in Zellen konnten stabile Transformanten als G418-resistente Stamme isoliert werden.
E. coli DHI wurde mit pF1900L mit Hilfe des Verfahrens, das von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook (1982) in ,,Molecular Gloning: A Laboratory Manual" (Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch), Gold Spring Harbor, New York: Gold Spring Harbor Laboratory, beschrieben wurde, transformiert, wodurch als Transformant ein E. coli AGI / pF1900L (FERM BP-3552) erhalten wurde.

Beispiel 2

(4) Konstruktion des Transduktionsvektors pF1900M

Ein Vektor pF1900M, der zuerst einmal kein FN-Sekretionssignal besitzt, wurde getrennt von den Transduktionsvektoren, die in den vorhergehenden Abschnitten konstruiert wurden, hergestellt (Fig. 12).
Zuerst wurde die Mehrfachklonierungsstelle in Nachbarschaft des 3'-Endes des FN-Verstärkers und des FN-Aktivators von prFNpp2. 1 durch Apa I aufgetrennt.
Nach Einbringen eines Bgl-ll-Linkers wurde das sich ergebende Material mit Bam III und Bgl II verdaut, wodurch ein DNA-Fragment isoliert wurde, das den FN-Verstärker und den FN-Aktivator enthielt. Dann wurde pSV2β-Globin mit Nde I verdaut und das sich ergebende Material mit T4DNA-Polymerase behandelt, worauf der Bgl-II-Linker eingebracht wurde. Das sich ergebende Material wurde mit Bgl II verdaut, um ein DNA-Fragment, das das Splicing/Polyadenylierungssignal von SV40 enthielt, und ein DNA-Fragment, das den Replikations ursprung von pBR322 und ein ampicillinresistentes Gen enthielt, zu isolieren. Diese isolierten DNA-Fragmente wurden angelagert und ein Plasmid, in dem das Splicingipolyadenylierungssignal von SV40 am 3'-Ende des FN-Verstärkers und des FN-Aktivators angeordnet ist, wurde ausgewämt und als pF1900M bezeichnet.

(5) Herstellung eines Genproduktes unter Verwendung von pF1900M

Um die Fähigkeit zu untersuchen, das Genprodukt des so hergestellten Ausprägungsvektors pF1900M zu produzieren, wurde menschliches Interferon-Gamma- Gen (im folgenden als "HuIFN-γ" bezeichnet) in 3Y1-Zellen der Ratte unter Verwendung von pF1900M eingebracht, um eine Serie von HuIFN-γ ausprägenden I-Zellenlinien (I6, I7, I25 und I26) zu erstellen. Unter Verwendung dieser Zellenlinien wurden das Niveau des hergestellten HuIFN-γ in einem serumfreien oder serumarmen Medium, das Ausprägungsniveau der mRNA, der Existenzzustand des in das Genom der Zelle eingeführten Gens und das erzeugte HuIFN-γ untersucht.
Mit den analytischen Ergebnissen wurden die folgenden fünf Punkte bestätigt. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde gezeigt, daß es nützlich ist, Säugetierzellentransformanten zu kultivieren, in die ein Strukturgen unter Verwendung des Transduktionsvektors pF1900M eingebracht wurde, um so das Genprodukt herzustellen.
(i) Die Menge des durch den Säugetierzellentransformanten, in den ein Strukturgen unter Verwendung des Transduktionsvektors pF1900M eingebracht wurde, hergestellten Genproduktes, wobei der Transformant einfach in einer einzelnen Schicht kultiviert wird, ist größer als die Menge des Genproduktes, die durch Kultivieren der konventionellen Säugetierzellentransformanten erhalten wird.
(ii) Die Menge des Genproduktes, das durch den Säugetierzellentransformanten hergestellt wurde, in den ein Strukturgen unter Verwendung des Transduktionsvektors pF1900M eingebracht wurde, wird vergrößert, indem das Wachstum der Zellen unterbrochen wird.
(iii) Die Menge des Genproduktes, das durch den Säugetierzellentransformanten hergestellt wurde, in den ein Strukturgen unter Verwendung des Transduktionsvektors pF1900M eingebracht wurde, hängt von der Aktivität des FN-Verstärkers und des FN-Aktivators zum Ausprägen der mRNA des Strukturgens ab.
(iv) In dem Säugetierzellentransformanten, in den ein Strukturgen unter Verwendung des Transduktionsvektors pF1900M eingebracht wurde, sind etwa 3 bis 6 Kopien des eingeführten Gens erhalten.
(v) Das Genprodukt, das durch den Säugetierzellentransformanten hergestellt wurde, in den ein Strukturgen unter Verwendung des Transdukfionsvektors pF1900M eingebracht wurde, ähnelt den natürlich auftretenden Genprodukten im Bezug auf die Modifikationen durch Zuckerketten und dergleichen.
Die konkreten Verfahren und Ergebnisse der Analyse werden im folgenden beschrieben.
(5)-1 Einbringen von HuIFN-γ-cDNA in Flußrichtung unterhalb des FN-Verstärkers und des FN-Aktivators pF1900M (Herstellung von pF1900γ)
Plasmid pF1900M wurde mit Eco RV verdaut, und ein Bgl-II-Linker wurde eingeführt, worauf mit Bgl II verdaut wurde, wodurch ein Vektorfragment erhalten wurde. Dann wurde HuIFN-γ-CDNA, die von Dr. Shigekazu OSADA, Leiter des "Molecular Biology Department in Bioscience Research", Osaka University dargestellt wurde, an den Sau-3AI-Stellen, die an der 50. und 892. Base, von der Transkriptionsanfangsstelle der mRNA gerechnet, angeordnet sind, aufgetrennt (Gray et al., Nature (London) 295, 503 bis 508 (1982)), und die erhaltenen DNA- Fragmente wurden an das pF1900M-Vektorfragment angelagert. Das Plasmid, in dem das 5'-Ende der HuIFN-γ-CDNA in Nachbarschaft des 3'-En des des FN- Aktivators auftritt, wurde ausgewählt, um ein HuIFN-γ ausprägendes Plasmid pF1900γ zu erhalten.
(5)-2 Errichten der das HuIFN-γ produzierenden Zellenlinien 16, I7, I25 und I26
Etwa 5×10&sup5; 3Y1-Zellen wurden in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 8 cm verteilt, und die Zellen wurden über Nacht kultiviert. Den 3Y1-Zellen wurden 20 µg pF1900γ, das im vorhergehenden Abschnitt hergestellt wurde, und 2 µg eines medikamentenbeständigen, genausprägenden Plasmides pSV2neo 4 h lang mit Hilfe des Verfahrens unter Verwendung der gemeinsamen Fällung mit Calciumphosphat (Chen et al., Molecular and Cellular Biology, 7, 2745 bis 2752 (1987)) verabreicht. Nach der Verabreichung wurden die 3Y1-Zellen im Medium nach Eagle mit der Modifikation von Dulbecco (Dulbecco's modified Eagle medium), das 10 Vol.-% Kalbsfötenserum (FCS) (im folgenden als "10%FCS-DMEM" bezeichnet) enthielt, 48 h lang kultiviert, und dann wurden die Zellen in vier frische Petrischalen verteilt. Nach dem erneuten Verteilen wurden die Zellen etwa zwei Wochen lang auf 10%FCS-DMEM kultiviert, das 300 µg/ml G418 (Geneticin) enthielt. Die hervorgebrachten Kolonien wurden unter Verwendung eines Klonierkelches (doning cup) isoliert und auf 10%FCS-DMEM, das 300 µg/ml G418 (Geneticin) enthielt, kultiviert. Nach der etwa vier Wochen dauernden Zweitkultur wurde das Medium gegen 10%FCS-DMEM, das kein G418 (Geneticin) enthielt, ausgetauscht, und die Zellen wurden nochmals subkultiviert, wodurch die I-Zellenlinie erhalten wurde.
Der Überstand (die überstehende Flüssigkeit) der Kultur einer jeden der erhaltenden I-Zellenlinien wurde gesammelt und das HuIFN-γ-Niveau darin durch das Antivirusassay gegen den Mengo-Virus bestimmt. Das heißt, in die Vertiefungen einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen wurden menschliche FL-Zellen in einer Menge von 5×10&sup4; Zellen pro Vertiefung gegeben, und 100 µl 5%FCS-DMEM und 45 µm in Serie verdünntes Standard-HuIFN-γ oder der gesammelte Überstand der Kultur der I-Zellenlinie wurden in jede Vertiefung gegeben, worauf 24 h lang kultiviert wurde. Zu jeder Vertiefung wurden 1×10&sup5; Einheiten Mengo- Viren gegeben und die Zellen wurden weitere 24 h lang kultiviert. Danach wurde der Überstand verworfen, und die Zellen in den Vertiefungen wurden mit Kristallviolett gefärbt. Aus der Konzentration des HuIFN-γ, die für die FL-Zellen erforderlich ist, um antivirale Aktivität zu entwickeln, und der Verdünnung des Überstandes der I-Zellenlinie, die eine vergleichbare Aktivität aufwies, wurde das HuIFN-γ-Niveau im Überstand berechnet.
Unter den 1-Zellenlinien wurden die I6-, I7-, I25- und I26-Zellenlinien ausgewählt, die die größte Produktionsmenge an HuIFN-γ im den Uberstand der Kultur abgaben, und für die im folgenden beschriebenen Untersuchungen verwendet.
(5)-3 Einflüsse des Kultivierungsverfahrens auf die HuIFN-γ-Produktion duroh I-Zellenlinien
In einer Petrischale mit einem Durchmesser von 5 cm wurden 2×10&sup5; Zellen der Linien I6, I7, I25 und I26 verteilt (1×10&sup4; Zellen/cm²), und die Zellen wurden in 4 ml 10%FCS-DMEM 3 Tage lang kultiviert. Das Medium wurde dann gegen 4 ml frisches Medium mit der gleichen Zusammensetzung ausgetauscht und die Kultivierung wurde weitere 2 Tage lang fortgesetzt. Die Zellen, die an der Petrischale hafteten, wurden zweimal mit PBS- gewaschen und dann in 4 ml DMEM, das kein FCS enthielt, (0%FCS-DMEM) kultiviert. Das Medium wurde erneut gegen 4 ml 0%FCS-DMEM ausgetauscht, und die Zellen wurden weitere 5 Tage lang kultiviert. Während dieser Kultivierung wurde die Zellenzahl und das HuIFN-γ-Niveau (Titer der antiviralen Aktivität) im Uberstand der Kultur für jede I-Zellenlinie gemessen. Die Ergebnisse sind Fig. 13 dargestellt. Die Anzahl der Zellen sind durch die schwarzen Punkte und die durchgezogene Linie bezeichnet, und das HuIFN-γ-Niveau im Überstand der Kultur ist durch das graue Balkendiagramm dargestellt. Der schwarze Pfeil bezeichnet den Austausch des Mediums gegen (0%FCS-DMEM, und der weiße Pfeil bezeichnet den Austausch des Mediums gegen 0%FCS-DMEM. Für alle Zellenlinien galt, daß sich die Zellen innerhalb von etwa 5 Tagen vom Beginn der Kultivierung bis zum Zusammenfließen vermehrten (1 bis 1,2×10&sup6; Zellen/Schale (5 bis 6×10&sup4; Zellen/cm²)) und sich innerhalb von 5 Tagen nach Wechseln des Mediums auf 0%FCS-DMEM auf 8×10&sup5; Zellen/Schale (4×10&sup4; Zellen/cm²) verringerten. Danach verringerte sich die Zellenmenge 3 Tage lang nicht mehr wesentlich. Das HuIFN-γ-Niveau im Überstand der Kultur stieg in den Zellenlinien 16 und 17 innerhalb eines Tages, nachdem die Zelldichte den Zusammenfluß erreicht hatte, auf etwa 5×10&sup4; Einheiten/ml an. Insbesondere wiesen die 17-Zellen nach dem Absenken der Zellenzahl das maximale Niveau von 4×10&sup5; Einheiten/ml 2 Tage lang auf Die Mengen an HuIFN-γ pro Zelle der Zellenlinien 16 und 17 betrugen im Mittel 0,03 Einheiten/Zelle/Tag beziehungsweise 0,05 Einheiten/Zelle/Tag zwischen dem dritten Tag und dem fünften Tag während der Stufe des Zellwachstums und im Mittel 0,06 Einheiten/Zelle/Tag beziehungsweise 0,12 Einheiten/Zelle/Tag zwischen dem fünften Tag und dem achten Tag, während die Zellen nicht wuchsen (diese Mengen wurden berechnet aus der Menge des innerhalb von 24 h angesammelten HuIFN-γ auf der Grundlage der Hypothese, daß HuIFN-γ sich nicht mit der Zeit zersetzt, sondern sich im Überstand der Kultur ansammelt, und aus der Zellenzahl, die für alle 24 h abgeschätzt wurde).
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde gefunden, daß die Produktionsfähigkeit von HuIFN-γ wenigstens in den Zellenlinien 16 und 17 verdoppelt wird. Diese Ergebnisse stimmen überein mit den Ergebnissen der CAT-Assays, die zeigen, daß die Aktivität des FN-Aktivators in ruhenden 3Y1-Zellen auf das etwa 2- bis 5fache des Wertes in wachsenden Zellen vergrößert ist (Fig. 6B).
(B) Einfluß der FCS-Konzentration im Medium auf die HuIFN-γ-Produktion
I7-Zellen wurden in Petrischalen mit einem Durchmesser von 8 cm verteilt mit einer Populationsdichte von 5×10&sup5; Zellen/Schale (1×10&sup5; Zellen/cm²), und die Zellen wurden 3 Tage lang in 10 ml/Schale 10 Vol.-% FCS-DMEM kultiviert. Das Medium wurde dann durch frisches Medium mit der gleichen Zusammensetzung ersetzt, und die Zellen wurden weitere 3 Tage lang kultiviert. So wurden die Zellen insgesamt 6 Tage lang kultiviert, wodurch die Zellen den Zusammenfluß (6×10&sup4; Zellen/cm²) erreichten. Am sechsten Tag, vom Beginn der Kultivierung aus gerechnet, wurde die Probennahme begonnen (Tag 0). Das heißt, 100 µl des Überstan des der Kultur wurde von jeder Petrischale abgenommen, und die Proben wurden bei 4ºC gelagert. Die Petrischalen wurden in zwei Gruppen einge teilt. Nach zweimaligem Waschen der Petrischalen mit PBS- wurden 10 ml 10%FCS-DMEM zu jeder der Petrischalen der einen Gruppe und 10 ml 0%FCS- DMEM zu jeder der Petrischalen der anderen Gruppe gegeben. Die Zellen wurden 10 Tage lang kultiviert, ohne das Medium zu wechseln. An den Tagen 1, 2, 3, 4, 6, 8 und 10 wurden jeweils 100 µl des Überstandes der Kultur von jeder der Petrischalen gesammelt, und die Proben wurden bei 4ºC gelagert. Die HuIFN-γ- Niveaus (Titer der antiviralen Aktivität) der Proben wurden gemessen und sind in Fig. 14A dargestellt.
Im Überstand des Kulturmediums am Tag 0 (das heißt, des Kulturmediums, in dem die Zellen 3 Tage lang in 10 ml 10%FCS-DMEM kultiviert wurden) betrug das HuIFN-γ-Niveau 1×10&sup5; Einheiten/ml (schwarze Balken im Diagramm). In der Gruppe von Zellen, die weiter in 10 ml 10%FCS-DMEM kultiviert wurden, betrug das HuIFN-γ-Niveau im Überstand 1×10&sup5; Einheiten/ml an Tag 1 und 5×10&sup5; Einheiten/ml an Tag 2 und danach. Es wird angenommen, daß der Grund dafür, daß sich das HuIFN-γ-Niveau nach Tag 2 nicht änderte, darin liegt, daß die Produktion und die Abgabe von HuIFN-γ und die Adsorption und die Zersetzung von HuIFN-γ ein Gleichgewicht erreichten.
Auf der anderen Seite zeigte die Gruppe, zu der 10 ml 0%FCS-DMEM gegeben worden waren, ein HuIFN-γ-Niveau von 1×10&sup4; Einheiten/ml an Tag 1, 1×10&sup5; Einheiten/ml an Tag 2 und 5×10&sup5; Einheiten/ml an Tag 3 und danach (weiße Balken im Diagramm).
Mikroskopische Untersuchungen ergaben, daß in beiden Gruppen die Populationsdichte an Tag 10 kleiner war als an Tag 0, daß aber ein Schrumpfen der Zellen und gemeinsames Abschälen der Zellen nicht beobachtet werden konnte.
Diese Ergebnisse zeigen, daß (b) die Ausprägung von HuIFN-γ durch den FN- Verstärker und den FN-Aktivator von pF1900M nicht wesentlich durch die FCS- Konzentration, die im Medium zur Kultivierung der Zellen erhalten ist, beeinflußt wird, und daß (c) die Ausprägung von HuIFN-γ durch den FN-Verstärker und den FN-Aktivator von pF1900M gefördert wird, wenn die Populationsdichte den Zusammenfluß erreicht und so die Vermehrung der Zellen unterbrochen wird.
(C) Änderung der Konzentration des produzierten HuIFN&sub1;, wenn das Medium jeden zweiten Tag ersetzt wird
I7-Zellen wurden in Petrischalen mit einem Durchmesser von 8 cm verteilt mit einer Pop ulationsdichte von 5×10&sup5; Zellen/Schale (1×10&sup5; Zellen/cm²), und die Zellen wurden 3 Tage lang in 10 ml 10%FCS-DMEM kultiviert. Das Medium wurde dann durch frisches Medium mit der gleichen Zusammensetzung ersetzt, und die Zellen wurden weitere 3 Tage lang kultiviert. So wurden die Zellen insgesamt 6 Tage lang kultiviert, wodurch die Zellen den Zusammenfluß (6×10&sup4; Zellen/cm²) erreichten. Am sechsten Tag, vom Beginn der Kultivierung aus gerechnet, wurde die Probennahme begonnen (Tag 0). Das heißt, 100 µl des Überstandes der Kul tur wurde von jeder Petrischale abgenommen, und die Proben wurden bei 4ºC gelagert. Die Petrischalen wurden in drei Gruppen eingeteilt. Nach zweimaligem Waschen der Petrischalen mit PBS- wurden 10 ml 10%FCS-DMEM zu jeder der Petrischalen der ersten Gruppe, 10 ml 0,5%FCS-DMEM zu jeder der Petrischalen der zweiten Gruppe und 10 ml 0%FCS-DMEM zu jeder der Petrischalen der dritten Gruppe gegeben. Die Zellen wurden 10 Tage lang kultiviert, wobei die Medien jeden zweiten Tag gegen jeweils 10 ml frisches Medium mit der gleichen Zusammensetzung ausgetauscht wurden. Jedes Mal, wenn das Medium gewechselt wurde, wurde der Überstand des alten Kulturmediums abgenommen und bei 4ºC gelagert. Die HuIFN-γ-Niveaus (Titer der anfiviralen Aktivität) der Proben wurden gemessen und sind in Fig. 14B dargestellt.
Im Überstand des Kulturmediums am Tag 0 (das heißt, des Kulturmediums, in dem die Zellen 3 Tage lang in 10 ml 10%FCS-DMEM kultiviert wurden) betrug das HuIFN-γ-Niveau 5×10&sup5; Einheiten/ml (schwarze Balken im Diagramm). In der ersten Gruppe von Zellen, zu der 10 ml 10%FCS-DMEM gegeben wurden (schwarze Balken im Diagramm), und in der zweiten Gruppe von Zellen, zu der 10 ml 0,5%FCS-DMEM gegeben wurden (graue Balken im Diagramm), betrug das HuIFN-γ-Niveau im Überstand 5×10&sup5; Einheiten/ml bei jeder Messung bis zum Tag 10. In der dritten Gruppe, zu der 10 ml 0%FCS-DMEM gegeben wurden, sank das HuIFN-γ-Niveau, obwohl es bis zum Tag 6 5×10&sup5; Einheiten/ml betragen hatte, auf 1×10&sup5; Einheiten/ml an Tag 8 und an Tag 10 (weiße Balken im Diagramm).
Mikroskopische Untersuchungen ergaben, daß in der ersten und zweiten Gruppe, zu der Medien mit 10 Vol.-% beziehungsweise 0,5%FCS-DMEM gegeben wurden, die Populationsdichten an Tag 10 nur geringfügig kleiner waren als an Tag 0. In der dritten Gruppe allerdings, zu der 0%FCS-DMEM gegeben wurde, wurde beobachtet, daß am Tag 6 oder danach einige Zellen starben oder schrumpften oder sich gemeinsam abschalten.
Diese Ergebnisse zeigen, daß (d) die Konzentration des produzierten HuIFN-γ bei 5×10&sup5; Einheiten/ml gehalten werden kann, was das maximale Niveau darstellt, selbst wenn das Medium jeden zweiten Tag ersetzt wird, daß (e) das Produktionsniveau von HuIFN-γ nicht von der FCS-Konzentration abhängt und daß (f), wenn das DMEM jeden zweiten Tag ersetzt wird, etwa 0,5 Vol.-% FCS zugegeben werden sollten, um die Zellen zu erhalten.
Die Ergebnisse dieses Abschnittes ((5)-3) zeigen, daß die Menge des von den 17- Zellen hergestellten HuIFN-γ in einer einfachen Einschichtkultur in einem serumarmen Medium größer ist als die Menge des HuIFN-γ, die durch das Kultivieren von Säugetierzellentransformanten erhalten werden kann (E. Sano et al. in "Biotechnology of Mammalian Cells" (Biotechnologie der Säugetierzellen) (M. Umeda et al., Hrsg.), S.149 bis 162, Japan Scientific Societies Press, Tokyo (1987); R. Fukunaga et al., Proceedings of the National Academy of Science USA, 81, 5086 bis 5090 (1984)).
(5)-4 Zustand der Ausprägung von HuIFN&sub1;-mRNA in 1-Zellenlinien
Der Zustand der Ausprägung von HuIFN-γ-mRNA in 1-Zellenlinien wurde mit dem Northern-Blot-Hybridisierungsverfahren analysiert. Zuerst wurde aus allen Zellenlinien 3Y1, I6, I7, I25 und I26 die Gesamt-RNAs mit dem Säure-Guanidin- Phenol-Chloroform-Verfahren (AGPC-Verfahren) extrahiert (1). Chomczynski und N. Sacchi, Analytical Biochemistry, 162, 156 bis 159 (1987)). Die Details der Verfahrensweise werden im folgenden beschrieben.
Zellen der Linien 3Y1, I6, I7, I25 und I26 wurden in Petrischalen aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 80 mm bis zu einer Populationsdichte von 3×10&sup6; Zellen/Schale kultiviert (Zusammenfluß), wobei die Anzahl der Petrischalen für jede Zellenlinie 30 betrug. Die Petrischalen für jede Zellenlinie wurden in zwei Gruppen eingeteilt (Gruppen A und B, jeweils 15 Schalen). Nach zweimaligem Waschen der Zellen mit PBS- wurden die Petrischalen der Gruppe A der Herstellung von mRNA unterworfen. Zu den Petrischalen der Gruppe B wurden jeweils 10 ml 0%FCS-DMEM gegeben, und die Zellen wurden weitere 48 h lang kultiviert, um das Zellwachstum vollständig zu stoppen. Danach wurden die Petrischalen der Gruppe B der Herstellung der RNA unterworfen. Die Herstel lung der RNA wurde mit folgendem Verfahren durchgeführt (AGPC-Verfahren):
Die Zellen, die zweimal mit kaltem PBS- gewaschen worden waren (in dem Zustand, in dem sie an den Petrischalen hafteten), wurden mit "Rubber Policeman" abgeschält, und die Zellen wurden Gruppe für Gruppe (15 Schalen pro Gruppe) in einer Falcon#2070-Röhre gesammelt. Die Proben wurden dann bei 1200 x g 5 min lang zentrifugiert, und das PBS- wurde durch Absaugen entfernt. Zur sich ergebenden Fällung der Zellen wurden 1 ml Denaturierlösung gegeben (4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, pH 7, 0,1 M β-Mercaptoethanol und 0,5 Gew.-% N-Lauroylsarcosin (Sarkosyl)). Die Mischung wurde durch wiederholtes Ausspritzen und Einsaugen durch eine Nadel mit Durchmesser 18 unter Verwendung einer 1-ml-Einmalspritze (kommerziell erhältlich von Terumo Corporation, Tokyo, Japan) homogenisiert, bis die Mischung ihre Viskosität verlor. Zum Homogenisat wurden 0,1 ml 2 M Natriumacetat, pH 4, 1 ml wassergesättigtes Phenol und 0,2 ml Chloroform gegeben, und die sich ergebende Mischung wurde mit Hilfe eines Vortexmischers heftig gerührt. Die sich ergebende Mischung wurde in Eis 15 min lang inkubiert und dann in zwei 1,5 ml fassende Zentrifugenröhrchen gegossen (kmmerziell erhältlich von Eppendori). Die Mischung wurde bei 12000 x g und 4ºC 15 min lang zentrifugiert. Die abgetrennte, waßrige Schicht wurde in ein neues Zentrifugenröhrchen übertragen und mit dem zweifachen Volumen Isopropanol versetzt. Die sich ergebende Mischung wurde bei -20ºC über Nacht inkubiert, um RNAS zu fällen. Die Mischung wurde bei 12000 x g und 4ºC 15 min lang zentrifugiert und der Überstand wurde ver worfen. Die Fällung wurde in 300 µl der Denaturierlösung gelöst, und die Mischung wurde dann 2 min lang zentrifugiert, um die unlöslichen Materialien zu entfernen. Der Überstand wurde in ein neues Zentrifugenröhrchen übertragen und mit einem gleichen Volumen Isopropanol versetzt. Die sich ergebende Mischung wurde bei -20ºC über Nacht inkubiert, um RNAS zu fällen, und dann bei 12000 x g und 4ºC 15 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die Fällung wurde mit 75 Vol.-% Ethanol gespült. Die Fällung wurde im Vakuum 2 min lang getrocknet und dann in 25 µl TE gelöst, um eine RNA-Lösung zu erhalten. Die RNA-Konzentration wurde bestimmt durch Messen der Extinktion bei 260 nm (O.D. 260) einer Lösung, die hergestellt wurde durch Verdünnen von 3 µl der RNA-Lösung mit TE auf 600 µ (das heißt, 200fache Verdünnung), und berechnet aus dem gemessenen Wert (X) gemäß der folgenden Gleichung:
RNA-Konzentration (µg/µl)= λ × 40 × 200 ÷ 1000
(worin 1 O.D.-260-Einheit = 40 µg/ml)
Die extrahierte RNA wurde durch Northern-Blot-Hybridisierung analysiert. Die Details der Verfahrensweise sind die folgenden:
Zu jeweils 20 µg der RNA, die aus den Zellenlinien 3Y1, I6, I7, I25 oder I26 extrahiert wurde, wurde Wasser bis zu einem Volumen von 4,5 µl zugegeben. Zur sich ergebenden Mischung wurden 2 µl eines 10×MOPS Elektrophoresepuffers (einer Mischung aus 200 mM Natrium-3-(N-morpholino)-propansulfonat, pH 7, 80 mM Natriumacetat und 10 mM EDTA, pH 8,0), 3,5 µl 12,3 M Formaldehyd und 10 µl Formamid zugegeben, und die sich ergebende Mischung wurde gut gerührt. Das sich ergebende Material wurde 15 min lang auf 65ºC erhitzt, um die RNAs zu denaturieren Zur denaturierten RNA-Lösung wurden 5 µl 6 x Probenpuffer (6 x Formaldehyd-Ladepuffer (eine Mischung aus 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,25 Gew.-% Bromphenolblau (BPB), 0,25 Gew.-% Xylolcyanol und 50 Vol.-% Glycerin)) zugegeben, und die sich ergebende Mischung wurde der Elektrophorese in Agarose- Formalin-Gel (einer Mischung aus 1,2 Gew.-% Agarose, 2,2 M Formaldehyd, 20 mM MOPS, pH 7, 8 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA, pH 8,0) und einem 1 x MOPS-Elektrophoresepuffer bei einer Dichte des elektrischen Feldes von 4 V/cm 4 h lang unterworfen (der Abstand des Bromphenolblaus nach der Elektrophorese von der Originalposition (MBPB) = 11 cm). Die aufgetrennten RNAs wurden auf eine Nylonmembran (Hybond N+, kommerziell erhältlich von Amersham) transkribiert unter Verwendung einer absaugenden Transkriptionsvorrich tung (VacuGene, kommerziell erhältlich von Pharmacia-LKB) bei einem Absaugdruck (VP) von 40 mmh2o, um einen Northern-Blot herzustellen.
Der Northern-Blot wurde in einer Hybridisierungsreaktionslösung (einer Mischung aus 50 Vol.-% Formamid, 5 x SSC (SSC bedeutet 150 mM NaCl / 15 mM Natriumcitrat), 5 x Lösung nach Denhalt (0,02 Gew.-% Ficoll 400 /0,02 Gew.-% Polyvinylpyrrolidon /0,02 Gew.-% Rinderserumalbumin (BSA)), 0,5 Gew.-% SDS, 0,2 mg/ml hitzedenaturierter Heringsperma-DNA) bei 42ºC 4 h lang durchgeführt. Dann wurde eine HuIFN-γ-CDNA-Sonde (1×10&sup9; cpm/µg) oder eine Rattenβ-Actin-CDNA-Sonde (1×10&sup9; cpm/µg), die mit Hilfe des Verfahrens mit zufälligem Starter mit ³²P markiert war, in einer Menge von 5×10&sup5; cpm/ml zugegeben. Das sich ergebende Material wurde dann bei 42ºC weitere 18 h lang inkubiert. Die überschüssige Hybridisierungsreaktionslösung, die am Northern-Blot haftete, wurde durch zweimaliges, 10 min langes Waschen des Blots in 2 x SSC bei Raumtemperatur, zweimaliges, 20 min langes Waschen in 2 x SSC / 0,1 Gew.-% SDS bei 42ºC und einmaliges, 20 min langes Waschen in 0,2 x SSC / 0,1 Gew.-% SDS bei 42ºC entfernt. Der gewaschene Northern-Blot wurde mit "Saranwrap" (Paraffinwachsfolie) (kommerziell erhältlich von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) eingewickelt, und die Mengen der RNA-Moleküle und ihre Länge, mit der die Sonden spezifisch hybridisierten, wurden analysiert unter Verwendung eines "Bioimage Analyser BAS2000 System" (kommerziell erhältlich von Fuji Photo Film).
Die nachgewiesenen Banden der mRNA von HuIFN-γ (IFN-y) und von Ratten-β- Actin (β-Actin) sind in Fig. 15A beziehungsweise Fig. 15B dargestellt. Im oberen Teil des Blots sind die Zellenlinie und die Gruppe für jede Spur dargestellt. Auf der linken Seite des Blots sind die Positionen der ribosomalen RNAs mit 28S und 18S, die in der RNA-Probe enthalten sind, bezeichnet und die Namen der Sonden sind auf der rechten Seite des Blots ausgewiesen. Die Tatsache, daß die Unterschiede der Dichten der Banden des Ratten-β-Actins bei allen Zellenlinien und Gruppen Mein sind (Fig. 15B), zeigt an, daß die Mengen der RNA-Proben, die in allen Spuren aufgebracht wurden, fast einheitlich sind. So spiegeln die Unterschiede der Dichten der Banden der mRNA von HuIFN-γ (Fig. 15A) die Unterschiede der Ausprägungsniveaus des HuIFN-γ-Gens wider.
Wie in Fig. 15A dargestellt, wurde die mRNA von HuIFN-γ als einzelne Bande in allen Zellenlinien mit Ausnahme der Ursprungszellenlinie 3Y1 nachgewiesen. Die Positionen der Banden liegen in der Nachbarschaft der niedermolekularen Seite der ribosomalen RNA mit 185 und fallen im wesentlichen mit der Position der Bande der mRNA von HuIFN-γ des menschlichen Lymphocyten zusammen, die von P. W. Gray et al., Nature (London) 295, 503 bis 508 (1982) berichtet wurde. Was die Zellenlinien 16, 17 und 126 betrifft, waren die Ausprägungsniveaus der mRNA von HuIFN-γ etwa gleich groß, wenn die Populationsdichte den Zusammenfluß erreichte (3×10&sup6; Zellen/Schale, Gruppe A). Weiter betrugen bei diesen Zellenlinien die Ausprägungsniveaus von HuIFN-γ, wenn das Zellwachstum völlig gestoppt war, indem die Zellen in 0%FCS-DMEM weitere 48 h lang kultiviert wurden (Gruppe B), das 1,5fache, 5fache und 3fache der Ausprägungsniveaus von Gruppe A. Das Ausprägungsniveau von mRNA von HuIFN-γ bei I25 war sowohl in Gruppe A als auch in Gruppe B niedrig, betrug nämlich das 0,2fache und das 0,3fache des Ausprägungsniveaus von Gruppe A der Zellenlinie I7.
Die Ergebnisse dieses Abschnittes entsprachen den Ergebnissen von Abschnitt (5)-3 (das heißt, die HuIFN-γ-Produktionen der I-Zellenlinien steigen an, nachdem das Zellwachstum gestoppt wurde). Deshalb ist es offensichtlich, daß die Menge an HuIFN-γ, die von den 1-Zellenlinien produziert wird, von der Ausprägungsaktivität des FN-Verstärkers und des N-Aktivators abhängt.
(5)-5 Existenzzustand von in die I-Zellenlinien eingeführter pf1900M-DNA
Die Existenzzustände der pF1900M-DNAs, die in die 1-Zellenlinien eingeführt wurden, wurden mit dem Southern-Blot-Hybridisierungsverfahren analysiert.
Zuerst wurden große Genom-DNAs aus den Zellenlinien 3Y1, I6, I7, I25 und I26 abgetrennt. Die Details dieser Verfahrensweise sind die folgenden:
Zellen der Linien 3Y1, I6, I7, I25 und I26 wurden in Petrischalen aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 80 mm bis zu einer Populationsdichte von 3×10&sup6; Zellen/Schale (Zusammenfluß) kultiviert, wobei die Anzahl der Petrischalen für jede Zellenlinie 10 betrug. Die Zellen wurden dann zweimal mit 10 ml/Schale PBS- gewaschen und mit 1 ml/Schale einer Mischung aus 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,4 Gew.-% Natriumdodecylsulfat (SDS), die 1 mg/ml Rinderpankreasproteinase K (kommerziell erhältlich von Sigma) enthält, (eine solche Lösung wird im folgenden als "Proteinase-K-Lösung" bezeichnet) lysiert. Das Zellenlysat wurde in Zentrifugenröhrchen mit Schraubkappen aus Kunststoff mit 50 ml Inhalt gesammelt und bei 60ºC 15 min lang und dann bei 37ºC über Nacht inkubiert, während die Schale langsam umgedreht wurde. Am nächsten Tag wurden 3 ml einer Proteinase-K-Lösung, die 10 ml/min Proteinase K enthielt, zu jedem Zentrifugenröhrchen zugegeben, und die sich ergebende Mischung wurde bei 60ºC 15 min lang und dann bei 37ºC zwei Nächte lang inkubiert, während die Schale langsam umgedreht wurde, um die proteinartigen Komponenten in den Zellen zu zersetzen. Nach der Inkubation wurde das Zellenlysat sechsmal mit einer Mischung aus salzgesättigtem Phenol (ss-Phenol) und Chloroform im Mischungsverhältnis von 1:1 und zweimal mit Chloroform extrahiert, und die Wasserschichten wurden abgetrennt. Bei den Extraktionsoperationen wurden die flüssigen Schichten sanft gemischt, so daß die DNAs mit großem Molekulargewicht nicht geschnitten wurden. Zur wäßrigen Schicht wurde 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 7,4, und 2,5 Volumen Ethanol gegeben, um die genomischen DNAs zu fällen. Die DNAs wurden mit der Spitze eines "Pipetteman" abgehoben und mit 5 ml 80%igem Ethanol gespült. Nach 5 min langem Trocknen der DNAs in Luft wurden sie in 5 ml einer Mischung aus 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, und 0,5 mM EDTA-Lösung (TE) bei 37ºC erneut gelöst. Es bedurfte einer Nacht, um die DNAs wieder zu lösen. Danach wurden 100 µl einer Ribonuklease A (RNase A) mit einer Konzentration von 10 mg/ml zugegeben, und die sich ergebende Mischung wurde bei 37ºC 1 h lang inkubiert, um die RNAs in der Lösung zu zersetzen. Das sich ergebende Material wurde sanft mit 5 ml einer Mischung aus salzgesättigtem Phenol und Chloroform im Mischungsverhältnis von 1:1 extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und erneut mit Chloroform extrahiert. Nach Abtrennen der wäßrigen Schicht wurden 0,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 7,4, und 13 ml Ethanol zugegeben, und die Mischung wurde gerührt. Die ausgefällten DNAs wurden mit 80%igem Ethanol gespült und an der Luft 5 min lang getrocknet, worauf in 2 ml TE gelöst wurde, um eine Lösung der genomischen DNA zu erhalten. Die DNA- Konzentration wurde bestimmt, indem das O.D. 260 einer Lösung gemessen wurde, die hergestellt wurde durch Verdünnen von 50 µl der DNA-Lösung mit TE auf 1 ml, und die DNA-Konzentration aus dem gemessenen Wert (Y) gemäß der folgenden Gleichung berechnet wurde:
DNA-Konzentration (µg/µl) = Y × 50 × 20 ÷ 1000
(worin 1 O.D.-260-Einheit = 50 µg/ml)
Die so erhaltenen, hochmolekularen, genomischen DNAs wurden mit dem Restriktionsenzym Bgl II verdaut, und der Existenzzustand der pF1900M-DNA, die in das Genom eingeführt worden war, wurde wie folgt durch das Squthern-Blot- Hybridisierungsverfahren analysiert:
Jeweils 40 µg der Lösung der genomischen DNA einer jeden Zellenlinie wurden vollständig mit 80 Einheiten Bgl II (kommerziell erhältlich von New England Biolabs) verdaut, und das sich ergebende Material wurde einer Gelelektrophorese mit 0,5 Gew.-% Agarose im TBE-Puffer bei einer Dichte des elektrischen Feldes von 7,5 V/cm 4 h lang unterworfen (der Abstand des Bromphenolblaus nach der Elektrophorese von der Originalposition (MBPB) = 15 cm). Die aufgetrennten DNAs wurden auf eine Nylonmembran (Hybond N+, kommerziell erhältlich von Amersham) transkribiert unter Verwendung einer absaugenden Transkriptionsvorrichtung (VacuGene, kommerziell erhältlich von Pharmacia-LKB) bei einem Absaugdruck (VP) von 40 mmH&sub2;O, um einen Southern-Blot herzustellen.
Der Southern-Blot wurde in einer Hybridisierungsreaktionslösung (einer Mischung aus 50 Vol.-% Formamid, 5 x SSC, 5 x Lösung nach Denhalt, 0,5 Gew.-% SDS, 0,2 mg/ml hitzedenaturierter Heringsperma-DNA) bei 42ºC 4 h lang inkubiert. Dann wurde eine HuIFN-γ-CDNA-Sonde (1×10&sup9; cpm/µg), die mit Hilfe des Verfahrens mit zufälligem Starter mit ³²P markiert war, in einer Menge von 5×10&sup5; cpm/ml zugegeben. Das sich ergebende Materiaiwurde dann bei 42ºC weitere 18 h lang inkubiert. Die überschüssige Hybridisierungsreaktionslösung, die am Southern-Blot haftete, wurde durch zweimaliges, 10 min langes Waschen des Blots in 2 x SSC bei Raumtemperatur, zweimaliges, 20 min langes Waschen in 2 x SSC / 0,1 Gew.-% SDS bei 42ºC und einmaliges, 20 min langes Waschen in 0,2 x SSC / 0,1 Gew.-% SDS bei 42ºC entfernt. Der gewaschene Southern-Blot wurde mit "Saranwrap" (Paraffinwachsfolie) (kommerziell erhältlich von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) eingewickelt, und die Mengen der RNA-Moleküle und ihre Länge, mit der die Sonden spezifisch hybridisierten, wurden analysiert unter Verwendung eines "Bioimage Analyser BAS2000 System" (kommerziell erhältlich von Fuji Photo Film).
Die Existenzzustände von pF1900M-DNA im Southern-Blot sind in Fig. 16 dargestellt. Die Zellenlinien, aus denen die genomischen DNAs extrahiert wurden, sind in oberen Bereich des Blots für jede Spur bezeichnet, und die Positionen der Markierungsmittel für die DNA-Länge, die im gleichen Gel elektrophoretisiert wurden, sind im linken Teil des Blots bezeichnet. Der Pfeil im rechten Teil des Blots bezeichnet die Position einer linearen pF1900M-DNA (die Einheitskettenlänge der pF1900M-DNA), die hergestellt wurde, indem pF1900M an einer Stelle mit Bgl II zerschnitten wurde.
Für alle Zellenlinien mit Ausnahme der Ursprungszellenlinie 3Y1 wurden Banden, die die spezifische Hybridisierung mit den Sonden zeigten, beobachtet. Die Zahl der Banden in den Zellenlinien I6, I7, I25 und I26 lauten 3, 6, 8 beziehungsweise 7. In diesen 1-Zellenlinien bezeichnet die Bande der größten Kopienzahl die Einheitskettenlänge der pF1900M-DNA, die 6 Kopien für 17 und 3 Kopien für die anderen Zellenlinien beträgt. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die pF1900M-DNA, die in die Ursprungszellenlinie 3Y1 eingeführt wurde, in die genomischen DNA der Zelle eingebracht wurde, wobei sie im wesentlichen die volle Länge beibehielt.
(5)-6 von 1-Zellenlinien hergestelltes HuIFN-γ-Protein
Natürlich auftretendes HuIFN-γ besitzt ein Molekulargewicht etwa 23 bis 25 kd (Y. K. Yip et al., Proceedings o[ the National Academy of Science USA, 79, 1820 bis 1824 (1982)), und der Peptidbereich davon, der von mRNA kodiert wird, besitzt ein Molekulargewicht von etwa 17,1 kd (1). W. Gray et al., Nature (London) 295, 503 bis 508 (1982)). Die restlichen 5 bis 8 kd bestehen aus Zuckerketten, die an das Peptid durch eine N-Glycosylbindung über einen Asparaginrest gebunden sind. Um das von den 1-Zellenlinien produzierte HuIFN-γ mit dem natürlich auftretenden HuIFN-γ zu vergleichen (1,erichtete Daten), wurde das HuIFN-γ vom Uberstand der Kultur mit einem Immunfällungsverfahren abgetrennt und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die Details der Verfahrensweise werden im folgenden beschrieben.
Das eingesetzte Immunfällungsverfahren war eine Modifikation eines Verfahrens von Harlow et al. (E. Harlow, D. Lane (Hrsg.), "Antibodies; a laboratory manual" (Antikörper, ein Laborhandbuch), 421 bis 470, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)). Als HuIFN-γ-Zellenlinien wurden 16 und 17 eingesetzt, und die Ursprungszellenlinie 3Y1 wurde als Kontrollexperiment eingesetzt.
In Petrischalen mit einem Durchmesser von 50 mm wurden 3Y1-Zellen, 16-Zellen und 17-Zellen bis zu 1,2×10&sup6; Zellen/Schale kultiviert (Ppulationsdichte von 6×10&sup4; Zellen/cm², Zusammenfluß) und dann über Nacht in 0%FCS-DMEM kultiviert. Das Medium wurde verworfen, und die an den Petrischalen Mebenden Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. 5 ml 0%FCS-EMEM ("Eagle's minimum essential medium", minimal notwendiges Medium nach Eagle), das kein Methionin enthielt, und 59 µm (18,6 MBq) eines 7,5 µM[³&sup5;S]-Methionins (41,8 TBq/mmol, New England Nudear, Code Nr. NEG-072) wurden zu jeder Schale zugegeben, und die Zellen wurden bei 37ºC 17 h lang unter 5% CO&sub2; kultiviert. Zu 1 ml des Uberstandes einer jeden Kultur wurden 4 µl normales Kaninchenserum gegeben, und die Mischung wurde bei 4ºC 6 h lang inkubiert. Dann wurden 4 µl SAC-Tabletten (SAC = Staphylococcus aureus Cowan 1) zu jeder Mischung gegeben, und die Bakterienzellen wurden gut suspendiert. Die Mischung wurde in Eis 40 min lang inkubiert und dann bei 12000 x g und 4ºC 5 min lang zentrifugiert, um die Fällung zu entfernen. Zu jedem Überstand wurden 5 µl polyklonale Anti-HuIFN-Antikörper vom Kaninchen (kommerziell erhältlich von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Kode Nr. PIF-3) (7 µg, 850 Neutralisationseinheiten) zugegeben, und die sich ergebende Mischung wurde bei 4ºC 3 h lang inkubiert. Zu jeder sich ergebenden Mischung wurden 20 µl Protein-A- Perlen (Affi-Gel Protein A, kommerziell erhältlich von Biorad, Kode Nr.153- 6153) zugegeben, und das sich ergebende Material wurde bei 4ºC 40 min lang sanft geschaukelt, worauf bei 10000 x g und 4ºC 15 s lang zentrifugiert wurde.
Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Tabletten viermal mit 1 ml kaltem PBS- gewaschen, und die Perlen wurden in 40 µl einer Mischung aus 0,2 M Tris- HCl, pH 7,8, 1 Gew.-% SDS und 100 mM p-Mercaptoethanol suspendiert. Die Suspension wurde bei 85ºC 10 min lang inkubiert, um den Antigen-Antikörper- Komplex aus den Protein-A-Perlen zu dissozlieren. Das sich ergebende Material wurde bei 10000 x g und Raumtemperatur 15 5 lang zentrifugiert und der Überstand gesammelt, um eine Immunfällungsprobe von HuIFN-γ zu erhalten.
Eine Teilmenge der Immunfällungsprobe wurde mit N-Glycanase (Peptid-N&sup4;-(N- acetyl-p-glucosaminyl)asparaginemidase behandelt, einem Enzym, das spezifisch N-Glycosylbindungen auftrennt (kommerziell erhältlich von Genzyme Co., Kode Nr.1472-00), um die Zuckerketten zu entfernen (F. Maley et al., Analytical Biochemistry, 180, 195 bis 204 (1989)).
10 µl der Immunfällungsprobe wurden in kochendem Wasser 5 min lang erhitzt und dann in Eis abgekühlt. Zum sich ergebenden Material wurden 5 µl Nonidet P-40 mit einem Gehalt von 7,5 Vol.-%, 1,2 µl N-Glycanase mit einem Gehalt von 0,25 Einheiten/µl und 13,8 µl Wasser gegeben, und die sich ergebende Mischung wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert. Am nächsten Tag wurden 30 µl 2 x Probenpuffer nach Laemmli (eine Mischung, die aus 2 Gew.-% SDS, 10 Vol.-% Glycerin, 100 mM Dithiothreitol (DTT), 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, und 0,001 Gew.-% Bromphenolblau (BPB) besteht) zugegeben, und das sich ergebende Material wurde 10 min lang gekocht. Das sich ergebende Material wurden der Gelelektrophorese in 16% SDS-Polyacrylamid unterzogen (Konzentriergel: 4,83 Gew.-% Monoacrylamid / 0,17 Gew.-% Bisacrylamid / 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 / 0,1 Gew.-% SDS; Trenngel: 15,4 Gew.-% Monoacrylamid / 0,53 Gew.-% Bisacrylamid / 375 mM Tris-HCl, pH 8,8 /0,1 Gew.-% SDS; Elektrophoresepuffer: 25 mM Tris /250 mM Glycin / 0,1 Gew.-% SDS, pH 8,3; Elektrophoresebedingungen: 100 V, 6 h). Auf der anderen Seite wurden zu 10 µl der Immunfällungsprobe, die nicht mit N-Glycanase behandelt worden war, 10 µl 2 x Probenpuffer nach Laemmli zugegeben, und das sich ergebende Material wurde 10 min lang gekocht. Das sich ergebende Material wurde als Kontrolle verwendet.
Nach der Elektrophorese wurden die Gele 1 h lang in eine fluoreszierende Verstärkungslösung (EN³HANCE, Kode Nr. NEF-981, kommerziell erhältlich von New England Nudear) eingetaucht und bei 70ºC nach Waschen mit Wasser getrocknet. Die Gele wurden bei -70ºC 2 h lang einem Röntgenftlm ausgesetzt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 17 dargestellt. Die Immunfällungsprobe, die auf jedes Gel angewendet wurde, war die folgende: Spur a, Überstand der Kultur 3Y1; Spur b, Überstand der Kultur 17; Spur c, Überstand der Kultur 3Y1 (behandelt mit N-Glycanase); Spur d, Uberstand der Kultur 17 (1)ehandelt mit N-Glycanase); Spur e, Überstand der Kultur 16 (1,ehandelt mit N-Glycanase); Spur f, Überstand der Kultur 16 (behandelt mit N-Glycanase). Im linken Teil der Zeichnung sind die Molekulargewichte der Markierproteine bezeichnet, die im Gel aufgetrennt sind. Im rechten Teil der Zeichnung sind die angenommene Position des natürlich auftretenden HuIFN-γ (Molgewicht etwa 22 kd, schwarzer Pfeil) und die angenommene Position des natürlich auftretenden HuIFN-γ, von dem die Zuckerketten entfernt wurden (Molgewicht etwa 17 kd, weißer Pfeil) bezeichnet. Da die Proteine der Banden, die an den Pfeilen angeordnet sind, nicht in der Immunfällungsprobe des Uberstandes der Kultur der Ursprungszellen 3Y1 existieren, sind sie offensichtlich das Produkt des HuIFN-γ-Gens, das in die 1-Zellen als pF1900γ eingeführt wurde.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß das HuIFN-γ, das von den 16-Zellen und 17- Zellen produziert wird, ein Molekül ist, das 17,1 kd des Polypeptides umfaßt, an das Zuckerketten über N-Glycosylbindungen gebunden sind und das ein Gesamtmolekulargewicht von 22 bis 25 kd zeigt. Deshalb wurde nachgewiesen, daß das HuIFN-γ, das wenigstens von den 16-Zellen und 17-Zellen produziert wird, dem natürlich auftretenden HuIFN-γ sehr ähnlich ist.
Obwohl die Erfindung in Form einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Modifikationen im Geist und im Rahmen der Erfindung gemacht werden können. Ein rekombinierter Vektor, durch den ein gewünschtes Strukturgen wirksam in Säugetierzellen ausgeprägt werden kann, die in einem serumfreien oder serumarmen Medium kultiviert werden, wird offenbart. Der erfindungsgemäße rekombinierte Vektor umfaßt eine klonierte DNA, die eine Verstärkeraktivität für das Fibronectin-Gen aufweist.

Claims

1. Klonierte DNA-Sequenz, abgeleitet von genomischer DNA der Ratte, mit Verstärkeraktivität für das Fibronectin-Gen der Ratte, wobei die DNA-Sequenz die Nukleotidsequenz umfaßt, die in Fig. 3 dargestellt ist.

2. Rekombinierter Vektor, umfassend die DNA nach Anspruch 1, funktionsbereit mit einem Aktivator und einem Strukturgen verknüpft.

3. Verfahren zur Herstellung eines Genproduktes, umfassend den Schritt, daß Säugetierzellen kultiviert werden, die mit dem rekombinierten Vektor nach Anspruch 2 transformiert wurden, und Sammeln des Genproduktes, das durch Ausprägung des Strukturgens produziert wurde.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Menge des Genproduktes vergrößert wird, indem die Säugetierzellen in einem serumfreien oder serumarmen Medium kultiviert werden.